ES2311005T3 - Mutantes y vacunas del virus de la anemia infecciosa de los pollos basadas sobre la proteina viral vp3 o secuencias de dicho virus que las codifica. - Google Patents
Mutantes y vacunas del virus de la anemia infecciosa de los pollos basadas sobre la proteina viral vp3 o secuencias de dicho virus que las codifica. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido derivado del virus de anemia de pollos, desprovisto de su medio ambiente natural, cuyo polipéptido comprende la secuencia presentada en la figura 3, en cuyo polipéptido se realiza una mutación que disminuye la capacidad de inducción de apoptosis, en el que dicho polipéptido mutado comprende como mínimo los primeros 110 aminoácidos N terminales tal como se ha mostrado en la figura 3.
Description
Mutantes y vacunas del virus de la anemia
infecciosa de los pollos basadas sobre la proteína viral VP3 o
secuencias de dicho virus que las codifica.
La presente invención se refiere a nuevas
proteínas y/o polipéptidos del Virus de la Anemia de los Pollos.
Además, se refiere a vacunas y a compuestos para prevenir o tratar
infecciones víricas en aves, en particular infecciones por el Virus
de la Anemia de los Pollos (CAV).
En particular, la presente invención se refiere
a vacunas que son menos patógenas que el propio CAV, pero que
conducen a la generación de anticuerpos neutralizantes en el animal
inmunizado.
Además, la presente invención se refiere a
composiciones que contienen anticuerpos contra partes del CAV para
controlar infecciones con CAV. Asimismo son objeto de la invención
anticuerpos anti-idiotipo que poseen inmunogenicidad
que corresponde al antígeno.
La invención se refiere asimismo a anticuerpos
para la detección o control de infecciones por CAV. Asimismo se
describirán conjuntos de prueba (kits) de diagnóstico para la
detección del CAV.
La invención se refiere asimismo a moléculas de
ADN recombinante derivadas de CAV, que codifican como mínimo para
una parte inmunogénica de una proteína de CAV y células huésped
transfectadas con dichas moléculas de ADN recombinante. La presente
invención hace posibles vacunas basadas en dichas células
huésped.
Asimismo son objeto de la presente invención las
llamadas vacunas de virus vivos en las que una parte de ADN que
codifica como mínimo para una parte inmunogénica de una proteína de
CAV es llevada a un virus que provoca infección en el huésped
deseado.
También son objeto de la presente invención
procesos para la profilaxis o control de infecciones por CAV, en
particular en pollos, y procesos para la preparación de partes
recombinantes de CAV que comprenden secuencias, y procesos para la
preparación de vacunas.
Además, la presente invención se refiere a
utilizaciones de las proteínas de CAV en la inducción de apoptosis
(muerte celular programada). En particular, las proteínas
(polipéptidos) pueden ser utilizadas en la inducción de apoptosis en
células tumorales.
Además, las proteínas de acuerdo con la presente
invención pueden ser utilizadas asimismo en la eliminación de otras
poblaciones celulares no deseadas, tales como células T reactivas
autoinmunes en enfermedades autoinmunes, tales como artritis
reumatoide, lupus, etc.
La presente invención también da a conocer la
inducción de la muerte celular por medio de terapia de genes. Los
procesos para la preparación de esta terapéutica y procesos para
tratamiento con la misma son también objeto de la invención.
El Virus de la Anemia de los Pollos (CAV) es un
virus de ADN caracterizado recientemente (Noteborn y De Boer,
1990). Pertenece a una nueva familia de virus. En pollos jóvenes el
CAV provoca anemia por destrucción de células precursoras
eritroblastoides y deficiencia inmunitaria por agotamiento de los
timocitos. Tienen lugar lesiones en el bazo y el hígado (Jeurissen
y otros, 1989). Un estudio reciente ha demostrado que el agotamiento
de los timocitos es provocado a través de la apoptosis inducida por
CAV (Jeurissen y otros, 1992b).
Gelderblom y otros (1989) y Todd y otros (1990)
han demostrado por medio de estudios mediante microscopio
electrónico que las partículas de CAV tienen una simetría
icosahédrica T3 y un diámetro de 23-25 nm. Las
partículas de CAV se concentran después de sedimentación en
equilibrio con una densidad de 1,33-1,34 g/ml en
CsCl.
Todd y otros (1990) han demostrado que
partículas de virus aisladas contienen solamente una proteína que
tenga un peso molecular de 50 kDa. El ADN de hebra única en la
partículas de CAV adopta forma de una hebra circular menos
(Gelderblom y otros; Todd y otros, 1990; Noteborn y otros, 1991). El
intermediario de ADN replicante fue clonado y secuenciado por
completo. El genoma de CAV tiene una longitud de 2319 nucleotidos.
En base a la estructura del genoma y a la secuencia de ADN, el
virus no puede ser situado en una de las familias de virus
conocidas (Noteborn y otros, 1991; Todd y otros, 1991). El genoma
del CAV contiene tres armazones de lectura parcial o completamente
solapada, grandes, que codifican para posibles proteínas que tienen
pesos moleculares de 51,6, 24,0 y 13,3 kDa. El genoma de CAV
contiene además una zona evidente promotora/multiplicadora y
solamente una señal de poliadenilación. La transcripción del
intermedio de ADN replicante produce una molécula de ARN
policistrónica poliadenilada de aproximadamente 2100 nucleótidos
(Noteborn y otros, 1992b).
Los pollos de días de vida son los más
susceptibles a infecciones por CAV. En estos animales se observan
letargia, anorexia y anemia desde los 10 días después de
inoculación con CAV. Después de la infección, la mortalidad puede
aumentar hasta un máximo de 50%. Al aumentar la edad la resistencia
se incrementa también. Jeurissen y otros (1992) han informado que
solamente los valores de hematocito de pollos que han sido
infectados con CAV a una edad de 1-3 días presentan
disminuciones. Las infecciones por CAV de pollos de
1-21 días de edad resulta en el agotamiento
específicamente del córtex del timo. No obstante, en pollos mayores
el CAV se puede multiplicar subclínicamente. La infección por CAV
en pollos mayores puede ser determinada por la aparición de
conversión de suero (Mcllroy y otros, 1992).
La extensión del CAV dentro de una población de
pollos tiene lugar sustancialmente por infección por contacto. Muy
probablemente por ingestión de heces u otros materiales contaminados
con heces de animales infectados por CAV. No obstante, no se puede
eliminar la infección aérea. La transmisión de virus a los recién
nacidos a través del huevo ha sido sugerida por Yuasa y otros
(1979), pero no se ha podido demostrar por los inventores de forma
experimental la transmisión vertical del CAV de animales madre a los
polluelos.
La deficiencia inmunitaria resultante del
agotamiento inducido por CAV del córtex del timo se considera que
es la causa de los síntomas de enfermedades que tienen lugar después
de infecciones secundarias de agentes normalmente no patógenos (De
Boer y otros, 1992; Engström, 1988; Rosenberger y Cloud, 1989; Von
Bülow y otros, 1986; Yuasa y otros, 1980). Por lo tanto, el CAV se
aísla en animales con la enfermedad de Newcastle, enfermedad de
Marek, bursitis infecciosa (Gumboro) y animales con "enfermedad de
ala azul" en asociación con reovirus. Las infecciones por CAV
conducen a reacciones de inoculación incrementadas, por ejemplo
contra el virus de la enfermedad de Newcastle.
Se ha observado que los anticuerpos maternales
proporcionan una importante protección contra la infección por CAV.
En un reciente estudio en condiciones de laboratorio se demostró
que los pollos inmunes maternalmente de días de edad no desarrollan
infección CAV. Los pollos de días de edad pueden ser también
protegidos pasivamente por inyección intravenosa de anticuerpos de
yema de huevo de animales madre inmunes (De Boer y otros, fechas no
publicadas).
El CAV se puede multiplicar en cultivo celular.
Los valores que se obtienen son bajos en general. En la actualidad,
células MD-CC-MSB1 (Yuasa, 1983;
Yuasa y otros, 1983)se usan para ello, en las que el CAV
induce un efecto citopatogénico 48-72 horas después
de la infección. También se utilizan células
MDCC-MSB1 para determinar anticuerpos
neutralizantes y anticuerpos dirigidos contra el CAV por medio de
inmunofluorescencia (Von Bülow y otros, 1985; Chettle y otros,
1991). No se ha descubierto hasta el momento que sea posible atenuar
la virulencia de CAV por paso seriado en células
MDCC-MSB1.
Los animales más viejos no desarrollan síntomas
de la enfermedad después de la infección por CAV y los pollos con
anticuerpos maternos están protegidos. Estos datos han sido
utilizados en Alemania en un programa de vacunación basado en una
exposición controlada al CAV de animales madre de
14-16 semanas. En Holanda este método de vacunación
no está permitido excepto a nivel experimental por los riesgos que
ello comporta. Tal como se ha indicado anteriormente, es posible
que el CAV pueda ser transmitido a las crías a través de huevos
fertilizados. McNulty y otros (1991) han demostrado recientemente
que poblaciones de aves seropositivas de CAV tienen números de
producción inferiores a los de las poblaciones de aves seronegativas
de CAV. Además, Adair (comunicación personal) ha demostrado
deficiencia inmune en pollos que tienen infección por CAV
subclínica. La posible extensión viral vertical y la deficiencia
inmunitaria provocada por CAV en infecciones subclínicas hace muy
deseable un programa de control basado en una vacuna inocua.
En general, las vacunas inactivadas y vacunas
subunitarias son las vacunas más seguras. El hecho de que en
condiciones de cultivo de tejidos el CAV se multiplica solamente con
valores bajos, hace la preparación de una vacuna inactivada
relativamente onerosa y engorrosa. Para la preparación de una vacuna
subunitaria contra infecciones por CAV son necesarias las proteínas
de CAV que inducen una respuesta inmune protectora en pollos
vacunados. Hasta el momento se ha encontrado solamente una proteína
(llamada VP1) en partículas de CAV purificado.
De manera sorprendente, se ha descubierto ahora
que esta proteína sola, tal como se muestra en los ejemplos, no es
capaz de proporcionar una respuesta inmunitaria que proteja contra
infecciones por CAV. Se ha descubierto que a pesar de que la VP1
parece ser la única proteína presente en la partícula de virus, la
proteína VP2 expresada ahora por los inventores por primera vez es
esencial para generar anticuerpos neutralizadores del virus. Por lo
tanto, es posible solamente desarrollar una vacuna efectiva en base
a partes del virus.
Los inventores han clonado los tres marcos de
lectura abierta presentes en el genoma de CAV en vectores de
baculovirus. Las tres proteínas VP1, VP2 y VP3 de CAV se expresaron
solamente en células Sf9, en combinación con una u otra de las
proteínas de CAV o las tres simultáneamente por medio de coinfección
con baculovirus de CAV recombinante. Se inyectaron animales madre
con lisados de células en crudo que contenían una o varias
proteínas de CAV. Solamente después de inmunización de pollos con
preparados antígenos conteniendo cantidades proporcionales de las
tres proteínas de CAV o conteniendo esencialmente VP1 y VP2 y
asimismo una cierta cantidad de VP3, se desarrollaron anticuerpos
neutralizantes. Los huevos de estos animales contenían anticuerpos
maternos contra CAV. Las pruebas de infección con crías de animales
madre vacunados mostró que como mínimo las proteínas VP1 y VP2 de
CAV son necesarias para la inducción de una respuesta inmune
protectora. Las crías de animales madre inyectados con las tres
proteínas CAV estaban incluso mejor protegidas contra infecciones
por CAV. La inyección en pollos con las tres proteínas de CAV que
se habían producido individualmente en células Sf9 indujeron pocos
anticuerpos neutralizantes contra CAV. Esto implica que para la
inducción óptima de anticuerpos neutralizantes contra CAV se deben
sintetizar conjuntamente 2 ó 3 proteínas de CAV en una célula de un
insecto.
Es posible que fragmentos de 2 ó 3 proteínas de
CAV sean ya suficientes para conseguir una respuesta inmune
protectora contra infecciones por CAV.
Los productos de CAV recombinante, VP1 + VP2 o
VP1 + VP2 + VP3, que se utilizarán para vacunación de gallinas de
cría, se pueden sintetizar por medio del sistema de baculovirus. Las
proteínas de CAV pueden ser también sintetizadas por medio de otros
sistemas, tales como células bacterianas o de levadura, a través de
infección retroviral o amplificación de genes (sistema
CHO-dhfr).
El hecho de que 2 ó 3 proteínas codificadas por
los marcos de lectura abierta del genoma de CAV puedan inducir una
respuesta inmune protectora en pollos, es también aplicable al
desarrollo de vectores de virus vivos. Las secuencias de
codificación para VP1 + VP2 o VP1 + VP2 + VP3 son clonadas en
vectores de virus vivos.
También es posible que una de las proteínas de
CAV VP1, VP2 o VP3, separadamente, pero dentro del contexto de un
vector de virus vivo, sea también apropiada para la inducción de una
respuesta inmune protectora contra infecciones por CAV.
La expresión de fragmentos de una o varias
proteínas de CAV antes mencionadas por vectores de virus vivos puede
ser suficiente para la inducción de una respuesta inmune
protectora.
En aves, solamente vectores de virus vivos que
muestran por sí mismos una buena replicación en el sistema aviar
pueden ser utilizados. Se pueden elegir para el uso de vectores
víricos en pollos, entre otros: virus de la viruela de los pollos,
vectores retrovíricos, vectores de virus de herpes (virus de Marek y
virus de herpes de pavo), adenovirus y virus de laringotraquitis.
Se ha descubierto que la inducción de muerte celular por CAV se
puede atribuir esencialmente a VP3 y parcialmente a VP2.
Por delección de los 11 aminoácidos C terminales
de VP3 se reduce fuertemente la inducción de apoptosis por VP3.
Como consecuencia, la actividad patogénica de CAV se puede reducir
drásticamente por la introducción de un codón de interrupción en la
región terminal de VP3. El codón adicional de interrupción en la
zona de codificación para VP3 es introducido en el clon de CAV
pCAV/EcoRI (Noteborn y De Boer) que contiene el genoma completo del
CAV. El genoma mutante completo del CAV es cortado del vector y
reciclado. Se transfectan células
MD-CC-MSB1 con el ADN mutante de CAV
reciclado y las crías del virus que son menos patógenas se recogen.
Se evacuaron pollos con el virus mutante atenuado de CAV. Dado que
la proteína VP2 tiene también un determinado efecto sobre la
inducción de apoptosis, es posible preparar también CAV atenuado que
contiene una mutación en la región de codificación para VP2 o VP2 y
VP3.
La introducción antes mencionada de un codón de
interrupción en la región de codificación para VP2 y/o VP3 también
puede ser utilizada para la producción de vectores de virus vivos
recombinantes de CAV.
Los animales infectados con CAV a una edad
superior no desarrollan síntomas clínicos. No obstante, parece que
dichas infecciones pueden conducir a grandes pérdidas económicas
para la industria aviar. La inmunización de animales con los
productos recombinantes de CAV antes descritos conducirá a una
protección activa contra los síntomas subclínicos antes
mencionados.
Las tres proteínas de CAV que han sido
expresadas en el sistema de baculovirus separadamente o en
combinación con una u otras dos proteínas de CAV se pueden utilizar
para identificar anticuerpos dirigidos contra CAV. Los pollos
infectados o vacunados con CAV pueden ser en este caso objeto de
seguimiento. Se pueden utilizar una o varias proteínas de CAV en
inmunoensayos, tal como el "ensayo inmunoabsorbente de encimas"
(ELISA), manchado con inmunoperoxidasa y ensayo de
inmunofluorescencia. Para la medición de anticuerpos neutralizantes
se requieren dos o más proteínas de CAV.
La inmunización de ratones con 3 productos
recombinantes de CAV sintetizados en células de insectos con
baculovirus recombinantes de CAV produjo finalmente anticuerpos
monoclonales específicos para VP2 y VP3. Estos monoclonales
reaccionaron con estructuras específicas en células infectadas con
CAV y no con células no infectadas.
Por medio de los anticuerpos generados mediante
proteínas de CAV recombinante, se pueden identificar proteínas de
CAV en preparaciones de órganos de pollos infectados por CAV. En
base a estos datos, se pueden desarrollar pruebas de diagnóstico
fiables. Los anticuerpos monoclonales y policlonales de acuerdo con
la invención pueden ser también utilizados en otros ensayos de
diagnóstico, tales como ELISA, RIA, SPIA, ensayos de
inmunofluorescencia y manchado con inmunoperoxidasa, opcionalmente
de forma conjunta con una o varias proteínas de CAV o fragmentos del
mismo.
En principio todas las realizaciones conocidas
de pruebas de diagnóstico inmunológico son posibles con todos los
marcadores disponibles, y dependiendo de la prueba a llevar a cabo y
de las condiciones en las que se debe llevar a cabo, una persona
con conocimientos ordinarios en la materia sería capaz de
seleccionar la realización más adecuada. Además, para los efectos
de esta invención los anticuerpos y/o otras proteínas/polipéptidos
son también derivados y/o fragmentos siempre que posean la actividad
deseada. En el caso de anticuerpos esto significa que deben ser
capaces como mínimo de reconocer el antígeno.
Los anticuerpos según la presente invención
pueden ser utilizados también para la inmunización pasiva de aves.
Contra los anticuerpos, según la presente invención, se pueden
generar anticuerpos que se llaman también "imagen interna" del
antígeno y por lo tanto se pueden utilizar nuevamente como tales, en
particular en inmunizaciones pasivas y en diagnóstico.
El CAV induce apoptosis en timocitos infectados.
Es posible que una infección por CAV de tumores humanos tenga
también como resultado la muerte celular de las células
tumorales.
In vitro la proteína VP3 de CAV es por sí
misma capaz de inducir apoptosis en células tumorales mononucleares
de pollos y en diversas células tumorales humanas.
La expresión de la proteína de CAV también puede
ser utilizada, por lo tanto, para la inducción de muerte celular en
tumores (humanos). La proteína VP3 puede ser expresada
(transitoriamente) en tumores por medio de transfección de ADN. La
expresión de VP3 en células (tumorales) puede tener lugar también
por infección de las células con vectores (retro)víricos que
contienen una secuencia codificante para VP3. La administración a
células de componentes no víricos (por ejemplo, liposomas o vectores
derivados de transferina) conteniendo proteínas VP3 y/o secuencias
codificadoras para VP3 es otra posibilidad para la
expresión/presencia de VP3 en células (tumorales).
Las utilizaciones antes mencionadas pueden
servir también para la posible inducción de muerte celular por
expresión en células (tumorales) de VP2 o VP2 junto con VP3.
Las proteínas VP2 y/o VP3 de CAV pueden ser
utilizadas en tratamientos para la reducción de formación de tumores
humanos. Esto puede tener lugar, por ejemplo, por inyección de las
proteínas según la invención directamente en un tumor sólido o
acoplando las proteínas a un ligando que tiene afinidad para un
antiligando asociado a un tumor. Este acoplamiento puede ser
efectuado tanto químicamente como (en caso de que el ligando sea
también una proteína) haciendo recombinante una proteína de
fusión.
El acoplamiento químico puede ser efectuado
directamente o a través de un grupo separador. Opcionalmente, una
molécula portadora inerte puede ser seleccionada, tal como una
proteína indiferente de suero, a la que se acoplan tanto el ligando
como la proteína vírica con o sin grupo separador.
Son ejemplos de combinaciones propuestas
frecuentemente de interacciones ligando-antiligando
los pares ligando-receptor, tales como
EGF/receptor, IL-2/receptor, /receptor celular T,
anticuerpo/antígeno de tumor, etc.
Se debe dar preferencia a una combinación
ligando-antiligando que se pueda internalizar por la
célula. Cuando se selecciona un conjugado puede ser ventajoso
aplicar un grupo inestable intrínseco como acoplamiento entre la
proteína vírica y el ligando, de manera que la proteína vírica en la
célula vuelve a su forma nativa. No en todos los casos será
necesario seleccionar una combinación internalizante. Las células
tumorales son metabólicamente activas y absorberán de manera activa
o pasiva substancias, es decir, también las proteínas de acuerdo con
la invención, mediante fagocitosis y/o pinocitosis.
El ligando al que se pueden acoplar las
proteínas, según la invención, de cualquier modo no es necesario que
sea un ligando completo. De modo general, será suficiente utilizar
la parte de unión antiligando. También serán útiles derivados de
los ligandos en cuestión, siempre que posean la actividad de unión
antiligando. En caso de que el ligando sea un anticuerpo, se tiene
que considerar el hecho de que los anticuerpos de otro origen
distinto al tipo al que se administran conducirá en la mayor parte
de casos a una respuesta inmune. Además, esto también es aplicable a
una serie de otros ligandos de proteínas.
En la actualidad es ya suficientemente conocido
que los anticuerpos pueden ser manipulados de manera tal que no
generan respuesta inmune reconociendo todavía el antígeno
deseado.
Se explicarán brevemente a continuación la forma
en la que los anticuerpos de animales pueden ser hechos adecuados
para utilización humana (humanización), pero se observará que
también son posibles adaptaciones de otro tipo.
En primer lugar es posible eliminar químicamente
la parte constante con respecto al anticuerpo a humanizar a efectos
de preparar fragmentos FAB, FAB'2 o fragmentos todavía más pequeños
(Winter y otros, 1990). En general, estos fragmentos serán como
mínimo menos inmunogénicos. Estos fragmentos pueden ser preparados
también por medio de tecnología de ADN recombinante.
Además, es posible substituir las partes
constantes de anticuerpos de animales por sus partes
correspondientes humanas por medio de tecnología de ADN
recombinante (Cabilly y otros, 1984; Boss y otros, 1984).
Además, es también posible inocular el dominio
de unión de antígeno de anticuerpos de animales en anticuerpos de
origen humano (Winter y otros, 1987).
Los antígenos de tumores conocidos contra los
cuales se han generado anticuerpos son, por ejemplo, CEA (antígeno
carcino embriónico) y similares.
La invención se explicará de manera más
detallada a continuación en base a la siguiente parte de
experimentos. Esto tiene solamente la finalidad de ilustración y no
se debe interpretar como limitación del ámbito de protección.
\vskip1.000000\baselineskip
El baculovirus recombinante
pAcRP23-lacZ (Bishop, 1992) fue obtenido a partir
del Dr. R. Possee, NERC Institute of Virology, Oxford, Inglaterra,
y el ADN genómico fue purificado tal como se ha descrito por Summers
y Smith (1987). Se obtuvieron células de Spodóptera frugiperda
(Sf9) de la American Tissue Culture Collection (no. CRL 1711). Se
cultivaron baculovirus en monocapas confluyentes y cultivos de
suspensión en medio TC 100 (Gibco/BRL) conteniendo 10% de suero
fetal de bovino tal como se describe por Summers y Smith (1987).
La línea celular T MDCC-MSB1
transformada con virus de la enfermedad de Marek (Yuasa, 1983; Yuasa
y otros, 1983) fue cultivada en medio RPMI-1680
(Gibco/BRL) conteniendo 10% de suero fetal de bovino; las células
fueron utilizadas para experimentos de transfección de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las secuencias de ADN de CAV son derivados
originalmente del plásmido de ADN
plc-20H/CAV-EcoRI (Noteborn y De
Boer, 1990). Todas las etapas de clonado con ADN plásmido se
llevaron a cabo en principio de acuerdo con los métodos descritos
por Maniatis y otros (1982).
Las secuencias de codificación de las tres
proteínas de CAV VP1, VP2 y VP3 se clonaron separadamente en un
vector de transferencia de baculovirus pAcYM1 (Matsuura y otros,
1987), que fue obtenido del Dr. D.H.L. Bishop, NERC Institute of
Virology, Oxford, Inglaterra. La secuencia de codificación para la
proteína VP3 de CAV y un mutante derivado de la misma se clonaron
en el vector de expresión pRSV-H20 (Offringa y
otros).
Se llevaron a cabo transformaciones de ADN en la
cepa de E. Coli HB101. Todos los plásmidos fueron
multiplicados en grandes cultivos bajo agitación, purificados sobre
gradientes de CsCl, y a continuación por filtrado sobre columnas de
Sephacryl S-500.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ADN del baculovirus recombinante
AcRP23-lacZ a partir de baculovirus extracelulares
según un método descrito por Summers y Smith (1987). El gen lacZ
contiene un lugar único de corte para la encima de restricción
Bsu361. El AcRP23-lacZ fue linealizado por digestión
con Bsu361. Se transfectaron células Sf9 con precipitados de
fosfato cálcico de baculovirus linealizado
AcRP23-lacZ ADN y vector de transferencia
recombinante de ADN de acuerdo con un método de Smith y otros
(1983); ésta es una adaptación del protocolo de transfección de
Graham y Van der Eb (1973) para células Sf9.
Para la transfección de las diversas líneas
celulares humanas y de pollos se resuspendieron 10 microgramos de
pRSV-VP3, pCMV-VP3,
pRSV-tr o ADN de pRSV-tr en 25
microlitros de agua Milli-Q y se mezclaron con 260
microlitros de tampón TBS. Se añadieron 15 microlitros de 10 mg/ml
DEAE dextrano a la mezcla de ADN que se incubó durante 30 minutos a
temperatura ambiente.
Las células fueron centrifugadas a 1500 rpm en
una mesa centrifugadora. El medio fue substituido por 5 ml de
tampón TBS, y las células fueron cuidadosamente resuspendidas. Las
células fueron peletizadas y el tampón TBS fue eliminado. Las
pastillas de células fueron resuspendidas cuidadosamente entre 300
microlitros de mezcla de DEAE dextrano/ADN y se incubaron durante
30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 0,5 ml 25% DMSO/TBS
y la suspensión fue incubada durante 3 minutos a temperatura
ambiente. Se añadieron 5 ml de TBS y las células fueron
centrifugadas a 1500 rpm en una mesa centrifugadora. El sobrenadante
fue eliminado, y se añadieron 5 ml de medio de tejidos. Las células
fueron resuspendidas, centrifugadas, transferidas a 5 ml de medio de
cultivo de tejidos e incubadas a 37ºC-5%
CO_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sobrenadantes que contienen baculovirus
extracelulares fueron analizados en ensayo de placas con rojo
neutro (Brown and Faulkner, 1977) y X-gal (Brown y
otros, 1991). Las placas lacZ negativas fueron inoculadas sobre una
monocapa de células Sf9 en platillos de microtitulación. Cinco días
después de la infección, los sobrenadantes fueron recogidos y
almacenados a 4ºC. Los lisados celulares fueron analizados en un
ensayo de hibridización "dot slot" con
plc-20H/CAV-EcoRI DNA marcado 32P
como sonda.
Se inocularon monocapas de células Sf9 con
sobrenadantes de lisados celulares que hibridizaron fuertemente con
la sonda marcada de ADN de CAV. Dos días después de la infección las
células fueron marcadas con leucina 3H. Las proteínas fueron
separadas sobre geles al 14% poliacrilamida (PAA)SDS (Laemmli
1970) que se hicieron visibles por medio de un método fluorográfico
y se comprobaron en cuanto a la presencia de proteína CAV
recombinante específica y ausencia de proteína
\beta-galactosidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Baculovirus CAV recombinante que expresaban la
proteína CAV esperada en células infectadas Sf9, se colocaron en
platillos, según el método descrito por Summers and Smith (1983). Se
infectaron monocapas de células Sf9 con un tipo de baculovirus CAV
recombinante con una multiplicidad de infección (moi) de
aproximadamente 5 unidades formadoras de placa (pfu) por célula. Se
llevaron a cabo coinfecciones de 2 ó 3 baculovirus recombinantes
CAV distintos sobre monocapas de células Sf9 con un moi de 10 pfu de
cada baculovirus CAV recombinante por célula. Tres días después de
la infección, las células de Sf9 infectadas fueron recogidas. Los
lisados de células en crudo fueron suspendidos en un tampón PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron intraperitoneal y subcutáneamente
grupos de pollos de 6 semanas con lisados crudos emulsionados en
coadyuvante de Freund completo de 10^{6} ó 10^{8} células de Sf9
que fueron infectadas con uno o varios baculovirus CAV
recombinante. Como grupo de control, se inyectó un grupo de 8
animales por experimento de inmunización con tampón de PBS
emulsionado en adyuvante de Freund completo. En diferentes días
después de la inmunización, se recogió sangre y se analizó el suero
para neutralizar anticuerpos dirigidos contra CAV.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuatro grupos, cada uno de 16 gallinas, fueron
inyectadas con lisados crudos de 2 x 107 células de Sf9 que fueron
infectadas simultáneamente con baculovirus recombinantes de VP1,
Vp2, Vp3, o con Vp1 y VP2, o con VP1 y VP3, o bien con VP2 y VP3
baculovirus recombinantes. Los lisados celulares fueron emulsionados
en un volumen igual de adyuvante de Freund completo. Como grupo de
control se inyectó un grupo de 16 gallinas con tampón de PBS en
adyuvante de Freund completo. Se extrajo material de yema de huevo
de gallinas inyectadas con estos lisados o tampón PBS con
cloroformo y se analizó en cuanto a presencia de anticuerpos
neutralizantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo el anticuerpo monoclonal
CVI-CAV-85.1 por inyección
intraperitonealmente de ratones, con células
MDCC-MSB1 inyectadas de CAV con adyuvante incompleto
de Freund. Finalmente, células de bazo de ratones inmunizados
fueron fusionadas con células de mieloma
P3X63-Ag8.653 (Noteborn y otros, 1991).
Los otros anticuerpos monoclonales dirigidos
contra antígenos de CAV fueron obtenidos por inyección de extractos
crudos de células Sf9 infectadas con los tres baculovirus
recombinantes CAV en el bazo de 4 ratones BALB/c. Los sueros de los
ratones inmunizados fueron comprobados 7 semanas después de la
inmunización para neutralizar los anticuerpos contra CAV. Las
células de bazo de los ratones inmunizados fueron fusionadas con
células de mieloma P3X63-Ag8.653. Se comprobaron
anticuerpos dirigidos contra antígenos CAV por diferentes formas:
una prueba de neutralización de sueros; ELISA basado en CAV
purificado y en lisados crudos de células de Sf9 infectadas con
baculovirus recombinante de CAV; pruebas de inmunofluorescencia en
MBCC-MSB1 infectados por CAV o en células Sf9
infectadas con baculovirus recombinante de CAV; "Western blots"
de lisados en crudo de células Sf9 infectadas con baculovirus
recombinante de CAV y manchado con inmunoperoxidasa en timo de
pollos infectados por CAV.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sueros de pollos y ratones inyectados con
lisados de células de Sf9 en crudo o tampón PBS, fueron diluidos
1:2 ó 1:4 y a continuación se preparó una serie de dilución al
doble. Los sueros diluídos fueron incubados durante 1 hora con
10^{4}-10^{5} de TCID_{50}
CAV-Cux-1 (Von Bülow y otros, 1983;
Von Bülow y otros 1985). Aproximadamente unas cien mil células de
la línea celular T MDCC-MSB1 transformadas por virus
de la enfermedad de Marek, fueron infectadas con esta mezcla de
sueros diluídos y virus. Como controles se infectaron células
MDCC-MSB1 con CAV que se neu-
tralizó con un antisuero de CAV positivo y un suero negativo originado en pollos específicos libres de patógenos.
tralizó con un antisuero de CAV positivo y un suero negativo originado en pollos específicos libres de patógenos.
Huevos fertilizados de los cinco grupos de
gallinas inmunizadas fueron incubados. Los pollos recibieron
inyección intramuscular en el día 1 con 10^{5.5} TCID_{50}
CAV-Cux-1. En los días 6 y 14
después de la infección, se sometieron a sección 5 pollos por
grupo. Se analizó el timo macroscópica e inmunohistológicamente.
Asimismo, se recogió sangre en heparina y las células de sangre
fueron sometidas a prueba en un ensayo de reaislamiento de virus.
14 días después de la infección, se recogió sangre en heparina de
todos los animales para determinar el hematocrito.
Cortes congelados de timo y tuétano de hueso se
realizaron y se utilizaron para manchado de inmunoperoxidasa con
anticuerpos monoclonales específicos de CAV, tal como se describe
por Jeurissen y otros (1988).
Las células se fijaron con 80% de acetona y se
utilizaron para pruebas de inmunofluorescencia con anticuerpos
monoclonales específicos de CAV e IgC de cabra, anti ratón,
conjugados con isotiocianato de fluoresceína (Noteborn y otros
1990).
Se lavaron tres veces con PBS muestras de sangre
de pollos infectados con CAV y se tomaron en 1 ml. Se añadieron
veinte microlitros de la suspensión celular obtenida a 10^{5}
células de MDCC-MSB1. Las células
MDCC-MSB1 se diluyeron 10 veces cada
4-5 días, se transfirieron a un medio de cultivo
fresco, hasta que el efecto fitopatogénico específico de CAV
resultó visible. Si después de 10 pasadas no se pudo observar efecto
citopatogénico, entonces se consideraba que el aislamiento de virus
era negativo. El número de veces de paso es una medición de la
magnitud de CAV infeccioso presente en la sangre de los pollos
infectados.
El genoma de CAV contiene tres marcos de lectura
abiertos grandes que se solapan de manera parcial o completa entre
sí. Utilizando codones iniciales en diferentes marcos de lectura, el
genoma del CAV codifica para 3 proteínas únicas. Las secuencias de
codificación para las proteínas de CAV eran separadamente clonadas
(VP1, figura 1; VP2, figura 2 y VP3, figura 3) en el vector de
transferencia de baculovirus pAcYM1. Dado que el marco de lectura
de VP3 queda completamente comprendido dentro del marco de lectura
VP2, VP3, en caso de expresión de VP2, es sintetizado en todos los
casos aunque en un grado claramente menor. El vector de
transferencia pAcYM1 carece de secuencias de codificación para
polihedrina, conteniendo de manera inclusiva el promotor de
polihedrina el residuo A del codón inicial para el gen de
polihedrina y las secuencias 3' no codificantes incluyendo la señal
de poliadenilación. A ambos lados de las secuencias de polihedrina
se encuentran secuencias virales flanqueantes. El vector de
transferencia contiene secuencias procariotas para multiplicación en
bacterias (Matsuura y otros, 1987).
El plásmido pEP-51.6 (Noteborn y
otros 1992a) contiene secuencias de ADN de CAV de las posiciones 791
a 2319. La inserción de ADN de CAV contiene la región de
codificación completa para la proteína VP1 flanqueada por
secuencias de 62 pares de bases 5'- 117 pares de bases 3' - no
codificantes de ADN. El plásmido pEP-51.6 fue
cortado parcialmente con HindIII y a continuación, cortado por
completo con EcoRI y los "extremos adhesivos" se llenaron por
medio de polimerasa de Klenow. Se aisló un fragmento de ADN de CAV
de 1,53 kb. El plásmido pAcYM1 fue linealizado con BamHI, los
extremos adhesivos se llenaron por medio de polimerasa de Klenow y
finalmente se trataron con fosfatasa alcalina (CIP). El fragmento
de ADN de CAV de 1,53 kb fue ligado en el ADN de pAcYM1
linealizado. La orientación de VP1 en el ADN de pAcYM1 se determinó
por análisis de encima de restricción y el constructo final pAcVP1
se muestra en la figura 4.
El plásmido pEP-24.0 (Noteborn y
otros, fechas no publicadas), contiene el fragmento de ADN de BamHI
de 1,15 kb, con secuencias de ADN de CAV de las posiciones 354 a
1508 (Noteborn y De Boer, 1990). Este fragmento de ADN de CAV
contiene la región de codificación para VP2 flanqueada por
secuencias de 26 pares de base 5'-y 484 pares de
bases 3'-no codificante de ADN. 106 pares de bases
más abajo del codón inicial para VP2, se encuentra el codón inicial
de VP3 en otro marco de lectura y la otra secuencia de codificación
para VP3. El plásmido pEP-24.0 fue tratado con
BamHI; el fragmento de 1,15 kb de ADN fue aislado y ligado en el
plásmido pAcYM1 de 9,3 kb tratado por CIP y linealizado por BamHI.
El constructo final de ADN pAcVP2 fue caracterizado con encimas de
restricción y se muestra en la figura 4.
El plásmido pEP-13.3 (Noteborn y
otros, fechas sin publicadas) contiene el fragmento de 0,46 kb de
ADN BamHI-EcoRI con secuencias de ADN de CAV de las
posiciones 427 a 868 (Noteborn y De Boer, 1990). El fragmento de ADN
de CAV contiene la región de codificación para secuencias de VP3,
58 bp 5'- y 25 bp 3'- no codificante de ADN. El plásmido
pEP-13.3 fue cortado con encimas de restricción
BamHI y EcoRI y el fragmento de 0,46 kb de
BamHI-EcoRI fue aislado. Se linealizó el vector de
transferencia de ADN pAcYMI con BamHI y se trató con CIP y se aisló
un fragmento de 9,3 kb. Los dos oligómeros de ADN sintéticos
5'-GATC-CAACCCGGGTTG-3'
y 5'-AATTCAACCCGGGTTG-3' fueros
hibridizados entre sí y conjuntamente formaron un enlace
BamHI-EcoRI ADN. El enlace de ADN fue ligado en el
0,46 BamHI-EcoRI y el fragmento de ADN BamHI de 9,3
kb. El constructo final pAc-VP3 fue analizado por
digestiones de encimas de restricción y se muestra en la figura
4.
Cada uno de los tres vectores de transferencia
de CAV recombinante fue transfetado separadamente, junto con el
baculovirus recombinante ADN AcRP23-lacZ en células
Sf9. La transfección tuvo lugar con baculovirus ADN
"desnudo" y vector de transferencia ADN. Este genoma de
baculovirus contiene, en vez del gen de polihedrina, el gen lacZ,
bajo regulación del promotor de polihedrina. Después de
recombinación homóloga se obtuvieron baculovirus que tenían siempre
incorporado uno de los tres genes de CAV en vez del gen lacZ y
estaban bajo regulación del promotor del gen de polihedrina. Los
baculovirus que han incorporado correctamente el gen CAV no
contienen ya el gen lacZ. En el primer caso, los virus de CAV
recombinante se caracterizaba por la ausencia de actividad
\beta-galactosidasa en placas de células de
insectos infectadas por baculovirus. Además, la integración de
secuencias de ADN de CAV en el genoma de baculovirus fue determinada
por medio de una sonda de ADN específica de CAV en un experimento de
hibridización.
La expresión de las proteínas de CAV específicas
en células de Sf9 infectadas con CAV recombinante fue analizada por
marcado de proteínas con 3H leucina y electroforesis de gel
PAA-SDS.
La proteína de CAV VP1 tiene un peso molecular
calculado de 51,6 kDa (Noteborn y De Boer, 1990). Los lisados de
células de insectos infectados con baculovirus de VP1 recombinante
contienen una proteína de 52 kDa además de productos baculovíricos
y celulares. La proteína de 52kDa se encontraba ausente de lisados
de células de insectos infectados con el baculovirus
AcRP23-lacZ y en células no infectadas. Las
expresiones in vitro de la secuencia de codificación de VP1
resultaron en una proteína de 52 kDa (Noteborn y De Boer, 1992). Muy
probablemente, VP1 no está glicosilada porque VP1 que es
sintetizada en un lisado de reticulocito de conejo y VP1 sintetizado
en células de insectos tienen el mismo peso molecular.
La traducción del gen que codifica para VP2,
pero que también contiene todas las secuencias de codificación para
VP3, produjo en un sistema in vitro proteínas de CAV
específicas de 30 y 28 kDa y una cantidad reducida de producto de
proteína de 16 kDa. La traducción de únicamente el marco de lectura
abierto que codifica para VP3 en un sistema in vitro, no
obstante, produjo solamente una proteína de 16 kDa. La expresión de
VP2 por baculovirus de VP2 recombinante en células de insectos
infectados produjo productos específicos de aproximadamente 28 kDa
y 30 kDa. Las células Sf9 infectadas con baculovirus lacZ
recombinante no contienen estas proteínas específicas de CAV. El
producto de 16 kDa específico de CAV se pudo manifestar en muy
pequeñas cantidades solamente. Estos datos muestran que el
baculovirus VP2 recombinante expresa fuertemente la proteína VP2 y
expresa VP3 pero en un grado menor. Una posible explicación de ello
es que un codón de inicio interno en un gen dispuesto en el genoma
del baculovirus se utiliza de manera muy ineficaz.
El baculovirus de VP3 recombinante sintetizado
en células de insectos infectados muestra un producto principal de
16 kDa y cantidades pequeñas de algunas proteínas que tienen pesos
moleculares aproximadamente de 21.000 y
12.000-14.000. En un ensayo de inmunofluorescencia
el anticuerpo monoclonal específico de CAV
CVI-CAV-85,1 reaccionó
específicamente con células Sf9 expresando VP3. Este anticuerpo
monoclonal precipitó específicamente solamente una proteína con un
peso molecular de 16.000 a partir de lisados de células Sf9 marcadas
radioactivamente infectadas con baculovirus recombinante de VP3. En
un análisis de escaneado ("pepscan") (Geysen y otros, 1984) el
epítopo del anticuerpo monoclonado
CVI-CAV-85.1 fue localizado en el
término N de VP3. El análisis "pepscan" se muestra en la figura
5.
En el caso de la anemia de los pollos se ha
determinado que los anticuerpos neutralizantes se correlacionan de
manera apropiada con la protección. La proteína de CAV o varias
proteínas de CAV que inducen anticuerpos neutralizantes en pollos
fueron por lo tanto la base de una vacuna subunitaria.
En el primer caso los inventores han examinado
cuales son las proteínas de CAV capaces de inducir anticuerpos
contra neutralización de CAV en pollos. Se inyectaron grupos de 8
pollos con edades aproximadamente de 6 semanas con lisados de
10^{6} o 10^{8} de células de Sf9 infectadas con CAV
recombinante emulsionadas en adyuvante de Freund completo. Como
control se inyectó un grupo de 8 pollos con tampón PBS emulsionado
en adyuvante de Freund completo. Antes de la inmunización y 2, 4 y
6 semanas después de la inmunización se tomaron muestras de sangre.
Ninguno de los animales de control inyectados con PBS en adyuvante
de Freund completo desarrolló anticuerpos neutralizantes contra CAV
(Tabla 1). Asimismo, pollos inyectados con lisados de 10^{6} o
10^{8} células de insectos e infectados con baculovirus de VP2
recombinante o de VP3 recombinante no desarrollaron anticuerpos
neutralizantes contra CAV. Tres de los pollos inyectados con lisado
de 10^{6} células de insecto de baculovirus de VP1 recombinante
infectado, y dos de los pollos inyectados con una dosis de 10^{8}
células infectadas, desarrollaron concentraciones bajas variando
entre 1:8 y 1:32.
Los inventores llegan a la conclusión de que las
tres proteínas de CAV recombinante, si se inyectan separadamente en
el pollo, no inducen o lo hacen de manera muy ligera, anticuerpos
neutralizantes contra CAV.
Como consecuencia, los inventores han estudiado
si la combinación de las tres proteínas de CAV recombinante es
capaz de inducir anticuerpos neutralizantes en el pollo. Con este
objetivo se infectaron células Sf9 simultáneamente con los tres
baculovirus de CAV recombinante. Se prepararon lisados en crudo de
10^{6} o 10^{8} de las células infectadas que, por lo tanto,
contenían VP1 + VP2 + VP3 recombinante. Se inyectaron grupos de ocho
pollos con edades de 6 a 8 semanas con estos lisados emulsificados
en adyuvante de Freund completo. Como control se inyectó un grupo
de ocho pollos con tampón PBS emulsionado en coadyuvante de Freund
completo. Cinco semanas después de la inmunización los ocho pollos
inmunizados con lisado de 10^{6} células infectadas se observó
que tenían concentraciones neutralizantes comprendidas entre 32 y
256, mientras que siete de los ocho animales inmunizados con
10^{8} células tenían concentraciones entre 16 y 512 (Tabla 2a).
Siete semanas después de la inmunización todos los animales de
ambos grupos se observó que habían desarrollado una concentración
neutralizante contra CAV. El grupo de pollos inyectado con tampón
PBS se observó que no había desarrollado respuesta inmune
neutralizante demostrable contra CAV.
¿Es realmente necesaria para la inducción de
anticuerpos neutralizantes contra CAV que las tres proteínas de CAV
sean sintetizadas simultáneamente en células de insectos? Para
contestar a esta pregunta se infectaron células Sf9 separadamente
con baculovirus recombinantes de VP1, VP2 y VP3. Entonces los
lisados de células en crudo fueron combinados, mezclados con
adyuvante de Freund e inyectados en un grupo de 8 pollos. Como
preparados de control se utilizó un lisado en crudo de células Sf9
con las cuales sintetizaron las tres proteínas de CAV
simultáneamente y tampón PBS. Ambos preparados fueron emulsionados
en coadyuvante de Freund completo y a continuación inyectados en
grupos separados cada uno de ellos de 8 pollos.
Se observó que sueros del grupo de pollos
inyectados con lisados en crudo de células Sf9 en las que se habían
sintetizado separadamente las 3 proteínas de CAV no contenían
anticuerpos neutralizantes contra CAV o lo hacían en muy pequeña
cantidad. No obstante, los animales del grupo de control inyectado
con lisados en crudo de células Sf9 que sintetizaron conjuntamente
las tres proteínas de CAV se observó, tal como se esperaba, que
habían desarrollado respuesta inmune neutralizante. Los animales
inyectados con tampón PBS se observó que eran negativos (Tabla
2b).
Los anteriores experimentos de inmunización
mostraron que 3 proteínas de CAV recombinante expresados
conjuntamente en células Sf9 inducían anticuerpos neutralizantes
contra CAV. En un experimento siguiente se examinó si combinaciones
de 2 proteínas de CAV eran también capaces de inducir anticuerpos
neutralizantes. En este caso los anticuerpos de las yemas de huevos
de animales madre inmunizados fueron objeto de medición.
Se inyectaron cuatro grupos de 16 pollos con
edades de 33 semanas con un lisado crudo de células de Sf9 que
habían sido infectadas simultáneamente con diferentes combinaciones
de baculovirus de CAV recombinante. Los preparados que contenían
VP1 + VP2 + VP3 o VP1 + VP2 indujeron en la mayor parte de animales
anticuerpos neutralizantes claramente demostrables en sus huevos
(Tabla 3). Los huevos de pollos inyectados con preparados que
contenían VP1 + VP3 o VP2 + VP3 se observó que no tenían titulación
clara de anticuerpos neutralizantes en las yemas. Solamente las
yemas de huevo de uno de los pollos examinados se observó que
contenía bajas concentraciones de anticuerpos neutralizantes. Los
huevos del grupo de control de 16 pollos inyectados con tampón PBS
se observó que no contenían anticuerpos neutralizantes.
Los datos de los experimentos antes mencionados
con proteínas de CAV recombinante muestran que VP1 + VP2
conjuntamente son necesarias y suficientes para la inducción de
anticuerpos neutralizantes contra infecciones por CAV. No obstante,
no se puede eliminar una pequeña cantidad de VP3 en los preparados
VP1 + VP2.
Los anticuerpos maternales protegen a los pollos
jóvenes contra síntomas clínicos provocados por una infección por
CAV. Los inventores han estudiado que grupos de pollos inmunizados
con proteínas de CAV recombinantes específicas quedaron protegidos
en las crías contra infección por CAV. En este caso el virus se
aisló y se observaron los síntomas clínicos característicos de CAV,
es decir: atrofia del timo, hematocrito reducido y mortalidad
incrementada.
Los grupos de crías entre 23 y 35 días de edad
se infectaron con una elevada dosis de CAV. Seis días después de la
infección 5 animales sometidos a seccionado y con animales madre
inyectados con tampón PBS, se observó que tenían en todos los casos
timo macroscópicamente visiblemente reducido. En el caso de crías de
animales madre inyectados con VP2 + VP3 recombinante, 4 de los 5
animales tenían timo pequeño. No obstante, las 5 crías sometidas a
seccionado de animales madre inyectados con 3 proteínas de CAV
recombinante conjuntamente se observó que tenían timo normal. En el
grupo de crías de animales madre tratados con VP1 + VP2 solamente 1
de 5 animales examinados se observó que tenía timo reducido (Tabla
4). Catorce días después de la infección, nuevamente se sometieron
a seccionado 5 animales por grupo. Todas las crías de animales madre
inmunizados con VP2 + VP3 recombinante o tampón PBS sufrieron
atrofia del timo. Las crías examinadas del grupo de animales
inyectados con 3 proteínas de CAV recombinante conjuntamente se
observó que tenían timo normal en todos los casos. Solamente 1 de
los 5 pollos examinados de los animales inyectados con VP1 + VP2
recombinante se observó que tenía timo reducido (Tabla 4). Un
experimento independiente mostró que crías de animales madre
inyectados con VP1 + VP3 recombinante tenían timos reducidos, tal
como se describe para la cría de animales madre inyectados con VP2
+ VP3 recombinante (Koch, resultados no publicados). Catorce días
después de la infección el hematocrito de las crías infectadas con
CAV fue objeto de determinación. Se seleccionó un hematocrito de 27%
como límite de anemia. Las crías de animales madre inyectados con
tampón PBS se observó que tenían en todos los casos un hematocrito
fuertemente reducido con valores variables entre 7 y 19% (Tabla 5).
Las crías de los animales madre inyectados con VP2 + VP3
recombinante tienen un promedio ligeramente más elevado de
hematocrito. En estos grupos solamente un animal único tenía un
hematocrito superior a 27. Un experimento independiente mostró que
también las crías de animales madre inyectados con VP1 + VP3
recombinante tenían hematocrito reducido (Koch, resultados no
publicados). De las 35 crías examinadas de animales inyectados con
preparados que contenían VP1, VP2 y VP3 solamente un animal tenía
hematocrito desviado, mientras que en el grupo de VP1 + VP2 2 de los
29 animales examinados tenían un hematocrito por debajo de 27%.
Se observó una elevada mortalidad con crías de
animales madre inyectados con VP2 y VP3 recombinante, 50,9% y con
PBS, 48,3%. En el grupo de crías de animales madre inyectados con
VP1 + VP2 + VP3 recombinante la mortalidad es de 9% y con VP1 + VP2
de 15,4%. No obstante, la mayor parte de los animales murieron
dentro de los 5 días después de la infección. La mortalidad
provocada por una infección por CAV tiene lugar, en general, algo
más tarde. Por esta razón, los inventores han distinguido en la
tabla 6 entre mortalidad antes del día 14 y después del día 14
después de la infección. La mortalidad antes del día 14 es
frecuentemente aespecífica, entre otros factores, como resultado de
la inyección. La mortalidad después del día 14 tiene lugar en el
grupo de animales con anticuerpos maternos contra VP1+ VP2 + VP3,
7%; VP1 + VP2, 0%, VP2 + VP3, 27,4% y en el grupo de control 20,7%.
En el grupo VP2 + VP3, 8 animales murieron después de tomar muestras
de sangre para determinar el hematocrito como resultado del mal
estado de los pollos, muy probablemente provocado por la anemia. En
el grupo PBS, dos animales murieron durante la toma de la sangre.
Todos estos animales tenían timo claramente reducido.
La anemia en las crías infectadas por CAV se
examinó llevando a cabo un aislamiento de virus en células de
sangre. Muestras de sangre en heparina de 5 animales por grupo se
tomaron en los días 6 y 14 después de la infección. Las crías de
los animales madre inyectados con VP2 + VP3 o PBS y que no tenían
prácticamente protección contra infecciones CAV, se observó que
contenían concentraciones de virus relativamente altas a los 6 y 14
días después de infección. Seis días después de la infección, las
crías de animales inyectados con VP1 + VP2 + VP3 o VP1 + VP2, se
observó que contenían una concentración de virus claramente más baja
que en las crías antes mencionadas. Catorce días después de la
infección, solamente el grupo de crías de animales inyectados con
VP1 + VP2 + VP3 tenían una concentración de virus claramente más
baja que los otros tres grupos.
Los resultados de la inducción de anticuerpos
neutralizantes en animales madre muestran que las proteínas VP1 y
VP2 de CAV recombinantes son muy importantes para la inducción de
una respuesta inmune neutralizante. Los experimentos de infección
muestran que la proteína VP3 de CAV recombinante proporciona una
protección suplementaria, además de la obtenida por el efecto de VP1
+ VP2.
Para la producción de anticuerpos monoclonales
contra CAV, se inyectaron ratones con lisados en crudo de células
Sf9 coinfectadas con baculovirus de VP1, VP2 y VP3 recombinante. En
total se obtuvieron 9 líneas celulares de hibridoma distintas,
produciendo anticuerpos monoclorales contra antígenos de CAV.
Transferencias Western con antígenos de CAV
producidos con el sistema de expresión de baculovirus demostraron
que los anticuerpos monoclonales (111,1), (111,2), (111,4),
(112,1), (112,2), (120,1) y (120,2) están fuertemente dirigidos
contra VP2 y los anticuerpos monoclonales (111,3) y (120,3)
fuertemente dirigidos contra VP3. Los anticuerpos monoclonales que
reaccionan fuertemente con VP2, muestran en todos los casos una
reacción cruzada débil con VP3. Inversamente, los anticuerpos
monoclonales dirigidos contra VP3 muestran una reacción cruzada
débil con VP2.
Una prueba de neutralización de suero demostró
que ninguno de los anticuerpos monoclonales obtenidos tenía
actividad neutralizante contra CAV, a pesar del hecho de que los
sueros de los ratones inmunizados utilizados para preparar los
hibridomas tenían actividad neutralizante contra CAV.
En un análisis de escaneado ("pepscan")
(Geysen y otros, 1984) el epítopo del anticuerpo monoclonal (112,2)
fue localizado en la mitad de VP2 (figura 6). El anticuerpo
monoclonal (111,3) se observó que estaba dirigido contra un epítopo
en el terminal extremo N de VP3 (figura 7), es decir, contiguo al
epítopo de VP3 reconocido por los anticuerpos monoclonales
CVI-CAV-85,1 (figura 5).
La inmunofluorescencia mostró que anticuerpos
monoclonales dirigidos contra VP2 y VP3 reconocen estructuras
específicas en células MDCC-MSB1 infectadas con CAV.
Ninguno de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos
de CAV reaccionaron con células MDCC-MSB1 no
infectadas. Los anticuerpos monoclonales específicos de VP2
reconocen otras estructuras que los anticuerpos monoclonales
específicos de VP3 en células infectadas por CAV.
\newpage
Jeurissen y otros han demostrado que el CAV
provoca apoptosis en timocitos infectados. Los inventores han
estudiado si una de las proteínas de CAV, en particular VP3, es
capaz de inducir independientemente apoptosis en células T de
pollos.
Las secuencias de codificación para VP3 se
clonaron en el vector de expresión pRSV-20H. El
fragmento
Bam-HI-Eco-RI de
0,46 kb con secuencias de ADN de CAV de posiciones
427-868 (Noteborn y otros, 1991) fueron aisladas del
plásmido pEP-13,3. El fragmento de ADN de CAV
contiene las secuencias de codificación para VP3 y además,
secuencias que flanquean 58 pares de bases 5' y 25 pares de bases
3'. El vector pRSV-H20 se ha linealizado con BgIII,
tratado con CIP y se aisló un fragmento de 4,3 kb. Se hibridizaron
dos oligómeros de ADN sintético
5'-GATCCAACCCGGGTTG-3' Y
5'-AATTCAACCCGGGTTG-3' y de este
modo, se formó un enlace de doble hebra BamHI-EcoRI.
El enlace de ADN de BamHI-EcoRI y el fragmento de
0,46 kb de ADN BamHI-EcoRI se ligaron en el
fragmento de 4,3 kb de ADN BgIII. El constructo final
pRSV-VP3 contenía la región de codificación para VP3
bajo regulación del promotor de virus de sarcoma de Rous y fue
controlado por análisis de encima de restricción (figura 8a;
Noteborn y otros, 1993).
Se transfectaron células
MDCC-MSB1 con ADN de pRSV-VP3 por
medio del método de dextrano DEAE. Cuarenta y dos horas después de
la transfección las células fueron fijadas y analizadas para
expresión de VP3 por manchado con
CVI-CAV-85,1 monoclonal. Las células
fueron también manchadas con ioduro de propidio, que mancha muy
fuertemente el ADN de núcleos intactos pero, de forma débil, el ADN
de núcleos apópticos (Telford y otros, 1992). Más del 90% de las
células transfectadas contenía una distribución de gránulos finos de
VP3 en el núcleo que fue manchado con ioduro de propidio. Dos días
después de infección, 40% de las células expresando VP3 se observó
que contenían núcleos débilmente manchados con ioduro de propidio y
se encontraba presente VP3 en forma de agregados. Tres días y más
adelante después de la infección, más del 90% de las células que
contenían VP3 se observó que contenían agregados de VP3 y ADN que
estaban débilmente manchados de ioduro de propidio (figura 9). Tres
días después de la transfección, el ADN de las células transfectadas
de VP3 mostraron la escalera oligonucleosomal, característica de la
apoptosis.
La distribución de VP3 observada en células
transfectadas corresponde por completo con células
MD-CC-MSB1 infectadas por CAV. Poco
tiempo después de la infección (1-1,5 días más
tarde), la VP3 está distribuida de forma granular fina en el
núcleo. El ADN celular está todavía intacto en esta etapa. Más
adelante de la infección (aproximadamente después de 3 días) VP3
forma agregados en el núcleo (Koch, fecha no publicada). El ADN de
las células infectadas por CAV es fragmentado (Jeurissen y otros,
1992).
La conclusión de los inventores es de que VP3 es
capaz por sí misma de inducir apoptosis específica de CAV en
células MDCC-MSB1. La expresión de ADN
pRSV-VP3 que codifica para VP3 en la línea de
células de monocitos LSCC-HD11 condujo también a la
apoptosis de estas células.
La expresión de la proteína VP2 en células
MDCC-MSB1 conduce también a daños en el ADN celular.
Tres días después de la infección de células
MDCC-MSB1 con ADN que codifica para VP2 en 20% y
después de 5 días, aproximadamente en la mitad de las células
transfectadas, los núcleos están débilmente manchados con ioduro de
propidio. Por lo tanto, también VP2, aunque en un menor grado que
VP3, parece involucrado en la inducción de la muerte celular
específica de CAV.
La VP3 es una proteína de 121 aminoácidos de
longitud, contiene dos fragmentos ricos en prolina, una zona
hidrofóbica y dos zonas fuertemente cargadas de modo positivo
(figura 8b). Las zonas cargadas positivamente son posiblemente
señales de localización de núcleo y/o dominios de unión de ADN
(Noteborn y otros, 1987; Ramakrishnan, 1993).
Los inventores han estudiado si el terminal C
básico extremo de VP# está involucrado en la actividad apóptica de
VP3. Con este objetivo, se preparó un producto de VP3 truncado
realizado por delección de 11 codones en el término C de las
secuencias que codifican VP3. El plásmido pEP-VP3
fue cortado con las encimas de restricción BamHI y HindIII y el
fragmento de 0,38 kb de ADN de BamHI-HindIII fue
aislado. Dos oligómenos de ADN sintético
5'-AGCTTGATTACCACTACTCCCTGAG-3' Y
5'-TCGACTCAGGGAGTAGTGGTAATCA-3' se
hibridizaron y formaron de este modo conjuntamente el enlace
HindIII-Sall ADN de doble hebra. El plásmido
pRSV-H20 fue cortado con BgIII y SaII tratado con
fosfatasa alcalina y se aisló un fragmento de ADN de 4,3 kb. El
enlace de ADN de HindIII-SaII y el fragmento de
0,32 kb de BamHI-HindIII se ligaron al fragmento de
4,3 kb de BgIII-SaII. El constructo final
pRSV-tr que contenía las secuencias de codificación
para la proteína VP3 truncada bajo la regulación del promotor de RSV
(figura 8a) fue analizado por medio de enzima de restricción y
análisis de secuencia.
Células de MDCC-MSB1 fueron
transfectadas transitoriamente con ADN de pRSV-tr y,
en diferentes momentos después de la transfección, fueron manchadas
con CVI-CAV-85,1 monoclonal y ioduro
de propidio. La inmunofluorescencia mostró que 42 horas después de
la transfección, la mayor parte de las células que expresaban VP3
truncada contenían VP3 granular fina en sus núcleos. El ADN celular
estaba fuertemente manchado con ioduro de propidio. Tres días
después de la transfección todavía el 80% de las células que
expresaban VP3 truncado tenían núcleos con ioduro de propidio
fuertemente manchado (figura 9). El ADN aislado de células
MDCC-MSB1 a los 3 días después de la transfección
con pRSV-tr se observó que se encontraba mucho menos
degradado que el ADN aislado de células
MD-CC-MSB1 aisladas de
pRSV-VP3. La fracción de núcleos positivos de ioduro
de propidio de células que expresan VP3 truncada disminuyó
lentamente hasta aproximadamente 50% a los 5 días después de
transfección. La mayor parte de las células que contenían VP3
truncada y manchadas débilmente por ioduro de propidio tenían una
distribución granular de VP3. Solamente una célula contenía
agregados de VP3.
La expresión de VP3 truncado en células
MD-CC-MSB1 aparentemente induce
muerte celular de manera mucho más eficaz que la expresión de VP3
de tipo salvaje. También es notable que el mutante de VP3 pueda
forma muchos menos agregados que el tipo salvaje de VP3.
Para la expresión de VP3 en células humanas, se
utilizaron los vectores de expresión pRSV-VP3
(figura 8) y pCMV-VP3. Las secuencias de
codificación para VP3 fueron clonadas en el vector de expresión
pCMV-neo que contenía el promotor fuerte del gen
muy inmediato de citomegalovirus (CMV) (Boshart y otros, 1985). El
fragmento 0,46 BamHI con secuencias de ADN de CAV de las posiciones
427-868 (Noteborn y otros, 1991) fueron aislados del
plásmido pAc-VP3 (figura 4). El vector
pCMV-neo fue linealizado con BamHI tratado
con CIP y se aisló un fragmento de 7,5 Kb. El fragmento de ADN 0,46
BamHI fue ligado en el fragmento de ADN 7,5 BamHI. La
orientación apropiada de la secuencia de codificación de VP3 con
respecto al promotor de CMV en el constructo final
pCMV-VP3 fue determinada por medio de análisis de
encima de restricción (figura 10).
Para la expresión del VP3 truncado en células
humanas se dotó al fragmento 0,46 kb XhoI-SaII del
plásmido pRSV-tr que codifica para VP3 truncada
(figura 8a) con extremos romos por tratamiento con polimerasa de
Klenow siendo aislados. El vector pCMV-neo fue
linealizado con BamHI, dotado de extremos romos y defosforilado por
tratamiento con CIP. El fragmento de ADN con extremo romo de 0,46 kb
fue ligado en el extremo romo 7,5 del fragmento de ADN. El
constructo pCMV-tr contiene las secuencias de
codificación para VP3 truncada bajo regulación del promotor de CMV
(figura 10).
En el primer caso, la VP3 fue expresada en 3
líneas celulares de tumor hematopoyético humano
KG-1, DOHH-2 y K562 y en una línea
celular inmortalizada Jobo-0. Las líneas celulares
KG-1 y K562 han sido derivadas de diferentes
pacientes con leucemia mieloide humana (Koeffler and Golde, 1980) y
DOHH-2 de un paciente con B-linfoma
folicular (Landegent y otros., resultados no publicados). Las
células Jobo-0 fueron inmortalizadas con el Virus
Epstein Barr (Landegent, resultados no publicados). Las 4 líneas
celulares humanas fueron transfectadas con ADN de
pRSV-VP3 (KG-1) o ADN de
pCMV-VP3 (DOHH-2, K562 y
Jobo-1). Las células fueron fijadas y analizadas
para expresión de VP3 por manchado con
CVI-CAV-85.1 monoclonal e inducción
de apóptosis por manchado con ioduro de propidio. Poco tiempo
después de la transfección se observaron células VP3 positivas con
una distribución granular fina de VP3 en el núcleo que fue manchada
con ioduro de propidio y células VP3 positivas con núcleos que
contenían agregados de VP3 con núcleos que no se manchaban con
ioduro de propidio. El porcentaje de células VP3 positivas con
núcleos que no se manchaban con ioduro de propidio y que contenían
agregados de VP3 se observó para las cuatro líneas celulares
hematopoiéticas diferentes que se encontraban entre 75 y 95% 5 días
después de la transfección (figura 11a). A continuación, células
K562 fueron transfectadas con ADN del plásmido
pCMV-tr que expresa VP3 truncada con terminal C. La
expresión de VP3 truncada en células K562 indujo la muerte celular
de manera mucho más eficaz que con el tipo salvaje de VP3.
La conclusión de los inventores es que la
expresión de VP3 en células hematopoiéticas de tumores humanos
conduce a la inducción específica de apóptosis. La expresión de VP3
en las células del tumor de seno humano, según línea celular
MCF-7 (Lippmann y otros. 1980) resultó también en la
inducción de apóptosis (Noteborn y otros., resultados no
publicados).
En la literatura se describe que los tumores
(humanos) y líneas celulares tumorales que no contienen p53
funcional son menos susceptibles o no lo son a la inducción de
muerte celular por quimioterapia y tratamiento de radiaciones (Lowe
y otros., 1993). El gen p53 supresor de tumores actúa como
intermediario en la inducción de apóptosis por agentes
antitumorales específicos. Los inventores han examinado si la VP3 es
capaz de inducir apóptosis en células humanas que no poseen p53 o
poseen p53 mutado. La VP3 fue expresada en células de osteosarcoma
humano por medio de transfección de DEAE-dextrano
con el plásmido pCMV-VP3. Las células
Saos-2 derivadas de osteosarcoma no pueden
sintetizar p53 y las células Saos-2/alal43 expresan
p53 mutado y, por lo tanto, no funcional. Como control positivo, la
línea celular U2-OS conteniendo el tipo salvaje p53
fue utilizada (Diller, y otros., 1990). Los resultados que se
indican en la figura 12a muestran que la VP3 puede inducir apóptosis
en un grado comparable en células que son
p53-(Saos-2 y Saos-2/Alal43) o
p53^{+} (U2-OS). Seis días después de la
transfección, la mayor parte de las células VP3 positivas son
apópticas. La expresión de VP3 truncada indujo una apóptosis mucho
menos eficaz en células Saos-2 (figura 12b). La
conclusión de los inventores es que la VP3 puede inducir, de manera
específica, apóptosis en células de tumores humanos que contienen o
no el gen supresor de tumores p53.
La figura 1 indica la secuencia de ADN y la
secuencia de aminoácido de la proteína VP1 del Virus de la Anemia de
Pollos. La numeración del ADN de CAV en sus secuencias es la
indicada en la patente Holandesa nº 9002008.
La figura 2 indica la secuencia de ADN y la
secuencia de aminoácido de la proteína VP2 del Virus de la Anemia de
Pollos. La numeración del ADN de ACV en sus secuencias es la
indicada en la patente Holandesa nº 9002008.
La figura 3 indica la secuencia del ADN y la
secuencia de aminoácido de la proteína VP3 del Virus de la Anemia de
Pollos. La numeración del ADN de CAV en sus secuencias es la
indicada en la patente Holandesa nº 9002008.
La figura 4 muestra la representación
esquemática de los 3 vectores de transferencia recombinantes de CAV
pAc-VP1, pAc-VP2 y
pAc-VP3.
La figura 5 muestra el análisis de escaneado
("pepscan") del anticuerpo monoclonal
CVI-CAV-85.1 con péptidos
(12-mers) derivados de VP3. La secuencia de núcleo
PSTVFR, contra la cual se dirige el monoclonal
CVI-CAV-85.1, se encuentra en las
posiciones 12 a 17 de la secuencia de aminoácidos de la VP3
(Noteborn y otros., 1991).
La figura 6 muestra el análisis "pepscan"
de anticuerpo monoclonal 111.2 con péptidos (12 mers) derivados de
VP2. El monoclonal 111.2 está dirigido contra el epítopo GLEDRSTQ
que se encuentra en las posiciones 109 a 116 de la secuencia de
aminoácidos de VP2 (Noteborn, y otros., 1991). Solamente los
resultados obtenidos con los péptidos números 1 a 140 se han
indicado (extinción de los péptidos números 141 a
206\leq0,103).
La figura 7 muestra el análisis pepscan del
anticuerpo monoclonal 111.3 con péptidos (12-mers)
derivados de VP3. El 111.3 monoclonal está dirigido contra el
epítopo PTSSR que se encuentra en las posiciones 19 a 23 de la
secuencia de aminoácidos de VP3 (Noteborn y otros., 1991).
Figura 8. El panel A muestra la representación
esquemática de los 2 vectores de expresión pRSV-VP3
y pRSV-tr. El panel B muestra la secuencia de
aminoácidos de la proteína VP3 de CAV. Los residuos de prolina se
han impreso en letra cursiva y los aminoácidos básicos en tipos
normales. Los aminoácidos del terminal 11 C, cuyos codones han sido
suprimidos en los vectores de expresión, están subrayados.
La figura 9 muestra la cinética del efecto
apóptico de VP3 o de VP3 truncada. Las células
MDCC-MSB1 fueron transfectadas con los plásmidos
pRSV-VP3 (o) o pRSV-tr (o), fijados
y manchados con el anticuerpo monoclonal
CVI-CAV-85.1 en diferentes tiempos
después de la transfección. Los porcentajes de las células
inmunofluorescentes con núcleos, que normalmente manchan con ioduro
de propidio, quedan también indicados. Por experimento, se contaron,
como mínimo, 100 células que habían expresado VP3 o VP3
truncada.
La figura 10 muestra una representación
esquemática de los vectores de expresión pCMV-VP3 y
pCMV-tr.
La figura 11 muestra la cinética del efecto
apóptico de VP3 en células hematopoiéticas (tumorales) humanas. La
línea celular KG1 fue transfectada con el plásmido
pRSV-VP3, y las líneas celulares
DOHH-2, K562 y Jobo-0 fueron
transfectadas con el plásmido pCMV-VP3. Los
porcentajes de células positivas de VP3 con núcleos que manchan
débilmente con ioduro de propidio, células apópticas, están también
indicados. Por experimento se contaron, como mínimo, 200
células.
La figura 12 muestra la cinética del efecto
apóptico de VP3 sobre líneas celulares de osteosarcoma humano. Las
células de las líneas celulares Saos-2,
Saos-2/Alal43 y U2-OS fueron
transfectadas con el plásmido pCMV-VP3. Los
porcentajes de células positivas VP3 con núcleos que manchan
débilmente con ioduro de propidio, células apópticas, quedan también
indicadas. Por experimento se contaron, como mínimo, 500
células.
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Claims (3)
1. Polipéptido derivado del virus de anemia de
pollos, desprovisto de su medio ambiente natural, cuyo polipéptido
comprende la secuencia presentada en la figura 3, en cuyo
polipéptido se realiza una mutación que disminuye la capacidad de
inducción de apoptosis, en el que dicho polipéptido mutado comprende
como mínimo los primeros 110 aminoácidos N terminales tal como se ha
mostrado en la figura 3.
2. Método para obtener un polipéptido, según la
reivindicación 1, que comprende el clonado del marco de lectura
abierto en un vector de baculovirus, expresando dicho polipéptido en
células Sf9 y preparando un lisado de células en crudo.
3. Anticuerpo o derivado de un fragmento del
mismo, dirigido contra un polipéptido según la reivindicación 1.
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