JP3829290B2 - ニワトリ貧血症ウイルス変異体およびワクチン、ならびにウイルスタンパク質ｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３またはウイルスをコードする配列に基づくそれらのための用途 - Google Patents

Description

本発明は、ニワトリ貧血症ウイルスの新規なタンパク質および／またはポリペプチドに関する。さらに、本発明は家禽類におけるウイルス感染、特にニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡＶ）による感染を予防または治療するためのワクチンおよび組成物に関する。
特に、本発明はＣＡＶそのものよりも病原性が低いにもかかわらず、免疫化された動物で中和抗体の産生をもたらすワクチンに関する。
さらに、本発明はＣＡＶによる感染を予防するためにＣＡＶの一部に対する抗体を含有する組成物にも関する。また、抗原に対応する抗原性を有するアンチイディオタイプの抗体も本発明の対象である。
本発明はまた、ＣＡＶ感染の検出または予防のための抗体にも関する。またＣＡＶ検出のための診断キットも記述される。
本発明は、さらにＣＡＶタンパク質の少なくとも抗原性を有する部分をコードするＣＡＶに由来する組換えＤＮＡ分子、そしてこのような組換えＤＮＡ分子でトランスフェクト（移入）された宿主細胞にも関する。これらの宿主細胞に基づくワクチンが本発明によって可能になる。
また、ＣＡＶタンパク質の少なくとも抗原性部分をコードするＤＮＡ片が望まれる宿主を感染するウイルスに導入された、いわゆる生きたウイルスワクチンも本発明の対象である。
特にニワトリにおけるＣＡＶ感染の予防または治療の方法、およびＣＡＶから成る配列の組換え部分を作る方法、ならびにワクチンの製造方法も本発明の対象である。
さらに、本発明はＣＡＶのタンパク質をアポプトシス（プログラムされた細胞死滅）を誘発するのに用いることに関する。特に、タンパク質（ポリペプチド）は腫瘍細胞のアポプトシスを誘発するのに用いることができる。
さらに、本発明に従うタンパク質は、その他の望ましくない細胞集団、たとえばリュウマチ性関節炎、狼瘡のような自己免疫病における自己免疫反応性Ｔ細胞等を除去するのに用いることができる。
本発明はさらに遺伝子治療による細胞死の誘発をも提供する。これらの治療薬を製造する方法および治療薬による治療法もまた本発明の対象である。
ニワトリ貧血症ウイルス（ＣＡＶ）は最近同定されたＤＮＡウイルス（ノテボーンおよびデ ボア、１９９０年）である。それは新しいウイルス科に属する。若いニワトリで、ＣＡＶは赤芽球の前躯体細胞を破壊し、そして胸線細胞を消耗させ免疫不全によって貧血をもたらす。患部は脾臓および肝臓に生じる（ジュリセン等、１９８９年）。最近の研究によると胸腺細胞の消耗はＣＡＶによって誘発されるアポプトシスによって起こることが示された（ジュリセン等、１９９２年ｂ）。
ゲルダーブロム等、（１９８９年）およびトッド等（１９９０年）は、電子顕微鏡を用いる研究によってＣＡＶ粒子がＴ３ ２０面体対称および２３〜２５ｎｍの直径を有することを示した。ＣＡＶ粒子は、平衡沈降の後、ＣａＣｌ中１．３３〜１．３４ｇ／ｍｌの密度で濃縮する。
トッド等（１９９０年）は単離されたウイルス粒子が５０ ｋＤａの分子量を有するただ１つのタンパク質を含むことを示した。ＣＡＶ粒子中の１本鎖ＤＮＡは円形マイナス鎖の形状である（ゲルダーブロム等；トッド等、１９９０年；ノテボーン等、１９９１年）。複製ＤＮＡ中間体がクローンされ、そして完全に配列が決定された。ＣＡＶゲノムは２３１９ヌクレオチド長である。ゲノム構造およびＤＮＡ配列を基にして、このウイルスは既知のウイルス科には位置づけることはできない（ノテボーン等、１９９１年；トッド等、１９９１年）。ＣＡＶゲノムは、分子量５１．６、２４．０および１３．３ｋＤａを有する可能なタンパク質をコードする部分的にまたは完全に重なり合う３つの大きなリーディングフレーム（読み枠）を含む。ＣＡＶゲノムは、さらに１つの明らかなプロモータ／エンハンサ領域およびただ１つのポリアデニル化シグナルを含む。複製ＤＮＡ中間体の転写は、約２１００ヌクレオチドから成るポリアデニル化されたポリシストロン性ＲＮＡ分子を産生する（ノテボーン等、１９９２年ｂ）。
生後１日目のヒナ（ヒヨコ）がＣＡＶ感染に最もかかりやすい。これらの動物では、ＣＡＶを接種後、１０日目から傾眠、食欲減退および貧血が観察される。感染後、死亡率は最大５０％にも上る。日数を経るにつれて抵抗もまた増加する。ジュリセン等（１９９２年）は、ＣＡＶで感染された生後１〜３日目のヒナのヘマクリット値のみが減少することを報告している。生後１〜２１日目のヒナのＣＡＶ感染は結果として特に、胸腺皮質の消耗をもたらす。しかしながら、より老いたニワトリではＣＡＶは無症状的に増殖することができる。より老いたニワトリのＣＡＶ感染は血清変換が起こることにより決定することができる（マクロイ等、１９９２年）。
一群のニワトリ内でのＣＡＶの広がりは実質的に接触感染によって起こる。最も可能性が高いのは、ＣＡＶ感染された動物からの排泄物によって汚染された排泄物またはその他のものを摂取することである。空気を経由しての感染も、しかしながら除外することはできない。卵を通してのヒナへのウイルスの媒介がユアサ等（１９７９年）によって提唱されたが、実験をとおしては、母体動物からヒナへのＣＡＶの媒介は本発明者等によって立証することができなかった。
ＣＡＶにより誘発された胸腺皮質の消耗に由来する免疫不全が通常非病原性因子による２次感染の後、現れる症状の起因であると考えられている（デ ボア等、１９９２年；エングストローム、１９８８年；ローゼンバーガーおよびクラウド、１９８９年；ウォン ビュロウ等、１９８６年；ユアサ等、１９８０年）。このようにＣＡＶはニューキャッスル病、マレック病、感染性滑液包炎（Ｇｕｍｂｏｒｏ）にかかった動物およびレオウイルスに関係のあるブルーウイング病にかかった動物から単離される。ＣＡＶ感染は、たとえばニューキャッスル病ウイルスに対して増加されたウイルス感染反応をもたらす。
母性の抗体がＣＡＶ感染に対して重要な保護を与えることが知られている。実験室条件での最近の研究によれば、母性免疫の生後１日目のヒナはＣＡＶ感染にかからないことが示された。生後１日目のヒナは、母体動物の卵黄から得られる抗体を静脈注射することによってある程度保護されることができる（デ ボア等、発行日不詳）。
ＣＡＶは細胞培養物中で増殖することができる。そのようにして得られるウイルス力値は一般的に低い。現在ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞（ユアサ、１９８３年；ユアサ等、１９８３年）がそのために用いられており、その中でＣＡＶは感染４８〜７２時間後、細胞変性効果を誘発する。ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞は中和抗体およびＣＡＶに対する抗体を免疫蛍光法によって決定するのに用いられる（ウォン ビュロウ等、１９８５年；チェトル等、１９９１年）。ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞中連続継代培養によって、ＣＡＶの毒性を弱毒化することはいままでのところ可能であるということが知られていない。
ＣＡＶ感染の後、より年老いた動物は病気の症状を現さない。そして母性抗体を有するヒナは感染から保護されている。これらのデータは、ドイツ国において生後１４〜１６週間の母性動物を制御されたＣＡＶ感染にさらすことに基づくワクチンプログラムにおいて用いられた。オランダ国においては、このワクチン法は、看護者の危険のために実験的レベル以外は許可されていない。前述のとおり、ＣＡＶが受精卵を経由してヒナに媒介されることは全く可能である。マクナルティ等（１９９１年）は最近ＣＡＶに対して血清陽性である群がＣＡＶに対して血清陰性の群と比べて産卵数が劣ることを示した。さらに、アディア（私信）は無症状のＣＡＶ感染を有するニワトリにおいて免疫不全がみられることを示した。可能な母体からのウイルスの広がり、およびＣＡＶの無症状感染によって引き起こされる免疫不全から無毒化ワクチンに基づくコントロールプログラムが非常に望ましいものとなる。
一般的に、不活性化ワクチンおよびサブユニットワクチンが最も安全なワクチンである。組織培養条件下、ＣＡＶは低い力値にしか増殖しないという事実から不活性化ワクチンの製造は比較的高価でそして労働集約的となる。ＣＡＶ感染に対するサブユニットワクチンの製造のためには、ワクチン接種されたニワトリで保護的免疫応答を誘発するＣＡＶタンパク質が必要である。現在のところ、ただ１つのタンパク質（ＶＰ１と呼ばれる）が精製されたＣＡＶ粒子中に見いだされている。
驚くべきことに、さらに本発明の実施の形態で示されるように、このタンパク質だけではＣＡＶ感染に対して保護的免疫応答を与えることができないということが見いだされた。ＶＰ１がウイルス粒子中に存在するただ１つのタンパク質のように見える事実にも拘わらず、本発明者等によって今回初めて発現されたＶＰ２タンパク質がウイルス中和抗体を産生するのに不可欠であるということが見いだされた。そこで、今になって初めてウイルス部分に基づく有効なワクチンを開発することが可能となった。
本発明者等は、ＣＡＶゲノム上に存在する３つのオープンリーディングフレームをバキュロウイルス ベクタにクローンした。３種のＣＡＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が組換えＣＡＶバキュロウイルスによる共感染法によってＳｆ９細胞中、単独で、または他のＣＡＶタンパク質の１つとともに、あるいは３種すべてが同時に発現された。母性動物にＣＡＶタンパク質の１種またはそれ以上を含む粗製細胞溶解物を注射した。３種すべてのＣＡＶタンパク質の相応量または実質的にＶＰ１およびＶＰ２、さらにＶＰ３をいくらか含む抗原調製物でニワトリを免疫化した後に、初めて中和抗体が産生した。このような動物の卵は、ＣＡＶに対する母性抗体を含んでいた。ワクチン接種された母性動物のヒナについての感染試験から少なくともＣＡＶタンパク質ＶＰ１およびＶＰ２が保護的な免疫応答を誘発するのに必要であることが示された。３種すべてのＣＡＶタンパク質を注射された母性動物のヒナはＣＡＶ感染に対してより有効に保護されていた。Ｓｆ９細胞中、各々別々に製造された３種すべてのＣＡＶタンパク質を注射されたニワトリは、ＣＡＶに対する中和抗体をほとんど誘発しなかった。これはＣＡＶに対する中和抗体を最適に誘発するためには２種または３種のＣＡＶタンパク質が一緒に細胞（昆虫）中で、合成されなければならないことを意味する。
２種または３種のＣＡＶタンパク質の断片は、ＣＡＶ感染に対する保護的な免疫応答を生じさせるのに充分であることが可能である。
卵を産む雌鳥のワクチン接種に用いる組換えＣＡＶ産生物、ＶＰ１＋ＶＰ２またはＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３はバキュロウイルス系を用いることにより合成できる。ＣＡＶタンパク質はまた、細菌細胞または酵母細胞、レトロウイルス感染または遺伝子増殖（ＣＨＯ−ｄｈｆｒ系）のような他の系を用いても合成することができる。
ＣＡＶゲノムのオープンリーディングフレームによってコードされる２種または３種のタンパク質がニワトリで保護的免疫応答を誘発することができるという事実は生きたウイルスベクタの開発にも適用ができる。ＶＰ１＋ＶＰ２またはＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３のためのコード配列がそれで生きたウイルスベクタにクローンされる。
ＣＡＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の一種が個別に、しかしながら生きたウイルスベクタという意味の範囲内において、ＣＡＶ感染に対する保護的免疫応答を誘発するのに適しているということもまた可能である。
生きたウイルスベクタにより１種またはそれ以上の前記のＣＡＶタンパク質の断片を発現することも保護的免疫応答を誘発するために充分であるかもしれない。
家禽では、それ自身トリ系で良好な複製を示す生きたウイルスベクタのみが使用できる。ニワトリで使用するのに適切なウイルス性ベクタは他のものを含めて、鶏痘ウイルス、レトロウイルスベクタ、ヘルペスウイルスベクタ（マーレックウイルスおよび七面鳥ヘルペスウイルス）、アデノウイルスおよび喉頭気管炎ウイルスである。ＣＡＶによって誘発される細胞死は実質的にＶＰ３にそして部分的にはＶＰ２に由来することが見いだされた。
ＶＰ３のＣ末端１１アミノ酸を削除することによって、ＶＰ３によるアポトシスの誘発が強く減少される。その結果、ＶＰ３のＣ末端領域に終止コドンを導入することによりＣＡＶの病原活性を著しく減少することができる。ＶＰ３のコード領域にある余分な終止コドンが完全なＣＡＶゲノムを含むＣＡＶクローン ｐＣＡＶ／ＥｃｏＲＩ（ノテボーンおよびデ ボア）に導入される。完全なＣＡＶ変異ゲノムはベクタから切出されそしてリサイクルされる。ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞はリサイクルされたＣＡＶ変異ＤＮＡによってトランスフェクトされる、そしてより病原性の少ない子ウイルスが収穫される。ニワトリは弱毒化されたＣＡＶ変異ウイルスによりワクチン接種される。ＶＰ２タンパク質もまたアポプトシス誘発に影響があるので、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のコード領域内の変性を含む弱毒化されたＣＡＶを製造することもまた可能である。
前記のＶＰ２および／またはＶＰ３のコード領域に終止コドンを導入することは、またＣＡＶ組換え生きたウイルスベクタの製造にも用いることができる。
より成長した段階でＣＡＶに感染された動物は臨床的な症状を現さない。にも拘わらず、このような感染は、家禽の業界に対して大きな経済的損害を与えるであろう。前記の組換えＣＡＶ産生物により動物を免疫化することにより前記の無症状の病状に対する積極的な保護が得られるであろう。
個別的に、または１種または２種の別のＣＡＶタンパク質とともにバキュロウイルス系で発現された３種のＣＡＶタンパク質は、ＣＡＶに対する抗体を追跡するのに用いることができる。ＣＡＶに感染されたまたはワクチン接種されたニワトリはこのようにして追跡できる。１種またはそれ以上のＣＡＶタンパク質はイムノアッセイ、たとえば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、イムノペルオキシダーゼ染色、および免疫蛍光法等に用いることができる。中和抗体を測定するためには２種またはそれ以上のＣＡＶタンパク質が要求される。
昆虫細胞中、ＣＡＶ組換えバキュロウイルスで合成した３種のＣＡＶ組換え産生物によりマウスを免疫化すると、最終的にＶＰ２およびＶＰ３に特異的なモノクロナール抗体が製造された。これらのモノクロナール抗体は、ＣＡＶに感染された細胞中の特異な構造物とのみ反応して、そして非感染の細胞とは反応しなかった。
組換えＣＡＶタンパク質によって産生された抗体を用いることによってＣＡＶに感染されたニワトリの臓器調製物中で、ＣＡＶタンパク質を追跡することができる。これらのデータに基づいて信頼のおける診断方法が開発される。本発明に従うモノクロナールおよびポリクロナール抗体は、たとえばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＳＰＩＡ、免疫蛍光アッセイおよびイムノペルオキシダーゼ染色法等のその他の診断アッセイにおいても、所望ならば１種またはそれ以上のＣＡＶタンパク質またはそれらの断片とともに使用することができる。
原則的には、免疫学的診断方法の公知のすべての態様が、利用できるすべてのラベルについてそして実施されるべき試験法およびそれが実施される条件に従って可能であり、当業者は最も適した態様を選択することができる。さらに、本発明の目的のためには、抗体および／または他のタンパク質ポリペプチドが望ましい活性を有する限りそれらの誘導体およびまたは断片であってもよい。抗体の場合、これは少なくとも抗原を認識できねばならないということを意味する。
本発明に従う抗体は、家禽の受動的（パッシブ）な免疫化にも用いることができる。本発明に従う抗体に対して、いわゆる抗原の内部イメージと呼ばれる抗体が産生される。そして再びこのような状態で、特に受動的な免疫化および診断薬の分野で用いることができる。
ＣＡＶは、感染された胸腺細胞でアポプトシスを誘発する。（ヒト）腫瘍のＣＡＶ感染は、また腫瘍細胞の細胞死をもたらすということが可能である。
試験内で、ＣＡＶタンパク質ＶＰ３はそれ自身、ニワトリ単核性腫瘍細胞において、および様々なヒト腫瘍細胞においてアポプトシスを誘発することができる。
そのため、ＣＡＶ蛋白を発現することは（ヒト）腫瘍において細胞死を誘発するために用いることもできる。ＶＰ３タンパク質は、ＤＮＡトランスフェクションによって腫瘍中一過的に発現することができる。（腫瘍）細胞中のＶＰ３の発現は、ＶＰ３のコード配列を含む（レトロ）ウイルスベクタで細胞を感染させることによっても生じ得る。細胞にＶＰ３タンパク質および／またはＶＰ３のコード配列を含む非ウイルス性成分（たとえばリポゾームまたはトランスフェリン由来のベクタ）を投与することも（腫瘍）細胞中にＶＰ３を発現または存在させるためのさらなる可能性である。
前記のように使用することにより（腫瘍）細胞中ＶＰ２またはＶＰ２とともにＶＰ３を発現することにより細胞死を誘発することも可能となる。
ＣＡＶタンパク質ＶＰ２および／またはＶＰ３は、（ヒト）腫瘍形成を減少する治療に用いることができる。これはたとえば本発明に従うタンパク質を直接、固形腫瘍に注射するか、あるいは腫瘍にくっついている抗リガンドに対する親和性を有するリガンドにタンパク質をカップリングすることにより起こり得る。このカップリングは、化学的におよび（リガンドもまたタンパク質である場合）融合タンパク質を組換えることにより達成することができる。
化学的カップリングは、直接的にまたはスペーサグループを介して達成することができる。所望ならば、スペーサグループを介するか否かに拘わらず、リガンドおよびウイルス性タンパク質が結合される分化していない血清タンパク質のような不活性な担体分子を選択することができる。
しばしば提唱されるリガンド／抗リガンド相互作用の組合わせの例は、リガンド−リセプタ対、たとえばＥＧＦ／リセプタ、ＩＬ−２／リセプタ、／Ｔ細胞リセプタ、抗体／腫瘍抗原等である。
細胞によって取込まれることができるリガンド−抗リガンドの組合わせが好ましい。コンジュゲート（接合体）が選択されるとき、細胞中のウイルス性タンパク質が未変性の形で戻るように、ウイルス性タンパク質およびリガンド間のカップリングとして潜在的に不安定な基を適用することは有利であり得る。必ずしもすべての場合、取込み可能な組合わせを選択する必要はない。腫瘍細胞は代謝的に活性であり、そして積極的にまたは消極的にファゴシトシスおよび／またはピノシトシスにより物質、すなわち本発明に従うタンパク質を取込むであろう。
本発明に従うタンパク質が、どのような様式であれ、カップリングされるリガンドは完全なリガンドである必要はない。一般的にそれは、抗リガンド結合部分を用いれば充分である。また、問題となるリガンドの誘導体もそれらが抗リガンド結合活性を有する限り有用であるだろう。リガンドが抗体である場合、それに対して投与されるタイプのものより別のものに由来する抗体がほとんどの場合免疫応答を起こすであろうという事実が考慮されるべきである。さらに、これは数多くの他のタンパク質リガンドに対しても当てはまる。
このようにして、抗体が免疫応答を起こさずに、しかも望ましい抗原を認識するように動作することができるということが充分に知れわたってきた。
下記に、動物抗体がどのようにして人間に対する腫瘍に適するよう（ヒューマナイジング）にされるか簡単に説明されるが、別のタイプを適用させることもまた可能であるということは明らかであろう。
まず第１に、ＦＡＢ、ＦＡＢ’２またはさらに小さい断片を作成するためにヒューマナイズされるべき抗体から一定の部分を化学的に除去することが可能である（ウインター等、１９９０年）。一般に、これらの断片は少なくとも抗原性がより低い。このような断片は組換えＤＮＡ法によって作成することができる。
さらに、動物抗体の一定の部分をヒト抗体の対応部分によって組換えＤＮＡ法を用いて置換することもまた可能である（キャビリ等、１９８４年；ボス等、１９８４年）。
加えて、動物抗体の抗原結合領域をヒト由来の抗体に接種することもまた可能である（ウインター等、１９８７年）。
それに対して抗体が形成された既知の腫瘍抗原はたとえば、ＣＥＡ（胎生児癌抗原）などである。
本発明は下記の実験例によってさらに詳しく説明される。これはしかしながら例示のためだけであり、権利範囲を限定するものと解釈すべきではない。
実験例
バキュロウイルス、昆虫細胞およびニワトリＴ細胞
組換えバキュロウイルス ｐＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺ（ビショプ，１９９２年）はＲ．ポッセ博士（ＮＥＲＣウイルス学研究所、オックスフォード、イングランド）から入手した。そしてゲノムＤＮＡはサマーおよびスミス（１９８７年）に記載されているとおり精製された。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（スポドプテラ フルギペルダ、Ｓｆ９）細胞はアメリカンティッシュカルチャコレクション（ｎｏＣＲＬ １７１１）から入手した。バキュロウイルスストックはサマーおよびスミス（１９８７年）に記載されているように１０％牛胎児血清（ＳＣＳ）を含むＴＣ１００培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中、融合性単層および懸濁培地中増殖された。
マレック病ウイルス（ユアサ、１９８３年；ユアサ等、１９８３年）で軽質転換されたＴ細胞系ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１は１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６８０培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で増殖された。これらの細胞をＤＮＡトランスセクション実験で用いた。
実施例１
１．１ ＣＡＶ ＤＮＡのクローニング
全てのＣＡＶ ＤＮＡ配列はプラスミドＤＮＡ ｐＩｃ−２０Ｈ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＩから最初誘導された（ノテボーンおよびデ ボア，１９９０年）。プラスミドＤＮＡによる全てのクローニングステップは、原則的にマニアティス等（１９８２年）により記載された方法に従って実施された。
３種のＣＡＶタンパク質ＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３のコード配列は、個別にＤ．Ｈ．Ｌ．ビショプ博士（ＮＥＲＣウイルス学研究所−オックスフォード、イギリス）から入手したバキュロウイルス転移ベクタ ｐＡｃＹＭ１（マツウラ等、１９８７年）にクローンされた。ＣＡＶタンパク質ＶＰ３およびそれから誘導される変異体のコード配列は、発現ベクタｐＲＳＶ−Ｈ２０（オフリンガ等）にクローンされた。
ＤＮＡ形質転換は、Ｅ．ｃｏｌｉ株 ＨＢ１０１で行った。全てのプラスミドは撹拌下、大量の培地で増殖され、ＣｓＣｌ₂グラデェントでセファアクリルＳ−５００カラムを通して

することにより精製された。
１．２ ＤＮＡ トランスフェクション
組換えバキュロウイルスＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺのＤＮＡは、サマーおよびスミス（１９８７年）によって記載された方法に従って、細胞外バキュロウイルスから単離された。ｌａｃＺ遺伝子は、制限酵素Ｂｓｕ３６１に特異な切断部位を含む。ＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺをＢｓｕ３６１で消化することにより直線化した。Ｓｆ９細胞は、スミス等（１９８３年）の方法に従って直線化バキュロウイルスＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺ ＤＮＡのリン酸カルシウム沈殿物および組換え転移ベクタによってトランスフェクトされた。これはＳｆ９細胞についてのグラハムおよびヴァン デル エブ（１９７３年）のトランスフェクションプロトコールの修正法である。
種々のヒトおよびニワトリ細胞系のトランスフェクションのために１０μｇのｐＲＳＶ−ＶＰ３、ｐＣＭＶ−ＶＰ３、ｐＲＳＶ−ｔｒまたはｐＲＳＶ−ｔｒ ＤＮＡを２５μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に再懸濁し、２６０μｌのＴＢＳ緩衝液と混合した。１０ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥデキストラン１５μｌをＤＮＡ混合物に添加し、室温で３０分間、インキュベートした。
細胞は、テーブル遠心分離器中で１５００ｒｐｍで遠心分離された。培地を、５ｍｌＴＢＳ緩衝液で置換し、そして細胞を注意深く再懸濁した。細胞をペレット状にし、ＴＢＳ緩衝液を除去した。細胞ペレットを注意深く３００のＤＥＡＥ デキストラン／ＤＮＡ混合物中に再懸濁し、そして室温で３０分間インキュベートした。２５％ＤＭＳＯ／ＴＢＳ ０．５ｍｌを添加し、そして懸濁液を室温で３分間インキュベートした。５ｍｌのＴＢＳを添加し、そして細胞をテーブル遠心分離器中で１５００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液が除かれ、そして５ｍｌの組織培養液が添加された。細胞を再懸濁し、遠心分離し、５ｍｌの組織培養培地に入れて、３７℃−５％ＣＯ₂でインキュベートした。
１．３ 組換え ＣＡＶ バキュロウイルスの選択
細胞外バキュロウイルスを含む上澄み液をニュートラルレッド（ブラウンおよびフォールカー、１９７７年）およびＸ−ｇａｌ（ブラウン等、１９９１年）を用いてプラークアッセイで分析した。ｌａｃＺ陰性プラークを、ミクロタイタ皿中Ｓｆ９細胞の単層に接種した。感染の５日後、上澄み液を収穫し、そして４℃で貯蔵した。細胞溶解液を３２ＰでラベルしたｐＩＣ−２０Ｈ／ＣＡＶ−ＥｃｏＲＬ ＤＮＡをプローブとしてドットスロット ハイブリダイゼーションアッセイで分析した。
Ｓｆ９細胞の単層に、ラベルされたＣＡＶ ＤＮＡ プローブと強くハイブリダイズした細胞溶解物の上澄み液を接種した。感染の２日後、細胞を３Ｈロイシンでラベルした。タンパク質は、蛍光法で可視化された１４％ポリアクリルアミド（ＰＰＡ）ＳＤＳゲル（レムリ、１９７０年）上で分離され、そして特異組換えＣＡＶタンパク質の存在およびβ−ガラクトシダーゼタンパク質の不存在について試験された。
１．４ 粗ＣＡＶタンパク質調製物の合成
感染されたＳｆ９の細胞中、期待されたＣＡＶタンパク質を発現した組換えＣＡＶバキュロウイルスをサマーおよびスミス（１９８３年）に記載された方法に従って、すくい上げた。単層状のＳｆ９細胞を細胞あたり約５−プラーク形成単位（ｐｆｕ）の感染度（ｍｏｉ）を有するバキュロウイルスの１つの型で感染した。２種または３種の違ったＣＡＶ組換えバキュロウイルスの共感染は、細胞あたり１０ｐｆｕの各々の組換えＣＡＶバキュロウイルスのｍｏｉを有するＳｆ９の細胞単層の上で実施された。感染の３日後、感染されたＳｆ９細胞を収穫した。粗細胞溶解物をＰＢＳ緩衝液に懸濁した。
実施例２
２．１ ニワトリをＣＡＶ−特異的タンパク質により免疫化
生後６週間のニワトリのグループに、１種またはそれ以上の組換えＣＡＶバキュロウイルスで感染された１０⁶または１０⁸Ｓｆ９細胞の完全なフロイントアジュバント中で乳化された粗溶解物を腹腔内および皮下注射した。コントロールとして８匹の動物グループに完全なフロイントアジュバントに乳化したＰＢＳ緩衝液を注射し、免疫化実験を行った。免疫化の後、異なった日に血液を採取し、そして血清を分析してＣＡＶに対する中和抗体を調べた。
２．２ 母性動物のＣＡＶに対する免疫化
各々１６雌鳥からなる４つのグループに、同時にＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３組換えバキュロウイルスで、またはＶＰ１およびＶＰ２組換えバキュロウイルスで、またはＶＰ１およびＶＰ２組換えバキュロウイルスで、ＶＰ１およびＶＰ３組換えバキュロウイルスで、またはＶＰ２およびＶＰ３組換えバキュロウイルスで感染した２×１０⁷Ｓｆ９細胞の粗溶解物を注射した。細胞溶解物は、完全なフロイントアジュバントの等体積に乳化した。コントロールとして、１６匹の雌鳥のグループに完全なフロイントアジュバント中、ＰＢＳ緩衝液を注射した。これらの溶解物またはＰＢＳ緩衝液を注射した雌鳥の卵の卵黄物質をクロロホルムで抽出し、そして中和抗体の存在を分析した。
実施例３
３．１ ＣＡＶタンパク質に特異的なモノクロナール抗体の製造と同定
モノクロナール抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１は、不完全なフロイントアジュバントを注入したＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞をマウスの腹腔内に注射することにより得られた。最後に、免疫化したマウスの脾臓細胞をＰ３×６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞に融合した（ノテボーン等，１９９１年）。
ＣＡＶ抗原に対する他のモノクロナール抗体は、３種のＣＡＶ組換えバキュロイウルスで感染したＳｆ９細胞の粗抽出物を４ＢＡＬＢ／Ｃマウスの脾臓に注射することにより得られた。免疫化したマウスの血清を免疫化の後、ＣＡＶに対する中和抗体の有無について７週間試験した。免疫化マウスの脾臓細胞をＰ３×６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞に融合した。ＣＡＶ抗原に対する抗体を次の異なった方法で試験した：血清中和試験；精製したＣＡＶおよびＣＡＶ組換えバキュロウイルスで感染したＳｆ９の細胞の粗溶解物に基づくＥＬＩＳＡ法；ＣＡＶ感染ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１またはＣＡＶ組換えバキュロウイルスで感染されたＳｆ９細胞についての免疫蛍光法；ＣＡＶ組換えバキュロウイルスで感染されたＳｆ９細胞の粗溶解物のウェスタンブロット法；およびＣＡＶ感染ニワトリの胸腺分室（ｃｏｕｐｅ）のイムノペルオキシダーゼ染色法。
実施例４
４．１ 試験管内中和試験
粗Ｓｆ９細胞溶解物またはＰＢＳ緩衝液を注射したニワトリおよびマウスの血清を１：２または１：４に希釈し、そして２倍連続希釈した。希釈された血清を１時間１０⁴〜１０⁵ＴＣ１Ｄ₅₀ＣＡＶ−Ｃｕｘ−１でインキュベートした（フォン ビューロ等，１９８３年；フォン ビューロ等，１９８５年）。マレック病ウイルスで軽質転換されたＴ細胞系ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１の約１００，０００細胞を希釈血清およびウイルスのこの混合物で感染させた。コントロールとして、陽性ＣＡＶ抗血清および非病原性ニワトリに由来する陰性血清で中和されたＣＡＶでＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞を感染した。
４．２ ＣＡＶ誘発実験
免疫化された雌鳥の５つのグループの有精卵を孵化した。１日目にヒナに１０^5.5ＴＣ１Ｄ₅₀ＣＡＶ−Ｃｕｘ−１を筋肉注射した。感染６日後および１４日後に、グループあたり５匹のヒナを解剖した。胸腺を肉眼でおよび免疫組織学的に検査した。またヘパリン血を採取し、そして血液細胞をウイルス再単離アッセイで検査した。感染１４日後にヘマトクリットを決定するために全ての動物からヘパリン血を採取した。
実施例５
５．１ 免疫組織および免疫蛍光
冷凍した胸腺分室と骨髄を作成し、ジュリセン等（１９８８年）に記載されているようにＣＡＶ−特異的モノクロナール抗体でイムノペルオキシダーゼ染色するのに用いた。
細胞を８０％アセトンで固定し、ＣＡＶ−特異的モノクロナール抗体およびフルオロセインイソチオシアネートでコンジュゲートしたヤギ抗−マウスＩｇＣを用いる免疫蛍光試験に使用した。
５．２ 血液試料中のＣＡＶの検出
ＣＡＶ感染されたヒナの血液試料をＰＢＳで３回洗浄し、１ｍｌとした。得られた細胞懸濁液２０μｌを１０⁵ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞に添加した。ＣＡＶ−特異的細胞病原性効果が見られるまで、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞を４〜５日毎に１０倍希釈し、新鮮な培地に移した。１０回継代培養の後、細胞病原性効果が見られなければ、ウイルス単離は陰性とみなされた。継代培養の回数は、感染ヒナドリの血液中に存在する感染性ＣＡＶの量の目安である。
結果と考察
組換え転移ベクタの作製
ＣＡＶゲノムは、部分的にまたは完全に互いが重なり合う３つの大きなオープンリーディングフレームを含む。異なったリーディングフレームで開始コドンを用いてＣＡＶゲノムは３つの特異なタンパク質をコードする。ＣＡＶタンパク質のコード配列を別々にバキュロウイルス転移ベクタｐＡｃＹＭ１にクローンした（ＶＰ１，図１；ＶＰ２，図２；ＶＰ３，図３）。ＶＰ３リーディングフレームはＶＰ２リーディングフレーム内に完全に入るので、ＶＰ２の発現の際、ＶＰが明らかにより少ない程度であるが合成される。転移ベクタｐＡｃＹＭ１は、ポリヘドリンのコード配列を欠く。ポリヘドリンプロモータは、その内にポリヘドリン遺伝子の開始コドンのＡ−末端およびポリアデニル化シグナルを含む３′−非コード配列を含有する。ポリヘドリン配列の両側に挟むようにウイルス配列がある。転移ベクタは、細菌中での増殖のための原核配列を含む（マツウラ等，１９８７年）。
プラスミドｐＥＰ−５１．６（ノテボーン等，１９９２年ａ）は、７９１位〜３２１９位ＣＡＶ ＤＮＡ配列を含む。ＣＡＶ ＤＮＡ挿入部は、６２ｂｐ５′−および１１７ｂｐ３′非コードＤＮＡ配列によって挟まれたＶＰ１タンパク質の完全なコード領域を含む。プラスミドｐＥＰ−５１．６を部分的にＨｉｎｄIIIで切断し、それからＥｃｏＲＩで完全に切断し、そして粘着末端をクレノウポリメラーゼを用いて平滑にした。１．５ｋｂＣＡＶ ＤＮＡ断片が単離された。プラスミドｐＡｃＹＭ１をＢａｍＨＩで直線化し、粘着末端をクレノウポリメラーゼで平滑にし、最後にアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。１．５３ｋｂＣＡＶ ＤＮＡ断片を直線化されたｐＡｃＹＭ１ ＤＮＡに結合した。ｐＡｃＹＭ１ ＤＮＡ中のＶＰ１の方向は、制限酵素分析により決定された。最終的な構築物ｐＡｃＶＰ１を図４に示す。
プラスミドｐＥＰ−２４．０（ノテボーン等，発表日不詳）は、３５４位〜１５０８位（ノテボーンおよびデ ボア，１９９０年）のＣＡＶ ＤＮＡ配列を持つ１．１５ｋｂＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を含む。このＣＡＶ ＤＮＡ断片は、２６ｂｐ５′−および４８４ｂｐ３′非コードＤＮＡ配列で挟まれたＶＰ２のコード領域を含む。ＶＰ２の開始コドンの１０６ｂｐ下流、別のリーディングフレームにＶＰ３の開始コドンおよびＶＰ３のための他のコード配列が見いだされる。プラスミドｐＥＰ−２４．０をＢａｍＨＩで処理し、１．１５ｋｂ ＤＮＡ断片を単離し、ＢａｍＨＩで直線化しかつＣＩＰ−処理した９．３ｋｂｐＡｃＹＭ１プラスミドに結合した。最終ＤＮＡ構築物ｐＡｃＶＰ２は、制限酵素で同定された。これを図４に示す。
プラスミドｐＥＰ−１３．３（ノテボーン等，発表日不詳）は、４２７位〜８６８位ＣＡＶ ＤＮＡ配列（ノテボーンおよびデ ボア，１９９０年）を持つ０．４６ＫｂＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を含む。ＣＡＶ ＤＮＡ断片は、ＶＰ３のコード領域、すなわち５８ｂｐ５′−および２５ｂｐ３′非コードＤＮＡ配列を含む。プラスミドｐＥＰ−１３．３を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、そして０．４６ｋｂＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離した。転移ベクタｐＡｃＹＭ１ ＤＮＡをＢａｍＨＩで直線化し、ＣＩＰで処理し、そして９．３Ｋｂ断片を単離した。２つの合成ＤＮＡオリゴマ ５′−ＧＡＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＧＴＴＧ−３′および５′−ＡＡＴＴＣＡＡＣＣＣＧＧＧＴＴＧ−３′を互いに対合（ハイブリダイズ）し、そしてともにＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡリンカを形成した。ＤＮＡリンカを０．４６ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩおよび９．３ｋｂＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片に結合した。最終構築物ｐＡｃ−ＶＰ３を制限酵素消化により分析した。これを図４に示す。
組換えＣＡＶバキュロウイルスの作製
３種の組換えＣＡＶ転移ベクタの各々をＳｆ９細胞中、組換えバキュロウイルスＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺ ＤＮＡと一緒に、個別的にトランスフェクトした。トランスフェクションは裸のバキュロウイルスＤＮＡおよび転移ベクタＤＮＡで起こった。このバキュロウイルスゲノムは、ポリヘドリンプロモータの制御のもとポリヘドリン遺伝子の代わりにｌａｃＺ遺伝子を含む。相同（ホモロガス）組換えの後、ｌａｃＺ遺伝子の代わりに、そしてポリヘドリン遺伝子のプロモータの制御下、３種のＣＡＶ遺伝子のひとつを常に導入したバキュロウイルスが得られた。ＣＡＶ遺伝子を正しく導入したバキュロウイルスは、もはやｌａｃＺ遺伝子を含まない。まず第１に、バキュロウイルスで感染した昆虫細胞のプラーク中で、組換えＣＡＶウイルスにβ−ガラクトシダーゼ活性がないことを同定した。さらに、バキュロウイルスゲノム中へのＣＡＶ ＤＮＡ配列の組み込みをハイブリダイゼーション試験で、ＣＡＶ−特異的ＤＮＡプローブを用いて決定した。
Ｓｆ９細胞中、ＣＡＶタンパク質の発現
組換えＣＡＶで感染されたＳｆ９細胞中での特定のＣＡＶタンパク質の発現は、３Ｈロイシンでのタンパク質ラベリングおよびＰＡＡ−ＳＤＳゲル電気泳動を用いて分析された。
ＣＡＶタンパク質ＶＰ１は、計算分子量５１．６ｋＤａを有する（ノテボーンおよびデ ボア，１９９０年）。組換えＶＰ１バキュロウイルスで感染された昆虫細胞の溶解物は、バキュロウイルス性および細胞産生物の他に５２ｋＤａのタンパク質を含む。５２ｋｂａのタンパク質は、バキュロウイルスＡｃＲＰ２３−ｌａｃＺで感染された昆虫細胞の溶解物および非感染の細胞中には存在しない。ＶＰ１のコード配列を試験管内で発現すると、結果として５２ｋＤａのタンパク質が得られた（ノテボーンおよびデ ボア，１９９２年）。ウサギ網状赤血球溶解物中で合成されたＶＰ１および昆虫細胞中で合成されたＶＰ１が同一の分子量を有するので、ＶＰ１は、おそらくグリコシル化されていない。
ＶＰ２をコードするが、ＶＰ３のコード配列の全ても含む遺伝子を試験管内系で翻訳すると、３０および２８ｋＤａの特定のＣＡＶタンパク質そして少量の１６ｋＤａタンパク質産生物が産生された。ＶＰ３をコードするオープンリーディングフレームのみを試験管内系で翻訳すると、しかしながら１６ｋＤａのタンパク質のみが産生された。感染された昆虫細胞中で、組換えＶＰ２バキュロウイルスによりＶＰ２を発現すると、約２８ｋＤａおよび３０ｋＤａの特定の産物が産生された。組換えｌａｃＺバキュロウイルスで感染されたＳｆ９細胞は、これらのＣＡＶ特異的タンパク質を含まない。１６ｋＤａのＣＡＶ特異的産生物は、非常に少量でのみ例証されることができた。これらのデータは、ＶＰ２バキュロウイルスがタンパク質ＶＰ２を強く発現するが、ＶＰ３を少程度発現することを示す。その可能な説明は、バキュロウイルスゲノム上にある遺伝子内で閉じ込められた開始コドンが非常に非効率的に用いられるということである。
感染された昆虫細胞中で、合成された組換えＶＰ３バキュロウイルスは、１６ｋＤａの主生成物と分子量約２１，０００および１２，０００〜１４，０００を有する幾つかのタンパク質を少量、産生した。免疫蛍光アッセイで、ＣＡＶ特異的モノクロナール抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１は、ＶＰ３を発現するＳｆ９細胞と特異的に反応する。このモノクロナール抗体は、ＶＰ３組換えバキュロウイルスで感染された、放射性同位体でラベルしたＳｆ９細胞の溶解物から分子量１６，０００を有するタンパク質のみを特異的に沈殿させた。ペプスカン（ｐｅｐｓｃａｎ）分析（ガイセン等，１９８４年）において、モノクロナール構体ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１のエピトープはＶＰ３のＮ末端に局在化されていた。ペプスカン分析を図５に示す。
組換えＣＡＶタンパク質で免疫化されたニワトリでの中和抗体の誘発
ニワトリ貧血症の場合、中和抗体が保護と適切に関連があることが確認されている。ニワトリに中和抗体を誘発するＣＡＶタンパク質または幾つかのＣＡＶタンパク質は、こうしてサブユニットワクチンの基礎を形成する。
まず第１に、本発明者らは、どのＣＡＶタンパク質がＣＡＶに対して抗体を誘発し、ニワトリで中和可能か検査した。生後約６週間の８匹のニワトリを１グループにして、完全なフロイントアジュバントに乳化した組換えＣＡＶ感染細胞１０⁶または１０⁸の溶解物を注射した。コントロールとして８匹のニワトリの１グループに完全なフロイントアジュバントに乳化したＰＢＳ緩衝液を注射した。免疫化前および免疫化、２、４および６週間後、血液試料を採取した。完全なフロイントアジュバント中、ＰＢＳを注射したコントロール群の動物のどれもＣＡＶに対する中和抗体を産生しなかった（表１）。組換えＶＰ２または組換えＶＰ３バキュロウイルスで感染された１０⁶または１０₈昆虫細胞の溶解物を注射したニワトリもＣＡＶに対して中和抗体を産生しなかった。組換えＶＰ１バキュロウイルス昆虫細胞で感染された溶解物を注射されたニワトリのうち３匹のニワトリが、そして１０₈感染細胞の投与量を注射されたニワトリのうち２匹のニワトリが１：８〜１：３２の範囲の低い力価を呈した。
３種の組換えＣＡＶタンパク質を別々にニワトリに注射すると、全くあるいはほんのわずかしかＣＡＶに対する中和抗体を誘発しないと結論される。
続いて、本発明者らは３種の組換えＣＡＶタンパク質の組み合わせがニワトリで中和抗体を誘発することができるかどうか研究した。この目的のために、Ｓｆ９細胞を３種の組換えＣＡＶバキュロウイルスで同時に感染させた。こうして組換えＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３を含む感染された１０⁶または１０⁸細胞の粗溶解物が調製された。生後６〜８週間の８匹のニワトリをグループに分け、完全なフロイントアジュバントに乳化した溶解物を注射した。コントロールとして、８匹のニワトリのグループに完全なフロイントアジュバント中に乳化したＰＢＳ緩衝液を注射した。免疫化５週間後、１０⁶感染細胞の溶解物で免疫化した８匹のニワトリは、全て３２〜２５６の間の中和抗体力価を持つことが見いだされた。ところが１０⁸細胞で免疫化した８匹の動物中の７匹は１６〜５１２の間の中和抗体の力価を持っていた（表２ａ）。免疫化７週間後、両方のグループの全ての動物がＣＡＶに対する中和抗体力価を呈することが見いだされた。ＰＢＳ緩衝液を注射されたニワトリのグループは、ＣＡＶに対する中和免疫応答を示さないことが見いだされた。
ＣＡＶに対する中和抗体の誘発のためには、３種のＣＡＶタンパク質が昆虫細胞の中で同時に合成されることが本当に必要か？ この質問に答えるために、Ｓｆ９細胞をＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３組換えバキュロウイルスで別々に感染させた。それから、粗細胞溶解物を組み合わせ、フロイントアジュバントと混合しそして８匹のニワトリのグループに注射した。コントロール調製物として、全て３種のＣＡＶタンパク質を同時に合成したＳｆ９細胞の粗溶解物を用いた。両方の調製物を完全なフロイントアジュバント中に乳化し、各々８匹のニワトリからなる別々のグループに注射した。
３種のＣＡＶタンパク質が別々に合成されたＳｆ９細胞の粗溶解物を注射されたグループのニワトリの血清は、ＣＡＶに対する中和抗体を全く含まないか、またはほんの少しのみしか含まないことが判った。しかしながら、３種のＣＡＶタンパク質を一緒に合成したＳｆ９細胞の粗溶解物を注射されたコントロールグループの動物は、期待されたように中和免疫応答を示すことが見いだされた。ＰＢＳ緩衝液を注射された動物は、陰性であることが判った。
免疫化された母性動物の卵の中の中和抗体
上記の免疫実験から、Ｓｆ９細胞中、一緒に発現された３種の組換えＣＡＶタンパク質がＣＡＶに対する中和抗体を誘発したことが示された。次の実験で、２種のＣＡＶタンパク質の組み合わせもまた中和抗体を誘発できるかどうか調べた。ここでは、免疫化された母性動物の卵黄中の抗体を測定した。
生後３３週間の１６匹のニワトリを４つのグループに分け、組換えＣＡＶバキュロウイルスの違った組み合わせで同時に感染されたＳｆ９細胞の粗溶解物を注射した。ＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３かＶＰ１＋ＶＰ２のいずれかを含む調製物は、ほとんどの動物で、それらの卵に明らかに認識されうる中和構体を誘発した（表３）。ＶＰ１＋ＶＰ３か、ＶＰ２＋ＶＰ３のいずれかを含む調製物を注射されたニワトリの卵は、卵黄に明らかな中和抗体を含まないことが判った。検査したニワトリの１匹の卵黄が低い力価の中和抗体を含むことが見いだされただけであった。ＰＢＳ緩衝液を注射された１６匹のニワトリのコントロールグループの卵には、中和抗体が見つからなかった。組換えＣＡＶタンパク質を用いる上記の実験のデータから、ＣＡＶ感染に対する中和抗体を誘発するにはＶＰ１＋ＶＰ２がともに必要でありかつ充分であることが示される。しかしながら、ＶＰ１＋ＶＰ２調製物中の少量のＶＰ３も除外できない。
免疫化されたニワトリのヒナでのＣＡＶ挑戦に対する保護
母体抗体がＣＡＶ感染によって引き起こされる臨床学的症状から若いヒナを保護する。本発明者らは、特定の組換えＣＡＶタンパク質で免疫化したどのグループのニワトリのヒナがＣＡＶ挑戦に対して保護されるかを研究した。ここで、ウイルスを単離し、そして胸腺の萎縮、ヘマトクリットの減少および死亡率の増大というＣＡＶに特徴的な臨床学的症状を観察した。
生後２３日と３５日の間のヒナをグループに分け、高い投与量のＣＡＶで挑戦した。感染の６日後、ＰＢＳ緩衝液を注射された母性動物を持つ解剖された５匹の動物には全て肉眼で判る胸腺の減少が見いだされた。組換えＶＰ２＋ＶＰ３を注射された母性動物のヒナの場合、５匹の動物中、４匹に小さい胸腺があった。しかしながら、３種の組換えＣＡＶタンパク質を一緒に注射された母性動物の５匹のヒナは、解剖されると全て正常な胸腺を有することが判った。ＶＰ１＋ＶＰ２で処理された母性動物のヒナのグループでは、調べた５匹の動物のうち、１匹のみが減少した胸腺を有することが見いだされた（表４）。感染の１４日後、グループあたり５匹の動物を解剖した。組換えＶＰ２＋ＶＰ３またはＰＢＳ緩衝液で免疫化した母性動物の全てのヒナは、胸腺萎縮を患った。３種の組換えＣＡＶタンパク質を一緒に注射した動物のグループの検査したヒナは全て正常な胸腺を有していた。組換えＶＰ１＋ＶＰ２を注射した動物の調べたヒナのうち１匹のみが減少した胸腺を有していた（表４）。組換えＶＰ２およびＶＰ３を注射した母性動物のヒナについて記載されているように（コシュ，未発表結果）、組換えＶＰ１およびＶＰ３を注射した母性動物のヒナが減少した胸腺を有することが別の実験でも示された。感染１４日後、全てのＣＡＶ感染されたヒナのヘマトクリットを決定した。２７％のヘマトクリットが貧血症の限度として選択された。ＰＢＳ緩衝液を注射した母性動物のヒナは、全て７〜１９％内の値の非常に減少したヘマトクリットを持つことが判った。組換えＶＰ２＋ＶＰ３を注射した母性動物のヒナは、平均的にわずかばかり高いヘマトクリットを有する。これらのグループでは、１匹の動物のみが２７より大きいヘマトクリットを有していた。別の実験から、組換えＶＰ１およびＶＰ３を注射した母性動物のヒナは減少したヘマトクリットを有していたことが示された（コシュ，未発表結果）。ＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３を含む調製物を注射した動物のヒナで調べた３５匹のうち、１匹の動物のみがはずれたヘマトクリットを持っていた。ところが、ＶＰ１＋ＶＰ２のグループの中では、２９匹の調べた動物のうち、２匹が２７％以下のヘマトクリットを有した。
組換えＶＰ２およびＶＰ３を注射した母性動物のヒナについて５０．９％の高い死亡率が、そしてＰＢＳを注射したグループでは４８．３％の死亡率が観察された。組換えＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３を注射した母性動物のヒナのグループでは、死亡率は９％であり、ＶＰ１＋ＶＰ２グループでは１５．４％であった。しかし、動物のほとんどは、挑戦後５日以内に死亡した。ＣＡＶ感染による死亡は、一般に後で起こる。この理由から、本発明者らは、表６で挑戦後、１４日目以前と１４日目以降の死亡率を区別した。１４日目以前の死亡は、しばしば非特異的であり、なかんずく注射の結果である。１４日目以降の死亡率は、ＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３に対する母体抗体のある動物のグループでは、７％であり、ＶＰ１＋ＶＰ２に対する母体抗体のグループでは０％、ＶＰ２＋ＶＰ３に対する母体抗体のグループでは２７．４％、そしてコントロールグループでは２０．７％である。ＶＰ２＋ＶＰ３グループでは、８匹の動物が、おそらく貧血症によるヒナの劣った条件の結果としてヘマトクリットを決定するために血液試料を採取した後、死亡した。ＰＢＳグループでは、血液採取中、２匹の動物が死亡した。これらの全ての動物は、明らかに減少した胸腺を持っていた。
ＣＡＶ感染されたヒナのウイルス血症は、血液細胞のウイルス単離を実施することにより検査した。グループあたり５匹の動物のヘパリン血液試料を挑戦後、６日および１４日目に採取した。ＶＰ２＋ＶＰ３またはＰＢＳを注射し、そして現実的にＣＡＶ感染に対して保護されていなかった母性動物のヒナは、感染６日後および１４日後に比較的高いウイルス力価を含有していることが判った。感染の６日後、ＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３またはＶＰ１＋ＶＰ２を注射した動物は、前記のヒナより明らかに低いウイルス力価を含有することが判った。感染の１４日後、ＶＰ１＋ＶＰ２＋ＶＰ３を注射した動物のヒナのグループのみが他の３つのグループより明らかに低いウイルス力価を持っていた。
母性動物中で中和抗体を誘発する実験結果によって、組換えＣＡＶタンパク質ＶＰ１およびＶＰ２が中和免疫応答を誘発するのに非常に重要であることが示される。感染実験は、組換えＣＡＶタンパク質ＶＰ３がＶＰ１＋ＶＰ２で得られる効果に加えて補完的な保護を与えることを示す。
ＣＡＶに対するモノクロナール抗体の製造と同定
ＣＡＶに対するモノクロナール抗体を製造するために、ＶＰ１，ＶＰ２およびＶＰ３組換えバキュロウイルスで共感染されたＳｆ９細胞の粗溶解物をマウスに注射した。全部でＣＡＶ抗原に対するモノクロナール抗体を産生する９の異なったハイブリドーマ細胞系が得られた。
バキュロウイルス発現系で製造されたＣＡＶ抗原のウエスタンブロットによって、モノクロナール抗体１１１．１，１１１．２，１１１．４，１１２．１，１１２．２，１２０．１および１２０．２がＶＰ２に対して強く指向しており、そしてモノクロナール抗体１１１．３および１２０．３がＶＰ３に対して強く指向していることが示された。ＶＰ２と強く反応するモノクロナール抗体は、全てＶＰ３と弱い交差反応を示す。逆に、ＶＰ３に対するモノクロナール抗体は、ＶＰ２と弱い交差反応を示す。
ハイブリドーマ製造のために用いた免疫化マウスの血清がＣＡＶに対する中和活性を有するにもかかわらず、得られたモノクロナール抗体がいずれもＣＡＶに対する中和活性を有しないことが血清中和試験によって示された。
ペプスカン分析（ゲイセン等，１９８４年）で、モノクロナール抗体１１１．２のエピトープはＶＰ２の中央に局在化していた（図６）。モノクロナール抗体１１１．３は、ＶＰ３のＮ末端のエピトープ（図７）、すなわちモノクロナール抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１（図５）によって認識されるＶＰ３エピトープの傍らに、指向することが見いだされた。
ＶＰ２およびＶＰ３に対するモノクロナール抗体がＣＡＶ感染されたＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞中で、特定の構造を認識することが免疫蛍光法によって示された。ＣＡＶ抗原に対するモノクロナール抗体のいずれも非感染のＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞と反応しなかった。ＣＡＶ感染細胞中で、ＶＰ２特異的モノクロナール抗体はＶＰ３特異的モノクロナール抗体よりも他の構造を認識する。
ニワトリ細胞でのＶＰ３の発現によるアポプトシスの誘発
ジュリセン等は、ＣＡＶが感染された胸腺細胞でアポプトシスを起こすことを示した。本発明者らは、ＣＡＶタンパク質のうちの１つ、特にＶＰ３が単独でニワトリＴ細胞中、アポプトシスを起こすことが可能がどうか研究した。
ＶＰ３のコード配列を発現ベクトルｐＲＳＶ−２０Ｈにクローンした。４２７位−８６８位のＣＡＶ ＤＮＡ配列（ノテボーン等，１９９１年）を持つ０．４６ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＥＰ−１３．３から単離した。ＣＡＶ ＤＮＡ断片は、ＶＰ３のコード配列そしてさらに５８ｂｐ５′および２５ｂｐ３′−を挟む配列を含む。ベクタｐＲＳＶ−Ｈ２０をＢｇ１ＩＩで直線化し、ＣＩＰで処理し、そして４．３ｋｂ断片を単離した。２つの合成ＤＮＡオリゴマ５′−ＧＡＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＧＴＴＧ−３′および５′−ＡＡＴＴＣＡＡＣＣＣＧＧＧＴＴＧ−３′をハイブリダイズし、そして２本鎖ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩリンカを形成した。ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡリンカおよび０．４６ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片を４．３ｋｂ Ｂｇ１ＩＩ ＤＮＡ断片に結合した。最終構築物ｐＲＳＶ−ＶＰ３は、ラウス肉腫ウイルスプロモータ制御のもとでのＶＰ３のコード配列を含んでいた。そして制限酵素分析によって確認された（図８ａ，ノテボーン等，１９９３年）。
ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞をＤＥＡＥデキストラン方法を用いてｐＲＳＶ−ＶＰ３のＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４２時間後、細胞を固定し、そしてモノクロナール抗体ＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１で染色して、ＶＰ３の発現について分析した。細胞をさらに、無傷の核のＤＮＡを非常に強く染色するが、アポプトシスされた核のＤＮＡを弱く染色するヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）で染色した（テルフォード等，１９９２年）。トランスフェクトされた細胞の９０％以上で、ヨウ化プロピジウムで染色された核の中に微顆粒状のＶＰ３が分配されて含まれていた。感染の２日後、ＶＰ３を発現する細胞の４０％は、ヨウ化プロピジウムで弱く染色される核を含むことが見いだされ、そしてＶＰ３は集合体（団粒）として存在した。感染３日目およびその後で、ＶＰ３含有細胞の９０％以上は、ＶＰ３集合体およびヨウ化プロピジウムで弱く染色されたＤＮＡを含むことが見いだされた（図９）。トランスフェクションの３日後、ＶＰ３でトランスフェクトされた細胞のＤＮＡは、アポプトシスに特徴的なオリゴヌクレオソマール ラダー パターン（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ ｌａｄｄｅｒ ｐａｔｔｅｒｎ）を示した。
トランスフェクト細胞中に観察されたＶＰ３分布は、ＣＡＶ感染されたＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞のそれとよく対応する。感染後、初期（１〜１．５日後）には、ＶＰ３は核に微顆粒状に分布され、細胞ＤＮＡはこの段階では無傷である。感染の後期（約３日後）に、ＶＰ３は核中で集合体を形成する（コシュ，発表日不詳）。ＣＡＶ感染された細胞のＤＮＡは断片化されている（ジュリセン等，１９９２年）。
本発明者らの結論は、ＶＰ３それ自身ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞中、ＣＡＶ特異的アポプトシスを誘発できるということである。単核細胞系ＬＳＣＣ−ＨＤ１１中で、ＶＰ３をコードするｐＲＳＶ−ＶＰ３を発現させても、これらの細胞でアポプトシスを引き起こした。
ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞中でのＶＰ２タンパク質の発現は、また細胞ＤＮＡに損傷を起こす。ＶＰ２をコードするＤＮＡでＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞を感染した３日後、トランスフェクトされた細胞の２０％が、そして感染５日後、細胞の約半分が、核がヨウ化プロピジウムで弱く染色される。この理由から、ＶＰ２もまたＶＰ３より程度が少ないが、ＣＡＶ特異的細胞死の誘発に関与しているようである。
ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞中でのアポプトシスの誘発について末端を切り取った（トランケート）ＶＰ３の影響
ＶＰ３は、鎖長１２１アミノ酸からなるタンパク質で、２つのプロリンが豊富な片、疎水性領域および２つの弱い正の荷電部分を含む（図８ｂ）。正の荷電領域は、おそらく核局在化シグナルおよび／またはＤＮＡ−結合領域である（ノテボーン等，１９８７年，ラマクリシュナン，１９９３年）。
本発明者らは、ＶＰ３の基本Ｃ末端がＶＰ３のアポプトシス活性に関与しているかどうか研究した。この目的のために、ＶＰ３コード配列のＣ末端で１１コドンを取り除いて、末端が切り取られたＶＰ３生成物を製造した。プラスミドｐＥＰ−ＶＰ３を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断し、そして０．３８ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII ＤＮＡを単離した。２つの合成ＤＮＡオリゴマ５′−ＡＧＣＴＴＧＡＴＴＡＣＣＡＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧ−３′および５′−ＴＣＧＡＣＴＣＡＧＧＧＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＡ−３′をハイブリダイズし、そして２本鎖ＨｉｎｄIII−ＳａｌＩ ＤＮＡリンカを形成した。プラスミドｐＲＳＶ−Ｈ２０をＢｇｌIIおよびＳａｌＩで切断し、アルカリフォスファターゼで処理し、そして４．３ｋｂ ＤＮＡ断片を単離した。ＨｉｎｄIII−ＳａｌＩ ＤＮＡリンカおよび０．３８ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片を４．３ｋｂ ＢｇｌII−ＳａｌＩ断片の中で結合した。ＲＳＶプロモータの制御のもと、末端の切り取られたＶＰ３タンパク質のコード配列を含む最終構築物を制限酵素および配列分析によって分析した（図８ａ）。
ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞を一過的にｐＲＳＶ−ｔ−ＤＮＡでトランスフェクトし、そしてトランスフェクションの後、異なった時期にモノクロナールＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１およびヨウ化プロピジウムで染色した。トランスフェクション４２時間後、末端を切り取られたＶＰ３を発現する細胞は、ほとんどその核に微顆粒状ＶＰ３を含んでいることを免疫蛍光が示した。細胞ＤＮＡは、ヨウ化プロピジウムで強く染色された。トランスフェクションの３日後でも、まだ末端を切り取られたＶＰ３を発現する細胞の８０％がヨウ化プロピジウムで強く染色された核を持っていた（図９）。ｐＲＳＶ−ｔｒでトランスフェクションの３日後、ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞から単離されたＤＮＡは、ｐＲＳＶ−ＶＰ３でトランスフェクトされたＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞から単離されたＤＮＡより分解しないことが判った。末端を切り取られたＶＰ３を発現する細胞のヨウ化プロピジウム陽性核の割合は、トランスフェクション後、５日目で約５０％にまで緩やかに減少した。末端を切り取られたＶＰ３を含みそしてヨウ化プロピジウムで弱く染色された細胞のほとんどは、顆粒状ＶＰ３分布を有していた。単一の細胞のみがＶＰ３集合体を含んでいた。ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞中での末端を切り取られたＶＰ３の発現では、野生型ＶＰ３の発現よりもかなり効率悪く細胞死が誘発された。ＶＰ３変異体は、野生型ＶＰ３よりも少なくしか集合体を形成できないことも注目できる。
ヒト腫瘍細胞中でのＶＰ３発現によるアポプトシスの誘発
ヒト細胞でＶＰ３を発現するために、発現ベクタｐＲＳＶ−ＶＰ３（図８ａ）およびｐＣＭＶ−ＶＰ３を用いた。ＶＰ３のコード配列を、シトメガロウイルス（ＣＭＶ）の強力プロモータとその近傍に初期（ｅａｒｌｙ）遺伝子を含む発現ベクタにクローンした（ボスハート等，１９８５年）。４２７位〜８６８位のＣＡＶ ＤＮＡ配列を有する０．４６ＢａｍＨＩ断片（ノテボーン等，１９９１年）をプラスミドｐＡｃ−ＶＰ３から単離した（図４）。ベクタｐＣＭＶ−ｎｅｏをＢａｍＨＩで直線化し、ＣＩＰで処理し、そして７．５ｋｂ断片を単離した。０．４６ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を７．５ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片に結合した。最終構築物ｐＣＭＶ−ＶＰ３中のＣＭＶプロモータに関して、ＶＰ３コード配列の正しい方向は制限酵素分析を用いて決定した（図１０）。
ヒト細胞中、端を切り取ったＶＰ３を発現するために、端を切り取ったＶＰ３をコードするプラスミドｐＲＳＶ−ｔｒの０．４６ｋｂＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片をクレノウポリメラーゼと処理して平滑断端を与えそして単離した。ｐＣＭＶ−ｎｅｏベクタをＢａｍＨＩで直線化し、平滑断端を与え、そしてＣＩＰで処理して脱リン酸化した。０．４６ｋｂ平滑断端ＤＮＡ断片を７．５平滑断端ＤＮＡ断片に結合した。構築物ｐＣＭＶ−ｔｒはＣＭＶプロモータの制御のもと、端の切り取られたＶＰ３のコード配列を含む（図１０）。
まず第１に、ＶＰ３を３つのヒト造血腫瘍細胞系ＫＧ−１，ＤＯＨＨ−２およびＫ５６２そして不死化した細胞系Ｊｏｂｏ−０中で発現した。細胞系ＫＧ−１およびＫ５６２は、ヒト骨髄球性白血病の異なった患者に（コフラーおよびコルディ，１９８０年）そしてＤＯＨＨ−２系は

の患者に由来する。Ｊｏｂｏ−０細胞をエプスタイン、バールウイルス（ランデゲント，未公表結果）で不死化した。４つのヒト細胞系をｐＲＳＶ−ＶＰ３（ＫＧ−１）のＤＮＡまたはｐＣＭＶ−ＶＰ３（ＤＯＨＨ−２，Ｋ５６２およびＪｏｂｏ−１）のＤＮＡでトランスフェクトした。細胞を固定化し、そしてモノクロナールＣＶＩ−ＣＡＶ−８５．１で染色することによりＶＰ３発現を、ならびにヨウ化プロピジウムで染色することによりアポプトシスの誘発を分析した。トランスフェクション後、すぐにＶＰ３陽性細胞でヨウ化プロピジウムで染色された核中に微顆粒状ＶＰ３の分布が観察され、そしてプロピジウムで染色されなかった核中にＶＰ３集合体を含む核が観察された。ヨウ化プロピジウムで染色されずＶＰ３集合体を含む核を有するＶＰ３陽性細胞の割合は、４つの異なった造血細胞系について、トランスフェクションの５日後で７５〜９５％の間の範囲にあることが判った（図１１ａ）。続いてＫ５６２細胞を、Ｃ末端が切り取られたＶＰ３を発現するプラスミドｐＣＭＶ−ｔｒのＤＮＡでトランスフェクトした。Ｋ５６２細胞中で末端が切り取られたＶＰ３を発現すると、野生型ＶＰ３より細胞死の誘発がより効率的ではなかった。
本発明者らの結論は、ヒト造血腫瘍細胞系でＶＰ３の発現は、アポプトシスの特異的な誘発をもたらすということである。ヒト乳腫瘍細胞系ＭＣＦ−７（リップマン等，１９８０年）中、ＶＰ３を発現しても、アポプトシスの誘発の結果となった（ノテボーン等，未発表結果）。
機能的ｐ５３を含まない（ヒト）腫瘍および腫瘍細胞系は化学療法剤および放射線治療による細胞死の誘発に対して感受性がないかまたは少ないと、文献には記載されている（ロー等，１９９３年）。特定の抗腫溶剤によるアポプトシスの誘発において、腫瘍サプレサー遺伝子ｐ５３が媒介体として働く。本発明者らは、ｐ５３を持たないかまたは変位体ｐ５３を持つヒト細胞中で、ＶＰ３がアポプトシスを誘発できるかどうか検査した。ＶＰ３をプラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ３を用いるＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションによりヒト骨肉腫細胞中で発現した。骨肉腫由来ＳａｏＳ−２細胞はｐ５３を合成できない。そしてＳａｏＳ−２／Ａｌａ１４３細胞は、変異した、したがって機能的でないｐ５３を発現する。正コントロールとして野生型ｐ５３を含むＵ２−ＯＳ細胞系を用いた（ディラ等，１９９０年）。ｐ５３^-（ＳａｏＳ−２およびＳａｏＳ−２／Ａｌａ１４３）であるからｐ５３⁺（Ｕ２−ＯＳ）である細胞中で、ＶＰ３は比較できる程度にアポプトシスを誘発できることが図１２ａの結果から示される。トランスフェクションの６日後、ＶＰ３陽性細胞のほとんどは消滅している。末端の切り取られたＶＰ３の発現は、ＳａｏＳ−２細胞で、ずっと効率悪くアポプトシスを誘発した（図１２ｂ）。本発明者らの結論は、腫瘍サプレサー遺伝子ｐ５３を含むかまたは含まないヒト腫瘍細胞中でＶＰ３がアポプトシスを特異的に誘発できるということである。
図面の説明
図１は、ニワトリ貧血症ウイルスのＶＰ１タンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を表す。ＣＡＶ ＤＮＡ配列の順番は、オランダ国特許９００２００８に記載されている。
図２は、ニワトリ貧血症ウイルスのＶＰ２タンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を表す。ＣＡＶ ＤＮＡ配列の順番は、オランダ国特許９００２００８に記載されている。
図３は、ニワトリ貧血症ウイルスのＶＰ３タンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を表す。ＣＡＶ ＤＮＡ配列の順番は、オランダ国特許９００２００８に記載されている。
図４は、３種のＣＡＶ組換え転移ベクタｐＡｃ−ＶＰ１，ｐＡｃ−ＶＰ２およびｐＡｃ−ＶＰ３の図式的表示である。
図５は、ＶＰ３由来のペプチド（１２−ｍｅｒｓ）を有するモノクロナール抗体ＣＶ１−ＣＡＶ−８５．１のペプスキャン分析を表す。ＣＶ１−ＣＡＶ−８５．１がそれに対して指向する核配列ＰＳＴＶＦＲは、ＶＰアミノ酸配列の１２位〜１７位である（ノテボーン等，１９９１年）。
図６は、ＶＰ２由来のペプチド（１２−ｍｅｒｓ）を有するモノクロナール抗体１１１．２のペプスキャン分析を表す。モノクロナール１１１．２は、ＶＰ２アミノ酸配列の１０９位〜１１６位であるエピトープＧＬＥＤＲＳＴＱを指向する（ノテボーン等，１９９１年）。ペプチド番号１〜１４０で得られた結果のみが示されている

図７は、ＶＰ３由来のペプチド（１２−ｍｅｒｓ）を有するモノクロナール抗体１１１．３のペプスキャン分析を表す。モノクロナール１１１．３は、ＶＰ３アミノ酸配列の１９位〜２３位であるエピトープＰＴＳＳＲを指向する。
図８パネルＡは、２種の発現ベクタｐＲＳＶ−ＶＰ３およびｐＲＳＶ−ｔｒの図式的表示である。パネルＢは、ＣＡＶタンパク質ＶＰ３のアミノ酸配列を表す。プロリン残基はイタリック体で印刷され、基本アミノ酸は太字で印刷されている。発現ベクタ中、コドンが取り除かれている１１のＣ末端アミノ酸には下線が施されている。
図９は、ＶＰ３または末端が切り取られたＶＰ３のアポプトシス効果の速度論（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を表す。ＭＤＣＣ−ＭＳＢ１細胞をプラスミドｐＲＳＶ−ＶＰ３（０）またはｐＲＳＶ−ｔｒでトランスフェクトし、固定しそしてトランスフェクション後、異なったときにモノクロナール抗体ＣＶ１−ＣＡＶ−８５．１で染色した。通常、ヨウ化プロピジウムで染色される、免疫蛍光を呈す細胞の百分率が示されている。一試験あたり、ＶＰ３または末端の切り取られたＶＰ３を発現した少なくとも１００細胞が数えられた。
図１０は、発現ベクタｐＣＭＶ−ＶＰ３およびｐＣＭＶ−ｔｒの図式的表示である。
図１１は、ヒト造血（腫瘍）細胞に対するＶＰ３のアポプトシス効果の速度論を表す。ＫＧ１細胞系をプラスミドｐＲＳＶ−ＶＰ３でトランスフェクトし、そして細胞系ＤＯＨＨ−２，Ｋ５６２およびＪｏｂｏ−０をプラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ３でトランスフェクトした。ヨウ化プロピジウムで弱く染色される核を有するＶＰ３陽性細胞、すなわち消滅細胞の百分率が示されている。一試験あたり少なくとも２００細胞を数えた。
図１２は、ヒト骨肉腫細胞系に対するＶＰ３のアポプトシス効果の速度論を表す。細胞系Ｓａｏｓ−２，Ｓａｏｓ−２／Ａｌａ１４３およびＵ２−ＯＳの細胞をプラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ３でトランスフェクトした。ヨウ化プロピジウムで弱く染色する核を有するＶＰ３陽性細胞、すなわち消滅細胞の百分率が示されている。一試験あたり少なくとも５００細胞を数えた。
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Claims (6)

1. 自然環境から遊離された、ニワトリ貧血症ウイルスに由来する、
   下記の配列２
   

   

   もしくは配列３
   

   

   で示されるアミノ酸配列、または、
   上記配列３の少なくとも最初の１１０ Ｎ−末端アミノ酸を含んでいる上記配列３のアミノ酸配列の変異アミノ酸配列
   の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドを、インビトロでアポトーシスを誘発するために使用することを特徴とする、ポリペプチドの使用方法。
2. 自然環境から遊離された、ニワトリ貧血症ウイルスに由来する、
   下記の配列２
   

   

   もしくは配列３
   

   

   で示されるアミノ酸配列、または、
   上記配列３の少なくとも最初の１１０ Ｎ−末端アミノ酸を含んでいる上記配列３のアミノ酸配列の変異アミノ酸配列
   の少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、かつアポトーシスを誘発することのできるポリペプチドを、細胞死の誘発のための薬剤の調製に使用することを特徴とする、ポリペプチドの使用方法。
3. 自然環境から遊離された、ニワトリ貧血症ウイルスに由来する、
   下記の配列２
   

   

   もしくは配列３
   

   

   で示されるアミノ酸配列、または、
   上記配列３の少なくとも最初の１１０ Ｎ−末端アミノ酸を含んでいる上記配列３のアミノ酸配列の変異アミノ酸配列
   の少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、かつアポトーシスを誘発することのできるポリペプチドを、腫瘍治療用の薬剤の調製に使用することを特徴とする、ポリペプチドの使用方法。
4. 自然環境から遊離された、ニワトリ貧血症ウイルスに由来する、
   下記の配列２
   

   

   もしくは配列３
   

   

   で示されるアミノ酸配列、または、
   上記配列３の少なくとも最初の１１０ Ｎ−末端アミノ酸を含んでいる上記配列３のアミノ酸配列の変異アミノ酸配列
   の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むアポトーシスを誘発することのできるポリペプチドをコード化し、かつ腫瘍細胞内で発現する組み換えＤＮＡ分子を、腫瘍治療用薬剤の調製に使用することを特徴とする、組み換えＤＮＡ分子の使用方法。
5. 自然環境から遊離された、ニワトリ貧血症ウイルス由来の、
   下記の配列２
   

   

   もしくは配列３
   

   

   で示されるアミノ酸配列、または、
   上記配列３の少なくとも最初の１１０ Ｎ−末端アミノ酸を含んでいる上記配列３のアミノ酸配列の変異アミノ酸配列
   の少なくとも１つのアミノ酸配列を含みかつアポトーシスを誘発することのできるポリペプチドと、
   腫瘍に関連するタンパク質、糖質またはリン脂質に親和性を有する物質とを少なくとも含んで成ることを特徴とする腫瘍治療のためのコンジュゲート。
6. 腫瘍に親和性のある物質が、抗体、その誘導体またはその断片である請求項５記載のコンジュゲート。

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