CN101365715B - 基质金属蛋白酶11疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及作为疫苗用于治疗肿瘤和癌症的含基质金属蛋白酶11(MMP-11)或基质裂解素-3(ST-3)的组合物或过量表达MMP-11的编码MMP-11的核酸。在具体实施方案中，组合物含有编码下述融合蛋白的核酸，所述的融合蛋白包括催化失活的MMP-11，其C末端连接有免疫增强元件，其中对编码MMP-11的密码子和免疫增强元件的密码子进行了优化，以增强融合多肽在人体细胞中的表达。在其它实施方案中，所述组合物含有催化失活的MMP-11，其C末端连接有免疫增强元件。本发明的组合物可单独使用或与针对其它肿瘤相关抗原的疫苗以及诸如放疗和化疗这样的常规疗法联合使用。
Description
对相关申请的交叉参考
本申请要求2005年10月7日申请的美国临时申请60/724,498的权利，其内容作为参考并入本申请。
发明领域
本发明涉及含有基质金属蛋白酶11(MMP-11)或溶基质蛋白酶-3(ST-3)的组合物或编码MMP-11的核酸用作治疗过量表达MMP-11的肿瘤和癌症的疫苗。在具体实施方案中，所述组合物含有编码下述融合蛋白的核酸，所述的融合蛋白包括催化失活的MMP-11，其C末端连接有免疫增强元件，其中编码MMP-11的密码子和免疫增强元件已进行优化以增强融合多肽在人细胞中的表达。在其它实施方案中，本发明的组合物含有催化失活的MMP-11，其C末端连接有免疫增强元件。本发明的组合物可单独使用或与抗其它肿瘤相关抗原的疫苗联合使用，并用于诸如放疗和化疗这样的常规疗法。
背景技术
基质金属蛋白酶11(MMP-11)或溶基质蛋白酶3(ST3)在许多扩散性原发癌及其多数转移中表达，在肉瘤及其它非上皮恶性肿瘤中较为罕见(参见Basset等，Critical Reviews in Oncology/Hematology26：43-53，(1997))。可通过测定MMP-11表达水平来确定有最高风险发生癌症复发的患者。已表明那些在其肿瘤中具有高水平的MMP-11RNA或蛋白的病人的复发性乳腺癌的发生频率要高于那些在其肿瘤中具有低水平的MMP-11 RNA或蛋白的病人。类似地，发现同正常组织相比，在胰腺癌中MMP-11的表达增加了，并且MMP-11的表达水平同所涉及的淋巴结以及总存活率强相关(Jones等，Clin.CancerRes.10：2832-2845，(2004))。同非肿瘤组织中的MMP-11 mRNA表达相比，结肠癌中的MMP-11 mRNA表达也显著增加(Thewes等，Diagn.MoI.Pathol.5：284-290，(1996))。
已通过几个潜伏期观测资料阐释了MMP-11在癌症发展中的作 用。例如，已表明MMP-11的表达可在小鼠中促进肿瘤形成(Noel等，J Clin Invest 97：1924-1930(1996))。也表明了MMP-11可促进恶性上皮细胞以旁分泌形式的归巢，并且归巢似乎需要诸如基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)(Mari等，J.Biol.Chem.273：618-626(1998))这样的胞外基质关联因子(Masson等，J.Cell Biol.140：1535-1541(1998))。MMP-11蛋白酶活性可以通过改变胞外基质并诱导其释放微环境因子来调节癌症发展(Noel等，Oncogene 19：1605-1612(2000))。已表明MMP-11在肿瘤细胞上具有抗细胞凋亡及抗坏死作用(Boulay等，Cancer Res.61：2189-2193(2001))，这似乎是通过其催化活性来介导的(Wu等，J.Cell Biochem.82：549-555(2001))。已表明MMP-11缺陷可增加无瘤生存率并调节局部或远处侵入(Andarawewa等，Cancer Res.63：5844-5849(2003))。在胃癌细胞中敲除MMP-11 mRNA似乎可在体外及体内强烈抑制肿瘤生长(Deng等，Biochem.Biophys.Res.Comm.26：274-281(2005))。也已经表明MMP-11可干预免疫系统对肿瘤的应答，其中由MMP-11剪切所生成的1-蛋白酶抑制物的剪切产物可降低肿瘤细胞对自然杀伤细胞(NK)的敏感性(Kataoka等，Am.J.Pathol.154：457-468，(1999))。此外，同野生型小鼠相比，在缺失MMP-11的小鼠中有更多数目的嗜中性粒细胞和巨噬细胞会渗透到肿瘤中，表明MMP-11可抑制这些细胞的化学引诱物(Boulay等，Cancer Res.61：2189-2193(2001))。因此，MMP-11似乎在肿瘤发生的初始阶段发挥着至关重要的作用。
已开发了几种可阻碍MMPs的合成、防止它们与指导其到细胞表面发挥作用的分子相互作用、或抑制它们酶活的试剂(综述参见Egeblad and Werb，Nature Reviews 2：163-174(2002))。大多数试剂并非特异针对MMP-11，而是干扰了MMP家族其它成员的功能。不过，几种这些MMP抑制物的临床试验已经表明抑制物具有有限的抗肿瘤作用。因此，根据上文，对于抑制或者干扰MMP-11活性的抗癌症治疗及处理存在着需求。
发明简述
本发明提供了作为疫苗用于治疗肿瘤和癌症的、含基质金属蛋白酶11(MMP-11)或者溶基质蛋白酶-3(ST-3)的组合物、过量表达 MMP-11的编码MMP-11核酸。在具体实施方案中，所述组合物含有编码下述融合蛋白的核酸，所述的融合蛋白包括催化失活的MMP-11，其C末端连接有免疫增强元件，其中对编码MMP-11的密码子和免疫增强元件进行了优化，以增强融合多肽在人细胞中的表达。在其它实施方案中，所述组合物含有催化失活的MMP-11，其C末端连接有免疫增强元件。本发明的组合物可单独使用或与抗其它肿瘤相关抗原的疫苗以及诸如放疗和化疗这样的常规疗法联合使用。
因此，本发明提供含有编码MMP-11多肽的核苷酸序列的核酸，其中一个或多个在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较低的、编码MMP-11的核苷酸密码子被在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较高的核苷酸密码子所替换(即，已对核苷酸序列进行优化以在人源细胞中高表达核酸)。
在核酸的优选实施方案中，由核苷酸序列编码的MMP-11进一步包括可使MMP-11催化失活的突变，在具体实施方案中，突变位于MMP-11的锌结合结构域。
在核酸的进一步的实施方案中，多核苷酸编码MMP-11，其中多核苷酸编码人MMP-11或者灵长类来源的MMP-11。
在核酸的更进一步的实施方案中，核酸包括核苷酸序列为SEQ IDNO：4的核苷酸序列。
本发明进一步提供编码融合多肽的核酸，所述的融合多肽具有与免疫增强元件或其实质部分相连接的MMP-11。在优选的实施方案中，一个或多个在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较低的编码融合多肽的核苷酸密码子被在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较高的核苷酸密码子所替换。在具体的实施方案中，免疫增强元件选自热休克蛋白(HSP)70、溶酶体缔合性膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素的C片段(FrC)、FrC的N末端结构域(DOM)、免疫球蛋白G1的恒定链的重链片段(FcIgG)、水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)、来自霍乱弧菌的霍乱毒素(CT)和热不稳定毒素的B亚基(LTB)
在核酸的通常优选实施方案中，免疫增强元件是大肠杆菌的LTB。在进一步的实施方案中，LTB不包括信号序列。在核酸更进一步的实施方案中，LTB是由如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列所编 码的。
在上述核酸优选的实施方案中，MMP-11包括可使MMP-11催化失活的突变。
在核酸进一步的实施方案中，MMP-11是由如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列所编码的。在更进一步的实施方案中，融合多肽包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
本发明进一步提供了含有与启动子可操作连接的任一上述实施方案中核酸的表达载体。本发明进一步提供了包含任一实施方案中的上述表达载体的宿主细胞。本发明进一步提供了生产过程，包括在可产生融合多肽的条件下于培养基中培养上述宿主细胞。
本发明进一步提供了含有与免疫增强元件或其实质部分相连接的MMP-11的融合多肽。
在融合多肽的具体实施方案中，免疫增强元件选自热休克蛋白(HSP)70、溶酶体缔合性膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素的C片段(FrC)、FrC的N末端结构域(DOM)、免疫球蛋白G1的恒定链的重链片段(FcIgG)、水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)、来自霍乱弧菌的霍乱毒素(CT)和热不稳定毒素的B亚基(LTB)。
在融合多肽的通常优选实施方案中，免疫增强元件多肽是大肠杆菌的LTB。在更进一步的实施方案中，LTB不包括信号序列。在更进一步的实施方案中，LTB包括如SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列。
在融合多肽的优选实施方案中，MMP-11包括可使其催化失活的突变。优选地，突变位于MMP-11的锌结合结构域。在更进一步的实施方案中，含有融合多肽的MMP-11多肽包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或多肽包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
本发明进一步提供了含有编码MMP-11的核苷酸序列的多核苷酸疫苗，其中一个或多个在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较低的、编码MMP-11的核苷酸密码子被在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较高的核苷酸密码子所替换。
在多核苷酸疫苗的优选实施方案中，由核苷酸序列所编码的MMP-11进一步包括可使MMP-11催化失活的突变。在通常优选的实施方案中，突变位于MMP-11的锌结合结构域。在多核苷酸疫苗的更进一步的实施方案中，MMP-11是人源或灵长类来源的MMP-11。在 多核苷酸疫苗的更进一步的实施方案中，核苷酸序列包括SEQ IDNO：4的核苷酸序列。
本发明进一步提供了编码具有与免疫增强元件或其实质部分相连接的MMP-11的融合多肽的多核苷酸疫苗。在多核苷酸疫苗的具体实施方案中，免疫增强元件选自热休克蛋白(HSP)70、溶酶体缔合性膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素的C片段(FrC)、FrC的N末端结构域(DOM)、免疫球蛋白G1的恒定链的重链片段(FcIgG)、水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)、来自霍乱弧菌的霍乱毒素(CT)和热不稳定毒素的B亚基(LTB)。
在多核苷酸疫苗的优选实施方案中，由核苷酸序列编码的MMP-11进一步包括可使MMP-11催化失活的突变。在通常优选的实施方案中，突变位于MMP-11的锌结合结构域。在多核苷酸疫苗的更进一步的实施方案中，MMP-11是人源或灵长类来源的MMP-11。在多核苷酸疫苗的更进一步的实施方案中，核苷酸序列包括SEQ IDNO：4的核苷酸序列。
在多核苷酸疫苗的通常优选的实施方案中，免疫增强元件多肽是大肠杆菌热不稳定毒素(LTB)的B亚基。在更进一步的实施方案中，LTB不包括信号序列，在更进一步的实施方案中，LTB是由如SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列所编码的。
在多核苷酸疫苗的更优选的实施方案中，一个或多个在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较低的、编码融合蛋白的核苷酸密码子被在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较高的核苷酸密码子所替换。
在进一步的实施方案中，MMP-11是由如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列所编码的。在更进一步的实施方案中，融合多肽包括如SEQID NO：11所示的核苷酸序列。
在多核苷酸疫苗的更进一步实施方案中，疫苗进一步包括一个或多个遗传佐剂。这种遗传佐剂包括，但不限定于，诸如CD80及CD86这样的辅刺激分子、诸如白介素1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子α与β(TNF-α及TNF-β)这样的致炎细胞因子、诸如IL-2、IL-12、IL-15及IL-18这样的细胞因子、诸如IL-4、IL-5、IL-10这样的Th2细胞因子、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、 粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-8、干扰素γ诱导的蛋白10(γIP10)、巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP-1α)、以及RANTES。
在多核苷酸疫苗更进一步实施方案中，疫苗进一步包括一种或多种常规佐剂。常规佐剂包括，但并不限定于，诸如磷酸铝或氢氧化铝这样的金属盐、诸如单磷酰脂质A、霍乱毒素、胞壁肽这样的来源于细菌的佐剂、诸如阳离子脂质体及包被甘露糖聚的脂质体这样的脂肪微粒、诸如QS-21这样的乳化佐剂、以及诸如乌苯美司这样的合成佐剂。
本发明进一步提供了含具有与免疫增强多肽或其实质部分相连接的MMP-11的融合多肽的多肽疫苗。在优选实施方案中，MMP-11具有可使其催化失活的突变。在通常的优选实施方案中，突变位于MMP-11的锌结合结构域。
在多肽疫苗的具体实施方案中，免疫增强元件选自热休克蛋白(HSP)70、溶酶体缔合性膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素的C片段(FrC)、FrC的N末端结构域(DOM)、免疫球蛋白G1的恒定链的重链片段(FcIgG)、水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)、来自霍乱弧菌的霍乱毒素(CT)和热不稳定毒素的B亚基(LTB)。
在通常的优选实施方案中，免疫增强元件是大肠杆菌的LTB。在更进一步的实施方案中，LTB不包括信号序列。在更进一步的实施方案中，LTB包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
在多肽疫苗的更进一步实施方案中，MMP-11包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或包括如SEQ DD NO：10所示的氨基酸序列。
在多肽疫苗的更进一步实施方案中，疫苗包括一种或多种可调节针对Th1或Th2应答的免疫应答的分子佐剂。这种分子佐剂包括，但不限定于，诸如CD80及CD86这样的辅刺激分子、诸如白介素1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子α与β(TNF-α及TNF-β)这样的致炎细胞因子、诸如IL-2、IL-12、IL-15及IL-18这样的细胞因子、诸如IL-4、IL-5、IL-10这样的Th2细胞因子、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-8、干扰素γ诱导的蛋白10(γIP10)、巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP-1α)、以及RANTES。
在多肽疫苗的更进一步实施方案中，疫苗可包括一种或多种常规 佐剂。常规佐剂包括，但并不限定于，诸如磷酸铝或氢氧化铝这样的金属盐、诸如单磷酰脂质A、霍乱毒素、胞壁肽这样的来源于细菌的佐剂、诸如阳离子脂质体及包被甘露糖聚的脂质体这样的脂肪微粒、诸如QS-21这样的乳化佐剂、以及诸如乌苯美司这样的合成佐剂。
本发明进一步提供了具有编码MMP-11的核苷酸序列的核酸的用途，其中一个或多个在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较低的、编码MMP-11的核苷酸密码子被在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较高的核苷酸密码子所替换；编码含有与免疫增强元件相连接的MMP-11的融合多肽的核酸在治疗个体的癌症的药物中的用途；及含有与免疫增强元件相连接的MMP-11的融合多肽在治疗个体的癌症药物中的用途。
本发明进一步提供了在个体中治疗癌症的方法，包括提供多核苷酸疫苗，该疫苗包括含编码MMP-11的核苷酸序列的核酸，其中一个或多个在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较低的、编码MMP-11的核苷酸密码子被在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较高的核苷酸密码子所替换，或者包括含有与免疫增强元件相连接的MMP-11的融合多肽；及对个体给药该疫苗以治疗癌症。在编码融合多肽的核酸的通常优选的实施方案中，一个或多个在人体内编码高表达蛋白的核酸中没有出现的编码融合多肽的核苷酸密码子被在人体内编码高表达蛋白的核酸中出现的核苷酸密码子所替换。
在上述方法的具体实施方案中，个体接受了从化疗、放疗、以及针对肿瘤相关抗原的疫苗中所选择的一种或多种治疗方法。在更进一步的实施方案中，个体患有选自乳腺、结肠、头颈、肺、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤(基细胞癌)、子宫(子宫颈癌和子宫内膜癌)的浸润性癌或者可能发展为浸润性癌的非浸润性癌。
在所述方法的优选实施方案中，由核苷酸序列所编码MMP-11进一步包括使MMP-11催化失活的突变。在通常优选的实施方案中，突变位于MMP-11的锌结合结构域。在多核苷酸疫苗更进一步的实施方案中，MMP-11是人源或者灵长类来源的MMP-11。在多核苷酸疫苗更进一步的实施方案中，核苷酸序列包括SEQ ID NO.4的核苷酸序列。
在所述方法的具体实施方案中，免疫增强元件选自热休克蛋白(HSP)70、溶酶体缔合性膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素的C片段 (FrC)、FrC的N末端结构域(DOM)、免疫球蛋白G1的恒定链的重链片段(FcIgG)、水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)、来自霍乱弧菌的霍乱毒素(CT)和热不稳定毒素的B亚基(LTB)。
在所述方法的通常优选的实施方案中，免疫增强元件多肽是大肠杆菌热不稳定毒素的B亚基(LTB)。在更进一步的实施方案中，LTB不包括信号序列，在更进一步的实施方案中，LTB是由如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列编码的。
在进一步的实施方案中，MMP-11是由如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列编码的。在更进一步的实施方案中，融合多肽包括如SEQ IDNO：11所示的核苷酸序列。
在所述方法的更进一步的实施方案中，疫苗进一步包括一种或多种遗传佐剂。这类遗传佐剂包括但并不限定于，诸如CD80及CD86这样的辅刺激分子、诸如白介素1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子α与β(TNF-α及TNF-β)这样的致炎细胞因子、诸如IL-2、IL-12、IL-15及IL-18这样的细胞因子、诸如IL-4、IL-5、IL-10这样的Th2细胞因子、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-8、干扰素γ诱导的蛋白10(γIP10)、巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP-1α)、以及RANTES。
在所述方法的更进一步的实施方案中，疫苗进一步包括一种或多种常规佐剂。常规佐剂包括，但并不限定于，诸如磷酸铝或氢氧化铝这样的金属盐、诸如单磷酰脂质A、霍乱毒素、胞壁肽这样的来源于细菌的佐剂、诸如阳离子脂质体及包被甘露糖聚的脂质体这样的脂肪微粒、诸如QS-21这样的乳化佐剂、以及诸如乌苯美司这样的合成佐剂。
本发明进一步提供了一种在个体中治疗癌症的方法，包括提供含具有与免疫增强元件相连接的MMP-11的融合多肽的疫苗；并对个体给药该疫苗以治疗癌症。
在上述方法的具体实施方案中，个体接受了从化疗、放疗、以及针对肿瘤相关抗原的疫苗中所选择的一种或多种治疗方法。在更进一步的实施方案中，个体患有选自乳腺、结肠、头颈、肺、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤(基细胞癌)、子宫(子宫颈癌和子宫内膜癌)的浸润性癌或者可能发展为浸润性癌的非浸润性癌。
在所述方法的具体实施方案中，免疫增强元件选自热休克蛋白(HSP)70、溶酶体缔合性膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素的C片段(FrC)、FrC的N末端结构域(DOM)、免疫球蛋白G1的恒定链的重链片段(FcIgG)、水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)、来自霍乱弧菌的霍乱毒素(CT)和热不稳定毒素的B亚基(LTB)。
在通常优选的方法中，免疫增强元件是大肠杆菌LTB。在更进一步的实施方案中，LTB不包括信号序列。在更进一步的实施方案中，LTB包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
在所述方法的更进一步的实施方案中，MMP-11包括如SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列或者包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
在所述方法的更进一步的实施方案中，疫苗包括一种或多种可调节针对Th1或Th2应答的免疫应答的分子佐剂。这里分子佐剂包括，但并不限定于，诸如CD80及CD86这样的辅刺激分子、诸如白介素1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子α与β(TNF-α及TNF-β)这样的致炎细胞因子、诸如IL-2、IL-12、IL-15及IL-18这样的细胞因子、诸如IL-4、IL-5、IL-10这样的Th2细胞因子、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-8、干扰素γ诱导的蛋白10(γIP10)、巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP-1α)、以及RANTES。
在多肽疫苗的更进一步实施方案中，疫苗可包括一种或多种常规佐剂。常规佐剂包括，但并不限定于，诸如磷酸铝或氢氧化铝这样的金属盐、诸如单磷酰脂质A、霍乱毒素、胞壁肽这样的来源于细菌的佐剂、诸如阳离子脂质体及包被甘露糖聚的脂质体这样的脂肪微粒、诸如QS-21这样的乳化佐剂、以及诸如乌苯美司这样的合成佐剂。
本发明进一步提供了鉴定用于抑制过量表达MMP-11的癌症的分析物的方法，它包括在小鼠中诱发癌症；对诱发癌症的小鼠给药分析物；并确定分析物是否在诱发了肿瘤的小鼠中抑制了癌症，这可鉴定出抑制过量表达MMP-11的癌症的分析物。
在具体的实施方案中，可确认分析物在给药小鼠前是可与MMP-11结合的。
在更进一步的实施方案中，在小鼠中诱发的癌症是结肠癌，在更 进一步的实施方案中，通过对小鼠给药足以在小鼠中诱发癌症的1-2二甲肼(DMH)而在小鼠中诱发癌症。
定义
在整个说明书及附加的权利要求中，除非文中另外明确说明，否则单数形式的“a”、“an”和“the”包括其复数相关含义。
在整个说明书及附加的权利要求中，使用了以下定义和缩写：
术语“启动子”是指DNA链上与RNA聚合酶结合的识别位点。启动子与RNA聚合酶形成初始复合物，以引发并启动位于启动子下游的核酸序列的转录活性。启动子可通过启动子中的包括称为“增强子”的活化序列或称为“沉默子”的抑制序列来进行修饰。术语进一步包括诱导型启动子和组成型启动子。
术语“表达盒”是指可从载体上来表达的核苷酸或基因序列，例如，编码cDkk-4蛋白的核苷酸或基因序列。通常，表达盒含有插入到载体中的基因序列，在某些实施方案中它可提供调控序列以表达核苷酸或基因序列。在其它实施方案中，核苷酸或基因序列提供了用于其表达的调控序列。在进一步的实施方案中，载体提供了某些调控序列，核苷酸或基因序列提供了其它的调控序列。例如，载体可提供用于转录核苷酸或基因序列的启动子，核苷酸或基因序列提供了转录终止序列。可由载体提供的调控序列包括，但不限定于，增强子、转录终止序列、剪切受体和供体序列、内含子、核糖体结合序列、及多聚A附加序列。
术语“载体”在某种意义上是指DNA片段可通过其导入到宿主生物或宿主组织中。有多种类型的载体，包括质粒、病毒(包括腺病毒)、噬菌体和粘粒。
术语“MMP-11”是指MMP-11蛋白或者多肽。
术语“免疫增强元件”是指相对于全长野生型MMP-11而言，本发明的MMP-11融合多肽中可刺激或增强对相关MMP-11的免疫应答的多肽部分。本发明中免疫增强元件包括，但并不限定于，含有选自热休克蛋白(HSP)70、溶酶体缔合性膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素的C片段(FrC)、FrC的N末端结构域(DOM)、免疫球蛋白G1的恒定链的重链片段(FcIgG)、水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)、 来自霍乱弧菌的霍乱毒素(CT)和大肠杆菌或其它细菌物种的热不稳定毒素的B亚基(LTB)的多肽中全部或实质部分的多肽。
术语“融合蛋白”或“融合多肽”是指具有至少两个共价连接的多肽的蛋白，其中一个多肽来自某个蛋白序列或结构域，另一个多肽来自另一个蛋白序列或结构域。本发明的融合蛋白包括MMP-11和另一个多肽，它包含免疫增强元件或其实质部分，在某些情况下，它是细菌毒素。MMP-11可以是人MMP-11或来自另一物种的MMP-11。含有融合蛋白的多肽优选地是N末端与C末端相连接。MMP-11和免疫增强元件可以以任何顺序融合。在本发明的某些实施方案中，MMP-11的C末端与免疫增强元件的氨基末端融合，或免疫增强元件与MMP-11的氨基末端融合。
术语“MMP-11融合蛋白”是一个统称，是指如上所述的融合蛋白，它包含与含有免疫增强元件或其部分的多肽相融合的MMP-11多肽或其片段或变异体。术语“MMP-11融合蛋白”与术语“MMP-11融合多肽”可交换使用。
术语“重组MMP-11”是指通过基因工程修饰的MMP-11。例如，该术语包括本文所述的催化失活的MMP-11及MMP-11融合多肽。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”是指任何通过磷酸二酯键相结合的核苷酸多聚体，例如任何长度的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)分子。多核苷酸或核酸包括基因及其片段或部分、探针、寡核苷酸及引物。DNA可以是互补DNA(cDNA)或基因组DNA，例如，编码MMP-11或其变异体的基因。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可交换使用。
术语“重组多核苷酸”或“重组核酸”是指通过基因工程修饰的多核苷酸。例如，该术语包括编码MMP-11的多核苷酸，其中多核苷酸包括可使MMP-11催化失活的突变。该术语进一步包括编码MMP-11或催化失活的MMP-11的多核苷酸，其中一个或多个核苷酸密码子已进行了优化以增强在人体内的表达。该术语也包括本文所述的MMP-11融合多肽。
术语“其变异体”是指重组MMP-11或多核苷酸。例如，催化失活的MMP-11或MMP-11融合多肽是野生型MMP-11的变异体。编码其中密码子已被优化以增强在人体内表达的MMP-11、催化失活的 MMP-11、或者MMP-11融合多肽的多核苷酸是编码野生型MMP-11的野生型多核苷酸的变异体。
术语“实质上相似”是指给定的核酸或氨基酸序列与参考序列至少有75％、优选地为85％、更优选地为90％、再更优选地为95％的一致性。在本发明中，参考序列可以是本文范围内所示的野生型MMP-11的核苷酸或氨基酸序列、或者某种免疫增强元件的野生型核苷酸或氨基酸的相应部分。参考序列可以是，例如，野生型人或非人MMP-11序列。因此，与野生型MMP-11或其片段“实质上相似”的MMP-11序列与野生型MMP-11的相应片段根据片段长度至少有75％的一致性，优选地为85％的一致性、更优选地为90％的一致性、再更优选地为95％的一致性。例如，可通过使用诸如从University ofWisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)获得的GAP电脑程序，6.0版这样的序列分析软件比较序列信息来确定是否给定的MMP-11或者免疫增强元件多肽或核苷酸序列与参考序列“实质上相似”。GAP程序使用了经Smith and Waterman(Ada.Appl.Math.2：482，1981)修正后的Needleman and Wunsch(J.MoI.Biol.48：443，1970)的比对方法。
术语“基因”是指编码基因产物的基因组核酸，这对于很多基因而言同时含有外显子与内含子序列，以及来源于编码基因产物的mRNA的cDNA，它不含有内含子序列。
术语基因或者多肽、变异体、片段或其亚基的“实质部分”，是指参考序列中至少50％，优选地为75％，更优选地为90％，再更优选地为95％的部分。
短语“密码子优化”、“为了在人体内增强表达对密码子进行优化”、“为了高表达已对核苷酸序列进行优化”及其它类似用于描述本发明中多核苷酸的短语，是指一个或多个在某生物体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较低的编码MMP-11和/或免疫增强元件的核苷酸密码子被在该生物体内编码高表达蛋白的核酸中出现频率较高的核苷酸密码子所替换。对于具体氨基酸而言“低频率”的核苷酸密码子是在该生物体内编码高表达蛋白的核酸中使用频率最低的核苷酸密码子。对于具体氨基酸而言“高频率”的核苷酸密码子是在该生物体内编码高表达蛋白的核酸中使用频率最高的、或者是使用频率高 于最低频率核苷酸密码子的核苷酸密码子。
术语“治疗”是指治愈性治疗以及防治性或预防性措施。需要治疗的个体包括那些已经生病的个体以及那些倾向于发生病变的个体或者其中预防病变发生的个体。
本发明中的多核苷酸及多肽适于用于与过表达MMP-11相关的病变或疾病的治疗，这些疾病的特征是异常细胞增殖，包括但并不限定于乳腺癌、结肠癌及肺癌。
术语“有效剂量”是指引入足量的疫苗组合物以产生足够水平的多肽，从而导致免疫应答。本领域的技术人员知道这种水平是可变化的。
术语“分析物”包括分子、化合物、组合物、药物、蛋白质、肽、核酸、抗体及其活性片段、核酸适体、肽适体及其它类似物。
附图的简要描述
图1所示的是载体pV1JnsB-mMMP-11的图谱。标出了人CMV启动子和鼠MMP-11cDNA。
图2所示的是鼠MMP-11的表达。用pV1JnsB-mMMP-11转染HeLa细胞，并通过Western印迹分析提取物。检测到与MMP-11分子量相对应的条带。
图3所示的是密码子优化了的编码催化失活的鼠MMP-11的核酸的核苷酸序列(mMMP-11opt)(SEQ ID NO：13)。对应于密码子优化了的、催化失活的mMMP-11的核苷酸用黑体表示，附加在多接头上的XbaI位点的核苷酸用下划线标出。克隆位点、Kozak序列及终止密码子的核苷酸用斜体表示。mMMP-11起始密码子用粗体表示。
图4所示的是密码子优化了的编码与大肠杆菌LTB相连接的催化失活的mMMP-11的核酸的核苷酸序列(mMMP-11-LTBopt)(SEQ IDNO：14)。对应于密码子优化了的、催化失活的mMMP-11的核苷酸用黑体表示，附加在多接头上的XbaI位点的核苷酸用下划线标出。编码大肠杆菌LTB序列的核苷酸用小写字母表示。克隆位点、Kozak序列及终止密码子的核苷酸用斜体表示。
图5所示的是催化失活的mMMP-11-LTBopt融合多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。含对应于催化失活的mMMP-11的多肽的氨基 酸序列用黑体表示，LTB序列用斜体表示。由多接头编码的氨基酸用下划线标出。
图6A所示的是含密码子优化了的、编码催化失活的mMMP-11的多核苷酸的载体pV1J-mMMP-11(cat-)opt的图谱。
图6B所示的是所示的是含密码子优化了的、编码与大肠杆菌LTB相连接的催化失活的mMMP-11的多核苷酸的载体pV1J-mMMP-11(cat-)-LTBopt的图谱。
图7所示的是通过抗MMP-11或抗LTB抗体所表示出的在用pV1J-mMMP-11(cat-)-LTBopt转染的HeLa细胞中pV1J-mMMP-11(cat-)-LTBopt的表达的Western印迹。
图8所示的是由mMMP-11、mMMP-11opt和mMMP-11(cat-)-LTBopt所引发细胞介导的免疫应答。6只BALB/c小鼠通过4个每周一次的DNA电穿孔(DNA-EP)注射来进行免疫。通过用跨mMMP-11蛋白C末端的肽进行的IFNγ细胞内染色来测定免疫应答。圆点表示每个单独的小鼠的％CD8+IFNγ+。水平线表示组内的几何平均值。
图9所示的是由催化失活的mMMP-11和mMMP-11(cat-)-LTBopt引发的体液应答。BALB/c小鼠通过4个每周一次的DNA电穿孔(DNA-EP)注射来进行免疫。通过Western印迹测定抗体的存在。对应于mMMP-11的50KDa条带的检测表明对mMMP-11的体液应答。
图10所示的是mMMP-11在由DMH诱导的鼠结肠瘤细胞中的过量表达。用6次静脉注射DMH处理A/J鼠。5周后，通过IHC和Western印迹分析结肠组织。Veh表示赋形剂(PBS)。
图11A所示的是用于验证mMMP-11(cat-)-LTBopt基因疫苗在抑制结肠癌的治疗效果所进行的实验流程。用6次静脉注射DMH处理A/J鼠。1组鼠不进行处理(自然组)，第二组用50μg质粒pV1J-mMMP-11(cat-)-LTBopt进行免疫。在最后一次DMH注射7到8周后，处死鼠，在显微镜下分析结肠的异常隐窝(crypt)(ACF)(图11B和11C)、息肉(图11D)和腺瘤(图11E)的形成。
图11B所示的是mMMP-11(cat-)-LTBopt基因疫苗抑制ACF的治疗效果。空心圆点表示每只鼠形成的数量；实心圆点表示组的几何平 均值。进行了统计学分析(T-student检验)。
图11C所示的是mMMP-11(cat-)-LTBopt基因疫苗抑制ACF的治疗效果。空心圆点表示每只鼠形成的数量；实心圆点表示组的几何平均值。进行了统计学分析(T-student检验)。
图11D所示的是mMMP-11(cat-)-LTBopt基因疫苗抑制息肉的治疗效果。空心圆点表示每只鼠形成的数量；实心圆点表示组的几何平均值。进行了统计学分析(T-student检验)。
图11E所示的是mMMP-11(cat-)-LTBopt基因疫苗抑制腺瘤的治疗效果。空心圆点表示每只鼠形成的数量；实心圆点表示组的几何平均值。进行了统计学分析(T-student检验)。
图12A所示的是由抗mMMP-11基因疫苗引发的免疫应答。用6次静脉注射DMH处理BALB/c鼠。1组鼠不进行处理(自然组)，第二组用50μg质粒pV1J-mMMP-11(cat-)-LTBopt进行免疫。通过IFNγ的细胞内染色测定免疫应答。黑色圆点表示每个单独的鼠的％CD8+IFNγ。水平线表示组内的几何平均值。
图12B所示的是由抗mMMP-11基因疫苗引发的免疫应答。用6次静脉注射DMH处理BALB/c鼠。1组鼠不进行处理(自然组)，第二组用50μg质粒pV1J-mMMP-11(cat-)-LTBopt进行免疫。通过CTL检测法测定免疫应答，其中效应细胞用mMMP-11肽刺激7天。以未携带或携带mMMP-11肽的p815肥大细胞瘤为靶细胞。
图13A所示的是mMMP-11(cat-)-LTBopt基因疫苗在BALB/c鼠中抑制ACF的治疗效果。在最后一次DMH注射7到8周后，处死鼠，在显微镜下分析结肠的ACF。空心圆点表示每只鼠形成的数量；实心圆点表示组的几何平均值。进行了统计学分析(T-student检验)。
图13B所示的是mMMP-11(cat-)-LTBopt基因疫苗在BALB/c鼠中抑制ACF的治疗效果。在最后一次DMH注射7到8周后，处死鼠，在显微镜下分析结肠的ACF。空心圆点表示每只鼠形成的数量；实心圆点表示组的几何平均值。进行了统计学分析(T-student检验)。
图13C所示的是mMMP-11(cat-)-LTBopt基因疫苗在BALB/c鼠中抑制息肉的治疗效果。在最后一次DMH注射7到8周后，处死鼠，在显微镜下分析结肠的息肉。空心圆点表示每只鼠形成的数量；实心圆点表示组的几何平均值。进行了统计学分析(T-student检验)。
图13D所示的是mMMP-11(cat-)-LTBopt基因疫苗在BALB/c鼠中抑制腺瘤的治疗效果。在最后一次DMH注射7到8周后，处死鼠，在显微镜下分析结肠的腺瘤。空心圆点表示每只鼠形成的数量；实心圆点表示组的几何平均值。进行了统计学分析(T-student检验)。
图14所示的是编码催化失活的人MMP-11的核酸的核苷酸序列(hMMP-11(cat-)opt)，其中为了在人体内表达而优化了密码子(SEQID NO：4)。
图15所示的是催化失活的hMMP-11的氨基酸序列(SEQ IDNO：5)。
图16所示的是编码含与大肠杆菌LTB连接的催化失活的hMMP-11的融合多肽的核酸的核苷酸序列，其中为了在人体内表达而优化了编码MMP-11和LTB的密码子(SEQ ID NO：12)(hMMP-11(cat-)-LTBopt)。编码LTB 1到21个氨基酸的密码子不包括在融合多肽中。对应于密码子优化的、催化失活的hMMP-11的核苷酸用黑体表示，多接头中含XbaI的其它核苷酸用下划线表示。编码大肠杆菌LTB序列的核苷酸用小写字母表示。
图17所示的是催化失活的hMMP-11-LTB融合多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。对应于催化失活的MMP-11的氨基酸用大写字母表示，含LTB的氨基酸用斜体表示，由多接头编码的氨基酸用下划线表示。起始密码子用粗体表示。
图18所示的是含密码子优化了的、编码催化失活的hMMP-11的多核苷酸的载体pV1J-hMMP-11(cat-)opt的图谱。
图19A所示的是DMH不干扰BALB/c小鼠的CD8+免疫应答。
图19B所示的是DMH不干扰A/J小鼠的CD8+免疫应答。
图19C所示的是DMH不干扰A/J小鼠的CD4+免疫应答。
图20所示的是含密码子优化了的、编码与大肠杆菌LTB相连接的催化失活的hMMP-11的多核苷酸的载体pV1J-hMMP-11(cat-)-LTBopt(参见SEQ ID NO：2)的图谱。
发明详述
本发明提供了可用作在个体中抑制过量表达MMP-11的肿瘤和癌症的抗MMP-11疫苗，特别是抑制过量表达MMP-11的浸润性癌，譬
如乳腺、结肠、头颈、肺、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤(基细胞癌)、子宫(子宫颈癌和子宫内膜癌)的特定癌症或可能发展为浸润性癌的非浸润性癌。例如，抗MMP-11疫苗或抗肿瘤相关抗原(抗TAA)疫苗可用于针对肿瘤细胞和基质间隔的单一治疗方案中；可与另一种通过多特异细胞介导的免疫应答来针对肿瘤细胞和基质间隔的抗TAA疫苗用于多治疗方案中；可与其它分子或佐剂一起用于多治疗方案中；可用于包括化疗的治疗中，其基本原理是使得基质结构对细胞毒性试剂更为通透；可用于包括放疗的治疗中；以及任一前述治疗中，其中MMP-11作为多抗原决定簇多肽或者微基因的一部分来提供。本发明中的抗MMP-11疫苗可以是多肽疫苗，或者优选地，是多核苷酸疫苗。
如实施例所示，已发现对具有用1，2-二甲肼(DMH)诱导而产生的具有结肠肿瘤的小鼠给药抗MMP-11疫苗，可使小鼠结肠组织中的DMH诱导的癌症发展发生显著降低。在诸如A/J这样的敏感的小鼠品系以及敏感程度更低的BALB/c中，在结肠组织中DMH诱导的癌症发展经历了不同的阶段：(1)异常隐窝形成(ACF)；(2)腺瘤；(3)息肉以及(4)腺癌(See Bird，Cancer Lett.93(1)：55-71(1995))。发明人发现MMP-11在DMH诱导的肿瘤组织中过量表达，这表明在小鼠中DMH诱导的致癌作用适合作为抗MMP-11治疗和接种疫苗的模型。随后发明人发现含编码小鼠MMP-11(mMMP-11)核酸的基因疫苗，其中已通过在催化位点的Zn结合结构域引入点突变而使mMMP-11催化失活，可在小鼠中诱导免疫应答，当编码催化失活的mMMP-11与编码不含信号肽的大肠杆菌热不稳定毒素(LTB)B亚基的核酸相连接，并且优化编码MMP-11的密码子以增强在小鼠中的表达，而且优化编码LTB的密码子以增强在人体内的表达时，免疫应答进一步增强了。最后，发明人发现基因疫苗在降低小鼠中所有阶段的DMH诱导的致癌作用方面都是有效的。因此，基于小鼠模型的结果，本发明提供了含编码MMP-11的多核苷酸或者MMP-11多肽的抗MMP-11疫苗，优选地是具有下面所列出的实施方案中任一一项中的抗MMP-11疫苗。
在最基本的实施方案中，本发明提供了核酸或多核苷酸，它包含编码MMP-11或由于遗传密码的简并性、下述的基因工程、或者二者所产生的核酸或多核苷酸分子，该分子与合适的异源启动子可操作连接或处于其控制下，并且优选地其中编码MMP-11的核酸已被修饰成含有可使所编码的MMP-11催化失活的突变。可使MMP-11催化失活的突变可通过基因工程手段引入到多核苷酸中。编码催化失活的MMP-11的重组多核苷酸包括来源于人及非人物种的多核苷酸，其中多核苷酸的修饰包括可使所编码的MMP-11催化失活的突变。非人物种包括灵长类，譬如黑猩猩、恒河猴、猕猴等，以及其它非灵长类物种，譬如小鼠、大鼠、狗等。在当前优选的实施方案中，编码MMP-11的重组多核苷酸是来源于人的，或可编码具有与人MMP-11的氨基酸序列相同或者实质相似的氨基酸序列的MMP-11。在GenBankAccession No.NM 005940(SEQ ID NO：1)中列出了编码人MMP-11(hMMP-11)的cDNA的核苷酸序列。按如下所示修饰编码hMMP-11的重组多核苷酸，以编码可用于本发明中抗MMP-11疫苗的变异体。应理解虽然本发明当前优选的实施方案包含编码hMMP-11的重组核酸或多核苷酸，但本发明并不限定于编码hMMP-11的重组多核苷酸。本发明进一步包括其中重组多核苷酸编码非人来源的MMP-11的实施方案，并且已按如下所示修饰编码可用于本发明中抗MMP-11疫苗的MMP-11变异体的重组核酸或多核苷酸。
在重组核酸或多核苷酸的优选的实施方案中，由多核苷酸编码的MMP-11是MMP-11的催化失活的变异体。编码催化失活的MMP-11的多核苷酸可通过基因工程将一个或多个编码含MMP-11锌结合位点H E X X H X X G X X H(SEQ ID NO：3)保守氨基酸(对于hMMP-11，为SEQ ID NO：5中的215到225位氨基酸)的核苷酸密码子修饰成其它的氨基酸以产生编码催化失活的MMP-11的重组多核苷酸的方式来产生。例如，如SEQ ID NO：4中编码催化失活的hMMP-11的核苷酸序列所示，编码hMMP-11216位氨基酸的保守的谷氨酸的核苷酸密码子GAA被改变为编码氨基酸缬氨酸的核苷酸密码子GTG，以产生具有如SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的催化失活的hMMP-11，其中216位的氨基酸位缬氨酸。Noel等，Oncogene 19：1605-1612(2000)已表明将216位的核苷酸密码子改变为编码丙氨酸的核苷酸密码子会使得hMMP-11催化失活，用编码丙氨酸的核苷酸密码子替换mMMP-11相应区域220位氨基酸上的编码谷氨酸的核苷酸密码子会使得mMMP-11催化失活。虽然编码SEQ ID NO：3的氨基酸2号位点上的谷氨酸的核苷酸密码子被改变成编码缬氨酸或丙氨酸的核苷酸密码子以产生催化失活的MMP-11，但核苷酸密码子也可被换成其它氨基酸，或者在不违背本发明的前提下将编码一个或多个Zn结合结构域其它保守氨基酸的密码子改变成可编码其它的氨基酸。
已表明对编码特定多肽的基因或转录单元进行密码子优化可增加所编码多肽的表达，即增加了所编码多肽的mRNA的翻译。对于多核苷酸疫苗而言，增加所编码多肽的表达可产生更多所编码的多肽，它们可在体内增强免疫原性，这反过来可增强疫苗的有效性。在涉及密码子优化的文本中，术语“表达”及其变型是指编码多肽的mRNA的翻译，并非指编码多肽的多核苷酸的转录。此处所用术语“基因”是指基因组DNA或者编码多肽的RNA以及编码多肽的cDNA。
密码子优化是指当基因转入一个与基因天然遗传环境有着不同的核苷酸密码子用法的异源遗传环境时寻求提高基因异源表达的过程，或者是当基因天然含有一个或多个在基因天然遗传环境中编码高表达的基因所不常使用的核苷酸密码子时，提供基因在其天然遗传环境中异位表达的过程。换句话说，密码子优化涉及将在特定的遗传环境或生物中使用频率相对较低的基因中的核苷酸密码子替换为在该遗传环境或者生物中以更高频率来表达的基因中所使用的核苷酸密码子。通过这种方式，可增加基因产物(多肽)的表达(翻译)。这里有一个假定：在高表达基因中出现频率高的核苷酸密码子比出现频率低的核苷酸密码子可更有效地进行翻译。
通常，对特定基因进行密码子优化的方法依赖于确定在生物中高表达的基因中所用的每个氨基酸的核苷酸密码子的频率，然后将目的基因中那些在高表达的基因中使用频率低的核苷酸密码子替换为所确定的在高表达基因中所使用的核苷酸密码子(参见，例如Lathe，Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid SequenceData：Theoretical and Practical Considerations，J.Molec.Biol.：183：1-12(1985)；Nakamura等，Nuc.Acid Res.28：292(2000)；Fuglsang，ProteinExpression & Purification 31：247-249(2003))。有很多计算机程序可自动分析某种生物中编码某个基因的核酸的核苷酸密码子，并给出用 在该生物高表达的基因中发现的核苷酸密码子来替换该生物中出现频率低的核苷酸密码子的核苷酸密码子。为了方便起见，在下面表1中给出了来源于Nakamura(同上)的人核苷酸密码子使用表，可确定在人体内编码高表达蛋白的核酸中哪些核苷酸密码子出现频率较低，在人体内编码高表达蛋白的核酸中哪些核苷酸密码子出现频率更高。
表1
*终止密码子
因此，在进一步实施方案中，提供了重组多核苷酸，其中一个或多个编码含MMP-11的氨基酸的核苷酸密码子被优化，以增强所编码 的MMP-11的表达，从而在抗MMP-11疫苗方面可增强抗MMP-11疫苗的效率。即，一个或多个在编码生物高表达蛋白的核酸中出现频率较低的编码MMP-11和/或免疫增强元件的核苷酸密码子已被编码生物高表达蛋白的核酸中出现频率较高的核苷酸密码子所替代。优选地，优化核苷酸密码子，以增强MMP-11在人体内的表达。但是，优化重组多核苷酸的密码子以增强在另一种生物——例如灵长类中的表达，与优化重组多核苷酸的密码子以增强在人体内表达是等价的。通常，优选地，MMP-11是催化失活的，而且通常催化失活的MMP-11是hMMP-11。如果对于MMP-11的特定氨基酸有多个核苷酸密码子，并且两个或多个核苷酸密码子在高表达的人基因中具有相同的相对使用频率，或者在高表达的人基因中的使用频率高于在高表达的人基因中具有最低使用频率的核苷酸密码子，则每个MMP-11的氨基酸的核苷酸密码子可独立地是任何一种具有相同使用频率的核苷酸密码子或者使用频率高于具有最低使用频率的核苷酸密码子。并不是所有编码MMP-11的密码子优化的多核苷酸中的核苷酸密码子都需要是在高表达人的基因中具有最高使用频率的核苷酸密码子。催化失活的hMMP-11的核苷酸序列的实施例及其中为了在人体内表达而优化了的编码催化失活的hMMP-11的密码子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
小鼠模型表明，当编码mMMP-11-opt羧基末端氨基酸的核苷酸密码子与编码免疫增强的大肠杆菌热不稳定毒素B(LTB)相连接或融合而产生含mMMP-11和大肠杆菌LTB的融合多肽时，含编码催化失活的mMMP-11，其中编码mMMP-11的核苷酸密码子被优化以增强在小鼠中表达的抗MMP-11疫苗(mMMP-11-opt)的效率被进一步增强。因此，在优选实施方案中，重组多核苷酸含有编码与编码免疫增强元件多肽或其实质部分的核酸相连接的催化失活的MMP-11的核酸(MMP-11融合多肽)。在通常优选实施方案中，重组多核苷酸含有编码与编码大肠杆菌LTB免疫增强元件的核酸相连接的催化失活的hMMP-11的核酸，从而使多核苷酸编码hMMP-11-LTB融合蛋白。在进一步实施方案中，编码LTB的核酸不包括编码LTB信号肽的密码子。编码大肠杆菌LTB的核酸可在GenBank登录号AB011677获得，大肠杆菌LTB的氨基酸序列如GenBank登录号BAA25726所示。 信号肽包括如BAA25726所示的氨基酸残基1到21的氨基酸序列。无信号肽的大肠杆菌LTB的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。编码无信号肽的大肠杆菌LTB，而且其中编码LTB的核苷酸密码子已被优化以增强在人体内表达的多核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。在具体优选实施方案中，编码催化失活的hMMP-11和LTB的多核苷酸的核苷酸密码子已被优化以在人体内表达。
由于大肠杆菌LTB是本文所述的用于融合多肽实施方案中的免疫增强元件多肽，因此本发明进一步考虑了含编码包括与另一种免疫增强元件多肽或其实质部分融合的MMP-11的融合多肽的重组多核苷酸的实施方案。免疫增强元件多肽的例子包括，但不限定于，热休克蛋白(HSP)70、溶酶体缔合性膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素的C片段(FrC)、FrC的N末端结构域(DOM)、免疫球蛋白G1的恒定链的重链片段(FcIgG)、水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)、来自霍乱弧菌的霍乱毒素(CT)和来自其它细菌物种的LTB。
因此，基于上文所述，本发明进一步提供编码含与LTB或其实质部分或另一种免疫增强元件多肽或其实质部分相连接的催化失活的MMP-11的单个融合多肽的重组核酸或多核苷酸。这种多核苷酸的实施例包括编码含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸(催化失活的hMMP-11)和如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列(无信号肽的大肠杆菌LTB)的多肽的多核苷酸。多核苷酸含有编码催化失活的hMMP-11的SEQ ID NO：4和编码无信号肽的大肠杆菌LTB的SEQ ID NO：7，或SEQ ID NO：8(编码密码子优化以增强在人体内表达的无信号肽的大肠杆菌LTB的多核苷酸)的核苷酸序列。作为实施例，多核苷酸可编码具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的催化失活的hMMP-11-LTB融合多肽。这种多核苷酸可由如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列编码。
在优选实施方案中，本文所述的任何重组核酸和多核苷酸的核苷酸密码子被优化，以增强所编码的重组多肽在人体内的表达。即，一个或多个在编码人高表达蛋白的核酸中出现频率低的重组核酸和多核苷酸的核苷酸密码子被在编码人高表达蛋白的核酸中出现频率更高的核苷酸密码子所替代。进一步优选地是，在编码任何本文所述融 合多肽的重组多核苷酸的情况中，编码含重组多肽的免疫增强元件多肽或LTB的重组多核苷酸的核苷酸密码子也被优化，以增强融合多肽在人体内的表达。这种重组多核苷酸的实施例包括编码催化失活的hMMP-11的如SEQ BD NO：6所示的密码子优化的核苷酸序列，及编码无信号肽的大肠杆菌LTB的如SEQ ID NO：8所示的密码子优化的核苷酸序列。作为实施例，编码密码子优化的、催化失活的hMMP-11-LTB融合多肽的重组多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ED NO：12所示。
本发明进一步提供含催化失活的MMP-11的重组多肽，其中一个或多个含MMP-11的锌结合位点H E X X H X X G X X H(SEQ ID NO：3)的保守氨基酸被改变为其它的氨基酸。例如，如SEQ ID NO：5所示的hMMP-11，其中hMMP-11的216位保守的谷氨酸被改变为缬氨酸，从而产生催化失活的MMP-11。优选地，催化失活的MMP-11多肽含有融合多肽，其中MMP-11在其羧基末端与免疫增强元件多肽或其实质部分相连接(MMP-11融合多肽)。在通常优选实施方案中，免疫增强元件多肽是大肠杆菌LTB。在进一步实施方案中，LTB不包括信号肽。MMP-11融合多肽的实施例包括具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的催化失活的hMMP-11，其羧基末端与具有如SEQ ED NO：7所示的氨基酸序列的无信号肽的大肠杆菌LTB的氨基末端相连接。例如，MMP-11融合多肽可由如SEQ ID NO：11所示的多核苷酸或如SEQED NO：12所示的密码子优化的多核苷酸编码。
虽然大肠杆菌LTB是本文所示例的MMP-11融合多肽实施方案中所用的免疫增强元件的来源，本发明进一步设想了包含含有与其它免疫增强元件多肽或者其实质部分相融合的MMP-11的MMP-11融合多肽的实施方案。免疫增强元件多肽的实施例包括，但并不限定于：热休克蛋白(HSP)70、溶酶体相关膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素的C片段(FrC)、FrC的N末端结构域(DOM)、免疫球蛋白G1的恒定链的重链片段(FcIgG)、水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)、来自霍乱弧菌的霍乱毒素(CT)和来自其它细菌物种的LTB。
本发明进一步提供了含有至少一种本说明书中所揭示的核酸分子的载体(在下文中为“重组多核苷酸”)，优选地，其中核酸分子可操作地连接到异源启动子上。这些载体可包含DNA或者RNA。在 绝大多数情况下，DNA质粒或病毒表达载体是优选的。典型的表达载体包括质粒、修饰后的病毒、噬菌体、粘粒、酵母人工染色体、以及游离的或完整的DNA的其它形式，其中任何一个都可表达本文所示的任意一种重组多核苷酸。优选地，编码任一上述实施方案的核苷酸密码子均被优化，以增强在人体内的表达。
含编码本文所示的、其中DNA优选地进行了密码子优化以增强在人体内的表达并可操作连接到异源启动子上的重组多核苷酸的多核苷酸的表达载体，可用于在重组宿主细胞中表达任一本文所示的重组多核苷酸。可以在适当条件下培养这类重组宿主以产生本文所示的任一重组多核苷酸。表达载体包括，但并不限定于，克隆载体、修饰后的克隆载体、特别设计的质粒、或者特别设计的病毒。在实施例所述的表达载体是可接受的表达载体。
优选地，本发明的核酸是装配到含有可为本文所示的任一在人体细胞中所编码的重组多核苷酸提供有效表达的序列的表达盒中的。优选地，表达盒含有与核酸可操作连接的同源或异源转录及翻译控制序列。这类控制序列包括至少一个转录启动子(组成型或诱导型)及转录终止子序列，并可进一步包括其它调控元件，譬如转录增强子、核糖体结合序列、剪切拼接序列等。在绝大多数实施方案中，启动子是异源启动子；不过，在特定的实施方案中，启动子可以是MMP-11的天然启动子。在一个特别有用的实施方案中，启动子是含有或不含内含子A序列的组成型巨细胞病毒立即/早期启动子(CMV)，本领域的技术人员也知道很多其它已知的启动子，譬如强免疫球蛋白启动子、鲁斯氏肉瘤病毒长末端重复启动子、SV40小或大T抗原启动子等。转录终止子包括牛生长激素终止子，也可使用其它已知的转录终止子，譬如SV40终止序列。质粒pV1JnsB和pV1JnsA，它们每个均在克隆位点及BGH多聚腺苷化信号前含有带有内含子A的巨细胞病毒即刻/早期区域启动子和增强子，是有用的表达载体的例子。在上述任一实施方案中的MMP-11可以克隆到克隆位点上以配齐表达盒。
可用于表达本文所示任一重组多核苷酸的已商品化的哺乳动物表达载体包括，但并不限定于：pV1JnsA，
pV1JnsB，pVAX1(Invitrogen，Carlsbad，AC)，pcDNA3.neo(Invitrogen)，pcDNA3.1(Invitrogen)，pcDNA3.1/Myc-His(Invitrogen)，pCI-neo(Promega，Madison，WI)，pLITMUS28，pLITMUS29，pLITMUS38 and pLITMUS39(New England Bioloabs，Beverly，MA)，pcDNAI，pcDNAIamp(Invitrogen)，pcDNA3(Invitrogen)，pMC1neo(Stratagene，La Jolla，CA)，pXT1(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)pBPV-1(8-2)(ATCC 37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224)，pRSVgpt(ATCC 37199)，pRSVneo(ATCC 37198)，pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)，及1ZD35(ATCC 37565)。
此外，多种细菌表达载体可以用于在细菌细胞中表达任一本文所示的重组多核苷酸。适合用于表达的商品化的细菌表达载体包括，但并不限定于，pCR2.1(Invitrogen)、pET11a(Novagen，Madison，WI)、lambda gt11(Invitrogen)和pKK223-3(Pharmacia)。
此外，多种真菌细胞表达载体可以用于在真菌细胞中表达任一本文所示的重组多核苷酸。适合用于表达的商品化的真菌细胞表达表达载体包括，但并不限定于，pYES2(Invitrogen)和Pichia表达载体(Invitrogen)。
同样，多种昆虫细胞表达载体可以用于在昆虫细胞中表达任一本文所示的重组多核苷酸。适合用于表达的商品化的昆虫细胞表达表达载体包括，但并不限定于，pBlueBacIII和pBlueBacHis2(Invitrogen)以及pAcG2T(Pharmingen)。
用于在哺乳动物细胞中表达任一本文所示的重组多核苷酸的病毒载体包括，但并不限定于，腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、辛德毕斯病毒载体、Simliki森林病毒载体、细小病毒载体、痘病毒载体(譬如牛痘病毒、禽痘、金丝雀痘等)、逆转录病毒载体、噬菌体载体及杆状病毒载体。许多用于产生编码本文中任一重组多核苷酸的重组病毒的病毒载体是已商品化的。
在通常优选的实施方案中，用于产生重组病毒的病毒载体有腺病毒或质粒载体，尽管线性DNA可与启动子或者诸如腺相关病毒或修饰的牛痘病毒这样的其它载体相连接，但也可使用逆转录病毒或者慢病毒载体。如果所选择的载体是腺病毒，通常优选的载体是所谓的第一代腺病毒载体。这些腺病毒载体的特征在于具有无功能的E1基因区，并且优选地具有缺失的腺病毒E1基因区。在某些实施方案中，表达盒插入到腺病毒E1区通常所处的位置。另外，这些载体可选择性地具有无功能的或缺失的E3去。而且优选地，所用的腺病毒基因 组同时缺失E1和E3区。
腺病毒载体可在已知的诸如293细胞、PERC.6细胞这样的可表达病毒E1基因的细胞系中繁殖，或者在来源于瞬时或稳定转化的293或PERC.6细胞的细胞系中繁殖，以表达外源蛋白。例如，当使用诸如四环素调控启动子这样的具有可控制基因表达的构建体时，细胞系可表达参与调控系统的组分。这类细胞系的一个实施例是TRex-293，其它实施例在本领域也是已知的。
为了利于操作腺病毒载体，腺病毒载体可以穿梭质粒形式存在。本发明也涉及穿梭质粒载体，它包括质粒部分和腺病毒部分，腺病毒部分含有腺病毒基因组，它缺失E1并且可选择性缺失E3，并且具有含编码催化失活MMP-11多肽或者催化失活的MMP-11融合多肽的核酸的插入表达盒。在优选的实施方案中，在质粒的腺病毒部分侧翼含有限制性位点，以便容易去除腺病毒载体。穿梭载体可在原核细胞或真核细胞中复制。
在本发明通常优选的实施方案中，含编码本文所示的任一重组MMP-11的核酸的表达盒插入到pMRKAdS-HV0腺病毒载体上(参见Emini等，WO0222080)。该质粒含有缺失了E1和E3区的Ads腺病毒基因组。通过将5′顺式作用包装区进一步扩展到E1基因，以整合在优化病毒包装方面具有重要作用的元件，从而增强了病毒的扩增，使得pMRKAdS-HV0质粒的设计比先前的腺病毒载体获得了改善。有利的是，这种增强的腺病毒载体可在较高的传代繁殖中维持遗传稳定性。
本发明进一步提供了使用含有任一本文所示重组多核苷酸的载体所转化或者转染的重组宿主细胞，特别是使用含有任一上述可操作连接到启动子上的核酸分子的载体所转化或者转染的宿主细胞。重组宿主细胞包括诸如大肠杆菌这样的细菌、诸如酵母这样的真菌细胞、植物细胞、包括但并不限定于牛、猪、猴、人或啮齿类来源的细胞系在内的哺乳动物细胞、包括但并不限定于果蝇和蚕来源的细胞系在内的昆虫细胞。例如，一种昆虫表达系统使用了Spodoptera frugiperda(Sf21)昆虫细胞(Invitrogen)与杆状病毒表达载体(pAcG2T，Pharmingen，San Diego，CA)。此外，合适的并且已商品化的哺乳动物物种包括但并不限定于，L细胞L-M(TK-)(ATCC CCL-1.3)、L 细胞L-M(ATCC CCL-1.2)、Saos-2细胞(ATCC HTB-85)、293细胞(ATCC CRL-1573)、Raji细胞(ATCC CCL-86)、CV-1细胞(ATCC CCL-70)、COS-1细胞(ATCC CRL-1650)、COS-7细胞(ATCCCRL-1651)、CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)、3T3细胞(ATCCCCL-92)、NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)、HeLa细胞(ATCCCCL-2)、C127I细胞(ATCC CRL-1616)、BS-C-1细胞(ATCC CCL-26)、MRC-5细胞(ATCC CCL-171)、HEK293T细胞(ATCC CRL-1573)、ST2细胞(Riken Cell bank，Tokyo，Japan RCB0224)、C3H10T1/2细胞(JCRB0602，JCRB9080，JCRB0003，或IFO50415)和CPAE细胞(ATCC CCL-209)。
如上所示，含有任一本文所示重组多核苷酸的表达载体可用于在重组宿主细胞中表达其编码的重组MMP-11。因此，本发明提供了在重组宿主细胞中表达任一本文所示重组多核苷酸的流程，包括向合适的宿主细胞中引入含有编码重组MMP-11的核酸的载体，并在可表达任一本文所示重组多核苷酸的条件下培养宿主细胞。编码重组MMP-11的多核苷酸可操作连接到组成型或诱导型的异源启动子上。
在宿主细胞中表达任一本文所示的重组核酸或多核苷酸后，可获得重组MMP-11多肽用于以多肽为基础的疫苗中。在本领域中，纯化多肽的方法是众所周知的，包括单独或者联合利用盐分分离、离子交换层析、排阻层析、羟磷灰石吸附层析或疏水作用层析来从细胞裂解物及提取物中进行纯化。此外，通过使用用特异针对MMP-11或者在MMP-11融合多肽情况下针对免疫增强元件多肽的单克隆或多克隆抗体而制备的免疫亲和柱，来从其它细胞多肽中分离重组MMP-11。
在本领域中，克隆、表达载体，转染与转化，以及表达蛋白的蛋白分离都是众所周知的，并在例如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual 2nd Edition；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，(1989)或者Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Edition.Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，NY(2001)中已经有所描述，
本发明中的抗MMP-11疫苗包括编码本文所示任一实施方案中的重组MMP-11或MMP-11融合多肽的多核苷酸疫苗，以及含本文所示任一实施方案中的重组MMP-11或MMP-11融合多肽的多肽疫苗。患 有诸如乳腺、结肠、头颈、肺、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤(基细胞癌)、子宫(子宫颈癌和子宫内膜癌)的浸润性癌这样的过表达MMP-11的浸润性癌、或者具有可能发展为浸润性癌的非浸润性癌的个体，可从利用本发明中疫苗的免疫反应中获益。抗MMP-11疫苗进一步包括腺病毒抗MMP-11疫苗，它含有具有任一本文所示重组多核苷酸的重组腺病毒。
在绝大多数基本的实施方案中，核酸或者多核苷酸抗MMP-11疫苗含有任一本文所示的重组多核苷酸，例如，编码任一前述实施方案中处于合适的异源启动子控制下或与其可操作连接的重组MMP-11多肽或MMP-11融合多肽的重组核酸分子或者多核苷酸。所编码的重组MMP-11多肽可以具有任何物种的MMP-11多肽的氨基酸序列，包括但并不限定于，来自人类、诸如黑猩猩、恒河猴、猕猴这样的灵长类、诸如小鼠、大鼠、狗这样的非灵长类等的MMP-11。优选地，所编码的重组MMP-11具有人MMP-11的氨基酸序列。下文举例说明用作多核苷酸抗MMP-11疫苗的、包括在上述基因盒及表达载体中的编码MMP-11的核酸的通常优选的实施方案。
在优选的实施方案中，由抗MMP-11疫苗的多核苷酸编码的MMP-11是催化失活的。例如，催化失活的hMMP-11如SEQ ID NO：4的核苷酸序列所示，其中编码hMMP-11的216位保守谷氨酸的核苷酸密码子GAA改变为编码缬氨酸的核苷酸密码子GTG，从而产生具有如SEQ ED NO：5所示的氨基酸序列的催化失活的hMMP-11。除了编码谷氨酸残基的核苷酸密码子可改变为编码缬氨酸的核苷酸密码子外，在不偏离本发明的情况下，核苷酸密码子也可改变为其它氨基酸或组氨酸残基改变为其它氨基酸。
如上所述，已表明编码特定多肽的基因或转录单元的密码子优化可增强被编码多肽的表达，即，增强编码多肽的mRNA的翻译。在多核苷酸疫苗的情况中，增强的被编码多肽的表达可产生更多的被编码多肽，则可增强疫苗的体内免疫原性，从而可增强疫苗的有效性。因此，在进一步的实施方案中，优化编码含MMP-11的氨基酸的核苷酸密码子，以增强MMP-11的表达，从而增强抗MMP-11疫苗的有效性。即，一个或多个在编码人高表达蛋白的核酸中出现频率低的编码MMP-11的核苷酸密码子被在编码人高表达多肽的核酸中出现频率较 高的核苷酸密码子所替代。催化失活的hMMP-11的核苷酸序列和其中编码催化失活的hMMP-11的密码子已进行了密码子优化，序列如SEQ ID NO：6所示。
实施例中的鼠模型表明，当编码mMMP-11-opt的密码子的羧基末端密码子与编码免疫增强元件多肽——大肠杆菌LTB的密码子相连接时，含编码催化失活的、密码子优化的鼠MMP-11的多核苷酸的抗MMP-11疫苗的有效性增强了。因此，在抗MMP-11疫苗的优选实施方案中，多核苷酸含有与编码免疫增强元件多肽或其实质部分(MMP-11融合多肽)相连接的编码催化失活的MMP-11的核酸。在通常优选实施方案中，多核苷酸含有与编码大肠杆菌LTB或其实质部分相连接的编码催化失活的MMP-11的核酸，从而使多核苷酸编码MMP-11-LTB融合蛋白。在进一步实施方案中，编码LTB的多核苷酸不包括编码LTB信号肽的密码子。通常，优选地是，MMP-11是hMMP-11。无信号肽的大肠杆菌LTB的核苷酸序列如SEQ ED NO：7所示，其氨基酸序列如SEQ ED NO：9所示。编码无信号肽的大肠杆菌LTB，而且其中核苷酸密码子已被优化以增强在人体内表达的多核苷酸序列如SEQ ED NO：8所示。在具体的优选实施方案中，含有编码催化失活的hMMP-11和LTB的核苷酸密码子被优化，以增强在人体内的表达。
除了大肠杆菌LTB是本文所述的抗MMP-11疫苗的融合多肽实施方案中所用的免疫增强元件多肽的来源外，本发明进一步考虑了含编码含与其它免疫增强元件多肽或其实质部分融合的MMP-11的融合多肽的多核苷酸的实施方案。免疫增强元件多肽的实施例包括，但不限定于，热休克蛋白(HSP)70、溶酶体缔合性膜蛋白(LAMP)、破伤风毒素的C片段(FrC)、FrC的N末端结构域(DOM)、免疫球蛋白G1的恒定链的重链片段(FcIgG)、水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)、来自霍乱弧菌的霍乱毒素(CT)和来自其它细菌物种的LTB。
因此，基于上文所述，本发明提供了编码含与免疫增强元件或其实质部分，例如大肠杆菌LTB相连接的催化失活的MMP-11的单个融合多肽的抗MMP-11疫苗的核酸或多核苷酸。这种疫苗的实施例包括编码含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸(催化失活的hMMP-11)和 如SEQ ID NO：8所示的氨基酸(LTB)的多肽，或分别如SEQ ID NO：4(催化失活的hMMP-11)和SEQ ID NO：7(编码无信号肽的LTB)或SEQ ED NO：8(其中编码无信号肽的LTB的核苷酸密码子被优化以增强在人体内的表达)所示的核苷酸序列。作为实施例，疫苗含有编码具有如SEQ ED NO：10所示的氨基酸序列的催化失活的hMMP-11-LTB融合多肽的多核苷酸。这种多肽由如SEQ ED NO：11所示的核苷酸序列编码。
在多核苷酸抗MMP-11疫苗的优选实施方案中，如上所述，编码催化失活的MMP-11的多核苷酸的核苷酸密码子已被优化，以增强在人体内的表达。进一步优选地是，编码免疫增强元件的多核苷酸的核苷酸密码子也被加强以增强在人体内表达。这种多核苷酸的实施例包括如SEQ ED NO：6所示的编码催化失活的hMMP-11的密码子优化的核苷酸序列，和编码LTB的如SEQ ED NO：8所示的密码子优化的核苷酸序列。作为实施例，编码密码子优化的，催化失活的hMMP-11-LTB融合多肽的多核苷酸具有如SEQ ED NO：12所示的核苷酸序列。
多核苷酸抗MMP-11疫苗可通过各种递送方式给药，例如直接注射、电穿孔、黏膜递送等。在某些优选实施方案中，疫苗可进行肌肉内、鼻内、腹膜内、皮下皮内、基因枪轰击、局部或口服给药。例如，疫苗可肌肉内给药到三角肌中，可用0.5mL注射器并在注射后2分钟内进行电刺激而进行给药。可通过MEDPULSER DNA递送系统(Inovio Biomedical Corporation，San Diego，CA)提供电刺激。优选地，多核苷酸抗MMP-11疫苗在药学上可接受的载体中含有任一上述多核苷酸以及诸如水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合这样的赋形剂。在通常优选的实施方案中，疫苗以盐溶液来配制。在某些情况下，预计多核苷酸疫苗可含有位于诸如弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)或单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的减毒株这样的细菌中的表达载体。多核苷酸抗MMP-11疫苗也可含有诸如湿润剂、乳化剂、缓冲液等这样的辅助物质。
多核苷酸抗MMP-11疫苗可包括一种或多种能调节针对Th1或Th2应答的免疫应答的遗传佐剂(编码一个或多个分子佐剂的核酸)。 这类遗传佐剂包括，但并不限定于，诸如CD80及CD86这样的辅刺激分子、诸如白介素1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子α与β(TNF-α及TNF-β)这样的致炎细胞因子、诸如IL-2、IL-12、IL-15及IL-18这样的细胞因子、诸如IL-4、IL-5、IL-10这样的Th2细胞因子、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-8、干扰素γ诱导的蛋白10(γIP10)、巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP-1α)、以及RANTES。Sasaki等Methods 31：243-254(1)提供了关于DNA疫苗的佐剂配制及递送系统的有益讨论(也参见Kim等，J.Interferon Cytokine Res.20：487-498(2000)及Kim等，Human Gene Therapy 11：305-321(2000))。遗传佐剂可以以表达盒的方式来提供，它可位于与编码任一上述实施方案中hMMP-11的表达载体相分离的表达载体上，或者与编码任一上述实施方案中hMMP-11位于同一个表达载体上。
多核苷酸抗MMP-11疫苗可包括一种或多种常规佐剂。常规佐剂包括，但并不限定于，诸如磷酸铝或氢氧化铝这样的金属盐、诸如单磷酰脂质A、霍乱毒素、胞壁肽这样的来源于细菌的佐剂、诸如阳离子脂质体及包被甘露糖聚的脂质体这样的脂肪微粒、诸如QS-21这样的乳化佐剂、以及诸如乌苯美司这样的合成佐剂。可在Vogel等，Vaccine and Prevention Research Program，Division of AIDS，NationalInstitute of Allergy and Infectious Diseases，National Institutes of Health，Bethesda，MD 20892的″A Compendium of Vaccine Adjuvants andExcipients(第二版)″中找到其它佐剂及辅料。
优选地，本发明的多核苷酸抗MMP-11疫苗可作为药学上可接受的载体中的溶液或悬浮液来给药，其DNA浓度范围为约10μg/mL到约5μg/mL。通常，免疫学上或预防用有效剂量为约5mg，优选地为约0.05的质粒疫苗载体，可直接给药到肌肉组织中。合适的剂量依赖于进行接种的个体，并可依赖于个体能够表达疫苗中所含的编码hMMP-11的核酸的能力，以及个体免疫系统对所表达的hMMP-11的反应。精确的所选剂量也在部分程度上依赖于给医师在给药或要求给药疫苗上的判断。
抗MMP-11疫苗进一步包括含任一上述重组多核苷酸的重组腺病毒。优选地，腺病毒疫苗普遍以诸如终体积小于约1mL的磷酸缓冲 盐这样的稀释液形式稀释后以肌肉内方式给药到三角肌。重组腺病毒的有效剂量通常为约106到1012个病毒颗粒，优选地，约107到1011 个病毒颗粒。
在本发明的某些实施方案中，本文所示的腺病毒及多核苷酸抗MMP-11疫苗以多次基础/加强的组合方式来使用，以诱导出增强的免疫应答。在这种情况下，按“基础及加强”方式给药两个载体。例如，一次或多次给药第一种载体，然后在预先确定的时间量——譬如2周、1个月、2个月、4个月或其它合适间隔之后，一次或多次给药第二种载体。优选地，载体携带编码相同多核苷酸或多核苷酸的组合的表达盒。在也使用了质粒载体的实施方案中，优选地，载体含有一个或多个哺乳动物或昆虫细胞所识别的启动子。在一个优选的实施方案中，质粒载体含有譬如，但并不限定于CMV启动子这样的强启动子。
如上所述，腺病毒载体抗MMP-11疫苗和多核苷酸抗MMP-11疫苗可以作为单一治疗方案的一部分给药脊椎动物以诱导免疫应答。在一个实施方案中，第一个载体是质粒，第二个载体是腺病毒载体。在一个选择性的实施方案中，第一个载体是腺病毒载体，第二个载体是质粒。在上述方法中，第一个类型的载体可以给药一次以上，每次都是在预先确定的时间量上分别给药载体。在经过预先确定的时间量之后，在这种一系列的给药第一种载体后可接着开始给药第二种载体一次或多次。与使用第一种类型的载体进行的治疗相似，第二种类型的载体也可以根据预先确定的时间间隔给药一次或者一次以上。
本发明的另一个实施方案是含有以多剂量形式或单位剂量形式包装在诸如细颈瓶、瓶子、小瓶等这样的合适的灭菌容器中的本发明的腺病毒载体或者多核苷酸抗MMP-11疫苗的试剂盒。优选地，容器在装填疫苗配制品后封闭密封。优选地，多核苷酸抗MMP-11疫苗包装在其上附有标签的容器中，该标签可确认该疫苗，并含有由诸如美国食品与药品管理局这样的政府管理机构所规定形式的启事，表明在适当的法律、剂量信息等方面正式批准该疫苗。优选地，标签含有有助于卫生保健从业人员对患者给药疫苗的关于疫苗的信息。优选地，试剂盒也含有与给药疫苗相关的已打印好的信息材料、用法说明、指示、以及任何必需的警告。
在其最基本的实施方案中，本发明中的抗MMP-11多肽疫苗含有 催化失活的MMP-11，其中一个或多个含MMP-11锌结合位点H E X XH X X G X X H(SEQ ID NO：3)的保守氨基酸改变为其它的氨基酸。例如，如SEQ ID NO：5所示，其中hMMP-11 216位保守的谷氨酸被改变位缬氨酸以产生催化失活的MMP-11。优选地，催化失活的MMP-11是MMP-11融合多肽，其中MMP-11在其C末端与免疫增强元件多肽或者其实质部分相融合或者相连接。在通常优选的实施方案中，免疫增强元件多肽是LTB多肽，优选地是其中信号肽被除去的LTB，例如，与含有如SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列的LTB多肽相连接的在SEQ ID NO：5中所示的催化失活的hMMP-11。
多肽抗MMP-11疫苗可通过诸如直接注射、黏膜递送、口服等这样的多种递送机制来给药。在某些优选的实施方案中，疫苗通过肌肉内、鼻内、腹膜内、皮下、皮内、局部或者口服等方式来给药。优选的，多核苷酸抗MMP-11疫苗可用药学上接受的载体和诸如水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合物这样的赋形剂来配制。多核苷酸抗MMP-11疫苗也可含有诸如湿润剂、乳化剂、缓冲液等这样的辅助物质。多肽抗MMP-11疫苗可包括一种或多种能调节针对Th1或Th2应答的免疫应答的分子佐剂。这类分子佐剂包括，但并不限定于，诸如CD80及CD86这样的辅刺激分子、诸如白介素1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子α与β(TNF-α及TNF-β)这样的致炎细胞因子、诸如IL-2、IL-12、IL-15及IL-18这样的细胞因子、诸如IL-4、IL-5、IL-10这样的Th2细胞因子、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-8、干扰素γ诱导的蛋白10(γIP10)、巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP-1α)、以及RANTES。多肽抗MMP-11疫苗可包括一种或多种常规佐剂。常规佐剂包括，但并不限定于，诸如磷酸铝或氢氧化铝这样的金属盐、诸如单磷酰脂质A、霍乱毒素、胞壁肽这样的来源于细菌的佐剂、诸如阳离子脂质体及包被甘露糖聚的脂质体这样的脂肪微粒、诸如QS-21这样的乳化佐剂、以及诸如乌苯美司这样的合成佐剂。可在前述Vogel等的″A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients(第二版)″中找到其它佐剂及辅料。
本发明进一步提供了鉴定用于抑制过表达MMP-11的癌症的分析物的方法，它包括在小鼠中诱发癌症；对诱发癌症的小鼠给药分析物； 并确定分析物是否在诱发了肿瘤的小鼠中抑制了癌症，这可鉴定出抑制过量表达MMP-11的癌症的分析物。在具体的实施方案中，在给药小鼠前先确定分析物可与MMP-11结合。在更进一步的实施方案中，在小鼠中诱发的癌症是结肠癌，在更进一步的实施方案中，是通过对小鼠给药足够量的可在小鼠中诱发癌症的1-2二甲肼(DMH)而在小鼠中诱发的癌症的。
提供下述实施例是为了进一步阐明本发明的特色及实施方案，而并不意味着对本发明进行限定。
实施例1
为了构建表达小鼠MMP-11的载体，从小鼠中作为基质一部分(stromal compartment)的成纤维细胞中克隆cDNA。从NIH-3T3细胞中提取总RNA，使用特异针对小鼠MMP-11的寡核苷酸利用聚合酶链反应(PCR)来扩增cDNA。所用的PCR引物有正向的5′-MMP-11，其核苷酸序列为5’-CCCGGGGCGG ATGGCACGGG CCGCCTGTC-3’(SEQ ID NO：16)，以及简并寡核苷酸的反向的3′-MMP-11-1473，其核苷酸序列为5′-GTCAGMGGAA AGTRTTGGCA GGCTCAGCAC AG-3’(SEQ ID NO：17)，其中M是A或C，R是A或G。按下述条件进行RT-PCR反应：45℃ 30分钟；94℃ 2分钟，然后进行40个循环的94℃ 15秒，58℃ 30秒，68℃ 2分钟。
获得了约1630bp的扩增产物，并克隆到TA克隆载体pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中以生成质粒pCR2.1-MMP-11。对所克隆的扩增产物的DNA序列分析表明所克隆的扩增产物的DNA序列与小鼠MMP-11cDNA的核苷酸序列(Accession number：NM 008606)完全匹配。通过用EcoRI消化从pCR2.1-MMP-11上切出编码小鼠MMP-11的cDNA，并将其克隆到质粒载体pV1JnsB的EcoRI位点上以生成表达载体pV1JnsB-MMP-11(图1)。如图1所示，编码MMP-11的cDNA位于人CMV启动子下游。Montgomery等在DNA Cell Biol.12：777-783(1993)中已描述过PV1j载体。
为了确认MMP-11的表达，用pV1JnsB-MMP-11转染HeLa细胞。使用与小鼠MMP-11有交叉反应的人MMP-11抗体通过Western印迹来分析细胞提取物。如图2所示，检测到了约50KDa的条带，表明 MMP-11已由载体表达。
实施例2
已表明使编码多种抗原的基因中的密码子优化可在体内增加表达并增强抗原性。因此，为了增加mMMP-11的表达并增强其抗原性，对mMMP-11编码序列进行了密码子优化。
将mMMP-11cDNA序列转换为编码相同氨基酸序列的多核苷酸序列，但是为了在小鼠细胞中表达而优化了密码子使用率(关于密码子优化的一般性讨论，参见Lathe，J.Molec.Biol.：183：1-12(1985))。该方法通常包括：由鉴定野生型mMMP-11多核苷酸序列中于小鼠体内高表达基因中不常见的密码子、将它们用在小鼠体内高表达基因中常见的密码子来替换、以产生为了在来源于小鼠的细胞中高表达多核苷酸而具有通常只是在高表达基因中才有的密码子的多核苷酸。然后检查新基因序列，以发现由密码子替换所产生的非预期序列(譬如，″ATTTA″序列、无意中生成的内含子剪切识别位点、不想要的限制性内切酶位点、高GC含量等)。可通过将含有非预期序列的密码子用其它密码子进行置换来除去非预期序列，优选地，如果可行，用另一种编码相同氨基酸并且在高表达基因中常见的密码子来置换。然后检验所合成的基因片段是否提高了表达。可用Vector NTI程序算法(InforMax，Rockville，MD)来设计针对以小鼠表达进行了密码子优化的基因。为了增加转录水平，可在ATG起始密码子处插入优化的Kozak序列。而且，在编码序列下游插入两个连续的终止密码子以增强翻译终止。
可在GENEART GmbH，Germany上通过装配寡核苷酸来合成密码子优化的编码mMMP-11的cDNA，然后克隆到pV1JnsA载体上的BglII/SalI位点，这样生成pV1JnsA-mMMP-11opt。为了在不修饰其免疫原性的情况下去除MMP-11的酶活性，在催化位点引入点突变，将220位的谷氨酸(E)改变为丙氨酸(A)(Noel等，Oncogene.19：1605-12(2000))。由此生成载体pV1JnsA-mMMP-11(cat-)opt。催化失活的mMMP-11突变体的密码子优化的核苷酸序列(mMMP-11(cat-)opt)如图3所示(SEQ DD NO：13)，载体pV1JnsA-mMMP-11(cat-)opt的图谱如图6A所示。
WO2005077977表明癌胚抗原(CEA)与诸如大肠杆菌热不稳定毒素B(LTB)这样的免疫增强元件的基因融合可进一步增加疫苗对CEA的功效。因此，为了增强MMP-11的功效，通过与去除信号序列的大肠杆菌LTB融合合成了编码催化失活的mMMP-11、的密码子优化的多核苷酸，并克隆到pV1JnsA载体上的BglII/SalI位点，这样生成pV1JnsA-mMMP-11(cat-)-LTBopt(图6B)。可在GENEART GmbH，Germany上通过装配寡核苷酸来合成催化失活的mMMP-11-LTB融合物。为了在人类来源的细胞中表达，对编码LTB的密码子进行了优化。图4和图5所示的分别是编码催化失活的mMMP-11-LTB融合多肽的密码子优化的核苷酸序列，及催化失活的mMMP-11-LTB融合多肽的氨基酸序列。
为了检验pV1JnsA-mMMP-11(cat-)-LTBopt的表达，用pV1JnsA-mMMP-11(cat-)-LTBopt通过Lipofectamine2000(Invitrogen)来转染HeLa细胞。用裂解缓冲液(2％SDS，5mM EGTA，5mM EDTA，2OmM Tris-HCl，pH7.4)制备全细胞提取物，并利用Western印迹法来分析催化失活的mMMP-11-LTB融合蛋白的表达。依照标准的Western印迹方案，用抗MMP-11及抗LTB抗体来检测催化失活的mMMP-11-LTB融合蛋白。抗MMP-11及抗LTB抗体购自BIOMOL(Exter，UK and Plymouth Meeting，PA，Anti-MMP-11cat.#SA-371)和Abeam(Cambridge，UK and MA，Anti-E.coIi heat labile toxin，cat#ab9199)。如图7所示，两个抗体均结合到了约60KDa的条带上，它对应着催化失活的mMMP-11-LTB融合蛋白的分子量。
实施例3
为了检验同野生型MMP-11相比mMMP-11(cat-)opt及mMMP-11(cat-)-LTBopt的免疫原能力，根据Zucchelli等(Enhancing Band T cell Immune response to an HCV E2 DNA vaccine by muscleelectro gene transfer.J.Virol.74：11598-11607，(2000))以一周为间隔，用包含于盐溶液中的50μg质粒DNA肌肉内注射、免疫每只BALB/c小鼠然后进行电穿孔(EP)。最后一次注射后2周，杀死小鼠，并通过干扰素γ(IFNγ)的细胞内染色来检测针对mMMP-11肽的免疫应答。如图8所示，野生型与催化失活的mMMP-11opt均可有效在小 鼠体内打破耐受(％CD8+IFNγ+＞0.1％)。在mMMP-11与催化失活的mMMP-11opt之间没有表现出任何显著性差异。然而，也是如图8所示，催化失活的mMMP-11opt与LTB的融合物显著增加了免疫应答(p＜0.05)。
在Western印迹中测定了体液应答。为了测定体液免疫应答，在聚丙烯酰胺凝胶上分离来自用pV1JnsB-mMMP-11转染的HeLa细胞的全细胞提取物，并转移到硝酸纤维素膜上。将来自上述免疫小鼠的血清与膜温育。然后，用与碱性磷酸酶相连接的抗小鼠IgG(SigmaChemicals，St.Louis，MO)来检测针对mMMP-11的小鼠抗体。检测到对应于mMMP-11分子量的条带表明存在针对mMMP-11的抗体。如图9所示，在用mMMP-11免疫的小鼠和用催化失活的mMMP-11(cat-)-LTBopt免疫的小鼠之间没有观察到明显显著的差异。
基于图8所示的结果，选取mMMP-11(cat-)-LTBopt作为用于疫苗研究的最佳免疫原。
实施例4
按如下所述生成过表达MMP-11的肿瘤模型。1，2-二甲肼(DMH)或其代谢物氧化偶氮甲烷(azoxymethane)通常在肿瘤诱发研究中用作初始的致癌物质。已发现DMH可在多个物种或动物中诱发结肠癌(Choudhary and H.Hansen，Chemosphere 37：801-843(1998))，甚至在某些案例中一次口服后即可，不过典型地需要6到10周次的处理。DMH是一种烷基化试剂，已表明用该化学药品处可在DNA碱基上诱导甲基加合物、点突变、微核及姊妹染色单体交换。用DMH处理可在结肠中诱发细胞凋亡(Blakey等，Cancer Res.45：242-249(1985))并增加结肠上皮细胞的细胞增殖(Ma等，World J.Gastroenterol.8：847-852(2002))，这是人结肠癌的特征。
在诸如A/J这样的敏感小鼠株系以及敏感程度更低的BALB/c中，结肠组织中DMH诱导的致癌作用的发展经历了不同的阶段：(1)异常隐窝形成(ACF)；(2)腺瘤；(3)息肉以及(4)腺癌。为了确认在肿瘤发生过程中mMMP-11的表达，A/J小鼠接受了6周次的DMH注射，在最后一次DMH注射5周后杀死小鼠：在此阶段在小鼠结肠组织中存在异常隐窝和某些腺瘤。冷冻内脏组织并用针对mMMP-11的抗体 通过Western印迹与免疫组织化学(IHC)来进行分析。在没有处理的小鼠(载体)中，IHC分析表明在正常隐窝基部有mMMP-11的表达：似乎mMMP-11的表达受结肠干细胞的限制。在异常隐窝及腺瘤形成时检测到强并且扩散的表达(图10)。该观察通过来自用DMH处理的或未处理的小鼠的结肠组织提取物的Western印迹分析得到确认：在DMH处理的结肠中存在活性形式的mMMP-11(图10)，这表明肿瘤组织导致蛋白酶的过量表达。这些数据表明可诱发致癌作用的DMH适于作为抗MMP-11治疗及接种疫苗的模型。
实施例5
本实施例给出了抗MMP-11疫苗的治疗功效。如前面实施例所示，MMP-11在A/J小鼠的异常隐窝形成(ACF)及给药1-2二甲肼(DMH)诱发的腺瘤中过表达。其它研究已揭示了DMH不干扰免疫系统及基因疫苗的功效。进行了下面的实验以确认是否DMH会干扰免疫系统的功能及基因疫苗的功效。
从第五周龄开始用六次腹膜内(IP)注射DMH来处理或者不处理(对照)10只BALB/c或A/J小鼠的组。在8和11周时，所有的小鼠接受注射50μg质粒pV1J-CEAopt(参见关于pV1J-CEAopt的WO2005077977)。两周后，从小鼠取血并通过使用跨CEA蛋白的15mer肽所刺激的细胞内染色来分析它们对由pV1J-CEAopt所编码的CEA的免疫应答。对于BALB/c小鼠，测定CD8+免疫应答。图19A所示的是在DMH处理和未处理的BALB/c小鼠之间其CD8+应答没有显著性差异。对于A/J小鼠，测定CD8+和CD4+免疫应答。图19B和19C所示的是在DMH处理和未处理的A/J小鼠之间其CD8+和CD4+应答没有显著性差异。这些结果表明DMH看来并不影响免疫系统活性。综上，这些数据表明MMP-11是一种肿瘤相关抗原，并且针对MMP-11的疫苗是治疗过表达MMP-11的癌症的可行手段。
为了检验抗MMP-11疫苗的功效，通过6周次注射DMH来处理60只A/J小鼠的组：如图11A中所示的图解所揭示的那样，一组不做处理(自然组)，第二组用pV1jnsA-mMMP-11(cat-)-LTBopt免疫然后进行电穿孔。最后一次免疫两周后，用覆盖完整蛋白的15mer肽库来分析细胞介导的免疫(CMI)；然而，在分析组中只检测到微弱的 免疫应答(数据未显示)。最后一次注射DMH后7到8周，杀死每个组中的20只小鼠，然后分析结肠中是否存在ACF、腺瘤、息肉及腺癌。接种小鼠表现出DMH诱发的ACF、腺瘤、息肉及腺癌都显著减少了(图11B到11E)。
实施例6
为了确认在另一个小鼠株系的DMH致癌作用模型中肿瘤保护的功效，使用BALB/c小鼠按上述免疫方案进行相同处理。最后一次免疫2周后，用覆盖完整蛋白的15mer肽库分析针对mMMP-11的CMI。
为了制备免疫小鼠的脾细胞，以无菌方式从杀死的小鼠体内摘取脾脏并通过载网将其破碎。通过与ACK裂解缓冲液(Life Technologies，Bethesda，MD)温育10分钟来获取红细胞裂解物。于1200rpm离心10分钟后，将白细胞重悬载RIO培养基中。将约1到2×106个脾细胞或者PBMC(外周血单核细胞)重悬于1mL RIO培养基中。与Brefeldin A一起向其中加入终浓度为1μg/mL的抗原肽。mMMP-11抗原肽包含覆盖完整MMP-11肽的15mer肽库组成。肽的总数目为121，分为4个库(A，从1到30；B，从31到60；C，从61到90；D，从91到121)。
于37℃温育12小时后，用3mL FACS缓冲液(添加了1％的FBS壁柜那含有0.05％NaN3的PBS)清洗细胞，并在室温下离心10分钟。将细胞于4℃在100μLFACS缓冲液中与抗小鼠CD16/CD32温育15分钟。然后，用FACS缓冲液清洗细胞后，将细胞与15mer mMMP-11抗原肽温育来分析IFNγ的分泌。
对于表面抗原染色，将均在FACS缓冲液中按1∶50稀释好的连接抗小鼠CD3的异藻蓝蛋白(APC)、连接抗小鼠CD4的藻红蛋白(PE)以及连接抗小鼠CD8α的多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)，加入到终体积为100μL的细胞中，并将细胞于暗处在室温下温育30分钟。用PERMWASH(Pharmingen)清洗后，将细胞重悬在100μLCYTOFIX-CYTOPERM溶液(Pharmingen)中，振荡，于暗处在4℃温育20分钟。
对于细胞内染色，将细胞与在PermWash中按1∶50稀释的(终体积为100μL)的连接抗小鼠干扰素γ的荧光素(FITC)于暗处在室温下温育30分钟。清洗后，将细胞重悬在250到300μL含1％甲醛的PBS中，用FACS CALIBER(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行分析。
在免疫组中检测到主要针对蛋白C末端的明显的免疫应答，它是CD8+特异性的(图12A)。所得到的CD8+效应物是具有功能的，因为它们能够裂解带有mMMP-11抗原肽的肿瘤靶细胞(图12B)。最重要的，在免疫小鼠从ACF到腺瘤的所有阶段都观察到高水平的显著的保护作用(图13A到13D)。这些数据表明mMMP-11是一种可选择的用做主动特异免疫疗法的靶标，并且基因疫苗接种在肿瘤保护中也非常有效。
实施例7
编码催化失活的人MMP-11核苷酸序列的克隆及优化
与小鼠MMP-11类似，也根据人体细胞最常见的密码子使用率对人MMP-11进行密码子优化，并通过将220位的催化位点处的谷氨酸(E)改变为丙氨酸(A)的密码子来使其催化失活。可通过装配寡核苷酸(GENEART，GmbH)来合成含有密码子优化的、催化失活的hMMP-11的多核苷酸，并克隆到pV1JnsA载体上的BglII/EcoRI位点，生成pV1JnsA-hMMP-11(cat-)opt(图18)。编码催化失活的hMMP-11的密码子优化的多核苷酸的核苷酸序列如图14所示。催化失活的hMMP-11的氨基酸序列如图15所示。将载体pV1JnsA-hMMP-11(cat-)opt设计为在人体内使用，并可用于诸如具有人MHC I类——譬如HLA-A2.1的转基因小鼠这样的潜伏期模型中以鉴定产生免疫的抗原决定簇。
为了提高含hMMP-11的抗MMP-11疫苗的功效，合成编码与除去信号序列的大肠杆菌LTB相融合的、催化失活的hMMP-11的密码子优化的多核苷酸，并克隆到pV1JnsA载体上的BglII/SalI位点，这样生成pV1JnsA-MMP-11(cat-)-LTBopt(图20)。pV1JnsA-MMP-11(cat-)-LTBopt的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。核苷酸序列起始于XbaI多接头的第二个核苷酸，它分开了编码催化失活的hMMP-11的核苷酸密码子与编码LTB的核苷酸密码子。在SEQ ID NO：2的核苷酸序列中，CMV启动子包括3647到4261位的 核苷酸，内含子A包括4396到5221位的核苷酸，催化失活的hMMP-11包括5253到6715位的核苷酸，XbaI多接头包括6715到5位的核苷酸，LTB包括6到315位的核苷酸，BGH polyA包括382到599位的核苷酸。可以通过在GENEART GmbH，Germany上进行寡核苷酸装配的方式来合成编码催化失活的人MMP-11-LTB融合物的多核苷酸。
文中所述的本发明及参考文献是为了阐释实施方案，应理解本发明并不受其所限。本领域的普通技术人员通过阅读本说明书应知道在其范围之内的其它修正与实施方案。因此，本发明仅受本文所附的权利要求所限。
Claims (9)
1.编码融合多肽的核酸，所述融合多肽具有与大肠杆菌热不稳定毒素的B亚基(LTB)相连接的催化失活的基质金属蛋白酶11(MMP-11)，其中所述LTB的信号序列缺失，所述多肽由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的核酸，其由SEQ ID NO：11或12的核苷酸序列组成。
3.含有与启动子可操作连接的权利要求1或2的核酸的表达载体。
4.其中含有权利要求3的表达载体的分离的宿主细胞。
5.一种用于在分离的宿主细胞中表达MMP-11融合多肽的方法，其包括在产生融合多肽的条件下于细胞培养基中培养权利要求4的宿主细胞。
6.含有与大肠杆菌热不稳定毒素的B亚基(LTB)相连接的催化失活的基质金属蛋白酶11(MMP-11)的融合多肽，其中LTB不包括信号序列，并且其中所述多肽由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成。
7.包含权利要求1或2的核酸和药学上可接受的赋形剂的疫苗。
8.包含权利要求6的多肽和佐剂的疫苗。
9.权利要求1或2的核酸或权利要求6的多肽在制备用于治疗结肠癌的药物中的用途。
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