JP2021506300A - Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）に対する免疫応答を誘導するための方法および組成物 - Google Patents

Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）に対する免疫応答を誘導するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本明細書において、ＨＢＶ抗原をコードする改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターおよびアデノウイルスベクターを提供する。同様に、ヒト対象における免疫応答を増強するためにプライム／ブーストレジメンにおいて、ＨＢＶ抗原をコードするＭＶＡおよびアデノウイルスベクターを利用することによって、ヒト対象における免疫応答を増強する方法も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１７年１２月１９日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５８１４８号明細書、および２０１７年１２月１９日に提出された米国特許仮出願第６２／６０７，４３９号明細書の優先権を主張する。
電子提出された配列表の参照
本出願は、作成日が２０１８年１２月１４日で、サイズ４９．６ＫＢを有するファイル名「６８８０９７−４１３ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ」を有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子提出された配列表を含有する。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
発明の分野
本出願は生物工学に関する。より特に、本発明は、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルスに対する免疫応答を増強するための方法および組成物に関する。
発明の背景
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、４つのオープンリーディングフレームおよび７つのタンパク質をコードする小さい３．２ｋｂの肝臓指向性ＤＮＡウイルスである。約２０億人の人がＨＢＶに感染しており、およそ２億４０００万人の人が、血液中のウイルスおよびサブウイルス粒子が６ヶ月超持続することによって特徴付けられる慢性Ｂ型肝炎感染症（慢性ＨＢＶ）を有する（１）。持続性のＨＢＶ感染症は、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞受容体がウイルスペプチドおよび循環中の抗原によって慢性的に刺激されることにより、循環中および肝臓内のＨＢＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の枯渇をもたらす。その結果、Ｔ細胞の多機能性が減少する（すなわち、ＩＬ−２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＩＦＮ−γレベルの減少、および増殖の欠如）。
ＨＢＶ感染症に対する安全かつ有効な予防用ワクチンは、１９８０年代以降、利用できるようになり、Ｂ型肝炎予防の主流である（３）。世界保健機構は、全ての乳児のワクチン接種を推奨しており、Ｂ型肝炎の流行が低いまたは中間の国では、全ての子供および青年（年齢＜１８歳）、ならびにある特定のリスク集団カテゴリーの人々のワクチン接種を推奨している。ワクチン接種により、世界全体での感染率は劇的に低下した。しかし、予防用ワクチンは、確立されたＨＢＶ感染症を治癒しない。
慢性的なＨＢＶは現在、ＩＦＮ−α、ならびにヌクレオシドまたはヌクレオチドアナログによって処置されているが、ウイルスＲＮＡの鋳型として、したがって新規ビリオンの鋳型として根本的な役割を果たす完全閉鎖環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）と呼ばれる細胞内ウイルス複製中間体が、感染した肝細胞において持続することにより、最終的な治癒は生じない。誘導されたウイルス特異的Ｔ細胞およびＢ細胞応答は、ｃｃｃＤＮＡを有する肝細胞を有効に排除することができると考えられている。ＨＢＶポリメラーゼを標的とする現行の治療は、ウイルス血症を抑制するが、核に存在するｃｃｃＤＮＡおよび関連する循環中の抗原の産生に及ぼす効果は限定的である。最も厳格な治癒の形態は、生物からのＨＢＶｃｃｃＤＮＡの排除であり得るが、これは自然の転帰としてもいずれかの治療介入の結果としても観察されていない。しかし、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の喪失は、臨床的に信頼できる治癒等価物であり、その理由は疾患の再発が重度の免疫抑制の場合に限って起こり得、これは予防的処置によって防止できるためである。このように、少なくとも臨床的見地から、ＨＢｓＡｇの喪失は、ＨＢＶに対する免疫再構成の最も厳格な形態に関連する。
例えば、ｐｅｇ化インターフェロン（ｐｅｇＩＦＮ）−αによる免疫調節は、有限の一連の処置による非処置時の持続的応答に関して、ヌクレオシドまたはヌクレオチド治療と比較してより良好であることが証明されている。直接の抗ウイルス効果に加えて、ＩＦＮ−αは、細胞培養およびヒト化マウスにおいてｃｃｃＤＮＡの後成的抑制を発揮することが報告されており、これはビリオン生産性の低減および転写物の低減をもたらす（４）。しかし、この治療もなお副作用を伴い、理由の一部としてＩＦＮ−αがＨＢＶ特異的Ｔ細胞に及ぼす調節的影響がごくわずかであることから、全体的な応答はむしろ低い。特に、治癒率は低く（＜１０％）、毒性は高い。同様に、直接作用するＨＢＶ抗ウイルス剤、すなわちＨＢＶポリメラーゼ阻害剤であるエンテカビルおよびテノフォビルは、ウイルス抑制の誘導において単剤として有効であり、薬物耐性変異体の出現に対する遺伝的障壁が高く、肝疾患の進行を持続的に防止する。しかし、ＨＢｓＡｇの喪失またはセロコンバージョンによって定義される慢性Ｂ型肝炎の治癒が、そのようなＨＢＶポリメラーゼ阻害剤によって達成されることはめったにない。したがって、これらの抗ウイルス剤は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の抗レトロウイルス治療と同様に、理論的には、肝疾患の再発を防止するためにいつまでも投与する必要がある。
治療的ワクチン接種は、慢性的に感染した患者からＨＢＶを排除する潜在性を有する（５）。多くの戦略が探索されているが、今日まで治療的ワクチン接種の成功は証明されていない。
発明の簡単な概略
したがって、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、特に慢性的なＨＢＶの処置において、高い治癒率で忍容性が良好な有限の処置のアンメットメディカルニーズが存在する。本出願はこの必要性を満たす。改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを提供する。本出願のＭＶＡベクターは、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む天然に存在しない核酸分子を含む。ＭＶＡベクターのＨＢＶポリメラーゼ抗原は、例えば哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり得る。好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原は、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能である。より好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原は、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である。本出願の一実施形態では、ＨＢＶポリメラーゼ抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。本出願の一実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも９０％同一である。本出願の一実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列は、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む。
本出願の一実施形態では、ＭＶＡベクターは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み得る。シグナル配列は、例えば配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、シグナル配列は、配列番号５または配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされる。
本出願の一実施形態では、ＭＶＡベクターは、配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む。本出願の一実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも９０％同一である。本出願の一実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。
同様に、本出願のＭＶＡベクターおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物も提供する。
同様に、それを必要とするヒト対象において免疫応答を増強する方法も提供する。方法は、（ａ）ヒト対象に、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む天然に存在しない核酸分子を含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を含む第１の組成物を投与するステップ；および（ｂ）ヒト対象に、本出願のＭＶＡベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物を投与するステップを含み、それによってヒト対象においてＨＢＶ抗原に対する増強された免疫応答を得る。本出願の一実施形態では、ＨＢＶポリメラーゼ抗原は、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない。本出願の一実施形態では、第１の組成物は、それを必要とする対象において免疫応答をプライミングするためであり、第２の組成物は、免疫応答をブースティングするためである。本出願の一実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の１〜１２週間後に実施される。本出願の一実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の２〜１２週間後に実施される。本出願の一実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の少なくとも１週間後に実施される。本出願の一実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の少なくとも２週間後に実施される。
本出願の一実施形態では、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原は、ヒト対象において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原は、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原は、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である。
本出願の一実施形態では、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。第１の組成物の第１のポリヌクレオチド配列は、例えば配列番号１９と少なくとも９０％同一であり得る。本出願の一実施形態では、第１の組成物の第１のポリヌクレオチド配列は、配列番号１９のポリヌクレオチド配列を含む。
本出願の一実施形態では、第１の組成物におけるアデノウイルスベクターの核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む。第１の組成物の第２のポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１７と少なくとも９０％同一であり得る。本出願の一実施形態では、第１の組成物の第２のポリヌクレオチド配列は、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含む。
本出願の一実施形態では、第１の組成物の第１および第２のポリヌクレオチド配列は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする。第１の組成物の融合タンパク質は、例えばリンカーを介してＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含み得る。第１の組成物のリンカーは、例えばアミノ酸配列（ＡｌａＧｌｙ）ｎを含むことができ、式中ｎは２〜５の整数である。好ましくは、リンカーは、配列番号１４を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。本出願の一実施形態では、第１の組成物の融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
本出願の一実施形態では、増強された免疫応答は、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強された抗体応答を含む。増強された免疫応答は、例えばヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を含み得る。増強された免疫応答は、例えばヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を含み得る。
本出願の一実施形態では、アデノウイルスベクターは、ｒＡｄ２６またはｒＡｄ３５ベクターである。
本出願の一実施形態では、ヒト対象において免疫応答を増強する方法は、（ａ）ヒト対象に、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む第１の天然に存在しない核酸分子を含む第１のプラスミド、および配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む第２の天然に存在しない核酸分子を含む第２のプラスミドの免疫学的有効量を含む第１の組成物を投与するステップ；ならびに（ｂ）ヒト対象に、本出願のＭＶＡベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物を投与するステップを含み、それによってヒト対象においてＨＢＶ抗原に対して増強された免疫応答を得る。本出願の一実施形態では、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原は、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない。本出願の一実施形態では、第１の組成物は、免疫応答をプライミングするためであり、第２の組成物は、免疫応答をブースティングするためである。本出願の一実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の１〜１２週間後に実施される。本出願の一実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の２〜１２週間後に実施される。本出願の一実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の少なくとも１週間後に実施される。本出願の一実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の少なくとも２週間後に実施される。
本出願の一実施形態では、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原は、ヒト対象において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原は、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原は、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である。
本出願の一実施形態では、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。第１の組成物の第１のポリヌクレオチド配列は、例えば配列番号１９と少なくとも９０％同一であり得る。本出願の一実施形態では、第１の組成物の第１のポリヌクレオチド配列は、配列番号１９のポリヌクレオチド配列を含む。
本出願の一実施形態では、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。本出願の一実施形態では、第１の組成物の第１のポリヌクレオチド配列は、配列番号２０と少なくとも９０％同一である。第１の組成物の第１のポリヌクレオチド配列は、例えば配列番号２０を含み得る。
本出願の一実施形態では、第１の組成物の第１のプラスミドの核酸分子は、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。シグナル配列は、例えば配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができ、好ましくは、シグナル配列は、配列番号５または配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる。
本出願の一実施形態では、第１の組成物の第２のポリヌクレオチド配列は、配列番号１８と少なくとも９０％同一である。第１の組成物の第２のポリヌクレオチド配列は、例えば配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含み得る。
本出願の一実施形態では、第１の組成物の第１および第２のポリヌクレオチド配列は、プロモーター配列、任意選択で１つまたは複数の追加の調節配列をさらに含み、好ましくは、プロモーター配列は、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含み、ならびに追加の調節配列は、配列番号８または配列番号１５のエンハンサー配列および配列番号１６のポリアデニル化シグナル配列からなる群から選択される。
本出願の一実施形態では、増強された免疫応答は、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強された抗体応答を含む。増強された免疫応答は、例えばヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を含み得る。増強された免疫応答は、例えばヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を含み得る。
発明の他の態様、特色および利点は、発明の詳細な記述、ならびにその好ましい実施形態および添付の特許請求の範囲を含む以下の開示から明らかであろう。
図面の簡単な説明
発明の前述の概要、ならびに以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読むとより良好に理解される。発明は、図面に示された実施形態そのものに限定されないと理解すべきである。
以下の図において：
図１Ａ〜１Ｂは、Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムおよびウイルス生活環を示す。図１Ａは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のゲノムの図であり、ネイティブウイルスでは、ポリメラーゼタンパク質（Ｐｏｌ）は、異なるオープンリーディングフレームにエンベロープタンパク質のコード配列を含有し、エンベロープタンパク質（ｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−Ｓ２、およびＳ）は、同じオープンリーディングフレームに存在する。図１Ｂは、ＨＢＶのウイルス生活環を示す。 （前記の通り。） 図２Ａ〜２Ｃは、本出願の実施形態に従うアデノウイルスおよびＭＶＡベクターにおける発現カセットの略図を示す。図２Ａは、ＣＭＶプロモーター、イントロン（ヒトＡｐｏＡＩ遺伝子に由来する断片−ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０１０３８、塩基対２９５〜５２３、ＡｐｏＡＩの第２のイントロンを有する）、ヒト免疫グロブリン分泌シグナル、その後に続く切断型ＨＢＶコア抗原のコード配列およびＳＶ４０ ポリアデニル化シグナルを含有する切断型ＨＢＶコア抗原の発現カセットを示す。図２Ｂは、ＨＢＶ抗原を除き、それ以外は切断型ＨＢＶコア抗原の発現カセットと同一である、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原の融合タンパク質の発現カセットを示す。図２Ｃは、Ｐｒ１３．５長プロモーターに作動可能に連結されたＨＢＶコア抗原を含む発現カセット、およびＰｒＨｙｂプロモーターに作動可能に連結されたＨＢＶポリメラーゼ抗原を含む発現カセットを示す。 （前記の通り。） （前記の通り。） 図３は、ＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡの異なる組合せによって免疫したＦ１マウスのＥＬＩＳＰＯＴ応答のグラフを示す。様々なワクチン接種動物群から単離した脾細胞を刺激するために使用したＨＢＶコアまたはポリメラーゼペプチドプールを、黒色（コア）および灰色（ｐｏｌ）で示す。Ｐｏｌ１およびｐｏｌ２応答を合計した。Ｘ軸は、アデノベクターの用量およびＭＶＡブーストの存在または非存在を示す。応答性Ｔ細胞の数を、脾細胞１０６個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表記してｙ軸に示す。 図４は、ＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡの異なる組合せによって免疫したＦ１マウスの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）応答のグラフを示す。様々なワクチン接種動物群から単離した脾細胞を刺激するために使用したＨＢＶコアおよびポリメラーゼペプチドプールを、黒色（コア）および灰色（ｐｏｌ）で示す。Ｐｏｌ１およびｐｏｌ２応答を合計した。Ｘ軸は、アデノベクターの用量およびＭＶＡブーストの存在または非存在を示す。ＩＦＮ−γに関して陽性のＣＤ８（＋）Ｔ細胞のパーセンテージをｙ軸に示す。 図５は、ＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡベクターの異なる組合せによって免疫したＦ１マウスのＩＣＳ応答のグラフを示す。様々なワクチン接種動物群から単離した脾細胞を刺激するために使用したＨＢＶコアおよびポリメラーゼペプチドプールを、黒色（コア）および灰色（ｐｏｌ）で示す。Ｐｏｌ１およびｐｏｌ２応答を合計した。Ｘ軸は、アデノウイルスベクターの用量およびＭＶＡブーストの存在または非存在を示す。ＩＦＮ−γに関して陽性のＣＤ４（＋）Ｔ細胞のパーセンテージをｙ軸に示す。 図６は、ＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡベクターの異なる組合せによって免疫したＮＨＰのＥＬＩＳＰＯＴ応答のグラフを示す。様々なワクチン接種動物群から単離したＰＢＭＣを刺激するために使用したＨＢＶコアまたはポリメラーゼペプチドプールを、□（コア）、○（ｐｏｌ１）、および△（ｐｏｌ２）で示す。Ｘ軸は、異なる実験群および時点を示す。応答性Ｔ細胞の数を、脾細胞１０６個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として表記してｙ軸に示す。バックグラウンド（培地＋ＤＭＳＯ刺激）を差し引いたデータを示す。ならびに 図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、ＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡベクターの異なる組合せによって免疫したＮＨＰのＩＣＳ応答のグラフを示す。様々なワクチン接種動物群から単離したＰＢＭＣを刺激するために使用したＨＢＶコアおよびポリメラーゼペプチドプールを、□（コア）、○（ｐｏｌ１）、および△（ｐｏｌ２）で示す。Ｘ軸は、異なる実験群および時点を示す。ＩＦＮ−γに関して陽性のＣＤ４（＋）およびＣＤ８（＋）Ｔ細胞のパーセンテージをｙ軸に示す。バックグラウンド（培地＋ＤＭＳＯ刺激）を差し引いたデータを示す。 （前記の通り。） （前記の通り。）
発明の詳細な記述
様々な刊行物、論文、および特許が、背景および本出願全体を通して引用または記載されているが、これらの参照の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイス、品目等に関する考察は、本発明の内容を提供する目的のためである。そのような考察は、これらの事柄のいずれかまたは全てが、開示または特許請求される任意の本発明に関連して先行技術の一部を形成すると認めたわけではない。
それ以外であると定義している場合を除き、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。そうでなければ、本明細書で使用するある特定の用語は、本明細書に記載の意味を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの」、「１つの（ａｎ）」、および「その」は、本文がそれ以外であると明白に示していない限り、複数形を含むことに注意しなければならない。
それ以外であると明記していない限り、本明細書で記載する濃度または濃度範囲などのいかなる数値も、全ての例において用語「約」によって修飾されると理解される。このように、数値は典型的に、列挙した値の±１０％を含む。例えば、濃度１ｍｇ／ｍＬは、０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、濃度範囲１％〜１０％（重量／体積）は、０．９％（重量／体積）〜１１％（重量／体積）を含む。本明細書で使用される場合、本文が明白にそれ以外であることを示していない限り、数値範囲の使用は、全ての可能性がある小範囲、ならびにそのような範囲内の整数および値の分数を含む、その範囲内の全ての個々の数値を明白に含む。
それ以外であると示していない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、その一連のあらゆる要素を指すと理解される。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を、単なる通例の実験を使用して認識するか、または確認することができる。そのような均等物は、本発明に包含されると意図される。
以下に続く本明細書および特許請求の範囲を通して、本文がそれ以外であることを必要としていない限り、用語「含む」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、記載の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含むことを暗示するが、他の任意の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を除外しないと理解される。本明細書で使用する場合、用語「含む」は、用語「含有する」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」に置換することができ、または時に本明細書において使用される場合、「有する」という用語に置換することができる。
本明細書で使用される場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素に明記されていないいかなる要素、ステップ、または成分も除外する。本明細書で使用される場合、「本質的にからなる」は、特許請求の範囲の基本的および新規特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップを除外しない。上記の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」はいずれも、本発明の一態様または一実施形態の文脈において本明細書で使用されている場合は常に、本開示の範囲を変化させるために用語「からなる」または「本質的にからなる」と置換することができる。
本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素の間の接続詞「および／または」は、個々のおよび組合せの選択肢の両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素を「および／または」で接続する場合、第１の選択肢は第２の要素を有しない第１の要素の適応性を指す。第２の選択肢は、第１の要素を有しない第２の要素の適応性を指す。第３の選択肢は、第１および第２の要素の両方の適応性を指す。これらの選択肢の任意の１つが、その意味に含まれ、したがって本明細書で使用される用語「および／または」の必要条件を満たすと理解される。１つより多くの選択肢の同時の適応性もまた、その意味に含まれ、したがって用語「および／または」の必要条件を満たすと理解される。
本明細書で使用される場合、「対象」は、本出願の実施形態に従う方法によって処置されるまたは処置された任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用される用語「哺乳動物」は、任意の哺乳動物を包含する。哺乳動物の例には、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、例えばサルまたは類人猿、ヒト等が挙げられるがこれらに限定されず、より好ましくはヒトである。
用語「アジュバント」および「免疫刺激剤」は、本明細書において互換的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質として定義される。この文脈において、アジュバントは、本出願のアデノウイルスおよび／またはＭＶＡベクターに対する免疫応答を増強するために使用される。
好ましい本発明の構成要素の寸法または特徴に言及する場合に本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「一般的に」、「実質的に」および類似の用語は、記載の寸法／特徴が厳密な境界またはパラメータではなく、当業者によって理解されるように機能的に同じまたは類似である軽微なその変形形態を除外しないことを示すと理解すべきである。少なくとも数値パラメータを含むそのような言及は、当技術分野で容認された数学的および工業的原理（例えば、切り上げ、測定、または他のシステムエラー、製作公差等）を使用して、最下位の有効数字を変化させない変動を含む。
２つまたはそれより多くの核酸またはポリペプチド配列（例えば、ＨＢＶ抗原性ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチド）の文脈における用語「同一」またはパーセント「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用するかまたは目視によって測定した場合に、最大に一致するように比較および整列させた場合に、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの明記されたパーセンテージを有する２つまたはそれより多くの配列または小配列を指す。
配列比較のため、典型的に、１つの配列は、それに対して試験配列を比較する基準配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および基準配列をコンピューターに入力し、必要に応じて小配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて基準配列と比較して試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアライメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって、または目視（一般的に、Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)を参照されたい）によって実行することができる。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これはそれぞれ、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402において説明されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードと整列させた場合にいくつかの陽性値閾値スコアＴにマッチするかまたはそれを満たす、クエリ配列における長さＷの短いワードを同定することによる高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定するステップを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、前記）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見するための検索を開始するためのシードとして作用する。次に、ワードヒットを、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各々の配列に沿って両方の方向に伸長させる。
累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（マッチする残基対に関する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列の場合、スコア行列を使用して累積スコアを計算する。各々の方向でのワードヒットの伸長は：累積アライメントスコアが、その最大達成値から量Ｘ低下した場合；１つまたは複数の負のスコア残基アライメントの蓄積により、累積スコアがゼロもしくはそれより下となる場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい）。
パーセント配列同一性の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性に関する統計分析も実施する（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される１つの類似性の測定は、最小総和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸の基準核酸に対する比較における最小総和確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は基準配列と類似であると考えられる。
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるさらなる指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載するように第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。このように、ポリペプチドは、例えば２つのペプチドが保存的置換のみによって異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子が、以下に記載されるストリンジェントな条件で互いにハイブリダイズすることである。
本明細書で使用される場合、免疫応答、例えばＣＤ４＋ Ｔ細胞応答、抗体応答、またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答に関連して使用する場合の用語「増強された」は、本出願のＭＶＡベクターまたはアデノウイルス単独を投与した対象から観察された対応する免疫応答と比較して、本出願に従うＭＶＡおよびアデノウイルスベクターのプライム−ブースト組合せを投与した対象における免疫応答の増加を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答」は、ワクチン接種後の全応答性Ｔ細胞集団内の免疫原特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の高い割合を観察することによって特徴付けられるＴ細胞免疫応答を指す。全体的な免疫原特異的Ｔ細胞応答は、ＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定することができる。免疫原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞免疫応答は、ＩＣＳアッセイによって決定することができる。
本明細書で使用される場合、用語「増強された抗体応答」は、本出願のＭＶＡおよびアデノウイルスベクター単独を投与した対象から観察された対応する免疫応答と比較して、本出願に従うＭＶＡおよびアデノウイルスベクターのプライム−ブースト組合せを投与した対象における増加した抗体応答を指す。
用語「アジュバント」は、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質として定義される。この文脈において、アジュバントは、本出願のプラスミド、アデノウイルス、および／またはＭＶＡベクターに対する免疫応答を増強するために使用される。
本明細書で使用される場合、用語「抗原性遺伝子産物またはその断片」、または「抗原性タンパク質」は、細菌、ウイルス、寄生虫、または真菌のタンパク質またはその断片を含み得る。好ましくは、抗原性タンパク質または抗原性遺伝子産物は、宿主において保護的免疫応答を生じることが可能であり、例えば疾患もしくは感染症（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、または真菌の疾患または感染症）に対する免疫応答を誘導する、および／または疾患もしくは感染症に対して対象を保護する疾患または感染症に対する免疫を対象において生じる（すなわち、ワクチン接種する）ことが可能である。
本出願の読者を助ける試みで、説明は様々な段落または節で区切られているか、または本出願の様々な実施形態を対象としている。これらの区切りは、段落または節または実施形態の物質を別の段落、節、または実施形態の物質と切り離すと考えるべきではない。逆に、当業者は、説明が広い応用を有し、企図することができる様々な節、段落、および文章の全ての組合せを包含すると理解するであろう。いかなる実施形態の考察も単なる例であることを意味しており、特許請求の範囲を含む本開示の範囲はこれらの例に限定されないと示唆することを意図する。例えば、本明細書に記載の本出願のＨＢＶベクターの実施形態（例えば、プラスミドＤＮＡまたはウイルスベクター）は、特定の順序で配置したある特定のプロモーター配列、エンハンサーまたは調節配列、シグナルペプチド、ＨＢＶ抗原のコード配列、ポリアデニル化シグナル配列等を含むがこれらに限定されない特定の構成要素を含有し得るが、当業者は、本明細書で開示される概念が、本出願のＨＢＶベクターにおいて使用することができる他の順序で配置した他の構成要素にも等しく当てはまり得ることを認識するであろう。本出願は、特定の組合せが明白に記載されているか否かによらず、本出願のＨＢＶベクターにおいて使用することができる任意の配列を有する任意の応用可能な構成要素の任意の組合せでの使用を企図する。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
本明細書で使用される場合、「Ｂ型肝炎ウイルス」または「ＨＢＶ」は、ヘパドナウイルス科のウイルスを指す。ＨＢＶは、４つのオープンリーディングフレームおよび７つのタンパク質をコードする小さい（例えば、３．２ｋｂ）肝臓指向性のＤＮＡウイルスである。図１Ａを参照されたい。ＨＢＶによってコードされる７つのタンパク質は、ｓｍａｌｌ（Ｓ）、ｍｅｄｉｕｍ（Ｍ）、およびｌａｒｇｅ（Ｌ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、またはエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質、プレコアタンパク質、コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、およびＨＢｘタンパク質を含む。ＨＢＶは、３つの表面抗原またはエンベロープタンパク質、Ｌ、Ｍ、およびＳを発現し、Ｓが最小であり、Ｌが最大である。ＭおよびＬタンパク質におけるエクストラドメインはそれぞれ、Ｐｒｅ−Ｓ２およびＰｒｅ−Ｓ１と呼ばれる。コアタンパク質は、ウイルスヌクレオキャプシドのサブユニットである。Ｐｏｌは、ウイルスＤＮＡの合成にとって必要であり（逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ、およびプライマー）、これは感染した肝細胞の細胞質に局在するヌクレオキャプシドで起こる。プレコアは、Ｎ末端シグナルペプチドを有するコアタンパク質であり、そのＮ末端およびＣ末端でタンパク質分解によりプロセシングされ、感染した細胞からいわゆるＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）として分泌される。ＨＢｘタンパク質は、完全閉鎖環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の効率的な転写にとって必要である。ＨＢｘは、ウイルスの構造タンパク質ではない。ＨＢＶの全てのウイルスタンパク質は、ｍＲＮＡを共有するコアおよびポリメラーゼを除き自身のｍＲＮＡを有する。タンパク質プレコアを除き、いずれのＨＢＶウイルスタンパク質も翻訳後タンパク質分解によるプロセシングを受けない。
ＨＢＶビリオンは、ウイルスエンベロープ、ヌクレオキャプシド、および１コピーの部分的二本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。ヌクレオキャプシドは、コアタンパク質の１２０個の二量体を含み、Ｓ、Ｍ、およびＬウイルスエンベロープ、または表面抗原タンパク質に埋もれているキャプシド膜によって覆われている。細胞内に侵入後、ウイルスは、脱殻し、ウイルスポリメラーゼが共有結合したキャプシド含有不完全閉鎖環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）が核に移行する。そのプロセスの間、コアタンパク質のリン酸化が構造の変化を誘導し、核移行シグナルを露出させ、キャプシドといわゆるインポーチンとの相互作用を可能にする。これらのインポーチンは、コアタンパク質と核膜孔複合体との結合を媒介し、それによってキャプシドが分解し、ポリメラーゼ／ｒｃＤＮＡ複合体が核に放出される。核内でｒｃＤＮＡが、脱タンパク質化され（ポリメラーゼの除去）、宿主ＤＮＡ修復機構によって完全閉鎖環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）ゲノムに変換され、重複する転写物がＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇ、コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼおよびＨＢｘタンパク質をコードする。コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ、およびプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）は、細胞質で会合し、未成熟なｐｇＲＮＡ含有キャプシド粒子へと自己アセンブリし、これはさらに成熟ｒｃＤＮＡキャプシドへと変換して共通の中間体として機能し、エンベロープに包まれて感染症のウイルス粒子として分泌されるか、または核に再度輸送されて安定なｃｃｃＤＮＡプールを補充および維持する。図１Ｂを参照されたい。
今日まで、ＨＢＶは、エンベロープタンパク質に存在する抗原性エピトープに基づいて４つの血清型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗ）に、およびウイルスゲノムの配列に基づいて８つの遺伝子型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）に分類される。ＨＢＶ遺伝子型は、異なる地域にわたって分布している。例えば、アジアで最も多い遺伝子型は、遺伝子型ＢおよびＣである。遺伝子型Ｄは、アフリカ、中東、およびインドで一般的であるが、遺伝子型Ａは、北部ヨーロッパ、サハラ下アフリカ、および西アフリカで広く認められる。
ＨＢＶ抗原
本明細書で使用される場合、用語「ＨＢＶ抗原」、「ＨＢＶの抗原性ポリペプチド」、「ＨＢＶ抗原性ポリペプチド」、「ＨＢＶ抗原性タンパク質」、「ＨＢＶ免疫原性ポリペプチド」、および「ＨＢＶ免疫原」は全て、対象においてＨＢＶに対する免疫応答、例えば液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することが可能なポリペプチドを指す。ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶのポリペプチド、その断片もしくはエピトープ、または複数のＨＢＶポリペプチド、その一部もしくは誘導体の組合せであり得る。ＨＢＶ抗原は、宿主において保護的免疫応答を生じる、例えばウイルス疾患または感染症に対する免疫応答を誘導することが可能であり、および／または対象において、ウイルス疾患または感染症に対して対象を保護する、ウイルス疾患もしくは感染症に対する免疫を生じる（すなわち、ワクチン接種する）ことが可能である。例えば、ＨＢＶ抗原は、任意のＨＢＶタンパク質、例えばＨＢｅＡｇ、プレコアタンパク質、ＨＢｓＡｇ（Ｓ、Ｍ、またはＬタンパク質）、コアタンパク質、ウイルスポリメラーゼ、または任意のＨＢＶ遺伝子型、例えば遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、および／もしくはＨに由来するＨＢｘタンパク質からのポリペプチドまたはその免疫原性断片、またはその組合せを含み得る。
（１）ＨＢＶコア抗原
本明細書で使用される場合、用語「ＨＢＶコア抗原」、「ＨＢｃＡｇ」、および「コア抗原」は全て、対象においてＨＢＶコアタンパク質に対する免疫応答、例えば液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することが可能なＨＢＶ抗原を指す。用語「コア」、「コアポリペプチド」、および「コアタンパク質」の各々は、ＨＢＶウイルスコアタンパク質を指す。完全長のコア抗原は、典型的には、１８３アミノ酸長であり、アセンブリドメイン（アミノ酸１〜１４９）および核酸結合ドメイン（アミノ酸１５０〜１８３）を含む。３４残基の核酸結合ドメインは、プレゲノムＲＮＡキャプシド形成にとって必要である。このドメインはまた、核輸入シグナルとしても機能する。これは、１７個のアルギニン残基を含み、その機能と整合して、高度に塩基性である。ＨＢＶコアタンパク質は溶液中で二量体であり、二量体は、正二十面体のキャプシドへと自己アセンブルする。コアタンパク質の各々の二量体は、いずれかの側にα−ヘリックスドメインが隣接する４つのα−ヘリックスバンドルを有する。核酸結合ドメインを欠如する切断型ＨＢＶコアタンパク質もまた、キャプシドを形成することが可能である。
本出願の一実施形態では、ＨＢＶ抗原は、切断型ＨＢＶコア抗原である。本明細書で使用される場合、「切断型ＨＢＶコア抗原」は、ＨＢＶコアタンパク質の完全長を含有しないが、対象においてＨＢＶコアタンパク質に対する免疫応答を誘導することが可能であるＨＢＶ抗原を指す。例えば、ＨＢＶコア抗原は、典型的に１７個のアルギニン（Ｒ）残基を含有するコア抗原の高度に正に帯電した（アルギニンに富む）Ｃ末端核酸結合ドメインの１つまたは複数のアミノ酸を欠失させるように改変することができる。本出願の一部の実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、切断型ＨＢＶコアタンパク質である。本出願の切断型ＨＢＶコア抗原は、好ましくはＨＢＶコア核輸入シグナルを含まないＣ末端切断型ＨＢＶコアタンパク質、および／またはＣ末端ＨＢＶコア核輸入シグナルが欠失している切断型ＨＢＶコアタンパク質である。本出願の一実施形態では、切断型ＨＢＶコア抗原は、Ｃ末端核酸結合ドメインの１〜３４アミノ酸残基の欠失、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４アミノ酸残基の欠失、好ましくは３４アミノ酸残基全ての欠失を含む。好ましい実施形態では、切断型ＨＢＶコア抗原は、Ｃ末端核酸結合ドメイン、好ましくは３４アミノ酸残基全ての欠失を含む。
本出願の実施形態に従って、ＨＢＶコア抗原は、複数のＨＢＶ遺伝子型（例えば、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）に由来するコンセンサス配列であり得る。本明細書で使用される場合、「コンセンサス配列」は、例えば相同なタンパク質のアミノ酸配列のアライメント（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して）によって決定した、相同なタンパク質のアミノ酸配列のアライメントに基づく人工的なアミノ酸配列を意味する。これは、少なくとも１００個の天然のＨＢＶ単離体からのＨＢＶ抗原（例えば、コア、ｐｏｌ等）の配列に基づいて、配列アライメントにおける各位置で見出される最も頻繁なアミノ酸残基の計算された順序であり得る。コンセンサス配列は、天然に存在せず、ネイティブウイルス配列とは異なり得る。コンセンサス配列は、マルチプル配列アライメントツールを使用して異なる起源からの複数のＨＢＶ抗原配列を整列させるステップ、および多様なアライメント位置で最も頻繁なアミノ酸を選択するステップによって設計することができる。好ましくは、ＨＢＶ抗原のコンセンサス配列は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来する。用語「コンセンサス抗原」は、コンセンサス配列を有する抗原を指すために使用される。
本出願の実施形態に従う切断型ＨＢＶコア抗原は、核酸結合機能を欠如し、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能である。好ましくは、切断型ＨＢＶコア抗原は、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能である。より好ましくは、切断型ＨＢＶコア抗原は、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である。
本出願の好ましい実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、コンセンサス抗原、好ましくはＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコンセンサス抗原、より好ましくはＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来する切断型コンセンサス抗原である。本出願に従う例示的な切断型ＨＢＶコアコンセンサス抗原は、配列番号２と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列からなる。配列番号２は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコアコンセンサス抗原である。配列番号２は、ネイティブコア抗原の高度に正に帯電した（アルギニンに富む）核酸結合ドメインの３４アミノ酸Ｃ末端欠失を含有する。
本出願の特定の実施形態では、ＨＢＶコア抗原は、配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶ抗原である。
（２）ＨＢＶポリメラーゼ抗原
本明細書で使用される場合、用語「ＨＢＶポリメラーゼ抗原」、「ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原」、または「ＨＢＶ ｐｏｌ抗原」は、対象においてＨＢＶポリメラーゼに対する免疫応答、例えば液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することが可能であるＨＢＶ抗原を指す。用語「ポリメラーゼ」、「ポリメラーゼポリペプチド」、「Ｐｏｌ」、および「ｐｏｌ」は、ＨＢＶウイルスＤＮＡポリメラーゼを指す。ＨＢＶウイルスＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ末端からＣ末端に、マイナス鎖ＤＮＡ合成のプライマーとして作用する末端タンパク質（ＴＰ）ドメイン、ポリメラーゼ機能にとって必須ではないスペーサー、転写のための逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン、およびＲＮアーゼＨドメインを含む４つのドメインを有する。
本出願の一実施形態では、ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原、またはその免疫原性断片または組合せを含む。ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、例えばある特定の酵素活性を減少させるかまたは実質的に排除するために、ポリメラーゼおよび／またはＲＮアーゼドメインの活性部位に変異を導入することによって、抗原の免疫原性を改善するためにさらなる改変を含有し得る。
好ましくは、本出願のＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有さず、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり得る。好ましくは、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能である。より好ましくは、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、ヒト対象において、少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である。
このように、本出願の一部の実施形態では、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、不活化Ｐｏｌ抗原である。本出願の一実施形態では、不活化ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、ポリメラーゼドメインの活性部位に１つまたは複数のアミノ酸変異を含む。別の実施形態では、不活化ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原は、ＲＮアーゼＨドメインの活性部位に１つまたは複数のアミノ酸変異を含む。好ましい実施形態では、不活化ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、ポリメラーゼドメインおよびＲＮアーゼＨドメインの両方の活性部位に１つまたは複数のアミノ酸変異を含む。例えば、ヌクレオチド／金属イオン結合にとって必要なＨＢＶ ｐｏｌ抗原のポリメラーゼドメインにおける「ＹＸＤＤ」モチーフを、例えばアスパラギン酸塩残基（Ｄ）の１つまたは複数をアスパラギン残基（Ｎ）に置換することによって、変異させることができ、それによって金属配位機能を排除するかまたは低減させ、それによって逆転写酵素機能を減少させるかまたは実質的に排除することができる。あるいは、または「ＹＸＤＤ」モチーフの変異に加えて、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原のＲＮアーゼＨドメインにおけるＭｇ２＋配位にとって必要な「ＤＥＤＤ」モチーフを、例えば１つまたは複数のアスパラギン酸塩残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に置換することによって、および／またはグルタミン酸塩残基（Ｅ）をグルタミン（Ｑ）に置換することによって変異させることができ、それによってＲＮアーゼＨ機能を減少させるかまたは実質的に排除することができる。特定の実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、（１）ポリメラーゼドメインの「ＹＸＤＤ」モチーフにおいてアスパラギン酸塩残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に変異させることによって、および（２）ＲＮアーゼＨドメインの「ＤＥＤＤ」モチーフにおける第１のアスパラギン酸塩残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に、および第１のグルタミン酸塩残基（Ｅ）をグルタミン残基（Ｎ）に変異させることによって改変され、それによってｐｏｌ抗原の逆転写酵素およびＲＮアーゼＨ機能を減少させるかまたは実質的に排除する。
本出願の好ましい実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、コンセンサス抗原、好ましくはＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するコンセンサス抗原であり、より好ましくはＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来する不活化コンセンサス抗原である。本出願に従う例示的なＨＢＶ ｐｏｌコンセンサス抗原は、配列番号４と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号４と少なくとも９８％同一である、例えば配列番号４と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号４は、ポリメラーゼおよびＲＮアーゼＨドメインの活性部位に位置する４つの変異を含むＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに由来するｐｏｌコンセンサス抗原である。特に、４つの変異は、ポリメラーゼドメインの「ＹＸＤＤ」モチーフにおけるアスパラギン酸塩残基（Ｄ）のアスパラギン残基（Ｎ）への変異、ならびにＲＮアーゼＨドメインの「ＤＥＤＤ」モチーフにおける第１のアスパラギン酸塩残基（Ｄ）のアスパラギン残基（Ｎ）への変異、およびグルタミン酸塩残基（Ｅ）のグルタミン残基（Ｑ）への変異を含む。
本出願の特定の実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。本出願の他の実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原は、配列番号４のアミノ酸配列からなる。
（３）ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原の融合体
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」、または「融合体」は、単一の天然のポリペプチドに通常存在しない少なくとも２つのポリペプチドドメインを有する単一のポリペプチド鎖を指す。
本出願の一実施形態では、ＨＢＶ抗原は、好ましくはリンカーを介して、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原、または切断型ＨＢＶコア抗原に作動可能に連結されたＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む融合タンパク質を含む。
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」は、リンカーの１つの部分が第１の分子に作動可能に連結され、リンカーの別の部分が、第２の分子に作動可能に連結される、２つの異なる分子を作動可能に連結するための分子架橋として作用する化合物または部分を指す。例えば、第１のポリペプチドおよび第２の異種ポリペプチドを含有する融合タンパク質では、リンカーは、主に第１のポリペプチドと第２の異種ポリペプチドとの間のスペーサーとしての役目を果たす。一実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって共に連結されたアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって連結された１〜２０個のアミノ酸で構成され、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。一実施形態では、１〜２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。好ましくは、リンカーは、立体妨害を受けないアミノ酸、例えばグリシンおよびアラニンで大部分が構成される。例示的なリンカーは、ポリグリシン、特に（Ｇｌｙ）５、（Ｇｌｙ）８、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、およびポリアラニンである。以下の実施例に示される１つの例示的な適したリンカーは、（ＡｌａＧｌｙ）ｎであり、式中ｎは２〜５の整数である。
好ましくは、本出願の融合タンパク質は、哺乳動物において、少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型のＨＢＶコアおよびＨＢＶ Ｐｏｌに対する免疫応答を誘導することが可能である。好ましくは、融合タンパク質は、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能である。より好ましくは、融合タンパク質は、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である。
本出願の一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２と少なくとも９０％同一である、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する切断型ＨＢＶコア抗原、リンカー、および配列番号４と少なくとも９０％同一である、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む。
本出願の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原、ｎが２〜５の整数である（ＡｌａＧｌｙ）ｎを含むリンカー、および配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む。より好ましくは、本出願の実施形態に従う融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
本出願の一実施形態では、融合タンパク質は、シグナル配列をさらに含む。好ましくは、シグナル配列は、配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を有する。より好ましくは、融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
ポリヌクレオチドおよびベクター
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の実施形態に従うＨＢＶ抗原をコードする天然に存在しない核酸分子および天然に存在しない核酸を含むベクターを提供する。天然に存在しない核酸分子は、本出願のＨＢＶ抗原をコードする任意のポリヌクレオチド配列を含むことができ、これは本開示を考慮して当技術分野で公知の方法を使用して作製することができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、本出願のＨＢＶコア抗原およびＨＢＶポリメラーゼ抗原の少なくとも１つをコードする。ポリヌクレオチドは、組換え技術（例えば、クローニング）によって得た、または合成（例えば、化学合成）によって産生されたＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。例えば、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはその組合せを含み得る。ポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドでもあり得る。本出願のポリヌクレオチドおよびベクターは、組換えタンパク質産生、宿主細胞におけるタンパク質の発現、またはウイルス粒子の産生のために使用することができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。
本出願の一実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号２と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号２と少なくとも９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。本出願の特定の実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含む切断型ＨＢＶコア抗原をコードする。
配列番号２のアミノ酸配列を含む切断型ＨＢＶコア抗原をコードする本出願のポリヌクレオチド配列の例には、配列番号１と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号１と少なくとも９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列が挙げられるがこれらに限定されない。本出願の特定の実施形態では、切断型ＨＢＶコア抗原をコードする天然に存在しない核酸分子は、配列番号１、１７、または１８のポリヌクレオチド配列を含む。
本出願の一実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号４と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする。本出願の特定の実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする。
配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原をコードする本出願のポリヌクレオチド配列の例には、配列番号３と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号３と少なくとも９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列が挙げられるがこれらに限定されない。本出願の特定の実施形態では、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードする天然に存在しない核酸分子は、配列番号３、１９、または２０のポリヌクレオチド配列を含む。
本出願の別の実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原、または切断型ＨＢＶコア抗原に作動可能に連結されたＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、本出願の天然に存在しない核酸分子は、配列番号２と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原；リンカー；ならびに配列番号４と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号４と少なくとも９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする。本出願の特定の実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原、ｎが２〜５の整数である（ＡｌａＧｌｙ）ｎを含むリンカー、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む融合タンパク質をコードする。本出願の特定の実施形態では、天然に存在しない核酸分子は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。
融合タンパク質をコードする本出願のポリヌクレオチド配列の例には、配列番号１と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号１と少なくとも９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列であって、配列番号１４と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号１４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号１４と少なくとも９８％、９９％、または１００％同一であるリンカーコード配列に作動可能に連結され、リンカーコード配列がさらに、配列番号３と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号３と少なくとも９８％、９９％、または１００％同一であるポリヌクレオチド配列にさらに作動可能に連結される、ポリヌクレオチド配列が挙げられるがこれらに限定されない。本出願の特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする天然に存在しない核酸分子は、配列番号３にさらに作動可能に連結された配列番号１４に作動可能に連結された配列番号１を含む。
別の一般的な態様では、本出願は、ＨＢＶ抗原をコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、遺伝子材料を別の細胞に運ぶために使用され、そこで複製および／または発現させることができる核酸分子である。本開示を考慮して当業者に公知の任意のベクターを使用することができる。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、コスミド、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、ベクターはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであり得る。当業者は、本開示を考慮して標準的な組換え技術を通して、本出願のベクターを構築することができる。
本出願の実施形態に従って、ベクターは発現ベクターであり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、転写することが可能なＲＮＡをコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築物を指す。発現ベクターには、組換えタンパク質発現のためのベクター、例えばＤＮＡプラスミド、またはウイルスベクター、および対象の組織において発現させるために対象に核酸を送達するためのベクター、例えばＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の要因に依存し得ることは当業者によって認識される。
本出願の実施形態に従うベクターは、多様な調節配列を含有し得る。本明細書で使用される場合、用語「調節配列」は、複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、核酸またはその誘導体の１つ（すなわち、ｍＲＮＡ）の安定性および／または宿主細胞もしくは生物への輸送を含む、核酸分子の機能的調節を可能にする、寄与する、またはモジュレートする任意の配列を指す。本開示の文脈では、この用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡ安定性に影響を及ぼすエレメント）を包含する。
本出願の一部の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。非ウイルスベクターの例には、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージ等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、非ウイルスベクターは、ＤＮＡプラスミドである。「ＤＮＡプラスミド」は、「ＤＮＡプラスミドベクター」、「プラスミドＤＮＡ」または「プラスミドＤＮＡベクター」と互換的に使用され、適した宿主細胞において自立複製を可能にする、二本鎖で一般的に環状のＤＮＡ配列を指す。コードされるポリヌクレオチドの発現のために使用されるＤＮＡプラスミドは、典型的には、複製開始点、マルチクローニングサイト、および例えば抗生物質耐性遺伝子であり得る選択可能マーカーを含む。本出願で使用するために適したＤＮＡプラスミドの例には、周知の発現系において使用するための市販の発現ベクター（原核細胞および真核細胞系の両方を含む）、例えば大腸菌（Escherichia coli）におけるタンパク質の産生および／または発現のために使用することができるｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）；酵母（Saccharomyces cerevisiae）株における産生および／または発現のために使用することができるｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；昆虫細胞における産生および／または発現のために使用することができるＭＡＸＢＡＣ（登録商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；哺乳動物細胞における高レベルの構成的タンパク質発現のために使用することができるｐｃＤＮＡ（商標）またはｐｃＤＮＡ３（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ならびにほとんどの哺乳動物細胞において目的のタンパク質の高レベルの一過性の発現のために使用することができるｐＶＡＸまたはｐＶＡＸ−１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられるがこれらに限定されない。任意の市販のＤＮＡプラスミドの骨格を、宿主細胞におけるタンパク質発現を最適にするために、通常の技術および容易に入手可能な出発材料を使用して、例えばある特定のエレメント（例えば、複製開始点および／または抗生物質耐性カセット）の方向を逆転させるように、プラスミドに対して内因性のプロモーター（例えば、抗生物質耐性カセットにおけるプロモーター）を置換するように、および／または転写されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子のコード配列）を置換するように改変することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press(1989)を参照されたい）。
本出願の好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、哺乳動物宿主細胞におけるタンパク質発現にとって適した発現ベクターである。哺乳動物宿主細胞におけるタンパク質発現にとって適した発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ（商標）、ｐｃＤＮＡ３（商標）、ｐＶＡＸ、ｐＶＡＸ−１、ＡＤＶＡＸ、ＮＴＣ８４５４等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはｐＶＡＸ−１に基づくが、これを、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現を最適にするためにさらに改変することができる。ｐＶＡＸ−１は、ＤＮＡワクチンにおいて一般的に使用されるプラスミドであり、強いヒト前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ−ＩＥ）プロモーター、その後に続くウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）由来ポリアデニル化配列（ｐＡ）を含有する。ｐＶＡＸ−１は、細菌プラスミドの繁殖を可能にする小さい原核細胞プロモーターによって駆動されるｐＵＣ複製開始点およびカナマイシン耐性遺伝子をさらに含有する。
本出願の一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一般的に、ウイルスベクターは、非感染性にされているが、それでもなおウイルスプロモーターおよびトランスジーンを含有し、それによってウイルスプロモーターを通してのトランスジーンの翻訳を可能にする、改変ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを保有する遺伝子操作ウイルスである。ウイルスベクターはしばしば、感染性の配列を欠如することから、それらは大規模トランスフェクションのためにはヘルパーウイルスまたはパッケージングラインを必要とする。本出願と共に使用するために適したウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、腸内ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられるがこれらに限定されない。
本出願の実施形態に従って、ベクター、例えばＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターは、ベクターのポリヌクレオチド配列によってコードされるＨＢＶ抗原の複製および発現が挙げられるがこれらに限定されないベクターの通常の機能を確立するために任意の調節エレメントを含み得る。調節エレメントには、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、翻訳終止コドン、リボソーム結合エレメント、転写ターミネーター、選択マーカー、複製開始点等が挙げられるがこれらに限定されない。ベクターは、１つまたは複数の発現カセットを含み得る。「発現カセット」は、細胞機構にＲＮＡおよびタンパク質を作製するよう指示するベクターの一部である。発現カセットは典型的には、３つの構成要素：プロモーター配列、オープンリーディングフレーム、および任意選択でポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンから終止コドンまでの目的のタンパク質（例えば、ＨＢＶ抗原）のコード配列を含有する読み取り枠である。発現カセットの調節エレメントは、目的のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結させることができる。本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、その最も広い妥当な文脈で解釈され、機能的に関連するポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドと機能的関係にある場合に「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、ベクターは、目的のＨＢＶ抗原の発現を制御するために、好ましくは発現カセット内にプロモーター配列を含む。用語「プロモーター」は、その通常の意味で使用され、作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、それが転写するヌクレオチド配列の近くの同じ鎖上に位置する。プロモーターは、構成的、誘導型、または抑制性であり得る。プロモーターは、天然に存在するかまたは合成であり得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む起源に由来し得る。プロモーターは、同種プロモーター（すなわちベクターと同じ遺伝的起源に由来する）または異種プロモーター（すなわち、異なるベクターまたは遺伝的起源に由来する）であり得る。例えば、使用されるベクターが、ＤＮＡプラスミドである場合、プロモーターは、プラスミドに対して内因性であり得るか（同種）、または他の起源に由来し得る（異種）。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内でＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドの上流に位置する。
本出願で使用するために適したプロモーターの例には、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。本出願において使用するために適した追加のプロモーターには、ＲＳＶプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター、ならびに以下のワクシニアウイルスまたはＭＶＡ由来およびＦＰＶ由来プロモーター：３０Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、ＰｒＳプロモーター、ＰｒＨｙｂ、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、Ｐｒ７．５Ｋ、Ｐｒ１３．５長プロモーター、４０Ｋプロモーター、ＭＶＡ−４０Ｋプロモーター、ＦＰＶ ４０Ｋプロモーター、３０ｋプロモーター、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーター、ＰｒＬＥ１プロモーター、およびＰＲ１２３８プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない様々なポックスウイルスプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。追加のプロモーターは、参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１０／０６０６３２号明細書、国際公開第２０１０／１０２８２２号明細書、国際公開第２０１３／１８９６１１号明細書および国際公開第２０１４／０６３８３２号明細書、ならびに国際公開第２０１７／０２１７７６号明細書に詳しく記載されている。
プロモーターはまた、ヒト遺伝子のプロモーター、例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはヒトメタロチオネインのプロモーターであり得る。プロモーターはまた、組織特異的プロモーター、例えば天然または合成の筋特異的または皮膚特異的プロモーターであり得る。
本出願の好ましい実施形態では、プロモーターは、強い真核細胞プロモーター、好ましくはサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ−ＩＥ）プロモーターである。例示的なＣＭＶ−ＩＥプロモーターのヌクレオチド配列を配列番号７に示す。
本出願の別の好ましい実施形態では、プロモーターはポックスウイルスプロモーター、好ましくはＰｒＭＶＡ１３．５長および／またはＰｒＨｙｂから選択されるプロモーターである。例示的なＰｒ１３．５長プロモーターおよびＰｒＨｙｂプロモーターのヌクレオチド配列をそれぞれ、配列番号２５および２６に示す。
一部の実施形態では、ベクターは、発現された転写物を安定化させる、ＲＮＡ転写物の核輸出を増強する、および／または転写−翻訳カップリングを改善する追加のポリヌクレオチド配列を含む。そのような配列の例には、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサー配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、典型的には、ベクターの発現カセット内の目的のタンパク質（例えば、ＨＢＶ抗原）のコード配列の下流に位置する。エンハンサー配列は、転写因子が結合すると、関連する遺伝子の転写を増強する調節性ＤＮＡ配列である。エンハンサー配列は、ベクターの発現カセット内で、好ましくはＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の上流であるが、プロモーター配列の下流に位置する。
本開示を考慮して当業者に公知の任意のポリアデニル化シグナルを使用することができる。例えば、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（例えば、配列番号１６）、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。本出願の好ましい実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルである。例示的なｂＧＨポリアデニル化シグナルのヌクレオチド配列を配列番号９に示す。
本開示を考慮して当業者に公知の任意のエンハンサー配列を使用することができる。例えば、エンハンサー配列は、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはウイルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶ由来のエンハンサーであり得る。特定のエンハンサーの例には、ウッドチャックＨＢＶ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ヒトアポリポタンパク質Ａ１前駆体に由来するイントロン／エクソン配列、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）長末端反復（ＬＴＲ）の非翻訳Ｒ−Ｕ５ドメイン、スプライシングエンハンサー、合成ウサギβ−グロビンイントロン、またはその任意の組合せが挙げられるがこれらに限定されない。本出願の好ましい実施形態では、エンハンサー配列は、ＨＴＬＶ−１ ＬＴＲの非翻訳Ｒ−Ｕ５ドメイン、ウサギβ−グロビンイントロン、およびスプライシングエンハンサーの３つの構成的エレメントの複合配列であり、これを本明細書において「トリプルエンハンサー配列」と呼ぶ。例示的なトリプルエンハンサー配列のヌクレオチド配列を配列番号８に示す。別の例示的なエンハンサー配列は、配列番号１５に示すＡｐｏＡＩ遺伝子断片である。
一部の実施形態では、ベクターは、シグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、シグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列の上流に位置する。シグナルペプチドは、典型的には、タンパク質の局在化を指示し、それが産生される細胞からのタンパク質の分泌を容易にし、ならびに／または抗原発現および抗原提示細胞に対する交差提示を改善する。シグナルペプチドは、ベクターから発現される場合、ＨＢＶ抗原のＮ末端に存在し得るが、細胞からの分泌時にシグナルペプチダーゼによって切断される。シグナルペプチドが切断されている発現されたタンパク質は、しばしば「成熟タンパク質」と呼ばれる。本開示を考慮して当技術分野で公知の任意のシグナルペプチドを使用することができる。例えば、シグナルペプチドは、シスタチンＳシグナルペプチド、免疫グロブリン（Ｉｇ）分泌シグナル、例えばＩｇ重鎖ガンマシグナルペプチドＳＰＩｇＧ、またはＩｇ重鎖イプシロンシグナルペプチドＳＰＩｇＥであり得る。
本出願の好ましい実施形態では、シグナルペプチド配列は、シスタチンＳシグナルペプチドである。シスタチンＳシグナルペプチドの例示的な核酸およびアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号５および６に示す。免疫グロブリン分泌シグナルの例示的な核酸およびアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１０および２７および配列番号１１に示す。
ベクター、例えばＤＮＡプラスミドはまた、細菌複製開始点、ならびに細菌細胞、例えば大腸菌（E. coli）におけるプラスミドの選択および維持のための抗生物質耐性発現カセットも含み得る。細菌の複製開始点および抗生物質耐性カセットは、ベクター内でＨＢＶ抗原をコードする発現カセットと同じ方向に、または反対（逆）方向に位置することができる。複製開始点（ＯＲＩ）は、そこで複製が開始される配列であり、プラスミドが細胞内で再生および生存することを可能にする。本出願で使用するために適したＯＲＩの例には、ＣｏｌＥ１、ｐＭＢ１、ｐＵＣ、ｐＳＣ１０１、Ｒ６Ｋ、および１５Ａ、好ましくはｐＵＣが挙げられるがこれらに限定されない。ｐＵＣ ＯＲＩの例示的なヌクレオチド配列を配列番号２１に示す。
細菌細胞における選択および維持のための発現カセットは典型的には、抗生物質耐性遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。好ましくは、抗生物質耐性遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター配列は、目的のタンパク質、例えばＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列とは異なる。抗生物質耐性遺伝子は、コドン最適化することができ、抗生物質耐性遺伝子の配列組成は通常、細菌、例えば大腸菌（E. coli）のコドン使用に調整される。カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、およびテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔｒ）、ならびにクロラムフェニコール、ブレオマイシン、スペクチノマイシン、カルベニシリン等に対して耐性を付与する遺伝子を含むがこれらに限定されない、本開示を考慮して当業者に公知の任意の抗生物質耐性遺伝子を使用することができる。
本出願の別の好ましい実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターであって、配列番号４と少なくとも９８％同一である、例えば配列番号４と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ ｐｏｌ抗原、および配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原の少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド；５’末端から３’末端に、プロモーター配列、好ましくは配列番号７のＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列、エンハンサー配列、好ましくは配列番号８のトリプルエンハンサー配列または配列番号１５のＡｐｏＡ１エンハンサー配列、およびシグナルペプチド配列、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を有するシスタチンＳシグナルまたは配列番号１１のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分泌シグナルをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された上流の配列；ならびにポリアデニル化シグナル、好ましくは配列番号１６のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたは配列番号９のｂＧＨポリアデニル化シグナルを含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された下流の配列を含む発現カセットを含むウイルスベクターである。
本出願の別の好ましい実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、好ましくはＭＶＡベクターであって、配列番号４と少なくとも９８％同一である、例えば配列番号４と少なくとも９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ ｐｏｌ抗原、および配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原の少なくとも１つをコードするポリヌクレオチド；５’末端から３’末端に、プロモーター配列、好ましくは配列番号２５のＰｒＭＶＡ１３．５長プロモーター配列または配列番号２６のＰｒＨｙｂプロモーター配列、およびシグナルペプチド配列、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を有するシスタチンＳシグナルまたは配列番号１１のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分泌シグナルをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された上流の配列；ならびにポリアデニル化シグナルまたは初期終止シグナルを含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された下流の配列であって、初期終止シグナルが配列番号２８のヌクレオチド配列を有するか、またはポリアデニル化シグナルが、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を有するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルもしくは配列番号９のポリヌクレオチド配列を有するｂＧＨポリアデニル化シグナルから選択され、好ましくはＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された下流の配列が配列番号２８のヌクレオチド配列を有する早期終止シグナルである、下流の配列を含む発現カセットを含むウイルスベクターである。
本出願の一実施形態では、ベクター、例えばウイルスベクターは、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｏｌ抗原をコードする。好ましくは、ベクターは、配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号３と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号３と１００％同一であるＨＢＶ Ｐｏｌ抗原のコード配列を含む。
本出願の別の実施形態では、ベクター、例えばウイルスベクターは、配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする。好ましくは、ベクターは、配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号１と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号１と１００％同一である切断型ＨＢＶコア抗原のコード配列を含む。
本出願のなお別の実施形態では、ベクター、例えばウイルスベクターは、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＢＶ Ｐｏｌ抗原、および配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする。好ましくは、ベクターは、配列番号１と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号１と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号１と９８％、９９％または１００％同一である切断型ＨＢＶコア抗原のコード配列であって、配列番号３と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号３と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号３と９８％、９９％または１００％同一であるＨＢＶ Ｐｏｌ抗原のコード配列に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原のコード配列を含有する融合体のコード配列を含む。好ましくは切断型ＨＢＶコア抗原のコード配列は、配列番号１４と少なくとも９０％同一である、例えば配列番号１４と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％同一である、好ましくは配列番号１４と９８％、９９％または１００％同一であるリンカーのコード配列を介してＨＢＶ Ｐｏｌ抗原のコード配列に作動可能に連結されている。本出願の特定の実施形態では、ベクターは、配列番号３にさらに作動可能に連結された配列番号１４に作動可能に連結された、配列番号１を有する融合体のコード配列を含む。
本出願のＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドおよび発現ベクターは、本開示を考慮して当技術分野で公知の任意の方法によって作製することができる。例えば、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドを、当業者に周知である標準的な分子生物学技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等を使用して発現ベクターに導入または「クローニング」することができる。
アデノウイルス
一態様では、本出願は、抗原性のＨＢＶコア抗原をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスを提供する。別の態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードする異種ヌクレオチド配列を含むアデノウイルスを提供する。別の態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶコア抗原をコードする第１の異種ヌクレオチド配列、および抗原性ＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードする第２の異種ヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスベクターを提供する。別の態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶコア−ＨＢＶ ｐｏｌ融合タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスを提供する。
本出願に従うアデノウイルスは、アデノウイルス科に属し、好ましくはマストアデノウイルス属に属するアデノウイルスである。これはヒトアデノウイルスであり得るが、ウシアデノウイルス（例えば、ウシアデノウイルス３、ＢＡｄＶ３）、イヌアデノウイルス（例えば、ＣＡｄＶ２）、ブタアデノウイルス（例えば、ＰＡｄＶ３または５）、またはシミアンアデノウイルス（サルアデノウイルスおよび類人猿アデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスまたはゴリラアデノウイルスを含む）を含むがこれらに限定されない、他の種に感染するアデノウイルスでもあり得る。好ましくは、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶまたはＡｄＨｕ；本出願では、種を記載せずにＡｄと呼ぶ場合、ヒトアデノウイルスを意味し、例えば簡略表記「Ａｄ５」は、ヒトアデノウイルス血清型５であるＨＡｄＶ５と同じウイルスを意味する）、またはシミアンアデノウイルス、例えばチンパンジーもしくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、またはＳＡｄＶ）である。
ほとんどの先進的な研究はヒトアデノウイルスを使用して実施されており、ヒトアデノウイルスは、本出願のある特定の態様によると好ましい。ある特定の好ましい実施形態では、本出願に従う組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスに基づく。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９、または５０に基づく。本出願の特に好ましい実施形態に従って、アデノウイルスは、血清型２６または３５の１つのヒトアデノウイルスである。
これらの血清型の利点は、ヒト集団における低い血清有病率および／または低い既存の中和抗体力価である。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えばその両方の全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００７／１０４７９２号明細書、およびAbbink et al., (2007) Virol 81 (9): 4654-63に記載されている。Ａｄ２６の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ １５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号明細書（例えば、配列番号１を参照されたい）に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えばその全ての全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７，２７０，８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号明細書、およびVogels et al., (2003) J Virol 77 (15): 8263-71に記載されている。Ａｄ３５の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ＿００００１９および国際公開第００／７００７１号明細書（例えば、図６を参照されたい）に見出される。
シミアンアデノウイルスもまた、一般的に、ヒト集団において低い血清有病率および／または低い既存の中和抗体力価を有し、チンパンジーアデノウイルスベクターを使用してかなりの量の研究が報告されている（例えば、米国特許第６０８３７１６号明細書；国際公開第２００５／０７１０９３号明細書；国際公開第２０１０／０８６１８９号明細書；国際公開第２０１００８５９８４号明細書；Farina et al, 2001, J Virol 75: 11603-13; Cohen et al, 2002, J Gen Virol 83: 151-55; Kobinger et al, 2006, Virology 346: 394-401; Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17；同様にBangari and Mittal, 2006, Vaccine 24: 849-62による総説；およびLasaro and Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39による総説も参照されたい）。したがって、他の好ましい実施形態では、本出願に従う組換えアデノウイルスは、シミアンアデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスに基づく。本出願の一実施形態では、組換えアデノウイルスは、シミアンアデノウイルス１、３、７、８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７．１、２８．１、２９、３０、３１．１、３２、３３、３４、３５．１、３６、３７．２、３９、４０．１、４１．１、４２．１、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０型、またはＳＡ７Ｐに基づく。
アデノウイルスベクターｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５
本出願の好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは、２つのまれな血清型：Ａｄ２６およびＡｄ３５のキャプシドタンパク質を含む。典型的な実施形態では、ベクターは、ｒＡｄ２６またはｒＡｄ３５ウイルスである。
このように、本出願において使用することができるベクターは、Ａｄ２６またはＡｄ３５キャプシドタンパク質（例えば、線維、ペントン、またはヘキソンタンパク質）を含む。当業者は、Ａｄ２６またはＡｄ３５キャプシドタンパク質の全体を本出願のベクターに使用する必要はないことを認識するであろう。このように、Ａｄ２６またはＡｄ３５キャプシドタンパク質の少なくとも一部を含むキメラキャプシドタンパク質を、本出願のベクターに使用することができる。本出願のベクターはまた、少なくとも１つのキャプシドタンパク質がＡｄ２６またはＡｄ３５に由来する限り、線維、ペントン、およびヘキソンタンパク質が各々異なる血清型に由来するキャプシドタンパク質も含み得る。好ましい実施形態では、線維、ペントン、およびヘキソンタンパク質は、各々がＡｄ２６に由来するか、または各々がＡｄ３５に由来する。
当業者は、複数の血清型に由来するエレメントを、単一の組換えアデノウイルスベクターにおいて組み合わせることができることを認識するであろう。このように、異なる血清型からの望ましい特性を組み合わせるキメラアデノウイルスを産生することができる。このように、いくつかの実施形態では、本出願のキメラアデノウイルスは、Ａｄ２６およびＡｄ３５血清型の既存の免疫の非存在を、温度安定性、アセンブリ、接着、産生量、リダイレクトされたまたは改善した感染症、標的細胞におけるＤＮＡの安定性等などの特徴と組み合わせることができる。
本出願の一実施形態では、本出願において有用な組換えアデノウイルスベクターは、Ａｄ３５またはＡｄ２６に主にまたは完全に由来する（すなわち、ベクターはｒＡｄ３５またはｒＡｄ２６である）。一部の実施形態では、アデノウイルスは、例えばゲノムのＥ１領域に欠失を含有することから、複製欠損である。Ａｄ２６またはＡｄ３５に由来する本出願のアデノウイルスに関して、典型的に、アデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列を、ヒト亜群Ｃのアデノウイルス、例えばＡｄ５のＥ４−ｏｒｆ６に置換する。これによって、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現する周知の補完細胞株、例えば２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞等においてそのようなアデノウイルスの繁殖が可能となる（例えば、Havenga et al, 2006, J Gen Virol 87: 2135-43；国際公開第０３／１０４４６７号を参照されたい）。本出願の一実施形態では、アデノウイルスは、その中に抗原をコードする核酸がクローニングされているＥ１領域の欠失、およびＡｄ５のＥ４ ｏｒｆ６領域を有する血清型３５のヒトアデノウイルスである。本出願の一実施形態では、アデノウイルスは、その中に抗原をコードする核酸がクローニングされているＥ１領域の欠失、およびＡｄ５のＥ４ ｏｒｆ６領域を有する血清型２６のヒトアデノウイルスである。Ａｄ３５アデノウイルスの場合、典型的に、アデノウイルスのＥ１Ｂ ５５Ｋオープンリーディングフレームの３’末端、例えばｐＩＸオープンリーディングフレームのすぐ上流の１６６ｂｐまたはこれを含む断片、例えばＢｓｕ３６Ｉ制限部位によって５’末端で印を付けられた、ｐＩＸ開始コドンのすぐ上流の２４３ｂｐ断片を保持するが、その理由は、ｐＩＸ遺伝子のプロモーターが部分的にこの領域に存在することにより、これがアデノウイルスの安定性を増加させるためである（例えば、Havenga et al, 2006、前記；国際公開第２００４／００１０３２号明細書を参照されたい）。
組換えアデノウイルスベクターの調製は、当技術分野で周知である。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば国際公開第２００７／１０４７９２号明細書、およびAbbink et al.,(2007) Virol 81 (9): 4654-63に記載されている。Ａｄ２６の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ １５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号明細書の配列番号１に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えば米国特許第７，２７０，８１１号明細書、およびVogels et al., (2003) J Virol 77(15): 8263-71に記載されている。Ａｄ３５の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ＿００００１９に見出される。
本出願の一実施形態では、本出願において有用なベクターは、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２０１２／０８２９１８号明細書に記載されるベクターを含む。
典型的には、本出願において有用なベクターは、組換えアデノウイルスゲノム全体を含む核酸（例えば、プラスミド、コスミド、またはバキュロウイルスベクター）を使用して産生される。このように、本出願はまた、本出願のアデノウイルスベクターをコードする単離された核酸分子も提供する。本出願の核酸分子は、クローニングによって得たまたは合成によって産生したＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。
本出願において有用なアデノウイルスベクターは、典型的に複製欠損である。これらの実施形態では、ウイルスは、ウイルスの複製にとって極めて重要な領域、例えばＥ１領域の欠失または不活化によって複製欠損にされる。これらの領域は、目的の遺伝子の挿入（通常、プロモーターに連結された）によって実質的に欠失または不活化させることができる。一部の実施形態では、本出願のベクターは、他の領域、例えばＥ２、Ｅ３、もしくはＥ４領域の欠失、またはプロモーターに連結された異種遺伝子の挿入を含有し得る。Ｅ２および／またはＥ４変異アデノウイルスの場合、一般的にＥ２および／またはＥ４補完細胞株を使用して組換えアデノウイルスを生成する。アデノウイルスのＥ３領域の変異は、Ｅ３が複製にとって必要ではないことから、細胞株によって補完される必要はない。
パッケージング細胞株は、典型的に、本出願のアデノウイルスベクターの十分量を産生するために使用される。パッケージング細胞は、複製欠損ベクターにおいて欠失または不活化されている遺伝子を含み、このように細胞においてウイルスを複製させる細胞である。適した細胞株は、例えばＰＥＲ．Ｃ６、９１１、２９３、およびＥ１ Ａ５４９を含む。
上記のように、広く多様なＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原（例えば、ＨＢＶコアおよびＨＢＶポリメラーゼ抗原）を、ベクターにおいて発現させることができる。必要であれば、ＨＢＶ抗原をコードする異種遺伝子をコドン最適化して、処置した宿主（例えば、ヒト）において適切な発現を確保することができる。コドン最適化は、当技術分野で広く適用されている技術である。典型的には、異種遺伝子を、アデノウイルスゲノムのＥ１および／またはＥ３領域にクローニングする。
異種Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子は、アデノウイルス由来プロモーター（例えば、主要後期プロモーター）の制御下であり得る（すなわち、作動可能に連結され得る）か、または異種プロモーターの制御下にあり得る。適した異種プロモーターの例には、ＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶプロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内の目的の異種遺伝子の上流に位置する。
ＭＶＡベクター
本出願にとって有用なＭＶＡベクターは、改変ワクシニアアンカラウイルスに由来する弱毒化ウイルスを利用する。ＭＶＡベクターは、広く多様なＨＢＶ抗原（例えば、ＨＢＶコアおよびＨＢＶポリメラーゼ抗原）を発現する。一態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶコア抗原をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換えＭＶＡベクターを提供する。別の態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換えＭＶＡベクターを提供する。一態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶコア抗原をコードする第１の異種ヌクレオチド配列および抗原性ＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードする第２の異種ヌクレオチド配列を含む組換えＭＶＡベクターを提供する。別の態様では、本出願は、抗原性ＨＢＶコア−ＨＢＶ ｐｏｌ融合タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換えＭＶＡベクターを提供する。
改変ワクシニアウイルスアンカラ（「ＭＶＡ」）
人為的に作製した弱毒化改変ワクシニアウイルスアンカラ（「ＭＶＡ」）を、ワクシニアウイルスアンカラ株（ＣＶＡ）のニワトリ胚線維芽細胞での５１６回の連続継代によって生成した（総論に関しては、Mayr, A.m et al. Infection 3, 6-14 (1975)を参照されたい）。これらの長期間の継代の結果として、得られたＭＶＡウイルスのゲノムはそのゲノム配列の約３１キロベースが欠失しており、したがってトリ細胞に対する高度の宿主細胞複製制限として記載された（Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 031-1038 (1991)）。得られたＭＶＡは、完全な複製コンピテント出発材料と比較して有意に非病原性であったことが、多様な動物モデルにおいて示された（Mayr, A. & Danner, K., Dev. Biol. Stand. 41: 225-34 (1978)）。
本出願の実践において有用なＭＶＡウイルスには、ＭＶＡ−５７２（１９９４年１月２７日にＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７として寄託）、ＭＶＡ−５７５（２０００年１２月７日にＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７として寄託）、ＭＶＡ−Ｉ７２１（Suter et al., Vaccine 2009を参照されたい）、およびＡＣＡＭ３０００（２００３年３月２７日にＡＴＣＣ（登録商標）ＰＴＡ−５０９５として寄託）が挙げられ得るがこれらに限定されない。
より好ましくは、本出願に従って使用されるＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮおよびＭＶＡ−ＢＮの誘導体を含む。ＭＶＡ−ＢＮは、国際ＰＣＴ出願国際公開第０２／０４２４８０号明細書に記載されている。ＭＶＡ−ＢＮの「誘導体」は、本明細書に記載されるＭＶＡ−ＢＮと本質的に同じ複製特徴を示すが、そのゲノムの１つまたは複数の部分に差を示すウイルスを指す。
ＭＶＡ−ＢＮ、ならびにその誘導体は、複製インコンピテントであり、すなわちｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで再生的に複製できないことを意味する。より詳しくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において再生的に複製することが可能であるが、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ（Boukamp et al (1988), J. Cell Biol. 106:761-771）、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ寄託番号９１１１２５０２）、ヒト胎児腎細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ寄託番号８５１２０６０２）、およびヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２）において再生的に複製することが可能ではない。加えて、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体は、Ｈｅｌａ細胞およびＨａＣａＴ細胞株におけるＭＶＡ−５７５より少なくとも２倍小さい、より好ましくは３倍小さいウイルス増幅比を有する。ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体のこれらの特性の試験およびアッセイは、国際公開第０２／４２４８０号明細書（米国特許出願公開第２００３／０２０６９２６号明細書）、および国際公開第０３／０４８１８４号明細書（米国特許出願公開第２００６／０１５９６９９号明細書）に記載されている。
先の段落において記載されたｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト細胞株において、用語「再生的に複製可能ではない」または「再生的に複製不可能」という用語は、例えば上記のように所望の特性を有するＭＶＡを得る方法も教示する国際公開第０２／４２４８０号明細書に記載されている。用語は、国際公開第０２／４２４８０号明細書または米国特許第６，７６１，８９３号明細書に記載のアッセイを使用して感染後４日目にｉｎ ｖｉｔｒｏで１未満のウイルス増幅比を有するウイルスに当てはまる。
用語「再生的に複製できない」は、感染後４日目で先の段落に記載のヒト細胞株においてｉｎ ｖｉｔｒｏで１未満のウイルス増幅比を有するウイルスを指す。国際公開第０２／４２４８０号明細書または米国特許第６，７６１，８９３号明細書に記載のアッセイは、ウイルス増幅比の決定に適用可能である。
先の段落に記載したヒト細胞株におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのウイルスの増幅または複製は、通常、感染細胞から産生されたウイルス（産出量）の、第１の場所で細胞に感染するために当初使用した量（投入量）に対する比として表記され、「増幅比」と呼ばれる。増幅比「１」は、感染細胞から産生されたウイルスの量が、細胞に感染するために当初使用した量と同じ量である感染状態を定義し、感染細胞がウイルス感染および再生を許容することを意味する。これに対し、増幅比１未満、すなわち、投入レベルと比較した産出量の減少は、ウイルスの再生的複製の欠如を示し、したがってウイルスの弱毒化を示す。
ＭＶＡに基づくワクチンの利点は、その安全性プロファイルならびに大規模ワクチン産生の利用能を含む。前臨床試験により、ＭＶＡ−ＢＮが、他のＭＶＡ株（国際公開第０２／４２４８０号明細書）と比較して優れた弱毒化および有効性を証明することが明らかとなった。ＭＶＡ−ＢＮ株の追加の特性は、ＤＮＡ−プライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンと比較した場合にワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンにおいて実質的に同じレベルの免疫を誘導できることである。
組換えＭＶＡ−ＢＮウイルスは、本明細書における最も好ましい実施形態であり、哺乳動物細胞におけるその明白な複製欠損およびその良好に確立された非病原性のために、安全であると考えられる。さらに、その有効性に加えて、工業規模での製造が実現可能であることは有益であり得る。加えて、ＭＶＡに基づくワクチンは、複数の異種抗原を送達することができ、液性および細胞性免疫の同時誘導を可能にする。
本出願にとって有用なＭＶＡベクターは、その関連する開示が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００２／０４２４８０号明細書および国際公開第２００２／２４２２４号明細書に記載の方法などの、当技術分野で公知の方法を使用して調製することができる。
本出願の好ましい実施形態では、ＭＶＡベクターは、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原、およびＨＢＶコア−ＨＢＶ ｐｏｌ融合抗原からなる群から選択される１つまたは複数の抗原性タンパク質をコードする核酸を含む。
ＨＢＶ抗原タンパク質は、ＭＶＡの１つまたは複数の遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入され得る。本出願の一実施形態では、ＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７、およびＩＧＲ１４８／１４９から選択される。本出願の一実施形態では、組換えＭＶＡの５、４、３、または２個未満のＩＧＲが、ＨＢＶコア抗原および／またはＨＢＶ ｐｏｌ抗原の抗原性決定因子をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。異種ヌクレオチド配列は、それに加えてまたはあるいは１つまたは複数の天然に存在する欠失部位、特にＭＶＡゲノムの主要な欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、またはＶＩに挿入され得る。本出願の一実施形態では、組換えＭＶＡの天然に存在する欠失部位の５、４、３、または２個未満が、ＨＢＶコア抗原および／またはＨＢＶ ｐｏｌ抗原の抗原性決定因子をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
ＨＢＶタンパク質の抗原性決定因子をコードする異種ヌクレオチド配列を含むＭＶＡの挿入部位の数は、１、２、３、４、５、６、７個、またはそれより多くであり得る。本出願の一実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、４、３、２個、またはそれより少ない挿入部位に挿入される。好ましくは、２個の挿入部位を使用する。本出願の一実施形態では、３つの挿入部位を使用する。好ましくは、組換えＭＶＡは、２個または３個の導入部位に挿入された少なくとも２、３、４、５、６、または７個の遺伝子を含む。
本明細書に提供する組換えＭＶＡウイルスは、当技術分野で公知の通常の方法によって生成することができる。組換えポックスウイルスを得る方法または外因性のコード配列をポックスウイルスゲノムに挿入する方法は、当業者に周知である。例えば、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、ウェスタンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ増幅技術などの標準的な分子生物学技術に関する方法は、Molecular Cloning, A laboratory Manual (2nd Ed.)（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）に記載され、ならびにウイルスの取り扱いおよび操作に関する技術は、Virology Methods Manual (B.W.J. Mahy et al.(eds.), Academic Press (1996))に記載されている。同様に、ＭＶＡの取り扱い、操作、および遺伝子工学に関する技術およびノウハウは、Molecular Virology: A Practical Approach(A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK (1993)に記載されている（例えば、Chapter 9: Expression of genes by Vaccinia virus vector)）およびCurrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Son, Inc. (1998)（例えば、Chapter 16, Section IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector)を参照されたい）。
本明細書に開示の様々な組換えＭＶＡの生成に関して、種々の方法が適用可能であり得る。ウイルスに挿入されるＤＮＡ配列を、ＭＶＡのＤＮＡの区分と相同なＤＮＡが挿入されている大腸菌（E. coli）プラスミド構築物内に入れることができる。個別に、挿入されるＤＮＡ配列をプロモーターにライゲートすることができる。プロモーター−遺伝子結合は、プロモーター−遺伝子結合が、非必須の座を含有するＭＶＡ ＤＮＡの領域に隣接するＤＮＡ配列と相同なＤＮＡにその両方の末端で隣接するように、プラスミド構築物内に位置することができる。得られたプラスミド構築物を、大腸菌（E. coli）細菌内での繁殖によって増幅し、単離することができる。挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離されたプラスミドを、細胞培養物、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）にトランスフェクトすることができ、同時に培養物をＭＶＡに感染させる。プラスミドにおける相同なＭＶＡ ＤＮＡとウイルスゲノムとの間の組換えは、それぞれ、外来のＤＮＡ配列の存在によって改変されたＭＶＡを生成することができる。
好ましい実施形態に従って、適した細胞培養の細胞、例えばＣＥＦ細胞に、ポックスウイルスを感染させることができる。次に、感染細胞に、外来のまたは異種遺伝子または複数の遺伝子を含む第１のプラスミドベクターを、好ましくはポックスウイルス発現制御エレメントの転写制御下でトランスフェクトさせることができる。上記で説明したように、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスゲノムの選択された部分への外因性の配列の挿入を指示することが可能な配列を含む。任意選択で、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスプロモーターに作動可能に連結されたマーカーおよび／または選択遺伝子を含むカセットも含有する。
適したマーカーまたは選択遺伝子は、例えば緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、または他のマーカーをコードする遺伝子である。選択またはマーカーカセットの使用は、生成された組換えポックスウイルスの同定および単離を単純化する。しかし、組換えポックスウイルスはまた、ＰＣＲ技術によっても同定することができる。次に、さらなる細胞に、上記で得た組換えポックスウイルスを感染させ、第２の外来または異種遺伝子または複数の遺伝子を含む第２のベクターをトランスフェクトさせることができる。念のため、この遺伝子は、ポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入され、第２のベクターもまた、第２の外来遺伝子または複数の遺伝子のポックスウイルスのゲノムへの組み込みを指示するポックスウイルス相同配列が異なる。相同組換えが起こった後、２つまたはそれより多くの外来または異種遺伝子を含む組換えウイルスを単離することができる。追加の外来遺伝子を組換えウイルスに導入する場合、感染およびトランスフェクションステップを、以前の感染ステップにおいて単離された組換えウイルスを使用することによって、およびトランスフェクションのためのさらなる外来遺伝子または複数の遺伝子を含むさらなるベクターを使用することによって、繰り返すことができる。
あるいは、上記の感染およびトランスフェクションステップは互換可能であり、すなわち適した細胞に、最初に外来遺伝子を含むプラスミドベクターをトランスフェクトし、次にポックスウイルスを感染させることができる。さらなる代替法として、各々の外来遺伝子を異なるベクターに導入し、得られた全ての組換えウイルスを細胞に同時感染させ、および全ての外来遺伝子を含む組換え体に関してスクリーニングすることが可能である。第３の代替法は、ＤＮＡゲノムと外来配列とのｉｎ ｖｉｔｒｏでのライゲーション、およびヘルパーウイルスを使用する組換えワクシニアウイルスＤＮＡゲノムの再構成である。第４の代替法は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローニングされたワクシニアウイルスゲノム、例えばＭＶＡと、ワクシニアウイルスゲノムにおける所望の組み込み部位に隣接する配列と相同なＤＮＡ配列が隣接する線形の外来配列との間の大腸菌（E.coli）または他の細菌種における相同組換えである。
異種ＨＢＶ遺伝子（例えば、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原、および／またはＨＢＶコア−ＨＢＶ−ｐｏｌ融合タンパク質）は、１つまたは複数のポックスプロモーターの制御下であり得る（すなわち、作動可能に連結され得る）。本出願の一実施形態では、ポックスウイルスプロモーターは、Ｐｒ７．５プロモーター、ハイブリッド初期／後期プロモーター、またはＰｒＳプロモーター、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、合成もしくは天然の初期または後期プロモーター、または牛痘ウイルスＡＴＩプロモーターである。
組成物、免疫原性組合せ、およびワクチン
本出願はまた、本出願に従う１つまたは複数のＨＢＶ抗原、ポリヌクレオチド、および／または１つまたは複数のＨＢＶ抗原をコードするベクターを含む組成物、免疫原性組合せ、より特にキット、およびワクチンにも関する。本明細書に記載の本出願のＨＢＶ抗原、ポリヌクレオチド（ＲＮＡおよびＤＮＡを含む）、および／またはベクターはいずれも、本出願の組成物、免疫原性組合せまたはキット、およびワクチンにおいて使用することができる。
一般的な態様では、本出願は、配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原、もしくは配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする単離されたもしくは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、単離されたもしくは天然に存在しない核酸分子を含むベクター、および／または単離されたもしくは天然に存在しない核酸分子によってコードされる単離されたもしくは天然に存在しないポリペプチドを含む組成物を提供する。
本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする単離されたまたは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。
本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原をコードする単離されたまたは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。
本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたまたは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）；および配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたまたは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。切断型ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ Ｐｏｌ抗原のコード配列は、同じ単離されたもしくは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、または２つの異なる単離されたもしくは天然に存在しない核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に存在し得る。
本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む。
本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む。
本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクター、および配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む。切断型ＨＢＶコア抗原のコード配列を含むベクターおよびＨＢＶ Ｐｏｌ抗原のコード配列を含むベクターは、同じベクターまたは２つの異なるベクターであり得る。
本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原であって、配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原、またはその逆を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む。好ましくは、融合タンパク質は、切断型ＨＢＶコア抗原をＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に作動可能に連結する、またはその逆に連結するリンカーをさらに含む。好ましくは、リンカーは、アミノ酸配列（ＡｌａＧｌｙ）ｎを有し、式中ｎは２〜５の整数である。
本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列からなる単離されたまたは天然に存在しない切断型ＨＢＶコア抗原を含む。
本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたまたは天然に存在しないＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む。
本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列からなる単離されたまたは天然に存在しない切断型ＨＢＶコア抗原；および配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたまたは天然に存在しないＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を含む。
本出願の一実施形態では、組成物は、配列番号２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原であって、配列番号４と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む、またはその逆を含む、単離されたまたは天然に存在しない融合タンパク質を含む。好ましくは、融合タンパク質は、切断型ＨＢＶコア抗原をＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に作動可能に連結する、またはその逆に連結するリンカーをさらに含む。好ましくは、リンカーは、アミノ酸配列（ＡｌａＧｌｙ）ｎを有し、式中ｎは２〜５の整数である。
別の一般的な態様では、本出願は、本出願の実施形態に従う切断型ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ ｐｏｌ抗原を発現するポリヌクレオチドを含む免疫原性組合せまたはキットにも関する。本明細書に記載の本出願のＨＢＶコアおよびｐｏｌ抗原をコードする任意のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを、本出願の免疫原性組合せまたはキットにおいて使用することができる。
本出願の実施形態に従って、ワクチンの組合せまたはキットにおけるポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドから発現されたＨＢＶ抗原が、同じまたは異なるポリヌクレオチドから発現されたか否かによらず、共に融合されるかまたは個別のタンパク質として産生されるように、連結され得るかまたは個別であり得る。一実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、発現されたタンパク質がまた個別のタンパク質であるが、組み合わせて使用されるように、同じまたは個別の組成物のいずれかとして組み合わせて使用される個別のウイルスベクターに存在する。別の実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドによってコードされるＨＢＶ抗原を、ＨＢＶコア−ｐｏｌ融合抗原が産生されるように、同じウイルスベクターから発現させることができる。任意選択で、コアおよびｐｏｌ抗原を、短いリンカーによって共に結合または融合することができる。あるいは、第１および第２のポリヌクレオチドによってコードされるＨＢＶ抗原は、コアおよびｐｏｌ抗原コード配列の間にリボソーム翻訳スリップ部位（シス−ヒドロラーゼ部位としても知られる）を使用して、単一のベクターから独立して発現させることができる。この戦略によって、個々のコアおよびｐｏｌ抗原が単一のｍＲＮＡ転写物から産生されるバイシストロニック発現ベクターが得られる。そのようなバイシストロニック発現ベクターから産生されるコアおよびｐｏｌ抗原は、ｍＲＮＡ転写物のコード配列の順序づけに応じて、追加のＮ末端またはＣ末端残基を有し得る。この目的のために使用することができるリボソーム翻訳スリップ部位の例には、手足口病ウイルス（ＦＭＤＶ）のＦＡ２翻訳スリップ部位が挙げられるがこれらに限定されない。別の可能性は、第１および第２のポリヌクレオチドによってコードされるＨＢＶ抗原を、２つの個別のベクター、すなわち１つがＨＢＶコア抗原をコードし、１つがＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードするベクターから独立して発現させることができることである。
好ましい実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドは、個別のウイルスベクターに存在する。好ましくは個別のベクターは、同じ組成物に存在する。
本出願の特定の実施形態では、免疫原性組成物またはキットは、配列番号２と少なくとも９０％同一である、好ましくは配列番号２と１００％同一であるアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクター；および配列番号４と少なくとも９８％同一である、好ましくは配列番号４と１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクター、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターを含む。
本出願の１つの特定の実施形態では、第１のベクターは第１のＤＮＡプラスミドであり、第２のベクターは第２のＤＮＡプラスミドである。第１および第２のＤＮＡプラスミドの各々は、複製開始点、好ましくは配列番号２１のｐＵＣ ＯＲＩ、および好ましくは配列番号２２と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチド配列を有するコドン最適化Ｋａｎｒ（カナマイシン耐性）遺伝子を含み、好ましくはｂｌａプロモーター、例えば配列番号２４に示すｂｌａプロモーターの制御下にある抗生物質耐性カセットを含む。第１および第２のＤＮＡプラスミドの各々は、独立してプロモーター配列、エンハンサー配列、および第１のポリヌクレオチド配列または第２のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたシグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つをさらに含む。好ましくは、第１および第２のＤＮＡプラスミドの各々は、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された上流の配列を含み、上流の配列は、５’末端から３’末端に、配列番号７のプロモーター配列、配列番号８のエンハンサー配列、および配列番号６のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。第１および第２のＤＮＡプラスミドの各々はまた、ＨＢＶ抗原のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナル、例えば配列番号９のｂＧＨポリアデニル化シグナルも含み得る。
本出願の１つの特定の実施形態では、第１のベクターは第１のウイルスベクターであり、第２のベクターは第２のウイルスベクターである。好ましくは、第１および第２のウイルスベクターの各々は、アデノウイルスベクター、より好ましくはＡｄ２６またはＡｄ３５ベクターであって、本出願のＨＢＶ ｐｏｌ抗原または切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド；５’末端から３’末端に、プロモーター配列、好ましくは配列番号７のＣＭＶプロモーター配列、エンハンサー配列、好ましくは配列番号１５のＡｐｏＡＩ遺伝子断片配列または配列番号８のトリプルエンハンサー配列、およびシグナルペプチド配列、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を有するシスタチンＳシグナルまたは配列番号１１のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分泌シグナルをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された上流の配列；ならびにポリアデニル化シグナル、好ましくは配列番号１６のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された下流の配列を含む発現カセットを含むアデノウイルスベクターである。
本出願の特定の実施形態では、第１のベクターは第１のウイルスベクターであり、第２のベクターは第２のウイルスベクターである。好ましくは、第１および第２のウイルスベクターの各々は、ＭＶＡベクターであって、本出願のＨＢＶ ｐｏｌ抗原および／または切断型ＨＢＶコア抗原をコードするポリヌクレオチド；５’末端から３’末端に、プロモーター配列、好ましくは配列番号２５のＰｒＭＶＡ１３．５長プロモーター配列または配列番号２６のＰｒＨｙｂプロモーター配列、および好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を有するシスタチンＳシグナルまたは配列番号１１のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分泌シグナルをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された上流の配列；ならびにポリアデニル化シグナルまたは早期終止シグナルを含む、ＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された下流の配列であって、早期終止シグナルが配列番号２８のヌクレオチド配列を有するか、またはポリアデニル化シグナルが、配列番号１６のポリヌクレオチド配列を有するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルもしくは配列番号９のポリヌクレオチド配列を有するｂＧＨポリアデニル化シグナルから選択され、好ましくはＨＢＶ抗原をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された下流の配列が、配列番号２８のヌクレオチド配列を有する早期終止シグナルである、下流の配列を含む発現カセットを含むＭＶＡベクターである。
本出願の一実施形態では、（ａ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を含む第１の組成物であって、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、第１の組成物；および（ｂ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物であって、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活を有しない第２の組成物を含むワクチンの組合せであって、第１の組成物が、免疫応答をプライミングするためにヒト対象に投与され、第２の組成物が、免疫応答をブースティングするためにヒト対象に１回または複数回投与される、ワクチンの組合せを提供する。
本出願の一実施形態では、（ａ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターの免疫学的有効量を含む第１の組成物であって、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、第１の組成物；および（ｂ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物であって、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない第２の組成物を含むワクチンの組合せであって、第１の組成物が、免疫応答をプライミングするためにヒト対象に投与され、第２の組成物が、免疫応答をブースティングするためにヒト対象に１回または複数回投与される、ワクチンの組合せを提供する。
免疫原性組合せが第１のウイルスベクターおよび第２のウイルスベクターを含む本出願のそれらの実施形態では、第１および第２のベクターの各々の量は特に限定されない。例えば第１のウイルスベクターおよび第２のウイルスベクターは、１０：１〜１：１０の重量比、例えば１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０の重量比で存在し得る。好ましくは、第１および第２のウイルスベクターは、１：１の重量比で存在する。
本出願の組成物および免疫原性組合せは、追加のＨＢＶ抗原および／または追加のＨＢＶ抗原もしくはその免疫原性断片をコードする追加のポリヌクレオチドまたはベクターを含み得る。しかし、特定の実施形態では、本出願の組成物および免疫原性組合せは、ある特定の抗原を含まない。
特定の実施形態では、本出願の組成物または免疫原性組合せまたはキットは、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードするポリヌクレオチド配列を含まない。
別の特定の実施形態では、本出願の組成物または免疫原性組合せまたはキットは、ＨＢＶ Ｌタンパク質またはＨＢＶ Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含まない。
本出願のなお別の特定の実施形態では、本出願の組成物または免疫原性組合せは、ＨＢＶエンベロープタンパク質またはＨＢＶエンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含まない。
本出願の組成物および免疫原性組合せはまた、薬学的に許容可能な担体も含み得る。薬学的に許容可能な担体は、非毒性であり、活性成分の有効性を妨害してはならない。薬学的に許容可能な担体は、１つまたは複数の賦形剤、例えば結合剤、崩壊剤、膨張剤、懸濁剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、香味料、甘味料、保存剤、色素、溶解剤、およびコーティングを含み得る。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば筋肉内、皮内、皮下、経口、静脈内、皮下、粘膜内（例えば、腸）、鼻腔内、または腹腔内経路に依存し得る。液体注射可能調製物、例えば懸濁剤および液剤の場合、適した担体および添加剤は、水、グリコール、油、アルコール、保存剤、着色剤等を含む。固体経口調製物、例えば散剤、カプセル剤、カプレット、ゲルキャップおよび錠剤の場合、適した担体および添加剤は、デンプン、砂糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等を含む。鼻腔内スプレー／吸入混合物の場合、水溶液／懸濁液は、適した担体および添加剤として水、グリコール、油、エモリエント、安定剤、湿潤剤、保存剤、芳香剤、着香料等を含み得る。
本出願の組成物および免疫原性組合せは、経口（腸内）投与および非経口注射を含むがこれらに限定されない、投与を容易にするためおよび有効性を改善するために対象への投与にとって適した任意の物質で製剤化することができる。非経口注射は、静脈内注射または注入、皮下注射、皮内注射、および筋肉内注射を含む。本出願の組成物はまた、経粘膜、眼、直腸、長時間作用型埋め込み、舌下投与、門脈循環を迂回する舌の下の口腔粘膜、吸入、または鼻腔内を含む他の投与経路のために製剤化することもできる。
本出願の好ましい実施形態では、本出願の組成物および免疫原性組合せは、非経口注射のために、好ましくは皮下、皮内注射、または筋肉内注射のために製剤化され、より好ましくは筋肉内注射のために製剤化される。
本出願の実施形態に従って、投与のための組成物および免疫原性組合せは、典型的には薬学的に許容可能な担体、例えば水性担体中の緩衝溶液、例えば緩衝食塩水等、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。組成物および免疫原性組合せはまた、ｐＨ調節剤および緩衝剤等の生理的条件を近似するために必要な薬学的に許容可能な物質を含有し得る。典型的な実施形態では、プラスミドＤＮＡを含む本出願の組成物または免疫原性組合せは、薬学的に許容可能な担体としてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含有し得る。プラスミドＤＮＡは、例えば０．５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ、例えば０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、または５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。
本出願の組成物および免疫原性組合せは、当技術分野で周知の方法に従ってワクチン（「免疫原性組成物」とも呼ばれる）として製剤化することができる。そのような組成物は、免疫応答を増強するためのアジュバントを含み得る。製剤における各々の構成要素の最適な比は、本開示を考慮して当業者に周知の技術によって決定することができる。
本出願の一実施形態では、アジュバントは、本出願の組成物または免疫原性組合せに含められるか、または本出願の組成物もしくは免疫原性組合せと同時投与される。アジュバントの使用は、任意選択であり、組成物をワクチン接種目的のために使用する場合、免疫応答をさらに増強し得る。本出願に従う同時投与または組成物に含めるために適したアジュバントは、好ましくはヒトにおいて潜在的に安全で、良好に認容され、および有効であるアジュバントでなければならない。アジュバントは、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＲＩＭ−３等）、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体阻害剤、ＲＩＧ−１阻害剤、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（Ａｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、変異体ＩＲＦ３およびＩＲＦ７遺伝子アジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ａｄｕｒｏ）、ＦＬＴ３Ｌ遺伝子アジュバント、ＩＬ−１２遺伝子アジュバント、およびＩＬ−７−ｈｙＦｃが挙げられるがこれらに限定されない低分子または抗体であり得る。
本出願の実施形態はまた、本出願の組成物および免疫原性組合せを作製する方法にも関する。本出願の実施形態に従って、組成物または免疫原性組合せを産生する方法は、ＨＢＶ抗原をコードする単離されたポリヌクレオチド、ベクター、および／または本出願のポリペプチドを、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体と混合するステップを含む。当業者は、そのような組成物を調製するために使用される通常の技術を熟知している。
免疫応答を誘導／増強する方法
別の一般的な態様では、本出願は、それを必要とする対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、本出願の組成物または免疫原性組成物の免疫学的有効量を投与するステップを含む方法に関する。本明細書に記載の任意の本出願の組成物および免疫原性組合せを、本出願の方法に使用することができる。
本出願は、アデノウイルスベクターと組み合わせたＭＶＡベクターを使用して、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原性タンパク質またはその免疫原性ポリペプチドに対する免疫応答をプライミングおよびブースティングする改善された方法を提供する。
本出願の一般的態様に従って、ヒト対象において免疫応答を増強する方法は：
ａ．ヒト対象に、本出願のアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を含む第１の組成物を投与するステップ；および
ｂ．ヒト対象に、本出願のＭＶＡベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物を投与するステップ
を含み、それによってヒト対象においてＨＢＶ抗原に対する増強された免疫応答を得る。
本出願の別の一般的態様に従って、ヒト対象において免疫応答を増強する方法は：
ａ．ヒト対象に、本出願のＭＶＡベクターの免疫学的有効量を含む第１の組成物を投与するステップ；および
ｂ．ヒト対象に、本出願のアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物を投与するステップ；
を含み、それによってヒト対象においてＨＢＶ抗原に対する増強された免疫応答を得る。
本出願の別の一般的な態様に従って、ヒト対象において免疫応答を増強する方法は：
ａ．ヒト対象に、本出願のＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む第１の天然に存在しない核酸を含む第１のプラスミドの免疫学的有効量、および本出願の切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む第２の天然に存在しない核酸を含む第２のプラスミドの免疫学的有効量を含む第１の組成物を投与するステップ；ならびに
ｂ．ヒト対象に、本出願のＭＶＡベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物を投与するステップ
を含み、それによってヒト対象においてＨＢＶ抗原に対する増強された免疫応答を得る。
本出願の別の一般的態様に従って、ヒト対象において免疫応答を誘導する方法は：
ａ．ヒト対象に、本出願のＭＶＡベクターの免疫学的有効量を含む第１の組成物を投与するステップ；および
ｂ．ヒト対象に、本出願のＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む第１の天然に存在しない核酸を含む第１のプラスミドの免疫学的有効量、および本出願の切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む第２の天然に存在しない核酸を含む第２のプラスミドの免疫学的有効量を含む第２の組成物を投与するステップ；
を含み、それによってヒト対象においてＨＢＶ抗原に対する増強された免疫応答を得る。
第１の組成物は、免疫応答をプライミングするためにそれを必要とするヒト対象に投与され、第２の組成物は、免疫応答をブースティングするためにそれを必要とするヒト対象に投与される。免疫応答のプライミングおよびブースティングは、例えば免疫応答を増強することができる。
本出願の実施形態に従って、増強された免疫応答は、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原性タンパク質に対する増強された抗体応答を含む。
好ましくは、増強された免疫応答は、ヒト対象においてＨＢＶ抗原性タンパク質に対する増強されたＣＤ４＋応答または増強されたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答をさらに含む。本出願の実施形態に従う方法によって生成された増強されたＣＤ４＋ Ｔ細胞応答は、例えばＨＢＶ抗原性タンパク質に対する支配的なＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の増加もしくは誘導、および／またはヒト対象におけるＨＢＶ抗原性タンパク質に対する特異的な多機能性ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増加もしくは誘導であり得る。多機能性ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、１つより多くのサイトカイン、例えばＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−アルファの２つまたはそれより多くを発現する。本出願の実施形態に従う方法によって生成された増強されたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、例えば、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原性タンパク質に対して特異的な多機能性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増加または誘導であり得る。
より好ましくは、本出願の実施形態に従う方法に起因する増強された免疫応答は、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原性タンパク質に対する増強されたＣＤ４＋ Ｔ細胞応答、増強された抗体応答、および増強されたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を含む。
本明細書で使用される場合、用語「感染症」は、病原体による宿主の侵入を指す。病原体は、それが宿主に侵入することが可能で、宿主内で複製または繁殖することが可能である場合、「感染性」であると考えられる。感染性作用剤の例には、ウイルス、例えばＨＢＶおよびある特定の種のアデノウイルス、プリオン、細菌、真菌、原虫等が挙げられる。「ＨＢＶ感染症」は、具体的には、ＨＢＶによる宿主生物、例えば宿主生物の細胞および組織の侵入を指す。
本出願の実施形態に従って、語句「免疫応答を誘導する」は、本明細書に記載の方法に関連して使用する場合、それを必要とする対象において、ＨＢＶまたはＨＢＶ感染症に対して所望の免疫応答または効果を引き起こすことを包含する。「免疫応答を誘導する」はまた、病原体、すなわちＨＢＶに対して処置するために治療免疫を提供することも包含する。本明細書で使用される場合、用語「治療免疫」または「治療的免疫応答」は、ワクチン接種したＨＢＶ感染対象が、それに対するワクチン接種を行った病原体、すなわちＨＢＶによる感染症を制御することができることを意味する。一実施形態では、「免疫応答を誘導する」は、それを必要とする対象において免疫を生じること、例えばＨＢＶ感染症等の疾患に対する治療効果を提供することを意味する。ある特定の実施形態では、「免疫応答を誘導する」は、ＨＢＶ感染症に対する細胞性免疫、例えばＴ細胞応答を引き起こすまたは改善することを指す。本出願の一実施形態では、「免疫応答を誘導する」は、ＨＢＶに対する細胞性免疫、例えばＴ細胞応答を引き起こすまたは改善することを指す。本出願の一実施形態では、「免疫応答を誘導する」は、ＨＢＶに対する液性免疫応答を引き起こすまたは改善することを指す。本出願の一実施形態では、「免疫応答を誘導する」は、ＨＢＶに対する細胞性および液性免疫応答を引き起こすまたは改善することを指す。
典型的には、本出願の実施形態に従う組成物および免疫原性組合せの投与は、ＨＢＶ感染症またはＨＢＶ感染症に特徴的な症状の発症後にＨＢＶに対する免疫応答を生成する治療目的、すなわち治療的ワクチン接種を有する。
本明細書で使用される場合、「免疫原性有効量」または「免疫学的有効量」は、それを必要とする対象において所望の免疫効果または免疫応答を誘導するために十分な組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または抗原の量を意味する。一実施形態では、免疫学的有効量は、それを必要とする対象において免疫応答を誘導するために十分である量を意味する。別の実施形態では、免疫学的有効量は、それを必要とする対象において免疫を生じるために、例えばＨＢＶ感染症などの疾患に対する治療効果を提供するために十分な量を意味する。免疫学的有効量は、多様な要因、例えば対象の身体条件、年齢、体重、健康等；特定の応用、例えば保護免疫または治療免疫を提供すること；およびそれに対する免疫が望ましい特定の疾患、例えばウイルス感染症に応じて変化し得る。免疫学的有効量は、本開示を考慮して当業者によって容易に決定することができる。
本出願の特定の実施形態では、免疫学的有効量は、以下の効果の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くを達成するために十分である組成物または免疫原性組合せの量を指す：（ｉ）ＨＢＶ感染症またはそれに関連する症状の重症度を低減または改善すること；（ｉｉ）ＨＢＶ感染症またはそれに関連する症状の持続を低減させること；（ｉｉｉ）ＨＢＶ感染症またはそれに関連する症状の進行を防止すること；（ｉｖ）ＨＢＶ感染症またはそれに関連する症状の退行を引き起こすこと；（ｖ）ＨＢＶ感染症またはそれに関連する症状の発生または発症を防止すること；（ｖｉ）ＨＢＶ感染症またはそれに関連する症状の再発を防止すること；（ｖｉｉ）ＨＢＶ感染症を有する対象の入院を低減させること；（ｖｉｉｉ）ＨＢＶ感染症を有する対象の入院期間を低減させること；（ｉｘ）ＨＢＶ感染症を有する対象の生存を増加させること；（ｘ）対象におけるＨＢＶ感染症を排除すること；（ｘｉ）対象におけるＨＢＶ複製を阻害または低減させること；ならびに／または（ｘｉｉ）別の治療の予防効果または治療効果を増強または改善すること。
他の特定の実施形態では、免疫学的有効量は、臨床的セロコンバージョンへの進展と整合するまでＨＢｓＡｇレベルを低減させるために；対象の免疫系による感染した肝細胞の低減に関連する持続的なＨＢｓＡｇクリアランスを達成するために；ＨＢＶ抗原特異的活性化Ｔ細胞集団を誘導するために；および／または１２ヶ月以内のＨＢｓＡｇの持続的喪失を達成するために十分な量でもある。目標とする指標の例は、５００コピーのＨＢｓＡｇ、ＩＵの閾値より下のより低いＨＢｓＡｇおよび／またはより高いＣＤ８数を含む。
一般的な指針として、ウイルスベクターに関連して使用する場合の免疫学的有効量は、ウイルス粒子約１×１０７個／用量〜ウイルス粒子約１×１０１２個／用量の範囲であり得る。免疫学的有効量は、ウイルス粒子約１×１０１０、約２×１０１０、約３×１０１０、約４×１０１０、約５×１０１０、約６×１０１０、約７×１０１０、約８×１０１０、約９×１０１０、約１×１０１１、約２×１０１１、約３×１０１１、約４×１０１１、約５×１０１１、または約１×１０１２個／用量であり得る。免疫学的有効量は、１つのベクターまたは複数のベクターに由来し得る。免疫学的有効量は、単一の組成物で、または複数の組成物で、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の組成物（例えば、錠剤、カプセル剤、または注射剤）で投与することができ、複数のカプセル剤または注射剤の投与は、集合的に対象に免疫学的有効量を提供する。同様に、いわゆるプライム−ブーストレジメンにおいて、対象に免疫学的有効量を投与し、その後同じ対象に免疫学的有効量の別の用量を投与することが可能である。プライム−ブーストレジメンのこの一般的な考え方は、ワクチンの分野の当業者に周知である。さらなるブースター投与を、必要に応じて任意選択でレジメンに追加することができる。
本出願の実施形態に従って、２つのウイルスベクター、例えばＨＢＶコア抗原をコードする第１のウイルスベクターおよびＨＢＶ ｐｏｌ抗原をコードする第２のウイルスベクターを含む免疫原性組合せを、両方のウイルスベクターを混合するステップおよび混合物を単一の解剖学的部位に送達するステップによって、対象に投与することができる。あるいは、各々が単一の発現ベクターを送達する２つの個別の免疫を実施することができる。そのような実施形態では、両方のウイルスベクターを２つの個別の免疫の混合物として単一の免疫として投与するかによらず、第１のウイルスベクターおよび第２のウイルスベクターを、１０：１〜１：１０の重量比で、例えば１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０の重量比で投与することができる。好ましくは、第１および第２のウイルスベクターは、１：１の重量比で投与される。
一部の実施形態では、本出願の方法に従って処置される対象は、ＨＢＶ感染対象、特に慢性ＨＢＶ感染症を有する対象である。急性ＨＢＶ感染症は、生得の免疫系の効率的な活性化がその後の広い適応性の応答（例えば、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞、中和抗体）によって補完されることによって特徴付けられ、これは通常、感染した肝細胞の複製の抑制または除去の成功をもたらす。これに対し、そのような応答は、ウイルス負荷および抗原負荷が高い場合には損なわれるかまたは減損し、例えばＨＢＶエンベロープタンパク質が大量に産生され、感染性ウイルスに対して１，０００倍過剰量でサブウイルス粒子として放出され得る。
慢性ＨＢＶ感染症は、ウイルス量、肝酵素レベル（壊死炎症活性）、ＨＢｅＡｇ、またはＨＢｓＡｇ量、またはこれらの抗原に対する抗体の存在によって特徴付けられる語句として記載される。ｃｃｃＤＮＡレベルは、およそ１０〜５０コピー／細胞で比較的一定のままであるが、ウイルス血症はかなり多様であり得る。ｃｃｃＤＮＡ種の持続は慢性化をもたらす。より詳しくは、慢性ＨＢＶ感染症のフェーズは：（ｉ）高いウイルス量および正常またはわずかに上昇した肝酵素によって特徴付けられる免疫寛容フェーズ；（ｉｉ）肝酵素の有意な上昇を伴うウイルス複製レベルの低下または減少が観察される免疫活性化ＨＢｅＡｇ陽性フェーズ；（ｉｉｉ）血清中の低いウイルス量および正常な肝酵素レベルを伴う低い複製状態の後にＨＢｅＡｇセロコンバージョンが起こり得る不活性なＨＢｓＡｇキャリアフェーズ；および（ｉｖ）ウイルス複製が周期的に起こり（再活性化）、肝酵素レベルの同時の変動、プレコアおよび／または基礎コアプロモーターの変異が一般的であり、ＨＢｅＡｇが感染細胞によって産生されないＨＢｅＡｇ陰性フェーズを含む。
本明細書で使用される場合、「慢性ＨＢＶ感染症」は、６ヶ月より長いＨＢＶの検出可能な存在を有する対象を指す。慢性ＨＢＶ感染症を有する対象は、慢性ＨＢＶ感染症のいずれかのフェーズにあり得る。好ましい実施形態では、本明細書で呼ぶ慢性ＨＢＶ感染症は、米国疾病予防管理センター（ＣＤＣ）によって公表された定義に従い、それに従って慢性ＨＢＶ感染症を以下の臨床基準によって特徴付ける：（ｉ）Ｂ型肝炎コア抗原に対するＩｇＭ抗体（ＩｇＭ抗ＨＢｃ）陰性およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）陽性、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）陽性、もしくはＢ型肝炎ウイルスＤＮＡに関する核酸試験陽性、または（ｉｉ）ＨＢｓＡｇもしくはＨＢＶ ＤＮＡの核酸試験陽性、または少なくとも６ヶ月間空けて２回のＨＢｅＡｇ陽性。
特定の実施形態に従って、免疫原性有効量は、慢性ＨＢＶ感染症を処置するために十分である組成物または免疫原性組合せの量を指す。
一部の実施形態では、慢性ＨＢＶ感染症を有する対象は、ヌクレオシドアナログ（ＮＵＣ）処置を受けており、ＮＵＣ抑制されている。本明細書で使用される場合、「ＮＵＣ抑制」は、ＨＢＶの検出不能なウイルスレベルおよび安定なアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを少なくとも６ヶ月間有する対象を指す。ヌクレオシド／ヌクレオチドアナログ処置の例は、ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤、例えばエンタカビルおよびテノフォビルを含む。好ましくは、慢性ＨＢＶ感染症を有する対象は、進行した肝線維症または肝硬変を有しない。そのような対象は典型的に、ＭＥＴＡＶＩＲスコア３未満および９ｋＰａ未満のフィブロスキャン結果を有するであろう。ＭＥＴＡＶＩＲスコアは、Ｂ型肝炎患者の肝生検における組織病理学的評価によって炎症および線維症の程度を評価するために一般的に使用される採点システムである。採点システムは、２つの標準化された数字：炎症の程度を反映する数字、および線維症の程度を反映する数字を割付する。
慢性ＨＢＶの排除または低減は、ウイルス性肝硬変および肝細胞癌を含む重度の肝疾患の早期の疾患の妨害を可能にし得ると考えられている。このように、本出願の方法はまた、ＨＢＶ誘導疾患を処置するための治療としても使用することができる。ＨＢＶ誘導疾患の例には、肝硬変、がん（例えば、肝細胞癌）、および線維症、特にＭＥＴＡＶＩＲスコアが３またはそれより高いことによって特徴付けられる進行線維症が挙げられるがこれらに限定されない。そのような実施形態では、免疫原性有効量は、１２ヶ月以内のＨＢｓＡｇの持続的な喪失および臨床疾患（例えば、肝硬変、肝細胞癌等）の有意な減少を達成するために十分な量である。
本出願の実施形態に従う方法は、それを必要とする対象に、本出願の組成物と組み合わせて別の免疫原性剤（例えば、別のＨＢＶ抗原または他の抗原）または別の抗ＨＢＶ剤（例えば、ヌクレオシドアナログまたは他の抗ＨＢＶ剤）投与するステップをさらに含む。
送達方法
本出願の組成物および免疫原性組合せは、非経口投与（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、または皮内注射）、経口投与、経皮投与、および鼻腔内投与を含むがこれらに限定されない、本開示を考慮して当業者に公知の任意の方法によって対象に投与することができる。好ましくは、組成物および免疫原性組合せは、非経口（例えば、筋肉内注射または皮内注射によって）、または経皮投与される。
組成物または免疫原性組合せが１つまたは複数のウイルスベクターを含む本出願の一部の実施形態では、投与は皮膚を通しての注射、例えば筋肉内または皮内注射、好ましくは筋肉内注射であり得る。筋肉内注射は、電気穿孔、すなわちＤＮＡプラスミドの細胞への送達を容易にするための電場の印加と組み合わせることができる。本明細書で使用される場合、用語「電気穿孔」は、生体膜において顕微鏡的経路（孔）を誘導するために膜内外で電場パルスを使用することを指す。Ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔の間、適切な大きさおよび持続の電場を細胞に印加し、細胞膜透過性が一過性に増強された状態を誘導し、このようにして単独では細胞膜を通過することができない分子の細胞取り込みを可能にする。電気穿孔によるそのような孔の作製は、細胞膜の１つの側から他方の側への生体分子、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物等の通過を容易にする。ＤＮＡワクチンを送達するためのＩｎ ｖｉｖｏ電気穿孔は、宿主細胞によるプラスミド取り込みを有意に増加させることが示されているが、注射部位で軽度から中等度の炎症ももたらす。その結果、皮内または筋肉内電気穿孔では、通常の注射と比較するとトランスフェクション効率および免疫応答が有意に改善される（例えば、それぞれ最大１，０００倍および１００倍）。
典型的な実施形態では、電気穿孔は、筋肉内注射と組み合わせる。しかし、電気穿孔を非経口投与の他の形態、例えば皮内注射、皮下注射等と組み合わせることも可能である。
本出願の組成物、免疫原性組合せ、またはワクチンの電気穿孔による投与は、可逆的な孔を細胞膜に形成させるために有効なエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔デバイスを使用して達成することができる。電気穿孔デバイスは、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含み得る。電気穿孔構成要素は、電気穿孔デバイスの以下の構成要素の１つまたは複数を含み得る：コントローラー、電流波形ジェネレーター、インピーダンステスター、波形ロガー、インプットエレメント、ステータス報告エレメント、接続口、メモリー構成要素、電源、および電源スイッチ。電気穿孔は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔デバイスを使用して達成することができる。本出願の組成物および免疫原性組合せ、特にＤＮＡプラスミドを含むものの送達を容易にすることができる電気穿孔デバイスおよび電気穿孔方法の例は、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ、ＰＡ）、Ｅｌｇｅｎエレクトロポレーター（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）Ｔｒｉ−Ｇｒｉｄ（商標）送達システム（Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１）、ならびにその全ての全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７，６６４，５４５号明細書、米国特許第８，２０９，００６号明細書、米国特許第９，４５２，２８５号明細書、米国特許第５，２７３，５２５号明細書、米国特許第６，１１０，１６１号明細書、米国特許第６，２６１，２８１号明細書、米国特許第６，９５８，０６０号明細書、および米国特許第６，９３９，８６２号明細書、米国特許第７，３２８，０６４号明細書、米国特許第６，０４１，２５２号明細書、米国特許第５，８７３，８４９号明細書、米国特許第６，２７８，８９５号明細書、米国特許第６，３１９，９０１号明細書、米国特許第６，９１２，４１７号明細書、米国特許第８，１８７，２４９号明細書、米国特許第９，３６４，６６４号明細書、米国特許第９，８０２，０３５号明細書、米国特許第６，１１７，６６０号明細書、および国際特許出願国際公開第２０１７１７２８３８号明細書に記載されるものを含む。同様に、本出願の組成物および免疫原性組合せを送達するための応用によって企図されるのは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，６９７，６６９号明細書に記載されるパルス電場の使用である。
組成物または免疫原性組合せが１つまたは複数のＤＮＡプラスミドを含む本出願の他の実施形態では、投与方法は経皮である。経皮投与は、ＤＮＡプラスミドの細胞への送達を容易にするために表皮アブレーションと組み合わせることができる。例えば、表皮アブレーションのために皮膚パッチを使用することができる。皮膚パッチを除去すると、組成物または免疫原性組合せが剥削された皮膚に堆積することができる。
送達方法は、上記の実施形態に限定されず、細胞内送達のための任意の手段を使用することができる。本出願の方法によって企図される他の細胞内送達方法には、リポソーム封入、ナノ粒子等が挙げられるがこれらに限定されない。
アジュバント
本出願の一部の実施形態では、ＨＢＶに対する免疫応答を誘導する方法は、アジュバントを投与するステップをさらに含む。用語「アジュバント」および「免疫刺激剤」は、本明細書において互換的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質として定義される。この文脈において、アジュバントは、本出願のＨＢＶ抗原および抗原性ＨＢＶポリペプチドに対する免疫応答を増強するために使用される。
本出願の実施形態に従って、アジュバントは、本出願の免疫原性組合せもしくは組成物に存在し得るか、または個別の組成物で投与することができる。アジュバントは、例えば低分子または抗体であり得る。本出願で使用するために適したアジュバントの例には、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＲＩＭ−３等）、ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体阻害剤、ＲＩＧ−１阻害剤、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（Ａｌｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、変異体ＩＲＦ３およびＩＲＦ７遺伝子アジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト（Ａｄｕｒｏ）、ＦＬＴ３Ｌ遺伝子アジュバント、ＩＬ−１２遺伝子アジュバント、およびＩＬ−７−ｈｙＦｃが挙げられるがこれらに限定されない。
本出願の組成物および免疫原性組合せはまた、少なくとも１つの他の抗ＨＢＶ剤と組み合わせて投与することもできる。本出願と共に使用するために適した抗ＨＢＶ剤の例には、低分子、抗体、および／またはキャプシド阻害剤として機能するＣＡＲ−Ｔ治療、ＴＬＲ阻害剤、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤、ＨＢＶポリメラーゼ阻害剤（例えば、エンテカビルおよびテノフォビル）、および／または免疫チェックポイント阻害剤等が挙げられるがこれらに限定されない。そのような抗ＨＢＶ剤は、本出願の組成物および免疫原性組合せと同時にまたは連続的に投与することができる。
プライム／ブースト免疫方法
本出願の実施形態はまた、いわゆるプライム−ブーストレジメンで、組成物または免疫原性組合せの免疫学的有効量を対象に投与するステップ、およびその後に同じ対象に組成物または免疫原性組合せの免疫学的有効量の別の用量を投与するステップも企図する。このように、一実施形態では、本出願の組成物または免疫原性組合せは、免疫応答をプライミングするために使用されるプライマーワクチンである。別の実施形態では、本出願の組成物または免疫原性組合せは、免疫応答をブーストするために使用されるブースターワクチンである。本出願の実施形態に従うプライミングおよびブースティングワクチンは、本明細書に記載の本出願の方法において使用することができる。プライム−ブーストレジメンのこの一般的な考え方は、ワクチン技術分野の当業者に周知である。本明細書に記載の本出願の組成物および免疫原性組合せのいずれも、ＨＢＶに対する免疫応答をプライミングおよび／またはブースティングするためのプライムおよび／またはブーストワクチンとして使用することができる。
本出願の実施形態に従って、本出願の組成物または免疫原性組合せは、免疫をプライミングするために少なくとも１回投与することができる。組成物または免疫原性組合せは、免疫をブースティングするために再投与することができる。組成物またはワクチン組合せのさらなるブースター投与を、任意選択で必要に応じてレジメンに追加することができる。アジュバントは、免疫をブースティングするために使用される本出願の組成物に存在することができ、ブースティング免疫のために本出願の組成物または免疫原性組合せと共に投与される個別の組成物に存在することができ、またはブースティング免疫として単独で投与することができる。アジュバントがレジメンに含まれるそれらの実施形態では、アジュバントは、好ましくは免疫をブースティングするため使用される。
プライム−ブーストレジメンの例および非制限的な例は、免疫応答をプライミングするために、対象に本出願の組成物または免疫原性組合せの免疫学的有効量の１回用量を投与するステップ、およびその後に免疫応答をブースティングするために、本出願の組成物または免疫原性組合せの免疫学的有効量の別の用量を投与するステップを含み、ブースティング免疫は、プライミング免疫を初めて投与した約１〜１２（１〜１２）週間後、約２〜１２（２〜１２）週間後、約２〜１０（２〜１０）週間後、約２〜６（２〜６）週間後、好ましくは約４週間後に初めて投与され、好ましくはプライミング免疫を初めて投与した約８週間後に初めて投与される。本出願の一実施形態では、ブースティング免疫は、プライミング免疫の少なくとも１週間後に投与される。本出願の一実施形態では、ブースティング免疫は、プライミング免疫の少なくとも２週間後に投与される。任意選択で、プライミング免疫を最初に投与した１０〜１４週間後、好ましくは１２週間後に、組成物または免疫原性組合せまたは他のアジュバントのさらなるブースティング免疫を投与する。
キット
本出願はまた、本出願の免疫原性組合せを含むキットも提供する。キットは、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを個別の組成物中に含むことができ、またはキットは、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを単一の組成物中に含むことができる。キットはさらに、１つまたは複数のアジュバントまたは免疫刺激剤、および／または他の抗ＨＢＶ剤を含み得る。
動物またはヒト生物において投与時に抗ＨＢＶ免疫応答を誘導または刺激する能力は、当技術分野で標準的な多様なアッセイを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで評価することができる。免疫応答の開始および活性化を評価するために利用することができる技術の一般的な説明に関しては、例えばＣｏｌｉｇａｎら（1992 and 1994, Current Protocols in Immunology; ed. J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health）を参照されたい。細胞性免疫の測定は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞に由来する細胞を含む活性化エフェクター細胞によって分泌されるサイトカインプロファイルの測定（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴによるＩＬ−１０またはＩＦＮガンマ産生細胞の定量）によって、免疫エフェクター細胞の活性化状態の決定によって（例えば、古典的な［３Ｈ］チミジン取り込みによるＴ細胞増殖アッセイ）、または感作された対象における抗原特異的Ｔリンパ球に関してアッセイすることによって（例えば、細胞傷害性アッセイにおけるペプチド特異的溶解等）実施することができる。
細胞性および／または液性応答を刺激する能力は、抗体結合および／または結合の競合によって決定することができる（例えば、Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Pressを参照されたい）。例えば、免疫原を提供する組成物の投与に応答して産生される抗体の力価を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。免疫応答はまた、ウイルスの中和が、特異的抗体によるウイルスの反応／阻害／中和を通しての感染性の喪失として定義される中和抗体アッセイによっても測定することができる。免疫応答はさらに、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）アッセイによって測定することができる。
実施形態
本出願は、以下の非制限的な実施形態も提供する。
実施形態１は、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む天然に存在しない核酸分子を含む改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターである。
実施形態２は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、実施形態１に記載のＭＶＡベクターである。
実施形態３は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、実施形態１または２に記載のＭＶＡベクターである。
実施形態４は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターである。
実施形態５は、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターである。
実施形態６は、シグナル配列が、配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を含み、好ましくはシグナル配列が、配列番号５または配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態５に記載のＭＶＡベクターである。
実施形態７は、第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３と少なくとも９０％同一である、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターである。
実施形態８は、第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態７に記載のＭＶＡベクターである。
実施形態９は、配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターである。
実施形態１０は、第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９０％同一である、実施形態９に記載のＭＶＡベクターである。
実施形態１１は、第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１０に記載のＭＶＡベクターである。
実施形態１２は、第２のポリヌクレオチド配列が、切断型ＨＢＶコア抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態９〜１１のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターである。
実施形態１３は、シグナル配列が、配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を含み、好ましくはシグナル配列が、配列番号５または配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１２に記載のＭＶＡベクターである。
実施形態１４は、第１および第２のポリヌクレオチド配列が、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする、実施形態９〜１３のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターである。
実施形態１５は、融合タンパク質が、リンカーを介してＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む、実施形態１４に記載のＭＶＡベクターである。
実施形態１６は、リンカーがアミノ酸配列（ＡｌａＧｌｙ）ｎを含み、ｎが２〜５の整数であり、好ましくは、リンカーが配列番号１４を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１５に記載のＭＶＡベクターである。
実施形態１７は、融合タンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、実施形態１６に記載のＭＶＡベクターである。
実施形態１８は、融合タンパク質がシグナル配列をさらに含み、好ましくは、シグナル配列が配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、シグナル配列が配列番号５または配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１４〜１７のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターである。
実施形態１９は、少なくとも１つのプロモーター配列、任意選択で１つまたは複数の追加の調節配列をさらに含み、好ましくは少なくとも１つのプロモーター配列が、配列番号２５および／または配列番号２６のポリヌクレオチド配列を含み、ならびに追加の調節配列が、配列番号８または配列番号１５のエンハンサー配列、および配列番号９または配列番号１６のポリアデニル化シグナルからなる群から選択される、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターである。
実施形態２０は、天然に存在しない核酸分子が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原をコードしない、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターである。
実施形態２１は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む第１の天然に存在しない核酸分子であって、第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号６のアミノ酸配列を含むシグナル配列をさらにコードし、および第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号２６のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列をさらに含む第１の天然に存在しない核酸分子、ならびに配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む第２の天然に存在しない核酸分子であって、第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１１のアミノ酸配列を含むシグナル配列をさらにコードし、および第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号２５のポリヌクレオチド配列を含むプロモーター配列をさらに含む第２の天然に存在しない核酸分子を含むＭＶＡベクターである。
実施形態２２は、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物である。
実施形態２３は、ヒト対象における免疫応答を増強する方法であって、（ａ）ヒト対象に、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む天然に存在しない核酸分子を含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を含む第１の組成物を投与するステップ；および（ｂ）ヒト対象に、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物を投与するステップを含み、それによってヒト対象においてＨＢＶ抗原に対する増強された免疫応答を得る方法である。
実施形態２４は、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、実施形態２３に記載の方法である。
実施形態２５は、第１の組成物が免疫応答をプライミングするためであり、第２の組成物が免疫応答をブースティングするためである、実施形態２３または２４に記載の方法である。
実施形態２６は、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において、少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、実施形態２３〜２５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７は、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態２３〜２６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８は、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態２３〜２７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２９は、シグナル配列が、配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を含み、好ましくはシグナル配列が、配列番号５または配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態２８に記載の方法である。
実施形態３０は、第１の組成物の第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号１９と少なくとも９０％同一である、実施形態２３〜２９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１は、第１の組成物の第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号１９のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態３０に記載の方法である。
実施形態３２は、第１の組成物におけるアデノウイルスの核酸分子が、配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態２３〜３１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３３は、第１の組成物の第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１７と少なくとも９０％同一である、実施形態３２に記載の方法である。
実施形態３４は、第１の組成物の第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態３３に記載の方法である。
実施形態３５は、第１の組成物の第１および第２のポリヌクレオチド配列が、ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする、実施形態３２〜３４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３６は、第１の組成物の融合タンパク質が、リンカーを介してＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された切断型ＨＢＶコア抗原を含む、実施形態３５に記載の方法である。
実施形態３７は、第１の組成物のリンカーが、アミノ酸配列（ＡｌａＧｌｙ）ｎを含み、ｎが２〜５の整数であり、好ましくはリンカーが、配列番号１４を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３６に記載の方法である。
実施形態３８は、第１の組成物の融合タンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、実施形態３７に記載の方法である。
実施形態３９は、第１の組成物の融合タンパク質が、シグナル配列をさらに含み、好ましくは、シグナル配列が配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を含み、より好ましくはシグナル配列が、配列番号５または配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３５〜３８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４０は、第１の組成物の天然に存在しない核酸分子が、プロモーター配列、任意選択で１つまたは複数の追加の調節配列をさらに含み、好ましくはプロモーター配列が、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含み、ならびに追加の調節配列が、配列番号８または配列番号１５のエンハンサー配列および配列番号１６のポリアデニル化シグナル配列からなる群から選択される、実施形態２３〜３９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４１は、第１の組成物の天然に存在しない核酸分子が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原、およびＨＢＶ Ｌタンパク質抗原からなる群から選択されるＨＢＶ抗原をコードしない、実施形態２３〜４０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４２は、増強された免疫応答が、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強された抗体応答を含む、請求項２３〜４１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４３は、増強された免疫応答が、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を含む、実施形態４２に記載の方法である。
実施形態４４は、増強された免疫応答が、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を含む、実施形態４２または４３に記載の方法である。
実施形態４５は、アデノウイルスベクターがｒＡｄ２６またはｒＡｄ３５ベクターである、実施形態２３〜４４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４６は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の１〜１２週間後に実施される、実施形態２３〜４５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４７は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の２〜１２週間後に実施される、実施形態２３〜４５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４８は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも１週間後に実施される、実施形態２３〜４５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４９は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも２週間後に実施される、実施形態２３〜４５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５０は、（ａ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を含む第１の組成物；および（ｂ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物を含むワクチン組合せであって、第１の組成物が、免疫応答をプライミングするためにヒト対象に投与され、第２の組成物が免疫応答をブースティングするためにヒト対象に１回または複数回投与される、ワクチン組合せである。
実施形態５１は、第１および第２の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、実施形態５０に記載のワクチン組合せである。
実施形態５２は、第１および第２の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、実施形態５０または５１に記載のワクチン組合せである。
実施形態５３は、第１および第２の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態５０〜５２のいずれか１つに記載のワクチン組合せである。
実施形態５４は、第１および第２の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態５０〜５３のいずれか１つに記載のワクチン組合せである。
実施形態５５は、シグナル配列が、配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を含み、好ましくはシグナル配列が、配列番号５または配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態５４に記載のワクチン組合せである。
実施形態５６は、第１および第２のポリヌクレオチド配列が配列番号３と少なくとも９０％同一である、実施形態５０〜５５のいずれか１つに記載のワクチン組合せである。
実施形態５７は、第１および第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態５６に記載のワクチン組合せである。
実施形態５８は、第１の組成物のアデノウイルスベクターが、ＭＶＡベクターの第３のポリヌクレオチド配列をさらに含み、および第２の組成物のＭＶＡベクターが、第４のポリヌクレオチド配列をさらに含み、第３および第４のポリヌクレオチド配列が、配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする、実施形態５０〜５７のいずれか１つに記載のワクチン組合せである。
実施形態５９は、第３および第４のポリヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９０％同一である、実施形態５８に記載のワクチン組合せである。
実施形態６０は、第３および第４のポリヌクレオチド配列が、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態５９に記載のワクチン組合せである。
実施形態６１は、（ａ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターの免疫学的有効量を含む第１の組成物；および（ｂ）配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物を含むワクチン組合せであって、第１の組成物が、免疫応答をプライミングするためにヒト対象に投与され、第２の組成物が免疫応答をブースティングするためにヒト対象に１回または複数回投与される、ワクチン組合せである。
実施形態６２は、第１および第２の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、実施形態６１に記載のワクチン組合せである。
実施形態６３は、第１および第２の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、実施形態６１または６２に記載のワクチン組合せである。
実施形態６４は、第１および第２の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態６１〜６３のいずれか１つに記載のワクチン組合せである。
実施形態６５は、第１および第２の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態６１〜６４のいずれか１つに記載のワクチン組合せである。
実施形態６６は、シグナル配列が、配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を含み、好ましくはシグナル配列が、配列番号５または配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態６５に記載のワクチン組合せである。
実施形態６７は、第１および第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号３と少なくとも９０％同一である、実施形態６１〜６６のいずれか１つに記載のワクチン組合せである。
実施形態６８は、第１および第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態６７に記載のワクチン組合せである。
実施形態６９は、第１の組成物のＭＶＡベクターが、第３のポリヌクレオチド配列をさらに含み、および第２の組成物のアデノウイルスベクターが、第４のポリヌクレオチド配列をさらに含み、第３および第４のポリヌクレオチド配列が、配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする、実施形態６１〜６８のいずれか１つに記載のワクチン組合せである。
実施形態７０は、第３および第４のポリヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９０％同一である、実施形態６９に記載のワクチン組合せである。
実施形態７１は、第３および第４のポリヌクレオチド配列が、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態７０に記載のワクチン組合せである。
実施形態７２は、キットである、実施形態５０〜７１のいずれか１つに記載のワクチン組合せである。
実施形態７３は、ヒト対象において免疫応答を増強する方法であって、（ａ）ヒト対象に、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む第１の天然に存在しない核酸分子を含む第１のプラスミド、および配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む第２の天然に存在しない核酸分子を含む第２のプラスミドの免疫学的有効量を含む第１の組成物を投与するステップ；ならびに（ｂ）ヒト対象に、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物を投与するステップを含み、それによってヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強された免疫応答を得る方法である。
実施形態７４は、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、実施形態７３に記載の方法である。
実施形態７５は、第１の組成物が、免疫応答をプライミングするためであり、第２の組成物が、免疫応答をブースティングするためである、実施形態７３または７４に記載の方法である。
実施形態７６は、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、実施形態７３〜７５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態７７は、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態７３〜７６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態７８は、第１の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態７３〜７７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態７９は、シグナル配列が、配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を含み、好ましくはシグナル配列が、配列番号５または配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態７８に記載の方法である。
実施形態８０は、第１の組成物の第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号２０と少なくとも９０％同一である、実施形態７３〜７９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８１は、第１の組成物の第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号２０のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態８０に記載の方法である。
実施形態８２は、第１の組成物の第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１８と少なくとも９０％同一である、実施形態７３〜８１に記載の方法である。
実施形態８３は、第１の組成物の第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態８２に記載の方法である。
実施形態８４は、第１の組成物の第１および第２のポリヌクレオチド配列が、プロモーター配列、任意選択で１つまたは複数の追加の調節配列をさらに含み、好ましくはプロモーター配列が、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含み、ならびに追加の調節配列が、配列番号８または配列番号１５のエンハンサー配列および配列番号１６のポリアデニル化シグナル配列からなる群から選択される、実施形態７３〜８３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８５は、増強された免疫応答が、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強された抗体応答を含む、請求項７３〜８４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８６は、増強された免疫応答が、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を含む、実施形態８５に記載の方法である。
実施形態８７は、増強された免疫応答が、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を含む、実施形態８５または８６に記載の方法である。
実施形態８８は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の１〜１２週間後に実施される、実施形態７３〜８７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８９は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の２〜１２週間後に実施される、実施形態７３〜８７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９０は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも１週間後に実施される、実施形態７３〜８７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９１は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも２週間後に実施される、実施形態７３〜８７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９２は、ヒト対象において免疫応答を増強する方法であって、（ａ）ヒト対象に、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のＭＶＡベクターの免疫学的有効量を含む第１の組成物を投与するステップ；ならびに（ｂ）ヒト対象に、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む天然に存在しない核酸分子を含む第１のプラスミド、および配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む天然に存在しない核酸分子を含む第２のプラスミドの免疫学的有効量を含む第２の組成物を投与するステップを含み、それによってヒト対象においてＨＢＶ抗原に対する増強された免疫応答を得る方法である。
実施形態９３は、第２の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、実施形態９２に記載の方法である。
実施形態９４は、第１の組成物が免疫応答をプライミングするためであり、第２の組成物が免疫応答をブースティングするためである、実施形態９２または９３に記載の方法である。
実施形態９５は、第２の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくは、ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくはＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、実施形態９２〜９４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９６は、第２の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態９２〜９５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９７は、第２の組成物のＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態９２〜９６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９８は、シグナル配列が、配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を含み、好ましくはシグナル配列が、配列番号５または配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態９７に記載の方法である。
実施形態９９は、第２の組成物の第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号２０と少なくとも９０％同一である、実施形態９２〜９８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１００は、第２の組成物の第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号２０のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態９９に記載の方法である。
実施形態１０１は、第２の組成物の第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１８と少なくとも９０％同一である、実施形態９２〜１００のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１０２は、第２の組成物の第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１０１に記載の方法である。
実施形態１０３は、第２の組成物の第１および第２のポリヌクレオチド配列が、プロモーター配列、任意選択で１つまたは複数の追加の調節配列をさらに含み、好ましくはプロモーター配列が、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含み、ならびに追加の調節配列が、配列番号８または配列番号１５のエンハンサー配列および配列番号１６のポリアデニル化シグナル配列からなる群から選択される、実施形態９２〜１０２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１０４は、増強された免疫応答が、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強された抗体応答を含む、実施形態９２〜１０３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１０５は、増強された免疫応答が、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を含む、実施形態１０４に記載の方法である。
実施形態１０６は、増強された免疫応答が、ヒト対象におけるＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を含む、実施形態１０４または１０５に記載の方法である。
実施形態１０７は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の１〜１２週間後に実施される、実施形態９２〜１０６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１０８は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の２〜１２週間後に実施される、実施形態９２〜１０６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１０９は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも１週間後に実施される、実施形態９２〜１０６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１０は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも２週間後に実施される、実施形態９２〜１０６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１１は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも４週間後に実施される、実施形態９２〜１０６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１２は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも８週間後に実施される、実施形態９２〜１０６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１３は、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも１２週間後に実施される、実施形態９２〜１０６のいずれか１つに記載の方法である。
本出願の以下の実施例は、本出願の性質をさらに例証するためである。以下の実施例は本発明を限定せず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって決定されると理解すべきである。
[実施例１]
ＨＢＶコアおよびＰｏｌ抗原配列の生成
肝炎コアタンパク質上のＴ細胞エピトープは、Ｂ型肝炎感染症の排除にとって重要であると考えられており、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質、例えばポリメラーゼは、応答の幅を改善するために役目を果たし得る。このため、Ｂ型肝炎コアおよびポリメラーゼタンパク質を、治療用Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチンの設計のための抗原として選択した。
ＨＢＶコアおよびポリメラーゼ抗原コンセンサス配列の誘導
ＨＢＶ ｐｏｌおよびコア抗原コンセンサス配列を、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに基づいて生成した。異なるＨＢＶ配列を異なる起源から得て、コアおよびポリメラーゼタンパク質に関して個別に整列させた。全てのサブタイプ（Ａ〜Ｈ）に関する当初の配列アライメントを、次にＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに限定した。コンセンサス配列を、各サブタイプにおいて個別におよび全ての合同ＢＣＤ配列において各々のタンパク質アライメントに関して定義した。多様なアライメント位置において、最も頻繁なアミノ酸をコンセンサス配列に使用した。
ＨＢＶコア抗原の最適化
ＨＢＶコア抗原コンセンサス配列を、ネイティブウイルスタンパク質に含有される２つの欠失を作製することによって最適化した。第１の欠失は、プレコア「ジンクフィンガー」部分を構成するコアタンパク質のＮ末端伸長部の欠失であり、その理由は、文献での報告により、ウイルスがこの配列を利用して、感染した個体におけるウイルスタンパク質に対する寛容を誘導することが示されたためであった。第２の欠失は、Ｃ末端の高度に正に帯電した分節に対応する３４アミノ酸の欠失であったが、これはウイルス生活環におけるプレゲノムキャプシド形成および生産的なウイルスプラス鎖ＤＮＡ合成にとって必要である。
ＨＢＶ Ｐｏｌ抗原の最適化
ＨＢＶ ｐｏｌ抗原コンセンサス配列を、逆転写酵素およびＲＮアーゼＨ酵素活性を除去するために４つの残基を変化させることによって最適化した。特に、任意の配位機能、およびこのようにヌクレオチド／金属イオン結合を排除するために、逆転写酵素ドメインの「ＹＸＤＤ」モチーフにおけるアスパラギン酸塩残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に変化させた。加えて、Ｍｇ２＋配位を排除するために、ＲＮアーゼＨドメインの「ＤＥＤＤ」モチーフにおける第１のアスパラギン酸塩残基（Ｄ）をアスパラギン残基（Ｎ）に変化させ、第１のグルタミン酸塩残基（Ｅ）をグルタミン残基（Ａ）に変化させた。加えて、ＨＢＶ ｐｏｌ抗原の配列をコドン最適化して、Ｓタンパク質およびＮ末端伸長部ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２を有するＳタンパク質の変化型を含むエンベロープタンパク質の内部オープンリーディングフレームを組み換えた。その結果、エンベロープタンパク質（ｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−Ｓ２、およびＳタンパク質）およびＸタンパク質のオープンリーディングフレームが除去された。
効率的なタンパク質分泌のためのシグナルペプチドの選択
以下のＨＢＶコア抗原のＮ末端にインフレームで導入した３つの異なるシグナルペプチドを評価した：（１）Ｉｇ重鎖ガンマシグナルペプチドＳＰＩｇＧ（ＢＡＡ７５０２４．１）；（２）Ｉｇ重鎖イプシロンシグナルペプチドＳＰＩｇＥ（ＡＡＢ５９４２４．１）；および（３）シスタチンＳ前駆体シグナルペプチドＳＰＣＳ（ＮＰ＿００１８９０１．１）。シグナルペプチド切断部位を、ＳｉｇｎａｌＰ予測プログラムを使用してコア融合体に関してｉｎ ｓｉｌｉｃｏで最適化した。分泌効率を、上清中のコアタンパク質レベルを分析することによって決定した。Ｎ末端で融合した３つの異なるシグナルペプチドを使用するコア抗原分泌のウェスタンブロット分析は、シスタチンＳシグナルペプチドが最も効率的なタンパク質分泌をもたらすことを証明した。
[実施例２]
切断型ＨＢＶコア抗原とＨＢＶ Ｐｏｌ抗原との融合体を発現するアデノウイルスベクターの生成
単一のオープンリーディングフレームから切断型ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ ｐｏｌ抗原の融合タンパク質を発現するアデノウイルスベクターを作製した。例えば２つの個別の発現カセットを使用することによる、または２つの配列を分離するために２Ａ様配列を使用することによる、２つのタンパク質（例えば、切断型ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶｐｏｌ抗原）を発現させるための追加の構成も同様に想像することができる。
アデノウイルスベクターの発現カセットの設計
発現カセット（図２Ａおよび図２Ｂに図示する）は、ＣＭＶプロモーター（配列番号７）、イントロン（配列番号１５）（ヒトＡｐｏＡＩ遺伝子に由来する断片、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０１０３８、塩基対２９５〜５２３、ＡｐｏＡＩの第２のイントロンを有する）、後に続く最適化コード配列−ヒト免疫グロブリン分泌シグナルコード配列（配列番号１０）の後に続くコア単独またはコアとポリメラーゼとの融合タンパク質、その後に続くＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号１６）を含む。
分泌シグナルは、過去の実験により、誘発されるＴ細胞応答に影響を及ぼすことなく（マウスの実験）、分泌されるトランスジーンを有する一部のアデノウイルスベクターの製造性が改善することが示されたことから含めた。
コアタンパク質の最後の２つの残基（ＶＶ）およびポリメラーゼタンパク質の最初の２つの残基（ＭＰ）を融合すると、隣接する相同配列と共にヒトドーパミン受容体タンパク質（Ｄ３アイソフォーム）上に存在する接合配列（ＶＶＭＰ）をもたらす。
コア配列とポリメラーゼ配列との間にＡＧＡＧリンカーを挿入すると、この相同性が排除され、ヒトプロテオームのＢｌａｓｔにおいてさらなるヒットなしに戻った。
[実施例３]
ＨＢＶコア抗原およびＨＢＶ Ｐｏｌ抗原を発現するＭＶＡベクターの生成
ＭＶＡベクターは、本出願のＨＢＶコアおよびＰｏｌコード配列の各々をコードするように設計されている。ＨＢＶコアおよびＰｏｌコード配列を、各々個別のプロモーターの制御下でＭＶＡベクターのＩＧＲ４４／４５に挿入した。２つのタンパク質を発現させるための追加の構成、例えば、コアおよびＰｏｌ抗原が融合タンパク質を含む単一の発現カセットを使用すること、またはあるいは２つの配列を分離するために２Ａ様配列を利用することもまた、想像することができる。さらに、ＭＶＡベクターにおける追加のおよび／または代替の挿入部位、例えばＨＢＶコアおよびＰｏｌコード配列の各々を同じまたは異なる挿入部位に挿入することもまた想像することができる。
ＭＶＡベクターの発現カセットの設計
発現カセット（図２Ｃに示す）は、ＨＢＶコア抗原に隣接してその発現を指示するＰｒ１３．５長プロモーター（配列番号２５）、およびＨＢＶ Ｐｏｌ抗原に隣接してその発現を指示するＰｒＨｙｂプロモーター（配列番号２６）で構成される。ＨＢＶコアコード配列は配列番号１を含み、ＨＢＶ Ｐｏｌコード配列は配列番号３を含む。配列番号１および３の各々は、負のシス作用部位を排除することによって、およびＧＣ含有量を調節することによって改変した。さらに、配列番号１および３の各々を、アミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヒトコドン使用に関してコドン最適化した。配列番号１および３の各々は、終止コドンに隣接して配置された追加の早期終止シグナル（ＴＴＴＴＴＮＴ（配列番号２８））を含む。
[実施例４]
マウスにおけるＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡベクターの組合せの免疫原性
材料および方法
ベクターの設計：コア単独（配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＢＶコア抗原）、または単一のオープンリーディングフレームから発現された融合タンパク質としてコアに加えてポリメラーゼ（配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＢＶ ｐｏｌ抗原）のいずれか発現する２つのアデノウイルスベクターを使用した。このため、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでＢ型肝炎ウイルスのＢ、Ｃ、およびＤ遺伝子型のコンセンサスを提供する配列を設計した。発現カセットは、ＣＭＶプロモーター、ＡｐｏＡＩイントロン、ヒト免疫グロブリン分泌シグナルを含み、その後にコード配列−コア単独またはコアとポリメラーゼの融合タンパク質、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが続く。
組換えＭＶＡベクターは、コアコード配列（配列番号１のヌクレオチド配列、および配列番号２のポリペプチド配列）に連結されたポックスウイルスプロモーターＰｒ１３．５（配列番号２５）、およびポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３のヌクレオチド配列、および配列番号４のポリペプチド配列）に連結されたＰｒＨｙｂ（配列番号２６）で構成され、いずれもその後に転写終止配列ＴＴＴＴＴＮＴ（配列番号２８）が続く。コアコード配列は、Ｎ末端免疫グロブリン分泌タグ（配列番号１１）を含み、およびポリメラーゼコード配列はＮ末端シスタチンＳシグナル配列（配列番号６）を含む。例えば、図２Ｃを参照されたい。
マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性試験：ＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡの組合せのｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性を評価するために、Ｆ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｂａｌｂ／Ｃ）を、異なるベクターの組合せによって筋肉内にプライム−ブースト免疫した。これらの免疫原性試験は、ＨＢＶ抗原コアおよびポリメラーゼによって誘発された細胞性免疫応答の決定に集中した。
抗原特異的応答を、ＩＦＮ−γ酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって分析および定量し、細胞内サイトカイン産生（ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−２、およびＩＦＮ−γ）を、フローサイトメトリーによって検出した。これらのアッセイにおいて、免疫した動物から単離された脾細胞を、コアタンパク質、Ｐｏｌタンパク質、または小さいペプチドリーダーおよび接合配列（各ペプチド２μｇ／ｍｌ）を含むペプチドプールと共にインキュベートした。加えて、ＭＶＡ特異的ペプチド（２μｇ／ｍｌ）を使用した。プールは、コアおよびＰｏｌアデノウイルスベクターの遺伝子型ＡＢＣＤコンセンサス配列にマッチする１１残基が重複する１５量体ペプチドからなる。大きい９４ｋＤａ ＨＢＶ Ｐｏｌタンパク質を中央で２つのペプチドプールに分割した。ＥＬＩＳＰＯＴにおいて、単一の抗原特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの放出を、適切な抗体によって、およびスポット形成細胞（ＳＦＣ）と呼ばれるマイクロプレート上での着色スポットとしてその後の色素産生の検出によって可視化した。ＩＣＳにおいて、特定の集団（ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、またはＣＤ８陽性細胞）におけるサイトカイン放出細胞のパーセンテージを決定した。
結果
マウスにおけるＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡの組合せの免疫原性の評価：本試験の目的は、Ｆ１マウスにＩＭ送達後のＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡの組合せによって誘導された免疫応答を評価することであった。Ｆ１マウスへの投与は、表１に要約するように実施した。動物に、ＨＢＶアデノウイルスベクターによる１回の免疫の８週間後にＨＢＶ ＭＶＡによる免疫を行った。最後の免疫の１週間後に脾細胞を収集した。
ＨＢＶアデノウイルスベクター単独およびＨＢＶ ＭＶＡベクターとの組合せは、マウスにおいてＰｏｌ特異的Ｔ細胞応答を生じた。低レベルのコア応答が、コアｐｏｌ融合体＋コアアデノウイルスベクターによって誘導され、これらの応答は、ＨＢＶ ＭＶＡベクターによるブースティングによって増幅された。コアｐｏｌ融合体アデノベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡベクターの組合せもまた、コア応答を誘導した（図３）。
Ｐｏｌ応答は、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞によって主に媒介されるが、コア応答は、主にＣＤ４（＋）Ｔ細胞を伴う（図４および５）。コアｐｏｌ融合体＋コアアデノウイルスおよびＨＢＶ ＭＶＡの組合せもまた、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞駆動性コア応答を誘導した（図４）。
結論：ＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡベクターの組合せは、Ｆ１マウスにおいてコアおよびｐｏｌに対するＴ細胞応答を生じる。
[実施例５]
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡベクターの組合せの免疫原性
ＮＨＰにおけるｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性試験：ＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡベクターの組合せのｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性を評価するために、モーリシャス島産カニクイザルを、異なるベクターの組合せによって筋肉内にプライム−ブースト免疫した。これらの免疫原性試験は、ＨＢＶコアおよびポリメラーゼ抗原によって誘発された細胞性免疫応答を決定することに集中した。
抗原特異的応答を、ＩＦＮ−γ酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって分析および定量し、細胞内サイトカイン産生（ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−２、およびＩＦＮ−γ）をフローサイトメトリーによって検出した。これらのアッセイでは、免疫した動物のＰＢＭＣを、コアタンパク質またはＰｏｌタンパク質（各ペプチド２μｇ／ｍｌ）を含むペプチドプールと共にインキュベートした。プールは、コアおよびＰｏｌアデノウイルスベクターの遺伝子型ＡＢＣＤコンセンサス配列にマッチする、１１残基が重複する１５量体ペプチドからなる。大きい９４ｋＤａのＨＢＶ Ｐｏｌタンパク質を、中央で２つのペプチドプールに分割した。ＥＬＩＳＰＯＴでは、単一の抗原特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの放出を、適切な抗体によって、およびスポット形成細胞（ＳＦＣ）と呼ばれるマイクロプレート上での着色スポットとしてその後の色素産生の検出によって可視化した。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）において、特定の集団（ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、またはＣＤ８陽性細胞）におけるサイトカイン放出細胞のパーセンテージを決定した。
結果
ＮＨＰにおけるＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡベクターの組合せの免疫原性の評価：本試験の目的は、モーリシャス島産カニクイザルにＩＭ送達後のＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡベクターの組合せによって誘導された免疫応答を評価することであった。ＮＨＰへの投与は、表２に要約するように実施した。動物に、ＨＢＶアデノウイルスベクターによる１回免疫の８週間後にＨＢＶ ＭＶＡベクターによる免疫を実施し、その８週間後に再度ＨＢＶアデノウイルスベクターによる免疫を行った。ＰＢＭＣを、各免疫の２週間後に収集した。
コアｐｏｌ融合体アデノウイルスベクター単独、およびＨＢＶ ＭＶＡベクターと組み合わせたコアｐｏｌ融合体＋コアアデノウイルスベクターは、ＮＨＰにおいて強力なＰｏｌおよびコア特異的Ｔ細胞応答を生じた。コアｐｏｌ融合体アデノウイルスベクターによるさらなるブースティングは、応答をさらに増加させなかった（図６）。
ＮＨＰにおけるコアおよびＰｏｌ応答は、ＣＤ４（＋）およびＣＤ８（＋）Ｔ細胞の両方によって媒介される。コアｐｏｌ融合体アデノベクター＋コアアデノベクター（プライミングとして使用される）およびＨＢＶ ＭＶＡ（ブースティングとして使用される）の組合せは、最も高いＣＤ４（＋）コア特異的、およびＣＤ８（＋）Ｐｏｌ特異的Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答を誘導した（図７）。
これらの結果は、ＨＢＶアデノウイルスベクターおよびＨＢＶ ＭＶＡベクターの組合せが、ＮＨＰにおいてコアおよびｐｏｌ抗原に対して強力なＴ細胞応答を生じたことを証明する。
本発明のその広い概念から逸脱することなく、上記の実施形態に変更を行うことができることは、当業者によって認識されるであろう。したがって、本発明は、開示の特定の実施形態に限定されないと理解され、本記載によって定義される本発明の精神および範囲内の改変を含むと意図される。
参考文献

Claims (49)

  1. 配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む天然に存在しない核酸分子を含む改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター。
  2. 前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくは、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、哺乳動物において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくは前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、請求項１に記載のＭＶＡベクター。
  3. 前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＭＶＡベクター。
  4. 前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＭＶＡベクター。
  5. 前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３と少なくとも９０％同一である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＭＶＡベクター。
  6. 前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のＭＶＡベクター。
  7. 配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＭＶＡベクター。
  8. 前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項７に記載のＭＶＡベクター。
  9. 前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のＭＶＡベクター。
  10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のＭＶＡベクターおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
  11. ヒト対象において免疫応答を増強する方法であって、
    ａ．前記ヒト対象に、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む天然に存在しない核酸分子を含むアデノウイルスベクターの免疫学的有効量を含む第１の組成物を投与するステップ；および
    ｂ．前記ヒト対象に、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＭＶＡベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物を投与するステップ、
    を含み、それによって前記ヒト対象において前記ＨＢＶ抗原に対する増強された免疫応答を得る方法。
  12. 前記第１の組成物の前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、前記ヒト対象において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくは、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、前記ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくは前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、前記ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記第１の組成物の前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記第１の組成物の前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号１９と少なくとも９０％同一である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記第１の組成物の前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号１９のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記第１の組成物における前記アデノウイルスベクターの核酸分子が、配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記第１の組成物の前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１７と少なくとも９０％同一である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記第１の組成物の前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記第１の組成物の前記第１および前記第２のポリヌクレオチド配列が、前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された前記切断型ＨＢＶコア抗原を含む融合タンパク質をコードする、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記第１の組成物の前記融合タンパク質が、リンカーを介して前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結された前記切断型ＨＢＶコア抗原を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記第１の組成物の前記リンカーが、アミノ酸配列（ＡｌａＧｌｙ）ｎを含み、ｎが２〜５の整数であり、好ましくは前記リンカーが、配列番号１４を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記第１の組成物の前記融合タンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記増強された免疫応答が、前記ヒト対象における前記ＨＢＶ抗原に対する増強された抗体応答を含む、請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記増強された免疫応答が、前記ヒト対象における前記ＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記増強された免疫応答が、前記ヒト対象における前記ＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記アデノウイルスベクターが、ｒＡｄ２６またはｒＡｄ３５ベクターである、請求項１１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の１〜１２週間後に実施される、請求項１１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の２〜１２週間後に実施される、請求項１１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  29. ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも１週間後に実施される、請求項１１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  30. ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも２週間後に実施される、請求項１１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  31. ヒト対象における免疫応答を増強する方法であって、
    （ａ）前記ヒト対象に、配列番号４と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼ抗原をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む第１の天然に存在しない核酸分子を含む第１のプラスミド、および配列番号２のアミノ酸配列からなる切断型ＨＢＶコア抗原をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む第２の天然に存在しない核酸分子を含む第２のプラスミドの免疫学的有効量を含む第１の組成物を投与するステップ；ならびに
    （ｂ）前記ヒト対象に、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＭＶＡベクターの免疫学的有効量を含む第２の組成物を投与するステップ、
    を含み、それによって前記ヒト対象における前記ＨＢＶ抗原に対する増強された免疫応答を得る方法。
  32. 前記第１の組成物の前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、逆転写酵素活性およびＲＮアーゼＨ活性を有しない、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記第１の組成物が免疫応答をプライミングするためであり、前記第２の組成物が免疫応答をブースティングするためである、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. 前記第１の組成物の前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、前記ヒト対象において少なくとも２つのＨＢＶ遺伝子型に対する免疫応答を誘導することが可能であり、好ましくは前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、前記ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＴ細胞応答を誘導することが可能であり、ならびにより好ましくは前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、前記ヒト対象において少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが可能である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記第１の組成物の前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記第１の組成物の前記ＨＢＶポリメラーゼ抗原に作動可能に連結されたシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記シグナル配列が、配列番号６または配列番号１１のアミノ酸配列を含み、好ましくは前記シグナル配列が、配列番号５または配列番号１０のポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記第１の組成物の前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号２０と少なくとも９０％同一である、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記第１の組成物の前記第１のポリヌクレオチド配列が、配列番号２０のポリヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記第１の組成物の前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１８と少なくとも９０％同一である、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記第１の組成物の前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記第１の組成物の前記第１および前記第２のポリヌクレオチド配列が、プロモーター配列、任意選択で１つまたは複数の追加の調節配列をさらに含み、好ましくは前記プロモーター配列が、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含み、ならびに前記追加の調節配列が、配列番号８または配列番号１５のエンハンサー配列および配列番号１６のポリアデニル化シグナル配列からなる群から選択される、請求項３１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記増強された免疫応答が、前記ヒト対象における前記ＨＢＶ抗原に対する増強された抗体応答を含む、請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記増強された免疫応答が、前記ヒト対象における前記ＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記増強された免疫応答が、前記ヒト対象における前記ＨＢＶ抗原に対する増強されたＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を含む、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の１〜１２週間後に実施される、請求項３１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の２〜１２週間後に実施される、請求項３１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  48. ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも１週間後に実施される、請求項３１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  49. ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の少なくとも２週間後に実施される、請求項３１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
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