JP5129292B2 - ヒト・サイトメガロウィルス感染に対するコドン最適化型ポリヌクレオチド系ワクチン - Google Patents
ヒト・サイトメガロウィルス感染に対するコドン最適化型ポリヌクレオチド系ワクチン Download PDFInfo
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Description
ヒト・サイトメガロウィルス(「HCMV」)は40歳までに成人の50%〜85%に感染する。(Gershon A. A.,他、「Viral Infections of Humans」Evans A.S.及びKaslow, R.A.編、Plenum Press, New York, NY(1997))。HCMV感染はほとんどの健常成人においては良性であるものの、移植患者及びその他の免疫不全患者、特にHIV患者においては、致命的な肺炎、並びに大腸炎、食道炎、白血球減少、及び網膜炎を招くおそれがある。固形臓器移植(SOT)患者又は造血性細胞移植(HCT)個体群において、HCMV疾患は、ドナー器官又はHCTからの新たな感染から発生するか、或いは、レシピエント内の潜在ウィルスの再活性化の結果として再発することが可能である。
本発明は、HCMVポリペプチドをコードするコドン最適化型コード領域を含むポリヌクレオチド、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチドを、ヒトの組織内にin vivo投与することにより、HCMV感染に対する保護を必要とするヒトの免疫応答を高めることに関する。本発明の核酸断片は、下記の形式のうちの1つ又は2つ以上で天然状態から変化させられる。第1に、HCMVポリペプチドをコードする核酸断片は、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、コドン最適化型コード領域の一部又は全てであってよい。加えて、HCMVポリペプチドをコードする核酸断片は、完全長ポリペプチドの一部だけをコードする断片であってよく、且つ/又は、この核酸断片を突然変異させることによって、例えばコード化ポリペプチドから、コード化ポリペプチド中に存在する偶発的なタンパク質モチーフ、又はコード化ポリペプチドと関連する毒性因子を取り除くこともできる。例えば核酸配列を突然変異させることによって、ポリペプチドの分泌を防止する偶発的なアンカー・モチーフをコードしないようにすることもできる。本発明のポリヌクレオチドは送達されると、in vivoのヒトの細胞中に統合され、予防上又は治療上有効な量のHCMVポリペプチド又はその断片がin vivo生成される。
本発明は、HCMVポリペプチドをコードするヒト・コドン最適化型コード領域を含むポリヌクレオチド、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチドを、ヒトの組織内にin vivo投与することにより、HCMV感染に対する保護を必要とするヒトの免疫応答を高める組成物及び方法に関する。ポリヌクレオチドは、in vivoのヒトの細胞中に統合され、免疫学的に効果的な量のHCMVポリペプチド、又は断片又は変異体がin vivo生成される。
本明細書中に使用される「コドン最適化型コード領域」は、コドンの1つ以上、2つ以上又は有意な数を、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に使用される1つ又は2つ以上のコドンと置換することにより、所与の脊椎動物の細胞中での発現のために適合された核酸コード領域を意味する。
本発明はさらに、本明細書中に記載された組成物のうちの1つ又は2つ以上をヒトに投与して、本明細書中に記載されたような組成物が投与されると、HCMVに対して免疫応答を生成するのに十分な量で、HCMVポリペプチドがヒト細胞内に発現されるようにすることを含む、ヒトにHCMVポリペプチドを送達する方法を提供する。
血流中に所望のポリペプチドを放出するために、唾液腺、肝臓及び膵臓を使用して胃腸系の分泌器官に投与する或る様式が、米国特許第5,837,693号明細書及び同第6,004,944号明細書に開示されている(これら双方の全体を参考のため、本明細書中に引用する)。
材料及び方法
下記材料及び方法を、本明細書中に開示された実施例全てに全般的に適用する。特定の材料及び方法を必要に応じて各実施例において開示する。
本発明の構造は、標準的な分子生物学技術を用いて、本明細書中又は当業者において提供された配列情報に基づいて構成される。これらの分子生物学技術は下記のものを含む。先ず、それぞれ80-90ヌクレオチド長の、構造の長さにわたる一連の相補オリゴヌクレオチド対が、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニール時に、付着末端を含有する80-90塩基対の二本鎖断片を形成するように合成される。それぞれのオリゴヌクレオチド対の一本鎖末端は、隣接するオリゴヌクレオチド・デュプレックスの一本鎖末端とアニールするように設計される。このように調製されたいくつかの隣接するオリゴヌクレオチド対は、アニールすることを可能にされ、ほぼ5〜6つの隣接オリゴヌクレオチド・デュプレックス断片が次いで、付着単鎖末端を介してアニールし合うのを可能にされる。この一連のアニール済オリゴヌクレオチド・デュプレックス断片は一緒にライゲートし合わせれ、そして好適なプラスミド、例えばInvitrogen Corporation, Carlsbad, CAから入手可能なTOPO(登録商標)ベクター内にクローニングされる。次いでこの構造は標準的な方法によって配列決定される。ライゲートし合わされた5〜6つの80-90塩基対断片、すなわち約500塩基対の断片を含む構造がこのように調製され、所望の配列全体が一連のプラスミド構造内に示されるようになる。次いで、これらのプラスミドの挿入体を好適な制限酵素で切断し、そしてライゲートし合わせることにより、最終構造が形成される。次いで、最終構造が標準細菌クローニング・ベクター内にクローニングされ、そして配列決定される。或いは、当該遺伝子を増幅させるPCRプライマーを使用して、HCMV感染済細胞(例えば、American Type Culture Collection, Manassas, VAから入手可能なATCC寄託番号CCL-171のMRC-5細胞)から、野生型配列を直接的にクローニングすることができる。本明細書中で言及されたオリゴヌクレオチド及びプライマーは、本明細書中及び当業者において提供された配列情報に基づいて、当業者であれば容易に設計することができ、そして数多くの商業的なヌクレオチド供給元のいずれか、例えばRetrogen, San Diego, CA及びGENEART(ドイツ国Regensburg)によって合成することができる。
本発明の構造を、真核発現ベクターV10551内に挿入した。ベクターは、改質pUC18バックグラウンド上で形成され(Yanisch-Perron, C.,他, Gene 33:103-119(1989))、そしてカナマイシン耐性遺伝子、ヒト・サイトメガロウィルス前初期1プロモーター/エンハンサー及びイントロンA、及びウシ成長ホルモン転写終止シグナル、及び外来遺伝子を挿入するためのポリリンカーを含有する。Hartikka, J.他、Num. Gene Ther. 7:1205-1217(1996)を参照されたい。しかし、商業的に入手可能なその他の真核発現ベクターを本発明に使用することもできる。これらのベクターの一例としては、プラスミドpcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、及びpZeoSV2(Invitrogen, San Diego, CAから入手可能)、及びプラスミドpCI(Promega, Madison, WIから入手可能)が挙げられる。
プラスミドDNAをEsherichia coli DH5α能力細胞中に形質転換し、そして高精製された、共有結合により閉じられた環状プラスミドDNAを、改質溶解手順によって分離し(Horn, N.A.他、Hum. Gene Ther. 6:565-573(1995))、続いて、標準的な二重CsCl-エチジウムブロミド勾配超遠心分離を施した(Sambrook他、Molecular Cloning A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989))。或いは、Qiagen(Valencia, CA)製のGigaカラムを使用して、キット指示書に従って、プラスミドDNAを調製した。全てのプラスミド調製物には、ゲル分析及びビシンコニン酸タンパク質アッセイ(Pierce Chem. Co., Rockford IL)に基づいて、検出可能な染色体DNA、RNA及びタンパク質の不純物はなかった。Limulusアメーバ状細胞溶解物アッセイ(LAL、Associates of Cape Cod, Falmouth, MA)を使用して内毒素レベルを測定し、このレベルは、プラスミドDNA 1mg当たり0.6内毒素単位を下回った。DNA溶液の分光光度A260/A280比は、典型的には1.8を上回った。プラスミドは、好適な溶液、例えば150mMリン酸ナトリウム(他の好適な賦形剤及び助剤に関しては、2002年2月14日付けで発行された米国特許第20020019358号明細書を参照されたい)中に沈澱され再懸濁されたエタノールであった。DNAを使用するまで-20℃で保存した。300mM塩溶液と混合することにより、そして適量のUSP水を添加することにより、DNAを希釈して、所望のモル濃度で所望の塩中の1mg/ml プラスミドDNAを得た。
American Type Culture Collection, Manassas, VAから入手可能な、良く特徴付けされたマウス・メラノーマ細胞系(UM-499としても知られているVM-92)中にプラスミドをトランスフェクトすることにより、発現プラスミドをin vitro分析した。良く特徴付けされた他のヒト細胞系、例えばMRC-5細胞(ATCC寄託番号CCL-171のMRC-5細胞)を使用することもできる。当業者によく知られた、カチオン系脂質に基づくトランスフェクション手順を使用して、トランスフェクションを実施した。他のトランスフェクション手順も当業者によく知られており、そして例えばエレクトロポレーション及び塩化カルシウム媒介性トランスフェクションを用いることができる(Graham F.L.及びA.J. van der Eb Virology 52:456-67(1973))。トランスフェクションに続いて、トランスフェクトされた細胞の細胞溶解物及び培養上澄みを評価して、HCMV抗原タンパク質の相対発現レベルを比較した。商業的に入手可能な抗pp65及び抗gBモノクローナル抗体(例えばResearch Diagnostics Inc., Flanders NJから入手可能な入手可能)を使用して、ウェスタン・ブロット及びELISAによって試料をアッセイし、これにより、発現された抗原の質及び量の双方を比較した。これに加えて、in vitroトランスフェクション・アッセイを用いて、HCMV pp65及びgBをコードするコドン最適化型コード領域を含む種々のプラスミドを混合することが、ヒト細胞中の発現レベルに与える効果を見極めた。
拘束された覚醒マウス(例えばHarlan Sparague Dawley, Indianapolis, INから入手可能な雌の週齢6-12のBALB/cマウス)の大腿四頭筋に、マイクロピペット・チップから切り取られたプラスチック・カラーを備えた、使い捨て式滅菌プラスチック・インスリン・シリンジ及び28G 1/2針(Becton-Dickinson, Franklin Lake, NJ, カタログ番号329430)(これらは全て既述の通りである(Hartikka, J.他、Num. Gene Ther. 7:1205-1217(1996))を使用して注射した。マウスの大腿直筋に左右対称に、塩溶液(例えば150mM リン酸ナトリウム又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS))中に調製された25μgのプラスミドDNA(1マウス当たり合計で50μg)、又は脂質を基剤とする送達系を注射した。
HCMVはヒト細胞にだけ感染させることができるが、Staczekによって概要が述べられているように、HCMV感染に対する信頼性の高い数多くの動物モデルが当業者に知られており、また、これらの動物モデルは本発明の方法と一緒に用いることにより、例えば免疫原性又は発現を試験することができる(Staczek, J. Microbiol. Rev 54:247-65(1990))。例えば、トランスジェニック・ヒト白血球抗原(HLA) A*0201.Kbマウス・モデルを使用することができる(Gallez-Hawkins, G.他、Scand J Immunol 55:592-8(2002))。垂直HCMV感染のマウス・モデルがTang他において記載されている(Tang, JL他、Arch Virol 147:1189-95(2002))。免疫不全SCID又はヌードマウス上に埋め込まれたヒト組織に感染するいくつかのモデルが記載されている(Bidanset, DJ他、J Infect Dis 184:192-5(2001);Pari, GS.他、J Infect Dis 177:523-8(1998);Mocarsiki, ES.他 Proc Natl Acad Sci. USA 90:104-8(1993))。胸腺欠損マウスを使用することにより、HCMVを用いてサイトメガロウィルス性網膜炎がモデル化されている(Laycock, KA他、Am J Ophthalmol 124:181-9(1997))。加えて、HCMV感染を模倣するための、動物サイトメガロウィルスを使用した動物モデルが記載されている。これらの動物モデルは、アカゲザルがアカゲザル・サイトメガロウィルスに感染させられた霊長類モデル、及びマウス・サイトメガロウィルスに感染させられたマウス・モデルを含む(Sequar, G他、J Virol 76:7661-71 (2002);Lockridge, KM他、J. Virol 73:9576-83(1999);Minamishima, Y.他、Microbiol Immunol 22:693-700(1978))。
キナーゼ部位が欠失したヒト・サイトメガロウィルスpp65をコードする、最小ヒト・コドン最適化型pp65コード領域を含む単離(分離型)ポリヌクレオチドの構成
VCL-6368は、上記発現ベクターVR10551内にクローニングされたヒトCMV抗原pp65の最適化形及び突然変異形をコードする。このプラスミドは、557アミノ酸タンパク質(SEQ ID NO:6)をコードする。このタンパク質の場合、ヒトCMV pp65抗原のアミノ酸Arg435-Lys438が欠失させられている。ヒトにおいて稀にしか使用されない5つのコドンを、より頻繁に使用される対応コドンに変化させることにより、このコード配列をヒトにおける発現に関して最小最適化した。5つのコドン及び変化は次の通りである:Ala GCGからGCCへ、Arg CGTからCGCへ、Pro CCGからCCC及びCCAへ、Ser TCGからTCCへ、そしてThr ACGからACCへ。最適化された配列はSEQ ID NO:5である。
分泌ヒト・サイトメガロウィルス糖タンパク質Bをコードする、最小ヒト・コドン最適化型糖タンパク質Bコード領域を含む分離型ポリヌクレオチドの構成
VCL-6365は、上記発現ベクターVR10551内にクローニングされたヒトCMV抗原gBの分泌形をコードする。このプラスミドは、ヒトCMV gB抗原(SEQ ID NO:14)のアミノ酸1-713をコードする。ヒトにおいて稀にしか使用されない5つのコドンを、より頻繁に使用される対応コドンに変化させることにより、野生型gBコード配列(SEQ ID NO:11)のヌクレオチド1-2139を、ヒトにおける発現に関して最小最適化した。5つのコドン及び変化は次の通りである:Ala GCGからGCCへ、Arg CGTからCGCへ、Pro CCGからCCC, CCT及びCCAへ、Ser TCGからTCCへ、そしてThr ACGからACCへ。最適化された配列はSEQ ID NO:13である。
ヒト・サイトメガロウィルスIE1をコードする、ヒト・コドン最適化型CMV IE1コード領域を含む分離型ポリヌクレオチドの構成
プラスミドVCL-6520は、発現ベクターVR-10551内に挿入されたヒトCMV IE1遺伝子のエクソン2及び4をコードする1236塩基対のヒト・コドン最適化型合成DNA構造を含む。ヒトCMV IE1遺伝子のエクソン2及び4の野生型配列は下記の通りである(SEQ ID NO:50)
ワクチン配合物の調製
下記方法のそれぞれにおいて、本発明のHCMV抗原コード・プラスミドを、VF-P1205-02Aとして本明細書中で説明されたポロキサマー系と配合する。VF-P1205-02Aは、非イオン性ブロック・コポリマー、CRL 1005及びカチオン性界面活性剤BAK(塩化ベンザルコニウム50%溶液、Ruger Chemical Co. Inc.)から成るポロキサマー系送達系を意味する。配合物の各成分の具体的な最終濃度を下記方法において説明するが、これらの方法のいずれに関しても、各成分の濃度は、当業者によって知られた基本的な化学量論計算によって変化させることにより、所望の濃度を有する最終溶液を形成することができる。
この実施例では、総容積3.6 ml中、0.3 mM BAK、7.5 mg/ml CRL 1005、及び5 mg/mlのDNAを含む配合物の調製が説明される。成分を曇り点未満の温度で合体させ、次いで、図8に概要を示したプロトコルに従って、配合物に数回にわたって室温(曇り点を上回る温度)まで熱サイクル処理を施した。
この実施例では、最終容積4.0ml中に0.3 mM BAK、34 mg/ml又は50 mg/ml CRL 1005、及び2.5 mg/mlのDNAを含む配合物の調製が説明される。成分を曇り点未満の温度で合体させ、次いで、図9に概要を示したプロトコルに従って、配合物に数回にわたって室温(曇り点を上回る温度)まで熱サイクル処理を施し、これを希釈し、そして濾過した。
この実施例では、総容積3.6 ml中に0.3 mM BAK、7.5 mg/ml CRL 1005、及び5 mg/mlのDNAを含む配合物の単純化された調製が説明される。成分を曇り点未満の温度で合体させ、次いで、図10に概要を示したプロトコルに従って、配合物を単に濾過し、次いで使用又は保存する。
動物免疫化
実施例1、2及び3に記載されたコドン最適化型ポリヌクレオチド、及び任意には、実施例4に記載されたコドン最適化型ポリヌクレオチドのうちの1つ又は2つ以上によってコードされた発現生成物の免疫原性を、免疫応答をin vivoで開始するそれぞれのプラスミドの能力に基づいて評価する。単一の構造並びに多数の構造を注射することによって、プラスミドを個別に、そして組み合わせで試験する。動物、例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、霊長類、又は他の好適な動物において、筋内(IM)注射により、免疫化を最初に行う。免疫化動物から血清を捕集し、そして免疫応答を定量する。免疫原性の試験はさらに、抗体力価の測定、抗体力価の中立化、T細胞サイトカイン生成、及びT細胞の細胞溶解活性を含む。ヒトにおける保護レベルとの相関は、当業者によってよく知られた方法に従って行われる。上記「免疫相関」を参照されたい。
実施例4に記載された方法のいずれかによって、プラスミドDNAを調製する。或いは、プラスミドDNAを上記のように調製し、そして、4:1 のDNA:脂質質量比のトランスフェクション促進カチオン性脂質、例えばDMRIE/DOPEと伴う又は伴わないPBS中に約0.1 mg/ml〜約10 mg/ml、好ましくは約1 mg/mlの濃度で溶解させる。別のDNA配合物は、PBSの代わりの150mM リン酸ナトリウム、アジュバント、例えばVaxfectin(登録商標)(4:1のDNA: Vaxfectin(登録商標)の質量比)、2% 油(スクアレン)-Tween 80-水中のS. minnesota(MPL)及びトレハロースジコリノミコレートAF (TDM)(MPL + TDM, Sigma/Aldrich, St. Louis, MOから入手可能、(カタログ番号M6536))に由来するモノ-ホスホリル脂質A(解毒された内毒素)、可溶化モノ-ホスホリル脂質A配合物(AF、Corixaから入手可能)、又は(±)-N-(3-アセトキシプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(オクチルオキシ)-1-プロパンアミニウムクロリド(化合物番号VC1240)(Shriver, J.W.他、Nature 415:331-335(2002)、及び国際公開02/00844号パンフレット参照、これらのそれぞれの全体を参考のため、本明細書中に引用する)。
分泌されたgB及びpp65をコードするコドン最適化型DNAプラスミド、及び野生型DNAプラスミド、及び上述のような突然変異体を、PBS中のDNAとして、又はポロキサマー系送達系:3 mg/ml DNA、34又は50 mg/ml CRL 1005、及び0.3 mM BAKと配合されたDNAとして、BALB/cマウス内に単一プラスミドとして注射する。隔週のインターバルで3回、10匹のマウスから成る群を免疫化し、そして血清を得ることにより、抗原のそれぞれに対する抗体力価を見極める。3つのプラスミドのそれぞれを等しい質量で含有する3価調製物でマウスが免疫化される群も含まれる。それぞれのプラスミドの研究デザインを表10に示し、そして典型的な免疫プロトコルを表11に示す。
上述の免疫化スキームに従って、HCMV pp65、gB、IE1をコードするプラスミドDNA、又はその断片、変異体又は誘導体を調製し、そしてこれを、ポリクローナル抗体を生成するのに適した動物中に注射する。血清を捕集し、そして上述のように抗体を滴定する。免疫化動物から得られた血清中の抗HCMVペプチド抗体の力価は、例えば、当業者に知られた方法に従って、固体支持体上のペプチドに吸着させること、又は選択された抗体を溶離することによって増大させることができる。
HCMV pp65及びgB、及びその断片、変異体及び誘導体をコードする構造のmRNA発現のリアルタイムRT-PCR定量分析
HCMV pp65及びgB及びIE1構造から発現されたmRNAレベルの定量は、遺伝子活性に対する価値の高い生物学的マーカーである。種々の方法、例えばノーザン・ブロット、スロット・ブロット、及び当業者に知られたその他の技術を用いて、mRNAのレベルを測定することができる。しかし、リアルタイムRT-PCRに基づく迅速法が、遺伝子活性をモニタリングするための効率的な信頼性の高い手段をもたらす。このような1つのシステムは、ABI PRISM(登録商標)配列検出システムとともに使用されるTaqMan(登録商標)RT-PCRアッセイである。これらは両方とも、Applied Biosystem, Inc.(Foster City, CA)から入手可能である。
ヒトCMV抗原をコードする免疫原性プラスミドの実証
一般試験手順
下記実施例のための試験手順は上述の通りであり、本明細書中に記載されているような特定のパラメーター及び材料が採用される。
上述のように、本発明の構造を発現ベクターVR 10551中に挿入した。
VF-P1205-02Aポロキサマー系送達系を、実施例4Bと同等のプロトコルを用いて調製し、この場合、DNA、ポロキサマー及びBAKの初期濃度はそれぞれ5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、0.3 mMであった。配合物を室温でPBSで希釈して、注射前の所要の試験濃度にした。
週齢6-8の9匹の雌BALB/cマウス(Harlan Sparague Dawley)から成る群が、PBS又は上述のCRL 1005ポロキサマー配合物と一緒に送達される、100μgのpp65 DNA、100μgのgB DNA、又は、それぞれ100μgのpp65 DNA及びgB DNAを含有する筋内(大腿直筋)注射を受容した。対照マウスは、100μgのpp65 DNA又は100μgのgB DNAを、PBS又はVF-P1205-02Aと一緒に送達される100μgの非コードベクターDNA(VR10051)と混合された状態で受容した。全てのマウスは、合計200μgのDNA、すなわち100μgのpp65 DNA及び100μgのgB DNAを含有するワクチン化接種を2回受容した(0日目及び13日目に投与)。第1回ワクチン接種後(11日目)及び第2回ワクチン接種後(22日目)に血清を捕集し、そして、gB特異的抗体及びpp65特異的抗体をそれぞれELISA及び免疫ブロット分析によって測定した。
上記接種計画に従ってワクチン接種されたマウスから、血清を捕集した。組換えCMV gB酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)を用いて、抗gB IgG力価を見極めた。
VR6368又はVR10551をトランスフェクトされたマウス・メラノーマVM92細胞から、1X NuPAGE LDS試料緩衝液中で直接的に溶解物を形成し、これらの溶解物を、必要になるまで-80℃で保存した。室温で解凍した後、0.5 MMジチオスレイトールの試料容積の10分の1を各試料に添加した。次いで、試料を10分間にわたって85℃で加熱し、そして、NuPAGE 4-12% Bis-Trisゲル上でのローディング前に、氷上で直ちに冷却した。室温で60分間にわたって、200Vで、電気泳動を実施した。タンパク質の移動のために、先ずポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜を30秒間にわたってメタノール中に浸し、次いで20%(v/v)メタノールを含有する1X NuPAGE移動緩衝剤中で平衡させた。室温で60分間にわたって、タンパク質をゲルからPVDF膜へ移動させた。タンパク質移動後に、膜をmilli-Q water 中ですすぎ、次いでオービタル震盪器上においてBBS中1%(w/v)BSA中で、45分間にわたって室温でブロックした。ブロック後、24時間以下の時間にわたって、膜をBBS中1%(w/v)BSA中で4℃で貯蔵した。ブロットを分断してストリップを形成し、これらを、オービタル震盪器上において一晩にわたって室温で、BBS中0.5%(w/v)BSA中に希釈されたマウス免疫血清中でインキュベートした。BBS中で洗浄した後、ストリップを室温で2.5時間にわたって、二次抗体(アルカリ性ホスファターゼに接合されたヤギ抗マウスIgG Fcγ)中にインキュベートした。次いでストリップをBBS中で再び洗浄し、そして、室温で10分間にわたってアルカリ性ホスファターゼ基質溶液中で展開させた。次いでストリップを蒸留水中で十分にすすぎ、そして紙タオル間で室温で乾かしておいた。
第2DNAワクチン接種後に捕集されたマウス血清を、上述のようにpp65 プラスミド(VR 6368)をトランスフェクトされた細胞から得られた溶解物の免疫ブロットにおいて試験することにより、VR 6368単独をワクチン接種されたマウス、及びプラスミド複合体をワクチン接種されたマウスにおける抗体応答の差を定性的に見極めた。免疫ブロットの第1の集合の場合、VR 6368をワクチン接種されたマウスの各群からプールされた血清を、希釈率1:200、1:400、1:800、1:1000及び1:2000で試験した。VF-P1205-02A中で調製されたVR 6365(gB)をワクチン接種されたマウスからプールされた血清試料を、負の対照として含んだ。pp-65特異的マウス・モノクローナル抗体を正の対照として含んだ。各免疫ブロット・ストリップは、分子量標準のレーン、VR 6368をトランスフェクトされた細胞溶解物を含有するレーン、及びVR10551をトランスフェクトされた細胞溶解物対照レーンを有する。VF-P1205-02Aと配合されたpp65 DNAをワクチン接種された全てのマウス(9匹中9匹)が、1:200の希釈率で血清を試験したときに、免疫ブロットによってpp65に対する検出可能な抗体を有した。VF-P1205-02Aと配合された二価HCMVプラスミド・ワクチンをワクチン接種された9匹のマウス中6匹が、1:200の希釈率で試験したときに、免疫ブロットによってpp65に対する検出可能な抗体を有した。VF-P1205-02Aと配合されたpp65 DNAをワクチン接種されたマウス、又は、VF-P1205-02Aと配合された二価HCMVプラスミド・ワクチンをワクチン接種されたマウスからプールされた血清の免疫ブロット滴定は、群の間でpp65に対する抗体応答の際立った差を明らかにしなかった。gB DNA単独をワクチン接種されたマウス内に、検出されたpp65抗体はなかった。
IFN-γ ELISpotアッセイによって、DNAコード化pp65に対するT細胞応答を見極めた。ワクチン接種済マウスの脾細胞を、オーバーラップするペプチドの2つの別個のプールで刺激した。これらのペプチドはともにpp65タンパク質全体にわたり、そして可能な全てのT細胞エピトープを含有するはずである。従って、ペプチド刺激に応答してIFN-γを生成するタイプのT細胞(例えばCD8+又はCD4+)は、このアッセイ法によって区別することはできない。理論上は、これらのペプチドは、クラスI又はクラスII MHCとの関連において提供され、こうして、同じ脾細胞調製物内部のCD8+T細胞及びCD4+T細胞双方を刺激することができる。
ヒトCMV抗原をコードする免疫原性プラスミドの確認
一般試験手順
下記実施例のための試験手順は上述の通りであり、本明細書中に記載されているような特定のパラメーター及び材料が採用される。
上述のように、発現ベクターVR10551内に好適な挿入体を挿入することにより、本発明の構造VR6365及びVR6368を構成し、これらの構造を、上記ポロキサマー配合物VF-P1205-02A配合物と配合した。
週齢6-8の9匹の雌BALB/cマウス(Harlan Sparague Dawley)から成る群が、pp65、gB、又はpp65及びgBをコードするプラスミドDNAを、VF-P1205-02Aを伴って又は伴わずに含有する左右対称の筋内(大腿直筋)注射(50μl/脚)を、0、21及び49日目に受容した。各マウスはワクチン接種1回当たり200μgのDNAを受容した。単独のgB又はpp65コード・プラスミドを含有する配合物の場合、充填剤として役立つブランクDNA(VCL10551)100μgを含んだ。充填剤DNAの不在において、VF-P1205-02Aを伴って又は伴わずに送達される100μgの単一プラスミドDNAをマウスにワクチン接種することにより、ブランクDNAの効果を試験した。第1ワクチン接種前(-1日目)及び各ワクチン接種後(20, 48及び63日目)に、血清試料を捕集し、そしてgB特異的抗体をELISAによって測定した。
ワクチン接種されたマウスから、血清を捕集し、そして実施例7で説明したように、組換えCMV gB酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)を用いて、抗gB IgG力価を見極めた。
ヒトCMV IE1をコードするプラスミドは免疫原性である。
一般試験手順
下記実施例のための試験手順は上述の通りであり、本明細書中に記載されているような特定のパラメーター及び材料が採用される。
マウスは、IE1プラスミドVR6250の大腿直筋内への筋内注射を受容した。下に示すような総DNA投与量はそれぞれPBS中100μlの容積であるが、ただし、等容積の注射として2回にわたって投与され、1回の投与は、それぞれのマウスの各大腿直筋内に行われる。負の対照群は5匹のマウスを含み、そして他の全ての群は10匹の含んだ。マウスは0日目と14日目とに注射を受容した。ELISpotアッセイによって脾細胞を、IE1反応性に関して分析した。このアッセイの場合、オーバーラップする98個の15量体ペプチド(11個のアミノ酸だけオーバーラップ)のプールで、脾細胞を刺激した。これらのペプチドは、VR6250構造上でコードされるIE1タンパク質全体にわたる。負の対照群から脾細胞を24日目に採取し、そしてIE1ペプチド・プールによってIFN-γ分泌T細胞に与えられる非特異的な刺激を分析した。抗原特異的なIFN-γ分泌T細胞の分析のために、IE1 DNAを注射された群から、27-29日目に、脾細胞を採取した。各群からアッセイのために2つの脾臓をプールした。各群から2つのプールを27日目及び28日目に分析し、各群から1つのプールを29日目に分析した。下記に報告された値は、1試験群当たり5つの脾臓プールの平均を表す。
IFN-γ ELISpotアッセイによって測定された抗原特異的刺激に応答したIFN-γ分泌脾細胞の数を定量化することにより、DNAワクチンに対するT細胞応答を見極めた。ImmunoSpotプレート(Cellular Technology Limited, Cleveland, OH)に、ラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体(BD Biosciences, San Diego, CA)をコーティングし、このプレートをRPMI-1640培地でブロックした。個々のワクチン接種済マウスから脾細胞懸濁液を分離し、これをELISpotプレートに、RPMI培地中1 x 106又は3.3 x 105細胞/ウェルで添加した。RPMI培地は刺激性抗原としてオーバーラップIE1ペプチドをそれぞれ5μg/mLを含有した。対照ウェルは、培地(抗原なし)中でインキュベートされた1 x 106脾細胞を含有した。37℃で20時間にわたってインキュベートした後、ビオチンで標識付けされたラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体及びアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼを順次添加することにより、捕捉されたIFN-γを検出した。比色分析基質3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)の変換によって生成されたスポットを、ImmunoSpot Analyzer(Cellular Technology Limited, Cleveland, OH)によって定量化した。その結果を、細胞106個当たりのスポット形成ユニット(SFU)として表す。
配合物選択研究
マウスCMV M84を使用した2つの試験マウス免疫原性研究において、種々異なるワクチン配合物の効力を評価した。マウスCMV M84はヒトCMV pp65の同族体と考えられ、ひいてはpp65抗原の代わりとして役立つ。第1の研究は、固定量のDNAを使用して脂質投与量応答を測定するのに対し、第2の研究は、投与量を増大させることにより、臨床的に適切なDNA投与量を評価した。
46.2重量% DMRIEと53.8重量% DOPEとを含有する脂質膜として、1:1モル比のDMRIE/DOPEを生成した(総乾燥脂質5.14 mg)。注射前に、混合脂質膜を注射用滅菌水中で水和することにより、カチオン性リポソームを形成した。次いで、これらのリポソームを2 x PBS中の好適な濃度のDNAに添加した。DNAを下記のようにDMRIE/DOPEと配合した:
週齢6-8の9匹のBALB/cマウス(Harlan Sparague Dawley)から成る群が、PBS中のDMRIE/DOPE又はCRL 1005と配合されたプラスミドDNAの左右対称(50μl/脚)の筋内(大腿直筋)注射を受容した。対照マウスはPBSだけの中のDNAを受容した。全てのマウスをほぼ21日目と49日目とにブーストした。最後の免疫化から2週間後に、3日連続してマウス3匹/群/日から脾細胞を採取し、そして抗原特異的T細胞応答を、IFN-γ ELISpotアッセイによって測定した。
25mM HEPES緩衝液とL-グルタミンとを含有するRPMI-1640培地中で、脾細胞培養を成長させた。RPMI-1640培地には、10%(v/v) FBS、55 μM β-メルカプトエタノール、100 U/mLのペニシリンGナトリウム塩、及び100μg/mLの硫酸ストレプトマイシンが補足されている。
IFN-γ ELISpotアッセイによって測定された抗原特異的刺激に応答したIFN-γ分泌脾細胞の数を定量化することにより、DNAワクチンに対するT細胞応答を見極めた。ImmunoSpotプレート(Cellular Technology Limited, Cleveland, OH)に、ラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体(BD Biosciences, San Diego, CA)をコーティングし、このプレートをRPMI-1640培地でブロックした。個々のワクチン接種済マウスから脾細胞懸濁液を生成し、これをELISpotプレートに、RPMI培地中1 x 106、3 x 105又は1 x 105細胞/ウェルで播種した。RPMI培地は1μg/mLの好適なMHCクラスI-制限ペプチド(M84, 297AYAGLFTPL305、(SEQ ID NO:32)Imgenex, San Diego, CA)、1 U/mlの組換えマウスIL-2(Roche, Indianapolis, IN)を含有した。対照ウェルは、IL-2(抗原なし)中でインキュベートされた1 x 106脾細胞を含有した。37℃で20時間にわたってインキュベートした後、ビオチンで標識付けされたラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体及びアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼを順次添加することにより、捕捉されたIFN-γを検出した。比色分析基質3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)の変換によって生成されたスポットを、ImmunoSpotリーダー(Cellular Technology Limited, Cleveland, OH)によって定量化した。ポロキサマー配合DNAをワクチン接種されたマウス及びネイクドDNAをワクチン接種されたマウスのT細胞応答間の統計的に有意な差を、α=0.05でスチューデントt-検定を用いて見極めた。
HCMV抗原採用試験
ワクチン接種計画
週齢6-8の9匹の雌BALB/cマウス(Harlan Sparague Dawley)から成る群が、pp65、gB、又はpp65及びgBをコードするプラスミドDNAを、CRL 1005(VF-P1205-02A配合物)を伴って又は伴わずに含有する左右対称の筋内(大腿直筋)注射(50μl/脚)を、0及び13日目に受容した。各マウスはワクチン接種1回当たり200μgのDNAを受容した。単独のgB又はpp65コード・プラスミドを含有する配合物の場合、100μgのブランクDNA(VR10551)を添加することにより、200μgの総DNAを産出した。第1ワクチン接種からほぼ3週間後(22日目)から開始して、ワクチン接種済マウスから脾臓細胞を採取し、IFN-γ ELISpotアッセイによってpp65特異的T細胞応答を測定した。3つのELISpotアッセイを実施した:アッセイ1では、1群当たり3匹のマウスから得られた脾臓細胞プールからの免疫応答を測定し、アッセイ2及び3では、1群当たり2匹のマウスから得られた脾臓細胞プールからの免疫応答を測定した。各群における付加的な2匹のマウスの免疫応答は、この一連のアッセイでは測定されなかった。
pp65誘導型ペプチド(Bio-Synthesis, Lewisvill, TX)による刺激に応答したIFN-γ分泌脾細胞の数を定量化することにより、DNAコード化pp65に対するT細胞応答を見極めた。ImmunoSpotプレート(Millipore, Billerica, MA)に、ラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体(BD Biosciences, San Diego, CA)をコーティングし、このプレートを、25mM HEPES緩衝液とL-グルタミンとを含有するRPMI-1640培地でブロックした。この培地には、10%(v/v) 熱不活性化FBS、55 μM b-メルカプトエタノール、100 U/mLのペニシリンGナトリウム塩、及び100μg/mLの硫酸ストレプトマイシン(10%)が補足されている。ワクチン接種済マウスから、脾細胞懸濁液を生成し、これを2 x 107細胞/mLの密度で10% RPMI培地中に再懸濁させ、そして5 x 105細胞/mL又は2.5 x 105細胞/mLの密度で、2つの別個のImmunoSpotプレートの3部ずつのウェル内に播種した。脾細胞を、オーバーラップするpp65ペプチドの2つの別個のプールで刺激した(1プレート当たり1プール)。これらのペプチドはともにpp65タンパク質全体にわたり、そして可能な全てのT細胞エピトープを含有するはずである。従って、ペプチド刺激に応答してIFN-γを生成するタイプのT細胞(例えばCD8+又はCD4+)は、このアッセイ法によって区別することはできない。理論上は、これらのペプチドは、クラスI又はクラスII MHCとの関連において提供され、こうして、同じ脾細胞調製物内部のCD8+T細胞及びCD4+T細胞双方を刺激することができる。ペプチド・プールは、15個のアミノ酸それぞれの68個(プールI)又は69個(プールII)のペプチドを含有し(プールII中の1つの13アミノ酸ペプチドを除く)、それぞれのペプチドはアッセイ・ウェル内で5μg/mLの最終濃度で表された。対照ウェルは、培地だけ(ペプチド抗原なし)の中で5 x 105細胞を含有した。37℃で21時間にわたってインキュベートした後、ビオチンで標識付けされたラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体(BD Biosciences, San Diego, CA)及びアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼを順次添加することにより、捕捉されたIFN-γを検出した。比色分析基質3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)の変換によって生成されたスポットを、ImmunoSpotリーダー(Cellular Technology Limited, Cleveland, OH)によって定量化した。データは、アッセイされた細胞100万個当たり、抗原特異的刺激に応答して生成されたスポット形成ユニット(SFU)として提供される。pp65誘導型ペプチドのプールと一緒にインキュベートされた同一の脾細胞調製物を含有するウェル内のスポット数から、培地だけの中でインキュベートされた脾細胞を含有するウェル内の平均スポット数を差し引くことにより、抗原特異的刺激を計算した。3つの複製ウェルを使用して、平均非特異的バックグラウンド応答を見極めた。各SFUは、1つのpp65特異的T細胞に応答する。試料サイズが小さいので(n=3)、平均値の差に関する統計的分析は行わなかった。
試験1-表18及び19参照
ワクチン接種計画
週齢6-8の9匹の雌BALB/cマウス(Harlan Sparague Dawley)から成る群が、pp65、gB、又はpp65及びgBをコードするプラスミドDNAを、CRL 1005(VF-P1205-02A配合物)を伴って又は伴わずに含有する左右対称の筋内(大腿直筋)注射(50μl/脚)を、0、21及び49日目に受容した。各マウスはワクチン接種1回当たり200μgのDNAを受容した。単独のgB又はpp65コード・プラスミドを含有する配合物の場合、100μgのブランクDNA(VR10551)を添加することにより、200μgの総DNA投与量を産出した。ブランクDNAの不在において、CRL 1005を伴って又は伴わずに送達される100μgの単一プラスミドDNAをマウスにワクチン接種することにより、ブランクDNAの効果を試験した。66日目から開始して脾細胞を採取し、そしてpp65特異的T細胞応答を上記IFN-γ ELISpotによって分析した。前の結果に基づいて、gB + ブランクDNA又はgB + ブランクDNA + CRL 1005をワクチン接種されたマウスに関して、pp65特異的T細胞応答は予期されなかった。従って、これらのマウスはELISpotアッセイでは評価されなかった。ワクチン接種済マウスと、pp65 + gBとの平均T細胞応答の統計的に有意な差を、α=0.05でスチューデントt-検定を用いて見極めた。
ワクチンの組み合わせ-DNAとタンパク質との組み合わせ
一般試験手順
下記実施例のための試験手順は上述の通りであり、本明細書中に記載されているような特定のパラメーター及び材料が採用される。
下記のような、50μl容積+/-のポロキサマーVF-P1205-02A(「02A」)、DMRIE:DOPE(「D/D」)及び/又はgBタンパク質中の20μgのHCMV二価DNAワクチンを、雌BALB/cマウス6匹/群の各大腿直筋に注射した。プラスミドVR6365はHCMV gBをコードし、プラスミドVR6368はHCMV pp65をコードする。CHO細胞から精製された完全長gBタンパク質を、Austral Biologicals(San Ramon, CA)から入手した。マウスは0日目と14日目とに注射を受容し、そして13日目と26日目とにgB抗体力価を見極めるために採血した。1群当たり2匹のマウスから、脾細胞を26, 27及び28日目に、pp65 IFN-γ ELISpot分析のために採取した(個々のマウスから得られた脾細胞をアッセイした。群1つ当たりn=6)。
gB特異的血清抗体を検出するためのELISAを、96ウェル型Costar 1/2ウェルEIAプレートで実施した。このプレートには、ホウ酸緩衝生理食塩水(BBS)中の濃度0.1μg/ウェルの組換えCMV gBをコーティングした。抗原をコーティングした後、プレートをシールし、そして4℃で一晩にわたってインキュベートした。自動プレート洗浄装置を使用して、0.1% Tween-20(BBST)を含有するBBSで4回洗浄した。100 μLのアッセイ緩衝液(BBS中10%のウシ胎仔血清)と一緒に、室温で1時間にわたってプレートをインキュベートすることにより、非特異結合をブロックした。次いで、ブロッキング緩衝液をデカントし、次いで、連続希釈された血清(アッセイ緩衝液中に希釈)を50 μL/ウェルで添加した。プレートをシールし、2時間にわたって室温でインキュベートし、次いで、自動プレート洗浄装置を使用して、0.1% Tween-20(BBST)を含有するBBSで4回洗浄した。アッセイ緩衝液中に1:5000で希釈されたヤギ抗マウスIgG Fc特異的二次抗体を、50 μL/ウェルで添加し、プレートをシールし、そして室温で2時間にわたってインキュベートした。自動プレート洗浄装置を使用して、0.1% Tween-20(BBST)を含有するBBSで、プレートを4回洗浄した。50 mM重炭酸ナトリウム緩衝液、pH 9.8及び1mMのMgCl2中1 mg/mlのp-ニトロフェニルホスフェートから成る基質を、50μL/ウェルで添加し、プレートをシールし、そして室温で60分間にわたってインキュベートした。各ウェルの吸光度を405 nmで見極めた。終点力価 = 最終希釈の逆数であり、最終希釈は、バックグラウンド・ウェルの平均吸光度値以上〜2倍である平均吸光度値をもたらす。
ワクチンの組み合わせ-三価ワクチンの組み合わせ
ワクチン接種計画
下に示すような複数のDNAプラスミドを含有する50μLのPBSを、10匹のマウスから成る群の各大腿直筋に注射した。プラスミドVR6365はHCMV gBをコードし、プラスミドVR6368はHCMV pp65をコードし、プラスミドVR6250はHCMV IE1をコードし、そして「ブランク」は等価のプラスミド主鎖ではあるが、いかなる抗原コード配列をも欠いていることを意味する。全てのDNAを、実施例4に記載されたような「02A」ポロキサマー系配合物と配合した。2つの注射セットを0日目と14日目とに実施した。gB抗体力価を見極めるために血清を26日目に採取した。
上記実施例7に記載された上記接種計画に従ってワクチン接種されたマウスから、血清を捕集した。上記実施例12に記載されているように、組換えCMV gB酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)を用いて、抗gB IgG力価を見極めた。
27-29日目に抗原特異的IFN-γ分泌性T細胞応答を分析するために、脾臓を捕集した。各群から2つの脾臓をアッセイのためにプールした。各群から2つのプールを27日目と28日目とに分析し、各群から1つのプールを29日目に分析した。脾臓細胞を処理し、そして実施例7に記載されたようなELISpotアッセイによって、pp65反応性に関して分析した。pp65 ELISpotアッセイに関して説明したように、ELISpotアッセイによってIE1反応性に関して脾臓細胞を分析した。ただしこの場合、オーバーラップする98個の15量体ペプチド(11個のアミノ酸だけオーバーラップ)のプールで、脾細胞を刺激した。これらのペプチドは、VR6250構造上でコードされるIE1タンパク質全体にわたる(実施例3参照)。
電気支援型プラスミド送達
注射された組織に短時間の電気パルスを加えることにより、in vivo遺伝子送達を増強することができる。この手順を本明細書中では、電気支援型プラスミド送達と呼ぶ。例えば、Aihara, H. & Miyazaki, J. Nat. Biotechnol. 16:867-70(1998); Mir, L.M.他、Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 4262-67 (1999); Hartikka, J.他、Mol. Ther. 4:407-15 (2001);及びMir, L.M.他;Rizzuto, G.他、Hum Gene Ther 11:1891-1900 (2000);Widera, G.他、J of Immuno. 164: 4635-4640 (2000)を参照されたい。細胞電気透過性化するために電気パルスを用いることにより、in vitroの原核細胞及び真核細胞内へ外来DNAが導入されている。細胞透過性化は、電極、及び生存細胞に匹敵する最適な電気的なパラメーターを用いて、in vivoで局所的に達成することもできる。
CMV gB DNAを使用してNew Zealand White Rabbitモデルにおいて、エレクトロポレーションで支援されたDNAワクチン送達を、DMRIE:DORE又はCRL 1005と配合されたDNA、及びPBS中のDNAと比較した。ウサギ(1群当たり5匹)の脛骨筋に、50μg DNA/500μl/脚を0日目と28日目とに注射した。注射直後に、200V(232 V/cm)、60m秒、2パルス及び2Hzの5 mm x 8.6 mm 4針アレイを有するBTX-ECM 830パルス発生器を使用して、エレクトロポレーションを実施した。
ヒト・コドン最適化型HCMV pp65及びgB、及びその断片及び変異体を含む組成物を使用した、患者の治療
現行のFDA 優良製造手順(Good Manufactureing Procedures)(GMP)に従って、プラスミド免疫治療製品を製造し、認可された研究用新薬(Investigational New Drug)申請の下で、ヒト患者に投与する。
別個のプラスミド上の最適化型gB及びpp65をコードするプラスミドDNAのそれぞれを0, 2及び8週目に、0.5mg又は2.5mgだけ筋内注射することにより、32人の健常成人を免疫化する。CD4+及びCD8+T細胞応答、及びHCMV gBの抗体力価を測定するためのELISpotアッセイを含む免疫原性研究のために、血液試料を免疫化前と、2, 4, 8, 10及び16週目とに採取する。
上記処置に続いて、健常HSCドナーを、供与の4週間前と2週間前とに、プラスミド組成物で免疫化する。免疫化前、及び免疫化後16週間にわたって2週間毎に、ドナーから採取された血液を使用して、免疫原性アッセイを実施する。レシピエントを2つの群に分ける。第1群は免疫化済ドナーからHSCを受容するが、しかし彼等自身は免疫化されない。第2群は免疫化済ドナーからHSCを受容し、そしてHSC移植からほぼ4週間後に、ドナーと同じプラスミド組成物で免疫化する。そして移植前及び上述のように2週間毎に、免疫原性アッセイを実施する。ドナー及びレシピエント双方に対して2週間毎に免疫化を繰り返すことができる。
Claims (8)
- 以下の:
(a)配列番号13を含む単離ポリヌクレオチド;
(b)配列番号5を含む単離ポリヌクレオチド;並びに
(c)CRL1005及び塩化ベンザルコニウム(BAK)を含む、アジュバント及びトランスフェクション促進剤であって該CRL1005及びBAKが、以下の:
0.3mM BAK及び7.5mg/mlCRL1005、
0.3mM BAK及び34mg/mlCRL1005、及び
0.3mM BAK及び50mg/mlCRL1005、
から成る群から選ばれる濃度で存在する、
を含む組成物であって、前記(a)のポリヌクレオチドは作用可能な状態でプロモーターに連結されたDNAであり、かつ、前記(b)のポリヌクレオチドも作用可能な状態でプロモーターに連結されたDNAである前記組成物。 - 前記(a)のポリヌクレオチドと前記(b)のポリヌクレオチドは、単一のプラスミド上に存在する、請求項1に記載の組成物。
- 前記(a)のポリヌクレオチドと前記(b)のポリヌクレオチドは、別々のプラスミド上に存在する、請求項1に記載の組成物。
- HCMVポリペプチド又はその免疫学的断片、変異体若しくは誘導体をコードする追加のポリヌクレオチド、あるいは不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、単離HCMVポリペプチドを発現するウイルスベクター、HCMVウイルス蛋白質又はその免疫学的断片若しくは誘導体からの単離ポリぺプチドから成る群から選ばれる慣用型のワクチン成分をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記追加のポリヌクレオチドが、前記HCMVポリペプチド又はその免疫学的断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化型コード領域を含む、請求項4に記載の組成物。
- 前記HCMVポリペプチドが、前初期−1蛋白質(IE−1)である、請求項5に記載の組成物。
- ヒトにおけるCMV感染の治療又は予防方法に使用するための、請求項1又は4に記載の組成物。
- ヒトにおけるCMV感染の治療又は予防用医薬の製造における、請求項1又は5に記載の組成物の使用。
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