JP2007508319A - 方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、宿主哺乳類被験体におけるT細胞エピトープに対する免疫応答を惹起するための方法であって、（i）該T細胞エピトープをコードする目的とするヌクレオチド（NOI）の投与を各投与が含む、該被験体への1〜14日間隔の少なくとも2回の投与を含む第1の免疫化、および所望により、（ii）該被験体への（a）該T細胞エピトープをコードするNOIまたは（b）該T細胞エピトープを含むタンパク質の少なくとも1回の投与を含む第2の免疫化を含んでなり、第1の免疫化の第1の投与と第2の免疫化の第1の投与との間の時間が21〜365日である方法に関する。

Description

関連特許出願の相互参照
本出願は、米国出願番号第60/510,086号（2003年10月10日出願）、同第60/526,571号（2003年4月12日出願）および同第60/567,771号（2004年5月5日出願）［これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる］に対して35 USC 119(e)に基づく利益を主張するものである。
発明の分野
本発明は免疫応答の惹起方法に関する。
発明の背景
ワクチン接種方法は当技術分野において記載されている。例えば、Prayagaら (1997) Vaccine 15(12-13): 1349-1352、Kilpatrickら (1997) Hybridoma 16: 381-389、Kilpatrickら (1998) Hybridoma 17: 569-576、Pertmerら (1995) Vaccine 13; 1427-1430およびOlsenら (1997) Vaccine 15; 1149-1156を参照されたい。しかし、核酸投与スケジュール（例えば、増強された細胞性免疫（CMI）応答を特異的に誘導するもの）の最適化が依然として必要とされている。これは、多種多様な免疫、炎症ならびに感染性の疾患および障害の予防および治療に非常に有益であろう。
発明の概要
本発明は、in vivoでCMI応答を惹起（または増強）するための方法を提供する。特に、該方法はin vivoでT細胞応答を惹起（または増強）する。
したがって、本発明は、宿主哺乳類被験体におけるT細胞エピトープに対する免疫応答を惹起する方法を提供し、この方法は、
（i）該T細胞エピトープをコードする目的とするヌクレオチド（NOI）を投与することを各投与が含む、該被験体への1〜14日間隔の少なくとも2回の投与を含む第1の免疫化、および所望により、
（ii）該被験体への（a）該T細胞エピトープをコードするNOIまたは（b）該T細胞エピトープを含むタンパク質の少なくとも1回の投与を含む第2の免疫化を含んでなり、ここで、第1の免疫化の第1の投与と第2の免疫化の第1の投与との間の時間は21〜365日間である。
発明の態様
以下の開示は、投与するNOIによりコードされる配列（例えば、エピトープまたは抗原）について記載する。第2の免疫化およびその後の免疫化の場合には、そのようなNOIの代わりに、同じエピトープまたは抗原を含むタンパク質を投与することが可能であると理解される。
本発明は、目的とするT細胞エピトープ（EOI）に対するT細胞応答を惹起する方法に関する。前記のとおり、該方法は、EOIをコードするNOIの投与を含む。該方法においては、少なくとも2、4、6、10または20個またはそれ以上（例えば、40個まで（40個を含む））の異なるNOIを投与することが可能であり、その場合、NOIのそれぞれは同じエピトープをコードしている。あるいは、NOIの各投与時に、同じNOIを投与することが可能である。同様に、EOIを含むタンパク質を投与する実施形態においては、該エピトープを含む少なくとも2、4、10個またはそれ以上（例えば、20個まで（20個を含む））の異なるタンパク質を投与することが可能であると理解される。あるいは、該タンパク質の各投与時には、同じタンパク質（該エピトープを含む）を投与することが可能である。
1つの態様においては、本発明は、宿主哺乳類被験体における少なくとも1つの標的抗原（TA）に対する増強された細胞性免疫（CMI）応答を惹起するための方法を提供し、該方法は、該TAの目的とする1以上のエピトープ（EOI）をコードする目的とするヌクレオチド配列（NOI）を該宿主哺乳類被験体に少なくとも2回投与することを含み、各NOI投与間の間隔は約48時間〜約144時間の範囲であり、該方法は、該宿主哺乳類被験体における該または各発現されたEOIに対する増強されたCMI応答を得るのに有効である。
本発明は、標的抗原（TA）の目的とする1以上のエピトープ（EOI）に対するCMI応答を免疫調節するために予防用および／または治療用に使用することが可能である。誘導される応答の時間経過は、既存のT細胞媒介性障害の免疫療法のため、そして後に遭遇する抗原に対する広範な防御を促進するための有効な方法の開発を可能にする。
本発明のこの態様のもう1つの利点は、関連する生物応答修飾物質および／またはアジュバントを使用することなくCMI応答が増強されうることである。
本発明の方法は活性化T細胞の産生をもたらしうる。活性化T細胞の多数の潜在的用途が予想される。例えば、ヒトに対する療法の場合には、活性化T細胞を単離し、ex vivoで培養し、T細胞媒介性免疫障害および／またはウイルス感染あるいは癌患者の治療のために宿主被験体に投与することが可能であると予想される。NOIをin vivoで投与し、ついで該T細胞を単離して適当な生物応答修飾物質および／または免疫調節物質および／またはアジュバント（例えば、ペプチド、サイトカインおよび抗原提示細胞などであるがこれらに限定されるものではない）の存在下でin vitroで増殖させることにより、T細胞を製造することが可能である。
本発明の方法において使用するNOIは、DNA配列を哺乳類宿主細胞内で該DNA配列の発現を誘導する調節配列の制御下に含むが、これらに限定されるものではない。NOIはT細胞エピトープをコードしており、したがって、典型的には、該エピトープを含むタンパク質をコードしている。したがって、好ましくは、NOIは被験体の細胞内で該エピトープ（該エピトープを含むタンパク質を含む）を発現しうる。
好ましい実施形態においては、T細胞エピトープはヘルパーT細胞および／またはCD8+ Tリンパ球（CD8+T細胞）エピトープでありうる。したがって、本発明の方法により惹起されるT細胞応答はヘルパーおよび／またはCD8+T細胞応答でありうる。より一層好ましくは、該応答はCD8+Tリンパ球応答、例えば細胞傷害性応答でありうる。
投与スケジュール
本発明の方法は、本明細書中では「免疫化」と称される一連の投与を含む。したがって、該方法は、本明細書中では「第1の免疫化」、「第2の免疫化」などと称される1、2、3、4、5またはそれ以上（例えば、10（10を含む）まで）のそのような一連の免疫化を含みうる。
いずれかの免疫化（例えば、第1の免疫化および／または第2の免疫化または全ての免疫化）の1またはそれ以上またはすべての投与は、2〜14日間にわたって（すなわち、免疫化の最初の投与および最終投与は互いに2〜14日以内である）、例えば3〜12日間または4〜8日間にわたって行えばよい。好ましくは、第1の免疫化は2〜14日間、例えば3〜12日間または4〜8日間にわたって行う。
1またはそれ以上またはすべての免疫化は、2〜50回、例えば5〜40回または10〜30回の投与を含みうる。したがって、典型的には、1またはそれ以上またはすべての免疫化において、少なくとも2回、例えば少なくとも3、5、10、30、50回またはそれ以上の投与（例えば、100回まで（100回を含む）の投与）を行うことが可能である。好ましくは、第1の免疫化（および場合によっては1またはそれ以上の後続の免疫化）は3〜20回の投与を含みうる。1つの実施形態においては、該方法（すなわち、合わせた免疫化のすべて）は3〜50回、例えば5〜40回または10〜30回の投与を含む。
1つの実施形態においては、2回以上の投与（典型的には2〜5回の投与）を同じ時点（例えば、同じ日、またはお互いに1日以内、お互いに12時間以内、お互いに2時間以内またはお互いに1時間以内）に行うことが可能である。後記のとおり、同じ時点に行うそのような投与は、同じまたは異なる部位に行うことが可能である。
1またはそれ以上またはすべての免疫化は2〜10、例えば3〜5の異なる時点での投与を含みうる。この場合、そのような時点は、好ましくは、異なる日におけるものである。したがって、1またはそれ以上またはすべての免疫化は、2〜10、例えば3〜5の異なる日における投与を含みうる。好ましくは、第1の免疫化および第2の免疫化においては、投与を異なる3または4日間で行う。
1またはそれ以上またはすべての免疫化の場合には、その免疫化の2、3、4回またはそれ以上の投与は2〜14日間隔、例えば3〜10日または4〜8日間隔でありうる。好ましくは、1またはそれ以上またはすべての免疫化については、その免疫化の2、3、4回またはそれ以上の投与は2〜6日間隔である。
2つの免疫化の間の時間は、本明細書においては、2つの免疫化の第1の投与同士の間の時間として定義される。典型的には、第1の免疫化と第2の免疫化との間の時間（好ましくは、すべての免疫化の間の時間）は21〜365日、例えば28〜300日、50〜250日または100〜200日である。1つの実施形態においては、該方法の免疫化のすべては、21〜365日、例えば28〜300日、50〜250日または100〜200日にわたって行う。
本発明の方法の1つの実施形態においては、一般にはNOIを2〜5回（2〜5の異なる時点で）、例えば2、3または4回（それぞれ2、3または4の異なる時点で）投与する。典型的には、そのような投与は2〜14日、例えば4〜12または6〜10日にわたって行う。好ましい実施形態においては、少なくとも2、3または4回のNOI投与を行い、それらは3日またはそれ未満、例えば2日またはそれ未満の日数で隔てられうる。1つの実施形態においては、第1の投与と第2の投与との間の時間は4日未満、典型的には3.5日未満、例えば3日もしくはそれ未満、または2日もしくはそれ未満である。
好ましくは、本明細書に記載されている投与の合間には被験体にNOIを投与せず、典型的には、NOI投与の合間には、免疫応答を刺激しうる他の産物（例えば、ポリペプチド抗原）を投与しない。1つの実施形態においては、本明細書に記載の投与計画のいずれかにおけるNOIの第1の投与の少なくとも7日前、例えば少なくとも14日前または少なくとも28日前には、NOIまたは免疫応答を刺激しうる別の産物（例えば、ポリペプチド抗原）を被験体に投与しない。1つの実施形態においては、本明細書に記載の投与計画のいずれかにおけるNOIの最終投与の少なくとも7日後、例えば少なくとも14日後または少なくとも28日後には、NOIまたは免疫応答を刺激しうる別の産物（例えば、ポリペプチド抗原）を被験体に投与しない。
典型的には、NOIを投与する各投与において（または各時点で）、約1pg〜約5mg、好ましくは約10pg〜約100μg、例えば25pg〜1μgまたは50pg〜約500pgのNOIを被験体に与える。前記のとおり、第2の免疫化および適用可能な場合にはその後続の免疫化においては、タンパク質を投与することが可能である。典型的には、各投与（または各時点）において0.1μg〜20mg、好ましくは1μg〜5mg、例えば10μg〜500μgのタンパク質を投与する。
前記のとおり、本発明の方法においては、NOIおよび場合によってはタンパク質を投与する。いくつかの実施形態においては、NOIまたはタンパク質をアジュバントまたはそれをコードするNOIと共投与する。この実施形態においては、アジュバントは、好ましくは、大腸菌（E. coli）易熱性エンテロトキシン（LT）またはビブリオ・コレレ（Vibrio Cholerae）コレラ毒素（CT）の非毒性形態である。該アジュバントはLTエンテロトキシンのAもしくはBサブユニット（LTB）またはCTコレラ毒素のBサブユニット（CTB）を含みうる。
アジュバントおよび特に遺伝的アジュバントの含有は、CMI応答を更に増強または調節するのに有用である。したがって、CMI応答を増強するための本発明の方法は、長く続き、持続的な増強されたCMI応答を惹起するための特に有効な組成物および方法を与える、NOIまたはタンパク質（あるいはNOIまたはタンパク質を含む組成物）へのアジュバントの添加により改良されうる。
該NOIまたはタンパク質は、好ましくは、粒子として投与される。本発明の方法の好ましい実施形態においては、該NOIまたはタンパク質は経皮的に投与される。より一層好ましい実施形態においては、該粒子は粒子加速装置により宿主哺乳類被験体に投与される。
1つの実施形態においては、該投与計画を実施した後、該計画がCMIの刺激（例えば、CTL応答）をもたらしたか否かを確認する。これは、例えば、被験体からのサンプル中のT細胞（例えば、CTL）の存在またはレベルを測定することにより行うことが可能である。検出されたT細胞は、一般には、NOIによりコードされるエピトープに特異的である。
本発明の他の態様は、添付の特許請求の範囲ならびに以下の説明および図面に記載されている。これらの態様は、別々の項目名で示されている。しかし、各項目における教示はその特定の項目名に必ずしも限定されるわけではないと理解されるべきである。
定義
本発明は、特に例示されている分子またはプロセスパラメーターに限定されるものではなく、それらはもちろん様々に変化しうると理解されるべきである。また、本発明で用いる用語は、専ら本発明の特定の実施形態を説明することを目的としたものであり、限定的なものではないと理解されるべきである。さらに、本発明の実施は、特に示さない限り、ウイルス学、微生物学、分子生物学、組換えDNA技術および免疫学の通常の方法（それらのすべては当技術分野の通常の技量の範囲内である）を用いる。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（2nd Edition,1989）;DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I & II（D.Glover編）;Oligonucleotide Synthesis（N.Gait編,1984）;A Practical Guide to Molecular Cloning（1984）およびFundamental Virology,2nd Edition,vol.I & II（B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編）を参照されたい。
本明細書に引用されているすべての刊行物、特許および特許出願は、前記のものも後記のものも、それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられている単数表現は、明らかに内容と矛盾しない限り、複数物に対する言及を含むことに注意しなければならない。特に示さない限り、本出願において用いる全ての科学技術用語は、当技術分野において一般に用いられるものと同じ意義を有する。本出願に用いる以下の用語または表現は、特定された意義を有する。
免疫応答
免疫系が疾患を抑制するメカニズムは、体液性免疫による中和抗体の誘導、および細胞性免疫によるT細胞応答の生成を含む。本明細書中で用いる、標的抗原（TA）（EOIを含む）に対する「免疫応答」なる語は、宿主哺乳類被験体における、そのTAに対する体液性および／または細胞性免疫応答の発生を意味する。
本明細書中で用いる「体液性免疫応答」なる語は、抗体分子により媒介される免疫応答を意味する。体液性免疫により生成される抗体は、主として細胞外感染因子に対して有効である。
本明細書中で用いる「細胞性免疫（CMI）応答」なる語は、Tリンパ球および／または他の白血球により媒介される免疫応答である。CMI免疫メカニズムは、一般には、細胞内感染および疾患に対して、より有効である。なぜなら、CMIメカニズムはT細胞を感作して、後にTAが出現すると、記憶T細胞を活性化して、対応するTAまたはその一部を標的細胞表面上に有する標的細胞を破壊して感染病原体を破壊するCMI応答をもたらすからである。CMI応答は、直接的な細胞-細胞接触によりおよび／または抗ウイルス活性を有するサイトカインのような分子の放出により宿主の感染細胞を破壊するエフェクター細胞によりもたらされる、感染源の破壊に集中する。したがって、特異的Tリンパ球細胞性応答により特徴づけられるCMI応答は、癌、ウイルス、病原性および他の細胞内微生物により引き起こされる疾患に対する抵抗性を得るのに決定的に重要である。
CMI応答に関与するT細胞
CMIおよび体液性応答を開始および／または増強するためには、少なくとも2つの特別な型のT細胞が必要になる。CD4補助受容体を発現するT細胞の特定のサブセット上の抗原受容体はTヘルパー（Th）細胞またはCD4 T細胞（本明細書中では以下、Tヘルパー細胞と称される）であってよく、それらは、MHCクラスII分子に結合した抗原ぺプチドを認識する。一方、CD8補助受容体を発現するT細胞の特定のサブセット上の抗原受容体は細胞傷害性Tリンパ球（CTL）またはCD8+T細胞（本明細書中では以下、CD8+T細胞と称される）と称され、それらは、MHCクラスI分子上に提示された抗原と反応する。
ヘルパーT細胞
ヘルパーT細胞またはCD4+細胞は更に、2つの機能的に異なるサブセット（すなわち、それらのサイトカインおよびエフェクター機能において異なるTh1およびTh2）に分類されうる。Th1およびTh2応答は正のみならず負の様態でも調節されて、Th1細胞性応答はIL-2、IL-12およびIFN-γのようなTh1サイトカインにより増強され、IL-4およびIL-10のようなTh2サイトカインにより減弱される。一方、抗体応答はIL-4およびIL-10のようなTh2サイトカインにより増強されるが、IFN-γ、およびIFN-γを増強し単球により産生される別のサイトカインであるIL-12のようなTh1サイトカインによりダウンレギュレーションされる。したがって、IFN-γ、IL-2およびIL-12のような古典的なTh1サイトカインは、炎症応答を誘導する免疫補助因子とみなされうる。一方、IL-4およびIL-10のような古典的なTh2サイトカインは、いくつかの状況において、重篤な炎症応答を抑制するサイトカインとみなされうる。
CD8+T細胞
CD8+T細胞は2以上の様態で機能しうる。CD8+T細胞の最もよく知られた機能は、MHCクラスI分子の環境においてペプチド抗原を保持する標的細胞の殺細胞または細胞溶解である。したがって、そのような理由により、これらの細胞は細胞傷害性Tリンパ球（CTL）と称されることが多いのである。しかし、おそらく、ある種の感染においてより強力な防御的で重要なもう1つの機能は、インターフェロンγ（IFN-γ）を分泌するCD8+T細胞の能力である。したがって、細胞溶解活性のアッセイおよびIFN-γ放出のアッセイは共に、CD8+T細胞免疫応答の測定（例えば、後記のELISPOTアッセイ）において重要である。感染症においては、疾患の症状が現われる前の疾患の初期段階で、感染性抗原を含む感染因子を殺すことによりCD8+T細胞が防御しうることを示唆する証拠が存在する。
CMI応答の増強
本発明は、宿主被験体における標的抗原に対するCMI応答を増強および／またはモジュレーションしうる方法に関する。本明細書中で用いる「増強」なる語は、CMI応答のすべての態様における向上を包含し、TAのEOIをコードするNOIの反復投与に対するCMI応答の大きさおよび／または持続時間および／または質の刺激および／または増大および／または強化および／またはアップレギュレーションを包含するが、これらに限定されるものではない。例えば、CMI応答は、（i）標的抗原を認識するCD8+T細胞の活性化および／または産生および／または増殖を増強することにより、および／または（ii）CMI応答をTh2型応答からTh1型応答へ変化させることにより、増強されうる。Th1関連応答のこの増強は、細胞内感染に対する応答において特に重要である。なぜなら、前記のとおり、CMI応答は、活性化Th1（例えば、IFN-γ誘導性）細胞により増強されるからである。
そのような増強された免疫応答は、一般には、インターフェロン産生CD4+および／またはCD8+ Tリンパ球の力価の増加、抗原特異的CD8+T細胞活性の増加、および目的とする抗原に対するTヘルパー2様免疫応答（Th2）ではなくTヘルパー1様免疫応答（Th1）（典型的には細胞性免疫に関連しているサブクラス（例えば、IgG2a）の抗原特異的抗体力価の増加、および通常はそれに付随する、典型的には体液性免疫に関連しているサブクラス（例えば、IgG1）の抗体力価の減少により、特徴づけられる）により特徴づけられる。
本発明の方法により惹起される応答（例えば、CMI応答の増強）は、多数のよく知られたアッセイにより、例えばリンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、CD8+T細胞アッセイにより、あるいは感作被験体におけるエピトープに特異的なTリンパ球に関するアッセイ（例えば、Ericksonら (1993) J. Immunol. 151: 4189-4199; およびDoeら (1994) Eur. J. Immunol. 24: 2369-2376を参照されたい）またはインターフェロンγ産生の測定のためのCD8+T細胞ELISPOTアッセイ（Miyaharaら PNAS(USA) (1998) 95: 3954-3959）により測定することが可能である。
1つの実施形態においては、該方法は調節性または抑制性T細胞応答を惹起する。そのような応答の惹起は、例えば、自己免疫疾患の予防または治療に用いることが可能である。
T細胞応答の増強
本明細書中の開示においては、応答の惹起は、しばしば、CMI応答の惹起として説明される。CMI応答の惹起はT細胞応答の惹起を含むと理解される。本発明の方法により惹起された応答は、「増強」された応答でありうる。本発明の方法において投与したのと同じ量のNOI（また、適用可能な場合には同じ量のタンパク質）を投与した対照方法において惹起される応答より、本発明の方法により惹起された応答のほうが大きい場合には、「増強」された応答が生じたと判定されうる。そのような対照方法は、例えば、1回の投与におけるNOI（また、適用可能な場合にはタンパク質）の投与よりなるものでありうる。あるいは、対照方法は、28日間隔の2回の別々の投与でのNOI（また、適用可能な場合にはタンパク質）の投与よりなるものでありうる。
本明細書中で用いる「T細胞応答の増強」なる語は、T細胞応答のすべての態様における向上を包含し、標的抗原のEOIをコードするNOIの反復投与に対するT細胞応答の大きさおよび／または持続時間および／または質の刺激および／または増大および／または強化および／またはアップレギュレーションを包含するが、これらに限定されるものではない。例えば、T細胞応答は、誘導されたT細胞の活性化および／または産生および／または分布および／または増殖、および／またはTAからのEOIをコードするT細胞誘導性／調節性NOIに対するT細胞応答の長さを増強することにより増強されうる。宿主被験体におけるT細胞応答の増強は宿主被験体におけるTh1免疫応答の増強および／またはモジュレーションに関連づけられうる。
T細胞応答の増強は、多数のよく知られたアッセイにより、例えばリンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、CD8+T細胞細胞傷害性細胞アッセイにより、あるいは感作被験体におけるエピトープに特異的なTリンパ球に関するアッセイ（例えば、Ericksonら (1993) J. Immunol. 151: 4189-4199; およびDoeら (1994) Eur. J. Immunol. 24: 2369-2376を参照されたい）またはインターフェロンγ産生の測定のためのCD8+T細胞ELISPOTアッセイ（Miyaharaら PNAS(USA) (1998) 95: 3954-3959）により測定することが可能である。
抗原
各病原因子または疾病状態は、免疫認識および宿主における病原因子または疾病状態の最終的な排除または抑制に決定的に重要な抗原または抗原上の免疫優性エピトープに関連づけられる。特定の疾患に対する体液性および／または細胞性免疫応答を開始させるためには、宿主免疫系が、その疾病状態に関連した抗原または抗原上の免疫優性エピトープと接触しなければならない。
本明細書中で用いる「抗原」は、個体において免疫学的応答を惹起しうる任意の物質、一般には巨大分子を意味する。免疫学的応答はBおよび／またはTリンパ球細胞のものでありうる。該用語は、個々の巨大分子または抗原性巨大分子の同質もしくは異質集団を表すために用いられうる。本明細書中で用いる「抗原」は、1以上の抗原決定基またはエピトープを含有するタンパク質分子またはその一部を意味するものとして用いられる。
標的抗原
本明細書中で用いる「標的抗原（TA）」なる語は、感染性病原体（例えば、限定的なものではないが細菌、ウイルス、真菌、酵母、寄生虫、および哺乳類生物種に感染しうる他の微生物）に対するCMI応答を誘導しうる1以上のエピトープを含む目的とする免疫原性ペプチドまたはタンパク質を意味する。標的抗原には、自己抗原、自家抗原、交差反応性抗原、アロ抗体、寛容原、アレルゲン、ハプテン、免疫原またはそれらの一部およびそれらの任意の組合せが含まれうるが、これらに限定されるものではない。したがって、EOIは、本明細書に記載の抗原またはタンパク質の任意のタイプ、あるいは本明細書に記載の特異的抗原またはタンパク質の任意のものに由来しうる。
エピトープ
本明細書中で用いる「エピトープ」なる語は、一般には、T細胞受容体および／または抗体により認識される標的抗原上の部位を意味する。好ましくは、それは、タンパク質抗原に由来するまたはタンパク質抗原の一部としての短いペプチドである。しかし、この用語は、糖ペプチドおよび糖鎖エピトープを有するペプチドをも包含すると意図される。単一の抗原分子はいくつかの異なるエピトープを含みうる。「エピトープ」なる語は、生物全体を認識する応答を刺激する、アミノ酸または糖の修飾配列をも含む。選択されるエピトープが、感染症を引き起こす感染因子（例えば、細菌またはウイルス）のエピトープである場合に、それは有利である。
本明細書中で用いる、目的とするエピトープ（EOI）なる語は、本発明の方法において使用しうる1以上のEOIを意味する。本発明の方法は、1、2、3、4、5〜10個またはそれ以上の異なるエピトープに対するT細胞応答を惹起するために使用することが可能である。したがって、該方法は、一緒になって1、2、3、4、5〜10個またはそれ以上の異なるエピトープをコードする1以上のNOIの投与、および／または一緒になって1、2、3、4、5〜10個またはそれ以上の異なるエピトープを含む1以上のタンパク質の投与を含みうる。
1つの実施形態においては、本発明の方法は、予め決められた（または予め定められた）および／または既知のエピトープ（これは、典型的には、予め決められたおよび／または既知のタンパク質に由来する）に対するT細胞応答を惹起するために行う。
エピトープ源
EOIは、ペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸および対応DNA配列の知見から、ならびに個々のアミノ酸の性質（例えば、サイズ、電荷など）およびコドン表から、過度な実験を伴うことなく作製されうる。例えば、Ivan Roitt, Essential Immunology, 1988; Kendrew, 前掲; Janis Kuby, Immunology, 1992 例えば p. 79-81を参照されたい。目的とするタンパク質またはエピトープが応答を刺激するかどうかを判定するためのいくつかの指針には、ペプチドの長さが含まれる。ペプチドは、MHCクラスI複合体に適合するためには少なくとも8または9アミノ酸長であるべきであり、クラスII MHC複合体に適合するためには少なくとも8〜25アミノ酸長、例えば少なくとも13〜25アミノ酸長であるべきである。この長さは、ペプチドがMHC複合体に結合するための最小の長さである。細胞がペプチドを切断する可能性があるため、ペプチドはこれらの長さより長いことが好ましい。ペプチドは、免疫応答を生成するのに十分に高い特異性でそれが種々のクラスIまたはクラスII分子に結合するのを可能にする適当なアンカーモチーフを含有すべきである（Bocchia, M.ら, Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Pentides to HLA Class I Molecules, Blood 85:2680-2684; Englehard, VH, Structure of peptides associated with class I and class II MHC molecules Ann. Rev. Immunol. 12:181 (1994)を参照されたい）。これは、目的とするタンパク質の配列を、MHC分子と結合したペプチドの報告のある構造と比較することにより、過度の実験を伴うことなく行うことが可能である。したがって、当業者は、タンパク質配列を、タンパク質データベース中に挙げられている配列と比較することにより、目的とするエピトープを確認することが可能である。
本発明の方法は、一般には、ウイルスまたは寄生虫のような多種多様な感染因子に由来するものを含む、任意の起源（例えば、病原体）に由来するEOIをコードするNOIに対するCMI応答の増強に適用可能である。例えば、EOIは、生物において無制限に増殖して病的増殖をきたしうる腫瘍細胞に由来する病原因子に由来するものでありうる。そのような病原因子の具体例はDavis, B.D.ら, Microbiology, 3rd ed., Harper International Editionに記載されている。
エピトープは非哺乳類、非マウスまたは非ヒトタンパク質に由来するものでありうる。エピトープは細胞内タンパク質または細胞外タンパク質に由来するものでありうる。1つの実施形態においては、エピトープは、分泌タンパク質、例えば、病原体により分泌されたタンパク質に由来する。エピトープは、T細胞応答が惹起されている被験体のタンパク質に由来するものであってもそうでなくてもよい。エピトープは、被験体に感染しうる病原体に由来するものでありうる。エピトープは、天然に存在するエピトープまたは天然では見いだされない人工的エピトープでありうる。
しかし、好ましい実施形態においては、本発明は、HIVウイルスファミリーの成分に対するCMI応答を増強することにより例示される。増強されたCMI応答は、任意のウイルス遺伝子（例えば、gag、pol、nefおよびenv遺伝子）の産物（env遺伝子の産物が好ましい標的である）内に位置するEOIに対して生成されうる。
したがって、1つの実施形態においては、本発明の方法は、HIV感染および／またはHIV感染により引き起こされる若しくは悪化する任意の病的状態（例えば、エイズ）の治療および／または予防のための特定の抗原に対する免疫応答を惹起する。
T細胞エピトープ
本発明の方法またはプロセスにおいては、TAのEOIは1以上のT細胞エピトープを含有しうる。本明細書中で用いる「T細胞エピトープ」なる語は、一般には、T細胞応答を誘導しうる、ペプチド構造体の特徴を意味する。これに関しては、T細胞エピトープは、MHC分子のペプチド結合間隙内で伸長コンホメーションをとる直鎖状ペプチド決定基を含むと当技術分野においてみなされている（Unanueら (1987) Science 236: 551-557）。本明細書中で用いるように、T細胞エピトープは、一般には、少なくとも約3〜5アミノ酸残基、好ましくは少なくとも5〜10またはそれ以上のアミノ酸残基、例えば8〜25アミノ酸残基を有するペプチドである。しかし、本明細書中で用いる「T細胞エピトープ」なる語は、任意のMHCクラスIまたはMHCクラスII拘束性ペプチドを包含する。CMI応答を個々のT細胞エピトープが刺激／増強する能力は、多数のよく知られたアッセイ、例えばリンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、CD8+T細胞細胞傷害性細胞アッセイにより、あるいは感作被験体におけるエピトープに特異的なTリンパ球に関するアッセイ（例えば、Ericksonら (1993) J. Immunol. 151: 4189-4199; およびDoeら (1994) Eur. J. Immunol. 24: 2369-2376を参照されたい）またはインターフェロンγ産生の測定のためのCD8+T細胞ELISPOTアッセイ（Miyaharaら PNAS(USA) (1998) 95: 3954-3959）により、測定することが可能である。
CD8+T細胞エピトープ
好ましくは、EOIはCD8+T細胞EOIである。CD8+T細胞誘導性EOIは、宿主被験体へのその投与の後に特異的CD8+T細胞の形成を刺激しうるまたはその活性を増強しうるエピトープである。CD8+T細胞エピトープは、1または2またはそれ以上のエピトープの一つながりの組換え体のような種々の異なる形態で提供されうる。CD8+T細胞エピトープは多種多様な疾患に関して既に同定されており文献中に見出されうる。そのようなCD8+T細胞EOIを含有する任意の選択されたTAに対するCD8+T細胞応答を生成させるために一連のエピトープを設計することが可能である。有利には、NOIにおいては、CD8+T細胞EOIは、不必要な核酸物質が回避されるよう介在配列を含まずに1つに連結された一つながりの複数のEOIとして提供されうる。1つの実施形態においては、NOIは、発現されたタンパク質からのエピトープの切断を可能にするプロテアーゼ切断部位として作用しうる配列をもコードしている。
Tヘルパーエピトープ
好ましくは、EOIはヘルパーTリンパ球EOIである。本発明での使用に適したTヘルパー細胞EOIを同定するためには、種々の方法が利用可能である。例えば、ペプチド配列の両親媒性は、Tヘルパー細胞誘導因子としての機能性をもたらすことが公知である。Tヘルパー細胞誘導性エピトープの詳しい考察は、参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,128,319号に記載されている。
B細胞エピトープ
好ましくは、EOIはCD8+T細胞EOIとB細胞EOIとの混合物である。本明細書中で用いる「B細胞エピトープ」なる語は、一般には、特異的抗体分子が結合するTA上の部位を意味する。抗体応答を惹起しうるエピトープの同定は、当技術分野でよく知られた技術を用いて容易に達成される。例えば、Geysenら (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002（所与の抗原中の免疫原性エピトープの位置を決定するためにペプチドを迅速に合成するための一般的方法）; 米国特許第4,708,871号（抗原のエピトープを同定し化学合成するための方法）; およびGeysenら(1986) Molecular Immunology 23: 709-715（所与の抗体に対する高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。
エピトープの組合せ
本発明の好ましい実施形態においては、EOIはCD8+T細胞誘導性EOIとTヘルパー細胞誘導性EOIとの混合物である。
当技術分野ではよく知られているとおり、TおよびB細胞誘導性エピトープは、しばしば、互いに異なっており、異なるペプチド配列を含みうる。したがって、タンパク質のペプチド鎖の特定の領域はT細胞エピトープまたはB細胞エピトープのいずれかを有しうる。したがって、CD8+T細胞エピトープにより惹起される免疫応答を増強するためには、CD8+T細胞エピトープに加えて、Tヘルパー細胞により認識される1以上のエピトープを含めることが好ましいかもしれない。
Tヘルパー細胞誘導性物質によりin vivoでCD8+T細胞誘導性応答を増強するメカニズムは完全には明らかでない。しかし、理論により束縛されるものではないが、増強因子は、Tヘルパー細胞を誘導するその能力により、特異的CD8+T細胞のクローン増殖および拡散を補助する必須サイトカインのレベルの増加をもたらす可能性がある。根底にあるメカニズムにかかわらず、本発明の方法におけるヘルパーT細胞およびCD8+T細胞誘導性EOIの混合物の使用はCMI応答の増強を補助すると予想される。特に適したTヘルパー細胞エピトープは、異なるHLA型の個体で活性であるもの、例えば、破傷風由来のTヘルパーエピトープ（それに対しては、ほとんどの個体が既に感作されているであろう）である。B細胞応答および抗体産生を刺激するために、B細胞EOIを含めることも有用かもしれない。2つのタイプの免疫応答（すなわち、T細胞応答のみ、およびT細胞応答とB細胞応答との組合せ）を得るために、合成NOIを構築することも可能である。
免疫優性エピトープ
TAの複数のEOIをコードするNOIで個体を免疫すると、多くの場合、応答性Tリンパ球の大多数はそのTA由来の1以上の直鎖状EOIに特異的となり、および／または、応答性Bリンパ球の大多数はそのTA由来の1以上の直鎖状または立体構造EOIに特異的となるであろう。したがって、本発明の目的においては、そのようなEOIは「免疫優性エピトープ」と称される。いくつかの免疫優性EOIを有する抗原においては、単独のEOIが、特異的TまたはB細胞応答の統制に関して、最も優性でありうる。
好ましくは、本発明の方法またはプロセスは、1以上のHSV-2エピトープに対するCMI応答の増強に有効である。好ましくは、本発明の方法またはプロセスは、1以上の免疫優性HSV-2エピトープに対するCMI応答の増強に有効である。好ましくは、本発明の方法は1以上のHbsAgエピトープに対するCMI応答の生成／増強に有効である。好ましくは、本発明の方法は1以上の免疫優性HbsAgエピトープに対するCMI応答の生成／増強に有効である。
実施例において示されているとおり、HSV-2およびHbsAg EOIの両方に対して得られた増強されたCMI応答は、本発明の方法が、多様な感染性病原体に由来するEOIに対して一般に有効であることを示している。さらに、ウイルスチャレンジに対する防御効果は、強力なCD8+T細胞応答の生成が予防用および治療用ワクチン接種方法の開発において重要であることを示している。
好ましくは、本発明の方法またはプロセスは、腫瘍関連抗原（TAA）に関連した1以上のEOIに対する増強されたCMI応答の惹起に有効である。有利には、腫瘍関連抗原（TAA）に由来するEOIは宿主免疫系の標的として働くことが可能であり、腫瘍の破壊を引き起こす応答を惹起しうる。そのようなTAAの具体例には、MART-1（T細胞により認識される黒色腫抗原-1）、MAGE-1、MAGE-3、5T4、gp100、癌胎児性抗原（CEA）、前立腺特異抗原（PSA）、MUCIN（MUC-1）、チロシナーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。他のTAAも、当技術分野で公知の方法（例えば、米国特許第4,514,506号に開示されているもの）により同定し単離しクローニングすることが可能である。
好ましい実施形態においては、NOIは少なくとも2つのHIV抗原をコードしている。NOIは、HIV gagタンパク質またはエピトープを含有するその断片、および1以上の他のHIV抗原またはエピトープを含有するその断片をコードする配列を含みうる。該抗原は、任意の入手可能なHIV分離株（典型的にはHIV-1）に由来するもの（例えば、HXB2）でありうる。該抗原はp24gagおよびp55gagのようなgag抗原（またはエピトープを含有するその断片）、ならびにHIVのpol、env、tat、vif、rev、nef、vpr、vpuおよびLTR領域に由来するタンパク質（またはエピトープを含有するその断片）を含みうる。
より好ましい実施形態においては、NOIは少なくとも3つのHIV抗原、好ましくはGag、nefおよびRT（あるいは、タンパク質全体ではなく、これらのタンパク質のいずれかのエピトープ含有断片）をコードしている。これらのコード配列は任意の順序で位置しうるが、好ましくは、Nef-RT-Gag、RT-Nef, GagまたはRT-Gag-Nefの順序で位置する。
1つの実施形態においては、発現されるHIVエピトープ／タンパク質は融合タンパク質、例えば、Nef、RTおよびGag由来の配列（前記断片を含む）を含有する融合タンパク質である。
好ましい実施形態においては、gag遺伝子はgag p6ペプチドをコードしていない。好ましくは、NOI中のnef遺伝子は、N末端の81アミノ酸をコードする配列を除去するよう末端切断（トランケート化）されている。
NOIによりコードされる、gagまたは任意の他のHIV抗原（例えば、nefまたはRT）の断片は、一般には、エピトープを含む。NOIによりコードされるタンパク質（該断片を含む）は、一般には、少なくとも8アミノ酸長、例えば8〜10アミノ酸長、または20、50、60、70、80、100、150もしくは200アミノ酸長までである。任意のそのようなタンパク質はコドン最適化してもよく、それにより例えば、該断片は、高発現される哺乳類遺伝子の場合に類似したコドン使用パターンを有するようになる。
1つの実施形態においては、NOIはポリペプチドの以下の組合せの1つをコードしている。
I．末端切断型NEF（末端アミノ酸1〜85をコードするヌクレオチドを欠く）に融合したp17、p24。
II．p17、p24、RT、末端切断型NEF（末端アミノ酸1〜85をコードするヌクレオチドを欠く）。
III．p17、p24（最適化gag）、末端切断型NEF（末端アミノ酸1〜85をコードするヌクレオチドを欠く）。
IV．p17、p24（最適化gag）、RT（最適化）末端切断型NEF（末端アミノ酸1〜85をコードするヌクレオチドを欠く）。
V．p17、p24、RT（最適化）末端切断型NEF（末端アミノ酸1〜85をコードするヌクレオチドを欠く）。
好ましい実施形態においては、NOIは不活性化コドン最適化RT、末端切断型Nef、およびコドン最適化gag遺伝子のp17/p24部分（例えば、WO 03/025003に開示されているもの）を含み、これらは、所望により、アイオワ長（Iowa length）HCMVプロモーター＋エキソン1の下流に、および／またはウサギグロビンポリアデニル化シグナルの上流に、機能しうる形で連結されうる。該ポリアデニル化シグナルはウサギβグロビン遺伝子のものでありうる。
好ましい実施形態においては、NOIは、図18〜22に示すポリヌクレオチド配列の任意の1以上、または少なくとも1つのエピトープ（好ましくはT細胞エピトープ）をコードするそのような配列の断片、あるいは図18〜22の配列のいずれかのホモログまたは該断片のホモログを含みうる。そのような断片またはホモログは、典型的には、少なくとも50ヌクレオチド、例えば少なくとも100、200、500または1000ヌクレオチド長である。1つの実施形態においては、NOIは、図17または20〜22のいずれか1つにおいて示すプラスミドあるいはそのようなプラスミドの断片または誘導体（ホモログを含む）の形態である。該プラスミドの構築はWO 03/080112（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
最適化コドン
本発明の好ましい実施形態においては、NOIのコード配列は、哺乳類細胞において高発現される遺伝子のコドン使用頻度に類似するように最適化される。DNA暗号は4つの文字（A、T、CおよびG）を有し、これらにより3文字の「コドン」が形成され、これは、生物の遺伝子においてコードされるタンパク質中のアミノ酸を表す。DNA分子に沿ったコドンの直鎖配列は、それらの遺伝子によりコードされるタンパク質中のアミノ酸の直鎖配列に翻訳される。該コードは高度に縮重性であり、61種のコドンが20種の天然アミノ酸をコードしており、3種のコドンが「終止」シグナルを表す。したがって、ほとんどのアミノ酸は2以上のコドンによりコードされており、実際には、いくつかは4以上の異なるコドンによりコードされている。
ある所与のアミノ酸をコードする2以上のコドンが利用可能である場合には、生物のコドン使用頻度パターンは高度に非ランダムとなることが認められている。種が異なれば、そのコドン選択における偏り（バイアス）も異なり、さらに、単一の種においても、高レベルで発現される遺伝子と低レベルで発現される遺伝子との間でコドンの利用が著しく異なることがある。この偏りはウイルス、植物、細菌および哺乳類細胞において異なり、いくつかの種では、他のものよりもランダムなコドン選択からの偏りが強く示される。
例えば、ヒトおよび他の哺乳類は、ある種の細菌またはウイルスほどの強い偏りを示さない。これらの理由により、大腸菌（E. coli）内で発現される哺乳類遺伝子または哺乳類細胞内で発現されるウイルス遺伝子は効率的な発現には不適当なコドン分布を有する可能性がかなりある。発現が生じることになる宿主内ではまれにしか認められないコドンのクラスターが異種DNA配列内に存在すると、その宿主内での異種発現レベルが低いことが予想されると考えられる。
NOIにおいては、コドン使用頻度パターンは、天然で見出されるものから、標的生物、例えば哺乳動物、特にヒトのコドンの偏りにより近いものへと改変されうる。「コドン使用係数（codon usage coefficient）」は、所与のポリヌクレオチド配列のコドンパターンが標的種のものにどのくらいよく類似しているかを表す尺度である。コドン出現頻度は、多数の種の高発現遺伝子に関して、文献から導かれうる（例えば、Nakamuraら Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215を参照されたい）。61種のコドンのそれぞれに関するコドン出現頻度（選択されたクラスの遺伝子の1000コドン当たりの出現数として表される）を20種の天然アミノ酸のそれぞれに関して標準化して、各アミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに関する値が1となるようにし、また、より低頻度のコドンに関する頻度が0から1の間となるように尺度を定めた。こうして、標的種の高発現遺伝子に関して、61種のコドンのそれぞれに1またはそれ未満の値が割り当てられる。その生物種の高発現遺伝子に対して、特定のポリヌクレオチドに関するコドン使用係数を計算するためには、その特定のポリヌクレオチドの各コドンに関する尺度（scaled）値に注目し、（これらの値の自然対数の和をコドンの総数で割り算し、真数をとることにより）これらの値すべての幾何平均をとる。該係数は0〜1の値を有し、該係数が高くなればなるほど、該ポリヌクレオチド中のより多くのコドンが、頻繁に使用されるコドンとなる。ポリヌクレオチド配列がコドン使用係数で1を有する場合には、該コドンのすべてが標的種の高発現遺伝子に関して「最も頻繁な」コドンである。
本発明においては、好ましくは、標的生物の高発現遺伝子において0.2未満のRSCU値を有するコドンはNOIのコドン使用頻度パターンから除かれる。相対同義コドン使用頻度（RSCU）値は、コドンの観測数を、そのアミノ酸に関する全てのコドンが同等に頻繁に使用された場合に予想される数で割り算して得られる値である。NOIは、一般には、高発現ヒト遺伝子に関して、0.3を超える、好ましくは、0.4を超える、最も好ましくは、0.5を超えるコドン使用係数を有する。ヒトに関するコドン使用頻度表はGenbankにおいても見出されうる。比較のために挙げると、高発現βアクチン遺伝子は0.747のRSCUを有する。ホモサピエンス（homo sapiens）に関するコドン使用頻度表を以下に示す。
Figure 2007508319
コード化GC 52.51％ 第1文字GC 56.04％ 第2文字GC 42.35％ 第3文字GC 59.13％。
アジュバント
本発明の方法またはプロセスは、CMI応答の増強を示すためにはアジュバントの存在を要しない。しかし、アジュバントおよび特に遺伝的アジュバントの含有は、CMI応答を更に増強またはモジュレートするのに有用でありうる。アジュバントは、免疫化被験体において共投与した抗原の免疫原性を増強することにより、およびワクチン製品において有益な共投与抗原に対するTh1様免疫応答を誘導することにより、CMI応答を増強しうる。
したがって、CMI応答を増強するための本発明の方法またはプロセスは、長く続き、持続的な増強されたCMI応答を惹起するための特に有効な組成物および方法を与える、NOIまたはタンパク質あるいはNOIまたはタンパク質を含む組成物へのアジュバントの添加により改良されうる。
本明細書中で用いる「アジュバント」なる語は、抗原特異的免疫応答を特異的または非特異的に改変、増強、誘導、再誘導、強化または開始しうる任意の物質または組成物を意味する。
用語「アジュバント」は、NOIと共に投与されると、NOIの単独またはタンパク質の単独の投与に際して生成されるCMI応答と比べてCMI応答を増強または強化またはモジュレートする細菌ADP-リボシル化外毒素、生物学的に活性な因子、免疫調節分子、生物応答修飾物質または免疫刺激分子、例えばサイトカイン、インターロイキン、ケモカインまたはリガンドまたはエピトープ（例えば、ヘルパーT細胞エピトープ）および場合によってはそれらの組合せを包含するが、これらに限定されるものではない。アジュバントは、ヒトまたは動物での使用に適した当技術分野で公知の任意のアジュバントでありうる。
免疫調節分子、例えばサイトカイン（TNFα、IL-6、GM-CSFおよびIL-2）ならびに共刺激および補助分子（B7-1、B7-2）は種々の組合せでアジュバントとして使用されうる。1つの実施形態においては、GM-CSFは、投与計画の前、途中または後には被験体に投与されない。EOIの発現部位における免疫調節分子およびEOIの同時産生は、CMI応答を増強するのを補助しうる特異的エフェクターの生成を増強しうる。CMI応答の増強の度合は、使用する具体的な免疫刺激分子および／またはアジュバントに左右されうる。なぜなら、CMI応答を増強および／またはモジュレーション（調節）するために免疫刺激分子が惹起しうるメカニズムは、その免疫刺激分子によって異なるからである。例えば、種々のエフェクターメカニズム／免疫調節分子には、補助シグナル（IL-2）の増強（IL-2）、プロAPCの動員（GM-CSF）、T細胞頻度の増加（IL-2）、抗原プロセシング経路およびMHC発現に対する影響（IFN-γおよびTNF-α）およびTh1応答からTh2応答への免疫応答の変換（LTB）が含まれるが、これらに限定されるものではない（WO 97/02045を参照されたい）。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド（WO 96/02555を参照されたい）もTh1応答の優先的誘導因子であり、本発明での使用に適している。
理論により束縛されるものではないが、アジュバントは、Th2応答からTh1応答への変換および／または発現されたEOIに対する特異的エフェクター関連メカニズムにより、発現されたNOIまたはタンパク質に対するCMI応答を増強するのを補助し、それに伴って、増強されたCMI応答の生成および維持をもたらしうるため（例えば、WO 97/02045における教示を参照されたい）、アジュバントの含有は好都合である。
NOIまたはタンパク質とともにアジュバントを含有させることも好都合である。なぜなら、それは、NOIまたはタンパク質が投与された被験体における所望のCMI応答を得るのに必要なNOIまたはタンパク質の用量をより低くまたはより少なくしうるからであり、あるいはそれは、被験体において定性的および／または定量的に異なる免疫応答を与えうるからである。NOIまたはタンパク質の単独投与と平行して、NOIまたはタンパク質と共にアジュバントを動物に投与し、ラジオイムノアッセイ、ELISA、CD8+T細胞アッセイなど（これらはすべて、当技術分野でよく知られている）のような標準的な方法によりそれらの2つの群における抗体および／または細胞性免疫を比較することにより、アジュバントの有効性を測定することが可能である。典型的には、アジュバントは抗原とは別の部分であるが、単一の分子がアジュバント特性および抗原特性の両方を有することも可能である。
本明細書中で用いる「遺伝的アジュバント」なる語は、NOIによりコードされるアジュバントであり、これは、EOIまたはタンパク質（エピトープを含むもの）をコードするNOIと共に投与されると、NOIまたはタンパク質の単独投与の際に生成するCMI応答と比べてCMI応答を増強する。
1つの好ましい実施形態においては、遺伝的アジュバントは細菌ADP-リボシル化外毒素である。ADP-リボシル化細菌毒素は関連細菌外毒素のファミリーであり、ジフテリア毒素（DT）、百日咳毒素（PT）、コレラ毒素（CT）、大腸菌（E. coli）易熱性毒素（LT1およびLT2）、シュードモナス（Pseudomonas）内毒素A、シュードモナス（Pseudomonas）外毒素S、ビー・セレウス（B. cereus）外酵素、ビー・スファエリクス（B. sphaericus）毒素、シー・ボツリヌム（C. botulinum）C2およびC3毒素、シー・リモスム（C. limosum）外酵素、ならびにシー・ペルフリンゲンズ（C. perfringens）、シー・スピリフォルマ（C. spiriforma）およびシー・ディフィシレ（C. difficile）からの毒素、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）EDINおよびADPリボシル化細菌毒素突然変異体、例えばCRM197、非毒性ジフテリア毒素突然変異体（例えば、Bixlerら (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251: 175; およびConstantinoら (1992) Vaccineを参照されたい）を包含する。ほとんどのADPリボシル化細菌毒素はA:B多量体として構成され、ここで、AサブユニットはADPリボシルトランスフェラーゼ活性を含有し、Bサブユニットは結合部分として作用する。本発明の組成物において使用する好ましいADPリボシル化細菌毒素には、コレラ毒素および大腸菌（E. coli）易熱性毒素が含まれる。
コレラ毒素（CT）および関連大腸菌（E. coli）易熱性エンテロトキシン（LT）は、全身、経口または粘膜投与された場合に強力な毒性を示し強力な免疫原であるそれらのそれぞれの腸管毒性細菌株の分泌産物である。CTおよびLTは共に、筋肉内または経口経路で投与された場合に抗原にアジュバント効果を与えることが公知である。これらのアジュバント効果は、毒性に要する用量より低い用量で観察されている。それらの2つの毒素は極めて類似した分子であり、アミノ酸レベルにおいて少なくとも約70〜80％相同である。
好ましくは、遺伝的アジュバントはコレラ毒素（CT）、エンテロトキシン産生性大腸菌（E. coli）易熱性毒素（LT）、またはアジュバント活性を保持するCTもしくはLTの誘導体、サブユニットもしくは断片である。より一層好ましい実施形態においては、遺伝的アジュバントはLTである。もう1つの好ましい実施形態においては、遺伝的アジュバントはCTBまたはLTBでありうる。
好ましくは、該エンテロトキシンは非毒性エンテロトキシンである。例えば、エンテロトキシンサブユニットコード領域の少なくとも1つは、それによりコードされるサブユニットペプチドを無毒化するために遺伝的に改変してもよく、例えば、末端切断型Aサブユニットコード領域は、サブユニットペプチド発現産物内のADP-リボシルトランスフェラーゼ活性を破壊または不活性化するために遺伝的に改変されている（WO 03/004055を参照されたい）。
後記実施例においては、プラスミドベクターにより発現される天然AおよびBサブユニットを含むLT完全毒素を遺伝的アジュバントとして使用し、これを、HSV-2/HbsAg抗原を発現するNOIと共に共投与して、増強されたCMI応答を得た。アジュバントを伴わないNOIまたはタンパク質の投与と比べて、アジュバントを含有させた場合には、全身T細胞応答の生成に関してCMI応答惹起能が著しく向上することを、結果は示している。
したがって、より一層増強されたCMI応答が望まれる場合に、この遺伝的アジュバントが特に望ましいことを、これらの結果は示している。他の望ましい遺伝的アジュバントには、IL-10、IL-12、IL-13、インターフェロン（IFN）（例えば、IFN-α、IFN-ssおよびIFN-γ）およびそれらの好ましい組合せをコードするNOIが含まれるが、これらに限定されるものではない。CMI応答を増強する他のそのような生物学的に活性な因子は、なお、当業者が容易に選択することが可能であり、それを含有する適当なプラスミドベクターは公知技術により構築されうる。
NOI
本発明のEOIは、EOIをコードするヌクレオチド配列として投与することが可能である。本明細書中で用いる目的とするヌクレオチド配列（NOI）なる語は、本発明の方法において使用する1以上のEOIをコードする1以上のNOIを意味する。「目的とするヌクレオチド配列（nucleotide sequence of interest; NOI）」なる語は「ポリヌクレオチド」なる語と同義である。NOIは、ゲノム由来、合成由来または組換え由来のDNAまたはRNAでありうる。NOIは、センス鎖またはアンチセンス鎖またはそれらの組合せにかかわらず、二本鎖または一本鎖でありうる。いくつかの用途には、好ましくは、NOIはDNAである。いくつかの用途には、好ましくは、NOIは組換えDNA技術（例えば、組換えDNA）の使用により製造される。いくつかの用途には、好ましくは、NOIはcDNAである。いくつかの用途には、好ましくは、NOIは、天然に存在する形態と同じでありうる。NOIは、単離または精製された形態（例えば、非細胞形態）でありうる。
ベクター
本発明の1つの実施形態においては、NOIを宿主被験体に直接投与する。本発明のもう1つの実施形態においては、NOIを含むベクターを宿主被験体に投与する。好ましくは、NOIは、遺伝的ベクターを使用して製造および／または投与される。当技術分野においてはよく知られているとおり、ベクターは、ある実体（entity）を1つの環境から別の環境へ導入するのを可能にしまたは容易にする手段である。本発明においては、本発明のNOIを含むベクターを複製させ、NOIによりコードされる本発明のEOIを発現させるために、例えば、組換えDNA技術において使用するいくつかのベクターが宿主および／または標的細胞内へのDNAセグメント（例えば、異種DNAセグメント、例えば、異種cDNAセグメント）のような実体の導入を可能にする。組換えDNA技術において使用するベクターの具体例には、プラスミド、染色体、人工染色体またはウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。「ベクター」なる語は発現ベクターおよび／または形質転換ベクターを包含する。「発現ベクター」なる語は、in vivoまたはin vitro／ex vivo発現を可能にする構築物を意味する。「形質転換ベクター」なる語は、1つの種から別の種へ導入されうる構築物を意味する。
1つの実施形態においては、NOIからの発現を駆動するためにウイルスプロモーターを使用する。該プロモーターはサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターでありうる。好ましいプロモーター要素は（特にNOIがHIV抗原をコードしている場合には）、イントロンAを欠くがエキソン1を含むCMV極初期（IE）プロモーターである。したがって、NOIからの発現はHCMV IE初期プロモーターの制御下にありうる。
裸DNA
本発明のNOIを含むベクターは、「裸核酸構築物」（好ましくは、宿主細胞ゲノムに相同なフランキング配列を更に含むもの）として直接投与することが可能である。本明細書中で用いる「裸DNA」なる語は、本発明のNOIを、その産生を制御する短いプロモーター領域と共に含むプラスミドを意味する。「裸DNA」と称されるのは、そのプラスミドがいかなる送達運搬体にも担持されていないからである。そのようなDNAプラスミドが真核細胞のような宿主細胞に進入すると、それがコードするタンパク質が該細胞内で転写され翻訳される。
ウイルスベクター
あるいは、本発明のNOIを含むベクターは、当技術分野で公知の種々のウイルス技術（例えば、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスのような組換えウイルスベクターによる感染）を用いて、適当な宿主細胞内に導入することが可能である。該ベクターは組換えウイルスベクターでありうる。適当な組換えウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ポックスウイルスベクターまたはパルボウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない（Kestlerら 1999 Human Gene Ther 10(10):1619-32を参照されたい）。ウイルスベクターの場合には、NOIの投与は標的細胞のウイルス感染によりもたらされる。
標的化ベクター
「標的化ベクター」なる語は、細胞に感染またはトランスフェクトまたは形質導入する能力あるいは宿主および／または標的細胞内で発現される能力が宿主被験体内の特定の細胞型（通常は、共通のまたは類似した表現型を有する細胞）に限定されているベクターを意味する。
発現ベクター
好ましくは、ベクター内に挿入された本発明のNOIは、宿主細胞によるEOIの発現をもたらしうる制御配列に機能しうる形で連結されている。すなわち、該ベクターは発現ベクターである。宿主細胞により産生された物質は、使用したNOIおよび／またはベクターに応じて、分泌されうるかまたは細胞内に含有されうる。当業者により理解されるとおり、NOIを含有する発現ベクターは、特定の原核細胞膜または真核細胞膜を介したEOIの分泌を導くシグナル配列を伴ったものとして設計されうる。
融合タンパク質
得られるCMI応答を更に増強および／または強化するために、本発明のNOIは、EOIに融合したアジュバントおよび／または生物応答修飾物質および／または免疫調節物質を含む融合タンパク質として発現されうる。生物応答修飾物質は、CMI応答の普遍的促進をもたらすという意味でアジュバントとして作用しうる。EOIは生物応答修飾物質のアミノまたはカルボキシ末端に結合されうる。
エピトープを含むタンパク質
該タンパク質配列はエピトープ配列と同じでありうる（すなわち、NまたはC末端にいずれの付加配列をも伴わない）。該タンパク質は、典型的には、単離または精製された形態（例えば、非細胞形態）である。該タンパク質は、典型的には、8〜400アミノ酸、例えば10〜300または15〜150アミノ酸の長さを有する。
NOIおよびタンパク質の投与
NOIまたはタンパク質は、単独でまたは組成物の一部として、種々の異なる経路により投与することが可能である。特定の組成物には特定の経路が好ましいかもしれない。なぜなら、それは、より有効なCMI応答の生成をもたらしたり、あるいは副作用を誘発する可能性がより低かったり、あるいは投与がより容易であるからである。ワクチン組成物の投与経路は、予防または治療すべき病原体または感染の種類に応じて様々となりうる。
NOIまたはタンパク質は、全身経路または粘膜経路または経皮経路により投与することが可能であり、あるいはそれは、特定の組織（例えば、肝臓、骨髄、または癌治療の場合には腫瘍）内に直接的に投与することが可能である。本明細書中で用いる「全身投与」なる語は任意の非経口投与経路を包含するが、これに限定されるものではない。特に、非経口投与には、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内または胸骨内注射、静脈内、動脈内または腎透析注入技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、全身的非経口投与は筋肉内注射である。
該方法の1つの好ましい実施形態においては、皮膚を介して、例えば経皮経路により、NOIまたはタンパク質を投与する。任意の受け入れられている免疫化の様式および経路を用いても本発明による幾つかの利点を得ることが可能であると考えられるが、後記実施例は経皮NOI投与による格別な利点を示している。これに関しては、理論により束縛されるものではないが、経皮投与は免疫系の細胞性部門をより効率的に活性化するため、経皮投与が好ましいと考えられる。
「経皮」送達なる語は、皮内（例えば、真皮または表皮内）、経皮（例えば、「皮膚経由（percutaneous）」）および経粘膜投与、すなわち、皮膚または粘膜組織の内部へのまたはそれらを通した抗原の通過による送達を意味する。例えば、Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, HadgraftおよびGuy (編), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, RobinsonおよびLee (編), Marcel Dekker Inc.,(1987); ならびにTransdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, KydonieusおよびBerner (編), CRC Press, (1987)を参照されたい。したがって、該用語は、米国特許第5,630,796号に記載されているような粒子送達装置（例えば、無針シリンジ）を使用した物質の運搬、および米国特許第5,865,796号に記載されているような粒子媒介運搬装置を使用した物質の送達を包含する。
本明細書中で用いる「粘膜投与」なる語は、経口、鼻腔内、膣内、直腸内、気管内、腸内および眼内投与を含むが、これらに限定されるものではない。
RSV、インフルエンザウイルスおよび風邪ウイルスのような環境病原体、または牧草およびブタクサ花粉ならびにハウスダストダニのようなアレルゲンへの自然暴露に対する防御には、粘膜経路、特に鼻腔内、気管内および眼内経路が好ましい。CMI応答の増強は、後に遭遇する標的抗原、例えばアレルゲンまたは微生物物質に対する防御効果を増強するであろう。
本発明の方法の1つの実施形態においては、第1および／または第2および／または後続の免疫化の投与のすべてが、同じリンパ節に流れ込む部位に対するものである。
本発明のもう1つの好ましい実施形態においては、NOIまたはタンパク質は、宿主被験体から単離された細胞に投与することが可能である。この好ましい実施形態においては、好ましくは、腫瘍関連抗原（TAA）由来のEOIをコードするNOIをプロ抗原提示細胞（APC）、例えば樹状細胞に投与する。APCを宿主被験体から取り出し、ex vivoで改変してEOIを発現させ、ついで該宿主被験体に再導入して、該TAAに対する増強されたCMI応答を誘導して抗腫瘍応答を惹起することが可能である。樹状細胞は、増強されたCMI応答を刺激するための最も強力なAPCであると考えられている。なぜなら、増強されたCMI応答を誘導するためには、発現されたEOIがプロAPCにより獲得されプロセシングされT細胞（Th1およびTh2ヘルパー細胞ならびにCD8+T細胞の両方）に提示されなければならないからである。もう1つの実施形態においては、宿主被験体からの癌細胞をin situまたはin vitroで改変することが可能である。
NOI粒子の投与
NOIまたはタンパク質製剤を送達するための粒子媒介方法は当技術分野で公知である。したがって、前記NOIを調製し適切に精製したら、それを当技術分野において公知の種々の技術を用いてコア担体粒子上にコーティング（コート化）することが可能である。担体粒子は、遺伝子銃装置からの細胞内送達に典型的に使用される粒径の範囲内で適当な密度を有する物質から選択される。もちろん、最適な担体粒径は標的細胞の直径に左右される。
「コア担体」は、ゲスト（guest）核酸（例えば、DNA、RNA）分子が粒子媒介技術（例えば、米国特許第5,100,792号を参照されたい）を用いて送達されうるよう、細胞膜通過に必要とされる推進力を得るために十分に高い密度および一定の粒径を与えるために該ゲスト核酸がコーティングされた担体を意味する。コア担体には、典型的には、タングステン、金、白金、フェライト、ポリスチレンおよびラテックスのような物質が含まれる。例えば、Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N.編, Oxford University Press, New York, NY p.10-11を参照されたい。タングステンおよび金粒子が好ましい。タングステン粒子は直径0.5〜2.0μmの平均サイズで容易に利用可能である。金粒子または微晶質金（例えば、Engelhard Corp., East Newark, NJから入手可能な金粉末A1570）も本発明に有用である。金粒子はサイズの均一性（Alpha Chemicalsからは1〜3μmの粒子サイズで入手可能、あるいはDegussa, South Plainfield, NJからは0.95μmを含む粒子サイズで入手可能）を示す。微晶質金は、典型的には0.5〜5μmの範囲の一様でない粒径分布を示す。しかし、微晶質金の不規則な表面積は、核酸での非常に効率的なコーティングをもたらす。
金またはタングステン粒子上へNOIまたはタンパク質をコーティングしまたは沈殿させるための多数の方法が公知であり既に記載されている。そのような方法のほとんどにおいては、一般には、所定量の金またはタングステンをプラスミドDNA、CaCl2およびスペルミジンと一緒にする。得られた溶液を該コーティング操作中に連続的にボルテックスして、該反応混合物の均一性を確保する。NOIの沈殿後、コート化粒子を適当な膜に移し、使用前に乾燥させ、サンプルモジュールまたはカセットの表面上にコーティングし、あるいは個々の遺伝子銃装置において使用する送達カセット内に充填することが可能である。
「粒子送達装置」は、通常の針を用いて皮膚に孔をあけること無しに経皮的に粒子組成物を送達する装置を意味する。本発明で使用する粒子送達装置は本明細書の全体にわたり記載されている。粒子媒介送達に適した種々の粒子加速装置が当技術分野において公知であり、すべて、本発明の実施における使用に適している。現在の装置設計においては、コート化担体粒子を標的細胞に噴射するために爆発型、電気式またはガス式発射を用いる。コート化粒子自体は、移動可能な担体シートに、遊離可能な様態で結合していたり、あるいはガス流が通過する表面に、遊離可能な様態で結合しており、該表面から粒子を上昇させ、それを標的に向けて加速することが可能である。ガス式発射装置の一例は米国特許第5,204,253号に記載されている。爆発型装置は米国特許第4,945,050号に記載されている。ヘリウム発射型粒子加速装置の一例として、PowderJect XR装置（PowderJect Vaccines, Inc., Madison, WI）が挙げられ、この装置は米国特許第5,120,657号に記載されている。本発明での使用に適した電気式発射装置は米国特許第5,149,655号に記載されている。これらの特許のすべての開示を参照により本明細書に組み入れることとする。
あるいは、粒子状NOIまたはタンパク質組成物は、無針シリンジ装置を使用して経皮的に投与することが可能である。例えば、本発明のNOIを含む粒子状組成物を、一般的な薬学的方法、例えば単なる蒸発（結晶化）、真空乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥を用いて得ることが可能である。所望により、共有されている国際公開番号WO 97/48485（それを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載の技術を用いて、該粒子を更に高密度化することが可能である。ついで、これらの粒子状組成物は、例えば国際公開番号WO 94/24263、WO 96/04947、WO 96/12513およびWO 96/20022（それらのすべてを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているような無針シリンジ系から送達されうる。前記の無針シリンジ系からの、抗原またはアレルゲンを含む粒子の運搬は、典型的には、一般には0.1〜250μmの範囲、好ましくは約10〜70μmの範囲の概算サイズを有する粒子で実施される。約250μmより大きな粒子も該装置から送達することが可能であり、上限は、該粒径が皮膚細胞に不都合な損傷を引き起こす時点である。送達された粒子が標的表面を透過する実際の距離は、粒径（例えば、ほぼ球状の粒子形状を仮定した場合のみかけの粒径）、粒子密度、粒子が該表面に衝突する初速度ならびに標的皮膚組織の密度および動粘度に左右される。この場合、無針注射において用いる最適粒子密度は、一般には約0.1〜25g/cm3、好ましくは約0.9〜1.5g/cm3であり、注入速度は、一般には約100〜3,000m/秒の範囲である。適当な気圧で、10〜70 Rmの平均径を有する粒子を、ノズルを介して、推進気流の超音速に近い速度で加速することが可能である。
粒子状組成物またはコート化粒子は、剤形に適した様態で且つ本発明の目的に有効な量で個体に投与される。送達すべき組成物の量は、試験すべき個体に応じて決まり、例えば、抗原またはアレルゲン約0.1mg〜1mg、より好ましくは1〜50μgである。厳密な必要量は、治療すべき個体の年齢および全身状態に応じて様々であり、当業者は、本明細書を読めば、適当な有効量を容易に決定しうるであろう。
WO 93/17706およびTangら, Nature (1992)356:152に記載されているとおり、金およびタングステン微粒子も輸送剤として使用することが可能である。この特定の場合には、塩化カルシウムおよびスペルミジンの存在下、NOIを微粒子上に沈殿させ、ついでその全体を、米国特許第4,945,050号および第5,015,580号ならびにWO 94/24243に記載されているような無針装置を使用して高速噴射により真皮内または表皮内に投与する。宿主被験体にワクチン接種するのに使用しうるNOIの量は、例えば、抗原を発現させるために使用するプロモーターの強度、発現産物の免疫原性、投与が意図される哺乳動物の状態（例えば、体重、年齢および全身健康状態）、投与方法および製剤のタイプのような多数の要因に左右される。一般に、ヒト種の成人における予防用または治療用の適当な用量は約1pg〜約5mg、好ましくは約10pg〜約1mg、最も好ましくは約25pg〜約500pgである。粒子媒介送達技術は他のタイプのNOI投与と比較して、著しく優れていることが判明している（Fynanら (1995) Int. J. Immunopharmacology 17:79-83, Fynanら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482およびRazら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523）。そのような研究で、表皮および筋肉組織の両方への、核酸に基づくワクチンの粒子媒介送達が調べられた。遺伝子銃で著しくより良好な結果が得られた1つの考えられうる理由は、筋肉内注射による細胞外送達とは対照的に、NOIが細胞内に送達されることである。
好ましくは、標的抗原（TA）の投与間の間隔は約48時間〜約192時間の範囲である。より好ましくは、標的抗原（TA）の投与間の間隔は約72時間〜約168時間の範囲である。より一層好ましくは、標的抗原（TA）の投与間の間隔は約72時間〜約144時間の範囲である。
宿主哺乳類被験体
本明細書中で用いる「宿主哺乳類被験体」は、脊索動物亜門（subphylum cordata）の任意のメンバー、例えば、限定的なものではないがヒトおよび他の霊長類、例えば非ヒト霊長類、例えばチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種；農場動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ；家庭哺乳動物、例えばイヌおよびネコ；実験用動物、例えばげっ歯類、例えばマウス、ラットおよびモルモット；鳥類、例えば家禽、野生および競技用鳥類、例えばニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽鳥類、アヒル、ガチョウなどを意味する。好ましい動物には、スポーツにおいて用いられる動物、例えば競争馬または障害飛越馬が含まれる。
該用語は特定の年齢を示すものではない。したがって、成体および新生個体の両方が含まれると意図される。本明細書に記載の方法は、前記の任意の脊椎動物種における使用を意図したものである。なぜなら、これらの脊椎動物のすべての免疫系は同様に作動するからである。哺乳動物の場合には、被験体は好ましくはヒトであるが、家畜、実験用動物または愛玩動物であってもよい。
予防および／または治療
本発明のこの方法またはプロセスはワクチン接種方法に広く適用可能であり、予防用および／または治療用ワクチン（免疫治療用ワクチンを含む）の開発に重要である。本明細書における治療に対する全ての言及は治療的、緩和的および予防的処置を含むと理解されるべきである。
本発明の方法においては、本明細書中に記載のNOIまたはタンパク質は、限定されるものではないが、医薬組成物またはワクチン組成物または免疫治療用組成物のような組成物の一部として単独で使用して、T細胞性免疫障害を予防および／または治療することが可能である。NOIまたはタンパク質あるいはNOIまたはタンパク質を含む組成物の投与は「予防」または「治療」用でありうる。本明細書中で用いる「治療」または「療法」は以下のすべてを含む：感染または再感染の予防、症状の軽減または消失、および病原体の減少または完全な排除。治療は予防的（感染前）または治療的（感染後）に行うことが可能である。
予防または治療は、NOIに対する有効なCMI免疫応答を惹起すること、および／または、T細胞性免疫障害により生じた症状および／または合併症を改善、軽減、治癒または少なくとも部分的に阻止することを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の組成物は、予防的に投与される場合には、典型的には、任意の症状の発現前に投与される。本発明のNOIまたは組成物の予防的投与は、いずれかの後続の感染または疾患を予防または改善することである。本発明のNOIまたは組成物が、治療的に投与される場合には、典型的には、感染または疾患の症状の開始時（またはその直後）に投与される。したがって、本発明の組成物は、病原因子または疾病状態への予想される暴露の前あるいは感染または疾患の開始後に投与されうる。
NOIまたはタンパク質（単独または組成物の一部として）の投与を予防的に行うのか治療的に行うのかどちらがより適当であるかは、通常は、疾患の性質によるであろう。例えば、本発明の免疫治療用組成物は、腫瘍細胞またはその抗原成分でのワクチン接種により腫瘍免疫を能動的に誘導するための免疫療法プロトコールにおいて使用しうるであろう。この場合には後者の治療形態が有利である。なぜなら、その免疫は持続的であり、また、腫瘍を消失させるための最良の方法の1つは強力で特異的な抗腫瘍CTL応答を誘導することであると一般に考えられているからである。一方、ワクチン組成物は、必ずしも必要ということではないが、好ましくは、標的抗原に関連した、後に遭遇する抗原またはその一部（例えば、エピトープ）に対する有効なCMI応答を誘導するために予防的に使用される。
予防的または治療的に有効な量
本発明において宿主被験体に投与されるNOIまたはタンパク質の用量は、やがて該被験体において有益な予防的または治療的CMI応答をもたらすのに十分なものであるべきである。
本明細書中で用いる「予防的または治療的に有効な量」なる語は、特定の標的抗原の1以上のEOIに対する増強されたCMI応答を惹起し、および／または、T細胞性免疫障害のような疾患からの症状および／または合併症を改善、軽減、治癒または少なくとも部分的に阻止するのに十分な投与量を意味する。
投与
予防または治療は、複数の時点におけるまたは単独の時点における1回の直接投与により達成されうる。また、投与は単一または複数の部位に対して行われうる。点眼剤による粘膜投与のようないくつかの投与経路はより高い用量を要しうる。当業者は、個々の送達経路に適合するように投与量および濃度を調節することが可能である。好都合にも、実施例は、NOIまたはNOIを含む組成物の1回の投与が、通常は、増強されたCMI応答を達成するのに十分であることを示している。
状態および疾患
本発明の方法は増強されたCMI応答を惹起するため、該方法は、ウイルス、細菌、寄生虫または他の感染因子のような病原体による後続の感染を防御するために使用することが可能である。好ましくは、標的抗原は病原体、または感染症、アレルゲンもしくは癌に関連した抗原である。感染症の具体例には、ウイルス、細菌、放線菌および寄生虫による疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。アレルゲンの具体例には、植物花粉、塵埃ダニタンパク質、動物の鱗せつ、唾液および真菌胞子が含まれるが、これらに限定されるものではない。腫瘍関連抗原（TAA）の具体例には、生腫瘍細胞または照射された腫瘍細胞、腫瘍細胞抽出物、および腫瘍抗原のタンパク質サブユニットが含まれるが、これらに限定されるものではない。また、該抗原は、避妊において使用するための精子タンパク質でありうる。いくつかの実施形態においては、該抗原は環境抗原である。環境抗原の具体例には、呼吸器合胞体ウイルス（「RSV」）、インフルエンザウイルスおよび風邪ウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。粘膜を介して侵入する病原体には、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザその他による上気道の病的状態を引き起こすもの、および腸感染症を引き起こす因子も含まれる。
増強されたCMI応答が重要である他の疾患の幾つかの公知具体例としては以下のものが挙げられる：ウイルス、例えば限定的なものではないがHIV、単純ヘルペスウイルス、帯状ヘルペスウイルス、C型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、エプスタインバーウイルス、麻疹ウイルス、デングウイルス、HTLV-1およびヒトパピローマウイルス（HPV）（例えば、HPV 16）により引き起こされる感染および疾患；細菌、例えば限定的なものではないが結核菌（Mycobacterium tuberculosis）およびリステリア属種（Listeria sp）、クラミジア（Chlamydia）、マイコバクテリア（Mycobacteria）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium Falciparum）、レジオネラ（Legioniella）ならびに腸管病原性、腸管毒素原性、腸管組織侵入性、腸管出血性および腸管凝集性大腸菌（E. coli）により引き起こされる疾患、ならびに病原性原虫、例えば限定的なものではないがマラリア、バベシア（Babesia）、住血吸虫（Schistosoma）、トキソプラズマ（Toxiplasma）およびイヌ回虫（Toxocara canis）によりまたは寄生原虫トキソプラズマ（Toxoplasma）およびトリパノソーマ（Trypanosoma）により引き起こされる疾患。さらに、本明細書に記載の投与計画は、T細胞応答が防御的役割を果たすタイプの癌に対する免疫化において重要であると予想される。本発明の方法および組成物を使用して治療されうる哺乳動物の癌の具体例には、黒色腫、転移癌、腺癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝癌、結腸癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、膀胱癌、腎癌、膵臓癌などが含まれるが、これらに限定されるものではない。1つの実施形態においては、癌は、例えばHPV（例えば、HPV 16）に関連づけられている（例えば、それにより引き起こされる）癌である。そのような癌は子宮頚癌でありうる。
癌
1つの好ましい実施形態においては、本発明の方法における、腫瘍関連標的抗原（TAA）由来のEOI（またはエピトープを含むタンパク質）をコードするNOIの使用は、癌治療に対する標的化抗原特異的ワクチンの開発を可能にする。TAA由来のEOIをコードするNOIおよび場合によっては免疫調節分子をコードするNOIの投与は、癌発生のリスクが増加している宿主被験体における予防（予防的免疫化）、初回手術後の疾患再発の予防（抗転移ワクチン接種）の点で、またはin vivoでT細胞数を増大させて散在性腫瘍の根治におけるそれらの有効性を向上させるための手段として（確立した疾患の治療）、特異的に増強されたCMI応答を惹起するための強力な系を与える。さらに、本発明の方法は、腫瘍保持者に再導入する前のex vivoでの細胞の処理（養子免疫療法としても知られる）により、宿主被験体における増強されたCMI応答を惹起するために使用することが可能である。本発明の方法またはプロセスを使用して、黒色腫のような癌のいずれかの証拠が現れる前に宿主被験体にNOIを投与することが可能であり（= 予防的ワクチン接種）、あるいは黒色腫のような癌に罹患した哺乳動物における疾患の退縮をもたらすことが可能である（治療的または免疫治療的ワクチン接種）。
1つの実施形態においては、NOIはHPV（例えば、HPV 16）由来の抗原（例えば、E6またはE7）をコードしている。
活性化T細胞
他の態様においては、本発明は活性化T細胞の製造方法に関する。その最も一般的な意味においては、この方法は、T細胞応答の増強の点でCMI応答を増強しうる標的抗原の予め選択されたEOIをコードするNOIを宿主被験体に投与する（好ましくは経皮的に投与する）ことを含む。本発明のこの態様においては、将来の使用のために、宿主のリンパ節からT細胞を回収する。
特異的活性化T細胞の多くの潜在的用途が予想される。例えば、ヒトに対する治療の場合には、特異的活性化T細胞をex vivoで培養し、ウイルス感染または癌患者の治療のためにヒトに投与することが可能であると予想される。本発明のこの態様においては、NOIをin vivoで投与し、ついでT細胞を単離して適当な生物応答修飾物質および／または免疫調節物質および／またはアジュバント（例えば、ペプチド、サイトカインおよび抗原提示細胞などであるがこれらに限定されるものではない）の存在下でin vitroで増殖させることにより、T細胞を製造することが可能である。
ホモログ
本発明で使用するタンパク質（タンパク質抗原を含む）、例えばGag、nefおよび／またはRT（NOIによりコードされている）は、天然に存在する形態に対する相同性および／または配列同一性を有しうる。同様に、そのようなタンパク質を発現しうるNOIコード配列は、一般には、天然に存在する配列に対する相同性および／または配列同一性を有するであろう。核酸およびアミノ酸の「配列同一性」を決定するための技術も当技術分野で公知である。典型的には、そのような技術は、遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列を決定しおよび／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定し、これらの配列を第2のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。
一般に、「同一性」は、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれのヌクレオチド 対 ヌクレオチドまたはアミノ酸 対 アミノ酸の正確な対応を指す。2以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）を、それらの「同一性（％）」を測定することにより比較することもできる。2つの配列の同一性（％）は、核酸配列の場合もアミノ酸配列の場合も、2つのアライン（整列）された配列間の厳密なマッチの数を、短いほうの配列の長さで割り、100を掛けたものである。
核酸配列に関するおおよそのアライメントは、SmithおよびWaterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムにより得られる。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O.Dayhoff編, 5 suppl.3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAにより開発されGribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)により標準化されたスコアリングマトリックスを使用することにより、アミノ酸配列に適用されうる。配列の同一性（％）を決定するためのこのアルゴリズムの典型的な実行は、Genetics Computer Group（Madison, WI）により「BestFit」ユーティリティーアプリケーションにおいてもたらされる。この方法のデフォルトパラメーターは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995)（Genetics Computer Group, Madison, WIから入手可能)に記載されている。本発明の場合に同一性（％）を確立するための好ましい方法は、University of Edinburghが著作権を有しJohn F. CollinsおよびShane S. Sturrokにより開発されIntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)により頒布されたプログラムのMPSRCHパッケージを使用することである。
このパッケージ一式から、Smith-Watermanアルゴリズムを使用することが可能であり、この場合、該スコアリング表にはデフォルトパラメーター（例えば、12のギャップオープンペナルティー、1のギャップ伸長ペナルティーおよび6のギャップ）を使用する。得られたデータからは、「Match（マッチ）」値が「配列同一性」を表す。配列間の同一性（％）または類似性（％）を計算するための他の適当なプログラムが当技術分野において一般に公知であり、例えば、別のアライメントプログラムとしてBLASTが挙げられ、これはデフォルトパラメーターで使用される。例えば、以下のデフォルトパラメーターを使用して、BLASTNおよびBLASTPを使用することが可能である：遺伝暗号 = 標準；フィルター = 無し；鎖 = 両方；カットオフ = 60；期待値 = 10；マトリックス = BLOSUM62；記載 = 50配列；ソート = HIGH SCORE；データベース = 非冗長, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS翻訳 + Swissタンパク質 + Spupdate + PIR。これらのプログラムの詳細はインターネットアドレスhttp://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLASTにおいて見出されうる。
あるいは、相同領域間で安定な二本鎖を形成する条件下のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびそれに続く一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化および該消化断片のサイズ決定により、相同性を決定することが可能である。2つのDNAまたは2つのポリペプチド配列は、前記方法を用いて決定した場合に、該分子の一定の長さにわたりそれらの配列が少なくとも約80％〜85％、好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約95％〜98％の配列同一性を示す場合に、互いに「実質的に相同」である。
また、本発明で用いる実質的に相同、または相同とは、特定のDNAまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列に関するものである。実質的に相同または相同なDNA配列は、例えばその特定の系に関して定められるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において特定することが可能である。例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50％ ホルムアミド、5×デンハルト液、5×SSC、、0.1％ SDSおよび100pg/ml 変性サケ精子DNAを含み、該洗浄条件は、37℃での2×SSC、0.1％ SDSおよびそれに続く68℃での1×SSC、0.1％ SDSを含みうる。適当なハイブリダイゼーション条件を定めることは当技術分野における技量の範囲内である。
アッセイ方法
本発明の方法の有効性は、（i）本明細書に記載のNOIを宿主被験体（例えば、ヒト被験体または実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、アカゲザルまたはチンパンジー）に投与し、（ii）ついで該宿主被験体からの血液、脾臓または他のリンパ系組織から細胞を集め、（iii）活性化T細胞（例えば、感染因子の成分を産生する細胞を殺すかまたは細胞溶解させるよう感作されたT細胞）の存在に関して該組織を試験する工程により、試験することが可能である。
NOIの投与を行ったら、宿主被験体のリンパ系組織からT細胞を回収する。好ましいリンパ系組織はリンパ節組織、最も好ましくは、NOI投与部位の近傍の排出性リンパ節からの組織である。本明細書中で用いる「近傍の節」なる語は、NOI投与部位の近位に位置する節を意味すると意図される。
そのような節は、物理的にNOI投与部位の近くに位置し、または投与部位から流出する領域内に位置し、物理的に投与部位からかなり遠い距離にある排出節も含む。
アッセイ方法の最終工程は、T細胞が活性されたかどうかを判定することを含む。典型的には、放射性クロム放出アッセイもしくは他の放射性同位体アッセイまたは単細胞アッセイを含む（これらに限定されるものではない）アッセイにより、T細胞活性化のレベルを測定することが可能である。また、生体染色および／またはセルソーターを使用する単細胞T細胞アッセイを用いることが可能である。T細胞の活性化の測定のための好ましい方法は、殺細胞に有効な量のT細胞を、自身の細胞表面上に候補EOIを提示したMHC適合標的細胞と接触させ、該T細胞が該標的細胞を細胞溶解するのに十分な時間にわたって該接触を維持し、該標的細胞のT細胞媒介細胞溶解の度合を測定することを含む。しかし、特異的T細胞応答を検出しうる任意の方法、例えば限定的なものではないがクロム放出アッセイ、単細胞アッセイまたは更には細胞-細胞コンジュゲートの測定を用いることが可能である。
1つの実施形態においては、本発明は、T細胞応答の惹起方法の有効性を試験するためのアッセイを提供する。そのT細胞応答の惹起方法は、本明細書に記載の任意のそのような方法と同じ方法である。すなわち該方法は、（i）T細胞エピトープをコードする目的とするヌクレオチド（NOI）を投与することを各投与が含む、被験体への1〜14日間隔の少なくとも2回の投与を含む第1の免疫化、および所望により（ii）該被験体への（a）該T細胞エピトープをコードするNOIまたは（b）該T細胞エピトープを含むタンパク質の少なくとも1回の投与を含む第2の免疫化を含み、ここで、第1の免疫化の第1の投与と第2の免疫化の第1の投与との間の時間は21〜365日間であってよく、かつ、該アッセイは、該方法を哺乳動物被験体に対して行い、次いで該被験体における該エピトープに特異的な活性化または記憶T細胞のレベルを測定することを含む。
（i）初回投与により生成した活性化T細胞のレベルが基底レベルに戻る前に第1の免疫化の全ての投与を行い、（b）基底レベルへのT細胞の回復の後に第2の免疫化を行えば、より高いレベルのT細胞応答が得られると考えられる。したがって、前記のアッセイを用いて、所与のT細胞応答惹起方法が活性化T細胞のレベルに対して適当な時点で行う第1の免疫化および第2の免疫化を行うかどうかを決定することができる。1つの実施形態においては、該アッセイは、（i）第1の免疫化の投与のすべてが、第1の免疫化の第1の投与と、基底レベルへの活性化T細胞レベルの低下との間の時間内に含まれるのかどうか、および／または（ii）第2の免疫化の第1の投与が基底レベルへの活性化T細胞レベルの低下後に行われるのかどうかを判定することを含む。
他の態様
もう1つの態様においては、CMI応答の付随的増強を必ずしも惹起することなく、増強された体液性応答を選択的に惹起する方法であって、TAの1以上のEOIをコードするNOIを宿主被験体に少なくとも3回投与することを含み、ここで、各NOI投与間の時間間隔が約48時間であり、さらに、該宿主哺乳動物被験体における該または各発現されたEOIに対する増強された体液性免疫応答をもたらすのに有効なものである方法を、提供する。
もう1つの態様においては、増強された体液性応答を惹起する方法であって、TAの1以上のEOIをコードするNOIを宿主被験体に少なくとも3回投与することを含み、ここで、各NOI投与間の時間間隔は約28日であり、さらに、該宿主哺乳動物被験体における該または各発現されたEOIに対する体液性免疫応答を増強するのを助ける増強されたCMI応答をもたらすのに有効な方法を、提供する。
組成物
本発明は、T細胞媒介免疫障害の予防および／または治療に有用な組成物を提供する。1つの実施形態においては、該組成物は医薬組成物である。もう1つの好ましい実施形態においては、該組成物は免疫治療用組成物である。より一層好ましい実施形態においては、該組成物はワクチン組成物である。該組成物は、前記の本発明のTAのEOIをコードするNOIの治療的または予防的に有効な量を含みうる。該組成物は、製薬上または免疫学的に許容される担体のような担体をも含みうる。製薬上許容される担体または免疫学的に許容される担体は、1つには、投与される個々の組成物によりおよび該組成物を投与するために用いる個々の方法により決定される。したがって、本発明の医薬組成物またはワクチン組成物または免疫治療用組成物の多種多様な適当な製剤が存在する。
製剤
NOIまたはタンパク質は医薬組成物または免疫治療用組成物またはワクチン組成物に製剤化されうる。そのような製剤は、製薬上許容される担体（例えば、無菌水または無菌等張食塩水）と組み合わされたNOIまたはタンパク質を含む。そのような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で製造され包装されまたは販売されうる。注射剤は、保存剤を含有する単位剤形で、例えばアンプルまたは複数用量容器中に製造され、包装されまたは販売されうる。製剤には、懸濁剤、水剤（溶液剤）、乳剤（油性または水性ビヒクル中のもの）、ペースト剤および移植可能な徐放性または生分解性製剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような製剤は更に、限定的なものではないが懸濁化剤、安定剤または分散剤を包含する1以上の追加的な成分を含みうる。非経口投与用製剤の1つの実施形態においては、その組成物の非経口投与の前に適当なビヒクル（例えば、発熱物質非含有無菌水）で再構成するための乾燥（例えば、散剤または顆粒剤）形態で有効成分を提供する。医薬組成物は、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液または溶液の形態で製造され包装されまたは販売されうる。この懸濁液または溶液は公知技術に従い製造することが可能であり、有効成分に加えて、本明細書中に記載の分散剤、湿潤剤または懸濁化剤のような追加的な成分を含みうる。そのような無菌注射剤は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えば水または1,3-ブタンジオールを使用して製造されうる。他の許容される希釈剤および溶媒には、リンゲル液、等張食塩水および不揮発性油、例えば合成モノ-またはジ-グリセリドが含まれるが、これらに限定されるものではない。
有用な他の非経口投与可能な製剤には、有効成分を微晶質形態中にまたはリポソーム製剤中にまたは生分解性高分子系の一成分として含むものが含まれる。徐放性または移植のための組成物は、製薬上許容される高分子物質または疎水性物質、例えばエマルション、イオン交換樹脂、やや溶けにくい高分子またはやや溶けにくい塩を含みうる。
本発明はまた、標的抗原のEOIに対するCMI応答を増強するためのキットを含む。そのようなキットは、TAのEOIをコードするNOIおよび／または該エピトープを含むタンパク質を含む。該キットはまた、アジュバント、好ましくは、NOIまたはタンパク質と共にまたはその一部として投与される遺伝的アジュバント、およびNOIまたはタンパク質の投与のための説明書を含みうる。キットの他の好ましい構成要素には、NOIまたはタンパク質の投与のためのアプリケーターを含む。本明細書中で用いる「アプリケーター」なる語は、限定的なものではないが、NOIを全身的にまたは粘膜にまたは経皮的に宿主被験体に適用するための、皮下シリンジ、遺伝子銃、粒子加速装置、ネブライザー、ドロッパー、気管支鏡、坐剤、含浸性のまたは被覆された膣挿入可能な物質、例えばタンポン、圧注剤、膣洗浄用の溶液、停留浣腸剤、坐剤、あるいは直腸または結腸洗浄用の溶液を包含する任意の装置を意味する。
つぎに、実施例により本発明を更に詳しく説明することとする。実施例においては後記図面が参照される。以下の実施例は、専ら本発明を例示するために並びに本発明の製造および使用において当業者の助けとするために記載されているに過ぎない。これらの実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。用いられている数字（例えば、量、温度など）に関しては、正確さを確保するように努めたが、もちろん、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。
一般的技術
特に示さない限り、本発明において用いる組換えDNA技術は、当業者によく知られている標準的な方法である。そのような技術は、例えばJ. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984); J. Sambrookら, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989) ; T. A.Brown (編), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991); D. M. GloverおよびB. D. Hames (編), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995および1996); ならびにF. M. Ausubelら (編), Current Protocols in Molecular Biology, GreenePub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 現在までの全ての改訂を含む)のような文献の全体にわたって記載され説明されており、それらを参照により本明細書に組み入れることとする。本発明の方法は、TAの少なくとも1以上のEOIをコードするNOIを被験体の組織内に直接的にin vivo導入して、該被験体組織の細胞により該EOIを発現させることを含む。
本発明のNOI構築物は、当業者に公知の通常の方法により製造することが可能である。DNAプラスミドまたは組換えベクターの構築方法は一般的なテキスト、例えばBurgerら, J. Gen. Virol., 72: 359-367 (1991)に記載されており、当技術分野においてよく知られている。また、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; およびAusubelら, 1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New Yorkも参照されたい。
例えば、TAの1以上のEOIをコードするNOI、またはCMI応答を誘導するのに十分な程度にTAの公知EOIに相同な配列をコードするNOIは、種々の微生物からNOIを単離するための当技術分野において記載されているよく知られた方法により得ることが可能である。あるいは、TAのEOIをコードするNOIは、核酸合成装置において合成することが可能である。したがって、本発明は、TAのEOIをコードするNOIの合成形態を含む。そのような単離されたNOIを含有し、好ましくは、NOIによりコードされるTAのEOIの宿主細胞内発現を導きうる他の組換え細菌プラスミドまたはウイルスベクター、およびそのようなベクターを含有する細胞（真核細胞または原核細胞、好ましくは真核細胞）も、公知技術により製造される。プラスミドまたはウイルスベクター形態のNOIによるTAのEOIの発現を保証するために、宿主細胞内での抗原の高レベル発現を導きうるプロモーター／調節領域に、NOIを、機能しうる形で連結する。多数のそのようなプロモーター／調節配列が当技術分野において入手可能であり、それらには、例えばヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーター／エンハンサー配列、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよび他の哺乳類プロモーター／エンハンサー配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書中で用いる「プロモーター／調節配列」は、該プロモーター／調節配列に機能しうる形で連結されたNOIの発現に必要とされるDNA配列を言う。いくつかの場合には、プロモーター／調節配列が、特定の組織タイプの細胞における発現のみを駆動しうるという点で、該プロモーター／調節配列は組織特異的に機能しうる。特に示さない限り、任意の特定のプラスミドベクターまたは他のDNAベクターまたはウイルスベクターの選択は本発明における限定要因ではなく、本開示を読めば、本明細書に開示されているものの代わりに他のDNAまたはウイルスベクターを使用することが可能である。個々のプロモーター／調節配列を選択し、それらのプロモーター／調節配列を、所望の抗原をコードするDNA配列に機能しうる形で連結することは、当業者の技量の範囲に十分に含まれる。そのような技術は当技術分野でよく知られており、例えばSambrook（前掲）およびAusbel（前掲）に記載されている。
以下の一般的方法を用いて、後記実施例1〜5に記載の研究を行った。各研究においては、本発明の代表的組成物を得るために、EOIを含むNOIを金粒子上にコーティングした。該コート化粒子を動物被験体に投与し、抗原特異的T細胞応答および／または抗体応答を惹起する該組成物の能力を評価した。
コア担体粒子のコーティング
適当な重量の金粒子を1.5mL エッペンドルフチューブ内に直接的に計り取った。ついで約300μLの0.05M スペルミジン溶液を加え、該金を分散させるためにソニケーターを使用して該金を懸濁させた。ついで、当該DNAプラスミドを含有する溶液（約50μL）を該金／スペルミジン溶液に2μg DNA/mg金の濃度で加えた。該DNA溶液は1つのタイプのプラスミドを含有しうる。あるいは、特定の実験では、2以上のプラスミド（例えば、遺伝的アジュバント）を１つに混合した後、該金溶液と混合することが可能である。該DNA／金混合物を穏やかな速度でボルテックスし、300μLの10％ CaCl2溶液を、ボルテックスしながら滴下した。該DNA／金粒子を室温で沈殿させ、ついで短時間（10〜15秒間）遠心分離して該金をペレット化した。該ペレットを約800μLのEtOHで3回洗浄した。ついで該DNA／金粒子を、EtOH中に調製された0.03mg/mL PVP（ポリビニルピロリドン）溶液に、3mLのPVP溶液中約1mgのDNA／金にて懸濁させた。ついで、既に記載されているとおりに、この溶液をTefzelチューブ上にコーティングした。例えば、PCT特許出願PCT/US95/00780ならびに米国特許第5,733,600号、第5,780,100号、第5,865,796号および第5,584,807号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
B型肝炎表面抗原（HBsAg）
プラスミド（PWRG7128構築物）の構築
B型肝炎表面抗原（HBsAg）ベクタープラスミドを以下のとおりに構築した。HbsAgコード領域を作製するために、pAM6構築物（American Type Culture Collection「ATCC」から入手）をNcoIで切断し、マング・ビーンヌクレアーゼで処理してX抗原の開始コドンを除去した。ついで、得られたDNAをBamHIで切断し、T4 DNAポリメラーゼで処理して該DNAを平滑末端化し、HBsAg発現カセットを得た。該HBsAg発現カセットは1.2kBの断片として存在する。完全長ヒトCMV（Towne株）極初期プロモーター（エンハンサーを伴う）を含有するプラスミド構築物pPJV7077（Schmaljohnら (1997) J. Virol. 71:9563-9569）をHindIIIおよびBglIIで切断し、ついでT4 DNAポリメラーゼおよび子ウシアルカリホスファターゼで処理して平滑末端化DNAを得、該HBsAg発現カセットを該プラスミド内に連結してpWRG7128構築物を得た。
in vitro免疫アッセイ
ELISAアッセイを用いて、個々のマウスの血清サンプルを、HBsAgに特異的な抗体に関して試験した。ELISAのために、Falcon Pro Bindマイクロタイタープレートを、PBS（リン酸緩衝食塩水, BioWhittaker）中の0.1μg／ウェルの精製HBsAg（BioDesign）で4℃で一晩コーティングした。該プレートを5％ ドライミルク／PBSで室温（RT）で一晩ブロッキングし、ついで洗浄バッファー（10 mM Tris緩衝食塩水, 0.1％ Brij-35）で3回洗浄した。希釈バッファー（2％ ドライミルク／PBS／0.05％ Tween 20）で希釈された血清サンプルを該プレートに加え、室温で2時間インキュベートした。該プレートを3回洗浄し、希釈バッファー中で1:8000希釈されたビオチン化ヤギ抗マウス抗体（Southern Biotechnology）を該プレートに加え、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを3回洗浄し、ついで、PBSで1:8000希釈されたストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（Southern Biotechnology）を加え、該プレートを室温で更に1時間インキュベートした。さらに3回の洗浄後、プレートを3回洗浄し、ついでTMB基質溶液（BioRad）を加え、30分後に反応を1N H2SO4で停止させた。光学濃度を450nmで読み取った。該サンプルと既知力価の標準物との比較により、終点力価を計算した。
細胞性免疫アッセイには、免疫化動物の脾臓からの脾細胞の単個細胞浮遊液を、Balb/cマウスにおける既知CD8エピトープに対応するペプチドの存在下、in vitroで培養した。該ペプチドをDMSO（10mg/ml）に溶解し、培養物中10μg/mlに希釈した。該ペプチドの配列はIPQSLDSWWTSL（配列番号20）であった。
IFNγ ELISPOTアッセイには、Millipore Multiscreen膜濾過プレートを、無菌0.1M 炭酸バッファー（pH 9.6）中、50μlの15μg/ml 抗IFNγ抗血清（Pharmingen）で4℃で一晩コーティングした。プレートを無菌PBSで6回洗浄し、ついで、10％ ウシ胎児血清（FBS）を含有する組織培養培地で室温で1〜2時間ブロッキングした。該培地を除去し、脾細胞を合計1×106細胞/ウェルでウェル内に分注した。免疫化動物からの1×106個未満の細胞を加えたウェルには、ナイーブ動物からの細胞を使用して合計1×106個となるようにした。細胞を組織培養インキュベーター内で、前記ペプチドの存在下、一晩インキュベートした。ついで該プレートをPBSで2回および蒸留水で1回洗浄した。この後、PBSで3回洗浄した。ビオチン化抗IFN-γモノクローナル抗体（Pharmingen）を該プレートに加え（PBS中1μg/ml溶液 50μl）、室温で2時間インキュベートした。該プレートをPBSで6時間洗浄し、ついで50μlのストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲート（PBS中、1:1000, Pharmingen）を加え、室温で2時間インキュベートした。該プレートをPBSで6回洗浄し、アルカリホスファターゼ発色基質（BioRad）を加え、暗いスポットが現れるまで該反応を進行させた。水で3回洗浄することにより該反応を停止させた。プレートを風乾させ、スポットを顕微鏡下で計数した。
HIV-1 GP120抗原
HIV-1 GP120抗原をコードするプラスミドの構築
HIV-1 gp120をコードするプラスミドベクターを以下のとおりに構築した。該ベクターは、Bluescript（Stratagene, La Jolla, CA）プラスミドバックボーン、ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）極初期プロモーター（Fullerら (1994) Aids Res. Hum Retroviruses 10:1433）およびSV40ウイルス後期ポリアデニル化部位から構築した。hCMVプロモーターは、極初期転写開始部位の522bp上流から96bp下流までの619塩基対（bp）のAccII断片内に含有されている。SV40ウイルス後期ポリアデニル化配列は、pSV2dhfr（もともとBethesda Research Laboratories (カタログ番号5369 SS) から入手可能であった）から誘導される約800bpのBamHI-BglII断片内に含有されている。まず、「pC-Env」と称されるHIV-1 gp160をコードするプラスミドを構築した。このプラスミドは、成熟gp160アミノ末端の4位アミノ酸をコードする配列から開始する、LAV-1BRU（ATCC受託番号53069, GenBankアクセッション番号K02013）からの2565bpのKpnI-XhoI断片を含有する。該envコード配列断片を、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D（gD）シグナルペプチドと成熟gDアミノ末端の非アミノ酸とをコードする160bpの合成断片のすぐ下流に配置し、既に記載されているとおりに（Fullerら (1994) Aids Res. Hum Retroviruses 10:1433）、該合成断片にインフレームで融合させた。
ついで、本明細書中で「pCIA-Env/T」と称されるHIV-1 gp120をコードするプラスミドを以下のとおりに構築した。pCIA-Env/TプラスミドはHIV-1 gp160の末端切断型形態をコードしている。このプラスミドは、envコード配列がヌクレオチド8188位のHindIII部位において末端切断されていること以外はpC-Env構築物と同一である。これは、gp120/gp41プロセシング部位の128アミノ酸残基下流に末端切断点を有する末端切断型gp160翻訳産物を与える。
in vitro免疫アッセイ
第5週および第6.5週（それぞれ初回免疫後および追加免疫後）に集めた試料にELISAアッセイを用いて、HIV gp120抗原に対する血清抗体応答を試験した。ELISAのために、Costar高結合性EIAプレートを、4℃で一晩のインキュベーションにより、50μlのPBS中0.3μg/ウェルの組換えHIV p120（Intracel）でコーティングした。プレートを3回洗浄し、PBS中の2％ BSAで室温で2時間ブロッキングした。血清の系列希釈物を該コート化プレートに加え、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、該プレートをアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG（H+L）（BioRad）の1:1500希釈物と共にインキュベートし、ついでp-ニトロフェニルホスフェート（PNPP）（BioRad）で発色させ、405nmでODを読み取った。
脾細胞により分泌された抗原特異的IFN-γの量をサイトメトリービーズアッセイにより測定した。1×106個の脾細胞を96ウェルプレートの各ウェルに加え、培地のみにおいて（陰性対照）、または配列RIQRGPGRAFVITGK（配列番号21）を有する1μg/mlのHIV gp120ペプチドを含有する培地において刺激した。5％ CO2中、37℃で48時間のインキュベーションの後、上清を取り出し、IFN-γレベルをサイトメトリービーズアッセイ（BD Biosciences）により測定した。
HSV-2抗原
HSV-2 ICP27をコードするプラスミドの構築
ICP27をコードするDNAワクチンを構築し、ついで本アジュバントプラスミドベクターの種々の組合せと一緒にしてワクチン組成物を得た。免疫化後、免疫化動物をHSV-2ウイルスでチャレンジし、種々のワクチン組成物の防御効果を判定した。
DNA抗原プラスミドの構築に関しては、該プラスミドを構築するために標準的なPCR技術を用いた。該ベクターの構築に用いた標準的なPCR条件は以下のとおりであった：1.5 mM MgCl2を加えた1×PCRコアバッファー (Promega Corp., Madison, WI); 0.400μMの各プライマー; 200μMの各dNTP (USB Inc., Cleveland, OH); 2.5μgのTaqポリメラーゼ (Promega Corp., Madison, WI); 1.0 ngの鋳型DNA; 100μlまでの水; および鉱油(Aldrich Chemical Inc., Milwaukee WI)重層。PTC-200サーモサイクラー（MJ Research Inc., Waltham, MA）を、以下の手順で運転するように設定した: 95℃で4分; (95℃で1分/ 55℃で1分15秒/ 72℃で1分)の30サイクル; 72℃で10分; 4℃で保持。QIAquick7 PCR Purification Kit（Qiagen Inc., Valencia CA）を使用して増幅産物をPCR反応から取り出した後、それを制限酵素（New England Biolabs, Beverly, MA）で切断した。
より詳しくは、HSV-2初期ICP27抗原をコードするDNAワクチンプラスミドベクターを以下のとおりに構築した。HSVは、約150〜160kbpのゲノムを有する二本鎖DNAウイルスである。ウイルスゲノムは、膜で包まれた二十面体ヌクレオカプシド内にパッケージングされる。該膜（またはエンベロープ）は少なくとも10個のウイルスコード化糖タンパク質を含む。そのうちで最も豊富なのはgB、gC、gDおよびgEである。また、該ウイルスゲノムは、約5個の極初期抗原の一群を含む70を超える他のタンパク質をコードしている。これらの初期タンパク質は該ウイルス複製サイクルの初期において合成され、該ウイルスのライフサイクルの後期においてのみ産生されるエンベロープ糖タンパク質とは対照的である。HSVの分子構造および体制の総説としては、例えば、RoizmanおよびSears（1996）“Herpes simplex viruses and their replication”, Fields Virology, 3rd ed., Fieldsら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PAを参照されたい。HSV-2 ICP27抗原は、HSV-2ゲノム、例えば、HSV-2ゲノムのヌクレオチド約114589-134980に及ぶゲノム領域またはHSV-2ゲノムのヌクレオチド110931-139697に及ぶEcoRI断片から容易に入手されうる。HSV-2ゲノムの配列は、公開されている入手元、例えば、アクセッション番号NC 001798でGenBankに寄託されている配列から入手可能である。
本研究で使用するICP27ベクターを構築するために、ICP27コード領域を、プライマー: 5'CGCC ACT CTC TTC CGA CACC3' (配列番号25) および5'CCAA GAA CAT CAC ACG GAA CC3' (配列番号26) を使用するHSV-2ゲノムからPCRして、ICP27コード領域に対応するHSV-2のヌクレオチド配列114523-116179（GenBank）を含有するヌクレオチド断片を得た。ついで該ICP27断片をpTargetベクター（Promega Corp., Madison, WI）のマルチクローニング領域中にクローニングした。
PJV7630プラスミドの構築
pPJV7630の抗原遺伝子の起源は、コスミド23と称されるコスミドベクター内にクローニングされたHSV-2株MSのゲノム断片である。コスミド23は、公開配列（HG52株）に基づけばヌクレオチド110,931-147,530に及ぶHSV-2からの3個のEcoRI断片から構成されていた。コスミド23をEcoRIで部分消化し、再連結し、約28,000bpの断片（110,931-139,697）のみを有する構築物を選択した。この分子をOP23と命名した。OP23内の配列を改変するために、この分子に6つの修飾を施した。これらは、HSV-2配列からの非極初期遺伝子およびバックボーンDNAを除去するように設計した。1つの最終的な修飾は、該バックボーン配列を、臨床用の適当な抗生物質耐性遺伝子で置換することであった。この工程を以下に説明する。
1．Bst1107IおよびScaI消化および再連結（アンピシリン耐性遺伝子を除去する）。OP23-1を作製する。
2．NsiI消化および再連結によりSV40複製起点を除去する。OP23-2を作製する。
3．BstXI部分消化および再連結によりICP27とICP0との間の領域を除去してOP23-3を作製する。
4．BspHIでの完全消化およびそれに続くBsiWIでの部分消化およびそれに続く再連結により、ICP22遺伝子の後の配列およびいくつかのバックボーン配列を除去する。OP23-4を作製する。
5．SrfI消化および再連結によりOP23-5を作製する。ICP4およびICP0との間の配列を除去する。
6．BstXIでの全消化および再連結によりOP23-6を作製する。ICP27とICP0との間から小さな断片を除去する。
7．抗生物質耐性遺伝子をコードするバックボーン配列を、カナマイシン耐性遺伝子を含有する断片で置換して、pPJV7630を作製する。
構築物pPJV7630は大きく（19517塩基）、それは、ICP0、ICP4、ICP22およびICP27極初期抗原をコードする遺伝子を含有する。
in vitro免疫アッセイ
マウス
単細胞浮遊液をマウス脾臓から得た。脾臓をメッシュを通して搾り出して単細胞浮遊液を得、ついで細胞を沈降させ、ACKバッファー（Bio Whittaker, Walkersville MD）で処理して赤血球を細胞溶解した。ついで該細胞を、HEPES、1％ グルタミン（Bio Whittaker）および5％ 熱不活化ウシ胎児血清（FCS, Harlan, Indianapolis IN)を補充したRPMI 1640培地内で2回洗浄した。細胞を計数し、5％ 熱不活化FCS、50μM メルカプトエタノール（Gibco-BRL, Long Island NY）、ゲンタマイシン（Gibco-BRL）、1mM MEM ピルビン酸ナトリウム（Gibco-BRL）およびMEM非必須アミノ酸（Sigma, St. Louis MO）を補充した、HEPESおよび1％ グルタミンを含有するRPMI 1640よりなる「全」培地内に、適当な濃度となるよう再懸濁させた。CD8特異的アッセイのために、既知CD8エピトープに対応するペプチドの存在下、細胞をin vitroで培養した。BALB/CマウスにおけるICP27の場合には、該ペプチドの配列はHGPSLYRTF（QCB Inc）であった。ペプチドをDMSO中に調製し（10mg/ml）、培地中に10μg/mlに希釈した。
IFN-γ ELISPOTアッセイには、Millipore Multiscreen膜濾過プレートを、無菌0.1M 炭酸バッファー（pH 9.6）中、50μlの15μg/ml 抗IFN-γ抗血清（Pharmingen）で4℃で一晩コーティングした。プレートを無菌PBSで6回洗浄し、ついで、10％ ウシ胎児血清（FBS）を含有する組織培養培地で室温で1〜2時間ブロッキングした。該培地を除去し、脾細胞を合計1×106細胞/ウェルでウェル内に分注した。免疫化動物からの1×106個未満の細胞を加えたウェルには、ナイーブ動物からの細胞を使用して合計1×106個となるようにした。細胞を組織培養インキュベーター内で、前記ペプチドの存在下、一晩インキュベートした。プレートをPBSで2回および蒸留水で1回洗浄した。この後、PBSで3回洗浄した。ビオチン化抗IFNγモノクローナル抗体（Pharmingen）を該プレートに加え（PBS中1μg/ml溶液50μl）、室温で2時間インキュベートした。プレートをPBSで6回洗浄し、ついで50μLのストレプトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲート（PBS中、1:1000, Pharmingen）を加え、室温で2時間インキュベートした。プレートをPBSで6回洗浄し、発色基質（BioRad）を加え、暗いスポットが現れるまで該反応を進行させた。水で3回洗浄することにより該反応を停止させた。プレートを風乾させ、スポットを顕微鏡下で計数した。
in vivoアッセイ
マウス
種々の免疫化スケジュールの、HSV-2での致死性チャレンジからマウスを防御する能力を試験するために、感染チャレンジモデルを使用した。チャレンジ前にマウスを免疫化し、感染のために、該マウスを麻酔し、30μLのPBS中の致死量のHSV-2を該マウスの鼻腔内に投与した。感染後の20日間にわたってマウスを追跡し、病状および死亡率に関して得点化した。
in vitro免疫アッセイ
家畜ブタ
末梢血単核細胞（PBMC）を単離するために、全血を、Histopaque-1077クッションを通して室温で遠心し（3000rpmで30分間）、その勾配からバンドとしてPBMCを回収した。PBMCを全培地中で3回洗浄し、25mLの全培地に再懸濁させて計数し、全培地内に1×107細胞/mlとなるよう再懸濁させた。ELISPOTアッセイを、マウスに関して記載されているとおりに行った。ただし、この場合には、抗原は、HSV-2抗原の重複ペプチドライブラリーから誘導されたペプチドのプールであり、検出には、家畜ブタIFN-γに特異的な抗IFN抗体ペア（R&D systems）を使用した。
in vivoアッセイ
家畜ブタ
家畜ブタにおける免疫応答を調べるために用いたもう1つのアッセイは遅延型過敏症反応（DTH）アッセイであった。このアッセイでは、それぞれXR1装置および針注射を使用してブタの皮膚に送達される抗原源としてDNAプラスミドおよびタンパク質抽出物の両方を使用した。投与の48時間後、DTH反応の指標として、該抗原の送達部位の周辺の発赤（紅斑）の面積を測定した。皮膚内への抗原送達は、免疫化の完了の7日後に行った。
実施例１
マウスを免疫化するために、NOIを含む2つの異なるプラスミドを使用した。これらは、HSV-2臨床ワクチン複数遺伝子プラスミド（PJV7630）、およびHCMVプロモーターに機能しうる形で連結されたICP27 NOIを含む単一遺伝子プラスミドであった。ICP27 NOIは、PJV7630内に見出される優性エピトープをコードしており、グラフは、このタンパク質に特異的なCD8応答を表す。
NOI投与スケジュール
NOIを、1週間に1、2または4回、すなわちそれぞれ第7日（D 7）、第0および7日（D 0, 7）または第0、2、4および7日（D 0, 2, 4, 7）に、投与した。NOIの1投与当たり1回または2回の適用を行い、1つの群においては、LTアジュバントをNOIと共に投与した。
結果
ICP27遺伝子は、PJV7630内に見出される優性抗原であり、図1Aおよび1Bは、この標的抗原に特異的なCD8応答を表す。典型的には、プラスミドPJV7630（図1B）およびICP27（図1A）は共に、1回のみのNOI投与の後には細胞100万個当たり500 ELISPOTを与え、2回のNOI投与の後には細胞100万個当たり1500 ELISPOTを与えている。2回のNOI投与をLT遺伝的アジュバントと共に行った場合には、約3500 ELISPOTが認められる。4回のNOI投与の後には、LTアジュバントの非存在下でさえも、細胞100万個当たり3500を超えるELISPOTが得られたが、LT遺伝的アジュバントはまた、該応答を増強するであろう。図1Aにおいては、NOIのLT共投与における応答は、その結果が尺度外（off-scale）であったため、測定されなかった。
まとめ
PJV7630で免疫化したマウスにおいて測定したICP27特異的CD8 IFN-γ ELISPOTに基づけば、集積化（clustering）NOI投与は細胞性免疫応答の増強をもたらすことが判明した。
実施例２
以下の3つの実験の目的は、単一遺伝子プラスミドの集積化（clustered）NOI投与により生じたCMI応答の増強が致死性チャレンジからの防御の増強と相関するかどうかを評価することにあった。
方法
プラスミドPJV7630を1週間にわたってマウスに投与した。1回（第7日）、2回（第0および7日）または4回（第0、2、4および7日）のいずれかのNOI投与を1週間かけて行った。1つの群では各免疫化において2用量のPJV7630を投与したが、大部分のマウスには各免疫化において単回用量のPJV7630を投与した。
結果
グラフには、「投与回数×投与当たりの用量数」が表示されており、4×1は、各投与において単回用量で4回のNOI投与がなされた動物を表す。1週間のNOI投与の後、該動物を1週間または2週間休ませ、ついで該動物にウイルスを感染させた。ウイルスの用量はLD50の約5倍であった。
図2Aは、2週間の休止後のC57Bl/6マウスの結果を示す。この結果は、4×1スケジュール（すなわち、4回の投与×1用量/投与）がより防御的であったことを明らかに示している。この結果は用量の増加によって生じるものではないようである。なぜなら、2×2（すなわち、2回のNOI投与×2用量）も合計4用量となるからである。
図2Bは、1週間の休止後のC57Bl/6マウスの結果を示す。図2Aに示す2週間の休止の場合と実質的に同じ結果が得られたことが、図2Bから明らかである。しかし、図2Bにおいては、ただ1回のNOI投与を受けた追加的な群が示されている。
図2Cは、1週間の休止後のBalb/cマウスの結果を示す。該チャレンジは、死亡率における明らかな相違を得るほど十分には高くなかったが、病状における相違は認められたことが、この結果から明らかである。括弧内の数字は病状スコアであり、数字が大きければ大きいほど、動物の病状は重くなる。この結果は、4×1（すなわち、4回の投与×1用量）が最良の防御をもたらすことを示している図2Aおよび2Bからの結果と一致している。
まとめ
4回の投与×1用量/投与の1週間内の集積化（clustering）は、単回投与よりも、または1投与当たりより多用量を用いた場合よりも、より強力な強防御性CMI応答を迅速に生成する。
実施例３
この実験の目的は、単一遺伝子プラスミドのDNA投与間の時間間隔を様々に変化させることにあった。
方法
各投与の投与日および投与間の時間間隔が異なる合計4回の投与をすべてのマウスに行った。6、4、2、1または0日の間隔での投与をマウスに与えた（すなわち、0日の場合は、1日に4回の投与を行った）。各スケジュールの最終投与は、同じ暦日に行い、最終投与の7日後にすべての動物を犠死させた。
結果
図3Aは、ICP27単一遺伝子プラスミドの集積化投与間の0、1、2、4および6日の時間間隔に関するCD8 ELISPOTの結果を示す。この結果は、投与間の時間間隔の増加がCD8 ELISPOTの結果を向上させることを示しており、NOI投与間で4日（すなわち、96時間）の間隔を与えた場合に、最大の結果が得られたことを示している。
図3Bは、HbsAg単一遺伝子プラスミドの集積化投与間の0、1、2、4および6日の時間間隔に関するCD8 ELISPOTの結果を示す。この結果は、投与間の時間間隔の増加がCD8 ELISPOTの結果を向上させることを示しており、NOI投与間で4〜6日の間隔を与えた場合に、最大の結果が得られたことを示している。
まとめ
マウスにおける集積化NOI投与間の時間間隔に関する試験から、4回のNOI投与を行う場合には、NOI投与を4または6日間隔で行う場合にCD8+T細胞応答に関する最適応答が得られることが、示された。
図3Cは、HbsAg単一遺伝子プラスミドの集積化投与からの抗体結果を示す。得られた抗体力価は非常に弱い。0、1、2、4または6日の投与間隔での集積化NOI投与は、CD8+T細胞応答が増強される場合でも、抗体力価を有意に増強しないらしいことを、これらの結果は示唆している。
実施例４
この実験の目的は、複数遺伝子プラスミド（PJV7630）の集積化NOI投与に対するCD8+T細胞応答に関するCMI応答を評価することにあった。
方法
合計4回のNOI投与を動物に行ったが、但しそのNOI投与間の時間間隔は様々に変化させた。各群における最終投与は同一日に行い（NOI投与の開始時は様々であった）、該投与の完了の1週間後および3週間後に応答を測定した。この3週サンプリングを加えたのは、その異なるスケジュールが投与のタイミングに及ぼした影響を最小にするためであった。例えば、6日の投与間隔で4回のNOI投与を受けた動物は第1の投与と4回目の投与との間に18日の時間間隔を有し、投与間に0の時間間隔を有する動物は第18日にすべての投与を受けた。
結果
図4Aおよび4Bの結果は、ICP27特異的CD8 IFN-γ ELISPOTにより測定した細胞性応答を示している。NOI投与間の時間がグラフに表示されている。すべての動物に合計4回の投与を行った。複数遺伝子プラスミド（PJV7630）の結果は、単一遺伝子プラスミド（ICP27）を使用した初期実験の結果とよく似ていることが明らかである。これに関しては、投与間の4日および6日の時間間隔がELISPOT測定において最適応答を与え（図3Cを参照されたい）、これは3週間の時点では維持されたが、応答は、その時点までに約3倍低下していた（図3Dを参照されたい）。
実施例５
この実験の目的は、HIV-1gp120のような比較的弱い抗原に対する体液性および細胞性免疫（CMI）応答の増強において、遺伝的アジュバントの使用と集積化NOI投与スケジュールとの間に相乗作用が存在するかどうかを判定することにあった。
方法
この実験では、マウスにおけるgp120抗原の少なくとも2つの投与を含み、ここで、その各「投与」は、集積化した1〜4 XRIの投与から構成される。後述の図5Aの概要図を参照されたい。また、投与間の休止期間は1週間である。LT A+B遺伝的アジュバント（pPJV2012）を使用した。pPJV2012プラスミドの地図を図10に示す。pPJV2012プラスミドは、LTAおよびLTBサブユニットタンパク質をコードするLT遺伝子をWO 03/004055に記載のプラスミドpPJV-2004およびpPJV-2005のそれぞれにクローニングすることにより調製した。ついで、LTAおよびLTBサブユニットタンパク質をコードする遺伝子を元のプラスミドから切り出し、単一プラスミド内に挿入して、pPJV2012プラスミドを得た。
結果
図5Bは、NOI投与間の時間間隔が7日である動物群から得たデータを示す。各集積化におけるXR1投与の回数を、LT A+B遺伝的アジュバント（pPJV2012）の存在または非存在と同様に、様々に変化させた。得られた結果は、遺伝的アジュバントの存在または非存在が細胞応答（IFN-γ産生）に対し最も強い影響を及ぼしたことを示している。NOI投与スケジュールが2回の投与に集積化された場合に、LTにより増強される応答が最強であったことを、図5Bは明らかに示している。これらの結果は、集積化投与スケジュールが、遺伝的LTアジュバントにより得られる全体的な細胞性応答に大きく寄与することを示している。
図5Cは、CMI応答とは異なり、集積化投与が全体的な抗体応答の強度に最大の影響を及ぼすことを示したことを証明している。図5Cに示されているとおり、1集積化当たり4回の投与を該遺伝的アジュバントベクターと共にまたはそれ無しで用いた場合に、非常に強力なgp120特異的力価（既に経験されているものより5〜10倍高い）が惹起された。重要なことに、該遺伝的アジュバントの存在は、IgG1サブクラスとIgG2aサブクラスとのバランスに影響を及ぼしたが、強力な抗体力価の惹起には必要とされなかった（示していない）。
まとめ
これらの結果は、弱い抗原をコードするNOIをアジュバントをコードするNOIと共に投与した場合には、2回のNOI投与の後に、インターフェロンγ放出に関して最大CMI応答が得られることを、示している。これとは対照的に、約48時間の投与間隔を伴う集積化された4回のNOI投与によれば、アジュバントを用いても用いなくても、強力な体液性免疫応答が得られる。
実施例６
この実験の目的は、pPJV7630での家畜ブタの免疫化が、IFN-γ ELISPOTおよびDTH応答により判定した場合に細胞性免疫応答を生成するかどうかを判定することにあった。
方法
この実験のために、pPJV7630またはプラセボ（金のみ）をXR1装置により家畜ブタに投与した。ブタに、各免疫化当たり2用量を投与し、4回の免疫化の集積化スケジュールを1週間かけて施した。したがって、各ブタには1集積化（cluster）において合計8用量のワクチンを投与した。第2の集積免疫化を最初の集積化の最後から28日後に開始した。
結果
図6Aは、最初の集積免疫化後の動物から得たIFN-γ ELISPOTデータを示す。値は8頭の免疫化動物および8頭の対照動物からの平均である。このデータは、免疫原性を測定するのが困難なモデルであると考えられている家畜ブタにおいて集積免疫化スケジュールが細胞性免疫応答を生成し得たことを示している。対照ブタはすべて、ELISPOTのバックグラウンドレベルを示した。
図6Bは、pPJV7630で免疫化されたブタ（4頭）における抗原投与部位に存在する紅斑の平均面積を示す（対照動物はこのグラフに含まれていない）。免疫化が完了し該ブタが2回の集積免疫化を受けた7日後に、抗原を投与した。抗原投与の48時間後の紅斑の存在は、これがDTH反応であることを示している。結果は、DTH応答が抗原特異的であることを示している。なぜなら、ヌルプラスミド（N）も、無関係な抗原（sAg）であるB型肝炎表面抗原プラスミドも、該DTH反応を誘導せず、一方、該ワクチン抗原を発現するプラスミド（0、4、22、27）は良好なDTH応答を示すからである。プラセボのみを投与したブタにおいては（データ非表示）、該抗原のいずれに対してもDTH反応は見られず、このことは、6Bにおける応答がpPJV7630での免疫化の結果であることを証明している。タンパク質抽出物を注射した部位では、いくつかの良好なDTH指標が、ICP22およびICP4タンパク質に関しては存在したが、対照PBS溶液ならびにICP0およびICP27タンパク質に関しては存在しなかった。注射には僅か5μgのタンパク質抽出物が利用可能であったこと、また、DTH応答を惹起するために最大100μgを使用しうることから、その低い応答は投与用量と関連するかもしれない。
まとめ
家畜ブタモデルにおいて、集積免疫化は該ワクチン抗原に対する細胞性免疫応答を誘導しうることが判明した。家畜ブタは、免疫応答惹起の良好なモデルであるとは考えられていないが、該集積免疫化は、細胞性免疫応答を惹起する能力を有していた。
実施例７
以下の表1に詳しく示すとおり、pPJV1671から発現されるhaタンパク質に対する抗体応答に対する用量および装置の効果を調べるために、家畜ブタでの研究を行った（XR粒子加速装置は前記で説明されている）。
Figure 2007508319
動物を初回免疫し、第4週にワクチンで追加免疫した。種々の時点で採血し、該追加免疫の2週間後の抗体力価を後記にグラフ化した。2つの群で各免疫化当たり合計8用量を、集積化により、または全てを1回で、投与した。集積化により免疫化された動物ではより高レベルの血清抗体を有していた。
抗体力価
リン酸緩衝食塩水中に希釈された200赤血球凝集素単位/ウェルのサルコシル（Sarkosyl）破壊精製Sw/INウイルスを使用して、標準的な方法に従うELISAにより、抗体力価を測定した。ブタ抗体は、ヤギ抗ブタ免疫グロブリンGアルカリホスファターゼコンジュゲートを使用することにより直接的に測定した。
プラスミドpPJV1671
プラスミドpPJV1671は、図8に示すとおり、インフルエンザA/パナマ/2007/99（H3N2）の赤血球凝集素（HA）抗原をコードするヒトDNAワクチンベクターである。HAコード配列は、鋳型RNA源としてCDCから得たA/パナマ/2007/99ウイルスのサンプルを使用する標準的な逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）クローニング技術により得た。最終的なpPJV1671 HA DNAワクチンベクターの作製においては、以下の工程を用いた。
・A/パナマ/2007/99（H3N2）のRNAセグメント#4のdsDNA断片のRT-PCR産生。
・大腸菌（E. coli）における標準的なpUC19系ベクター中でのRNAセグメント#4 DNAクローンの増幅。
・RNAセグメント4クローン内のH3パナマHAコード配列の配列分析。
・pPJV7563 DNAワクチンベクターに適合した末端（NheIおよびBsp120I）を有するH3パナマコード配列を含有する（そのATGコドンは有さない）DNA断片を作製するための第2のPCR反応。
pPJV7563内へのH3パナマHAコード配列の挿入は、コザックコンセンサスに適合する最終的なpPJV1671 H3パナマHA DNAワクチンベクターを与える。（NheI部位における挿入により）ベクターが供給するATGコドンの使用は、図9に示すとおり、HA遺伝子のコード配列のアミノ末端に、マイナーな2アミノ酸の挿入をもたらす。
まとめ
この研究は、集積免疫化が家畜ブタモデルにおける抗体応答を有意に向上させたことを示している。
プラスミドpPJV7563
pPJV7563の構築
pPJV7563プラスミド地図を図11に示す。プラスミドpPJV7563の塩基組成を図12に示す。プラスミドpPJV7563内の成分およびそれらの位置は以下のとおりである。
1-44 トランスポゾン903配列
45-860 トランスポゾン903からのカナマイシン耐性コード配列
861-896 トランスポゾン903配列
897-902 Sal1部位
903-1587 CMVプロモーター
1588-1718 CMVの極初期遺伝子からの非翻訳リーダー配列
1719-1724 BamH1およびBglII制限酵素の融合体
1725-1857 ラットインスリンイントロンA
1858-1863 BamH1部位
1864-1984 HBV表面抗原5'非翻訳リーダー
1985-1993 合成開始コドン/Nhe1クローニング部位
1994-2011 合成クローニング部位
2012-2544 HBVエンハンサー
2545-2555 かつてのベクター配列。NCBIデータベースに対してヒット無し
2556-2686 ウサギβ-グロビンポリアデニル化領域
2687-3759 pUC19ベクター配列。
pPJV7563プラスミドは以下のとおりに調製した。
図13（PJV7563の構築の概要を示す流れ図）の説明：
pWRG7074内のウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（BGHpA）をウサギβ-グロブリンポリアデニル化シグナル（RBGpA）により置換してpWRG7284を得た。CMVプロモーターおよびエキソン1/2融合体を含有するpWRG7128由来PCR断片によりCMV配列全てを置換することにより、CMVのイントロンAをpWRG7284から除去した。これによりpWRG7293を得た。
CMVおよびHBV配列をpWRG7284から除去し、それをpWRG7293からのCMVおよび5'-HBV配列ならびにpWRG7128からの3'-HBV配列により置換した。SIV nef遺伝子配列をこの工程で除去してpPJV7382を得た。ラットインスリンイントロンA（RIA）を付加することによりpPJV7382を更に改変して、pPJV7389を得た。pPJV7389内のカナマイシン耐性（KanR）遺伝子を短縮化形態により置換して、この遺伝子の両末端から不要な配列を除去して、pPJV7496を得た。RIA内のNhe1部位をpPJV7496から除去してpPJV7530を得た。
pPJV7530内のHBV配列から3'-UTRの5'領域までを除去し、pPJV7468からのHBV 5'-UTR、flu M2遺伝子および3'-UTRの5'領域により置換して、PJV7549を得た。種々の抗原をコードするベクター内のWRG7128からのHBVenhおよびHBV 5'UTR領域の保持が抗原発現および免疫原性の両方を再現性良く改善しうることが、PJVによりもたらされた。これらは今やPJV DNAワクチンベクター内の共通の要素である。ついでM2遺伝子をpPJV7549から欠失させ、ポリリンカーを形成するオリゴヌクレオチドにより置換した。この操作はpPJV7563（他のコード配列を受け入れうる発現ベクター）を与えた。
PJV7563の親ベクターであるプラスミドpWRG7074の構築
標準的プラスミドバックボーンpWRG7074を作製した。このバックボーンは、いくつかの臨床試験で使用されるHBsAg発現ベクターであるpWRG7128を作製するための前駆体プラスミドとして使用した。この節においては、このバックボーンの誘導を、図15および16（それぞれ「プラスミドPJV7074およびPJV7128の誘導を示す流れ図」および「主要プラスミド特徴マップ」）にて説明し、図示する。簡潔に説明すると、ヒトCMV極初期プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を含有する単一断片を、標準的な良く特徴づけられているpUC19細菌プラスミドベクター内に挿入することにより、pWRG7074を誘導した。いくつかの後続の操作を行って、アンピシリンをカナマイシン（KanR）耐性マーカーにより置換し、いくつかの制限部位を改変した。CMVプロモーターおよびbGHポリA領域の起源であるDNA断片は、プラスミドpJW4303（当時はスタンフォード大学にいたJim Mullinsから供与されたもの）から得た。
プラスミドWRG7074およびWRG7128の構築に関する詳細な説明を以下に記載する。特に示さない限り、すべてのクローニングはPowderJect Vaccines, Inc., Madison, WI（以前はAgracetus, Inc., Auragen, Inc.またはGeneva, Inc. Middleton, WIとして知られていた)において行った。構築工程はイタリック体で示されている。黒丸は、特定の配列に関する実際上の情報を示す。
工程1：TPAシグナルペプチドコード配列を含有するpJW4303（地図, 図10.2）の小さなHindIII-BamHI断片をHindIII-BamHI消化により欠失させた。この小さな断片をHindIII-NotI-BamHIリンカーにより置換してJW4303-Not1を得た。
pJW4303由来のCMVプロモーターおよびbGHポリA領域を含有する断片は、かつてPJVについて2131bp長であると決定されたSalI-XhoI断片である。pJW4303から誘導されたSalI-XhoI断片のヌクレオチド配列を推定した。以下の項目は図10.2に示されている。
・該断片のヌクレオチド1位のSalI部位。
・ヌクレオチド7位のCMVIEプロモーター断片の開始部位。これは、GenBank配列アクセッション番号M60321（ヒトサイトメガロウイルス極初期タンパク質遺伝子5'末端）からのヌクレオチド451位に対応する。
・ヌクレオチド1648位のCMVIEプロモーター断片の末端。これは、GenBank配列アクセッション#M60321（ヒトサイトメガロウイルス極初期タンパク質遺伝子5'末端）からのヌクレオチド2097位に対応する。推定CMVIEプロモーター領域と前記GenBank配列との間に少数のヌクレオチド相違が認められたことに注目すべきである。これはおそらく、異なるCMVウイルス分離体間の自然多型によるものであろう。
・ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターのシグナルペプチドコード配列のヌクレオチド1661位のATG翻訳開始コドン。該TPAシグナルペプチドコード配列は、Luら, J. Virol. 70:3978, 1996に記載されているとおりに、合成DNAから誘導した。そのLuらの刊行物はpJW4303の構築を簡潔に記載しているが、この記載は、該推定配列と合致しない幾つかの誤りを含む。
・それぞれヌクレオチド1649位および1724位のコード配列挿入部位HindIIIおよびNheI。SIV nef相同性領域はbGHpA領域の一部として示されることに注意されたい。
・SIV nefに対する相同性領域から開始するヌクレオチド1741位のBamHI制限部位。これは、GenBank配列アクセッション番号M33262（サル免疫不全ウイルス分離体239、完全プロウイルスゲノムおよびフランキング配列）のヌクレオチド9444位に対応する。
・SIV nef相同性領域を終結させるヌクレオチド1849位のBglII制限部位。これは、GenBank配列アクセッション#M33262（サル免疫不全ウイルス分離体239、完全プロウイルスゲノムおよびフランキング配列）のヌクレオチド9552位に対応する。
・1999年に、サル免疫不全ウイルスnef遺伝子配列の配列に対して相同な109塩基対に相当する配列がこのベクター内に存在することが見出された。図10.1に示すとおり、この配列はpWRG7128の構築時に除去されている。しかし、pWRG7074にはそれが残存する。この配列はpWG4303においては並びにpWRG7077およびpWRG7074を経由する誘導体においては存在した。SIV nef相同性はヌクレオチド77位と184位との間で見出される。したがって、bHGポリA領域に隣接したSIV nef断片の挿入物は、起源DNAのPJV受け入れ前に生じた明らかな構築人工産物であった。
・ヌクレオチド1873位のウシ成長ホルモンポリA領域相同性の開始部位。これは、GenBank配列アクセッション番号M57764（ウシ成長ホルモン遺伝子、完全コード配列）のヌクレオチド2326位に対応する。
・添付（Attachment）4のヌクレオチド2096位のウシ成長ホルモンポリA領域相同性の末端。これは、GenBank配列アクセッション番号M57764（ウシ成長ホルモン遺伝子、完全コード配列）のヌクレオチド2550位に対応する。
・該断片の末端（ヌクレオチド2131位）のXhoI制限部位。
工程2：pJW4303-NotI（SalI-XhoI断片）由来のCMVプロモーターおよびbGHポリAをpUC19のSal部位内に挿入してプラスミドpWRG7012（後記の図）を得た。pWRG7012は2つのBamHI部位および2つのHindIII部位を含有する。これらの部位のそれぞれの1つを後続工程で除去した（後記を参照されたい）。
工程3：pWRG7012のEcoR1-Xba1領域を欠失させてpUC19のマルチクローニング部位の大断片を除去してpWRG7013（図10.2）を作製した。
PWRG7013は2つのHindIII部位を保有するが、1つのBamHI部位しか有さない。
工程4：CMVプロモーターの5'側に位置するHindIII部位をpWRG7012から除去して、イントロンと下流のインサートとの間のHindIII部位の容易な利用を可能にした。これはpWRG7014（図10.2）を与えた。
pWRG7014は2つのBamHI部位を保有するが、1つのHindIII部位しか有さない。
工程5：ただ1つのHindIII部位および1つのBamHI部位を含有するプラスミドを得るために、pWRG7013由来のHindIII-EcoR1断片をHindIII-EcoR1を欠失させたpWRG7014内に配置してpWRG7020（WRG7077のアンピシリン耐性形態）（図10.2）を得た。
工程6：pUC19内のEam1105 1-Pst1隣接アンピシリン耐性遺伝子を欠失させた。複製起点を含有する断片をポリメラーゼでの処理により平滑末端化した。PUC4K内のPst1隣接カナマイシン耐性遺伝子を単離した。この断片をポリメラーゼでの処理により平滑末端化し、複製起点断片に連結した。これは、pWRG7031由来のCMV-HBsAg-bGH-pAカセットを受け入れることが可能であった（工程8）KanRベクターであるpWRG7072を与えた。
工程7：pWRG7020内のポリリンカーのHd3-BamH1配列を欠失させ、該ベクターをポリメラーゼで平滑末端化した。pAM6内のBamH1隣接1.4KB HBsAg含有断片を単離した。この断片をポリメラーゼでの処理により平滑末端化し、該ベクター内に連結した。これは、アンピシリン耐性HBsAg発現プラスミドであるpWRG7031を与えた。
工程8：pWRG7072のPvu2-Sph1配列を欠失させた。pWRG7031をEcoR1で切断し、該部位をポリメラーゼで平滑末端化し、更に該プラスミドをSph1で切断し、CMV、HBVおよびウシ配列を含有する断片を単離した。この断片を、調製されたpWRG7072内に連結して、pWRG7074を得た。
工程9：pWRG7074をBgl2で切断し、ポリメラーゼで平滑末端化し、更にBstX1で切断してベクター断片を得た。pWRG7074をNco1で切断し、マング・ビーンヌクレアーゼで平滑末端化し、更にBstX1で切断して、3'-エンハンサーを含有する挿入断片を得た。これらの2つの断片の連結は、pWRG7074内に見出されるSIV NEF配列およびHbxAgの5'コード領域を欠くHBsAg発現プラスミドである、pWRG7128を与えた。
工程10：pWRG7077の構築：pWRG7072をSap1で切断し、ポリメラーゼで平滑末端化し、更にSph1で切断して、複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子を含有する断片を得た。WRG7020内のEcoR1部位を切断し平滑末端化し、ついでSph1で部分切断して、CMVプロモーター、イントロンAおよびBGHポリアデニル化領域を含有する断片を得た。これらの断片を1つに連結してpWRG7077を得た。最終ベクターpWRG7077は、工程1に記載した改変（TPAシグナルペプチドコード配列を、Not1制限部位を含有するリンカーにより置換した）を有する以外は起源プラスミドpJW4303に由来する元のCMV-イントロンA-bGH-pA領域を含有する。
実施例８
ATCCから得たHPV16ゲノムクローンから、PCRにより、E6およびE7のコピーを調製した。該完全長プラスミドは完全ウイルスゲノムを含有するため、それをBSL-2条件下で維持する。それぞれp53およびRbの結合領域を欠失させることにより、E6およびE7を無毒化した（Slebosら, Virol. 1995, 208, 111-120; およびSmahelら, Virol. 2001, 281, 231-238）。PCR断片をPJV7563内にクローニングして、イントロンAを伴わないCMVプロモーターの制御下に該遺伝子を配置した。
プラスミドをQiagen内毒素不含Megaキットにより調製し、それを、標準的なスペルミジンCaCl2法により2μg DNA/mg金で金粒子上にコーティングした。0.05mg/mlのPVPを使用して、カートリッジを調製した。XR研究装置を500psiで使用して、B6マウスの剃毛腹部に単回送達で免疫化した。
TC-1細胞をJohns Hopkins School of Medicineから得た。細胞を最少継代数で培養して増殖させ、ついでバイアルを凍結し、使用するまで液体窒素中で保存した。PBS内での注射のために、細胞を調製した。麻酔したマウスの、剃毛された右脇腹に、2×104〜2×105細胞を含む50〜100μlを皮下注射した。第7日から始めて月曜、水曜および金曜に腫瘍を測定した。直交する2つの径を測定し、それらを掛け算して平方面積を得た。該動物の健康状態も監視した。腫瘍が120 mm2を超えるまでに成長したり、腫瘍が壊死状態になったり、あるいはマウスが瀕死状態になった場合には、マウスを安楽死させた。
ELISPOTアッセイのために、最終免疫化の1週間後にマウスを犠死させた。脾臓を無菌的に摘出し、単細胞浮遊液を調製した。BD -IFN ELISPOTキットにおいて製造業者の指示書に従い、細胞を1×106または5×105細胞/ウェルでプレーティングした。E7 CD4およびCD8ならびにE6 CD8に特異的なペプチドを10μMの最終濃度で加えた。培地ウェルは、ペプチドを含有するウェルと同等量のDMSOを含有していた。培地スポットを、ペプチドの存在下で誘導されたものから差し引くことにより、特異的スポットを計算した。
結果
E6またはE7 DNAでのB6マウスの免疫化は、有意な数のIFN分泌細胞の誘導を引き起こす（図23）。E6の場合には、CD8特異的エピトープのみが公知である。E7の場合には、CD4特異的エピトープおよびCD8特異的エピトープの両方が同定されており、両方に対する強力な応答がPMED免疫化後に見られる。E6またはE7ワクチンへの大腸菌（E. coli）易熱性毒素（LT）またはコレラ毒素（CT）DNAの添加を試験した。LTはE7ペプチドに対するIFN ELISPOT応答を約2倍増強したが（図23）、いずれの毒素においても腫瘍防御における増強は全く見られなかった。
興味深いことに、TC-1細胞のみの注射はE6およびE7に対するIFN応答を誘導する（図24）。これらは、3日間隔で集積化して投与した3用量のPMED免疫化で観察されるものより低い。TC-1注射をPMED免疫化と組合せると、中間的な結果が得られる。
5×104 TC-1細胞の注射は、未処理B6マウスにおいて腫瘍の一貫した急速な発達を引き起こす。わずか1用量のE6またはE7 DNAでの予防的処理は腫瘍発生に対する相当な防御をもたらす（図25）。E6またはE7での治療的免疫化も、腫瘍注射の3日後に開始する集積化した3用量の投与を行った場合には有効である（図26）。より少ない用量の投与はそれほど有効ではない（データ非表示）。E6プラスミドおよびE7プラスミドの共投与は、これまでに1回しか試験していないが、いずれか一方の単独投与以上に有効ではなかった。
1つの試験においては、E6ワクチン接種により初回TC-1チャレンジに対して防御された動物（図26）を、更に処理を行うことなく、50日後に再チャレンジした。図27に示すとおり、すべての動物がこの第2チャレンジに対して完全に防御され、一方、年齢を釣り合せた未処理対照のすべては腫瘍を発生し、安楽死に付された。
より大きな腫瘍の処理を試みたところ、成功の度合は様々であった。例えば、図28に示す通り、20 mm2から開始する集積化した3用量のE6 DNAでの処理は5匹中５匹のマウスにおいて退縮を引き起こし、一方、35 mm2から開始する処理は、腫瘍成長およびそれに続く急速な進行を僅かに遅らせたに過ぎなかった。
前記のデータは、無毒化されたE6およびE7 DNAが、B6マウスに投与された場合に、それぞれのペプチドエピトープに対する強力なT細胞応答を惹起することを示している。さらに、これらの応答は、TC-1腫瘍細胞の増殖を該ワクチンが抑制する能力と大きく相関している。そのような処理は予防または治療として有効である。
実施例９
ICP27単一遺伝子プラスミドを使用して、各群の最終投与が同一日に行われるように、2日間隔の1〜8回の投与をマウスに行った。最終投与の2週間後に、CD8 ELISPOTを測定した。結果を図29に示す。最大に近い効果を得るためには少なくとも3回の投与が必要であり、追加的な投与は改善をほとんどまたは全くもたらさないことを、この結果は示している。
リンパ節に対する集積化投与の累積的効果を調べるために、マウスに1、2、3または4回のpPJV7630の投与（4日の投与間隔を用いる）を行い、ついでリンパ節からの細胞を8日後に検査した。結果を図30に示す。投与回数の増加と共に、節のサイズの増加が明らかであった。ワクチン投与の完了の8日後に測定したリンパ節の重量および細胞数は、2回以上の投与を行った場合にはナイーブマウスに比べて増加し、3回の投与が最高値を与えた。
実施例１０
追加免疫ワクチン接種の効果を調べるための実験を行った。初回免疫投与を受けたマウスを、初回免疫投与および追加免疫投与の両方を受けたマウスと比較した。両群のマウスを同時に初回免疫し、同じワクチンをワクチン接種に使用した。第2群には、初回免疫の28日後に追加免疫を行った。
図31は、1回の集積化（P）で、または28日間隔の2回の集積化（P/B）でpPJV7630を投与した動物について行ったIFN-γ ELISPOTアッセイの結果を示す。pPJV7630構築物から発現された4つの極初期抗原のそれぞれのペプチドライブラリーを使用して、脾細胞を試験した。最終ワクチン投与の2週間後にアッセイを行った。認められる通り、追加免疫投与の実施は、刺激された応答における相当な増強をもたらす。
実施例１１
PJV7630をXR1装置により家畜ブタに投与した。各免疫化当たり2用量をブタに投与し、1週間に及ぶ4回の免疫化の集積化スケジュールを行った。すなわち、各ブタには集積化毎に合計8用量のワクチンを投与した。前回の集積化の最後から21日後に、2回の集積免疫化追加免疫を開始した。投与（PB）の開始前および各追加免疫（B1およびB2）の7〜10日後に、血液サンプルを採取した。記載されているとおりにIFN-γ ELISPOTアッセイを行った。数値は10匹の動物に対する平均±SEMである。図32は、得られた結果および追加免疫ワクチン接種の効果を示す。
実施例１２
XR-1によるpPJV7630の1回投与のPMEDの2、3および4日後に採取した皮膚サンプルを凍結し、すり砕き、上清内のサイトカインレベルを試験した。炎症性サイトカインを評価するためにCBAキットを使用して、IL-6、TNF-αおよびMCP-1（単球走化性タンパク質）の著しい増加を見出した。これらは第2日に最高となり、時間経過と共に減少した。いずれの時点においてもIL-10、IL-12またはIFN-γの増加は見出されなかった。サイトカインの増加は一般には創傷治癒において見出される。
皮膚およびリンパ節に対する集積化投与の累積的効果を調べるために、マウスに1、2、3または4回のpPJV7630の投与（4日の投与間隔を用いる）を行い、ついでリンパ節からの細胞を4および8日後に検査した。投与回数の増加と共に、節のサイズの増加が明らかであった。ワクチン投与の完了の8日後に測定したリンパ節の重量および細胞数は、2回以上の投与を行った場合にはナイーブマウスに比べて増加した（図30を参照されたい）。
また、リンパ節細胞をMHC-II陽性細胞（抗原提示細胞）、CD80陽性細胞（活性化マーカー）および二重陽性細胞に関して染色し、フローサイトメトリーにより分析した（以下の表）。一般に、一重および二重陽性細胞の数は投与回数と共に増加した。
Figure 2007508319
リンパ節集団の分析は、集積免疫化の結果として、リンパ節内の抗原提示細胞の数の約5〜10倍の増加を示している。
要約すると、PMEDの数日後に投与部位の種々の領域において強い身体的変化が見出される。PMEDの2日後に炎症性サイトカインのピークが皮膚内で見出された。また、集積化投与の際に、細胞（特に、活性化抗原提示細胞）の蓄積がリンパ節内で見出され、このことは皮膚の応答性の上昇を示唆している。
実施例１３
記載されている実験に、Balb/cマウスを使用した。腹部領域を剃毛し、粒子媒介免疫治療送達（particle mediated immunotherapeutic delivery (PMID)）を用いてDNAの初回免疫化を行った。各動物に合計3μgのDNAを投与した。これは、第0日または第4日の通常の「パルス（pulse）」免疫化（3×1μgのDNA）により、あるいは隔日（第0、2および4日）のそれぞれの日に投与される1μgのDNAでの「集積（cluster）」免疫化により行った。最初のDNA投与の10日後にマウスを選択し、脾臓を集めた。脾臓細胞を薄くそぐことにより脾細胞を回収し、赤血球を細胞溶解した。該脾細胞を洗浄し計数した。専用ELIspotプレート（インターフェロンγ捕捉抗体でコーティングされブロッキングされたもの）を使用した。脾細胞をこれらのプレートに移し、特異的ペプチドの存在下、37℃／5％ CO2で一晩インキュベートした。該脾細胞を細胞溶解し、存在するインターフェロンγ分泌細胞の数を示すために標準的な方法により該プレートを現像した。
結果
結果（図33に示す）は、「集積」免疫化を受けた動物からは、通常の「パルス」法を用いて同量のDNAが投与された動物と比べて有意に多い数のIFN-γスポット形成細胞が単離されたことを示した（*は有意差を示す）。
HIV由来のGagおよびRT抗原を発現する構築物で「集積化」法により免疫化されたマウスの細胞性免疫応答は、通常の「パルス」法により同量のDNAで免疫化された動物のものより有意に高かった。
実施例１４
記載されている実験に、Balb/cマウスを使用した。腹部領域を剃毛し、粒子媒介免疫治療送達 (PMID)を用いてDNAの初回免疫化を行った。各動物に合計1μgのDNAを投与した。これは、第0日の通常の「パルス（pulse）」免疫化（2×0.5μgのDNA）により、あるいは第0および7日のそれぞれの日に投与される0.5μgのDNAでの「改変集積（modified cluster）」免疫化により行った。初回免疫化の83日後に1.0μgのDNAの「パルス」を用いて、すべてのマウスを追加免疫した。該追加免疫の7日後（第90日）にマウスを選択し、脾臓を集めた。脾臓細胞を薄くそぐことにより脾細胞を回収し、赤血球を細胞溶解した。該脾細胞を洗浄し計数した。専用ELIspotプレート（インターフェロンγ捕捉抗体でコーティングされブロッキングされたもの）を使用した。脾細胞をこれらのプレートに移し、特異的ペプチドの存在下、37℃／5％ CO2で一晩インキュベートした。該脾細胞を細胞溶解し、存在するインターフェロンγ分泌細胞の数を示すために標準的な方法により該プレートを現像した。
結果
結果（図34に示す）は、「改変集積化（modified cluster）」を用いて免疫化された動物からは、通常の「パルス」法を用いて同量のDNAが投与された動物と比べて多い数のIFN-γスポット形成細胞が単離されたことを示した。したがって、HIV由来のGagおよびRT抗原を発現する構築物で「改変集積化」法により免疫化されたマウスの細胞性免疫応答は、通常の「パルス」法により同量のDNAで免疫化された動物のものより有意に高かった。
実施例１５
使用したプラスミドは、HIV抗原であるRT、NefおよびGagを発現した。PMIDのためのカートリッジの調製は、既に記載されているとおり（Eisenbraunら, DNA and Cell Biology, 1993 Vol 12 No 9 pp 791-797; Pertnerら）に行った。簡潔に説明すると、プラスミドDNAを2μm金粒子（DeGussa Corp., South Plainfield, N.J., USA）上にコーティングし、Tefzelチューブ内に充填し、ついでそれを、カートリッジとして使用するために1.27cmの長さに切断し、使用するまで4℃で乾燥保存した。典型的なワクチン接種においては、各カートリッジは、約1μgのDNAでコーティングされた0.5mgの金を含有していた。
4頭のミニブタの群に、それらの下面腹部にPMIDによる初回免疫化を行い（第1日に開始した）、ついでPMIDによる追加免疫を行った（第57日に開始した）。対照動物には免疫化しなかった。免疫化はパルス投与により（すなわち、4カートリッジを一度に投与する）、あるいは集積化投与により（すなわち、2カートリッジを48時間間隔の3回のそれぞれに投与する）行った。初回免疫化または追加免疫化の開始の14日後に、末梢血単核細胞（PBMC）の調製のために末梢血サンプルを集めた。
ブタの血液をヘパリン中に集め、PBS中で2:1希釈し、50ml Falconチューブ内のHistopaque（Sigma）上に重層した。該チューブを1200gで30分間遠心分離し、ブタリンパ球を界面から集めた。塩化アンモニウム細胞溶解バッファーを使用して、残存赤血球を細胞溶解した。細胞を計数し、完全RPMI培地内に2×106/mlで再懸濁させた。
Elispotアッセイを行うために、プレートを8μg/ml（PBS中）の精製マウス抗ブタIFN-γ（Biosource ASC4934）でコーティングした。プレートを4℃で一晩コーティングした。使用前に、該プレートをPBSで3回洗浄し、完全RPMI培地で2時間ブロッキングした。PBMCを該プレートに2×105細胞/ウェルで加えた。各ウェル内の全容量は200μlであった。組換えGag、NefまたはRTタンパク質（自社内で調製したもの）を5μg/mlの最終濃度で加えた。プレートを37℃の加湿インキュベーター内で16時間インキュベートした。
水での1回の洗浄（細胞の細胞溶解を保証するために1分間の浸漬を行う）およびPBSでの3回の洗浄により、細胞をプレートから除去した。ビオチン結合抗ブタIFN-γをPBS中0.5μg/mlで加えた。プレートを、振とうしながら室温で2時間インキュベートした。ついでプレートをPBSで3回洗浄した後、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Caltag）を1/1000希釈で加えた。PBS中で3回洗浄した後、BCICP基質（Biorad）と共に15〜45分間インキュベートすることにより、スポットを現像した。水を使用して基質を洗い落とし、プレートを乾燥させた。AID Elispotリーダー（Cadama Biomedical, UK）を使用して、スポットを計数した。
結果
結果を図35に示す。初回免疫化後、集積免疫化により初回免疫されたミニブタからのPBMC中のIFN-γ産生スポットの数は、パルス免疫化を受けたものと比べて有意に多かった（それぞれ平均±SEMで311±96および45±31; p<0.05スチューデントt検定）。さらに、パルス追加免疫後のIFN-γ産生スポットの数は、集積化初回免疫を受けた動物においては、パルス初回免疫の場合と比べて有意に多かった（それぞれ平均±SEMで431±60および186±66; p<0.05スチューデントt検定）。要約すると、これらの結果は、集積化初回免疫が通常のパルス初回免疫を上回る利点をもたらすこと、およびこの利点が、免疫応答のその後の追加免疫段階でも維持されることを示している。
この図において、群1は非免疫化の対照であり、群2はパルス初回免疫、パルス追加免疫の群であり、群3はパルス初回免疫、集積化追加免疫の群である。
実施例１６
記載されている実験に、C57BL/6マウスを使用した。腹部領域を剃毛し、粒子媒介免疫治療送達(PMID)を用いてDNAの初回免疫化を行った。第0日の通常の「パルス」免疫化（1μgのDNAオボアルブミン）により、あるいは隔日（第0、2日)-集積化2× または第0、2および4日-集積化3×、のそれぞれの日に投与される1μgのDNAでの「集積（cluster）」免疫化により、各動物の免疫化を行った。最初のDNA投与の10日後にマウスを選択し、脾臓を集めた。脾臓細胞を薄くそぐことにより脾細胞を回収し、赤血球を細胞溶解した。該脾細胞を洗浄し計数した。専用ELIspotプレート（インターフェロンγまたはIL2捕捉抗体でコーティングされブロッキングされたもの）を使用した。脾細胞をこれらのプレートに移し、特異的ペプチドの存在下、37℃／5％ CO2で一晩インキュベートした。既に明らかにされているオボアルブミン特異的CD4およびCD8ペプチドを使用した。脾細胞を細胞溶解し、存在するインターフェロンγまたはIL2分泌細胞の数を示すために標準的な方法により該プレートを現像した。
結果
結果（図36および37に示す）は、「集積」免疫化を受けた動物からは、通常の「パルス」法を用いて同量のDNAが投与された動物と比べて有意に多い数のIFN-γおよびIL2スポット形成細胞が単離されたことを示した。図36においては、各棒グラフは個々のマウスでの応答を表す。
オボアルブミンを発現する構築物で「集積化」法により免疫化されたマウスの細胞性免疫応答は、通常の「パルス」法により同量のDNAで免疫化された動物よりも有意に高かった。
実施例１７
記載されている実験に、C57BL/6マウスを使用した。腹部領域を剃毛し、粒子媒介免疫治療送達(PMID)を用いてDNAの初回免疫化を行った。各動物に合計3μgのDNAを投与した。これは、第0日の通常の「パルス」免疫化（3×1μgのDNA）により、あるいは隔日（第0、2および4日）のそれぞれの日に投与される1μgのDNAでの「集積（cluster）」免疫化により投与された。
ついで、パルスまたは集積免疫化により初回免疫された動物を、29日後に、1μgのDNAの単回パルス免疫化により追加免疫した。前記のとおりに、該追加免疫の9日後（第38日）に脾臓を摘出し、抗原特異的細胞の度数をELISPOTにより測定した。また、抗原特異的標的を殺すCD8 T細胞の能力を、ペプチドまたはIL2を加えた5日間のin vitro増殖の後、ユウロピウム（Europium）に基づくCTLアッセイにより測定した。
結果
図38に示す結果は、集積免疫化により初回免疫された動物が、パルス免疫化により同量のDNAで免疫化されたマウスより強力な回復（recall）応答を示したことを示している。これは、ELISPOTにより、IFNgおよびIL2産生細胞の度数の増加により示された。また、集積免疫化により初回免疫された動物は、パルスDNA追加免疫の後にパルス免疫化により免疫化された動物と比べてより強力なCTL応答を示した。
オボアルブミンを発現する構築物で「集積化」法により免疫化されたマウスの記憶免疫応答は、通常の「パルス」法により同量のDNAで免疫化された動物より有意に高かった。
前記説明において記載されているすべての刊行物を参照により本明細書に組み入れることとする。本発明の範囲および精神から逸脱しない、記載されている本発明の方法および系の種々の修飾および変更が、当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して説明されているが、特許請求されている本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、分子生物学または関連分野における当業者に明らかな、本発明の実施のための記載されている方法の種々の修飾が、本発明に含まれると意図される。
図1は、マウスへの1週間での1、2または4回のNOI投与、すなわちそれぞれ第7日（D 7）；第0および7日（D 0, 7）；または第0、2、4および7日（D 0, 2, 4, 7）のNOI投与後の「CD8+T細胞」応答を示す。NOI 1投与当たりに1回または2回の適用を行い、1つの群においては、LTアジュバントをNOIと共に投与した。図1Aは、ICP27単一遺伝子プラスミドの投与後のCD8+T細胞応答を示す。図1Bは、PJV7630複数遺伝子プラスミドの投与後のCD8+T細胞応答を示す。 図2は、集積化（clustered）NOI投与を用いる感染チャレンジへのマウスの防御を示す。図2Aは、2週間の休止後のC57Bl/6マウスの結果を示す。 図2は、集積化（clustered）NOI投与を用いる感染チャレンジへのマウスの防御を示す。図2Bは、1週間の休止後のC57Bl/6マウスの結果を示す。 図2は、集積化（clustered）NOI投与を用いる感染チャレンジへのマウスの防御を示す。1週間の休止後のBalb/cマウスの結果を示す。 図3Aは、ICP27単一遺伝子プラスミドの集積化投与間の最適時間間隔を示す。 図3Bは、HbsAg単一遺伝子プラスミドの集積化NOI投与後に得られた細胞性応答を示す。 図3Cは、HbsAg単一遺伝子プラスミドの集積化NOI投与後に得られた抗体力価を示す。 図4Aは、0、1、2、4および6日の投与間隔での複数遺伝子プラスミド（PJV7630）の集積化NOI投与の1週間後のELISPOT測定を示す。図4Bは、0、1、2、4および6日の投与間隔での複数遺伝子プラスミド（PJV7630）の集積化NOI投与の3週間後のELISPOT測定を示す。 図5Aは、各「投与」が1〜4回のXRI投与および各投与間の休止時間から構成されることを示す概要図である。 図5Bは、遺伝的LTアジュバントと集積化NOI投与スケジュールとの組合せで得られたIFN-γ遊離の点でのCMI応答を示す。 図5Cは、遺伝的LTアジュバントと集積化NOI投与スケジュールとの組合せで得られた抗体応答を示す。 図6Aは、最初の集積免疫化後の家畜ブタから得られたIFNγ ELISPOTデータを示す。 図6Bは、pJV7630で免疫化されたブタ（4頭）における抗原投与部位に存在する紅斑の平均面積を示す。 図7は、家畜ブタにおける抗HA抗体応答を示す。 図8は、インフルエンザA/パナマ/2007/99（H3N2）の赤血球凝集素（HA）抗原をコードするヒトDNAワクチンベクターであるプラスミドpJV1671を示す。 図9は、pPJV1671によりコードされるH3パナマHAおよびコンセンサス配列と、H3パナマHA天然配列との比較を示す。 図10はpPJV2012のプラスミド地図を示す。 図11はpPJV7563のプラスミド地図を示す。 図12はpPJV7563プラスミドのヌクレオチド配列を示す。 図13は、PJV7563の構築の概要を示す流れ図を示す。 図14（i）〜（viii）は、pPJV7563の構築における主要プラスミドの特徴マップを示す。 図14（i）〜（viii）は、pPJV7563の構築における主要プラスミドの特徴マップを示す。 図14（i）〜（viii）は、pPJV7563の構築における主要プラスミドの特徴マップを示す。 図14（i）〜（viii）は、pPJV7563の構築における主要プラスミドの特徴マップを示す。 図14（i）〜（viii）は、pPJV7563の構築における主要プラスミドの特徴マップを示す。 図14（i）〜（viii）は、pPJV7563の構築における主要プラスミドの特徴マップを示す。 図15は、プラスミドWRG7074およびWRG7128の誘導を示す流れ図を示す。 図16（i）〜（v）は更なる主要プラスミド特徴マップを示す。 図16（i）〜（v）は更なる主要プラスミド特徴マップを示す。 図16（i）〜（v）は更なる主要プラスミド特徴マップを示す。 図16（i）〜（v）は更なる主要プラスミド特徴マップを示す。 図16（i）〜（v）は更なる主要プラスミド特徴マップを示す。 HIV抗原を発現する構築物、およびHIV抗原をコードする配列に関する。 HIV抗原を発現する構築物、およびHIV抗原をコードする配列に関する。 HIV抗原を発現する構築物、およびHIV抗原をコードする配列に関する。 HIV抗原を発現する構築物、およびHIV抗原をコードする配列に関する。 HIV抗原を発現する構築物、およびHIV抗原をコードする配列に関する。 HIV抗原を発現する構築物、およびHIV抗原をコードする配列に関する。 HIV抗原を発現する構築物、およびHIV抗原をコードする配列に関する。 HIV抗原を発現する構築物、およびHIV抗原をコードする配列に関する。 HIV抗原を発現する構築物、およびHIV抗原をコードする配列に関する。 HPV E6およびE7抗原での免疫化に関する。HPV16 E7癌遺伝子をコードするプラスミドDNAでワクチン接種された第14日のC57Bl/6マウスからのCD8、インターフェロンγELISPOTの結果である。 HPV E6およびE7抗原での免疫化に関する。TC-1細胞(TC-1#7)を伴うおよび伴わないE7 DNAワクチンでのCD4ペプチド、IFNg ELISPOT。 HPV E6およびE7抗原での免疫化に関する。TC-1腫瘍抑制試験（全群）。 HPV E6およびE7抗原での免疫化に関する。HPV16腫瘍細胞が注射されHPV16 E6 DNAプラスミドでワクチン接種されたC57Bl/6マウスにおける腫瘍測定。 HPV E6およびE7抗原での免疫化に関する。C57Bl/6マウスにおける腫瘍測定、TC-1細胞再チャレンジ実験。 HPV E6およびE7抗原での免疫化に関する。TC-1腫瘍抑制試験（(5×104)TC-1細胞群）。 本発明の方法の使用により得られた応答を調べる更なる実験の結果を示す。 本発明の方法の使用により得られた応答を調べる更なる実験の結果を示す。 本発明の方法の使用により得られた応答を調べる更なる実験の結果を示す。 本発明の方法の使用により得られた応答を調べる更なる実験の結果を示す。集積化投与後の家畜ブタにおける免疫応答。 本発明の方法の使用により得られた応答を調べる更なる実験の結果を示す。「集積化」免疫化と通常の「パルス」免疫化との比較。 本発明の方法の使用により得られた応答を調べる更なる実験の結果を示す。通常の「パルス」免疫化と「変形集積化」免疫化との比較。 本発明の方法の使用により得られた応答を調べる更なる実験の結果を示す。 本発明の方法の使用により得られた応答を調べる更なる実験の結果を示す。 本発明の方法の使用により得られた応答を調べる更なる実験の結果を示す。 本発明の方法の使用により得られた応答を調べる更なる実験の結果を示す。

Claims (28)

  1. 宿主哺乳類被験体におけるT細胞エピトープに対するT細胞応答を惹起する方法であって、
    （i）該T細胞エピトープをコードする目的とするヌクレオチド（NOI）を投与することを各投与が含む、該被験体への1〜14日間隔の少なくとも2回の投与を含む第1の免疫化、および所望により、
    （ii）該被験体への（a）該T細胞エピトープをコードするNOIまたは（b）該T細胞エピトープを含むタンパク質の少なくとも1回の投与を含む第2の免疫化、
    を含み、かつ、第1の免疫化の第1の投与と第2の免疫化の第1の投与との間が21〜365日間である、方法。
  2. 第1のおよび／または第2の免疫化の投与を2〜12日間にわたって行う、請求項1記載の方法。
  3. 第1のおよび／または第2の免疫化において、前記NOIまたはタンパク質を2〜10回投与する、請求項1または2記載の方法。
  4. 第1のおよび／または第2の免疫化の2、3、4回またはそれ以上の投与が2〜6日間隔である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
  5. 第1の免疫化の第1の投与と第2の免疫化の第1の投与との間が50〜250日間である、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
  6. 被験体への（a）前記T細胞エピトープをコードするNOIまたは（b）前記T細胞エピトープを含むタンパク質、の少なくとも1回の投与を含む第3の免疫化を更に含み、かつ、第2の免疫化の第1の投与と第3の免疫化の第1の投与との間が10〜365日間である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
  7. 第3の免疫化において、
    ・前記NOIまたはタンパク質を2〜5回投与する、および／または
    ・それらの投与が2〜6日間隔である、および／または
    ・第2の免疫化の第1の投与と第3の免疫化の第1の投与との間が50〜250日間である、
    請求項6記載の方法。
  8. 前記NOIが、DNA配列を、被験体の細胞内で該DNA配列の発現を誘導しうる調節配列の制御下に含む、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
  9. T細胞エピトープがCD4+ヘルパーTリンパ球細胞エピトープおよび／またはCD8+Tリンパ球（CTL）エピトープである、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
  10. 1回またはそれ以上のNOIの投与が0.1〜2μgのNOIの投与を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
  11. 1回またはそれ以上の投与が皮膚への投与を含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
  12. 少なくとも1回のNOIまたはタンパク質の投与に関して、該NOIまたはタンパク質が粒子上にコーティングされているかまたは粒子内に取り込まれている、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
  13. 粒子を粒子加速装置により被験体に投与する、請求項12記載の方法。
  14. 少なくとも1回のNOIまたはタンパク質の投与に関して、該NOIまたはタンパク質を、
    （i）製薬上許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤を含む医薬組成物、または
    （ii）免疫学的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤を含むワクチン組成物、または
    （iii）免疫学的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤を含む免疫治療用組成物
    として投与する、請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
  15. 前記NOIもしくはタンパク質を、アジュバントと共に、もしくは被験体の細胞内でアジュバントを発現しうるポリヌクレオチドと共に投与する、請求項1〜13のいずれか1項記載の方法、または、前記組成物が更にアジュバントを含むかもしくは被験体の細胞内でアジュバントを発現しうるポリヌクレオチドを含む、請求項14記載の方法。
  16. 前記アジュバントが大腸菌（E. coli）熱不安定性エンテロトキシン（LT）またはビブリオ・コレレ（Vibrio cholerae）コレラ毒素（CT）の非毒性形態である、請求項15記載の方法。
  17. 前記アジュバントがLTエンテロトキシンのBサブユニット（LTB）またはCTコレラ毒素のBサブユニット（CTB）である、請求項15記載の方法。
  18. T細胞エピトープが病原体または癌細胞に由来するものである、請求項1〜17のいずれか1項記載の方法。
  19. T細胞エピトープがHSV、HIVまたはHPVに由来するものである、請求項1〜18のいずれか1項記載の方法。
  20. 被験体における疾患を予防または治療するために実施する、請求項1〜19のいずれか1項記載の方法。
  21. 前記NOIが少なくとも2つのHSV、HIVまたはHPV抗原をコードしている、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
  22. 前記NOIが、HIV-1 gagタンパク質またはそのgagエピトープを含有する断片、および第2のHIV抗原または該第2のHIV抗原のエピトープをコードする断片をコードしている、請求項21記載の方法。
  23. 前記第2の抗原が、Nef、RT、またはNefもしくはRTのエピトープを含有する断片よりなる群から選ばれる、請求項22記載の方法。
  24. 前記NOIが、
    ・Gag（p17,p24）、Nef末端切断型、
    ・Gag（p17,p24）（コドン最適化）、Nef（末端切断型）、
    ・Gag（p17,p24）、RT、Nef（末端切断型）、
    ・Gag（p17,p24）、コドン最適化RT、Nef（末端切断型）、
    ・Gag（p17,p24）、コドン最適化RT、コドン最適化Nef末端切断型；
    および／または、任意に、アイオワ長（Iowa length）HCMVプロモーター＋エキソン1の下流でウサギグロビンポリアデニル化シグナルの上流に、機能しうる形で連結された不活化コドン最適化RT、末端切断型Nef、およびコドン最適化gag遺伝子のp17/p24部分、
    よりなる群から選ばれる抗原の組合せをコードしている、請求項22記載の方法。
  25. 同じエピトープをそれぞれがコードしている少なくとも2つの異なるNOIを投与するか、および／または同じエピトープを含む少なくとも2つの異なるタンパク質を投与する、請求項1〜24のいずれか1項記載の方法。
  26. T細胞応答の惹起方法の有効性を試験するためのアッセイであって、該方法が
    （i）T細胞エピトープをコードする目的とするヌクレオチド（NOI）を投与することを各投与が含む、被験体への1〜14日間隔の少なくとも2回の投与を含む第1の免疫化、および所望により、
    （ii）該被験体への（a）該T細胞エピトープをコードするNOIまたは（b）該T細胞エピトープを含むタンパク質の少なくとも1回の投与を含む第2の免疫化を含み、
    ここで、第1の免疫化の第1の投与と第2の免疫化の第1の投与との間が21〜365日間であり、かつ
    該アッセイが、該方法を哺乳動物被験体に対して行い、次いで該被験体における該エピトープに特異的な活性化または記憶T細胞のレベルを測定することを含んでなる、アッセイ。
  27. （i）第1の免疫化の投与のすべてが、第1の免疫化の第1の投与と基底レベルへの活性化T細胞のレベルの低下との間の時間内に含まれるのかどうか、および／または
    （ii）第2の免疫化の第1の投与が基底レベルへの活性化T細胞のレベルの低下の後に行われるのかどうか、
    を判定することを含む、請求項26記載のアッセイ。
  28. （i）請求項1〜27のいずれか1項において規定されたNOIまたは請求項14記載の組成物、および
    （ii）請求項1〜27のいずれか1項記載の方法またはアッセイによる該NOIまたは組成物の投与のための説明書、
    を含んでなる、請求項1〜27のいずれか1項記載の方法またはアッセイを行うためのキット。
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