JP5872755B2

JP5872755B2 - 抗ｈｓｖ−２ワクチン接種のための組成物および方法

Info

Publication number: JP5872755B2
Application number: JP2009521028A
Authority: JP
Inventors: マーガリス，マイケル; ビラルタ，エイドリアン; エム．ケール，デイビッド; ドン，リチュン
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 2006-07-20
Filing date: 2007-07-20
Publication date: 2016-03-01
Anticipated expiration: 2027-07-20
Also published as: US20120328657A1; AU2007275047A8; US8840904B2; US20150030631A1; US20080102087A1; US20100160418A1; US20140370055A1; JP2009544289A; US8828408B2; US8293248B2; EP2521786A2; US7628993B2; US20100158949A1; JP2013138680A; US20150010597A1; US20100040651A1; US8263087B2; WO2008011609A3; WO2008011609A2; US20100160419A1

Description

連邦支援の研究開発下で行われた発明に対する権利に関する陳述
本明細書に記載の一部研究は、国立アレルギー感染病研究所助成金１Ｒ４１ＡＩ０６５０１５‐０１から一部資金援助を受けた。米国連邦政府は、開示される発明において一部権利を有し得る。

関連出願の相互参照
本出願は、２００６年７月２０日出願の米国仮特許出願第６０／８０７，９１１号に対する優先利益を主張し、あらゆる目的のために、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

発明の背景
発明の分野
本発明は、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）に対する免疫応答を誘起するための予防的および治療用組成物ならびに方法に関する。特に、本発明は、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２等のＨＳＶ‐２タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするＤＮＡワクチンを導入および発現することにより、脊椎動物において免疫応答を誘起するための予防的および治療用組成物ならびに方法に関連する。

最新技術の説明
免疫原性タンパク質を用いるワクチン接種は、多くの疾患の発生を排除または削減してきた。しかしながら、特定の病原体および病状に関連するタンパク質を免疫原として使用するには大きな問題がある。多くのタンパク質抗原は、本質的に免疫原性ではない。多くの場合、免疫系の動作の仕方により、それらはワクチンとして有効でない。

脊椎動物の免疫系は、いくつかの相互作用する要素で構成される。最も良く特徴付けられ、最も重要な部分は、体液および細胞（細胞傷害性）系である。体液性免疫は、抗体、すなわち体液に分泌され、抗原を直接認識するタンパク質が関与する。細胞系は、対照的に、外来抗原を産生している他の細胞を認識して破壊する特殊な細胞に依存する。この基本的な機能的区分は、免疫防御の２つの異なる方法を反映している。体液性免疫は、主に、動物に外因性の抗原に向けられるのに対して、細胞系は、動物の体内で活発に合成される抗原に応答する。

体液性免疫のエフェクタである抗体分子は、抗原に応答して、特殊なＢリンパ球細胞であるＢ細胞により分泌される。抗体は、抗原に結合して直接不活性化する（抗体を中和する）、または免疫系の他の細胞を活性化して抗原を破壊することができる。

細胞性免疫認識は、特殊なクラスのリンパ球細胞、すなわち細胞傷害性Ｔ細胞により媒介される。これらの細胞は抗原全体を認識しないが、代わりに、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と称されるタンパク質に結合された標的細胞の表面上に出現する、それらの分解ペプチドフラグメントに応答する。原則として、すべての有核細胞はクラスＩ分子を有する。細胞内で産生されたタンパク質は、正常な細胞代謝の一部として、継続的にペプチドに分解されると考えられる。これらのフラグメントは、ＭＨＣ分子に結合され、細胞表面に運ばれる。したがって、細胞性免疫系は、体内のあらゆる細胞で産生される多様なタンパク質を常に監視し、外来抗原を産生している任意の細胞を排除する態勢にある。

ワクチン接種は、動物を抗原に応答するように準備させるプロセスである。ワクチン接種は免疫認識よりも複雑であり、Ｂ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞のみならず、他の種類のリンパ球細胞も同様に関与する。ワクチン接種中、抗原を認識する細胞（Ｂ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞）は、クローン的に広がる。さらに、抗原に特異的な補助細胞（ヘルパーＴ細胞）の集団も増加する。ワクチン接種は、抗原を処理し、２つの経路のうちの１つを刺激し得る形式でそれを表示することができる、特定抗原提示細胞も伴う。

ワクチン接種は、ルイ・パスツールの時代からほとんど変わっていない。外来抗原は、動物に導入されると、表面免疫グロブリンに結合することにより特定のＢ細胞を活性化する。また外来抗原は、抗原処理細胞によって取り込まれる。ここで外来抗原は分解され、これらの細胞の表面上にフラグメントとしての現れ、クラスＩＩＭＨＣ分子に結合される。クラスＩＩ分子に結合されたペプチドは、ヘルパークラスのＴ細胞を刺激することができる。ヘルパーＴ細胞および活性化Ｂ細胞は、いずれも能動的な体液性免疫の産生に必要である。細胞性免疫は、同様であるがよく解明されていない機序により刺激されると考えられる。

したがって、２つの異なる個別経路の抗原処理は、Ｔヘルパー細胞を刺激することができる、クラスＩＩＭＨＣ分子に結合される外因性抗原、ならびに分解されてクラスＩＭＨＣ分子に結合され、細胞傷害性クラスのＴ細胞により認識される内因性タンパク質を産生する。

ＭＨＣ分子の分布にほとんど、または全く差はない。基本的に、すべての有核細胞はクラスＩ分子を発現するが、クラスＩＩＭＨＣタンパク質は、数種類のリンパ球細胞に限定される。

通常のワクチン接種スキームは、体液性免疫応答を産生する。それらは、細胞傷害性免疫を提供する場合もある。体液性系は、ワクチン接種を受けた個体を病原体によるその後のチャレンジから保護し、病原体がそのライフサイクル中に細胞外相を経過する場合に、細胞内感染の拡大を防ぐことができる。しかしながら、それは細胞内病原体の排除にはほとんど役に立たない。細胞傷害性免疫は、感染した細胞を排除することによって、体液性系を補完する。したがって、有効なワクチン接種は、両種類の免疫を活性化する必要がある。

ウイルス等の細胞内病原体、および悪性細胞を除去するためには、細胞傷害性Ｔ細胞応答が必要である。クラスＩ分子と併せて体外から投与された抗原を適切な濃度で提示し、適切な応答を保証することは困難であることが判明している。これは、（例えば、乳癌または大腸癌細胞上の）腫瘍特異的抗原に対するワクチン、および弱免疫原性ウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ、ヘルペス、非Ａ、非Ｂ型肝炎、ＣＭＶ、およびＥＢＶ）に対するワクチンの開発を著しく妨げている。

抗体が感染性を増強することが示されているウイルス等の因子に対して免疫付与する際、細胞性免疫応答のみを提供することが望ましい。慢性および潜伏ウイルス感染の両方、および悪性細胞に対するそのような応答を提供することも有用となる。

合成ペプチドワクチンの使用は、ペプチドが、組織適合性分子と容易に結合せず、血中半減期が短く、急速にタンパク分解される、または抗原提示単球およびマクロファージに対して特異的に局在化しない、のいずれかの理由のために、必ずしもこれらの問題を解決するものではない。よくても、体外から投与されたすべての抗原は、抗原提示マクロファージに結合するために、あらゆる自己タンパク質と競合する必要がある。

ヘルペスウイルス、非Ａ、非Ｂ型肝炎、ＨＩＶ等からの弱免疫原性ウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘発するために、多くの努力が払われて来た。これらの病原体は、体外で増殖させることが困難かつ危険である。陰部ヘルペスは世界的に極めて蔓延している性感染症であり、大きな健康の負担であると考えられる。原因因子は、通常、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）である。ＨＳＶ‐２に対する細胞性免疫応答は、疾患の予防および再発疾患の制御の両方に重要であると考えられる。ＨＳＶ‐２テグメントタンパク質ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２、およびｇＤは、それぞれ遺伝子ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ４９、およびＵＳ６として知られるか、またはそれらによってコードされる。これらのタンパク質は、それぞれＨＬＡＡ^*０１０１、Ａ^*０２０１（ｘ２）、およびＢ^*０７０２によって制限されるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む。

上述のように、ウイルスでコードされたタンパク質に対応する合成ペプチドワクチンが形成されているが、いくつかの欠陥がある。ワクシニアウイルスベクターを使用して、他のウイルスからタンパク質を発現する試みも行われている。しかしながら、（ａ）組み換えワクシニアウイルスは、既に免疫のある個人において循環から急速に排除される場合があり、（ｂ）複合ウイルス抗原の投与は、ウイルスの弱免疫原性部分が免疫応答を誘発できない「抗原競合」として知られる現象を誘起する場合があるため、不本意な結果に終わっている。

タンパク質またはペプチドワクチンに関する別の主な問題は、強力な免疫応答を産生するために抗原の注入が繰り返される場合に生じ得るアナフィラキシ反応である。この現象において、抗原に応答して形成されるＩｇＥ抗体は、深刻で時に致命的なアレルギー反応をもたらす。

したがって、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ‐２）に関連するタンパク質またはポリペプチドに対する、安全かつ有効な免疫応答を引き起こすための方法が必要である。さらに、これらの抗原を細胞表面上のクラスＩ組織適合性抗原と結合して、細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発し、血中物質のアナフィラキシおよびタンパク分解を回避して、単球およびマクロファージに対する材料の局在化を促進する方法がおおいに必要とされる。

発明の概要
本発明は、ＤＮＡワクチンを提供し、その一部は、ＨＳＶ‐２テグメント遺伝子ＵＬ４６、ＵＬ４７およびＵＬ４９を含み、他の一代替形態ではＨＳＶ‐２ｇＤ遺伝子を含み、それらはすべて、個別に発現プラスミド（ＶＲ１０１２）にクローン化され、脊椎動物の免疫付与に使用された。筋肉内（ＩＭ）注射により、１００μｇ用量のＤＮＡワクチン製剤を各動物に３回接種した。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMアジュバントおよびポロキサマーに基づく製剤について、ＨＳＶＤＮＡワクチンに対する免疫応答を高めるそれらの能力を評価した。ＰＢＳで調剤されたプラスミドＤＮＡを対照として使用した。各テグメントタンパク質ＤＮＡワクチンは、強力な体液性応答を誘起した。ワクチンの製剤に関わりなく、ＵＬ４９およびＵＬ４７は、ＵＬ４６よりも強い細胞応答を誘発した。ポロキサマーは、他のワクチン製剤と比較して、ＵＬ４７ＤＮＡワクチンに対する細胞性免疫応答を著しく高めた。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMは、ＵＬ４６およびＵＬ４９ＤＮＡワクチンに対する抗体応答を約２倍高めた。

本発明は、脊椎動物に抗単純ヘルペスウイルス免疫を付与するための方法であって、調剤ポリヌクレオチド、すなわち免疫原性ペプチドをコードする発現可能なポリヌクレオチドを含む正電荷のリポソームを得るステップと、調剤ポリヌクレオチドを脊椎動物に導入し、それにより、リポソームが単球、マクロファージ、または別の細胞に組み込まれるステップと、を含む方法を提供する。ここで、ポリヌクレオチドの免疫原性翻訳生成物が形成され、生成物は、主な組織適合性複合体の環境で細胞により処理および提示され、それにより、免疫原に対する免疫応答を誘発する。この場合もポリヌクレオチドはＤＮＡであるが、ｍＲＮＡを使用し得る。

別の実施形態において、医薬または免疫原性ポリペプチドを脊椎動物の細胞内部に体内で送達するための方法であって、未調剤ポリヌクレオチド、すなわち、医薬的に許容される注入可能な担体および単純ヘルペスウイルスポリペプチドを動作可能にコードするポリヌクレオチドを含む製剤を、細胞を含む組織の間質腔に導入するステップを含み、それにより、ポリヌクレオチドが細胞内部に取り込まれ、脊椎動物への免疫原性または薬学的影響を発現する、方法が提供される。ポリヌクレオチドを筋肉細胞に体内で導入するための方法も提供される。本方法は、医薬的に許容される担体にポリヌクレオチドを含む組成物を提供するステップと、組成物を脊椎動物の筋肉組織と体内で接触させるステップとを含み、それにより、ポリヌクレオチドが組織の筋肉細胞に導入される。この実施形態において、担体は、好ましくは等張性、低張性、または弱高張性であり、蔗糖液により提供されるように、比較的低いイオン強度を有する。

本発明の特に興味を引く側面の１つは、脊椎動物に対する単純ヘルペスポリペプチドの長期投与を達成するための方法であって、ポリペプチドを動作可能にコードする未調剤または調剤ＤＮＡ配列を、脊椎動物の組織に間質的に導入するステップを含み、それにより、組織の細胞は少なくとも１ヶ月または少なくとも３ヶ月、より好ましくは少なくとも６ヶ月間、ポリペプチドを産生する。本発明のこの実施形態において、ポリペプチドを産生する細胞は、筋肉細胞等の非増殖細胞である。

本発明に基づく別の方法は、脊椎動物において単純ヘルペスポリペプチドの一過性発現を得るための方法であり、ポリペプチドを動作可能にコードする未調剤または調剤ｍＲＮＡ配列を、脊椎動物の組織に間質的に導入するステップを含み、それにより、組織の細胞は約２０日未満、通常は約１０日未満、多くの場合は３日または５日未満の間、ポリペプチドを産生する。本発明の方法の多くは、固形組織への投与が好ましい。

本発明の重要な側面の１つは、陰部ヘルペスの治療のための方法であって、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２を動作可能にコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドを医薬的に許容される注入可能な担体に含む治療量の組成物を、陰部ヘルペスを患う動物の筋肉組織に体内で導入するステップを含み、それにより、ポリヌクレオチドが細胞に取り込まれ、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２はインビボで産生される。好ましくは、ポリヌクレオチドは調剤ポリヌクレオチドであり、組成物は間質的に筋肉組織に導入される。しかしながら、未調剤ポリヌクレオチドも考えられる。

本発明は、本明細書に記載の方法で考えられるあらゆる使用に対する医薬品も含む。例えば、単純ヘルペスポリペプチドを動作可能にコードする未調剤または調剤ポリヌクレオチドを、生理学的に許容される管理形態で容器に含む医薬品がある。

別の実施形態において、本発明は、単純ヘルペスペプチドを動作可能にコードする未調剤または調剤ポリヌクレオチドを、生理学的に許容される注入可能な担体中の溶液に含み、組織に間質的に導入して、組織の細胞にポリペプチドを発現させるために好適な医薬品、および当該溶液を収容する容器を提供する。ペプチドは免疫原性であり得、ヒトへの溶液の投与は、ヒトまたは動物にワクチン接種するために機能し得る。同様に、ペプチドは治療用であってもよく、ポリペプチドに関連する治療を必要とする脊椎動物への溶液の投与は、治療効果を有する。

また本発明は、未調剤または調剤アンチセンスポリヌクレオチドを、生理学的に許容される注入可能な担体中の溶液に含み、組織に間質的に導入して組織の細胞にポリヌクレオチドを取り込ませ、治療効果を提供するために好適な医薬品、および溶液を収容する容器を提供する。

本発明の特に重要な側面の１つは、陰部ヘルペスの治療のための医薬品に関し、滅菌された医薬的に許容される担体、担体中の少なくとも１つのｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２タンパク質を動作可能にコードする医薬的に有効な量の未調剤または調剤ポリヌクレオチド、および担体とポリヌクレオチドを滅菌状態で収容する容器を含む。好ましくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。

さらに別の観点から、本発明は、単純ヘルペスポリペプチドを脊椎動物に供給する際に使用するための医薬品を含み、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２またはそれらの組み合わせのいずれかを動作可能にコードする医薬的に有効な量の未調剤または調剤ポリヌクレオチドと、担体およびポリヌクレオチドを滅菌様式で収容する容器と、容器から組織の間質腔へのポリヌクレオチドの移動を可能にするための容器に関連する手段とを含み、それにより、組織の細胞はポリヌクレオチドを取り込み、発現し得る。そのような移動を可能にする手段は、例えば、針によって穿刺可能な従来の中隔を含み得る。代替として、容器がシリンジである場合、手段は、シリンジのプランジャまたはシリンジに取り付けられた針を含むと考えられる。本発明に使用される容器は、通常、少なくとも１μｇ、好ましくは少なくとも５または１０μｇ、より好ましくは少なくとも５０または１００μｇのポリヌクレオチドを収容し、１つ以上の単位用量を提供する。多くの適用の場合、容器は少なくとも５００μｇまたは１ｍｇのポリヌクレオチドを収容し、多くの場合、少なくとも５０または１００ｍｇのポリヌクレオチドを含む。

本発明の別の側面は、脊椎動物に免疫付与するために使用する医薬品を提供する。当該医薬品は、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２またはそれらの組み合わせのいずれかを動作可能にコードする、医薬的に有効な量の未調剤または調剤ポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドを滅菌様式で収容する密閉容器と、容器から組織の間質腔へのポリヌクレオチドの移動を可能にするための容器に結合された手段とを含み、それにより、組織の細胞はポリヌクレオチドを取り込み、発現することができる。

本発明のさらに別の側面は、組織に間質的に導入して、組織を含む細胞に、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２またはそれらの組み合わせのいずれかを産生させて陰部ヘルペスを治療するための医薬を調製する際、生理学的に活性型のｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２またはそれらの組み合わせのいずれかを動作可能にコードする未調剤または調剤ポリヌクレオチドを使用することである。

ポリヌクレオチドが導入される組織は、持続性の非分裂細胞であり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列のいずれかであり得る。ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、それ自体は複製しないが、プラスミドに挿入されるＤＮＡ配列であってもよく、プラスミドは自己複製子をさらに含む。ＤＮＡは、宿主細胞ゲノムに統合されないように組み換えられた配列であってもよい。ポリヌクレオチド配列は、細胞内に含まれるか、またはそこから分泌される単純ヘルペスウイルスポリペプチドをコードし得る、またはペプチドの分泌を指示する配列を含み得る。

ＤＮＡ配列は、プロモータ配列も含み得る。好適な一実施形態において、ＤＮＡ配列は、ＤＮＡの実質的な転写を所定の細胞においてのみ可能にする細胞特異的プロモータを含む。ＤＮＡは、ＤＮＡを転写するためのポリメラーゼもコードし、ポリメラーゼの認識部位を含み得る。また注入可能な製剤は、初期量のポリメラーゼを含み得る。

多くの場合において、ポリペプチド送達が一過性となるように、ポリヌクレオチドは、限られた期間翻訳されることが好ましい。ポリペプチドは、有利に治療用ポリペプチドであってもよく、酵素、ホルモン、リンホカイン、レセプタ、特に細胞表面レセプタ、成長因子または他の制御因子等の調節タンパク質、または生きている脊椎動物における細胞に送達することが望まれ、その対応するＤＮＡまたはｍＲＮＡを得ることができる任意の他のタンパク質またはペプチドを含み得る。

好適な実施形態において、ポリヌクレオチドは筋肉組織に導入され、他の実施形態において、ポリヌクレオチドは皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、または血液の組織に組み込まれる。製剤は、多様な経路によって脊椎動物に、皮内、皮下、髄腔内、または静脈内に注入されるか、または体の空洞内に配置され得る。好適な実施形態において、ポリヌクレオチドは、筋肉内に注入される。さらに他の実施形態において、ポリヌクレオチドを含む製剤は、皮膚に押し付けられる。経皮投与も吸入と同様に考えられる。

好適な一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡを転写するためのポリペプチドおよびポリメラーゼの両方をコードするＤＮＡであり、ＤＮＡは、ポリメラーゼの認識部位を含み、注入可能な製剤は、細胞内に初期量のポリメラーゼを提供するための手段をさらに含む。初期量のポリメラーゼは、物理的にＤＮＡとともに存在し得る。代替として、ｍＲＮＡコーディングを含むことにより提供され、したがってｍＲＮＡが細胞によって翻訳される。本発明のこの実施形態において、ＤＮＡは、好ましくはプラスミドである。好ましくは、ポリメラーゼはファージＴ７ポリメラーゼであり、認識部位は複製配列のＴ７起点である。

本発明の別の側面に基づいて、脊椎動物に免疫付与するための方法が提供される。本方法は、免疫原性翻訳生成物（すなわち、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２またはそれらの組み合わせのいずれか）をコードする発現可能なポリヌクレオチドを含む製剤を取得するステップと、脊椎動物に該製剤を導入するステップとを含む。ここでポリヌクレオチドの翻訳生成物は、脊椎動物の細胞によって形成され、単純ヘルペスウイルス免疫原に対する免疫応答を誘発する。本方法の一実施形態において、注入可能な製剤は、免疫原性ペプチドをコードする発現可能なポリヌクレオチドを含む、医薬的に許容される担体を含み、脊椎動物に該製剤を導入する際、ポリヌクレオチドは脊椎動物の細胞に組み込まれる。ここで、ポリヌクレオチドの免疫原性翻訳生成物が形成され、免疫原に対する免疫応答を誘発する。

一代替実施形態において、製剤は脊椎動物から採取し、ポリヌクレオチド（すなわち、ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ４９、またはＵＳ６あるいはそれらの組み合わせのいずれか）を用いて体外でトランスフェクトした１つ以上の細胞を含み、それにより、ポリヌクレオチドは、該細胞に組み込まれ、ポリヌクレオチドの免疫原性翻訳生成物が形成される。またそれにより、脊椎動物に製剤を導入する際、免疫原に対する免疫応答が誘発される。本発明の実施形態のいずれにおいても、免疫原性生成物は、細胞によって分泌され得るか、または主な組織適合性抗原の環境で脊椎動物の細胞により提示され得る。それにより、免疫原に対する免疫応答を誘発する。本方法は、脊椎動物から得た非分裂分化細胞を使用して実施することができる。この細胞は、血液サンプルから得たリンパ球であり得る。代替として、本方法は、分裂可能な部分的に分化した皮膚繊維芽細胞を使用して実施することができる。好適な実施形態において、本方法は、免疫原性翻訳生成物をコードするポリヌクレオチドを筋肉組織に組み込むことによって実施される。

本方法を使用して、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはそれらの混合を選択的に誘発することができる。細胞がクラスＩの主な組織適合性複合体を発現する実施形態において、免疫原性ペプチドは、クラスＩ混合物の環境で提示され、免疫応答は細胞性であって、細胞傷害性Ｔ細胞の産生を含む。

そのような一実施形態において、免疫原性ペプチドは、ＨＳＶ‐２ウイルスと関連し、クラスＩ抗原の環境で提示され、ウイルスに感染した細胞を破壊できる細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する。細胞傷害性Ｔ細胞応答は、ポリヌクレオチドが切断されたｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２またはそれらの組み合わせの抗原欠失体液性エピトープのいずれかをコードする方法に従っても産生され得る。

別の実施形態において、脊椎動物を免疫付与する方法が提供される。本方法は、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２またはそれらの組み合わせのいずれかをコードする発現可能なポリヌクレオチドを含む、正電荷のリポソームを得るステップと、リポソームを脊椎動物に導入し、それにより、リポソームが単球、マクロファージ、または別の細胞に組み込まれるステップとを含む。ここで、ポリヌクレオチドの免疫原性翻訳生成物が形成され、生成物は、主な組織適合性複合体の環境で細胞により処理および提示され、それにより、免疫原に対する免疫応答を誘発する。この場合も、ポリヌクレオチドは好ましくはＤＮＡであるが、ｍＲＮＡを使用してもよい。前述のように、本方法はリポソームを使用せず、注入可能な担体中のポリヌクレオチドのみを利用して実施することができる。

本発明は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを脊椎動物の組織に体内で投与することによって、単純ヘルペスウイルス感染に対する保護を必要とする脊椎動物または哺乳動物の免疫応答を増強することを目的とする。ここで、ポリヌクレオチドは、１つ以上の核酸フラグメントを含み、１つ以上の核酸フラグメントは、任意で、１つ以上の単純ヘルペスウイルスポリペプチドを動作可能にコードする、コドン最適化コーディング領域のフラグメント、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体である。本発明は、上述のポリヌクレオチド、および少なくとも１つの単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を脊椎動物の組織に体内で投与することによって、単純ヘルペスウイルス感染に対する保護を必要とする脊椎動物の免疫応答を増強することをさらに目的とする。単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドは、例えば、精製したサブユニット、組み換えタンパク質、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドを発現するウイルスベクターであり得るか、または従来型単純ヘルペスウイルスワクチン中に存在するような不活性または弱毒化単純ヘルペスウイルスであり得る。いずれかの方法に基づいても、ポリヌクレオチドは、脊椎動物の細胞に体内で組み込まれ、免疫学的に有効な量のコードされた単純ヘルペスウイルスポリペプチドの免疫原性エピトープ、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、体内で産生される。使用する際、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドあるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体も、免疫学的に有効な量で投与される。

本発明に基づいて、ポリヌクレオチドは、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドの投与前、投与時（同時）、または投与後に投与することができる。ポリヌクレオチドによってコードされた単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、脊椎動物における単純ヘルペスウイルスに対する免疫応答を誘発できる、少なくとも１つの免疫原性エピトープを含む。さらに、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、使用する際、脊椎動物における免疫応答を誘発できる少なくとも１つの免疫原性エピトープを含む。単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはポリヌクレオチドによってコードされたそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、本方法に従って投与できる単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドと同一のタンパク質、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体であり得るが、同一である必要はない。

本発明のポリヌクレオチドは、核酸フラグメントを含み得る。そこで、核酸フラグメントは、任意の単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を動作可能にコードする、コドン最適化コーディング領域のフラグメントであり、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２タンパク質、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含むがそれらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、派生融合タンパク質をコードすることもできる。ここで、２つ以上の核酸フラグメントは、フレームに結合されて、例えば、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２だがこれらに限られない単一ポリペプチドをコードし、その核酸フラグメントのうちの少なくとも１つは、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、異種核酸または核酸フラグメントをさらに含み得る。そのような異種核酸または核酸フラグメントは、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、例えば、Ｂ型肝炎コアタンパク質または分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとともにフレームに融合される異種ポリペプチドをコードし得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、または単純ヘルペスウイルスの少なくとも１つの免疫原性エピトープを含むそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする。ここで、エピトープは、Ｂ細胞（抗体）応答、Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）応答、またはその両方を誘発する。

同様に、送達される単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体（組み換えタンパク質、精製したサブユニット、または単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドを発現するウイルスベクター、あるいは不活性単純ヘルペスウイルスワクチンの形態のいずれか）は、任意の単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体であり得、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２タンパク質、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含むが、それらに限定されない。一部の実施形態において、派生したタンパク質は、融合タンパク質であり得る。他の実施形態において、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、異種タンパク質、例えば、分泌シグナルペプチド、またはＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質に融合することができる。

本発明の核酸およびそのフラグメントは、以下の方法のうちの１つ以上でそれらの天然の状態から変質させることができる。第１に、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸あるいはそのフラグメントは、ワクチンが送達される動物におけるコドンの使用に基づいて最適化されたコドン最適化コーディング領域の一部またはすべてであり得る。さらに、単純ヘルペスウイルスポリペプチドをコードする核酸あるいはそのフラグメントは、全長ポリペプチドの一部のみをコードするフラグメントであり得、および／または例えば、コードされたポリペプチドまたはコードされたポリペプチドに関連する毒性因子に存在する望ましくないタンパク質モチーフをコードされたポリペプチドから除去するように変異し得る。例えば、核酸配列は、ポリペプチドが細胞から放出するのを妨げる膜アンカー領域をコードしないように変異し得る。送達する際、本発明のポリヌクレオチドは、脊椎動物の細胞に体内で組み込まれ、予防的または治療用に有効な量の単純ヘルペスウイルスの免疫学的エピトープが体内で産生される。

本発明は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物をさらに提供する。ここで、ポリヌクレオチドは、１つ以上の核酸フラグメントを含み、各核酸フラグメントは、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントである。本発明は、また、上述のポリヌクレオチド、および少なくとも１つの単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含む免疫原性組成物を提供する。そのような組成物は、例えば、本明細書に記載されるような担体、賦形剤、トランスフェクション促進剤、および／またはアジュバントをさらに含み得る。

上述のようなポリヌクレオチドおよび単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含む免疫原性組成物を提供して、例えば、組成物のポリヌクレオチド部分が、組成物の単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド部分の前（または後）に投与される場合、ポリヌクレオチドおよびタンパク質製剤を個別に投与することができる。代替として、ポリヌクレオチドおよび単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含む免疫原性組成物は、例えば、ポリヌクレオチドおよびタンパク質が同時に投与される場合、ポリヌクレオチドおよびタンパク質の両方を含む、単一製剤として提供することができる。別の代替例において、組成物のポリヌクレオチド部分および組成物の単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド部分は、同時であるが、個別の製剤で提供することができる。

１つ以上の核酸フラグメントを含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物であって、各核酸フラグメントが、任意で、単純ヘルペスウイルスポリペプチドあるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体と、それとともに、１つ以上の単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドあるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を（組み換えタンパク質、精製サブユニット、タンパク質を発現するウイルスベクターのとして、または不活性または弱毒化単純ヘルペスウイルスワクチンの形態で）動作可能にコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントを、本明細書において「混合ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）ワクチン組成物」または「単一製剤異種プライムブーストワクチン組成物」として参照する。

本発明の組成物は、一価、二価、三価、または多価であり得る。一価組成物は、一つの核酸フラグメントを含むただ１つのポリヌクレオチドを含む。当該核酸フラグメントは、任意で、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体、および任意で同一の単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいは単離型のそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントである。単一製剤の異種プライムブーストワクチン組成物において、一価組成物は、核酸フラグメントを含むポリヌクレオチドを含み得る。核酸フラグメントは、任意で、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体、およびポリヌクレオチドとして同一の抗原領域を有する単離されたポリペプチドをコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントである。二価組成物は、ポリヌクレオチドまたはタンパク質のいずれかの形態で、２つの異なる単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含み、それぞれ免疫応答を誘発することができる。組成物のポリヌクレオチドは、２つの単純ヘルペスウイルスポリペプチドをコードすることができる。または代替として、ポリヌクレオチドは、ただ１つの単純ヘルペスウイルスポリペプチドをコードすることができ、第２の単純ヘルペスウイルスポリペプチドは、例えば、単一製剤の異種プライムブーストワクチン組成物のように、本発明の単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドによって提供される。二価組成物の両方の単純ヘルペスウイルスポリペプチドがポリヌクレオチドの形態で送達される場合において、それらの単純ヘルペスウイルスポリペプチドを動作可能にコードする核酸フラグメントは、同一のポリヌクレオチド上である必要はなく、２つの異なるポリヌクレオチド上であり得る。三価またはそれ以上の多価組成物は、単離形態であるか、または本発明の１つ以上のポリヌクレオチドによってコードされた３つの単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含む。

本発明は、例えば、ヒト等の脊椎動物に対して、本発明の核酸フラグメントの送達のためのプラスミドおよび他のポリヌクレオチド構成をさらに提供する。単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の発現を提供する。本発明は、担体、賦形剤、トランスフェクション促進剤、免疫原性増強剤、例えば、アジュバント、または１つ以上の他の薬剤をさらに提供して、投与された遺伝子およびその遺伝子生成物のトランスフェクション、発現または有用性を増強する。

一実施形態において、多価組成物は、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を動作可能にコードする１つ以上の核酸領域を含む、単一ポリヌクレオチド、例えば、プラスミドを含む。本発明の組成物中のポリヌクレオチド、例えば、プラスミドの数を削減することにより、生成物の製造および販売に大きな影響を与え、それにより、組成物の製造に関連する費用を削減することができる。１つ以上の発現した抗原コーディング配列を単一プラスミド上に含めるために多数のアプローチがある。これらには、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列、二重プロモータ／発現カセット、および融合タンパク質の使用を含まれる。

本発明は、それぞれ１つ以上の核酸フラグメントを含む、１つ以上のポリヌクレオチドを脊椎動物の組織に投与(ここでは、各核酸フラグメントは、任意で、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントである)、および、任意で、１つ以上の単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を脊椎動物の組織に投与することによって、単純ヘルペスウイルス感染に対する脊椎動物の免疫応答を増強するための方法も提供する。単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドは、単純ヘルペスウイルスポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与前、投与時（同時）、または投与後に投与することができる。

さらに、本発明は、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、またはそのフラグメント、変異体、または誘導体のコンセンサスアミノ酸配列を提供し、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２タンパク質を含むがそれらに限定されない。コンセンサスポリペプチドまたはそのフラグメント、変異体、または誘導体をコードするポリヌクレオチドも、本発明において実施される。そのようなポリヌクレオチドは、既知の方法、例えば、以下に記載されるようなアミノ酸配列の逆翻訳、および対応するポリヌクレオチドのＰＣＲ合成によって得ることができる。

図面の簡単な説明
本明細書に組み込まれ、その一部を形成する添付の図面は、本発明の好適な実施形態を示し、記載と併せて本発明の原理を説明する。

ＶＲ１０１２ＤＮＡワクチン骨格またはプラスミドの略図である。負の選択による、ＣＤ４およびＣＤ８濃縮のサンプルデータを実証する。標識モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて分画を染色し、フローサイトメトリによって解析した。ＨＳＶ‐２エピトープに特異的なクローン化ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化についての、全長ＨＳＶ‐２遺伝子をコードする、コドン最適化プラスミドと野生型プラスミドとの比較を示す。（「コドン最適化」）ワクチンまたは野生型（株ＨＧ５２）プラスミドのいずれか、および５０ｎｇ／ウェルの関連ヒトクラスＩＨＬＡｃＤＮＡを用いて、Ｃｏｓ‐７細胞をトランスフェクトした。関連タンパク質に応答することが知られるＣＤ８＋Ｔ細胞クローンとともに、これらのＡＰＣを培養した。上清のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによって分析した。ＨＳＶ‐２エピトープに特異的なクローン化ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化についての、全長ＨＳＶ‐２遺伝子をコードする、コドン最適化プラスミドと野生型プラスミドとの比較を示す。（「コドン最適化」）ワクチンまたは野生型（株ＨＧ５２）プラスミドのいずれか、および５０ｎｇ／ウェルの関連ヒトクラスＩＨＬＡｃＤＮＡを用いて、Ｃｏｓ‐７細胞をトランスフェクトした。関連タンパク質に応答することが知られるＣＤ８＋Ｔ細胞クローンとともに、これらのＡＰＣを培養した。上清のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡによって分析した。組み換えＨＳＶ‐２テグメントタンパク質とのヒト血清プールの反応性を示すグラフであり、それぞれは、捕捉抗原として使用するために１：５の希釈で培養された。ＨＳＶ‐２を有する、またはＨＳＶ‐１またはＨＳＶ‐２感染のいずれかを有しないドナーのプール血清から得たヒトＩｇＧの結合がルーチンＥＬＩＳＡにより検出された。ＥＬＩＳＡにより検出されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＨＳＶ−２テグメントＤＮＡワクチンによって誘起されたＩｇＧ応答を示すグラフを含む。血清は、各免疫付与の前および最終的な殺処理時（Ｘ軸０、１４、２８および４２日目）において収集した。グラフ上の棒は幾何平均である。抗体価（Ｙ軸）は、ＯＤ₄₅₀値から決定した。ＥＬＩＳＡにより検出されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＨＳＶ−２テグメントＤＮＡワクチンによって誘起されたＩｇＧ応答を示すグラフを含む。血清は、各免疫付与の前および最終的な殺処理時（Ｘ軸０、１４、２８および４２日目）において収集した。グラフ上の棒は幾何平均である。抗体価（Ｙ軸）は、ＯＤ₄₅₀値から決定した。ＥＬＩＳＡにより検出されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＨＳＶ−２テグメントＤＮＡワクチンによって誘起されたＩｇＧ応答を示すグラフを含む。血清は、各免疫付与の前および最終的な殺処理時（Ｘ軸０、１４、２８および４２日目）において収集した。グラフ上の棒は幾何平均である。抗体価（Ｙ軸）は、ＯＤ₄₅₀値から決定した。ＥＬＩＳＡにより検出されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＨＳＶ−２テグメントＤＮＡワクチンによって誘起されたＩｇＧ応答を示すグラフを含む。血清は、各免疫付与の前および最終的な殺処理時（Ｘ軸０、１４、２８および４２日目）において収集した。グラフ上の棒は幾何平均である。抗体価（Ｙ軸）は、ＯＤ₄₅₀値から決定した。ＥＬＩＳＡにより検出されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＨＳＶ−２テグメントＤＮＡワクチンによって誘起されたＩｇＧ応答を示すグラフを含む。血清は、各免疫付与の前および最終的な殺処理時（Ｘ軸０、１４、２８および４２日目）において収集した。グラフ上の棒は幾何平均である。抗体価（Ｙ軸）は、ＯＤ₄₅₀値から決定した。ＥＬＩＳＡにより検出されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＨＳＶ−２テグメントＤＮＡワクチンによって誘起されたＩｇＧ応答を示すグラフを含む。血清は、各免疫付与の前および最終的な殺処理時（Ｘ軸０、１４、２８および４２日目）において収集した。グラフ上の棒は幾何平均である。抗体価（Ｙ軸）は、ＯＤ₄₅₀値から決定した。ＥＬＩＳＡにより検出されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＨＳＶ−２テグメントＤＮＡワクチンによって誘起されたＩｇＧ応答を示すグラフを含む。血清は、各免疫付与の前および最終的な殺処理時（Ｘ軸０、１４、２８および４２日目）において収集した。グラフ上の棒は幾何平均である。抗体価（Ｙ軸）は、ＯＤ₄₅₀値から決定した。ＥＬＩＳＡにより検出されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＨＳＶ−２テグメントＤＮＡワクチンによって誘起されたＩｇＧ応答を示すグラフを含む。血清は、各免疫付与の前および最終的な殺処理時（Ｘ軸０、１４、２８および４２日目）において収集した。グラフ上の棒は幾何平均である。抗体価（Ｙ軸）は、ＯＤ₄₅₀値から決定した。ＥＬＩＳＡにより検出されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＨＳＶ−２テグメントＤＮＡワクチンによって誘起されたＩｇＧ応答を示すグラフを含む。血清は、各免疫付与の前および最終的な殺処理時（Ｘ軸０、１４、２８および４２日目）において収集した。グラフ上の棒は幾何平均である。抗体価（Ｙ軸）は、ＯＤ₄₅₀値から決定した。４２日目におけるＨＳＶ‐２テグメントＤＮＡワクチンに対する細胞応答をグラフに図示する。マウス（１０／群）は、０、１４、および２８日目に免疫付与し、４２日目に脾臓細胞を試験した。各積み重ね表示棒は、単一の動物を表す。ＯＲＦごとに４−８ペプチドプール（１８−２４ペプチド／プール）を試験した。単一表示棒の高さは、ＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）／１０⁶の脾臓細胞を示す。異なるＹ軸に注意する。ＳＦＵの数が多すぎて数えられない場合は（ＴＮＴＣ）、任意に１，０００と示した。４２日目におけるＨＳＶ‐２テグメントＤＮＡワクチンに対する細胞応答をグラフに図示する。マウス（１０／群）は、０、１４、および２８日目に免疫付与し、４２日目に脾臓細胞を試験した。各積み重ね表示棒は、単一の動物を表す。ＯＲＦごとに４−８ペプチドプール（１８−２４ペプチド／プール）を試験した。単一表示棒の高さは、ＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）／１０⁶の脾臓細胞を示す。異なるＹ軸に注意する。ＳＦＵの数が多すぎて数えられない場合は（ＴＮＴＣ）、任意に１，０００と示した。４２日目におけるＨＳＶ‐２テグメントＤＮＡワクチンに対する細胞応答をグラフに図示する。マウス（１０／群）は、０、１４、および２８日目に免疫付与し、４２日目に脾臓細胞を試験した。各積み重ね表示棒は、単一の動物を表す。ＯＲＦごとに４−８ペプチドプール（１８−２４ペプチド／プール）を試験した。単一表示棒の高さは、ＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）／１０⁶の脾臓細胞を示す。異なるＹ軸に注意する。ＳＦＵの数が多すぎて数えられない場合は（ＴＮＴＣ）、任意に１，０００と示した。最小エピトープのペプチド切断、およびＣＤ４⁺反応対ＣＤ８⁺反応の一例である。エピトープは、ＵＬ４６ペプチドのアミノ酸１８３位または１８１位において開始し、９または１１‐ｍｅｒである。

最小エピトープのペプチド切断、およびＣＤ４⁺反応対ＣＤ８⁺反応の一例である。エピトープは、アミノ酸３８８位、３９１位、３８９位または３９９位において開始し、１１または１３‐ｍｅｒである。選択したＵＬ４９のペプチド用量曲線を図示する。タンパク質のこの領域は、ＣＤ８⁺エピトープを形成する。ペプチドは、９、１１または１３‐ｍｅｒであり、アミノ酸１９９位、２００位または２０１位において開始する。選択したＵＬ４６のペプチド用量曲線を図示する。タンパク質のこの領域は、ＣＤ４⁺エピトープを形成する。ペプチドは、１１または１３‐ｍｅｒであり、アミノ酸３８８位、３８９位、３９１位または３９３位において開始する。ＵＬ４６、ＵＬ４７、およびＵＬ４９において同定されたヒトおよびＨ‐２^dＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺エピトープの概略を示す。Ｈ‐２^dエピトープに対しては、表示棒の高さは、ＥＣ₅₀に比例する。脚注１‐５は、以下のように記される。１Ｖｅｒｊａｎｓら、ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ２０００；１８２：９２３‐９２７２Ｋｏｅｌｌｅら、ＰｒｏｃＮａｔＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ２００３；１００：１２８９９‐１２９０４３Ｐｏｓａｖａｄら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ２００３；１７０：４３８０‐４３８８４Ｋｏｅｌｌｅら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ２００１；１６６：４０４９‐４０５８５Ｋｏｅｌｌｅら、ＪＶｉｒｏｌ１９９８；７２：７４７６‐７４８３ＶＲ２１３９プラスミド構成、およびｇＤのアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ｇＤをコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１３９プラスミド構成、およびｇＤのアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ｇＤをコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１３９プラスミド構成、およびｇＤのアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ｇＤをコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１３９プラスミド構成、およびｇＤのアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ｇＤをコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４３プラスミド構成、およびＵＬ４９のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４９をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４３プラスミド構成、およびＵＬ４９のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４９をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４３プラスミド構成、およびＵＬ４９のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４９をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４３プラスミド構成、およびＵＬ４９のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４９をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４４プラスミド構成、およびＵＬ４７のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４７をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４４プラスミド構成、およびＵＬ４７のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４７をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４４プラスミド構成、およびＵＬ４７のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４７をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４４プラスミド構成、およびＵＬ４７のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４７をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４４プラスミド構成、およびＵＬ４７のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４７をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４５プラスミド構成、およびＵＬ４６のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４６をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４５プラスミド構成、およびＵＬ４６のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４６をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４５プラスミド構成、およびＵＬ４６のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４６をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４５プラスミド構成、およびＵＬ４６のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４６をコードする本発明のプラスミドの詳細である。ＶＲ２１４５プラスミド構成、およびＵＬ４６のアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列を含む、ＵＬ４６をコードする本発明のプラスミドの詳細である。

ｇＤのコドン最適化核酸配列を提供する。ＵＬ４９のコドン最適化核酸配列を提供する。ＵＬ４７のコドン最適化核酸配列を提供する。ＵＬ４６のコドン最適化核酸配列を提供する。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＳＶ‐２テグメントＤＮＡワクチンの免疫原性を示す。血清は、各免疫付与の前および最終的な殺処理時において収集した。上３つのパネルは、トランスフェクトしたＶＭ９２細胞から形成されるタンパク質に対してＥＬＩＳＡによって決定された抗体価（Ｙ軸）を示す。（Ｋｕｍａｒ，Ｓ．ら、ＡＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅ４２ｋＤａＣ‐ｔｅｒｍｉｎｕｓｏｆｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎ１ｏｆＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍｉｎｄｕｃｅｓａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ‐ｇａｍｍａａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｙｓ：ｉｍｍｕｎｏ‐ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅ‐ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ．ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ，２００２．８１（１）：ｐ．１３‐２４）。ペロキシダーゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧおよび比色分析検出を使用して、マウスＩｇＧを測定した。各記号は個別の動物を表し、塗りつぶされた表示棒は、１０マウス／群から得た幾何平均である。１：１００より小さいタイターは、１００としてプロットされる。各実験未使用のマウスは、すべての時点（図示せず）において１：１００より小さいタイターを有した。抗体タイターは、連続ワクチン接種の各時点間で著しく異なる（^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．００５、一対の両側ｔ検定）。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＳＶ‐２テグメントＤＮＡワクチンの免疫原性を示す。血清は、各免疫付与の前および最終的な殺処理時において収集した。上３つのパネルは、トランスフェクトしたＶＭ９２細胞から形成されるタンパク質に対してＥＬＩＳＡによって決定された抗体価（Ｙ軸）を示す。（Ｋｕｍａｒ，Ｓ．ら、ＡＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅ４２ｋＤａＣ‐ｔｅｒｍｉｎｕｓｏｆｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎ１ｏｆＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍｉｎｄｕｃｅｓａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ‐ｇａｍｍａａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｙｓ：ｉｍｍｕｎｏ‐ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅ‐ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ．ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ，２００２．８１（１）：ｐ．１３‐２４）。ペロキシダーゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧおよび比色分析検出を使用して、マウスＩｇＧを測定した。各記号は個別の動物を表し、塗りつぶされた表示棒は、１０マウス／群から得た幾何平均である。１：１００より小さいタイターは、１００としてプロットされる。各実験未使用のマウスは、すべての時点（図示せず）において１：１００より小さいタイターを有した。抗体タイターは、連続ワクチン接種の各時点間で著しく異なる（^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．００５、一対の両側ｔ検定）。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＳＶ‐２テグメントＤＮＡワクチンの免疫原性を示す。血清は、各免疫付与の前および最終的な殺処理時において収集した。上３つのパネルは、トランスフェクトしたＶＭ９２細胞から形成されるタンパク質に対してＥＬＩＳＡによって決定された抗体価（Ｙ軸）を示す。（Ｋｕｍａｒ，Ｓ．ら、ＡＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅ４２ｋＤａＣ‐ｔｅｒｍｉｎｕｓｏｆｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎ１ｏｆＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍｉｎｄｕｃｅｓａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ‐ｇａｍｍａａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｙｓ：ｉｍｍｕｎｏ‐ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅ‐ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ．ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ，２００２．８１（１）：ｐ．１３‐２４）。ペロキシダーゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧおよび比色分析検出を使用して、マウスＩｇＧを測定した。各記号は個別の動物を表し、塗りつぶされた表示棒は、１０マウス／群から得た幾何平均である。１：１００より小さいタイターは、１００としてプロットされる。各実験未使用のマウスは、すべての時点（図示せず）において１：１００より小さいタイターを有した。抗体タイターは、連続ワクチン接種の各時点間で著しく異なる（^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．００５、一対の両側ｔ検定）。図２０Ｄは、抗体応答が、４２日目の粗混合天然ＨＳＶ‐２タンパク質に対することを示す。テグメントタンパク質に特異的なＴ細胞が高い親和性を有することを示す。脾臓細胞は、２〜３匹の免疫付与したマウスからプールし、１３‐アミノ酸および短鎖ペプチドを用いて、ＩＦＮ‐γ ＥＬＩＳＰＯＴにより検査した。ペプチドは、１０μＭ〜１０^-6μＭの１０倍希釈で滴定した。一般に、ＣＤ８⁺エピトープに対して反応するレスポンダ細胞は、ＣＤ４⁺エピトープに対して反応する細胞よりも高い親和性を示した。一部の例において、強力なＥＬＩＳＰＯＴ応答は、１０^-12Ｍでみられた。アミノ酸の位置は、各ペプチドにたいして指定される。テグメントタンパク質に特異的なＴ細胞が高い親和性を有することを示す。脾臓細胞は、２〜３匹の免疫付与したマウスからプールし、１３‐アミノ酸および短鎖ペプチドを用いて、ＩＦＮ‐γ ＥＬＩＳＰＯＴにより検査した。ペプチドは、１０μＭ〜１０^-6μＭの１０倍希釈で滴定した。一般に、ＣＤ８⁺エピトープに対して反応するレスポンダ細胞は、ＣＤ４⁺エピトープに対して反応する細胞よりも高い親和性を示した。一部の例において、強力なＥＬＩＳＰＯＴ応答は、１０^-12Ｍでみられた。アミノ酸の位置は、各ペプチドにたいして指定される。テグメントタンパク質に特異的なＴ細胞が高い親和性を有することを示す。脾臓細胞は、２〜３匹の免疫付与したマウスからプールし、１３‐アミノ酸および短鎖ペプチドを用いて、ＩＦＮ‐γ ＥＬＩＳＰＯＴにより検査した。ペプチドは、１０μＭ〜１０^-6μＭの１０倍希釈で滴定した。一般に、ＣＤ８⁺エピトープに対して反応するレスポンダ細胞は、ＣＤ４⁺エピトープに対して反応する細胞よりも高い親和性を示した。一部の例において、強力なＥＬＩＳＰＯＴ応答は、１０^-12Ｍでみられた。アミノ酸の位置は、各ペプチドにたいして指定される。テグメントタンパク質に特異的なＴ細胞が高い親和性を有することを示す。脾臓細胞は、２〜３匹の免疫付与したマウスからプールし、１３‐アミノ酸および短鎖ペプチドを用いて、ＩＦＮ‐γ ＥＬＩＳＰＯＴにより検査した。ペプチドは、１０μＭ〜１０^-6μＭの１０倍希釈で滴定した。一般に、ＣＤ８⁺エピトープに対して反応するレスポンダ細胞は、ＣＤ４⁺エピトープに対して反応する細胞よりも高い親和性を示した。一部の例において、強力なＥＬＩＳＰＯＴ応答は、１０^-12Ｍでみられた。アミノ酸の位置は、各ペプチドにたいして指定される。テグメントタンパク質に特異的なＴ細胞が高い親和性を有することを示す。脾臓細胞は、２〜３匹の免疫付与したマウスからプールし、１３‐アミノ酸および短鎖ペプチドを用いて、ＩＦＮ‐γ ＥＬＩＳＰＯＴにより検査した。ペプチドは、１０μＭ〜１０^-6μＭの１０倍希釈で滴定した。一般に、ＣＤ８⁺エピトープに対して反応するレスポンダ細胞は、ＣＤ４⁺エピトープに対して反応する細胞よりも高い親和性を示した。一部の例において、強力なＥＬＩＳＰＯＴ応答は、１０^-12Ｍでみられた。アミノ酸の位置は、各ペプチドにたいして指定される。

細胞内サイトカインサイトメトリによるテグメント特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の検出を示す。ＵＬ４７ｐＤＮＡを用いて３回ワクチン接種した後、毒性ＨＳＶ‐２を用いて生存チャレンジしたマウスから得た脾臓細胞は、８週間後に収穫し、５つの最適ＵＬ４７ＣＤ８ペプチドのプールをそれぞれ１μＭで刺激した（図２２Ａ）。図２２Ｃは、同一マウスのＤＭＳＯ対照である。図２２Ｂは、ＵＬ４７ＣＤ８エピトープペプチドプールで刺激された実験未使用のマウスの脾臓細胞である。ｔｋ^-‐ＨＳＶ−２感染したＢＡＬＢ／ｃマウスから得た脾臓細胞は、テグメントタンパク質エピトープを認識することを示す。マウスは、デポプロベラの５日後に４ｘ１０⁷ ｐｆｕｔｋ^-‐ＨＳＶ‐２を用いてチャレンジした。１４日目の細胞は、ＣＤ８ペプチドエピトープを用いてＩＦＮ‐γ ＥＬＩＳＰＯＴにおいて試験した。前述のＩＣＰ２７ＣＤ８⁺エピトープは、正の対照である（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．，ＡｒｒｉｎｇｔｏｎＪ，ＤｏｎｇＬ，ＢｒａｕｎＲＰ，ＰａｙｎｅＬＧ，ＰｏｔｅｎｔｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙａＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇＨＳＶ‐２ＩＣＰ２７ａｎｄｔｈｅＥ．ｃｏｌｉｈｅａｔｌａｂｉｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００６．２４（２３）：ｐ．５０１６‐２６）。ＨＳＶ‐２膣内チャレンジモデルにおいて、テグメントワクチンが有益であることを立証する。１０匹のマウスから成る群は、５０ｘＬＤ₅₀のＨＳＶ‐２株１８６を用いてチャレンジし、１４日間観察した。図２４Ａ：死亡率。図２４Ｂ：平均膣内ＨＳＶ‐２ＤＮＡ複製数。図２４Ｃ：生存動物における臨床スコア。ＨＳＶ‐２膣内チャレンジモデルにおいて、テグメントワクチンが有益であることを立証する。１０匹のマウスから成る群は、５０ｘＬＤ₅₀のＨＳＶ‐２株１８６を用いてチャレンジし、１４日間観察した。図２４Ａ：死亡率。図２４Ｂ：平均膣内ＨＳＶ‐２ＤＮＡ複製数。図２４Ｃ：生存動物における臨床スコア。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスにＩＭ投与されたｇＤ₂アミノ酸の１〜３４０位をコードするｐＤＮＡワクチンＶＲ２１３９に対する免疫応答を示す。各ワクチン前および４２日目のＥＬＩＳＡによるＩｇＧタイター（図２５Ａ）。プールした重複ｇＤ₂ペプチドを抗原として使用した４２日目の原ＩＦＮ‐γ ｓｆｕ／１００万脾臓細胞（図２５Ｂ）。各ドットは、個々のマウス（ｎ＝９）であり、表示棒は平均である。

発明を実施するための形態
本発明の実施には、脊椎動物細胞に組み込むためのポリペプチドを動作可能にコードする調剤または未調剤ポリヌクレオチドの取得が必要である。ポリヌクレオチドは、プロモータ等の標的細胞による発現に必要なすべての遺伝情報を有する際、ポリペプチドを動作可能にコードする。これらのポリヌクレオチドは、注入可能な材料を脊椎動物の細胞に送達する任意の方法、例えば、筋肉または皮膚等の組織の間質腔への注入、循環または体内空洞への導入、もしくは吸入または吹送によって、脊椎動物に投与することができる。調剤ポリヌクレオチドは、医薬的に許容される脂質またはリポソームを用いて、脊椎動物に注入されるか、または他の方法で送達される。例えば、ポリヌクレオチドがリポソームと結合される場合、リポソーム、好ましくは陽イオン性または正電荷のリポソームを形成するための材料を必要とし、リポソーム製剤は、これらの材料で形成される必要がある。手持ちのリポソーム材料を用いて、ポリヌクレオチドを有利に使用し、細胞を体外でトランスフェクトして免疫剤として使用するか、またはリポソームが食細胞によって取り込まれ得る体内部位にポリヌクレオチドを投与することができる。

代替として、未調剤ポリヌクレオチドは、医薬的に許容される液体担体を用いて、動物に注入されるか、または他の方法で送達される。すべての適用に対して、液体担体は、水性または一部水性であり、発熱物質を含まない滅菌水を含む。製剤のｐＨは、適切に調整および緩衝される。

ポリヌクレオチド材料
本発明の方法に基づいて使用される調剤または未調剤ポリヌクレオチド材料は、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列、あるいはｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２もしくはそれらの組み合わせのいずれかをコードするＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む。（米国特許第６，４１３，５１８号、第６，８５５，３１７号、および第７，０３７，５０９号、および米国特許公開第ＵＳ２００６／０２１６３０４号を参照）。これらのポリヌクレオチド配列は、細胞への進入を促進するために作用し得る任意の送達手段を含まない、例えば、ポリヌクレオチド配列は、ウイルス配列、特に遺伝情報を担持し得る任意のウイルス粒子を含まないという意味において未調剤である。代替として、これらのポリヌクレオチド配列は、リポソーム製剤、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^TM試薬等であるがそれに限定されない荷電脂質、または米国特許第７，１０５，５７４号に開示されるＶａｘｆｅｃｔｉｎ^TMアジュバント等のトランスフェクション促進材料を用いて調剤される。

これらの方法で使用されるＤＮＡ配列は、宿主細胞のゲノムに統合されないＤＮＡ配列であり得る。これらは、複製しないＤＮＡ配列であるか、またはゲノム統合能力を欠失するように遺伝子操作された特異的に複製する配列であり得る。

本発明のポリヌクレオチド配列は、ＨＳＶ‐２タンパク質ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２、もしくはそれらの組み合わせのいずれかのＤＮＡまたはＲＮＡ配列である。本発明のポリヌクレオチドは、治療用ポリペプチドをコードすることもできる。ポリペプチドは、大きさおよびグリコシル化されているか否かにかかわらず、ポリヌクレオチドの任意の翻訳生成物であると理解される。治療用ポリペプチドは、主要実施例として、動物における欠陥または欠損種を補い得るポリペプチド、または毒性効果を通じて作用し、有害細胞を制限または体から除去するポリペプチドを含む。

本発明のポリヌクレオチド配列は、好ましくは、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２、またはそれらの組み合わせのいずれかをコードし、これらの配列は、これらのポリペプチドの発現を制御する調節タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド配列に関連して使用され得る。調節タンパク質は、ゲノムＤＮＡに結合することによって作用し、その転写を調節するようにできる。代替として、メッセンジャーＲＮＡに結合することによって作用し、その安定性または翻訳の効率性を増減することができる。

ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、種々の脊椎動物系における使用に好適なプロモータは周知である。例えば、マウス系において使用する場合、好適な強力プロモータは、ＲＳＶＬＴＲ、ＭＰＳＶＬＴＲ、ＳＶ４０ＩＥＰ、およびメタロチオネインプロモータを含む。一方、ヒトにおいては、ＣＭＶＩＥＰ等のプロモータを有利に使用することができる。ゲノムに統合されず、発現可能なＤＮＡのすべての形態は、複製するか複製しないかにかかわらず、本発明によって検討されている方法に含まれる。

自動核酸合成機器が使用できる場合、ヌクレオチド配列が判明している場合、またはＰＣＲクローン化および発酵の組み合わせによって、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を直接合成することができる。さらに、望ましいポリペプチドの配列が判明している場合、ポリヌクレオチドに好適なコーディング配列を推測することができる。

ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合は、対応するＤＮＡから体外で容易に調製することができる。例えば、従来技術はファージＲＮＡポリメラーゼＳＰ６、Ｔ３、またはＴ７を利用し、個別のリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、ＤＮＡテンプレートからｍＲＮＡを調製する。適切なファージプロモータ、例えば、Ｔ７起点の複製部位は、転写される遺伝子の直接上流のテンプレートＤＮＡに配置される。この方法でＴ７を利用するシステムは周知であり、例えばＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，§３．８（ｖｏｌ．１１９８８）等の文献に記載されている。

ＤＮＡおよびｍＲＮＡワクチン
本発明の方法に従って、発現可能なＤＮＡおよびｍＲＮＡの両方を細胞に送達し、そこにポリペプチド翻訳生成物を形成することができる。核酸が適切な制御配列を含む場合、それらは、比較的大量のｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２、またはそれらの組み合わせのいずれかの合成を指示する。細胞に送達されたＤＮＡおよびｍＲＮＡがｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２、またはそれらの組み合わせのいずれかをコードする場合、本方法を適用して、免疫性を改善し、有効性を高めることができる。すべての脊椎動物の免疫系は同様に動作するため、記載される適用は、哺乳類および鳥類、ならびに魚類を含む、すべての脊椎動物系において実施できる。

本発明の方法は、動物の細胞にポリヌクレオチドを体内で直接注入することによって、または次に動物体内に再導入される動物細胞の一部の体外トランスフェクションによって適用され得る。

ポリヌクレオチドは、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、または血液の細胞を含む、動物体内の種々の細胞に送達され得る。ポリヌクレオチドは、筋肉または皮膚の細胞に体内で直接送達することが好ましい。ポリヌクレオチドは、注射器を使用して、筋肉または皮膚に注入することができる。それらは、ワクチン銃を使用して、筋肉または皮膚に送達することもできる。

近年、陽イオン性脂質を使用して、一部適用における細胞のトランスフェクション、特に、体外トランスフェクションを促進できることが示されている。陽イオン性脂質ベースのトランスフェクション技術は、他の方法よりも好適であり、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、または電気穿孔法よりも効率的で便利である。前述のようなレトロウイルス媒介のトランスフェクションは、宿主細胞ゲノムにおける統合イベントを生じ、癌遺伝子の活性化または他の望ましくない結果をもたらし得る。陽イオン性技術がメッセンジャーＲＮＡと作用するという知識は、細胞内ヌクレアーゼによって、ＲＮＡが急速に反転され、宿主ゲノムに統合されないため、このアプローチにとってさらに有利である。望ましい主要標的細胞の多くは、培地中で急速に分裂しないため、高レベルの逆発現を生じるトランスフェクションシステムは、安定して形質転換したクローンの選択および拡大を必要とする代替方法にとって好適である。

陽イオン性リポソームを用いて、細胞を高い効率でトランスフェクトする能力は、免疫付与のための代替方法を提供する。抗原の遺伝子は、動物から除去された細胞に導入される。抗原を発現しているトランスフェクト細胞を動物に再注入すると、免疫系は、（ここで）内因性抗原に応答することができる。アジュバントまたはリンホカインのいずれかをともに注入し、リンパ球細胞をさらに刺激することによって、プロセスを増強できる可能性がある。

ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２またはそれらの組み合わせのいずれかを含む核酸を用いたワクチン接種は、細胞性免疫応答を特異的に標的する方法を提供する。分泌されるｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２タンパク質のうちの少なくとも１つを発現する細胞は、正常な抗原処理経路に侵入し、体液性および細胞傷害性応答の両方を産生する。分泌されないタンパク質への応答は、さらに選択的である。クラスＩＭＨＣ分子のみを発現する細胞において合成された非分泌タンパク質は、細胞傷害性ワクチン効果のみを産生すると予想される。クラスＩおよびクラスＩＩ分子を含有する細胞における同一抗原の発現は、細胞傷害性およびヘルパーＴ細胞の両方を刺激することによって、より活発な応答を産生し得る。タンパク質のペプチドフラグメントとともに、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、ＶＰ２２、またはそれらの組み合わせのいずれかの遺伝子を注入することによって、免疫応答の増強も可能である。抗原は、クラスＩＭＨＣ分子により細胞性免疫系に提示され、一方ペプチドは、クラスＩＩＭＨＣ分子により提示され、ヘルパーＴ細胞を刺激する。いずれの場合においても、この方法は、これまで不可能であった方法で免疫応答を刺激および調整する方法を提供する。

リポソーム形成材料
リポソームは、単膜または多重膜ベシクルであり、脂溶性材料で形成された膜部分と内部水性部分とを有する。水性部分を本発明において使用して、標的細胞に送達されるポリヌクレオチド材料を含有する。本明細書において使用されるリポソーム形成材料は、第４アンモニウム基等の陽イオン基、および約６〜約３０炭素原子を有する飽和または不飽和アルキル基等の１つ以上の脂溶性基を有することが好ましい。一群の好適な材料は、欧州特許公開第０１８７７０２号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。これらの化合物は、上記の特許出願において詳述されるように調製することができ、代替として、これらの化合物、Ｎ‐（２，３‐ジ‐（９‐（Ｚ）‐オクタデセニルオキシ））‐プロプ‐１‐イル‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）のうちの少なくとも１つは、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ），Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．２０８７７，ＵＳＡから市販されている。

さらに、多数の好適なリポソーム形成陽イオン性脂質化合物は、文献に記載されている。例えば、Ｌ．Ｓｔａｍａｔａｔｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：３９１７‐３９２５（１９８８）；Ｈ．Ｅｉｂｌ，ｅｔａｌ．，ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０：２６１‐２７１（１９７９）を参照されたい。

リポソーム製剤
本発明における使用に好適なリポソームが、市販されている。例えば、ＤＯＴＭＡリポソームは、メリーランド州、ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇのＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓから商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの下で入手可能である。

代替として、リポソームは、前述の種類の容易に入手可能な開始物質または新規に合成された開始物質から調製できる。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は、文献に説明されている。例えば、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３‐７４１７を参照されたい。同様の方法を使用して、他の陽イオン性脂質材料からリポソームを調製することができる。さらに、従来型リポソーム形成材料を使用して、負の電荷を有するか、または電荷中性のリポソームを調製することができる。そのような材料は、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジル‐エタノールアミン等を含む。これらの材料は、０％〜約７５％の割合でＤＯＴＡＰまたはＤＯＴＭＡ開始物質と有利に混合することもできる。

従来の方法を使用して、他の非陽イオン性リポソームを調製することができる。これらのリポソームは、陽イオン性リポソームのように容易に細胞壁と融合しない。しかしながら、それらはマクロファージによって体内で取り込まれる。したがって、これらの細胞へのポリヌクレオチドを送達するのに特に有効である。例えば、市販のジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせで使用して、コレステロールを添加するか否かにかかわらず、従来型リポソームを形成することができる。したがって、例えば、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣベシクルは、超音波処理バイアルへの窒素ガスの気流下で、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣそれぞれ５０ｍｇを乾燥させることにより調製することができる。サンプルは、真空ポンプ下に一晩配置し、翌日に脱イオン水で水和する。次に、最大設定で逆カップ（浴槽型）プローブを備えた加熱システムモデル３５０ソニケータを使用して、サンプルをキャップ付きバイアル内で２時間超音波処理し、その間浴槽は１５℃で循環させる。代替として、負電荷ベシクルは、超音波処理を行わずに調製し、多層ベシクルを産生するか、または核膜孔膜を通じて突出することにより、個別の大きさの単層ベシクルを産生することができる。他の方法は、当業者に周知であり、使用可能である。

治療製剤ポリヌクレオチド塩
本明細書に記載のポリヌクレオチドの医薬的に許容される塩の投与は、本発明の範囲内に含まれる。そのような塩は、有機塩基または無機塩基を含む、医薬的に許容される非毒性塩基から調製され得る。無機塩基に由来する塩は、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム等を含む。医薬的に許容される有機非毒性塩基に由来する塩は、一次、二次、および三次アミンの塩、塩基性アミノ酸等を含む。医薬的な塩に関して参考になる論考については、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ６６：１‐１９（１９７７）を参照されたい。

好適な送達経路である、注入用ポリヌクレオチドは、単位用量をアンプル形態、または複数用量容器に調製することができる。ポリヌクレオチドは、油性または好ましくは水性媒体中の懸濁液、溶液、または乳液等の形態で存在し得る。代替として、ポリヌクレオチド塩は、再構成のため、送達の時点で凍結乾燥形態であってもよく、発熱物資を含まない滅菌水等の好適な媒体を用いる。再構成される液体および凍結乾燥形態の両方は、薬剤、好ましくは緩衝剤を注入溶液のｐＨを適切に調節するために必要な量で含む。任意の非経口使用の場合、特に、製剤が静脈内投与される場合は、溶質の総濃度を制御し、製剤を等張性、低張性、または弱高張性にする必要がある。砂糖等の非イオン性材料は、張性を調整するために好適であり、スクロースが特に好適である。これらの形態のいずれも、澱粉または砂糖、グリセロールまたは生理食塩水等の好適な製剤化剤をさらに含み得る。単位用量ごとの組成物は、液体または固体にかかわらず、０．１％〜９９％のポリヌクレオチド材料を含み得る。

使用前にポリヌクレオチドが包含される、単位用量のアンプルまたは複数用量容器は、その医薬的に有効な用量に好適な量、または複数の有効量のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む溶液を入れる密閉シール容器を含み得る。ポリヌクレオチドは、滅菌製剤として包装され、密閉シール容器は、使用するまで製剤の滅菌状態を維持するように設計される。

ポリヌクレオチドが包装される容器にはラベルが付けられ、ラベルは、例えば、食品医薬品局等の政府機関によって規定された形式の通知を示す。この通知は、ヒトに投与するためのポリヌクレオチド材料の製造、使用、または販売に関する、連邦法下の機関の承認を反映している。

連邦法では、ヒトの治療における薬剤の使用には、連邦政府の機関による承認を義務付けている。執行の責任は、そのような承認を保証するための適切な規制を発行する、食品医薬品局の責任であり、合衆国法典第２１条、§§３０１‐３９２に詳細が記載される。動物の組織から形成された生成物を含む、生物学的物質に関する規制は、合衆国法典第４２条、§２６２下で提供される。同様の承認が、大部分の海外諸国によって義務付けられている。規制は国によって異なるが、個別の手順は当業者に周知である。

投与の用量および経路
投与される用量は、治療対象の状態と大きさ、および治療頻度と投与経路に大きく依存する。用量および頻度を含む継続治療の計画は、初期応答および臨床判断によって導かれる場合がある。組織の間質腔への非経口経路の注入が好ましいが、例えば、鼻、喉、気管支組織、または肺の粘膜に特異的な投与において、エアロゾル製剤の吸入等の他の非経口経路が必要な場合がある。

好適な手順において、部位あたり１０μｌ〜部位あたり約１ｍｌの量で、裸のポリヌクレオチドを水性担体に含む製剤を組織に注入する。製剤中のポリヌクレオチド濃度は、約０．１μｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌである。

本発明は、１つ以上の核酸フラグメントを含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドを脊椎動物の組織に体内で投与することによって、単純ヘルペスウイルス感染に対する保護を必要とする脊椎動物の免疫応答を増強するための組成物および方法を対象とする。各核酸フラグメントは、任意で、保護を必要とする脊椎動物の細胞における単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を動作可能にコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントである。本発明は、上述のポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を脊椎動物の組織に体内投与することも対象とする。単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、またはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、例えば、組み換えタンパク質、精製サブユニットタンパク質、タンパク質を発現する異種活性または不活性あるいは弱毒化ウイルスベクターによって発現および担持されたタンパク質であるか、または市販の従来型不活性単純ヘルペスワクチンに存在するような不活性単純ヘルペスウイルスであり得る。いずれかの方法に従って、ポリヌクレオチドは、脊椎動物の細胞に体内で組み込まれ、免疫学的に有効な量の単純ヘルペスタンパク質、あるいはポリヌクレオチドでコードされたフラグメントもしくは変異体は、体内で産生される。単離されたタンパク質、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体も免疫学的に有効な量で投与される。ポリヌクレオチドは、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の投与前、投与時（同時）、または投与後のいずれかに、それを必要とする脊椎動物に投与することができる。

本発明の範囲内の単純ヘルペスウイルスポリペプチドの非限定例は、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、誘導体、および変異体を含むが、それらに限定されない。多種多様な単純ヘルペスウイルス型および亜型から得た単純ヘルペスウイルスポリペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当該技術分野において周知である。

本発明は、コドン最適化および／または他の操作を通じて授与される最適な発現および安全性を有する、配列をコードする単純ヘルペスウイルスを脊椎動物に送達するためのワクチン組成物および方法も提供する。これらのワクチン組成物は、コードされた遺伝子生成物が対象となる脊椎動物において最適に発現するような方法で調製および投与される。結果として、これらの組成物および方法は、単純ヘルペスウイルス感染に対する免疫応答を刺激する際に有用である。本発明には、発現システム、送達システム、およびコドン最適化単純ヘルペスウイルスコーディング領域も含まれる。

特定の実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドワクチンおよびポリペプチド（例えば、組み換えタンパク質、精製サブユニットタンパク質、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドを発現するウイルスベクター、あるいは不活性もしくは弱毒化単純ヘルペスウイルスワクチン形態の）ワクチンの両方を単一製剤に混合する、混合ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）ワクチンを提供する。単一製剤は、本明細書に記載されるような単純ヘルペスウイルスポリペプチドをコードするポリヌクレオチドワクチン、および任意で、有効量の望ましい単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含む。ポリペプチドは、任意の形態、例えば、組み換えタンパク質、精製サブユニットタンパク質、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドを発現するウイルスベクター、あるいは不活性もしくは弱毒化単純ヘルペスウイルスワクチンの形態で存在し得る。ポリヌクレオチドワクチンによりコードされる単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体と同一であり得る。代替として、ポリヌクレオチドによりコードされる単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体と異なり得る。

「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）実体は、１つ以上のその実体を意味する。例えば、「１つのポリヌクレオチド」は、１つ以上のポリヌクレオチドを表すことを意味することに留意されたい。そのようにして、「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において同義的に使用できる。

「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸または核酸フラグメント、および複数の核酸または核酸フラグメントを包含するものであり、単離された分子または構成物、例えば、ウイルスゲノム（例えば、非感染性ウイルスゲノム）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、あるいはポリヌクレオチドを含むｐＤＮＡの誘導体（例えば、（Ｄａｒｑｕｅｔ，Ａ‐Ｍｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４：１３４１‐１３４９（１９９７）に記載されるようなミニサークル）を意味する。ポリヌクレオチドは、従来型リン酸ジエステル結合または非従来型結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）において見出されるようなアミド結合）を含み得る。

「核酸」または「核酸フラグメント」という用語は、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチドまたは構成物に存在するＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを意味する。その核酸またはフラグメントは、線形（例えば、ｍＲＮＡ）あるいは円形（例えば、プラスミド）形態、および二重鎖あるいは単鎖形態で提供され得る。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。例えば、ベクターに含まれる組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために、単離されていると考えられる。さらに、単離されたポリヌクレオチドの例として、溶液中の異種宿主細胞または（部分的あるいは実質的に）精製されたポリヌクレオチドに維持される、組み換えポリヌクレオチドを含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドの体内または体外ＲＮＡ転写を含む。本発明に基づく単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されたそのような分子をさらに含む。

本明細書では、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されたコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、コーディング領域の一部であると考えられ得る。しかし任意のフランキング配列、例えば、プロモータ、リボソーム結合部位、転写ターミネータ等は、コーディング領域の一部ではない。本発明の２つ以上の核酸または核酸フラグメントは、例えば、単一プラスミド上の単一ポリヌクレオチド構成物において、あるいは、例えば、個別の（異なる）プラスミド上の個別のポリヌクレオチド構成物に存在し得る。さらに、任意の核酸または核酸フラグメントは、単一単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、誘導体、もしくは変異体をコードするか、例えばまたは１つ以上のポリペプチドをコードし得て、例えば、核酸は２つ以上のポリペプチドをコードし得る。さらに、核酸は、プロモータ、リボソーム結合部位、あるいは転写ターミネータ等の調節要素を含むか、または単純ヘルペスウイルスコーディング領域、例えば、特殊化された要素またはモチーフ、すなわち、分泌シグナルペプチドまたは異種機能分野等に融合された異種コーディング領域をコードし得る。

「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、本発明の単純ヘルペスウイルスポリペプチドについて言及する場合、対応する天然ポリペプチドの免疫原性または抗原性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明の単純ヘルペスウイルスポリペプチドのフラグメントは、タンパク分解フラグメント、削除フラグメント、特に、動物に送達されると、細胞からの高い分泌、または高い免疫原性、あるいは減弱した病原性を呈する単純ヘルペスウイルスポリペプチドのフラグメントを含む。ポリペプチドフラグメントは、線形および３次元エピトープ等の天然ポリペプチドの抗原または免疫原性エピトープを含む、ポリペプチドの任意の部分をさらに含む。本発明の単純ヘルペスウイルスポリペプチドの変異体は、上述のようなフラグメント、およびアミノ酸置換、削除、または挿入による改変アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。対立遺伝子多型等の変異体は自然に生じ得る。「対立遺伝子多型」とは、微生物またはウイルスの染色体またはゲノム上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の代替形態を意味する。ＧｅｎｅｓＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８５）。例えば、本明細書では、所定の遺伝子生成物における変異体である。単純ヘルペスウイルスｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２タンパク質に言及する場合、天然の単純ヘルペスウイルス株が、ウイルスによりコードされるタンパク質の種類によって区別されるという意味で、そのようなタンパク質のそれぞれは「変異体」である。しかしながら、単一のｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、およびＶＰ２２変異型内で、さらにアミノ酸削除、挿入、または置換等の自然発生的または非自然発生的な変異が生じ得る。非自然発生的変異体は、既知の突然変異誘発技術を使用して産生され得る。変異型ポリペプチドは、保存性または非保存性アミノ酸置換、削除、または追加を含み得る。本発明の単純ヘルペスウイルスポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチド上では認められない追加の特徴を呈するように変更されたポリペプチドである。例として、融合タンパク質を含む。類似体は、本発明の別の形態の単純ヘルペスウイルスポリペプチドである。一例は、前駆タンパク質の切断によって活性化し、活性成熟ポリペプチドを産生できる前駆タンパク質である。

「感染性ポリヌクレオチド」または「感染性核酸」という用語は、許容細胞によって取り込まれる際、完全感染性ウイルス粒子の合成を単独で十分に媒介する、単離されたウイルスポリヌクレオチドおよび／または核酸を包含するものである。したがって、「感染性核酸」は、許容宿主細胞においてその複製周期を開始するために、例えば、ウイルスレプリカーゼをコードする、ポリペプチドのいずれかの事前合成された複製を必要としない。

本明細書において定義される「非感染性ポリヌクレオチド」または「非感染性核酸」という用語は、許容細胞によって取り込まれる際、例えば、ポリペプチド等の追加の添加材料なしに、完全感染性ウイルス粒子の合成を媒介できないポリヌクレオチドまたは核酸である。感染性ポリヌクレオチドまたは核酸は、単に、非許容細胞によって取り込まれたという理由だけでは「非感染性」にはならない。例えば、限られた許容される宿主群を有するウイルスから得た感染性ウイルスポリヌクレオチドは、許容宿主（すなわち、ウイルス自体に対して許容状態の宿主）に由来する細胞によって取り込まれる際、完全感染性ウイルス粒子の合成を媒介できる場合は感染性である。非許容宿主に由来する細胞による取り込みが完全感染性ウイルス粒子の合成を生じないという事実によって、核酸が「非感染性」になることはない。すなわち、本用語は、宿主細胞、組織の種類、またはポリヌクレオチドあるいは核酸フラグメントを取り込む種の性質によって決められるものではない。

一部の例において、単離された感染性ポリヌクレオチドまたは核酸は、ウイルス粒子のレセプタを欠失する、すなわち、ウイルスの侵入に対して非許容状態の宿主細胞集団において、完全感染性ウイルス粒子を産生し得る。したがって、産生されるウイルスは、周囲細胞に感染しない。しかしながら、ウイルス粒子を含む上清がウイルスに対して許容状態の細胞に移送されると、感染が生じる。

「複製ポリヌクレオチド」または「複製核酸」という用語は、許容宿主細胞により取り込まれる際、同一ポリヌクレオチドまたは核酸の複数、例えば、１つ以上の複製を産生できる、ポリヌクレオチドおよび／または核酸を包含することを意味する。感染性ポリヌクレオチドおよび核酸は、複製ポリヌクレオチドおよび核酸のサブセットであり、これらの用語は同義ではない。例えば、ウイルス外被タンパク質の遺伝子を欠失する欠陥ウイルスゲノムは、複製、例えば、それ自体の複数の複製を産生し得るが、外被タンパク質、または外被タンパク質をコードする別の核酸が体外から提供されない限り、完全感染性ウイルス粒子の合成を媒介できないため、感染性ではない。

一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、核酸、または核酸フラグメントはＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、プロモータおよび／またはポリペプチドをコードする核酸フラグメントに動作可能に関連する他の転写物あるいは翻訳調節要素も含む。動作可能な結合は、遺伝子生成物、例えば、ポリペプチドをコードする核酸フラグメントが、調節配列の影響または制御下で、遺伝子生成物の発現を配置するような方法で１つ以上の調節配列に結合される。２つのＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドをコードする核酸フラグメントおよび核酸フラグメントの５’末端に結合されるプロモータ）は、プロモータ機能の導入によって、望ましい遺伝子生成物をコードするｍＲＮＡの転写が生じる場合、および２つのＤＮＡフラグメント間の連結の性質が（１）枠移動突然変異の導入を生じない、（２）遺伝子生成物の発現を指示する発現調節配列の能力を干渉しない、あるいは（３）転写されるＤＮＡテンプレートの能力を干渉しない場合、「動作可能に関連する」。したがって、プロモータ領域とポリペプチドをコードする核酸フラグメントは、プロモータがその核酸フラグメントの転写をもたらし得る場合、動作可能に関連する。プロモータは、既定の細胞のみにおいてＤＮＡの実質的転写を指示する、細胞特異的プロモータであり得る。プロモータに加えて、他の転写制御要素、例えば、エンハンサ、オペレータ、リプレッサ、および転写停止シグナルは、ポリヌクレオチドと動作可能に関連し、細胞特異的な転写を指示することができる。適切なプロモータおよび転写制御領域は、本明細書において開示される。

多様な転写制御領域は、当業者に周知である。これらは、非限定的に、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域を含み、例えば、サイトメガロウイルス（前初期プロモータ、イントロン‐Ａと連結）、シミアンウイルス４０（早期プロモータ）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）からのプロモータおよびエンハンサセグメント等であるが、それらに限定されない。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子に由来する領域、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβグロビン、ならびに真核細胞における遺伝子発現を制御できる他の配列を含む。さらに適切な転写制御領域は、組織特異的プロモータおよびエンハンサ、ならびにリンホカイン誘導プロモータ（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導されるプロモータ）を含む。

同様に、多様な翻訳制御要素は、当業者に周知である。これらは、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ピコルナウイルスからの要素（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも称される）を含むが、それらに限定されない。

本発明のＤＮＡポリヌクレオチドは、円形または線形化プラスミドあるいはベクター、もしくは非感染性かつ非統合性（すなわち、脊椎動物細胞のゲノムに統合されない）でもあり得る他の線形ＤＮＡであり得る。線形化プラスミドは、以前は円形であったが、例えば、制限エンドヌクレアーゼを用いた消化により線形化されたプラスミドである。線形ＤＮＡは、例えば、Ｃｈｅｒｎｇ，Ｊ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ６０：３４３‐５３（１９９９）、およびＣｈｅｎ，Ｚ．Ｙ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：４０３‐１０（２００１）において論じられるような特定状況において有利となり得る。本明細書での使用では、プラスミドおよびベクターという用語は同義的に使用できる。

代替として、ＤＮＡウイルスゲノムを使用して、ＤＮＡポリヌクレオチドを脊椎動物細胞に投与することができる。一部の実施形態において、本発明のＤＮＡウイルスゲノムは、非複製、非感染性、および／または非統合である。適切なＤＮＡウイルスゲノムは、非限定的に、単純ヘルペスウイルスゲノム、アデノウイルスゲノム、アデノ関連ウイルスゲノム、およびポックスウイルスゲノムを含む。非感染性ウイルスゲノムを脊椎動物組織に体内で導入するための方法に関する参照文献は、当業者によく知られている。

他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。脊椎動物細胞にＲＮＡ配列を導入するための方法は、米国特許第５，５８０，８５９に記載されている。

本発明のポリヌクレオチド、核酸、および核酸フラグメントは、分泌またはシグナルペプチドをコードする追加核酸と結合され、本発明の核酸フラグメントまたはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示し得る。シグナル仮説によると、哺乳動物細胞により分泌されたタンパク質は、粗小胞体全体にわたる成長タンパク質鎖のエクスポートが開始されると、成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド、または分泌リーダー配列を有する。当業者であれば、脊椎動物細胞により分泌されたポリペプチドは、一般に完全または「全長」ポリペプチドから切断され、ポリペプチドの分泌または「成熟」形態を生成する、ポリペプチドのＮ‐末端に融合されたシグナルペプチドを有することを承知している。一部の実施形態では、天然のリーダー配列が使用されるか、またはその配列に動作可能に関連したポリペプチドの分泌を指示する能力を維持する、その配列の官能性誘導体が使用される。代替として、異種哺乳動物リーダー配列、またはその官能性誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ‐グルクロニダーゼのリーダー配列と置換され得る。

本発明の一側面に基づいて、ポリヌクレオチド構成物、例えば、核酸フラグメントを含むプラスミドが提供される。ここで核酸フラグメントは、単純ヘルペスウイルスに由来するポリペプチドを動作可能にコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントであり、コーディング領域は、治療または免疫付与される脊椎動物に送達される望ましい脊椎動物種、例えば、ヒトの脊椎動物細胞における発現のために最適化される。適切な単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、単純ヘルペスウイルスｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２タンパク質に由来し得るが、それらに限定されない。追加的な単純ヘルペスウイルス由来のコーディング配列も、天然の単純ヘルペスウイルスコドンまたは治療または免疫付与される脊椎動物における発現のために最適化されたコドンのいずれかを使用して、プラスミド上、あるいは個別のプラスミド上に含まれ、発現し得る。１つ以上の最適化単純ヘルペス配列をコードするそのようなプラスミドが、治療または免疫付与される脊椎動物の組織に体内で送達される際、１つ以上のコードされた遺伝子生成物が発現、すなわち、転写および翻訳される。遺伝子生成物の発現レベルは、関連プロモータの強さおよび関連エンハンサ要素の存在と活性、ならびにコーディング領域の最適化の程度に大きく依存する。

本明細書では、「プラスミド」という用語は、遺伝物質（すなわち、核酸）からなる構成物を意味する。一般に、プラスミドは、大腸菌等の細菌宿主細胞において機能する複製の起源、およびプラスミドを含む細菌宿主細胞を検出するために選択可能なマーカーを含む。本発明のプラスミドは、挿入されたコーディング配列が真核細胞において転写および翻訳できるように配置される、本明細書に記載の遺伝要素を含み得る。またプラスミドは、ウイルス核酸からの配列を含み得る。しかしながら、そのようなウイルス配列は、通常、ウイルス粒子へのプラスミドの統合を指示するか、または可能にするには十分でないため、プラスミドは非ウイルスベクターである。本明細書に記載の一部の実施形態において、プラスミドは閉鎖環状ＤＮＡ分子である。

「発現」という用語は、コーディング配列によりコードされる生成物の生物学的産生を意味する。大部分の場合において、コーディング配列を含むＤＮＡ配列は、転写されてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成する。その後、メッセンジャーＲＮＡは翻訳され、関連する生物活性を有するポリペプチド生成物を形成する。また発現のプロセスは、転写のＲＮＡ生成物に対するステップの処理、例えば、スプライシングしてイントロンを除去するステップ、および／またはポリペプチド生成物の翻訳後処理をさらに含み得る。

本明細書では、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含するものであり、２つ以上のアミノ酸の任意の１つまたは複数の鎖を含む。したがって、本明細書では、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」を含むが、それらに限定されない用語、または２つ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖の意味で使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれる。「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または交互に置き換えて使用することができる。本用語は、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク分解的切断、または非自然発生アミノ酸による修飾を経たポリペプチドをさらに含む。

本発明のポリペプチドとして、前述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体、または変異体、ならびにそれらの任意の組み合わせも含まれる。本発明のポリペプチド、およびそれらのフラグメント、誘導体、類似体、または変異体は、単純ヘルペスポリペプチドに関連する抗原および免疫原性ポリペプチドであり得、予防または治療、すなわち、単純ヘルペスウイルスにより生じた感染疾患の治癒、改善、その重篤度の軽減、またはその感染の予防あるいは低減に使用される。

本明細書では、「抗原ポリペプチド」または「免疫原性ポリペプチド」は、脊椎動物に導入されると、その脊椎動物の免疫系分子と反応する、すなわち、抗原性のポリペプチド、および／または脊椎動物において免疫応答を誘導する、すなわち、免疫原性のポリペプチドである。免疫原性ポリペプチドは、抗原性でもあるが、抗原ポリペプチドは、その大きさまたは構造のため、必ずしも免疫原性とは限らない可能性が高い。本発明の抗原および免疫原性ポリペプチドの例は、例えば、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２、あるいはそれらのフラグメントもしくは変異体、または異種ポリペプチドに融合された前述のポリペプチドあるいはフラグメントのいずれか、例えば、Ｂ型肝炎コア抗原を含むが、それらに限定されない。本発明の単離された抗原および免疫原性ポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに加えて、組み換えタンパク質、精製サブユニット、タンパク質を発現するウイルスベクターとして、または不活性単純ヘルペスウイルスワクチン、例えば、弱毒化生ワクチン、熱殺菌されたウイルスワクチン等の形態で提供され得る。

免疫特異的結合は、非特異的結合を除くが、他の抗原との交差反応は除外しない。すべての免疫原性エピトープが抗原性である場合、抗原性エピトープは、免疫原性である必要はない。

「単離された」単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、その天然形態でない単純ヘルペスウイルスポリペプチドまたはタンパク質を意味する。特定レベルの精製は不要である。例えば、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドは、その天然環境または自然環境から除去され得る。組み換えで産生された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、および宿主細胞において発現したタンパク質は、本発明の目的のために、単離していると考えられ、増殖した卵または培養細胞からの単純ヘルペスウイルスビリオンの分離を含む、任意の適切な手技によって分離、分画、または一部あるいは実質的に精製された天然または組み換え単純ヘルペスウイルスポリペプチドもそのように見なされる。さらに、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドまたはタンパク質は、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドを発現する活性または不活性ウイルスベクターとして提供され、不活性単純ヘルペスウイルスワクチン組成物において見出されるものを含み得る。したがって、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドおよびタンパク質は、例えば、組み換え単純ヘルペスウイルスポリペプチド、単純ヘルペスウイルスの精製サブユニット、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドを発現するウイルスベクターとして、あるいは不活性もしくは弱毒化単純ヘルペスウイルスワクチンの形態で提供され得る。

本明細書では、「エピトープ」という用語は、脊椎動物、例えば、ヒトにおいて抗原または免疫原性活性を有するポリペプチドの部分を意味する。本明細書では、「免疫原性エピトープ」は、当該技術分野において既知の任意の方法によって決定される、動物において免疫応答を誘発するタンパク質の一部分として定義される。本明細書では、「抗原性エピトープ」という用語は、当該技術分野において周知の任意の方法によって決定される、抗体またはＴ細胞レセプタが免疫特異的に結合できるタンパク質の一部分として定義される。

本明細書では、「免疫原性担体」という用語は、第２のポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の免疫原性を増強する、第１のポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を意味する。一般に、「免疫原性担体」は、望ましいポリペプチドあるいはそのフラグメントに融合または接合される。「免疫原性担体」の一例は、表面エピトープとして対象の免疫原性エピトープを発現する組み換えＢ型肝炎コア抗原である。例えば、欧州特許第０３８５６１０Ｂ１号を参照されたい。

本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは、本発明の単純ヘルペスウイルスポリペプチド、例えば、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２ポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または約８〜約３０のアミノ酸の配列を含む。免疫原性または抗原性エピトープを含む一部ポリペプチドは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００アミノ酸残基長である。抗原および免疫原性エピトープは、線形であってもよく、すなわち、ポリペプチドにおける隣接アミノ酸で構成されるか、または３次元、すなわち、エピトープが非隣接アミノ酸で構成され、非隣接アミノ酸はポリペプチドの二次または三次構造のために集合し、それによりエピトープを形成することもできる。

抗原性エピトープを含有する（例えば、抗体またはＴ細胞レセプタが結合し得るタンパク質分子の領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を定期的に誘発できることは、当該技術において周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照されたい。

免疫応答を誘発できるペプチドは、タンパク質の一次配列内に表される場合が多く、一連の単純な化学的規則によって特徴付けることができ、無傷のタンパク質の免疫優勢領域にも、アミノまたはカルボキシル末端にも限定されない。極めて疎水性のペプチドおよび６つ以下の残基のペプチドは、一般に、模倣タンパク質に結合する誘導抗体において有効でないが、長鎖ペプチド、特にプロリン残基を含むものは通常有効である。上記のＳｕｔｃｌｉｆｆｅら、６６１を参照されたい。

コドン最適化
「コドン最適化」は、少なくとも１つ、１つ以上、または相当数の天然配列のコドンを、対象の脊椎動物の遺伝子においてより頻繁に、あるいは最も頻繁に使用されるコドンと置換することにより、対象の脊椎動物、例えば、ヒトの細胞における発現を増強するために核酸配列を修飾することと定義される。多様な種は、特定のアミノ酸の一部コドンに対して特定のバイアスを呈する。

一側面において、本発明は、所定の脊椎動物、例えば、ヒトの細胞内で最適に発現するように適合されたコドンを使用して、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする、コドン最適化コーディング領域の核酸フラグメントを含むポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは、対象の脊椎動物の遺伝子における使用に好適なコドンをＤＮＡ配列に組み込むことにより調製される。単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするコドン最適化コーディング領域の核酸フラグメントを含む、ポリヌクレオチド発現構成物、ベクター、および宿主細胞、ならびに脊椎動物における単純ヘルペス疾患の治療または予防にポリヌクレオチド発現構成物、ベクター、宿主細胞を使用する種々の方法も提供される。

本明細書では、「コドン最適化コーディング領域」という用語は、少なくとも１つ、または１つ以上、あるいは相当数のコドンを、所定の脊椎動物の遺伝子においてより頻繁に使用される１つ以上のコドンと置換することによって、その脊椎動物の細胞内で発現するように適用された核酸コーディング領域を意味する。

任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列の偏位は、遺伝子をコードする配列の変異を可能にする。各コドンは３つのヌクレオチドを含むため、ＤＮＡを含むヌクレオチドは４つの特定の塩基に限定され、６４の可能なヌクレオチドの組み合わせが存在する。そのうちの６１は、アミノ酸をコードする（残りの３つのコドンは、シグナル終了翻訳をコードする（停止または終止））。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝子コード」は、本明細書において表１として再現される。結果として、多数のアミノ酸が１つ以上のコドンにより指定される。例えば、アミノ酸であるアラニンおよびプロリンは、４つのトリプレットによりコードされ、セリンおよびアルギニンは６つのトリプレットによりコードされる。一方、トリプトファンおよびメチオニンは、ただ１つのトリプレットによりコードされる。この縮退により、ＤＮＡ塩基組成物は、ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更することなく、広い範囲で変化し得る。

多数の有機体は、成長ペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするための特定コドンの使用に関してバイアスを表す。コドン選択またはコドンバイアス、すなわち有機体間のコドン使用の差は、遺伝コードの縮退によって得られ、多数の有機体間で十分に文献に見出される。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関する場合が多く、特に、翻訳されるコドンの特性、および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に順に依存すると考えられる。細胞における選択ｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、コドン最適化に基づいて、所定の有機体における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整することができる。

多様な動物、植物、および微生物種についての多数の遺伝子配列が知られているため、コドン使用の相対頻度を計算できる。コドン使用頻度表は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／の「コドン使用データベース」（２００２年７月９日）から容易に入手できる。これらの表は、多くの方法で適合できる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．ら、“ＣｏｄｏｎｕｓａｇｅｔａｂｕｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓｆｏｒｔｈｅｙｅａｒ２０００”Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。例として、ＧｅｎＢａｎｋＲｅｌｅａｓｅ１２８．０（２００２年２月１５日）から計算されたヒト、マウス、家禽ネコ、およびウシのコドン使用頻度表を以下の表２〜５として複製する。これらの表は、ｍＲＮＡ命名法を使用する。よって、ＤＮＡで見出されるチミン（Ｔ）の代わりに、表では、ＲＮＡで見出されるウラシル（Ｕ）を使用する。表は、全６４コドンではなく、各アミノ酸に対して頻度が計算されるように改変されている。

これらの表、または同様の表を利用することにより、当業者は、任意の所定のポリペプチド配列に頻度を適用し、ポリペプチドをコードするが、所定の種に対してより最適なコドンを使用する、コドン最適化コーディング領域の核酸フラグメントを産生することができる。コドン最適化コーディング領域は、種々の異なる方法によって設計できる。

「完全最適化」と称する別の方法において、コドンの実際の頻度は、コーディング領域全体にランダムに分布する。したがって、この方法を最適化に使用して、仮説のポリペプチド配列が１００ロイシン残基を有する場合、表２のヒトにおける使用頻度を参照すると、約７または７％のロイシンコドンはＵＵＡとなり、約１３または１３％のロイシンコドンはＵＵＧとなり、約１３または１３％のロイシンコドンはＣＵＵとなり、約２０または２０％のロイシンコドンはＣＵＣとなり、約７または７％のロイシンコドンはＣＵＡとなり、約４１または４１％のロイシンコドンはＣＵＧとなる。これらの頻度は、仮説のポリペプチドをコードするコーディング領域内のロイシンコドン全体にランダムに分布することになるであろう。当業者には理解されるように、配列におけるコドンの分布は、この方法を使用して大幅に変化するが、配列は常に、同一のポリペプチドをコードする。

「完全最適化」法を使用する際、全体ポリペプチド配列は、上述のようにコドン最適化され得る。種々の望ましいフラグメントに関して、完全ポリペプチドの変異体または誘導体、フラグメント変異体、もしくは誘導体を最初に設計することができ、その後、個別にコドン最適化される。代替として、全長ポリペプチド配列は、所定の種に対してコドン最適化され、結果としてポリペプチド全体をコードするコドン最適化コーディング領域を生じ、その後、ポリペプチドのフラグメント、変異体、および誘導体をコードするコドン最適化コーディング領域の核酸フラグメントは、元のコドン最適化コーディング領域から形成される。当業者には十分に理解されるように、所定の種におけるコドンの使用頻度に基づいて、コドンが全長コーディング領域にランダムに割り当てられた場合、フラグメント、変異体、および誘導体をコードする核酸フラグメントは、必ずしも所定の種に対して完全にコドン最適化されるとは限らない。しかしながら、そのような配列であっても、天然コドン使用よりも望ましい種のコドン使用頻度にはるかに近い。このアプローチの利点は、所定のポリペプチドの各フラグメント、変異体、および誘導体をコードするコドン最適化核酸フラグメントの合成は、ルーチンであるが、多大な時間を必要とし、結果として相当の費用がかかることである。

「完全最適化」法を使用する際、「約」という用語を正確に使用して、所定のアミノ酸のコドン頻度の分率を説明する。本明細書では、「約」はアミノ酸が所定の値より１つ多いか、または１つ少ないと定義される。アミノ酸の全体数値は、分率使用頻度が０．５０以上である場合は四捨五入により切り上げられ、分率使用頻度が０．４９以下である場合は四捨五入で切り下げられる。６２のロイシン残基を有する仮説のポリペプチドに関する、ヒト遺伝子におけるロイシンの使用頻度の例を再度使用すると、コドンの分率使用頻度は、６２に種々のコドンの頻度を掛けることによって計算される。したがって、６２の７．２８％は４．５１ＵＵＡコドン、または「約５」、すなわち４、５、あるいは６ＵＵＡコドンに等しく、６２の１２．６６％は、７．８５ＵＵＧコドン、または「約８」、すなわち７、８、あるいは９ＴＵＧコドンに等しく、６２の１２．８７％は、７．９８ＣＵＵコドン、または「約８」、すなわち７、８、あるいは９ＣＴＵコドンに等しく、６２の１９．５６％は、１２．１３ＣＵＣコドン、または「約１２」、すなわち１１、１２、あるいは１３ＣＵＣコドンに等しく、６２の７．００％は、４．３４ＣＵＡコドン、または「約４」、すなわち３、４、あるいは５ＣＵＡコドンに等しく、６２の４０．６２％は、２５．１９ＣＵＧコドン、または「約２５」、すなわち２４、２５、あるいは２６ＣＵＧコドンに等しい。

「最小限の最適化」と称される第３の方法において、コーディング領域は、一部のみが最適化される。例えば、本発明は、所定の種に対してコドン位置の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％がコドン最適化されたポリペプチドをコードする、コドン最適化コーディング領域の核酸フラグメントを含む。つまり、それらは、望ましい種、例えば、脊椎動物種、例えば、ヒトの遺伝子において、天然核酸配列において通常使用されるコドンの代わりに、選択的に使用されるコドンを含む。対象の脊椎動物の遺伝子においてほとんど見出されないコドンは、対象の脊椎動物のコーディング領域において、より一般的に利用されるコドンに変更される。

非常に変わりやすいコドンに対するこの最小限のヒトコドン最適化は、以下の例を含むがそれらに限定されない、いくつかの利点を有する。対象の遺伝子のヌクレオチド配列に対して行われる変更が少ないため、必要とされる操作が少ない。これは、望まれない突然変異を導入するリスクおよび費用を低減し、市販の部位特異的突然変異導入キットの使用を可能にして、高価なオリゴヌクレオチド合成の必要性を削減する。さらに、ヌクレオチド配列における変更数を削減することにより、配列の二次構造を変化させる可能性を減少させる。これは、一部宿主細胞における遺伝子発現に大きな影響を有し得る。望ましくない制限部位の導入も削減され、プラスミド発現ベクターへの対象の遺伝子のサブクローニングを促進する。

本発明は、単純ヘルペスウイルスポリペプチドのコーディング領域を含む単離されたポリヌクレオチド、例えば、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体も提供する。単離されたポリヌクレオチドもコドン最適化することができる。

ヒトコドン最適化コーディング領域は、本明細書に記載の方法のいずれかによって設計され得る。「一様な」最適化の場合、各アミノ酸は、そのアミノ酸のヒトゲノムにおいて最も頻繁に使用されるコドンを割り当てる。

上述のように、「約」という用語は、特定のコドンによってコードされるアミノ酸の数が、所定の数よりも１つ多いか、または１つ少ないことを意味する。当業者には、ポリペプチド配列における任意のアミノ酸の総数が一定である必要があり、したがって、所定のアミノ酸をコードする１つのコドンが１つ「多い」場合、同一のアミノ酸をコードする別のコドンは１つ「少ない」必要があることが理解されるであろう。

最小限の最適化の別の形態において、問題になっている特定の単純ヘルペスウイルス配列に関するコドン使用頻度表（ＣＵＴ）が生成され、ヒトゲノムＤＮＡのＣＵＴと比較される。アミノ酸は、ヒトおよび単純ヘルペスウイルスＤＮＡ間のコドン使用頻度に少なくとも１０％ポイントの差（多いまたは少ない）があることに対して同定される。次に、野生型単純ヘルペスウイルスコドンを修飾して、そのようなアミノ酸それぞれの優勢ヒトコドンに一致させる。さらに、そのアミノ酸のコドンの残りも修飾して、それらがそのようなアミノ酸それぞれの優勢ヒトコドンに一致するようにする。

組成物および方法
一部の実施形態において、本発明は、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする少なくとも１つのコドン最適化領域を含む、１つ以上のポリヌクレオチドを脊椎動物の組織に体内で投与することにより、単純ヘルペスウイルス感染に対する保護を必要とする脊椎動物の免疫応答を増強する組成物および方法を対象とする。さらに、本発明は、本明細書に記載されるような１つ以上のポリヌクレオチド、および少なくとも１つの単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含む組成物を脊椎動物に投与することにより、単純ヘルペスウイルス感染に対する保護を必要とする脊椎動物の免疫応答を増強する組成物および方法を対象とする。ポリヌクレオチドは、単離されたポリペプチドの投与前、投与時（同時）、または投与後のいずれかに投与され得る。

単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするコーディング領域は、特定の脊椎動物にコドン最適化され得る。コドン最適化は、本明細書に記載の方法によって実施される。例えば、一部の実施形態において、単純ヘルペスウイルスのポリペプチドをコードするコドン最適化コーディング領域、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするそのようなコーディング領域の核酸フラグメントは、特定の脊椎動物のコドン使用に基づいて最適化される。本発明のポリヌクレオチドは、脊椎動物の細胞に体内で組み込まれ、免疫学的に有効な量の単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、体内で産生される。単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするコーディング領域は、哺乳動物、例えば、ヒト、類人猿、サル（例えば、ヨザル、リスザル、オマキザル、アカゲザル、アフリカミドリザル、パタスモンキー、カニクイザル、およびミドリザル）、オランウータン、ヒヒ、テナガザル、およびチンパンジー、イヌ、オオカミ、ネコ、ライオン、およびトラ、ウマ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、キリン、クマ、ウサギ、マウス、フェレット、アザラシ、クジラ、鳥類（例えば、アヒル、ガチョウ、アジサシ、ミズナギドリ、カモメ、シチメンチョウ、ニワトリ、ウズラ、キジ、ガン、ムクドリ、およびセキセイインコ）、または他の脊椎動物に対してコドン最適化され得る。

一実施形態において、本発明は、単純ヘルペスウイルスのポリペプチドをコードするコドン最適化コーディング領域、あるいはヒトのコドン使用に基づいて最適化されたそのようなコーディング領域のフラグメント、変異体、もしくは誘導体の核酸フラグメントに関する。例えば、単純ヘルペスウイルスのポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするヒトコドン最適化コーディング領域は、ヒト遺伝子における使用に好適な１つ以上のコドンを、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするＤＮＡ配列において自然に使用されるコドンの代わり用いることによって調製される。また、単純ヘルペスウイルスポリペプチドをコードするコドン最適化コーディング領域、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするようなコーディング領域の核酸フラグメントを含むポリヌクレオチド、べクター、および他の発現構成物、単純ヘルペスウイルスのポリペプチドをコードするコドン最適化コーディング領域、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするようなコーディング領域の核酸フラグメントを含むポリヌクレオチド、ベクター、およびその他の発言構成物を含む医薬組成物、およびそのようなポリヌクレオチド、ベクター、および他の発現構成物を使用する種々の方法も提供される。単純ヘルペスウイルスポリペプチドをコードするコーディング領域は、本明細書に記載されるように、一様に最適化、完全に最適化、最小限に最適化、領域によりコドン最適化され得る、および／またはコドン最適化されない。

本発明は、さらに単純ヘルペスウイルス抗原のポリペプチド、例えば、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２を、任意で他の抗原と併せてコードするコドン最適化コーディング領域を含むポリヌクレオチドを対象とする。本発明は、それらポリペプチドのフラグメント、変異体、および誘導体をコードするコドン最適化核酸フラグメントを含むポリヌクレオチドも対象とする。

一部の実施形態において、本発明は、核酸フラグメントを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。ここで核酸フラグメントは、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、例えば、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２と同一のポリペプチドを少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％コードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントであり、核酸フラグメントは、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、例えば、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２をコードするコドン最適化領域の変異体である。ヒトコドン最適化コーディング領域は、任意の脊椎動物種に対して、本明細書に記載される方法のいずれかにより最適化することができる。

単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド
本発明は、さらに１つ以上の核酸フラグメントからなる、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物へと導かれる。ここで各核酸フラグメントは、１つ以上の単離された単純ヘルペスウイルス成分または単離されたポリペプチドとともに、任意で、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を動作可能にコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントである。単純ヘルペスウイルス成分は、不活性ウイルス、弱毒化ウイルス、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドを発現するウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスタンパク質、そのフラグメント、変異体、もしくは誘導体であり得る。

本発明の単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドは、任意の形態であってもよく、当該技術分野において周知の手技を使用して生成される。例えば、組み換えにより産生された単離された単純ヘルペスウイルスタンパク質、それらの天然環境から直接精製された単離された単純ヘルペスウイルスタンパク質、単離された単純ヘルペスウイルスタンパク質を発現する組み換え（非単純ヘルペスウイルス）ウイルスベクター、または従来型ワクチン等の不活性単純ヘルペスウイルスワクチンの形態で送達されるタンパク質を含む。

本発明において、従来型抗原ワクチン組成物とコドン最適化核酸組成物との混合は、用量を節約する濃度で治療上有利な効果をもたらす。例えば、認可された市販の製品、例えば、上述の従来の製品に対して既定の患者における治療上有益な効果に十分な免疫応答は、適量のコドン最適化核酸を用いて補充または増強されると、より少ない認可された市販の製品を使用することで得られる。したがって、用量の節約は、本発明のコドン最適化核酸と併せて、従来型単純ヘルペスウイルスワクチンを投与することによって予期される。

特に、従来型ワクチンの用量は、本発明のコドン最適化核酸組成物と併せて投与される場合、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％削減できる。

同様に、ＤＮＡベースの医薬単独により生じる望ましいレベルの免疫応答は、一定分量の従来型ワクチンを含むことにより、少ないＤＮＡで得られる。さらに、従来型医薬およびＤＮＡベースの医薬の混合物を使用することにより、両材料の使用量を削減できる一方、いずれかの成分を単独で大量投与することにより生じる望ましいレベルの免疫応答を生じることができる（例えば、それらを混合して使用する場合、いずれかの免疫製品を少量使用するだけでよい）。これは、任意の時点で送達される材料をより少量で使用することだけでなく、ワクチン接種計画における投与点の数が減少する（例えば、３または４回の注射に対して２回）、および／または免疫応答の速度が減少する（例えば、望ましい応答レベルは、免疫付与後６週間ではなく３週間で得られる）ことにより明らかとなる。

特に、ＤＮＡベースの医薬の用量は、従来型単純ヘルペスウイルスワクチンと混合して投与された場合、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％減少し得る。

ＤＮＡベースの医薬および従来型抗原の正確な量の決定は、上述のような多くの因子に基づいて、当業者により容易に決定される。
用量の節約に加えて、特許請求される混合組成物は、免疫応答の拡大および／または増強された有益な免疫応答を提供する。そのような拡大または増強された免疫応答は、ＤＮＡを添加して従来型ワクチンへの細胞応答を増強する、従来型ワクチンをＤＮＡ医薬に添加して体液性応答を増強する、認識される、および／またはより望ましく応答する（エピトープを拡大する）追加エピトープ（体液性および／または細胞性の両方）を誘起する混合物を使用する、特定の望ましいスペクトルの免疫応答のために設計されたＤＮＡ‐従来型ワクチン混合物を採用する、いずれかの成分を多量に使用することにより望ましいスペクトルを得る、ことによって実現される。当業者であれば、望ましい応答スペクトルに対して特異的な標準免疫アッセイにより、拡大した免疫応答を測定できる。

拡大および用量の節約は、いずれも同時に得ることができる。
送達される単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体（組み換えタンパク質、精製サブユニット、または単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチドを発現するウイルスベクターのいずれか、あるいは不活性単純ヘルペスウイルスワクチンの形態）は、任意の単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体であってもよく、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２タンパク質、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含むが、それらに限定されない。本明細書に記載される任意の単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、核酸フラグメントを含む任意のポリヌクレオチドを有する組成物に混合することができることに留意されたい。ここで核酸フラグメントは、任意で、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を動作可能にコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントである。タンパク質は、異なっても同一であってもよく、あるいは１つ以上の単離された単純ヘルペスウイルスタンパク質と１つ以上のポリヌクレオチドとの任意の組み合わせに混合されてもよい。

一部の実施形態において、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、誘導体、もしくは変異体は、第２の単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、誘導体、もしくは変異体に融合または接合されるか、またはＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を含むが、それらに限定されないＢ型肝炎タンパク質、あるいはジフテリアまたは破傷風に由来するタンパク質等の他の異種タンパク質に融合され得る。第２の単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、または他の異種タンパク質は、それが結合される単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の免疫原性を増強する「担体」として作用し得る。本発明の範囲内で担体として有用なＢ型肝炎ウイルスタンパク質、およびそれらのフラグメントならびに変異体は、米国特許第６，２３１，８６４号および第５，１４３，７２６号に開示されている。該融合または接合タンパク質をコードするコーディング領域を含むポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。

Ｂ型肝炎コア抗原（「ＨＢｃＡｇ」）および異種タンパク質配列を強力な免疫原性部分として含む組み換え粒子の使用は、十分に文献に見出される。例えば、組み換えＨＢｃＡｇのアミノ末端に異種配列を追加することにより、それらの表面上に異種エピトープを発現し、実験動物に接種されると高い免疫原性を示す、粒子構造の同時アセンブリが生じる。Ｃｌａｒｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ３３０：３８１‐３８４（１９８７）を参照されたい。異種エピトープは、タンパク質のカルボキシ末端の約４０のアミノ酸を異種配列で置換することによって、ＨＢｃＡｇ粒子に挿入することもできる。これらの組み換えＨＢｃＡｇタンパク質も同時に免疫原性粒子を形成する。ＳｔａｈｌおよびＭｕｒｒａｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６２８３‐６２８７（１９８９）を参照されたい。さらに、キメラＨＢｃＡｇ粒子が構成される場合があり、免疫優勢ループにおいて、ＨＢｃＡｇタンパク質の中心により近い領域内のアミノ酸残基の配列に挿入されるか、またはその全体あるいは一部が置換される。それにより、結果として生じる粒子の表面上に異種エピトープを表すことが可能になる。欧州特許第０４２１６３５Ｂ１号およびＧａｌｉｂｅｒｔ，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ２８１：６４６‐６５０（１９７９）を参照されたい。また米国特許第４，８１８，５２７号、第４，８８２，１４５号および第５，１４３，７２６も参照されたい。

単離された単純ヘルペスウイルスタンパク質、あるいはそれらの変異体、フラグメント、もしくは誘導体を含むキメラＨＢｃＡｇ粒子は、当業者に周知の組み換え技術により調製される。プロモータに動作可能に結合されるＨＢｃＡｇのコーディング領域を担持するポリヌクレオチド、例えば、プラスミドが構成される。便利な制限部位は、異種配列が挿入され得るように、ＨＢｃＡｇのＮ末端、中心、および／またはＣ末端部分をコードするコーディング領域に設計される。ＨＢｃＡｇ／単純ヘルペスウイルス融合タンパク質を発現する構成物は、単純ヘルペスウイルスタンパク質、あるいはその変異体、フラグメント、もしくは誘導体をコードするＤＮＡ配列を枠内で、ＨＢｃＡｇのコーディング領域の望ましい制限部位に挿入することによって調製する。その後、キメラＨＢｃＡｇが発現される条件下で、結果として生じる構成物を適切な宿主細胞、例えば、大腸菌に挿入する。キメラＨＢｃＡｇは、発現すると粒子に自己集合し、その後、例えば、超遠心分離によって単離することができる。形成された粒子は、単離された単純ヘルペスウイルスタンパク質、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体が、好ましくは外側粒子表面上に暴露した粒子に含まれることを除いて、Ｂ型肝炎ウイルスから単離された天然の２７ｎｍＨＢｃＡｇ粒子に類似する。

キメラＨＢｃＡｇ粒子において発現した単純ヘルペスウイルスタンパク質、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、キメラＨＢｃＡｇの適切な粒子が自己集合できる任意の大きさであり得る。上述のように、さらに小さい抗原性エピトープは、免疫原性担体、例えば、ＨＢｃＡｇの環境で発現される場合、免疫原性であり得る。したがって、本発明のＨＢｃＡｇ粒子は、そこに挿入される対象の単純ヘルペスウイルスタンパク質フラグメントの少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または約１５〜約３０のアミノ酸を含み得る。本発明のＨＢｃＡｇ粒子は、そこに挿入される対象の単純ヘルペスウイルスタンパク質フラグメントの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０，３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００のアミノ酸残基の免疫原性または抗原性エピトープをさらに含み得る。

ＨＢｃＡｇの免疫優勢ループ領域は、約アミノ酸残基７５〜８３位、約アミノ酸７５〜８５位、または約アミノ酸１３０〜１４０位にマップされた。Ｃｏｌｕｃｃｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４３７６‐４３８０（１９８８）、およびＳａｌｆｅｌｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：７９８（１９８９）を参照されたい。キメラＨＢｃＡｇは、外来エピトープが免疫優勢ループにクローン化される場合、コア粒子を依然として形成できる場合が多い。したがって、例えば、単純ヘルペスウイルスタンパク質フラグメントのアミノ酸は、種々の位置、例えば、Ｎ末端、約アミノ酸７５位〜約アミノ酸８５位、約アミノ酸７５位〜約アミノ酸８３位、約アミノ酸１３０位〜約アミノ酸１４０位において、あるいはＣ末端において、ＨＢｃＡｇアミノ酸の配列に挿入され得る。単純ヘルペスウイルスタンパク質フラグメントのアミノ酸が、天然コアタンパク質配列の全部または一部を置換する場合、挿入される単純ヘルペスウイルス配列は、一般に短くはないが、それが置換するＨＢｃＡｇ配列より長くあり得る。

代替として、粒子形成が望ましくない場合、全長単純ヘルペスウイルスコーディング配列は、ＨＢｃＡｇのコーディング領域に融合することができる。ＨＢｃＡｇ配列は、本明細書に記載の単純ヘルペス抗原のいずれかのＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて融合され得る。融合は、柔軟なタンパク質リンカーを含み得る。これらの融合構成物は、記載される方法のいずれかによってコドン最適化され得る。

キメラＨＢｃＡｇは、核酸フラグメントを含むポリヌクレオチドと併せて、本発明において使用できる。ここで核酸フラグメントのそれぞれは、任意で、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を、脊椎動物の単純ヘルペスワクチンとして、動作可能にコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントである。

方法および投与
本発明は、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をヒトに送達するための方法も提供する。本方法は、本明細書に記載される１つ以上の組成物をヒトに投与するステップであって、本明細書に記載されるような組成物を投与する際、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体が、単純ヘルペスウイルスに対する免疫応答を生成するために十分な量で、ヒト細胞内で発現されるようにするステップ、または免疫応答を生成するために十分な量の単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体自体をヒトに投与するステップを含む。

本発明は、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をヒトに送達するための方法をさらに提供する。本方法は、本明細書に記載されるような組成物を投与する際、脊椎動物において免疫応答が生成されるように、本明細書に記載の１つ以上の組成物を脊椎動物に投与するステップを含む。
「脊椎動物」という用語は、単数の「脊椎動物」、および複数の「脊椎動物」を包含することを意図し、哺乳動物および鳥類、ならびに魚類、爬虫類、および両生類を含む。

「哺乳動物」という用語は、単数の「哺乳動物」および複数の「哺乳動物」を包含することを意図し、ヒト、類人猿、サル（例えば、ヨザル、リスザル、オマキザル、アカゲザル、アフリカミドリザル、パタスモンキー、カニクイザル、およびミドリザル）、オランウータン、ヒヒ、テナガザル、チンパンジー等の霊長類、イヌ、オオカミ等のイヌ科動物、ネコ、ライオン、トラ等のネコ科動物；ウマ、ロバ、シマウマ等のウマ科動物、ウシ、ブタ、ヒツジ等の食用動物；シカ、キリン等の有蹄動物、クマ等の蹠行性肉食動物、ウサギ、マウス、フェレット、アザラシ、クジラ等の他の動物を含むが、それらに限定されない。特に、哺乳動物は、ヒト対象、食用動物、またはコンパニオンアニマルであり得る。
「鳥類」という用語は、単数の「鳥類」および複数の「鳥類」を包含することを意図し、アヒル、ガチョウ、アジサシ、ミズナギドリ、カモメ等の野生水鳥、およびシチメンチョウ、ニワトリ、ウズラ、キジ、ガン、アヒル等の家禽鳥類を含むが、それらに限定されない。「鳥類」という用語は、ムクドリおよびセキセイインコ等のスズメ目の鳥類も包含する。

本発明は、単純ヘルペスウイルスに対する免疫応答を生成、増強、または調節するための方法であって、本明細書に記載される１つ以上の組成物を脊椎動物に投与するステップを含む方法をさらに提供する。本方法において、組成物は、少なくとも１つの核酸フラグメントを含む、１つ以上の単離されたポリヌクレオチドを含み得る。ここで核酸フラグメントは、任意で、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントである。別の実施形態において、組成物は、上述のようなポリヌクレオチド、および単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の両方を含み得る。ここでタンパク質は、組み換えタンパク質、特に、融合タンパク質、精製サブユニット、タンパク質を発現するウイルスベクターとして、または不活性単純ヘルペスウイルスワクチンの形態で提供される。したがって、後者の組成物は、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、および単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の両方を含む。組成物のポリヌクレオチドによりコードされる単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体は、組成物の単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体と同一である必要はない。本方法に基づいて使用される組成物は、一価、二価、三価または多価であり得る。

組成物のポリヌクレオチドは、単純ヘルペスウイルス、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体のタンパク質をコードする、ヒト（または他の脊椎動物）コドン最適化コーディング領域のフラグメントを含み得る。ポリヌクレオチドは、脊椎動物の細胞に体内で組み込まれ、抗原量の単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体が、体内で生成される。本方法に基づく組成物を投与する際、免疫応答を誘発するために十分な量の単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体が脊椎動物において発現される。そのような免疫応答を使用して、例えば、診断アッセイに使用するため、または実験用試薬として、あるいは本明細書に記載されるような治療または予防ワクチンとして、単純ヘルペスウイルスに対する抗体を生成し得る。

本発明は、脊椎動物において単純ヘルペスウイルスに対する保護および／または治療免疫応答を生成、増強、または調節するための方法であって、本明細書に記載の１つ以上の組成物の治療および／または予防免疫を必要とする脊椎動物に投与するステップを含む方法をさらに提供する。本方法において、組成物は、少なくとも１つの核酸フラグメントを含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。ここで核酸フラグメントは、任意で、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントである。さらなる実施形態において、本方法に使用される組成物は、少なくとも１つの核酸フラグメントを含む単離されたポリヌクレオチドであって、ここで核酸フラグメントは、任意で、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするコドン最適化コーディング領域のフラグメントである単離されたポリヌクレオチドと、少なくとも１つの単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の両方を含む。したがって、後者の組成物は、単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチド、および単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体、例えば、組み換えタンパク質、精製サブユニット、タンパク質を発現するウイルスベクター、または不活性ウイルスワクチンの両方を含む。本方法に基づく組成物を投与する際、治療または予防に有効な量の単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体がヒトにおいて発現される。

本明細書では、「免疫応答」は、脊椎動物に送達される組成物に対する免疫応答を誘発する、その脊椎動物の能力を意味する。免疫応答の例は、抗体応答または細胞性、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答を含む。本発明の１つ以上の組成物を使用し、例えば、予防ワクチンとして、脊椎動物における単純ヘルペス感染を予防するため、健康な個体において、単純ヘルペスへの暴露または単純ヘルペス疾患の罹患前に、単純ヘルペスウイルスに対する免疫を確立または増強し、したがって疾患を予防する、または疾患症状の重篤度を軽減することができる。

上述のように、本発明の組成物は、単純ヘルペスウイルス感染の予防、および単純ヘルペスウイルス感染の治療的処理の両方に使用できる。既に単純ヘルペスに暴露した個人、または既に単純ヘルペス疾患を患う個体において、本発明を使用して、脊椎動物の免疫系をさらに刺激し、したがって、疾患または障害に関連する症状を軽減または排除する。本明細書に定義されるように、「治療」とは、本発明の１つ以上の組成物を使用して、脊椎動物における単純ヘルペス疾患症状を予防、治癒、遅延、または重篤度を軽減すること、および／または単純ヘルペスウイルスに既に暴露され、したがって治療を必要とする脊椎動物において一定期間、単純ヘルペス疾患を悪化させないことを意味する。「予防」という用語は、本発明の１つ以上の組成物を使用して、まだ単純ヘルペスウイルスの特定株に暴露されていない脊椎動物において免疫を生成し、それにより、その脊椎動物が後に単純ヘルペスウイルスの特定株に暴露される際、疾患症状を予防または軽減することを意味する。本発明の方法は、したがって、治療ワクチン接種または防止あるいは予防ワクチン接種と称することができる。本発明の任意の組成物は、単純ヘルペスに対する総免疫を提供する、またはすべての単純ヘルペス疾患症状を総合的に治癒または排除する必要がない。本明細書では、「治療および／または予防免疫を必要とする脊椎動物」とは、治療、すなわち、単純ヘルペス疾患症状の予防、治癒、遅延、または重篤度の軽減、および／または一定の期間、単純ヘルペス疾患を悪化させないことが望ましい個体を意味する。

本発明の１つ以上の組成物は、「プライムブースト」療法において利用される。「プライムブースト」療法の例は、Ｙａｎｇ，Ｚ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：７９９‐８０３（２００２）において見出すことができる。これらの実施形態において、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドワクチン組成物は、脊椎動物に送達され、それにより、単純ヘルペスウイルスに対する脊椎動物の免疫応答をプライムした後、第２の免疫原性組成物は、ブーストワクチン接種として利用される。本発明の１つ以上の組成物を使用して免疫をプライムし、その後、第２の免疫原性組成物、例えば、１つまたは複数の組み換えウイルスワクチン、異なるポリヌクレオチドワクチン、または１つ以上の精製サブユニットの単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を使用して、抗単純ヘルペスウイルス免疫応答をブーストする。

一実施形態において、プライム組成物およびブースト組成物は、単一組成物または単一製剤に混合される。例えば、単一組成物は、単離された単純ヘルペスウイルスポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をプライム成分として含み、単純ヘルペスタンパク質をコードするポリヌクレオチドをブースト成分として含み得る。この実施形態において、組成物は、単一バイアルに含まれ得、ここでプライム成分およびブースト成分はともに混合される。一般に、ポリヌクレオチドからのタンパク質の発現レベルのピークは、投与の（例えば、７〜１０日）後になるまで生じないため、ポリヌクレオチド成分は、単離されたタンパク質成分に対するブーストを提供し得る。プライム成分およびブースト成分の両方を含む組成物は、本明細書において「混合ワクチン組成物」または「単一製剤異種プライム‐ブーストワクチン組成物」と称される。さらに、プライム組成物は、ブースト組成物の前に投与されるか、またはブースト組成物がより長く作用することが予想される場合は、ブースト組成物の後にも投与され得る。
別の実施形態において、プライム組成物は、ブースト組成物と同時であるが、個別の製剤で投与され、ここでプライム組成物およびブースト組成物は分離されている。

本明細書では、「プライミング」または「プライマリー」および「ブースト」または「ブースティング」という用語は、すなわち、免疫学においてこれらの用語が通常有する定義に基づいて、初期および後の免疫をそれぞれ意味し得る。しかしながら、一部の実施形態において、例えば、プライム成分およびブースト成分が単一製剤に存在する場合、「プライム」および「ブースト」組成物は同時に投与されるため、初期および後の免疫付与は不要となり得る。

一部の実施形態において、本発明の１つ以上の組成物は、本明細書に記載の方法によって脊椎動物に送達され、それにより、有効な治療免疫応答および／または有効な予防免疫応答を実現する。より具体的に、本発明の組成物は、筋肉、皮膚、脳組織、肺組織、肝組織、脾臓組織、骨髄組織、胸腺組織、心筋、心内膜、心膜等の心臓組織、リンパ組織、血液組織、骨組織、膵臓組織、腎組織、胆嚢組織、胃組織、腸組織、精巣組織、卵巣組織、子宮組織、膣組織、直腸組織、神経系組織、眼組織、腺組織、舌組織、および軟骨等の結合組織を含むがそれらに限定されない、脊椎動物の任意の組織に投与され得る。

さらに、本発明の組成物は、肺、口、鼻腔、胃、腹膜腔、腸、任意の心室、静脈、動脈、毛細血管、リンパ管腔、子宮腔、膣腔、直腸腔、関節腔、脳室、脊髄の脊柱管、眼内腔、唾液腺または肝臓の導管ルーメンを含むがそれらに限定されない、脊椎動物の任意の内腔に投与され得る。本発明の組成物が唾液腺または肝臓の導管ルーメンに投与される場合、望ましいポリペプチドは、唾液腺および肝臓内で発現され、ポリペプチドが唾液腺または肝臓のそれぞれから脊椎動物の血流に送達されるようにする。唾液腺、肝臓、および膵臓を使用する消化系の分泌器官に投与して、望ましいポリペプチドを血流に放出するための特定モードは、米国特許第５，８３７，６９３号および第６，００４，９４４号に開示されている。

一部の実施形態において、組成物は、骨格筋または心筋いずれかの筋肉、あるいは肺組織に投与される。肺組織に投与するための具体的であるが非限定的のモードは、Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１４５４‐１１４５９（１９９６）に開示され、参照することによりその全体が組み込まれる。

開示される方法に基づいて、本発明の組成物は、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮膚内（ｉ．ｄ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、または肺内経路により投与することができる。他の好適な投与経路は、気管内、経皮、眼内、鼻腔内、吸入、腔内、静脈内（ｉ．ｖ．）、導管内（例えば、膵臓へ）、および実質内（すなわち、任意の組織へ）投与を含むが、それらに限定されない。経皮送達は、皮膚内（例えば、真皮または表皮へ）、経皮（例えば、経皮）、および経粘膜的（すなわち、皮膚または粘膜組織内へ、またはそこを通しての）投与を含むが、それらに限定されない。腔内投与は、口、膣、直腸、鼻腔、腹膜、または腸内腔への投与、および気管内（すなわち、脊柱管へ）、室内（すなわち、脳室または心室へ）、房内（すなわち、心房内へ）、およびくも膜下（すなわち、脳のくも膜腔へ）の投与を含むが、それらに限定されない。

経口適応の場合、本発明は、舌ストリップの形態で投与され得る。ここで組成物は、ストリップに組み込まれるか、または適用される。使用者がストリップを舌の上に置くと、ストリップは、口内で溶解または分解する。それにより、組成物が放出される。

単純ヘルペスウイルスに対する免疫応答を生成する、および／またはそのような応答を必要とするヒトにおいて、単純ヘルペスウイルスに対する予防あるいは治療に有効な免疫応答を生成するために十分な量の望ましいペプチドまたはタンパク質の発現を望ましい組織内で生じる限り、任意の投与モードを使用することができる。本発明の投与手段は、針注入、カテーテル注入、バイオリスティックインジェクタ、粒子加速器（例えば、「遺伝子銃」または空気圧式「無針」インジェクタ）Ｍｅｄ‐Ｅ‐Ｊｅｔ（Ｖａｈｌｓｉｎｇ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１７１：１１‐２２（１９９４））、Ｐｉｇｊｅｔ（Ｓｃｈｒｉｊｖｅｒ，Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ１５：１９０８‐１９１６（１９９７））、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ１２：１５０３‐１５０９（１９９４）、Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４：１０９‐１１８（１９９８））、ＡｄｖａｎｔａＪｅｔ（Ｌｉｎｍａｙｅｒ，Ｉ．ら、ＤｉａｂｅｔｅｓＣａｒｅ９：２９４‐２９７（１９８６））、Ｍｅｄｉ‐ｊｅｃｔｏｒ（Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｊ．，ａｎｄＲｏｅｄｌ，Ｅ．Ｊ．Ｏｃｃｕｐ．Ｍｅｄ．２１：８２１‐８２４（１９７９））、米国特許第５，３９９，１６３号、米国特許第５，３８３，８５１号、ゲル形態スポンジデポ、他の市販のデポ材料（例えば、ヒドロゲル）、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口または坐薬固形（錠剤またはピル）医薬製剤、局所皮膚用クリーム、およびデカンティング、ポリヌクレオチドで被覆した縫合の使用（Ｑｉｎ，Ｙ．ら、ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ６５：２１９３‐２２０３（１９９９））または手術中の局所適用を含む。一部投与モードは、筋肉内または皮内ニードルベースの注入、およびカテーテル注入による肺適用を含む。エネルギー介在プラスミド送達（ＥＡＰＤ）法を、本発明の組成物の投与に採用することもできる。そのような方法の１つは、注入される組織への短い電気パルスの適用、電気穿孔として一般に知られる手順を伴う。一般に、Ｍｉｒ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ９６：４２６２‐７（１９９９）、Ｈａｒｔｉｋｋａ，Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：４０７‐１５（２００１）、Ｍａｔｈｉｅｓｅｎ，Ｉ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６：５０８‐１４（１９９９）、ＲｉｚｚｕｔｏＧ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１１：１８９１‐９００（２０００）を参照されたい。

本発明の１つ以上の組成物の有効量の決定は、例えば、発現または直接投与される抗原、例えば、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体、対象の年齢および体重、治療を必要とする正確な状態およびその重篤度、ならびに投与形態を含む、多くの因子に基づく。上記の因子に基づいて、正確な量、投与回数、および投与のタイミングの決定は、当該技術分野の範囲内であり、担当医または獣医により容易に決定される。

本発明の組成物は、種々の塩、賦形剤、送達媒体、および／または、例えば、２００２年２月１４日公開の米国特許出願公開第２００２／００１９３５８号に開示されるような助剤を含む。

さらに、本発明の組成物は、細胞の内部、および／または細胞内の望ましい部位へのポリヌクレオチドの送達を容易にする、１つ以上のトランスフェクション促進化合物を含み得る。本明細書で使用されるように、「トランスフェクション促進化合物」、「トランスフェクション促進剤」、および「トランスフェクション促進材料」は同義であり、交互に置き換えて使用され得る。一部のトランスフェクション促進化合物は、以下に記載されるような「アジュバント」でもあり、すなわち、細胞の内部へのポリヌクレオチドの送達を促進することに加えて、化合物はそのポリヌクレオチドによりコードされる抗原に対する免疫応答を変化または増加させる働きをすることに留意されたい。トランスフェクション促進化合物の例は、リン酸カルシウム、ミョウバン（硫酸アルミニウム）、および金粒子（例えば、「粉末」タイプの送達媒体）等の無機材料、例えば、陽イオン性の細胞間標的（特定の細胞型への選択的送達のため）、細胞内標的（核局在化またはエンドソーム脱出のため）、および両親媒性（らせん形成または孔形成）であるペプチド、例えば、ヒストン等の塩基性（例えば、正負荷）、標的（例えば、アシアロタンパク質）、ウイルス性（例えば、Ｓｅｎｄａｉウイルス外被タンパク質）、および孔形成タンパク質、例えば、陽イオン性（例えば、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＣ‐Ｃｈｏｌ）、塩基性（例えば、ステリルアミン）、中性（例えば、コレステロール）、陰イオン性（例えば、ホスファチジルセリン）、および両性イオン（例えば、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ）である脂質、およびデンドリマー、星型ポリマー、「同種」ポリアミノ酸（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン）、「異種」ポリアミノ酸（例えば、リシンおよびグリシンの混合物）、コポリマー、ポリビニルピロリジノン（ＰＶＰ）、ポロキサマー（例えば、ＣＲＬ１００５）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーを含むが、それらに限定されない。トランスフェクション促進材料は、単独または１つ以上の他のトランスフェクション促進材料との組み合わせで使用できる。２つ以上のトランスフェクション促進材料は、化学結合（例えば、脂質化ポリリシン、ＰＥＧ化ポリリシン等における共有およびイオン化）（Ｔｏｎｃｈｅｖａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３８０（３）：３５４‐３６８（１９８８））、機械的混合（例えば、「ポリリシン＋陽イオン性脂質」等の液相または固相中の自由運動材料）（ＧａｏおよびＨｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：１０２７‐１０３６（１９９６）、Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１３１：３１１‐３１３（１９９２））、および凝集（例えば、陽イオン性脂質＋ポリラクチド、およびポリリシン＋ゼラチン等における共沈、ゲル形成）により混合することができる。

トランスフェクション促進材料のカテゴリの１つは、陽イオン性脂質である。陽イオン性脂質の例は、５‐カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）およびジパルミトイル‐ホスファチジルエタノールアミン‐５‐カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）である。陽イオン性コレステロール誘導体も有用であり、｛３β‐［Ｎ‐Ｎ’，Ｎ’‐ジメチルアミノ）エタン］‐カルボモイル｝‐コレステロール（ＤＣ‐Ｃｈｏｌ）を含む。ジメチルジオクタデシル‐アンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、Ｎ‐（３‐アミノプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐（ビス‐（２‐テトラデシルオキシエチル））‐Ｎ‐メチル‐アンモニウムブロマイド（ＰＡ‐ＤＥＭＯ）、Ｎ‐（３‐アミノプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐（ビス‐（２‐ドデシルオキシエチル））‐Ｎ‐メチル‐アンモニウムブロマイド（ＰＡ‐ＤＥＬＯ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリス‐（２‐ドデシルオキシ）エチル‐Ｎ‐（３‐アミノ）プロピル‐アンモニウムブロマイド（ＰＡ‐ＴＥＬＯ）、およびＮ１‐（３‐アミノプロピル）（（２‐ドデシルオキシ）エチル）‐Ｎ２‐（２‐ドデシルオキシ）エチル‐１‐ピペラジンアミニウムブロマイド（ＧＡ‐ＬＯＥ‐ＢＰ）を、本発明に採用することもできる。

非ジエーテル陽イオン性脂質、例えば、ＤＬ‐１，２‐ジオレオイル‐３‐ジメチルアミノプロピル‐β‐ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩジエステル）、１‐Ｏ‐オレイル‐２‐オレオイル‐３‐ジメチルアミノプロピル‐ｐ‐ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩエステル／エーテル）、およびそれらの塩は、体内の遺伝子送達を促進する。一部の実施形態において、陽イオン性脂質は、頭部基における第４アンモニウム部分に結合されたヘテロ原子により結合される基を含む。グリシルスペーサは、リンカーをヒドロキシル基に接続できる。

本発明の一部の実施形態において使用するための具体的であるが、非限定的な陽イオン性脂質は、ＤＭＲＩＥ（（±）‐Ｎ‐（２‐ヒドロキシエチル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス（テトラデシルオキシ）‐１‐プロパナミニウムブロマイド）、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ（（±）‐Ｎ‐（３‐アミノプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス（シン‐９‐テトラデセニルオキシ）‐１‐プロパナミニウムブロマイド）、およびＧＡＰ−ＤＭＲＩＥ（（±）‐Ｎ‐（３‐アミノプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐（ビス‐ドデシルオキシ）‐１‐プロパニミニウムブロマイド）を含む。

本発明の一部の実施形態において使用するための具体的であるが、非限定的な他の陽イオン性界面活性剤は、Ｂｎ−ＤＨＲＩＥ、ＤｈｘＲＩＥ、ＤｈｘＲＩＥ−ＯＡｃ、ＤｈｘＲＩＥ−ＯＢｚおよびＰｒ−ＤＯｃｔＲＩＥ−ＯＡｃを含む。これらの脂質は、同時係属の米国特許出願第１０／７２５，０１５号に開示される。本発明の別の側面において、陽イオン性界面活性剤は、Ｐｒ−ＤＯｃｔＲＩＥ−ＯＡｃである。

他の陽イオン性脂質は、（±）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐Ｎ‐［２‐（スペルミンカルボキシアミド）エチル］‐２，３‐ビス（ジオレイルオキシ）‐１‐プロパニミニウムペンタヒドロクロリド（ＤＯＳＰＡ）、（±）‐Ｎ‐（２‐アミノエチル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス（テトラデシルオキシ）‐１‐プロパナミニウムブロマイド（β‐アミノエチル‐ＤＭＲＩＥまたはβＡＥ‐ＤＭＲＩＥ）（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１２８０：１‐１１（１９９６）、およびＤＭＲＩＥから開発された（±）‐Ｎ‐（３‐アミノプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス（ドデシルオキシ）‐１‐プロパナミニウムブロマイド（ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ）（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１４５４‐１１４５９（１９９６））を含む。

本発明に有用なＤＭＲＩＥ由来の陽イオン性脂質の他の例は、（±）‐Ｎ‐（３‐アミノプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐（ビス‐デシルオキシ）‐１‐プロパナミニウムブロマイド（ＧＡＰ−ＤＤＲＩＥ）、（±）‐Ｎ‐（３‐アミノプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐（ビス‐テトラデシルオキシ）‐１‐プロパナミニウムブロマイド（ＧＡＰ−ＤＭＲＩＥ）、（±）‐Ｎ‐（（Ｎ”‐メチル）‐Ｎ’‐ウレイル）プロピル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス（テトラデシルオキシ‐）‐１‐プロパナミニウムブロマイド（ＧＭＵ−ＤＭＲＩＥ）、（±）‐Ｎ‐（２‐ヒドロキシエチル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス（ドデシルオキシ）‐１‐プロパナミニウムブロマイド（ＤＬＲＩＥ）、および（±）‐Ｎ‐（２‐ヒドロキシエチル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス‐（［Ｚ］‐９‐オクタデセニルオキシ）プロピル‐１‐プロパナミニウムブロマイド（ＨＰ−ＤＯＲＩＥ）である。

免疫原性組成物が陽イオン性脂質を含む実施形態において、陽イオン性脂質は、１つ以上の共脂質と混合され得る。定義するために、「共脂質」という用語は、陽イオン性脂質成分と混合することができ、リン脂質等の両親媒性脂質およびコレステロール等の中性脂肪を含む、任意の疎水性材料を意味する。陽イオン性脂質および共脂質は、多様な非共役結合した巨視的構造、例えば、リポソーム、多重膜ベシクル、単膜ベシクル、ミセル、および単純膜を産生する多くの方法で混合または結合され得る。共脂質の非限定的なクラスの１つは、両性イオン化リン脂質であり、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンを含む。ホスファチジルエタノールアミンの例は、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰｙＰＥを含む。一部の実施形態において、共脂質は、ジアシルホスファチジルエタノールアミン骨格に組み込まれた２つのフィタノイル置換基を含むＤＰｙＰＥであり、陽イオン性脂質は、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥである（結果としてＶａｘｆｅｃｔｉｎ^TMアジュバントを生じる）。他の実施形態において、共脂質はＤＯＰＥであり、ＣＡＳ名は１，２‐ジオレオイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミンである。

本発明の組成物が陽イオン性脂質および共脂質を含む場合、陽イオン性脂質：共脂質のモル比は、約９：１〜約１：９、約４：１〜約１：４、約２：１〜約１：２、または約１：１であり得る。

均一性を最大限にするため、陽イオン性脂質および共脂質成分を、クロロホルム等の溶媒に溶解した後、陽イオン性脂質／共脂質溶液を真空下で蒸発することにより、ガラス容器（例えば、Ｒｏｔｏｖａｐ丸底フラスコ）の内面上の膜となるまで乾燥させることができる。水性溶媒に懸濁する際、両親媒性脂質成分分子は、均一性脂質ベシクルに自己集合する。続いてこれらの脂質ベシクルを、当業者に周知の方法に基づいて処理し、例えば、本発明のコドン最適化ポリヌクレオチドと混合する前に、均一な大きさの選択された標準直径となるようにする。たとえば、脂質溶液の超音波処理は、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８：７４１３‐７４１７（１９８７）および米国特許第５，２６４，６１８号に記載されている。

組成物が陽イオン性脂質を含む実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、水性溶液にプラスミドを混合することによって脂質と混合され、本明細書で調製される陽イオン性脂質：共脂質の溶液が混合される。構成溶液それぞれの濃度を、混合する前に調節し、２つの溶液を混合する際、望ましい最終プラスミド／陽イオン性脂質：共脂質比、および望ましいプラスミド最終濃度が得られるようにする。陽イオン性脂質：共脂質混合物は、大気温度で約１分間、渦流混合することによって、適量の水性溶媒中に混合された脂質材料の薄膜を水和させることにより適切に調製される。個別成分のクロロホルム溶液を混合することによって薄膜を調製して、望ましいモル溶質比を得た後、望ましい量の溶液を適切な容器に等分する。溶媒は、最初に乾燥した不活性ガス（例えば、アルゴン）気流を用いて蒸発させた後、高真空処理によって除去される。

他の疎水性および両親媒性添加物、例えば、ステロール、脂肪酸、ガングリオシド、糖脂質、リポペプチド、リポサッカリド、ネオビーズ、ニオソーム、プロスタグランジン、およびスフィンゴリピドも、本発明の組成物に含まれる。そのような組成物において、それらの添加物は、（総脂質に対して）約０．１モル％〜約９９．９モル％、約１〜５０モル％、または約２〜２５モル％の間の量で含まれ得る。

本発明の追加実施形態は、ポリヌクレオチドの前、後、または同時に投与される助剤を含む組成物を対象とする。本明細書では、「助剤」とは、その助剤を含むこと以外は同様の組成物に比べて、脊椎動物細胞へのポリヌクレオチドの体内進入、および／またはそのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの体内発現を増強するその能力のために、組成物に含まれる物質である。一部の助剤は、細胞へのポリヌクレオチドの進入を増強することに加えて、そのポリヌクレオチドによりコードされる免疫原に対する免疫応答を増強する。本発明の助剤は、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、または両性イオン化界面活性剤あるいは洗剤（好ましくは、非イオン性界面活性剤または洗剤）、キレート剤、ＤＮＡｓｅ阻害剤、ポロキサマー、核酸を凝集または縮合する薬剤、乳化剤または溶解剤、湿潤剤、ゲル形成剤、および緩衝剤を含む。

本発明の組成物において使用するための助剤は、非イオン性洗剤および界面活性剤ＩＧＥＰＡＬＣＡ６３００，ＮＯＮＩＤＥＴＮＰ−４０、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、Ｔｗｅｅｎ‐２０^TM、Ｔｗｅｅｎ‐８０^TM、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（平均分子量：８４００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：８０％）、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ７７（登録商標）（平均分子量：６６００、疎水性物質の概算分子量：２１００、親水性物質の概算重量％：７０％）、ＰｌｕｒｏｎｉｃＰ６５（登録商標）（平均分子量：３４００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：５０％）、ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００^TM、およびＴｒｉｔｏｎＸ‐１１４^TM、陰イオン性洗剤硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、糖スタキオース、縮合剤ＤＭＳＯ；およびキレータ／ＤＮＡｓｅ阻害剤ＥＤＴＡ、ＣＲＬ１００５（１２ｋＤａ、５％ＰＯＥ）、およびＢＡＫ（塩化ベンザルコニウム５０％溶液、ＲｕｇｅｒＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．Ｉｎｃ．から入手可能）を含むが、それらに限定されない。一部の特定実施形態において、助剤は、ＤＭＳＯ、ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（登録商標）（平均分子量：８４００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：８０％）、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ７７（登録商標）（平均分子量：６６００、疎水性物質の概算分子量：２１００、親水性物質の概算重量％：７０％）、ＰｌｕｒｏｎｉｃＰ６５（登録商標）（平均分子量：３４００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：５０％）、ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６４（登録商標）（平均分子量：２９００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：４０％）、およびＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１０８（登録商標）（平均分子量：１４６００、疎水性物質の概算分子量：３０００、親水性物質の概算重量％：８０％）である。例えば、２００２年２月１４日公開の米国特許出願公開第２００２／００１９３５８号を参照されたい。

本発明の一部組成物は、ポリヌクレオチドの前、後、または同時に１つ以上のアジュバントをさらに含み得る。「アジュバント」という用語は、（１）特定の抗原に対する免疫応答を変化または増加させる、あるいは（２）薬剤の効果を増加または補助する能力を有する任意の材料を意味する。ポリヌクレオチドワクチンに関して、「アジュバント」は、トランスフェクション促進剤であり得ることに注意する必要がある。同様に、上述のある種の「トランスフェクション促進剤」も「アジュバント」であり得る。アジュバントは、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物と併用され得る。プライムブースト療法において、本明細書に記載されるように、アジュバントは、プライミング免疫付与、ブースター免疫付与、またはその両方と併用され得る。適切なアジュバントは、サイトカインおよび成長因子、細菌成分（例えば、特定のスーパー抗原中の内毒素、外毒素、および細胞壁成分）、アルミニウムベースの塩；カルシウムベースの塩、シリカ、ポリヌクレオチド、トキソイド、血清タンパク質、ウイルスおよびウイルス由来材料、毒素、毒、イミダゾキノリン化合物、ポロキサマー、および陽イオン性脂質を含むが、それらに限定されない。

多種多様な材料が、多様な機序を通じてアジュバント活性を有することが示されている。ポリペプチドの発現、抗原性、または免疫原性を増加し得る任意の化合物は、潜在的アジュバントである。本発明は、潜在的アジュバントに対する改善した免疫応答を検査するためのアッセイを提供する。本発明に基づいて免疫応答を増強するそれらの能力を検査できる潜在的アジュバントは、ミョウバン、ベントナイト、ラテックス、およびアクリル粒子等の不活性担体、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）（ブロックコポリマーＣＲＬ‐８９４１、スクアレン（代謝可能なオイル）および微粒子シリカ安定剤）等のプルロニックブロックポリマー、フロインドアジュバント等のデポフォーマー、サポニン、リゾレシチン、レチナール、ＱｕｉｌＡ、リポソーム、およびプルロニックポリマー製剤等の界面活性材料、細菌リポポリサッカリド等のマクロファージ刺激剤、インシュリン、ザイモサン、内毒素、およびレバミゾール等の代替経路補体活性剤、およびポロキサマー、ポリ（オキシエチレン）‐ポリ（オキシプロピレン）トリ‐ブロックコポリマー等の非イオン性界面活性剤を含むが、それらに限定されない。上述のようなトランスフェクション促進材料も、アジュバントとして含まれる。

本発明に基づいて免疫応答を増強するそれらの能力を検査できるポロキサマーは、酸化プロピレンおよび酸化エチレンのブロックコポリマーであり、酸化プロピレンブロックが２つの酸化エチレンブロックに挟持される、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）界面活性剤等の市販のポロキサマーを含むが、それらに限定されない。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）界面活性剤の例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ１２１（平均分子量：４４００、疎水性物質の概算分子量：３６００、親水性物質の概算重量％：１０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ１０１（平均分子量：３８００、疎水性物質の概算分子量：３０００、親水性物質の概算重量％：１０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ８１（平均分子量：２７５０、疎水性物質の概算分子量：２４００、親水性物質の概算重量％：１０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６１（平均分子量：２０００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：１０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ３１（平均分子量：１１００、疎水性物質の概算分子量：９００、親水性物質の概算重量％：１０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ１２２（平均分子量：５０００、疎水性物質の概算分子量：３６００、親水性物質の概算重量％：２０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ９２（平均分子量：３６５０、疎水性物質の概算分子量：２７００、親水性物質の概算重量％：２０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ７２（平均分子量：２７５０、疎水性物質の概算分子量：２１００、親水性物質の概算重量％：２０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６２（平均分子量：２５００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：２０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ４２（平均分子量：１６３０、疎水性物質の概算分子量：１２００、親水性物質の概算重量％：２０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６３（平均分子量：２６５０、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：３０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ４３（平均分子量：１８５０、疎水性物質の概算分子量：１２００、親水性物質の概算重量％：３０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６４（平均分子量：２９００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：４０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ４４（平均分子量：２２００、疎水性物質の概算分子量：１２００、親水性物質の概算重量％：４０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ３５（平均分子量：１９００、疎水性物質の概算分子量：９００、親水性物質の概算重量％：５０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３（平均分子量：５７５０、疎水性物質の概算分子量：３６００、親水性物質の概算重量％：３０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１０３（平均分子量：４９５０、疎水性物質の概算分子量：３０００、親水性物質の概算重量％：３０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１０４（平均分子量：５９００、疎水性物質の概算分子量：３０００、親水性物質の概算重量％：４０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８４（平均分子量：４２００、疎水性物質の概算分子量：２４００、親水性物質の概算重量％：４０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１０５（平均分子量：６５００、疎水性物質の概算分子量：３０００、親水性物質の概算重量％：５０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８５（平均分子量：４６００、疎水性物質の概算分子量：２４００、親水性物質の概算重量％：５０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ７５（平均分子量：４１５０、疎水性物質の概算分子量：２１００、親水性物質の概算重量％：５０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ６５（平均分子量：３４００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：５０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７（平均分子量：１２６００、疎水性物質の概算分子量：３６００、親水性物質の概算重量％：７０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ９８（平均分子量：１３０００、疎水性物質の概算分子量：２７００、親水性物質の概算重量％：８０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ８７（平均分子量：７７００、疎水性物質の概算分子量：２４００、親水性物質の概算重量％：７０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ７７（平均分子量：６６００、疎水性物質の概算分子量：２１００、親水性物質の概算重量％：７０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８（平均分子量：１４６００、疎水性物質の概算分子量：３０００、親水性物質の概算重量％：８０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ９８（平均分子量：１３０００、疎水性物質の概算分子量：２７００、親水性物質の概算重量％：８０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ８８（平均分子量：１１４００、疎水性物質の概算分子量：２４００、親水性物質の概算重量％：８０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（平均分子量：８４００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：８０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ３８（平均分子量：４７００、疎水性物質の概算分子量：９００、親水性物質の概算重量％：８０％）である。

本発明に基づいて免疫応答を増強するそれらの能力を試験できる逆ポロキサマーは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ３１Ｒ１（平均分子量：３２５０、疎水性物質の概算分子量：３１００、親水性物質の概算重量％：１０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ２５Ｒ１（平均分子量：２７００、疎水性物質の概算分子量：２５００、親水性物質の概算重量％：１０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ１７Ｒ１（平均分子量：１９００、疎水性物質の概算分子量：１７００、親水性物質の概算重量％：１０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ３１Ｒ２（平均分子量：３３００、疎水性物質の概算分子量：３１００、親水性物質の概算重量％：２０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ２５Ｒ２（平均分子量：３１００、疎水性物質の概算分子量：２５００、親水性物質の概算重量％：２０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ１７Ｒ２（平均分子量：２１５０、疎水性物質の概算分子量：１７００、親水性物質の概算重量％：２０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ１２Ｒ３（平均分子量：１８００、疎水性物質の概算分子量：１２００、親水性物質の概算重量％：３０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ３１Ｒ４（平均分子量：４１５０、疎水性物質の概算分子量：３１００、親水性物質の概算重量％：４０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ２５Ｒ４（平均分子量：３６００、疎水性物質の概算分子量：２５００、親水性物質の概算重量％：４０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ２２Ｒ４（平均分子量：３３５０、疎水性物質の概算分子量：２２００、親水性物質の概算重量％：４０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ１７Ｒ４（平均分子量：３６５０、疎水性物質の概算分子量：１７００、親水性物質の概算重量％：４０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ２５Ｒ５（平均分子量：４３２０、疎水性物質の概算分子量：２５００、親水性物質の概算重量％：５０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ１０Ｒ５（平均分子量：１９５０、疎水性物質の概算分子量：１０００、親水性物質の概算重量％：５０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ２５Ｒ８（平均分子量：８５５０、疎水性物質の概算分子量：２５００、親水性物質の概算重量％：８０％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ１７Ｒ８（平均分子量：７０００、疎水性物質の概算分子量：１７００、親水性物質の概算重量％：８０％）、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｒ１０Ｒ８（平均分子量：４５５０、疎水性物質の概算分子量：１０００、親水性物質の概算重量％：８０％）を含むが、それらに限定されない。

本発明に基づいて免疫応答を増強するそれらの能力を試験できる他の市販のポロキサマーは、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ１２１（平均分子量：４４００）、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ１２２（平均分子量：５０００）、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１０４（平均分子量：５８５０）、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１０５（平均分子量：６５００）、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３（平均分子量：５７５０）、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８５（平均分子量：４６００）、およびＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ９４（平均分子量：４６００）等のポリエチレンおよびポリプロピレングリコールのブロックコポリマーである化合物を含む。ここで、Ｌは界面活性剤が液体であることを示し、Ｐはそれらがペーストであることを示し、最初の桁は界面活性剤のポリプロピレン部分の分子重量の測定値であり、数字の最後の桁に１０を掛けると、界面活性剤の酸化エチレン含有率を得る。化合物は、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）ＮＰ１０（ノニルフェノールエトキシ化界面活性剤−１０％溶液）、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）ＮＰ３０（３０モルの酸化エチレンを有する１モルのノニルフェノールの凝縮物）、およびＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）ＮＰ５（５．５モルの酸化ナフタレンを有する１モルのノニルフェノールの凝縮物）等のノニルフェニルポリエチレングリコールである。

本発明に基づいて免疫応答を増強するそれらの能力を試験できる他のポロキサマーは以下を含む。（ａ）Ａ型セグメントおよびＢ型セグメントを含むポリエーテルブロックコポリマー。ここでＡ型セグメントは、比較的親水性の線形ポリマーセグメントを含み、その反復単位は、約−０．４以下の平均Ｈａｎｓｃｈ‐Ｌｅｏ分率定数に寄与し、約３０〜約５００の分子重量寄与を有する。Ｂ型セグメントは、比較的疎水性の線形ポリマーセグメントを含み、その反復単位は、約−０．４以上の平均Ｈａｎｓｃｈ‐Ｌｅｏ分率定数に寄与し、約３０〜約５００の分子重量寄与を有する。ポリマーセグメントそれぞれの反復単位を結合するリンクの少なくとも約８０％は、エーテル結合を含む。（ｂ）ポリエーテルセグメントおよびポリカチオン性セグメントを有するブロックコポリマー。ここでポリエーテルセグメントは、少なくともＡ型ブロックを含み、ポリカチオン性セグメントは、複数の陽イオン性反復単位を含む。（ｃ）ポリマー、ポリエーテルセグメント、および化学式‐‐ＮＨ‐‐Ｒ⁰の複数の陽イオン性反復単位からなるポリカチオン性セグメントを含むポリエーテル‐ポリカチオンコポリマー。式中、Ｒ⁰は、置換され得る２〜６炭素原子の直鎖脂肪族基である。ここで、前記ポリエーテルセグメントは、Ａ型またはＢ型セグメントの少なくとも１つを含む。米国特許第５，６５６，６１１号を参照されたい。他の対象ポロキサマーは、ＣＲＬ１００５（１２ｋＤａ，５％ＰＯＥ）、ＣＲＬ８３００（１１ｋＤａ，５％ＰＯＥ）、ＣＲＬ２６９０（１２ｋＤａ，１０％ＰＯＥ）、ＣＲＬ４５０５（１５ｋＤａ，５％ＰＯＥ）およびＣＲＬ１４１５（９ｋＤａ，１０％ＰＯＥ）を含む。

本発明に基づいて免疫応答を増強するそれらの能力を試験できる他の助剤は、アカシア（アラビアゴム）、ポロキシエチレンエーテルＲ‐‐Ｏ‐‐（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_x‐‐Ｈ（ＢＲＩＪ（登録商標））、例えば、ポリエチレングリコールドデシルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）３５、ｘ＝２３）、ポリエチレングリコールドデシルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）３０、ｘ＝４）、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）５２、ｘ＝２）、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）５６、ｘ＝１０）、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）５８Ｐ、ｘ＝２０）、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）７２、ｘ＝２）、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）７６、ｘ＝１０）、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）７８Ｐ、ｘ＝２０）、ポリエチレングリコールオレイルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）９２Ｖ、ｘ＝２）、およびポリオキシル１０オレイルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）９７、ｘ＝１０）、ポリ‐Ｄ‐グルコサミン（キトサン）、クロロブタノール、コレステロール、ジエタノールアミン、ジギトニン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、グリセリルモノステアレート、ラノリンアルコール、モノ‐およびジ‐グリセリド、モノエタノールアミン、ノニルフェノールポリオキシエチレンエーテル（ＮＰ‐４０（登録商標））、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＡｍｒｅｓｃｏからのＮＯＮＩＤＥＴＮＰ‐４０）、エチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）ⁿ、ｎ＝１１（ＲｏｃｈｅからのＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０）、約９の酸化エチレン単位（ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０）を有するオクチルフェノール酸化エチレン縮合体、ＩＧＥＰＡＬＣＡ６３０（登録商標）（（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール、ＮＯＮＩＤＥＴＮＰ‐４０と構造的に同じ）、オレイン酸、オレイルアルコール、ポリエチレングリコール８０００、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル４０水素化ヒマシ油、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０、またはＴＷＥＥＮ‐２０（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸（ポリソルベート８０、またはＴＷＥＥＮ‐８０（登録商標））、プロピレングリコールジアセテート、プロピレングリコールモノステアレート、硫酸プロタミン、タンパク分解酵素、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、モノラウレートナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ソルビタン誘導体（ＳＰＡＮ（登録商標））、例えば、ソルビタンモノパルミテート（ＳＰＡＮ（登録商標）４０）、ソルビタンモノステアレート（ＳＰＡＮ（登録商標）６０）、ソルビタントリステアレート（ＳＰＡＮ（登録商標）６５）、ソルビタンモノオレエート（ＳＰＡＮ（登録商標）８０）、およびソルビタントリオレエート（ＳＰＡＮ（登録商標）８５）、２，６，１０，１５，１９，２３‐ヘキサメチル‐２，６，１０，１４，１８，２２‐テトラコサ‐ヘキサエン（スクアレン）、スタキオース、ステアリン酸、スクロース、サーファクチン（枯草菌からのリポペプチド抗生物質）、ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）９（Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標））ＭＷ５８２．９、約９〜１０の酸化エチレン単位を有するオクチルフェノール酸化エチレン縮合物（ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００^TM）、約７〜８の酸化エチレン単位を有するオクチルフェノール酸化エチレン縮合物（ＴｒｉｔｏｎＸ‐１１４^TM）、トリス（２‐ヒドロキシエチル）アミン（トロラミン）、および乳化ろうを含むが、それらに限定されない。

一部アジュバント組成物において、アジュバントはサイトカインである。本発明の組成物は、１つ以上のサイトカイン、ケモカイン、またはサイトカインおよびケモカインの生成を誘導する化合物、あるいは１つ以上のサイトカイン、ケモカイン、もしくはサイトカインおよびケモカインの生成を誘導する化合物をコードするポリヌクレオチドを含み得る。例として、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターフェロンΩ（ＩＦＮΩ）、インターフェロンτ（ＩＦＮτ）、インターフェロンγ誘導因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、ＲＡＮＴＥＳ（活性時に調節され、正常Ｔ細胞を発現し、分泌されると推定される）、マクロファージ炎症性タンパク質（例えば、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）、リーシュマニア伸長開始因子（ＬＥＩＦ）、およびＦｌｔ‐３リガンドを含むが、それらに限定されない。

本発明の一部組成物において、ポリヌクレオチド構成物は、（±）‐Ｎ‐（３‐アミノプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス（シン‐９‐テトラデセニルオキシ）‐１‐プロパナミニウムブロマイド（ＧＡＰ‐ＤＭＯＲＩＥ）を含むアジュバント組成物と複合され得る。組成物は、１つ以上の共脂質、例えば、１，２‐ジオレオイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２‐ジフィタノイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、および／または１，２‐ジミリストイル‐グリセル‐３‐ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）も含み得る。ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥおよびＤＰｙＰＥを１：１のモル比で含むアジュバント組成物は、本明細書ではＶａｘｆｅｃｔｉｎ^TMアジュバントと称される。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第００／５７９１７号を参照されたい。

他の実施形態において、ポリヌクレオチド自体は、本発明のポリヌクレオチドの全体または一部が細菌ＤＮＡから生じる場合のように、アジュバントとして機能し得る。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧ‐ＤＮＡ）のモチーフを含む細菌ＤＮＡは、パターン認識レセプタを通じて、脊椎動物における天然の免疫細胞を引き起こす（ＴＬＲ９等のトールレセプタを含む）。したがって、マクロファージ、樹状細胞、およびＢリンパ球上に潜在的な免疫刺激効果を有する。例えば、Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：６２‐６９（２００２）、Ｊｕｎｇ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：２３６８‐７３（２００２）を参照されたい。また、Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：２８７９‐８３（１９９６）も参照されたい。非メチル化ＣｐＧ‐ジヌクレオチドをアジュバントとして使用する方法は、例えば、米国特許第６，２０７，６４６号、第６，４０６，７０５号、および第６，４２９，１９９号に記載されている。

抗原に対する免疫応答を増加させるアジュバントの能力は、一般に、免疫を媒介とする保護の著しい増加によって明らかとなる。例えば、液性免疫の増加は、一般に抗原に対する抗体タイターの著しい増加によって明らかとなり、Ｔ細胞活性の増加は、一般に細胞増殖、または細胞性細胞毒性、またはサイトカイン分泌の増加によって明らかとなる。アジュバントは、例えば、主に液性またはＴｈ₂応答を主に細胞性またはＴｈ₁応答に変更することにより、免疫応答も変化させることができる。

本発明の核酸分子および／またはポリヌクレオチド、例えば、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、線形ＤＮＡ、またはオリゴヌクレオチドは、種々の緩衝液のいずれにも可溶化され得る。好適な緩衝液は、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、通常食塩水、トリス緩衝液、およびリン酸ナトリウム（例えば、１５０ｍＭリン酸ナトリウム）を含む。不溶性ポリヌクレオチドは、弱酸または弱塩基に可溶化された後、緩衝液を用いて望ましい量に希釈される。緩衝液のｐＨは、必要に応じて調節できる。さらに、医薬的に許容される添加物を使用して、適切なオスモル濃度を提供する。そのような添加物は、当業者の知識の範囲内である。体内で使用される水性組成物に対して、ピロゲンを含まない滅菌水を使用することができる。そのような製剤は、ヒトへの投与に適切な医薬的に許容される組成物を調製するように、適量の水性溶液とともに、有効量のポリヌクレオチドを含む。

本発明の組成物は、既知の方法に基づいて調剤できる。好適な調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１６版、Ａ．Ｏｓｏｌ編、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９５）において説明される。組成物は水性溶液として投与され得るが、乳液、ゲル、溶液、懸濁液、凍結乾燥形態、または当該技術分野において既知の任意の他の形態として調剤することもできる。さらに、組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、および保存剤等の医薬的に許容される添加物を含み得る。

以下の実施例は、単なる説明の目的で含まれ、本発明の範囲を限定するものではなく、当該範囲は、添付の請求項により画定される。

実施例
材料および方法
以下の材料および方法は、一般に、本明細書に開示されるすべての実施例に適用する。必要に応じて、特定の材料および方法が各実施例において開示される。
本発明の実践は、別段の指示がない限り、当該技術分野の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学（ＰＣＲを含む）、ワクチン学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来型技術を採用する。そのような技術は、文献において十分に説明される。例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ：（１９８９）、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）、ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ：４，６８３，１９５、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）、ＣｕｌｔｕｒｅＯｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）、ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓＡｎｄＥｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅＴｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、論文ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓＦｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４巻および１５５巻（Ｗｕら編）、ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓＩｎＣｅｌｌＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）を参照されたい。

遺伝子構成物
本発明の構成物は、本明細書において、また当該技術分野で提供される配列情報に基づき、以下を含むがそれらに限定されない標準分子生物学手技を利用して構成される。第１に、それぞれ８０〜９０ヌクレオチド長の系列相補オリゴヌクレオチド対および構成物の長さのスパンは、標準方法により合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニールする際、付着端を含む８０〜９０塩基対の二本鎖フラグメントを形成するように合成される。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖末端は、隣接するオリゴヌクレオチド二本鎖の一本鎖末端を用いてアニールするように設計される。この方法で調製されたいくつかの隣接するオリゴヌクレオチド対をアニールすることができ、約５〜６の隣接するオリゴヌクレオチド二本鎖フラグメントは、後に一本鎖付着端を介してともにアニールすることができる。次に、この系列のアニールされたオリゴヌクレオチド二本鎖フラグメントをともに結紮し、カリフォルニア州、ＣａｒｌｓｂａｄのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクター等の適切なプラスミドにクローン化する。次に、構成物を標準方法により配列決定する。この方法で調製された構成物は、ともに結紮された５〜６の隣接する８０〜９０塩基対フラグメント、すなわち、約５００塩基対のフラグメントを含み、構成物の望ましい配列全体が一連のプラスミド構成物において表されるように調製される。次に、これらのプラスミドの挿入部分を適切な制限酵素で切断し、ともに結紮して最終構成物を形成する。次に、最終構成物を標準細菌クローニングベクターにクローン化し、配列決定する。本明細書において参照されるオリゴヌクレオチドおよびプライマーは、本明細書および当該技術分野において提供される配列情報に基づいて、当業者により容易に設計され得る。またそれらは、例えば、カリフォルニア州、ＳａｎＤｉｅｇｏのＲｅｔｒｏｇｅｎ、およびドイツ、ＲｅｇｅｎｓｂｕｒｇｎｏＧＥＮＥＡＲＴ等の多数の商業的ヌクレオチドプロバイダのいずれかにより合成され得る。

プラスミドベクター
本発明の構成物は、例えば、真核発現ベクターＶＲ１０１２またはＶＲ１０５５１に挿入され得る。これらのベクターは、修飾されたｐＵＣ１８バックグラウンド上に構築され（Ｙａｎｉｓｃｈ‐Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．ら、Ｇｅｎｅ３３：１０３‐１１９（１９８５）を参照されたい）、カナマイシン耐性遺伝子、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモータ／エンハンサおよびイントロンＡ、ウシ成長ホルモン転写終結シグナル、ならびに外来遺伝子を挿入するためのポリリンカーを含む。Ｈａｒｔｉｋｋａ，Ｊ．ら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：１２０５‐１２１７（１９９６）を参照されたい。しかしながら、他の市販の標準真核発現ベクターを本発明において使用してもよく、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ‐ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５‐Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、ならびにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）を含むが、それらに限定されない。

ＶＲ１０５５１と称される最適化バックボーンプラスミドは、上述のＶＲ１０１２バックボーンからのマイナーチェンジを有する。ＶＲ１０５５１ベクターはＶＲ１０１２に由来し、ｈＣＭＶ−ＩＥイントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ−ＩＥ）遺伝子エンハンサ／プロモータおよび５’未翻訳領域（ＵＴＲ）を使用するという点において類似する。ＶＲ１０１２からＶＲ１０５５１への変更は、複数のクローニング部位に対する一部の修飾を含み、修飾されたウサギβグロビン３’未翻訳領域／ポリアデニル化シグナル配列／転写ターミネータは、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する同一の機能領域の代わりに用いられている。

プラスミドＤＮＡの精製
プラスミドＤＮＡは、適切な大腸菌株（ＤＨ５α株を含むが、それらに限定されない）適格細胞に変換することができ、高度に精製された共有結合環状プラスミドＤＮＡは、修飾された溶解手順（Ｈｏｒｎ，Ｎ．Ａ．ら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６：５６５‐５７３（１９９５））、続いて標準二重ＣｓＣｌ‐エチジウムブロマイド勾配超遠心（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））により単離した。代替として、プラスミドＤＮＡは、キットの説明書に従い、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）から入手したＧｉｇａカラムを用いて精製する。ゲル分析およびビシンコニンタンパク質分析（イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．）に基づくと、すべてのプラスミド製剤は、検出可能なクロモソームＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質不純物を含まなかった。血球抽出物（ＬｉｍｕｌｕｓＡｍｅｂｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅ）分析（ＬＡＬ，ＡｓｓｏｃｉａｔｓｏｆＣａｐｅＣｏｄ，Ｆａｌｍｏｕｔｈ，Ｍａｓｓ．）を使用して、内毒素レベルを測定したところ、プラスミドＤＮＡの０．６内毒素単位／ｍｇ未満であった。ＤＮＡ溶液の分光光度Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀比は、通常１．８より高い。プラスミドは、エタノールで沈殿され、適切な溶液、例えば、１５０ｍＭリン酸ナトリウム中に再懸濁された（他の適切な賦形剤および助剤については、２００２年２月１４日公開の米国特許出願公開第２００２／００１９３５８号を参照されたい）。ＤＮＡは、使用するまで−２０℃で保管した。ＤＮＡは、それを３００ｍＭ食塩水と混合し、適量のＵＳＰ水を添加することにより希釈して、望ましいモル濃度の望ましい塩で１ｍｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡを得た。

哺乳動物細胞株におけるプラスミド発現
発現プラスミドは、十分に特徴付けられたマウスメラノーマ細胞株（ＶＭ‐９２、ＵＭ‐４４９としても知られる）にプラスミドをトランスフェクトすることにより、体外で分析される。例えば、Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｕｋｈｕ，Ｌ．，Ｙａｎｇ，Ｇ．，Ｔｓａｉ，Ｙ．，Ｂｕｓｔａｍｅｎｔｅ，Ｃ．，Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｎｏｒｍａｎ，ＪおよびＭａｎｔｈｏｒｐｅ，Ｍ．“ＣｏｎｖｅｒｔｉｎｇａｎＡｌｃｏｈｏｌｔｏａｎＡｍｉｎｅｉｎａＣａｔｉｏｎｉｃＬｉｐｉｄＤｒａｍａｔｉｃａｌｌｙＡｌｔｅｒｓｔｈｅＣｏ‐ｌｉｐｉｄＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ，ＣｅｌｌｕｌａｒＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＡｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｅＵｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＤＮＡ‐ＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎＣｏｍｐｌｅｘｅｓ，”Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２８０：１‐１１（１９９６）を参照されたい。他の十分に特徴付けられたヒト細胞株、例えば、ＭＲＣ−５細胞、ＡＴＣＣ受入番号ＣＣＬ−１７１またはヒト横紋筋肉腫細胞株ＲＤ（ＡＴＣＣＣＣＬ−１３６）を使用することもできる。トランスフェクションは、当業者によく知られた陽イオン性脂質ベースのトランスフェクション手順を使用して実施する。他のトランスフェクション手順は、当該技術分野においてよく知られ、例えば、電気穿孔および塩化カルシウムの媒介によるトランスフェクションを使用することができる（ＧｒａｈａｍＦ．Ｌ．およびＡ．Ｊ．ｖａｎｄｅｒＥｂＶｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６‐６７（１９７３））。トランスフェクションの後、トランスフェクトされた細胞の、細胞溶解物、および培養上清を評価して、単純ヘルペスウイルス抗原タンパク質の発現の相対レベルを比較する。ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡにより、市販のポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体（例えば、ニュージャージー州、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＩｎｃ．）を使用して標本を試験し、発現した抗原の質と量の両方を比較する。

単一の単純ヘルペスウイルスタンパク質をコードするプラスミドに加えて、２つ以上の単純ヘルペスウイルスコーディング領域を含む単一のプラスミドを、標準方法に従って構成する。例えば、２つ以上の単純ヘルペスウイルスコーディング領域が、真核細胞において単一の転写物として転写されるポリシストロン性構成物は、種々のコーディング領域をＩＲＥＳ配列で分離することにより構成され得る。代替として、２つ以上のコーディング領域は、それぞれ独自のプロモータ配列とともに、単一プラスミドに挿入され得る。

コドン最適化アルゴリズム
以下は、単純ヘルペス抗原のヒトコドン最適化配列を得るために使用されるアルゴリズムの概要である。
逆翻訳
アミノ酸配列から開始し、（ａ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／から入手するヒトコドン使用頻度表を使用し、手作業で逆翻訳することができる。
ホモサピエンス［ｇｂｐｒｉ］：５５１９４ＣＤＳ’ｓ（２４２９８０７２コドン）
フィールド：［トリプレット］［頻度：／１０００］（［数］）

＊コーディングＧＣ５２．４５％先頭文字ＧＣ５６．０４％第２の文字ＧＣ４２．３７％第３の文字ＧＣ５８．９３％（２００３年１１月６日現在の表）
または（ｂ）ｗｗｗ．ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｓ．ｃｏｍにログオンして、以下のように逆翻訳ツールを使用する。
（１）Ｐｒｏｔｅｉｎ（タンパク質）タブ下で、アミノ酸配列を貼り付ける。
（２）ｄｏｗｎｌｏａｄｃｏｄｏｎｕｓａｇｅ（コドン使用をダウンロード）タブ下で、ホモサピエンスをハイライト表示した後、ＣＵＴをダウンロードする。

（２００３年１１月６日現在の表）
（３）Ａｐｐｌｙ（適用）ボタンを押す。
（４）Ｏｐｔｉｍｉｚｅ（最適化）タブ下で、Ｇｅｎｅｒａｌ（全般）タブを開く。
（５）ｕｓｅｏｎｌｙｍｏｓｔｆｒｅｑｕｅｎｔｃｏｄｏｎ（最も頻出するコドンのみを使用）ボックスをチェックする。
（６）Ａｐｐｌｙ（適用）ボタンを押す。
（７）Ｏｐｔｉｍｉｚｅ（最適化）タブ下で、Ｍｏｔｉｆ（モチーフ）タブを開く。
（８）望ましいクローニング制限部位を不良なモチーフにロードする。任意の望ましくない配列、例えば、ＰｒｉｂｎｏｗＢｏｘ配列（TＡＴＡＡ）、Ｃｈｉ配列（ＧＣＴＧＧＣＧＧ）、および制限部位を不良なモチーフにロードする。
（９）Ｏｕｔｐｕｔ（出力）タブ下で、Ｓｔａｒｔ（スタート）ボックスをクリックする。出力は、配列、モチーフ検索結果（Ｒｅｐｏｒｔ（レポート）タブ下）、およびコドン使用レポートを含む。

プログラムは、システインプロリン等のアミノ酸、およびアルギニンなどの最も頻出するコドンを必ずしも使用するとは限らなかった。これを変更するには、ＥｄｉｔＣＵＴ（ＣＵＴを編集）タブに戻り、虹色の表示棒を望ましいコドンに対して、１００％に手動でドラッグする。その後、Ｏｕｔｐｕｔ（出力）タブ下でやり直しスタートする。
ＣＧＧをアルギニンについて使用すると、ＧＣ含有が極めて高くなり得るため、代替としてＡＧＡをアルギニンに対して使用することができる。コドン使用の差は、ＣＧＧの１１．６／１０００に対し、ＡＧＡの１１．５／１０００である。

スプライスドナーおよびアクセプタ部位の検索
（１）ＢｅｒｋｅｌｅｙＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｇ＿ｔｏｏｌｓ／ｓｐｉｃｅ．ｈｔｍｌ／）にログオンする。
（２）ヒトまたはその他および両方のスプライス部位のボックスをチェックする。
（３）５’および３’スプライス部位の最小スコアを０〜１の間で選択する。
０．４のデフォルト設定を使用した。
デフォルト最小スコアは０．４である。

認識された
スプライス部位％偽検出％
ヒト５’スプライス部位９３．２％５．２％
ヒト３’スプライス部位８３．８％３．１％

（４）配列に貼り付ける。
（５）提出する。
（６）予測されるドナーまたはアクセプタに基づいて、部位が予測されなくなるまで個別のコドンを変更する。
５’および３’配列に追加する。
遺伝子配列の５’末端上で、制限酵素部位およびＫｏｚａｋ配列（ｇｃｃａｃｃ）をＡＴＧの前に追加した。配列の３’末端上で、終止コドンに続いてｔｃａを追加し（逆鎖上ではｔｇａ）、次に制限酵素部位を追加した。続いて、ＳＥＣＣｅｎｔｒａｌにおいてＧＣ含有およびオープンリーディングフレームをチェックした。

ワクチン製剤の調製
ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２をコードするコドン最適化および非コドン最適化コーディング領域、または代替として、種々の単純ヘルペスウイルスタンパク質、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を、単独で、またはＨＢｃＡｇ等の担体タンパク質との融合としてコードする（コドン最適化または非コドン最適化）コーディング領域を含むプラスミド構成物、および空ベクター等の種々の対照は、ポロキサマーＣＲＬ１００５およびＢＡＫ（塩化ベンザルコニウム５０％溶液、ＲｕｇｅｒＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．Ｉｎｃ．から入手可能）を用いて、以下の方法により調剤される。製剤の各成分の具体的な最終濃度は、以下の方法で説明されるが、これらの方法のいずれの場合も、各成分の濃度は、最終溶液が望ましい濃度を有するように、当業者に知られる基本的化学量論計算により変えることができる。

例えば、ＣＲＬ１００５の濃度を、例えば、トランスフェクション効率、発現効率、または免疫原性に基づいて調節し、最終濃度約１ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌの間、例えば、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約６．５ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約７．５ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約９ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、約３５ｍｇ／ｍｌ、約４０ｍｇ／ｍｌ、約４５ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約５５ｍｇ／ｍｌ、約６０ｍｇ／ｍｌ、約６５ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ、または約７５ｍｇ／ｍｌのＣＲＬ１００５を得る。

同様に、ＤＮＡの濃度は、送達される製剤の量、対象の年齢および体重、送達方法および経路、ならびに送達される抗原の免疫原性を含む多数の因子に基づいて調節される。一般に、本発明の製剤は、最終濃度約１ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌのプラスミド（または他のポリヌクレオチド）を有するように調節される。例えば、本発明の製剤は、最終濃度約１ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約２．５、約３ｍｇ／ｍｌ、約３．５、約４ｍｇ／ｍｌ、約４．５、約５ｍｇ／ｍｌ、約５．５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約９ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、または約３０ｍｇ／ｍｌのプラスミドを有し得る。

本発明の一部の製剤は、例えば、単純ヘルペスウイルスタンパク質ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２をコードするコーディング領域、ならびに任意で、サイトカイン等の免疫増強タンパク質をコードするプラスミドを含む、本発明のプラスミドのカクテルを含む。カクテルに望ましい種々のプラスミドは、他の成分に添加する前に、ＰＢＳまたは他の希釈剤中でともに混合される。さらに、プラスミドは、カクテル中に均等な割合で存在し得る。または、例えば、抗原の相対発現レベルあるいはコードされた抗原の相対免疫原性に基づいて、割合を調節してもよい。したがって、カクテル中の種々のプラスミドは、均等な割合で存在し得る。または、１つのプラスミドは、カクテル中の他のプラスミドに対して最大２倍あるいは３倍含まれえる。

さらに、ＢＡＫの濃度は、例えば、望ましい粒子サイズおよび改善された安定性に基づいて調節され得る。実際に、一部の実施形態において、本発明の製剤は、ＣＲＬ１００５およびＤＮＡを含むが、ＢＡＫは含まない。一般に、本発明のＢＡＫ含有製剤は、最終濃度約０．０５ｍＭ〜約０．５ｍＭのＢＡＫを有するように調節される。例えば、本発明の製剤は、最終濃度約０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、または０．５ｍＭのＢＡＫを有し得る。

以下の方法により産生される製剤の総量は、比例サイズの機器を選択することにより、スケールアップまたはスケールダウンされ得る。最後に、以下に記載の方法のいずれかを実施する際、製剤の３つの構成要素であるＢＡＫ、ＣＲＬ１００５、およびプラスミドＤＮＡは、任意の順序で添加され得る。以下に記載の方法のそれぞれにおいて、「曇り点」という用語は、温度変化または透明な溶液が濁る、すなわち、溶液中に溶解した成分が溶液から凝結し始める他の滴定における点を意味する。

予混合製剤の熱サイクル
この実施例は、０．３ｍＭＢＡＫ、７．５ｍｇ／ｍｌＣＲＬ１００５、および５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを総量３．６ｍｌに含む製剤の調製について説明する。材料をともに曇り点より低い温度で混合した後、製剤を室温（曇り点より上）に数回熱サイクル処理する。
ＢＡＫの１．２８ｍＭ溶液をＰＢＳ中で調製し、８４６μｌの溶液を磁気撹拌棒が取り付けられた１５ｍｌの丸底フラスコに入れて、撹拌棒／ホットプレート（ホットプレートはオフ）の上の氷浴中で１０分間、適度な速度で撹拌する。次に、１００μｌ容積式ピペットを使用してＣＲＬ１００５（２７μｌ）を添加し、溶液をさらに６０分間、氷上で撹拌する。コドン最適化コーディング領域を含むプラスミド、および任意で、コドン最適化または非コドン最適化コーディング領域を含む追加プラスミド、例えば、単純ヘルペスウイルスタンパク質、および／またはサイトカイン等の他のタンパク質をともに望ましい割合でＰＢＳにおいて混合し、合計６．４ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを得た。このプラスミドカクテルを、５ｍｌピペットを使用し、１分以上かけて撹拌溶液にゆっくり滴下添加する。溶液は、ポロキサマーの曇り点より低いため、この時点（氷上）で透明であり、氷上で１５分間さらに撹拌する。その後、氷浴を除去して溶液を大気温度で１５分間撹拌し、ポロキサマーが曇り点を通過すると曇った溶液を産生する。

次に、フラスコを氷浴中に戻してさらに１５分間撹拌し、混合液をポロキサマー曇り点より下に冷却して透明な溶液を産生する。氷浴を再度除去し、大気温度でさらに１５分間、溶液を撹拌する。曇り点より上および下で１５分間（合計３０分間）撹拌することを１熱サイクルと定義する。混合液を６回以上サイクルにかける。結果として生じる製剤をすぐに使用するか、またはガラスバイアルに入れて曇り点より下に冷却し、後の使用のため、−８０℃に凍結する。

動物免疫付与
本明細書に記載のコドン最適化されたポリヌクレオチドによりコードされる種々の単純ヘルペスウイルス発現生成物の免疫原性を、各プラスミドが免疫応答を体内で生じる能力に基づいて最初に評価する。単一の構成物および複数の構成物を注入することにより、プラスミドを個別に、および混合で試験する。免疫付与は、最初に動物、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長類、または他の適切な動物において、筋肉内（ＩＭ）あるいは皮内（ＩＤ）注射により行う。免疫付与された動物から血清を収集し、標準手順に従って、タンパク質‐免疫付与された対象抗体‐抗種抗体型分析において、精製された固定化抗原タンパク質を使用し、抗原特異的抗体応答をＥＬＩＳＡ分析により定量する。免疫原性の試験は、抗体タイターの測定、抗体タイターの中和、Ｔ細胞増殖、サイトカインのＴ細胞分泌、細胞傷害性Ｔ細胞応答、および抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の直接計数をさらに含む。当業者によく知られる方法に従って、ヒトにおける免疫応答の保護レベルと関連付ける。

ＤＮＡ製剤
プラスミドＤＮＡは、ポロキサマーを用いて調剤する。代替として、プラスミドＤＮＡを調製し、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解し、ＤＮＡ：脂質質量比が４：１のＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ等のトランスフェクション促進陽イオン性脂質を含むか、または含まない。代替ＤＮＡ製剤は、ＰＢＳの代わりに、１５０ｍＭリン酸ナトリウム、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TM等のアジュバントを４：１のＤＮＡ：Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TM質量比で、Ｓ．Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入手したモノホスホリル脂質Ａ（解毒された内毒素）（ＭＰＬ）、および２％オイル（スクアレン）‐Ｔｗｅｅｎ８０‐水（ＭＰＬ＋ＴＤＭ、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から入手可能（カタログ＃Ｍ６５３６））中のトレハロースジコリノマイコレートＡＦ（ＴＤＭ）、可溶性モノホスホリル脂質Ａ製剤（ＡＦ、Ｃｏｒｉｘａから入手可能）、あるいは（±）‐Ｎ‐（３‐アセトキシプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス（オクチルオキシ）‐１‐塩化プロパナミニウム（化合物＃ＶＣ１２４０）を含む（Ｓｈｒｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ４１５：３３１‐３３５（２００２）、およびＰ．Ｃ．Ｔ．公開ＷＯ第０２／００８４４Ａ２号を参照されたい）。

動物免疫付与
ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２をコードするコドン最適化および非コドン最適化コーディング領域、または代替として、種々の単純ヘルペスウイルスタンパク質、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を、単独で、またはＨＢｃＡｇ等の担体タンパク質との融合としてコードする（コドン最適化または非コドン最適化）コーディング領域を含むプラスミド構成物、および空ベクター等の種々の対照を、単一プラスミドとして、または２つ以上のプラスミドのカクテルとして、ＰＢＳ中のＤＮＡ、またはポロキサマーベースの送達系：２ｍｇ／ｍｌＤＮＡ、３ｍｇ／ｍｌＣＲＬ１００５、および０．１ｍＭＢＡＫで調剤されるものとしてＢＡＬＢ／ｃマウスに注入する。１０匹のマウス群を、２週間間隔で３回免疫付与し、血清を採取して抗原のそれぞれに対する抗体タイターを決定する。３つのプラスミド構成物のそれぞれを等しい質量で含む、三価製剤によりマウスを免疫付与する群も含まれる。

免疫付与スケジュールは、以下のとおりである。
３日目前採血
０日目プラスミド注入、筋肉内、大腿直筋両側、５〜５０μｇ／ｌｅｇ
２１日目プラスミド注入、筋肉内、大腿直筋両側、５〜５０μｇ／ｌｅｇ
４９日目プラスミド注入、筋肉内、大腿直筋両側、５〜５０μｇ／ｌｅｇ
５９日目血清採取

ＥＬＩＳＡにより、組み換えタンパク質、ペプチド、またはトランスフェクション上清、およびトランスフェクトされたＶＭ‐９２細胞の生、不活性、または溶解ウイルスから得た溶解物を用いて、血清抗体タイターを決定する。

Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ ^TM アジュバントを使用する、ワクチン製剤によるマウスの免疫付与
Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMアジュバント（１：１モル比の陽イオン性脂質ＶＣ１０５２および中性共脂質ＤＰｙＰＥ）は、ＤＮＡをマウスに筋肉内投与すると、対抗して抗体タイターを増強する合成陽イオン性脂質製剤である。

Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TM混合物は、ＶＣ１０５２陽イオン性脂質のクロロホルム溶液をＤｐｙＰＥ中性共脂質のクロロホルム溶液と混合することにより調製する。乾燥膜は、２ｍｌ滅菌ガラスバイアル中で、クロロホルムを窒素気流下で蒸発させ、バイアルを真空下に一晩放置して溶媒の痕跡を除去することにより調製する。各バイアルは、それぞれ１．５μモルのＶＣ１０５２およびＤＰｙＰＥを含む。リポソームは、滅菌水を添加した後、ボルテックスすることにより調製する。結果として生じるリポソーム溶液を、４：１のリン酸モル：陽イオン性脂質モル比でＤＮＡと混合する。

ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２をコードするコドン最適化および非コドン最適化コーディング領域、または代替として、種々の単純ヘルペスウイルスタンパク質、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を、単独で、またはＨＢｃＡｇ等の担体タンパク質との融合としてコードする（コドン最適化または非コドン最適化）コーディング領域を含むプラスミド構成物、および空ベクター等の種々の対照を、ＰＢＳ中望ましい比率で混合して、最終濃度１．０ｍｇ／ｍｌを得る。プラスミドカクテルおよび対照は、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMを用いて調剤する。１日目および２１日目ならびに４９日目に、各製剤を用いて、５匹のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの各群に、５０μｌのＤＮＡ溶液（１匹のマウスにつき合計１００μｌ）を大腿直筋内に両側注入する。０日目（前採血）、２０日目（採血１）、および４１日目（採血２）ならびに６２日目（採血３）、また注入後最大４０週目にマウスを採血して血清を得る。プラスミドＤＮＡによりコードされる種々の単純ヘルペスタンパク質に対する抗体タイターを、ＥＬＩＳＡにより測定する。

細胞毒性Ｔ細胞応答は、Ｈａｒｔｉｋｋａら、“ＶａｘｆｅｃｔｉｎＥｎｈａｎｃｅｓｔｈｅＨｕｍｏｒａｌＲｅｓｐｏｎｓｅｔｏＰｌａｓｍｉｄＤＮＡ‐ｅｎｃｏｄｅｄＡｎｔｉｇｅｎｓ，”Ｖａｃｃｉｎｅ１９：１９１１‐１９２３（２００１）に記載のように測定する。標準ＥＬＩＳＰＯＴ手技は、ＣＤ４+およびＣＤ８+ Ｔ細胞分析に使用する。

動物における抗血清の産生
ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２をコードするコドン最適化および非コドン最適化コーディング領域、または代替として、種々の単純ヘルペスウイルスタンパク質、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を、単独で、またはＨＢｃＡｇ等の担体タンパク質との融合としてコードする（コドン最適化または非コドン最適化）コーディング領域を含むプラスミド構成物、および空ベクター等の種々の対照は、上述の免疫付与スキームに従って調製し、適切な動物に注入して、ポリクローナル抗体を生成する。血清を収集し、上記のように抗体を力価する。

モノクローナル抗体も、ハイブリドーマ技術を使用して産生される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）、Ｋｏｈｌｅｒ，ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴ‐ＣｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８１），ｐｐ．５６３‐６８１）。一般に、そのような手順は、上述のように動物（好ましくはマウス）を免疫付与するステップを含む。そのようなマウスの脾細胞を摘出し、適切な骨髄腫細胞株と融合する。任意の適切な骨髄腫細胞株を本発明に従って採用することができるが、メリーランド州、ＲｏｃｋｖｉｌｌｅのＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２０）を採用することが好ましい。融合後、結果として生じるハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地中で選択的に維持し、Ｗａｎｄｓら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ８０：２２５‐２３２（１９８１）により説明されるように希釈を制限することによりクローン化する。この文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。そのような選択を通じて得られるハイブリドーマ細胞を次に分析して、種々の単純ヘルペスウイルスタンパク質を結合できる抗体を分泌するクローンを同定する。

代替として、本明細書に記載の単純ヘルペスウイルスタンパク質に結合できる追加の抗体は、抗イディオタイプ抗体の使用を通しての２段階手順において産生され得る。そのような方法は、抗体はそれら自体が抗原であり、したがって、第２の抗体に結合する抗体を得ることができるという事実を利用する。この方法に従って、種々の単純ヘルペスウイルスに特異的な抗体を使用し、動物、好ましくはマウスを免疫付与する。そのような動物の脾細胞を次に使用して、ハイブリドーマ細胞を産生し、ハイブリドーマ細胞を検査して、単純ヘルペスウイルスタンパク質特異的抗体に結合する能力が同族の単純ヘルペスウイルスタンパク質によりブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定する。そのような抗体は、単純ヘルペスウイルスタンパク質に特異的な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、動物の免疫付与に使用して、さらなる単純ヘルペスウイルス特異的抗体の形成を誘起することができる。

本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂ならびに他のフラグメントを使用してもよいことが理解されるであろう。そのようなフラグメントは、通常（Ｆａｂフラグメントを産生するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを産生するための）ペプシン等の酵素を使用して、タンパク分解的切断により産生される。代替として、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２結合フラグメントは、組み換えＤＮＡ手技の適用、または合成化学により産生できる。

「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましい場合がある。そのような抗体は、上述のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝構成物を使用して産生することができる。キメラ抗体を産生するための方法は、当該技術分野において知られている。再検討するために、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２（１９８５）、Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４（１９８６）、Ｃａｂｉｌｌｙら、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ１７１４９６、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ１７３４９４、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ８６０１５３３、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ８７０２６７１、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６４３（１９８４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３１４：２６８（１９８５）を参照されたい。

これらの抗体は、例えば、診断分析において、研究試薬として使用し、動物を検査してワクチンの有効性を同定するか、または動物をさらに免疫付与して単純ヘルペスウイルスに特異的な抗イディオタイプ抗体を生成する。抗単純ヘルペスウイルス抗体の使用に関する非限定例は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（競合、サンドウィッチ、および直接）、免疫蛍光法、免疫電子顕微鏡法、放射免疫測定、免疫沈降、凝集分析、免疫拡散、免疫電気泳動、およびエピトープマッピング（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｅｄ．ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第４版、Ｉ巻およびＩＩ巻，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８６））における使用を含む。

粘膜ワクチン接種および電気補助プラスミド送達
粘膜ＤＮＡワクチン接種
ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２をコードするコドン最適化および非コドン最適化コーディング領域、または代替として、種々の単純ヘルペスウイルスタンパク質、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を、単独で、またはＨＢｃＡｇ等の担体タンパク質との融合としてコードする（コドン最適化または非コドン最適化）コーディング領域を含むプラスミド構成物、および空ベクター等の種々の対照（１００μｇ／５０μｌ総ＤＮＡ）を、０週目、２週目および４週目に、筋肉内（ｉ．ｍ．）、鼻腔内（ｉ．ｎ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、膣内（ｉ．ｖａｇ．）、直腸内（ｉ．ｒ．）、または経口ルートでＢＡＬＢ／ｃマウスに送達する。ＤＮＡは、未調剤であるか、または陽イオン性脂質ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ（ＤＤ）あるいはＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ／ＤＯＰＥ（ＧＤ）で調剤して送達する。エンドポイントとして、種々の単純ヘルペスウイルス抗原に対する血清ＩｇＧタイターをＥＬＩＳＡにより測定し、ＥＬＩＳＰＯＴ分析におけるＩＦＮ‐γおよびＩＬ−４の抗原特異的産生により脾臓Ｔ細胞応答を測定する。標準クロミウム放出分析を使用して、種々の単純ヘルペスウイルス抗原に対し、特異的細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を測定する。四量体分析を使用し、立証済みの定量化および細胞内サイトカイン染色により達成される発現型特徴付けを用いて、抗原特異的Ｔ細胞を検出および定量する。さらに、膣洗浄のＥＬＩＳＡにより、種々の単純ヘルペスウイルス抗原に対するＩｇＧおよびＩｇＡ応答を解析する。

電気補助プラスミド送達
体内遺伝子送達は、注入された組織に対する短い電気パルスの適用により増強することができ、その手順は、本明細書において電気補助プラスミド送達（ＥＡＰＤ）と称される。例えば、Ａｉｈａｒａ，Ｈ．およびＭｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：８６７‐７０（１９９８）、Ｍｉｒ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：４２６２‐６７（１９９９）、Ｈａｒｔｉｋｋａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：４０７‐１５（２００１）、およびＭｉｒ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｒｉｚｚｕｔｏ，Ｇ．ら、ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ１１：１８９１‐９００（２０００）、Ｗｉｄｅｒａ，Ｇ．ら、Ｊ．ｏｆＩｍｍｕｎｏ．１６４：４６３５‐４６４０（２０００）を参照されたい。細胞電気的透過性のための電気パルスの使用は、外来ＤＮＡを原核および真核細胞に体外導入するために用いられている。細胞透過性は、細胞生存に適合する電極および最適電気的パラメータを使用して、局所的に体内で得ることも可能である。

電気穿孔手順は、種々の電気穿孔装置を用いて行うことができる。これらの装置は、外部プレート型電極または侵襲性針／ロッド電極を含み、アレイに配置された２つの電極または複数の電極を有し得る。プレートまたは針電極間の距離は、電極の数、標的領域の面積、および治療対象により異なり得る。

ＴｒｉＧｒｉｄ針アレイは、最適形状である幾何学的三角形の３つの細長い電極を含む、３つの電極アレイである。針アレイは、種々のアレイ形成で配置された１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の針を含み得る。電極は、導電ケーブルを通じて、電源に接続される高電圧切り替え装置に接続される。

電極アレイは、核酸注入部位周辺の筋肉組織に、約３ｍｍ〜３ｃｍの深さで配置される。挿入の深さは、標的組織および電気穿孔を受ける患者の大きさによって異なる。プラスミドＤＮＡ等の外来核酸を注入し、核酸の分散に十分な時間が経過した後、方形波電気パルスを組織に適用する。各パルスの振幅は、電極間の間隔に基づいて、約１００ボルト〜約１５００ボルト、例えば、約１００ボルト、約２００ボルト、約３００ボルト、約４００ボルト、約５００ボルト、約６００ボルト、約７００ボルト、約８００ボルト、約９００ボルト、約１０００ボルト、約１１００ボルト、約１２００ボルト、約１３００ボルト、約１４００ボルト、または約１５００ボルト、あるいは約１〜１．５ｋＶ／ｃｍの範囲である。各パルスは、約１μｓ〜約１０００μｓ、例えば、約１μｓ、約１０μｓ、約５０μｓ、約１００μｓ、約２００μｓ、約３００μｓ、約４００μｓ、約５００μｓ、約６００μｓ、約７００μｓ、約８００μｓ、約９００μｓ、または約１０００μｓの持続時間および約１〜１０Ｈｚのパルス周波数を有する。パルスの極性は、パルス生成器とのコネクタを切り換えることにより、電気穿孔中に逆転させることができる。パルスは、複数回反復する。電気穿孔パラメータ（例えば、電圧振幅、パルスの持続時間、パルスの数、電極挿入の深さおよび周波数）は、当業者に理解されるように、標的組織型、使用される電極の数、および電極間隔の距離によって異なる。

パルスレジメンの完了直後に、電気穿孔を受ける対象を、任意で、膜安定剤で処理し、電気穿孔の結果としての細胞膜透過性を長引かせることができる。膜安定剤の例は、ステロイド（例えば、デキサメタゾン、メチルプレドニゾン、およびプロゲステロン）、アンジオテンシンＩＩおよびビタミンＥを含むが、それらに限定されない。単一用量のデキサメタゾン、体重１ｋｇにつき約０．１ｍｇが有益な効果を得るために十分なはずである。

電気穿孔等のＥＡＰＤ手技は、リポソーム製剤に含まれるプラスミドに使用することもできる。リポソーム‐プラスミド懸濁液を動物または患者に投与し、例えば、ＴｒｉＧｒｉｄ針アレイにより生成された安全かつ効果的な電場により注入部位を処理する。電気穿孔は、リポソーム二重層を不安定化することにより、細胞へのプラスミド送達を補助することができ、リポソームと標的細胞構造との間の膜融合が生じるようにする。電気穿孔は、プラスミドの放出を誘起することにより、高濃度で、標的細胞の表面におけるリポソームから細胞へのプラスミド送達を補助することもでき、電気穿孔の結果として、細胞膜内に形成される孔を介して、濃度勾配により細胞膜全体でプラスミドが駆動されるようにする。

非ヒト霊長類における治療タンパク質発現に対する電気穿孔の効果を試験するため、雄または雌のアカゲザルに、ｇＤ、ＶＰ１１／１２、ＶＰ１３／１４、および／またはＶＰ２２をコードするコドン最適化および非コドン最適化コーディング領域、または代替として、種々の単純ヘルペスタンパク質、あるいはそれらのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を、単独で、またはＨＢｃＡｇ等の担体タンパク質との融合としてコードする（コドン最適化または非コドン最適化）コーディング領域を含むプラスミド構成物、および空ベクター等の種々の対照（動物につき合計０．１〜１０ｍｇＤＮＡ）を２または６回、筋肉内注入する。標的筋肉群は、両側大腿直筋、頭蓋脛骨筋、二頭筋、腓腹筋または三角筋を含むが、それらに限定されない。標的領域を削り、０．５〜１．５ｃｍの間隔で４〜１０の間の電極を含む針アレイを標的筋肉に埋め込む。注入が完了すると、一連の短い電気パルスを、ＩｃｈｏｒＴＧＰ‐２パルス生成器を使用して、標的筋肉に埋め込まれた電極に適用する。パルスは、約１２０〜２００Ｖの振幅を有する。パルスシーケンスは、１秒以内に完了する。この時間中、標的筋肉は短い収縮または痙攣を起こし得る。注入および電気穿孔は、反復してもよい。

種々の時点において、ワクチン接種したサルから血清を収集する。エンドポイントとして、種々の単純ヘルペスウイルス抗原に対する血清ＩｇＧタイターをＥＬＩＳＡにより測定し、ＰＢＭＣＴ細胞の増殖を、ＥＬＩＳＰＯＴ分析または四量体分析によりＩＦＮ‐γおよびＩＬ−４の抗原特異的産生により測定して、立証済みの定量化および細胞内サイトカイン染色により達成される発現型特徴付けを用いて、抗原特異的なＴ細胞を検出および定量する。標準クロミウム放出発生を使用して、種々のＴＶ抗原に対する特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を測定する。

ワクチン構成物および評価
ＵＬ４６、４７、および４９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一次陰部感染から単離された７〜８のＨＳＶ‐２株をＰＣＲで増幅し、配列決定した。このコンセンサスをワクチン設計に使用した。
プラスミドは、合成、全長、コドン最適化ＵＬ４６、ＵＬ４７、またはＵＬ４９ＤＮＡをバックボーンプラスミドＶＲ１０１２にクローニングすることにより構成した。

コドン最適化ＵＬ４６、４７、および４９構成物を、Ｃｏｓ‐７細胞を異なる個別の構成物およびＨＬＡＡ^*０２０１、Ａ^*０１０１、またはＢ^*０７０２をコードする全長ｃＤＮＡと共トランスフェクトすることにより、全長野生型ＵＬ４６、４７、および４９と比較した。ＵＬ４６、ＵＬ４７、またはＵＬ４９エピトープに対して反応することが知られるＣＤ８⁺ Ｔ細胞クローンを、読み出しとして採用されるＩＦＮ‐γ分泌のＥＬＩＳＡを使用し、トランスフェクトされた細胞を用いて培養した。
ＤＮＡワクチンは、ＰＢＳ、１μｇＤＮＡ／１．０９μｇＶａｘｆｅｃｔｉｎ^TMのＶａｘｆｅｃｔｉｎ^TMアジュバント、またはＰＢＳ中１μｇＤＮＡ／１．５μｇポロキサマーのＣＲＬ１００５等であるがそれに限定されないポロキサマーを用いて調剤した。

動物および免疫レジメン
雌の４〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群につき１０匹）を、０日目、１４日目、および２８日目に両側大腿四頭筋（１回の免疫付与につき１００μｇ）へのＩＭ注入により、５０μＬ中の５０μｇＤＮＡで免疫付与した。
１日目（前採血）、１３日目、２７日目、および４２日目に、各動物から血清を収集した。脾細胞は、４２日目の最終的な殺処理時に単離した。

抗体応答のＥＬＩＳＡ評価
ＥＬＩＳＡ用の抗原は、ワクチン構成物を用いてＶＭ９２細胞を一時的にトランスフェクトし、上清を収集することにより形成された組み換え全長テグメントタンパク質に由来した。
０．１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有するＴＢＳ中で、血清を連続して希釈した。標準試薬は、抗原特異的ＩｇＧをＯＤ４５０ｎｍの吸光度により測定した。各抗原に対する正（４２日目）の血清プールは、すべてのＥＬＩＳＡプレート上で実行した。指数曲線は、（バックグラウンド吸光度に対して訂正された）希釈対ＯＤ₄₅₀の中間部分における値から生成した。一時点における各動物の抗体タイターは、個別の希釈から決定された（標準曲線から計算された）標準タイターとして計算した。実験血清のすべての希釈に対するＯＤ₄₅₀が非常に低い場合、タイターは１：１と指定した。

ＥＬＩＳＰＯＴ分析による細胞性応答の評価
Ｔ細胞によるＩＦＮ‐γ分泌は、標準試薬を用いて、ＥＬＩＳＰＯＴ分析により試験した。プレートは、コンピュータにより読み出した。
個別の動物から得た脾細胞（二重ウェル中０．５‐１ｘ１０⁶細胞／ウェル）を、ペプチドプール（１８‐２４９アミノ酸が重複する１３‐ｍｅｒペプチド、それぞれ０．４２‐０．５６μｇ／ｍｌ）、または正（ＣｏｎＡ）あるいは負（媒体）の対照を用いて刺激した。単一１３‐ｍｅｒペプチドを１０μｇ／ｍｌで用いて、プールされた応答脾細胞も試験した。
より短い（９〜１１ａａ）ペプチド、用量応答曲線、および／または実験未使用の脾細胞ＡＰＣと逆混合されたＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺応答物（負の選択、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、純度８０％より大）を使用して、応答を産生することが分かったペプチドをさらに評価した。スポットの数が多すぎて数えられないプレートは、任意で１０３スポットと指定した。

考察
ＨＳＶ‐２ＵＬ４６、ＵＬ４７、およびＵＬ４９ＤＮＡワクチンは、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ‐２ｄ）マウスにおいて免疫原性である。
Ｈ‐２ｄＣＤ８⁺エピトープは、すべてのワクチンに関して認められ、ＣＤ４⁺エピトープは、ＵＬ４６およびＵＬ４９に対して認められた。
ＣＤ８⁺脾細胞は、１０^-3〜１０^-6μＭの濃度でペプチドに応答し、ＣＤ４⁺脾細胞は、１０^-1μＭ以上のペプチド濃度を必要とする。
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける細胞性応答は、ＳＦＵ／１０６脾細胞として発現される場合、ＵＬ４７に最大であり、ＵＬ４９およびＵＬ４６へと続く。
相対抗体タイターは、ＵＬ４９＞ＵＬ４７＞ＵＬ４６である。
ポロキサマーベースの製剤は、４２日目に、３つのテグメントＤＮＡワクチンすべてに対し、アジュバントなしの場合と比較して３〜５倍、体液性免疫をブーストした。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMに基づく製剤は、４２日目に、アジュバントなしの場合と比較して約２倍、ＵＬ４６およびＵＬ４９ＤＮＡに対する抗体応答をブーストした。

ポロキサマーは、ＵＬ４７ＤＮＡワクチンに対する細胞性応答を有意にブーストしたが（ｐ＝０．０３）、ＵＬ４６またはＵＬ４９ＤＮＡワクチンに対してはブーストしなかった。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMは、任意の試験済みワクチンに対して、統計的に有意なアジュバント効果を有さなかった（ｐ＞０．０５）。
３つのＨＳＶ‐２テグメントタンパク質に対する細胞性免疫は、ＤＮＡワクチン接種後に検出可能であった。ＵＬ４７およびＵＬ４９の両方に対する応答は、特に強力であった。ペプチド合成に関する問題のため、ＵＬ４７およびＵＬ４９に関する分析では１つまたは２つのペプチドが欠損したのに比べて、ＵＬ４６ペプチドの１９％が分析中に欠損した。それにもかかわらず、複数のＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺エピトープが同定されており、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける動物病原性研究を補助するであろう。

ポロキサマーおよびＶａｘｆｅｃｔｉｎ^TMベースの製剤のアジュバント効果は中度であり、抗原間で一定ではなかった。アジュバント効果は、低用量の抗原、またはより高い種において使用される場合により明らかとなり得る。

対象のＨＳＶ‐２遺伝子を同定する。
ＨＳＶ‐２は、ほぼ８５個のタンパク質をコードする（Ｒｏｉｚｍａｎ，Ｂ．，Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｗｈｉｔｌｅｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｅｓ，ｉｎＦｉｅｌｄｓＶｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，Ｅｄｉｔｏｒ．２００７，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．ｐ．２５０１‐２６０２）。ｐＤＮＡアプローチは、１つまたは少数のＯＲＦに限定される。ＯＲＦの選択条件は、感染細胞の迅速な認識、免疫優勢（個体内および集団内）、抗ウイルスエフェクタ機能、および病変の局在を含む。

テグメントタンパク質ＵＬ４６、ＵＬ４７、ＵＬ４９、およびＵＬ７は、ＣＤ８+抗原である（Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら、ＣＤ８ＣＴＬｆｒｏｍｇｅｎｉｔａｌｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｌｅｓｉｏｎｓ：ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｖｉｒａｌｔｅｇｕｍｅｎｔａｎｄｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｌｙｓｉｓｏｆｉｎｆｅｃｔｅｄｃｕｔａｎｅｏｕｓｃｅｌｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１．１６６：ｐ．４０４９‐４０５８）。ＵＬ４７およびＵＬ４９に特異的なＣＤ８⁺ Ｔ細胞はＨＬＡペプチドテトラマーを用いる「直接」ＰＢＭＣ染色により検出されるために十分の量がある（Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｂｙＣＤ８+ Ｔ‐ｃｅｌｌｓｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒａｓｋｉｎ‐ｔｒｏｐｉｃｖｉｒｕｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００２．１１０：ｐ．５３７‐５４８）。糖タンパク質、カプシド、または前初期タンパク質に特異的なＣＤ８⁺細胞は、より少数であり、「直接」ＰＢＭＣ染色において検出されたことがない（Ｋｏｅｌｌｅ、未発表）。対象につき最大９５の単独で派生したＨＳＶ‐２特異的ＣＤ８+クローンの研究は、テグメントタンパク質に対する応答が免疫優勢であったことを示した（Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．，ＬｉｕＺ．，ＭｃＣｌｕｒｋａｎＣ．Ｌ．，ＣｅｖａｌｌｏｓＲ．Ｃ．，ＶｉｅｉｒａＪ．，ＨｏｓｋｅｎＮ．Ａ．，ＭｅｓｅｄａＣ．Ａ．，ＳｎｏｗＤ．Ｃ．，ＷａｌｄＡ．，ＣｏｒｅｙＬ．，Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅａｍｏｎｇｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＤ８Ｔ‐ｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｔｉｓｓｕｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｏｍｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３．１００：ｐ．１２８９９‐１２９０４）。

次に、４８ＨＳＶ‐２ＯＲＦ（全体の５７％）に対するヒトＣＤ８⁺応答を、これらのＯＲＦを被覆する５，２３０合成ペプチドを形成することにより測定した。末梢血液から得たＣＤ８⁺ Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴにより読み出しとして調査した（Ｈｏｓｋｅｎ，Ｎ．，ＭｃＧｏｗａｎＰ．，ＭｅｉｅｒＡ．，ＫｏｅｌｌｅＤ．Ｍ．，ＳｌｅａｔｈＰ．，ＷｅｇｅｎｅｒＦ．，ＥｌｌｉｏｔｔＭ．，ＧｒａｂｓｔｅｉｎＬ．，ＰｏｓａｖａｄＣ．，ＣｏｒｅｙＬ．，ＤｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅＣＤ８+ Ｔｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｏｌｅｘｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２ｐｒｏｔｅｉｎｓａｍｏｎｇｐｅｒｓｏｎｓｗｉｔｈｇｅｎｉｔａｌｈｅｒｐｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，２００６．８０：ｐ．５５０９‐５５１５）。ＨＳＶ‐２感染した２４対象のうち、５０％はテグメントタンパク質ＵＬ４６およびＵＬ４７を認識した。ＵＬ４９に対する応答は、わずかに低かった（最大４０％）。

エンベロープ糖タンパク質Ｂ中のＨＬＡＡ^*０２０１制限エピトープおよびアジュバントからなる、ＨＳＶ‐２治療ワクチンの試行は実施中である。ベースライン（ｎ＝４２人）において、ｇＢにおけるＨＬＡＡ^*０２０１エピトープに対する応答の集団発生率は４５％であるのに対し、テグメントタンパク質ＵＬ４７におけるＡ^*０２０１エピトープの場合は６８％である（ｐ＝０．０１２、フィッシャーの直接確率検定）。

前初期、カプシド、またはエンベロープタンパク質に特異的な細胞にたいする、テグメント特異的ＣＤ８⁺ Ｔ細胞の利点の１つは、テグメント特異的ＣＤ８＋ T細胞が、標的細胞が感染した直後にそれらを死に至らしめ得ることである。これは、ビリオン入力タンパク質の認識によるものであり、転写ブロッカーアクチノマイシンＤ、またはＵＶ処理ウイルスで感作された標的細胞を用いるＣＴＬ分析において証明されている（Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら、ＣＤ８ＣＴＬｆｒｏｍｇｅｎｉｔａｌｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｌｅｓｉｏｎｓ：ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｖｉｒａｌｔｅｇｕｍｅｎｔａｎｄｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｌｙｓｉｓｏｆｉｎｆｅｃｔｅｄｃｕｔａｎｅｏｕｓｃｅｌｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１．１６６：ｐ．４０４９‐４０５８）。

処理されたテグメント入力タンパク質の認識は、ＨＳＶＴＡＰ阻害剤タンパク質ＩＣＰ４７による免疫回避を無視する。
さらに、陰部ＨＳＶ‐２病変の治療／治療後段階におけるヒト皮膚検体のテトラマー原位置染色は、テトラマー特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、再発中にＨＳＶ‐２感染細胞に隣接して局在し、治療後、真皮‐表皮接合において終端する末梢神経の領域を監視することを示す（Ｚｈｕ，Ｊ．，Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｃａｏ，Ｊ．，Ｖｅｚｑｕｅｚ，Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｍ．Ｌ．，Ｈｌａｄｉｋ，Ｆ．，Ｗａｌｄ，Ａ．，Ｃｏｒｅｙ，Ｌ．，Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｖｉｒｕｓ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＤ８+ ＴｃｅｌｌｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓｔｏｓｅｎｓｏｒｙｎｅｒｖｅｅｎｄｉｎｇｓｌｉｍｉｔＨＳＶ‐２ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｇｅｎｉｔａｌｓｋｉｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，２００７．ｅｐｕｂＦｅｂ２６２００７：ｐ．ｅｐｕｂＦｅｂ２６２００７）。

集団内および対象内優勢、高い絶対数値レベル、病変および治療後皮膚に対する局在、抗ウイルスエフェクタ機能、および感染細胞の迅速な認識を総合して、ＨＳＶ‐２テグメントタンパク質は、ＨＳＶ‐２病変、症状、および脱落を減少させるためのＣＤ８＋対象治療アプローチの合理的な標的であると主張する。

候補ワクチンテグメントＨＳＶ‐２遺伝子のアミノ酸配列を決定する。
循環北米ＨＳＶ‐２株におけるテグメントタンパク質ＵＬ４６、ＵＬ４７、およびＵＬ４９を配列決定した。一次陰部ヘルペスを有することが確認された個体からＨＳＶ‐２を単離し（Ａｓｈｌｅｙ，Ｒ．Ａ．ら、ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）ａｎｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＧ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｔｙｐｅｓ１ａｎｄ２ｉｎｈｕｍａｎｓｅｒａ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８８．２６：ｐ．６６２‐６６７）、それらを体外で最小限継代させ、テグメント遺伝子を正確なポリメラーゼでＰＣＲ増幅して、それらを二方向に配列決定した（Ｍａｒｔｉｎ，Ｅ．，ＫｏｅｌｌｅＤＭ，ＢｙｒｄＢ，ＨｕａｎｇＭＬ，ＶｉｅｉｒａＪ，ＣｏｒｅｙＬ，ＷａｌｄＡ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ‐ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｌｉｎｋｅｄｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２ｓｔｒａｉｎｓ．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００６．４４（７）：ｐ．２５４１‐６）。すべての野生型株がＨＧ５２からの同一コーディングの差を共有する多くの座を同定した（Ｄｏｌａｎ，Ａ．ら、Ｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８．７２：ｐ．２０１０‐２０２１）。他の座において、野生型株間で異なる多型アミノ酸が存在した。これらに対して、われわれのワクチン組成物の一般的な対立遺伝子を選択した。（表８）

表８。８つの野生型ＨＳＶ‐２分離株において選択されたコーディング多型。ＨＧ５２命名ごとのアミノ酸（ＡＡ）数（Ｄｏｌａｎ，Ａ．ら、Ｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８．７２：ｐ．２０１０‐２０２１）。表項目は、ＨＧ５２ＡＡをリストし、次に、野生型が続く。ワクチン配列ＶＲ２１４５、ＶＲ２１４４、およびＶＲ２１４３も示す。

ＣＤ８+ Ｔ細胞エピトープは、ＨＩＶに関して証明されるように、選択的圧力下で突然変異し、ＣＤ８⁺ ＣＴＬを「脱出」させる可能性があることが憂慮された。（Ｎｏｌａｎ，Ｄ．，Ｉ．ＪａｍｅｓおよびＳ．Ｍａｌｌａｌ，ＨＩＶ／ＡＩＤＳ．ＨＩＶ：ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｉｎｇｔｈｅｐｒｅｓｓｕｒｅｓｏｆｍｏｄｅｒｎｌｉｆｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５．３０７（５７１４）：ｐ．１４２２‐４）。ＨＳＶ‐２は、正確なＤＮＡポリメラーゼを有するが、アシクロビル治療中に突然変異が実際に生じる（Ｃｚａｒｔｏｓｋｉ，Ｔ．ら、Ｆｕｌｍｉｎａｎｔ，ａｃｙｃｌｏｖｉｒ‐ｒｅｓｉｓｔａｎｔ，ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２ｈｅｐａｔｉｔｉｓｉｎａｎｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔｗｏｍａｎ．ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００６．４４（４）：ｐ．１５８４‐６）。ＵＬ４６、ＵＬ４７、およびＵＬ４９における既知のＣＤ８⁺エピトープ領域に注目し、１００以上の追加の野生型ＨＳＶ‐２株を配列決定した。いかなるコーディング多型も、ＵＬ４６またはＵＬ４７のＣＤ８⁺エピトープ内または付近（Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら、ＣＤ８ＣＴＬｆｒｏｍｇｅｎｉｔａｌｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｌｅｓｉｏｎｓ：ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｖｉｒａｌｔｅｇｕｍｅｎｔａｎｄｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｌｙｓｉｓｏｆｉｎｆｅｃｔｅｄｃｕｔａｎｅｏｕｓｃｅｌｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１．１６６：ｐ．４０４９‐４０５８、Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．，ＬｉｕＺ．，ＭｃＣｌｕｒｋａｎＣ．Ｌ．，ＣｅｖａｌｌｏｓＲ．Ｃ．，ＶｉｅｉｒａＪ．，ＨｏｓｋｅｎＮ．Ａ．，ＭｅｓｅｄａＣ．Ａ．，ＳｎｏｗＤ．Ｃ．，ＷａｌｄＡ．，ＣｏｒｅｙＬ．，Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅａｍｏｎｇｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＤ８Ｔ‐ｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｔｉｓｓｕｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｏｍｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３．１００：ｐ．１２８９９‐１２９０４）、あるいは任意のタンパク質のＣＤ４⁺エピトープ内または付近（Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２ｔｅｇｕｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙＣＤ４Ｔｃｅｌｌｓｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇｈｕｍａｎｇｅｎｉｔａｌｈｅｒｐｅｓｌｅｓｉｏｎｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８．７２：ｐ．７４７６‐７４８３、Ｐｏｓａｖａｄ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｔｃｅｌｌｉｍｍｕｎｉｔｙｔｏｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｉｎｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅｐｅｒｓｏｎｓ：ｓｉｌｅｎｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｒａｃｑｕｉｒｅｄｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００３．１７０：ｐ．４３８０‐４３８８、Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｔｅｇｕｍｅｎｔ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｖｉｒｕｓ‐ｒｅａｃｔｉｖｅＣＤ４Ｔ‐ｃｅｌｌｓｌｏｃａｌｉｚｅｔｏｔｈｅｃｏｒｎｅａｉｎｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｋｅｒａｔｉｔｉｓｉｎｈｕｍａｎｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，２０００．７４：ｐ．１０９３０‐１０９３８）において認められなかった。

対照的に、ＵＬ４９のＨＬＡＢ^*０７０２制限されたＣＤ８⁺エピトープでは、不均一性が認められる（ＡＡ４９〜５７）。分離株の７０％は、大部分の配列ＲＰＲＧＥＶＲＥＦＬを有する一方、２９％は少数ＲＰＭＲＥＶＲＦＬを有し、１％は希少ＲＰＲＧＫＶＲＦＬを有した。われわれの免疫研究（Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｃ．，Ｂｙｒｄ，Ｂ．，Ｓｅｔｔｅ，Ａ．，Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．，Ｗａｌｄ，Ａ．ＨＳＶ‐２ＶＰ２２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｒｏｍｗｉｌｄ‐ｔｙｐｅｉｓｏｌａｔｅｓｔｈａｔｅｓｃａｐｅａｄｏｍｉｎａｎｔＣＤ８ＣＴＬｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｌｉｎｋａｇｅｗｉｔｈａｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｔａｎａｄｊａｃｅｎｔｃａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅＩＩｓｕｂｓｔｒａｔｅｄｏｍａｉｎ．ｉｎ３０ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓＷｏｒｋｓｈｏｐ．２００５．Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）は、手短に言うと、３つの変異体はすべて組み換えＨＬＡＢ^*０７０２に十分に結合するが［ＩＣ₅₀は２ｎＭより小、（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ，Ｓ．ら、ＳｅｖｅｒａｌｃｏｍｍｏｎＨＬＡ‐ＤＲｔｙｐｅｓｓｈａｒｅｌａｒｇｅｌｙｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１９９８．１６０（７）：ｐ．３３６３‐７３）に従う分析］、「大部分」に特異的なＣＤ８^+* Ｔ細胞は、「少数」または「希少」変異型と交差反応性でないことを示す。７０％適合の「大部分」を用いるワクチン接種は、循環株の３０％を欠損し得る。

タンパク質の発現および安定性のために遺伝子を最適化し、それらを合成して、ｐＤＮＡバックボーンにクローン化する。
ｐＤＮＡワクチンのＡＡ配列を確立した後、高い真核発現を目的として、独自のコドン最適化アルゴリズムを使用した。遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔにより合成した。ｇＤ₁エピトープタグＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤを用いる場合と、用いない場合とで、ＵＬ４６、ＵＬ４７、およびＵＬ４９の異形を形成した。それぞれをプラスミドＶＲ１０１２にクローン化した（Ｈａｒｔｉｋｋａ，Ｊ．ら、ＡｎｉｍｐｒｏｖｅｄｐｌａｓｍｉｄＤＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｆｏｒｄｉｒｅｃｔｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｔｏｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ．ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ，１９９６．７（１０）：ｐ．１２０５‐１７）。ＶＲ１０１２は、カナマイシン耐性をコードし、ＣＭＶ前初期遺伝子１のプロモータ／エンハンサンおよびイントロンＡ、ならびにウシ成長ホルモンベースのターミネータを含む。１）多数の細胞、動物種、および組織において高レベルの発現を実現する、２）自家研究において安定性に問題がない、３）大腸菌において高いプラスミド収率が得られる、最も重要なことに、４）ＶＲ１０１２ベースの生成物が臨床試験に存在するという理由から、ＶＲ１０１２を選択した。挿入物は、４倍の平均冗長に対して検証された配列であった。

Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMアジュバントを、筋肉内注入研究に使用した。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMは、ＶＣ１０５２（（±）‐Ｎ‐（３‐アミノプロピル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ビス（ミリストレイルオキシ）‐１‐プロパナミニウムブロマイド）およびＤＰｙＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）の等モル混合物である（Ｈａｒｔｉｋｋａ，Ｊ．ら、ＡｎｉｍｐｒｏｖｅｄｐｌａｓｍｉｄＤＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｆｏｒｄｉｒｅｃｔｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｔｏｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ．ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ，１９９６．７（１０）：ｐ．１２０５‐１７）。ＶＣ１０５２およびＤＰｙＰＥのクロロホルム溶液をガラスバイアル中で混合し、クロロホルムを蒸発させて、真空パッキングすることにより脂質薄膜を調製した。ワクチン接種時、脂質薄膜を１ｍＬの０．９％食塩水で２．１８ｍｇ／ｍＬに再構成した。等量の脂質をｐＤＮＡ（０．９％食塩水中２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭリン酸ナトリウム）に添加することにより、最終ｐＤＮＡ（リン酸）：陽イオン性モル比４：１でワクチンを調製した。再構成ワクチンを室温で保持し、６０分以内に使用した。

初期実験は、ＶＭ９２細胞の一時的トランスフェクションにより、ＵＬ４６、ＵＬ４７、およびＵＬ４９のｇＤタグ付き異形を発現した（Ｋｕｍａｒ，Ｓ．ら、ＡＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅ４２ｋＤａＣ‐ｔｅｒｍｉｎｕｓｏｆｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎ１ｏｆＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍｉｎｄｕｃｅｓａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ‐ｇａｍｍａａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｙｓ：ｉｍｍｕｎｏ‐ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅ‐ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ．ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ，２００２．８１（１）：ｐ．１３‐２４）。免疫ブロットは、予測されたＭＷにおいて帯域を示した（図示せず）。後のすべての実験では、エピトープタグのない全長テグメント構成物を使用した。ＵＬ４６、ＵＬ４７、およびＵＬ４９に特異的なヒトＣＤ８+ ＣＴＬクローンを使用して（Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら、ＣＤ８ＣＴＬｆｒｏｍｇｅｎｉｔａｌｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｌｅｓｉｏｎｓ：ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｖｉｒａｌｔｅｇｕｍｅｎｔａｎｄｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｌｙｓｉｓｏｆｉｎｆｅｃｔｅｄｃｕｔａｎｅｏｕｓｃｅｌｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１．１６６：ｐ．４０４９‐４０５８、Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．，ＬｉｕＺ．，ＭｃＣｌｕｒｋａｎＣ．Ｌ．，ＣｅｖａｌｌｏｓＲ．Ｃ．，ＶｉｅｉｒａＪ．，ＨｏｓｋｅｎＮ．Ａ．，ＭｅｓｅｄａＣ．Ａ．，ＳｎｏｗＤ．Ｃ．，ＷａｌｄＡ．，ＣｏｒｅｙＬ．，Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅａｍｏｎｇｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＤ８Ｔ‐ｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｔｉｓｓｕｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｏｍｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３．１００：ｐ．１２８９９‐１２９０４）、ｐＤＮＡワクチンが、ＣＤ８+ Ｔ細胞に対して処理および提示されるタンパク質をコードしたことを確証した。ＣＯＳ‐７細胞は、（１）候補ワクチンプラスミド、および（２）特異的ヒトＨＬＡクラスＩ α鎖をコードするｃＤＮＡと共トランスフェクトした。ヒトＨＬＡクラスＩ重鎖は、非ヒト霊長類（ＣＯＳ‐７細胞）β₂マイクログロブリン（β₂Ｍ）を用いて、機能的ヘテロ二量体を形成する。ワクチン構成物が、抗原性ペプチドに対して処理され得るタンパク質をコードする場合、一部のＨＬＡクラスＩ‐β₂Ｍヘテロ二量体は、ＨＳＶ‐２ペプチドを装填した細胞表面に移行する。２日後、関連テグメントタンパク質に特異的なヒトＣＤ８⁺ Ｔ細胞クローンを追加した。Ｔ細胞活性は、上清のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡにより検出された（Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら、ＣＤ８ＣＴＬｆｒｏｍｇｅｎｉｔａｌｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｌｅｓｉｏｎｓ：ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｖｉｒａｌｔｅｇｕｍｅｎｔａｎｄｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｌｙｓｉｓｏｆｉｎｆｅｃｔｅｄｃｕｔａｎｅｏｕｓｃｅｌｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１．１６６：ｐ．４０４９‐４０５８、Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｂｙＣＤ８+ Ｔ‐ｃｅｌｌｓｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒａｓｋｉｎ‐ｔｒｏｐｉｃｖｉｒｕｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００２．１１０：ｐ．５３７‐５４８）。特定の応答が検出された（図３）。Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡクラスＩｃＤＮＡ単独、ＨＳＶ‐２プラスミドＤＮＡ単独、またはＨＳＶ‐ＤＮＡおよび「不適切な」ＨＬＡを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ‐７細胞を認識しなかった（図示せず）。

ヒト抗ＨＳＶ抗体は、候補ワクチンによりコードされるタンパク質も認識した。ワクチンコードされたタンパク質を形成するには、ＶＭ９２細胞（Ｋｕｍａｒ，Ｓ．ら、ＡＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅ４２ｋＤａＣ‐ｔｅｒｍｉｎｕｓｏｆｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎ１ｏｆＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍｉｎｄｕｃｅｓａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ‐ｇａｍｍａａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｙｓ：ｉｍｍｕｎｏ‐ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅ‐ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ．ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ，２００２．８１（１）：ｐ．１３‐２４）を、ワクチンプラスミドを用いてトランスフェクトし、上清を収集した。これらを抗原（１：５希釈）として使用し、ＥＬＩＳＡプレートを被覆した。ＨＳＶ‐２血清陽性個体から得たプール血清は、組み換えテグメントタンパク質と結合したが（図４）、ＨＳＶ‐２血清陰性個体から得たプール血清は結合しなかった。これらの試験は、ＨＳＶ‐２特異的Ｔ細胞および抗体が、ワクチンコードされたＨＳＶ‐２テグメントタンパク質を真正に認識することを示す。

マウスにおいてＨＳＶ‐２テグメントプラスミド単独または混合物に対する免疫応答を測定する。
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ‐２^d）を選択して、免疫原性および保護効果の試験を組み合わせることができるようにした。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける既知のＨＳＶ‐２ＣＤ８+エピトープのみがタンパク質ＩＣＰ２７内に存在する（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．，ＡｒｒｉｎｇｔｏｎＪ，ＤｏｎｇＬ，ＢｒａｕｎＲＰ，ＰａｙｎｅＬＧ，ＰｏｔｅｎｔｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙａＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇＨＳＶ‐２ＩＣＰ２７ａｎｄｔｈｅＥ．ｃｏｌｉｈｅａｔｌａｂｉｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００６．２４（２３）：ｐ．５０１６‐２６）。ｇＤのいくつかの型共通領域は、これらの動物におけるＣＤ４+エピトープである（ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ，Ｌ．ら、ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔＣＤ４＋Ｔｈ１‐ｔｙｐｅＴ‐ｃｅｌｌｐｅｐｔｉｄｅｅｐｉｔｏｐｅｓｆｒｏｍｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＤｔｈａｔｃｏｎｆｅｒｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＪＶｉｒｏｌ，２００３．７７（１７）：ｐ．９４６３‐７３）。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＨＳＶ‐２による膣内感染を非常に受けやすい（Ｌｏｐｅｚ，Ｃ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆｎａｔｕｒａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ，１９７５．２５８：ｐ．１３５２‐１３５３）。

体液性応答。１００μｇｐＤＮＡを大腿四頭筋につき５０μｇＩＭとして、０日目、１４日目、および２８日目にマウスを免疫付与した。第６，８４４，０１１号において実施例１として示されるように、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMとＣＲＬ１００５ポロキサマーとを、ＰＢＳに対するアジュバントとして比較した（Ｓｅｌｉｎｓｋｙ，Ｃ．ら、ＡＤＮＡ‐ｂａｓｅｄｖａｃｃｉｎｅｆｏｒｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｉｓｅａｓｅｓ．ＨｕｍＶａｃｃｉｎ，２００５．１（１）：ｐ．１６‐２３）。Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMに注目し、結果（タイター、抗体への速度、抗体に対する各時点のタイター、およびＴ細胞のＩＦＮ−γ ｓｆｕ／１０⁶脾細胞）は、概してアジュバント、および、この高ｐＤＮＡ用量におけるＰＢＳの結果と同様であったため、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMデータのみを示す。
すべてのマウスは、第２の免疫付与により、関連タンパク質に対する抗体を産生した（図２０Ａ〜Ｉ）。抗体タイターは、各ワクチンおよびすべての時点比較に関して、一測定から次の測定にかけて著しく高かった（ｐ＜０．０３、対応のある両側ｔ検定）。ワクチン誘発された抗体がＨＳＶ‐２溶解物全体に結合したことも検証した（図４）。これらのデータもプラスミドが真正にＨＳＶ‐２タンパク質をコードすることを示す。

ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるテグメントＤＮＡワクチンに対するＣＤ８ ⁺ およびＣＤ４ ⁺ 応答
４つのＡＡによりオフセットされる重複ペプチド１３ＡＡ長を合成して、予測されるワクチン配列に一致させた（表８）。初期分析では、ペプチドプールを使用した（１８〜２４ペプチド／プール、各ペプチドの濃度は０．５μｇ／ｍＬ）。第３の免疫付与から２週間後に採取された個別のマウスの脾細胞（図６Ａ〜Ｃ）を試験した。読み出しはＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴであった（Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．，ＡｒｒｉｎｇｔｏｎＪ，ＤｏｎｇＬ，ＢｒａｕｎＲＰ，ＰａｙｎｅＬＧ，ＰｏｔｅｎｔｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙａＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇＨＳＶ‐２ＩＣＰ２７ａｎｄｔｈｅＥ．ｃｏｌｉｈｅａｔｌａｂｉｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００６．２４（２３）：ｐ．５０１６‐２６）。各動物に関してプールに対する応答をまとめて累積応答を求め、スポット形成単位（ｓｆｕ）／１０⁶脾細胞として表した。ＵＬ４７およびＵＬ４９の場合、応答は、実験未使用のマウスよりも高かった（ｐ＜０．０１、両側ｔ検定）。ＵＬ４６の場合、２匹の実験未使用のマウスにおける応答が高かったため、応答は実験未使用のマウス（ｐ＝０．３７）と統計的に差はなかった。しかしながら、ＵＬ４６から得た単一ペプチドの試験は、依然として抗原性ペプチドを明らかにした。

陽性プールにおける個別のペプチドを、フォローアップＥＬＩＳＰＯＴにおいて試験した。それぞれの場合において、単一または近接する重複ペプチドは陽性であった。重複領域（存在する場合）およびＭＨＣペプチドエピトープ予測アルゴリズムを使用して（Ｂｕｉ，Ｈ．Ｈ．ら、ＡｕｔｏｍａｔｅｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃＭＨＣｂｉｎｄｉｎｇｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｔｏｏｌｓ：ＡＲＢｍａｔｒｉｘａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５、Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ．，Ｍ．Ａ．ＢｅｄｎａｒｅｋおよびＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＳｃｈｅｍｅｆｏｒｒａｎｋｉｎｇｐｏｔｅｎｔｉａｌＨＬＡ‐Ａ２ｂｉｎｄｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓｂａｓｅｄｏｎｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｏｆｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｐｅｐｔｉｄｅｓｉｄｅ‐ｃｈａｉｎｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４．１５２：ｐ．１６３‐１６８、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．ら、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄａｔａｂａｓｅｆｏｒＭＨＣｌｉｇａｎｄｓａｎｄｐｅｐｔｉｄｅｍｏｔｉｆｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９．５０：ｐ．２１３‐３１９）、さらなる試験のためにより短いペプチドを選別した。磁気ビーズ接合した抗体に負の選択を使用して、ＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺脾細胞を富化し、これらをＡＰＣとして実験未使用の脾細胞と逆混合した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴにおいて、各ワクチンタンパク質の強力なＣＤ８⁺エピトープが認められた。ＣＤ４⁺応答は、ＵＬ４６およびＵＬ４９において検出された。ｓｆｕ／１０⁶脾細胞またはＥＣ₅₀として定量される場合、ＣＤ４⁺応答は、一般にＣＤ８⁺応答よりも弱かった（最大応答の５０％を生じる濃度（図２１））。一部のＣＤ８⁺エピトープは、１０^-12Ｍにおいて活性であった（図２１）。そのような強力ＣＤ８⁺エピトープは、通常、関連ＭＣＨクラスＩ分子と強固に結合する。ＵＬ４６１８３‐１９１（ＫＹＡＡＡＶＡＧＬ）をＨ‐２Ｋ^dに結合するためのＩＣ₅₀は、９．９１ｎＭであった（非常に強固な結合）（Ｓｅｔｔｅ，Ａ．ら、ＡｒｏａｄｍａｐｆｏｒｔｈｅｉｍｍｕｎｏｍｉｃｓｏｆｃａｔｅｇｏｒｙＡ‐Ｃｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００５．２２（２）：ｐ．１５５‐６１）。全体として、テグメントタンパク質ワクチンは高い結合力を誘発し、多くの場合、マルチエピトープおよび混合（ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺）Ｔ細胞応答を誘発した。

ＨＳＶ‐２感染したマウスは、テグメントタンパク質エピトープに対するＴ細胞を生成する。
ＨＳＶ‐２感染により体内でプライムされたＴ細胞は、ワクチン接種によりブーストされる。これに関連して、テグメント特異的Ｔ細胞がＨＳＶ‐２感染、およびワクチン（上記）により体内でプライムしたかどうかを試験することが重要であった。チミジンキナーゼ（３３３ｔｋ‐）を欠損する弱毒化ＨＳＶ‐２株３３３変異体により、ＢＡＬＢ／ｃマウスを感染させた（Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｇ．Ｎ．およびＤ．Ｉ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍｏｒａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｇａｉｎｓｔｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２ｉｎｔｈｅｍｕｒｉｎｅｆｅｍａｌｅｇｅｎｉｔａｌｔｒａｃｔ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５．２０６：ｐ．２３４‐２４１）。感染の６日前に、皮下デポプロベラ（プロゲスティン）により、マウスを膣内感染しやすくした。１４日目（図２２および２３）のマウスから得た脾細胞は、ｐＤＮＡワクチン（上記）を使用して既に見出されているＣＤ８⁺テグメントエピトープに対するＴ細胞応答を示した。ヒトおよびマウスの両方において、テグメントタンパク質ＵＬ４６、ＵＬ４７、およびＵＬ４９を処理し、ウイルス感染中にＭＨＣクラスＩの経路を介して提示される。

テグメントワクチンは、ＨＳＶ‐２による致命的な膣内チャレンジに対して部分的保護を提供する。
「ＣＤ８⁺専用」ワクチンは、マウスを致命的な膣内または足蹠ＨＳＶ‐１チャレンジから保護することができるが（Ｂｌａｎｅｙ，Ｊ．Ｅ．ら、ＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈａｓｉｎｇｌｅｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｌａｓｓＩ‐ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ‐ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｅｐｉｔｏｐｅｏｆｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２ｃｏｎｆｅｒｓｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８．７２：ｐ．９５６７‐９５７４、Ｏｒｒ，Ｍ．Ｔ．，Ｏｒｇｕｎ，Ｎ．Ｎ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｗａｙ，Ｓ．Ｓ．，Ｃｕｔｔｉｎｇｅｄｇｅ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｓｉｎｌｇｅｉｍｍｕｎｅ‐ｄｏｍｉｎａｎｔｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｆｅｒｓｉｍｍｕｎｉｔｙｔｏｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ‐１ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７．１７８：ｐ．ＩｎＰｒｅｓｓＡｐｒｉｌ１５，２００７ｅｄｉｔｉｏｎ）、膣内ＨＳＶ‐２モデルにおいて研究されたことはない。われわれは、一価テグメントワクチンが、膣内モデルにおいて部分的保護を提供したことを見出した。毒性ＨＳＶ‐２株１８６（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．ａｎｄＦ．Ｒａｐｐ，Ｌａｔｅｎｃｙｉｎｖｉｔｒｏｕｓｉｎｇｉｒｒａｄｉａｔｅｄｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ．ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ，１９８１．５２（Ｐｔ１）：ｐ．１１３‐９）を致命的チャレンジに使用した。３Ｘ１０³ｐｆｕ。エンドポイントは、１日に２回、１４日目の生存、および１〜５日目の膣ＨＳＶ‐２タイターを測定した。全ダクロン製スワブを１ｍＬＰＣＲ緩衝液に入れ、抽出して、上述のような高スループット実時間ＰＣＲにより、ＨＳＶ‐２ＤＮＡ複製数を解析した（Ｒｙｎｃａｒｚ，Ａ．Ｊ．ら、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｓｓａｙｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇＨＳＶＤＮＡｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９．３７：ｐ．１９４１‐１９４７）。陽性ワクチン対照は、１０⁶ｐｆｕの弱毒化ＨＳＶ‐２３３３ｔｋ‐（デポプロベラ後）、または３回の切断ｇＤ₂ ｐＤＮＡワクチンの注入によって膣内感染させた（以下を参照されたい）。陰性対照は、空プラスミドであった。ｐＤＮＡワクチンは、０日目、１４日目、および２８日目の３回、ＰＢＳ中１００μｇ／ｄｏｓｅＩＭで投与した。デポプロベラ後、ＬＤ₅₀の５０倍（５０Ｘ（３Ｘ１０³）＝１．５Ｘ１０⁵ｐｆｕ）のワクチン接種の１４日後にマウスをチャレンジした。

ＨＳＶ‐２３３３ｔｋ‐およびｇＤ₂は、すべての動物を保護した（図２４）。ＵＬ４７ｐＤＮＡは、ＵＬ４９に対して考えられるわずかな保護とともに、４４％保護（９匹の動物のうち４匹）を提供した。ＥＬＩＳＡにより、全体ＨＳＶ‐２溶解物を使用して、ＵＬ４７およびＵＬ４９生存体が感染したこと、それらが免疫構成物単独への免疫により説明できる値よりもはるかに高いＯＤ₄₅₀値（データ表示せず）を有したことが確認された（図２０Ａ〜Ｉ）。テグメントワクチンは、チャレンジ後に膣内で生じる非滅菌：ＨＳＶ‐２複製であった（図２４）。ｇＤ₂ワクチン（以下）は、ＨＳＶ‐２の複製において測定可能な減少をもたらした（図２４）。臨床的悪性度スコアは、ＵＬ４７、ＵＬ４９、およびｇＤ₂ワクチン接種後に減少した。

ｇD ₂ は、最小配列変型を示し、ＨＳＶ‐複製を低減する有効な予防ワクチンである。
６つの野生型ｇＤ₂遺伝子を配列決定した。ＨＧ５２からの変化はほとんど見られなかったが、１つはＶ１６９Ａの変化を有し、２つ目はＶ３５３ＡおよびＬ３７５Ｐの変化を有した。既知のｇＤ₂ ＣＤ８⁺または中和エピトープにおいて変化は検出されなかった。（Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．，ＬｉｕＺ．，ＭｃＣｌｕｒｋａｎＣ．Ｌ．，ＣｅｖａｌｌｏｓＲ．Ｃ．，ＶｉｅｉｒａＪ．，ＨｏｓｋｅｎＮ．Ａ．，ＭｅｓｅｄａＣ．Ａ．，ＳｎｏｗＤ．Ｃ．，ＷａｌｄＡ．，ＣｏｒｅｙＬ．，Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅａｍｏｎｇｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＤ８Ｔ‐ｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｔｉｓｓｕｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｏｍｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３．１００：ｐ．１２８９９‐１２９０４、Ｔｉｇｇｅｓ，Ｍ．Ａ．ら、ＨｕｍａｎＣＤ８+ ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｃｌｏｎｅｓｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｉｖｅｒｓｅｖｉｒｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎａｎｔｉｇｅｎｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９９２．６６：ｐ．１６２２‐１６３４、Ｓｐｅａｒ，Ｐ．Ｇ．，Ｒ．Ｊ．Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、およびＧ．Ｈ．Ｃｏｈｅｎ，Ｔｈｒｅｅｃｌａｓｓｅｓｏｆｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓｆｏｒａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｎｔｒｙ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００．２７５：ｐ．１‐８．）。われわれの候補ｐＤＮＡｇＤ₂ワクチン、ＶＲ２１３９は、ＨＧ５２配列を使用してｇＤ₂のＡＡ１〜３４０をコードする。ＡＡ３４１〜３９３は、リーダーおよび経膜領域を含むため省略した。体液性応答は、ＥＬＩＳＡにより、市販のｇＤ₁を包被抗原として使用し、型共通のｇＤエピトープに抗する市販のｍＡｂを較正器として使用することにより検出された（図２５）。細胞性応答は、テグメントタンパク質に関して上述されるとおりに重複する１３‐ｍｅｒペプチドで検出された。１００μｇｇＤ₂ ｐＤＮＡワクチンを０日目、１４日目、および２８日目の３回、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ^TMとともにワクチン接種した後、活発な体液性および全脾細胞ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ応答が大部分の動物において認められた（図２５）。生存、臨床的悪性度、および膣内ＨＳＶ‐２ＤＮＡウイルス量の利点については上述のとおりである。

要約
ＣＤ８⁺ Ｔ細胞応答は、マウスおよびヒトにおける皮膚および神経節のＨＳＶ感染を制御する。テグメントタンパク質は、ＨＳＶ‐２に対するＣＤ８⁺ヒト免疫応答の重要な標的である。（Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら、ＣＤ８ＣＴＬｆｒｏｍｇｅｎｉｔａｌｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｌｅｓｉｏｎｓ：ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｖｉｒａｌｔｅｇｕｍｅｎｔａｎｄｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｌｙｓｉｓｏｆｉｎｆｅｃｔｅｄｃｕｔａｎｅｏｕｓｃｅｌｌｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１．１６６：ｐ．４０４９‐４０５８、Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｙｐｅ２ｔｅｇｕｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙＣＤ４Ｔｃｅｌｌｓｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇｈｕｍａｎｇｅｎｉｔａｌｈｅｒｐｅｓｌｅｓｉｏｎｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８．７２：ｐ．７４７６‐７４８３、Ｐｏｓａｖａｄ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｔｃｅｌｌｉｍｍｕｎｉｔｙｔｏｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｉｎｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅｐｅｒｓｏｎｓ：ｓｉｌｅｎｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｒａｃｑｕｉｒｅｄｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００３．１７０：ｐ．４３８０‐４３８８、Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．，ＬｉｕＺ．，ＭｃＣｌｕｒｋａｎＣ．Ｌ．，ＣｅｖａｌｌｏｓＲ．Ｃ．，ＶｉｅｉｒａＪ．，ＨｏｓｋｅｎＮ．Ａ．，ＭｅｓｅｄａＣ．Ａ．，ＳｎｏｗＤ．Ｃ．，ＷａｌｄＡ．，ＣｏｒｅｙＬ．，Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅａｍｏｎｇｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＤ８Ｔ‐ｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｔｉｓｓｕｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｏｍｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３．１００：ｐ．１２８９９‐１２９０４、Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｔｅｇｕｍｅｎｔ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｖｉｒｕｓ‐ｒｅａｃｔｉｖｅＣＤ４Ｔ‐ｃｅｌｌｓｌｏｃａｌｉｚｅｔｏｔｈｅｃｏｒｎｅａｉｎｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｋｅｒａｔｉｔｉｓｉｎｈｕｍａｎｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，２０００．７４：ｐ．１０９３０‐１０９３８、Ｖｅｒｊａｎｓ，Ｇ．Ｍ．ら、ＩｎｔｒａｏｃｕｌａｒＴｃｅｌｌｓｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘ（ＨＳＶ）‐ｉｎｄｕｃｅｄａｃｕｔｅｒｅｔｉｎａｌｎｅｃｒｏｓｉｓｒｅｃｏｇｎｉｚｅＨＳＶｔｅｇｕｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓＶＰ１１／１２ａｎｄＶＰ１３／１４．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，２０００．１８２：ｐ．９２３‐９２７）。ＨＳＶ‐２テグメントタンパク質をコードするＤＮＡワクチンは、ＣＤ８⁺、ＣＤ４⁺、および抗体応答を刺激することが見出され、選択された一価ワクチンは、膣内チャレンジモデルにおいて部分的に保護するものであった。

他の実施形態
前述の説明は、本発明の原理の単なる一例であると考えられる。さらに、当業者であれば多数の修正および変更を容易に思いつくため、本発明を、上述のような厳密な構成物およびプロセスに限定することは望ましくない。したがって、あらゆる適切な修正および相当物が、以下の請求項により画定される本発明の範囲内に含まれ得る。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、およびｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、本明細書および以下の請求項において使用される際、既定の特徴、整数、成分、またはステップの存在を特定するものであるが、それらの１つまたは複数の他の特徴、整数、成分、ステップ、あるいは群の存在もしくは追加を除外しない。

本発明は、その詳細な説明と併せて記載されているが、前述の説明は、本発明の範囲を説明するものであって限定を目的とせず、本発明の範囲は、添付の請求項の範囲によって画定されることを理解されたい。他の側面、利点、および修正は、以下の請求項の範囲内に含まれる。
本明細書において引用されるすべての特許文書および参考文献は、参照することによって十分に説明されたかのように組み込まれる。

Claims

配列番号９の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド。
異種核酸配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
前記異種核酸配列は、異種単純ヘルペス・ウイルス・ポリペプチド又は分泌シグナル・ペプチドに由来する異種ポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
配列番号１１及び／又は配列番号１２の核酸配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、及び担体を含む医薬組成物。
アジュバント、及びトランスフェクション促進性化合物から成る群から選ばれる成分をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
前記アジュバントは、（ナノ−）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−テトラデセネイロキシ）−１−プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ）、並びに天然脂質；サイトカイン；モノ−ホスポリル・リピドＡ及びトレハロースジコリノミコレートＡＦ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）；可溶化モノ−ホスホリル・リピドＡ配合物；及び１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰ_yＰＥ）から成る群から選ばれる１以上の補助脂質であり、そして前記トランスフェクション促進性化合物は、（ナノ−）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシロキシ）−１−プロパナミニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）である、請求項７に記載の組成物。
脊椎動物において単純ヘルペスウイルス・ポリペプチドに対する検出可能な免疫応答を高めるための又は脊椎動物における単純ヘルペス・ウイルス感染を治療若しくは予防するための医薬であって、ａ）請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物、又はｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、前記医薬。