KR20060123138A - 방법 - Google Patents

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KR20060123138A
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랄프 패트릭 브라운
리춘 동
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파우더젝트 백신, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 (i) 숙주 포유동물 피검체에 1 내지 14일의 간격으로 투여되는 2회 이상의 투여를 포함하며, 각각의 투여는 T 세포 에피토프를 코딩하는 목적 뉴클레오티드 (nucleotide of interest: NOI)를 투여하는 것을 포함하는 제 1 면역화, 및 임의로 (ii) (a) T 세포 에피토프를 코딩하는 NOI 또는 (b) T 세포 에피토프를 포함하는 단백질을 상기 피검체에 1회 이상 투여하는 것을 포함하는 제 2 면역화를 포함하며; 제 1 면역화의 제 1 투여와 제 2 면역화의 제 1 기간이 21 내지 365일인, 숙주 포유동물 피검체에서 T 세포 에피토프에 대한 T 세포 반응의 유도 방법에 관한 것이다.
T 세포 반응, NOI (nucleotide of interest), 클러스터 투여

Description

방법 {Method}
연관 특허 출원에 대한 상호 참조
본원은 2003년 10월 10일에 출원된 미국 출원 제60/510,086호, 2003년 12월 4일에 출원된 미국 출원 제60/526,571호 및 2004년 5월 5일에 출원된 미국 출원 제60/567,771호에 대해 35 USC 119(e) 하의 이익을 주장하며 상기 출원은 모두 본원에 참조로 삽입된다.
본 발명은 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
백신처리 방법이 당 기술 분야에서 설명되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Prayaga et al. (1997) Vaccine 15 (12-13): 1349-1352]; [Kilpatrick et al. (1997) Hybridoma 16: 381-389]; [Kilpatrick et al. (1998) Hybridoma 17: 569-576; Pertmer et al. (1995) Vaccine 13: 1427-1430]; 및 [Olsen et al. (1997) Vaccine 15: 1149-1156]을 참조할 수 있다. 그러나, 향상된 세포 매개된 면역 (cell mediated immune: CMI) 반응을 특이적으로 유도하는 것을 비롯한 핵산 투여 계획의 최적화가 여전히 필요하다. 이는 다양한 면역, 염증 및 감염성 질환 및 장애의 예방 및 치료에 매우 유리하다.
발명의 요지
본 발명은 생체 내에서 CMI 반응을 유도 (또는 향상)시키는 방법을 제공한다. 특히, 본 방법은 생체 내에서 T 세포 반응을 유도 (또는 향상)시킨다.
따라서, 본 발명은
(i) 숙주 포유동물 피검체 (subject)에 1 내지 14일의 간격으로 투여되는 2회 이상의 투여를 포함하며, 각각의 투여는 T 세포 에피토프를 코딩하는 목적 뉴클레오티드 (nucleotide of interest: NOI)를 투여하는 것을 포함하는 제 1 면역화, 및 임의로
(ii) (a) T 세포 에피토프를 코딩하는 NOI 또는 (b) T 세포 에피토프를 포함하는 단백질을 상기 피검체에 1회 이상 투여하는 것을 포함하는 제 2 면역화를 포함하며;
제 1 면역화의 제 1 투여와 제 2 면역화의 제 1 투여 사이의 기간이 21 내지 365일인, 숙주 포유동물 피검체에서 T 세포 에피토프에 대한 면역 반응의 유도 방법을 제공한다.
하기 개시사항은 투여되는 NOI에 의해 코딩되는 에피토프 또는 항원과 같은 서열에 대해 논한다. 제 2 및 후속한 면역화의 경우, NOI 대신에, 동일한 에피토프 또는 항원을 포함하는 단백질을 투여할 수 있음이 이해된다.
본 발명은 목적 에피토프 (epitope of interest: EOI) 중 T 세포 에피토프에 대한 T 세포 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상술된 바와 같이, 본 방법은 EOI를 코딩하는 NOI의 투여를 포함한다. 각각의 NOI가 동일한 에피토프를 코딩하는 적어도 2, 4, 6, 10 또는 20개 또는 그 이상 (예들 들어 40개 이하)의 상이한 NOI가 투여될 수 있다. 달리, NOI의 각각의 투여 시, 동일한 NOI가 투여될 수 있다. 유사하게, EOI를 포함하는 단백질이 투여되는 실시양태에서, 에피토프를 포함하는 적어도 2, 4, 10개 또는 그 이상 (예를 들어 20개 이하)의 상이한 단백질이 투여될 수 있음이 이해된다. 달리, 단백질의 각각의 투여 시, (에피토프를 포함하는) 동일한 단백질이 투여될 수 있다.
하나의 양상으로, 본 발명은 표적 항원 (target antigen: TA)에 대한 하나 이상의 EOI를 코딩하는 NOI를 숙주 포유동물 피검체에 적어도 2회 투여함을 포함하고, 각각의 NOI 투여 간격이 약 48시간 내지 약 144시간 범위이며, 숙주 포유동물 피검체에서 발현된 EOI 또는 각각의 발현된 EOI에 대해 향상된 CMI 반응을 제공하기에 효과적인, 숙주 포유동물 피검체에서 적어도 하나의 TA에 대한 향상된 CMI 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명은 TA의 하나 이상의 EOI에 대한 CMI 반응을 예방학적 및(또는) 치료학적으로 면역조절하기 위해 사용될 수 있다. 유도된 반응의 시간 경과는 기존의 T 세포 매개된 장애의 면역 치료 및 후속적으로 대면하는 항원에 대한 광범위한 보호를 촉진하기 위한 효과적인 계획이 전개되게 할 수 있다.
본 발명의 이러한 양상에 대한 추가의 이점은 연관된 생물학적 반응 변형제 및(또는) 아주반트의 사용 없이도 CMI 반응을 향상시키는 능력을 갖는 것이다.
본 발명의 방법은 활성화된 T 세포를 생성할 수 있다. 활성화된 T-세포의 많은 잠재적 사용이 계획된다. 예를 들어, 사람 치료의 경우, 활성화된 T-세포를 분리하여 생체 외에서 배양하고 T 세포 매개된 면역 장애 및(또는) 바이러스 감염의 치료를 위해 숙주 피검체에 투여하거나 암 환자에 투여할 수 있다는 것이 예상된다. T-세포는 NOI를 생체 내에서 투여한 후, T-세포를 분리하여 적합한 생물학적 반응 변형제 및(또는) 면역조절제 및(또는) 아주반트, 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 펩티드, 사이토킨 및 항원 제시 세포의 존재 하에서 시험관 내에서 증대시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 NOI는, 이로 제한됨이 없이, 포유동물 숙주 세포에서 DNA 서열의 발현을 지시하는 조절 서열의 제어하에 있는 DNA 서열을 포함한다. NOI는 T 세포 에피토프를 코딩하여, 통상적으로 에피토프를 포함하는 단백질을 코딩한다. 따라서, 바람직하게는, NOI는 피검체의 세포에서 에피토프 (에피토프를 포함한 단백질을 포함)를 발현할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, T 세포 에피토프는 헬퍼 T 세포 및(또는) CD8+ T 림프구 (CD8+ T 세포) 에피토프일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 유도되는 T 세포 반응은 헬퍼 및(또는) CD8+ T 세포 반응일 수 있다. 보다 바람직하게는, CD8+ T 림프구 반응, 예로 세포독성 반응일 수 있다.
투여 계획
본 발명의 방법은 본원에서 "면역화"로 언급되는 투여 세트를 포함한다. 따라서, 이 방법은 본원에서 "제 1 면역화", "제 2 면역화" 등으로 언급되는 1, 2, 3 4, 5 또는 그 이상 (예를 들어 10 이하)의 면역화 세트를 포함할 수 있다.
임의의 면역화 (예를 들어, 제 1 및(또는) 제 2 또는 모든 면역화)의 1회 이상 또는 모든 투여는 2 내지 14일 (즉, 면역화의 제 1 및 최종 투여가 각각의 투여에 대해 2 내지 14일 이내에 일어남), 예를 들어 3 내지 12일 또는 4 내지 8일에 걸쳐 일어날 수 있다. 바람직하게는, 제 1 면역화는 2 내지 14일, 예를 들어 3 내지 12일 또는 4 내지 8일에 걸쳐 일어난다.
하나 이상의 면역화 또는 모든 면역화는 2 내지 50회, 예를 들어 5 내지 40회 또는 10 내지 30회 투여를 포함할 수 있다. 따라서, 통상적으로, 하나 이상 또는 모든 면역화에서 적어도 2회, 예를 들어 적어도 3, 5, 10, 30, 50회 또는 그 이상 (예를 들어 100회 이하)의 투여가 수행될 수 있다. 바람직하게는, 제 1 면역화 (및 임의로 하나 이상의 후속한 면역화)는 3 내지 20회 투여를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 (즉, 모든 면역화가 공동으로) 3 내지 50회, 예를 들어 5 내지 40회 또는 10 내지 30회 투여를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 1회 이상의 투여 (통상적으로 2 내지 5회 투여)는 동일 시점에 (예를 들어, 같은 날 (day)에, 또는 서로에 대해 같은 날 이내, 서로에 대해 12시간 이내, 서로에 대해 2시간 이내 또는 서로에 대해 1시간 이내) 수행될 수 있다. 후술되는 바와 같이, 동일 시점에 이루어지는 이러한 투여는 동일하거나 상이한 부위에서 수행될 수 있다.
하나 이상의 면역화 또는 모든 면역화는 2 내지 10개, 예를 들어 3 내지 5개의 상이한 시점에서의 투여를 포함할 수 있으며, 이러한 시점은 바람직하게는 상이한 날에 속한다. 따라서, 하나 이상의 면역화 또는 모든 면역화는 2 내지 10개, 예를 들어 3 내지 5개의 상이한 날에의 투여를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제 1 및 제 2 면역화에서, 투여는 3 또는 4개의 상이한 날에 일어난다.
하나 이상의 면역화 또는 모든 면역화에서, 이러한 면역화를 위한 2, 3, 4회 또는 그 이상 투여는 2 내지 14일 간격, 예를 들어 3 내지 10일 또는 4 내지 8일 간격일 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 면역화 또는 모든 면역화에서, 이러한 면역화를 위한 2, 3, 4회 또는 그 이상의 투여는 2 내지 6일 간격이다.
2개의 면역화 사이의 시간은 본원에서는 2개의 면역화의 제 1 투여 사이의 시간으로 정의된다. 통상적으로, 제 1 및 제 2 면역화 사이의 시간 (및 바람직하게는 모든 면역화 사이의 시간)은 21 내지 365일, 예를 들어 28 내지 300일, 50 내지 250일 또는 100 내지 200일이다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법의 모든 면역화는 21 내지 365일, 예를 들어 28일 내지 300일, 50 내지 250일 또는 100 내지 200일에 걸쳐 수행된다.
본 발명의 방법의 하나의 실시양태에서, NOI는 일반적으로 2 내지 5회 (2 내지 5개의 상이한 시점에서), 예를 들어 2, 3 또는 4회 (각각 2, 3 또는 4개의 상이한 시점에서) 투여된다. 통상적으로, 이러한 투여는 2 내지 14일, 예를 들어 4 내지 12일 또는 6 내지 10일에 걸친다. 바람직한 실시양태에서, NOI의 적어도 2, 3 또는 4회 투여가 수행되며, 투여는 3일 이하, 예를 들어 2일 이하로 간격을 둘 수 있다. 하나의 실시양태에서, 제 1 및 제 2 투여 사이의 시간은 4일 미만, 통상적으로 3.5일 미만, 예를 들어 3일 미만 또는 2일 미만이다.
바람직하게는, NOI는 본원에서 논의되는 투여의 중간에 피검체에 투여되지 않으며, 통상적으로 면역 반응을 자극할 수 있는 다른 생성물 (예: 폴리펩티드 항원)은 상기 NOI 투여 중간에 투여되지 않는다. 하나의 실시양태에서, NOI 또는 면역 반응을 자극할 수 있는 다른 생성물 (예: 폴리펩티드 항원)은 본원에서 언급되는 투여 처방에서 NOI의 제 1 투여의 적어도 7일, 예를 들어 적어도 14일 또는 적어도 28일 전에는 피검체에 투여되지 않는다. 하나의 실시양태에서, NOI 또는 면역 반응을 자극할 수 있는 다른 생성물 (예: 폴리펩티드 항원)은 본원에서 언급되는 투여 처방에서 NOI의 최종 투여의 적어도 7일, 예를 들어 적어도 14일 또는 적어도 28일 후에는 피검체에 투여되지 않는다.
통상적으로, NOI가 투여되는 각각의 투여 시 (또는 각각의 시점에서) 피검체에 약 1 pg 내지 약 5 mg의 NOI, 바람직하게는 약 10 pg 내지 약 100 μg의 NOI, 예를 들어 25 pg 내지 1 μg 또는 50 pg 내지 약 500 pg의 NOI가 제공된다. 상술된 바와 같이, 제 2 면역화 및, 적용가능한 경우, 후속한 면역화에서, 단백질이 투여될 수 있다. 통상적으로, 약 0.1 μg 내지 20 mg의 단백질, 바람직하게는 1 μg 내지 5 mg의 단백질, 예를 들어 10 μg 내지 500 μg의 단백질이 각각의 투여 시 (또는 각각의 시점에서) 투여된다.
상술된 바와 같이, 본 발명의 방법에서 NOI 및 임의의 단백질이 또한 투여된다. 일부 실시양태에서, NOI 또는 단백질은 아주반트 또는 이를 코딩하는 NOI와 공동-투여된다. 이러한 실시양태에서, 아주반트는 바람직하게는 이. 콜라이 (E. coli) 열-불안정 엔테로톡신 (LT) 또는 비브리오 콜레라 (Vibrio Cholerae) 콜레라 독소 (CT)의 무독성 형태이다. 아주반트는 LT 엔테로톡신의 A 또는 B 서브유니트 (LTB) 또는 CT 콜레라 독소의 B 서브유니트 (CTB)를 포함할 수 있다.
아주반트, 특히, 유전자 아주반트의 포함은 CMI 반응을 추가로 향상시키거나 조절하는데 유용하다. 따라서, CMI 반응을 향상시키기 위한 본 발명의 방법은, NOI 또는 단백질 (또는 NOI 또는 단백질을 포함하는 조성물)에 아주반트를 첨가함으로써 개선되어, 장기간의 지속적인 향상된 CMI 반응을 유도하기 위한 특히 효과적인 조성물 및 방법을 제공할 수 있다.
NOI 또는 단백질은 바람직하게는 입자로 투여된다. 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, NOI 또는 단백질은 경피적으로 투여된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 입자는 입자 가속화 디바이스에 의해 숙주 포유동물 피검체에 투여된다.
하나의 실시양태에서, 투여 처방 수행 후 이러한 투여 처방이 CMI (예: CTL 반응)의 자극을 유도하였는가를 확인한다. 이는, 예를 들어 피검체로부터의 샘플에서 T 세포 (예: CTL)의 존재 또는 수준을 측정함으로써 수행될 수 있다. 검출되는 T 세포는 일반적으로 NOI에 의해 코딩되는 에피토프에 특이적이다.
본 발명의 다른 양상은 첨부된 특허청구범위 및 하기한 기재 및 도면에 제시된다. 이들 양상은 각각의 단락의 제목 하에 제시된다. 그러나, 각각의 단락 하에서의 교시가 반드시 그러한 특정 단락 제목으로만 제한되지는 않는 것으로 이해되어야 한다.
정의
본 발명은, 당연히 가변적일 수 있으므로 특정의 예시된 분자 또는 공정 변수에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정 실시양태를 기재하기 위한 목적이기 때문에 제한을 의도하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 실시는, 달리 언급이 없는 한, 모두가 당 분야의 통상의 기술에 속하는, 바이러스학, 미생물학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술 및 면역학에 대한 통상의 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]; [DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.)]; [Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984)]; [A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]; 및 [Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)]에서 충분히 설명된다.
상기 및 하기의 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 전문이 참조로 본원에 삽입된다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는, 그 내용이 달리 명백히 지시하지 않는 한, 복수 형태를 포함한다는 것을 주목해야 한다. 본원에 사용된 모든 과학적 및 기술적 용어는, 달리 구체화되지 않는 한, 당 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어 또는 구는 구체화된 의미를 갖는다.
면역 반응
면역계가 질환을 제어하는 메카니즘은 체액성 면역을 통한 중화 항체의 유도 및 세포성 면역을 통한 T-세포 반응의 유도를 포함한다. 본원에 사용된 용어, TA (EOI 포함)에 대한 "면역 반응"은 숙주 포유동물 피검체에서 TA에 대한 체액성 및(또는) 세포성 면역 반응의 전개를 언급한다.
본원에 사용된 용어, "체액성 면역 반응"은 항체 분자에 의해 매개되는 면역 반응을 언급한다. 체액성 면역에 의해 생성되는 항체는 주로 세포외 감염제에 대해 효과적이다.
본원에 사용된 용어 "세포 매개된 면역 (CMI) 반응"은 T-림프구 및(또는) 다른 백혈구에 의해 매개되는 것이다. CMI 면역 메카니즘은, TA가 나중에 나타날 때 기억 T 세포가 활성화되어 상응하는 TA를 갖는 표적 세포 또는 이들 세포 표면 상의 이의 부분을 파괴하여 이로써 감염화 병원체를 파괴하는 CMI 반응을 일으키도록 CMI 메카니즘이 T 세포를 프라이밍 (priming) 하기 때문에, 일반적으로 세포내 감염 및 질환에 대해 보다 효과적이다. CMI 반응은 직접적인 세포-대-세포 접촉 및(또는) 항-바이러스 활성을 갖는 사이토킨과 같은 분자의 방출에 의해 숙주의 감염된 세포를 파괴하는 이펙터 세포에 의해 매개되는 감염원의 파괴에 집중된다. 따라서, 특이적 T 림프구 세포성 반응으로 특징지워지는 CMI 반응은 암, 바이러스, 병원체 및 기타 세포내 미생물에 의해 발병되는 질환에 대한 내성을 생성하는데 중요하다.
CMI 반응에 관련된 T 세포
적어도 2개의 특정 타입의 T 세포가 CMI 및 체액성 반응을 개시 및(또는) 향상시키는데 필요하다. CD4 공동-수용체를 발현하는 특정 서브세트의 T 세포에 대한 항원성 수용체는 T 헬퍼 (Th) 세포 또는 CD4 T 세포 (이하에서는 T 헬퍼 세포라고 칭함)일 수 있으며, 이들은 MHC 부류 II 분자에 결합된 항원성 펩티드를 인지한다. 이와는 대조적으로, CD8 공동-수용체를 발현하는 특정 서브세트의 T 세포에 대한 항원성 수용체는 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte: CTL) 또는 CD8+ T 세포 (이하 CD8+ T 세포라 칭함)이라 불리며, 이들은 MHC 부류 I 분자 상에 제시되는 항원과 반응한다.
헬퍼 T 세포
헬퍼 T 세포 또는 CD4+ 세포는 2개의 기능적으로 상이한 서브세트 (사이토킨 및 이펙터 기능이 상이한 Th1 및 Th2)로 더욱 분류될 수 있다. Th1 및 Th2 반응은, Thl 세포 반응이 IL-2, IL-12 및 IFN-감마와 같은 Th1 사이토킨에 의해 증대되고 IL-4 및 IL-10과 같은 Th2 사이토킨에 의해 감소되도록 포지티브 및 네가티브 방식으로 조절된다. 이와는 대조적으로, 항체 반응은 IL-4 및 IL-10과 같은 Th2 사이토킨에 의해 향상되지만, IFN-감마 및 IFN-감마를 향상시키고 단핵구에 의해 생산되는 또 다른 사이토킨 IL-12와 같은 Th1 사이토킨에 의해 하향조절된다. 따라서, 전형적인 Th1 사이토킨, 예를 들어 IFN-감마, IL-2 및 IL-12는 염증 반응을 유도하는 면역 보조-인자로서 간주될 수 있다. 이와는 대조적으로, 전형의 Th2 사이토킨, 예를 들어 IL-4 및 IL-10은 일부 상황에서 심각한 염증 반응을 억제하는 사이토킨으로 간주될 수 있다.
CD8 + T 세포
CD8+ T 세포는 하나 이상의 방식으로 기능할 수 있다. CD8+ T 세포의 가장 잘 알려진 기능은 MHC 부류 I 분자와의 연계속에서 펩티드 항원을 갖는 표적 세포를 죽이거나 용해시키는 것이다. 이것이 바로 이들 세포가 통상 세포독성 T 림프구 (CTL)로 불리는 이유이다. 그러나, 아마도 특정 감염에서 보다 큰 보호적 관련성을 갖는, 또 다른 기능은 인터페론 감마 (IFN-감마)를 분비하는 CD8+ T 세포의 능력이다. 따라서, 분해 활성 및 IFN-감마 방출의 검정은 (예를 들어 후술되는 바와 같이 ELISPOT 검정에서) CD8+ T 세포성 면역 반응을 측정하는데 있어 모두 가치있는 것이다. 감염성 질환에서, CD8+ T 세포가 질환의 임의의 징후가 나타나기 전인 질환의 초기 단계에서 감염성 항원을 포함하는 감염제를 죽임으로써 이러한 질환으로부터 보호할 수 있다는 증거가 있다.
향상된 CMI 반응
본 발명은 표적 항원에 대한 숙주 피검체에서의 CMI 반응을 향상 및(또는) 조절할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어, "향상"은, 이로 제한됨이 없이, TA의 EOI를 코딩하는 반복 투여되는 NOI에 대한 CMI 반응의 크기 및(또는) 지속기간 및(또는) 질의 자극 및(또는) 증대 및(또는) 증강 및(또는) 상향조절을 포함하여, 모든 양상의 CMI 반응에서의 개선을 포함한다. 예로써, CMI 반응은 (i) 표적 항원을 인식하는 CD8+ T 세포의 활성화 및(또는) 생성 및(또는) 증식을 향상시키고(시키거나) (ii) Th2 타입 반응으로부터 Th1 타입 반응으로의 CMI 반응의 이동에 의해 향상될 수 있다. Th1 관련된 반응의 이러한 향상은 상술된 바와 같이 CMI 반응이 활성화된 Th1 (예: IFN-감마 유도) 세포에 의해 향상되기 때문에 세포내 감염에 반응하는데 특히 가치가 있다.
이러한 면역 반응은 일반적으로 인터페론-생성 CD4+ 및(또는) CD8+ T 림프구의 증가된 역가, 증가된 항원-특이적 CD8+ T 세포 활성, 및 T 헬퍼 2-형 면역 반응 (Th2) 대신에 목적 항원에 대한 T 헬퍼 1-형 면역 반응 (Th1) (통상 체액성 면역과 관련된 아류의 항체 (예: IgG1)의 역가의 동반된 감소와 함께, 통상 세포성 면역과 관련된 아류의 항체 (예: IgG2a)의 항원-특이적 역가의 증가로 특징지워짐)으로 특징지워질 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 유도되는 반응 (예: CMI 반응의 향상)은 많은 공지된 검정, 예를 들어 림프구-증식 (림프구 활성화) 검정, CD8+ T 세포 검정, 감작화된 피검체에서 에피토프에 특이적인 T-림프구에 대한 검정 (예를 들어, 문헌 [Erickson et al. (1993) J. Immunol. 151: 4189-4199]; 및 [Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 2369-2376] 참조) 또는 인터페론 감마 생성을 측정하기 위한 CD8+ T 세포 ELISPOT 검정 [Miyahara et al., PNAS (USA) (1998) 95: 3954-3959]에 의해 측정될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 방법은 조절적 또는 억제자 T 세포 반응을 유도한다. 이러한 반응의 유도는, 예를 들어 자가면역 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있다.
향상된 T-세포 반응
본원의 개시사항에서 반응의 유도는 대개 CMI 반응을 유도한다는 면에서 논의된다. CMI 반응의 유도는 T 세포 반응의 유도를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 방법에 의해 유도되는 반응은 "향상된" 반응일 수 있다. "향상된" 반응은 본 발명의 방법에 의해 유도된 반응이, 대조 방법 (이 방법에서, NOI (및, 적용가능한 경우, 또한 단백질)은 본 발명의 방법에서 투여되는 것과 동일한 양이 투여된다)에서 유도된 반응보다 큰 경우에 일어나는 것으로 표현될 수 있다. 이러한 대조 방법은, 예를 들어 단일 투여의 NOI (및, 적용가능한 경우, 또한 단백질)의 투여로 이루어질 수 있다. 달리, 대조 방법은 28일 간격으로 2회 분리 투여되는 NOI (및, 적용가능한 경우, 또한 단백질)의 투여로 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "T-세포 반응 향상"은, 이로 제한됨이 없이, TA의 EOI를 코딩하는 반복 투여되는 NOI에 대한 T-세포 반응의 크기 및(또는) 지속기간 및(또는) 질의 자극 및(또는) 증대 및(또는) 증강 및(또는) 상향조절을 포함하여, 모든 양상의 T-세포 반응에서의 개선을 포함한다. 예를 들어, T-세포 반응은 유도된 T-세포의 활성화 및(또는) 생성 및(또는) 분배 및(또는) 증식 및(또는) TA로부터의 EOI를 코딩하는 T-세포 유도/조절 NOI에 대한 T-세포 반응의 수명을 향상시킴으로써 향상될 수 있다. 숙주 피검체에서 T-세포 반응의 향상은 숙주 피검체에서 Th1 면역 반응의 향상 및(또는) 조절과 관련될 수 있다.
T-세포 반응의 향상은 다양한 널리 공지된 검정, 예를 들어 림프구-증식 (림프구 활성화) 검정, CD8+ T-세포 세포독성 세포 검정, 감작화된 피검체에서 에피토프에 특이적인 T-림프구에 대한 검정 (예를 들어, 문헌 [Erickson et al. (1993) J. Immunol. 151: 4189-4199]; 및 [Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 2369-2376] 참조) 또는 인터페론 감마 생성을 측정하기 위한 CD8+ T 세포 ELISPOT 검정 [Miyahara et al., PNAS (USA) (1998) 95: 3954-3959]에 의해 측정될 수 있다.
항원
각각의 질환 원인제 또는 질환 상태는, 항원, 또는 면역 인지 및 숙주에서 질환 원인제 또는 질환 상태의 궁극적인 제거 또는 제어에 중요한 항원 상의 면역지배 에피토프와 관련된다. 특정 질환에 대한 체액성 및(또는) 세포성 면역 반응을 늘리기 위해, 숙주 면역계는 질환 상태와 관련된 항원 또는 항원 상의 면역지배 에피토프와 접촉해야 한다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 개체에서 면역학적 반응을 유도할 수 있는 일반적으로 거대분자인 임의의 작용제 (agent)를 언급한다. 면역 반응은 B-세포 및(또는) T-림프구 세포의 것일 수 있다. 이 용어는 각각의 거대분자 또는 항원성 거대분자의 균질 또는 이질 집단을 언급하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "항원"은 하나 이상의 항원성 결정인자 또는 에피토프를 포함하는 단백질 분자 또는 이의 부분을 언급하기 위해 사용된다.
표적 항원
본원에 사용된 용어 "표적 항원 (TA)"는 감염성 병원체, 예를 들어 이로 제한됨이 없이 세균, 바이러스, 진균, 효모, 기생생물, 및 포유동물 종을 감염시킬 수 있는 다른 미생물에 대한 CMI 반응을 유도할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 목적 면역원성 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 표적 항원은, 이로 제한됨이 없이, 자가 항원, 자체-항원, 교차-반응 항원, 동종이계 항원, 면역허용원 (tolerogen), 알레르겐, 합텐, 면역원 또는 이의 일부 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 따라서, EOI는 본원에 언급된 임의의 타입의 항원 또는 단백질 또는 본원에 언급된 임의의 특이적 항원 또는 단백질로부터의 것일 수 있다.
에피토프
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 일반적으로 T-세포 수용체 및(또는) 항체에 의해 인지되는 표적 항원 상의 부위를 언급한다. 바람직하게는, 단백질 항원으로부터 유도되거나 이의 일부인 짧은 펩티드이다. 그러나, 상기 용어는 또한 글리코펩티드 및 탄수화물 에피토프를 갖는 펩티드를 포함하고자 한다. 단일 항원성 분자는 수개의 상이한 에피토프를 포함할 수 있다. 용어 "에피토프"는 또한 전체 유기체를 인지하는 반응을 자극하는 아미노산 또는 탄수화물의 변형된 서열을 포함한다. 선택된 에피토프가 감염성 질환을 유발하는 감염제 (예: 세균 또는 바이러스)의 에피토프인 경우가 유리하다.
본원에 사용된 용어 "목적 에피토프 (EOI)"는 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 하나 이상의 EOI를 언급한다. 본 발명의 방법은 1, 2, 3, 4, 5 내지 10개 또는 그 이상의 상이한 에피토프에 대한 T 세포 반응을 유도하는데 이용될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 1, 2, 3, 4, 5 내지 10개 또는 그 이상의 상이한 에피토프를 함께 코딩하는 하나 이상의 NOI의 투여 및(또는) 1, 2, 3, 4, 5 내지 10개 또는 그 이상의 상이한 에피토프를 함께 포함하는 하나 이상의 단백질의 투여를 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 방법은 통상적으로 미리 결정되고(되거나) 공지된 단백질로부터 미리 결정 (또는 미리 규정)되고(되거나) 공지된 에피토프에 대한 T 세포 반응을 유도하기 위해 수행된다.
에피토프의 공급원
EOI는 펩티드 또는 폴리펩티드의 아미노산 및 상응하는 DNA 서열에 대한 지식, 및 특정 아미노산의 특성 (예: 크기, 하전 등) 및 코돈 딕셔너리로부터 과도한 실험 없이 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ivan Roitt, Essential Immunology, 1988]; Kendrew, 상기 문헌; [Janis Kuby, Immunology, 1992 e.g., pp. 79-81] 참조). 반응을 자극할 목적 단백질 또는 에피토프 여부를 결정하는 지침은 펩티드 길이를 포함한다: MHC 부류 I 복합체에 맞추기 위한 펩티드의 아미노산 길이는 적어도 8 또는 9개 아미노산이고, MHC 부류 II 복합체에 맞추기 위한 펩티드의 아미노산 길이는 적어도 8 내지 25개, 예를 들어 13 내지 25개 아미노산이어야 한다. 이러한 길이는 펩티드가 MHC 복합체에 결합하기 위한 최소한의 길이이다. 세포가 펩티드를 절단할 수 있기 때문에 펩티드는 이러한 길이보다 긴 것이 바람직하다. 상기 펩티드는, 펩티드가 면역 반응을 생성하기에 충분히 높은 특이성으로 다양한 부류 I 또는 부류 II 분자에 결합할 수 있게 할 적합한 앵커 모티프를 포함해야 한다 (문헌 [Bocchia, M. et al., Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Pentides to HLA Class I Molecules, Blood 85: 2680-2684]; [Englehard, VH, Structure of peptides associated with class I and class II MHC molecules Ann. Rev. Immunol. 12: 181 (1994)] 참조). 이는 과도한 실험 없이도 목적 단백질의 서열을 MHC 분자와 관련된 펩티드의 공개된 구조와 비교하여 수행될 수 있다. 따라서, 당업자는 단백질 서열을 단백질 데이터베이스에 열거된 서열과 비교하여 목적 에피토프를 확인할 수 있다.
본 발명의 방법은 일반적으로 폭넓게 다양한 감염제, 예를 들어 바이러스 또는 기생생물로부터의 것을 포함하여 임의의 공급원 (예: 병원체)으로부터의 EOI를 코딩하는 NOI에 대한 CMI 반응을 향상시키는데 적용가능하다. 예를 들어, EOI는 유기체에서 비제한적으로 증식하여 병적 성장을 이끌 수 있는 종양 세포로부터 유래된 병원성 작용제로부터 유도될 수 있다. 이러한 병원성 작용제의 예가 문헌 [Davis, B. D. et al., Microbiology, 3rd ed., Harper International Edition]에 기재되어 있다.
에피토프는 비-포유동물, 비-마우스 또는 비-사람 단백질로부터의 것일 수 있다. 에피토프는 세포내 단백질 또는 세포외 단백질로부터의 것일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 에피토프는 분비된 단백질, 예를 들어 병원체에 의해 분비된 단백질로부터의 것이다. 상기 에피토프는 T 세포 반응이 유도되는 피검체의 단백질로부터 것이거나 아닐 수 있다. 상기 에피토프는 피검체를 감염시킬 수 있는 병원체로부터의 것일 수 있다. 상기 에피토프는 자연 발생적 에피토프 또는 자연에서 발견되지 않는 인위적 에피토프일 수 있다.
그러나, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 HIV 바이러스 패밀리의 성분에 대해 CMI 반응을 향상시키는 것을 예시할 수 있다. 향상된 CMI 반응은 바이러스 유전자, 예를 들어 gag, pol, nef 및 env 유전자의 생성물 내에 있는 EOI에 대해 생성될 수 있으며, env 유전자의 생성물이 바람직한 표적물이다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명의 방법은 HIV 감염 및(또는) HIV 감염에 의해 유발되거나 악화되는 임의의 상태, 예를 들어 AIDA의 치료 및(또는) 예방을 위한 특정 항원에 대한 면역 반응을 유도한다.
T 세포 에피토프
본 발명의 방법 또는 공정에서, TA의 EOI는 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "T 세포 에피토프"는 일반적으로 T 세포 반응을 유도할 수 있는 펩티드 구조의 특징을 언급한다. 이에 대해, 당 기술 분야에서는 T 세포 에피토프가 MHC 분자의 펩티드-결합 틈 (cleft) 내에서 펼친 (extended) 구조를 취하는 선형 펩티드 결정자를 포함한다고 받아들여진다 [Unanue et al. (1987) Science 236: 551-557]. 본원에 사용된 바와 같이, T 세포 에피토프는 일반적으로 적어도 약 3 내지 5개 아미노산 잔기, 바람직하게는 적어도 5 내지 10개 또는 그 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 8 내지 25개 아미노산 잔기를 갖는 펩티드이다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "T 세포 에피토프"는 MHC 부류 I 또는 MHC 부류 II 제한된 펩티드를 포함한다. CMI 반응을 자극/향상시킬 특정 T 세포 에피토프의 능력은 많은 널리 공지된 검정, 예를 들어 림프구-증식 (림프구 활성화) 검정, CD8+ T-세포 세포독성 세포 검정, 감작화된 피검체에서 에피토프에 특이적인 T-림프구에 대한 검정 (예를 들어, 문헌 [Erickson et al. (1993) J. Immunol. 151: 4189-4199]; 및 [Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 2369-2376] 참조) 또는 인터페론 감마 생성을 측정하기 위한 CD8+ T 세포 ELISPOT 검정 [Miyahara et al., PNAS (USA) (1998) 95: 3954-3959]에 의해 측정될 수 있다.
CD8 + T-세포 에피토프
바람직하게는, EOI는 CD8+ T-세포 EOI이다. CD8+ T-세포-유도 EOI는 숙주 피검체에 투여한 후 특이적 CD8+ T-세포의 형성을 자극하거나 활성을 증가시킬 수 있는 에피토프이다. CD8+ T-세포 에피토프는 1 또는 2개 또는 그 이상의 에피토프의 재조합 스트링 (string)과 같은 다양한 여러가지 형태로 제공될 수 있다. 많은 여러가지 질환에 대한 CD8+ T-세포 에피토프가 확인되었으며 문헌에서 찾을 수 있다. CD8+ T-세포 EOI를 함유하는 임의의 선택된 TA에 대한 CD8+ T-세포 반응을 생성하기 위한 에피토프 스트링을 디자인할 수 있다. 유리하게는, NOI에서 CI8+ T-세포 EOI는 불필요한 핵산 물질이 피해지도록 방해하는 서열 없이 함께 연결된 다수의 EOI의 스트링으로 제공될 수 있다. 하나의 실시양태에서, NOI는 또한 발현된 단백질로부터의 에피토프가 절단되도록 프로테아제 절단 부위로서 작용할 수 있는 서열을 코딩한다.
T 헬퍼 에피토프
바람직하게는, EOI는 헬퍼 T 림프구 EOI이다. 본원에 따라 사용하기에 적합한 T 헬퍼 세포 EOI를 확인하기 위한 다양한 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 펩티드 서열의 양쪽 친매성이 T 헬퍼 세포 유도자로서 기능할 능력을 발휘하게 하는 것으로 공지되어 있다. T 헬퍼 세포-유도 에피토프에 대한 충분한 논의가 본원에 참조로 삽입된 미국 특허 제5,128,319호에 나타나 있다.
B 세포 에피토프
바람직하게는, EOI는 CD8+ T-세포 EOI와 B 세포 EOI의 혼합물이다. 본원에 사용된 용어 "B 세포 에피토프"는 일반적으로 특정 항체 분자가 결합하는 TA 상의 부위를 언급한다. 항체 반응을 유도할 수 있는 에피토프의 확인은 당 기술 분야에서 널리 공지된 기술을 이용하여 쉽게 수행된다 (예를 들어, 문헌 [Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002] (지정된 항원에서 면역원성 에피토프의 위치를 결정하기 위해 펩티드를 신속하게 합성하는 방법); 미국 특허 제4,708,871호 (항원에 대한 에피토프를 확인하고 화학적으로 합성하기 위한 절차); 및 [Geysen et al. (1986) Molecular Immunology 23: 709-715] (지정된 항체에 대해 높은 친화성을 갖는 펩티드를 확인하기 위한 기술) 참조).
에피토프의 조합
본 발명의 바람직한 실시양태에서, EOI는 CD8+ T-세포-유도 EOI와 T 헬퍼 세포-유도 EOI의 혼합물이다.
당 기술 분야에서 널리 공지되어 있는 바와 같이, T 및 B 세포 유도 에피토프는 일반적으로 서로 상이하고, 상이한 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 단백질의 펩티드 쇄의 특정 영역은 T 세포 또는 B 세포 에피토프를 함유할 수 있다. 따라서, CD8+ T-세포 에피토프에 추가하여, CD8+ T-세포 에피토프에 의해 생성된 면역 반응을 증강시키기 위해 T 헬퍼 세포에 의해 인지되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
T 헬퍼 세포 유도제에 의해 생체 내에서 CD8+ T-세포 유도된 반응을 향상시키는 메카니즘이 완전히 석명되지는 않았다. 그러나, 이론에 구애됨이 없이, 향상제는 T 헬퍼 세포를 유도하는 능력으로 특정 CD8+ T-세포의 클로날 팽창 및 보급을 돕는데 필요한 사이토킨의 수준을 증가시킬 것으로 보인다. 기초 메카니즘에 관계 없이, 본 발명의 방법에서 헬퍼 T 세포와 CD8+ T-세포-유도 EOI의 혼합물의 사용이 CMI 반응을 향상시키는 것을 도울 것으로 생각된다. 특히 적합한 T 헬퍼 세포 에피토프는 상이한 HLA 타입의 개체에서 활성인 것, 예를 들어 파상풍균으로부터의 T 헬퍼 에피토프 (이에 대해 대부분의 개체는 이미 프라이밍된 바 있을 것이다)이다. 또한, B 세포 반응 및 항체 생성을 자극하기 위한 B 세포 EOI를 포함하는 것이 유리할 수 있다. 또한, 합성 NOI는 2개 타입의 면역 반응 (T 세포 반응 단독 및 B 세포 반응과 조합된 T 세포 반응)을 생성하도록 제작될 수 있다.
면역지배 에피토프
개체가 TA의 다수 EOI를 코딩하는 NOI로 면역화되는 경우, 많은 경우에서 대부분의 반응 T 림프구는 그 TA로부터의 하나 이상의 선형 EOI에 대해 특이적일 것이고/이거나 대부분의 반응 B 림프구는 그 TA로부터의 하나 이상의 선형 또는 구조적 EOI에 대해 특이적일 것이다. 본 발명의 목적상, 이러한 EOI는 "면역지배 에피토프"로 언급된다. 수개의 면역지배 EOI를 갖는 항원에서, 단독 EOI는 특이적 T 또는 B 세포 반응을 지휘한다는 면에서 가장 지배적일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법 또는 공정은 하나 이상의 HSV-2 에피토프에 대한 CMI 반응을 향상시키는데 효과적이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법 또는 공정은 하나 이상의 면역지배 HSV-2 에피토프에 대한 CMI 반응을 향상시키는데 효과적이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 하나 이상의 HbsAg 에피토프에 대한 CMI 반응을 생성/향상시키는데 효과적이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 하나 이상의 면역지배 HbsAg 에피토프에 대한 CMI 반응을 생성/향상시키는데 효과적이다.
하기 실시예에 나타나는 바와 같이, HSV-2 및 HbsAg EOI 모두에 대해 수득된 향상된 CMI 반응은, 본 발명의 방법이 일반적으로 다양한 감염성 병원체로부터의 EOI에 대해 효과적이라는 것을 나타낸다. 또한, 바이러스 챌린지에 대한 보호적 효과는, 강력한 CD8+ T-세포 반응의 생성이 예방적 및 치료학적 백신처리 계획의 전개에 가치있음을 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명의 방법 또는 공정은 종양 관련된 항원 (tumor associated antigen: TAA)와 관련된 하나 이상의 EOI에 대한 향상된 CMI 반응을 유도하는데 효과적이다. 유리하게는, TAA로부터 유래된 EOI는 숙주 면역계에 대한 표적물로서 작용하고 종양을 파괴하는 반응을 유도할 수 있다. 이러한 TAA의 예는, 이로 제한됨이 없이, T 세포-1에 의해 인지되는 흑색종 항원 (Melanoma Antigen Recognised by T cells-1: MART-1), MAGE-1, MAGE-3, 5T4, gp100, 암종태아성 항원 (Carcinoembryonic antigen: CEA), 전립선-특이적 항원 (prostate-specific antigen: PSA), 뮤신 (MUC-1), 티로시나제를 포함한다. 다른 TAA는 당 기술 분야에서 공지된 방법으로 확인, 분리 및 클로닝되는 것, 예를 들어 미국 특허제4,514,506호에 개시된 것일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, NOI는 적어도 2개의 HIV 항원을 코딩한다. NOI는 HIV gag 단백질 또는 에피토프를 함유하는 이의 단편, 및 하나 이상의 HIV 항원 또는 에피토프를 함유하는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 상기 항원은 이용가능한 HIV 단리물 (통상적으로 HIV-1), 예를 들어 HXB2로부터 유래될 수 있다. 상기 항원은 gag 항원 (또는 에피토프를 함유하는 이의 단편), 예를 들어 p24gag 및 p55gag, 및 HIV의 pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu 및 LTR 영역으로부터 유래된 단백질 (또는 에피토프를 함유하는 이의 단편)을 포함할 수 있다.
보다 바람직한 실시양태에서, NOI는 적어도 3개의 HIV 항원, 바람직하게는 Gag, nef 및 RT (또는 전체 단백질 대신에 에피토프를 함유하는 이들 단백질의 단편)를 코딩한다. 이들 코딩 서열은 임의의 순서일 수 있으나, 바람직하게는 Nef-RT-Gag, RT-Nef, Gag 또는 RT-Gag-Nef의 순서이다.
하나의 실시양태에서, 발현되는 HIV 에피토프/단백질은 융합 단백질, 예를 들어 Nef, RT 및 Gag로부터의 서열 (상술된 단편을 포함)을 함유하는 융합 단백질이다.
바람직한 실시양태에서, gag 유전자는 gag p6 펩티드를 코딩하지 않는다. 바람직하게는, NOI 중의 nef 유전자는 N 말단 81개 아미노산을 코딩하는 서열을 제거하기 위해 절단된다.
NOI에 의해 코딩되는 gag 또는 임의의 다른 HIV 항원 (예: nef 또는 RT)의 단편은 에피토프를 포함한다. NOI에 의해 코딩되는 단백질 (이의 단편을 포함)은 일반적으로 길이가 적어도 8개 아미노산, 예를 들어 8 내지 10개 아미노산 또는 20, 50, 60, 70, 80, 100, 150 또는 200개 이하의 아미노산이다. 이러한 단백질은, 예를 들어 단편이 고도로 발현되는 포유동물 유전자의 코돈 사용 패턴을 닮은 패턴을 갖도록, 코돈이 최적화될 수 있다.
하나의 실시양태에서, NOI는 하기 폴리펩티드 조합물 중 하나를 코딩한다:
I. p17, p24, 절단된 NEF (말단 아미노산 1 내지 85를 코딩하는 뉴클레오티드 부재)에 융합.
II. p17, p24, RT, 절단된 NEF (말단 아미노산 1 내지 85를 코딩하는 뉴클레오티드 부재).
III. p17, p24 (최적화된 gag), 절단된 NEF (말단 아미노산 1 내지 85를 코딩하는 뉴클레오티드 부재).
IV. p17, p24 (최적화된 gag), RT (최적화됨), 절단된 NEF (말단 아미노산 1 내지 85를 코딩하는 뉴클레오티드 부재).
V. p17, p24, RT (최적화됨), 절단된 NEF (말단 아미노산 1 내지 85를 코딩하는 뉴클레오티드 부재).
바람직한 실시양태에서, NOI는 아이오와 길이 (Iowa length) HCMV 프로모터 + 엑손 1의 하부 및(또는) 토끼 글로빈 폴리-아데닐화 시그널의 상부에 임의로 작동적으로 연결된, 불활성화되고 코돈 최적화된 RT, 절단된 Nef 및 코돈 최적화된 gag 유전자의 p17/p24 부분 (예를 들어 국제 공개 제WO 03/025003호에 기재된 것)을 포함한다. 폴리아데닐화 시그널은 토끼 베타 글로빈 유전자의 것일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, NOI는 도 18 내지 도 22에 나타낸 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 적어도 하나의 에피토프 (바람직하게는 T 세포 에피토프)를 코딩하는 이러한 서열의 단편; 또는 도 18 내지 22의 서열의 상동체 또는 상기 단편의 상동체를 포함한다. 이러한 단편 또는 상동체는 통상적으로 적어도 50개, 예를 들어 적어도 100, 200, 500 또는 1000개의 뉴클레오티드의 길이이다. 하나의 실시양태에서, NOI는 도 17 또는 20 내지 22에 나타낸 바와 같은 플라스미드 또는 이들 플라스미드의 단편 또는 유도체 (상동체 포함)의 형태이다. 플라스미드의 제작이 국제 공개 제WO 03/080112호 (참조로 본원에 삽입됨)에 기재되어 있다.
최적화된 코돈
본 발명의 바람직한 실시양태에서, NOI의 코딩 서열은 포유동물 세포에서 고도로 발현되는 유전자의 코돈 사용을 닮도록 최적화된다. DNA 코드는 4 문자 (A, T, C 및 G)를 가지며, 유기체 유전자에 코딩되는 단백질의 아미노산을 나타내는 3 문자 "코돈"을 쓰기 위해 이들 4 문자를 이용한다. DNA 분자를 따라 코돈의 선형 서열이 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산에 대한 선형 서열로 해독된다. 코돈은 고도로 축퇴되어 있으며, 61개 코돈이 20개 천연 아미노산을 코딩하고 3개의 코돈이 "정지" 시그널을 나타낸다. 따라서, 대부분의 아미노산은 하나 이상의 코돈에 의해 코딩되며, 사실상 수개의 아미노산이 4개 이상의 상이한 코돈에 의해 코딩된다.
하나 이상의 코돈이 지정된 아미노산을 코딩하기 위해 이용가능한 경우, 유기체의 코돈 사용 패턴은 고도로 비-임의적인 것으로 관측되었다. 상이한 종은 이들의 코돈 선택에 있어 상이한 경향을 나타내며, 코돈의 사용은 단일 종에서 높거나 낮은 수준으로 발현되는 유전자 사이에 뚜렷한 차이점이 있을 수 있다. 이러한 경향은 바이러스, 식물, 세균 및 포유동물 세포에서 상이하고, 일부 종은 다른 종보다 임의 코돈 선택으로부터 멀어져 보다 강한 경향을 나타낸다.
예를 들어, 사람 및 기타 포유동물은 특정 세균 또는 바이러스보다 덜 강하게 편향된다. 이러한 이유로, 이. 콜라이에서 발현되는 포유동물 유전자 또는 포유동물 세포에서 발현되는 바이러스 유전자가 효과적인 발현을 위해 코돈의 부적당한 분포를 가질 상당한 가능성이 있다. 발현이 일어날 숙주에서 드물게 관측되는 코돈 무리의 이종 DNA 서열의 존재는 이러한 숙주에서 낮은 이종 발현 수준의 전조로 믿어진다.
NOI에서, 코돈 사용 패턴은 천연에서 발견되는 패턴으로부터 변화되어 표적 유기체, 예를 들어 포유동물, 특히 사람의 코돈 경향을 더 밀접하게 나타낼 수 있다. "코돈 사용 계수"는 지정된 폴리뉴클레오티드 서열의 코돈 패턴이 표적 종의 패턴을 얼마나 밀접하게 닮는가에 대한 측정이다. 코돈 빈도는 많은 종의 고도로 발현된 유전자에 대한 문헌 자료로부터 유도될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nakamura et al., Nucleic Acids Research 1996, 24: 214-215] 참조). 61개 코돈 각각에 대한 코돈 빈도 (선택된 부류의 유전자에 대한 1000개 코돈 당 발생 수로서 표현됨)가 20개 천연 아미노산 각각에 대해 표준화되어, 각각의 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 대한 값을 1로 설정하고 보다 덜 일반적인 코돈에 대한 빈도는 0 내지 1 사이에 놓이도록 설정한다. 따라서, 61개 코돈 각각이 표적 종의 고도로 발현되는 유전자에 대해 1 또는 보다 낮은 값이 할당된다. 표적 종의 고도로 발현되는 유전자에 대해 특정 폴리뉴클레오티드에 대한 코돈 사용 계수를 계산하기 위해, 특정 폴리뉴클레오티드의 각각의 코돈에 대해 등급을 매긴 값을 주목하여 모든 이들 값의 기하학적 평균을 취한다 (이들 값의 자연 로그의 합을 코돈의 총수로 나누고 진수를 취한다). 그 계수는 0 내지 1 사이의 값을 가질 것이며, 계수가 보다 높을수록 폴리뉴클레오티드에서 보다 많은 코돈이 자주 사용된다. 폴리뉴클레오티드 서열이 1의 코돈 사용 계수를 갖는 경우, 모든 코돈이 표적 종의 고도로 발현되는 유전자에 대한 "가장 빈발하는" 코돈이다.
본 발명에 따라, NOI의 코돈 사용 패턴은 표적 유기체의 고도로 발현되는 유전자에서 0.2 미만의 RSCU (relative synonymous codon usage; 상대 동의 코돈 사용)값을 갖는 코돈을 제거시키는 것이 바람직할 것이다. RSCU 값은 코돈의 관측 수를 아미노산에 대한 모든 코돈이 동일하게 빈번히 사용되는 경우에 예측되는 수로 나눈 것이다. NOI는 일반적으로 고도로 발현되는 사람 유전자에 대해 0.3 보다 큰, 바람직하게는 0.4 보다 큰, 가장 바람직하게는 0.5 보다 큰 코돈 사용 계수를 갖는다. 또한, 사람에 대한 코돈 사용 표를 GenBank에서 찾을 수 있다. 비교로서, 고도로 발현되는 베타 작용 유전자는 RSCU가 0.747이다. 호모 사피엔스에 대한 코돈 사용 표가 하기에 나타나 있다:
호모 사피엔스 [gbpri]: 27143 CDS (12816923 코돈)
필드: [삼중자] [빈도: /1000] ([수])
Figure 112006032523465-PCT00001
코딩 GC 52.51 ％ 제 1 문자 GC 56.04 ％ 제 2 문자 GC 42.35 ％ 제 3 문자 GC 59.13 ％
아주반트
본 발명의 방법 또는 공정은 향상된 CMI 반응을 입증하는데 아주반트의 존재를 필요로 하지 않는다. 그러나, 아주반트, 특히, 유전자 아주반트의 포함은 CMI 반응을 더욱 향상 또는 조절하는데 있어 유용할 수 있다. 아주반트는 면역화된 피검체에서 공동-투여되는 항원의 면역원성을 향상시키고 백신 생성물에서 유리한 공동-투여되는 항원에 대한 Th1-형 면역 반응을 유도함으로써 CMI 반응을 향상시킬 수 있다.
따라서, CMI 반응을 향상시키기 위한 본 발명의 방법 또는 공정은 NOI 또는 단백질 또는 NOI 또는 단백질을 포함하는 조성물에 아주반트를 첨가하여 개선시킴으로써 오랫동안 지속적인 향상된 CMI 반응을 유도하는데 특히 효과적인 조성물 및 방법을 제공할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "아주반트"는 항원-특이적 면역 반응을 특이적으로 또는 비특이적으로 변화, 향상, 지정, 재지정, 강화 또는 개시할 수 있는 물질 또는 조성물을 언급한다.
용어 "아주반트"는, 이로 제한됨이 없이, NOI와 함께 투여되었을 때 NOI 단독 또는 단백질 단독 투여시 생성되는 CMI 반응에 비해 CMI 반응을 향상 또는 증강 또는 조절하는, 세균성 ADP-리보실화 외독소, 생물학적 활성 인자, 면역조절 분자, 생물학적 반응 조절자 또는 면역자극 분자, 예를 들어 사이토킨, 인터루킨, 케모킨 또는 리간드 또는 에피토프 (예: 헬퍼 T 세포 에피토프) 및 임의로 이들의 조합물을 포함한다. 아주반트는 사람 또는 동물 사용에 적합한 당 기술 분야에서 공지된 아주반트일 수 있다.
면역조절 분자, 예를 들어 사이토킨 (TNF-알파, IL-6, GM-CSF, 및 IL-2) 및 공동-자극 및 보조적 분자 (B7-1, B7-2)가 다양한 조합으로 아주반트로서 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, GM-CSF는 투여 처방의 수행 전, 진행 중 또는 수행 후에 피검체에게 투여되지 않는다. EOI의 발현 부위에서 면역조절 분자 및 EOI의 동시 생성은 CMI 반응을 향상시키는 것을 도울 수 있는 특정 이펙터의 생성을 향상시킬 수 있다. CMI 반응의 향상 정도는, 상이한 면역조절 분자가 CMI 반응을 향상 및(또는) 조절하기 위한 상이한 메카니즘을 유도할 수 있기 때문에, 특정 면역조절 분자 및(또는) 아주반트에 의존할 것이다. 예를 들어, 상이한 이펙터 메카니즘/면역조절 분자는, 이로 제한됨이 없이, 헬프 시그널 (IL-2)의 증대, 프로 APC (GM-CSF)의 모집, T 세포 빈도 (IL-2)의 증가, 항원 프로세싱 경로 및 MHC 발현 (IFN-감마 및 TNF-알파)에 대한 효과 및 Th1 반응으로부터 Th2 반응 (LTB)로의 면역 반응의 전환을 포함한다 (국제 공개 제WO 97/02045호). 또한, 비메틸화된 CpG 포함 올리고뉴클레오티드 (국제 공개 제W0 96/02555호)가 Th1 반응에 대한 우선적인 유도자이며 본 발명에서 사용하기에 적합하다.
이론에 구애됨이 없이, 아주반트가 Th2 반응을 Th1 반응으로 전환시키고(시키거나) 발현된 EOI에 대한 특정 이펙터 관련된 메카니즘 (그 결과 향상된 CMI 반응이 생성되고 유지된다)에 의해 발현된 NOI 또는 단백질에 대한 CMI 반응을 향상시키는 것을 도울 수 있기 때문에, 아주반트를 포함시키면 유리하다 (국제 공개 제WO 97/02045호).
또한, NOI 또는 단백질과 함께 아주반트를 포함시키면, NOI 또는 단백질이 투여되는 피검체에서 목적하는 CMI 반응을 달성하는데 필요한 NOI 또는 단백질의 용량 보다 적은 용량이 필요하거나, 피검체에서 질적으로 및(또는) 양적으로 상이한 면역 반응을 생기게 할 수 있기 때문에 유리하다. 아주반트의 유효성은 동물에게 NOI 또는 단백질 단독 투여와 병행하여 NOI 또는 단백질과 함께 아주반트를 투여하고, 2개의 군에서 표준 검정, 예를 들어 방사선면역검정, ELISA, CD8+ T-세포 검정 등의 당 분야에서 널리 공지된 검정을 이용해 항체 및(또는) 세포-매개된 면역을 비교함으로써 결정될 수 있다. 통상적으로, 단일 분자가 아주반트 및 항원 특성을 모두 가질 수 있지만, 아주반트는 항원으로부터의 분리된 잔기이다.
본원에 사용된 용어 "유전자 아주반트 (genetic adjuvant)"는 NOI에 의해 코딩되고, EOI 또는 단백질 (에피토프 포함)을 코딩하는 NOI와 함께 투여되었을 때 NOI 또는 단백질 단독으로 투여할 때 생성되는 CMI 반응에 비해 CMI 반응을 향상시키는 아주반트를 언급한다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 유전자 아주반트는 세균성 ADP-리보실화 외독소이다. ADP-리보실화 세균 독소는 관련 세균 외독소의 일 부류이며, 디프테리아 독소 (diphtheria toxin: DT), 백일해 독소 (pertussis toxin: PT), 콜레라 독소 (cholera toxin: CT), 이 콜라이 열-불안정 독소 (LT1 및 LT2), 슈도모나스 (Pseudomonas) 내독소 A, 슈도모나스 외독소, S, 비. 세레우스 (B. cereus) 엑소엔자임, 비. 스패리쿠스 (B. sphaericus) 독소, 씨. 보툴리늄 (C. botulinum ) C2 및 C3 독소, 씨. 리모숨 (C. limosum) 엑소엔자임, 및 씨. 페르프린젠스 (C. perfringens ), 씨. 스피리포르마 (C. spiriforma) 및 씨. 디피실 (C. difficile)로부터의 독소, 스타필로코쿠스 아 우레우스 (Staphylococcus aureus) EDIN, 및 ADP-리보실화 세균 독소 변이체, 예를 들어 CRMl97, 무독성 디프테리아 독소 변이체 (예를 들어, 문헌 [Bixler et al. (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251: 175]; 및 [Constantino et al. (1992) Vaccine] 참조)를 포함한다. 대부분의 ADP-리보실화 세균 독소는 A:B 멀티머로 구성되며, 여기서 A 서브유니트는 ADP-리보실트랜스퍼라제 활성을 포함하고 B 서브유니트는 결합 잔기로서 작용한다. 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 바람직한 ADP-리보실화 세균 독소는 콜레라 독소 및 이. 콜라이 열-불안정 독소를 포함한다.
콜레라 독소 (CT) 및 관련 이. 콜라이 열-불안정 엔테로톡신 (LT)은, 전신적, 경구적 또는 점막으로 투여되었을 때 강력한 면역원이고 강한 독성을 나타내는, 각각의 엔테로톡신 세균 균주의 분비 생성물이다. CT 및 LT 모두 근육 내 또는 경구 경로를 통해 투여되었을 때 항원에 대한 아주반트 효과를 제공하는 것으로 공지되어 있다. 이들 아주반트 효과는 독성에 필요한 용량 이하에서 관측되었다. 2개의 독소는 극히 유사한 분자이며, 아미노산 수준에서 적어도 약 70 내지 80 ％ 상동적이다.
바람직하게는, 유전자 아주반트는 콜레라 독소 (CT), 엔테로톡신인 이. 콜라 이 열-불안정 독소 (LT), 또는 아주반트능을 보유하는 CT 또는 LT의 유도체, 서브유니트 또는 단편이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 유전자 아주반트는 LT이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 유전자 아주반트는 CTB 또는 LTB일 수 있다.
바람직하게는, 엔테로톡신은 무독성 엔테로톡신이다. 예로써, 엔테로독신 서브유니트 코딩 영역의 적어도 하나가 이로써 코딩되는 서브유니트 펩티드의 독성을 없애기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 절단된 A 서브유니트 코딩 영역이 서브유니트 펩티드 발현 생성물에서 ADP-리보실 트랜스퍼라제 활성을 파괴하거나 불활성화시키기 위해 유전적으로 변형되었다 (국제 공개 제WO 03/004055호).
하기 기재되는 실시예에서, 플라스미드 벡터에 의해 발현되는 천연 A 및 B 서브유니트를 포함하는 LT 홀로톡신이 향상된 CMI 반응을 얻기 위해 HSV-2/HbsAg 항원을 발현하는 NOI와 함께 공동-투여되는 유전자 아주반트로서 사용되었다. 그 결과, 아주반트의 포함으로, 아주반트 없는 NOI 또는 단백질의 투여와 비교하여 전신성 T 세포 반응을 생성함에 있어, CMI 반응을 유도하는 능력이 상당히 개선된다는 것이 입증된다.
따라서, 이러한 결과는 이러한 유전자 아주반트가 보다 향상된 CMI 반응이 필요한 경우에 특히 바람직하다는 것을 나타낸다. 다른 바람직한 유전자 아주반트는, 이로 제한됨이 없이, IL-10, IL-12, IL-13, 인터페론 (IFN) (예:, IFN-알파, IFN-ss 및 IFN-감마), 및 이들의 바람직한 조합물을 코딩하는 NOI를 포함한다. CMI 반응을 향상시키는 다른 생물학적 활성 인자가 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있으며, 이를 포함하는 적합한 플라스미드 벡터가 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다.
NOI
본 발명의 EOI는 EOI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 목적 뉴클레오티드 서열 (nucleotide sequence of interest: NOI)는 본 발명의 방법에 사용되는 하나 이상의 EOI를 코딩하는 하나 이상의 NOI를 언급한다. 용어 "NOI"는 용어 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. NOI는 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원의 DNA 또는 RNA일 수 있다. NOI는 센스 또는 안티센스 가닥 또는 이들의 조합물을 나타내는 이중쇄 또는 단쇄일 수 있다. 일부의 적용에서, 바람직하게는, NOI는 DNA이다. 일부 적용에서, 바람직하게는, NOI는 재조합 DNA 기술 (예: 재조합 DNA)을 이용하여 제조된다. 일부 적용에서, 바람직하게는, NOI는 cDNA이다. 일부 적용에서, 바람직하게는, NOI는 천연 발생의 형태와 동일할 수 있다. NOI는 분리되거나 정제된 형태, 예를 들어 비-세포 형태일 수 있다.
벡터
본 발명의 하나의 실시양태에서, NOI는 숙주 피검체에 직접적으로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, NOI를 포함하는 벡터가 숙주 피검체에 투여된다. 바람직하게는, NOI는 유전자 벡터를 사용하여 제조 및(또는) 투여된다. 당 기술 분야에서 널리 공지되어 있는 바와 같이, 벡터는 하나의 환경으로부터 또 다른 환경으로 실체의 이동을 가능하게 하거나 용이하게 하는 도구이다. 본 발명에 따라, 예시로서, 재조합 DNA 기술에서 이용되는 일부 벡터가 실체 (entity), 예를 들어 DNA의 단편 (예를 들어, 이종 DNA 단편 (예: 이종 cDNA 절편))를, 본 발명의 NOI를 포함하는 벡터를 복제하고(하거나) NOI에 의해 코딩되는 본 발명의 EOI를 발현하기 위한 목적으로, 숙주 및(또는) 표적 세포로 이동시키는 것을 가능하게 한다. 재조합 DNA 기술에 사용되는 벡터의 예는, 이로 제한됨이 없이, 플라스미드, 염색체, 인위적 염색체 또는 바이러스를 포함한다. 용어 "벡터"는 발현 벡터 및(또는) 형질전환 벡터를 포함한다. 용어 "발현 벡터"는 생체 내 또는 시험관 내/생체 외에서 발현할 수 있는 제작물을 의미한다. 용어 "형질전환 벡터"는 하나의 종으로부터 다른 종으로 이동될 수 있는 제작물을 의미한다.
하나의 실시양태에서, 바이러스 프로모터는 NOI로부터 발현을 이끄는데 사용된다. 프로모터는 사이토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus: CMV)일 수 있다. 바람직한 프로모터 요소 (특히, NOI가 HIV 항원을 코딩하는 경우)는 인트론 A가 없고 엑손 1은 포함하는 CMV 즉시형 초기 (immediately early: IE) 프로모터이다. 따라서, NOI로부터의 발현은 HCMV IE 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
네이키드 ( naked ) DNA
본 발명의 NOI를 포함하는 벡터는, 바람직하게는 숙주 세포 게놈에 상동인 플랭킹 서열을 추가로 포함하는, "네이키드 핵산 제작물"로서 직접적으로 투여될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "네이키드 DNA"는 이의 생성을 제어하기 위한 짧은 프로모터 영역과 함께 본 발명의 NOI를 포함하는 플라스미드를 언급한다. 플라스미드는 어떠한 전달 비히클로도 운반되지 않기 때문에 "네이키드" DNA라 불린다. 이러한 DNA 플라스미드가 숙주 세포, 예를 들어 진핵생물 세포에 들어가면, 플라스미드가 코딩하는 단백질이 세포내에서 전사되고 해독된다.
바이러스 벡터
달리, 본 발명의 NOI를 포함하는 벡터는 당 분야에 공지된 다양한 바이러스 기술을 이용해, 예를 들어 레트로바이러스, 단순 포진 바이러스 및 아데노바이러스와 같은 재조합 바이러스 벡터로 감염시켜 적합한 숙주세포로 도입될 수 있다. 상기 벡터는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다. 적합한 재조합 바이러스 벡터는, 이로 제한됨이 없이, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated viral: AAV) 벡터, 헤르페스-바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바쿨로바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터 또는 파르보바이러스 벡터를 포함한다 ([Kestler et al., 1999 Human Gene Ther 10 (10): 1619-32] 참조). 바이러스 벡터의 경우, NOI의 투여는 표적 세포의 바이러스 감염에 의해 매개된다.
표적 벡터
용어 "표적 벡터"는 세포를 감염 또는 형질감염 또는 형질전환하거나 숙주 및(또는) 표적 세포에서 발현될 능력이 숙주 피검체 내의 특정 세포 타입, 일반적으로 공통적 또는 유사한 표현형을 갖는 세포로 제한되는 벡터를 언급한다.
발현 벡터
바람직하게는, 벡터로 삽입되는 본 발명의 NOI는 숙주 세포에 의해 EOI의 발현을 제공할 수 있는 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 즉, 벡터는 발현 벡터이다. 숙주 세포에 의해 생성되는 작용제는 사용되는 NOI 및(또는) 벡터에 따라 분비되거나 세포내로 포함될 수 있다. 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, NOI를 포함하는 발현 벡터는 특정 원핵생물 또는 진핵생물 세포막을 통해 EOI의 분비를 지시하는 시그널 서열을 갖도록 디자인될 수 있다.
융합 단백질
본 발명의 NOI는 수득되는 CMI 반응을 더욱 향상 및(또는) 증대시키기 위해 EOI에 융합된 아주반트 및(또는) 생물학적 반응 변형제 및(또는) 면역조절제를 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 생물학적 반응 개질제는 CMI 반응에 대해 일반화된 자극을 제공한다는 의미에서 아주반트로서 작용할 수 있다. EOI는 생물학적 반응 변형제의 아미노 또는 카르복시 말단에 부착될 수 있다.
에피토프를 포함하는 단백질
단백질 서열은 에피토프 서열과 동일할 수 있다 (즉, N 또는 C 말단에 추가의 서열 없음). 상기 단백질은 통상적으로 비-세포 형태와 같이 분리되거나 정제된 형태이다. 상기 단백질의 길이는 통상적으로 8 내지 400개 아미노산, 예를 들어 10 내지 300개 아미노산 또는 15 내지 150개 아미노산이다.
NOI 및 단백질 투여
NOI 또는 단백질은 다양한 상이한 경로를 통해 단독으로 또는 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 특정 경로는, 보다 효과적인 CMI 반응을 생성하거나 부작용을 유도할 가능성이 적거나 투여가 쉬운 것과 같이, 특정 조성물에 대해 유리할 수 있다. 백신 조성물에 대한 투여 경로는 예방되거나 치료될 병원체 또는 감염물의 확인에 따라 다양할 수 있다.
NOI 또는 단백질은 전신 경로 또는 점막 경로 또는 경피 경로를 통해 투여되거나 특정 조직, 예로 간, 골수로 또는 암 치료의 경우 종양으로 직접적으로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "전신 투여"는, 이로 제한됨이 없이, 모든 비경구 경로의 투여를 포함한다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강 내, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내 또는 흉골 내 주사, 정맥 내, 동맥 내 또는 신장 투석 주입 기술을 포함한다. 바람직하게는, 전신적 비경구 투여는 근육내 주사이다.
본 발명의 방법의 하나의 바람직한 실시양태에서, NOI 또는 단백질은, 예를 들어 경피 경로에 의해 피부를 통해 투여된다. 면역화에 대해 모든 허용되는 방식 및 경로가 이용될 수 있고 이에 따라 이점을 달성할 수 있으나, 하기 실시예는 경피 NOI 투여를 이용한 특정 이점을 입증한다. 이에 대해, 이론에 구애됨이 없이, 경피 투여가 면역계의 세포 매개된 부분을 보다 효과적으로 활성화시키기 때문에 바람직한 것으로 믿어진다.
용어 "경피" 전달은 피부 내 (예: 진피 또는 상피 내로), 경피 (예: "피부 통과") 및 경점막 투여, 즉 피부 또는 점막으로 또는 이들을 통해 작용제의 통과에 의한 전달을 의도한다 (예를 들어, 문헌 [Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989)]; [Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson and Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987)]; 및 [Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987)] 참조). 따라서, 상기 용어는 미국 특허 제5,630,796호에 기재된 바와 같이 입자 전달 디바이스 (예: 바늘 없는 주사기)를 사용한 전달, 및 미국 특허 제5,865,796호에 기재된 바와 같이 입자-매개된 전달 디바이스를 사용한 전달을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "점막 투여"는, 이로 제한됨이 없이, 경구, 비강 내, 질 내, 직장 내, 기관 내, 장 및 안 투여를 포함한다.
점막 경로, 특히 비강 내, 기관 내 및 안 경로가 환경 병원체, 예로 RSV, flu 바이러스 및 감기 바이러스 또는 알레르겐, 예로 풀 및 돼지풀 꽃가루 및 집 먼지 진드기에의 자연 노풀에 대한 보호에 바람직하다. CMI 반응의 향상은 후속적으로 대면하는 표적 항원, 예로 알레르겐 또는 미생물제에 대한 보호적 효과를 향상시킬 것이다.
본 발명의 방법의 하나의 실시양태에서, 제 1 및(또는) 제 2 및(또는) 후속한 면역화를 위한 모든 투여는 동일한 림프절로 빠지는 부위에 대한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, NOI 또는 단백질은 숙주 피검체로부터 단리된 세포에 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 바람직하게는, 종양 관련된 항원 (TAA)로부터의 EOI를 코딩하는 NOI는 수지상 세포와 같은 프로 (professional) 항원 제시 세포 (antigen presenting cell: APC)에 투여된다.
APC는 숙주 피검체로부터 유도되고 생체 외에서 EOI를 발현하도록 변형된 후 항-종양 반응을 유도하기 위해 TAA에 대한 향상된 CMI 반응을 유도할 숙주 피검체로 다시 전달될 수 있다. 수지상 세포는 발현된 EOI가 향상된 CMI 반응을 유도하기 위해 프로 APC에 의해 T 세포 (Th1 및 Th2 헬퍼 세포 및 CD8+ T-세포)로 포착되고 프로세싱되며 제시되어야 하기 때문에, 향상된 CMI 반응을 자극하기 위한 가장 강력한 APC인 것으로 믿어진다. 또 다른 실시양태에서, 숙주 피검체로부터의 암 세포는 동일계 또는 시험관 내에서 변형될 수 있다.
NOI 입자 투여
NOI 또는 단백질 제제를 전달하기 위한 입자-매개된 방법은 당 기술 분야에서 공지되어 있다. 따라서, 일단 제조되고 적절히 정제된 상술된 NOI는 당 기술 분야의 공지된 다양한 기술을 이용해 코어 캐리어 입자로 코팅될 수 있다. 캐리어 입자는 유전자 건 디바이스로부터의 세포내 전달에 통상적으로 사용되는 입자 크기 범위에서 적합한 밀도를 갖는 물질 중에서 선택된다. 최적 캐리어 입자는 당연히 표적 세포의 직경에 의존할 것이다.
용어 "코어 캐리어"는 게스트 핵산 (예: DNA, RNA)이 규정된 입자 크기 및 세포막 투과에 필요한 운동량을 달성하기 위한 충분한 고밀도를 부여하도록 코팅되어 게스트 분자가 입자-매개된 기술을 이용하여 전달될 수 있는 캐리어를 의미한다 (미국 특허 제5,100,792호). 코어 캐리어는 통상적으로 텅스텐, 금, 백금, 철산화물, 폴리스티렌 및 라텍스를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N. ed., Oxford University Press, New York, NY pages 10-11] 참조). 텅스텐 및 금 입자가 바람직하다. 직경의 평균 크기가 0.5 내지 2.0 ㎛인 텅스텐 입자가 용이하게 이용가능하다. 또한, 금 입자 또는 미세결정 금, 예를 들어 금 분말 A1570 (엥겔하드 코포레이션 (Engelhard Corp.), 미국 뉴저지주 이스트 뉴악 소재)이 본 발명에 사용될 수 있다. 금 입자는 균일한 입자 크기를 제공한다 (1 내지 3 ㎛ 입자 크기 (알파 케미칼스 (Alpha Chemicals)), 0.95 ㎛를 포함한 입자 크기 (데구사 (Degussa), 미국 뉴저지주 플레인필드 소재). 미세결정 금은 통상적으로 0.5 내지 5 ㎛ 범위의 다양한 입자 크기 분포를 제공한다. 그러나, 불규칙한 표면적의 미세결정 금이 핵산을 사용한 고도로 효과적인 코팅을 제공한다.
NOI 또는 단백질을 금 또는 텅스텐 입자에 코팅 또는 침전시키기 위한 많은 방법이 공지되고 기재되어 있다. 대부분의 이러한 방법은 일반적으로 예정량의 금 또는 텅스텐을 플라스미드 DNA, CaCl2 및 스페르미딘과 조합한다. 생성된 용액은 반응 혼합물의 균일성을 확보하기 위해 코팅 절차 동안 연속적으로 와동시킨다. NOI를 침전시킨 후, 코팅된 입자를 적합한 막에 옮기고, 사용 전에 건조시키며, 샘플 모듈 또는 카세트의 표면에 코팅시키거나, 특정 유전자 건 기구에 사용하기 위한 전달 카세트에 적재 (loading) 할 수 있다.
용어 "입자 전달 디바이스"는 피부를 찌르는 통상의 바늘의 도움 없이 경피적으로 미립자 조성물을 전달하는 기구를 의미한다. 본 발명에 사용하기 위한 입자 전달 디바이스가 본 문헌의 전반에 걸쳐 논의된다. 입자-매개된 전달에 적합한 다양한 입자 가속 디바이스가 당 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 실시에 사용하기 위해 모두 적합하게 한다. 현재의 디바이스 디자인은 표적 세포로 코팅된 캐리어 입자를 나아가게 하기 위해 폭발적, 전기적 또는 기체 발포를 이용한다. 코팅된 캐리어 입자는 이동가능한 캐리어 시트에 방출가능하게 부착되거나, 표면을 따라 제거가능하게 접착되어 표면을 따라 가스 스트림을 통과시키면 표면으로부터 입자를 들어올리고 이를 표적물로 가속시킬 수 있다. 기체 발포 디바이스의 예가 미국 특허 제5,204,253호에 기재되어 있다. 폭발 타입 디바이스가 미국 특허 제4,945,050호에 기재되어 있다. 헬륨 발포-타입 입자 가속 장치에 대한 하나의 예는 파우더젝트 (PowderJect) XR 장치 (파우더젝트 백신, 인코포레이티드 (PowderJect Vaccines, Inc.), 메디슨 소재)이며, 이 장치는 미국 특허 제5,120,657호에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 전기적 발포 장치는 미국 특허 제5,149,655호에 기재되어 있다. 이들 특허 모두의 개시사항이 참조로 본원에 삽입된다.
달리, 미립자 NOI 또는 단백질 조성물은 바늘 없는 주사기 디바이스를 사용해 경피적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 NOI를 포함하는 미립자 조성물은 일반적인 제약학적 방법, 예를 들어 단순 증발 (결정화), 진공 건조, 분무 건조 또는 동결건조를 이용해 수득될 수 있다. 필요한 경우, 입자는 본원에 참조로 삽입된 공동 소유의 국제 공개 제WO 97/48485호에 기재된 기술을 이용하여 더욱 조밀화될 수 있다. 이어서, 이들 미립자 조성물은 국제 공개 제WO 94/24263호, 제WO 96/04947호, 제WO 96/12513호 및 제WO 96/20022호 (모두 본원에 참조로 삽입됨)에 기재된 바와 같은 바늘 없는 주사기 시스템으로부터 전달될 수 있다. 상기 참조된 바늘 없는 주사기 시스템으로부터의 항원 또는 알레르겐을 포함하는 입자의 전달은 일반적으로 약 0.1 to 250 ㎛, 바람직하게는 약 10 내지 70 ㎛의 크기를 갖는 입자를 사용하여 실시된다. 약 250 ㎛ 보다 큰 입자도 디바이스로부터 전달될 수 있으며, 상한은 입자의 크기가 피부 세포에 바람직하지 못한 손상을 일으키는 한도이다. 전달된 입자가 표적물 표면을 투과할 실제 거리는 입자 크기 (예를 들어, 대략 구형 입자 형상을 취하는 공칭 입자 직경), 입자 밀도, 입자가 표면에 충돌하는 초기 속도 및 표적된 피부 조직의 밀도 및 운동학상 점도에 따른다. 이에 대해, 바늘 없는 주사에 이용하기 위한 최적 입자 밀도는 일반적으로 약 0.1 내지 25 g/cm3, 바람직하게는 약 0.9 내지 1.5 g/cm3의 범위이고, 주사 속도는 일반적으로 약 100 내지 3,000 m/sec의 범위이다. 적합한 기체 압력을 이용하여, 10 내지 70 Rm의 평균 직경을 갖는 입자를 노즐을 통해 추진 기체 유동의 초음속에 접근하는 속도로 가속시킬 수 있다.
입자 조성물 또는 코팅된 입자는 개체에 투여 제형에 적합한 방식으로 본 발명의 목적에 효과적일 양으로 투여된다. 전달되는 조성물의 양 (예를 들어 약 0.1 mg 내지 1 mg, 보다 바람직하게는 1 내지 50 ug의 항원 또는 알레르겐)은 시험되는 개체에 따른다. 정확한 필요 양은 치료되는 개체의 나이 및 일반적 상태에 따라 다양할 수 있으며, 적합한 유효량은 본 명세서를 읽은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 금 또는 텅스텐 마이크로입자는 문헌 (국제 공개 제WO 93/17706호 및 Tang petal., Nature (1992) 356: 152)에 기재된 바와 같이 수송제로서 사용될 수 있다. 이러한 특별 경우에서, NOI는 염화칼슘 및 스페르미딘의 존재 하에서 마이크로입자에 침전된 후, 전체가 바늘 없는 장치, 예를 들어 미국 특허 제4,945,050호 및 제5,015,580호 및 국제 공개 제WO 94/24243호에 기재된 장치를 사용하여 진피 또는 상피로 고속 제트에 의해 투여된다. 숙주 피검체를 백신처리하기 위해 사용될 수 있는 NOI의 양은 다양한 인자, 예를 들어 항원을 발현하기 위해 사용되는 프로모터 길이, 발현되는 생성물의 면역원성, 투여가 의도되는 포유동물의 상태 (예: 체중, 나이 및 일반적 건강 상태), 투여 방식 및 제형 타입에 의존한다. 일반적으로, 사람 종의 성인에서 예방적 또는 치료적 사용을 위한 적합한 용량은 약 1 pg 내지 약 5 mg, 바람직하게는 약 10 pg 내지 약 1 mg, 가장 바람직하게는 약 25 pg 내지 약 500 pg이다. 입자-매개된 전달 기술이 NOI 투여를 위한 다른 타입과 비교되었으며 현저하게 우수한 것으로 밝혀졌다 ([Fynan et al. (1995) Int. J. Immunopharmacology 17: 79-83], [Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11478-11482], 및 [Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9519-9523]). 이러한 연구는 표피 및 근육 조직에 핵산-기초된 백신의 입자-매개된 전달을 조사하였다. 유전자 건을 사용하여 달성되는 현저한 우수한 결과에 대한 하나의 가능한 이유는, NOI가 근육 내 주사에 의한 세포외 전달과는 대조적으로 세포내로 전달되기 때문이다.
바람직하게는, 표적 항원 (TA)의 투여 간격은 약 48시간 내지 약 192시간의 범위이다. 보다 바람직하게는, TA의 투여 간격은 약 72시간 내지 약 168시간의 범위이다. 보다 더 바람직하게는, TA의 투여 간격은 약 72시간 내지 약 144시간의 범위이다.
숙주 포유동물 피검물
본원에 사용된 용어 "숙주 포유동물 피검물"은, 제한 없이, 비-사람 영장류, 예로 침팬지 및 다른 원숭이 (ape 및 monkey 종); 농장 동물, 예로 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 가정용 동물, 예로 개 및 고양이; 마우스, 래트, 기니아 피그와 같은 설취 동물을 포함하는 실험 동물; 닭, 칠면조 및 다른 가금류 새, 오리, 거위 등과 같은 가정용, 야생 및 게임용 새를 포함한 새를 포함하여, 사람 및 다른 영장류를 포함한 척색동물 아문의 일원을 의미한다. 바람직한 동물은 스포츠에 사용되는 동물, 예로 경주마 또는 쇼우 점핑 마 (show jumping horse)를 포함한다.
상기 용어는 특정 연령을 나타내지 않는다. 따라서, 성숙 및 신생 개체 모두를 포함하고자 한다. 본원에 기재된 방법은 상기 척추동물 모두의 면역계가 유사하게 작동하기 때문에 상기 척추동물 종 모두에 사용하고자 한다. 포유동물인 경우 피검체는 바람직하게는 사람이며, 또한 가정용 가축, 실험 동물 또는 애완용 동물일 수 있다.
예방 및(또는) 치료
본 발명의 방법 또는 공정은 백신처리 방법에 광범위하게 적용가능하며, 예방적 및(또는) 치료적 백신 (면역치료적 백신을 포함)의 전개에 관련된다. 치료에 대한 본원에서의 모든 참조는 치유적, 완화적 및 예방적 처리를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 방법에서, 본원에 기재된 NOI 또는 단백질은 조성물, 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, T 세포 매개된 면역 장애를 예방 및(또는) 치료하기 위한 제약 조성물 또는 백신 조성물 또는 면역치료 조성물의 일부로서 단독으로 사용될 수 있다. NOI 또는 단백질 또는 NOI 또는 단백질을 포함하는 조성물의 투여는 "예방적" 또는 "치료적" 목적일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "치료적" 또는 "치료"은 감염 또는 재감염의 예방; 징후의 감소 또는 제거; 및 병원체의 감소 또는 완전한 제거를 포함한다. 처리는 (감염 전에) 예방적으로나 (감염 후) 치료적으로 수행될 수 있다.
예방 또는 치료는, 이로 제한됨이 없이, NOI에 대한 효과적인 CMI 면역 반응의 유도 및(또는) T 세포 매개된 면역 장애로부터 생기는 징후 및(또는) 합병증의 완화, 경감, 치유 또는 적어도 부분적인 진행 억제를 포함한다. 예방적으로 제공되는 경우, 본 발명의 조성물은 통상적으로 징후에 앞서 제공된다. 본 발명의 NOI 또는 조성물의 예방적 투여는 후속하는 감염 또는 질환을 예방하거나 완화시키는 것이다. 치료적으로 제공되는 경우, 본 발명의 NOI 또는 조성물은 통상적으로 감염 또는 질환의 징후의 개시 시 (또는 개시직 후)에 제공된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 질환 원인제에 예상되는 노출 전 또는 질환 상태 또는 감염 또는 질환의 개시 후에 제공될 수 있다.
예방적 또는 치료적 NOI 또는 단백질의 투여 (단독 또는 조성물의 일부로서)가 보다 적합한지의 여부는 일반적으로 질환의 특성에 의존할 것이다. 예로써, 본 발명의 면역치료 조성물은 종양 세포 또는 이의 항원성 성분으로 백신처리하여 종양 면역을 능동적으로 유도하기 위해 면역치료 프로토콜에 사용될 수 있다. 후자의 처리 형태는, 면역이 지속적이며 종양을 제거하는 최선의 방법 중의 하나가 강력한 특이적 항-종양 CTL 반응을 유도하는 것이라는 일반적 믿음이 있기 때문에 유리하다. 다른 한편으로, 백신 조성물은, 반드시는 아니지만, 후속적으로 대면하는 항원 또는 표적 항원에 관련된 이의 부분 (예: 에피토프)에 대한 효과적인 CMI 반응을 예방적으로 유도하는데 사용될 것이다.
예방적 또는 치료학적 유효량
본 발명과의 연계 속에서, 숙주 피검체에 투여되는 NOI 또는 단백질의 용량은 시간이 흐르면서 피검체에서 유리한 예방적 또는 치료적 CMI 반응을 발휘하기에 충분해야 한다.
본원에 사용된 용어 "예방적 또는 치료적 유효 용량"은 특정 표적 항원의 하나 이상의 EOI에 대한 향상된 CMI 반응을 유도하고(하거나) 질환으로부터의 징후 및(또는) 합병증, 예를 들어 T 세포 매개된 면역 장애를 완화, 감소, 치유 또는 적어도 부분적으로 억제하기에 충분한 양의 용량을 의미한다.
투여량
예방 또는 치료는 단일 시점 또는 다수 시점에서 단일 직접 투여에 의해 달성될 수 있다. 또한, 투여는 단일 또는 다수 부위로 전달될 수 있다. 일부 경로의 투여, 예를 들어 안 점액을 통한 점막 투여는 보다 고용량을 필요로 한다. 당업자는 특정 경로의 전달에 맞는 용량 및 농도를 조정할 수 있다. 유리하게는, 실시예는 NOI 또는 이를 포함하는 조성물의 단일 용량이 일반적으로 향상된 CMI 반응을 달성하기에 충분하다는 것을 입증한다.
상태 및 질환
본 발명의 방법은 향상된 CMI 반응을 유도하기 때문에, 이 방법은 병원체, 예로 바이러스, 세균, 기생생물 또는 기타 감염제에 의한 후속적 감염을 보호하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 표적 항원은 병원체 또는 감염성 질환, 알레르겐 또는 암과 관련된 항원이다. 감염성 질환의 예는, 이로 제한됨이 없이, 바이러스, 세균, 미코박테리움 및 기생생물 질환을 포함한다. 알레르겐의 예는, 이로 제한됨이 없이, 식물 꽃가루, 먼지 진드기 단백질, 동물 비듬, 타액 및 진균 포자를 포함한다. 종양-관련된 항원 (TAA)의 예는, 이로 제한됨이 없이, 살아있거나 조사된 종양 세포, 종양 세포 추출물 및 종양 항원의 단백질 서브유니트를 포함한다. 또한, 항원은 피임에 사용하기 위한 정액 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 환경 항원이다. 환경 항원의 예는, 이로 제한됨이 없이, 호흡기 세포융합 바이러스 (respiratory syncytial virus: RSV), flu 바이러스 및 감기 (cold) 바이러스를 포함한다. 또한, 점막을 통해 침입하는 병원체는, RSV, flu, 기타 상부 호흡기 질환을 일으키는 것 및 장 감염을 일으키는 작용제를 포함한다.
향상된 CMI 반응이 중요한 기타 질환에 대한 공지된 예는 다음과 같다: 바이러스, 예를 들어, 이로 제함됨이 없이, HIV, 단순 포진 바이러스, 대상 포진 바이러스, C형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 홍역 바이러스, 뎅기열 바이러스, HTLV-1 및 사람 유두종 바이러스 (human papilloma virus: HPV) (예: HPV 16)에 의해 발병되는 감염 및 질환; 세균, 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 리스테리아 종 (Listeria sp), 클라미디아 (Chlamydia), 미코박 테리아 (Mycobacteria), 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 레지오니엘라 (Legioniella) 및 엔테로병원성, 엔테로독소발생성, 엔테로침윤성, 엔테로출혈성 이. 콜라이 (E. coli)에 의해 발병되는 질환, 및, 이로 제한됨이 없이, 말라리아 (malaria), 바베시아 (Babesia), 쉬스토소마 (Schistosoma), 톡시플라스마 (Toxiplasma) 및 톡소카라 카니스 (Toxocara canis)를 포함한 병원성 원생동물에 의하거나 원생동물 기생체 톡소플라스마 (Toxoplasma) 및 트리파노소마 (Trypanosoma)에 의해 발병되는 질환. 또한, 본원에 기재된 투여 처방은 T 세포 반응이 예방적 역할을 하는 암의 형태에 대해 면역화하는데 가치있는 것으로 예기된다. 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 포유동물의 암에 대한 예는, 이로 제한됨이 없이 흑색종, 전이, 선암, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 결장암, 비-호킨스 림프종, 호킨스 림프종, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 경부암, 방광암, 신장암, 췌장암 등을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 암은 HPV (예: HPV 16)에 관련된, 예를 들어 이에 의해 발병되는 것이다. 이러한 암은 경부암일 수 있다.
암
하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 종양 관련된 표적 항원 (TAA)으로부터의 EOI (또는 에피토프를 포함하는 단백질)를 코딩하는 NOI의 사용은 암 치료를 위한 표적 항원-특이적 백신의 개발을 가능하게 한다. TAA로부터의 EOI를 코딩하는 NOI 및 임의의 면역조절 분자를 코딩하는 NOI의 투여는, 암 전개에 대해 증가된 위험을 갖는 숙주 피검체에서의 예방 (예방 면역화), 초기 수술 후 질환 재발의 예방 (항-전이 백신처리) 측면에서, 또는 생체 내에서 T 세포수의 증대를 위한 수단 (따라서, 퍼진 종양의 제거에 있어 이들의 유효성을 개선 (기성 질환의 치료))으로써 특히 향상된 CMI 반응을 유도할 강력한 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 종양 소지자에게 다시 옮기기 전에 생체 외에서 세포를 처리하여 숙주 피검체에서 향상된 CMI 반응을 유도하는데 이용될 수 있다 (입양 면역요법으로도 공지됨). 본 발명의 방법 및 공정은 흑색종과 같은 암의 임의의 징후 이전에 (= 예방적 백신처리) 또는 흑색종과 같은 암에 걸린 포유동물에서 질환의 퇴화를 중재하기 위해 (치료적 또는 면역치료적 백신처리) 숙주 피검체에 NOI를 투여하는데 이용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, NOI는 HPV (예: HPV 16)로부터의 항원, 예를 들어 E6 또는 E7을 코딩한다.
활성화된 T-세포
다른 양상으로, 본 발명은 활성화된 T-세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 가장 일반적인 의미로서, 본 방법은 숙주 피검체에, 향상된 T-세포 반응의 측면에서 CMI 반응을 향상시킬 수 있는 표적 항원의 예비선정된 EOI를 코딩하는 NOI를 투여, 바람직하게는 경피 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 이러한 양상에 따라, T-세포는 추가의 사용을 위해 숙주의 림프절로부터 회수된다.
특정적으로 활성화된 T-세포의 많은 잠재적인 이용이 고려된다. 예를 들어, 사람 치료의 경우, 특정적으로 활성화된 T-세포는 생체 외에서 배양되어 바이러스 감염 또는 암을 갖는 환자의 치료를 위해 사람에게 투여될 수 있다. 이러한 양상에 따라, T-세포는 NOI를 생체 내에서 투여한 후, T-세포를 분리하고, 적합한 생물학적 반응 변형제 및(또는) 면역조절제 및(또는) 아주반트, 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 펩티드, 사이토킨 및 항원 제시 세포의 존재 하에 시험관 내에서 증대시킨다.
상동체
단백질 (단백질 항원을 포함), 예를 들어 (NOI에 의해 코딩되는 바와 같이) 본 발명에서 사용되는 Gag, nef 및(또는) RT는 천연 발생 형태와 상동성 및(또는) 서열 동일성을 가질 수 있다. 유사하게, 이러한 단백질을 발현할 수 있는 NOI 코딩 서열은 일반적으로 천연 발생 서열과 상동성 및(또는) 서열 동일성을 가질 것이다. 또한, 핵산 및 아미노산 "서열 동일성"을 측정하기 위한 기술도 당 기술 분야에서 공지되어 있다. 통상적으로, 이러한 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정 및(또는) 이로써 코딩되는 아미노산 서열을 결정, 및 이들 서열을 제 2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다.
일반적으로, "동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각에 대한 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 대응을 언급한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 이들의 "동일성 백분율 (％)"을 결정함으로써 비교될 수 있다. 핵산 또는 아미노산 서열이든, 2개 서열의 동일성 백분율은 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 매치를 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 수이다.
핵산 서열에 대한 대략적 정렬이 문헌 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)]의 로컬 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이러한 알로리즘은 데이호프 [Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3: 353-358, National Biomedical ResearchFoundation, Washington, D.C., USA]에 의해 개발되고 그리브스코브 [Gribskov, Nucl. AcidsRes. 14 (6): 6745-6763 (1986)]에 의해 표준화된 스코어링 매트릭스를 이용하여 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적 수행이 "BestFit" 유용성 적용에서 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group) (미국 위스콘신주 메디슨 소재)에 의해 제공된다. 이러한 방법의 디폴트 (default) 변수가 [Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995)] (제네틱스 컴퓨터 그룹, 미국 위스콘신주 메디슨 소재)에 기술되어 있다. 본 발명과의 연계 속에서 동일성 백분율을 확립하는 바람직한 방법은 존 에프. 콜린스 (John F. Collins) 및 셰인 에스. 쉬터록 (Shane S. Sturrok)에 의해 개발되어 유니버서티 오브 에딘버그 (University of Edinburgh)가 판권을 갖고 인텔리제네틱스, 인코포레이션 (IntelliGenetics, Inc.) (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에 의해 보급되는 프로그램의 MPSRCH 패키지를 이용하는 것이다.
이러한 슈트의 패키지로부터 스미쓰-워터만 (Smith-Waterman) 알고리즘이 이용될 수 있으며, 디폴트 변수가 스코어링 표 (예를 들어, 갭 오픈 패널티: 12, 갭 익스텐션 패널티: 1 및 갭: 6)에 대해 사용된다. 생성된 데이터로부터 "매치" 값은 "서열 동일성"을 반영한다. 서열 사이의 동일성 또는 유사성 백분율을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램이 일반적으로 당 기술 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 또 다른 정렬 프로그램은 BLAST이며, 디폴트 변수와 함께 사용된다. 예를 들어, 하기 디폴트 변수를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP가 이용될 수 있다: 유전 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽 모두; 컷오프= 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 기술 = 50개 서열; 분류 (sorted by) = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-중복, GenBank +EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 해독 + Swiss 단백질 + Spupdate + PIR. 이러한 프로그램의 상세 내용은 하기 인터넷 주소 http://www. ncbi. nlm. gov/cgi-bin/BLAST에서 찾을 수 있다.
달리, 상동성은 이러한 영역 사이에 안정한 듀플렉스를 형성하고 단일쇄 특이적 뉴클레아제(들)에 의해 분해 한 후 분해된 단편의 크기를 결정하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화에 의해 결정될 수 있다. 2개의 DNA 또는 2개의 폴리펩티드 서열은, 상술한 방법을 이용해 측정했을 때 분자의 한정된 길이에 걸쳐 적어도 약 80 ％ 내지 85 ％, 바람직하게는 적어도 약 90 ％, 가장 바람직하게는 적어도 약 95 ％ 내지 98 ％ 서열 동일성을 나타내는 경우, "실질적으로 상동성"이다.
본원에 사용된 바와 같이, 실질적 상동성 또는 상동성은 또한 특정 DNA 또는 폴리펩티드 서열에 완전한 동일성을 나타내는 서열을 언급한다. 실질적 상동성 또는 상동성인 DNA 서열은, 예를 들어 특정 시스템에 대해 정의된 바와 같은 엄격 조건 하에 써던 혼성화 실험으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 엄격 혼성화 조건은 50 ％ 포름아미드, 5x 덴하르트 용액, 5x SSC, 0.1 ％ SDS 및 100 pg/ml 변성된 연어 정자 DNA를 포함할 수 있고, 세척 조건은 2x SSC, 0.1 ％ SDS (37 ℃)에 이어 lx SSC, 0.1 ％ SDS (68 ℃)를 포함할 수 있다. 적합한 혼성화 조건을 정의하는 것은 당 기술 분야의 기술에 속한다.
검정 방법
본 발명의 방법의 유효성은 (i) 본원에 기재된 바와 같은 NOI를 숙주 피검체, 예를 들어 사람 피검체 또는 실험 동물, 예를 들어 마우스, 래티, 토끼, 기니아 피그, 염소, 붉은털 원숭이 또는 침팬지에게 투여한 후; (ii) 숙주 피검체로부터의 혈액, 비장 또는 다른 림프 조직에서 세포를 수집하고; (iii) 활성화된 T-세포, 예를 들어 감염제의 성분을 생성하는 세포를 죽이거나 분해시키도록 프라이밍된 T 세포의 존재에 대해 조직을 시험하는 단계에 의해 시험될 수 있다.
일단 NOI 투여가 수행되면, 숙주 피검체의 림프 조직으로부터의 T-세포가 회수된다. 바람직한 림프 조직은 림프절 조직, 가장 바람직하게는 NOI 투여의 부위에 인접한 드레이닝 (draining) 림프절로부터의 조직일 것이다. 본원에 사용된 용어 "인접 절 (proximal node)"은 NOI 투여 부위에 인접하게 위치된 절(들)을 언급하고자 한다.
이러한 절은 신체적으로 NOI 투여 부위에 인접하게 위치되거나 투여 부위를 드레이닝하는 영역에 위치되며, 투여 부위로부터 신체적으로 보다 떨어져 있는 절을 드레이닝하는 것을 포함한다.
검정 방법의 최종 단계는 T-세포가 활성되었는지의 여부를 결정하는 것을 수반하다. 통상적으로, T-세포 활성화의 수준은, 이로 제한됨이 없이, 방사활성 크롬-방출 검정, 또는 다른 방사선동위원소 검정, 또는 단일 세포 검정을 포함하는 검정으로 측정될 수 있다. 또한, 바이러스 스트레인을 사용하는 단일 세포 T-세포 검정 및(또는) 세포 분류기가 사용될 수 있다. T-세포 활성화의 측정을 위한 바람직한 방법은 살생 유효량의 T-세포를 표적 세포 표면에 후보 EOI를 나타내는 MHC-매치된 표적 세포와 접촉시키고; T-세포가 표적 세포를 용해시키기에 충분한 시간 동안 접촉을 유지하며; 표적 세포의 T-세포 매개된 용해의 정도를 측정하는 것을 포함한다. 그러나, 이로 제한됨이 없이, 크롬 방출 검정, 단일-세포 검정 또는 세포-세포 결합물의 균일한 측정을 포함하여, 특정 T-세포 반응을 검출할 수 있는 방법이 이용될 수 있다.
하나의 실시양태로서, 본 발명은 본원에 기재된 방법과 동일한 T 세포 반응 유도 방법의 유효성을 시험하는 검정법을 제공한다. 따라서, 이 방법은 (i) 숙주 포유동물 피검체에 1 내지 14일의 간격으로 투여되는 2회 이상의 투여를 포함하며, 각각의 투여는 T 세포 에피토프를 코딩하는 NOI를 투여하는 것을 포함하는 제 1 면역화, 및 임의로 (ii) (a) T 세포 에피토프를 코딩하는 NOI 또는 (b) T 세포 에피토프를 포함하는 단백질을 상기 피검체에 1회 이상 투여하는 것을 포함하는 제 2 면역화를 포함하며, 제 1 면역화의 제 1 투여와 제 2 면역화의 제 1 투여 사이의 기간이 21 내지 365일인 T 세포 반응을 유도하는 방법을 포유동물 피검체에서 수행하고, 상기 피검체에서 에피토프에 특이적인 활성화된 또는 기억 T 세포의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
보다 높은 수준의 T 세포 반응은 (i) 제 1 면역화의 모든 투여가 개시 투여(들)에 의해 생성되는 활성화된 T 세포의 수준이 기본 수준으로 돌아가기 전에 일어나고, (ii) 제 2 면역화가 T 세포가 기본 수준으로 돌아간 후 일어나는 경우에 달성된다. 따라서, 상술된 검정법은 T 세포 반응을 유도하는 지정된 방법이 활성화된 T 세포의 수준에 대해 적합한 시간에 제 1 및 제 2 면역화를 갖는지의 여부를 결정하는데 이용될 수 있다. 하나의 실시양태로서, 이 검정법은 (i) 제 1 면역화의 투여가 제 1 면역화의 제 1 투여와 활성화된 T 세포 수준의 기본 수준으로의 감소 사이의 시간 기간에 일어나고(나거나), (ii) 제 2 면역화의 제 1 투여가 활성화된 T 세포 수준의 기본 수준으로의 감소 후에 일어나는지의 여부를 결정하는 것을 포함한다.
기타 양상
추가의 양상으로, TA의 하나 이상의 EOI를 코딩하는 NOI를 숙주 피검체에 적어도 3회 투여하는 것을 포함하고, 각각의 NOI의 투여 간격이 약 48시간이며, 숙주 포유동물 피검체에서 발현된 EOI 또는 각각의 발현된 EOI에 대한 향상된 체액성 면역 반응을 제공하기에 효과적이고, 반드시 CMI 반응의 연관된 향상을 유도하는 것이 아닌, 향상된 체액성 반응을 선택적으로 유도하는 방법이 제공된다.
또 다른 양상으로, TA의 하나 이상의 EOI를 코딩하는 NOI를 숙주 피검체에 적어도 3회 투여하는 것을 포함하고, 각각의 NOI의 투여 간격이 약 28일이며, 숙주 포유동물 피검체에서 발현된 EOI 또는 각각의 발현된 EOI에 대한 체액성 면역 반응을 향상시키는 것을 돕는 향상된 CMI 반응을 제공하기에 효과적인, 향상된 체액성 반응을 유도하는 방법이 제공된다.
조성물
본 발명은 T 세포 매개된 면역 장애를 예방 및(또는) 치료하는데 유용한 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 조성물은 면역치료 조성물이다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 조성물은 백신 조성물이다. 조성물은 상술된 바와 같이 본 발명의 TA의 EOI를 코딩하는 NOI의 치료학적 또는 예방학적 유효량을 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 제약학적으로나 면역학적으로 허용되는 담체와 같은 담체를 포함할 수 있다. 제약학적으로 허용되는 담체 또는 면역학적으로 허용되는 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물 및 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물, 백신 조성물 또는 면역치료 조성물에 대한 다양한 적합한 제제가 있다.
제제
NOI 또는 단백질은 제약 조성물, 면역치료 조성물 또는 백신 조성물로 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 제약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 멸균수 또는 멸균 등장 염수와 함께 조합된 NOI 또는 단백질을 포함한다. 이러한 제제는 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조되거나 포장되거나 시판될 수 있다. 주사 제제는 단위 용량 형태, 예를 들어 앰플 또는 보존제를 포함하는 다수-용량 용기에 제조되거나 포장되거나 시판될 수 있다. 제제는, 이로 제한됨이 없이, 현탁물, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트 및 이식가능한 지연-방출 또는 생분해성 제제를 포함한다. 이러한 제제는, 이로 제한됨이 없이, 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함한 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 하나의 실시양태에서, 활성 성분은, 재구성 조성물을 비경구 투여하기 전에 적합한 비히클 (예: 멸균된 발열물-비함유 물)을 사용하여 재구성하는 건조 (예: 분말 또는 과립) 형태로 제공된다. 제약 조성물은 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁물 또는 용액의 형태로 제조, 포장 또는 시판될 수 있다. 이러한 현탁물 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있으며, 활성 성분 이외에, 추가의 성분, 예를 들어 본원에 기재된 분산제, 습윤제 또는 현탁화제를 포함할 수 있다. 이러한 멸균 주사가능한 제제는 무독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용제, 예를 들어 물 또는 1,3-부탄 디올을 사용해 제조될 수 있다. 다른 허용되는 희석제 및 용제는, 이로 제한됨이 없이, 링거 용액, 등장성 염화나트륨 용액 및 비휘발성 오일, 예로 합성적 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함한다.
유용할 수 있는 다른 비경구적으로 투여가능한 제제는 미세결정 형태로, 리포좀 제제로 또는 생분해성 중합체 시스템의 성분으로서 활성 성분을 포함하는 것을 포함한다. 지연 방출 또는 이식을 위한 조성물은 제약학적으로 허용되는 중합체성 또는 소수성 물질, 예로 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 중합체 또는 난용성 염을 포함할 수 있다.
또한, 표적 항원의 EOI에 대한 CMI 반응을 향상시키기 위한 키트가 본 발명에 포함된다. 이러한 키트는 TA의 EOI를 코딩하는 NOI 및(또는) 에피토프를 포함하는 단백질을 포함한다. 또한, 키트는 아주반트 (바람직하게는 유전자 아주반트가 NOI 또는 단백질와 함께 또는 일부로서 투여된다) 및 NOI 또는 단백질의 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 키트의 다른 바람직한 성분은 NOI 또는 단백질을 투여하기 위한 적용기구를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "적용 기구"는 숙주 피검체에 전신적으로, 점막으로 또는 경피적으로 NOI를 적용하기 위한, 이로 제한됨이 없이, 피하 주사기, 유전자 건, 입자 가속 디바이스, 분무기, 점적기, 기관지경, 좌약, 침투되거나 코팅된 질-삽입용 물질, 예로 탐폰, 관주기, 질 관주 용액, 이상정체 관장제, 좌약, 직장 또는 결장 관주 용액을 포함한 디바이스를 언급한다.
하기 발명은 단지 예시로써 도면을 참조하여 더욱 설명될 것이다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 설명하고 당업자가 동일한 것을 만들고 이용하는 것을 돕기 위해 제시되는 것이다. 이러한 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다. 사용된 수 (예: 양, 온도 등)에 대해 정확히 하려고 노력했으나, 일부 실험 오차 및 편차는 허용되어야 한다.
도 1은 1주일 동안 각각 7일 (D 7), 0 및 7일 (D 0,7) 또는 0, 2, 4 및 7일 (D 0, 2, 4, 7)에 마우스에 1, 2 또는 4회에 걸쳐 NOI를 투여한 후의 (CD8+ T 세포) 반응을 제공한다. NOI 투여 당 1 또는 2 쇼트 (shot)가 수행되었으며, 하나의 군에서 LT 아주반트가 NOI와 함께 공동-투여되었다.
도 1A는 ICP27 단일 유전자 플라스미드의 투여 후의 CD8+ T 세포 반응을 나타낸다.
도 1B는 PJV7630 다수-유전자 플라스미드의 투여 후의 CD8+ T 세포 반응을 나타낸다.
도 2는 클러스터 (clustered) NOI 투여를 이용하여 감염 챌린지로부터 마우 스의 보호를 나타낸다.
도 3A는 ICP27 단일 유전자 플라스미드의 클러스터 투여 사이의 최적 시간 간격을 나타낸다.
도 3B는 HbsAg 단일 유전자 플라스미드의 클러스터 NOI 투여 후의 세포 반응을 나타낸다.
도 3C는 HbsAg 단일 유전자 플라스미드의 클러스터 NOI 투여 후의 항체 역가를 나타낸다.
도 4A는 0, 1, 2, 4 및 6일 투여 간격으로 다수유전자 플라스미드 (PJV7630)의 클러스터 NOI 투여 1주일 후의 ELISPOT 측정을 나타낸다.
도 4B는 0, 1, 2, 4 및 6일 투여 간격으로 다수유전자 플라스미드 (PJV7630)의 클러스터 NOI 투여 3주일 후의 ELISPOT 측정을 나타낸다.
도 5A는 각각의 "투여"가 1 내지 4회의 XR1 투여 및 각각의 투여 사이의 휴식 기간으로 이루어짐을 나타내는 도식적 디아그램이다.
도 5B는 유전자 LT 아주반트의 조합물과 클러스터 NOI 투여 스케쥴로부터 수득된 IFN-감마 방출에 따른 CMI 반응을 나타낸다.
도 5C는 유전자 LT 아주반트의 조합물과 클러스터 NOI 투여 스케쥴로부터 수득된 항체 반응을 나타낸다.
도 6A는 제 1 클러스터 면역화 후 식용 돼지 (demostic pig)로부터 수득된 IFN-γ ELISPOT 데이터를 나타낸다.
도 6B는 pPJV7630로 면역화된 돼지 (4마리 동물)에서 항원 투여 위치에 존재 하는 홍반의 평균 면적을 나타낸다.
도 7은 식용 돼지에서의 항-HA 항체 반응을 나타낸다.
도 8은 인플루엔자 A/Panama/2007/99 (H3N2)의 헤마글루티닌 (HA) 항원을 코딩하는 사람 DNA 백신 벡터인 플라스미드 pPJV1671을 나타낸다.
도 9는 H3 Panama HA 천연 서열을 JV1671에 의해 코딩되는 H3 Panama HA 및 컨센서스 서열과 비교한 것이다.
도 10은 pPJV2012의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 11은 pPJV7563의 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 12는 pPJV7563 플라스미드에 대한 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
도 13은 PJV7563의 제작을 개요하는 흐름도를 제공한다.
도 14 (i) 내지 (viii)는 pPJV7563 제작 시의 주요 플라스미드의 특징적 맵을 제공한다.
도 15는 플라스미드 WRG7074 및 WRG7128의 흐름도 전개를 제공한다.
도 16 (i) 내지 (v)는 추가의 주요 플라스미드의 특징적 맵을 제공한다.
도 17 내지 22는 HIV 항원을 발현하는 제작물 및 HIV 항원을 코딩하는 서열에 관한 것이다.
도 23 내지 28은 HPV E6 및 E7 항원을 사용한 면역화에 관한 것이다.
도 29 내지 38은 본 발명의 방법을 이용하여 수득된 반응을 조사하는 추가 실험으로부터의 결과를 나타낸다.
일반적 기술
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 이용된 재조합 DNA 기술은 당업자에게 널리 공지된 표준 절차이다. 이러한 기술은 문헌 (J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984); J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989); T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991); D. M. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996); 및 F. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, GreenePub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지의 모든 개정판을 포함))에 기술되고 설명되며, 본원에 참조로 삽입된다. 본 발명의 방법은 피검체 조직의 세포에 의한 EOI의 발현을 위해 피검체의 조직으로 TA의 적어도 하나 이상의 EOI를 코딩하는 NOI를 직접적으로 생체 내에 도입하는 것을 수반한다.
본 발명의 NOI 제작물은 당업자에게 공지된 통상의 방법으로 제조될 수 있다. DNA 플라스미드 또는 재조합 벡터를 제작하기 위한 방법이 일반적 교제 (Burger et al., J. Gen. Virol., 72: 359-367 (1991))에 기술되어 있으며, 당 기술 분야에서 널리 공지되어 있다 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; 및 Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York).
예로써, TA의 하나 이상의 EOI 또는 CMI 반응을 유도하도록 TA의 공지된 EOI 에 충분히 상동인 서열을 코딩하는 NOI가, 다양한 미생물 공급원으로부터 NOI를 분리하기 위한 당 기술 분야에서 기술되는 하기의 널리 공지된 절차에 따라 수득될 수 있다. 달리, TA의 EOI를 코딩하는 NOI는 핵산 합성기로 합성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 TA의 EOI를 코딩하는 NOI의 합성 형태를 포함한다. 또한, 이러한 분리된 NOI를 포함하고 바람직하게는 숙주 세포에서 NOI에 의해 코딩되는 TA의 EOI의 발현을 지시할 수 있는 기타 재조합 세균 플라스미드 또는 바이러스 벡터; 및 이러한 백터를 포함하는 세포인 진핵생물 또는 원핵생물 세포, 바람직하게는 진핵생물 세포도 공지된 기술로 제조된다. 플라스미드 또는 바이러스 벡터 형태의 NOI에 의한 TA의 EOI 발현을 확실하게 하기 위해, NOI는 숙주 세포에서 항원의 발현을 고수준으로 유도할 수 있는 프로모터/조절 영역에 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 사람 사이토메갈로바이러스 즉시형 초기 프로모터/인핸서 서열, SV40 초기 프로모터, 로우즈 육종 바이러스 프로모터 및 다른 포유동물 프로모터/인핸서 서열을 포함한 많은 프로모터/조절 서열이 사용가능하다. 본원에 사용된 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동적으로 연결된 NOI의 발현에 필요한 DNA 서열을 언급한다. 일부 예에서, 프로모터/조절 서열은 특정 조직 타입의 세포에서만 발현을 유도할 수 있다는 점에서 조직 특이적 방식으로 기능할 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 플라스미드 벡터 또는 다른 DNA 벡터 또는 바이러스 벡터의 선택은 본 발명의 제한 요소가 아니며, 본원의 기술을 읽고 본원에 기재된 것 대신 다른 DNA 또는 바이러스 벡터를 대체할 수 있다. 특정 프로모터/조절 서열의 선택 및 목적 항원을 코딩하는 DNA 서열에 대한 프로모터/조절 서열의 작동적 연결은 당업자의 기술 범위에 속한다. 이러한 기술은 당 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 문헌 (Sambrook (상기 참조) 및 Ausubel (상기 참조))에 기술되어 있다.
하기 일반적 방법이 하기 실시예 1 내지 5에 기재된 연구를 수행하는데 이용되었다. 각각의 연구에서, EOI를 포함하는 NOI는 본 발명에 따른 예시적 조성물을 제공하기 위해 금 입자에 코팅되었다. 코팅된 입자가 동물 피검체에 투여되었으며, 항원 특이적 T 세포 및(또는) 항체 반응을 유도하는 조성물의 능력이 평가되었다.
코어 캐리어 입자 코팅
적절한 중량의 금 입자를 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 직접적으로 무게를 재었다. 약 300 μL의 0.05M 스페르미딘 용액을 가하고 금을 분산시키기 위해 초음파기를 사용해 금을 현탁시켰다. 관련 DNA 플라스미드를 포함하는 용액 (약 50 μL)를 2 μg DNA/mg 금의 농도로 금/스페르미딘 용액에 가하였다. 금 용액과 혼합하기 전에, DNA 용액은 한가지 타입의 플라스미드를 포함하거나, 특정 실험을 위해 2가지 이상의 플라스미드 (예를 들어 유전자 아주반트)가 함께 혼합될 수 있다. DNA/금 혼합물을 적당한 속도로 와동시키고, 300 μL의 10 ％ CaCl2 용액을 와동시키면서 적가하였다. DNA/금 입자를 실온에서 침전시키고, 간단히 (10 내지 15초) 원심분리시켜 금을 펠렛화하였다. 펠렛을 약 800 μL의 EtOH로 3회 세척하였다. 이어서, DNA/금 입자를 3 mL의 PVP (폴리비닐피롤리돈) 용액 중에 약 1 mg의 DNA/ 금으로 EtOH에 제조된 0.03 mg/mL PVP 용액에 현탁시켰다. 이어서, 이 용액을 이전에 기재된 바와 같은 Tefzel 튜빙에 코팅하였다 (PCT 출원 제PCT/US95/00780호, 및 미국 특허 제5,733,600호; 제5,780,100호; 제5,865,796호 및 제5,584,807호, 이의 기술이 본원에 참조로 삽입됨).
B형 간염 표면 항원 ( HBSAG )
플라스미드 ( PWRG7128 제작물) 제작
B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 벡터 플라스미드를 하기와 같이 제작하였다. HbsAg 코딩 영역을 생성하기 위해, pAM6 제작물 (American Type Culture Collection: ATCC)을 NcoI로 절단하고, 녹두 뉴클레아제로 처리하여 X-항원의 개시 코돈을 제거하였다. 생성된 DNA를 BamHI으로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 DNA의 말단을 무디게 하고, HBsAg 발현 카세트를 생성하였다. HBsAg 발현 카세트는 1.2 kB 단편으로 존재한다. 전체 길이의 CMV (Towne strain) 즉시형 초기 프로모터 (인핸서 포함)를 포함하는 플라스미드 제작물 pPJV7077 (Schmaljohn et al. (1997) J. Virol. 71: 9563-9569)을 HindIII 및 BglII로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제 및 송아지-알칼리 포스파타제로 처리하여 무딘 말단 DNA를 생성한 후, HBsAg 발현 카세트를 이 플라스미드에 결합시켜 pWRG7128 제작물을 수득하였다.
시험관 내 면역 검정
각각의 마우스의 혈청을 ELISA 검정을 이용해 HBsAg에 특이적인 항체에 대해 시험하였다. ELISA를 위해, Falcon Pro Bind 미세역가 평판을 PBS (포스페이트 완충 염수, BioWhittaker) 중의 웰 당 0.1 μg의 정제된 HBsAg (BioDesign)로 4 ℃에 서 밤새 코팅하였다. 평판을 5 ％ 분유/PBS를 사용해 실온 (RT)에서 1시간 동안 차단시킨 후, 세척 완충액 (10 mM Tris 완충 염수, 0.1 ％ Brij-35)으로 3회 세척하고, 희석 완충액 (2 ％ 분유/PBS/0.05 ％ Tween 20) 중에 희석된 혈청 샘플을 평판에 가하고, RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 평판을 3회 세척하고, 희석 완충액 중에 1:8000으로 희석된 바이오티닐화된 염소 항-마우스 항체 (Southern Biotechnology)를 평판에 가한 후, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 평판을 3회 세척하고, PBS 중에 1:8000으로 희석된 스트렙트아비딘-서양고추냉이 퍼옥시다제 결합체 (Southern Biotechnology)를 가하고, 평판을 RT에서 추가의 1시간 동안 인큐베이션하였다. 추가의 3회 세척 후, TMB 기질 용액 (BioRad)을 가하고, 30분 후 1N H2SO4를 사용해 반응을 정지시켰다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 종점 역가를 공지 역가의 표준물을 갖는 샘플과 비교하여 계산하였다.
세포성 면역 검정을 위해, 면역화된 동물의 비장으로부터의 비세포 (splenocyte) 현탁액을 Balb/c 마우스의 공지된 CD8 에피토프에 상응하는 펩티드의 존재 하에 시험관 내에서 배양하였다. 펩티드를 DMSO (10 mg/ml)에 용해시키고 배양물에 10 μg/ml로 희석시켰다. 펩티드의 서열은 IPQSLDSWWTSL (서열 20)이었다.
IFN-γ ELISPOT 검정을 위해, Millipore Multiscreen 막 여과 평판을 멸균 0.1 M 카보네이트 완충액 (pH 9.6) 중의 15 μg/ml 항-IFN-γ 항혈청 (Pharmingen) 50 μl로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 평판을 멸균 PBS로 6회 세척하고, 10 ％ 우 태 혈청 (fetal bovine serum: FBS)를 포함하는 조직 배양 배지를 사용해 RT에서 1 내지 2시간 동안 차단하였다. 배지를 제거하고, 비장 세포를 웰 당 총 1x106개 세포로 웰에 분배시켰다. 면역화된 동물로부터의 1x106개 미만의 세포가 가해진 웰에 대해, 비투약 (naive) 동물로부터의 세포를 사용해 총 1x106개 세포로 만들었다. 세포를 상술된 펩티드의 존재 하에서 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 평판을 PBS로 2회 세척하고, 증류수로 1회 세척하였다. 이어서, PBS로 3회 세척하였다. 바이오티닐화된 항 IFN-γ 단일클론 항체 (Pharmingen)를 평판에 가하고 (PBS 중 1 μg/ml 용액 50 μl), RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 평판을 PBS로 6회 세척한 후, 스트렙트아비딘 알칼리 포스파타제 결합체 (PBS 중 1:1000, Pharmingen) 50 μl를 가하고, RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 평판을 PBS로 6회 세척하고, 알칼리 포스파타제 색상 기질 (BioRad)을 가하고, 어두운 스폿이 나타날 때까지 반응시켰다. 물로 3회 세척하여 반응을 정지시켰다. 평판을 공기 건조시키고, 현미경 하에서 스폿을 계수하였다.
HIV -1 GP120 항원
HIV -1 GP120 항원을 코딩하는 플라스미드의 제작
HIV-1 gpl20를 코딩하는 플라스미드 벡터를 하기와 같이 제작하였다. Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) 플라스미드 골격, hCMV 즉시형 초기 프로모터 (Fuller et al. (1994) Aids Res. Hum Retroviruses 10: 1433) 및 SV40 바이러스 후기 폴리아데닐화 부위로 시작하여 상기 벡터를 제작하였다. 즉시형 초기 전사 개시 부위로부터 상부로 522 염기쌍 (base pair: bp) 및 하부로 96 bp에 걸친 619 bp AccII 단편에 hCMV 프로모터가 포함된다. pSV2dhfr (이전에 Bethesda Research Laboratories에서 입수 가능, catalogue #5369 SS)로부터 유도된 약 800 bp BamHI-BglII 단편에 SV40 바이러스 후기 폴리아데닐화 서열이 포함된다. 먼저, HIV-1 gpl60를 코딩하는 플라스미드 ("pC-Env"로 명명)를 제작하였다. 이 플라스미드는 LAV-1BRU (ATCC 입수 번호 53069, GenBank 입수 번호 K02013)로부터의 2565 bp KpnI-XhoI 단편을 포함하며, 성숙한 gp160 아미노 말단의 아미노산 위치 #4를 코딩하는 서열에서 시작한다. env 코딩 서열 단편은 단순 포진 바이러스 당단백질 D (gD) 시그널 펩티드 및 이전에 기재된 바와 같은 (Fuller et al. (1994) Aids Res. Hum Retroviruses 10: 1433) 성숙한 gD 아미노 말단의 비아미노산을 코딩하는 160 bp 합성 단편의 바로 하부에 위치되고 이와 인프레임으로 융합되었다.
이어서, HIV-1 gpl20을 코딩하는 플라스미드 ("pCIA-Env/T"로 명명)를 하기와 같이 제작하였다. pCIA-Env/T 플라스미드는 HIV-1 gpl60의 절단된 형태를 코딩하며, env 코딩 서열이 뉴클레오티드 위치 8188에 있는 HindIII 위치에서 절단된다는 것을 제외하고는 pC-Env 제작물과 동일하다. 이는 gpl20/gp41 프로세싱 부위의 하부에 128개 아미노산 잔기가 놓인 절단점을 갖는 절단된 gp160 해독 산물을 생성한다.
시험관 내 면역 검정
(각각 프라이밍 후 및 부스팅 후) 5주 및 6.5주에 수집된 시료에 대해 ELISA 검정을 이용하여 HIV gpl20 항원에 대한 혈청 항체 반응을 시험하였다. ELISA를 위해, Costar 고결합 EIA 평판을 50 μl PBS 중의 재조합 HIV gpl20 (Intracel) 0.3 μg/웰과 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하여 코팅하였다. 평판을 3회 세척하고, PBS 중의 2 ％ BSA로 실온에서 2시간 동안 차단하였다. 일련의 혈청 희석물을 코팅된 평판에 가하고, 1시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 평판을 알칼리 포스파타제 결합된 염소 항-마우스 IgG (H+L) (BioRad)의 1:1500 희석물과 함께 인큐베이션하고, 이어서 p-니트로페닐포스페이트 (PNPP) (BioRad)로 색상을 전개시켜 405 nm에서 흡광도를 판독하였다.
비세포에 의해 분비되는 항원-특이적 IFN-γ의 양을 세포계산 비드 검정을 이용하여 측정하였다. 1 X 106개 비세포를 96-웰 평판의 각각의 웰에 가하고, 배지 단독 (음성 대조군) 또는 RIQRGPGRAFVITGK (서열 21)을 갖는 HIV gpl20 펩티드 1 μg/ml를 갖는 배지에서 자극하였다. 5 ％ C02 하에 37 ℃에서 48시간 인큐베이션한 후, 상청액을 제거하고, 세포계산 비드 검정 (BD Biosciences)로 IFN-감마 수준을 측정하였다.
HSV -2 항원
HSV -2 ICP27 를 코딩하는 플라스미드의 제작
ICP27을 코딩하는 DNA 백신을 제작하고, 다양한 아주반트 플라스미드 벡터 조합물과 조합하여 백신 조성물을 제공하였다. 면역화 후, 면역화된 동물을 HSV-2 바이러스로 챌린지하고, 다양한 백신 조성물의 보호 효과를 측정하였다.
DNA 항원 플라스미드의 제작에 표준 PCR 기술을 이용하였다. 벡터의 제작에 이용된 표준 PCR 조건은 다음과 같다: 1.5 mM MgCl2를 갖는 lx PCR 코어 완충액 (Promega Corp., Madison, WI); 0.400 μM의 각각의 프라이머; 200 μM의 각각의 dNTP (USB Inc., Cleveland, OH); 2.5 μg Taq 폴리머라제 (Promega Corp., Madison, WI); 1.0 ng 템플레이트 DNA; 100 μl가 되도록 하는 물; 및 무기 오일 (Aldrich Chemical Inc., Milwaukee WI) 오버레이. 하기 과정을 수행하도록 PTC-200 써모싸이클러 (thermocycler) (MJ Research Inc., Waltham, MA)를 프로그래밍하였다: 4분 @ 95 ℃; 30 사이클의 (1분 @ 95 ℃/1분 15초 @ 55 ℃/1분 @ 72 ℃); 10분 @ 72 ℃; 4 ℃ 유지. 증폭 생성물을 제한 효소 (New England Biolabs, Beverly, MA)로 절단하기 전에 QIAquick7 PCR 정제 키트 (Qiagen Inc., Valencia CA)를 사용해 PCR 반응물로부터 분리시켰다.
보다 구체적으로, HSV-2 초기 ICP27 항원을 코딩하는 DNA 백신 플라스미드 벡터를 하기와 같이 제작하였다. HSV는 약 150 내지 160 kbp의 게놈을 갖는 이중쇄 DNA 바이러스이다. 바이러스 게놈은 막으로 둘러싸인 20면체 뉴클레오캡시드 안에 포장된다. 막 (또는 외피)는 적어도 10개의 바이러스-코딩된 당단백질을 포함하며, 가장 많은 것은 gB, gC, gD, 및 gE이다. 또한, 이 바이러스 게놈은 약 5개의 즉시형 초기 항원의 군을 포함하여 70개 이상의 다른 단백질을 코딩한다. 이러한 초기 단백질은 바이러스의 생활 주기에서 나중에 만들어지는 외피 당단백질과는 대조적으로 바이러스 복제 사이클에서 초기에 합성된다. HSV의 분자 구조 및 조직화에 대한 검토를 위해 문헌 (Roizman and Sears (1996) "Herpes simplex viruses and their replication" in Fields Virology, 3rd ed., Fields et al. eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA)을 참조한다. HSV-2 ICP27 항원은 HSV-2 게놈, 예를 들어 HSV-2 게놈의 약 뉴클레오티드 114589로부터 134980까지의 게놈 영역 또는 HSV-2 게놈의 뉴클레오티드 110931 내지 139697의 EcoRI 단편으로부터 쉽게 수득될 수 있다. HSV-2 게놈의 서열은 공개된 공급원, 예를 들어 GenBank 입수 번호 NC_001798로 기탁된 서열로부터 입수가능하다.
본 연구에 사용되는 ICP27 벡터를 제작하기 위해, ICP27 코딩 영역을 프라이머 5'CGCC ACT CTC TTC CGA CACC3' (서열 25) 및 5'CCAA GAA CAT CAC ACG GAA CC3' (서열 26)을 사용하여 HSV-2 게놈으로부터 PCR하여 ICP27 코딩 영역에 상응하는 HSV-2의 뉴클레오티드 서열 114523-116179 (GenBank)을 포함하는 뉴클레오티드 단편을 수득하였다. 이어서, ICP27 단편을 pTarget 벡터 (Promega Corp., Madison, WI)의 다중 클로닝 영역에 클로닝하였다.
PJV7630 플라스미드의 제작
pPJV7630에 대한 항원 유전자의 기원은 코스미드 23이라 불리는 코스미드 벡터로 클로닝된 HSV-2 스트레인 MS의 게놈 단편이다. 코스미드 23은 공개된 서열 (HG52 스트레인)에 기초하여 뉴클레오티드 110,931 내지 147,530에 걸친 HSV-2로부터의 3개의 EcoRI 단편으로 구성되었다. 코스미드 23을 EcoRI으로 부분적으로 분해하고, 재결합한 후, 단지 약 28,000 bp 단편 (110,931 내지 139,697) 만을 갖는 제작물을 선별하였다. 이러한 분자를 OP23으로 명명하였다. 이러한 분자로부터 OP23 내의 서열을 변형시키기 위해 6개의 변형을 가하였다. 이들은 HSV-2 서열로부터 비-즉시형 초기 서열 및 골격 DNA 서열을 제거하도록 디자인되었다. 하나의 최종 변형은 골격 서열을 임상적 사용을 위해 적합한 항생제 내성 유전자로 대체하는 것이었다. 그 단계는 하기와 같이 기재된다.
1. Bstl 107I 및 ScaI 분해 및 재결합 (암피실린 내성 유전자 제거). OP23-1 생성.
2. 복제를 위한 SV40 기원을 제거하기 위해 NsiI 분해 및 재결합. OP23-2 생성.
3. ICP27과 ICPO 사이의 영역을 제거하기 위해 BstXI 부분적 분해 및 재결합. OP23-3 생성
4. ICP22 유전자 다음에 오는 서열 및 일부 골격 서열을 제거하기 위해 BspHI로 분해한 후 BsiWI로 부분적으로 분해하고 재결합.
5. Srfl 분해 및 재결합하여 OP23-5 생성. ICP4과 ICPO 사이의 서열을 제거.
6. BstXI 총 분해 및 재결합하여 OP23-6 생성. ICP27과 ICPO 사이로부터의 소단편 제거.
7. 항생제 내성 유전자를 코딩하는 골격 서열을 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 단편으로 대체하여 pPJV7630 생성.
제작물 pPJV7630은 크기가 크며 (19517개 염기), ICPO, ICP4, ICP22 및 ICP27 즉시형 초기 항원을 코딩하는 유전자를 포함한다.
시험관 내 면역 검정
마우스
단일 세포 현탁물을 마우스 비장으로부터 수득하였다. 비장을 메쉬를 통해 압착하여 단일 세포 현탁물을 생성한 후, 세포를 침전시키고, ACK 완충액 (Bio Whittaker, Walkersville MD)으로 처리하여 적혈구를 용해시켰다. 이어서, 상기 세포를 HEPES, 1 ％ 글루타민 (Bio Whittaker) 및 5 ％ 열 불활성화된 FCS (Harlan, Indianapolis IN)로 보충된 RPMI 1640 배지로 2회 세척하였다. 세포를 계수하고, HEPES 및 1 ％ 글루타민을 갖고 5 ％ 열 불활성화된 FCS로 보충된 RPMI 1640, 50 μM 머캅토에탄올 (Gibco-BRL, Long Island NY), 젠타마이신 (Gibco-BRL), 1 mM MEM 나트륨 피루베이트 (Gibco-BRL) 및 MEM 비필수 아미노산 (Sigma, St. Louis MO)로 이루어진 "총" 배지 중에 적합한 농도로 재현탁하였다. CD8 특이적 검정을 위해, 세포를 공지된 CD8 에피토프에 상응하는 펩티드의 존재 하에서 시험관 내에서 배양하였다. BALB/C 마우스에서의 ICP27을 위한 펩티드의 서열은 HGPSLYRTF (QCB Inc)이었다. 펩티드는 DMSO (10 mg/ml) 중에서 만들고, 배양 배지에 10 μg/ml로 희석하였다.
IFN-γ ELISPOT 검정을 위해, Millipore Multiscreen 막 여과 평판을 4 ℃에서 밤새 멸균 0.1 M 카보네이트 완충액 (pH 9.6) 중의 15 μg/ml 항-IFN-γ 항혈청 (Pharmingen) 50 μL로 코팅하였다. 평판을 멸균 PBS로 6회 세척하고, 10 ％ FBS를 포함하는 조직 배양 배지로 실온에서 1 내지 2시간 동안 차단하였다. 배지를 제거하고, 비장 세포를 웰 당 총 1 X 106개 세포로 웰에 분배시켰다. 면역화된 동물로부터의 1 X 106개 미만의 세포가 가해진 웰에 대해, 비투약 동물로부터의 세포를 사용하여 총 1 X 106개가 되게 하였다. 세포를 상술된 바와 같은 펩티드의 존재 하에서 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 평판을 PBS로 2회 세척하고 증류수로 1회 세척하였다. 이어서, PBS로 3회 세척하였다. 바이오티닐화된 항 IFN-γ 단일클론 항체 (Pharmingen)을 평판에 가하고 (PBS 중 1 μg/ml 용액 50 μL), 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 평판을 PBS로 6회 세척하고, 스트렙트아비딘 알칼리 포스파타제 결합물 (PBS 중 1:1000, Pharmingen) 50 μL를 가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 평판을 PBS로 6회 세척하고, 색상 기질 (BioRad)을 가한 후, 어두운 스폿이 나타날 때까지 반응을 진행하였다. 물로 3회 세척하여 반응을 정지시켰다. 평판을 공기 건조시키고, 스폿을 현미경 하에서 계수하였다.
생체 내 검정
마우스
감염성 챌린지 모델을 사용하여 HSV-2에 의한 치명적 챌린지로부터 마우스를 보호하기 위한 상이한 면역화 스케쥴을 시험하였다. 챌린지 전에 마우스를 면역화하고, 감염을 위해 마취시키고 PBS 30 μL 중의 HSV-2 치사량을 비강 내로 투여하였다. 감염시킨지 20일 후, 마우스를 병 및 사망률에 대해 점수화하였다.
시험관 내 면역 검정
식용 돼지
말초 혈액 단핵구 (PBMC)를 분리하기 위해, 전체 혈액을 실온에서 Histopaque-1077 쿠션 (3000 rpm, 30분)을 통해 회전시키고, PBMC를 구배물로부터 밴드로서 회수하였다. PBMC를 총 배지로 3회 세척하고, 계수를 위해 총 배지 25 mL에 재현탁시킨 후, 총 배지 중에 1 X 107개 세포/ml로 재현탁시켰다. 항원이 HSV-2 항원의 중첩 펩티드 라이브러리로부터 유도되는 펩티드의 푸울이라는 것을 제외하고는 마우스에 대해 기재된 바와 같이 ELISPOT 검정을 수행하고, 식용 돼지 IFN-γ (R&D systems)에 특이적인 항-IFN 항체 쌍을 검출에 사용하였다.
생체 내 검정
식용 돼지
식용 돼지에서의 면역 반응을 조사하는데 사용되는 또 다른 검정은 지연 타입 과민감성 (delayed type hypersensitivity: DTH) 검정이었다. 이 검정은 항원 공급원으로서 각각 XR1 디바이스 및 바늘 주사를 이용해 식용 돼지로 전달되는 DNA 플라스미드 및 단백질 추출물을 사용하였다. 항원 전달 부위 주변의 붉은 (홍반) 면적을 DTH 반응의 지시자로서 투여 48시간 후 측정하였다. 피부로의 항원 전달은 면역 반응이 완결된 지 7일 후 수행되었다.
실시예 1
NOI를 포함하는 2개의 상이한 플라스미드를 사용하여 마우스를 면역화하였다. 이들은 HSV-2 임상 백신 다수 유전자 플라스미드 (PJV7630) 및 HCMV 프로모터 에 작동적으로 연결된 ICP27을 포함하는 단일 유전자 플라스미드였다. ICP27 NOI는 PJV7630에서 발견되는 지배적 에피토프를 코딩하고, 그래프는 이러한 단백질에 특이적인 CDS 반응을 나타낸다.
NOI 투여 스케쥴
NOI를 1주일 동안 각각 7일 (D 7), 0 및 7일 (D 0, 7), 또는 0, 2, 4 및 7일 (D 0, 2, 4, 7)에 1, 2 또는 4회 투여하였다. NOI 투여 당 1 또는 2 쇼트 (shot)가 수행되었으며, 하나의 군에서는 LT 아주반트가 NOI와 함께 공동-투여되었다.
결과
ICP27 유전자는 PJV7630에서 발견되는 지배적 항원이며, 도 1A 및 1B는 이러한 표적 항원에 대해 특이적인 CDS 반응을 나타낸다. 통상적으로, 플라스미드 PJV7630 (도 1B) 및 ICP27 (도 1A)는 단지 1회의 NOI 투여 후 500개 ELISPOT/1 X 106개 세포를 나타내고, 2회의 NOI 투여 후 1500개 ELISPOT/1 X 106개 세포를 나타내었다. 2회의 NOI 투여 후 LT 유전자 아주반트를 투여한 경우 약 3500개 ELISPOT가 발견되었다. LT 아주반트의 부재 하에서도 4회의 NOI 투여 후 3500개 이상의 ELISPOT/1 X 106개 세포를 나타내었으며, LT 유전자 아주반트는 반응을 향상시킬 것이다. 도 1A에서, NOI와 함께 공동-투여된 LT로부터의 반응은 결과가 오프-스케일이었으므로 측정되지 못했다.
요약
클러스터 NOI 투여는, PJV7630로 면역화된 마우스에서 측정된 ICP27 특이적 CD8 IFN-감마 ELISPOT에 기초하여, 세포성 면역 반응을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2
하기 3개의 실험의 목적은, 단일 유전자 플라스미드의 클러스터 NOI 투여로부터 생기는 향상된 CMI 반응이 치명적 챌린지로부터의 향상된 보호와 관련되는지를 평가하기 위한 것이었다.
방법
플라스미드 PJV7630를 1주 기간에 걸쳐 마우스에 투여하였다. 1회 (7일), 2회 (0 및 7일) 또는 4회 (0, 2, 4 및 7일)의 NOI 투여를 1주의 기간에 걸쳐 수행하였다. 하나의 군은 각각의 면역 시 2 용량을 투여받았으나, 대부분의 마우스는 각각의 면역화 시 단일 용량의 PJV7630을 투여받았다.
결과
그래프에서 표지는 "투여수 X 용량수/투여"이므로, 4 X 1 은 각각의 투여 시 단일 용량으로 4회의 NOI 투여된 동물이다. NOI 투여 1주 후, 바이러스로 감염시키기 1주 또는 2주 전 동물을 휴식시켰다. 바이러스 용량은 LD50의 약 5배이었다.
도 2A는 2주 휴식 후 C57B1/6 마우스로부터의 결과이다. 그 결과, 4 X 1 스케쥴 (즉, 4회 투여 X 1 용량/투여)가 보다 보호적임을 분명히 나타낸다. 이러한 결과는 2 X 2 (즉, 2회 NOI 투여 X 2 용량)가 총 4 용량이기 때문에 증가된 용량으로부터 생기는 것으로는 보이지 않는다.
도 2B는 1주 휴식 후 C57B1/6 마우스로부터의 결과이다. 도 2A에서 나타난 2주 휴식 후의 결과와 실질적으로 동일한 결과가 얻어졌다는 것이 분명하다. 그러나, 도 2B에는 단지 1회의 NOI 투여를 갖는 추가의 군이 있다.
도 2C는 1주 휴식 후 Balb/c 마우스로부터의 결과이다. 챌리지 용량이 사망률에서 분명한 차이를 얻기에 충분히 높지 않았다는 것이 분명하다. 괄호 안의 수는 병 스코어이며, 그 수가 높을수록 동물은 보다 병적이다. 그 결과는 도 2A 및 2B로부터의 결과와 일치하며, 4 X 1 (즉, 4회 투여 X 1 용량)이 가장 우수한 보호를 부여한다는 것을 나타낸다.
요약
1주 동안 4회 투여 X 1 용량/투여의 클러스터 투여가 단일 투여하거나 1 이상의 용량/투여를 이용하는 것보다 강력한 강한 보호적 CMI 반응을 빠르게 나타내었다.
실시예 3
본 실험의 목적은 단일 유전자 플라스미드의 DNA 투여 사이의 시간 간격을 다양화하는 것이었다.
방법
모든 마우스는 각각의 투여를 받는 날이 다르고 투여 사이의 시간 간격이 다른 총 4회의 투여를 받았다. 마우스는 투여 사이에 6, 4, 2, 1 또는 0일 간격을 가졌다 (즉, 0은 하루에 4회의 쇼트를 가졌다). 각각의 스케쥴의 최종 투여는 동일한 역일 (calendar day)에 수행되었으며, 최종 투여 7일 후 모든 동물을 희생시켰다.
결과
도 3A는 ICP27 단일 유전자 플라스미드의 클러스터 투여 사이의 시간 간격이 0, 1, 2, 4 및 6일인 경우의 CD8 ELISPOT 결과를 제공한다. 그 결과, 투여 사이의 시간 간격이 증가하면 CD8 ELISPOT 결과가 향상되며, NOI 투여 사이의 시간 간격이 4일 (즉, 96시간)인 경우에 최대 결과가 얻어진다는 것을 나타낸다.
도 3B는 HbsAg 단일 유전자 플라스미드의 클러스터 투여 사이의 시간 간격이 0, 1, 2, 4 및 6일인 경우의 CD8 ELISPOT 결과를 제공한다. 그 결과, 투여 사이의 시간 간격이 증가하면 CD8 ELISPOT 결과가 향상되며, NOI 투여 사이의 시간 간격이 4 내지 6일인 경우에 최대 결과가 얻어진다는 것을 나타낸다.
요약
마우스에서 클러스터 NOI 투여 사이의 시간 간격의 조사는, 4회의 NOI 투여가 수행될 때 CD8+ T 세포 반응의 면에서 최적 반응은 NOI 투여가 4 또는 6일 간격일 때 얻어진다는 것을 입증하였다.
도 3C는 HbsAg 단일 유전자 플라스미드의 클러스터 투여로부터의 항체 결과를 제공한다. 수득된 항체 역가는 아주 약하였다. 이러한 결과는, 0, 1, 2, 4, 또는 6일 투여 간격의 클러스터 NOI 투여가 CD8+ T 세포 반응은 향상시키지만, 항체 역가를 유의하게 향상시키지는 않은 것으로 보인다는 것을 나타낸다.
실시예 4
본 실험의 목적은 다수 유전자 플라스미드 (PJV7630)의 클러스터 NOI 투여에 대해 CD8+ T 세포 반응의 면에서 CMI 반응을 평가하고자 하는 것이었다.
방법
동물들은 총 4회의 NOI 투여를 받았으며, NOI 투여 사이의 시간 간격은 달리하였다. 각각의 군에 대한 최종 투여는 동일한 날 (NOI 투여의 개시는 달리함)에 수행하였으며, 투여를 완결한 지 1주 및 3주 후에 반응을 측정하였다. 3주 샘플링은, 상이한 스케쥴이 투여의 타이밍에서 갖는 효과를 최소화하기 위해 추가되었다. 예를 들어, 6일의 투여 간격을 가지면서 4회의 NOI 투여를 갖는 동물은 제 1 투여와 제 4 투여 사이의 시간 간격이 18일이며, 투여 사이의 시간 간격이 0인 동물은 18일에 모든 쇼트를 가졌다.
결과
도 4A 및 4B의 결과는 ICP27 특이적 CD8 IFN-감마 ELISPOT에 의해 측정되는 세포 반응을 나타낸다. NOI 투여 사이의 시간이 그래프에 표시되어 있다. 모든 동물은 총 4 쇼트를 받았다. 다수 유전자 플라스미드 (PJV7630)로부터의 결과는 단일 유전자 플라스미드 (ICP27)를 사용하는 초기 실험으로부터의 결과와 유사하였다는 것이 분명하다. 이에 대해, 4일 및 6일의 투여 간격은 ELISPOT 측정 면에서 최적 반응을 나타내었으며 (도 3C), 이는 3주에도 유지되었으나, 반응은 그 시간까지 약 3배 낮아졌다 (도 3D).
실시예 5
본 실험의 목적은 HIV-1gp120과 같은 비교적 약한 항원에 대한 체액성 및 세포 매개된 면역 (CMI) 반응을 향상시키는데 있어 유전자 아주반트의 사용과 클러스터 NOI 투여 스케쥴 사이에 상승작용이 있는지의 여부를 측정하기 위한 것이었다.
방법
본 실험은 마우스에서 적어도 2회 투여의 gpl20 항원 투여를 수반하며, 각각의 "투여"는 1 내지 4회 XR1 투여의 클러스터로 구성되었다. 도 5A에 있는 도식적 디아그램을 참조한다. 또한, 투여 사이의 휴식 기간은 1주이었다. LT A+B 유전자 아주반트 (pPJV2012)를 사용하였다. pPJV2012 플라스미드의 맵이 도 10에 제공되어 있다. pPJV2012 플라스미드는 국제 공개 제WO 03/004055호에 기술되어 있는 바와 같이 각각 플라스미드 pPJV-2004 및 pPJV-2005로 LTA 및 LTB 서브유니트 단백질을 코딩하는 LT 유전자를 클로닝하여 제조되었다. LTA 및 LTB 서브유니트단백질을 코딩하는 유전자를 최초 플라스미드로부터 절단하고, 단일 플라스미드로 삽입하여 pPJV2012 플라스미드를 제작하였다.
결과
도 5B는 NOI 투여 사이에 7일 시간 간격을 갖는 동물군으로부터 수득된 데이터를 나타낸다. 각각의 클러스터에서 XR1 투여의 수는 LT A+B 유전자 아주반트 (pPJV2012)의 존재 또는 부재와 같이 다양하였다. 수득된 결과는 유전자 아주반트의 존재 또는 부재가 세포 반응 (IFN-감마 생성)에 가장 강한 영향을 갖는다는 것을 나타낸다. 도 5B는 NOI 투여 스케쥴이 2회 투여로 클러스터되었을 때 LT-향상된 반응이 가장 강하였다는 것을 분명히 입증한다. 이러한 결과는 클러스터 투여 스케쥴이 유전자 LT 아주반트를 사용해 수득되는 전체 세포 반응에 상당히 기여한다는 것을 입증한다.
도 5C는 CMI 반응과는 대조적으로, 클러스터 투여가 총 항체 반응의 세기에 가장 큰 영향을 갖는 것으로 나타났다는 것을 입증한다. 도 5C에 설명된 바와 같이, 유전자 아주반트 벡터의 존재 또는 부재 하에 클러스터 당 4회의 투여를 이용하여 매우 강한 gp120-특이적 역가 (이전에 나타내었던 역가 보다 5 내지 10배 높음)를 유도하였다. 중요하게도, 유전자 아주반트의 존재는 IgGl-대-IgG2a 서브클래스의 균형에는 영향을 끼쳤으나, 강한 항체 역가를 유도하는데는 필요하지 않았다 (나타내지 않음).
요약
상기 결과는, 약한 항원을 코딩하는 NOI가 아주반트를 코딩하는 NOI와 함께 공동-투여되는 경우, 2회의 NOI 투여 후 인터페론 감마 방출 면에서 최대 CMI 반응이 수득된다는 것을 입증하였다. 이와는 대조적으로, 강한 체액성 면역 반응은 아주반트의 존재 또는 부재 하에 약 48시간의 투여 간격의 4회 NOI 투여 클러스터로 수득되었다.
실시예 6
본 실험의 목적은 pPJV7630을 사용한 식용 돼지의 면역화가 IFN-γ ELISPOT 및 DTH 반응으로 확인되는 바와 같이 세포성 면역 반응을 생성하는가를 측정하는 것이었다.
방법
본 실험을 위해, 식용 돼지에게 XR1 디바이스로 pPJV7630 또는 위약 (금 단독)을 투여하였다. 돼지는 각각의 투여에 대해 2 용량을 투여받았으며, 1주의 기간에 걸쳐 4회 투여의 클러스터 스케쥴을 가졌다. 따라서, 각각의 돼지는 하나의 클러스터에 8 용량의 백신을 투여받았다. 제 2 클러스터 면역화는 제 1 클러스터 면역화가 끝난 지 28일 후에 개시되었다.
결과
도 6A는 제 1 클러스터 면역화 후 동물로부터 수득되는 IFN-γ ELISPOT 데이터를 나타낸다. 값은 8마리의 면역화된 동물 및 8마리의 대조군 동물로부터의 평균값이다. 이 데이터는 클러스터 면역화 스케쥴이 면역원성을 측정하기가 힘든 모델인 것으로 간주되는 식용 돼지에서 세포성 면역 반응을 증가시킬 수 있었다는 것을 나타낸다.
도 6B는 pPJV7630로 면역화된 돼지 (4마리 동물)에서 항원 투여의 부위에 존재하는 홍반의 평균 면적을 나타낸다 (대조군 동물은 그래프에 포함시키지 않았다). 항원은 면역화가 완결된지 7일 후 투여되었으며, 돼지는 2번의 클러스터 면역화 처리되었다. 항원 투여 48시간 후 홍반의 존재는, 이것이 DTH 반응이라는 것을 나타낸다. 그 결과, N (null) 플라스미드 또는 비관련 항원 (sAg)인 B형 간염 표면 항원은 DTH 반응을 유도하지 않으나 백신 항원 (0, 4, 22, 27)은 양호한 DTH 반응을 나타내기 때문에, DTH 반응은 항원 특이적인 것으로 나타났다. 단지 위약만이 투여된 돼지에서는 (자료 나타나지 않음), 항원에 대한 어떠한 DTH 반응도 발견되지 않았으며, 6B에서의 반응이 pPJV7630를 사용한 면역화의 결과라는 것을 입증한다. 단백질 추출물이 주사되는 부위에서, ICP22 및 ICP4 단백질에 대한 수개의 양호한 DTH 측정이 있었으나, 대조군 PBS 용액 및 ICPO 및 ICP27 단백질에 대해서는 DTH 반응이 없었다. 단지 5 μg의 단백질 추출물이 주사에 이용되었으며, 100 μg 이하의 추출물이 DTH 반응을 유도하는데 사용될 수 있기 때문에, 낮은 반응은 투여 용량에 관련될 수 있다.
요약
식용 돼지 모델에서, 클러스터 면역화는 백신 항원에 대해 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 식용 돼지는 면역 반응을 일으키는데 우수한 모델인 것으로 간주되지 않으나, 클러스터 면역화는 세포성 면역 반응을 일으키는 능력을 가졌다.
실시예 7
하기 표 1에 상세히 나타낸 바와 같이, pPJV1671로부터 발현되는 ha 단백질에 대한 항체 반응에 대해서 투여량 및 디바이스의 영향을 조사하기 위해 식용 돼지 연구를 수행하였다 (XR 입자 가속화 디바이스는 상기 기술되어 있다).
코호트 (Cohort) (동물 번호) 백신 쇼트수
1 (1-8) pPJV1671 Gun#49 0.5 mg Au/쇼트 2
2 (9-16) pPJV1671 XR-2 11/16 1.5 mg Au/쇼트 2
3 (17-24) pPJV1671 XR-2 11/16 1.5 mg Au/쇼트 1
4 (25-32) pPJV1671 XR-2 11/16 1.0 mg Au/쇼트 1
5 (38-40) pPJV1671 XR-2 11/16 클러스터 면역화* 1.5 mg Au/쇼트 2 X 4
6 (41-48) pPJV1671 XR-2 11/16 1.5 mg Au/쇼트 8
7 (49-56) 음성 대조군
* 1, 3, 5 및 8일에 2 쇼트
동물을 프라이밍하고 4주에 백신으로 부스팅하였다. 혈액을 다양한 시점에서 채혈하고, 부스팅한 지 2주 후 항체 역가를 그래프로 나타내었다. 2개의 군은 각각의 면역화에서 클러스터에 의하거나 한번에 모두 총 8 용량을 투여받았다. 클러스터로 면역화된 동물은 높은 혈청 항체 수준을 나타내었다.
항체 역가
항체 역가는 포스페이트 완충된 염수 중에 희석된 사르코실-파괴되고 정제된 Sw/IN 바이러스의 200 혈구응집 유니트/웰을 이용해 표준 절차에 따라 ELISA로 측정되었다. 돼지 항체는 염소 항-돼지 면역글로불린 G 알칼리 포스파타제 결합체를 사용해 직접적으로 측정되었다.
플라스미드 pPJV1671
pPJV1671은, 도 8에 나타낸 바와 같이. 플라스미드 인플루엔자 A/Panama/2007/99 (H3N2)의 헤마글루티닌 (HA) 항원을 코딩하는 사람 DNA 백신 벡터이다. HA 코딩 서열은 템플레이트 RNA의 공급원으로서 CDC로부터 수득되는 A/Panama/2007/99 바이러스의 샘플을 사용해 표준 역전사효소/폴리머라제 쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 수득되었다. 하기 단계가 최종 pPJV1671 HA DNA 백신 백터를 개발하는데 사용되었다:
ㆍ A/Panama/2007/99 (H3N2)의 RNA 절편 #4에 대한 dsDNA 단편의 RT-PCR 생성.
ㆍ 이. 콜라이에서 표준 pUC 19-기초된 벡터 내의 RNA 절편 #4 DNA 클론의 증식.
ㆍ RNA 절편 4 클론 내의 H3 Panama HA 코딩 서열의 서열 분석.
ㆍ pPJV7563 DNA 백신 벡터 (Nhe I 및 Bsp 120I)와 조화되는 말단을 갖는 H3 Panama 코딩 서열 (이의 ATG 코돈 없음)을 포함하는 DNA 단편을 생성하기 위해 제 2 PCR 반응.
H3 Panama HA 코딩 서열을 pPJV7563로 삽입하여 Kozak 컨센서스를 따르는 최종 pPJV1671 H3 Panama HA DNA 백신 벡터를 수득하였다. (NheI 부위에서 삽입을 통한) 벡터-공급된 ATG 코돈의 사용으로 도 9에 나타낸 바와 같이 HA 유전자의 코딩 서열의 아미노 말단에 적은 2-아미노산 삽입이 발생하였다.
요약
본 연구는 클러스터 면역화가 식용 돼지 모델에서 항체 반응을 상당히 개선하였다는 것을 입증하였다.
플라스미드 pPJV7563
pPJV7563 의 제작
pPJV7563 플라스미드 맵이 도 11에 제공되어 있다. pPJV7563 플라스미드에 대한 기초 조성이 도 12에 제공되어 있다. 플라스미드 pPJV7563의 성분 및 이들의 위치는 하기와 같다:
1-44: 트랜스포존 903 서열
45-860: 트랜스포존 903으로부터의 카나마이신 내성 코딩 서열
861-896: 트랜스포존 903 서열
897-902: Sal1 부위
903-1587: CMV 프로모터
1588-1718: CMV의 즉시형 초기 유전자로부터의 비해독되는 리더 서열
1719-1724: BamHl 및 BglII 제한 효소의 융합
1725-1857: 래트 인슐린 인트론 A
1858-1863: BamHl 부위
1864-1984: HBV 표면 항원 5'-비해독 리더
1985-1993: 합성 개시 코돈/Nhel 클로닝 부위
1994-2011: 합성 클로닝 부위
2012-2544: HBV 인핸서
2545-2555: 올드 (old) 벡터 서열. NCBI 데이터베이스에 대한 적중 없음
2556-2686: 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 영역
2687-3759: pUCl9 벡터 서열
pPJV7563 플라스미드는 하기와 같이 제조되었다:
PJV7563 의 제작을 개요하는 도 13의 흐름도에 대한 설명
pWRG7074 중의 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그널 (bovine growth hormone polyadenylation signal: BGHpA)을 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 시그널 (rabbit beta-globulin polyadenylation signal: RBGpA)로 대체하여 pWRG7284를 생성하였다. 모든 CMV 서열을 CMV 프로모터 및 엑손1/2 융합물을 포함하는 pWRG7128 유도된 PCR 단편으로 대체함으로써 CMV의 인트론 A를 pWRG7284로부터 제거하여 pWRG7293을 수득하였다.
CMV 및 HBV 서열을 pWRG7284로부터 제거하고, pWRG7293로부터의 CMV 및 5'-HBV 서열 및 pWRG7128로부터의 3'-HBV 서열로 대체하였다. 이 단계에서 SIV nef 유전자 서열을 제거하여 pWRG7382를 수득하였다. 래트 인슐린 인트론 A (rat insulin intron A: RIA)를 가해 pPJV7382를 더욱 조작함으로써 RG7389를 수득하였다. pPJV7389에 있는 카나마이신 내성 (Kanamycin resistance: KanR) 유전자를 짧은 버젼으로 대체하여 이러한 유전자의 양 말단으로부터 불필요한 서열을 제거함으로써 pPJV7496를 생성하였다. pPJV7496로부터 RIA에 있는 Nhe 1 부위를 교정하여 pPJV7530를 수득하였다.
pPJV7530에서 3'-UTR의 5' 영역을 지나 HBV 서열을 제거하고, pPJV7468로부터의 HBV 5'-UTR, flu M2 유전자 및 3'-UTR의 5' 영역으로 대체시켜 PJV7549를 수득하였다. PJV는 WRG7128로부터의 HBVenh 및 HBV 5'UTR 영역을 다양한 항원을 코딩하는 벡터에 유지시킴으로써 항원 발현 및 면역원성 모두를 재현적으로 개선시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 이들은 현재 PJV의 DNA 백신 벡터에서 공통적인 요소이다. 이어서, M2 유전자를 pPJV7549로부터 결실시키고, 폴리링커를 형성하는 올리고뉴클레오티드로 대체하였다. 이러한 조작으로 다른 코딩 서열을 수용할 수 있는 발현 벡터인 pPJV7563을 수득하였다.
PJV7563 의 모벡터인 플라스미드 pWRG7074 의 제작
표준 플라스미드 골격인 pWRG7074가 개발되었다. 이 골격은 전구체 플라스미드로 사용되었으며, 이로부터 수개의 임상 시도에서 사용되는 HBsAg 발현 벡터인 pWRG7128를 조작하였다. 본 절에서는 이러한 골격의 유도체화가 서술적으로 기술되며, 도 15 ("플라스미드 PJV7074 및 PJV7128의 흐름도 전개")및 16 ("주요 플라스미드 특징 맵")에 나타나 있다. 간단히 설명하면, 사람 CMV 즉시형 초기 프로모터 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열을 포함하는 단일 단편을 표준의 특징이 잘 알려진 pUC19 세균 플라스미드 벡터에 삽입하여 pWRG7074를 유도체화시켰다. 암피실린을 카나마이신 (KanR) 내성 마커로 대체시키고 일부 제한 부위를 변형시키는 수개의 연속한 조작을 수행하였다. CMV 프로모터 및 bGH 폴리A 영역의 공급원인 DNA 단편을 짐 물린 (Jim Mullin, 당시 스탠포드대에 재직)으로부터 선물로 받은 플라스미드 pJW4303으로부터 수득하였다.
플라스미드 WRG7074 및 WRG7128의 제작에 대해 하기에서 기술한다. 달리 언급하지 않는 한, 모든 클로닝은 PowderJack Vaccines, Inc. (Madison, WI) (및 Agracetus, Inc. Auragen, Inc. 또는 Geneva, Inc. (Middleton, WI)로 이전에 알려짐)에서 수행되었다. 제작 단계는 이탤릭체로 되어 있으며, 점 (ㆍ)은 특정 서열에 대한 실제 정보를 제공한다.
단계 1: TPA 시그널 펩티드 코딩 서열을 포함하는 pJW4303 (맵, 도 10.2)의 작은 HindIII-BamHI 단편을 HindIII-BamHI 분해로 결실시켰다. 이러한 작은 단편을 HindIII-Notl-BamHl 링커로 대체하여 JW4303-Notl를 생성하였다.
pJW4303로부터의 CMV 프로모터 및 bGH 폴리A 영역을 포함하는 단편은, 길이가 2131 bp인 것으로 측정되었기 때문에 PJV가 갖는 Sal I-Xho I 단편이다. pJW4303으로부터 유도되는 Sal I-Xho I 단편에 대한 뉴클레오티드 서열이 추론되었다. 하기 항목이 도 10.2에서 확인된다:
ㆍ단편의 뉴클레오티드 위치 1에 있는 Sal I 부위
ㆍ뉴클레오티드 위치 7에 있는 CMVIE 프로모터 단편의 개시. 이는 GenBank 서열 입수 #M60321 (사람 사이토메갈로바이러스 즉시형 초기 단백질 유전자 5' 말단)로부터의 뉴클레오티드 위치 451에 상응한다.
ㆍ뉴클레오티드 위치 1648에 있는 CMVIE 프로모터 단편의 말단. 이는 GenBank 서열 입수 #M60321 (사람 사이토메갈로바이러스 즉시형 초기 단백질 유전자 5' 말단)로부터의 뉴클레오티드 위치 2097에 상응한다. 유추된 CMVIE 프로모터 영역과 상술된 GenBank 서열 사이에 약간의 뉴클레오티드 차이가 관측되었다. 이는 상이한 CMV 바이러스 분리물 사이의 천연 다형성에 기인한 듯하다.
ㆍ사람 조직 플라스미노겐 활성자의 시그널 펩티드 코딩 서열을 위한 뉴클레오티드 위치 1661에 있는 ATG 해독 개시 코돈. TPA 시그널 펩티드 코딩 서열은 문헌 (Lu et al., J. Virol. 70: 3978, 1996)에 기재된 바와 같이 합성 DNA로부터 유도되었다. 상기 문헌은 pJW4303의 제작을 간략히 기술하나, 이러한 기술은 유추된 서열과 일치하지 않는 다소간의 실수를 포함한다.
ㆍ각각 뉴클레오티드 위치 1649 및 1724에 있는 코딩 서열 삽입 위치 Hind III 및 Nhe I. SIV nef 상동 영역이 bGHpA 영역의 일부로서 나타난다는 것을 주목한다.
ㆍSIV nef에 상동인 영역을 시작하는 뉴클레오티드 위치 1741에 있는 Bam HI 제한 부위. 이는 GenBank 서열 입수 입수 #M33262 (시미안 면역결핍 바이러스, 분리물 239, 완전한 프로바이러스 게놈 및 플랭킹 서열)의 뉴클레오티드 위치 9444에 상응한다.
ㆍSIV nef 상동 영역을 종결하는 뉴클레오티드 위치 1849에 있는 Bgl II 제한 부위. 이는 GenBank 서열 입수 #M33262 (시미안 면역결핍 바이러스, 분리물 239, 완전한 프로바이러스 게놈 및 플랭킹 서열)의 뉴클레오티드 위치 9552에 상응한다.
ㆍ1999년에 시미안 면역결핍 바이러스 nef 유전자의 서열과 상동인 109개 염기쌍을 나타내는 서열이 이 벡터에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 도 10.1에 도시된 바와 같이, 이 서열은 pWRG7128이 제작될 때 제거되었다. 그러나, pWRG7074에는 남아 있었다. 이 서열은 pWG4303 및 유도체 pWRG7077 및 pWRG7074에 존재하였다. SIV nef 상동체는 뉴클레오티드 위치 77 및 184 사이에서 발견된다. 따라서, bGH 폴리A 영역에 인접한 SIV nef 단편의 삽입물은 공급 DNA의 PJV 수용 이전에 발생한 명백한 제작 인공물이었다.
ㆍ뉴클레오티드 위치 1873에 있는 소 성장 호르몬 폴리A 영역 상동체의 개시. 이는 GenBank 서열 입수 #M57764 (소 성장 호르몬 유전자, 완전 코딩 서열)의 뉴클레오티드 위치 2326에 상응한다.
ㆍ결합물 4의 뉴클레오티드 위치 2096에 있는 소 성장 호르몬 폴리A 영역 상동체의 말단. 이는 GenBank 서열 입수 #M57764 (소 성장 호르몬 유전자, 완전 코딩 서열)의 뉴클레오티드 위치 2550에 상응한다.
ㆍ단편의 말단에 있는 Xho I 제한 부위 (뉴클레오티드 위치 2131).
단계 2: pJW4303-NotI (SaII-XhoI 단편)으로부터의 CMV 프로모터 및 bGH 폴리A 단편을 pUC19의 Sal I 부위로 삽입하여 플라스미드 pWRG7012의 생성.
pWRG7012는 2개의 BamHI 부위 및 2개의 HindIII 부위를 포함한다. 각각의 이들 부위 중의 하나는 후속한 단계 (하기 참조)에서 제거되었다.
단계 3: pUC19의 다중 클로닝 부위의 커다란 부분을 제거하기 위해 pWRG7012의 EcoRI-XbaI 영역을 결실시켜 pWRG7013 (도 10.2)를 생성.
PWRG7013은 2개의 HindIII 부위 및 단지 1개의 BamHI 부위를 포함한다.
단계 4: 인트론과 하부 삽입물 사이의 HindIII 부위의 용이한 이용이 가능하도록 pWRG7012로부터 CMV 프로모터의 5'에 위치된 HindIII 부위의 제거. 이는 pWRG7014 (도 10.2)를 생성하였다.
pWRG7014는 2개의 BamHI 부위 및 단지 1개의 HindIII 부위를 포함한다.
단계 5: 단지 1개의 HindIII 부위 및 1개의 BamHI 부위를 포함하는 플라스미드를 생성하기 위해, pWRG7013으로부터 HindIII-EcoRI 단편을 HindIII-EcoRl 결실된 pWRG7014에 위치시켜 WRG7077의 암피실린 내성 버젼인 pWRG7020 (도 10.2)을 생성하였다.
단계 6: pUC19에서 Eaml105 1-Pstl 플랭킹된 암피실린 내성 유전자를 결실. 복제 기원을 포함하는 단편을 폴리머라제로 처리하여 말단을 무디게 함. PUC4K에 있는 Pst1 플랭킹된 카나마이신 내성 유전자를 분리. 이 단편을 폴리머라제로 처리하여 말단을 무디게 하고, 복제 단편의 기원에 결합시켜, pWRG7031 (단계 8)로부터의 CMV-HBsAg-bGH-pA 카세트를 수용할 수 있는 KanR 벡터인 pWTG7072를 생성하였다.
단계 7: pWRG7020에서 폴리링커의 Hd3-BamHl 서열을 결실시키고 폴리머라제로 말단을 무디게 함. pAM6에서 BamHI 플랭킹된 1.4 KB HBsAg 포함 단편을 분리. 이 단편을 폴리머라제로 처리하여 말단을 무디게 하고, 벡터에 결합시켰다. 이로써 암피실린 내성 HBsAg 발현 플라스미드인 pWRG7031을 생성하였다.
단계 8: pWRG7072의 Pvu2-Sphl 서열을 결실. pWRG7031를 EcoRI으로 절단하고, 폴리머라제로 말단을 무디게 한 후, Sph1으로 플라스미드를 추가로 절단하여, CMV, HBV 및 소 서열을 포함하는 단편을 분리. 이 단편을 제조된 pWG7072에 결합시켜 pWRG7074를 생성하였다.
단계 9: pWRG7074을 Bgl2로 절단하고, 폴리머라제로 말단을 무디게 한 후, BstXl으로 추가로 절단하여 벡터 단편을 생성. pWRG7074을 Ncol으로 절단하고, 녹두 뉴클레아제로 말단을 무디게 한 후, BstXl으로 추가로 절단하여 3'-인핸서를 포함하는 삽입 단편을 생성하였다. 이들 2개의 단편을 결합시켜 HbxAg의 5'-코딩 영역 및 pWRG7074에서 발견되는 SIV NEF 서열이 없는 HBsAg 발현 플라스미드인 pWRG7128을 생성하였다.
단계 lO: pWRG7077의 제작: pWRG7072을 Sapl으로 절단하고, 폴리머라제로 말단을 무디게 한 후, Sph1으로 추가로 절단하여 복제 기원 및 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 단편을 생성하였다. WRG7020에 있는 EcoRI 부위를 절단하고, 말단을 무디게 한 후, Sph1로 부분적으로 절단하여 CMV 프로모터, 인트론 A 및 BGH 폴리아데닐화 영역을 포함하는 단편을 생성하였다. 이러한 단편을 함께 결합시켜 pWRG7077를 생성하였다. 최종 벡터 pWRG7077는 공급 플라스미드 pJW4303로부터 유도된 최초 CMV-인트론 A-bGH-pA 영역은 포함하나, TPA 시그널 펩티드 코딩 서열이 Not I 제한 부위를 포함하는 링커로 대체되어 단계 1에서 기재된 것의 변형물이다.
실시예 8
본 발명자는 ATCC로부터 수득된 HPV 16 게놈 클론으로부터 PCR에 의해 E6 및 E7의 복사물을 제조하였다. 완전한 길이의 플라스미드는 완전한 바이러스 게놈을 포함하므로 BSL-2 조건 하에 유지된다. 본 발명자는 각각 p53 및 Rb에 대한 결합 영역을 결실시킴으로써 E6 및 E7을 무독화시켰다 (Slebos et al., Virol. 1995, 208, 111-120; 및 Smahel et al., Virol. 2001, 281, 231-238). PCR 단편을 pJV7563에 클로닝하여 유전자를 인트론 A 없이 CMV 프로모터의 제어하에 배치하였다.
플라스미드를 Qiagen 내독소-비함유 Mega 키트로 제조하고, 표준 스페르미딘 CaCl2 방법으로 금 mg 당 DNA 2 μg으로 금 입자에 코팅하였다. 0.05 mg/ml PVP를 사용하여 카트리지를 제조하였다. B6 마우스를 500 psi의 XR 연구 디바이스를 사용해 면도된 복부에 단일 전달함으로써 면역화시켰다.
TC-1 세포는 존스 호킨스 의대 (Johns Hopkins School of Medicine)로부터 입수하였다. 세포를 최소한의 계대수로 배양하여 증대시킨 후, 바이알을 동결시키고, 사용할 때까지 액체 N2 중에 저장하였다. 세로를 PBS 중의 주사물로 제조하였다. 마취된 마우스의 면도된 우측 옆구리에 2 X 104 내지 2 X 105개 세포로 50 내지 100 μl를 피하 주사하였다. 종양을 7일에 시작하여 월요일, 수요일 및 금요일에 측정하였다. 직각으로 2개의 직경을 측정하고, 이를 곱하여 사각 면적을 구하였다. 또한, 동물의 건강을 모니터링하였다. 종양이 120 mm2를 초과하게 성장하거나, 종양이 괴사성을 보이거나, 마우스가 죽어가는 것으로 보이면, 마우스를 안락사시켰다.
ELISPOT 검정을 위해, 마우스를 마지막 면역화한 지 1 주일 후 희생시켰다. 비장을 무균적으로 적출하고, 단일 세포 현탁물을 제조하였다. 세포를 BD γ-IFN ELISPOT 키트에서 제조자의 지시에 따라 1 X 106 또는 5 X 105개 세포/웰로 도말하였다. E7 CD4 및 CD8 및 E6 CD8에 특이적인 펩티드를 10 μM의 최종 농도로 가하였다. 배지 웰은 펩티드를 포함하는 웰과 같이 동일한 양의 DMSO를 포함하였다. 펩티드 존재 하에 유도된 스폿으로부터 배지 스폿을 감하여 특이적 스폿을 계산하였다.
결과
E6 또는 E7 DNA로 B6 마우스를 면역화하여 상당량의 γ-IFN 분비 세포를 유도하였다 (도 23). E6의 경우, 단지 CD8-특이적 에피토프가 공지되었다. E7의 경우, CD4- 및 CD8-특이적 에피토프가 확인되었으며, PMED 면역화 후 이 둘 모두에 대한 강한 반응이 나타났다. 이. 콜라이 열 불안정 독소 (LT) 또는 콜레라 독소 (CT) DNA를 E6 또는 E7 백신에 첨가하여 시험하였다. LT는 E7 펩티드에 대한 γ-IFN ELISPOT 반응을 약 2배 (도 23) 증가시키는 반면, 종양 보호에서는 2가지 독소에서 어떠한 증가도 나타나지 않았다.
흥미롭게도, TC-1 세포 단독의 주사가 E6 및 E7에 대한 γ-IFN 반응을 증가시켰다. 3일 간격으로 클러스터로 전달된 3 용량의 PMED 면역화로 관측되는 것보다는 낮았다. TC-1 주사와 PMED 면역화를 조합하여 중간적 결과를 얻었다. 5 X 104개 TC-1 세포의 주사는 비처리된 E6 마우스에서 일관되고 빠른 종양 전개를 이끌었다.
5 X 104개 TC-1 세포의 주사는 비처리된 B6 마우스에서 일관되고 빠른 종양 전개를 이끌었다. 1 용량 같이 적은 용량의 E6 또는 E7 DNA로 예방적 처리하여 종양 전개에 대해 실질적인 보호를 제공하였다 (도 25). 종양을 주사한 지 3일 후부터 시작하여 3 용량의 클러스터로 E6 또는 E7을 전달하는 경우, 치료적 면역화가 효과적이었다. 보다 적은 용량의 전달은 덜 효과적이었다 (데이터는 나타내지 않음). E6과 E7 플라스미드의 공동-전달은 비록 단지 1번 시험되었지만 단독 전달보다 더 효과적이지는 않았다.
하나의 연구에서, E6 백신 처리에 의해 초기 TC-1 챌린지에 대해 보호되었던 동물은 추가의 처리 없이 50일 후에 다시 챌린지를 받게 하였다. 도 27에 나타난 바와 같이, 모든 동물은 이러한 2차 챌린지에 대해 완전히 보호되었으나, 같은 연령의 비처리된 대조군은 모두 종양이 전개되어 안락사시켰다.
본 발명자는 큰 종양에 대해 다양한 성공률로 치료를 시도하였다. 예를 들어, 도 28에 나타난 바와 같이, 20 mm2로 시작하는 경우 3 용량의 E6 DNA의 클로스터로 처리하여 5마리의 마우스 중 5마리에서 퇴화를 이끌었으나, 35 mm2로 시작하는 경우 종양 성장이 단지 약간 지연되었으나 이후 빨리 진행되었다.
상기 제시된 데이터는 무독화된 E6 및 E7 DNA가 B6에 전달되는 경우 각각의 펩티드 에피토프에 대해 강한 T 세포 반응을 유도한다는 것을 나타내었다. 또한, 이러한 반응은 백신이 TC-1 종양 세포의 성장을 억제시키는 능력과 크게 관련되었다. 이러한 처리는 예방 또는 치료로서 효과적이었다.
실시예 9
마우스에 ICP27 단일 유전자 플라스미드를 사용하여 2일 간격으로 1 내지 8 쇼트 처리하고 각각의 군에 대한 최종 전달은 같은 날이 되도록 하였다. 최종 전달한지 2주 후, CDS ELISPOT를 측정하였다. 그 결과를 도 29에 나타내었으며, 거의 최대의 효과를 얻는 데는 적어도 3회의 전달이 필요하며 추가의 전달은 거의 또는 전혀 개선을 나타내지 않았다.
림프절에 대한 클러스터 투여의 축적 효과를 조사하기 위해, 마우스에 pPJV7630를 1, 2, 3 또는 4 쇼트로 처리한 후 (4일 간격으로 쇼트 처리), 8일 후 림프절로부터의 세포를 조사하였다. 그 결과가 도 30에 나타나 있다. 쇼트의 수를 증가시키면, 절의 크기의 증가가 뚜렷하였다. 백신 전달을 완결한 지 8일 후 측정된 림프절에서의 세포 수 및 중량은, 1 초과의 쇼트가 처리되는 경우 비투약 마우스에 비해 증가하였으며, 3 쇼트가 가장 높은 값을 나타내었다.
실시예 10
본 실험은 부스팅 백신 처리의 효과를 조사하기 위해 수행하였다. 프라이밍 투여를 받은 마우스를 프라이밍 및 부스팅 투여 모두를 받은 마우스와 비교하였다. 2개 군의 마우스를 동시에 프라이밍하고, 동일한 백신을 백신 처리에 사용하였다. 제 2 군은 프라이밍 처리한 지 28일 후에 부스팅하였다.
도 31은 단일 클러스터 (P) 또는 28일 간격의 2개의 클러스터 (P/B)로 pPJV7630를 투여한 동물에서 수행된 IFN-γ ELISPOT 검정의 결과를 나타낸다. pPJV7630 제작물로부터 발현되는 4개의 즉시형 초기 항원 각각에 대한 펩티드 라이브러리를 사용하여 비세포를 시험하였다. 백신의 최종 전달 2 주후 검정을 수행하였다. 부스터 투여는 자극되는 반응을 실질적으로 증가시켰다.
실시예 11
XR1 디바이스로 식용 돼지에게 PJV7630를 투여하였다. 각각의 면역화에 대해 2 용량을 투여하였으며, 1주일에 걸쳐 4회 면역화하는 클러스터 스케쥴로 처리하였다. 따라서, 각각의 돼지에는 총 8 용량의 백신이 하나의 클러스터로 처리되었다. 이전 클러스터가 끝난 지 21일 후 두 번째 클러스터 면역화 부스팅을 개시하였다. 투여를 개시하기 전 (PB) 및 각각의 부스팅 처리한 지 7 내지 10일 후 (B1 및 B2) 채혈하였다. IFN-γ ELISPOT 검정을 상술된 바와 같이 수행하였으며, 그 값은 10마리의 동물에 대한 평균 ± SEM이다. 도 32는 수득된 결과 및 부스팅 백신 처리의 효과를 나타낸다.
실시예 12
XR-1으로 단일 쇼트의 pPJV7630로 PMED 처리한 지 2, 3 및 4일 후 피부 샘플을 취하여 동결시키고, 분쇄한 후, 상청액 중의 사이토킨 수준을 시험하였다. CBA 키트로 염증 사이토킨을 평가한 결과, IL-6, TNF-α 및 MCP-1 (단핵구 주화성 단백질)의 강한 증가를 확인하였다. 이는 2일에 가장 높았으며, 시간이 흐름에 따라 감소하였다. IL-10, IL-12 또는 IFN-γ는 증가하지 않았다. 향상된 사이토킨은 상처 치유 시 일반적으로 발견된다.
피부 및 림프절에서 클러스터 투여의 축적 효과를 시험하기 위해서, 마우스에 pPJV7630을 1, 2, 3 또는 4 쇼트로 처리하고 (4일 간격으로 쇼트 처리), 4일 및 8일 후 림프절로부터의 세포를 조사하였다. 쇼트의 수를 증가시키면, 절의 크기의 증가가 뚜렷하였다. 백신 전달을 완결한 지 8일 후 측정된 림프절에서의 세포 수 및 중량은, 1 초과의 쇼트가 처리되는 경우 비투약 마우스에 비해 증가하였다 (도 30).
또한, 림프절 세포를 MHC-II 양성 (항원 제시 세포), CD80 양성 (활성화 마커) 및 이둘 모두의 양성 세포에 대해 염색하고, 유동 세포계산 (하기 표 참조)으로 분석하였다. 일반적으로, 단일 및 이중 양성 세포의 수가 쇼트 수와 같이 증가하였다.
4일 - 절 집단 (총 세포에 대한 비율 (％))
MHC-11 CD80 MHC-II/CD80
비투약 13 0.9 1.7
1 쇼트 13.1 0.9 1.5
2 쇼트 18.1 1.6 2.2
3 쇼트 17.8 2.2 3.1
4 쇼트 21.3 2.5 4.1
8일 - 절 집단 (총 세포에 대한 비율 (％))
MHC-11 CD80 MHC-II/CD80
비투약 17 0.3 1.4
1 쇼트 16.3 0.3 1
2 쇼트 23 0.4 1.5
3 쇼트 23 0.8 2.9
4 쇼트 18 0.8 1.2
림프절 집단의 분석 결과, 클러스터 면역화의 결과로서 림프절의 항원 제시 세포의 수가 약 5 내지 10배 증가하였다.
요약하면, 급진적인 신체적 변화가 PMED 처리 후 쇼트 부위의 상이한 영역에서 발견되었다. 본 발명자는 PMED 처리 2일 후 피부에서 염증성 사이토킨 피크를 발견하였다. 또한, 클러스터 투여 동안, 세포, 구체적으로 활성화된 항원 제시 세포의 축적이 림프절에서 발견되었으며, 피부의 고조된 반응성을 제시하였다.
실시예 13
Balb/c 마우스를 기술되는 실험에 사용하였다. 복부 부위를 면도질하고, 입자 매개된 면역치료적 전달 (particle mediated immunotherapeutic delivery: PMID)을 이용해 초기 면역화 DNA를 투여하였다. 각각의 동물에 3 μg DNA를 투여하였다. 이는 0일 또는 4일에 통상의 "펄스" 면역화 (3 X 1 μg DNA)에 의하거나 격일로 (1, 2 및 4일) 투여되는 1 μg DNA로 "클러스터" 면역화로 투여하였다. 제 1 DNA 투여 10일 후 마우스를 선별하여, 비장을 수집하였다. 비세포를 비장 세포를 찢어서 (teasing out) 수거하고, 적혈구를 용해시켰다. 비세포를 세척하고 계수하였다. (인터페론-감마 포획 항체로 코팅되고 차단된) 특화된 ELISPOT 평판을 사용하였다. 비세포를 이들 평판에 옮기고, 특정 펩티드의 존재 하에 37 ℃/5 ％ C02에서 밤새 인큐베이션하였다. 비세포를 용해시키고, 표준 절차를 이용해 평판을 전개시켜 인터페론-감마 분비 세포의 수를 측정하였다.
결과
그 결과 (도 33에 나타남), 통상의 "펄스" 방법을 이용해 동일량의 DNA로 면역화된 동물에 비해 "클러스터" 면역화 처리된 동물로부터 상당히 높은 수의 IFN-감마 스폿 형성 세포가 분리되었다 (*는 유의한 차이를 나타낸다).
HIV로부터의 Gag 및 RT 항원을 발현하는 제작물로 "클러스터" 방법을 이용해 면역화된 마우스의 세포성 면역 반응은 통상의 "펄스" 방법을 이용해 동일량의 DNA로 동물을 면역화시키는 것보다 상당히 높았다.
실시예 14
Balb/c 마우스를 기술되는 실험에 사용하였다. 복부 부위를 면도질하고, PMID을 이용해 초기 면역화 DNA를 투여하였다. 각각의 동물에 총 1 μg DNA를 투여하였다. 이는 0일에 통상의 "펄스" 면역화 (2 X 0.5 μg DNA)에 의하거나 각각 0일 및 7일에 투여되는 0.5 μg DNA로 "변형된 클러스터" 면역화로 투여하였다. 초기 면역화한 지 83일 후에 1회 "펄스"의 1.0 μg DNA를 사용해 부스팅하였다. 부스팅 면역화한 지 7일 후 (90일)에 마우스를 선별하여, 비장을 수집하였다. 비세포를 비장 세포를 찢어서 수거하고, 적혈구를 용해시켰다. 비세포를 세척하고 계수하였다. (인터페론-감마 포획 항체로 코팅되고 차단된) 특화된 ELISPOT 평판을 사용하였다. 비세포를 이들 평판에 옮기고, 특정 펩티드의 존재 하에 37 ℃/5 ％ C02에서 밤새 인큐베이션하였다. 비세포를 용해시키고, 표준 절차를 이용해 평판을 전개시켜 존재하는 인터페론-감마 분비 세포의 수를 측정하였다.
결과
그 결과 (도 34에 나타남), 통상의 "펄스" 방법을 이용해 동일량의 DNA로 면역화된 동물에 비해 "변형된 클러스터" 면역화 처리된 동물로부터 상당히 높은 수의 IFN-감마 스폿 형성 세포가 분리되었다. 따라서, HIV로부터의 Gag 및 RT 항원을 발현하는 제작물로 "변형된 클러스터" 방법을 이용해 면역화된 마우스의 세포성 면역 반응은 통상의 "펄스" 방법을 이용해 동일량의 DNA로 동물을 면역화시키는 것보다 높았다.
실시예 15
HIV 항원 RT, Nef 및 Gag을 발현하는 플라스미드를 사용하였다. PMID를 위한 카트리지의 제조는 이전에 기재된 바와 같다 (Eisenbraun et al., DNA and Cell Biology, 1993 Vol 12 No 9 pp 791-797; Pertner et al.). 간단히 설명하면, 플라스미드 DNA를 2 μm 금 입자 (DeGussa Corp., South Plainfield, N. J., USA)에 코팅하고, Tefzel 튜빙에 로딩한 후, 1.27 cm 길이로 잘라 카트리지로 사용하고, 사용할 때까지 4 ℃에서 건조하게 보관하였다. 통상의 백신 처리에서, 각각의 카트리지는 약 1 μg DNA로 코팅된 0.5 mg 금을 포함하였다.
4마리의 미니 돼지군을 PMID로 초기 면역화 (1일에 개시) 시킨 후 복부에 PMID로 부스팅 면역화시켰다 (57일에 개시). 대조 동물은 면역화시키지 않았다. 면역화는 펄스 투여 (즉, 한번에 4개의 카트리지 전달)하거나 클러스터 투여 (즉 48시간 간격의 3번의 기회 중 각각의 기회에 2개의 카트리지 전달)하였다. 초기 또는 부스팅 면역화를 개시한 지 14일 후, PBMC를 제조하기 위해 말초혈액 샘플을 수집하였다.
돼지 혈액을 PBS 중에 2:1로 희석된 헤파린에 수집하고, 50 ml Falcon 튜브의 Histopaque (Sigma)에 층을 이루게 하였다. 튜브를 30분 동안 1200 g에서 원심분리시키고, 돼지 림프구를 경계면으로부터 수거하였다. 잔류 적혈구를 염화암모늄 용해 완충액을 사용해 용해시키고, 완전한 RPMI 배지에 2 X 106/ml로 재현탁시켰다.
ELISPOT 검정을 수행하기 위해, 평판을 8 μg/ml (PBS 중) (정제된 마우스 항-돼지 IFN-γ, Biosource ASC4934)로 코팅하였다. 평판을 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 사용하기 전에 평판을 PBS로 3회 세척하고, 2시간 동안 완전 RPMI 배지로 차단하였다. PBMC를 2x105개 세포/웰로 평판에 가하였다. 각각의 웰 당 총 부피는 200 μl이었다. 재조합 Gag, Nef 또는 RT 단백질 (조직 내에서 제조됨)을 5 μg/ml의 최종 농도로 가하였다. 평판을 축축한 37 ℃ 인큐베이터에서 16시간 동안 인큐베이션하였다.
평판을 물로 1회 (세포 용해를 확실하게 하기 위해 1분 함침) 및 PBS로 3회 세척하여 이로부터 세포를 제거하였다. 바이오틴-결합된 항-돼지 IFN-γ를 PBS 중에 0.5 μg/ml로 가하였다. 평판을 실온에서 2시간 동안 진동시키면서 인큐베이션하였다. 이어서, 평판을 PBS로 3회 세척하고, 1/1000 희석된 스트렙트아비딘 알칼리 포스파타제 (Caltag)를 가하였다. PBS 중에 3회 세척한 후, 15 내지 45분 동안 BCICP 기질 (Biorad)와 함께 인큐베이션하여 스폿을 나타내었다. 기질을 물을 사용해 세척해 내고, 평판을 건조시켰다. AID ELISPOT 판독기 (Cadama Biomedical, UK)을 사용해 스폿을 계수하였다.
결과
그 결과가 도 35에 나타나 있다. 초기 면역화 후, 클러스터 면역화에 의해 프라이밍된 미니 돼지로부터의 PBMC 중의 IFN-γ 생성 스폿의 수는, 펄스 면역화 처리된 동물과 비교해 상당히 많았다 (각각 311 ± 96 및 45 ± 31 평균 ± SEM; p<0.05 스튜던츠 t 시험). 또한, 펄스 부스팅 후 IFN-γ 생성 스폿의 수도 펄스 프라이밍과 비교해 클러스터 프라이밍 처리된 동물에서 상당히 많았다 (각각 431 ± 60 및 186 ± 66 평균 ± SEM; p<0.05 스튜던츠 t 시험). 요약하면, 이러한 결과는 클러스터 프라이밍이 통상의 펄스 프라이밍에 비해 이점을 제공하며, 이러한 이점이 면역 반응의 후속적 부스팅 단계에서 유지된다는 것을 나타낸다.
도 35에서 그룹 1은 비-면역화된 대조구이고, 그룹 2는 펄스 프라이밍, 펄스 부스팅 군이고, 그룹 3은 펄스 프라이밍, 클러스터 부스팅 군이다.
실시예 16
C57BL/6 마우스를 기술되는 실험에 사용하였다. 복부 부위를 면도질하고, PMID을 이용해 초기 면역화 DNA를 투여하였다. 각각의 동물은 0일에 통상의 "펄스" 면역화 (1 μg DNA 오브알부민)에 의하거나 격일 (0, 2) (클러스터 2X) 또는 0, 2 및 4일 (클러스터 3X)에 1 μg DNA로 "클러스터" 면역화로 처리되었다. 제 1 DNA 투여한 지 10일 후에 마우스를 선별하여, 비장을 수집하였다. 비세포를 비장 세포를 찢어서 수거하고, 적혈구를 용해시켰다. 비세포를 세척하고 계수하였다. (인터페론-감마 또는 IL2 포획 항체로 코팅되고 차단된) 특화된 ELISPOT 평판을 사용하였다. 비세포를 이들 평판에 옮기고, 특정 펩티드의 존재 하에 37 ℃/5 ％ C02에서 밤새 인큐베이션하였다. 앞서 정의된 오브알부민 특이적 CD4 및 CD8 펩티드를 사용하였다. 비세포를 용해시키고, 표준 절차를 이용해 평판을 전개시켜 존재하는 인터페론-감마 또는 IL2 분비 세포의 수를 측정하였다.
결과
그 결과 (도 36 및 도 37에 나타남), 통상의 "펄스" 방법을 이용해 동일량의 DNA로 면역화된 동물에 비해 "클러스터" 면역화 처리된 동물로부터 상당히 높은 수의 IFN-감마 및 IL2 스폿 형성 세포가 분리되었다. 도 36에서, 각각의 막대는 개개의 마우스로부터의 반응을 나타낸다.
오브알부민을 발현하는 제작물로 "클러스터" 방법을 이용해 면역화된 마우스의 세포성 면역 반응은 통상의 "펄스" 방법을 이용해 동일량의 DNA로 동물을 면역화시키는 것보다 높았다.
실시예 17
Balb/c 마우스를 기술되는 실험에 사용하였다. 복부 부위를 면도질하고, PMID을 이용해 초기 면역화 DNA를 투여하였다. 각각의 동물에 총 3 μg DNA를 투여하였다. 이는 0일에 통상의 "펄스" 면역화 (3 X 1 μg DNA)에 의하거나 각각 격일 (0, 2 및 4)로 투여되는 1 μg DNA로 "클러스터" 면역화로 투여하였다.
펄스 또는 클러스터 면역화 처리된 동물을 29일 후에 1 μg DNA의 단일 펄스 면역화로 부스팅하였다. 상술된 바와 같이 부스팅 처리한 지 9일 후 (38일)에 비장을 적출하고, ELISPOT으로 항원 특이적 세포의 FR (frequency)을 측정하였다. CD8 T 세포가 항원 특이적 세포를 죽이는 능력을, 펩티드 또는 IL2를 사용해 시험관 내 증대시킨 지 5일 후에 유로퓸-기초된 CTL 검정으로 측정하였다.
결과
그 결과 (도 38에 나타남), 펄스 면역화로 동일량의 DNA로 면역화된 동물에 비해 클러스터 면역화로 프라이밍된 동물이 보다 강한 리콜 반응을 나타내었다. 이는 ELISPOT 검정 시 IFNg 및 IL2 생성 세포의 FR 증가로 나타났다. 또한, 클러스터 면역화로 프라이밍된 동물은 펄스 DNA 부스팅 후 펄스 면역화로 면역화된 동물에 비해 보다 강한 CTL 반응을 나타내었다.
오브알부민을 발현하는 제작물로 "클러스터" 방법을 이용해 면역화된 마우스의 기억 면역 반응은 통상의 "펄스" 방법을 이용해 동일량의 DNA로 동물을 면역화시키는 것보다 상당히 높았다.
본원에 언급된 모든 공개문이 본원에 참조로 삽입된다. 본 발명에 대해 기재된 방법 및 시스템을 본 발명의 범위 및 요지를 벗어나지 않으면서 다양한 변형 및 변화를 줄 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다. 본 발명을 특정한 바람직한 실시양태와 연관지어 기술하였지만, 청구되는 발명이 이러한 특정 실시양태에 부당하게 제한되어서는 안된다는 것을 알아야 한다. 실제로, 분자 생물학 또는 관련 분야의 전문가에게 있어 명백한, 본 발명을 수행하기 위해 기재된 형태에 대한 다양한 변형을 본 발명에 포함시키고자 한다.
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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <400> 3 Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala Gln 1 5 10 15 Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His 20 25 30 His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Gln 35 40 45 Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser 50 55 60 <210> 4 <211> 3759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide vector sequence <400> 4 ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60 agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120 agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180 tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240 tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300 ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360 tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg 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Synthetic nucleotide construct <400> 9 atgggtgccc gagcttcggt actgtctggt ggagagctgg acagatggga gaaaattagg 60 ctgcgcccgg gaggcaaaaa gaaatacaag ctcaagcata tcgtgtgggc ctcgagggag 120 cttgaacggt ttgccgtgaa cccaggcctg ctggaaacat ctgagggatg tcgccagatc 180 ctggggcaat tgcagccatc cctccagacc gggagtgaag agctgaggtc cttgtataac 240 acagtggcta ccctctactg cgtacaccag aggatcgaga ttaaggatac caaggaggcc 300 ttggacaaaa ttgaggagga gcaaaacaag agcaagaaga aggcccagca ggcagctgct 360 gacactgggc atagcaacca ggtatcacag aactatccta ttgtccaaaa cattcagggc 420 cagatggttc atcaggccat cagcccccgg acgctcaatg cctgggtgaa ggttgtcgaa 480 gagaaggcct tttctcctga ggttatcccc atgttctccg ctttgagtga gggggccact 540 cctcaggacc tcaatacaat gcttaatacc gtgggcggcc atcaggccgc catgcaaatg 600 ttgaaggaga ctatcaacga ggaggcagcc gagtgggaca gagtgcatcc cgtccacgct 660 ggcccaatcg cgcccggaca gatgcgggag cctcgcggct ctgacattgc cggcaccacc 720 tctacactgc aagagcaaat cggatggatg accaacaatc ctcccatccc agttggagaa 780 atctataaac ggtggatcat tctcggtctc aataaaattg ttagaatgta ctctccgaca 840 tccatccttg acattagaca gggacccaaa gagcctttta gggattacgt cgaccggttt 900 tataagaccc tgcgagcaga gcaggcctct caggaggtca aaaactggat gacggagaca 960 ctcctggtac agaacgctaa ccccgactgc aaaacaatct tgaaggcact aggcccggct 1020 gccaccctgg aagagatgat gaccgcctgt cagggagtag gcggacccgg acacaaagcc 1080 agagtgttga tggtgggttt tccagtcaca cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac 1140 aaggcagctg tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt 1200 cactcccaaa gaagacaaga tatccttgat ctgtggatct accacacaca aggctacttc 1260 cctgattggc agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg 1320 tgctacaagc tagtaccagt tgagccagat aaggtagaag aggccaataa aggagagaac 1380 accagcttgt tacaccctgt gagcctgcat gggatggatg acccggagag agaagtgtta 1440 gagtggaggt ttgacagcca cctagcattt catcacgtgg cccgagagct gcatccggag 1500 tacttcaaga actgctga 1518 <210> 10 <211> 505 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic protein construct <400> 10 Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 20 25 30 His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45 Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu 50 55 60 Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn 65 70 75 80 Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp 85 90 95 Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys 100 105 110 Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val 115 120 125 Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His 130 135 140 Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu 145 150 155 160 Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser 165 170 175 Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly 180 185 190 Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu 195 200 205 Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala 210 215 220 Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr 225 230 235 240 Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile 245 250 255 Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys 260 265 270 Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly 275 280 285 Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu 290 295 300 Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr 305 310 315 320 Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala 325 330 335 Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly 340 345 350 Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Met Val Gly Phe Pro 355 360 365 Val Thr Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Ala Ala Val 370 375 380 Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile 385 390 395 400 His Ser Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu Trp Ile Tyr His Thr 405 410 415 Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val 420 425 430 Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu Val Pro Val Glu 435 440 445 Pro Asp Lys Val Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu Asn Thr Ser Leu Leu 450 455 460 His Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro Glu Arg Glu Val Leu 465 470 475 480 Glu Trp Arg Phe Asp Ser His Leu Ala Phe His His Val Ala Arg Glu 485 490 495 Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys 500 505 <210> 11 <211> 1689 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide construct <400> 11 atgggcccca tcagtcccat cgagaccgtg ccggtgaagc tgaaacccgg gatggacggc 60 cccaaggtca agcagtggcc actcaccgag gagaagatca aggccctggt ggagatctgc 120 accgagatgg agaaagaggg caagatcagc aagatcgggc ctgagaaccc atacaacacc 180 cccgtgtttg ccatcaagaa gaaggacagc accaagtggc gcaagctggt ggatttccgg 240 gagctgaata agcggaccca ggatttctgg gaggtccagc tgggcatccc ccatccggcc 300 ggcctgaaga agaagaagag cgtgaccgtg ctggacgtgg gcgacgctta cttcagcgtc 360 cctctggacg aggactttag aaagtacacc gcctttacca tcccatctat caacaacgag 420 acccctggca tcagatatca gtacaacgtc ctcccccagg gctggaaggg ctctcccgcc 480 attttccaga gctccatgac caagatcctg gagccgtttc ggaagcagaa ccccgatatc 540 gtcatctacc agtacatgga cgacctgtac gtgggctctg acctggaaat cgggcagcat 600 cgcacgaaga ttgaggagct gaggcagcat ctgctgagat ggggcctgac cactccggac 660 aagaagcatc agaaggagcc gccattcctg tggatgggct acgagctcca tcccgacaag 720 tggaccgtgc agcctatcgt cctccccgag aaggacagct ggaccgtgaa cgacatccag 780 aagctggtgg gcaagctcaa ctgggctagc cagatctatc ccgggatcaa ggtgcgccag 840 ctctgcaagc tgctgcgcgg caccaaggcc ctgaccgagg tgattcccct cacggaggaa 900 gccgagctcg agctggctga gaaccgggag atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 960 tatgacccct ccaaggacct gatcgccgaa atccagaagc agggccaggg gcagtggaca 1020 taccagattt accaggagcc tttcaagaac ctcaagaccg gcaagtacgc ccgcatgagg 1080 ggcgcccaca ccaacgatgt caagcagctg accgaggccg tccagaagat cacgaccgag 1140 tccatcgtga tctgggggaa gacacccaag ttcaagctgc ctatccagaa ggagacctgg 1200 gagacgtggt ggaccgaata ttggcaggcc acctggattc ccgagtggga gttcgtgaat 1260 acacctcctc tggtgaagct gtggtaccag ctcgagaagg agcccatcgt gggcgcggag 1320 acattctacg tggacggcgc ggccaaccgc gaaacaaagc tcgggaaggc cgggtacgtc 1380 accaaccggg gccgccagaa ggtcgtcacc ctgaccgaca ccaccaacca gaagacggag 1440 ctgcaggcca tctatctcgc tctccaggac tccggcctgg aggtgaacat cgtgacggac 1500 agccagtacg cgctgggcat tattcaggcc cagccggacc agtccgagag cgaactggtg 1560 aaccagatta tcgagcagct gatcaagaaa gagaaggtct acctcgcctg ggtcccggcc 1620 cataagggca ttggcggcaa cgagcaggtc gacaagctgg tgagtgcggg gattagaaag 1680 gtgctgtaa 1689 <210> 12 <211> 562 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic protein construct <400> 12 Met Gly Pro Ile Ser Pro Ile Glu Thr Val Ser Val Lys Leu Lys Pro 1 5 10 15 Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Thr Glu Glu Lys 20 25 30 Ile Lys Ala Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys 35 40 45 Ile Ser Lys Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Val Phe Ala 50 55 60 Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg 65 70 75 80 Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile 85 90 95 Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp 100 105 110 Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu Asp Glu Asp Phe Arg Lys 115 120 125 Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Ile Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile 130 135 140 Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala 145 150 155 160 Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Glu Pro Phe Arg Lys Gln 165 170 175 Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly 180 185 190 Ser Asp Leu Glu Ile Gly Gln His Arg Thr Lys Ile Glu Glu Leu Arg 195 200 205 Gln His Leu Leu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln 210 215 220 Lys Glu Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys 225 230 235 240 Trp Thr Val Gln Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val 245 250 255 Asn Asp Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile 260 265 270 Tyr Pro Gly Ile Lys Val Arg Gln Leu Cys Lys Leu Leu Arg Gly Thr 275 280 285 Lys Ala Leu Thr Glu Val Ile Pro Leu Thr Glu Glu Ala Glu Leu Glu 290 295 300 Leu Ala Glu Asn Arg Glu Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr 305 310 315 320 Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile Ala Glu Ile Gln Lys Gln Gly Gln 325 330 335 Gly Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln Glu Pro Phe Lys Asn Leu Lys 340 345 350 Thr Gly Lys Tyr Ala Arg Met Arg Gly Ala His Thr Asn Asp Val Lys 355 360 365 Gln Leu Thr Glu Ala Val Gln Lys Ile Thr Thr Glu Ser Ile Val Ile 370 375 380 Trp Gly Lys Thr Pro Lys Phe Lys Leu Pro Ile Gln Lys Glu Thr Trp 385 390 395 400 Glu Thr Trp Trp Thr Glu Tyr Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp 405 410 415 Glu Phe Val Asn Thr Pro Pro Leu Val Lys Leu Trp Tyr Gln Leu Glu 420 425 430 Lys Glu Pro Ile Val Gly Ala Glu Thr Phe Tyr Val Asp Gly Ala Ala 435 440 445 Asn Arg Glu Thr Lys Leu Gly Lys Ala Gly Tyr Val Thr Asn Arg Gly 450 455 460 Arg Gln Lys Val Val Thr Leu Thr Asp Thr Thr Asn Gln Lys Thr Glu 465 470 475 480 Leu Gln Ala Ile Tyr Leu Ala Leu Gln Asp Ser Gly Leu Glu Val Asn 485 490 495 Ile Val Thr Asp Ser Gln Tyr Ala Leu Gly Ile Ile Gln Ala Gln Pro 500 505 510 Asp Gln Ser Glu Ser Glu Leu Val Asn Gln Ile Ile Glu Gln Leu Ile 515 520 525 Lys Lys Glu Lys Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala His Lys Gly Ile 530 535 540 Gly Gly Asn Glu Gln Val Asp Lys Leu Val Ser Ala Gly Ile Arg Lys 545 550 555 560 Val Leu <210> 13 <211> 1689 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide construct <400> 13 atgggcccca tcagtcccat cgagaccgtg ccggtgaagc tgaaacccgg gatggacggc 60 cccaaggtca agcagtggcc actcaccgag gagaagatca aggccctggt ggagatctgc 120 accgagatgg agaaagaggg caagatcagc aagatcgggc ctgagaaccc atacaacacc 180 cccgtgtttg ccatcaagaa gaaggacagc accaagtggc gcaagctggt ggatttccgg 240 gagctgaata agcggaccca ggatttctgg gaggtccagc tgggcatccc ccatccggcc 300 ggcctgaaga agaagaagag cgtgaccgtg ctggacgtgg gcgacgctta cttcagcgtc 360 cctctggacg aggactttag aaagtacacc gcctttacca tcccatctat caacaacgag 420 acccctggca tcagatatca gtacaacgtc ctcccccagg gctggaaggg ctctcccgcc 480 attttccaga gctccatgac caagatcctg gagccgtttc ggaagcagaa ccccgatatc 540 gtcatctacc agtacatgga cgacctgtac gtgggctctg acctggaaat cgggcagcat 600 cgcacgaaga ttgaggagct gaggcagcat ctgctgagat ggggcctgac cactccggac 660 aagaagcatc agaaggagcc gccattcctg tggatgggct acgagctcca tcccgacaag 720 tggaccgtgc agcctatcgt cctccccgag aaggacagct ggaccgtgaa cgacatccag 780 aagctggtgg gcaagctcaa ctgggctagc cagatctatc ccgggatcaa ggtgcgccag 840 ctctgcaagc tgctgcgcgg caccaaggcc ctgaccgagg tgattcccct cacggaggaa 900 gccgagctcg agctggctga gaaccgggag atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 960 tatgacccct ccaaggacct gatcgccgaa atccagaagc agggccaggg gcagtggaca 1020 taccagattt accaggagcc tttcaagaac ctcaagaccg gcaagtacgc ccgcatgagg 1080 ggcgcccaca ccaacgatgt caagcagctg accgaggccg tccagaagat cacgaccgag 1140 tccatcgtga tctgggggaa gacacccaag ttcaagctgc ctatccagaa ggagacctgg 1200 gagacgtggt ggaccgaata ttggcaggcc acctggattc ccgagtggga gttcgtgaat 1260 acacctcctc tggtgaagct gtggtaccag ctcgagaagg agcccatcgt gggcgcggag 1320 acattctacg tggacggcgc ggccaaccgc gaaacaaagc tcgggaaggc cgggtacgtc 1380 accaaccggg gccgccagaa ggtcgtcacc ctgaccgaca ccaccaacca gaagacggag 1440 ctgcaggcca tctatctcgc tctccaggac tccggcctgg aggtgaacat cgtgacggac 1500 agccagtacg cgctgggcat tattcaggcc cagccggacc agtccgagag cgaactggtg 1560 aaccagatta tcgagcagct gatcaagaaa gagaaggtct acctcgcctg ggtcccggcc 1620 cataagggca ttggcggcaa cgagcaggtc gacaagctgg tgagtgcggg gattagaaag 1680 gtgctgtaa 1689 <210> 14 <211> 562 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic protein construct <400> 14 Met Gly Pro Ile Ser Pro Ile Glu Thr Val Ser Val Lys Leu Lys Pro 1 5 10 15 Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Thr Glu Glu Lys 20 25 30 Ile Lys Ala Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys 35 40 45 Ile Ser Lys Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Val Phe Ala 50 55 60 Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg 65 70 75 80 Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile 85 90 95 Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp 100 105 110 Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu Asp Glu Asp Phe Arg Lys 115 120 125 Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Ile Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile 130 135 140 Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala 145 150 155 160 Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Glu Pro Phe Arg Lys Gln 165 170 175 Asn Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly 180 185 190 Ser Asp Leu Glu Ile Gly Gln His Arg Thr Lys Ile Glu Glu Leu Arg 195 200 205 Gln His Leu Leu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln 210 215 220 Lys Glu Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys 225 230 235 240 Trp Thr Val Gln Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val 245 250 255 Asn Asp Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile 260 265 270 Tyr Pro Gly Ile Lys Val Arg Gln Leu Cys Lys Leu Leu Arg Gly Thr 275 280 285 Lys Ala Leu Thr Glu Val Ile Pro Leu Thr Glu Glu Ala Glu Leu Glu 290 295 300 Leu Ala Glu Asn Arg Glu Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr 305 310 315 320 Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile Ala Glu Ile Gln Lys Gln Gly Gln 325 330 335 Gly Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln Glu Pro Phe Lys Asn Leu Lys 340 345 350 Thr Gly Lys Tyr Ala Arg Met Arg Gly Ala His Thr Asn Asp Val Lys 355 360 365 Gln Leu Thr Glu Ala Val Gln Lys Ile Thr Thr Glu Ser Ile Val Ile 370 375 380 Trp Gly Lys Thr Pro Lys Phe Lys Leu Pro Ile Gln Lys Glu Thr Trp 385 390 395 400 Glu Thr Trp Trp Thr Glu Tyr Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp 405 410 415 Glu Phe Val Asn Thr Pro Pro Leu Val Lys Leu Trp Tyr Gln Leu Glu 420 425 430 Lys Glu Pro Ile Val Gly Ala Glu Thr Phe Tyr Val Asp Gly Ala Ala 435 440 445 Asn Arg Glu Thr Lys Leu Gly Lys Ala Gly Tyr Val Thr Asn Arg Gly 450 455 460 Arg Gln Lys Val Val Thr Leu Thr Asp Thr Thr Asn Gln Lys Thr Glu 465 470 475 480 Leu Gln Ala Ile Tyr Leu Ala Leu Gln Asp Ser Gly Leu Glu Val Asn 485 490 495 Ile Val Thr Asp Ser Gln Tyr Ala Leu Gly Ile Ile Gln Ala Gln Pro 500 505 510 Asp Gln Ser Glu Ser Glu Leu Val Asn Gln Ile Ile Glu Gln Leu Ile 515 520 525 Lys Lys Glu Lys Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala His Lys Gly Ile 530 535 540 Gly Gly Asn Glu Gln Val Asp Lys Leu Val Ser Ala Gly Ile Arg Lys 545 550 555 560 Val Leu <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu 1 5 10 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Ile Thr Gly Lys 1 5 10 15 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 17 cgccactctc ttccgacacc 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 ccaagaacat cacacggaac c 21 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 His Gly Pro Ser Leu Tyr Arg Thr Phe 1 5

Claims (28)

  1. (i) 숙주 포유동물 피검체에 1 내지 14일의 간격으로 투여되는 2회 이상의 투여를 포함하며, 각각의 투여는 T 세포 에피토프를 코딩하는 목적 뉴클레오티드 (nucleotide of interest: NOI)를 투여하는 것을 포함하는 제 1 면역화, 및 임의로
    (ii) (a) T 세포 에피토프를 코딩하는 NOI 또는 (b) T 세포 에피토프를 포함하는 단백질을 상기 피검체에 1회 이상 투여하는 것을 포함하는 제 2 면역화를 포함하며,
    제 1 면역화의 제 1 투여와 제 2 면역화의 제 1 투여 사이의 기간이 21 내지 365일인, 숙주 포유동물 피검체에서 T 세포 에피토프에 대한 T 세포 반응의 유도 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 제 1 및(또는) 제 2 면역화의 투여가 2 내지 12일에 걸쳐 일어나는 유도 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 제 1 및(또는) 제 2 면역화에서 NOI 또는 단백질을 2 내지 10회 투여하는 유도 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 및(또는) 제 2 면역화의 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 투여가 2 내지 6일 간격인 유도 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 면역화의 제 1 투여와 제 2 면역화의 제 1 투여 사이의 기간이 50 내지 250일인 유도 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, (a) T 세포 에피토프를 코딩하는 NOI 또는 (b) T 세포 에피토프를 포함하는 단백질을 피검체에 1회 이상 투여하는 것을 포함하는 제 3 면역화를 추가로 포함하고, 제 2 면역화의 제 1 투여와 제 3 면역화의 제 1 투여 사이의 기간이 10 내지 365일인 유도 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 제 3 면역화에서,
    - NOI 또는 단백질을 2 내지 5회 투여하고(하거나),
    - 2 내지 6일의 간격으로 투여하고(하거나),
    - 제 2 면역화의 제 1 투여와 제 3 면역화의 제 1 투여 사이의 기간이 50 내지 250일인 유도 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, NOI가 피검체의 세포에서 DNA 서열의 발현을 지시할 수 있는 조절 서열의 제어 하에 있는 DNA 서열을 포함하는 유도 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 에피토프가 CD4+ 헬퍼 T 림프구 세포 에피토프 및(또는) CD8+ T 림프구 (CTL) 에피토프인 유도 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, NOI의 1회 이상의 투여가 0.1 내지 2 μg의 NOI 투여를 포함하는 유도 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 1회 이상의 투여가 피부로의 투여를 포함하는 유도 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, NOI 또는 단백질의 1회 이상의 투여용으로, NOI 또는 단백질을 입자에 코팅하거나 입자에 삽입시키는 유도 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 입자를 입자 가속 디바이스에 의해 피검체에 투여하는 유도 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, NOI 또는 단백질의 1회 이상의 투여용으로, NOI 또는 단백질을
    (i) 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물; 또는
    (ii) 면역학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 백신 조 성물; 또는
    (iii) 면역학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 면역치료 조성물로 투여하는 유도 방법.
  15. 제 1항 내지 제 13 중 어느 한 항 또는 제 14항에 있어서, NOI 또는 단백질을 아주반트 (adjuvant) 또는 피검체의 세포에서 아주반트를 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드와 공동-투여하거나; 조성물이 아주반트 또는 피검체의 세포에서 아주반트를 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 유도 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 아주반트가 이. 콜라이 (E. coli) 열-불안정 엔테로톡신 (LT) 또는 비브리오 콜레라 (Vibrio Cholerae ) 콜레라 독소 (CT)의 무독성 형태인 유도 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 아주반트가 LT 엔테로톡신의 B 서브유니트 (LTB) 또는 CT 콜레라 독소의 B 서브유니트 (CTB)인 유도 방법.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 에피토프가 병원체 또는 암세포로부터의 것인 유도 방법.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 에피토프가 HSV, HIV 또는 HPV로부터의 것인 유도 방법.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 피검체에서 질환을 예방 또는 치료하기 위해 수행되는 유도 방법.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, NOI가 2개 이상의 HSV, HIV 또는 HPV 항원을 코딩하는 유도 방법.
  22. 제 21항에 있어서, NOI가 HIV-1 gag 단백질 또는 그의 gag 에피토프를 함유하는 단편, 및 제 2의 HIV 항원 또는 상기 제 2 HIV 항원 에피토프를 코딩하는 단편을 코딩하는 유도 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 제 2 항원이 Nef, RT, 또는 Nef 또는 RT의 에피토프를 함유하는 단편으로 이루어진 군 중에서 선택되는 유도 방법.
  24. 제 22항에 있어서, NOI가
    -Gag (pl7, p24), Nef 절단물
    -Gag (p17, p24) (코돈 최적화됨), Nef (절단물)
    -Gag (pl7, p24), RT, Nef (절단물)
    -Gag (p17, p24), 코돈 최적화된 RT, Nef (절단물)
    -Gag (p17, p24), 코돈 최적화된 RT, 코돈 최적화된 Nef 절단물; 및(또는)
    아이오와 길이 (Iowa length) HCMV 프로모터 + 엑손 1의 하부 및 토끼 글로빈 폴리-아데닐화 시그널의 상부에 임의로 작동적으로 연결된, 불활성화되고 코돈 최적화된 RT, 절단된 Nef 및 코돈 최적화된 gag 유전자의 p17/p24 부분으로 이루어진 군 중에서 선택되는 항원의 조합물을 코딩하는 유도 방법.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 동일한 에피토프를 코딩하는 2개 이상의 상이한 NOI를 투여하고(하거나) 동일한 에피토프를 포함하는 2개 이상의 상이한 단백질을 투여하는 유도 방법.
  26. (i) 숙주 포유동물 피검체에 1 내지 14일의 간격으로 투여되는 2회 이상의 투여를 포함하며, 각각의 투여는 T 세포 에피토프를 코딩하는 목적 뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 제 1 면역화, 및 임의로 (ii) (a) T 세포 에피토프를 코딩하는 NOI 또는 (b) T 세포 에피토프를 포함하는 단백질을 상기 피검체에 1회 이상 투여하는 것을 포함하는 제 2 면역화를 포함하며, 제 1 면역화의 제 1 투여와 제 2 면역화의 제 1 투여 사이의 기간이 21 내지 365일인 T 세포 반응을 유도하는 방법을 포유동물 피검체에서 수행하고,
    상기 피검체에서 에피토프에 특이적인 활성화된 또는 기억 T 세포의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 상기 T 세포 반응을 유도하는 방법의 유효성을 시험하기 위한 검정 방법.
  27. 제 26항에 있어서,
    (i) 제 1 면역화의 투여가 모두 제 1 면역화의 제 1 투여와, 활성화된 T 세포 수준의 기본 수준으로의 감소 사이의 기간에 일어나고(나거나)
    (ii) 제 2 면역화의 제 1 투여가 활성화된 T 세포 수준의 기본 수준으로의 감소 후에 일어나는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는 검정 방법.
  28. (i) 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에서 정의된 NOI 또는 제 14항에 따른 조성물; 및
    (ii) 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에서 정의된 유도 방법 또는 검정 방법에 따라 NOI 또는 조성물의 투여를 위한 설명서를 포함하는, 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항의 유도 방법 또는 검정 방법을 수행하기 위한 키트.
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