CN100340290C - 包含ADP-核糖化毒素和含有CpG结构的寡核苷酸的颗粒疫苗组合物 - Google Patents
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Abstract
描述了在粘膜表面引起免疫应答的方法,也描述了适合于本方法的用于在粘膜表面引起免疫应答的组合物。此外,提供了用于治疗或防治通过粘膜表面侵入受试者机体的病原体引起的疾病的方法。
Description
技术领域
本发明涉及适用于通过粉末注射递送系统穿越皮肤疫苗递送的组合物。本发明尤其涉及诱导粘膜免疫应答的方法和应用颗粒疫苗组合物治疗和接种的方法。
发明背景
粘膜是不同病原体,如细菌、病毒和寄生虫的侵入门户。因此,疫苗或在粘膜表面诱导免疫保护(抗体和细胞免疫)接种方法,对合适的抵抗众多疾病,如AIDS、肺炎和流感是必要的。通常认为,用注射器和针头通过肠外接种不能导致粘膜免疫应答,只有将疫苗直接应用在粘膜组织才能引起粘膜免疫性。非复制疫苗对粘膜表面的局部应用,由于其递送效率低,还不是很成功。
通过皮肤途径免疫可引起血清抗体应答。通过皮肤途径递送(delivery)疫苗的方法包括:用液体注射器皮内注射,经皮免疫(TCI),贴剂递送(patch delivery)和我们最近描述的表皮粉末注射技术。与其它皮肤免疫方法相比,粉末注射使用较少的疫苗剂量可诱导较高的血清抗体效价。重要的是,通过粉末注射方法,各种各样的佐剂可共同配成处方,与疫苗一起递送以提高和调节免疫应答。
皮肤不是粘膜组织;因此,通过皮肤接种不能引起粘膜应答。然而,Glenn G.M.等最近报道了经皮免疫后对霍乱毒素的IgA抗体应答,而不是对共同施用(co-administered)的白喉类毒素的抗体应答(Glenn等(1998)J.Immunol.161:3211-3214;Glenn(1999)Infect Immun.67:1100-1106)。在这些研究中,作者声明,与预期的结果一样,没有发现对共同施用的白喉类毒素的粘膜IgA抗体,在这些实验中使用的霍乱毒素剂量是100mg。TCI是一种通过非穿刺完整皮肤利用ADP-核糖化外毒素(如霍乱毒素等)递送液体疫苗的技术。
发明概述
本发明提供了一种可诱导对抗原产生粘膜免疫性的新方法,该方法优选与佐剂或佐剂结合物(adjuvant combination)共同组成处方,用粉末注射技术递送。本发明至少有四点不同于TCI方法:1)粉末注射是通过穿孔角质层递送颗粒疫苗组合物,而TCI是通过将液体疫苗组合物涂布于完整的非穿刺皮肤;2)粉末注射诱导对疫苗抗原的粘膜免疫应答,而TCI仅仅对霍乱毒素接种媒介物/佐剂诱导粘膜IgA,而不是对共同施用的抗原;3)除ADP-核糖化外毒素外,其它佐剂如CpG,在粉末注射方法中可用于诱导和提高粘膜应答,而TCI仅仅依赖于ADP-核糖化外毒素来递送;4)粉末注射比TCI使用的疫苗和佐剂剂量更低。我们进行的一些研究已经阐明:粉末注射系统使用的疫苗剂量在TCI中既不能对霍乱毒素诱导出,也不能对与佐剂共同施用的疫苗诱导出可检测到的粘膜抗体应答。本发明同时也提供了在此方法中使用的疫苗组合物,以及提供了对通过粘膜表面进入机体的病原体引起的疾病的治疗方法。
因此,本发明提供了一种在粘膜表面引起免疫应答的方法,包括用穿越皮肤递送技术将颗粒疫苗组合物递送到脊椎受试者(subject)皮肤或穿过皮肤,其中所述的疫苗组合物包含抗原或编码抗原的核酸,优选的方法是用无针注射器粉末注射装置递送颗粒疫苗组合物。
本发明也提供了抗原或编码抗原的核酸在颗粒疫苗组合物的生产过程中的用途,该组合物用于脊椎受试者粘膜表面引起粘膜免疫应答,其中所述的颗粒疫苗组合物是通过穿越皮肤递送技术被递送入皮肤或穿过皮肤的。优选使用无针注射器粉末注射装置。
进而,佐剂组合物可被递送到脊椎受试者。佐剂组合物可用于与疫苗组合物相同或不同的位点。也可以将佐剂组合物先于疫苗组合物或在其后或同时递送。佐剂组合物和疫苗组合物可作为单一组合物或单独组合物施用。在一个特别的实施方案中,佐剂组合物是颗粒形式,用穿越皮肤递送技术递送,优选使用无针注射器粉末注射装置。
因此,本发明提供了在颗粒疫苗组合物的生产过程中抗原或编码抗原的核酸的用途,该组合物用于脊椎受试者粘膜表面产生粘膜免疫应答,其中所述的佐剂组合物是共同施用于生物体,颗粒疫苗组合物是通过穿越皮肤递送技术递送入皮肤或穿过皮肤,优选使用无针注射器粉末注射装置。
在一个优选的实施方案中,佐剂组合物包含两种或多种佐剂的结合。在特别优选的实施方案中,佐剂组合物包含霍乱毒素和包含CpG结构的寡核苷酸。
在另外的实施方案中,本发明提供了适合于穿越皮肤递送技术向脊椎受试者皮肤或穿过皮肤递送的颗粒疫苗组合物。所述的组合物包含抗原、或编码该抗原的核苷酸、作为佐剂的ADP-核糖化毒素、和包含CpG结构的寡核苷酸。在优选的实施方案中,ADP-核糖化毒素是霍乱毒素。这些组合物也被特殊的作为治疗法或作为疫苗施用于皮肤而对通过粘膜表面进入机体的病原体产生粘膜免疫。优选用无针注射器粉末注射装置递送颗粒疫苗组合物。
本发明进一步包括产品,其包含:(i)包含抗原或编码抗原的核酸的颗粒疫苗组合物;和(ii)作为结合制剂同时、顺次或单独使用用于在脊椎受试者的粘膜表面产生粘膜免疫应答的佐剂组合物,其中所述的组合物是通过穿越皮肤递送技术递送入或穿过机体皮肤。
本文也提供了装载有(如:包含)一种本发明的疫苗组合物和/或佐剂组合物的无针注射器粉末注射装置。此外,也提供了适合于无针注射器粉末注射装置使用的剂量容器。该容器包含本发明的一种颗粒疫苗组合物和/或佐剂组合物。
还有在另外的实施方案中,本发明提供了用于治疗或防治由通过粘膜表面侵入脊椎受试者机体内的病原体引起的疾病的方法。该方法要求使用穿越皮肤递送技术向需要治疗或接种的脊椎受试者皮肤内或穿过皮肤递送颗粒疫苗组合物,其中疫苗组合物包含抗原或编码抗原的核酸,和然后共同施用佐剂组合物于受试者。佐剂组合物包含ADP-核糖化毒素和疫苗和佐剂组合物的共同施用足以产生对抗原特异的粘膜免疫应答。优选ADP-核糖化毒素是霍乱毒素。
本发明也提供了衍生于或获自通过粘膜表面进入脊椎受试者机体内病原体的抗原,和编码该抗原的核酸,在引起粘膜免疫应答的颗粒疫苗组合物的生产过程中的用途,其中所述的颗粒疫苗组合物是用于治疗或防治由所述病原体引起的疾病,通过将疫苗组合物以足以在受试者的粘膜表面产生粘膜免疫应答的量施用于所述需要治疗或接种的受试者。在某些方面,疫苗组合物进一步包含作为佐剂的ADP-核糖化毒素和包含CpG结构的寡核苷酸。在其它方面,佐剂组合物与疫苗组合物共同施用,其中佐剂组合物包含ADP-核糖化毒素,和疫苗与佐剂组合物的共同施用,足以在受试者的粘膜表面产生对抗原特异的粘膜免疫应答。
参照本文公开的内容,本领域的普通技术人员很容易想到本发明的这些以及其它的实施方案。
附图简述
图1A和1B显示用粉末注射技术递送白喉类毒素组合物引起的粘膜抗体应答。用两个剂量的5μg白喉类毒素和5μg霍乱毒素组成的处方在第0周和第4周给小鼠接种。图1A和图1B分别表明了第6周用ELISA测定的小鼠个体唾液中IgG效价和IgA效价。
图2比较了用粉末注射技术或TCI递送技术递送白喉类毒素疫苗组合物诱导血清抗体应答。用两个5μg剂量的白喉类毒素和5μg霍乱毒素组成的处方在第0周和第4周给小鼠接种。显示了第6周用ELISA检测的8只小鼠混合血清的血清IgG效价。缩写DT:(白喉类毒素);CT:(霍乱毒素);TCI:(经皮免疫);PowerJect:(穿越皮肤粉末注射)。
图3比较了通过粉末注射技术或TCI递送技术递送白喉类毒素疫苗组合物诱导的粘膜应答。用5μg白喉类毒素和5μg霍乱毒素组成的处方在第0周和第4周给小鼠接种。在第6周收取组织块并体外培养7天。用ELISA检测组织培养上清液中抗白喉类毒素抗体。显示了8只小鼠的平均IgG水平。缩写PP:(集合淋巴结);MLN:(肠系膜淋巴结);CT:(霍乱毒素);DT:(白喉类毒素);PJ:(穿越皮肤粉末注射);TCI:(经皮免疫)。
图4是分别对通过(1)粉末注射技术,(2)TCI递送技术或通过常规针头和注射器腹膜内注射递送白喉类毒素疫苗组合物的应答中,鼻水(nasal secretion)中IgG抗体水平的比较。用5μg白喉类毒素和5μg霍乱毒素组成的处方在第0周和第4周给小鼠接种。在第6周收集鼻水用ELISA检测抗白喉类毒素抗体。显示了4只单只动物的IgG效价。缩写IP:(用针头腹膜内注射);TCI:(经皮免疫);PowerJect:(穿越皮肤粉末注射)。
图5比较了通过粉末注射或流感疫苗的TCI递送流感疫苗组合物(含有或不含有霍乱毒素佐剂)后产生的对流感疫苗(存在于气管培养上清液中)的IgA抗体水平。在第0周和第4周给小鼠接种两个5μg剂量的流感疫苗。第6周收集气管并体外培养7天。用ELISA检测培养上清液中的IgA抗体。显示了每种免疫方案中6只单只动物的IgA效价。缩写Flu:(流感疫苗);CT:(霍乱毒素);PJ:(穿越皮肤粉末注射);TCI:(经皮免疫)。
图6是通过粉末注射或TCI递送施用流感疫苗组合物(含有或不含有霍乱毒素佐剂)后,对流感疫苗(鼻水中)产生的IgG抗体水平的比较。在第0周和第4周给小鼠接种两个5μg剂量的流感疫苗。第6周收集鼻水用于ELISA检测抗体。显示了6只动物平均IgG抗体效价。缩写Flu:(流感疫苗);CT:(霍乱毒素);PJ:(穿越皮肤粉末注射);TCI:(经皮免疫);SI:(小肠);PP:(集合淋巴结);MLN:(肠系膜淋巴结)。
图7是通过粉末注射或TCI递送施用流感疫苗组合物(含有或不含有霍乱毒素佐剂)后,对流感疫苗(存在于粘膜组织培养上清液中)产生的IgG抗体水平的比较。在第0周和第4周给小鼠接种两个5μg剂量的流感疫苗。第6周收集粘膜组织并体外培养7天。用ELISA检测培养上清液中的IgG抗体。显示了6只单只动物的IgG效价。缩写:Flu:(流感疫苗);CT:(霍乱毒素);PJ:(穿越皮肤粉末注射);TCI:(经皮免疫)。
图8A-8D是通过粉末注射分别递送施用(a)不含佐剂的流感疫苗,(b)含霍乱毒素佐剂的流感疫苗,(c)含包含CpG结构的寡核苷酸佐剂的流感疫苗,(d)含这两种佐剂的联合物的流感疫苗后对流感疫苗(鼻水中)产生IgA抗体水平的比较。在第0周和第4周给小鼠接种两个5μg剂量的流感疫苗。第6周收集鼻水用ELISA检测。图8A显示了8只动物鼻水中平均IgA效价。图8B显示了8只动物唾液中平均IgA效价。图8C显示了8只动物阴道冲洗混合物中IgA效价。图8D显示了8只动物粪便提取物中平均IgA效价。缩写Flu:(流感疫苗);PR8:(PR8流感疫苗);CT:(霍乱毒素);CpG:(含CpG结构的寡核苷酸);PJ:(穿越皮肤粉末注射)。
图9是通过粉末注射分别给予(a)不含佐剂的流感疫苗组合物,(b)含霍乱毒素佐剂的流感疫苗组合物,(c)含包含CpG结构的寡核苷酸佐剂的流感疫苗组合物,(d)这两种佐剂的联合物的流感疫苗组合物后对流感疫苗(来自于不同的体外培养的粘膜组织)产生IgA抗体水平的比较。在第0周和第4周给小鼠接种两个5μg剂量的流感疫苗。第6周收集粘膜组织体外培养7天,用ELISA检测。显示了8只小鼠平均IgA效价。缩写PP:(集合淋巴结);SI:(小肠);PR8:(PR8流感疫苗);CT:(霍乱毒素);CpG:(含CpG结构的寡核苷酸);PJ:(穿越皮肤粉末注射)。
图10A-10C是通过粉末注射分别给予(a)不含佐剂的流感疫苗组合物,(b)含霍乱毒素佐剂的流感疫苗组合物,(c)含包含CpG结构的寡核苷酸佐剂的流感疫苗组合物,(d)这两种佐剂结合物的流感疫苗组合物后,对流感疫苗(在粘膜分泌物和体外培养的粘膜组织中)产生IgG抗体水平的比较。在第0周和第4周给小鼠接种两个5μg剂量的流感疫苗。第6周收集粘膜分泌物用ELISA检测。第6周收集粘膜组织并体外培养7天,用ELISA检测培养上清液中流感特异性抗体。图10A显示了8只动物不同粘膜组织培养上清液中IgG平均效价。图10B显示了8只动物粪便提取物中平均IgG效价。图10C显示了8只动物唾液混合物中IgG效价。缩写PP:(集合淋巴结);SI:(小肠);MLN:(肠系膜淋巴结);Flu:(流感疫苗);CT:(霍乱毒素);CpG:(含CpG结构的寡核苷酸);PJ:(穿越皮肤粉末注射)。
图11显示了通过粉末注射分别给予(a)不含佐剂的市售流感疫苗,(b)含霍乱毒素佐剂的市售流感疫苗,或(c)含有霍乱毒素佐剂和包含CpG结构的寡核苷酸佐剂的联合物的市售流感疫苗后,对流感抗原产生的IgG抗体水平。每组8只小鼠接受不同的疫苗组合物,免疫4周后收集血清样本。数据显示了单只动物的IgG效价(O)和每组8只动物的平均效价(-)。缩写:no adj.(无佐剂);CT:(霍乱毒素);CpG:(含CpG结构的寡核苷酸)。
图12显示了在接种小鼠用异源流感菌株激发(challenge),对死亡率的保护。通过粉末注射给小鼠接种(a)不含佐剂的市售流感疫苗,(b)含霍乱毒素佐剂的市售流感疫苗,或(c)含有霍乱毒素佐剂和包含CpG结构的寡核苷酸佐剂的结合物的市售流感疫苗。每组8只小鼠接受不同的疫苗组合物,激发采用鼻内给予10X鼠源流感(mouse-adaptedinfluenza)(Aichi/68(H3N2))病毒LD50剂量。与0%的非接种对照组动物(°)激发后存活8天,以及仅有40%的接种单独的疫苗组合物的动物(◇)激发后存活10天相对照,不论是通过粉末注射接受单独含有霍乱毒素佐剂的疫苗组合物(□)或者是接受含有包含CpG结构的寡核苷酸佐剂的霍乱毒素佐剂(*)疫苗组合物的所有动物激发后存活完整的21天监控期。缩写:no adj.(无佐剂);CT:(霍乱毒素);CpG:(含CpG结构的寡核苷酸)。
图13显示了存在于通过粉末注射接种含有霍乱毒素佐剂和含CpG结构的寡核苷酸佐剂的结合物的市售流感疫苗的小鼠粘膜组织样本中的流感抗原特异性IgA分泌细胞。对照组动物通过用常规针头和注射器鼻内施用或皮下注射接种同样含有上述佐剂化(adjuvanted)的流感疫苗组合物(磷酸盐缓冲液中)。每组8只动物用不同的疫苗组合物于第0天初次接种和第28天强化,强化免疫后两周收集粘膜组织样本。用混合样本制备细胞悬液,用ELISPOT分析法计数流感病毒抗原特异性IgA分泌细胞。图中显示的数据是8只小鼠混合粘膜组织中IgA点形成细胞(SPC)的平均频率。缩写:IN(鼻内);EI(穿越皮肤粉末注射);SC(皮下);PP(集合淋巴结)。
优选实施方案详述
在详细描述本发明之前,有一点必须清楚,即本发明并不限定于特殊的药学制剂或工艺参数,因为这些,当然,可改变。同样也必须清楚这里所用的术语仅仅是为了描述发明的特殊实施方案,而不是为了限定。
必须指出,如无另外的明确说明,本说明书和所附的权利要求中所用的单数形式“a”“an”“the”包括被谈到的对象的复数形式。因此,例如谈到“一个颗粒”包括两个或多个颗粒,谈到“一种抗原”或“一种佐剂”包括混合物或两种或多种这样的因子的结合物,谈到“一种赋形剂”包括两种或多种赋形剂的混合物等等。
A.定义
除非有另外的限定,本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的意义相同。尽管相同或相近于本文所描述的一系列方法和材料可用于本发明的实施,本文描述优选的材料和方法。
为了描述本发明,将使用下列术语,并且进行如下说明。
如本文所用,术语“穿越皮肤递送”(transdermal delivery)包括皮内(如进入真皮或表皮)和穿越皮肤的(如“经皮的”)即通过因子递送到或经过至少皮肤的最外层(top layer of skin)。参见,如:TransdermalDrug Delivery:Developmental Issues and Research Initiatives,Hadgraft andGuy(eds.),Marcel Dekker,Inc.,(1989);Controlled Drug Delivery:Fundamentals and Applications,Robinson and Lee(eds.),Marcel DekkerInc.,(1987);和Transdermal Delivery of Drugs,Vols.1-3,Kydonieus andBerner(eds.),CRC Press,(1987)。术语明确地包括将颗粒因子递送到目标组织,提供粘膜免疫应答,特别是包括通过粉末注射技术递送因子。
至于“无针注射器”意指一种可用于实施粉末注射技术的仪器,和在本文用于穿越皮肤递送颗粒组合物,而不具穿刺皮肤的常规针头。本发明所用的合适的无针注射器将在整篇文件中讨论。
“抗原”是指任何有免疫源性的一部分或因子,通常是大分子,它可单独在个体诱导免疫学应答。术语被用于指单独的大分子或抗原性大分子的同源或异源群(population)。如本文所述,术语“抗原”包括过敏原。因此,抗原包括蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、寡糖、多糖等等。进而,抗原可从任何病毒、细菌、寄生虫、原虫或真菌衍生所得,也可以是完整的有机体。典型的抗原可衍生于通过粘膜表面侵入机体的病原体。术语也包括衍生于粘膜组织肿瘤的肿瘤抗原(例如,食管癌、肺癌、胃癌、宫颈癌等)。同样地,如在DNA免疫应用中的表达抗原的寡核苷酸或多聚核苷酸,也包括在抗原的定义内。合成抗原也包括在内,如抗原表位,侧翼抗原表位和其它的重组或合成的衍生抗原(Bergmann等(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781;Bergmann等(1996)J.Immunol.157:3242-3249;Suhrbier,A.(1997)Immunol.and Cell Biol.75:402-408;Gardner等(1998)第12届世界AIDS研讨会(12thWorld AIDS Conference),日内瓦,瑞士,6月28日-7月3日,1998)。
术语“疫苗组合物”是指包含抗原的任何药剂组合物,它们被用于保护或治疗受试者的疾病或病情症状。这样,术语既包括疫苗亚组分,如包含从完整有机体分离或分散的抗原的疫苗组合物,抗原与这些完整的有机体自然状态下联系在一起,同时组合物包括细菌、病毒、寄生虫和其它微生物在内的完全不再有传染力的(killed)、减毒的或灭活的病原体。疫苗组合物也包括如本文所述的一种或多种佐剂。典型的疫苗组合物是被用于预防经过粘膜表面侵入机体的病原体所引起的疾病。
术语“粘膜表面”包括所有被分泌粘液保护的机体外表面。这些粘膜表面包括胃肠道表面、呼吸道表面和生殖道表面。眼和尿道也包括在该定义内。皮肤不是粘膜表面。
对一个选定的因子、抗原或感兴趣的组合物的“免疫学应答”或“免疫应答”是指一个个体对存在于因子或感兴趣的组合物中的分子(如抗原)产生的体液和/或细胞免疫应答。为了本发明的目的,“体液免疫应答”是指以抗体分子介导的免疫应答,而细胞免疫应答是指以T淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。
“粘膜免疫应答”意指对粘膜表面的抗原或感染因子(上下文中的体液的或细胞的)的免疫性的产生。粘膜表面体液免疫性的产生涉及向粘液的抗体分泌。IgG亚族的抗体可能存在于粘液中。然而,粘膜免疫应答的明显标志是IgA抗体的产生。IgA是粘膜分泌物中重要的抗体亚族,在这里它们的功能是阻止微生物从外表面进入。“抗原特异性IgA应答”是指直接针对特异性抗原的IgA抗体产生。抗原特异性免疫应答是粘膜免疫应答产生的重要部分。
术语“佐剂”指任何有能力特异性的或非特异性的改变、提高、指导、加强或启动抗原特异性免疫应答的物质或组合物。因此,佐剂和抗原(如疫苗组合物)的共同施用可以使接受抗原的受试者在接受较低或较少剂量抗原的情况下能够产生粘膜免疫应答。佐剂的有效性可通过分别施用于动物佐剂加疫苗组合物和疫苗组合物对照后,和用本领域熟知的放射免疫检测法、酶联免疫检测法(ELISAs)、CTL分析等标准检测法检测比较两种情况下产生的抗体效价和/或细胞介导的免疫性来实现。典型的情况下,在疫苗组合物中,佐剂可以是从抗原分离出来的一部分,尽管单一分子兼有佐剂和抗原的特性(如霍乱毒素)。对于本发明的目的,佐剂既用来提高对特异性抗原的免疫应答,如当佐剂与疫苗共同施用时,产生的粘膜免疫应答大于给予等量没有佐剂的疫苗组合物,或也可使用佐剂对施用于皮肤的抗原指导粘膜免疫应答。此外,对于本发明的目的,佐剂的“有效剂量”是指该剂量可以增强对疫苗组合物中共同施用的抗原的免疫学应答,这样,只需较低或较少剂量的抗原就可产生有效的粘膜免疫应答。
“佐剂组合物”是指包含佐剂的任何药剂组合物。佐剂组合物可以用任何合适的药剂形式,如液体、粉末、膏剂、洗液、乳剂、胶剂等,通过本发明的方法递送。然而,优选的佐剂组合物将是颗粒形式。
同样地,抗原或疫苗组合物的“有效剂量”是指该剂量可以刺激接受疫苗组合物的受试者产生抗原特异性粘膜免疫应答。免疫应答可以是体液、细胞介导和/或保护性的粘膜免疫应答。优选的粘膜免疫应答是,或包括,粘膜表面的IgA应答。
这里所用的术语“共同施用”,如佐剂是与抗原“共同施用”(如疫苗组合物),指佐剂与抗原同时施用或合并施用,例如,当这两种在同一组合物中或在几乎同一时间而不同部位分别单独组合物的施用,也包括佐剂与抗原在不同时间的单独组合物的施用。例如,佐剂组合物可在相同或不同部位先于抗原给予,也可以在给予抗原后施用。给予佐剂和抗原的时间间隔,其范围可以是几分钟、几小时直至几天。
由抗原或佐剂组成的颗粒典型地被制成药剂组合物,其可以包含一种或多种添加的物质,如载体(carrier)、媒介物(vehicle)和/或赋形剂。“载体”“媒介物”“赋形剂”通常是指基本上惰性的物质,它们是无毒的和不以有害的方式与组合物中的其它组分反应。这些物质可以用来增加颗粒组合物中固体含量。合适载体的例子包括水、硅树脂、凝胶、蜡等。常被用作“赋形剂”的例子包括药剂级的右旋糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇糖、肌醇、葡聚糖、淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、碳酸钙、硫酸钙、枸橼酸钠、枸橼酸、酒石酸、氨基乙酸、高分子量的聚乙二醇(PEG)和它们的结合物。
这里所用的术语“治疗(treatment)”,包括下列任一种:感染或再感染的防治;症状的减轻或消除;病原体的减少或完全消除。治疗可以实现预防的目的(感染前)。
其中,术语“个体(individual)”和“受试者(subject)”可交互使用,指脊索亚门的任何成员,包括但不限于人类和其它灵长类(包括非人灵长类,如黑猩猩和其它类人猿以及猴子);畜牧动物,如牛、绵羊、猪、山羊和马;家畜哺乳类,如狗和猫;实验动物包括啮齿类,如小鼠、大鼠和豚鼠;鸟类(包括家养、野生和野味(game)鸟类如鸡、火鸡和其它鹌鹑鸟类、鸭、鹅);鱼等。该术语不指明特定年龄。因此既包括成年也包括新生个体。因此,这里所描述的方法可用于上述脊椎动物种属的任何动物,因为所有这些脊椎动物的免疫系统运行相似。
B.一般方法
本发明所用的抗原优选从通过粘膜表面侵入脊椎动物组织的病原体衍生或获得。或者抗原也可以是合成的诱导抗体(特别是IgA抗体)的抗原,它们直接作用于病原体或对通过粘膜表面侵入机体的病原体有特异性。本发明中所用的佐剂或佐剂结合物优选包含或衍生于细菌ADP-核糖化外毒素家族的细菌外毒素(“bAREs”),进一步优选包含或衍生于霍乱毒素(CT)。抗原以颗粒形式递送,优选通过粉末注射技术施用于目标皮肤位点。佐剂被同样的施用于皮肤,如,以颗粒形式,和优选通过粉末注射技术。
抗原
适合的病毒抗原包括,但不限于,来自于包括肝炎A病毒(HAV)、肝炎B病毒(HBV)、肝炎C病毒(HCV)、δ肝炎病毒(HDV)、肝炎E病毒(HEV)和肝炎G病毒(HGV)的肝炎病毒家族的抗原或编码这些抗原的多核苷酸序列。参见,例如,国际公布号WO 89/04669;WO 90/11089;和WO90/14436。HCV基因组编码数个病毒蛋白质,包括E1和E2。参见,例如,Houghton等(1991)Hepatology 14:381-388。包含编码这些蛋白质序列的基因组片段及其抗原性片段将会用于本方法中。同样地,HDV的δ-抗原的编码序列是已知的(参见,例如,美国专利第5,378,814号)。这些序列编码的肽/蛋白也已经知道或很容易获得。
同样地,大量来自于人疱疹病毒家族的不同的蛋白可用于本发明,包括衍生于单纯疱疹病毒(HSV)1型和2型的蛋白,如HSV-1和HSV-2糖蛋白gB,gD,gH;衍生于水痘带状病毒(VZV),EB病毒和巨细胞病毒(CMC)包括CMCgB和gH的蛋白;和衍生于其它人类疱疹病毒如HHV6和HHV7的抗原。(参见,如Chee等(1990)Cytomegalovirus(J.K.McDougall,ed.,Springer-Verlap,pp.125-169;McGeoch等(1988)J.Gen.Virol.69:1531-1574;美国专利第5171568号;Baer等(1984)Nature 310:207-211;Davison等(1986)J.Gen.Virol.67:1759-1816.)
人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原,如众多的HIV-1和HIV-2分离株gp120分子,包括HIV不同基因亚型的成员,已经知道和报道(参见,如:Myers等,Los Alamos Database,Los Alamos National Laboratory,LosAlamos,New Mexico(1992);和Modrow等(1987)J.Virol.61:570-578),衍生于任何这些分离株的抗原可用于本发明的方法。进而,本发明对于衍生于任何不同的HIV分离株的免疫源性蛋白同样适用,包括任何不同的包膜蛋白,如gp160和gp41,gag抗原如p24gag和p55gag,也包括衍生于pol,env,tat,vif,rev,nef,vpr,vpu和HIV的LTR区域。
衍生于或得自于其它病毒的抗原也可用于权利要求的方法,如,但不限于,来自于下列病毒家族成员的蛋白:小RNA病毒科(如脊髓灰质炎病毒、鼻病毒等);杯状病毒科;披膜病毒科(如风疹病毒、登革热病毒等);黄病毒科;冠状病毒科;呼肠弧病毒科(如轮状病毒等);双节段RNA病毒科;弹状病毒科(如狂犬病毒等);正粘病毒科(如流感病毒A、B和C型等);纤细病毒科;副粘病毒科(如流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸多核病毒、副流感病毒等);本雅病毒科;沙粒病毒科;逆转录病毒科(如HTLV-I、HTLV-II、HIV-I(也被认为是HTLV-III,LAV,ARV,hTLR等)),包括但不限于来自于HIVIIIb,HIVSF2,HIVLAI,HIVMN;HIV-1CM235,HIV-1US4;HIV-2和其它病毒分离株中的抗原;猿类免疫缺陷病毒(SIV);乳头瘤病毒;蜱传脑炎病毒等。参见,如:Virology,3rd Edition(W.K.Joklik,ed.1988);Fundamental Virology,2nd Edition(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.1991),对这些病毒和其它病毒进行了描述。
更适宜地,用于本发明的病毒抗原获自或衍生于通过粘膜表面典型地侵入机体的已知引起或与人类疾病有关的病毒病原体,如,但不限于,HIV(AIDS),流感病毒(Flu),单纯带状疱疹病毒(生殖器感染、冷感冒症、STDs),轮状病毒(腹泻),副流感病毒(呼吸道感染),麻疹和流行性腮腺炎病毒(麻疹、流行性腮腺炎),风疹病毒(风疹)和鼻病毒(普通感冒)。
适合的细菌和寄生虫抗原得自于或衍生于已知与成为疾病病因的因子,这些疾病包括但不限于白喉、百日咳、破伤风、结核、细菌或真菌肺炎、中耳炎、淋病、霍乱、伤寒、脑膜炎、单核细胞增多症、鼠疫、志贺菌病或沙门菌病、军团病、莱姆病、麻风病、疟疾、钩虫病、盘尾丝虫病、血吸虫病、锥虫病、Lesmaniasis、贾第虫病(Giardia)、变形虫病、丝虫病、Borelia和旋毛虫病。进一步还有来自于或衍生于非传统病毒的抗原,如库鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布综合症(CJD)、痒病、传播性水貂脑病和慢性消瘦疾病,以及蛋白感染颗粒如与疯牛病有关的阮病毒。
更适宜地,用于本发明的细菌抗原得自于或衍生于通过粘膜表面典型地侵入机体的已知引起或与人类疾病有关的细菌病原体,如,但不限于,链球菌(肺炎,咽喉炎,中耳炎)、嗜血杆菌属流行性感冒(中耳炎)、莫拉菌属cartarrhalis(中耳炎)、淋病奈瑟菌(淋病)、霍乱弧菌(霍乱,腹泻)、沙门氏菌(小肠感染,腹泻)、大肠杆菌(小肠感染,生殖道感染)、志贺菌属(志贺菌病)、结核病分枝杆菌(结核病)、脑膜炎奈瑟菌(脑膜炎)、肺炎支原体(呼吸道感染)和衣原体(肺炎,生殖道感染)。
粘膜免疫性对于用疫苗或组合物治疗或防治经吸入或经口遇到的过敏原引起的过敏状况或紊乱可能是重要的。在这方面,粘膜抗体(IgA和/或IgG抗体)可以在它们产生过敏状况前结合和清除这些抗原。这样,用于本发明的合适的过敏原种类包括,但不限于,花粉、动物头皮屑、禾本科植物、霉菌、灰尘、抗生素、叮刺昆虫的毒液和各种各样的环境因素(包括化学物和金属物)、药物和食物过敏原。通常的树木过敏原包括棉花、popular、桉树、白桦、枫树、橡树、榆树、山胡桃木树的花粉;通常的植物过敏原来自于包括黑麦、豚草、英国车前草、酸尾草(sorrel-dock)和藜草的植物;植物接触性过敏原来自于包括毒橡树、毒常春藤、荨麻的过敏原。通常的草本过敏原包括梯牧草(Timothy)、Johnson、百幕大和霉系属牧草;通常的过敏原也可以从霉菌或真菌得到,如:链格孢属,镰刀菌属,单孢枝霉属,曲霉属,小多孢属,毛霉菌属和嗜热放线菌;青霉菌和四环素是通常的抗生素过敏原;皮肤过敏原来自于居住环境或有机粉尘(典型的真菌产地),昆虫如家螨(dermatphagoides pterosinyssis),或动物源如羽毛、猫和狗的皮屑;通常的食物过敏原包括牛奶和奶酪(奶牛厂),蛋,小麦,坚果(如花生),海鲜(如贝壳类),豌豆,大豆,和麸质过敏原。通常的环境过敏原包括金属(镍和金),化学物质(甲醛,苦味酸和松节油),胶乳,橡胶,纤维(棉花和羊毛),粗麻布,染发剂,化妆品,清洁剂和香水过敏原;通常的药物过敏原包括局部麻醉药和水杨酸过敏原;通常的抗生素过敏原包括青霉素和磺胺过敏原;通常的昆虫过敏原包括蜜蜂、黄蜂和蚂蚁毒液,蟑螂萼(cockroach calyx)过敏原。特性显著的过敏原包括,但不限于,Der pI过敏原的主要和潜在的抗原表位(Hoyne等(1994)Immunology 83:190-195),蜜蜂毒液磷脂酶A2(PLA)(Akdis等(1996)J.Clin Rnvest.98:1676-1683),白桦花粉过敏原Bet v1(Bauer等(1997)Clin.Exp.Immunol.107:536-541),和多抗原表位重组草过敏原rKBG8.3(Cao等(1997)Immunology 90:46-51)。这些和其它合适的过敏原可从商业购买和/或容易的通过下列已知技术制备提取物。
用于本发明的抗原可以用多种本领域已知的方法获得或生产。特别是,可以从天然材料通过标准纯化技术直接分离。或者可以用已知技术重组生产抗原。参见,如:Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Vols.I,II,III,Second Edition(1989);DNA Cloning,Vols.I,II(D.N.Glover ed.1985)。这里所用的抗原也可以通过化学聚合物合成法,如固相肽合成法,以所描述的氨基酸序列为基础合成。这些方法是本领域技术人员所熟知的。参见,如:J.M.Stewart and J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Ed.,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)and G.Barany and R.B.Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,editors E.Gross and J.Meienhofer,Vol.2,AcademicPress,New York,(1980),pp.3-254,对于固相肽合成技术;和M.Bodansky,Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Berlin(1984)and E.Gross and J.Meienhofer,Eds.,The Peptides:Analysis,Synthesis,Billogy,见上文,Vol.1,对于经典溶液合成(classical solution synthesis)。
如果愿意,编码上述描述的抗原的多核苷酸序列可以用重组方法获得,如通过筛选表达基因的细胞的cDNA和基因组文库,或从包含同样基因的已知载体得到基因。此外,可以用标准的技术,如苯萃取和cDNA或基因组DNA的PCR,从包含同样基因的细胞和组织直接分离得到目的基因。参见,如:Sanbrook等,见上文,对于得到和分离DNA的技术描述。多核苷酸序列也可以通过合成生产,而不是克隆。
还有另外的方便方法,可以通过聚合酶链反应(PCR)分离特异性核苷酸分子。Mullis等(1987)Methods Enzymol.155:335-350。该技术用DNA聚合酶,通常是耐热DNA聚合酶,复制DNA目标区域。通过与目的DNA的相对链和末端互补的特异性序列的寡核苷酸鉴别被复制的DNA区域以及引发复制反应。复制的第一轮产物本身是随后复制的模板,这样,复制的连续进行产生了被所用引物对限定的DNA片段的几何级放大。
一旦获得后,多核苷酸序列可以在哺乳动物,细菌,酵母或昆虫表达系统表达,以提供合适的抗原制剂,或用它本身作为核苷酸抗原组合物(如:用于核苷酸免疫技术)。
不论抗原以何种形式使用(肽,全菌,核苷酸),目标抗原如本文所述,通常是和佐剂一起,制成颗粒组合物用于受试者,佐剂可以用来提高对抗原的粘膜免疫应答,或可以用于对抗原指导粘膜免疫应答。因此,颗粒组合物被用于皮肤,几乎在一种或多种粘膜表面引起令人惊讶的粘膜免疫应答的产生。优选使用可穿孔角质层的穿越皮肤递送系统,如粉末注射系统。佐剂递送到皮肤也优选典型的穿孔角质层穿越皮肤递送方法。正如前面解释的那样,佐剂既可以提供于与抗原同样的组合物中,也可以单独提供,既可以与抗原或疫苗组合物同时,也可以先于或随抗原之后施用。此外,佐剂可以被用于相同或不同的部位。
佐剂
本发明可以有效的使用任何合适的佐剂或佐剂结合物。例如:合适的佐剂包括,但不限于,由铝盐形成的佐剂(alum),例如氢氧化铝,磷酸铝,硫酸铝等等;水包油和油包水乳剂,例如完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA);细菌细胞壁成分制成的佐剂,如包含脂多糖的佐剂(如脂质A或单磷酸脂质A(MPL),Imoto等(1985)Tet.Lett.26:1545-1548),包含海藻糖二霉菌酸酯(TDM),和细胞壁骨架(CWS);热休克蛋白或它们的衍生物的佐剂;衍生于ADP-核糖化细菌毒素的佐剂,包括白喉毒素(DT),百日咳毒素(PT),霍乱毒素(CT),大肠杆菌(E.coli)热不稳定毒素(LT1和LT2),假单孢菌属外毒素A,假单孢菌属外毒素S,仙人掌(B.cereus)胞外酶,球果菌属毒素,肉毒菌C2和C3毒素,Limosum胞外酶,以及来自产气荚膜梭菌、C.spiriforma、差异(sifficile)梭菌金黄色葡萄球菌EDIN的毒素,以及ADP-核糖化细菌毒素突变体例如CRM197,非毒素白喉毒素突变体(参见,如:Bixler等(1989)Adv.Exp.Med.Biol.251:175;和Constantino等(1992)Vaccine);皂角苷佐剂,如Quil A(美国专利No.5057540),或由皂角苷如ISCOMs产生的颗粒(免疫刺激复合物);趋化因子和细胞因子,如白细胞介素(如IL-1,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-12等),干扰素(如γ干扰素),巨细胞集落刺激因子(M-CSF),肿瘤坏死因子(TNF),防御素1or2,RANTES,MIP-α和MIP-2等;胞壁肽,如N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异构谷氨酰胺(thr-MDP),N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异构谷氨酰胺(nor-MDP),N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异构谷氨酰-L-丙氨酰-2-(1’-2’-软脂酰-sn-甘油酰-3羟基磷脂酰)-乙胺(MTP-PE)等;从CpG家族分子,CpG二核苷酸和包含CpG结构的合成寡核苷酸衍生的佐剂(参见,如:Krieg等Nature(1995)374:546,Medzhitov等(1997)Curr.Opin.Immunol.9:4-9,和Davis等J.Immunol.(1998)160:870-876)如TCCATGACGTTCCTGATGCT(SEQ ID NO:1)和ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(SEQ ID NO:2);以及合成佐剂,如PCPP(聚-二(苯氧基羧酸酯)膦腈)(poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene](Payne等Vaccines(1998)16:92-98)。这些佐剂可从一系列经销商购买,如Accurate Chemicals;Ribi Immunechemicals,Hamilton,MT;GIBCO;Sigma,St.Louis,MO。优选衍生于ADP-核糖化细菌毒素的佐剂,更优选与霍乱毒素和热不稳定毒素一起的佐剂。还优选包含CpG结构的寡核苷酸。
佐剂可以单独的使用,也可以和两种或两种以上的佐剂结合使用。在这一点上,结合的佐剂在促进粘膜免疫应答方面有叠加或协同作用。协同作用是指两种或多种佐剂结合后所达到的效果比预计单独应用每一种佐剂所达到的效果的简单相加要大。优选的佐剂结合物是衍生于ADP-核糖化细胞毒素和包含CgP结构的合成寡核苷酸。更优选由霍乱毒素和寡核苷酸ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(SEQ ID NO:2)组成的结合物。
不幸的是,大部分上述参考佐剂已知是高毒性的。因此,通常认为其在人体应用是有毒的。正因为如此,通常可用于人体的佐剂只有明矾,一种铝盐化合物。尽管如此,一系列上述佐剂通常被用于动物和适用于众多的受试者,其中几种正在进行临床前研究和人体临床研究。然而,如本文上述所讨论的那样,优选将佐剂以颗粒形式通过粉末注射方法应用。令人惊奇的是,已经发现通常认为人用毒性太大的佐剂,当以颗粒形式通过粉末注射技术使用时,没有出现伴随的毒性问题。不用被特殊的理论限制,很明显的,用穿越皮肤递送方法(粉末注射)将佐剂递送到皮肤,可使其与皮肤表皮层的朗罕氏细胞以及皮层的树突状细胞相互作用。这些细胞在免疫应答的启动和维持中很重要。因此,通过向这些细胞或其附近递送佐剂,可以提高佐剂的效果。此外,在本发明的实施中,穿越皮肤递送佐剂可避免毒性问题,因为:(1)皮肤外层血管不丰富,因此减少了进入循环系统的佐剂量,也就减少了毒性作用;(2)皮肤细胞不断脱落,因此残余佐剂被排除,而不是被吸收;(3)实际上用较少的佐剂就可产生适当的佐剂效果(与用常规技术如肌肉注射递送佐剂相比)。
一旦选择后,佐剂可被制成合适的药剂形式肠外使用,这些剂型的制备是本领域普通技术人员所熟知的。参见,如:Remington’s PharmaceuticalSciences(1990)Mack Publishing Company,Easton,Penn.,18th edition。也可以将佐剂按下面描述的方法制成颗粒形式。药剂形态中应有足够量的佐剂,可产生预期的效果,即可以提高对共同施用的目标抗原的免疫应答,和/或可以指导对目标抗原的粘膜免疫应答。通常用约0.1μg-1000μg佐剂,优选约1μg-500μg佐剂,更优选用约5μg-300μg佐剂,可有效的提高对所用抗原的免疫应答。因此,例如CpG,在本发明中,剂量范围为约0.5-50μg,优选约1-25μg,更优选约5-20μg。对于霍乱毒素,剂量范围在约0.1μg-50μg,优选约1μg-25μg,更优选约5μg-15μg。同样地,对于明矾或PCPP,剂量范围在约2.5μg-500μg,优选约25-250μg,更优选约50-150μg。对于MPL,用本发明的方法,剂量范围在约1-250μg,优选约20-150μg,更优选约40-75μg。
其它佐剂的剂量,对于本领域的技术人员,使用常规方法,是很容易决定的。施用剂量将依赖于一系列的因素,包括共同施用的抗原,也包括作为粘膜免疫应答刺激因子的佐剂的能力。
颗粒组合物
一旦得到目标抗原,(以及选择的佐剂),可将其制成颗粒组合物。特别是,包含目标抗原和/或佐剂的颗粒制剂可以用标准的化学制剂学和方法制造,所有这些方法对于适当的专业技工是很容易得到的。例如,一种或多种抗原和/或佐剂可以与一种或多种可作为药用的赋形剂或媒介物联合制成抗原、佐剂或疫苗组合物。辅助物质,如加湿或乳化剂,pH缓冲物质等,可以存在于赋形剂或媒介物中。这些赋形剂,媒介物和辅助物质通常是一些其自身不对接受组合物的个体产生免疫应答和施用后不具不适当毒性的药剂因子。可作为药用的赋形剂包括,但不限于,液体如水,盐水,聚乙二醇,透明质酸,甘油和乙醇。可作为药用的盐类其中包括,例如无机酸盐,如盐酸盐,氢溴化物,磷酸盐,硫酸盐等;以及有机酸盐如醋酸盐,丙酸盐,丙二酸盐,苯甲酸盐等。还有,尽管不是必需,但更好的是抗原组合物包含可作为药用稳定剂的载体,特别是对于肽、蛋白质或其它类似的抗原。作为肽类的稳定剂的合适载体包括,但不限于,药用级右旋葡萄糖,蔗糖,乳糖,海藻糖,甘露醇,山梨醇,肌醇,右旋糖苷等。其它的合适载体包括,同样不限于,淀粉,纤维素,磷酸钠或磷酸钙,枸橼酸,酒石酸,甘氨酸,高分子量的聚乙二醇和它们的结合物。在REMINGTON’S PHARMACEUTICALSCIENCES(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中对可作为药用的赋形剂,载体,稳定剂和其它的辅助物质进行了彻底的讨论,这里引为参考。
制成的组合物应包含一定量的目标抗原,它足以增加免疫学应答,如上述定义的那样。合适的有效量对于本领域的技术人员是很容易确定的。这个量在一个相对的宽阔范围内,通常在0.1μg-25mg或更多目标抗原的范围内。特殊的合适量可通过常规实验确定。组合物可包含约0.1%-99.9%的抗原。如果组合物中包括佐剂,或该方法是用于提供颗粒佐剂组合物,则佐剂可按照上述描述的方法,确定一个合适的量。然后,组合物可通过标准的技术制成颗粒形式,如通过简单的蒸发(空气干燥),真空干燥,喷雾干燥,冷冻干燥(真空冷冻干燥),喷雾-冷冻干燥,喷雾包被,沉淀,超临界流体颗粒形成等。如果愿意,合成的颗粒可使用在共同拥有的国际公布No.WO97/48485中描述的技术增加密度,引入本文作为参考。
在使用前,包装单剂量或多剂量的容器,其是一个装入合适量的由目标抗原和/或选择的佐剂(如疫苗组合物)组成的颗粒的密封容器。颗粒组合物可以包装为无菌形式,设计这样密封的容器,可以使药剂在按照本发明的方法使用前无菌保存。如果愿意,容器可改制成直接用于无针注射系统。
包装颗粒的容器可进一步进行标记,以便识别组成物和提供有关的剂量信息。此外,容器可标记上政府例如FDA,规定的提示,在其中显示按照联邦生产、使用或销售法规,包含在其中的抗原、佐剂(或疫苗组合物)已被批准人体使用。
然后,颗粒组合物(包含目标抗原和/或选择的佐剂)可通过穿越皮肤递送技术施用。适宜的是,通过粉末注射方法递送颗粒组合物,如用共同拥有的国际公布Nos.WO94/24263,WO96/04947,WO96/12513,和WO96/20022上描述的无针注射系统,所有这些引入本文作为参考。从该无针注射系统的颗粒递送是和颗粒一起实施的,这些颗粒大小通常在0.1-250μm的范围内,优选10-70μm之间。大于250μm的颗粒也可以通过该装置递送,但是必须指出,作为上限的颗粒可以引起对皮肤细胞的不幸的损害。递送颗粒将要穿透目标表面的实际距离依赖于颗粒大小(如假定为大约几何学球形颗粒的标称(nominal)直径),颗粒密度,颗粒冲击表面的初始速度以及目标皮肤组织的密度和运动学粘性。在这一点上,无针注射的最佳颗粒密度范围通常是约0.1-25g/cm3,优选约0.9-1.5g/cm3,注射速度范围通常在约100-3000m/sec或更大。在合适的气压下,平均直径约10-70μm的颗粒通过喷嘴加速,形成接近超声速的推进气体流。
如果愿意,这些无针注射系统可被预装载含有目标抗原和/或选定的佐剂组成的合适剂量。装载的注射器可以包装在密封的容器中,也可以如前面描述的那样进一步作标记。
包膜颗粒
相应地,如果希望胞内递送,抗原和/或佐剂可被包被到合适的载体颗粒,如金或钨。如果抗原是核酸形式提供,优选胞内递送。因此,在本发明的一个实施方案中,抗原、编码抗原的多核苷酸(如DNA疫苗)和/或佐剂是用载体颗粒递送的。递送这些疫苗制剂的颗粒介导法在本领域是已知的。特别是,一旦制备和经过适当的纯化,抗原、编码抗原的核酸分子和/或佐剂可用本领域已知的各种技术包被到载体颗粒(如发射核心载体(ballistic core carriers))。载体颗粒选自于颗粒大小在一定范围内密度合适的物质,颗粒大小范围是指可用于基因枪胞内递送。最适载体颗粒大小当然依赖于目标细胞的直径。
任何合适的载体颗粒都可使用,例如由聚合物或金属(如钨,金,铂和铱);然而,优选钨和金载体颗粒。平均大小在0.5-2.0μm直径的钨颗粒很容易得到。尽管这些用于颗粒介导方法的颗粒有最适的密度和可以用DNA高效包被,但是钨对于某些细胞类型可能有潜在的毒性。金颗粒或微晶金(如金粉A1570,购自于Engelhard Corp.,East Newark,NJ)也可用于本方法。金颗粒提供均一的大小(购自于Alpha Chemicals的颗粒大小1-3μm,购自于Degussa,South Plainfield,NJ的颗粒大小包括0.95μm)和减少的毒性。微晶金提供了形形色色的颗粒大小分布,典型地在0.5-5μm范围内。而且,微晶金不规则的表面区保证了核酸、抗原和佐剂的高效包被。
已知有很多方法已经描述了向金或钨颗粒上包被或沉淀DNA或RNA。这些方法通常是将预定量的金或钨与质粒DNA,CaCl2和亚精胺结合。在包被过程中,连续的涡旋混合液以保证反应混合物的均一性。在核酸沉淀后,包被颗粒可被转移到合适的膜上,使其在使用前、包被到样品模块或样品盒前、装入基因枪专用递送盒前干燥。
肽抗原和/或佐剂可以通过类似于本领域的技术,按照经验比率简单混合两种成分,通过硫酸铵沉淀或其它溶剂沉淀法将其附着于载体颗粒,或通过肽的化学结合附着于载体颗粒。L-半胱氨酸与金的结合已在此前描述过(Brown等(1980)Chemical Society Reviews 9:271-311)。其它的方法包括,例如,将肽抗原溶解到无水乙醇,水,或乙醇/水混合物,将溶液加入到一定量的载体颗粒,然后,在空气或氮气流下边搅拌边干燥混合物。或者可在真空条件下,用离心法将肽抗原干燥到载体颗粒上。一旦干燥,可把包被颗粒重新悬浮在合适的溶剂中(如乙酸乙酯或丙酮),研磨(如超声法)制成大体均一的悬液。
随着他们的形成,包被抗原和/或佐剂制剂的载体颗粒可以通过颗粒介导递送技术递送到目标皮肤位点。各种各样的适合颗粒介导递送的颗粒加速装置在本领域是已知的,并且都适用于本发明的实施。目前的装置设计使用爆发的、电子或气体的释放把包被的载体颗粒推向靶细胞。包被的抗体颗粒自身可被可释放的附着于可移动的载体膜上,或者可移动地附着于有气流通过的表面上,从表面提升和加速它们到靶位。美国专利No.5204253描述了一种气体释放装置的例子。美国专利No.4945050描述了一种爆发型装置。美国专利No.5120657描述了一种氦释放型颗粒加速器PowderJectXR instrument(PowderJect Vaccines,Inc.,Madison),WI。美国专利No.5149655描述了一种适合于这里使用的电子释放装置。所有这些专利的公开引入本文作为参考。
单一剂量的包被载体颗粒可提供在一个合适的容器内,例如,提供在内表面包被一定剂量颗粒的一定长度的试管。共同拥有的美国专利Nos.5733600和5780100描述了制备这种容器的方法,它们的公开引入本文作为参考。
以适合剂型的方式和对本发明的目的有效的量,将颗粒组合物或包被的颗粒施用于个体。递送组合物的量(如,约0.1μg-1mg,优选1-50μg抗原或过敏原),依赖于被测试的个体和被施用的特殊的抗原或过敏原。必需的准确量依赖于被治疗个体的年龄和总体状况,对于本领域的技术人员,在通读本说明的基础上,很容易决定一个合适的有效量。
用法和用量表
抗原、佐剂或包含抗原和/或佐剂的组合物可通过适合剂量制剂的方式,以可有效产生期望的粘膜免疫应答的量施用于受试者。对于编码抗原的核酸分子,每次施用的抗原量通常约在0.001μg-10mg范围内,优选每剂量使用核酸分子的量在约0.01μg-5000μg范围内(通常在每剂量0.5μg/kg-100μg/kg核酸分子范围内),而对于抗原分子(如肽、糖类或完整微生物),其范围在1μg-20mg,优选1μg-5mg,更优选10μg-3mg。当然,精确的量既依赖于受试者,也依赖于治疗或防治的情况。特别是,准确的所需量将根据个体的年龄和综合状况、所选择的特殊的抗原和/或佐剂以及其它因素而不同。对于本领域的技术人员,在通读本说明的基础上,很容易确定合适的有效量,和/或可以通过常规的实验来确定。
对于粉末注射,实施颗粒的穿越皮肤递送所用的颗粒大小通常约在0.1-250μm之间。然而,最适的颗粒大小通常至少在10-15μm(典型细胞的大小)。大于250μm的颗粒也可以用该装置递送,但是必须指出,作为颗粒大小的上限,其可能引起对皮肤的不幸的损害。对于其它的生物药剂,如肽和蛋白制剂,大小通常约在0.1-250μm,优选约0.1-150μm,更优选20-60μm。
递送颗粒将要穿透目标表面的实际距离依赖于颗粒大小(如假定为大约几何学球形颗粒的标称直径),颗粒密度,颗粒冲击表面的初始速度以及目标皮肤组织的密度和运动学粘性。在这一点上,无针注射的最佳颗粒密度范围通常是约0.1-25g/cm3,体积密度的范围是约0.5-3.0g/cm3。注射速度范围通常在约100-3000m/sec。
如果愿意,佐剂或包含佐剂的组合物可被制成为可注射的剂型,典型的有流体溶液或悬浮液,或易于在注射前溶于或悬浮于流体媒介物的颗粒形式。可将佐剂乳化或甚至用胶囊包装,如脂质体载体。也可以将佐剂组合物制成适于局部使用的剂型,例如可药用的局部载体形式,如软膏、乳剂、胶剂、霜剂或洗剂。对于本领域的技术人员,在通读本说明的基础上,很容易知道其它合适的药剂形式和施用途径。
药剂治疗可以按照单剂量计划,也可以按照多剂量计划。对于疫苗组合物,多剂量计划可以首次用1-10个独立剂量接种,在一定的时间间隔后用其它剂量接种,选择用于维持或增强免疫应答,例如在1-4个月给予第二个剂量,如果需要,几个月后再给予一定剂量。剂量处方将,至少部分,通过受试者的需要来决定,并且依赖于医师的判断。此外,如果希望防治疾病,通常在初次感染目标抗原前使用组合物。如果是希望治疗,例如减少症状或复发,通常在初次感染后施用组合物。
C.实施例
以下是实施本发明的具体实施例。提供实施例的目的仅仅是为了阐明,而不是意于用任何形式限制本发明的范围。
尽管已经努力保证所用数字的精确性(如数量、温度等),但是一些实验的误差和偏差当然是允许的。
材料和方法概述
疫苗配制:可用一系列的颗粒配制工艺将疫苗制成粉末。优选将赋形剂,如海藻糖、蔗糖、琼脂糖、甘露醇或糖类赋形剂混合物用于制剂中,提供(抗原和/或佐剂的)稳定性和提高颗粒特性(如提高硬度、密度)。标准的颗粒制备工艺包括空气干燥、冷冻干燥、喷雾包膜、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥和超临界流体技术。
下面是一个空气干燥疫苗组合物的例子。首先,使抗原(如白喉类毒素,流感疫苗等)与佐剂(如霍乱毒素,包含CpG结构的合成寡核苷酸等)结合,然后与海藻糖/水溶液混合。将溶液轻轻混合,倒入玻璃皮氏培养皿,置通风橱中干燥两天,之后在干燥器(NalgeneTM Plasticdesiccator)中进一步干燥,接着用N2气净化一天。用刮铲收集干燥的固体,用研钵和研棒研磨。最后,称取干燥粉末的重量,根据配制的剂量数决定将总量分成每个剂量干燥物质的量。测量重新配制的疫苗组合物的颗粒大小分布,可用的颗粒大小范围很广泛(如1-100mm)。通过称量确定粉末疫苗组合物的合适量并装入颗粒盒子。典型地,每剂量约需1-2mg干重。重量偏差小于或等于10%。
装置:粉末注射技术使用先前描述的氦-粉末PowderJectND粉末注射装置(无针注射器)(参见,如Bellhouse,等的美国专利No.5899880)。用于实施本研究的粉末注射装置是一种从PowderJect Vaccines,Inc.(Madison,WI)得到的可回收重复使用的研究模型。该仪器长约15cm,由开关、氦气室、疫苗盒(包含颗粒疫苗组合物)、喷嘴和消声器组成。使用时,不锈钢的气室装有约5ml药用级氦气,压力达到50巴。打开开关后,释放的氦气冲破三层盒子的膜,将疫苗颗粒加速到足够高的速度,使得颗粒可穿透角质层被递送入表皮。氦气被皮肤反射回来通过排出消声器排除。颗粒的穿透深度依赖于粉末处方、颗粒大小、气压和装置的结构。所有这些参数可通过实验优化到使递送粉末穿透不同厚度的角质层。
小鼠和接种:接种前,将购自于HSD的7周龄雌性Balb/C或SwissWebster小鼠,置于鼠笼中适应环境观察一周。通过腹膜内注射100mg/kg绿胺酮和10mg/kg赛拉嗪麻醉小鼠,用剃刀将腹部皮肤脱毛。将粉末注射装置轻轻压在接种位点并开动开关。典型的免疫方法由相隔4周的两次接种组成,每次接种前和免疫加强两周后,在麻醉状态下通过后眶下点取血法(retro-orbital bleeding)收集血液。对于经皮免疫(TCI)程序,麻醉小鼠的腹部皮肤被脱毛后,将液体疫苗组合物用于脱毛区,并在用温水冲洗前保持1小时。
ELISA(酶联免疫法):通过标准的ELISA程序测定对各种不同的疫苗组合物的抗体应答。特别是,将溶入PBS(每孔)中的待测抗原0.1μg(白喉类毒素)或1μg(流感病毒)包被96孔板,4℃维持过夜。用含有0.1%Brij-35的TBS洗板三次,和含1%BSA(牛血清白蛋白)(白喉类毒素)或5%干乳(流感病毒)的PBS稀释的测试血清孵育1.5小时。将含有高水平的特异性抗原的抗体的标准血清加入到每个板,用于在最终数据分析时标化效价。然后洗板并与生物素标记的羊抗鼠免疫球蛋白IgG或特异性IgG亚族(PBS中1∶8000稀释,Sothern Biotechnology)在室温下孵育1小时。三次洗板后与链霉素-辣根过氧化物酶结合物(PBS中1∶8000稀释,Sothern Biotechnology)在室温下孵育1小时。最后,洗板并用TMB底物(来自于Bio-Rad,Richmond,CA的试剂盒)显色。用Softmax Pro4.1 program(Molecular Devices)作为校准最高稀释度,用超过平均背景0.1的A450检测测试血清的终点效价。用接受除测试血清以外的所有试剂的微孔(well)测定平均背景吸收。
实施例1
通过皮肤免疫诱导对白喉类毒素的粘膜免疫应答
为了测定向皮肤粉末注射递送疫苗组合物是否可诱导粘膜抗体应答,进行了下列实验。将5μg白喉类毒素和10μg霍乱毒素与海藻糖赋形剂结合,并按照以上描述的方法制成粉末疫苗组合物。然后通过粉末注射递送粉末疫苗组合物免疫Balb/C小鼠。在实验的第0天和第28天进行免疫。在第42天收集血清和唾液。然后用ELISA测定白喉类毒素特异性抗体效价。
除抗原特异性血清IgG效价诱导外(未提供资料),向皮肤粉末注射白喉类毒素可诱导出唾液中对白喉类毒素的IgG(图1A)和IgA(图1B)抗体。已知用常规的针头和注射器向深层组织(如肌肉)注射,通常不能诱导唾液中IgA抗体。而作为对比,本发明的表皮粉末注射免疫可引起粘膜(IgA抗体)应答。
实施例2
粉末注射或TCI施用方法产生粘膜抗体应答的比较
为了比较用粉末注射和TCI向皮肤递送疫苗组合物,引起粘膜抗体应答的能力,进行了如下研究。将含5μg白喉类毒素与5μg霍乱毒素的结合物的疫苗组合物制成颗粒形式(用于粉末注射)或液体形式(用于TCI施用)。分别用两种方法将组合物于实验的第0周和第4周免疫Balb/C小鼠。第6周收集血清和粘膜组织样本。体外培养粘膜组织样本(气管、肺、阴道、小肠、集合淋巴结和肠系膜淋巴结)7天。用ELISA检测组织培养上清液和血清中的抗原特异性应答。
图2-4描述了研究结果。首先,如图2所示,粉末注射既可以引起对白喉类毒素也可以引起对霍乱毒素高水平的血清IgG抗体,而同样的免疫组合物用TCI方法施用只能引起对霍乱毒素中等水平的血清IgG抗体,并且检测不到对共同施用的白喉类毒素的IgG抗体(图2)。
此外,如图3所示,发现通过粉末注射方法免疫的小鼠粘膜组织培养上清液中有一致的高水平IgG抗体。这些抗体很可能是7天体外培养的粘膜组织样本中的抗体分泌细胞产生的(在开始培养前,用大量的缓冲液和培养基冲洗样本以除去所有血清抗体)。作为对比,将同样的疫苗组合物通过TCI免疫小鼠,在任何培养的粘膜组织中都没有导致任何可检测到的抗体(图3)。这些数据显示,疫苗组合物粉末注射到皮肤成功地引起弥散于粘膜组织中的抗原特异性抗体分泌细胞的产生,产生对目标抗原的粘膜免疫性重要步骤。这些数据也显示了:在TCI方法中不能产生免疫性的抗原和佐剂量,用粉末注射方法时可以在受试者中成功提供免疫状态。
最后,通过检测粘膜分泌物中的抗体,也显示了粉末注射对皮肤粘膜免疫性的成功诱导。再看图4,发现粉末注射,而不是TCI施用,诱导出免疫小鼠鼻水中高水平的IgG应答(图4)。现在比较容易接受肠外注射(如本研究中的腹膜内(IP)注射对照)不能产生鼻粘膜抗体应答。鼻水中存在升高的IgG(如仅见于粉末注射)表明了成功的粘膜免疫应答。而且,通过粉末注射法进行小鼠皮肤免疫时,在其阴道分泌物、肺灌洗物和粪便样品中,也发现了高水平的IgG抗体(未提供数据)。
实施例3
通过皮肤免疫诱导对流感病毒的粘膜免疫应答
为了证实疫苗组合物对皮肤的粉末注射法可对其它抗原诱导粘膜免疫应答,进行了以下研究。从商业购买灭活的流感病毒。由于灭活的流感病毒是80-120nm的颗粒,因此TCI方法将因为角质层的相对不通透性而无法递送疫苗通过皮肤。
尤其是,将5μg灭活流感病毒(Strain Aichi/68,H3N2)制成粉末或液体疫苗两种形式,每种组合物都包含5μg的霍乱毒素佐剂。分别通过粉末注射或TCI将疫苗施用于Balb/C小鼠。在研究的第0周和第4周进行免疫。第6周收集粘膜分泌物用于抗体分析。第6周收集粘膜组织块样品用于体外培养和抗体分析。
图5-7描述了该研究的结果。首次发现了在体外组织培养分析(见图5)基础上,粉末注射递送疫苗组合物(霍乱毒素(CT)与流感病毒一起配制)诱导了流感特异性IgA应答。而且,霍乱毒素佐剂提高了用粉末注射法免疫的小鼠的粘膜IgA应答(见图5:用粉末注射法单独注射流感病毒和与CT一起制成的流感病毒比较)。在该检测中,TCI法单独施用流感病毒或与霍乱毒素佐剂联合施用,未能产生可检测到的对流感疫苗的IgA应答。
现参照图7,当检测鼻水时,接受疫苗粉末注射的小鼠中,用ELISA检测到抗流感病毒IgG的升高。这里,霍乱毒素佐剂又显示了对抗体应答的提高(见图6:流感病毒单独粉末注射和流感病毒与CT联合粉末注射的比较)。用TCI方法,不论是单独施用流感病毒,或是与CT佐剂联合施用,均不能产生可检测到的抗体应答(图7)。
最后,参照图6,在组织块培养基础上,也发现了颗粒疫苗组合物在各种不同的粘膜组织中引起流感特异性IgG抗体应答,将流感疫苗与霍乱毒素佐剂配合施用提高了这种粘膜免疫应答(见图7:流感单独粉末注射和流感与CT佐剂联合粉末注射的比较)。
实施例4
通过皮肤免疫诱导对流感病毒的粘膜免疫应答
为了确定通过粉末注射技术向皮肤递送时,是否所用的佐剂而不是CT佐剂引起了粘膜免疫应答,进行了下列研究。本研究的第二个目的是确定通过粉末注射向皮肤递送时,CpG和CT佐剂的联合是否具有协同作用(synergistic fashion)或叠加作用而引起了粘膜应答。
灭活的流感病毒PR8作为本研究中的目标抗原。5μg的灭活流感病毒(PR8/38株,H1N1)与5μg CT佐剂(含有或不含有10μg CpG DNA)或10μg CpG DNA(CpG序列:ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(SEQ IDNo:2))联合使用,并制成颗粒(粉末)组合物。疫苗组合物通过粉末注射装置用于Balb/C小鼠。在研究的第0周和第4周进行免疫。第6周收集粘膜分泌物和血清样本,然后用于抗体分析。第6周收集粘膜组织块用于体外培养和抗体分析。
图8-10描述了研究结果。现在参照图8A-8D,流感疫苗组合物与CT佐剂配合向皮肤粉末注射后,在鼻粘膜(图8A)、唾液(图8B)、阴道冲洗液(图8C)和粪便提取物(图8D)产生的分泌型IgA应答。这和上述实施例3得到的结果一致。而且,包含CpG佐剂的疫苗组合物也引起对流感疫苗的粘膜应答(图8A-8D)。然而,令人惊奇的是阐明了CpG与CT佐剂联合使用可产生增效作用,也就是说,在诱导分泌型IgA应答方面,联合使用比单独使用任何一种都更有效(图8A-8D)。在粘膜分泌物检测中(鼻粘膜、唾液、阴道和粪便),CT与CpG佐剂的联合应用可产生一致的高水平IgA效价。
如图9所示,从接受包含CT或包含CpG佐剂的疫苗组合物的小鼠获得的粘膜组织样品(气管、阴道、肺、集合淋巴结和小肠)体外培养上清液中,也检测到了IgA抗体。而且,与上述报告一致,联合使用CT和CpG佐剂比单独施用任何一种佐剂所诱导的IgA产量要高。同时,也比单独施用任何一种佐剂的效果的简单相加要高。这些资料显示:颗粒流感疫苗组合物向皮肤的注射诱导了弥散的粘膜免疫应答,而且,CpG/CT佐剂联合使用在促进粘膜免疫应答方面起到了协同作用。
最后,也测定了粪便提取物、唾液和粘膜组织培养物中的IgG效价(见图10A-10C的结果),使用CT或CpG佐剂的这些粘膜样本中显示了IgG效价的升高。而且,佐剂的联合使用在促进对流感疫苗的粘膜IgG应答方面,也比单独使用任何一种都更有效。
实施例5
通过皮肤免疫诱导对流感抗原的粘膜免疫应答
为了评价一些问题,进行了下列研究。首先,进行研究以便证实通过皮肤施用(如上述实施例所示)引起抗流感粘膜免疫性的能力无菌株特异性。另外,再重新观察当给予皮肤粉末注射时,CpG和CT佐剂联合使用对诱导粘膜应答能力的效果。
从商业购买流感疫苗产品(Strain A/Sydney/5197(H3N2)流感亚群疫苗产品得自于Swiss Serum Institute,Switzerland)。将1/10剂量的人流感疫苗产品(相当于1.5μg HA抗原)与海藻糖赋形剂结合,将其制成颗粒,或与10μgCT佐剂联合制成颗粒,或与5μgCT和10μg CpG DNA制成颗粒(CpG序列:ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(SEQ ID No:2))。通过粉末注射装置将颗粒疫苗组合物施用于Balb/C小鼠(8只/组)。第0周进行免疫,研究的第4周收集血清标本,但时间应先于在第4周进行的用10X LD50的鼠源Aichi/68(H3N2)流感病毒通过鼻内递送法激发(challenge)。对照组小鼠不接受任何疫苗组合物。然后,用前面描述的ELISA程序检测流感特异性IgG效价。
图11-12描述了研究的结果。参见图11,用ELISA检测的接种4周后血清样本的抗体(IgG)应答。由图可见,用包含CT和CpG佐剂的组合物免疫可产生较高的IgG效价。再看图12,用图示阐明了各种不同的疫苗组合物保护免疫小鼠对抗异源流感病毒激发的能力。由图可见,在超过21天的激发研究监视期内,包含1/10剂量A/Sydney株人疫苗和CT佐剂或CT与CpG联合佐剂的疫苗组合物提供了完全的保护(100%存活率)。这些结果与未实验的对照组(naive control)100%死亡率,以及接受不含佐剂的1/10剂量的A/Sydney株人疫苗的小鼠的60%死亡率形成了对比。本发明的疫苗组合物通过无针粉末注射给予皮肤后,对粘膜暴露于病毒的激发提供了保护作用。
实施例6
通过不同的途径施用时,霍乱毒素毒性的比较
霍乱毒素是迄今为止鉴别出的最有效免疫原之一。用于本发明的方法时,可诱导强烈的粘膜应答。进行下列研究意在评价CT佐剂直接应用于粘膜组织(鼻内应用液体CT)或以颗粒形式通过无针注射(通过PowderJectND粉末注射装置)应用于皮肤时,其剂量范围的相对毒性。尤其是,将下列剂量1μg,5μg,10μg,20μg和50μg的CT通过粉末注射或鼻内施用给予每组小鼠(每组8只Balb/C小鼠)时。研究结果在下表1中描述。由表可见,即使在高剂量(50μg CT)时,粉末注射给予皮肤没有出现任何毒性征兆,而10μg CT,当直接给予鼻粘膜时,导致100%死亡率。这些结果说明通过无针粉末注射将疫苗组合物给予皮肤可避免佐剂毒性。
表1
CT剂量 | 鼻内#死亡率/总数 | 粉末注射#死亡率/总数 |
1μg | 0/8 | 0/8 |
5μg | 0/8 | 0/8 |
10μg | 8/8 | 0/8 |
20μg | …… | 0/8 |
50μg | …… | 0/8 |
实施例7
皮肤免疫后粘膜组织流感特异性IgA分泌细胞的检测
为了定量通过皮肤粉末注射免疫的小鼠粘膜组织中存在的抗原特异性IgA分泌细胞数,进行了如下研究。在本研究中,灭活的流感病毒PR8株作为目标抗原。5μg的灭活流感病毒(PR8/38株,H1N1)与10μg CT佐剂和10μg CpG DNA(CpG序列:ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(SEQID No:2))联合使用,并制成颗粒(粉末)组合物。将粉末疫苗组合物通过粉末注射装置用于每组8只Balb/C小鼠的实验组。分别在研究的第0天和第28天进行免疫。
同时也设立对照组。对于对照疫苗,将5μg灭活的流感病毒(PR8/38株,H1N1)与10μgCT佐剂和10μg CpG DNA(CpG序列:ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(SEQ ID No:2))联合使用,并与磷酸盐缓冲液(PBS)混合制成液体组合物。第一组对照组8只Balb/C小鼠,用常规针头和注射器将液体疫苗组合物皮下递送。对于第二组对照组8只Balb/C小鼠,则鼻内给予液体疫苗组合物。与实验组一样,也在研究的第0天和第28天进行免疫。
第二次免疫后两周(即研究的第42天),从每组小鼠收集粘膜组织样品(气管、小肠、肺组织和集合淋巴结),将样品分别混合,既用于评估粘膜抗体产物的组织块培养分析,也用于在ELISPOT检测法中评估流感特异性IgA分泌细胞。尤其是,小块的气管和小肠收集后,要用含0.1%庆大霉素的无钙、镁Hank’s平衡盐溶液(“HBSS”,GIBCO-BRL,Grand Island,NY)大量的冲洗。最后,将组织块用完全的RPMI培养基冲洗,并在90%O2和10%CO2,37℃条件下,在24孔平底组织培养板(COSTAR)上培养7天。培养基是含10%胎牛血清,1%L-谷氨酸,0.01%庆大霉素和1%抗生素-抗真菌溶液的Kennett’s H-Y培养基(JRH BioSciences,Zlenexa,KS)。用ELISA检测组织培养上清液中的流感特异性抗体(未提供数据)。
在IgA的ELISPOT中,从免疫小鼠肺和集合淋巴结制备的单细胞悬液用于检测。为了制备单细胞悬液,先收集肺并用Dipdase液(1.5mg/mlHBSS,Bioehringer Mannheim Biochemicals,Indianapolis,IN)边搅拌边消化2小时。收集集合淋巴结并用精细镊切开,然后,将分成几部分的混合物通过一个70μm的灭菌细胞滤器(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)而得到单细胞悬液。然后用无钙、镁的HBSS充分冲洗,并在含10%胎牛血清、1%L-谷氨酸和1%抗生素-抗真菌溶液的RPMI培养基中重新悬浮。
ELISPOT检测是在96孔硝化纤维素板(Milliscreen,Millipore)上进行的。将10μg/ml福尔马林灭活的PR8流感病毒用0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)用于板子的包被。在室温下,板子用10%RPMI阻断1小时。冲洗后,将100μl不同浓度的粘膜组织淋巴细胞悬液加入每个孔,置5%CO2,37℃条件下培养过夜。然后用PBS洗板5次,每孔中加入100μl用PBS适当稀释的羊抗鼠IgA-碱性磷酸酶结合物(SouthemBiotechnologies),并在室温下温育4小时。然后,用PBS(0.05%吐温-80)洗板5次。然后用碱性磷酸酶底物试剂盒(Bio-Red Laboratories,Melville,NY)显色。通过在Olympus解剖显微镜(Leeds PrecisionInstruments,Inc.,Minneapolis,MN)下计数染色点而定量染色点数。
图13描述了ELISPOT检测法的结果。如图可见,用PR8疫苗组合物佐以CT和CpG穿越皮肤粉末注射免疫的小鼠,其集合淋巴和肺粘膜组织IgA形成点出现的频率分别是200/百万细胞和542/百万细胞。通过粘膜组织(鼻内递送)直接接受同样疫苗组合物的小鼠,仅仅显示出略高频率,分别是集合淋巴结266/百万细胞和肺粘膜组织783/百万细胞。这些结果与从通过皮下注射接收同样疫苗组合物的小鼠得到的结果形成了对比,在那些小鼠中,用该检测法检测不到流感特异性IgA分泌细胞。这些数据有力的说明了本发明中向皮肤施用粉末组合物引起了强烈的粘膜免疫应答,大体上与直接粘膜免疫技术(鼻内)得到的结果相当。
因此,公开了诱导粘膜免疫应答的新颖的疫苗组合物和方法。尽管在某些方面详细的描述了本发明的优选实施方案。但是必须明白,在不违反本发明所附权利要求所定义的精神和范围的情况下,可以进行显而易见的变化。
<110>宝德杰克特疫苗有限公司
<120>通过皮肤途径接种诱导粘膜免疫性
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atcgactctc gagcgttctc 20
Claims (8)
1.一种适合于递送入或穿过脊椎动物受试者皮肤的颗粒疫苗组合物,这里所述的组合物包含:
a)抗原或编码所述抗原的核苷酸;
b)作为佐剂的ADP-核糖化毒素;和
c)包含CpG结构的寡核苷酸。
2.根据权利要求1的一种疫苗组合物,其中所述的ADP-核糖化毒素是霍乱毒素。
3.根据权利要求1的一种疫苗组合物,其中所述的抗原衍生于或得自于经过粘膜表面侵入受试者机体的病原体。
4.根据权利要求1的一种疫苗组合物,其中所述的抗原是病毒抗原或细菌抗原。
5.根据权利要求1的一种疫苗组合物,其中所述的抗原是活的,减毒微生物。
6.一种适用于无针注射器粉末注射装置的剂量容器组合产品,该剂量容器包含一种如权利要求1~5的任何一项中所定义的疫苗组合物。
7.一种无针注射器粉末注射装置的组合产品,所述注射装置中装载有权利要求1~5的任何一项中定义的疫苗组合物。
8.组分(a)一种衍生于或得自于通过粘膜表面侵入脊椎动物受试者机体的病原体的抗原,或编码所述抗原的核苷酸;(b)作为佐剂的ADP-核糖化毒素;和(c)包含CpG结构的寡核苷酸的结合在颗粒疫苗组合物生产中的用途,该颗粒疫苗组合物可用于治疗或防治所述病原体引起的疾病,该疫苗组合物可以足以在受试者的粘膜表面引起抗原特异性IgA抗体应答的量施用于需要治疗或接种的所述受试者。
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