CN1295480A - 含有白细胞介素－12和呼吸道合胞病毒抗原的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有抗原,例如RSV抗原,和白细胞介素－12混合的疫苗组合物。该疫苗组合物可吸附于矿物悬液。这些疫苗组合物调节对抗原的保护性免疫应答。

Description

含有白细胞介素-12和呼吸道合胞病毒抗原的疫苗
发明背景
免疫系统采用许多机制来攻击病原体；然而，并不是所有这些机制在免疫接种后均必定被激活。接种疫苗诱导的保护性免疫力依赖于疫苗诱导恰当免疫应答的能力来抵抗或消灭病原体。根据病原体，这可能需要细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答。
辅助性T细胞在免疫应答中作用的范例是，它们可以根据它们产生的细胞因子分成细胞亚群，而且在这些细胞亚群中观察到的独特性细胞因子分泌决定了它们的功能。此T细胞模型包括两个主要亚群：产生IL-2和干扰素γ(IFN-γ)的TH-1细胞，它同时增强细胞和体液免疫应答；产生IL-4、IL-5和IL-10的TH-2细胞，它增强体液免疫应答。(Mosmann等，免疫学杂志。126：2348(1986))。通常理想的是增强抗原的免疫原性以在被接种的生物体内获得更强的免疫应答，并增强宿主对抗原物质的抵抗力。一类和被接种的抗原一起施用，能增强抗原的免疫原性的物质被称为佐剂。例如，已证明某些淋巴因子有佐剂活性，能增强对抗原的免疫应答(Nencioni，等，免疫学杂志。139：800-804(1987)；EP285441授予Howard等)。
发明简述
本发明涉及疫苗组合物，它包括一种或多种呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，白细胞介素IL-12和矿物悬液的混合物。IL-12可吸附于矿物悬液或简单的和它混合。在本发明的一具体实施例中，IL-12吸附于例如明矾(例如，氢氧化铝或磷酸铝)的矿物悬液。这些疫苗组合物调节对抗原的保护性免疫应答；即，该疫苗组合物能在量和质上促进接种疫苗宿主的抗体应答，在量上增加细胞介导的免疫力，提供对病原体的保护性免疫应答。在本发明的一个具体实施例中，RSV抗原是RSV F和/或G蛋白抗原。
本发明还涉及制备含有与矿物悬液混合的RSV抗原和IL-12的疫苗组合物的方法。特别是，IL-12吸附于矿物悬液。本发明还涉及诱导或增强被免疫者保护性免疫应答的体液和/或细胞介导的免疫力，包括对脊椎动物施用有效量的疫苗组合物，该疫苗组合物包含以生理学上可接受的溶液配制的RSV抗原、IL-12和矿物悬液。特别是，IL-12吸附于矿物悬液。
附图简述
图1表示用F/AlOH加递增剂量IL-12接种的BALB/c小鼠脾脏免疫细胞的增殖应答。黑色阴影条表示用天然F蛋白体外刺激后的增殖。
图2A和2B表示IL-12对F/AlOH诱导BALB/c小鼠分泌IFN-γ(图2A)和IL-5(图2B)的脾细胞活性的效果。
图3表示IL-12对F/AlOH诱导或增强细胞介导免疫应答能力的效果，以及IL-12对F/AlOH在初次免疫后诱导抗原依赖性杀伤细胞能力的影响。实线和虚线分别表示在攻击5日后，支气管肺泡灌洗液效应细胞以同系RSV-感染的或对照靶细胞培养后观察到的杀伤细胞活性。
图4表示IL-12对F/AlOH增强先前感染了RSV的血清阳性BALB/c小鼠细胞的介导免疫应答能力的效果。实线和虚线分别表示在攻击5日后，支气管肺泡灌洗液效应细胞与同系RSV-感染的靶细胞或对照靶细胞培养后观察到的杀伤细胞活性。
图5表示重组IL-12对接种F/AlOH的BALB/c小鼠体内诱导保护性免疫应答的效果。条图是几何平均数的一个标准偏差。星号表示感染性病毒低于可检测的水平。
发明详述
IL-12由各种各样的抗原递呈细胞产生，主要是由巨噬细胞和单核细胞产生。它是诱导原初T细胞成为TH-1细胞的关键要素。IL-12的产生或对其反应的能力在保护性TH-1类应答的发展中证明是关键性的，例如，在寄生虫感染中，最值得注意的利士曼病中就是如此(Scott，等，美国专利号No.5,571,515)。IL-12的作用由NK细胞和辅助性T细胞产生的IFN-γ所介导。对T依赖性蛋白抗原的IgG2a抗体的诱导(Finkelman和Holmes，免疫学年度综述。8：303-33(1990))和对T非依赖性抗原的IgG3应答中，IFN-γ则是关键性的细胞因子(Snapper等，实验医学杂志，175：1367-1371(1992))。白细胞介素-12(IL-12)，原先称为自然杀伤细胞刺激因子，是一种异二聚体细胞因子(Kobayashi等，J.Exp.Med.170：827(1989))。IL-12蛋白在重组宿主细胞中的表达和分离在国际专利申请WO90/05147(1990年5月17日公开，)中有所描述。
本文所描述的研究是关于IL-12在呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗中作为佐剂的应用。因此，本发明涉及含有RSV抗原、IL-12和矿物悬液的混合物的疫苗组合物。在本发明的具体实施例中，IL-12吸附于例如明矾的矿物悬浮液上(例如，氢氧化铝或磷酸铝)。这些疫苗组合物调节对抗原的保护性免疫应答；即，该疫苗组合物能诱导被接种宿主产生对病原体保护性免疫应答所需的细胞介导免疫力。在具体实施例中，抗原是RSV F蛋白和/或G蛋白。
IL-12可从数种适当的来源获得。它可通过重组DNA工艺学生产；例如，将编码人类IL-12的基因在宿主系统中克隆并表达，使能大量生产纯的人IL-12。在本发明中同样有用的是IL-12的生物学活性亚基或片段。另外，某些T淋巴细胞系能产生高水平的IL-12，从而提供了易于得到的来源。重组人IL-12和小鼠IL-12的商品来源包括Genetics Institute,Inc.(Cambridge,MA)。本发明的抗原，例如，RSV抗原，可用于在脊椎动物如哺乳动物宿主中诱导对该抗原的免疫应答。例如，抗原可以是RSV F蛋白(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7683-7687(1984))或G蛋白(Satake等，Nuc.AcidsRes.13：7795-7812(1985))抗原或其保留了刺激免疫应答能力的部分。这些免疫原性部分的例子为含有RSV F蛋白氨基酸位点283-315，289-315和294-299的多肽。这些区域包括能诱导中和性抗体和抗融合抗体的RSV F蛋白表位(Paradiso等，美国专利号5,639,853)。另外，RSV F蛋白的天然二聚形式(140kD)也可用(Paradiso等，美国专利号5,223,254)。
本发明的方法包括对脊椎动物施用免疫有效剂量的疫苗组合物，该疫苗组合物含有抗原(例如F和/或G蛋白的RSV抗原)，辅佐剂量的IL-12和矿物悬液的混合物。特别是，IL-12吸附于矿物悬液。本文所用的IL-12的“辅佐剂量”是指足够增强或改变对疫苗抗原(例如F和/或G蛋白等RSV抗原)免疫应答的IL-12量。本文所用的疫苗组合物的“免疫有效”剂量，是指适合诱导免疫应答的剂量。IL-12和抗原的具体用量由被治疗的脊椎动物的年龄、体重和医学状况所决定，同时还由施药方法所决定。本领域熟练的技术人员很容易确定合适的剂量。该疫苗组合物可任选的配制在药物学或生理学上可接受的载体，例如生理盐水或多元醇，(例如甘油或丙烯醇)中施药。
该疫苗组合物可任选的含有另外的佐剂，例如植物油或其乳剂，表面活性物质，例如：十六烷基胺，十八烷氨基酸酯，十八烷基胺，溶血卵磷脂，二甲基-二(十八烷基溴化铵)，N,N-双十八烷基-N’-N’双(2-羟乙基-丙烷二胺)，羟甲基十六烷基甘油，以及复合多元醇；聚胺，例如：吡喃，硫酸葡聚糖，多聚IC，聚羧乙烯；肽，例如：胞壁酰二肽，二甲基甘氨酸，促吞噬肽，免疫刺激复合物，油乳剂；脂多糖，例如：MPL_(3-O-去乙酰基-磷酸脂A；RIBI ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,Montana)和矿物凝胶。也可将本发明的抗原掺入脂质体，共螯合物(cochleates)，可生物降解多聚物例如聚丙交酯，聚乙交酯和聚丙交酯-共-乙交酯，或ISCOMS(免疫刺激复合物)中，以及还可使用添加的活性成分。本发明的抗原也可和细菌毒素及其减毒衍生物联用。本发明的抗原也可和其它的淋巴因子，包括，但不限于，IL-2，IL-3，IL-15，IFN-γ和GM-CSF联用。
疫苗可通过多种途径施用给人或动物，包括但不限于，肠胃外、动脉内、真皮内、透皮(例如通过使用缓释多聚物)，肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、口腔或鼻内施药途径。在这些疫苗中使用的抗原量，视抗原的特性而不同。为适合本发明疫苗，需要对采用传统载体抗原所确定的剂量范围进行判定和操作，这正好在本领域熟练技术人员的能力内。本发明的疫苗计划用于治疗未成年和成年温血动物中，特别是人。通常，IL-12和抗原将联用；然而，在某些情况下，本领域技术人员知道，IL-12可以紧挨着抗原接种之前或之后施用。
本发明的RSV抗原可和另一个分子偶联来调节或增强免疫应答。合适的的载体蛋白质包括对哺乳动物可安全施用，并作为免疫学上有效的载体的细菌毒素。例子包括百日咳、白喉和破伤风类毒素和无毒性突变蛋白质(交叉反应材料(CRM))，例如白喉类毒素的无毒性变体，CRM197。天然毒素或类毒素的，含有至少一个T细胞表位的片段，也可用作抗原载体。制备抗原和载体分子偶联物的方法为本领域熟知，而且可在例如Dick和Burret,ContribMicrobiol Immunol.10：48-114(Cruse JM,Lewis RE Jr,eds；Basel,Krager(1989))和美国专利号No.5,360,897(Anderson等)中找到。
IL-12的佐剂作用具有许多重要的意义。IL-12的佐剂作用能增加疫苗接种生物体针对抗原所产生的保护性抗体浓度。因此，有效的(亦即，保护性)接种可用比通常所需更少量的抗原而达到。抗原所需量的减少可以使得制备困难且昂贵的抗原被更广泛的使用。另外，IL-12用作佐剂能增强免疫原性微弱或免疫原性贫乏的抗原诱导免疫应答的能力。当抗原在有效免疫通常所要求的浓度是有毒的情况下，它可提供更安全的免疫接种。通过减少抗原量，毒性反应的危险也降低了。另外，佐剂作用可以减少在短时间内用大量疫苗免疫的个体的抗原负担。
通常，疫苗接种方案要求在几星期或几个月的时间内施用抗原，以激发“保护性”免疫应答。保护性免疫应答是足以保护被免疫生物体抵抗疫苗针对的一种或多种特定病原体所致疾病的免疫应答。IL-12，当和抗原(例如RSV抗原，包括但不限于，F蛋白和G蛋白)一起施用并和铝的矿物悬液混合或吸附于其上时，可加速保护性免疫应答的产生。这可以减少有效疫苗接种方案的时间过程。在一些例子中，单剂即能产生保护性免疫应答。
本文所述的工作的目的是确定采用重组IL-12作为抗RSV疫苗免疫应答改进剂的可行性。为达到该目的，用RSV A2株的天然融合(F)蛋白和上升量的IL-12免疫数组BALB/c小鼠。F蛋白和IL-12吸附于氢氧化铝(AlOH，Alu-gel-STM，Serva Fine Biochemicals，Westbury，NY)佐剂。然后，比较疫苗诱导全身性细胞介导免疫应答和体液免疫应答的能力。本文中的结果显示IL-12是全身性体液和细胞介导免疫应答的强有力改进剂。在初次和二次接种后，观察到补体辅助的和抗F蛋白的IgG2a抗体滴度显著增加。另外，0.01和0.1微克IL-12对F/AlOH诱导细胞介导免疫应答的能力有深度影响。用RSV A2株攻击5日后，血清阴性和血清阳性的小鼠肺部都含有增强的抗原-依赖性杀伤性细胞活性。
为说明IL-12对AlOH辅佐疫苗诱导的免疫应答作用的模型，分析了与天然F蛋白培养的大量脾细胞的上清液中和辅助性T细胞亚类有关的细胞因子。本文提供的结果说明IL-12增加了疫苗组合物诱导1型辅助性T细胞(Th1)占支配地位免疫应答的能力。IL-12在疫苗中的存在看来和培养上清液中IFN-γ的增加量有关。另外，结果暗示在配方中增加IL-12量减少了该疫苗产生2型辅助性T细胞(Th2)的能力。亦即，当疫苗中IL-12量增加时，培养上清液中含有更少量的IL-5。然而在IL-12剂量大于1.0微克时，Th1和Th2细胞因子都减少。
本文所述的工作还检测了IL-12对RSV天然结合(G)蛋白和甲醛-灭活RSV(FI-RSV)的免疫原性的免疫调节作用。这两种疫苗都显示能在啮齿动物中产生和Th2辅助性T细胞诱导有关的免疫应答。FI-RSV疫苗是起初由Pfizer配制的Lot-100疫苗的复制品(Fulginiti等，Am.J.Epidemiol.89：435-448(1969)和Chin等，Am.J.Epidemiol.89：449-463(1969))。两种疫苗都吸附于AlOH，单独配制或与剂量增加10倍的IL-12一起配制。
采用几个评定标准来测定的IL-12免疫调节性能。IL-12改变G/AlOH和FI-RSV使接种者在攻击后产生非典型肺部炎症反应的能力的活性特别明显。单独用FI-RSV或G/AlOH免疫两次，再用RSV A2株攻击的小鼠，发生了非典型肺部炎症反应；这些炎症反应特征是攻击5天支气管肺泡灌洗(BAL)液中的嗜伊红粒细胞百分比和IL-5量呈统计学显著增加。相反，在用RSV A2株实验性感染的对照小鼠中未观察到肺嗜伊红粒细胞。
在FI-RSV中加入10倍递增剂量的IL-12显著减少了攻击后BAL液中检测到的嗜伊红粒细胞相对百分比和IL-5量。伴随IL-5和嗜伊红粒细胞的减少，血清中的抗-F和抗-G蛋白特异性IgG1抗体显著转换为IgG2a。亦即，用含有IL-12的FI-RSV接种导致IgG1显著减少和蛋白-特异性IgG2a抗体滴度的显著增加。因此，该数据提示IL-12限制了F和G蛋白-特异性Th2辅助性T细胞的诱导和它们伴随的IL-5分泌，而且，反而产生了IFN-γ分泌性Th1辅助性T细胞。因此，该结果提示FI-RSV中存在IL-12，并且最终在免疫应答的部位指导了不同Th1辅助性T细胞亚类的诱导。该数据也支持了IL-12注射可促进Th1辅助性T细胞，而阻碍FI-RSV诱导Th2辅助性T细胞的能力这一观点。
尽管在G/AlOH中加入10倍递增剂量的IL-12导致肺部IL-5浓度显著减少和抗-G和抗-F蛋白IgG亚类抗体比率发生改变，看来IL-12不能改变G/AlOH在攻击后使小鼠形成肺嗜伊红粒细胞的能力。因此，该数据提示对控制全身性体液免疫应答和嗜伊红粒细胞的移动和复制存在不同的途径。另外，可能有除IL-5以外的细胞因子在引起肺嗜伊红粒细胞中起作用。在G/AlOH中加入IL-12导致BAL液中IL-5显著减少，但对攻击后肺组织中相关的嗜伊红粒细胞百分比无显著作用。然而，在所用的试验中IL-5可能以不可检测水平存在于肺中。也可能IL-12不能限制嗜伊红粒细胞产生倾向是由于G/AlOH中有相当大量的G蛋白(与FI-RSV相比)，或天然G蛋白可能有数个能吸引嗜伊红粒细胞的表位。这些表位中的一些可能因甲醛处理而破坏。因此，在FI-RSV和G/AlOH之间吸引的嗜伊红粒细胞能力方面的差异可能是一种数量现象。IL-12不能转化由G/AlOH引起的非典型肺部炎症反应，在另一方面，可能和高度糖基化蛋白的特殊性有关。
如上所述，本文中的结果显示IL-12是针对纯化的RSV天然G和F蛋白产生全身性体液免疫应答的强大调节剂。不仅如此，IL-12的存在看来不增强与所有RSV疫苗IgG2a亚类有关的补体结合中和抗体滴度。用G/AlOH或FI-RSV二次免疫后2周未观察到血清补体结合中和抗体滴度增加。关于FI-RSV疫苗，IL-12不能确实影响中和抗体滴度可能反映甲醛处理破坏了F和G蛋白中负责诱导IgG2a补体结合抗体的表位。由于在疫苗中IL-12量增加，中和抗体和IgG1抗体减少。相反，IL-12重复性的增加了IgG2a和补体，从而增强了对F/AlOH应答的中和滴度(见表1和2，下文)。
IL-12不能影响用天然G和F蛋白接种后IgG2a补体结合中和抗体的产生，对此的解释看来更复杂。不希望受理论束缚，一个解释是在IL-12施用后增加的主要蛋白-特异性IgG2a抗体是针对非中和性表位的。另一个可能性是在G/AlOH中污染的F蛋白诱导了补体结合中和抗体，它掩盖了IL-12对G蛋白-特异性IgG2a中和抗体产生的效果。
数据提示IL-12最适剂量是在0.01和0.1微克之间；更高的IL-12剂量(10微克)显示反作用。该结论根据是疫苗产生保护性体液和细胞介导免疫应答的能力。联系在一起，结果支持重组IL-12用于疫苗配方以调节全身性体液和细胞介导免疫应答。更进一步说，在IL-12施用后，未观察到对疫苗接种者的总体健康有不良作用。
总之，本文中的结果显示IL-12作为含有矿物悬液的RSV疫苗的免疫应答调节剂是有用的。另外，免疫应答转换发生在IL-12剂量适合人用时。因此，清楚的是RSV F和G蛋白单独或和其它病毒抗原联合，用加有IL-12的明矾凝胶作佐剂，对RSV疫苗的制备特别合适。
给出以下的实施例目的是阐明本发明，但不能解释成限制本发明的范围。本文所引用的所有参考文献的内容在此纳入以备参考。
实施例
实施例1：IL-12对吸附于氢氧化铝佐剂的RSV F蛋白免疫原性的效果
研究设计
该研究目的是测定重组小鼠IL-12对用氢氧化铝佐剂配制的RSV融合蛋白免疫原性的效果。雌性原初BALB/c小鼠(8-10周龄)在0和4周时用纯化的天然融合(F)蛋白肌肉内接种。F蛋白吸附于AlOH，Alu-gel-STM(2％氢氧化铝，Serva Fine Chemicals，Westbury，NY)。
疫苗如此制备：每只小鼠接受3.0微克F蛋白/剂，100微克氢氧化铝(AlOH)/剂，和0，0.01，0.1，或1.0微克IL-12/剂。对照小鼠单独注射100微克溶于PBS的Alu-gel-STM。初次免疫4周后，二次免疫2周后，收集血清，用ELISA测定几何平均终点抗体滴度。微孔用高效纯化离子交换纯化的F蛋白包被。另外，抗病毒A2株中和抗体滴度用噬斑减少中和试验在存在和不存在补体的情况下测定。
为测定IL-12对疫苗诱导不同辅助性T细胞亚类能力的效果，在二次免疫2周后获得脾细胞悬浮液，在存在增加浓度的纯化F蛋白，纯化的UV-灭活RSV A2，CRM197，伴刀豆球蛋白A(Con A，T淋巴细胞促细胞分裂原)下或单用培养液培养6日。收集这些培养物上清液，用捕获-ELISA检测干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-5(IL-5)。
研究结果
表1所示结果是用ELISA测定的几何平均终点抗体滴度。中和抗体滴度是几何平均中和抗体滴度，系用噬斑减少中和试验在存在(+)和不存在(-)5％提供补体的血清时测定的。抗体滴度分别在初次和二次接种4和2周后测定。
IL-12分别在初次和二次接种4周(上表，表1)和2周(下表，表1)增加了F/AlOH诱导的全身性体液免疫应答。例如，用每剂0.1或1.0微克IL-12配制的F/AlOH初次免疫4周后，总IgG终点抗体滴度和单用F/AlOH接种的小鼠血清终点滴度比较，显著不同而且分别增强了10和18倍，以相似的方式，总IgG抗体滴度分别在二次接种后提高了3和8倍(下表，表1)。数据还提示IgG抗体滴度增加依赖于疫苗中IL-12的剂量。这是测定F蛋白-特异性IgG2a滴度最好的范例。和单用F/AlOH初次免疫后4周诱导的血清抗-F蛋白IgG2a抗体滴度比较，用F/AlOH和0.01，0.1或1.0微克IL-12配方的疫苗分别显著提高了4-，48-，158-倍(上表，表1)。IgG2a抗体滴度提高也见于用F/AlOH加IL-12二次接种2周之后(下表，表1)。
最重要的是，该数据提示加入IL-12能增加F/AlOH诱导补体辅助性血清中和抗体滴度的能力。注射F/AlOH加1.0微克IL-12小鼠的血清补体辅助中和抗体滴度在初次免疫4周后提高了至少7倍(上表，表1)。用0.1或1.0微克的IL-12配制的F/AlOH二次接种后，中和抗体滴度分别增加了5倍和10倍(下表，表1)。
该结果提示注射IL-12小鼠的脾脏免疫细胞在递呈抗原时，比单用明矾凝胶疫苗接种的小鼠免疫细胞有更强的复制能力(图1)。例如，用F/AlOH加0.01微克IL-12两次免疫的小鼠脾脏免疫细胞的刺激指数在与天然F蛋白体外培养后，是那些单用F/AlOH免疫小鼠的将近两倍。该结果还提示使用的IL-12剂量大于0.01微克时起反作用。接种F/AlOH加0.1或1.0微克IL-12的小鼠刺激指数小5倍。
为了估计不同剂量IL-12对铝佐剂诱导不同辅助性T细胞亚类能力的效果，制备了脾细胞悬浮液，并在有或无天然F蛋白的情况下培养。数据提示无IL-12配制的F/AlOH诱导了2类辅助性T细胞应答。在与天然F蛋白培养6日的脾细胞上清液中勉强可检测到IFN-γ(图2A)。另外，同样的上清液每毫升含有6纳克IFN-γ(图2B)。
在F/AlOH中加入IL-12看来增强了脾脏免疫细胞分泌IFN-γ的能力(图2A)。在于天然F蛋白培养6日后，单用F/AlOH或加0.01，0.1，或1.0微克IL-12分别接种的小鼠脾脏细胞分泌了每毫升上清液1，9，16和16单位的IFN-γ。然而，该数据显示疫苗中存在0.1或1.0微克IL-12和培养上清液中IL-5数量减少有关。换言之，用F/AlOH加10倍递增剂量的IL-12接种小鼠的同样上清液每毫升也分别分泌了6，13，2，和0.4纳克IL-5(图2B)。
表1：重组小鼠IL-12改变F/AlOH免疫BALB/c小鼠全身性体液免疫应答的能力
    抗体滴度
    F蛋白(x1000)*     中和+
疫苗 IL-12  IgG IgG1  IgG2a     (+)     (-)
 F／AlOHF／AlOHF／AlOHF／AlOHPBS／AlOH  1．0μg0．1μg0．01μg无无  4，621．22，554．2586．8a258．3a＜0．05  272．9263．4268．9120．3NT  1，057．4318．925．3a6．7dNT     132f2722＜20＜20     ＜20＜20＜20＜20＜20
 F／AlOHF／AlOHF／AlOHF／AlOHPBS／AlOH  1．0μg0．1μg0．01μg无无  12，862．2b4，524．93，052．2c1，521．5c＜1．0  889．4752．71，247．1630．4NT  1，730．0521．3205．4e48．0dNT     519g224h9649＜20     55322232＜20
BALB/c小鼠用吸附于氢氧化铝(AlOH，100微克/剂)的天然F蛋白(3微克/剂)第0和4周肌肉中接种。IL-12以所示剂量加入到疫苗中。对照小鼠用PBS加AlOH注射。上表和下表分别表示初次和二次接种4周和2周后的抗体滴度。
★数据为用ELISA测定的几何平均终点抗体滴度。
+数据为几何平均中和抗体滴度，用噬斑减少中和试验在存在(+)或不存在(-)5％补体的情况下测定。每组5只小鼠。
aP＜0.05对比用F/AlOH加0.1或1.0微克IL-12接种后产生的IgG滴度。
bP＜0.05对比用F/AlOH加0.0，0.01或0.1微克IL-12接种后产生的IgG滴度。
cP＜0.05对比用F/AlOH加0.1微克IL-12接种后产生的IgG滴度。
dP＜0.05对比用F/AlOH加0.01，0.1或1.0微克IL-12接种后产生的IgG滴度。
eP＜0.05对比用F/AlOH加1.0微克IL-12接种后产生的IgG滴度。
fP＜0.05对比用F/AlOH加0.0，0.01或0.1微克IL-12接种后产生的补体依赖中和抗体滴度。
gP＜0.05对比用F/AlOH加0.0或0.01微克IL-12接种后产生的补体依赖中和抗体滴度。
hP＜0.05对比用F/AlOH不加IL-12接种后产生的补体依赖中和抗体滴度。
实施例2：远处部位注射IL-12对F/AlOH诱导全身性体液免疫应答的效果
研究设计
该研究的目的是测定当重组小鼠IL-12注射到远离F/AlOH注射点部位时对全身性体液免疫应答的生物学效果。为达到该目的，雌性原初BALB/c小鼠(8-10周龄)用RSV A2株的离子交换纯化的天然融合(F)蛋白肌肉内接种。F蛋白(3微克/剂)吸附于氢氧化铝佐剂(AlOH，100微克/剂，Alu-gel-STM)。F/AlOH和10倍递增剂量的重组小鼠IL-12(1，10，100纳克IL-12/剂)联用。简单说，使用了2种F/AlOH加IL-12的免疫方案。第一种方案，各组小鼠一条腿肌肉注射F/AlOH，对侧腿接受10倍递增剂量的IL-12。第二种方案，各组小鼠用含有3种10倍递增剂量的IL-12中的1种配制的F/AlOH疫苗注射1次。该疫苗4℃培养过夜，以使IL-12最大程度吸附于AlOH。另外，对照小鼠分别单用F/AlOH，溶于PBS的F蛋白，或PBS加AlOH接种。初次接种4周后，采集血清，用ELISA测定几何平均终点抗-F蛋白IgG总抗体滴度和亚类抗体滴度。
研究结果
表2中描述的结果证实IL-12增强了F/AlOH接种诱导全身性体液免疫应答的能力。和单用F/AlOH比较，F/AlOH加10或100纳克IL-12诱导的抗-F蛋白总IgG抗体滴度在初次免疫4周后显著更高。更重要的是，疫苗中存在10或100纳克IL-12与蛋白特异性IgG2a抗体滴度的统计学增高相关(表2)。然而，该数据也提示在单剂量方案中，IL-12必须存在于注射区域。当小鼠单用F/AlOH初次接种，而IL-12注射在远离部位时，只获得统计学上较低的抗-F蛋白抗体滴度(表2)。注射F/AlOH加100纳克IL-12的小鼠蛋白特异性IgG2a抗体滴度，比那些单用F/AlOH免疫，加上100纳克IL-12施用在对侧腿免疫的小鼠群要高10倍。
表2：远处部位注射IL-12对F/AlOH初次接种4周后诱导全身性体液免
疫应答能力的效果+
    抗体滴度(Log 10)
    疫苗 纳克IL-12     #注射     #部位     IgG     IgG1     IgG2a
 F／AlOHF／AlOHF／AlOHF／AlOHF／AlOHF／AlOHF／AlOHF／PBSPBS     100100101011无无无     212121111     212121111  5．6±0．2b6．9±0．2a5．8±0．2b6．6±0．3a6．0±0．2b6．1±0．2b6．1±0．23．5±0．5＜3．0  5．3±0．2b6．0±0．1b5．5±0．2b5．9±0．2b5．5±0．2b5．6±0．2b5．5±0．23．3±0．4NT  4．7±0．3b6．2±0．2a5．0±0．3b6．0±0．3a5．2±0．4b5．4±0．3b5．2±0．3＜3．0NT
+雌性原初BALB/c小鼠用吸附于氢氧化铝(AlOH)的天然融合(F)蛋白(3微克/剂)肌肉内接种。F/AlOH和10倍递增剂量的重组小鼠IL-12(100，10，1纳克IL-12/剂)联用。使用两种F/AlOH加上IL-12的免疫方法：2注射，2部位表示小鼠-条腿肌肉注射F/AlOH，对侧腿接受10倍递增剂量的IL-12；1注射，1部位表示小鼠用含有F/AlOH加3种10倍递增剂量的IL-12之一的疫苗注射一次。另外，对照小鼠单用F/AlOH，溶于PBS的F蛋白，或PBS加上AlOH接种。数据是每组5只小鼠的几何终点滴度。
aP＜0.05远离部位注射IL-12的小鼠血清抗-F蛋白抗体滴度，和单用F/AlOH免疫的小鼠滴度相比。
bp＞0.05对比单用F/AlOH免疫的小鼠血清抗-F蛋白抗体滴度。
实施例3：IL-12对F/AlOH在血清阴性接种鼠中诱导细胞介导免疫应答能力的效果
研究设计
该实验的目的是确定IL-12加入到F/AlOH中是否能增强细胞介导免疫应答。雌性原初BALB/c小鼠(8-10周龄)用三种基于F蛋白，加上重组小鼠IL-12的疫苗中的一种肌肉内接种。天然F蛋白从RSV A2株经离子交换纯化后获得。疫苗由吸附于氢氧化铝(AlOH，100微克/剂)的F蛋白，加上三种10倍递增剂量的IL-12(0.01，0.1，和1.0微克的IL-12/剂)中的一种组成。氢氧化铝在Wyeth-Lederle Vaccines and Pediatrics,Pearl River,NY制备。对照小鼠单用F/AlOH接种，或鼻内施用模拟感染的Hep2细胞裂解液。初次接种4周后，小鼠用RSV A2(～106pFU)鼻内攻击，5日后进行支气管肺泡灌洗(BAL)。炎症细胞在和RSV-感染的同系靶细胞和对照靶细胞培养后，直接用标准的4小时51Cr释放试验测定其溶细胞活性。
研究结果
图3描述的数据显示IL-12增强了F/AlOH诱导细胞介导免疫应答的能力。初次接种F/AlOH加0.01微克IL-12(实心三角)的小鼠攻击5日后BAL细胞对RSV-感染(实线)的同系靶细胞的溶细胞活性是39％。当单用F/AlOH初次接种(实心圆形)的小鼠BAL细胞和相同的RSV-感染的同系靶细胞培养时，未检测到细胞毒作用。该结果还提示杀伤性细胞活性是抗原依赖的。接种F/AlOH加0.01微克IL-12的小鼠BAL细胞不裂解未感染病毒的同系对照靶细胞(虚线)。
该数据还提示大于0.01微克剂量的IL-12对增强细胞介导免疫应答起反作用(图3)。用F/AlOH加0.1(倒实心三角)或1.0(正实心三角)微克IL-12初次免疫导致攻击5日后，和初次接种F/AlOH加0.01微克IL-12的小鼠比较，BAL细胞的溶细胞活性分别减少3倍和8倍。
实施例4：IL-12对F/AlOH在血清阳性接种鼠中诱导细胞介导免疫应答能力的效果
研究设计
该研究的目的是测定在先前感染了RSV的接种鼠中IL-12对F/AlOH增强细胞介导免疫应答能力的效果。雌性原初BALB/c小鼠(8-10周龄)通过RSV A2株实验性感染进行初次免疫。4周后，小鼠用三种基于F蛋白的疫苗加重组小鼠IL-12中的一种注射。疫苗由吸附于氢氧化铝(AlOH，100微克/剂)的F蛋白加上三种10倍递增剂量的IL-12(0.01，0.1，和1.0微克的IL-12/剂)中的一种组成。氢氧化铝在Wyeth-Lederle Vaccines and Pediatrics制备。对照小鼠用RSV感染初次免疫，用F/AlOH单独二次接种，或鼻内施用模拟感染的Hep2细胞裂解液。二次接种2周后，小鼠用RSV A2(～106PFU)鼻内攻击，5日后进行支气管肺泡灌洗(BAL)。炎症细胞在和RSV-感染的同系靶细胞和对照靶细胞培养后，直接用标准的4小时51Cr释放试验测定其溶细胞活性。
研究结果
图4描述的数据显示IL-12的所有三种剂量都放大了F/AlOH增强先前感染RSV小鼠的细胞介导免疫应答的能力。二次接种F/AlOH加0.1微克IL-12(倒实心三角)的小鼠攻击5日BAL细胞对RSV-感染(实线)同系靶细胞的溶细胞活性是58％(效∶靶比=54∶1)。当以感染初次免疫和单用F/AlOH二次接种(实心圆形)的小鼠BAL细胞和相同的RSV-感染同系靶细胞培养时，细胞毒活性为35％。当杀伤性细胞活性以18∶1效∶靶比检测时，上述细胞毒活性分别是52％和27％。该结果还提示杀伤性细胞活性是抗原依赖的。用RSV初次免疫，并用F/AlOH加IL-12二次接种的小鼠BAL细胞不裂解未感染病毒的同系对照靶细胞(虚线)。
该数据还提示F/AlOH扩充细胞介导免疫应答的能力依赖于疫苗中的IL-12剂量(图4)。在血清阳性的动物中，抗原依赖性杀伤性细胞活性的最高水平看来出现在用F/AlOH加0.1微克IL-12二次免疫的小鼠攻击5日后的肺中(倒实心三角，图4)。
实施例5：IL-12对非典型肺部炎症反应产生倾向的效果
研究设计
该研究的目的是测定高度纯化天然G蛋白或Pfizer Lot 100甲醛灭活疫苗的复制品使BALB/c小鼠在攻击后易产生非典型肺部炎症反应能力的效果。两种疫苗都吸附于氢氧化铝佐剂。
雌性原初BALB/c小鼠(8-10周龄)于0和4周时用1微克吸附于氢氧化铝(AlOH，Alu-gel-STM，Serva，100微克剂量)佐剂的纯化天然结合糖蛋白(G)或0.1ml甲醛-灭活的RSV(FI-RSV)肌肉内接种。FI-RSV疫苗是最初由Pfizer配制的Lot-100的复制品，而且吸附于AlOH(1600微克剂量)。该疫苗用作非典型肺部炎症反应，一种对亚基疫苗不良性免疫反应的基础模型。
IL-12以10倍递增剂量(0.1到10.0微克IL-12/剂)加到G/AlOH和FI-RSV中。小鼠的其它伴随组用RSV的A2株感染(0.05ml鼻内)，用吸附于AlOH(1600微克/剂)的0.1ml甲醛-灭活的副流感病毒3型(FI-PIV3)疫苗肌肉内注射，或鼻内施用50微升模拟-感染的Hep2细胞裂解液(模拟)。二次接种2周后，收集血清，在包被有亲和纯化的G蛋白或离子交换纯化的F蛋白的微孔中用ELISA测定几何平均终点抗体滴度。还在存在或不存在补体的情况下用噬斑减少中和试验测定了几何平均中和抗体滴度。
为了特性分析IL-12对局部肺部炎症反应的效果，在用感染性病毒(RSVA2，～106 PFU)攻击5日后进行了支气管肺泡灌洗(BAL)。炎症细胞形态学用DIF-QIK_(染色白细胞的试剂；Baxter International,Inc.,Deerfield,Illinois)对细胞制备物染色后进行测定，对至少400个细胞进行计数。通过捕获-ELISA测定了BAL液中IFN-γ和IL-5的存在。通过用ANOVA(用JMP软件分析方差；SAS Institute,Cary,North Carolina)比较OD490后测定了各组之间IL-5和IFN-γ分泌的统计学差异。
研究结果
数据提示用Lot-100 FI-RSV疫苗的复制品胃肠外免疫使BALB/c小鼠易于产生F和G蛋白-依赖的辅助性T细胞应答，其中占优势的是2类(Th2)表型。二次免疫2周后的血清抗-G(表3)和血清抗-F(表4)蛋白IgG1对IgG2a抗体比率支持该结论。用FI-RSV二次免疫后观察到的血清抗-F蛋白IgG1对IgG2a抗体滴度比率为75.3(表4)。类似的，二次接种2周后观察到的血清抗-G蛋白IgG1对IgG2a抗体滴度比率大于184.2(表3)。
另外，FI-RSV免疫与IL-5产生的升高以及攻击5日后BAL液中非典型肺炎症免疫反应的诱导相关(表6)。
表6“％EOS”栏中的结果是病毒攻击5日后BAL液中计数的嗜伊红粒细胞(EOS)的几何平均相对百分比。“ND”表示未检测到。IL-5用捕获ELISA检测，从标准曲线定量。“IL-5(OD)”栏中的结果是几何平均光密度(OD490)。
接种FI-RSV的小鼠攻击5日后在肺中观察到的嗜伊红粒细胞(EOS)的几何平均相对百分比(38.5％)，当与接种FI-PIV3(6.5％)并经历了初次感染的对照小鼠比较时，或与实验性感染(＜1.0％)而免疫的小鼠比较时，有显著提高(表6)。另外，接种FI-RSV(106pg/ml)的小鼠分泌到灌洗液中的IL-5量，当与接种FI-PIV3(＜8pg/ml)或感染性病毒(＜35pg/ml)小鼠感染5日后的灌洗液体比较时，有显著提高(表6)。
结果表明在该研究中所用的G蛋白含有的F蛋白浓度对BALB/c小鼠具有免疫原性。值得注意的是，G/AlOH二次接种2周后观察到了抗-F蛋白总IgG抗体滴度(表4)。该数据显示G和G/AlOH中污染的F蛋白，和FI-RSV疫苗类似，主要诱导Th2辅助性T细胞亚类。二次接种后血清抗-F蛋白IgG1对IgG2a抗体比率为大于617(表4)。与此相似，G/AlOH二次接种后血清G蛋白特异性IgG1对IgG2a抗体比率大于1251(表3)。另外，G/AlOH免疫和非典型肺炎症免疫反应的诱导以及攻击5日后BAL液中IL-5的存在相关(表6)。G/AlOH二次接种的小鼠攻击5日后在肺中观察到的嗜伊红粒细胞(EOS)几何平均相对百分比(35.0％)，当与接种FI-PIV3(6.5％)，并经历了初次感染的对照小鼠比较时，有显著提高。另外，接种G/AlOH(167pg/ml)的小鼠分泌到灌洗液中的IL-5量，当与接种模拟感染的Hep-2细胞裂解液(＜35pg/ml)，感染性病毒(＜35pg/ml)，或FI-PIV3(＜8pg/ml)的小鼠感染5日后的灌洗液体比较时，有显著提高(表6)。
和用FI-RSV或G/AlOH接种相反，感染RSV野生型A2株引起F蛋白依赖的1型(Th1)辅助性T细胞应答。包含在感染性病毒中的F蛋白诱导的全身性体液免疫应答的特征是二次血清抗-F蛋白IgG1对IgG2a抗体比率小于1.0(表4)。最重要的是，非典型肺部炎症反应和先前RSV感染无关(表6)。肺嗜伊红粒细胞在经历了初次感染的原初小鼠中未观察到(表6)。
该结果提示IL-12对用复制品疫苗或G/AlOH接种后产生的体液免疫应答有极大的作用。该结果提示IL-12剂量是重要的。例如，数据显示在污染了F蛋白的G/AlOH中加入0.1或1.0微克IL-12，导致血清抗-F蛋白IgG2a抗体滴度(与单用G/AlOH接种的小鼠滴度比较)，分别增加4倍和1，300倍(表4)。
在G/AlOH中加入10微克IL-12后，也观察到IL-12的抑制效果。该数据暗示IL-12限制了G/AlOH引起抗-F蛋白IgG1抗体滴度的能力。当与单用G/AlOH产生的滴度比较时，用G/AlOH加10微克IL-12二次免疫产生显著减少5倍的IgG1抗体滴度(表4)。该数据暗示10微克IL-12抑制了Lot-100复制品疫苗诱导其特征性抗-F蛋白总IgG抗体滴度的能力。血清抗体滴度比用FI-RSV加0.1微克IL-12两次免疫的小鼠低17倍(表4)。
表3和4显示的结果是用ELISA测定的几何平均终点抗体滴度。1/2a是几何平均IgG1对IgG2a亚类抗体滴度的比率。“NT”表示未测试；“ND”表示未测到。
加入IL-12看来不显著改变用FI-RSV或G/AlOH二次接种后产生的抗-G蛋白总IgG抗体滴度的数量级(表3)。然而，疫苗中IL-12的存在显著减少了IgG1抗体滴度，而IgG2a蛋白特异性抗体滴度显著提高(表3)。
该结果提示IL-12改变了疫苗诱导Th2和Th1辅助性T细胞应答的能力。血清G和F蛋白特异性IgG1和IgG2a抗体滴度的转换(表3和4)支持这一假设。例如，二次免疫2周后，G/AlOH加0.1微克IL-12免疫小鼠血清的F蛋白-特异性抗体亚类比率从617.1减少到92.1(表4)。另外，每剂IL-12从0.1微克10倍增加到1.0微克导致F蛋白-特异性抗体亚类比率减少到0.1。然而，该数据提示大于1.0微克的IL-12剂量起反作用。例如，在用G/AlOH加1.0微克IL-12二次接种后诱导的F蛋白特异性IgG2a抗体亚类滴度与单用G/AlOH诱导的比较时，高1,300倍(表4)。然而，用G/AlOH加10微克IL-12免疫导致的F蛋白-特异性IgG2a亚类抗体滴度与用G/AlOH加1.0微克IL-12接种后产生的相当。
以上数据提示，IL-12通过诱导不同的辅助性T细胞亚类，具有改变攻击后肺组织中嗜伊红粒细胞浸润和/或复制的能力。这是IL-12作用于疫苗使小鼠在攻击5日后增加IL-5量和肺中嗜伊红粒细胞相对百分比能力改变的典型范例(表6)。当与单用FI-RSV接种的小鼠BAL液比较时，在FI-RSV疫苗中加入0.1或1.0微克IL-12分别显著减少了IL-5量和嗜伊红粒细胞的相对数量(表6)。在G/AlOH中加入每剂1.0微克IL-12也导致攻击后BAL液中IL-5量的减少。然而，IL-12看来对G/AlOH使BALB/c小鼠在攻击后易于产生肺嗜伊红粒细胞的能力没有任何转换效果(表6)。值得注意的是，受RSV A2株感染而免疫的小鼠中未观察到非典型肺部炎症反应。另外，在初次感染5日后对照小鼠的肺中未观察到IL-5和嗜伊红粒细胞(表6)。IFN-γ在所有被测试的组中都位于或靠近基线处(数据未显示)。
表5中显示的结果是几何平均中和抗体滴度。此滴度分别在初次和二次接种的4周和2周后在存在(+)或不存在(-)5％血清作为补体源的情况下用噬斑减少中和实验测定。
尽管IL-12转换了F和G蛋白-特异性IgG1对IgG2a抗体亚类的比率，但分别在初次和二次接种后的4周和2周后，补体辅助性中和抗体滴度没有统计学意义的增加(表5)。的确，该结果提示IL-12减少了二次接种2周后的血清中和抗体滴度。单用FI-RSV接种的小鼠的几何平均血清中和抗体滴度要比FI-RSV加10微克IL-12接种小鼠至少高4倍。在G/AlOH中10微克IL-12的存在也和二次接种2周后补体-非依赖性中和抗体有统计学意义的10倍减少相关。然而，由污染了F蛋白的G/AlOH诱导的补体-依赖性中和抗体滴度和用实验性感染接种的小鼠相同(表5)。
表3：IL-12对用FI-RSVa二次接种2周后血清G蛋白特异性IgG亚类抗体滴度的效果
    抗-G蛋白抗体滴度
疫苗 IL-12(μg)     IgG     IgG1  IgG2A       1／2a
 FI-RSVFI-RSVFI-RSVFI-RSVFI-PIV3     1010．100     8，35933，13667，62119，568c592     ＜1001622，7749，209dNT     200°          ＜0．52，013    0．12，942    0．9＜50f   ＞184．2NT        ND
 G／AlOHG／AlOHG／AlOHG／AlOHRSV模拟     1010．1000     629，245846，753575，6131，183，142557，743＜50     32，47073，028108，976614，243g72，432NT     113，378  0．3304，257  0．2113，700  1．0491h     1，251．0106，366  0．7NT        ND
表3图例说明
a数据是几何平均终点抗体滴度。该滴度用ELISA对二次接种2周后收集的血清测定。NT和ND分别表示未测试和未测到。每组5只小鼠。
bP＜0.05对比单用FI-RSV或加0.1或1.0微克IL-12接种的小鼠血清总IgG抗体滴度。
cP＜0.05对比用FI-RSV加0.1微克IL-12接种的小鼠血清总IgG抗体滴度。
dP＜0.05对比用FI-RSV加1.0或10.0微克IL-12接种的小鼠血清IgG1抗体滴度。
eP＜0.05对比用FI-RSV加0.1微克IL-12接种的小鼠血清IgG2a抗体滴度。
fP＜0.05对比用FI-RSV加0.1或1.0微克IL-12接种的小鼠血清IgG2a抗体滴度。
gP＜0.05对比用G/AlOH加10.0微克IL-12接种的小鼠血清IgG1抗体滴度。
hP＜0.05对比用G/AlOH加0.1，1.0或10.0微克IL-12接种的小鼠血清IgG2a抗体滴度。
表4：IL-12对用FI-RSV二次免疫2周后产生血清抗-F蛋白抗体滴度的效果a
    抗-F蛋白抗体滴度
疫苗 IL-12(μg)     IgG     IgG1     IgG2A       1／2a
 FI-RSVFI-RSVFI-RSVFI-RSVFI-PIV-3     1010．100     58，884b601，243980，212250，576c148     376d33，27436，18874，814＜50     21，698e    0．292，944      0．4201，813     0．2993f        75．3＜50         ND
 G／AlOHG／AlOHG／AlOHG／AlOHRSV模拟     1010．1000     479，623819，426989，555450，3081，808，423＜50     37，404g38，925g106，930193，754103，954NT     136，748h   0．3410，869h   0．11，161       92．1314          617．1389；162     0．3NT           ND
表4图例说明
a数据是几何平均终点抗体滴度。该滴度用ELISA对二次接种2周后收集的血清测定。NT和ND分别表示未测试和未测到。每组5只小鼠。
bP＜0.05对比用FI-RSV加0.1或1.0微克IL-12接种的小鼠血清总IgG抗体滴度。
cP＜0.05对比用FI-RSV加0.1，1.0或10.0微克IL-12接种的小鼠血清总IgG抗体滴度。
dP＜0.05对比单用FI-RSV或加0.1或1.0微克IL-12接种的小鼠血清IgG1抗体滴度。
eP＜0.05对比单用FI-RSV或加0.1微克IL-12接种的小鼠血清IgG2a抗体滴度。
fP＜0.05对比用FI-RSV加0.1或1.0微克IL-12接种的小鼠血清IgG2a抗体滴度。
gP＜0.05对比单用G/AlOH接种的小鼠血清IgG1抗体滴度。
hP＜0.05对比单用G/AlOH或加0.1微克IL-12接种的小鼠血清IgG2a抗体滴度。
表5：IL-12对吸附于AlOH的天然G蛋白和FI-RSV诱导血清中和抗体能力的效果
中和抗体滴度★
    初次     二次
疫苗b IL-12(μg)     (+)     (-)     (+)     (-)
 FI-RSVFI-RSVFI-RSVFI-RSVFI-PIV3    10．01．00．1无无     ＜10132711＜10     ＜10＜10＜10＜10＜10     ＜203490c85c＜20     ＜20＜20＜20＜20＜20
 G／AlOHG／AlOHG／AlOHG／AlOHRSV模拟    10．01．00．1无无无     381509941194＜10     ＜1013221214＜10     1，1162，1551，9353，2782，794＜20     35d67d117382113＜20
a数据为几何平均中和抗体滴度。该滴度分别在初次和二次接种4周和2周在存在(+)或不存在(-)5％补体的情况下用噬斑减少中和试验测定。每组5只小鼠。
bBALB/c小鼠单用FI-RSV或G/AlOH，或加10倍递增剂量的重组小鼠IL-12肌肉内免疫。
cP＜0.05对比用FI-RSV加1.0或10.0微克IL-12，或FI-PIV3接种的小鼠血清中和抗体滴度。
dP＜0.05对比单用G/AlOH，1微克IL-12，或10微克IL-12接种的小鼠血清中和抗体滴度。
表6：IL-12对用吸附于AlOH的天然G蛋白或甲醛-灭活的RSV接种的
BALB/c小鼠以RSV A2株攻击5日后肺部炎症反应的效果
    疫苗b     IL-12     ％EOSb     IL-5(pg／ml)     IL-5(OD)c
 FI-RSVFI-RSVFI-RSVFI-RSVFI-PIV3     10．010．100     ND10．917．838．5d6．5     ＜7＜7＜10106＜8     0．0290．0350．0440．160f0．036
 G／AlOHG／AlOHG／AlOHG／AlOHRSV模拟     10．010．1000     31．124．732．835．0＜1．0eND     502437167＜35＜35     0．1150．0740．0960．191g0．0280．035
aBALB/c小鼠在第0和4周用甲醛灭活的RSV(FI-RSV)加上10倍递增剂量的重组小鼠IL-12肌肉内免疫。
对照小鼠用灭活的副流感病毒3型(FI-PIV3)，混合有QS-21的天然融合蛋白(F/QS-21)或用RSV A2株感染。
其它对照小鼠鼻内施用模拟感染的Hep2细胞裂解液(模拟)，或肌肉内注射PBS/QS-21。
b数据是病毒攻击5日后BAL液中计数的嗜伊红粒细胞(EOS)几何平均相对百分比。ND表示未测到。
cIL-5用捕获ELISA检测，用标准曲线定量。数据是几何平均光密度(OD490)。
dP＜0.05对比用FI-PIV3或FI-RSV加1.0微克IL-12接种的小鼠检测到的嗜伊红粒细胞数。
eP＜0.05对比单用G/AlOH或FI-RSV接种的小鼠检测到的嗜伊红粒细胞数。
fP＜0.05对比用FI-RSV加0.1，1.0，或10.0微克IL-12接种的小鼠检测到的IL-5(OD490)。
gP＜0.05对比用FI-RSV加1.0微克IL-12接种的小鼠检测到的IL-5(OD490)。
实施例6：IL-12对F/AlOH诱导BALB/c小鼠产生保护性免疫应答能力的效果
研究设计
该研究的目的是调查IL-12促进F/AlOH在肺中诱导保护性免疫应答的能力。雌性原初BALB/c小鼠(8-10周龄)用RSV A2株的离子交换纯化的天然融合(F)蛋白肌肉内初次接种。F蛋白(30纳克/剂)单独和PBS，或和重组小鼠IL-12(10或100纳克IL-12/剂)两种剂量中的一种联用。F蛋白和IL-12吸附于氢氧化铝(AlOH，100微克/剂)4℃过夜。其它对照小鼠用RSV A2株实验性感染而免疫。初次免疫4周后，所有小鼠用RSV A2(50微升，～5x106PFU)攻击。4天后分析肺组织中病毒复制水平。简单说，整块切下肺和器官组织，匀浆，澄清，速冻，储存在-70℃直到分析感染性病毒。呼吸道组织中病毒复制水平用Hep-2细胞单层噬斑试验分析。初次接种4周后收集血清，用ELISA测定几何平均终点抗-F蛋白总IgG抗体滴度和IgG亚类抗体滴度。几何平均血清中和抗体滴度在存在或不存在5％补体的情况下也通过针对病毒A2株的噬斑减少中和试验来测定。
研究结果
图5显示的结果是攻击4日后测定的每克肺组织中病毒几何平均噬斑形成单位(PFU)。表7中描述的数据是用ELISA测定的几何平均终点抗-F蛋白IgG抗体滴度。中和抗体滴度是几何平均中和抗体滴度，在存在(+)或不存在(-)5％补体的情况下用噬斑减少试验测定。抗体滴度在初次接种4周后测定。
在F/AlOH中加入10或100纳克IL-12诱导的免疫应答比用仅溶于PBS的F/AlOH初次免疫4周后引起的免疫应答显然更有效。初次免疫用F/AlOH加10或100纳克IL-12并用RSV A2攻击的小鼠肺组织中未检测到感染性病毒(图5)。相反的，单用溶于PBS的F/AlOH，或单用PBS/AlOH初次接种的小鼠肺中含有大于3log10PFU的病毒。
检测了血清中F蛋白-特异性终点IgG和补体-辅助性中和抗体的滴度，提示用IL-12配制的疫苗的效力增强和全身性体液免疫应答提高相关(表7)。用F/AlOH加100纳克IL-12免疫后产生的平均补体-辅助性中和抗体滴度比用溶于PBS中的F/AlOH单独接种的小鼠的滴度要高得多。不仅如此，用F/AlOH加10纳克IL-12免疫不导致F蛋白-特异性终点IgG滴度和补体-辅助性中和抗体滴度提高(表7)。然而，这些小鼠的肺抑制了病毒复制(图5)。因此，IL-12、全身性体液免疫应答的增加、和促进效果之间的关联不能建立。在所有的类似情况下，关联的缺少和疫苗中F蛋白少于最适的30纳克剂量有关。不管怎样，少量加入10纳克IL-12增强了F/AlOH诱导BALB/c小鼠产生全身性免疫应答的能力，它比用溶于PBS的F/AlOH单独接种后产生的应答要明显有效得多。
表7：重组小鼠白细胞介素-12对吸附于氢氧化铝(AlOH)佐剂的融合
(F)蛋白诱导BALB/c小鼠产生保护性免疫应答能力的效果
    血清抗体滴度(Log10)_
    抗-F蛋白     中和
抗原 IL-12(ng)     IgG     IgG1     IgG2a     +      -
 F／AlOHF／AlOHF／AlOHPBSRSV     无10100无无  5．7±0．16．2±0．2b6．3±0．8b＜3．05．6±0．1  5．3±0．25．7±0．3b5．7±0．7b＜3．04．6±0．2  3．2±1．14．7±1．3b5．0±1．7a＜3．05．9±0．9  1．5±0．22．2±0．9b2．5±0．8*＜1．32．3±0．3     ＜1．31．31．3＜1．31．4
≠BALB/c小鼠用吸附于氢氧化铝(AlOH，100微克/剂)的离子交换纯化的F蛋白(30纳克/剂)肌肉内接种。F/AlOH单独和PBS，或和100或10纳克重组小鼠IL-12/剂联用。其它对照小鼠用RSV A2株实验性感染来免疫。数据是几何终点IgG滴度和中和抗体滴度(log10)±1个平均标准偏差(每组5只小鼠)。中和抗体滴度(log10)在存在(+)或不存在(-)5％补体的情况下测定。
aP＜0.05对比用溶于PBS的F/AlOH接种的小鼠血清抗体滴度。
bP＞0.05对比用溶于PBS的F/AlOH接种的小鼠血清抗体滴度。
等效例
本领域中熟练技术人员使用常规实验方法将会认识，或能够确定，本文所述的本发明具体实施例的许多等效例。这些等效例应包括在本发明的范围中。

Claims (27)

1．一种疫苗组合物，其特征在于：它包括呼吸道合胞病毒抗原，辅佐剂量的白细胞介素-12和矿物悬液的混合物，以及可任选的包括生理学上可接受的载体。
2．如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于：白细胞介素-12吸附于矿物悬液。
3．如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于：白细胞介素-12是人白细胞介素-12。
4．如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于：矿物悬液是明矾的水悬浮液。
5．如权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于：明矾是氢氧化铝或磷酸铝。
6．如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于：呼吸道合胞病毒抗原选自RSV F蛋白，RSV G蛋白，以及它们的组合。
7．如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于：呼吸道合胞病毒抗原偶联于载体分子。
8．如权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于：所述载体分子选自破伤风毒素、白喉毒素、百日咳毒素和它们的无毒性变体。
9．如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于：白细胞介素-12的佐剂剂量为约0.01微克到约1.0微克。
10．一种诱导针对呼吸道合胞病毒抗原免疫应答的方法，其特征在于：所述方法包括对脊椎动物宿主施用有效剂量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括呼吸道合胞病毒抗原，辅佐剂量的白细胞介素-12和矿物悬液的混合物，以及可任选地包括生理学上可接受的载体。
11．如权利要求10所述的方法，其特征在于：白细胞介素-12吸附于矿物悬液。
12．如权利要求10所述的方法，其特征在于：白细胞介素-12是人白细胞介素-12。
13．如权利要求10所述的方法，其特征在于：矿物悬液是明矾的水悬浮液。
14．如权利要求13所述的方法，其特征在于：明矾是氢氧化铝或磷酸铝。
15．如权利要求10所述的方法，其特征在于：白细胞介素-12的佐剂剂量为约0.01微克到约1.0微克。
16．如权利要求10所述的方法，其特征在于：呼吸道合胞病毒抗原偶联于载体分子。
17．如权利要求16所述的方法，其特征在于：所述载体分子选自破伤风毒素、白喉毒素、百日咳毒素和它们的无毒性变体。
18．如权利要求10所述的方法，其特征在于：呼吸道合胞病毒抗原选自RSV F蛋白，RSV G蛋白，以及它们的组合。
19．一种免疫原性组合物，其特征在于：包括呼吸道合胞病毒抗原，辅佐剂量的白细胞介素IL-12和矿物悬液的混合物，以及可任选的包括生理学上可接受的载体。
20．如权利要求19所述的免疫原性组合物，其特征在于：白细胞介素-12吸附于矿物悬液。
21．如权利要求19所述的免疫原性组合物，其特征在于：白细胞介素-12是人白细胞介素-12。
22．如权利要求19所述的免疫原性组合物，其特征在于：矿物悬液是明矾的水悬浮液。
23．如权利要求22所述的免疫原性组合物，其特征在于：明矾是氢氧化铝或磷酸铝。
24．如权利要求19所述的免疫原性组合物，其特征在于：呼吸道合胞病毒抗原选自RSV F蛋白，RSV G蛋白，以及它们的组合。
25．如权利要求19所述的免疫原性组合物，其特征在于：呼吸道合胞病毒抗原偶联于载体分子。
26．如权利要求25所述的免疫原性组合物，其特征在于：所述载体分子选自破伤风毒素、白喉毒素、百日咳毒素和它们的无毒性变体。
27．如权利要求19所述的免疫原性组合物，其特征在于：白细胞介素-12的辅佐剂量为约0.01微克到约1.0微克。
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