DE69432486T2

DE69432486T2 - Huehner-anaemie-virus mutante, impfstoffe, und verwendung basiert auf virusproteinen vp1, vp2 und vp3, oder dafuer kodierende virus-sequenzen

Info

Publication number: DE69432486T2
Application number: DE69432486T
Authority: DE
Inventors: Hubertus Matheus NOTEBORN; Guus Koch
Original assignee: Leadd BV
Current assignee: Leadd BV
Priority date: 1993-07-20
Filing date: 1994-07-19
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2014-07-20
Also published as: AU703187B2; EP1253201A2; ATE236980T1; ZA945275B; PT1253201E; DE69432486D1; EP1253201A3; JP3829290B2; WO1995003414A2; DE69435117D1; CA2167578C; AU7547394A; WO1995003414A3; ATE401406T1; DK1253201T3; EP0784685A2; ES2311005T3; EP1253201B1; JPH09504941A; US5952002A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Proteine und/oder Polypeptide des Hühneranämievirus. Daneben bezieht sie sich auf Impfstoffe und Zusammensetzungen zur Prävention oder Behandlung von Virusinfektionen bei Geflügel, insbesondere Infektionen mit dem Hühneranämievirus (CAV).
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Impfstoffe, die weniger pathogen sind als das CAV selbst, aber dennoch zur Bildung von neutralisierenden Antikörpern in dem immunisierten Tier führen.
Daneben bezieht sich die Erfindung auf Zusammensetzungen, die Antikörper gegen Teile des CAV enthalten, zur Bekämpfung von Infektionen mit CAV. Auch antiidiotypische Antikörper, die eine Immunogenität besitzen, die der des Antigens entspricht, sind Gegenstand der Erfindung.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Antikörper für den Nachweis oder die Bekämpfung von CAV-Infektionen. Auch diagnostische Testkits für den Nachweis von CAV werden beschrieben.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf rekombinante DNA-Moleküle, die von CAV abgeleitet sind und die für wenigstens einen immunogenen Teil eines CAV-Proteins codieren, sowie auf Wirtszellen, die mit solchen rekombinanten DNA-Molekülen transfiziert sind. Impfstoffe auf der Basis dieser Wirtszellen werden durch diese Erfindung ermöglicht.
Auch sogenannte Lebendvirusimpfstoffe, bei denen ein Stück DNA, die für wenigstens einen immunogenen Teil eines CAV-Proteins codiert, in ein für den gewünschten Wirt infektiöses Virus gebracht wird, sind Gegenstand der Erfindung.
Verfahren zur Prophylaxe oder Bekämpfung von CAV-Infektionen, insbesondere bei Hühnern, und Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Teilen von CAV, die Sequenzen umfassen, und Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Daneben bezieht sich die Erfindung auf Verwendungen der Proteine des CAV zur Induktion von Apoptose (programmiertem Zelltod). Insbesondere können die Proteine (Polypeptide) für die Induktion von Apoptose in Tumorzellen verwendet werden.
Daneben können die Proteine gemäß der Erfindung auch für die Beseitigung anderer unerwünschter Zellpopulationen, wie autoimmunreaktiver T-Zellen bei Autoimmunkrankheiten, wie rheumatoider Arthritis, Lupus usw., verwendet werden.
Die Erfindung sorgt weiterhin für die Induktion von Zelltod mittels Gentherapie. Verfahren zur Herstellung dieser Therapeutika und Verfahren zur Behandlung mit denselben sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Das Hühneranämievirus (CAV) ist ein kürzlich charakterisiertes DNA-Virus (Noteborn und De Boer, 1990). Es gehört zu einer neuen Virusfamilie. Bei jungen Hühnern verursacht CAV eine Anämie durch Zerstörung von Erythroblastoid-Vorläuferzellen und Immunschwäche durch Abreicherung von Thymocyten. Läsionen kommen in der Milz und Leber vor (Jeurissen et al., 1989). Eine neuere Studie hat gezeigt, dass die Abreicherung von Thymocyten durch von CAV induzierte Apoptose verursacht wird (Jeurissen et al., 1992b).
Gelderblom et al. (1989) und Todd et al. (1990) haben mittels elektronenmikroskopischer Studien gezeigt, dass CAV-Partikel eine T3-Ikosaeder-Symmetrie und einen Durchmesser von 23–25 nm haben. Die CAV-Partikel konzentrieren sich nach Gleichgewichtssedimentation bei einer Dichte von 1,33–1,34 g/ml in CsCI.
Todd et al. (1990) haben gezeigt, dass isolierte Viruspartikel nur ein einziges Protein mit einem Molekulargewicht von 50 kDa enthalten. Die einzelsträngige DNA in den CAV-Partikeln liegt in Form eines zirkulären Minusstranges vor (Gelderblom et al.; Todd et al., 1990; Noteborn et al., 1991). Die replikative DNA-Zwischenstufe wurde kloniert und vollständig sequenziert. Das CAV-Genom ist 2319 Nucleotide lang. Auf der Basis der Genomstruktur und der DNA-Sequenz kann das Virus nicht in einer der bekannten Virusfamilien untergebracht werden (Noteborn et al., 1991; Todd et al., 1991). Das CAV-Genom enthält drei große, partiell oder vollständig überlappende Leseraster, die für mögliche Proteine mit Molekulargewichten von 51,6, 24,0 und 13,3 kDa codieren. Das CAV-Genom enthält überdies einen offensichtlichen Promotor/Enhancer-Bereich und nur ein Polyadenylierungssignal. Durch Transcription der replikativen DNA-Zwischenstufe entsteht ein polyadenyliertes polycistronisches RNA-Molekül von ungefähr 2100 Nucleotiden (Noteborn et al., 1992b).
Tagealte Küken sind am anfälligsten für CAV-Infektionen. Bei diesen Tieren werden ab 10 Tagen nach der Impfung mit CAV Lethargie, Anorexie und Anämie beobachtet. Nach der Infektion kann die Mortalität auf maximal 50% zunehmen. Mit zunehmendem Alter nimmt auch die Resistenz zu. Jeurissen et al. (1992) haben berichtet, dass nur der Hämatokritwert von Küken, die im Alter von 1–3 Tagen mit CAV infiziert wurden, abgenommen hat. CAV-Infektionen von 1–21 Tagen alten Küken führen zu einer Abreicherung insbesondere des Thymuscortex. Bei älteren Hühnern kann sich CAV jedoch subklinisch vermehren. Eine CAV-Infektion bei älteren Hühnern kann anhand des Auftretens einer Serumkonversion bestimmt werden (McIlroy et al., 1992).
Die Ausbreitung von CAV in einer Gruppe von Hühnern erfolgt im Wesentlichen über Kontaktinfektion. Am wahrscheinlichsten ist die Aufnahme von Kot oder anderem Material, das mit Kot von CAV-infizierten Tieren kontaminiert ist. Eine Infektion über die Luft kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Die Übertra gung von Viren an den Nachwuchs über das Ei wird von Yuasa et al. (1979) vorgeschlagen, aber in einem Experiment konnte die vertikale Übertragung von CAV von Muttertieren auf Küken von uns nicht nachgewiesen werden.
Eine Immunschwäche, die aus der CAV-induzierten Abreicherung des Thymuscortex resultiert, gilt als Ursache für Krankheitssymptome, die nach sekundären Infektionen durch normalerweise nichtpathogene Agentien auftreten (De Boer et al., 1992; Engström, 1988; Rosenberger und Cloud, 1989; von Bülow et al., 1986; Yuasa et al., 1980). So wird CAV aus Tieren mit Newcastle-Krankheit, Marek-Krankheit, infektiöser Bursitis (Gumboro) und bei Tieren mit der "Blauflügelkrankheit" in Verbindung mit Reoviren isoliert. CAV-Infektionen führen zu erhöhten Impfreaktionen, z. B. gegen das Virus der Newcastle-Krankheit.
Es hat sich gezeigt, dass mütterliche Antikörper einen bedeutenden Schutz vor CAV-Infektion ergeben. Eine neuere Studie unter Laborbedingungen hat gezeigt, dass tagealte Küken von immunen Müttern keine CAV-Infektion entwickeln. Tagealte Küken können auch passiv durch intravenöse Injektion von Antikörpern aus Eidottern von immunen Muttertieren geschützt werden (De Boer et al., Daten nicht veröffentlicht).
CAV kann in Gewebekultur vermehrt werden. Die dann erhaltenen Titer sind im Allgemeinen gering. Zur Zeit werden dafür MDCC-MSB1-Zellen (Yuasa, 1983; Yuasa et al., 1983) verwendet, bei denen CAV 48–72 Stunden nach der Infektion eine cytopathogene Wirkung induziert. MDCC-MSB1-Zellen werden auch verwendet, um neutralisierende Antikörper und gegen CAV gerichtete Antikörper mittels Immunofluoreszenz zu bestimmen (von Bülow et al., 1985; Chettle et al., 1991). Bisher hat es sich nicht als möglich erwiesen, die Virulenz von CAV durch serielle Passage in MDCC-MSB1-Zellen abzuschwächen.
Ältere Tiere entwickeln nach CAV-Infektion keine Krankheitssymptome, und Küken mit mütterlichen Antikörpern sind geschützt. Diese Daten wurden in Deutschland bei einem Impfprogramm verwendet, das auf der kontrollierten Einwirkung von CAV auf 14–16 Wochen alte Muttertiere beruhte. In den Nieder landen ist dieses Impfverfahren wegen der damit verbundenen Risiken nur auf experimenteller Ebene erlaubt. Wie oben erwähnt, ist es ohne weiteres möglich, dass CAV über das befruchtete Ei auf den Nachwuchs übertragen werden kann. McNulty et al. (1991) haben vor kurzem gezeigt, dass CAV-seropositive Gruppen von Tieren geringere Produktionszahlen haben als CAV-seronegative Gruppen. Außerdem hat Adair (persönliche Mitteilung) bei Hühnern mit einer subklinischen CAV-Infektion eine Immunschwäche gezeigt. Wegen der möglichen vertikalen Virusausbreitung und der durch CAV verursachten Immunschwäche bei (sub)klinischen Infektionen ist ein Bekämpfungsprogramm auf der Basis eines unschädlichen Impfstoffs sehr wünschenswert.
Im Allgemeinen sind inaktivierte Impfstoffe und Untereinheit-Impfstoffe die unbedenklichsten Impfstoffe. Die Tatsache, dass sich CAV unter Gewebekulturbedingungen nur bis auf geringe Titer vermehrt, macht die Herstellung eines inaktivierten Impfstoffs relativ teuer und aufwändig. Für die Herstellung eines Untereinheit-Impfstoffs gegen CAV-Infektionen sind solche CAV-Proteine notwendig, die bei geimpften Hühnern eine schützende Immunantwort induzieren. Bisher wurde in gereinigten CAV-Partikeln nur ein einziges Protein (genannt VP1) gefunden.
Überraschenderweise hat sich jetzt gezeigt, dass dieses Protein allein, wie in den Beispielen näher gezeigt wird, nicht in der Lage ist, eine Immunantwort zu ergeben, die vor CAV-Infektionen schützt. Es hat sich gezeigt, dass, obwohl VP1 das einzige in dem Viruspartikel vorhandene Protein zu sein scheint, das VP2-Protein, das jetzt von uns zum ersten Mal exprimiert wurde, für die Bildung von virusneutralisierenden Antikörpern wesentlich ist. Daher ist es erst jetzt möglich, einen effektiven Impfstoff auf der Basis von Teilen des Virus zu entwickeln.
Wir haben die drei im CAV-Genom vorhandenen offenen Leseraster in Baculovirus-Vektoren kloniert. Die drei CAV-Proteine VP1, VP2 und VP3 wurden in Sf9-Zellen jeweils allein, in Kombination mit einem der anderen CAV-Proteine oder alle drei gleichzeitig mittels (Co)Infektion mit rekombinanten CAV-Baculoviren exprimiert. Muttertieren wurden Rohzelllysate injiziert, die ein oder mehrere CAV-Proteine enthielten. Erst nach der Immunisierung von Hühnern mit Antigenpräparaten, die proportionale Mengen aller drei CAV-Proteine enthielten oder die im Wesentlichen VP1 und VP2 und auch etwas VP3 enthielten, entwickelten sich neutralisierende Antikörper. Eier von solchen Tieren enthielten mütterliche Antikörper gegen CAV. Infektionstests mit dem Nachwuchs von geimpften Muttertieren zeigten, dass wenigstens die CAV-Proteine VP1 und VP2 für die Induktion einer schützenden Immunantwort notwendig sind. Der Nachwuchs von Muttertieren, denen alle drei CAV-Proteine injiziert wurden, war noch besser vor Injektionen mit CAV geschützt. Eine Injektion von Hühnern mit allen drei CAV-Proteinen, die jeweils einzeln in Sf9-Zellen produziert wurden, induzierte wenige neutralisierende Antikörper gegen CAV. Dies impliziert, dass für eine optimale Induktion von neutralisierenden Antikörpern gegen CAV 2 oder 3 CAV-Proteine zusammen in einer (Insekten)Zelle synthetisiert werden müssen.
Es ist möglich, dass Fragmente von 2 oder 3 CAV-Proteinen bereits ausreichen, um eine schützende Immunantwort gegen CAV-Infektionen zu bewirken.
Die rekombinanten CAV-Produkte, VP1 + VP2 oder VP1 + VP2 + VP3, die für die Impfung von Legehennen verwendet werden, können mit Hilfe des Baculovirus-Systems synthetisiert werden. Die CAV-Proteine können auch mit Hilfe anderer Systeme, wie Bakterien- oder Hefezellen, über (retro)virale Infektion oder Genamplifikation (CHO-dhfr-System) synthetisiert werden.
Die Tatsache, dass 2 oder 3 Proteine, die im offenen Leseraster des CAV-Genoms codiert sind, bei Hühnern eine schützende Immunantwort induzieren können, lässt sich auch auf die Entwicklung von lebenden Virusvektoren anwenden. Die codierenden Sequenzen für VP1 + VP2 oder VP1 + VP2 + VP3 werden dann in lebende Virusvektoren einkloniert.
Es ist auch möglich, dass eines der CAV-Proteine VP1, VP2 oder VP3 getrennt, aber dann im Kontext eines lebenden Virusvektors, ebenfalls für die Induktion einer schützenden Immunantwort gegen CAV-Infektionen geeignet ist.
Die Expression von Fragmenten eines oder mehrerer der oben genannten CAV-Proteine durch lebende Virusvektoren kann für die Induktion einer schützenden Immunantwort ausreichend sein.
Bei Geflügel können nur lebende Virusvektoren, die selbst eine gute Replikation im Vogelsystem zeigen, verwendet werden. Für die Verwendung viraler Vektoren bei Hühnern kommen unter anderem folgende in Frage: Hühnerpockenvirus, retrovirale Vektoren, Herpesvirusvektoren (Marek-Virus und Truthahn-Herpes-Virus), Adenoviren und Laryngotrachitis-Virus. Es hat sich gezeigt, dass die von CAV induzierte Induktion des Zelltods im Wesentlichen VP3 und teilweise VP2 zugeschrieben werden kann.
Durch Deletion der 11 C-terminalen Aminosäuren von VP3 wird die Induktion der Apoptose durch VP3 stark reduziert. Folglich kann die pathogene Wirkung von CAV durch Einführung eines Stopcodons in den C-terminalen Bereich von VP3 drastisch reduziert werden. Das zusätzliche Stopcodon im codierenden Bereich für VP3 wird in den CAV-Klon pCAV/EcoRI (Noteborn und De Boer) eingeführt, der das vollständige CAV-Genom enthält. Das vollständige mutante CAV-Genom wird aus dem Vektor ausgeschnitten und wieder zirkularisiert. MDCC-MSB1-Zellen werden mit der zirkularisierten mutanten CAV-DNA transfiziert, und der Virusnachwuchs, der weniger pathogen ist, wird geerntet. Hühner werden mit den abgeschwächten mutanten CAV-Viren geimpft. Da das VP2-Protein auch eine Wirkung auf die Induktion der Apoptose hat, ist es möglich, auch abgeschwächtes CAV herzustellen, das eine Mutation im codierenden Bereich für VP2 oder VP2 und VP3 enthält.
Die oben genannte Einführung eines Stopcodons in den codierenden Bereich für VP2 und/oder VP3 kann auch bei der Herstellung von rekombinanten lebenden CAV-Virusvektoren verwendet werden.
Mit CAV infizierte Tiere entwickeln in einem späteren Alter keine klinischen Symptome mehr. Und dennoch scheint es, dass solche Infektionen zu großen ökonomischen Verlusten für die Geflügelindustrie führen können. Die Immunisie rung von Tieren mit den oben beschriebenen rekombinanten CAV-Produkten führt zu einem aktiven Schutz vor den oben genannten subklinischen Symptomen.
Die drei CAV-Proteine, die getrennt oder in Kombination mit einem der beiden anderen CAV-Proteine in dem Baculovirus-System exprimiert wurden, können verwendet werden, um gegen CAV gerichtete Antikörper zu erkennen. So können mit CAV infizierte oder geimpfte Hühner ausfindig gemacht werden. Ein oder mehrere CAV-Proteine können in Immunoassays, wie ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), Immunoperoxidase-Färbung und Immunofluoreszenzassay, verwendet werden. Um neutralisierende Antikörper zu messen, sind zwei oder mehr CAV-Proteine erforderlich.
Eine Immunisierung von Mäusen mit den 3 rekombinanten CAV-Produkten, die in Insektenzellen mit rekombinanten CAV-Bakuloviren synthetisiert wurden, ergab schließlich monoklonale Antikörper, die für VP2 und VP3 spezifisch waren. Diese monoklonalen Antikörper reagierten mit spezifischen Strukturen in CAV-infizierten Zellen und nicht mit uninfizierten Zellen.
Mit Hilfe der Antikörper, die mit rekombinanten CAV-Proteinen erzeugt wurden, können CAV-Proteine in Organpräparaten von CAV-infizierten Hühnern erkannt werden. Auf der Basis dieser Daten können zuverlässige diagnostische Tests entwickelt werden. Die monoklonalen und polyklonalen Antikörper gemäß der Erfindung können auch in anderen diagnostischen Assays, wie ELISA, RIA, SPIA, Immunofluoreszenzassays und Immunoperoxidase-Färbung, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren CAV-Proteinen oder Fragmenten davon, verwendet werden.
Im Prinzip sind alle bekannten Ausführungsformen von immunologischen diagnostischen Tests mit allen bekannten Markern möglich, und je nach dem durchzuführenden Test und den Bedingungen, unter denen er durchgeführt werden muss, wird der Fachmann in der Lage sein, die am besten geeignete Ausführungsform auszuwählen. Daneben sind Antikörper und/oder andere Protei ne/Polypeptide für den Zweck dieser Erfindung auch Derivate und/oder Fragmente, soweit sie die gewünschte Aktivität besitzen. Im Falle von Antikörpern bedeutet dies, dass sie wenigstens in der Lage sein müssen, das Antigen zu erkennen.
Die Antikörper gemäß der Erfindung können auch für die passive Immunisierung von Geflügel verwendet werden. Gegen die Antikörper gemäß der Erfindung können Antikörper erzeugt werden, die ein sogenanntes "internes Abbild" des Antigens sind und somit wiederum als solche verwendet werden können, insbesondere bei passiven Immunisierungen und Diagnosen.
CAV induziert Apoptose in infizierten Thymocyten. Es ist möglich, dass eine CAV-Infektion von (humanen) Tumoren ebenfalls zum Zelltod der Tumorzellen führt.
In vitro ist das CAV-Protein VP3 selbst in der Lage, Apoptose in mononuklearen Hühner-Tumorzellen und in verschiedenen humanen Tumorzellen zu induzieren.
Daher kann die Expression des CAV-Proteins für die Induktion des Zelltods bei (humanen) Tumoren verwendet werden. Das VP3-Protein kann mittels einer DNA-Transfektion in Tumoren (vorübergehend) exprimiert werden. Die Expression von VP3 in (Tumor)Zellen kann auch stattfinden, indem man die Zellen mit (retro)viralen Vektoren infiziert, die eine codierende Sequenz für VP3 enthalten. Die Verabreichung nichtviraler Komponenten (z. B. Liposomen oder von Transferrin abgeleitete Vektoren), die VP3-Proteine und/oder codierende Sequenzen für VP3 enthalten, an Zellen ist eine weitere Möglichkeit für die Expression/Anwesenheit von VP3 in (Tumor)Zellen.
Die oben genannten Verwendungen können auch zur möglichen Induktion des Zelltodes durch Expression von VP2 oder VP2 zusammen mit VP3 in (Tumor)-Zellen dienen.
Die CAV-Proteine VP2 und/oder VP3 können bei Behandlungen zur Reduktion der Bildung von (humanen) Tumoren verwendet werden. Dies kann zum Beispiel dadurch erfolgen, dass man die Proteine gemäß der Erfindung direkt in einen festen Tumor injiziert oder die Proteine mit einem Liganden koppelt, der eine Affinität zu einem tumorassoziierten Antiliganden hat. Diese Kopplung kann sowohl chemisch als auch (wenn der Ligand ebenfalls ein Protein ist) über die Herstellung eines rekombinanten Fusionsproteins erfolgen.
Die chemische Kopplung kann direkt oder über eine Spacergruppe durchgeführt werden. Gegebenenfalls kann ein inertes Trägermolekül ausgewählt werden, wie ein indifferentes Serumprotein, an das sowohl der Ligand als auch das virale Protein gebunden sind, entweder über eine Spacergruppe oder auch nicht.
Beispiele für häufig vorgeschlagene Kombinationen von Ligand-Antiligand-Wechselwirkungen sind Ligand-Rezeptor-Paare, wie EGF/Rezeptor, IL-2/Rezeptor, /T-Zellrezeptor, Antikörper/Tumor-Antigen usw.
Vorzuziehen ist eine Ligand-Antiligand-Kombination, die von der Zelle internalisiert werden kann. Wenn ein Konjugat ausgewählt wird, kann es vorteilhaft sein, eine intrinsisch instabile Gruppe als Kopplung zwischen dem Virusprotein und dem Liganden anzuwenden, so dass das virale Protein in der Zelle in die native Form zurückkehrt. Nicht in allen Fällen wird es notwendig sein, eine internalisierende Kombination auszuwählen. Tumorzellen sind metabolisch aktiv und nehmen Substanzen, d. h. auch die Proteine gemäß der Erfindung, über Phagocytose und/oder Pinocytose aktiv oder passiv auf.
Der Ligand, an den die Proteine gemäß der Erfindung in beliebiger Weise gekoppelt werden können, braucht kein vollständiger Ligand zu sein. Im Allgemeinen wird es ausreichen, den Antiligand-bindenden Teil zu verwenden. Auch Derivate der in Frage stehenden Liganden sind geeignet, solange sie die Antiligand-bindende Wirkung besitzen. Wenn der Ligand ein Antikörper ist, ist die Tatsache zu berücksichtigen, dass Antikörper anderen Ursprungs als der Typ, an den sie verabreicht werden, in den meisten Fällen zu einer Immunreaktion führen. Außerdem gilt dies auch für mehrere andere Proteinliganden.
Inzwischen ist ausreichend bekannt, dass Antikörper in einer solchen Weise manipuliert werden können, dass sie keine Immunantwort erzeugen, aber dennoch das gewünschte Antigen erkennen.
Im folgenden wird kurz erklärt, wie tierische Antikörper für die menschliche Verwendung geeignet gemacht (humanisiert) werden können, aber es sollte klar sein, dass auch Anpassungen eines anderen Typs möglich sind.
Erstens ist es möglich, den konstanten Teil von dem zu humanisierenden Antikörper chemisch zu entfernen, so dass FAB-, FAB'2- oder noch kleinere Fragmente hergestellt werden (Winter et al., 1990). Im Allgemeinen werden diese Fragmente wenigstens weniger immunogen sein. Solche Fragmente können auch mittels DNA-Rekombinationstechnik hergestellt werden.
Daneben ist es auch möglich, die konstanten Teile von tierischen Antikörpern mittels DNA-Rekombinationstechnik durch ihre menschlichen Gegenstücke zu ersetzen (Cabilly et al., 198; Boss et al., 1984).
Außerdem ist es weiterhin möglich, die antigenbindenden Domänen tierischer Antikörper in Antikörper menschlichen Ursprungs einzuimpfen (Winter et al., 1987).
Bekannte Tumorantigene, gegen die Antikörper erzeugt wurden, sind z. B. CEA (carcino embryonic antigen) und dergleichen.
Die Erfindung wird im Einzelnen anhand des folgenden experimentellen Teils erläutert. Dies dient nur zur Veranschaulichung und sollte nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung interpretiert werden.
Experimenteller Teil
Baculovirus, Insektenzellen und Hühner-T-Zellen
Das rekombinante Baculovirus pAcRP23-lacZ (Bishop, 1992) wurde von Dr. R. Possee, NERC Institute of Virology, Oxford, England, erhalten, und die genomische DNA wurde so gereinigt, wie es von Summers und Smith (1987) beschrieben wurde. Zellen von Spodoptera frugiperda (Sf9) wurden von der American Tissue Culture Collection (Nr. CRL 1711) erhalten. Baculovirus-Vorratskulturen wurden in konfluenten Monoschichten und Suspensionskulturen in TC-100-Medium (Gibco/BRL), das 10% fetales Kälberserum enthält, gezüchtet, wie es von Summers und Smith (1987) beschrieben wurde.
Die T-Zelllinie MDCC-MSB1, die mit dem Virus der Marek-Krankheit transformiert war (Yuasa, 1983; Yuasa et al, 1983) wurde in RPMI-1680-Medium (Gibco/BRL) gezüchtet, das 10% fetales Kälberserum enthielt; die Zellen wurden für DNA-Transfektionsexperimente verwendet.
Beispiel I
1.1 Klonierung von CAV-DNA
Alle CAV-DNA-Sequenzen sind ursprünglich von der Plasmid-DNA pIc-20H/CAV-EcoRI abgeleitet (Noteborn und De Boer, 1990). Alle Klonierungsschritte mit Plasmid-DNA wurden im Prinzip nach den Verfahren durchgeführt, die von Maniatis et al. beschrieben wurden (1982).
Die codierenden Sequenzen der drei CAV-Proteine VP1, VP2 und VP3 wurden getrennt in den Baculovirus-Transfervektor pAcYM1 (Matsuura et al., 1987) einkloniert, der von Dr. D.H.L. Bishop, NERC Institute of Virology, Oxford, England, erhalten wurde. Die codierende Sequenz für das CAV-Protein VP3 und eine davon abgeleitete Mutante wurden in den Expressionsvektor pRSV-H20 (Offringa et al.) einkloniert.
DNA-Transformationen wurden im E.-coli-Stamm HB101 durchgeführt. Alle Plasmide wurden in großen Kulturen unter Rühren vermehrt, auf CsCI-Gradienten gereinigt und dann durch Filtration auf Sephacryl-S-500-Säulen gereinigt.
1.2 DNA-Transfektion
DNA des rekombinanten Baculovirus AcRP23-lacZ wurde nach einem von Summers und Smith (1987) beschriebenen Verfahren von extrazellulären Baculoviren isoliert. Das lacZ-Gen enthält eine einzige Schnittstelle für das Restriktionsenzym Bsu361. Das AcRP23-lacZ wurde durch Spaltung mit Bsu361 linearisiert. Sf9-Zellen wurden nach dem Verfahren von Smith et al. (1983) mit Calciumphosphatniederschlägen von linearisierter Baculovirus-AcRP23-lacZ-DNA und rekombinanter Transfer-Vektor-DNA transfiziert; dies ist eine Modifikation der Transfektionsvorschrift von Graham und Van der Eb (1973) für Sf9-Zellen.
Für die Transfektion der verschiedenen Human- und Hühnerzelllinien wurden 10 Mikrogramm pRSV-VP3-, pCMV-VP3-, pRSV-tr- oder pRSV-tr-DNA in 25 μl Milli-Q-Wasser resuspendiert und mit 260 Mikroliter TBS-Puffer gemischt. 15 Mikroliter DEAE-Dextran von 10 mg/ml wurden zu dem DNA-Gemisch gegeben, das 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde.
Die Zellen wurden in einer Tischzentrifuge bei 1500 U/min zentrifugiert. Das Medium wurde durch 5 ml TBS-Puffer ersetzt, und die Zellen wurden vorsichtig resuspendiert. Die Zellen wurden sedimentiert, und der TBS-Puffer wurde entfernt. Das Zellsediment wurde vorsichtig in 300 Mikroliter DEAE-Dextran/ DNA-Mischung resuspendiert und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurden 0,5 ml 25%iges DMSO/TBS hinzugefügt, und die Suspension wurde 3 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurden 5 ml TBS hinzugefügt, und die Zellen wurden in einer Tischzentrifuge bei 1500 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und 5 ml Gewebemedium wurden hinzugefügt. Die Zellen wurden resuspendiert, zentrifugiert, in 5 ml Gewebekulturmedium aufgenommen und bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert.
1.3 Auswahl von rekombinantem CAV-Baculovirus
Die Überstände, die extrazelluläre Baculoviren enthalten, wurden in einem Plaqueassay mit Neutralrot (Brown und Faulkner, 1977) und X-gal (Brown et al., 1991) analysiert. Mit den lacZ-negativen Plaques wurde eine Monoschicht von Sf9-Zellen in Mikrotiterplatten geimpft. Fünf Tage nach der Infektion wurden die Überstände geerntet und bei 4°C gelagert. Die Zelllysate wurden in einem Dot-Slot-Hybridisierungsassay mit ³²P-markierter pIc-20H/CAV-EcoRI-DNA als Sonde analysiert.
Monoschichten von Sf9-Zellen wurden mit Überständen von Zelllysaten geimpft, die stark mit der markierten CAV-DNA-Sonde hybridisierten. Zwei Tage nach der Infektion wurden die Zellen mit ³H-Leucin markiert. Die Proteine wurden auf 14%igen Polyacrylamid-(PAA)-SDS-Gelen (Laemmli, 1970) getrennt, mittels eines fluorographischen Verfahrens sichtbar gemacht und auf die Anwesenheit von spezifischem rekombinantem CAV-Protein und die Abwesenheit des β- Galactosidase-Proteins getestet.
1.4 Synthese von rohen CAV-Protein-Präparaten
Rekombinante CAV-Baculoviren, die das erwartete CAV-Protein in infizierten Sf9-Zellen exprimierten, wurden nach dem von Summers und Smith (1983) beschriebenen Verfahren präpariert. Monoschichten von Sf9-Zellen wurden mit einer Art von rekombinantem CAV-Baculovirus mit einem MOI (multiplicity of infection) von ungefähr 5 plaquebildenden Einheiten (pfu) pro Zelle infiziert. Coinfektionen von 2 oder 3 verschiedenen rekombinanten CAV-Baculoviren wurden mit Sf9-Monoschichten mit einem MOI von 10 pfu von jedem rekombinanten CAV-Baculovirus pro Zelle durchgeführt. Drei Tage nach der Infektion wurden die infizierten Sf9-Zellen geerntet. Die rohen Zelllysate wurden in PBS-Puffer suspendiert.
Beisipel II
2.1. Immunisierung von Hühnern mit CAV-spezifischen Proteinen
Gruppen von 6 Wochen alten Hühnern wurden intraperitoneal und subkutan in vollständigem Freund-Adjuvans emulgierte rohe Lysate von 10⁶ oder 10⁸ Sf9-Zellen, die mit einem oder mehreren rekombinanten CAV-Baculoviren infiziert waren, injiziert. Als Kontrolle wurde einer Gruppe von 8 Tieren in einem Immunisierungsexperiment in vollständigem Freund-Adjuvans emulgierter PBS-Puffer injiziert. An verschiedenen Tagen nach der Immunisierung wurde Blut abgenommen, und das Serum wurde auf gegen CAV gerichtete neutralisierende Antikörper analysiert.
2.2 Immunisierung von Muttertieren gegen CAV
Vier Gruppen von jeweils 16 Hennen wurden rohe Lysate von 2 × 10⁷ Sf9-Zellen injiziert, die gleichzeitig mit den rekombinanten Baculoviren VP1, VP2 und VP3 oder mit den rekombinanten Baculoviren VP1 und VP2 oder mit VP1 und VP3 oder mit VP2 und VP3 infiziert waren. Die Zelllysate wurden in einem gleichen Volumen von vollständigem Freund-Adjuvans emulgiert. Als Kontrolle wurde einer Gruppe von 16 Hennen PBS-Puffer in vollständigem Freund-Adjuvans injiziert. Dottermaterial von Eiern von Hennen, denen diese Lysate oder PBS-Puffer injiziert worden waren, wurden mit Chloroform extrahiert und auf die Anwesenheit neutralisierender Antikörper analysiert.
Beispiel III
3.1 Herstellung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch gegen CAV-Proteine gerichtet sind
Der monoklonale Antikörper CVI-CAAV-85.1 wurde erhalten, indem man Mäusen intraperitoneal CAV-infizierte MDCC-MSB1-Zellen mit unvollständigem Freund-Adjuvans injizierte. Schließlich wurden Milzzellen der immunisierten Mäuse mit P3X63-Ag8.653-Myelomzellen fusioniert (Noteborn et al., 1991).
Die anderen monoklonalen Antikörper, die gegen CAV-Antigene gerichtet sind, wurden erhalten, indem man rohe Extrakte von Sf9-Zellen, die mit den drei rekombinanten CAV-Baculoviren infiziert waren, in die Milz von 4 Balb/c-Mäusen injizierte. Die Seren der immunisierten Mäuse wurden 7 Wochen nach der Immunisierung auf neutralisierende Antikörper gegen CAV getestet. Die Milzzellen der immunisierten Mäuse wurden mit P3X63-Ag8.653-Myelomzellen fusioniert. Gegen CAV-Antigene gerichtete Antikörper wurden auf verschiedene Weise getestet: mit einem Serumneutralisierungstest; ELISAs auf der Basis von gereinigtem CAV und von rohen Lysaten von Sf9-Zellen, die mit rekombinantem CAV-Baculovirus infiziert waren; Immunofluoreszenztests an CAV-infizierten MDCC-MSB1- oder Sf9-Zellen, die mit rekombinantem CAV-Baculovirus infiziert waren; Western-Blots von rohen Lysaten von Sf9-Zellen, die mit rekombinantem CAV-Baculovirus infiziert waren; und Immunoperoxidase-Färbung an Thymusschnitten von CAV-infizierten Hühnern.
Beispiel IV
4.1. In-vitro-Neutralisierungstest
Die Seren von Hühnern und Mäusen, denen rohe Sf9-Zelllysate oder PBS-Puffer injiziert worden waren, wurden 1 : 2 oder 1 : 4 verdünnt, und dann wurde eine Verdünnungsreihe mit zweifachen Verdünnungen hergestellt. Die verdünnten Seren wurden 1 Stunde lang mit 10⁴–10⁵ TCID50-CAV-Cux-1 (von Bülow et al., 1983; von Bülow, 1985) inkubiert. Ungefähr hunderttausend Zellen der T-Zelllinie MDCC-MSB1, die mit dem Virus der Marek-Krankheit transformiert waren, wurden mit diesem Gemisch von verdünnten Seren und Virus infiziert. Als Kontrollen wurden MDCC-MSB1-Zellen mit CAV infiziert, das mit einem positiven CAV-Antiserum und einem negativen Serum, das aus speziellen pathogenfreien Hühnern stammte, neutralisiert worden war.
4.2 CAV-Reizexperimente
Befruchtete Eier der fünf Gruppen von immunisierten Hennen wurden ausgebrütet. Am Tag 1 wurde den Küken intramuskulär 10^5,5 TCID₅₀ CAV-Cux-1 injiziert. Am Tag 6 und am Tag 14 nach der Infektion wurden 5 Hühner pro Gruppe einer Sektion unterzogen. Der Thymus wurde makroskopisch und immunhistologisch analysiert. Außerdem wurde Heparinblut entnommen, und die Blutzellen wurden in einem Virus-Reisolationsassay getestet. Vierzehn Tage nach der Infektion wurde allen Tieren Heparinblut entnommen, um den Hämatokritwert zu bestimmen.
Beispiel
5.1 Immunohistologie und Immunofluoreszenz
Gefrorene Schnitte von Thymus und Knochenmark wurden hergestellt und für Immunoperoxidase-Färbung mit CAV-spezifischen monoklonalen Antikörpern verwendet, wie es von Jeurissen et al. (1988) beschrieben ist. Zellen wurden mit 80%igem Aceton fixiert und für Immunofluoreszenztests mit CAV-spezifischen monoklonalen Antikörpern und Fluoresceinisothiocyanat-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgC verwendet (Noteborn et al., 1990).
5.2 Nachweis von CAV in Blutproben
Blutproben von CAV-infizierten Küken wurden dreimal mit PBS gewaschen und in 1 ml aufgenommen. Zwanzig Mikroliter der erhaltenen Zellsuspension wurden zu 10⁵ MDCC-MSB1-Zellen gegeben. Die MDCC-MSB1-Zellen wurden alle 4–5 Tage zehnfach verdünnt und in frisches Kulturmedium übergeführt, bis eine CAV-spezifische cytopathogene Wirkung sichtbar wurde. Wenn nach 10 Passagen noch keine cytopathogene Wirkung beobachtet werden konnte, wurde die Virusisolation als negativ angesehen. Die Zahl der Passagevorgänge ist ein Maß für die Menge an infektiösem CAV, das im Blut der infizierten Küken vorhanden ist.
Ergebnisse und Diskussion
Konstruktion von rekombinanten CAV-Transfervektoren
Das CAV-Genom enthält drei große offene Leseraster, die einander teilweise oder vollständig überlappen. Durch Verwendung von Startcodons in verschiedenen Leserastern codiert das CAV-Genom für 3 unterschiedliche Proteine. Die codierenden Sequenzen für die CAV-Proteine wurden getrennt (VP1, 1; VP2, 2; und VP3, 3) in den Baculovirus-Transfervektor pAcYMl einkloniert. Da das VP3-Leseraster vollständig innerhalb des VP2-Leserasters liegt, wird VP3 im Falle der Expression von VP2 stets ebenfalls synthetisiert, wenn auch in deutlich geringerem Ausmaß. Dem Transfervektor pAcYM1 fehlen die codierenden Sequenzen für Polyhedrin, der Polyhedrin-Promotor enthält in sich eingeschlossen den A-Rest des Startcodons für das Polyhedrin-Gen und die 3'-nichtcodierenden Sequenzen einschließlich des Polyadenylierungssignals. Auf beiden Seiten der Polyhedrin-Sequenzen befinden sich flankierende virale Sequenzen. Der Transfervektor enthält prokaryontische Sequenzen für die Vermehrung in Bakterien (Matsuura et al., 1987).
Das Plasmid pEP-51.6 (Noteborn et al., 1992a) enthält CAV-DNA-Sequenzen der Positionen 791 bis 2319. Die CAV-DNA-Insertion enthält den vollständigen codierenden Bereich für das Protein VP1, das von 62 bp 5'- und 117 bp 3'-nichtcodierenden DNA-Sequenzen flankiert ist. Das Plasmid pEP-51.6 wurde partiell mit HindIII geschnitten, dann mit EcoRI vollständig geschnitten, und die "klebrigen Enden" wurden mit Hilfe von Klenow-Polymerase aufgefüllt. Ein 1,53 kb langes CAV-DNA-Fragment wurde isoliert. Das Plasmid pAcYM1 wurde mit BamHI linearisiert, die klebrigen Enden wurden mit Hilfe von Klenow-Polymerase aufgefüllt, und schließlich wurde mit Alkalischer Phosphatase (CIP) behandelt. Das 1,53 kb lange CAV-DNA-Fragment wurde mit der linearisierten pAcYM1-DNA ligiert. Die Orientierung von VP1 in pAcYM1-DNA wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestimmt, und das endgültige Konstrukt pAcVP1 ist in 4 gezeigt.
Das Plasmid pEP-24.0 (Noteborn et al., Daten nicht veröffentlicht) enthält das 1,15 kb lange BamHI-DNA-Fragment mit CAV-DNA-Sequenzen der Positionen 354 bis 1508 (Noteborn und De Boer, 1990). Dieses CAV-DNA-Fragment enthält den codierenden Bereich für VP2, der von 26 bp 5'- und 484 bp 3'-nichtcodierenden DNA-Sequenzen flankiert ist. 106 bp stromabwärts des Startcodons für VP2 befinden sich das Startcodon für VP3 in einem anderen Leseraster und die andere codierende Sequenz für VP3. Das Plasmid pEP-24.0 wurde mit BamHI behandelt; das 1,15 kb lange DNA-Fragment wurde isoliert und an das mit BamHI linearisierte und mit CIP behandelte, 9,3 kb lange pAcYM1-Plasmid ligiert. Das endgültige DNA-Konstrukt pAcVP2 wurde mit Restriktionsenzymen charakterisiert und ist in 4 gezeigt.
Das Plasmid pEP-13.3 (Noteborn et al., Daten nicht veröffentlicht) enthält das 0,46 kb lange BamHI-EcoRI-DNA-Fragment mit CAV-DNA-Sequenzen der Positionen 427 bis 868 (Noteborn und de Boer, 1990). Das CAV-DNA-Fragment enthält den codierenden Bereich für VP3, 58 bp 5'- und 25 bp 3'-nichtcodierende DNA-Sequenzen. Das Plasmid pEP-13.3 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI geschnitten, und ein 0,46 kb langes BamHI-EcoRI-Fragment wurde isoliert. Die DNA des Transfervektors pAcYM1 wurde mit BamHI linearisiert und mit CIP behandelt, und ein 9,3 kb langes Fragment wurde isoliert. Die beiden synthetischen DNA-Oligomere 5'-GATCCAACCCGGGTTG-3' und 5'-AATTCAACCCGGGTTG-3' wurden miteinander hybridisiert und bilden zusammen einen BamHI-EcoRI-DNA-Linker. Der DNA-Linker wurde mit dem 0,46 kb langen BamHI-EcoRI-Fragment und dem 9,3 kb langen BamHI-DNA-Fragment ligiert. Das endgültige Konstrukt pAc-VP3 wurde durch Abbau mit Restriktionsenzymen analysiert und ist in 4 gezeigt.
Konstruktion von rekombinantem CAV-Baculovirus
Jeder der drei rekombinanten CAV-Transfervektoren getrennt wurde zusammen mit der rekombinanten Baculovirus-AcRP23-lacZ-DNA in Sf9-Zellen transfiziert. Die Transfektion erfolgte mit "nackter" Baculovirus-DNA und Transfervektor-DNA. Dieses Baculovirus-Genom enthält anstatt des Polyhedrin-Gens das lacZ- Gen unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promotors. Nach einer homologen Rekombination wurden Baculoviren erhalten, in die anstelle des lacZ-Gens stets eines der drei CAV-Gene eingebaut war, die damit unter der Kontrolle des Promotors des Polyhedrin-Gens standen. Die Baculoviren, in die das CAV-Gen korrekt eingebaut ist, enthalten das lacZ-Gen nicht mehr. Im ersten Fall wurden die rekombinanten CAV-Viren in Plaques von Baculovirus-infizierten Insektenzellen auf die Abwesenheit von β-Galactosidase-Aktivität charakterisiert. Weiterhin wurde die Integration von CAV-DNA-Sequenzen in das Baculovirus-Genom in einem Hybridisierungsexperiment mit Hilfe einer CAV-spezifischen DNA-Sonde bestimmt.
Expression der CAV-Proteine in Sf9-Zellen
Die Expression der spezifischen CAV-Proteine in Sf9-Zellen, die mit rekombinantem CAV infiziert waren, wurde durch Proteinmarkierung mit 3H-Leucin und PAA-SDS-Gel-Elektrophorese analysiert.
Das CAV-Protein VP1 hat ein berechnetes Molekulargewicht von 51,6 kDa (Noteborn und De Boer, 1990). Lysate von mit rekombinantem VP1-Baculovirus infizierten Insektenzellen enthalten ein Protein von 52 kDa neben baculoviralen und zellulären Produkten. Das 52-kDa-Protein fehlte in Lysaten von Insektenzellen, die mit dem Baculovirus-AcRP23-lacZ infiziert waren, und in nichtinfizierten Zellen. Die in-vitro-Expression der codierenden Sequenz von VP1 führte zu einem Protein von 52 kDa (Noteborn und De Boer, 1992). Höchstwahrscheinlich ist das VP1 nicht glycosyliert, da VP1, das in einem Kaninchen-Reticulocyten-Lysat synthetisiert wird, und VP1, das in Insektenzellen synthetisiert wird, dasselbe Molekulargewicht haben.
Die Translation des Gens, das für VP2 codiert, aber auch alle codierenden Sequenzen für VP3 enthält, lieferte in einem in-vitro-System spezifische CAV-Proteine von 30 und 28 kDa und eine kleinere Menge eines 16-kDa-Proteinprodukts. Die Translation nur des offenen Leserasters, der für VP3 codiert, in einem in-vitro-System ergab jedoch nur ein Protein von 16 kDa. Die Expression von VP2 durch rekombinanten VP2-Baculovirus in infizierten Insektenzellen lieferte spezifische Produkte von ungefähr 28 kDa und 30 kDa. Mit einem rekombinanten lacZ-Baculovirus infizierte Sf9-Zellen enthalten diese CAV-spezifischen Proteine nicht. Das CAV-spezifische Produkt von 16 kDa konnte meistens nur in sehr kleinen Mengen nachgewiesen werden. Diese Daten zeigen, dass das rekombinante VP2-Baculovirus das Protein VP2 stark exprimiert und VP3 nur in kleinerem Ausmaß exprimiert. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass ein internes Startcodon in einem Gen, das auf dem Baculovirus-Genom liegt, nur sehr ineffizient genutzt wird.
Rekombinantes VP3-Baculovirus synthetisierte in infizierten Insektenzellen ein Hauptprodukt von 16 kDa und kleine Mengen von einigen Proteinen mit Molekulargewichten von ungefähr 21000 bzw. 12000 bis 14000. In einem Immunofluoreszenzassay reagierte der CAV-spezifische monoklonale Antikörper CVI-CAV-85.1 spezifisch mit Sf9-Zellen, die VP3 exprimierten. Dieser monoklonale Antikörper fällte aus Lysaten von radioaktiv markierten Sf9-Zellen, die mit rekombinantem VP3-Baculovirus infiziert waren, spezifisch nur ein Protein mit einem Molekulargewicht von 16000 aus. In einer Pepscan-Analyse (Geysen et al., 1984) wurde das Epitop des monoklonalen Antikörpers CVI-CAV-85.1 auf dem N-Terminus von VP3 lokalisiert. Die Pepscan-Analyse ist in 5 gezeigt.
Induktion von neutralisierenden Antikörpern in Hühnern, die mit rekombinanten CAV-Proteinen immunisiert wurden
Im Falle von Hühneranämie wurde bestimmt, dass neutralisierende Antikörper richtig mit einem Schutz korrelieren. Das CAV-Protein oder mehrere CAV-Proteine, die in Hühnern neutralisierende Antikörper induzieren, bilden also die Basis für einen Untereinheit-Impfstoff.
Im ersten Fall haben wir untersucht, welches CAV-Protein in der Lage ist, Antikörper gegen CAV zu induzieren, die bei Hühnern neutralisierend wirken. Gruppen von 8 Hühnern in einem Alter von ungefähr 6 Wochen wurden in vollständigem Freund-Adjuvans emulgierte Lysate von 10⁶ oder 10⁸ Sf9-Zellen, die mit rekombinantem CAV infiziert waren, injiziert. Als Kontrolle wurde einer Gruppe von 8 Hühnern in vollständigem Freund-Adjuvans emulgierter PBS-Puffer injiziert. Vor der Immunisierung und 2, 4 sowie 6 Wochen nach der Immunisierung wurden Blutproben entnommen. Keines der Kontrolltiere, denen PBS in vollständigem Freund-Adjuvans injiziert wurde, entwickelte neutralisierende Antikörper gegen CAV (Tabelle 1). Auch Hühner, denen Lysate von 10⁶ oder 10⁸ Insektenzellen, die mit rekombinanten VP2- oder rekombinanten VP3-Baculoviren infiziert worden waren, injiziert wurden, entwickelten keine neutralisierenden Antikörper gegen CAV. Von den Hühnern, denen Lysat von 10⁶ infizierten rekombinanten VP1-Baculovirus-Insektenzellen injiziert wurde, entwickelten drei Hühner und von den Hühnern, denen eine Dosis von 10⁸ infizierten Zellen injiziert wurde, entwickelten zwei Hühner geringe Titer, die zwischen 1 : 8 und 1 : 32 variierten.
Wir schließen daraus, dass die drei rekombinanten CAV-Proteine, wenn sie getrennt in die Hühner injiziert werden, keine oder nur sehr wenig neutralisierende Antikörper gegen CAV induzieren.
Anschließend haben wir untersucht, ob die Kombination der drei rekombinanten CAV-Proteine in der Lage ist, neutralisierende Antikörper in den Hühnern zu induzieren. Zu diesem Zweck wurden Sf9-Zellen gleichzeitig mit den drei rekombinanten CAV-Baculoviren infiziert. Rohe Lysate von 10⁶ oder 10⁸ der infizierten Zellen, die daher rekombinantes VP1 + VP2 + VP3 enthielten, wurden hergestellt. Gruppen von acht Hühnern in einem Alter von 6–8 Wochen wurden diese Lysate injiziert, die in vollständigem Freund-Adjuvans emulgiert waren. Als Kontrolle wurde einer Gruppe von 8 Tieren in vollständigem Freund-Adjuvans emulgierter PBS-Puffer injiziert. Fünf Wochen nach der Immunisierung wurde gefunden, dass die acht Hühner, die mit Lysat von 10⁶ infizierten Zellen immunisiert wurden, alle neutralisierende Titer zwischen 32 und 256 aufwiesen, während sieben der acht Tiere, die mit 10⁸ Zellen immunisiert wurden, Titer zwischen 16 und 512 aufwiesen (Tabelle 2a). Sieben Wochen nach der Immunisierung wurde gefunden, dass alle Tiere der beiden Gruppen einen neutralisierenden Titer gegen CAV entwickelt hatten. Bei der Gruppe der Hühner, denen PBS-Puffer injiziert wurde, wurde gefunden, dass sie keine nachweisbare neutralisierende Immunantwort gegen CAV entwickelt hatten.
Ist es für die Induktion von neutralisierenden Antikörpern gegen CAV wirklich notwendig, dass die drei CAV-Proteine gleichzeitig in Insektenzellen synthetisiert werden? Um diese Frage zu beantworten, wurden Sf9-Zellen getrennt mit rekombinanten VP1-, VP2- und VP3-Baculoviren infiziert. Dann wurden die rohen Zelllysate miteinander kombiniert, mit Freund-Adjuvans gemischt und in eine Gruppe von 8 Hühnern injiziert. Als Kontrollpräparate wurden ein rohes Lysat von Sf9-Zellen, die alle die 3 CAV-Proteine gleichzeitig synthetisierten, sowie PBS-Puffer verwendet. Beide Präparate wurden in vollständigem Freund-Adjuvans emulgiert und dann in getrennte Gruppen von jeweils 8 Hühnern injiziert.
Es wurde gefunden, dass Seren der Gruppe von Hühnern, denen rohe Lysate von Sf9-Zellen, bei denen die 3 CAV-Proteine getrennt synthetisiert wurden, injiziert wurden, keine oder nur sehr wenig neutralisierende Antikörper gegen CAV enthielten. Bei den Tieren der Kontrollgruppe, denen rohe Lysate von Sf9-Zellen injiziert wurden, welche die 3 CAV-Proteine zusammen synthetisierten, wurde jedoch wie erwartet gefunden, dass sie eine neutralisierende Immunantwort entwickelt hatten. Die Tiere, denen PBS-Puffer injiziert worden war, erwiesen sich als negativ (Tabelle 2b).
Neutralisierende Antikörper in Eiern von immunisierten Muttertieren
Die obigen Immunisierungsexperimente zeigten, dass 3 rekombinante CAV-Proteine, die zusammen in Sf9-Zellen exprimiert wurden, neutralisierende Antikörper gegen CAV induzierten. In einem nächsten Experiment wurde untersucht, ob Kombinationen von 2 CAV-Proteinen ebenfalls in der Lage sind, neutralisierende Antikörper zu induzieren. Hier wurden die Antikörper in den Dottern von Eiern von immunisierten Muttertieren gemessen.
Vier Gruppen von 16 Hühnern im Alter von 33 Wochen wurde ein rohes Lysat von Sf9-Zellen injiziert, das gleichzeitig mit verschiedenen Kombinationen von rekombinanten CAV-Baculoviren infiziert wurde. Die Präparate, die entweder VP1 + VP2 + VP3 oder VP1 + VP2 enthielten, induzierten in den meisten Tieren neutralisierende Antikörper, die in ihren Eiern eindeutig nachweisbar sind (Tabelle 3). Bei den Eiern von Hühnern, denen Präparate injiziert wurden, die entweder VP1 oder VP3 oder VP2 + VP3 enthielten, wurde gefunden, dass sie keinen eindeutigen Titer an neutralisierendem Antikörper in den Dottern aufwiesen. Bei den Dotter von Eiern von nur einem der untersuchten Hühner wurde gefunden, dass sie niedrige Titer an neutralisierenden Antikörpern enthielten. Bei den Eiern der Kontrollgruppe von 16 Hühnern, denen PBS-Puffer injiziert wurde, wurde gefunden, dass sie keine neutralisierenden Antikörper enthielten.
Die Daten aus den oben genannten Experimenten mit rekombinanten CAV-Proteinen zeigen, dass VP1 + VP2 zusammen für die Induktion neutralisierender Antikörper gegen CAV-Infektionen notwendig und hinreichend sind. Eine kleine Menge von VP3 in den Präparaten von VP1 + VP2 kann jedoch nicht ausgeschlossen werden.
Schutz vor CAV-Angriff beim Nachwuchs von immunisierten Hühnern
Mütterliche Antikörper schützen junge Küken vor klinischen Symptomen, die durch eine CAV-Infektion verursacht werden. Wir haben untersucht, welche Gruppen von Hühnern, die mit spezifischen rekombinanten CAV-Proteinen immunisiert wurden, Nachwuchs bekamen, der vor CAV-Angriffen geschützt war. Hier wurde Virus isoliert, und klinische Symptome, die für CAV charakteristisch sind, wurden beobachtet: Atrophie des Thymus, reduzierter Hämatokritwert und erhöhte Mortalität.
Gruppen von zwischen 23 und 35 Tage altem Nachwuchs wurden mit einer hohen Dosis von CAV gereizt. Sechs Tage nach der Infektion wurde bei 5 Tieren, die einer Sektion unterzogen wurden und die Muttertiere hatten, denen PBS-Puffer injiziert wurde, gefunden, dass sie alle einen makroskopisch sichtbar reduzierten Thymus hatten. Im Falle des Nachwuchses von Muttertieren, denen rekombinantes VP2 + VP3 injiziert wurde, hatten 4 der 5 Tiere einen kleinen Thymus. Bei den 5 Tieren des Nachwuchses, die einer Sektion unterzogen worden waren und von Muttertieren stammten, denen die 3 rekombinanten CAV-Proteine zusammen injiziert worden waren, wurde gefunden, dass sie alle einen normalen Thymus hatten. In der Gruppe des Nachwuchses von Muttertieren, die mit VP1 + VP2 behandelt worden waren, wurde nur bei 1 von den 5 untersuchten Tieren gefunden, dass sie einen reduzierten Thymus hatten (Tabelle 4). Vierzehn Tage nach der Infektion wurden wiederum 5 Tiere pro Gruppe einer Sektion unterzogen. Alle Tiere des Nachwuchses von Muttertieren, die mit rekombinantem VP2 + VP3 oder PBS-Puffer immunisiert worden waren, litten unter Thymusatrophie. Bei dem untersuchten Nachwuchs aus der Gruppe von Tieren, denen die 3 rekombinanten CAV-Proteine zusammen injiziert worden waren, wurde gefunden, dass sie alle einen normalen Thymus hatten. Nur bei einem der 5 untersuchten Küken von den Tieren, denen rekombinantes VP1 + VP2 injiziert worden war, wurde gefunden, dass es einen reduzierten Thymus hatte (Tabelle 4). Ein unabhängiges Experiment zeigte, dass der Nachwuchs von Muttertieren, denen rekombinantes VP1 und VP3 injiziert worden war, einen reduzierten Thymus hatte, wie es für den Nachwuchs von Muttertieren beschrieben ist, denen rekombinantes VP2 und VP3 injiziert wurde (Koch, Ergebnisse nicht veröffentlicht). Vierzehn Tage nach der Infektion wurde der Hämatokritwert bei allen CAV-infizierten Tieren des Nachwuchses bestimmt. Ein Hämatokrit von 27% wurde als Grenze für eine Anämie gewählt. Bei dem Nachwuchs der Muttertiere, denen PBS-Puffer injiziert worden war, wurde gefunden, dass alle Tiere einen stark reduzierten Hämatokritwert mit Werten, die zwischen 7 und 19% variieren, aufwiesen (Tabelle 5). Der Nachwuchs der Muttertiere, denen rekombinantes VP2 + VP3 injiziert worden war, hat im Durchschnitt einen leicht höheren Hämatokritwert. In diesen Gruppen hatte nur ein einziges Tier einen Hämatokritwert von mehr als 27. Ein unabhängiges Experiment zeigte, dass auch Nachwuchs von Muttertieren, denen rekombinantes VP1 und VP3 injiziert wurde, einen reduzierten Hämatokritwert hatte (Koch, Ergebnisse nicht veröffentlicht). Von den 35 untersuchten Tieren des Nachwuchses der Tiere, denen Präparate injiziert worden waren, die VP1, VP2 und VP3 enthielten, hatte nur ein einziges Tier einen abweichenden Hämatokritwert, während 2 von den 29 untersuchten Tieren in der Gruppe mit VP1 + VP2 einen Hämatokritwert von unter 27% hatten.
Bei Nachwuchs von Muttertieren, denen rekombinantes VP2 und VP3 injiziert worden war, wurde eine hohe Mortalität von 50,9% und bei denjenigen, denen PBS injiziert worden war, von 48,3% beobachtet. In der Gruppe des Nachwuchses von Muttertieren, denen rekombinantes VP1 + VP2 + VP3 injiziert worden war, beträgt die Mortalität 9%, und bei VP1 + VP2 beträgt sie 15,4%. Die meisten der Tiere starben jedoch innerhalb von 5 Tagen nach der Reizung. Der durch eine CAV-Infektion verursachte Tod erfolgt im Allgemeinen etwas später. Aus diesem Grund haben wir in Tabelle 6 zwischen Mortalität vor Tag 14 und nach Tag 14 nach der Reizung unterschieden. Die Mortalität vor Tag 14 ist oft aspezifisch, unter anderem als Ergebnis einer Infektion. Die Mortalität nach Tag 14 in der Gruppe von Tieren mit mütterlichen Antikörpern gegen VP1 + VP2 + VP3 beträgt 7%; gegen VP1 + VP2 beträgt sie 0%, gegen VP2 + VP3 beträgt sie 27,4% und in der Kontrollgruppe 20,7%. In der Gruppe von VP2 + VP3 starben 8 Tiere nach der Entnahme von Blutproben zur Bestimmung des Hämatokritwertes als Ergebnis des schlechten Zustands der Küken, der höchstwahrscheinlich durch die Anämie verursacht wurde. In der PBS-Gruppe starben 2 Tiere während der Blutentnahme. Alle diese Tiere hatten einen deutlich reduzierten Thymus.
Die Virämie bei dem CAV-infizierten Nachwuchs wurde untersucht, indem man eine Virusisolation an Blutzellen durchführte. Heparin-Blutproben von 5 Tieren pro Gruppe wurden an den Tagen 6 und 14 nach der Reizung entnommen. Bei dem Nachwuchs von Muttertieren, denen VP2 + VP3 oder PBS injiziert wurde und die praktisch keinen Schutz vor CAV-Infektionen aufwiesen, wurde gefunden, dass die Tiere 6 bzw. 14 Tage nach der Infektion relativ hohe Virustiter enthielten. Sechs Tage nach der Infektion wurde gefunden, dass der Nachwuchs von Tieren, denen VP1 + VP2 + VP3 oder VP1 + VP2 injiziert worden war, einen deutlich niedrigeren Virustiter enthielt als der oben genannte Nachwuchs. Vierzehn Tage nach der Infektion zeigte nur die Gruppe des Nachwuchses von Tieren, denen VP1 + VP2 + VP3 injiziert worden war, einen deutlich niedrigeren Virustiter als die anderen 3 Gruppen.
Die Ergebnisse der Induktion von neutralisierenden Antikörpern in Muttertieren zeigen, dass die rekombinanten CAV-Proteine VP1 und VP2 für die Induktion einer neutralisierenden Immunantwort sehr wichtig sind. Die Infektionsexperimente zeigen, dass das rekombinante CAV-Protein VP3 neben der Wirkung, die durch VP1 + VP2 erhalten wird, einen zusätzlichen Schutz ergibt.
Die Produktion und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern gegen CAV
Für die Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen CAV wurden Mäusen rohe Lysate von Sf9-Zellen injiziert, die mit rekombinanten VP1-, VP2- und VP3-Baculoviren coinfiziert worden waren. Insgesamt wurden 9 verschiedene Hybridomzelllinien erhalten, die monoklonale Antikörper gegen CAV-Antigene erzeugen.
Western-Blots mit CAV-Antigenen, die mit dem Baculovirus-Expressionssystem erzeugt wurden, zeigten, dass die monoklonalen Antikörper 111.1, 111.2, 111.4, 112.1, 112.2, 120.1 und 120.2 stark gegen VP2 gerichtet sind und dass die monoklonalen Antikörper 111.3 und 120.3 stark gegen VP3 gerichtet sind. Die monoklonalen Antikörper, die stark mit VP2 reagieren, zeigen alle eine schwache Kreuzreaktion mit VP3. Umgekehrt zeigen die gegen VP3 gerichteten monoklonalen Antikörper eine schwache Kreuzreaktion mit VP2.
Ein Serumneutralisationstest zeigte, dass keiner der erhaltenen monoklonalen Antikörper eine neutralisierende Aktivität gegen CAV hatte, obwohl die zur Herstellung der Hybridome verwendeten Seren der immunisierten Mäuse eine neutralisierende Aktivität gegen CAV hatten.
In einer Pepscan-Analyse (Geysen et al., 1984) wurde das Epitop des monoklonalen Antikörpers 111.2 in der Mitte von VP2 lokalisiert (6). Es wurde gefunden, dass der monoklonale Antikörper 111.3 gegen ein Epitop am N-terminalen Ende von VP3 (7) gerichtet war, nämlich neben dem VP3-Epitop, das von den monoklonalen Antikörpern CVI-CAV-85.1 erkannt wurde (5).
Immunofluoreszenz zeigte, dass gegen VP2 und VP3 gerichtete monoklonale Antikörper spezifische Strukturen in CAV-infizierten MDCC-MSB1-Zellen erkennen. Keiner der gegen CAV-Antigene gerichteten monoklonalen Antikörper reagierte mit nicht infizierten MDCC-MSB1-Zellen. Die VP2-spezifischen monoklonalen Antikörper erkennen in CAV-infizierten Zellen andere Strukturen als VP3-spezifische monoklonale Antikörper.
Expression von VP3 in Hühnerzellen induziert Apoptose
Jeurissen et al. haben gezeigt, dass CAV bei infizierten Thymocyten eine Apoptose verursacht. Wir haben untersucht, ob ein einziges der CAV-Proteine, insbesondere VP3, unabhängig eine Apoptose bei Hühner-T-Zellen induzieren kann.
Die codierenden Sequenzen für VP3 wurden in den Expressionsvektor pRSV-20H einkloniert. Das 0,46 kb lange BamHI-EcoRI-Fragment mit CAV-DNA-Sequenzen auf den Positionen 427-868 (Noteborn et al., 1991) wurde aus dem Plasmid pEP-13.3 isoliert. Das CAV-DNA-Fragment enthält die codierenden Sequenzen für VP3 und überdies 58 bp 5'- und 25 bp 3'-flankierende Sequenzen. Der Vektor pRSV-H20 wurde mit BglII linearisiert, mit CIP behandelt, und ein 4,3 kb langes Fragment wurde isoliert. Zwei synthetische DNA-Oligomere 5'-GATCCAACCCGGGTTG-3' und 5'-AATTCAACCCGGGTTG-3' wurden miteinander hybridisiert und bildeten zusammen einen doppelsträngigen BamHI-EcoRI-Linker. Der BamHI-EcoRI-DNA-Linker und das 0,46 kb lange BamHI-EcoRI-DNA-Fragment wurden an das 4,3 kb lange BglII-DNA-Fragment ligiert. Das endgültige Konstrukt pRSV-VP3 enthielt den codierenden Bereich für VP3 unter der Kontrolle des Rous-Sarkom-Virus-Promotors und wurde durch Restriktionsenzymanalyse kontrolliert (8a; Noteborn et al., 1993).
MDCC-MSB1-Zellen wurden nach dem DEAE-Dextran-Verfahren mit DNA von pRSV-VP3 transfiziert. Zweiundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen fixiert und durch Färbung mit monoklonalem CVI-CAV-85.1 auf VP3 analysiert. Die Zellen wurden auch mit Propidiumiodid angefärbt, das DNA von intakten Zellkernen sehr stark färbt, aber DNA von apoptotischen Zellkernen nur schwach färbt (Telford et al., 1992). Mehr als 90% der transfizierten Zellen enthielten eine feinkörnige Verteilung von VP3 im Zellkern, der mit Propidiumiodid angefärbt war. Zwei Tage nach der Infektion wurde gefunden, dass 40% der Zellen, die VP3 exprimierten, Zellkerne enthalten, die nur schwach mit Propidiumiodid angefärbt waren, und VP3 war in Form von Aggregaten vorhanden. Drei Tage und später nach der Infektion wurde gefunden, dass mehr als 90% der VP3-haltigen Zellen VP3-Aggregate und DNA, die von Propidiumiodid nur sehr schwach angefärbt wurde, enthalten (9). Drei Tage nach der Transfektion zeigte die DNA der VP3-transfizierten Zellen das oligonucleosomale Leitermuster, das für eine Apoptose charakteristisch ist.
Die bei transfizierten Zellen beobachtete VP3-Verteilung entspricht vollständig derjenigen bei CAV-infizierten MDCC-MSB1-Zellen. Schon früh nach der Infektion (nach 1–1,5 Tagen) ist VP3 feinkörnig im Zellkern verteilt: die zelluläre DNA ist in diesem Stadium noch intakt. Spät in der Infektion (nach ungefähr drei Tagen) bildet VP3 Aggregate im Zellkern (Koch, Datum nicht veröffentlicht). Die DNA der CAV-infizierten Zellen ist fragmentiert (Jeurissen et al., 1992).
Unsere Schlussfolgerung lautet, dass VP3 für sich allein in der Lage ist, die CAV- spezifische Apoptose bei MDCC-MSB1-Zellen zu induzieren. Die Expression von pRSV-VP3-DNA, die in der Monocytenzelllinie LSCC-HD11 für VP3 codiert, führte ebenfalls zur Apoptose in diesen Zellen.
Die Expression des VP2-Proteins in MDCC-MSB1-Zellen führt ebenfalls zu einer Beschädigung der zellulären DNA. Drei Tage nach der Infektion von MDCC-MSB1-Zellen mit DNA, die für VP2 codiert, sind in 20% und nach 5 Tagen bei ungefähr der Hälfte der transfizierten Zellen die Zellkerne nur schwach mit Propidiumiodid angefärbt. Daher scheint auch VP2, wenn auch in geringerem Ausmaß als VP3, bei der Induktion des CAV-spezifischen Zelltodes beteiligt zu sein.
Die Wirkung von verkürztem VP3 auf die Induktion der Agoptose bei MDCC-MSB1-Zellen
VP3 ist ein Protein mit einer Länge von 121 Aminosäuren, enthält zwei prolinreiche Stücke, einen hydrophoben Bereich und zwei stark positiv geladene Teile (8b). Die positiv geladenen Bereiche sind möglicherweise Kernlokalisierungssignale und/oder DNA-bindende Domänen (Noteborn et al., 1987; Ramakrishnan, 1993).
Wir haben untersucht, ob das basische C-terminate Ende von VP# an der apoptotischen Aktivität von VP3 beteiligt ist. Zu diesem Zweck wurde ein verkürztes VP3-Produkt durch Deletion von 11 Codons am C-Terminus der VP3-codierenden Sequenzen hergestellt. Das Plasmid pEP-VP3 wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII geschnitten, und die 0,38 kb lange BamHI-HindIII-DNA wurde isoliert. Zwei synthetische DNA-Oligomere, 5'-AGCTTGATTACCACTACTCCCTGAG-3' und 5'-TCGACTCAGGGAGTAGTGGTAATCA-3', wurden miteinander hybridisiert und bildeten somit zusammen den doppelsträngigen HindIII-SalI-DNA-Linker. Das Plasmid pRSV-N20 wurde mit BglII und SalI geschnitten, mit Alkalischer Phosphatase behandelt, und ein 4,3 kb langes DNA-Fragment wurde Isoliert. Der HindIII-SalI-DNA-Linker und das 0,38 kb lange BamHI-HindIII-Fragment wurden in das 4,3 kb lange BglII-SalI-Fragment einligiert. Das endgültige Konstrukt pRSV-tr, das die codierenden Sequenzen für das verkürzte VP3-Protein unter der Kontrolle des RSV-Promotors enthielt (8a), wurde mittels Restriktionsenzym- und Sequenzanalyse analysiert.
MDCC-MSB1-Zellen wurden vorübergehend mit pRSV-tr-DNA transfiziert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Transfektion mit monoklonalem CVI-CAV-85.1 und Propidiumiodid angefärbt. Immunofluoreszenz zeigte, dass 42 Stunden nach der Transfektion die meisten der Zellen, die verkürztes VP3 exprimierten, feinkörniges VP3 in ihren Zellkernen enthielten. Die zelluläre DNA wurde mit Propidiumiodid stark angefärbt. Drei Tage nach der Transfektion wiesen noch 80% der Zellen, die verkürztes VP3 exprimierten, Zellkerne auf, die sich mit Propidiumiodid stark anfärben ließen (9). Bei DNA, die am Tag 3 nach der Transfektion mit pRSV-tr aus MDCC-MSB1-Zellen isoliert wurde, zeigte sich, dass sie viel weniger abgebaut wurde als DNA, die aus pRSV-VP3-transfizierten MDCC-MSB1-Zellen isoliert wurden. Die Fraktion der propidiumiodidpositiven Zellkerne von Zellen, die verkürztes VP3 exprimieren, nahmen 5 Tage nach der Transfektion langsam auf ungefähr 50% ab. Die meisten der Zellen, die verkürztes VP3 enthielten und durch Propidiumiodid nur schwach angefärbt wurden, hatten eine körnige VP3-Verteilung. Nur eine einzige Zelle enthielt VP3-Aggregate.
Die Expression von verkürztem VP3 in MDCC-MSB1-Zellen induziert den Zelltod anscheinend viel weniger effizient als die Expression von Wildtyp-VP3. Es ist auch bemerkenswert, dass die VP3-Mutante viel weniger Aggregate bilden kann als das Wildtyp-VP3.
Expression von VP3 in humanen Tumorzellen induziert Apoptose
Für die Expression von VP3. in humanen Zellen wurden die Expressionsvektoren pRSV-VP3 (8a) und pCMV-VP3 verwendet. Die codierenden Sequenzen für VP3 wurden in den Expressionsvektor pCMV-neo einkloniert, der den starken Promotor des unmittelbar-frühen Gens des Cytomegalovirus (CMV) enthielt (Boshart et al., 1985). Das 0,46 kb lange BamHI-Fragment mit CAV-DNA-Sequenzen auf den Positionen 427-868 (Noteborn et al., 1991) wurde aus dem Plasmid pAc-VP3 (4) isoliert. Der Vektor pCMV-neo wurde mit BamHI linearisiert, mit CIP behandelt, und ein 7,5 kb langes Fragment wurde isoliert. Das 0,46 kb lange BamHI-Fragment wurde mit dem 7,5 kb langen BamHI-DNA-Fragment ligiert. Die richtige Orientierung der VP3-codierenden Sequenz in Bezug auf den CMV-Promotor in dem endgültigen Konstrukt pCMV-VP3 wurde mittels Restriktionsenzymanalyse bestimmt (10).
Für die Expression von verkürztem VP3 in humanen Zellen wurde das 0,46 kb lange XhoI-SalI-Fragment des Plasmids pRSV-tr, das für verkürztes VP3 codierte (8a), durch Behandlung mit Klenow-Polymerase mit glatten Enden versehen und isoliert. Der Vektor pCMV-neo wurde mit BamHI linearisiert, mit glatten Enden versehen und durch Behandlung mit CIP dephosphoryliert. Das 0,46 kb lange DNA-Fragment mit den glatten Enden wurden mit dem 7,5 kb langen DNA-Fragment mit den glatten Enden ligiert. Das Konstrukt pCMV-tr enthält die codierenden Sequenzen für verkürztes VP3 unter der Kontrolle des CMV-Promotors (10).
Im ersten Fall wurde VP3 in den 3 humanen hämatopoetischen Tumorzelllinien KG-1, DOHH-2 und K562 und in der immortalisierten Zelllinie Jobo-0 exprimiert. Die Zelllinien KG-1 und K562 stammen von verschiedenen Patienten mit humaner Myeloid-Leukämie (Koeffler und Golde, 1980), und DOHH-2 stammt von einem Patienten mit einem follikulären B-Lymphom (Landegent et al., Ergebnisse nicht veröffentlicht). Jobo-O-Zellen wurden mit dem Epstein-Barr-Virus immortalisiert (Landegent, Ergebnisse nicht veröffentlicht). Die 4 Humanzelllinien wurden mit DNA von pRSV-VP3 (KG-1) oder mit DNA von pCMV-VP3 (DOHH-2, K562 und Jobo-1) transfiziert. Die Zellen wurden fixiert und durch Färbung mit monoklonalem CVI-CAV-85.1 auf VP3-Expression und durch Färbung mit Propidiumiodid auf Apoptose analysiert. Schon früh nach der Transfektion wurden VP3-positive Zellen mit einer feinkörnigen Verteilung von VP3 im Zellkern, der mit Propidiumiodid angefärbt worden war, und VP3-positive Zellen mit Zellkernen, die VP3-Aggregate mit Zellkernen enthielten, die sich mit Propidiumiodid nicht anfärben ließen, beobachtet. Für den Prozentsatz von VP3- positiven Zellen mit Zellkernen, die sich mit Propidiumiodid nicht anfärben ließen und VP3-Aggregate enthielten, wurde für die 4 verschiedenen hämatopoetischen Zelllinien 5 Tage nach der Transfektion ein Bereich zwischen 75 und 95% gefunden (11a). Dann wurden K562-Zellen mit DNA des Plasmids pCMV-tr transfiziert, das C-terminal verkürztes VP3 exprimiert. Die Expression von verkürztem VP3 in K562-Zellen induzierte den Zelltod viel weniger effizient als Wildtyp-VP3.
Unsere Schlussfolgerung lautet, dass die Expression von VP3 in humanen hämatopoetischen Tumorzellen zu einer spezifischen Induktion der Apoptose führt. Die Expression von VP3 in der humanen Brusttumorzelllinie MCF-7 (Lippmann et al., 1980) führte ebenfalls zur Induktion von Apoptose (Noteborn et al., Ergebnisse nicht veröffentlicht).
In der Literatur ist beschrieben, dass (humane) Tumoren und Tumorzelllinien, die kein funktionelles p53 enthalten, weniger/nicht anfällig für die Induktion von Zelltod durch Chemotherapeutika und Strahlungsbehandlung sind (Lowe et al., 1993). Das Tumorsuppressor-Gen p53 wirkt als Vermittler bei der Induktion der Apaptose durch spezifische Antitumormittel. Wir haben untersucht, ob VP3 in der Lage ist, eine Apoptose in Humanzellen zu induzieren, die kein p53 besitzen oder die mutiertes p53 besitzen. VP3 wurde mittels DEAE-Dextran-Transfektion mit dem Plasmid pCMV-VP3 in humanen Osteosarkomzellen exprimiert. Die von einem Osteosarkom abgeleiteten Saos-2-Zellen können p53 nicht synthetisieren, und Saos-2/Ala143-Zellen exprimieren mutiertes und somit nichtfunktionelles p53. Als positive Kontrolle wurde die U2-OS-Zelllinie verwendet, die Wildtyp-p53 enthielt (Diller et al., 1990). Die in 12a angegebenen Ergebnisse zeigen, dass VP3 eine Apoptose zu einem vergleichbaren Grad in Zellen induzieren kann, die p53-negativ (Saos-2 und Saos-2/Ala143) oder p53-positiv (U2-OS) sind. Sechs Tage nach der Transfektion sind die meisten der VP3-positiven Zellen apoptotisch. Die Expression von verkürztem VP3 induzierte bei Saos-2-Zellen eine viel weniger effiziente Apoptose (12b). Unsere Schlussfolgerung lautet, dass VP3 spezifisch eine Apoptose bei menschlichen Tumorzellen induzieren kann, die das Tumorsuppressor-Gen p53 enthalten oder auch nicht enthalten.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des VP1-Proteins des Hühneranämievirus. Die Nummerierung der CAV-DNA-Sequenzen entspricht der im Niederländischen Patent Nr. 9002008 angegebenen.
2 zeigt die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des VP2-Proteins des Hühneranämievirus. Die Nummerierung der CAV-DNA-Sequenzen entspricht der im Niederländischen Patent Nr. 9002008 angegebenen.
3 zeigt die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz des VP3-Proteins des Hühneranämievirus. Die Nummerierung der CAV-DNA-Sequenzen entspricht der im Niederländischen Patent Nr. 9002008 angegebenen.
4 zeigt die Diagramm-Darstellung der 3 CAV-rekombinanten Transfervektoren pAc-VP1, pAc-VP2 und pAc-VP3.
5 zeigt die Pepscan-Analyse des monoklonalen Antikörpers CVI-CAV-85.1 mit Peptiden (12-meren), die von VP3 abgeleitet sind. Die Kernsequenz PSTVFR, gegen die der monoklonale Antikörper CVI-CAV-85.1 gerichtet ist, befindet sich auf den Positionen 12 bis 17 der VP3-Aminosäuresequenz (Noteborn et al., 1991).
6 zeigt die Pepscan-Analyse des monoklonalen Antikörpers 111.2 mit Peptiden (12-meren), die von VP2 abgeleitet sind. Der monoklonale Antikörper 111.2 ist gegen das Epitop GLEDRSTQ gerichtet, das sich auf den Positionen 109 bis 116 der VP2-Aminosäuresequenz befindet (Noteborn et al., 1991). Nur die mit den Peptiden Nr. 1 bis 140 erhaltenen Ergebnisse sind gezeigt (Extinktion der Peptide Nr. 141 bis 206 ≤ 0,103).
7 zeigt die Pepscan-Analyse des monoklonalen Antikörpers 111.3 mit Peptiden (12-meren), die von VP3 abgeleitet sind. Der monoklonale Antikörper 111.3 ist gegen das Epitop PTSSR gerichtet, das sich auf den Positionen 19 bis 23 der VP3-Aminosäuresequenz befindet (Noteborn et al., 1991).
B Bild A zeigt die Diagramm-Darstellung der 2 Expressionsvektoren pRSV-VP3 und pRSV-tr. Bild B zeigt die Aminosäuresequenz des CAV-Proteins VP3. Die Prolinreste sind kursiv gedruckt, und die basischen Aminosäuren sind fett gedruckt. Die 11 C-terminalen Aminosäuren, deren Codons im Expressionsvektor deletiert sind, sind unterstrichen.
9 zeigt die Kinetik der apoptotischen Wirkung von VP3 oder verkürztem VP3. MDCC-MSB1-Zellen wurden mit dem Plasmid pRSV-VP3 (o) oder pRSV-tr (o) transfiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion fixiert und mit dem monoklonalen Antikörper CVI-CAV-85.1 angefärbt. Die Prozentsätze der immunofluoreszenten Zellen mit Zellkernen, die sich normal mit Propidiumiodid anfärben lassen, sind angegeben. Pro Experiment wurden wenigstens 100 Zellen gezählt, die VP3 oder verkürztes VP3 exprimiert hatten.
10 zeigt die Diagramm-Darstellung der Expressionsvektoren pCMV-VP3 und pCMV-tr.
11 zeigt die Kinetik der apoptotischen Wirkung von VP3 auf humane hämatopoetische (Tumor)Zellen. Die Zelllinie KG1 wurde mit dem Plasmid pRSV-VP3 transfiziert, und die Zelllinien DOHH-2, K562 und Jobo-0 wurden mit dem Plasmid pCMV-VP3 transfiziert. Die Prozentsätze der VP3-positiven Zellen mit Zellkernen, die sich nur schwach mit Propidiumiodid anfärben lassen, d.h. der apoptotischen Zellen, sind angegeben. Pro Experiment wurden wenigstens 200 Zellen gezählt.
12 zeigt die Kinetik der apoptotischen Wirkung von VP3 auf humane Osteosarkomzelllinien. Zellen der Zelllinien Saos-2, Saos-2/Ala143 und U2-O5 wurden mit dem Plasmid pCMV-VP3 transfiziert. Die Prozentsätze der VP3-positiven Zellen mit Zellkernen, die sich nur schwach mit Propidiumiodid anfärben lassen, d. h. der apoptotischen Zellen, sind angegeben. Pro Experiment wurden wenigstens 500 Zellen gezählt.
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Claims

Verwendung eines vom Hühneranämievirus abgeleiteten Polypeptids außerhalb seiner natürlichen Umgebung, wobei das Polypeptid wenigstens eine der Aminosäure-Sequenzen, wie sie in den 2 oder 3 aufgeführt sind, oder eine Mutante der Aminosäure-Sequenz, wie sie in der 3 aufgeführt ist, umfasst, die wenigstens die ersten 110 N-terminalen Aminosäuren umfasst, um Apoptose zu induzieren.
Proteinartige Substanz, umfassend wenigstens 3 vom Hühneranämievirus abgeleitete Polypeptide, wobei die Polypeptide Aminosäuren umfassen, wie sie in den 1, 2 und 3 aufgeführt sind, und entweder direkt oder indirekt Antikörper gegen das Hühneranämievirus erzeugen können, wobei das Polypeptid der in der 3 aufgeführten Aminosäure-Sequenz eine Mutante ist, die wenigstens die ersten 110 N-terminalen Aminosäuren umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante eine reduzierte Kapazität zur Induktion von Apoptose aufweist.
Zusammensetzung zur Verhinderung einer Hühneranämievirus-Infektion, die eine proteinartige Substanz gemäß Anspruch 2 und ein Hilfsmittel umfasst.
Attenuiertes Hühneranämievirus, das eine Mutation in seiner DNA-Codierung für das Virusprotein VP3 besitzt, wobei VP3 wenigstens die ersten 110 N-terminalen Aminosäuren umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das VP3 eine reduzierte Kapazität zur Induktion von Apoptose aufweist.
Zusammensetzung zur Verhinderung einer Hühneranämievirus-Infektion bei Geflügel, die ein Virus gemäß Anspruch 4 und ein Hilfsmittel umfasst.
Verwendung eines vom Hühneranämievirus abgeleiteten Polypeptids außerhalb seiner natürlichen Umgebung, wobei das Polypeptid wenigstens eine der Aminosäure-Sequenzen, wie sie in den 2 oder 3 aufgeführt sind, oder eine Mutante der Aminosäure-Sequenz, wie sie in der 3 aufgeführt ist, umfasst, die wenigstens die ersten 110 N-terminalen Aminosäuren umfasst und Apoptose induzieren kann, zur Herstellung eines Medikaments zur Zelltod-Induktion.
Verwendung eines vom Hühneranämievirus abgeleiteten Polypeptids außerhalb seiner natürlichen Umgebung, wobei das Polypeptid wenigstens eine der Aminosäure-Sequenzen, wie sie in den 2 oder 3 aufgeführt sind, oder eine Mutante der Aminosäure-Sequenz, wie sie in der 3 aufgeführt ist, umfasst, die wenigstens die ersten 110 N-terminalen Aminosäuren umfasst und Apoptose induzieren kann, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren.
Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das für ein vom Hühneranämievirus abgeleitetes Polypeptid außerhalb seiner natürlichen Umgebung codiert, wobei das Polypeptid wenigstens eine der Aminosäure-Sequenzen, wie sie in den 2 oder 3 aufgeführt sind, oder eine Mutante der Aminosäure-Sequenz, wie sie in der 3 aufgeführt ist, umfasst, die wenigstens die ersten 110 N-terminalen Aminosäuren umfasst und Apoptose induzieren kann, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren, wobei das DNA-Molekül in einer Tumorzelle exprimiert wird.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die DNA durch einen Virusvektor in die Tumorzelle gebracht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die DNA durch eine Rezeptorvermittelte Aufnahme in die Tumorzelle gebracht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die DNA durch Liposome in die Tumorzelle gebracht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die DNA direkt in den Tumor injiziert wird.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die DNA durch Elektroporation in die Tumorzelle gebracht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei die DNA durch Teilchenbeschuss in die Tumorzelle gebracht wird.
Konjugat zur Behandlung von Tumoren, umfassend wenigstens ein vom Hühneranämievirus abgeleitetes Polypeptid außerhalb seiner natürlichen Umgebung, wobei das Polypeptid wenigstens einen Teil einer der Aminosäure-Sequenzen, wie sie in den 2 oder 3 aufgeführt sind, oder eine Mutante der Aminosäure-Sequenz, wie sie in der 3 aufgeführt ist, umfasst, die wenigstens die ersten 110 N-terminalen Aminosäuren umfasst und Apoptose induzieren kann, und eine Substanz mit einer Affinität gegenüber Tumor-assoziierten Proteinen, Zuckern oder Lipiden.
Konjugat gemäß Anspruch 15, in welchem die Substanz, die eine Affinität gegenüber Tumoren hat, ein Antikörper oder ein Derivat oder ein Fragment desselben ist.