CN118028252A - 表达ciav vp1和vp2基因的重组鸡马立克病病毒疫苗株及其应用 - Google Patents
表达ciav vp1和vp2基因的重组鸡马立克病病毒疫苗株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了表达鸡传染性贫血病病毒(CIAV)VP1和VP2基因的重组鸡马立克病病毒（MDV）疫苗株及其应用。所述的疫苗株是以MDV血清1型疫苗株rMS△Meq为载体，通过CRISPR/Cas9操作技术，将表达CIAV VP1和VP2基因以及表达荧光报告基因GFP的转移质粒插入所述的MDV血清1型疫苗株rMS△Meq的UL41基因内部，并利用流式细胞筛选技术及蚀斑克隆技术筛选后获得的。该重组MDV可以用于制备预防或治疗CIA的药物，在CIAV感染严重地区应用，有助于加快我国鸡群中CIA的净化工程，最大程度降低该病对养禽业造成的巨大经济损失及社会影响，本发明的提出为鸡传染性贫血病的防治提供了一种新的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用，特别涉及一种表达鸡传染性贫血病病毒VP1和VP2蛋白的重组鸡马立克病病毒疫苗株及其构建方法和应用，本发明属于医学或兽医学技术领域。
背景技术
鸡传染性贫血病（Chicken Infectious Anaemia, CIA）是由鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus, CIAV)感染引起的一种以雏鸡再生障碍性贫血及全身性淋巴组织萎缩为特征的一种免疫抑制性疾病。近年该病持续处于高发状态，感染几乎所有品系的鸡。该病可水平和垂直方式传播。种鸡感染CIAV，可传播给后代雏鸡，造成雏鸡死亡率增加，机体会产生免疫耐受，病毒可在体内长期存在并持续向外界排毒。同时，CIAV常常与马立克病病毒（Marek’s diease virus, MDV）、禽白血病毒和网状内皮组织增生征病毒等其他病原混合感染，集中表现在发病率上升和疫苗失效这两个方面，进一步加剧鸡群免疫抑制、甚至死亡的现象，给养禽业带来巨大的经济损失。目前，国内外商品化CIA疫苗稀缺，CIA弱毒活疫苗存在潜在的感染致病风险，同时灭活疫苗生产过程中，在细胞和鸡胚上培养均很难获得高滴度的CIAV。DNA疫苗和亚单位疫苗的研究也显示，这两类潜在疫苗同时诱导的体液免疫和细胞免疫水平的效果不理想，且免疫程序复杂。因此，研发新型的可高效综合防控CIA及其他病毒病的疫苗至关重要。
随着 DNA 重组技术、病毒反向遗传操作及基因编辑等基因工程技术的发展，重组活载体疫苗的研制成为当下和未来疫苗研制的主要方向之一。重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌构建成一个载体，然后把外源基因插入其中使之表达的活疫苗。活载体疫苗不仅兼具传统疫苗的免疫效果好、成本低等优点，还减少了毒力返祖的风险。与其他病毒载体相比，MDV属疱疹病毒科，其较大的基因组和多个可供外源基因插入的复制非必须区域，可以诱导机体产生持久和多样的免疫应答反应。此外，MDV是一种特定的细胞结合型病毒，感染方式是通过细胞之间的直接接触，不易受到母体抗体的干扰，以此构建重组活载体疫苗，是一种理想且有潜力的策略。
目前构建MDV重组活载体疫苗的方法主要有：同源重组法、细菌人工染色体 (BAC)法、Fosmid/cosmid载体和CRISPR/cas9技术。传统的同源重组法构建过程复杂费时而且效率较低，需要加入筛选标记基因并进行重组病毒的纯化。BAC法是建立在同源重组基础上的，同样需要构建病毒文库，构建过程复杂、周期长。BAC自身序列难以去除，使得后期获得的重组病毒带有不必要的外源基因序列，存在安全隐患。
CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR-Cas9基因编辑技术，是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，是目前用于基因编辑中前沿的方法。其中CRISPR是规律间隔性成簇段回文重复序列的简称，cas是CRISPR相关蛋白的简称，它是一种DNA内切酶，有识别靶序列的结构域和核酸酶裂片组成。CRISPR/Cas9技术中Cas9蛋白和sgRNA能够定向的对靶序列进行有效的切割，之后通过同源重组或者非同源末端连接修复机制使缺失后的部位或者插入外源基因的部位重新连接。该法较传统方法更加快速高效，且能够实现多个位点的同时编辑。这种快速发展的技术已被广泛应用于流行病学研究、基因差异分析、基因分型等。CRISPR/Cas9 技术最直接的应用是作为基因操作的工具，用于靶基因的沉默和基因治疗等。该操作技术在疱疹病毒上已经得到了广泛应用，包括单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒 (CMV)、伪狂犬病毒(PRV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、火鸡疱疹病毒(HVT)、鸭瘟病毒(DPV)和鸡马立克病病毒(MDV)等。
CIAV是圆环病毒科-环形病毒属的唯一成员，该病毒无囊膜，直径约为25nm，呈正二十面体结构。病毒基因组全长为 2298-2319 bp，为单股、负义、闭合圆环状DNA。CIAV由三个部分重叠的开放阅读框ORF1 (1347 bp)、ORF2 (648 bp)和ORF3 (363 bp)，分别为编码三个蛋白，VP1蛋白(52 kD)、VP2蛋白(21 kD)和VP3蛋白(13 kD)。其中ORF3包含在ORF2中，而ORF2和ORF1存在部分重叠。
VP1蛋白是CIAV的衣壳蛋白，也是其主要的免疫原性蛋白，含有丰富的中和抗原表位；VP2蛋白为病毒的支架蛋白，也称辅助性蛋白，协助VP1正确折叠，两者共同形成一定的空间构象，刺激机体产生中和抗体，是病毒中和抗原必不可少的部分；VP3蛋白是CIAV的非结构蛋白，具有凋亡作用，因此被称为凋亡蛋白或者凋亡素，诱导CIAV感染鸡发生胸腺淋巴细胞和造血细胞凋亡。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株及其构建方法，本发明构建得到的疫苗株对CIAV提供有效的免疫保护作用，并诱导鸡体产生良好的抗CIAV抗体。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
1. 首先，本发明使用CIAV流行毒株HeN19/3001株（GenBank：MT332107），获得VP1、VP2基因序列，并在其基础上对VP2基因序列进行密码子优化。本发明提供了密码子优化的VP2基因：CIAV编码的VP2蛋白开放阅读框包含VP3蛋白的开放阅读框，VP3蛋白又称凋亡素，能够诱导感染细胞发生凋亡。VP2基因序列经密码子优化，终止了VP3蛋白的表达，提高VP2基因的表达效率，增加VP2基因与VP1基因共表达时所产生的免疫原性。优化完的VP2核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
2. 体外构建共表达CIAV VP1和VP2基因的转移质粒。
具体的，本发明的一种表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株，其是将CIAVVP1、优化后的VP2基因和GFP基因以串联的形式插入pCAGGS质粒中，以构建表达CIAV VP1和VP2基因的转移质粒。本发明中所述的转移质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
3. 载体的选择：本发明以MDV血清1型新型基因工程疫苗株rMDV-MS-△Meq疫苗株（简称rMS△Meq株，该毒株记载于公开号为CN102363769B，发明名称为“鸡马立克病毒Meq基因缺失疫苗株,其构建方法及应用”的专利）为载体，构建了表达CIAV VP1和VP2基因的重组病毒。
4. 表达CIAV VP1和VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒的构建：本发明通过CRISPR/Cas9操作技术，将表达CIAV VP1和优化完VP2基因以及带荧光报告基因GFP的转移质粒插入MDV的UL41区域，获得在UL41基因内部表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV。并利用流式细胞筛选技术及蚀斑克隆技术获得纯化的重组MDV疫苗株rMS△Meq-CIAV-GFP（简称rMC-A2-GFP）。
在上述研究的基础上，本发明提出了表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株，所述的疫苗株是以MDV血清1型疫苗株rMS△Meq为载体，通过CRISPR/Cas9操作技术，将表达CIAV VP1和VP2基因的表达盒以及表达荧光报告基因GFP的表达盒以串联的形式插入所述的MDV血清1型疫苗株rMS△Meq的UL41基因内部后获得的表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株，对所述的VP2基因进行了密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，优选的，所述的表达CIAV VP1、VP2和GFP基因的转移质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，优选的，CRISPR/Cas9操作中涉及的sgRNA的序列如下所示：
进一步的，本发明还提出一种构建所述的表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株的方法，包括以下步骤：
1）以CIAV HeN19/3001株VP1、VP2基因的DNA为模版，分别设计、合成特异性引物VP1-F1/VP1-R1、VP2-F1/VP2-R1，扩增并获得VP1、VP2片段，获得的VP2基因片段进行了密码子优化，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
2）以pEGFP-N1质粒载体为模版，设计、合成特异性引物GFP-kF/GFP-kR，扩增并获得GFP片段；
3）将以上VP1、优化完VP2、GFP片段共同连接到pCAGGS质粒上，成功获得表达CIAVVP1和VP2基因以及表达荧光报告基因GFP的转移质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述序列如下所示：
4）重组MDV的拯救
4.1）根据rMS△Meq疫苗株的UL41序列，设计靶向UL41基因sgRNA单正义链以及负义链，所述的sgRNA序列如下所示：
两条sgRNA双链分别与线性化的px330质粒载体连接，分别获得p-sgRNA1以及p-sgRNA2质粒；
4.2）转染CEF细胞
将p-sgRNA1、p-sgRNA2以及转移质粒共转染CEF细胞12h后，感染 rMS△Meq毒株，37 培养4天；
4.3）共表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV的拯救
消化培养的CEF细胞，将打散的细胞悬液注入流式管中，进行流式分选，分选带绿色荧光的单个细胞，然后进行蚀斑筛选、纯化、每克隆一代，提取DNA，分别利用VP1-JF/VP1-JR引物和VP2-JF/VP2-JR引物扩增VP1和VP2的基因，PCR产物连接pMD-18 T载体，测序鉴定，引物序列如下所示：
4.4）共表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV的筛选
重复4.3）操作，连续克隆5-6代，待蚀斑均带有绿色荧光，且测序鉴定VP1以及VP2基因均正确，根据亲本株rMS△Meq的UL41区域设计UL41-JF/UL41-JR引物，亲本株扩增大小为650bp，重组MDV不能扩增，同时，利用IFA和WB检测VP1以及VP2基因的表达情况，经测序鉴定纯化获得表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株，命名为rMC- A2-GFP，引物序列如下所示：
其中，优选的，步骤4.2）p-sgRNA质粒和转移质粒共转染及病毒感染的具体方法是：将0.5g p-sgRNA1、0.5/>g p-sgRNA2以及1/>g转移质粒按100:1的比例用opti-MEN培养液稀释，再用3倍体积的TransIT-X2转染试剂混匀，孵育20min；配置好的溶液逐滴均匀加入长满CEF细胞的6孔板中进行转染，转染后的6孔板置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，转染12h，感染100PFU rMS△Meq毒株，感染12h后更换培养液，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养4天。
更进一步的，本发明还提出了所述的表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株在制备预防由CIAV 和MDV感染导致的疾病的疫苗中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明构建的重组病毒rMC-A2-GFP可以稳定表达VP1和VP2蛋白，并具有良好的遗传稳定性。该重组病毒rMC-A2-GFP与亲本疫苗株rMS△Meq具有一致的复制特性。接种动物后，重组病毒rMC-A2-GFP安全性好，对鸡无副作用。能够在免疫后产生较高水平的体液免疫和细胞免疫反应，可诱导机体产生CIAV特异性中和抗体。rMC-A2-GFP疫苗株不仅对CIAV提供有效的免疫保护，还能明显降低已感染CIAV的鸡群中胸腺萎缩的发生率，以及胸腺中CIAV的病毒载量，对已感染鸡体内的CIAV具有较强的清除作用。该重组疫苗在阻断CIA的水平传播和垂直传播中均能起到关键作用。本发明获得的表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株rMC-A2-GFP可以用于制备预防或治疗鸡传染性贫血病的药物。
附图说明
图1为本发明提供的VP2密码子优化后VP3基因表达鉴定；
图2为本发明提供的转移质粒酶切鉴定结果；
其中，M:DL15000maker；1为pCAGGS；2为转移质粒；
图3为本发明提供的转移质粒VP1和VP2蛋白表达的荧光结果；
其中，A为阴性对照质粒载体 pCAGGS；B为阳性对照质粒载体pEGFP-N1；C为转移质粒表达GFP的荧光图；D为VPI蛋白表达的阳性对照已知成功表达VPI蛋白的重组质粒pCAGGS-VPl；E为转移质粒通过anti-VP1验证VP1蛋白表达的荧光图；F为VP2蛋白表达的阳性对照已知成功表达VP2蛋白的重组质粒pCDNA3.1-VP2；G为转移质粒通过anti-VP2验证VP2蛋白表达的荧光图；
图4为本发明提供的转移质粒VP1和VP2蛋白表达的Western blot结果；
其中，1为已知成功表达VPI蛋白的重组质粒 pCAGGS-VP1；2为通过anti-VP1鉴定转移质粒中VPI蛋白表达；3为亲本毒rMS-△Meq；4为已知成功表达VP2蛋白的重组质粒pCDNA3.1-VP2；5为通过anti-VP2鉴定转移质粒中VP2蛋白表达；6为亲本毒rMS-△Meq；M为蛋白Marker；
图5为本发明提供的亲本rMS△Meq株和重组MDV rMC-A2-GFP株在CEF上产生的细胞病变；
图6为本发明提供的亲本rMS△Meq株和重组MDV rMC-A2-GFP株PCR鉴定；
其中，1为rMS-△Meq株；2为rMC-A2-GFP株；3为CAV HeN19/3001株；4为rMC-A2-GFP株；5为CAV HeN19/3001株；6为rMS-△Meq株;
图7为本发明提供的间接免疫荧光试验鉴定重组MDV 中VP1和VP2蛋白的表达结果；
图8为本发明提供的Western blot试验鉴定重组MDV 中VP1和VP2蛋白的表达结果；
图9为本发明提供的PCR法检测重组病毒的纯化情况；
图10为本发明提供的PCR法检测外源基因VP1和VP2在重组病毒传代中的遗传稳定情况；
图11为本发明提供的间接免疫荧光试验检测外源基因VP1和VP2在重组病毒传代中的稳定表达情况；
图12为本发明提供的亲本rMS△Meq株和重组MDV rMC-A2-GFP株在CEF上的复制曲线；
图13为本发明提供的重组MDV rMC-A2-GFP株免疫鸡攻毒CIAV后存活率；
图14为本发明提供的重组MDV rMC-A2-GFP株免疫21天攻毒7天胸腺图；
其中，A为空白对照组；B为攻毒对照组；C为免疫攻毒组；D为仅免疫组；
图15为本发明提供的各组CIA发病率；
图16为本发明提供的重组MDV rMC-A2-GFP株免疫鸡攻毒CIAV后胸腺中CIAV病毒载量；
图17为本发明提供的重组MDV rMC-A2-GFP株免疫后ELISA抗体检测；
其中，A为免疫后检测机体内CIAV ELISA抗体S/N值；B为免疫后检测机体内CIAVELISA抗体滴度；
图18为本发明提供的重组MDV rMC-A2-GFP株免疫后PBMCs中CD8+T细胞占比。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 表达CIAV VP1和VP2基因带荧光标记的转移质粒的构建
实验材料
rMS△Meq疫苗株（该毒株记载于公开号为CN102363769B，发明名称为“鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株，其构建方法及应用”的专利）、CIAV HeN19/3001株由哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室保存；CIAV VP1/VP2单克隆抗体均由哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室构建及保存；无特定病原体（SPF）鸡胚、鸡由哈尔滨兽医研究所动物中心提供；大肠杆菌DH5α为哈尔滨兽医研究所实验动物中心保存；DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自AxyPrep公司；质粒中提试剂盒购自QIAGEN公司；C112同源重组酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司；TranslT-X2转染试剂构自哈尔滨牧乐生物科技开发有限公司；Opti-MEN培养基、FITC标记的羊抗鼠IgG二抗购自Sigma公司。
2. 试验方法
1）以CIAV HeN19/3001株VP1基因（GenBank：MT332107）的DNA为模版，分别设计、合成特异性引物VP1-F1/VP1-R1、VP2-F1/VP2-R1，扩增并获得VP1、VP2片段，获得的VP2基因片段进行了密码子优化，其后以pEGFP-N1质粒载体为模版，设计、合成特异性引物GFP-kF/GFP-kR，扩增并获得GFP片段。将以上VP1、优化完VP2、GFP片段共同连接到pCAGGS质粒上，成功获得转移质粒表达CIAV VP1和VP2基因以及表达荧光报告基因GFP的转移质粒pCAGGS-VP1/2 cassette-GFP cassette-LHR-RHR，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
本发明在VP1基因扩增过程中的程序，优选为94℃预变性1min；98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min30s，35个循环。
优化后的VP2核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，VP2密码子优化后VP3基因表达鉴定结果如图1所示。特异性引物VP2-F1/VP2-R1序列如表1所示。
本发明在VP2基因扩增过程中的程序，优选为94℃预变性1min；98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min，35个循环。
本发明在GFP基因扩增过程中的程序，优选为94℃预变性1min；98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸2min，35个循环。
结果：成功构建转移质粒pCAGGS-VP1/2 cassette-GFP cassette-LHR-RHR，酶切鉴定结果如图2所示；转移质粒中GFP基因、VP1和VP2基因成功表达，如图3和4所示。
实施例2 重组MDV的拯救
（1）靶向MDV UL41基因sgRNA的设计和合成
1）根据rMS△Meq疫苗株的UL41序列，利用网站https：//zlab.bio/guide-design-resources设计靶向UL41基因sgRNA单正义链以及负义链。本发明所用的sgRNA序列如表2所示。
将sgRNA正义链和负义链退火形成互补的双链，PCR程序：95℃ 5min，75℃ 10min，65℃ 25min，25℃ 20min。
2）px330质粒载体的线性化：利用BbsI限制性核酸内切酶线性化px330质粒。
3）p-sgRNA质粒的合成：将线性化px330质粒与两条sgRNA利用T4连接酶进行连接，连接产物转入DH5α感受态细胞，获得两条p-sgRNA质粒。
（2）共表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV的拯救与筛选
1）p-sgRNA质粒和转移质粒共转染及病毒感染
将1g p-sgRNA1、1/>g p-sgRNA2以及1/>g pCAGGS-VP1/2 cassette-GFP cassette-LHR-RHR转移质粒按100:1的比例用opti-MEN培养液稀释，再用3倍体积的TransIT-X2转染试剂混匀，孵育20min。配置好的溶液逐滴均匀加入长满CEF细胞的6孔板中进行转染，同时转染pCAGGS质粒为阴性对照。转染后的6孔板置于含5％CO2的37℃培养箱中培养。转染12h，感染100PFU rMS△Meq毒株，感染12h后更换培养液。置于含5％CO2的37℃培养箱中培养4天。
2）重组MDV蚀斑筛选
胰酶消化培养4天的细胞，将打散的细胞悬液注入流式管中，进行流式分选。分选带绿色荧光的单个细胞加入96孔板中，置于5％CO2的37℃培养箱中培养4-5天。 在倒置荧光显微镜下标记带绿色荧光的蚀斑，在标记的蚀斑上滴加0.25％胰酶，消化数分钟，用枪尖划几下，吸起消化液，加入长成单层的鸡胚成纤维细胞中，长有单层细胞的平皿中吸出部分维持液洗一下标记并消化的蚀斑，加至长成单层的鸡胚成纤维细胞中，37°C，5％CO2继续培养，待长出蚀斑后，再次纯化。每克隆一代，提取DNA，分别利用VP1-JF/VP1-JR引物和VP2-JF/VP2-JR引物扩增VP1和VP2的基因，PCR产物连接pMD-18 T载体，测序鉴定。本发明所用的VP1-JF/VP1-JR、VP2-JF/VP2-JR序列如表2所示。
结果：成功拯救出表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV，该重组毒与亲本株细胞病变形态无明显差别，如图5所示；重组毒中VP1和VP2基因均为预期片段大小。VP1基因扩增大小为1203bp，VP2基因扩增大小为620bp，如图6所示；重组毒中的GFP基因、VP1和VP2基因均成功表达，如图7、8所示。
3）重组MDV蚀斑纯化
重复以上操作，连续克隆5-6代，待蚀斑均带有绿色荧光，且测序鉴定VP1和VP2基因均正确。根据亲本株rMS△Meq的UL41区域设计UL41-JF/UL41-JR引物，亲本扩增大小为650bp，重组MDV不能扩增。同时，利用IFA和WB检测VP1和VP2基因的表达情况。经测序鉴定纯化且VP1和VP2基因稳定表达的病毒命名为rMC- A2-GFP。本发明所用的UL41-JF/UL41-JR序列如表2所示。
结果：如图9所示，随着重组MDV克隆次数的增加，无亲本株存在，即重组MDV完全纯化。
实施例3 重组MDV毒株rMC- A2-GFP的生物学特性
（1） 重组MDV毒株rMC-A2-GFP毒株遗传稳定性
在相同培养条件下，分别培养亲本病毒rMS△Meq和rMC-A2-GFP毒株，在显微镜下观察蚀斑大小、折光性、形状和形态的变化情况。纯化后的重组毒在CEF上连续继传至F20代，每一代次均在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况。在病毒传代至3代时，用检测引物进行PCR检测，连续继传至F20代，利用IFA和WB检测F20代VP1和VP2基因的表达情况。
结果：如图10、11所示，rMC- A2-GFP株可稳定遗传且表达VP1和VP2基因。
（2） 重组MDV毒株rMC-A2-GFP毒株体外生长特性
在相同培养条件下，在铺满原代CEF的六孔板的板孔里分别感染亲本病毒rMS△Meq和rMC-A2-GFP毒株100PFU，在感染后24h、48h、60h、72h、96h、120h和144h收取病毒毒液，冻存于液氮罐中。收取完毕后，将冻存的细胞毒液分别以1000倍、10000倍稀释感染铺满单层细胞的六孔板，每24h收集的细胞毒同时做3个重复。培养6天，显微镜下观察并记录各孔的蚀斑数，并计算出各天蚀斑总数和平均蚀斑数。
结果：rMC- A2-GFP株的体外生长性能与亲本株rMS△Meq无明显差异，如图12所示。
（3）重组MDV毒株rMC- A2-GFP对CIAV免疫保护效力评价
50只1日龄SPF白色来航鸡随机分成4组，其中前2组每组10只，后2组15只，第1组为空白对照组，第2组为重组MDV毒株rMC- A2-GFP免疫组，第3组为CIAV强毒攻毒对照组，第4组为重组MDV毒株rMC- A2-GFP免疫CIAV强毒攻毒组，上述4组分别饲养于负压隔离器中，雏鸡自由采食及饮水。重组MDV毒株rMC-A2-GFP免疫剂量为每只5000PFU，腹腔注射。免疫组于每周采取翅静脉血，用于检测ELISA抗体。免疫后的第21天使用CIAV强毒 JL17P10株攻毒，攻毒剂量为每只105.5TCID50，腹腔注射。分别在攻毒后7天、12天全部剖检，记录每只鸡胸腺萎缩情况，确定是否是CIA发病（注：CIAV阳性率计算
方式为： 即判定为CIA发病且该组群鸡只CIA发病
达到60% 即认定攻毒对照成立。ELISA抗体的S/N值<0.6为EIISA抗体阳性，且抗体滴度达到2050为阳性。）并做生物学统计。实验分组如表3所示。
此次动物试验中免疫组在试验期内健康、无发病和死亡，该重组MDV毒株rMC- A2-GFP具有良好的安全性；由图13、14、图15及表4可见，攻毒后7天（7dpc），CIAV攻毒对照组的CIA发病率为80%，攻毒对照组成立；免疫攻毒组中一只鸡发病，CIA发病率为1/7（14%）；由表4中可见，7dpc和12dpc，免疫攻毒组胸腺指数均显著高于攻毒对照组，表明重组MDV毒株rMC- A2-GFP对CIAV起到良好的免疫保护效果，显著降低CIAV感染后导致的胸腺萎缩。图16的结果显示，重组MDV毒株rMC-A2-GFP可以显著的降低胸腺中CIAV的病毒载量，可以有效的阻止CIAV的感染；如图17所示，重组MDV毒株rMC-A2-GFP在免疫后第4周（4wpv）检测的CIAVELISA抗体为阳性，抗体滴度达到1×104，直至7wpv抗体滴度处于持续升高的趋势。证明该重组MDV毒株rMC-A2-GFP可以引起高水平的体液免疫反应；图18中，该重组MDV毒株rMC-A2-GFP在3wpv和4wpv时可引起PBMCs中较高的CD8+ T细胞的占比，即免疫后可以引起较高水平的细胞免疫反应。
不同的小写字母表示各组之间的统计学显著差异（p＜0.0001）。
Claims (6)
1.表达鸡传染性贫血病病毒（Chicken infectious anemia virus, CIAV）VP1和VP2基因的重组鸡马立克病病毒（Marek’s diease virus, MDV）疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是以MDV血清1型疫苗株rMS△Meq为载体，通过CRISPR/Cas9操作技术，将表达CIAV VP1和VP2基因以及表达荧光报告基因GFP的转移质粒插入所述的MDV血清1型疫苗株rMS△Meq的UL41基因内部后获得的表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株，对所述的VP2基因进行了密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株，其特征在于，所述的表达CIAV VP1和VP2基因以及表达荧光报告基因GFP的转移质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.如权利要求1所述的表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株，其特征在于，CRISPR/Cas9操作中涉及的sgRNA的序列如下所示：
。
4.一种构建权利要求1-3任一项所述的表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）以CIAV HeN19/3001株VP1、VP2基因的DNA为模版，分别设计、合成特异性引物VP1-F1/VP1-R1、VP2-F1/VP2-R1，扩增并获得VP1、VP2片段，获得的VP2基因片段进行了密码子优化，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
2）以pEGFP-N1质粒载体为模版，设计、合成特异性引物GFP-kF/GFP-kR，扩增并获得GFP片段；
3）将以上VP1、优化完VP2和GFP基因片段共同连接到pCAGGS质粒上，成功获得表达CIAVVP1和VP2基因以及表达荧光报告基因GFP的转移质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，引物序列如下所示：
；
4）重组MDV的拯救
4.1）根据rMS△Meq疫苗株的UL41序列，设计靶向UL41基因sgRNA单正义链以及负义链，所述的sgRNA序列如下所示：
；
两条sgRNA双链分别与线性化的px330质粒载体连接，分别获得p-sgRNA1以及p-sgRNA2质粒；
4.2）转染CEF细胞
将p-sgRNA1、p-sgRNA2以及转移质粒共转染CEF细胞12h后，感染 rMS△Meq毒株，37培养4天；
4.3）共表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV的拯救
消化培养的CEF细胞，将打散的细胞悬液注入流式管中，进行流式分选，分选带绿色荧光的单个细胞，然后进行蚀斑筛选、纯化、每克隆一代，提取DNA，分别利用VP1-JF/VP1-JR引物和VP2-JF/VP2-JR引物扩增VP1和VP2的基因，PCR产物连接pMD-18 T载体，测序鉴定，引物序列如下所示：
；
4.4）共表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV的筛选
重复4.3）操作，连续克隆5-6代，待蚀斑均带有绿色荧光，且测序鉴定VP1以及VP2基因均正确，根据亲本株rMS△Meq的UL41区域设计UL41-JF/UL41-JR引物，亲本株扩增大小为650bp，重组MDV不能扩增；同时，利用IFA和western blotting检测VP1以及VP2基因的表达情况，经测序鉴定纯化获得表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株，命名为rMC- A2-GFP，引物序列如下所示：
。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4.2）p-sgRNA质粒和转移质粒共转染及病毒感染的具体方法是：将0.5g p-sgRNA1、0.5/>g p-sgRNA2以及1/>g转移质粒按100:1的比例用opti-MEN培养液稀释，再用3倍体积的TransIT-X2转染试剂混匀，孵育20min；配置好的溶液逐滴均匀加入长满CEF细胞的6孔板中进行转染，转染后的6孔板置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，转染12h，感染100 PFU rMS△Meq毒株，感染12h后更换培养液，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养4天。
6.权利要求1-3任一项所述的表达CIAV VP1和VP2基因的重组MDV疫苗株在制备预防由CIAV感染导致的疾病的疫苗中的应用。
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