CN113151193B - 血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rR188I及其构建方法和应用 - Google Patents

血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rR188I及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rR188I及其构建方法和应用。本发明的疫苗株rR188I是在我国FAdV‑4新近分离株HLJFAd15基因组全长的感染性克隆粘粒Fos‑rFAdV4基础上将Hexon基因的第563位碱基由G突变为A，即编码的第188位氨基酸由R突变为I，获得感染性克隆粘粒Fos‑rR188I，然后利用Fos‑rR188I成功拯救出疫苗株rR188I。致病性实验显示rR188I对SPF鸡无致病性(突变之前具有100％的死亡率)。免疫保护实验证明，接种rR188I的SPF鸡可以完全抵抗FAdV‑4强毒株的攻毒感染，证明rR188I具有非常好的免疫原性，可以作为疫苗候选毒株，同时致弱毒株大大降低了强毒株生物安全的隐患。

Description

血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rR188I及其构建方法和 应用
技术领域
本发明涉及一株血清4型禽腺病毒疫苗株及其构建方法和应用，特别涉及一株通过点突变获得的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株及其构建方法和应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
禽腺病毒(FAdVs)在全世界广泛流行，流行毒株主要有FAdV-4、FAdV-11、FAdV-1、FAdV-8a、FAdV-8b等血清型，给家禽养殖业造成了严重的经济损失。FAdVs感染最早于1987年在巴基斯坦的安卡拉地区发现，因此该病也称为“安卡拉病”，之后在中国、日本、韩国、印度、美国、加拿大等不同国家和地区都有相关的报道。FAdVs根据群特异性抗原的不同可以分为3个群：I群包括传统的从鸡、火鸡、鹅及其他禽类获得的腺病毒；II群主要是和火鸡出血性肠炎、大理石脾病相关的腺病毒；III群主要是与减蛋综合征病毒有关的一类病毒。I群腺病毒根据分子结构可以进一步分为5个种(A-E)，根据血清型不同分为12个血清型(1-7、8a、8b、9-11)。I群禽腺病毒致病性差异很大，致病毒株主要导致心包积液、包涵体肝炎、肌胃糜烂等症状；非致病毒株可以在家禽体内持续感染复制，具有开发疫苗载体的潜力。
2015年06月以来，由高致病性血清4型禽腺病毒(FAdV-4)感染引起的禽心包积液-包涵体肝炎综合征(HHS)在我国的江苏、山东、黑龙江、湖北等省份突发流行，死亡率高达30％-100％，给我国家禽养殖产业造成巨大的经济损失，对我国家禽绿色健康养殖构成巨大的威胁和挑战。FAdV-4感染的家禽出现急性死亡，死亡高峰集中在1周之内，死亡家禽出现典型的心包积液以及包涵体肝炎症状。此外，FAdV-4感染能够导致宿主的免疫抑制，由此导致的免疫失败、继发感染、混合感染进一步加剧了HPS的危害。FAdV-4的感染宿主非常广泛，不仅感染规模养殖的蛋鸡、肉鸡、肉种鸡，也可以感染鸭、鹅及多种野生鸟类，FAdV-4感染宿主多样性增加了跨宿主传播的潜在风险，给该病的科学防控增加了难度。此外，FAdV-4不仅可以通过呼吸道等途径进行水平传播，还可以通过鸡胚进行垂直传播，对鸡胚源兽用疫苗的生产构成威胁，部分人用疫苗也是通过鸡胚进行生产，这也给人类公共卫生安全构成一定的潜在威胁。
因此，开发安全有效的疫苗是防控HPS的关键。关于疫苗研发已经有很多相关报道，但是之前的疫苗成分研究主要集中在两个方面：一个是强毒灭活作为免疫原，二是表达FAdV-4的某一个蛋白作为亚单位疫苗。本发明发明人对我国新发流行的高致病性FAdV-4进行了持续的流行病学监测和遗传进化分析，分离鉴定了蛋鸡分离株HLJFAd15，并首次利用Fosmid系统建立了FAdV-4的反向遗传操作系统，利用该系统将强毒株的hexon基因进行替换拯救获得rR188I毒株，致病性实验显示rR188I对SPF鸡无致病性(突变之前具有100％的死亡率)。免疫保护实验证明，接种rR188I的SPF鸡可以完全抵抗FAdV-4强毒株的攻毒感染，证明rR188I具有非常好的免疫原性，可以作为疫苗候选毒株，同时致弱毒株大大降低了强毒株生物安全的隐患。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株及其构建方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株，所述的疫苗株是通过将我国FAdV-4新近分离株HLJFAd15的Hexon基因的第563位碱基由G突变为A，即编码的第188位氨基酸由R突变位I，然后通过病毒拯救后获得的。
其中，优选的，所述的FAdV-4新近分离株HLJFAd15的全基因组GenBank序列号为KU991797.1。
进一步的，本发明还提出了构建所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株的方法，包括以下步骤：
(1)含有HLJFAd15毒株完整基因组的粘粒的构建
获得FAdV-4新近分离株HLJFAd15毒株的全基因序列，HLJFAd15的全基因组GenBank序列号为KU991797，连接至pCC1Fos载体，经噬菌体包装后电转进EPI300感受态细胞中，涂布在氯霉素抗性LB平板上，挑取阳性克隆，经ZRBAC DNA miniprep Kit提取粘粒后，使用载体通用引物测序，得到含有HLJFAd15毒株完整基因组的粘粒，命名为Fos-rFAdV4；
(2)rR188I感染性克隆粘粒的构建
将HLJFAd15的Hexon基因克隆至pCAGGS载体中，所用引物为pCAGGS-Hexon F/R，然后将Hexon基因的第563位碱基由G突变为A，即编码的第188位氨基酸由R突变为I，所用引物为pR188I F/R，生成突变质粒pCAGGS-Hexon-R188I；接着使用Counter-Selection BACModification Kit构建rR188I感染性克隆粘粒，方法如下：首先将步骤(1)构建的Fos-rFAdV4电转进DH10B感受态细胞中，通过氯霉素抗生素筛选阳性克隆；然后再将Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒中的重组酶质粒pRed E/T电转进含Fos-rFAdV4的DH10B感受态细胞中，通过氯霉素和链霉素筛选阳性克隆；以Counter-Selection BACModification Kit试剂盒中的rpsl-neo表达盒DNA为模板，使用引物R188I-rpslneo F和R188I-rpslneo R扩增带有需替换Hexon基因片段两端各50bp同源臂的rpsl-neo表达盒，将回收的PCR产物直接转化进入经L-阿拉伯糖诱导的含有Fos-rFAdV4和pRed E/T的DH10B感受态细胞中，即可替换原始Hexon基因，通过氯霉素、链霉素和卡那霉素抗生素筛选阳性克隆，得到Fos-rFAdV4-Hexon-rpslneo；再以相同方式，以pCAGGS-hexon-R188I质粒为模板，所述的pCAGGS-hexon-R188I质粒为HLJFAd15毒株Hexon基因克隆到pCAGGS中得到，使用引物R188I F和R188I R扩增突变的Hexon基因，将PCR产物电转进上一步阳性克隆制备的经L-阿拉伯糖诱导的含Fos-rFAdV4-Hexon-rpslneo的DH10B感受态中，通过链霉素和氯霉素抗生素筛选得到Hexon基因的第563位碱基由G突变为A，即第188位氨基酸由R突变为I的阳性克隆，命名为Fos-rR188I；引物序列如下：
pCAGGS-Hexon F：CATCATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGGCGGCCCTCACGCCCGACCTG
pCAGGS-Hexon R：GTCAGGAACATCGTATGGGTACACGGCGTTGCCTGTGGCGAAAGG
pR188I F：CAGGGACCCGGAAtAAATCCTCTGCGA
pR188I R：TCGCAGAGGATTTaTTCCGGGTCCCTG
R188I-rpslneo F：CACGGCTTACAACCCGCTGGCTCCCAAGGAGTCCATGTTTAACAACTGGTGGCCTGGTGATGATGGCGGGATCG
R188I-rpslneo R：GTGTCGAACACGCCATAGAGCATGTACACGTAAGTGGGATCATCCATGGGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG
R188I F：CACGGCTTACAACCCGCTGGCTCC
R188I R：GTGTCGAACACGCCATAGAGCATG
(3)病毒拯救
用QIAGEN质粒中提试剂盒提取Fos-rR188I粘粒，用FseI限制性内切酶进行线性化，通过醇沉回收DNA，将LMH细胞接种至6孔板，用转染试剂X-tremeGene HP DNATransfection Reagent Kit转染线性化的Fos-rR188I，转染后6h更换新鲜培养基，5d后将6孔板放入-80℃冰箱反复冻融3次，离心，收集上清，即为拯救所获的rR188I重组毒。
更进一步的，本发明还提出了所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株在制备防治由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)感染引起的禽心包积液-包涵体肝炎综合征(HHS)、包涵体肝炎(IBH)药物中的应用。
其中，优选的，所述的药物为疫苗。
一种血清4型禽腺病毒弱毒活疫苗，其含有本发明所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明发明人对我国新发流行的高致病性FAdV-4进行了持续的流行病学监测和遗传进化分析，分离鉴定了蛋鸡分离株HLJFAd15，并利用其感染性克隆粘粒Fos-rFAdV4，统将强毒株的hexon基因第188位氨基酸由R突变位I拯救获得rR188I毒株，致病性实验显示rR188I对SPF鸡无致病性(突变之前具有100％的死亡率)。免疫保护实验证明，接种rR188I的SPF鸡可以完全抵抗FAdV-4强毒株的攻毒感染，因此说明rR188I具有非常好的免疫原性，可以作为疫苗候选毒株，同时致弱毒株大大降低了强毒株生物安全的隐患。
附图说明
图1为肝脏DNA进行PCR扩增结果；
其中，M：DL2,000；1：HLJFAd15；+：阳性对照；-：阴性对照；
图2为HLJFAd15的hexon序列分析；
图3为HLJFAd15的1966bp缺失序列分析；
图4为HLJFAd15毒株的细胞培养；
其中，A：HLJFAd15感染LMH细胞；B：正常细胞；
图5为HLJFAd15毒株感染SPF鸡胚的症状及病理变化；
其中，A：肝脏出现点状坏死；B：肝细胞出现包涵体；
图6为HLJFAd15感染SPF鸡死亡曲线；
图7为HLJFAd15感染SPF鸡临床剖检症状；
其中，A：空白对照组；B：点眼滴鼻攻毒组；C：肌肉注射攻毒组；
图8为HLJFAd15感染SPF鸡肝脏病理变化；
其中，A：肝细胞出现大量包涵体；B：肝脏出现大量病毒粒子；
图9为17株临床FAdV-4毒株的鉴定；
图10为我国新发流行FAdV-4毒株1966bp天然缺失的流行情况；
图11为Fos-rFAdV4粘粒构建示意图；
图12为Fos-rR188I粘粒构建示意图；
图13为Fos-rFAdV4图谱；
图14重组毒生长曲线；
图15为rR188I安全性评价幸存曲线；
图16为rR188I安全性评价病理切片；
图17为rR188I肌肉注射免疫2周龄SPF鸡攻毒保护情况幸存曲线；
图18为rR188I肌肉注射免疫2周龄SPF鸡攻毒保护情况病理切片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 新发血清4型禽腺病毒强毒株HLJFAd15的分离鉴定
1.材料和方法
1.1实验材料
1.1.1毒株及细胞
FAdVs疑似病料采集于我国不同省份发病鸡场，病毒从患有FAdVs疑似症状的鸡、鸭肝脏中分离获得。
LMH细胞购自ATCC，在1％青链霉素、10％FBS(购自Gibco公司)的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养。
1.1.2主要实验试剂
Ex Taq预混酶、PrimerSTARMax预混酶、DL 2,000Marker购自TaKaRa试剂公司；DNA提取试剂盒购自Axygen公司；DNase/RNase DeionizedWater(dd H2O)购自北京天根有限公司；琼脂糖购自Invivogen公司；引物由吉林库美生物科技有限公司合成；荧光定量探针由哈尔滨赛信生物科技开发有限公司合成。
1.1.3主要实验仪器
高通量组织破碎仪购自Retsch公司；小型高速离心机、PCR仪购自Eppendorf公司；核酸胶凝胶成像仪器购自GENE公司；旋涡震荡器购自IKA公司；荧光定量PCR仪LightCycler480购自Roche公司。
1.1.4实验动物
本研究中SPF鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，并由实验动物中心(许可证号：SQ 2019-195)饲养。本研究中涉及的所有动物实验均已获得黑龙江省动物实验伦理委员会批准(许可证号：SQ20150508)，并按照科学技术部的《实验动物指南》以及动物道德准则和批准的规程进行操作。
1.2实验方法
1.2.1病料的分离鉴定
取病鸡的肝脏(1.0～2.0g)置于1.5mL无菌的离心管内，加入1mL无菌的PBS，每管加入2个钢珠，反复冻融3次，利用研磨仪对组织进行研磨破碎，震荡指数为300rps，3min。将研磨好的组织悬液12,000rpm、4℃条件下离心2min，取200μL上清进行病毒DNA的提取，具体操作如下：
1.向200μL病毒悬液中加入200μLBufferV-L，旋涡振荡混匀，室温静置5min；
2.加入75μLBufferV-N，旋涡振荡混匀，12,000g离心5min；
3.将上清转移至2mL离心管中，加入300μL含1％冰乙酸的异丙醇，上下颠倒混匀；
4.将混合液转移到制备管中，6,000g离心1min；
5.弃滤液，加入500μLW1洗涤液，12,000g离心1min；
6.弃滤液，加入800μLW2洗涤液，12,000g离心1min；
7.弃滤液，12,000g空离1min；
8.将制备管放到1.5mL离心管内，加入40μL dd H2O，室温静置1min，12,000g离心1min；得到DNA产物，将DNA产物浓度稀释至50ng/μL备用。
1.2.2FAdV-4PCR鉴定及测序
取1.2.1种提取的DNA为模板，运用实验室前期根据Hexon区域建立的FAdV-I通用PCR检测方法进行PCR检测。
表1 FAdV-I通用PCR检测引物序列
引物 序列
FAdV-IF GCCACCGGAAGCTACTTTGA
FAdV-IR TTGTGATCCATGGGCATGA
PCR反应体系为25μL：
反应程序为：
取5μL PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测，将含有目的条带的PCR产物进行测序。
同时根据文献报道的方法对外源DNA和RNA病毒进行检测：以1.2.1中提取的DNA为模板，进行MDV(Lv et al.,2017)、NDV(Zhu et al.，2016)、ALV(Wang et al.，2014)等外源DNA病毒的检测；提取病毒RNA并制备cDNA，进行ARV(Zhong et al.，2016)、IBDV(Lu etal.，2015)和IBV(De Wit etal.，1995)等外源RNA病毒的检测。
1.2.3 FAdV-4的分离培养
取1.2.1中研磨的病毒悬液的上清，过滤除菌后接种于LMH细胞中，同时设置阴性对照，每天观察LMH细胞的状态，连续培养7天，如未出现CPE，反复冻融三次后取上清进行盲传，直至出现明显的CPE，根据ReedMuench方法(Reed andMuench，1938)计算TCID50。
1.2.4 FAdV-4的全基因组测序
利用GenBank上提供的FAdV-4参考毒株，分析毒株相对保守区域，设计36对引物，对各部分序列进行扩增、测序。
PCR反应体系为50μL：
PCR反应程序为：
对PCR产物进行检测，将含有目的条带大小的PCR产物进行测序。
表2 FAdV-4全基因组测序PCR检测引物
1.2.5 FAdV-4序列分析
将1.2.4获得的序列使用Seqman软件进行拼接，并用Clustal X程序(2.0版)和MEGA 6.0程序版本3.1(Larkin et al.，2007)进行进化树分析。
1.2.6 FAdV-4致病性分析
实验中使用的SPF鸡、SPF鸭均采购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，操作过程严格按照实验动物操作规范，同时考虑动物福利，减轻动物的数量和痛苦。实验分组均为随机分组，病毒接种途径包括点眼滴鼻和肌肉注射两种常规接种方式，空白组接种PBS作为阴性对照组。接种后每天观察SPF鸡的死亡情况以及临床症状，并在感染后按照不同动物实验的需求，按照实验方案采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺和法氏囊等组织样品。实验中设计的病理切片的制备和观察由哈尔滨兽医研究所病理组完成，将采集的内脏组织利用福尔马林进行固定，切成薄片，用HE染色，进行病理切片分析。
1.3实验结果
1.3.1 HLJFAd15的分离、鉴定及致病性分析
1.3.1.1 HLJFAd15的PCR鉴定
提取严重HHS症状的鸡肝脏组织DNA，利用PCR方法扩增其血清型特异性的hexon的L1序列，测序之后进行序列比对分析发现，HLJFAd15毒株为FAdV-4(图1)。
1.3.1.2 HLJFAd15的hexon序列分析
HLJFAd15毒株鉴定为FAdV-4之后，设计针对FAdV-4的hexon序列的特异性引物，扩增其全长hexon序列并进行序列分析，结果发现HLJFAd15毒株与我国流行JSJ13毒株高度同源(图2)。
1.3.1.3 HLJFAd15的hexon序列分析
通过hexon全长序列比对，确定HLJFAd15毒株为FAdV-4，鉴于HLJFAd15毒株与JSJ13毒株高度同源，我们根据JSJ13毒株的序列(GenBank序列号：KM096544)设计了36对引物，扩增了HLJFAd15毒株的全基因组序列，并上传至GenBank(序列号：KU991797.1)。通过全基因组序列分析发现，HLJFAd15毒株的基因组在ORF42和ORF43之间存在1966bp的大片段天然缺失(图3)，证实为我国新发的FAdV-4毒株。
1.3.1.4 HLJFAd15毒株的分离
通过全基因组序列分析，HLJFAd15毒株鉴定为我国新发的新基因型FAdV-4，之后在LMH细胞进行了病毒的分离。HLJFAd15毒株可以很好的感染LMH细胞，感染72h后产生明显的CPE(图4)。HLJFAd15毒株感染LMH细胞之后，进行噬斑纯化，纯化后的病毒用于后续研究。
1.3.1.5 HLJFAd15毒株ELD50的测定
9日龄的SPF鸡胚通过尿囊膜接种0.2mL的肝脏研磨液上清之后，在接种后5～7天出现死亡，死亡的鸡胚表现出典型的腺病毒感染症状，病死鸡胚肝脏出现白色或浅黄色坏死灶，肝脏病理切片显示肝脏细胞中出现典型的包涵体(图5)。根据最终死亡结果，按照Reed-Muench公式计算HLJFAd15毒株的病毒滴度为106.35ELD50/0.2mL。
1.3.1.6 HLJFAd15毒株感染SPF鸡动物模型的建立
35日龄的SPF鸡(13只/组)通过点眼滴鼻(PO)或者肌肉注射(IM)的攻毒途径，接种106.0ELD50/0.2mL的HLJFAd15病毒液，连续观察10天。结果显示IM组SPF鸡死亡高峰出现在2～4天，死亡率达到100％，而IM组SPF鸡死亡高峰出现在3～6天，死亡率为76.9％(图6)。
对病死的SPF进行解剖发现，SPF鸡出现典型的心包积液、肝脏肿大症状，心包腔内出现大量的淡黄色液体(图7)，与临床感染症状一致，证明我们成功建立了新型FAdV-4的SPF鸡攻毒感染模型。
采集肿大的肝脏用福尔马林固定之后，制作病理切片，进行HE染色，观察可以发现病变肝脏细胞中出现大量的包涵体，同时透射电镜观察可见肝脏组织中含有大量的病毒粒子(图8)。
1.3.1.7新发FAdV-4临床毒株的流行
选取了17株背景清晰的临床分离致病毒株(表3)，对病毒pVIII至GAM-1序列进行测定和分析，结果显示我国17株不同地区的临床分离毒株在ORF42和ORF43之间均存在1966bp的大片段的一致性天然缺失(图9、图10)。
表3 我国FAdV-4流行毒株背景信息
HHS：心包积液-包涵体肝炎；IBH：包涵体肝炎
实施例2FAdV-4反向遗传疫苗株rR188I的构建
1材料和方法
1.1病毒、细胞和菌株
新发血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus 4,FAdV-4)HLJFAd15毒株由实施例1分离鉴定，NCBI登录号：KU991797.1。HLJFAd15感染性克隆粘粒Fos-rFAdV4、鸡肝癌细胞(Chicken Leghorn Male Hepatocellular Cell,LMH)、DH10B感受态菌株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病团队(以下简称本实验室)保存。
1.2主要试剂
Counter-Selection BAC Modification Kit购自Gene Bridges公司；β-琼脂糖I、FseI限制性内切酶购自NEB公司；PrimeSTAR HS DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；凝胶回收试剂盒购自AxyPrep公司；质粒中提试剂盒购自QIAGEN公司。EDTA-胰酶消化液、青链霉素双抗购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司；DMEM/F12、Opti-MEM、FBS购自gibico公司；转染试剂X-tremeGene HP DNA Transfection Reagent Kit购自Roche公司。
1.3引物及DNA片段的合成
本实施例涉及到的引物如表4，由吉林省库美生物科技有限公司合成。
表4 引物
注：下划线表示同源臂，小写字母表示突变
1.4 FAdV-4感染性克隆粘粒的构建
将FAdV-4HLJFAd15毒株接种至LMH细胞扩大培养后，采用实验室前期建立的禽腺病毒病毒粒子纯化和DNA提取方法，提取FAdV-4HLJFAd15毒株病毒基因组。将基因组使用End-Repair Enzyme Mix进行末端平末端修饰，通过脉冲场凝胶电泳，用β-琼脂糖I胶回收约43kb大小的DNA。按照CopyControlTM Fosmid Library Production Kit产品说明书，将回收的DNA连接至pCC1Fos载体，经噬菌体包装后电转进EPI300感受态细胞中，涂布在氯霉素抗性LB平板上。挑取100个阳性克隆，经ZRBAC DNA miniprep Kit提取粘粒后，使用载体通用引物测序，得到FAdV-4基因组完整的粘粒Fos-rFAdV4，Fos-rFAdV4粘粒构建示意图如图11所示。
1.5 rR188I感染性克隆粘粒的构建
按常规方法，将HLJFAdV15的Hexon基因克隆至pCAGGS载体中，所用引物为pCAGGS-Hexon F/R，然后将Hexon基因的第563位碱基由G突变为A，即第188位氨基酸由R突变为I，所用引物为pR188I F/R，生成突变质粒pCAGGS-Hexon-R188I。接着使用Counter-SelectionBAC Modification Kit构建rR188I感染性克隆粘粒。简述如下：首先将Fos-rFAdV4电转进DH10B感受态细胞中，通过氯霉素抗生素筛选阳性克隆；然后再将Counter-Selection BACModification Kit试剂盒中的重组酶质粒pRed E/T电转进含Fos-rFAdV4的DH10B感受态细胞中，通过氯霉素和链霉素筛选阳性克隆；以Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒中的rpsl-neo表达盒DNA为模板，使用引物R188I-rpslneo F和R188I-rpslneo R扩增带有需替换Hexon基因片段两端各50bp同源臂的rpsl-neo表达盒，将回收的PCR产物直接转化进入经L-阿拉伯糖诱导的含有Fos-rFAdV4和pRed E/T的DH10B感受态细胞中，即可替换原始Hexon基因，通过氯霉素、链霉素和卡那霉素抗生素筛选阳性克隆，得到Fos-rFAdV4-Hexon-rpslneo。再以相同方式，以pCAGGS-Hexon-R188I质粒为模板，使用引物R188I F和R188I R扩增突变的Hexon基因(R188I)，将PCR产物电转进上一步阳性克隆制备的经L-阿拉伯糖诱导的含Fos-rFAdV4-Hexon-rpslneo的DH10B感受态中，通过链霉素和氯霉素抗生素筛选得到阳性克隆Fos-rR188I，构建示意图如图12所示。
1.6病毒拯救
用QIAGEN质粒中提试剂盒提取Fos-rFAdV4、Fos-rR188I粘粒，用FseI限制性内切酶进行线性化，通过醇沉回收DNA。将LMH接种至6孔板，16h后用转染试剂X-tremeGene HPDNA Transfection Reagent Kit分别转染线性化的Fos-rFAdV4和Fos-rR188I，转染后6h更换新鲜培养基。5d后将6孔板放入-80℃冰箱反复冻融3次，3300g离心5min，收集上清，即为拯救所获的rFAdV-4和rR188I重组毒。将rFAdV-4和rR188I在LMH细胞上连续培养传代，收集冻融后的上清冻存。
1.7重组毒鉴定及体外生长特性评价
取第五代重组毒，提取DNA后，用引物Hexon F和Hexon R做PCR扩增和测序。将rFAdV-4和rR188I按MOI 0.01剂量接种LMH，于接毒后12h、24h、48h、72h、96h、120h收取病毒，用噬斑法测定各点的病毒滴度。
2、结果
2.1 FAdV-4感染性克隆粘粒的构建
挑取的100个克隆中，经FAdV-4基因组末端测序鉴定，获得1个包含FAdV-4基因组全长的粘粒Fos-rFAdV4(图13)。
2.2 rR188I感染性克隆粘粒的构建
经测序比较，获得了以HLJFAd15毒株为骨架，Hexon基因第563位碱基由G突变为A(即第188位氨基酸由R突变为I)的重组嵌合粘粒Fos-rR188I。
2.3重组毒的拯救
线性化的粘粒Fos-rFAdV4和Fos-rR188I转染LMH均出现典型的FAdV-4病变，并且能稳定传代，成功拯救重组毒rFAdV-4和rR188I。提取病毒基因组后，用Hexon F和Hexon R为引物，以重组毒rFAdV-4和rR188I DNA作为模板进行PCR扩增，将PCR产物送测序，结果显示rFAdV-4的Hexon基因与HLJFAd15毒株一致，rR188I的Hexon基因Hexon基因第563位碱基由G突变为A(即第188位氨基酸由R突变为I)。rFAdV-4和rR188I生长曲线无明显差异(图14)。
实施例3 FAdV-4反向遗传疫苗株rR188I免疫效果初步评估
1材料和方法
1.1细胞和病毒
鸡肝癌细胞(Chicken Leghorn Male Hepatocellular Cell,LMH)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病团队(以下简称本实验室)保存。
新发血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus 4,FAdV-4)HLJFAd15毒株由实施例1分离鉴定。反向遗传重组亲本毒rFAdV-4、反向遗传疫苗株rR188I由实施例2构建。
1.3试验动物
无特定病原体(Specific-pathogen-free，SPF)鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所试验动物中心，饲养在该中心的负压隔离器内。
1.4病毒和疫苗培养
将LMH细胞培养于细胞培养瓶中，待细胞铺满时，用无血清培养基按0.01MOI的量接种HLJFAd15、rFAdV-4和rR188I。在37℃细胞培养箱吸附1h，之后更换细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM培养基)，继续置于37℃细胞培养箱培养，逐日观察细胞病变(CPE)情况。接毒后72h，将细胞反复冻融三次，3300g离心5min，收集细胞悬液即为病毒或疫苗。本研究培养的HLJFAd15滴度1.36×107PFU/ml，rFAdV-4滴度为3.12×107PFU/ml，rR188I滴度为3.43×107PFU/ml；经检测无支原体、无细菌、无外源病毒，纯净性良好。分装并置于负80℃冰箱备用。
1.5疫苗株rR188I安全性评价
为检测rR188I对免疫鸡的安全性，将30只3周龄的SPF鸡随机分成3组，每组10只，其中2组每只鸡分别肌肉注射rFAdV-4和rR188I各2×105PFU，1组作为空白对照。每天观察鸡的发病和死亡情况，持续观察2周。剖检病死鸡及试验终点安乐死鸡，将肝脏制作病理切片，经过HE染色后观察。
1.6疫苗株rR188I有效性评价
将30只1周龄的SPF鸡随机分成3组，每组10只，其中1组按2×105PFU/羽剂量肌肉注射免疫rR188I，1组注射DMEM/F12培养基作为攻毒对照，另1组不做任何处理作健康对照组。2周后，用HLJFAd15按2×103PFU/羽攻毒免疫组和攻毒对照组，健康对照不做任何处理。攻毒后每天观察鸡的发病和死亡情况，持续观察2周。剖检病死鸡及试验终点安乐死鸡，将肝脏、脾脏和法氏囊制作病理切片，经过HE染色后观察。
2、结果
2.1疫苗安全性评价结果
在注射后第2天，rFAdV-4组出现死亡，第3天达到100％死亡。rR188I和空白对照组鸡全部存活，持续观察2周无明显异常。rFAdV-4组鸡肝脏出现严重病变，rR188I和空白对照组鸡肝脏无明显异常。说明反向遗传疫苗株rR188I对SPF鸡无致病性，安全性良好(图15和图16)。
2.2疫苗有效性评价结果
攻毒保护试验结果表明，2周龄SPF鸡肌肉注射免疫rR188I，2周后攻毒能实现100％死亡保护，并且肝脏、脾脏和法氏囊无明显异常，而攻毒对照组出现严重病变。说明rR188I有效(图17和图18)。

Claims (5)

1.血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是通过将我国FAdV-4新近分离株HLJFAd15的Hexon基因的第563位碱基由G突变为A，即编码的第188位氨基酸由R突变为I，然后通过病毒拯救后获得的；所述的FAdV-4新近分离株HLJFAd15的全基因组GenBank序列号为KU991797.1。
2.如权利要求1所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株，其特征在于，所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株是通过以下方法构建得到的：
(1)含有HLJFAd15毒株完整基因组的粘粒的构建
获得FAdV-4新近分离株HLJFAd15毒株的全基因序列，HLJFAd15的全基因组GenBank序列号为KU991797，连接至pCC1Fos载体，经噬菌体包装后电转进EPI300感受态细胞中，涂布在氯霉素抗性LB平板上，挑取阳性克隆，经ZR BAC DNA miniprep Kit提取粘粒后，使用载体通用引物测序，得到含有HLJFAd15毒株完整基因组的粘粒，命名为Fos-rFAdV4；
(2)rR188I感染性克隆粘粒的构建
将HLJFAd15的Hexon基因克隆至pCAGGS载体中，所用引物为pCAGGS-Hexon F/R，然后将Hexon基因的第563位碱基由G突变为A，即编码的第188位氨基酸由R突变为I，所用引物为pR188I F/R，生成突变质粒pCAGGS-Hexon-R188I；接着使用Counter-Selection BACModification Kit构建rR188I感染性克隆粘粒，方法如下：首先将步骤(1)构建的Fos-rFAdV4电转进DH10B感受态细胞中，通过氯霉素抗生素筛选阳性克隆；然后再将Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒中的重组酶质粒pRed E/T电转进含Fos-rFAdV4的DH10B感受态细胞中，通过氯霉素和链霉素筛选阳性克隆；以Counter-Selection BACModification Kit试剂盒中的rpsl-neo表达盒DNA为模板，使用引物R188I-rpslneo F和R188I-rpslneo R扩增带有需替换Hexon基因片段两端各50bp同源臂的rpsl-neo表达盒，将回收的PCR产物直接转化进入经L-阿拉伯糖诱导的含有Fos-rFAdV4和pRed E/T的DH10B感受态细胞中，即可替换原始Hexon基因，通过氯霉素、链霉素和卡那霉素抗生素筛选阳性克隆，得到Fos-rFAdV4-Hexon-rpslneo；再以相同方式，以pCAGGS-hexon-R188I质粒为模板，所述的pCAGGS-hexon-R188I质粒为HLJFAd15毒株Hexon基因克隆到pCAGGS中得到，使用引物R188I F和R188I R扩增突变的Hexon基因，将PCR产物电转进上一步阳性克隆制备的经L-阿拉伯糖诱导的含Fos-rFAdV4-Hexon-rpslneo的DH10B感受态中，通过链霉素和氯霉素抗生素筛选得到Hexon基因的第563位碱基由G突变为A，即第188位氨基酸由R突变为I的阳性克隆，命名为Fos-rR188I；引物序列如下：
pCAGGS-Hexon F：CATCATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGGCGGCCCTCACGCCCGACCTG
pCAGGS-Hexon R：GTCAGGAACATCGTATGGGTACACGGCGTTGCCTGTGGCGAAAGG
pR188I F：CAGGGACCCGGAAtAAATCCTCTGCGA
pR188I R：TCGCAGAGGATTTaTTCCGGGTCCCTG
R188I-rpslneo F：CACGGCTTACAACCCGCTGGCTCCCAAGGAGTCCATGTTTAACAACTGGTGGCCTGGTGATGATGGCGGGATCG
R188I-rpslneo R：GTGTCGAACACGCCATAGAGCATGTACACGTAAGTGGGATCATCCATGGGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG
R188I F：CACGGCTTACAACCCGCTGGCTCC
R188I R：GTGTCGAACACGCCATAGAGCATG
(3)病毒拯救
用QIAGEN质粒中提试剂盒提取Fos-rR188I粘粒，用FseI限制性内切酶进行线性化，通过醇沉回收DNA，将LMH细胞接种至6孔板，用转染试剂X-tremeGene HP DNA TransfectionReagent Kit转染线性化的Fos-rR188I，转染后6h更换新鲜培养基，5d后将6孔板放入-80℃冰箱反复冻融3次，离心，收集上清，即为拯救所获的rR188I重组毒。
3.权利要求1所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株在制备防治由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)感染引起的禽心包积液-包涵体肝炎综合征(HHS)、包涵体肝炎(IBH)药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物为疫苗。
5.一种血清4型禽腺病毒弱毒活疫苗，其特征在于，含有权利要求1所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株。
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