JPH11510367A - ニワトリ貧血ウイルスの中和性立体配座エピトープ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ニワトリ貧血ウイルスの立体配座中和性エピトープの生産、およびＣＡＶの感染を予防または治療するための組成物、特に、ＣＡＶそれ自体よりも病原性が低いワクチン。これらすべての組成物は、ＣＡＶ感染に対する保護免疫応答に必要とされる立体配座中和性エピトープを合成することが示された。本発明は、ＣＡＶゲノムに由来する組換えＤＮＡ分子、および他のウイルスベクターのゲノムに一体化されたＣＡＶゲノムの組換えＤＮＡ断片を提供する。特に、これらの組成物は、ＣＡＶ感染に対するサブユニットワクチン、組換え型生ウイルスワクチンおよび弱毒化ワクチンを含む。また、本発明は、ＣＡＶに対して向けられた中和性抗体の生産およびＣＡＶの検出用診断キットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ニワトリ貧血ウイルスの中和性立体配座エピトープ 発明の要約 本発明は、ワクチン接種動物において保護免疫応答を誘導するのに必要な、Ｃ ＡＶ蛋白質ＶＰ１の中和性立体配座エピトープの形成および特徴付けを提供する 。 特に、ＣＡＶに対する中和抗体の生産について記載されている。診断テストに おいて、これらの生産された中和抗体に基づいて、ＣＡＶ（粒子）が検出される 。 ＣＡＶインターフェロンに対する種々のワクチンベクターが開示されている。 全てのこれらのワクチンはＣＡＶよりも病原性が低い。全てのこれらのワクチン ベクターはＣＡＶの必要な中和性立体配座エピトープを生産することが示される 。 １つのベクターは、同一細胞においてＶＰ１およびＶＰ２双方を発現するバク ロウイルスに基づいて、サブユニットワクチンを提供する。第２のタイプのワク チンは生きたウイルスベクターであり、ＶＰ１およびＶＰ２についてのコーディ ング配列を安定に保有するマレク病ベクターを含む。第３のＣＡＶワクチンは、 細胞病原性効果が低下した、遺伝子的に弱毒化されたＣＡＶ株を含む。 発明の背景 ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）は、直径２３ないし２５ｎｍの粒子、および 環状一本鎖（マイナス鎖）ＤＮＡよりなるゲノムを持つユニークなタイプの小ウ イルスである（Gelder blomら，1989，Notebornら，1991,およびToddら，1990） 。このＤＮＡは、最近クローン化され、全配列が決定された環状二本鎖複製中間 体を介して、感染細胞において増殖する。ＣＡＶゲノムは２３１９ヌクレオチド 長である(NotebornおよびDe Boer，1990)。異なる大陸で単離されたＣＡＶ株の ＤＮＡ分析は、種々のウイルス単離体の間で些細な差異しかないことを明らかと した（Meehanら，1992;受託番号Ｍ81223、Claessensら，1991;Ｄ10068、Katoら ，1995; Ｄ31965およびPallisterら，1994 Sofneら，1993および1994;Ｌ14767） 。最近、ゲノム構造に基づいて、ＣＡＶはシルコウイルスの新規なウイルス科に 入 れられてきた。しかしながら、ＣＡＶは、ブタ・シルコウイルスおよびオウム嘴 −羽病ウイルスなどの、動物一本鎖環状ＤＮＡウィルスから構成されるこのウイ ルス科の他のメンバーとは関係がない（NotebornおよびKoch，1995）。ＣＡＶゲ ノムは、ＣＡＶ転写を調節する１つの明らかなプロモーター／エンハンサー領域 (Noteborn，1994)を含有する。ＣＡＶゲノムからの主要転写物は、５１．６ｋＤ ａ（ＶＰ１）、２４．０ｋＤａ（ＶＰ２）および１３．３ｋＤａ(ＶＰ３または アポプチン(NotebornおよびKoch，1995，Notebornら，1992およびPhenix，1994) )の３種の蛋白質をコードする約２１００ヌクレオチドのスプライシングされて いないポリシストロニックｍＲＮＡである。全ての３種の予測されるＣＡＶ蛋白 質はＣＡＶ−感染細胞で合成される(NotebornおよびKoch，1995)。同一細胞内で 合成された（組換え）ＶＰ１およびＶＰ２による同時免疫化は、保護応答を誘導 し、ニワトリ感染性貧血に対するサブユニットワクチンとして使用できる(Koch ら，1995およびNotebornおよびKoch，l994c)。 ＣＡＶはニワトリにおいて臨床的な、および無症状の病気を引き起こし、重要 な鳥類病原体として世界的に認識されている(McIlroyら，1992およびMcNultyら ，1991)。１日齢ヒヨコは、ＣＡＶに特に感染しやすい。これらの動物において 、嗜眠、食欲不振および貧血が、ＣＡＶの接種１０日後から観察される。感染後 、死亡率は最大５０％まで増加し得る。年齢が上がると共に、耐性も増加する(J eurissenら，1992)。１−３日齢でＣＡＶに感染したヒヨコのヘマトクリット値 は減少する。１−２１日齢ヒヨコのＣＡＶ感染の結果、特に、胸腺皮質が減少す る。しかしながら、年齢のいったニワトリにおいて、ＣＡＶは無症状で増幅し得 る。年齢のいったニワトリにおけるＣＡＶ感染は、血清変換の発生によって測定 できる。 胸腺皮質細胞の減少は免疫不全を引き起こし、その結果、同時に感染が増加し 、また、ワクチン接種の失敗を招くと考えられる（NotebornおよびKoch，1995） 。胸腺細胞、たいていは赤芽球細胞の減少は、ＣＡＶ誘導アポトーシスを介して 起こる(Jeurisseno，1992a)。ＣＡＶがコードする蛋白質アポプチンはこの現象 の主要な誘発物質である(Noteborn，1994)。 母体抗体はＣＡＶ感染に対して重要な保護を与えることが判明した。Vielitz ら(1991)は、卵当たり子孫に受動的に移される、大量の抗体からのＣＡＶに暴露 された雌鳥を報告している。これらの抗体はニワトリ感染性貧血関連病に対して 保護する。ＣＡＶ−中和抗体は、ＣＡＶ−組換えバクロウイルスで共感染させ、 全ての３種のＣＡＶ蛋白質、または主としてＶＰ１およびＶＰ２が生産された細 胞の溶解物を接種した雌鳥が生んだ卵の黄身において観察された。特異的臨床徴 候は、これらの可孫から孵化したＣＡＶ対抗性の子孫において発生しなかった(K ochら，1995)。 VielitzおよびLandgraf(1988)は、感染性貧血に対するワクチンを開発し、こ れはニワトリ胚で増殖したＣＡＶに基づく。現在、これは商業的に入手できる唯 一のワクチンである。ワクチン接種した繁殖動物の子孫は感染性貧血に対して保 護される。母体免疫化が消失した場合に、鳥類は病気を発症することなくウイル スに感染しやすくなるので、ワクチン接種が可能である。明らかに、非弱毒化ウ イルスに基づく生ワクチンの使用は危険を有する。３週齢ニワトリの実験的感染 の結果、病気は認められないが、免疫系の機能の包括的低下が起こった(McConne lら，1993および1993a)。この知見に関して、McIlroy(1992)は、ＣＡＶは病気は 見られなくとも、かなりの経済的損失を引き起こす証拠を提出した。すなわち、 無症状病は食料変換および平均体重に負に影響し、薬物処理を増大させ、その双 方の結果、かなりの経済的負担が生じる。現在まで、非病原性ＣＡＶは単離され ていない。 バクロウイルス発現系によって合成された組換えＣＡＶ蛋白質は、サブユニッ トワクチンとして使用できる。組換えＣＡＶ蛋白質ＶＰ１およびＶＰ２は母体免 疫性によってニワトリを保護することが示されている(Kochら，1995)。バクロウ イルスベクターは、脊椎動物に対しては非病原性であることが知られている昆虫 特異的ウイルスであるので、それを培養し、過度の危険なくしてニワトリに与え ることができる(VlakおよびKeus，1990)。 一般に、生ウイルスワクチンは良好な免疫応答を誘導し、サブユニットワクチ ンよりも安価である。したがって、種々のCAV蛋白質の免疫原性についての知識 を用いて、弱毒化ＣＡＶ、または、鳥類ヘルペスウイルス（Nakamuraら，1992,M orgenら,1993）または鶏痘ウィルス（Nazeruabら，1992，BoyleおよびHeine,199 3）などの他の組換えウイルスベクターを構築することができる。これらの組換 えウイルスは、それら自身の蛋白質に加えて、ＣＡＶ蛋白質ＶＰ１およびＶＰ２ を発現するはずであり、それらの子孫を感染性貧血に対して保護する産卵鶏繁殖 動物およびブロイラー繁殖動物双方に対するワクチンとして適用することができ る。加えて、かかるベクターを用いて、母体により免疫化ブロイラーを無症状病 から保護することができる。 発明の詳細 本発明は、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）の中和性立体配座エピトープ楕造 の生産および分析に関する。 さらに、ＣＡＶに対して向けられた中和性モノクローナル抗体の生産が開示さ れる。これらの中和性抗体はＣＡＶ蛋白質ＶＰ１の立体配座エピトープに対して 向けられることが知られている。 また、これらの中和性抗体に基づく、ＣＡＶの検出のための診断テストキット も記載する。本発明は、中和性抗体がＣＡＶ粒子を中和するメカニズムについて の証拠を提供する。 ＶＰ１の中和性立体配座エピトープの生成では、同一細胞内のVP2の合成が必 要である。昆虫細胞のみにおいてＶＰ１のみを発現する組換えバクロウイルスは 、ＣＡＶに向けられた中和性抗体と反応しないが、これらの中和性抗体は、ＶＰ １およびＶＰ２が１つの細胞内で合成される場合に反応する。 しかしながら、精製されたＣＡＶキャプシドにおいては、ＶＰ１のみが存在す る。本発明は、ＶＰ１の合成の間に、たいていはＣＡＶキャプシドを生じさせる 複合体形成の間に、ＶＰ２が一時的にＶＰ１に結合することを開示する。ＣＡＶ キャプシドの変性の結果、このことから中和エピトープが破壊され、中和性エピ トープは立体配座エピトープであることが示される。 その上、本発明は、家禽においてウイルス感染、特にＣＡＶによる感染を予防 または治療するためのワクチンおよび組成物に関する。 特に、本発明は、ＣＡＶそれ自体よりは病原性が低いが、依然として、中和性 立体配座エピトープを生産できるワクチンに関する。ニワトリへのこれらのタイ プのワクチンの接種は、中和性抗体の創生に至り、かくして、動物およびそれら の子孫をＣＡＶ感染から保護する。 本発明は、そのゲノム上に別々にＶＰ１またはＶＰ２をコードするコーディン グ配列を含有するバクロウイルスベクターに関する。この組換えバクロウイルス は同一細胞中でＶＰ１およびＶＰ２を合成することができ、その結果、ＣＡＶの 中和性立体配座エピトープが生成される。 また、本発明は、ＶＰ１、ＶＰ２蛋白質をコードするＣＡＶ配列を含有するマ レク病ウイルス（ＭＤＶ）ベクターの構築に関する。特に、この組換えＭＤＶベ クターは、ＶＰ１の中和性立体配座エピトープが適当に生産されるように組換え ＣＡＶ蛋白質を合成する。 さらに、本発明は、種々の弱毒化ＣＡＶ株の形成を記載し、弱毒化ＣＡＶ株は 野生型由来ＣＡＶ株と比較して、ニワトリＴ細胞において低下した細胞変性効果 を示した。弱毒化ＣＡＶ株は、点突然変異をクローン化ＣＡＶ ＤＮＡゲノムに 導入することによって作成され、特にプロモーター／エンハンサー領域内の配列 を突然変異させた。弱毒化ＣＡＶ突然変異株は中和性立体配座エピトープを生産 することができる。 特にニワトリにおけるＣＡＶ感染の予防または制御方法、およびＣＡＶ構成配 列を含む組換え部分の調製方法、およびワクチンの調製方法もまた本発明の主題 である。 かくして、本発明はさらに、パスツール研究所（パリ、仏国）に番号xxxxxx， yyyyyy，zzzzzzの下で寄託されたハイブリドーマによって生産される、１３２− １、１３２−２または１３２−３と命名されるモノクローナル抗体によって認識 される、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）のウイルス蛋白質１（ＶＰ１）の立体 配座エピトープと反応する、中和性抗体または、その抗体断片もしくは誘導体を 提供する。抗体が本発明による抗体であるか否かを決定するための可能な実験は 、それが寄託されたハイブリドーマからの抗体と交差反応（または競合）するか を 見ることである。抗体の断片および誘導体は当該分野でよく知られており、当業 者にさらなる説明はほとんど必要ない。 また、本発明は、前記開示の抗体によって認識されるニワトリ貧血ウイルスの ウイルス蛋白質１の立体配座中和性エピトープを提供する。エピトープはより大 きな分子の一部であってもよく、それはたとえば担体に結合させることができ、 あるいはエピトープをポリペプチド鎖内で（間隔を設けて）反復させることがで きる。好ましくは、エピトープはＶＰ１のより大きな部分の一部である。何故な らば、かかる分子は正しい立体配座をより容易に有するだろうからである。 記載されているごとく、立体配座エピトープはそれが１つの細胞内で好ましく はＶＰ２と共に１つのベクターから生産されるならば、ＶＰ１上に存在するに過 ぎないであろう。したがって、本発明は、ＣＡＶのウイルス蛋白質２と共に１つ の細胞内でウイルス蛋白質１を発現させることを含み、ＶＰ１をコードする遺伝 情報およびＶＰ２をコードする遺伝情報を１つの組換えベクター上に別々に存在 させる、前記した立体配座エピトープを含むウイルス蛋白質１の生産方法を提供 する。 また、本発明は、ＶＰ１をコードする遺伝情報およびＶＰ２をコードする遺伝 情報を２つの屁別々のコーディング配列として含む、丁度前記した方法で用いる ベクターを包含する。好ましくは、かかるベクターは、２種の病原体に対する保 護を与えることができるように、マレク病ウイルスベクターに基づく。 本発明のウイルス蛋白質のための非常に安全で効果的な発現系はバクロウイル スベクターに基づくベクターである。前記したごとく、バクロウイルスは、一般 に、脊椎動物を感染しないのでそれらで安全とみなされる。 また、本発明は、非常に重要な中和性立体配座エピトープを有するが、減少し た病原性を有するワクチンまたはワクチン組成物（たとえば、弱毒化ウイルス） に到達するもう１つの方法を提供する。 これは、ＶＰ１およびＶＰ２をコードする遺伝子（その遺伝子の少なくとも一 方は、その調節配列がその有効性を低下させるように修飾された転写開始部位の 上流にあるＣＡＶ配列に由来する調節配列の制御下にある）から少なくともそれ らの一部の機能的部分を発現させることよりなる、本発明の中和性立体配座エピ トープを含むウイルス蛋白質１を提供する方法を供することによって達成される 。このようにして、速くは複製せず、したがって、病原性が低い（すなわち、弱 毒化された）組換ウイルスを生産することができる。 かかるウイルス粒子も、本発明の一部である。上記で開示したように、修飾は 、好ましくは、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域におけるものであ り、最も好ましくは、修飾はプロモーターエンハンサー領域における１２塩基対 インサートである。 また、本発明のいずれかの方法で使用される核酸、たとえば、ＶＰ１の少なく とも機能的部分をコードする遺伝子およびＶＰ２の機能的部分をコードする遺伝 子を含むベクターであって、該遺伝子の少なくとも一方はその効率を低下させる ように修飾された調節配列の制御下にあるようなベクターと同様に、本発明のい ずれかの方法によって得ることができる組換えウイルス粒子も本発明の一部であ る。 本発明の抗体およびエピトープも試料中のＣＡＶまたはＣＡＶに対する抗体の 存在を検出または測定するための診断テストキットに有用である。 さらに、投与のための適当なアジュバントおよび／または適当な伝達体と合わ せた本発明の組換えウイルス粒子を含むＣＡＶ関連病の治療または予防のための ワクチンと同様に、投与のための適当なアジュバントおよび／または適当な伝達 体と合わせた本発明の抗体またはエピトープを含むＣＡＶ関連病の治療または予 防のためのワクチンもここに提供される。 以下の実験の部に基づいて、本発明をさら詳しく説明する。これは例示目的の ためだけであり、保護の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。 実験 ＣＡＶに対する中和性モノクローナル抗体を誘導するＣＡＶ粒子の精製 ＣＡＶに対する中和性モノクローナル抗体の生産のために、マウスに精製され たＣＡＶ粒子を注射した。 ＭＩＬＬＩＴＡＮ ３００−ｋＤａフィルターによって(Millipore，米国)、 ＣＡＶ−感染ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞の１リットル培養の上清を４０倍に濃縮し た。上清を１０ｍＭトリス（ｐＨ８．７）−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液に 対して透析した。引き続いて、最終濃度０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ ＤＳ）をＣＡＶ−キャプシド懸濁液に添加し、３７℃で３０分間インキュベート した。最後に、ＣＡＶキャプシドを３０％ショ糖クッハョン上でペレット化した 。ＣＡＶキャプシドを含有するペレットを１ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。マ ウスに１００μｌ ＣＡＶ−キャプシド懸濁液を２回注射した。 イン・ビトロ中和テスト 候補モノクローナル抗体の上清を１：２に希釈し、次いで、２倍希釈系列を作 成した。希釈した上清を１０４−１０５ＴＣＴＤ５０ ＣＡＶ−Ｃｕｘ−１（Vo n Bulowら，1983，Von Bulow，1985）と共にインキュベートした。マレク病ウイ ルスによって形質転換されたＴ細胞のほぼ１０００００細胞を、希釈上清および ウイルスのこの混合物で感染させた(Yuasaら，1983，Yuasaら，1983)。 免疫蛍光および免疫ペルオキジターゼアッセイ Notebornら(1980)によって記載されているごとく、細胞を８０％アセトンで固 定化し、ＣＡＶ−特異的モノクローナル抗体およびフルオレセインを結合したヤ ギ抗−マウスＩｇＣにての免疫蛍光で使用した。 Jeurissenら(1988)によって記載されてるいごとく、組換え−ＶＰ１／ＶＰ２ −ＭＤＶ−感染ＣＥＦを、ＣＡＶ−特異的モノクローナルでの免疫ペルオキシダ ーゼ染色で使用した。 酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ） ５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムｐＨ９．６に１：１００００希釈したＣＡＶ−特 異的中和性モノクローナル抗体で、マイクロタイターウェル(Greiner，FRG)を被 覆した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ８０を含有する水道水でウェルを３回洗浄した 。４％ウマ血清、５１グラム／リットルＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ ８０（飽和緩衝液）を含有するリン酸緩衝化生埋食塩水１００μｌで、３７℃ で３０分間ウェルを飽和させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ８０を含有する水道水 でウェルを３回洗浄した。次に、５０μｌの非希釈ニワトリ血清およびＣＡＶ 粒子を含有する５０μｌの３０倍濃縮上清、または組換えＶＰ１およびＶＰ２蛋 白質を含有する昆虫細胞の５０μｌ溶解物を混合し、ウェル当たりに添加し、３ ７℃で１時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ８０を含有する水道 水でウェルを３回洗浄した。ウェル当たり、飽和緩衝液中のペメオキシダーゼ標 識ウサギ抗−マウス免疫グロブリンｃコンジュゲートの１：２０００倍希釈１０ ０μｌを添加した。３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ８０を含有する水道水で再度洗浄した。テトラメチルベンジジン、酢酸ナトリ ウムおよび過酸化水素の１００μｌの標準溶液をウェルに添加し、室温で１０分 間インキュベートした。反応を１０％硫酸でブロックする。種々のウェルを標準 として４５０ｎｍで調べる。 バクロウイルスおよび昆虫細胞 組換えバクロウイルスＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺ(Bishop，1992)をイングランド 、オックスフォードのＮＥＲＣ Institute of VirologyのR．Possee博士から得 、ゲノムＤＮＡをSummersおよびsmith(1987)によって記載れさているごとくに精 製した。スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞はアメ リカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得た（番号ＣＲＬ１７１１）。 バクロウイルスストックは、Summersおよびsmith(1987)によって記載されてい るごとく、１０％胎児うし血清を含有するＴＣ−１００培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲ Ｌ）中、単層単層および懸濁培養にて増殖させた。 ＣＡＶ ＤＮＡのクローニング 全てのＣＡＮ ＤＮＡ配列はプラスミドＤＮＡ ｐＩｃ−２０Ｈ／ＣＡＶ−Ｅ ｃｏＲＩ(NotebornおよびDe Boer，1990)から元来由来する。プラスミドＤＮＡ での全てのクローニング工程は、原理的には、Maniatisら(1982)によって記載さ れている方法に従って行った。 ＤＮＡ形質転換はイー・コリ株ＨＢ１０１で行った。全てのプラスミドは撹拌 下で大培養にて増殖させ、ＣｓＣｌグラジエント、次いで、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ −Ｓ５００カラム上での濾過によって、またはＱＩＡＧＥＮ−クロマトグラフィ ーカラムでの濾過によって精製した。 組換えＶＰ１／ＶＰ２バクロウイルスの構築および選択 組換え導入ベクターｐＡｃＶＰ１／ＶＰ２ ＤＮＡを、Ｓｆ９細胞において、 線状化組換えバクロウイルスＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺ ＤＮＡでトランスフェク トした。相同組換えの後、各々、ｐ１０またはポリヘドリン遺伝子のプロモータ ーの制御下にある２つのＣＡＶ蛋白質ＶＰ１およびＶＰ２をｌａｃＺの代わりに ポリヘドリンユニットに組み込んだ組換えバクロウイルスが得られた。最初の例 においては、組換えＣＡＶウイルスは、バクロウイルス−感染昆虫細胞のプラー クにおけるベータ−ガラシトシダーゼ活性の不存在につき特徴付けた。バクロウ イルスゲノムにおけるＣＡＶ ＤＮＡ配列の組込みは、ハイブリダイゼーション 実験においてＣＡＶ−特異的ＤＮＡプローブによって決定した。 免疫沈殿アッセイ 感染の２日後、細胞をＰｒｏｍｉｘ 標識（ＩＣＮ、米国）と共にインキュベ ートし、４時間後、細胞をＥ１Ａ緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、０． １％トリトン−Ｘ−１００、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＦ、および ５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶解させ、４℃にてＶＰ２に向けられたモノクローナル 抗体１１１．１と共に２時間インキュベートし、Ｅ１Ａ緩衝液で洗浄し、ＰＡＡ −ＳＤＳゲルで分離した。 ＣＥＦにおけるＭＤＹ ＤＮＡのトランスフェクション 組換え−ＶＰ１／ＶＰ２ ＭＤＶの構築のために、ＭＤＶ Ｒｉｓｐｅｎｓ単 離体(Van Vlotenら，1972)を感染させたニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）から単 離した、精製された組換えＶＰ１／ＶＰ２ ＭＤＶ−導入ベクターおよびＤＮＡ での共トランスフェクションを、GrahamおよびVan der Eb(1973)によって記載さ れている方法で行った。 ニワトリＴ細胞の突然変異体−CAVゲノムでのトランスフェクション 種々の突然変異体−ＣＡＶキローンをＥｃｏＲＩで消化し、ＣＡＶ（突然変異 体させた）配列を含有するＥｃｏＲＩ断片を再環化させ、Noteborn（1991）によ って記載されているＤＥＡＥ−デキストラン方法を用いることによって、ＭＤＣ Ｃ−ＭＳＢ１でトランスフェクトした。対照として、平行して、ｐＣＡＶ−Ｅｃ ｏＲＩクローンにて、全工程を行った。 結果および考察 ＣＡＶに対する中和性モノクローナル抗体の生産 NotebornおよびKoch（1994）は２つのタイプのＣＡＶ−特異的モノクローナル 抗体を記載した。１つのタイプはＶＰ２に向けられ、他方、他のものはＶＰ３に 向けられる。これらのモノクローナル抗体のいずれもＣＡＶ−特異的中和性活性 を明らかとしない。さらに、より重要なことは、これらのモノクローナル抗体の いずれもＶＰ１に向けられなかったことである。本発明者らは、中和性モノクロ ーナル抗体は、ＶＰ１に向けられるであろうと推定する。というのは、キャプシ ドは主としてＶＰ１を含有するからである（Toddら，1990)。以下、本発明者ら は、ＣＡＶに対する中和性抗体の生産を記載する。 ＣＡＶに対する中和性モノクローナル抗体の生産では、精製ＣＡＶ粒子をマウ スに注射した。 ＣＡＶに対する（中和性）モノクローナル抗体についての最初のスクリーニン グとして、ＶＰ１およびＶＰ２を共合成する（後記参照）組換え−ＶＰ１／ＶＰ ２−バクロウイルス感染昆虫細胞でマイクロタイターウェルを被覆した。高い中 和力価を持つＣＡＶ−特異的抗血清は、組換えＶＰ１および／またはＶＰ２産物 にて、特異的に１：１０００の希釈に到達した（後記参照）。組換えＶＰ１／Ｖ Ｐ２産物と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するいくつかの異なるハ イブリドーマ細胞系が得られた。 ＣＡＶ−特異的血清中和テストは、得られたこれらのモノクローナル抗体のう ちの３種がＣＡＶに対する中和活性を有することを示した。これらの３種のＣＡ Ｖ−特異的中和モノクローナル抗体を１３２．１、１３２．２および１３２．３ （仏国、Institute Pasteurに番号xxxx、yyyy、zzzz下で寄託）と命名した。 ＣＡＶに向けられた中和性モノクローナル抗体の鏡検 免疫蛍光は、３種のモノクローナル抗体１３２．１、１３２．２およびひ１３ ２．３がＣＡＶ−感染ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞で特異的構造を認識することを示 した。これらのモノクローナル抗体のいずれも未感染ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞と 反応しなかった。 ＣＡＶに対する中和性モノクローナル抗体１１１．１（１３２．１）と共に、 またはモノクローナル１１１．１（ＶＰ２に対する）または１１１．３（ＶＰ３ に対する）と共にインキュベートした精製ＣＡＶ粒子で、電子顕微鏡分析を行っ た。Ｔｏｄｄら（１９９０）は、精製ＣＡＶキャプシドは、ほとんどはＶＰ１で あるらしい５０−ｋＤａ蛋白質のみを含有することを報告している。種々のモノ クローナル抗体は免疫金標識によって検出された。中和モノクローナル抗体１３ ２．１のみがＣＡＶ粒子に結合することが判明した。モノクローナル抗体１３２ ．１のＣＡＶ粒子への結合は、その溶解の結果となる。さらに、中和性モノクロ ーナル抗体１３２．１とのインキュベーションのため溶解したＣＡＶキャプシド は、ＶＰ２またはＶＰ３に向けられたモノクローナル抗体との結合は示さなかっ た。 これらの結果は、中和性モノクローナル抗体が作用するメカニズムを明らかに する；それらは、そのようにして非感染性粒子を生じさせることによって、ウイ ルスキャプシドの溶解を引き起こす。さらに、これらのデータは、精製されたＣ ＡＶ粒子が（ほとんど）ＶＰ１のみを含有することを示す。 中和性モノクローナル抗体はＶＰ１上の立体配座エピトープに向けられる。 Ｐｅｐａｃａｎ分析(Geysenら，1984)は、３種の中和性モノクローナル抗体い ずれもがＶＰ１またはＶＰ２またはＶＰ３に由来する１２量体のうちの１つと有 意に反応しないことを明らかとした。簡単のために、モノクローナル抗体１３２ ．１で得られたデータのみを図１でＶＰ１のために示し、図２でＶＰ２のために 示す。これらの結果は、中和性モノクローナル抗体が立体配座エピトープに向け られることを示す。 これらのデータは、以下の実験によって確認した。天然条件下のナイロンフィ ルターにドットした精製ＣＡＶ粒子は依然として中和性モノクローナル抗体と反 応できた。しかしながら、ＳＤＳの存在下での沸騰の後、ＣＡＶキャプシド蛋白 質はモノクローナル抗体１３２．１に結合しなかった。 Notebornら(1994b)によって記載れしているごとくに、部分的に精製されたＣ ＡＶ粒子およびモノクローナル抗体１３２．１、１３２．２または２３２．３に て天然条件下で行った免疫沈殿実験は、約５０ｋＤａの蛋白質がこれらのモノク ローナル抗体によって沈殿されることを示した。 提示された結果は、中和性モノクローナル抗体がＶＰ１の立体配座エピトープ に向けられることを示す。 ＣＡＶに向けられる中和性抗体に基づく酵素結合イムノソルベント検定法（Ｅ ＬＩＳＡ） 本発明者には、複合体−捕獲−ブロッキング（ＣＴＢ）−ＥＬＩＳＡを開発し た。ＣＡＶ−感染ＭＤＣＣ−ＭＳＢ−１細胞に由来する豊富化ＣＡＶ粒子または 前記したバクロウイルス系によって合成された組換えＶＰ１／ＶＰ２蛋白質を使 用することができる。 ＣＡＶ−感染ニワトリからの血清は、ＣＡＶキャプシドまたは組換えＶＰ１／ ＶＰ２上の全てのエピトープをブロックするであろう抗体を含有する。これは、 ＣＡＶキャプシドまたは組換えＶＰ１／ＶＰ２は被覆したモノクローナル抗体１ ３２．１には結合しないことを意味する。しかしながら、陰性血清はＣＡＶキャ プシドまたは組換えＶＰ１／ＶＰ２の被覆された１３２．１への結合を可能とす るであろう。陰性対照血清で検出されるシグナルの０．５よりも小さいシグナル は陽性として調査されるであろう。 本発明者らのＣＴＢ−ＥＬＩＳＡの検出レベルは、非常に感度の良い、血清中 和テストで測定された２４ないし２５の力価である。４００を超える血清を分析 した。血清中和テストとの比較は、血清中和テスト内の陽性血清の９６．５％が ＣＴＢ−ＥＬＩＳＡ内で陽性であり、血清中和テスト内の陰性血清の９８．３％ がＣＴＢ−ＥＬＩＳＡ内で陰性であった。 組換えＶＰ１／ＶＰ２導入ベクターの構築 ＣＡＶ蛋白質ＶＰ１およびＶＰ２についてのコーディング配列を、PharMingen ,サンジエゴ，米国から商業的に入手できるバクロウイルス導入ベクターｐＡｃ ＵＷ５１（カタログ番号２１２０５Ｐ）にクローン化した。このベクターを図３ に示すが、バクロウイルスポリヘドリンプロモーターおよびｐ１０プロモーター の 間の中央内のポリヘドリンフランキング配列および両転写ユニットのための、ポ リアデニル化シグナルを含めた所要の３’−非暗号転写配列を含有する。導入ベ クターは、細菌中での増殖のための原核生物配列を含有する。 プラスミドｐＥＴ−１６ｂ−ＶＰ２(Notebornら,データは未公表)は３８０位 ないし１５１２位のＣＡＶ ＤＮＡ配列を含有する。このＣＡＶ ＤＮＡ断片は 、４８４ｂｐの３’−非暗号ＣＡＶ ＤＮＡ配列が直ぐに隣接するＶＰ２に対す る暗号領域を含有する。ＶＰ２についてのスタートコドンの１０６ｂｐ下流には 、ＶＰ３についてのスタートコドンがもう１つのリーディングフレームに見い出 される。該プラスミドｐＥＴ−１６ｂ−ＶＰ２を制限酵素ＮｄｅＩおよびＮｈｅ Ｉで処理し、粘着末端をクレノウポリメラーゼによって満たした。０．８ｋｂ ＣＡＶ ＤＮＡ断片を単離した。プラスミドｐＡｃＵＷ５１をＢａｍＨＩで線状 化し、粘着末端をクレノウポリメラーゼによって満たし、最後に、アルカリ性ホ スファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。０．８ｋＢ ＣＡＶ ＤＮＡ断片を線状化 ｐＡｃＵＷ５１ ＤＮＡにおいて連結した。ｐＡｃＵＷ５１におけるＶＰ２の向 きは、制限酵素分析によって測定した。この構築体をｐＥＷ−ＶＰ２と呼ぶ。 プラスミドｐＥＴ−１６ｂ−ＶＰ２(Notebornら,データは未公表)は８５３位 ないし２３１９位のＣＡＶ ＤＮＡ配列を含有する。該ＣＡＶ ＤＮＡ挿入は、 １１７ｂｐ３’−非暗号ＣＡＶ ＤＮＡ配列が直ぐに隣接する蛋白質ＶＰ１につ いての完全な暗号領域を含有する。プラスミドｐＥＴ−１６ｂ−ＶＰ２を制限酵 素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで処理し、粘着末端をクレノウポリメラーゼで満た した。１．４５ｋｂ ＣＡＶ ＤＮＡ断片を単離した。プラスミドｐＥＷ−ＶＰ ２をＥｃｏＲＩで線状化し、粘着末端をクレノウポリメラーゼで満たし、最後に 、ＣＩＰで処理した。１．４５ｋｂ ＣＡＶ ＤＮＡ断片を線状化ｐＥＷ−ＶＰ ２において連結した。ｐ１０プロモーターユニットのＶＰ１対向の無機は制限酵 素分析によって測定し、最終構築体ｐＡｃＶＰ１／ＶＰ２を図３に示す。 組換え−ＶＰ１／ＶＰ２バクロウイルスの構築 ＶＰ１およびＶＰ２をコードするオープンリーディングフレームを別々に単一 のバクロウイルス導入ベクターｐＡｃＵＷ５１にクローン化した。ＶＰ１をコー ドするＣＡＶ配列はバクロウイルスｐ１０プロモーターの調整下にあり、ＶＰ２ はバクロウイルスポリヘドリンプロモーターの調整下にある。Ｓｆ９昆虫細胞の トランスフェクションは、「裸の」バクロウイルスＤＮＡおよび導入ベクターＤ ＮＡで起こった。相同組換えの後、ｌａｃＺユニットの代わりに、ＶＰ１／ＶＰ ２発現ユニットを組込み、組換えバクロウイルスのポリヘドリン領域に一体化さ れたバクロウイルスが得られた。組込みバクロウイルスは、ベータ−ガラクトジ ターゼ活性の存在およびＣＡＶ ＤＮＡ配列の一体化によって特徴付けられる。 Ｓｆ９細胞におけるＣＡＶ蛋白質ＶＰ１およびＶＰ２の発現 組換え−ＶＰ１／ＶＰ２バクロウイルスを感染させたＳｆ９におけるＣＡＶ蛋 白質ＶＰ１およびＶＰ２の同時発現は、クーマシーブリリアントブルー染色およ びプロミックス(Promix)(ICN，米国)または３Ｈ−ロイシン（Amersham，英国） およびＰＡＡ−ＳＤＳゲル電気泳動での蛋白質標識によって分析した。 ＰＣＴ／ＮＬ９４／００１６８では、組換えＶＰ１バクロウイルスで感染させ た昆虫細胞の溶解物は５２ｋＤのＣＡＶ−特異的蛋白質を含有し、感染昆虫細胞 における組換え−ＶＰ２バクロウイルスによるＶＰ２の発現は３０ｋＤａの主要 な特異的産物を生じたことが示されている。組換え−ＶＰ１／ＶＰ２バクロウイ ルスでの昆虫細胞の感染の結果、５２ｋＤおよび３０ｋＤのＣＡＶ−特異的蛋白 質双方が合成された。両ＣＡＶ特異的産物は放射性標識蛋白質バンドまたはクー マシーブリリアントブルー染色蛋白質バンドとして検出できた。後者の結果は、 両産物が組換えＶＰ１／ＶＰ２バクロウイルス感染昆虫細胞で比較的高レベルで 産生されることを示す。組換え−ｌａｃＺバクロウイルスで感染させたＳｆ９細 胞はこれらのＣＡＶ−特異的蛋白質を含有しなかった。 かくして、本発明者らは、組換えＶＰ１／ＶＰ２感染Ｓｆ９細胞の粗製溶解物 の雌鳥における接種は、ＣＡＶに向けられた中和性抗体を誘導できるという証拠 を得た。 ＶＰ１の立体配座中性エピトープの形成のためのＶＰ２の役割 ＰＣＴ／ＮＬ９４／００１６８に、およびKochら(1995)によって報告されてい るごとく、組換えＣＡＶ蛋白質ＶＰ１およびＶＰ２の同時合成および単純でな い混合が、中和性で保護的免疫応答を得るのに必要である。これらのデータは、 ＶＰ２が、感染のいくつかの段階において、ウイルス組立および／またはＶＰ１ の正して立体配座（これは、中性エピトープの形成の結果となる）に必要な非構 造蛋白質であることを示唆する。ＶＰ２の要件の１つの説明は、ビリオンの組立 の間に必要であるが、最終産物では存在しないスカフォールド蛋白質としてそれ が作用するということである(LeibowitzおよびHorwitz，1975)。スカフォールド 蛋白質の例はアデノウイルスのＩＶａ２および３９ｋＤａ蛋白質である(D'Hallu inら，1978;Personら，1979)。これらの蛋白質はいわゆる軽いキャプシドの形成 のためのスカフォールドとして作用するが、次の工程で除去される。ＶＰ２は、 ＣＡＶビリオンの形成の間に同様に機能するであろう。しかしながら、この段階 においては、本発明者らは、精製されたＣＡＶ調製物の電気ブロットで(Toddら ，1990)、あるいは前記した免疫金−標識ＶＰ２−特異的モノクローナル抗体と 共にインキュベートした溶解ＣＡＶ粒子の電子顕微鏡写真において検出されない ままである（非常に）少量のＶＰ２がＶＰ１と会合し、立体配座中和性エピトー プと会合することを全くは排除できない。細菌、グラジエント−精製ＣＡＶにお けるＶＰ２の存在についての弱い証拠が報告された(Buchholz，1994)。 以下の実験においては、ＶＰ２が同時に合成される場合は、ＶＰ１の中和性エ ピトープがただ（最適）存在するという証拠を提供する。昆虫細胞を、ＶＰ１、 ＶＰ２（ＰＣＴ／ＮＬ９４／００１６８参照）またはＶＰ１プラスＶＰ２双方を 発現する組換えＣＡＶ−バクロウイルスで感染させた。感染したＳｆ９を感染の ３または４日後に収穫し、ＣＡＶ−特異的中和性モノクローナル抗体１３２．１ での免疫蛍光テストで使用した。ＣＡＶ−特異的蛋白質ＶＰ２のみを含有する細 胞はモノクローナル抗体１３２．１と全く反応しなかった。ＶＰ１のみを含有す る細胞は、モノクローナル抗体１３２．１とのインキュベーションの後、非常に 貧弱に免疫蛍光シグナルを明らかとした。しかしながら、ＶＰ１およびＶＰ２双 方を発現する組換えＶＰ１／ＶＰ２バクロウイルスを感染させた昆虫細胞は、中 和性モノクローナル１３２．１に非常に強固に結合した。ＶＰ１、ＶＰ２または ＶＰ１プラスＶＰ２を発現する昆虫細胞の平行した放射性標識溶解物のＰＡＡ− ＳＤＳゲル電気泳動は、単独でまたはＶＰ２と同時に発現された場合、ＶＰ１が 同一レベルで発現されることを明らかとした。 ＶＰ１およびＶＰ２は相互に一時的に相互作用する。 ＶＰ１の中和性エピトープはＶＰ２が存在する場合にのみ形成され、したがっ て、立体配座的に区別されるエピトープである。これは、ＶＰ１およびＶＰ２が 短時間の間、相互に会合することを意味する。非常に温和な条件下での免疫沈殿 によって、本発明者らは、ＶＰ１がＶＰ２と会合し得るか否かを調べた。Ｓｆ９ 昆虫細胞を組換えバクロウイルスで感染させ、これはＶＰ１、ＶＰ２、またはＶ Ｐ１プラスＶＰ２を合成した。結果は、モノクローナル抗体１１１．１は、ＶＰ ２が単独でまたはＶＰ１の存在下で合成される場合にＶＰ２を沈殿させることを 明瞭に明らかとした。ＶＰ２以外に、ＶＰ１も発現される場合には、ＶＰ１はＶ Ｐ２と共に少し共沈した。モノクローナル抗体１１１．１は、ＶＰ１がＶＰ２の 不存在下で合成される場合にはＶＰ１を検出可能に沈殿させなかった。これらの データは、ＶＰ１およびＶＰ２が（比較的少量）相互に会合することを示す。こ の会合事象の間に、ＶＰ１はその立体配座を得て、その結果中和性エピトープが 得られる。 ＣＡＶ感染に対するワクチンの開発のための基礎 前記した結果は、ＣＡＶに対する中和性抗体の誘導のためには、特異的立体配 座を有するＶＰ１が必要であることを示す。バクロウイルス発現系においては、 この正しいＶＰ１立体配座は、ＶＰ１プラスＶＰ２またはＶＰ１プラスＶＰ２プ ラスＶＰ３が同時に合成される場合のみ可能である。たとえば、ドデシル硫酸ナ トリウムでのＶＰ１の変性の結果、中和性エピトープが破壊され、これは、ＶＰ １中和性エピトープが立体配座エピトープであることを示す。 産卵雌鳥のワクチン接種で使用される組換えＣＡＶ産物ＶＰ１プラスＶＰ２ま たはＶＰ１プラスＶＰ２プラスＶＰ３はバクロウイルス系によって合成できる。 また、ＣＡＶ蛋白質は、哺乳動物細胞系における（レトロ）ウイルス感染または 遺伝子増幅（ＣＨＯ−ｄｈｆｒ系）を介して、酵母細胞のごとき他の発現系によ って合成できる。 原理的には、（ＶＰ２またはＶＰ２およびＶＰ３と組み合わせた）ＶＰ１の断 片の発現は、保護免疫応答の誘導に十分であり得る。ＶＰ１の１２量体がＣＡＶ に対する中和性抗体と反応できないという事実は、より大きなＶＰ１断片が、中 和性エピトープを形成するための正しいＶＰ１立体配座を得るために必要である ことを示す。しかしながら、少量のアミノ酸の突然変異または少しのアミノ酸欠 失はＶＰ１の中和性エピトープの形成に影響しないであろうことを考慮すべきで ある。 ＣＡＶオープンリーディングフレームによってコードされる２または３の蛋白 質が保護免疫応答を誘導できるという事実も生きたウイルスベクターの開発に適 用できる。ＶＰ１プラスＶＰ２またはＶＰ１プラスＶＰ２プラスＶＰ３について のコーディング配列を、次いで、生きたウイルスベクターにクローン化する。 また、別々に、しかし生きたウイルスベクターの意味に入るＣＡＶ蛋白質ＶＰ １、ＶＰ２またはＶＰ３のうちの１つもＣＡＶ感染に対する保護免疫応答の誘導 に適する。生きたウイルスベクターによる前記したＣＡＶ蛋白質のうちの１つの 断片の発現は、保護免疫応答の誘導に十分であろう。 ＶＰ３はニワトリ単核細胞においてアポトーシスを引き起こす（ＰＣＴ／ＮＬ ９４／００１６８；Notebornら，1994a)）という事実は、ＶＰ３を発現しない生 きたウイルスベクターを発現するのに好都合である。マレク病ウイルスの複製は 、ＶＰ３−誘導アポトーシスによって負に誘導される。 別法として、ＣＡＶ感染に対する中和および保護免疫応答を誘導するのに必要 な所要の立体配座を持つＶＰ１を発現する弱毒化ＣＡＶを生産することができる 。 組換え−ＭＤＶ−ＶＰ１／ＶＰ２導入ベクターの構築 ＣＡＶ蛋白質ＶＰ１およびＶＰ２についてのコーディング配列をマレク病ウイ ルス）ＭＤＶ）導入ベクターｐＭＤ−ＵＳ１０−ＳＶ（Koch，未公表データ）に クローン化した。導入ベクターは、ＭＤＶ ＵＳ１０領域の配列が隣接するＳＶ ４０初期プロモーター、および細菌における増殖のための原核生物配列を含有す る。導入ベクターの模式的表示は図４に示す。 ｎｔ３６８位ないしｎｔ２３１９位のＣＡＶコーディング配列を、ＳＶ４０初 期プロモーターの調節下にあるｐＭＤ−ＵＳ１０−ＳＶ導入ベクターに挿入した 。この組換え導入ベクターは、制限酵素消化によってチェックし、ｐＭＤ−ＵＳ １０−ＳＶ−ＶＰ１／ＶＰ２と呼ぶ。 ５４９位に点突然変異（ＴをＡに変化）を導入することによって、過剰の停止 コドンをＶＰ３をコードする遺伝子に導入した（Noteborn,未公表データ）。し たがって、挿入されたＣＡＶ配列はＶＰ１およびＶＰ２のみを発現するであろう 。ベクターｐＭＤ−ＵＳ１０−ＳＶ−ＶＰ１／ＶＰ２でトランスフェクトしたニ ワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）の間接免疫蛍光分析は、ＶＰ１およびＶＰ２が事 実発現され、他方ＶＰ３は発現されなかったことを示した。 組換えＶＰ１／ＶＰ２ ＭＤＶの構築 リン酸カルシウムトランスフェクション方法を用い、ＣＥＦ細胞において、組 換え導入ベクターｐＭＤ−ＵＳ１０−ＳＶ−ＶＰ１／ＶＰ２ ＤＮＡをＭＤＶ（ Ｒｉｓｐｅｎｓ単離体）ＤＮＡでトランスフェクトした。相同組換えの後、ＵＳ １０領域にＣＡＶコーディング配列が組み込まれた組換えＭＤＶが得られた(Mak a,uraら，1992)。組換え−ＶＰ１／ＶＰ２ ＭＤＶはＶＰ２の発現によって特 徴付けられる。ＶＰ２ら向けられるモノクローナル抗体を用いる平行したプラー ク精製および免疫ペルオキシダーゼ分析によって、いくつかの１００％−精製組 換えＶＰ１／ＶＰ２ ＭＤＶ独立株が得られた。 組換えＶＰ１／ＶＰ２ ＭＤＶの特徴付け ＭＤＶゲノムにおけるＣＡＶ−ＤＮＡ配列の正しい一体化はＰＣＲおよび制限 酵素分析によって測定した。種々の精製された組換えＶＰ１／ＶＰ２ ＭＤＶの 引き続いての継代によって、それらは安定なままでいることが示された。ＶＰ１ ／ＶＰ２発現ユニットが（部分的に）喪失したいずれの組換えも得られなかった 。 組換え−ＶＰ１／ＶＰ２ ＭＤＶを感染させたＣＥＦ細胞におけるＣＡＶ蛋白 質ＶＰ１およびＶＰ２の同時発現は、間接的免疫蛍光によって判明した。ＶＰ２ に対して向けられるＣＩ−ＣＡＶ−１１１．１（１１１．１）およびＶＰ１に向 けられるＣＶＩ−ＣＡＶ−１３２．１（１３２．１）を用いた。 モノクローナル抗体１３２．１はＶＰ１の中和性エピトープに対して向けられ る。中和性抗体１３２．１が組換え−ＭＤＶ発現ＶＰ１を認識でき、ＶＰ２と共 合成できるという事実は、必要な中和性エピトープがＭＤＶ−発現ＶＰ１に存在 することを意味する。したがって、ニワトリの組換え−ＶＰ１／ＶＰ２ ＭＤＶ でのワクチン接種の結果、中和性／保護抗体応答が起こる。ＣＡＶ ＶＰ１およ びＶＰ２蛋白質の合成の外に、組換え−ＶＰ１／ＶＰ２ ＭＤＶは、ＭＤＶ感染 に対する保護免疫応答の誘導に必要なＭＤＶ蛋白質を合成するであろう。 クローン化ＣＡＶゲノムｐＣＡＶ／ＥｃｏＲＩに基づく弱毒化ＣＡＶの生産 ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩクローンは種々の感染性ＣＡＶ粒子の生産で用いる。その 目的に、完全なインサート、２，３１９−ｂｐＥｃｏＲＩ断片が細菌配列から単 離させ、ＤＮＡポリメラーゼ処理によって再環状化される必要がある。引き続い て、たとえば、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞を再環状化ＥｃｏＲＩ断片でトランスフ ェクトし、数日後、野生型ＣＡＶが生産されるであろう。 突然変異変化を、ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩクローンおよび単離体のＣＡＶ配列に導 入し、再環化させ、ＭＳＣＣ−ＭＳＢ１細胞においてトランスフェクトすること ができる。野生型ＣＡＶの代わりに、原理的には、突然変異ＣＡＶを生産するこ とができ、突然変異体が病原性が低いならば、弱毒化ＣＡＶを生産することがで きる。弱毒化ＣＡＶの生産についての完全な戦略は図５に示す。 突然変異プロモーター／エンハンサー領域を含有するＣＡＶゲノムの構築 ＣＡＶプロモーター／エンハンサー領域の顕著な特徴は、１２ｂｐのインサー トによって中断された４または５つの完全に近い２１−ｂｐ反復の配列である(N otebornら，1991)。この領域はＣＡＶ転写の調節に関与する(Notebornら，1994b )。 弱毒化ＣＡＶの生産のために、本発明者らは、ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩクローンの １２−ｂｐインサート／直接反復領域(Notebornら,1991)に突然変異変化を導入 した。野生型（ｗｔ）および種々のＣＡＶ突然変異体の突然変異プロモーター／ エンハンサー領域を図６に示す。Ｎａｅ突然変異体は１２ｂｐ／直接反復領域配 列を全く含有しない。これらに代えて、ＮａｅＩ部位（５’−ＧＣＧＧＣ−３’ ）が導入され、これは図６において「Ｎ」で与えられる。 全ての他の突然変異体は、ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩクローンの場合のように、４つ の元の直接反復を５に代えて含有する。「６ｂ」ｐ、１２ｂｐ」、「２４ｂｐ」 と呼ばれる種々のＣＡＶ突然変異体は変化した１２ｂｐインサートを含有する。 突然変異体「Ｎａｅにおけるｗｔ」および、勿論、元のＣＡＶ−ＥｃｏＲＩクロ ーン（「ｗｔ」と呼ばれる）は元の１２−ｂｐインサート配列５’−ＡＡＧＡＧ ＧＣＧＴＴＣＣ−３’を含有する。 ＣＡＶ突然変異体「６ｂｐ」、「１２ｂｐ」、「１８ｂｐ」、「２４ｂｐ」お よび「Ｎａｅにおけるｗｔ」は１２−ｂｐインサート／直接反復領域に直ぐに隣 接する全てのさらなる配列を含有する。この領域の５’−部位において、リンカ ー５’−ＧＣＣＣＡＴＧＴ−３’を、および３’において、リンカー５’−ＧＡ ＴＣＣＧＣＣ−３’を導入した。 突然変異ＣＡＶゲノムは弱毒化感染性ＣＡＶの生産の結果となる。 突然変異ＣＡＶゲノムが生きたＣＡＶ粒子を生産し得るか否かを判断するため に、まず、ＶＰ３の合成を調べた。トランスフェクション後のいくつかの時点に おいて、種々のトランスェクトＭＤＣＣ−ＭＳＢ１−細胞培養の一部をアセトン −固定し、ＶＰ３に向けられモノクローナル抗体を用いる間接的免疫蛍光によっ て分析した。平行して、１ｍｌの各培養を、１０％胎児ウシ血清を補足した９ｍ ｌの新鮮なＲＰＭＩ−培地に添加した。 「ｗｔ」再環化ＣＡＶゲノムＤＮＡでトランスェクトした培養ＭＤＣＣ−ＭＳ Ｂ１細胞のほぼ１５％および９０％は、各々、６日および１１日後にＶＰ３を含 有した（細胞はトランスフェクション後に一回継代した）。 完全な１２−ｂｐインサート／直接反復領域を欠くＣＡＶ突然変異体ゲノムは 感染性ウイルス粒子を生産しないことが示された。トランスフェクションの６日 後に、細胞のせいぜい２％がＶＰ３を生産し、これは、「Ｎａｅ」ＤＮＡの一過 性発現のためである。同様のパーセンテージが、ＶＰ３のみをコードする発現プ ラスミドｐＲＳＶ−ＶＰ３（Notebornら，1994b）で得られ、これは真核生物細 胞では複製しないことが知られている。３週間および数継代の後、Ｎａｅ−ＤＮ ＡトランスェクトＭＤＣｃ−ＭＳＢ１細胞培養でＶＰ３はもはや存在しなかった 。 トランスフェクション後に種々の時間間隔で、突然変異体−ＤＮＡゲノム「６ ｂｐ」、「１２ｂｐ」、１８ｂｐ、２４ｂｐおよび「Ｎａｅにおけるｗｔ」でト ランスェクトしたＭＤＣＣ−ＭＳＢ１培養のＶＰ３−陽性細胞のパーセンテージ は、「ｗｔ」−ＤＮＡゲノムでトランスェクトした培養と比較して有意に低かっ た。これらのデータは、種々のＣＡＶ突然変異体が野生型ＣＡＶよりも遅く複製 することを意味する。特に、突然変異体「６ｂｐ」および「１８ｂｐ」はそれら の複製速度は低下した。もっともありそうには、１２−インサートの突然変異変 化の結果、突然変異ＣＡＶの遅いウイルス拡大が得られた。これらの実験の結果 を図７に示す。 引き続いて、本発明者らは、新鮮なＭＳＣＣ−ＭＳＢ１培養を、全ての調べた 突然変異ＣＡＶ−ＤＮＡゲノムでトランスェクトした細胞の上清で感染させた。 「Ｎａｅ」−ＤＮＡ−トランスェクト細胞に由来するものを除き、全ての上清は 感染性ウイルス粒子を含有することが判明した。「突然変異ウイルス」を含有す る上清で感染させたこれらの培養については、ＶＰ３を含有する細胞が存在する ことが、間接的免疫蛍光によって示され得る。 ＣＡＶ突然変異体は低下した細胞病理学的効果を有する。 ＶＰ３合成の前記検出と平行して、トランスェクト細胞をアポトーシス的にな ったか否かを分析した。ＣＡＶは感染の２−３日後にアポトーシスを誘導するこ とが知られている。その目的で、細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、これは「 正常」ＤＮＡを強く染色するが、アポトーシスＤＮＡを弱くおよび／または不規 則的に染色する。既に、トランスフェクションの１１日後に、「ｗｔ」ＤＮＡで トランスェクトしたほとんど全てのＭＳＣＣ−ＭＳＢ１細胞はアポトーシス的で あることが示され、他方、種々の突然変異ＣＡＶ−ＤＮＡゲノムでトランスェク トした細胞の大部分はそうでない。アポトーシスを誘導する能力は、ＣＡＶ突然 変異体「６ｂｐ」および「１８ｂｐ」につき最も低下したことが示された。 弱毒化ＣＡＶのＤＮＡ分析 １２−ｂｐインサート／直接反復領域およびフランキング配列のポリメラーゼ 鎖反応および配列分析によって、元々の突然変異は種々の突然変異体「６ｂｐ」 、 「１２ｂｐ」、「１８ｂｐ」、［２４ｂｐ」および「Ｎａｅにおけるｗｔ」につ き変化しなかったことが示された。これらの結果は、種々のＣＡＶ突然変異体が 少なくともＭＤＣＣ−ＭＳＢ１における約１カ月の培養の後に安定であり、事実 、これらのＣＡＶ突然変異体は目で見え、培養ニワトリＴ細胞で細胞病理学的効 果を低下を引き起こすことを示す。 種々のＣＡＶ突然変異体で感染させたＭＤＣＣ−ＭＳＢ１培養から単離された ＤＮＡのサザーンブロット分析は、全ての目に見えるＣＡＶ突然変異体が、野生 型ＣＡＶにつき記載したごとくに、全てのＣＡＶ ＤＮＡを生産したことを明ら かとした。二本鎖複製中間体および一本鎖ＤＮＡは野生型および突然変異ＣＡＶ 双方につき検出された。 弱毒化ＣＡＶはＣＡＶ−特異的中和性エピトープを合成する。 間接的免疫蛍光によって、中和性モノクローナル抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ１３２． １およびＶＰ２に向けられたモノクローナル抗体、すなわち、ＣＶＩ−ＣＡＶ１ １１．２およびＶＰ３、すなわち、ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１を用い、全ての突 然変異ＣＡＶゲノムがＣＡＶ蛋白質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を合成できるこ とが示された。より重要なことは、中和性モノクローナル抗体１３２．１が、種 々のＣＡＶ突然変異体と反応したことである。この知見は、突然変異ＣＡＶが、 保護免疫応答を誘導するためのＣＡＶとしてワクチン接種したニワトリの免疫計 によって認識されなければならない必要な中和性ＣＡＶ−特異的エピトープを生 じることを示す。 ＣＡＶクローンｐＣＡＶ−ＥｃｏＲＩに基づいて、突然変異ＣＡＶゲノムを作 成でき、その結果、目に見える突然変異ＣＡＶ粒子が生成する。これらのＶＰ３ 突然変異体は、培養ニワトリＴ細胞において野生型ＣＡＶよりもかなり遅く複製 する。これらのＣＡＶ突然変異体によって引き起こされる細胞変性効果も野生型 ＣＡＶと比較して低下する。ＣＡＶ突然変異体は、全て、全部のＣＡＶ蛋白質を 生産することができ、その結果、ＶＰ１上で必要な中和エピトープが生成する。 したがって、これらのＣＡＶ突然変異体は当該分野における弱毒化バージョン である。 図面の説明 図１は、ＶＰ１に由来するペプチド（１２量体）での型１３２．１の中和性モ ノクローナル抗体のｐｅｐｓｃ．分析を示す。 図２は、ＶＰ２に由来するペプチド（１２量体）での型１３２．１の中和性モ ノクローナル抗体のｐｅｐｓｃａｎ分析を示す。 図３は、組換え導入ｐＵＷ−ＶＰ１／ＶＰ２のダイアグラム表示を示す。 図４は、組換え導入ベクターｐＭＤ−ＵＳ１０−ＳＶ−ＶＰ１／ＶＰ２のダイ アグラム表示を示す。 図５は、野生型ＣＡＶの２３１９ｂｐを含有するプラスミドｐＣＡＶ／Ｅｃｏ ＲＩに基づく、弱毒化ＣＡＶ−突然変異体の生産のための戦略を示す。 図６は、種々の突然変異および野生型ＣＡＶ株のＣＡＶプロモーター／エンハ ンサーの付着構造を示す。 図７は、突然変異体または野生型環化ＤＮＡのトランスフェクション後におけ る種々の−突然変異体ＣＡＶおよび野生型ＣＡＶで得られたＶＰ３−発現速度を 示す。ＶＰ３−発現速度はＶＰ３−陽性ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞のパーセンテー ジとして与える。 図８は、ＣＡＶの配列を与える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．xxxxxx、yyyyyy、zzzzzzの番号で仏国パリのパスツール研究所に寄託され ているハイブリドーマによって生産される、１３２−１、１３２−２および１３ ２−３と命名されるモノクローナル抗体によって認識される、ニワトリ貧血ウイ ルス（ＣＡＶ）のウイルス蛋白質１（ＶＰ１）の立体配座エピトープと反応する 中和性抗体または抗体断片またはその誘導体。 ２．請求項１記載の抗体によって認識されるニワトリ貧血ウイルスのウイルス 蛋白質１の立体配座中和性エピトープ。 ３．１つの細胞においてＣＡＶのウイルス蛋白質２と共に前記ウイルス蛋白質 １を発現させることを含み、ＶＰ１をコードする遺伝情報およびＶＰ２をコード する遺伝情報が１つの組換えベクター上に別々に存在することを特徴とする、請 求項２に従う立体配座エピトープを含むウイルス蛋白質１の生産方法。 ４．２つの別々のコーディング配列として、ＶＰ１をコードする遺伝情報およ びＶＰ２をコードする遺伝情報を含む、請求項３に従う方法に使用するベクター 。 ５．マレク病ウイルスベクターに基づく請求項４記載のベクター。 ６．バクロウイルスベクターに基づく請求項４記載のベクター。 ７．ＶＰ１およびＶＰ２をコードする遺伝子から少なくそれらの機能的部分を 発現させることを含み、該遺伝子は、ＣＡＶ配列に由来する転写開始部位上流の 調節配列の制御下にあり、該調節配列はその効率を低下させるように修飾されて いることを特徴とする請求項１に従う中和性立体配座エピトープを含むウイルス 蛋白質１の提供方法。 ８．ＶＰ１がウイルス粒子の形態で提供されることを特徴とする請求項３また は７記載の方法。 ９．修飾がプロモーター／エンハンサー領域におけるものであることを特徴と する請求項７記載の方法。 10．修飾がプロモーターエンハンサー領域における１２塩基対インサートにお けるものであることを特徴とする請求項９記載の方法。 11．請求項７〜１０に記載の方法によって得ることができる組換えウイルス粒 子。 12．ＶＰ１の少なくとも機能的部分をコードする遺伝子およびＶＰ２の機能的 部分をコードする遺伝子を含み、該遺伝子の少なくとも一方は、その効率を低下 させるように修飾された調節配列の制御下にあることを特徴とする請求項７〜１ ０に記載の方法に用いるための核酸。 13．請求項１記載の抗体および／または請求項２記載のエピトープを用いて、 試料中のＣＡＶまたはＣＡＶ抗体の存在を検出または測定するための診断テスト キット。 14．投与のための適当なアジュバントおよび／または適当な伝達体と合わせた 、請求項１記載の抗体または請求項２記載のエピトープを含むＣＡＶ関連病の治 療または予防用のワクチン。 15．投与のための適当なアジュバントおよび／または適当な伝達体と合わせた 、請求項１１記載の組換えウイルス粒子を含むＣＡＶ関連病の治療または予防用 ワクチン。