JP2002502883A

JP2002502883A - インターロイキン−１２および呼吸合法体ウイルス抗原を含んで成るワクチン

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Publication number: JP2002502883A
Application number: JP2000531188A
Authority: JP
Inventors: ハンコツク，ジエラルド・イー; エルドリツジ，ジヨン・エイチ
Original assignee: アメリカン・サイアナミド・カンパニー
Priority date: 1998-02-12
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 2002-01-29
Also published as: IL137810A0; KR20010040932A; WO1999040937A2; EP1053016A2; BR9907885A; AU2596699A; CN1295480A; WO1999040937A3; CA2320042A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、RSV抗原のような抗原、および懸濁状の鉱物に吸着することができるインターロイキンIL-12を含んで成るワクチン組成物に関する。このようなワクチン組成物は、抗原に対する防御免疫反応をモジュレートする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）発明の背景免疫系は、病原体を攻撃するために多くの機構を使用する：しかしこのような
機構のすべてが免疫感作後に賦活化される必要はない。ワクチンにより誘導され
る防御免疫は、病原体に抵抗する、またはそれを排除するための適切な免疫応答
を誘導するワクチンの能力に依存する。病原体に依存して、これには細胞性およ
び／または体液性免疫反応が必要である。

【０００２】免疫反応におけるヘルパーＴ細胞の役割に関する代表例は、Ｔ細胞がそれらが
生産するサイトカインに基づきサブセットに分けられ、そしてこのような細胞中
で観察されるサイトカインの独特なプロフィールによりそれらの機能が決定され
る。このＴ細胞モデルには２つの主要なサブセットを含む：細胞性および体液性
免疫反応の両方を上昇させるIL-2およびインターフェロン-γ（IFN-γ）を生産するTh1細胞、および体液性免疫反応を上昇させるIL-4、IL-5およびIL-10を生産
するTh2細胞である（Mosmannら、J.Immumol.126:2348(1986))。多くの場合、免疫感作された生物中でより強い免疫反応を得るために抗原の免疫原的効力を強化
すること、そして抗原をもつ病原体に対する宿主の抵抗性を強化することが望ま
しい。一緒に投与される抗原の免疫原性を強める物質は、アジュバントとして知
られている。例えばある種のリンホカインはアジュバント活性を有し、これによ
り抗原に対する免疫反応を強化する（Nencioniら、J.Immumol.139:800-804(1987
)；Howardらへの欧州特許第285441号明細書）。

【０００３】発明の要約本発明は、１以上の呼吸合胞体ウイルス（RSV）抗原、インターロイキン IL-1
2および懸濁状の鉱物の混合物を含んで成るワクチン組成物に関する。IL-12は鉱
物懸濁物に吸着させるか、または単にそれらと混合することができる。本発明の
特定の態様では、IL-12をミョウバン（例えば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム）のような鉱物懸濁物に付着させる。このようなワクチン組成物は
抗原に対する防御免疫をモジュレートし；すなわちワクチン組成物は量的および
質的にワクチン接種された宿主の抗体反応を改善することができ、そして病原体
に対する防御反応に関して細胞性免疫を量的に上昇させることができる。本発明
の特定の態様では、RSV抗原はRSV Ｆおよび／またはＧタンパク質抗原である。

【０００４】本発明はまた、RSV抗原およびIL-12と懸濁状の鉱物を混合することを含んで成
るワクチン組成物の調製法に関する。特に、IL-12は鉱物懸濁物上に吸着させる。また本発明は、防御免疫反応に関してワクチンの体液性および／または細胞性
免疫を誘導する、または上昇させる方法に関し、この方法は脊椎動物宿主に、RS
V抗原、IL-12および懸濁状の鉱物の混合物を生理学的に許容できる溶液中に含ん
で成るワクチン組成物の効果的量を投与することを含んで成る。特にIL-12は鉱物懸濁物に吸着している。

【０００５】発明の詳細な説明 IL-12は種々の抗原提示細胞、主にマクロファージおよび単球により生産される。これは自然なＴ細胞からTh1細胞の誘導に重要な要素である。IL-12の生産ま
たはそれに対して反応する能力は、例えば寄生体の感染中、最も顕著なものでは
リーシュマニア症（Scottら、米国特許第5,571,515号明細書）で、防御的なTh1-
様反応の発生に極めて重要となることが示された。IL-12の効果は、ＮＫ細胞およびＴヘルパー細胞により生産されるIFN-γにより媒介される。IFN-γは、Ｔ−
依存的タンパク質抗原に対するIgG2a抗体の誘導（FinkelmanおよびHolmes,Annu. Rev.Immunol.8 :303-33(1990)に、そしてＴ−依存的抗原に対するIgG3反応（Snap
perら、J.Exp.Med.175:1367-1371(1992)に重要である。インターロイキン-12（I
L-12）は始めはナチュラルキラー細胞刺激因子と呼ばれたが、ヘテロ二量体サイ
トカインである（Kobayashiら、J.Exp.Med.170:827(1989)）。組換え宿主細胞中
でのIL-12タンパク質の発現および単離は、国際公開第90/05147号明細書に記載されている。

【０００６】本明細書に記載する研究は、呼吸合胞体ウイルス（RSV)ワクチン中のアジュバ
ントとしてのIL-12の利用性に関する。したがって本発明はRSV抗原、IL-12および懸濁状の鉱物の混合物を含んで成るワクチン組成物に関する。本発明の特定の
態様では、IL-12はミョウバン（例えば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム）のような鉱物懸濁物に付着させる。このようなワクチン組成物は抗原に
対する防御免疫反応をモジュレートする；すなわちワクチン組成物は、病原体抗
原に対する防御反応に関してワクチン接種された宿主の細胞性免疫を誘導するこ
とができる。特定の態様では、抗原はRSV Ｆタンパク質および／またはＧタンパ
ク質である。

【０００７】 IL-12は数種の適当な源から得ることができる。これは組換えＤＮＡ法により生産することができ；例えばヒトIL-12をコードする遺伝子を宿主系にクローン化し、そして発現させて、大量の純粋なヒトIL-12を生産することが可能である。また本発明に有用であるのは、IL-12の生物学的に活性なサブユニットまたは断片である。さらに、特定のＴリンパ球系は高レベルのIL-12を生産し、すなわち即座に利用できる供給源を提供する。市販されている組換えヒトおよびマウス
IL-12の供給源には、ジェネティックスインスティチュート社（Genetics Insti
tute,Inc.：ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を含む。本発明の抗原、例えばRSV抗原は哺乳動物宿主のような脊椎動物中で抗原に対する免疫反応を誘導するために使用することができる。例えば抗原はRSV Fタンパク質（Collinsら、Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 81 :7683-7687 (1984）またはＧタンパク質(Satakeら、Nu c. Acids Res.13 :7795-7812(1985)抗原または免疫反応を刺激する能力を保持するそれらの部分であることができる。そのような免疫原性部分の例は、RSV Fタンパク質のアミノ酸部分283-315、289-315および294-299を含んで成る。このような領域は中和およびアンチフュージョン(antifusion)抗体の両方を誘導するRS
V Fタンパク質のエピトープを含む（Paradisoら、米国特許第5,639,853号明細書
）。あるいは自然な二量体状態のRSV Fタンパク質（140kD)を使用することもできる（Paradisoら、米国特許第5,223,254号明細書）。

【０００８】本発明の方法は、この方法は脊椎動物に、抗原、例えばFおよび／またはＧタンパク質のようなRSV抗原、アジュバント量のIL-12および懸濁状の鉱物の混合物
を含んで成るワクチン組成物の免疫的に効果的な用量を投与することを含んで成
る。特にIL-12は鉱物懸濁物に吸着している。本明細書で使用するように、IL-12
の「アジュバント量」とは、ワクチン抗原、例えばＦおよび／またはＧタンパク
質のようなRSV抗原に対する免疫反応を強化またはモディファイするために十分であるIL-12の量を意味するものとする。本明細書で使用するワクチン組成物の「免疫的に効果的な」用量とは、免疫反応を誘導するために適当な用量である。
具体的な用量は、処置する脊椎動物の年齢、体重、および医学的状態、ならびに
投与方法に依存する。適当な用量は当業者により容易に決定されるだろう。ワク
チン組成物は場合によっては、生理食塩水またはグリセロールもしくはプロピレ
ングリコールのようなエタノールポリオールのような医薬的にまたは生理学的に
許容できる賦形剤中で投与することもできる。

【０００９】ワクチン組成物は場合により、植物油またはそれらの乳剤、表面活性物質、例
えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、オクタデシルアミン
、リソレシチン、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド、N,N-ジコク
タデシル-N'-Nビス(2-ヒドロキシエチル-プロパンジアミン)、メトキシヘキサデ
シルグリセロールおよびプルロニックポリオール；ポリアミン、例えばピラン、
硫酸デキストラン、ポリIC、カルボポール；ペプチド、例えばムラミルジペプチ
ド、ジメチルグリシン、タフトシン、免疫刺激複合体；油性乳剤；MPL(商標)(3-
O-脱アシル化モノホスホリルリピッドＡのようなリポ多糖；RIBIイムノンケムリサーチ社(ImmunoChem Research,Inc.)、ハミルトン、モンタナ州）；および鉱
物ゲルのようなさらなるアジュバントを含んで成ることができる。本発明の抗原
はリポソーム、コキレート（cochleate)、ポリ−ラクチド、ポリ−グリコライド
およびポリ−ラクチド−コ−グリコライドのような生分解性ポリマー、またはIS
COMS（免疫刺激複合体）中に包含することもでき、そして補助的な有効成分も使
用することができる。本発明の抗原は、細菌毒素およびそれらの弱毒化誘導体と
組み合わせて投与することもできる。本発明の抗原は限定するわけではないがIL
-2、IL-3、IL-15、IFN-γおよびGM-CSFを含む他のリンホカインと組み合わせて投与することもできる。

【００１０】ワクチンはヒトまたは動物に、限定するわけではないが非経口的、イントラル
テリアル（intrarterial)、皮内的、経皮的（徐放性ポリマーの使用によるような）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口および鼻内の投与経路を含む様々な
経路で投与することができる。そのようなワクチン内で使用する抗原の量は、抗
原の同一性に大変依存するだろう。多くのキャリアー抗原で使用される確立され
た用量範囲を、本発明のワクチンに適合するように調整または操作することは、
十分に当業者の能力の範囲内であろう。本発明のワクチンは未成熟および成体の
温血動物の両方、特にヒトを処置するための使用に意図される。典型的にはIL-1
2および抗原を同時投与するが；しかし場合によっては当業者は、IL-12は抗原を
用いたワクチン接種前、または後に極めて近い時間で投与することができる。

【００１１】本発明のRSV抗原は、免疫反応をモジュレートまたは強化するために別の分子にカップルすることができる。適当なキャリアータンパク質は、キャリアーとし
て哺乳動物に投与するのに安全であり、しかも免疫的に効果的である細菌毒素を
含む。例には百日咳、ジフテリアおよび破傷風トキソイドおよびジフテリアトキ
ソイドの非毒性変異体、CRM₁₉₇のような非毒性の突然変異体タンパク質(交差反応物質(CRM））を含む。少なくとも１つのＴ−細胞エピトープを含む天然の毒素
またはトキソイドの断片も、抗原のキャリアーとして有用である。抗原とキャリ
アー分子との結合体の調製法は当該技術分野では周知であり、そして例えばDick
およびBurret、Contrib Microbial Immunol.10:48-114（Cruse JM,Lewis RE Jr 編集；Based,Krager(1988)および米国特許第5,360,897号明細書(Andersonら)）に見いだすことができる。

【００１２】 IL-12のアジュバント作用は、多くの重要な意義を有する。IL-12のアジュバン
ト性（adiuvanticity）はワクチン接種した生物中の抗原に対して生産される防御抗体の濃度を上昇させることができる。その結果、効果的（すなわち防御的）
なワクチン接種を、通常必要とされる量よりも少ない量で達成することができる
。この抗原の必要量の減少は、調製することが難しく、しかも経費がかかるワク
チン使用の普及を導くことができる。さらにアジュバントとしてのIL-12の使用は、免疫反応を誘導するには抗原性が弱いか、または免疫原性がよくない抗原の
能力を強めることができる。また通常効果的な免疫感作に必要とされる通常の濃
度で抗原が毒性である時、より安全なワクチン接種を提供することもできる。抗
原の量を減らすことにより、毒性反応の危険性が減る。さらにアジュバント作用
は、短期間に多数のワクチンにより免疫感作される個体の抗原負荷量を減らすこ
とができる。

【００１３】多くの場合、ワクチン接種の処方には「防御」免疫反応を刺激するために、数
週間または数カ月にわたり抗原の投与を必要とする。防御免疫反応は、ワクチン
が対象とする特定の病原体（１つまたは複数）による増殖的感染から免疫感作し
た生物を保護するために十分な免疫反応である。限定するわけではないがＦタン
パク質およびＧタンパク質のようなRSV抗原のような抗原を、懸濁状のミョウバンに混合または吸着させて一緒に投与する時、IL-12は防御免疫反応の生成を促進することができる。これは効果的なワクチン接種処方のタイムコースを減らす
ことができる。場合によっては、防御的反応の生成を単回の用量で生じるかもし
れない。

【００１４】本明細書に記載する研究の目的は、RSVに対するワクチン用の免疫反応モディファイヤーとして組換えIL-12を使用することの可能性を決定することであった。そのためには、BALB/cマウス群をRSVのA2種の天然の融合(Ｆ)タンパク質およびIL-12の量を増加させながら免疫感作させた。Ｆタンパク質およびIL-12は水酸
化アルミニウム（AlOH、Alu-gel-S(商標)、セルバファインバイオケミカルズ(
Serva Fine Biochemicals)、ウエストベリー、ニューヨーク州）アジュバントに
吸着させた。その後にワクチンが全身性の細胞性および体液性免疫反応を誘導す
る能力について比較した。本明細書に記載する結果では、IL-12が全身性の体液性および細胞性免疫反応の両方の強力なモディファイヤーであることが証明され
た。補体の補助および抗-Ｆタンパク質IgG2a抗体の力価における有意な増加が、
１次および２次ワクチン接種後に観察された。さらに0.01および0.1μgのIL-12 は、細胞性免疫反応を誘導するためのF/AlOHの能力に甚大な効果を有した。RSV のA2株を用いた攻撃誘発から５日後、セロネガティブおよびセロポジティブマウ
スの肺には増加した抗原−依存的キラーＴ細胞活性が含まれた。

【００１５】 AlOHアジュバントワクチンにより生成される免疫反応に関するIL-12の作用様式を説明するために、天然のＦタンパク質と培養したバルク脾臓細胞に由来する
上清を、ヘルパーＴ細胞サブセットに付随するサイトカインについて分析した。
本明細書に与える結果は、IL-12が１型ヘルパーＴ細胞（Th1）により支配される
免疫反応を誘導するワクチン成分の能力を上昇させることを示唆した。ワクチン
中のIL-12の存在は、培養上清中のIFN-γの量の上昇と関連しているようである。さらに配合物中にIL-12量を増大させると、ワクチンが２型ヘルパーＴ細胞（T
h2）の生成する能力を減少させることを意味している。すなわち、ワクチン中の
IL-12の量が増すほど、培養上清は低量のIL-5を含む。しかし1.0μgより多い用量では、Th１およびTh2の両サイトカインは減少するようである。

【００１６】本明細書に記載する研究では、RSV天然の付着(Ｇ)タンパク質およびホルマリン-不活性化RSV(FI-RSV)の免疫原性に及ぼすIL-12の免疫調節効果も調査した。両ワクチンは齧歯類でTh2ヘルパーＴ細胞の誘導に関連する免疫反応を生成することを示した。FI-RSVワクチンはファイザー（Pfizer）により配合されたもとは
Lot-100ワクチンの複製であった（Fulginitiら、Am.J.Epidemiol,89:435-448(19
69)およびChinら、Am.J.Epidemiol,89:449-463(1969)）。両ワクチンともAlOHに
吸着し、単独または10倍増したIL-12の用量の存在下で配合した。

【００１７】 IL-12の免疫調節特性を決定するための幾つかの基準を評価した。IL-12はレシ
ピエントを攻撃誘発後に、異例な肺炎反応に偏らせるG/AlOHおよびFI-RSVの能力
を改質する能力が特に有意であった。FI-RSV単独またはG/AlOH単独のいずれかで
２回免疫感作し、そしてRSVのA2株で攻撃誘発したマウスは、異例な肺炎反応を発症し;このような炎症反応は、攻撃誘発から５日後の気管支肺胞洗浄(BAL)液中
の統計的に有意に上昇した割合の好酸球およびIL-5量が特徴であった。対照的に
肺の好酸球はRSVのA2株で実験的に感染させた対照マウスでは観察されなかった。

【００１８】 FI-RSVにIL-12の10倍増加用量を加えると、攻撃誘発後のBAL液中に検出される
相対的な好酸球の割合およびIL-5量が両方とも有意に減少した。IL-5および好酸
球に同時に生じた減少は、血清中の抗-Fおよび抗-Gタンパク質に特異的なIgG1か
らIgG2a抗体への有意な変換であった。すなわちIL-12を含有するFI-RSVを用いた
ワクチン接種は、IgG1の有意な減少をもたらし、そしてIgG2aタンパク質−特異的抗体力価の上昇をもたらした。したがってこのデータは、IL-12はＦおよびＧタンパク質-特異的Ｔ２ヘルパーＴ細胞の誘導、そしてそれらの同時のIL-5分泌を制限し、そして代わりにIFN-γ-分泌Th1ヘルパーＴ細胞を生産することを意味
している。すなわちこの結果は、FI-RSV中のIL-12の存在が、そして最終的には免疫反応の部位で、明らかなTh1ヘルパー細胞サブセットの誘導を支配することを示唆している。このデータはまた、IL-12注射により生産されたTh1ヘルパーT 細胞は、FI-RSVがT2ヘルパーT細胞を誘導する能力を妨害するという考えを支持している。

【００１９】 G/AlOHに10倍増加用量のIL-12を加えると、肺のIL-5濃度の有意な減少および抗-Gおよび抗-Fタンパク質IgGサブクラス抗体比に変化をもたらしたが、マウスを攻撃誘発した後にIL-12はG/AlOHが肺好酸球増加症に傾かせる能力をモディファイすることはできないように思われる。すなわちデータは、全身性の体液性免
疫反応および好酸球の可動化および複製の制御のために明確な経路が存在するこ
とを示唆している。あるいはIL-5以外のサイトカインが肺の好酸球生成に役割を
果たしているのかもしれない。IL-12をG/AlOHに加えると、BAL液にIL-5の有意な
減少をもたらすが、攻撃誘発後の肺組織中の好酸球の相対的割合に有意な効果は
なかった。しかしIL-5は使用したアッセイでは検出できないレベルで肺に存在し
ているかもしれない。またIL-12が好酸球の偏りを制限することができないのは、FI-RSVと比べた時にG/AlOH中に比較的大量のＧタンパク質によるものか、ある
いは天然のＧタンパク質が好酸球へ偏る可能性をもつ幾つかのエピトープを持つ
のかもしれないという可能性もある。このようなエピトープの中にはホルマリン
処理により破壊され得るものもある。すなわちFI-RSVとG/AlOHとの間でそれらが
好酸球へ偏らせる能力についての矛盾は、量的な現象かもしれない。一方ではIL
-12がG/AlOHにより偏らされる異例の肺の炎症反応を変換することができないのは、重度にグリコシル化されたタンパク質の独自性に関連するのかもしれない。

【００２０】上記のように、本明細書に与える結果はIL-12がRSVの精製された天然のＧおよ
びＦタンパク質の両方に対して生成される全身性の体液性免疫反応の有力な調節
物質であることを示している。にもかかわらず、IL-12の存在はすべてのRSVワク
チンでIgG2aサブクラスに起因する補体結合中和抗体力価を強化しないようである。増加した血清の補体結合中和抗体力価は、G/AlOHまたはFI-RSVのいずれかで
２次免疫感作した２週間後に観察されなかった。FI-RSVワクチンに関しては、IL
-12が中和抗体力価に正の影響を及ぼすことができないのは、IgG2a補体結合抗体
生成の原因であるＧおよびＦタンパク質エピトープのホルマリン処理による破壊
が反映しているのかもしれない。ワクチン中にIL-12の量が増えるほど、中和およびIgG1抗体は減少する。対照的にF/AlOHに反応して、IL-12は再生的にIgG2aお
よび補体が強化する中和力価を増加させる（以下の表１および２を参照にされた
い）。

【００２１】天然のＦおよびＧタンパク質をワクチン接種した後に、IL-12がIgG2a補体結合
中和抗体の生成に影響を及ぼすことができない説明は、より複雑と思われる。い
かなる理論にも拘束されることを望まないが、１つの説明はIL-12の投与後に上昇するタンパク質−特異的IgG2a抗体のほとんどが、非−中和エピトープに対して向けられているということである。別の可能性は、G/AlOH中のＦタンパク質の
混入が、IL-12のＧタンパク質−特異的IgG2a中和抗体の生成に及ぼす効果をわか
りにくくする補体結合中和抗体を誘導したということである。

【００２２】このデータはIL-12の最適用量が0.01から1.0μgの間であり；IL-12のより高い
用量(10μg)は逆効果と思われることを示唆している。この結論は、ワクチン防御体液性および細胞性免疫反応を生成する能力に基づく。まとめて考えると結果
は、ワクチン配合物中の組換えIL-12の使用が、全身性の体液性および細胞性免疫反応を調節することを支持している。さらにレシピエントの一般的健康にに及
ぼす不都合な効果は、IL-12の投与後に観察されなかった。

【００２３】まとめると、本明細書に与える結果はIL-12が懸濁状の鉱物を含有するRSVワク
チンに免疫反応モディファイヤーとして有用であることを示していた。さらに免
疫反応の変換はヒトの使用に適当なIL-12用量で起こる。すなわちミョウバンゲルにIL-12を加えて抗原性を補強したRSV FおよびGタンパク質は、単独または他のウイルス抗原と組み合わせて、RSVワクチン調製物として特に適当である。

【００２４】以下の実施例は本発明を具体的に説明する目的で提供し、本発明の範囲を限定
することを意図していない。本明細書に引用するすべての参考文献の教示は、引
用により本明細書に編入する。

【００２５】

【実施例】

実施例１：水酸化アルミニウムアジュバントに吸着したRSV Fタンパク質の免疫原性に及ぼすIL-12の効果実験計画この実験の目的は、組換えマウスIL-12が水酸化アルミニウムアジュバントを用いて配合されたRSVの融合タンパク質の免疫原性に及ぼす効果を決定することである。天然のメスBALB/cマウス（８〜10週齢）は、精製した天然の融合（Ｆ）
タンパク質を用いて第０および４週に筋肉内にワクチン接種した。このＦタンパ
ク質はAlu-Gel-S(商標)(２％の水酸化アルミニウム、セルバファインケミカル
ズ、ウェストベリー、ニューヨーク州）に吸着していた。

【００２６】ワクチンは、各マウスが3.0μgのFタンパク質／用量、１回の用量あたり100μ
gの水酸化アルミニウム(AlOH)、および０、0.01、0.1または1.0μgのIL-12／用量を受容するように調製した。対照マウスは100μgのAlu-Gel-S(商標)(PBS中)の
みを注射した。初回免疫から４週間後および２次ワクチン接種から２週間後、血
清をELISAにより幾何平均終点抗体力価（geometric mean endpoint antibody ti
ter)を決定するために集めた。マイクロウェルは高度に精製されたイオン交換精
製したＦタンパク質で覆われていた。さらに中和抗体力価はウイルスのA2株に対
して補体の存在下、または不在下でプラーク減少中和試験（plaque reduction n
eutralization test）により決定した。

【００２７】ワクチンの明らかなヘルパーＴ細胞サブセットの生成能力に及ぼすIL-12の効果を決定するために、バルク脾臓細胞懸濁液を２次免疫感作から２週間後に得、
そして濃度を上げた精製したＦタンパク質、精製したUV−不活性化RSV A2、CRM₁ ₉₇ 、コンカナバリンＡ（ConA、Ｔリンパ球マイトジェン）の存在下で、または培
地単独で６日間培養した。このような培養物からの上清をプールし、そして捕捉
−ELISAによりインターフェロン-γ（IFN-γ）およびインターロイキン-5（IL-5
）の存在について試験した。結果表１に示す結果は、ELISAにより決定した幾何平均終点抗体力価である。中和抗体の力価は幾何平均中和抗体力価であり、そして補体を供給するために５％血
清の存在下（＋）および不在（−）下でプラーク減少中和試験により決定した。
抗体力価は、初回および２次ワクチン接種からそれぞれ４および２週間後に決定
した。

【００２８】 IL-12は初回および２次ワクチン接種からそれぞれ４週間後（表１の上パネル）および２週間後（表１の下パネル）に、F/AlOHにより生成される全身性の体液
免疫反応を増した。例えば、用量あたり0.1または1.0μgのいずれかのIL-12を用
いて配合されたF/AlOHで初回免疫感作した４週間後に、全IgG終点抗体力価はF/A
lOH単独で免疫感作したマウスの血清中の終点力価と比べた時に、有意に異なり、そしてそれぞれ10倍および18倍強化された。同様な様式で、全IgG抗体力価は２次ワクチン接種から２週間後に、それぞれ３および８倍上昇した（下のパネル
、表１）。データはさらにIgG抗体力価の上昇がワクチン中のIL-12の用量に依存
することを示していた。これはＦタンパク質-特異的IgG2a力価の決定後に最もよ
く例示された。F/AlOH単独で１次免疫感作した４週間後に誘導された血清の抗- Ｆタンパク質IgG2a抗体力価と比べた時、F/AlOHに0.01、0.1または1.0μgのいず
れかのIL-12を加えて配合したワクチンは、それぞれ４−、48−および158−倍有
意に上昇した（上パネル、表１）。IgG2a抗体力価の上昇は、F/AlOHにIL-12を加
えた２次ワクチン接種から２週間後にも観察された。

【００２９】最も重要なことは、データはIL-12の添加がF/AlOHが補体により補助される血清の中和抗体力価を生成する能力を増すことができることを示唆していた。F/Al
OHに1.0μgのIL-12を加えて注射したマウスの血清の補体が補助する中和抗体力価は、初回免疫感作から４週間後に少なくとも７倍高められた（上パネル、表１
）。0.1または1.0μgのIL-12のいずれかを加えて配合したF/AlOHで２次ワクチン
接種後、中和抗体力価はそれぞれ５倍および10倍上昇した（下パネル、表１）。

【００３０】結果はIL-12を注射したマウスの脾臓に由来する免疫細胞が、アルミニウムゲル単独をワクチン接種したマウスに由来する細胞に比べて、抗原が提示された時
に複製する可能性がより高いことを意味していた（図１）。例えばF/AlOHに0.01
μgのIL-12を加えて２回免疫感作したマウスに由来する脾免疫細胞の刺激指数は
、天然のＦタンパク質とインビトロ培養した後に、F/AlOH単独で免疫感作したマ
ウスの脾免疫細胞の約２倍であった。この結果はさらに0.01μgより高いIL-12の
用量を使用することは逆効果であることを示唆していた。F/AlOHに0.1μgまたは
1.0μgのいずれかのIL-12を加えてワクチン接種したマウスの刺激指数は５倍低かった。

【００３１】アルミニウムアジュバントの明らかな抗原依存的ヘルパーＴ細胞サブセット生
成能力に及ぼす種々の用量のIL-12の効果を見積もるために、バルク脾臓細胞懸濁液を調製し、そして天然のＦタンパク質の存在下、または不在下で培養した。
データはF/AlOHがIL-12無しで配合された時、２型-様ヘルパーＴ細胞反応が生じ
たことを示唆した。IFN-γは天然のＦタンパク質と６日間培養した脾臓細胞の上
清にはほとんど検出できなかった（図２Ａ）。代わりに同じ上清は１mlの培養上
清あたり６ngのIL-5を含んだ（図２Ｂ）。

【００３２】 IL-12をF/AlOHに加えると、脾免疫細胞がIFN-γを分泌する能力が増すようであった（図２Ａ）。天然のＦタンパク質を用いて６日間培養した後、１、９、16
および16単位のIFN-γが、それぞれF/AlOH単独、またはそれに0.01、0.1または1
.0μgのいずれかのIL-12を加えたワクチンを接種したマウスに由来する脾臓細胞
による上清１mlあたりに分泌された（図２Ａ）。しかしデータは、ワクチン中の
0.1または1.0μgのIL-12の存在が培養上清中のIL-5の量の減少に関連していたこ
とを示す。換言すると、F/AlOHに10倍増しのIL-12用量を加えてワクチン接種したマウスに由来する同じ上清が、それぞれ上清１mlあたり６、13、２および0.4n
gのIL-5を分泌した（図２Ｂ）。

【００３３】

【表１】

【００３４】 BALB/cマウスは、水酸化アルミニウム（AlOH、100μg／用量）に吸着させた天
然のＦタンパク質（３μg／用量）で、第０週および第４週に筋肉内にワクチン接種した。IL-12はワクチンに示した用量で加えた。対照マウスはPBSにAlOHを加
えて注射した。上および下のパネルは、それぞれ１次および２次ワクチン接種か
ら４および２週間後の抗体力価を表す。 ★ 数字は、ELISAにより測定された幾何平均終点抗体力価である。 † 数字は幾何平均中和抗体力価であり、そして５％補体の存在下（＋）または
不在下（−）でプラーク減少中和試験により測定した。１群あたり５匹のマウス
であった。^a Ｐ＜0.05 対 F/AlOHに0.1または1.0μgのIL-12を加えてワクチン接種した後に誘導されたIgG力価。^b Ｐ＜0.05 対 F/AlOHに0.0、0.01または0.1μgのIL-12を加えてワクチン接種した後に誘導されたIgG力価。^c Ｐ＜0.05 対 F/AlOHに0.1μgのIL-12を加えてワクチン接種した後に誘導され
たIgG力価。^d Ｐ＜0.05 対 F/AlOHに0.01、0.1または1.0μgのIL-12を加えてワクチン接種した後に誘導されたIgG力価。^e Ｐ＜0.05 対 F/AlOHに1.0μgのIL-12を加えてワクチン接種した後に誘導され
たIgG力価。^f Ｐ＜0.05 対 F/AlOHに0.0、0.01または0.1μgのIL-12を加えてワクチン接種した後に誘導された補体依存的中和抗体力価。^g Ｐ＜0.05 対 F/AlOHに0.0または0.01μgのIL-12を加えてワクチン接種した後
に誘導された補体依存的中和抗体力価。^h Ｐ＜0.05 対 IL-12を加えずにF/AlOHでワクチン接種した後に誘導された補体
依存的中和抗体力価。

【００３５】実施例２：F/AlOHの全身性体液性免疫反応を誘導する能力に及ぼすIL-12の遠位部位での投与効果実験計画この実験の目的は、組換えマウスIL-12がF/AlOHの遠位部位に注射された時、全身性体液性免疫反応に及ぼす生物学的効果を決定することであった。そのため
に、天然のメスBALB/cマウス（８〜10週齢）を、RSVのA2株に由来するイオン交換で精製した天然の融合(F)タンパク質で筋肉内(IM)に初回免疫した。Ｆタンパク質（３μg／用量）は、水酸化アルミニウムアジュバント（AlOH、100μg/用量
、Alu-gel-S(商標)）に吸着していた。F/AlOHを10倍増加させた用量の組換えマウスIL-12と組み合わせて（１、10、100ng IL-12／用量）投与した。簡単にF/Al
OHにIL-12を加えた２つの免疫感作プロトコールを採用した。第１のシナリオでは、マウス群は一方の太股にF/AlOHをIM注射され、そして反対側の太股に10倍量
に増加した用量のIL-12を受容した。第２の場合はマウス群は１回、10倍量に増加した用量のIL-12の３つのうちの１つを用いて配合したF/AlOHから成るワクチンを１回注射された。ワクチンは４℃で一晩インキューベーションされ、IL-12 のAlOHへの吸着に最大時間とした。さらに対照マウスは、F/AlOH単独、PBS中にＦタンパク質のみ、またはPBSにAlOHのみを加えたもののいずれかでワクチン接種した。１次ワクチン接種から４週間後、血清をELISAにより幾何平均終点抗-Ｆ
タンパク質合計およびサブクラスIgG抗体力価の決定に集めた。結果結果を表２に表し、F/AlOHでワクチン接種した後に誘導された全身性の体液性
免疫反応をIL-12が増す能力が確認された。F/AlOH単独と比較する時、10または1
00ngのいずれかのIL-12を加えたF/AlOHにより誘導される抗-Ｆタンパク質総合Ig
G抗体力価は、１次免疫感作から４週間後に有為に大きかった。より重要なことは、ワクチン中に10または100ngのいずれかのIL-12の存在は、統計的に強化され
たタンパク質特異的IgG2a抗体力価と関連した（表２）。しかしデータはまた、単回用量のプロトコールでは、IL-12が注射の局所的部位に存在しなければならないことを示唆していた。マウスをF/AlOH単独で初回免疫し、そしてIL-12を遠位部位に注射する時、統計的に低い抗−Ｆタンパク質抗体力価が得られた（表２
）。F/AlOHに100ngのIL-12を加えて注射したマウスのタンパク質特異的IgG2a抗体力価は、F/AlOH単独に100ngのIL-12を反対側のの太股に投与したコホートマウ
スよりも10倍大きかった。

【００３６】

【表２】

【００３７】 † 天然のメスBALB/cマウスを、水酸化アルミニウムアジュバンド（AlOH）に吸
着させた天然の融合（Ｆ）タンパク質（３μg／用量）で筋肉内(IM)に初期免疫した。F/AlOHは、組換えマウスIL-12を10倍に増した用量と組み合わせて投与した（100、10、１ng IL-12／用量）。F/AlOHにIL-12を加えた２つの免疫感作法を
使用した：２inj.、２つの部位は１方の太股にF/AlOHをIM注射し、そして反対側
の太股に10倍増したIL-12の用量を受容したマウスを表し；１inj.、１部位はマウスが、F/AlOHに10倍量に増加した用量のIL-12の３つのうちの１つ加えて成るワクチンを１回注射されたことを示す。さらに対照マウスは、F/AlOH単独、PBS 中にＦタンパク質のみ、またはPBSにAlOHを加えたもののみのいずれかでワクチン接種した。数字は、１群あたり５匹のマウスの幾何終点力価である。 ^a Ｐ＜0.05 対 IL-12を遠位に注射されたマウスからの血清抗Ｆ-タンパク質抗体力価、およびF/AlOH単独で免疫感作したマウスの力価。^b Ｐ＞0.05 対 F/AlOH単独で免疫感作したマウスの血清抗Ｆ-タンパク質抗体力
価。

【００３８】実施例３：セロネガティブレシピエントを対象としてF/AlOHが細胞性免疫反応を誘導する能力に及ぼすIL-12の効果実験計画この実験の目的は、IL-12をF/AlOHに加えることが細胞性免疫反応を増大させることができるかどうかを確かめることであった。天然のメスBALB/cマウス（８
〜10週齢）を、組換えマウスIL-12を加えたＦタンパク質に基づく３種のワクチン１つで筋肉内に初回免疫した。天然のＦタンパク質はRSVのA2 株からイオン交
換精製した後に得た。ワクチンは水酸化アルミニウム（AlOH、100μg/用量）に吸着しＦタンパク質（３μg／用量）に10倍増加させたIL-12用量の３種（0.01、
0.1および1.0μgのIL-12／用量）の１つを加えて成った。水酸化アルミニウムは
ワイエス−レーダーレワクチンアンドペディアトリックス（Wyeth-Lederle V
accines and Pediatrics、パールリバー、ニューヨーク州）で調製された。対照マウスはF/AlOH単独でワクチン接種されるか、またはモック感染したHep2細胞
ライゼートを鼻内投与した。１次ワクチン接種から４週間後、マウスをRSV A2( 〜10⁶PFU)で鼻内に攻撃誘発し、そして気管支肺胞洗浄（BAL）を５日後に行った
。炎症細胞の細胞溶解能力を、同系のRSV−感染および対照標的細胞とインキューベーションした後に、標準的な４−時間の⁵¹Ｃｒ放出アッセイにより直接測定
した。結果図３に示す結果は、IL-12がF/AlOHの細胞性免疫反応を生じる能力を強化したことを示した。F/AlOHに0.01μgのIL-12を加えて初回免疫したマウスに由来する
BAL細胞の細胞溶解活性（黒三角）は、攻撃誘発から５日後の同系のRSV−感染（
実線）標的細胞に対して39％であった。F/AlOHのみで初回免疫されたマウスのBA
L細胞（黒丸）を同系のRSV−感染標的細胞とインキューベーションする時、細胞
毒性は検出されなかった。さらにこの結果は、キラー細胞活性が抗原依存的であ
ることを示していた。F/AlOHに加えて0.01μgのIL-12でワクチン接種したマウス
に由来するBAL細胞は、ウイルスに感染していない同系の対照標的(破線)を溶解しなかった。

【００３９】またデータは、0.01μgよりも多いIL-12用量は細胞性免疫反応の増加には逆効
果であることを示唆していた（図３）。F/AlOHに0.1（逆三角）または1.0（右向
三角）μgのいずれかを加えた１次免疫感作は、F/AlOHに0.01μgのIL-12を加えて初回免疫したマウスと比べた時、攻撃誘発から５日後のBAL細胞にそれぞれ３および８倍低い細胞溶解活性をもたらした。

【００４０】実施例４：セロポジティブレシピエントを対象としてF/AlOHが細胞性免疫反応を誘導する能力に及ぼすIL-12の効果実験計画この実験の目的は、RSVに前以て感染させたレシピエントを対象として、F/AlO
Hの細胞性免疫反応を広げる能力に及ぼすIL-12の効果を決定することであった。
天然のメスBALB/cマウス（８〜10週齢）を、RSVのA2株で実験的感染により初回免疫した。４週間後、マウスにＦタンパク質に基づくワクチンに組換えマウスIL
-12を加えた３種のうちの１つで筋肉内に注射した。ワクチンは水酸化アルミニウム（AlOH、100μg/用量）に吸着したＦタンパク質（３μg／用量）に、10倍増
加させたIL-12用量の３種の１つから成った（0.01、0.1および1.0μgのIL-12／用量）。水酸化アルミニウムはワイエス−レーダーレアンドペディアトリック
ス（Wyeth-Lederle Vaccines and Pediatrics）で調製された。対照マウスはRS
Vで感染させることにより初回免疫し、そしてF/AlOH単独で２次ワクチン接種するか、またはモック感染したHep2細胞ライゼートを鼻内投与した。２次ワクチン
接種から２週間後、マウスをRSV A2(〜10⁶PFU)で鼻内に攻撃誘発し、そして気管
支肺胞洗浄（BAL）を５日後に行った。炎症細胞の細胞溶解活性を、同系のRSV−
感染および対照標的細胞とインキューベーションした後に、標準的な４−時間の ⁵¹ Ｃｒ放出アッセイにより直接測定した。結果図４に表すデータは、すべての３種のIL-12用量でF/AlOHが前以てRSVで感染さ
せたマウスの細胞性免疫反応を広げる能力を増幅させたことを証明した。F/AlOH
に0.1μgのIL-12を加えて２次ワクチン接種したマウスに由来するBAL細胞の細胞
溶解活性（逆黒三角）は、攻撃誘発から５日後の同系のRSV−感染（実線）標的細胞に対して58％であった（エフェクター：標的比＝54:１）。感染により初回免疫され、そしてF/AlOH単独で２次ワクチン接種されたマウスのBAL細胞（黒丸）を、同じ同系のRSV−感染標的細胞とインキューベーションした時、細胞溶解活性は35％であった。キラー細胞活性を18:1のエフェクター：標的比で調査した
時、細胞溶解活性はそれぞれ52％および27％であった。さらにこの結果は、キラ
ー細胞活性が抗原依存的であることを示していた。RSVで初回免疫し、そしてF/A
lOHにIL-12を加えて２次ワクチン接種したマウスに由来するBAL細胞は、ウイルスに感染していない対照標的(破線)を溶解しなかった。

【００４１】さらにデータは、F/AlOHが細胞性免疫反応を拡大する能力はワクチン中のIL-1
2の用量に依存したことを示唆した（図４）。セロホジティブ動物では、抗原− 依存的キラー細胞活性の最大レベルは、攻撃誘発から５日後にF/AlOHに0.1μgの
IL-12で２次免疫感作したマウスの肺に生じたようであった（逆黒三角、図４）。

【００４２】実施例５：異例の肺炎症反応に関してIL-12が疾病素質に及ぼす効果実験計画この実験の目的は、攻撃誘発後にBALB/cマウスを異例の肺炎症反応に罹患し易
くする高度に精製された天然のＧタンパク質またはファイザー(Pfizer) Lot100 ホルマリン不活性化ワクチンの複製のいずれかの能力に及ぼすIL-12の効果を決定することであった。両ワクチンは、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着し
ていた。

【００４３】天然のメスのBALB/cマウス（８〜10週齢)を第０および第４週に、水酸化アルミニウム(AlOH、Alu-gel-S(商標)、セルバ、100μg用量）アジュバントに吸着し
た１μgの精製した天然のアタッチメントである糖タンパク質（Ｇ）または0.1ml
のホルマリン-不活性化RSV(FI-RSV)のいずれかを筋肉内(IM)にワクチン接種した
。FI-RSVワクチンは、元はファイザー(Pfizer)により製剤されたLot-100ワクチンの複製であり、そしてAlOH（1600μg用量)に吸着していた。このワクチンはサ
ブユニットワクチンについて望ましくない免疫反応である異例の肺炎症反応に関
する基準として使用した。

【００４４】 IL-12をG/AlOHおよびFI-RSVに、10倍増加した用量で加えた(0.1〜10.0μgのIL
-12／用量）。さらにマウスの同伴群をRSVのA2株で感染させ（0.05ml、鼻内に）
、AlOH(1600μg／用量）に吸着した0.1mlのホルマリン-不活性化パラインフルエ
ンザウイルス３型(FI-PIV3)ワクチンをIM注射するか、または50μlのモック−感
染させたHep2細胞ライゼート(MOCK)を鼻内投与した。２次ワクチン接種から２週
間後、ELISAにより幾何平均中和抗体力価を決定するために、血清をアフィニティ精製したＧタンパク質またはイオン交換精製したＦタンパク質のいずれかを被
覆したマイクロウェル中に集めた。幾何平均中和抗体力価は、ウイルスのA2株に
対する補体の存在下および不在下で、プラーク減少中和試験によっても決定した
。

【００４５】 IL-12が局所的な肺炎症反応に及ぼす効果を特徴付けるために、気管支肺胞洗浄（BAL）を感染性ウイルス（RSV A2、-10⁶PFU）で攻撃誘発してから５日後に行
った。炎症細胞の形態は、細胞標本をDIF-QIK(商標)(白血球を染色する試薬：バ
キスターインターナショナル社(Baxter International Inc.)、ディアフィール
ド、イリノイ州）で染色し、そして少なくとも400個の細胞を数えた後に決定した。BAL液もIFN-γおよびIL-5の存在について捕捉-ELISAにより調査した。群間のIL-５およびIFN-γ分泌における統計的差異は、ANOVA（JMPソフトウェアによる変異体の分析；SASインスティチュート、キャリー、ノースカロライナ州）によるＯＤ₄₉₀を比較した後に決定した。結果データは、Lot-100 FI-RSVワクチンの複製で非経口的な免疫感作が、主に２型
（Th2)表現型であるＦおよびＧタンパク質依存的ヘルパーＴ細胞反応をBALB/cマ
ウスに生成し易くさせたことを示唆する。２次免疫感作から２週間後の血清抗−
Ｇ（表３）および血清抗−Ｆ（表４）タンパク質IgG1対IgG2a抗体比は、この結論を支持した。FI-RSVで２次ワクチン接種後に観察された血清抗−Ｆタンパク質
IgG1対IgG2a抗体力価の比は、75.3であった（表４）。同様に２次ワクチン接種から２週間後観察された血清抗−Ｇタンパク質IgG1対IgG2a抗体力価の比は、184
.2より大きかった（表３）。

【００４６】さらにFI-RSVでの免疫感作には、攻撃誘発から５日後のBAL液中にIL-5生産の上昇および異例の肺炎症免疫反応の誘導が付随した（表６）。

【００４７】表６で”％EOS"カラム中の結果は、ウイルスで攻撃誘発してから５日後のBAL 液中で数えた好酸球(EOS)の幾何平均相対百分率である。“ND"は測定されなかっ
たことを示す。IL-5は捕捉ELISAにより検出され、そして標準曲線から定量した。“IL-5(OD)"カラムの結果は、幾何平均光学密度(OD₄₉₀)である。

【００４８】攻撃誘発から５日後にFI-RSVでワクチン接種したマウスの肺中に観察される好
酸球の幾何平均相対百分率（38.5％）は、FI-RSVでワクチン接種し、そして１次
感染を受けた対照マウス、または実験的感染により免疫感作したマウス（＜1.0 ％）と比べた時に有意に上昇した（表６）。さらに、FI-RSV（106pg/ml)でワクチン接種したマウスの洗浄液中に分泌されたIL-5の量は、感染から５日後にFI-P
IV3(＜８pg/ml）または感染性ウイルス（＜35pg/ml）のいずれかのレシピエント
に由来するこのような液と比べた時に有意に上昇した（表６）。

【００４９】結果は、この実験で使用したＧタンパク質がBALB/cマウスに免疫原性であるＦ
タンパク質濃度を含んでいたことを示している。注目すべきことは、G/AlOHで２
次ワクチン接種してから２週間後に観察された血清抗−Ｆタンパク質全IgG抗体力価であった（表４）。データは、ＧおよびG/AlOH中の混入Ｆタンパク質の両方
がFI-RSVと同様に、主にTh2ヘルパーＴ細胞サブセットを誘導したことを意味した。２次ワクチン接種後の血清抗−Ｆタンパク質IgG1対IgG2a抗体比は、617より
大きかった（表４）。同様な様式で、G/AlOHで２次ワクチン接種後の血清Ｇタン
パク質−特異的IgG1対IgG2a抗体比は、1251より大きかった（表３）。さらにG/A
lOHでの免疫感作は、攻撃誘発から５日後のBAL液中の異例な肺炎症反応の誘導お
よびIL-5の存在と関連した（表６）。攻撃誘発から５日後にG/AlOHで２回ワクチ
ン接種したマウスの肺に観察される好酸球の幾何平均相対的百分率（35.0％）は
、FI-PIV3でワクチン接種され、そして１次感染を受けた対照マウス（6.5％）に
比べた時に有意に上昇した。さらにG/AlOHでワクチン接種したマウスの洗浄液中
に分泌されたIL-5の量（167pg/ml）は、感染から５日後にモック感染したHep-2 細胞ライゼート(＜35pg/ml）、感染性ウイルス（＜35pg/ml）またはFI-PIV3（＜
8pg/ml）のいずれかのレシピエントに由来する液と比較して有意に上昇した（表
６）。

【００５０】 FI-RSVまたはG/AlOHのいずれかでのワクチン接種とは対照的に、RSVの野生型A
2株での感染はＦタンパク質依存的１型（Th1)ヘルパーＴ細胞反応を誘導した。感染性ウイルス中に含まれるＦタンパク質により誘導される全身性の体液性免疫
反応は、２次血清抗−Ｆタンパク質IgG1対IgG2a抗体比が1.0より低いことが特徴
であった（表４）。最も重要なことは、異例な肺炎症反応が前のRSV感染とは関連していなかったことである（表６）。肺の好酸球は、１次感染を受けた天然の
マウスには観察されなかった（表６）。

【００５１】この結果はIL-12が、複製ワクチンまたはG/AlOHのいずれかでワクチン接種した後に生じる体液性免疫反応に甚大な影響を有したことを示唆している。この結
果はIL-12の用量が重要であることを意味していた。例えばデータは0.1または1.
0μgのIL-12の、Ｆタンパク質が混入したG/AlOHへの添加が、G/AlOH単独でワクチン接種したマウスからの力価と比較した時に、２次免疫感作から２週間後の血
清抗−Ｆタンパク質IgG2a抗体力価をそれぞれ４および1,300倍増加させたことを
示した（表４）。

【００５２】 IL-12の阻害効果は、G/AlOHに10μgを添加した後にも観察された。データは、
IL-12がG/AlOHの抗−Ｆタンパク質IgG1抗体力価を生成する能力を制限したことを意味していた。G/AlOH単独により生成される力価と比較する時、G/AlOHに10μ
gのIL-12を加えた２次免疫感作は、５倍そして有意に低いIgG1抗体力価を生成し
た（表４）。データは10μgのIL-12が、Lot-100複製ワクチンのその特徴的な抗-
Ｆタンパク質全IgG抗体力価を誘導する能力を阻害したことを示す。血清抗体力価は、FI-RSVに0.1μgのIL-12を加えて２回免疫感作したマウスよりも17倍低かった（表４）。

【００５３】表３および４に示す結果は、ELISAにより測定された幾何平均終点抗体力価である。1/2aは、幾何平均IgG1対IgG2aサブクラス抗体力価の比である。“NT"は試
験しなかったことを示し；“ND"は測定されなかったことを示す。

【００５４】 IL-12の添加は、FI-RSVまたはG/AlOHのいずれかで２次ワクチン接種した後に生成する抗−Ｇタンパク質全IgG抗体力価の規模を劇的に変えなかったようである（表３）。しかしワクチン中のIL-12の存在は、IgG1抗体力価を有意に低下させる一方、IgG2aタンパク質特異的抗体力価は有意に上昇した(表３）。

【００５５】この結果は、IgG1がワクチンのTh2およびTh1ヘルパー細胞反応を誘導する能力
をモディファイしたことを意味する。血清ＧおよびＦタンパク質特異的IgG1およ
びIgG2a抗体力価の変換（表３および４）が、この仮説を支持している。例えば２次免疫感作から２週間後、Ｆ−タンパク質特異的抗体サブクラス比は、0.1μg
のIL-12をG/AlOHへ添加することにより617.1から92.1に減少した（表４）。さら
にIL-12を0.1から1.0μg/用量に10倍増加させると、Ｆタンパク質−特異的抗体サブクラス比の0.1への減少をもたらした。しかしデータは1.0μgよりも多いIL-
12の投与は、逆効果であったことを示唆した。例えば、G/AlOHに1.0μgのIL-12 を加えて２次ワクチン接種した後に誘導されるＦ−タンパク質特異的IgG2a抗体サブクラス力価は、G/AlOH単独で生成されるものと比べた時に1,300倍大きかった（表４）。しかしG/AlOHに10μgIL-12を加えて免疫感作すると、G/AlOHに1.0 μgIL-12を加えて免疫感作した後に生成したものに匹敵するＦ−タンパク質特異
的IgG2aサブクラス抗体力価をもたらした。

【００５６】このデータは、IL-12が明らかなヘルパーＴ細胞サブセットの誘導を介して、攻撃誘発後の肺組織中に好酸球の浸潤および／または複製をモディファイする能
力を有することを意味する。これはIL-12が攻撃誘発から５日後に、肺にIL-5の量および好酸球の相対的割合を増加させるようにマウスにさせるワクチンの能力
に及ぼす影響により例証される（表６）。FI-RSV単独でワクチン接種したマウス
に由来するBAL液と比較する時、0.1または1.0μgのIL-12をFI-RSVワクチンに加えると、IL-5の量および好酸球の相対数がそれぞれ有意に減少した（表６）。用
量あたり1.0μgのIL-12をG/AlOHに加えても、攻撃誘発後のBAL液中にIL-5の減少
をもたらした。しかしIL-12はBALB/cマウスが攻撃誘発後に肺好酸球増加症に罹患し易くするG/AlOHの能力に及ぼす変換効果はもたないようであった（表６）。
異例の肺炎症反応がウイルスのA2株で感染させることにより免疫感作したマウス
では観察されなかったことは注目すべきであった。さらに、IL-5および好酸球増
加症は１次感染から５日後の対照マウスの肺には観察されなかった（表６）。IF
N-γは調査したすべての群でベースラインであるか、それに近かった（データは
示さず）。

【００５７】表５に示す結果は、幾何平均中和抗体力価である。力価は１次および２次ワク
チン接種からそれぞれ４および２週間後に、補体の供給源として５％血清の存在
下（＋）または不在下（−）でプラーく減少中和試験により測定した。

【００５８】 IL-12はＦおよびＧタンパク質−特異的IgG1対IgG2a抗体サブクラスの比を変換
したが、１次および２次ワクチン接種からそれぞれ４および２週間後の補体が援
助する中和抗体力価には有意な統計的増加はなかった（表５）。実際に、この結
果はIL-12が２次ワクチン接種から２週間後に血清中和抗体力価を減少させることを意味していた。FI-RSV単独でワクチン接種したマウスの幾何平均血清中和抗
体力価は、FI-RSVに10μgのIL-12を加えたレシピエントの力価よりも少なくとも
４倍大きかった。G/AlOH中の10μgIL-12の存在も、２次ワクチン接種から２週間
後の補体−非依存的中和抗体に統計的に有意な10倍の減少をもたらした。しかし
Ｆタンパク質が混入したG/AlOHにより誘導される補体−依存的中和抗体力価の規
模は、実験的感染によりワクチン接種したマウスの規模と等しかった（表５）。

【００５９】

【表３】

【００６０】表３の注釈^a 数字は、幾何平均終点抗体力価である。力価はELISAにより２次ワクチン接種
から２週間後に集めた血清について測定した。NTおよびDTは、それぞれ試験して
いない、および測定していないことを示す。１群あたり５匹のマウスであった。 ^b Ｐ＜0.05 対 FI-RSV単独またはそれに0.1または1.0μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスに由来する全血清IgG抗体力価。^c Ｐ＜0.05 対 FI-RSVに0.1μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスに由来
する全血清IgG抗体力価。^d Ｐ＜0.05 対 FI-RSVに1.0または10.0μgのIL-12を加えてワクチン接種したマ
ウスに由来する血清IgG1抗体力価。^e Ｐ＜0.05 対 FI-RSVに0.1μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスに由来
する血清IgG2a抗体力価。^f Ｐ＜0.05 対 FI-RSVに0.1または1.0μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスに由来する血清IgG2a抗体力価。^g Ｐ＜0.05 対 G/AlOHに10.0μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスに由来する血清IgG1抗体力価。^h Ｐ＜0.05 対 G/AlOHに0.1、1.0または10.0μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスに由来する血清IgG2a抗体力価。

【００６１】

【表４】

【００６２】表４の注釈^a 数字は、幾何平均終点抗体力価である。力価はELISAにより２次ワクチン接種
から２週間後に集めた血清について測定した。NTおよびDTは、それぞれ試験して
いない、および測定していないことを示す。１群あたり５匹のマウスであった。 ^b Ｐ＜0.05 対 FI-RSVに0.1または1.0μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスに由来する全血清IgG抗体。^c Ｐ＜0.05 対 FI-RSVに0.1、1.0または10.0μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスに由来する全血清IgG抗体。^d Ｐ＜0.05 対 FI-RSV単独または0.1または1.0μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスに由来する血清IgG1抗体。^e Ｐ＜0.05 対 FI-RSV単独または0.1μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウ
スに由来する血清IgG2a抗体。^f Ｐ＜0.05 対 FI-RSVに0.1または1.0μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスに由来する血清IgG2a抗体。^g Ｐ＜0.05 対 G/AlOH単独でワクチン接種したマウスに由来する血清IgG1抗体。^h Ｐ＜0.05 対 G/AlOH単独または0.1μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウ
スに由来する血清IgG2a抗体。

【００６３】

【表５】

【００６４】^a 数字は、幾何平均終点抗体力価である。力価は１次および２次ワクチン接種からそれぞれ４および２週間後に、プラーク減少中和試験により、そして５％補
体の存在下（＋）または不在下（−）で測定した。１群あたり５匹のマウスであ
った。^b BALB/cマウスはFI-RSVまたはG/AlOH単独、あるいは10倍増加させた用量の組換えマウスIL-12を加えて筋肉内に免疫感作した。^c Ｐ＜0.05 対 FI-RSVに1.0または10.0μgのIL-12を加えて、またはFI-PIV3でワクチン接種したマウスに由来する血清中和抗体力価。^d Ｐ＜0.05 対 G/AlOH単独、または１μgのIL-12または10μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスに由来する血清中和抗体力価。

【００６５】

【表６】

【００６６】^a BALB/cマウスは第０および４週に、ホルマリンで不活性化したRSV(FI-RSV)に
加えて組換えマウスIL-12の10倍増加用量を筋肉内に免疫感作した。対照マウスは、ホルマリン−不活性化パラインフルエンザウイルス３型（FI-PIV3)、QS-21 と混合した天然の融合タンパク質（F/QS-21)をワクチン接種するか、またはRSV のA2株を感染させた。さらに対照マウスはモック−感染したHep2細胞ライゼート
の鼻内投与を受けるか(MOCK)、またはPBS/QS-21を筋肉内注射された。^b 数字は、ウイルスでの攻撃誘発から５日後のBAL液中で数えた好酸球（EOS）の幾何平均相対百分率である。NDは測定しなかったことを表す。^c IL-5は捕捉ELISAにより検出され、そして標準曲線から定量された。数字は幾
何平均光学密度（OD₄₉₀）である。^d Ｐ＜0.05 対 FI-PIV3またはFI-RSVに1.0μgのIL-12を加えたいずれかをワクチン接種したマウスで検出された好酸球。^e Ｐ＜0.05 対 G/AlOHまたはFI-RSV単独のいずれかをワクチン接種したマウスで検出された好酸球。^f Ｐ＜0.05 対 FI-RSVに0.1、1.0または10.0μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスで検出されたIL-5(OD₄₉₀)。^g Ｐ＜0.05 対 FI-RSVに1.0μgのIL-12を加えてワクチン接種したマウスで検出
されたIL-5(OD₄₉₀)。

【００６７】実施例６：BALB/cマウスに防御免疫反応を生成するF/AlOHの能力に及ぼすIL-1 2の効果実験計画この実験の目的は、肺に防御免疫反応を生じるF/AlOHの能力を改善するIL-12 の能力を調査することであった。自然なメスのBALB/cマウス（８〜10週齢）を、
RSVのA2株に由来するイオン交換精製した天然の融合(Ｆ)タンパク質で筋肉内(IM
)に初回免疫した。Ｆタンパク質（30ng／用量）を、PBSのみ、または組換えマウ
スIL-12の２つのうちの１つの用量（10または100ng IL-12／用量）と組み合わせ
て投与した。Ｆタンパク質およびIL-12を水酸化アルミニウムアジュバント（AlO
H、100μg／用量)に４℃で一晩吸着させた。さらに対照マウスは、RSVのA2株で実験的感染により免疫感作した。１次免疫感作から４週間後、すべてのマウスを
RSV A2（50μl、〜５×10₆ PFU）で攻撃誘発した。肺組織中のウイルス複製のレ
ベルは、４日後に評価した。簡単に説明すると、肺および気管支組織をまとめて
摘出し、ホモジナイズし、清澄化し、急激に凍結し、そして感染性ウイルスにつ
いてアッセイするまで−70℃で保存した。呼吸管組織中のウイルス複製のレベル
は、Hep-2細胞単層を使用するプラークアッセイで評価した。血清も１次ワクチン接種から４週間後に、幾何平均終点抗-Ｆタンパク質合計およびサブクラスIgG
抗体力価をELISAにより測定するために集めた。幾何平均血清中和抗体力価も、５％補体の存在または不在下で、ウイルスのA2株に対するプラーク減少中和試験
により明らかになった。結果図５に示す結果は、攻撃誘発から４日後に決定した肺組織１グラムあたりのウ
イルスの幾何平均プラーク形成単位（PFU)である。表７に示したデータは、ELIS
Aにより測定された幾何平均終点抗-Ｆタンパク質IgG抗体力価である。中和抗体力価は幾何平均中和抗体力価であり、そして５％補体の存在または不在下でプラ
ーク減少中和試験により測定した。抗体力価は１次ワクチン接種から４週間後に
測定した。

【００６８】 F/AlOHに10または100ngのIL-12のいずれかを添加すると、PBS中のF/AlOH単独で１次免疫感作した４週間後に生成される場合よりも有意に効力的な免疫反応を
誘導した。感染性ウイルスは、F/AlOHに10または100ngのいずれかのIL-12を加え
て初回免疫し、そしてRSV A2で攻撃誘発したマウスの肺組織中に検出されなかっ
た。対照的に、PBS中F/AlOH単独またはPBS/AlOH単独のいずれかで初回免疫したマウスの肺は、３log₁₀PFUウイルスより多くを含んでいた。

【００６９】Ｆタンパク質−特異的終点IgGおよび補体-援助中和抗体力価に関する血清の調
査では、IL-12を配合したワクチンの増大した効力が、最高になった全身性の体液性免疫反応と関連していたことを示唆した(表７)。F/AlOHに100ngのIL-12を加
えて免疫感作した後に生じた平均補体−援助中和抗体力価は、PBS中のF/AlOH単独で初回免疫したマウスの場合よりも有意に大きかった。これにもかかわらず、
F/AlOHに10ngのIL-12を加えた免疫感作は、上昇したＦタンパク質−特異的終点I
gGおよび補体−援助中和抗体力価をもたらさなかった（表７）。しかしこのよう
なマウスの肺はウイルスの複製を阻害した（表５）。このようにIL-12、上昇した全身性の体液性免疫反応および改善された効力との間の相関は確立できなかっ
た。すべてについて同様に、関係が無いことはワクチン中に最適な30ng未満のＦ
タンパク質用量が関連した。とにかく少なくとも10ngのIL-12を添加することは、F/AlOHがBALB/cマウスに、PBS中F/AlOH単独でのワクチン接種後に生成されるものよりも有意に効力的な全身性の免疫反応を誘導する能力を強化した。

【００７０】

【表７】

【００７１】 ‡ BALB/cマウスは水酸化アルミニウムアジュバント（AlOH、100μg／用量）ア
ジュバントに吸着したイオン交換精製したＦタンパク質（30ng／用量）で筋肉内
（IM)に初回免疫した。F/AlOHはPBS単独と、または100または10ngの組換えマウスIL-12／用量を組み合わせて投与した。さらに対照マウスは、RSVのA2株を実験
的に感染させることにより免疫感作させた。数字は、群あたり平均５匹のマウス
の幾何終点IgGおよび中和抗体力価（log₁₀)±１の平均標準偏差である。中和抗体力価（log₁₀)は５％補体の存在下（＋）または不在下（−）で測定した。^a Ｐ＜0.05 対 PBS中のF/AlOH単独でワクチン接種したマウスの血清抗体力価。 ^b Ｐ＞0.05 対 PBS中のF/AlOH単独でワクチン接種したマウスの血清抗体力価。均等物当業者は日常的な実験を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の具体的
態様に対する多くの均等物を認識し、そして確認することができる。そのような
均等物は、本発明の範囲に包含されるものとする。

【図面の簡単な説明】

【図１】 F/AlOHに加えて増加させたIL-12用量を加えてワクチン接種したBALB/cマウスに由来する脾免疫細胞の増殖的反応を示すグラフである。黒塗りの棒は天然のＦ
タンパク質でのインビトロ刺激後の増殖を説明している。

【図２】図２Ａおよび２Ｂは、BALB/cマウスを対象としてIFN-γ（図２Ａ）およびIL-5
（図２Ｂ）分泌脾臓細胞を生成するF/AlOHの能力に及ぼすIL-12の効果を示すグラフである。

【図３】 F/AlOHが細胞性免疫反応を誘導または拡大する能力に及ぼすIL-12の効果、および１次免疫感作後にF/AlOHが抗原−依存的キラー細胞を誘導する能力に及ぼす
IL-12の影響を示すグラフである。実線および破線は、攻撃誘発から５日後に気管支肺胞洗浄エフィクター細胞をそれぞれ同系のRSV-感染または対照標的細胞と
インキューベーションした後に観察されたキラー細胞活性を示す。

【図４】 RSVで前以て感染させたセロポジティブBALB/cマウスの細胞性免疫反応をF/AlO
Hが追加免疫（booster）する能力に及ぼすIL-12の効果を示している。実線および破線は、攻撃誘発から５日後に気管支肺胞洗浄エフィクター細胞をそれぞれ同
系のRSV-感染または対照標的細胞とインキューベーションした後に観察されたキ
ラー細胞活性を表す。

【図５】 F/AlOHをワクチン接種したBALB/cマウスに誘導される防御免疫反応に及ぼす組
換えIL-12の効果を説明するグラフである。棒は幾何平均の１標準偏差である。アスタリスクは感染性ウイルスが検出可能レベル未満であったことを表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4C085 AA04 BA51 BB24 DD75 EE03 EE06 EE07 FF13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】呼吸合胞体ウイルス抗原、アジュバント量のインターロイキ
ン-12、および懸濁状の鉱物の混合物を含んで成り、そして場合により生理学的に許容できる賦形剤を含んで成るワクチン組成物。
【請求項２】インターロイキン-12が鉱物懸濁物に吸着している、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】インターロイキン-12がヒトのインターロイキン-12である、請
求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】懸濁状の鉱物がミョウバンの水性懸濁物である、請求項１に
記載のワクチン組成物。
【請求項５】ミョウバンが水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム
である、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】呼吸合胞体ウイルス抗原が、RSV Fタンパク質、RSV Gタンパ
ク質およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載のワ
クチン組成物。
【請求項７】呼吸合胞体ウイルス抗原がキャリアー分子に結合している、
請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項８】キャリアー分子が破傷風トキシン、ジフテリアトキシン、百
日咳トキシンおよびそれらの非−毒性変異体から成る群から選択される、請求項
７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】インターロイキン-12のアジュバント量が約0.01μg〜約1.0 μgである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】脊椎動物宿主に、呼吸合胞体ウイルス抗原、アジュバント
量のインターロイキン-12、および懸濁状の鉱物の混合物を含んで成り、そして場合により生理学的に許容できる賦形剤を含んで成る効果的量のワクチン組成物
を投与することを含んで成る、呼吸合胞体ウイルス抗原に対する免疫反応を誘導
する方法。
【請求項１１】インターロイキン-12が鉱物懸濁物に吸着している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】インターロイキン-12がヒトのインターロイキン-12である
、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】懸濁状の鉱物が、ミョウバンの水性懸濁物である、請求項
１０に記載の方法。
【請求項１４】ミョウバンが水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウ
ムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】インターロイキン-12のアジュバント量が約0.01μg〜約1.
0μgである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】呼吸合胞体ウイルス抗原がキャリアー分子に結合している
、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】キャリアー分子が破傷風トキシン、ジフテリアトキシン、
百日咳トキシンおよびそれらの非−毒性変異体から成る群から選択される、請求
項１６に記載の方法。
【請求項１８】呼吸合胞体ウイルス抗原が、RSV Fタンパク質、RSV Gタン
パク質およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１０に記載
の方法。
【請求項１９】呼吸合胞体ウイルス抗原、アジュバント量のインターロイ
キン-12、および懸濁状の鉱物の混合物を含んで成り、そして場合により生理学的に許容できる賦形剤を含んで成る免疫原性組成物。
【請求項２０】インターロイキン-12が鉱物懸濁物に吸着している、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】インターロイキン-12がヒトのインターロイキン-12である
、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】懸濁状の鉱物がミョウバンの水性懸濁物である、請求項１
９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】ミョウバンが水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウ
ムである、請求項２２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】呼吸合胞体ウイルス抗原が、RSV Fタンパク質、RSV Gタン
パク質およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１９に記載
の免疫原性組成物。
【請求項２５】呼吸合胞体ウイルス抗原がキャリアー分子に結合している
、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】キャリアー分子が破傷風トキシン、ジフテリアトキシン、
百日咳トキシンおよびそれらの非−毒性変異体から成る群から選択される、請求
項２５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】インターロイキン-12のアジュバント量が約0.01μg〜約1.
0μgである、請求項１９に記載の免疫原性組成物。