JP5129292B2 - ヒト・サイトメガロウィルス感染に対するコドン最適化型ポリヌクレオチド系ワクチン - Google Patents

ヒト・サイトメガロウィルス感染に対するコドン最適化型ポリヌクレオチド系ワクチン Download PDF

Info

Publication number
JP5129292B2
JP5129292B2 JP2010101904A JP2010101904A JP5129292B2 JP 5129292 B2 JP5129292 B2 JP 5129292B2 JP 2010101904 A JP2010101904 A JP 2010101904A JP 2010101904 A JP2010101904 A JP 2010101904A JP 5129292 B2 JP5129292 B2 JP 5129292B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hcmv
codons
dna
codon
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2010101904A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2010227101A (ja
JP2010227101A5 (ja
Inventor
ジー． ハーマンソン，ゲイリー
ジェイ． ギール，アンドリュー
コプケ ウラック，メアリー
Original Assignee
バイカル インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バイカル インコーポレイテッド filed Critical バイカル インコーポレイテッド
Publication of JP2010227101A publication Critical patent/JP2010227101A/ja
Publication of JP2010227101A5 publication Critical patent/JP2010227101A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5129292B2 publication Critical patent/JP5129292B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • C07K14/04—Varicella-zoster virus
    • C07K14/045—Cytomegalovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/763—Herpes virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

発明の背景
ヒト・サイトメガロウィルス(「HCMV」)は40歳までに成人の50%〜85%に感染する。(Gershon A. A.,他、「Viral Infections of Humans」Evans A.S.及びKaslow, R.A.編、Plenum Press, New York, NY(1997))。HCMV感染はほとんどの健常成人においては良性であるものの、移植患者及びその他の免疫不全患者、特にHIV患者においては、致命的な肺炎、並びに大腸炎、食道炎、白血球減少、及び網膜炎を招くおそれがある。固形臓器移植(SOT)患者又は造血性細胞移植(HCT)個体群において、HCMV疾患は、ドナー器官又はHCTからの新たな感染から発生するか、或いは、レシピエント内の潜在ウィルスの再活性化の結果として再発することが可能である。
認可された治療法はあるものの、HCMV関連疾患は、HIV患者及び同種関連HCT及びSOT環境においては、今もなお重度に身体を消耗させ、生命を脅かす疾患である。加えて、HCMVは、米国内で最も一般的な子宮内感染であり、その結果、毎年8,000人を上回る幼児が死亡するか又は重度の後遺症を被っている。これらの理由から、HCMVは、米国内で開発が最も必要なワクチン上位10種のリストにランク付けされた(Vaccines for the 21st century: a tool for decision making, National Academy of Sciences (1999))。
既存の治療法は、免疫グロブリン及び抗ウィルス剤、例えばガンシクロビル及びその誘導体を使用することを含む。これらの免疫グロブリン及び抗ウィルス剤は、リスクのある個体群において予防的に又は感染中極めて早期に使用すると、極めて効果的である。しかし、これらの治療法は、特に晩期発症型疾患(最初の100日後に発症)に対しては著しい毒性を有し、有効性が制限されるという特徴を有している(Fittet, A.M., Drug Aging 19: 343-354(2002); von Bueltzingsloewen, A.,他、Bone Marrow Transplant 12:197-202 (1993); Winston, D.J.他、Ann. Intern. Med. 188: 179-184(1993)；Goodrich, J.M.,他、Ann. Intern. Med. 118:173-178(1993)；Boeckh, M.,他、Blood 88:4063-4071(1996)；Salzberger, B.,他、Blood 90:2502-2508(1997)；Preiser, W.,他、J. Clin. Virol. 20:59-70(2001)；Grangeot-Keros, L.及びCointe, D., J. Clin. virol. 21:213-221(2001)；Boeckh, M.,及びBowden, R., Cancer Treat. Res. 76:97-136(1995)；Zaia, J.A.,他、Hematology(Am. Soc. Hematol. Educ. Program)339-355(2000))。
より迅速で高感度の診断法を開発するのに加えて、分子生物学的方法は、ヒト病原体に対する規定のサブユニット・ワクチンの開発を可能にする。実際、安全で効果的な組換えサブユニット・ワクチンがあれば、治療の必要性が有意に低減され、おそらくは排除されることになるはずである。HCMVの場合、感染のコントロールが、最小3つのウィルス・タンパク質：pp65、糖タンパク質B(gB)、及び前初期-1タンパク質(IE1)の抗体及びT細胞認識と相関されている。
ppUL83、低マトリックスタンパク質、ICP27、PK68及びpp64としても知られる65kDウィルス・タンパク質pp65は、最も豊富に発現される構造タンパク質のうちの1つである(図1)。Dウィルス・タンパク質pp65は、ウィルス・ゲノムのUL83遺伝子によってコードされる(HCMV株AD169ゲノム配列のヌクレオチド119352-121037、Genbank X17403)。このタンパク質は、細胞内へのウィルス進入直後にMHC提示のためにプロセッシングされ、このことが、他のウィルス・タンパク質が感染済細胞内の抗原プロセッシング経路を遮断する前にMHCが提示されるのを可能にすると考えられる。従って、このタンパク質のT細胞認識は、感染コントロールにとって重要である(Solache他、J. Immunol 163:5512-5518(1999))。この文献全体を参考のため本明細書中に引用する。
糖タンパク質B(gB)は、UL55(Genbank X17403のヌクレオチド80772-83495)によってコードされた906アミノ酸エンベロープ糖タンパク質(図4)である。糖タンパク質B(gB)は、I型内在性膜タンパク質である。I型内在性膜タンパク質は、ビリオン・エンベロープと細胞膜との融合に関与し、感染力のために必要とされ、高免疫原性であり、そしてHCMV株の中では高い保存度を有しており、これによりこのタンパク質はワクチンにとって魅力的な標的になる。完全長タンパク質は、アミノ末端シグナル・ペプチド(アミノ酸1-24)、細胞外ドメイン(アミノ酸25-713)、推定上の膜貫通アンカー・ドメイン(アミノ酸714-771)と、細胞内ドメイン(アミノ酸772-906)とを含有する。膜貫通アンカー・ドメインの欠失の結果、gBが分泌される(Zheng他、J. Virol. 70:8029-8040(1996))。加えて、完全長タンパク質は、アミノ酸460と461との間で宿主フリン・プロテアーゼによって切断されることにより、ヘテロダイマーとして密に会合し続ける、gp93及びgp55の切断生成物を形成する(Mocarski E.S.及びC.T. Courcelle, 第2629-2674頁、Field's Virology、第4版、Knipe DM及びHowley PM編、Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia (2001))。この段落で引用した参考文献のそれぞれを全体的に、参考のため本明細書中に引用する。
IE1は、HCMV ORF UL123(Genbank X17403、ヌクレオチド171006-172765)によってコードされた491アミノ酸タンパク質(図7)である。遺伝子は、4つのエクソンを含む1.9Kb mRNAであり、エクソン2-4だけが翻訳されている。85個のN末端アミノ酸は、エクソン2及び3によってコードされ、残りはエクソン4によってコードされる。IE2は、エクソン1-3及びエクソン5を、多くのスプライス変異形と共有するタンパク質の関連群である。一緒にして言えば、IE1とIE2とは、HCMV主要前初期プロモーターを転写活性化することにより、ウィルス転写を調節する(Malone, CL他、J. Virol 64:1498-1506(1990)；Mocarski, E. Fields Virology、Field他編、第3版、第2447-2491頁、Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia (1996)；Chee M.S.他、Curr Topics Microbiol. Immunol. 154:125-169(1990))。この段落で引用した参考文献のそれぞれを全体的に、参考のため本明細書中に引用する。
IE1は、アミノ酸173-196によってコードされたATP結合部位に依存するキナーゼ活性を有する。IE1は、E2F依存性転写を活性化するための細胞因子を自己リン酸化又はリン酸化することができる。エクソン3及び4は、ウィルス転写活性化のために必要であると共に、エクソン4内の所要の領域がこのエクソン全体にわたって広範囲に分布されている。エクソン4によってコードされるタンパク質部分は、高度の二次構造を有することが知られている。IE1は核に輸送されるものの、核局在化シグナルは同定されていない(Pajovic, S他、Mol. Cell. Bio. 17:6459-6464(1997))。Gyulai他は、エクソン4から成るヌクレオチド断片を発現させるエフェクター細胞に対する高レベルのin vitro CTL応答を示した(Gyulai他、J. Infectious Diseases 181:1537-1546(2000))。この段落で引用した参考文献のそれぞれを全体的に、参考のため本明細書中に引用する。
目下のところHCMVに対して利用可能なワクチンはない。しかし、弱毒化生HCMVワクチン、カナリア痘系ワクチン及び組換えgBワクチンを用いて、臨床試験が実施されている(Plotkin, S.A., Pediatr. Infect. Dis. J. 18:313-325(1999))。ヒトにおいて試験された最初のHCMVワクチンは、AD169実験室用株から形成された弱毒化生ワクチンであった(Elek, S.D.及びStern, H., Lancet 1:1-5(1974))。局所的な反応が一般的であったが、しかし、HCMVは、ワクチン・レシピエントのいずれからも分離されなかった。このワクチンは、初期段階Iの研究よりも先には調査されなかった。
HCMVに対する免疫応答は、動物モデル及びヒトの両方において急性及び慢性HCMV感染を研究することによって見極められている。抗体は母体・胎児伝播を防止する上で重要であると考えられ、主としてエンベロープ糖タンパク質、特にgBを対象とする(Plotkin, S. A., Pediatr. Infect. Dis. J. 18:313-325(1999)；Fowler, K.Bl., N. Engl. J. Med. 326:663-667(1992))。
その反対に、移植レシピエント及びHIV感染者におけるHCMV感染のコントロールは、CD4+、CD8+及びNK T細胞を含む保存細胞免疫応答と関連する。CD8+ T細胞性応答は、主としてHCMVの前初期(IE)タンパク質と、豊富な外皮タンパク質pp65とに向けられる(Gyulai, Z.他、J. Infect. Dis. 181:1537-1546(2000)；Tabi, Z.他、J. Immunol. 166：5695-5703(2001)；Wills, M.R., 他、J. Virol. 70:7569-7579(1996)；Frankenberg, N.他、Virology 295:208-216(2002)；Retiere, C.,他、J. Virol. 74:3948-3952(2000)；Koszinowski, U.H.他、J. Virol. 61:2054-2058(1987)；Kern, F.他、J. Infect. Dis. 185:1709-1716(2002))。ほぼ92%の人がpp65に対して、また別の76%の人がIE1のエクソンに対してCD8+応答を有している(Gyulai, Z.他、J. Infect. Dis. 181:1537-1546(2000)；Kern, F.他、J.Infect. Dis. 185:1709-1716(2002))。加えて、感染個体の別の3分の1は、gBに対してCTL応答を有している。ほとんど全ての感染者はHCMVに対してCD4+応答を有しているが、これらの応答の遺伝子及びエピトープのマッピングは、CD8+ T細胞に関するものほど完全には調査されていない(Kern, F.他、J. Infect. Dis. 185:1709-1716(2002)；Davignon, J. L.他、J. Virol. 70:2162-2169(1996)；He, H.他、J. Gen. Virol. 76:1603-1610(1995)；Beninga, J.他、J. Gen. Virol. 76:153-160(1995))。感染した健常者におけるヘルパーT細胞性応答は、CD4+ T細胞性応答測定方法の開発においてHCMVが正対照として頻繁に使用されるのに十分に頑強である(Kern, F.他、J. Infect. Dis. 185:1709-1716(2002)；Currier, J.R.他、J. Immunol Methods 260:157-172(2002)；Picker, L.J.他、Blood 86:1408-1419(1995))。
HCMVに対するワクチンを開発しようという他の試みは、精製型又は組換え型ウィルス・ポリペプチド、つまり完全長、変性又は短いエピトープを投与することにより、免疫応答を誘発することに焦点を当てられている。米国血液学会(American Society for Hematology)によって発行された概説において、Zaia他は、野生型及び突然変異型タンパク質を発現させるためにDNAワクチンを使用することを含む、HCMVワクチンを開発するための、ペプチドに基づく種々のアプローチに関して説明している(Zaia, J.A.他、Hematology 2000, Am Soc Hematol Educ Program、第339-355頁、Am. Soc. Hematol.(2000))。Endresz他は、マウス中にHCMV特異的CTLを誘発することを説明しており、マウスは、HCMV Towne株完全長gB(構成的に、又はテトラサイクリンで調節可能なプロモーター下で発現される)、pp65、又は及びアミノ酸715-772が欠失したgBをコードするプラスミドで免疫化される(Endresz, V他 Vaccine 17:50-8(1999)；Endresz, V他 Vaccine 19:3972-80(2001))。米国特許第6,100,064号明細書に記載された分泌gBポリペプチドの製造法の場合、このポリペプチドは膜貫通ドメインを欠いているが、しかしC末端ドメインを保持している。米国特許第5,547,834号明細書及び同第5,834,307号明細書に記載されたgBポリペプチドは、内タンパク質分解切断部位にアミノ酸置換基を有していることにより、タンパク質分解プロセッシングを防止する。米国特許第6,251,399号明細書及び同第6,156,317号明細書に記載されたワクチンは、免疫原性エピトープを含むpp65の短いペプチド断片を使用する。数多くの他のグループが、強力な免疫応答を誘発するためにHCMV pp65及びgB中のエピトープを分析している(Liu, YN.他、J. Gen. Virol. 74:2207-14(1993)；Ohlin, M.他、J. Virol. 67:703-10(1993)；Navarro, D.他J. Med. Virol. 52:451-9(1997)；Khattab BA.他、J. Med. Virol. 72:68-76(1997)；Diamond, DJ他、Blood 90:1751067(1997)；Solache, A.他、J. Immunol. 163:5512-8(1999)。米国特許第6,162,620号明細書は、野生型gB又は膜配列を欠いたgBをコードするポリヌクレオチドに関する。米国特許第6,133,433号明細書は、完全長野生型pp65、又はその特異的721nt断片をコードするヌクレオチドに関する。この段落で引用した参考文献のそれぞれを全体的に、参考のため本明細書中に引用する。
過去数年間にわたって、ワクチン又は改善型ワクチンの必要がある数多くの感染性疾患に対してDNA系ワクチンを試験することには相当の関心が寄せられている。DNA系ワクチンのいくつかのよく認識された利点は、製造のスピード、容易さ及びコスト、多価ワクチンの開発及び試験の融通性、DNAワクチンが多種多様な動物モデル並びにヒトにおいて頑強な細胞性応答を生成することができるという発見、及び、プラスミドDNAを送達ベクターとして使用することの安全性の証明を含む(Donnelly, J.J.他、Annu. Rev. Immunol. 15:617-648(1997)；Manickan, E.他、Crit. Rev. Immunol. 17(2):139-154(1997))。DNAワクチンはワクチン開発において次の世代を形成し(Nossal, G., Nat. Med. 4:475-476(1998))、そして多数のDNAワクチンが臨床試験中である。この段落で引用した参考文献のそれぞれを全体的に、参考のため本明細書中に引用する。
免疫治療用生成物のデザインは、直接的な遺伝子導入による免疫化のコンセプトに基づいている。プラスミドに基づく免疫治療薬は、アジュバント配合物中の組換えサブユニット・ワクチンの安全性と相まって、弱毒化生ワクチンに対して固有の免疫刺激を生じさせるというポジティブな特質を提供する。
移植個体群において、HCMV疾患は細胞免疫応答と関連しており(Riddell, S.R., 「免疫不全宿主におけるサイトメガロウィルス性肺炎の病原(Pathogenesis of cytomegalovirus pneumonia in immunocompromised hosts)」Semin. Respir. Infect. 10:199-208(1995))、ひいては効果的な生成物がCD4+及びCD8+ T細胞性応答を誘発するべきである。調製済プラスミドは、このような細胞免疫応答を誘発することが判っており、移植環境における生きたベクターの使用に関連して、安全上の懸念を有することはない(Shiver, J. W.,他、Nature 415: 331-335(2002))。
所与の哺乳動物種において好ましいコドン頻度を使用して、病原体からポリペプチドをコードするコード領域を入れ替える結果、哺乳動物種の細胞中での発現が著しく増大すると共に、免疫原性も増大する。例えば、Deml, L.他、J. Virol. 75:10991-11001(2001)、及びNarum, DL他、Infect. Immun. 69:7250-7253(2001)を参照されたい。この段落で引用した参考文献のそれぞれを全体的に、参考のため本明細書中に引用する。
HCMV感染に対してヒトを保護するために、便利で安全な、そして効果的な免疫原性化合物がこの技術分野においてなおも必要である。本発明は、安全でしかも効果的な免疫原性化合物と、このような免疫原性化合物を使用して、ヒト、特に移植レシピエント、及び免疫不全個体をHCMV感染に対して保護するための方法とを提供する。
発明の概要
本発明は、HCMVポリペプチドをコードするコドン最適化型コード領域を含むポリヌクレオチド、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチドを、ヒトの組織内にin vivo投与することにより、HCMV感染に対する保護を必要とするヒトの免疫応答を高めることに関する。本発明の核酸断片は、下記の形式のうちの1つ又は2つ以上で天然状態から変化させられる。第1に、HCMVポリペプチドをコードする核酸断片は、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、コドン最適化型コード領域の一部又は全てであってよい。加えて、HCMVポリペプチドをコードする核酸断片は、完全長ポリペプチドの一部だけをコードする断片であってよく、且つ/又は、この核酸断片を突然変異させることによって、例えばコード化ポリペプチドから、コード化ポリペプチド中に存在する偶発的なタンパク質モチーフ、又はコード化ポリペプチドと関連する毒性因子を取り除くこともできる。例えば核酸配列を突然変異させることによって、ポリペプチドの分泌を防止する偶発的なアンカー・モチーフをコードしないようにすることもできる。本発明のポリヌクレオチドは送達されると、in vivoのヒトの細胞中に統合され、予防上又は治療上有効な量のHCMVポリペプチド又はその断片がin vivo生成される。
本発明はさらに、免疫原性組成物であって、HCMVポリペプチドをコードする1つ又は2つ以上のコドン最適化型コード領域を含むポリヌクレオチド、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物を提供する。このような組成物は、種々のトランスフェクション促進剤又は免疫促進剤、例えばポリキサマー、カチオン性脂質、又はアジュバントを含んでよい。
本発明はさらに、HCMVポリペプチド、その断片、変異体又は誘導体の発現を可能にする核酸コード配列を脊椎動物に送達するためのプラスミド及びその他のポリヌクレオチド構造を提供する。本発明はさらに、キャリヤ、賦形剤、トランスフェクション促進剤、免疫原性促進剤、例えばアジュバント、又は投与される遺伝子及びその遺伝子生成物のトランスフェクション、発現、又は有効性を高めるためのその他の物質を提供する。
本発明はさらに、HCMVポリペプチドをコードする1つ又は2つ以上のコドン最適化型コード領域を含む1つ又は2つ以上のポリヌクレオチド、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片を含む1つ又は2つ以上のポリヌクレオチドを、ヒトの組織に投与することにより、HCMV感染に対するヒトの免疫応答を高める方法を提供する。或る実施態様の場合、本発明はさらに、2つ又は3つ以上の異なる免疫原性組成物を脊椎動物組織に順次投与することによって、HCMV感染に対するヒト患者の免疫応答を高める方法を提供する。このような方法は、HCMVポリペプチドをコードする1つ又は2つ以上のコドン最適化型コード領域を含む1つ又は2つ以上のポリヌクレオチド、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片を含む1つ又は2つ以上のポリヌクレオチドを最初に投与して免疫性をプライミングし、次いで、異なるワクチン組成物、例えば組換えウィルス性ワクチン、タンパク質サブユニット・ワクチン、或いは、組換え菌又は死菌ワクチンを順次投与することにより、ヒトにおける抗HCMV免疫応答をブーストすることを含む。
本発明はさらに、HCMVポリペプチドをコードする、そしてまたHCMVポリペプチド又はその断片、変異体又は誘導体をコードする1つ又は2つ以上のコドン最適化型コード領域を含む1つ又は2つ以上のポリヌクレオチド；又は、HCMVポリペプチド、その断片、変異体又は誘導体をコードする1つ又は2つ以上の非最適化型ポリヌクレオチドを、ヒトの組織に投与することによって、HCMVに対するヒト患者の免疫応答を高める方法を提供する。
HCMVポリペプチド、又はHCMVポリペプチド、その断片、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドと、コドン最適化型核酸組成物との組み合わせは、投与量節約濃度で、治療上有益な効果を提供する。例えば、適量のコドン最適化型核酸を補足するか又はこの核酸で増強すると、従来型ワクチンの使用量をより少なくして、治療上有益な効果を得るのに十分な免疫応答を得ることができる。
従来型ワクチンは、ウィルス又は細菌の死んだ又は不活性の断片、或いは細菌タンパク質又はウィルス・タンパク質又はタンパク質断片を含むワクチン組成物を含み、このワクチンを患者に注射することにより、免疫系による作用を誘発する。本発明に関連して、従来型ワクチンは、免疫原性ポリペプチド、又は免疫原性ポリペプチド、その断片、変異体又は誘導体をコードするヌクレオチドを含む組成物と、免疫原性ポリペプチド、その断片、変異体又は誘導体をコードするヌクレオチドを含むベクターとを含み、これらは、本明細書中に記載されたコドン最適化型ポリヌクレオチドの生成物ではなく、又はこれらのコドン最適化型ポリヌクレオチドを含有しない。こうして、従来型ワクチン中には、遺伝子操作型ワクチン、例えば遺伝子操作型生ワクチン、キメラ生ワクチン、複製欠陥生ワクチン、サブユニット・ワクチン、免疫原性の改善のために個々の成分として送達された、又はウィルス様粒子内に統合された一価、多価又はキメラ・サブユニット・ワクチンの種々の変異形のペプチド・ワクチン、及びポリヌクレオチド・ワクチンが含まれる。本明細書中に記載された助剤も、従来型ワクチンの考えられる成分である。
こうして、本発明の複合ポリヌクレオチド・ワクチン組成物の投与によって、投与量の節約が考えられる。
具体的には、従来型ワクチンの投与量は、本発明のコドン最適化型核酸組成物と組み合わせて、又はこの組成物の前に、又はこの組成物に続いて投与すると、最小5%、最小10%、最小20%、最小30%、最小40%、最小50%、最小60%又は最小70%だけ低減することができる。
同様に、DNA系薬剤単独によってもたらされる所望の免疫応答レベルも、従来型DNAワクチンを含むことによって、より少ないDNAを用いて達成することができる。さらに、従来型DNAワクチンと、コドン最適化型DNA系ワクチンとを組み合わせることによって、両材料はより少ない量で使用されることが可能になる一方、いずれの成分も単独でより多量に投与することから生じる免疫応答の所望レベルが依然として提供される(例えば、組み合わせで使用すると、どちらの免疫生成物も使用量を少なくすることができる)。送達される材料量のこのような低減は、ワクチン接種計画において、それぞれの投与の際に、投与の数を低減するのに加えて行うことができる(例えば3回又は4回の注射に対して2回の注射)。さらに、この組み合わせは、免疫応答キネティクスを軽減することをも可能にする(例えば所望応答レベルは、免疫化後6週間の代わりに3週間で達成される)。
具体的には、DNA系薬剤の投与量は、従来型CMVワクチンと組み合わせて投与すると、最小5%、最小10%、最小20%、最小30%、最小40%、最小50%、最小60%又は最小70%だけ低減することができる。
DNA系薬剤及び従来型抗原の正確な量は、本明細書中に記載された多数のファクターに応じて見極められ、当業者によって容易に見極められる。
投与量節約に加えて、主張された複合組成物は、免疫応答を広げ、且つ/又は有益な免疫応答を高めることを可能にする。免疫応答のこのような拡大又は増強は：従来型ワクチンに対する細胞性応答を高めるためにDNAを添加し；体液性応答を高めるために、DNA薬剤に従来型ワクチンを添加し；付加的なエピトープ(体液性及び/又は細胞性の両方)が認識されるように且つ/又はより望ましく応答されるようにする(エピトープを広げる)組み合わせを使用し；特定の所望の免疫応答スペクトルに合わせて設計されたDNA-従来型ワクチン複合体を採用し；どちらかの成分をより多量に使用することによって所望の免疫応答スペクトルを獲得することにより、達成される。広げられた免疫応答は、所望の応答スペクトルに対して特異的な種々の標準免疫アッセイによって、当業者により測定することができる。これらのアッセイに関しては本明細書中により詳細に説明する。
免疫応答拡大及び投与量節約の双方を同時に達成することができる。
HCMV株AD169に由来する完全長の天然型HCMV pp65(Genbank WMBE65)の野生型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1)及びアミノ酸翻訳(SEQ ID NO:2)を示す。 HCMV株AD169に由来する完全長の天然型HCMV pp65(Genbank WMBE65)の野生型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:1)及びアミノ酸翻訳(SEQ ID NO:2)を示す。 天然型HCMV pp65の完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:3)及びアミノ酸翻訳(SEQ ID NO:4)を示す。 天然型HCMV pp65の完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:3)及びアミノ酸翻訳(SEQ ID NO:4)を示す。 天然型HCMV pp65をコードする野生型ヌクレオチド配列(「wt」)(SEQ ID NO:1)と完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(「opt」) (SEQ ID NO:8)とのアラインメントを示す。 天然型HCMV pp65をコードする野生型ヌクレオチド配列(「wt」)(SEQ ID NO:1)と完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(「opt」) (SEQ ID NO:8)とのアラインメントを示す。 HCMV gB株AD169の野生型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:11)及びアミノ酸翻訳(SEQ ID NO:12)を示す。SEQ ID NO:11は、完全長HCMV gB(Genbank X04606のヌクレオチド157-3125)に対応するオープン・リーディング・フレームをコードする核酸断片を含有する。 HCMV gB株AD169の野生型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:11)及びアミノ酸翻訳(SEQ ID NO:12)を示す。SEQ ID NO:11は、完全長HCMV gB(Genbank X04606のヌクレオチド157-3125)に対応するオープン・リーディング・フレームをコードする核酸断片を含有する。 HCMV gB株AD169の野生型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:11)及びアミノ酸翻訳(SEQ ID NO:12)を示す。SEQ ID NO:11は、完全長HCMV gB(Genbank X04606のヌクレオチド157-3125)に対応するオープン・リーディング・フレームをコードする核酸断片を含有する。 HCMV gB株AD169の野生型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:11)及びアミノ酸翻訳(SEQ ID NO:12)を示す。SEQ ID NO:11は、完全長HCMV gB(Genbank X04606のヌクレオチド157-3125)に対応するオープン・リーディング・フレームをコードする核酸断片を含有する。 HCMV gB株AD169の野生型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:11)及びアミノ酸翻訳(SEQ ID NO:12)を示す。SEQ ID NO:11は、完全長HCMV gB(Genbank X04606のヌクレオチド157-3125)に対応するオープン・リーディング・フレームをコードする核酸断片を含有する。 切断された分泌HCMV gBの完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:13)及びアミノ酸配列(SEQ ID NO:14)を示す。SEQ ID NO:13は、最小のヒトコドン最適化型分泌gBをコードする核酸(SEQ ID NO:14)を含有する。 切断された分泌HCMV gBの完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:13)及びアミノ酸配列(SEQ ID NO:14)を示す。SEQ ID NO:13は、最小のヒトコドン最適化型分泌gBをコードする核酸(SEQ ID NO:14)を含有する。 切断された分泌HCMV gBの完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:13)及びアミノ酸配列(SEQ ID NO:14)を示す。SEQ ID NO:13は、最小のヒトコドン最適化型分泌gBをコードする核酸(SEQ ID NO:14)を含有する。 切断された分泌HCMV gBの完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:13)及びアミノ酸配列(SEQ ID NO:14)を示す。SEQ ID NO:13は、最小のヒトコドン最適化型分泌gBをコードする核酸(SEQ ID NO:14)を含有する。 完全長野生型HCMV gBをコードする野生型ヌクレオチド配列(「wt」)(SEQ ID NO:11)と完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(「opt」) (SEQ ID NO:16)とのアラインメントを示す。 完全長野生型HCMV gBをコードする野生型ヌクレオチド配列(「wt」)(SEQ ID NO:11)と完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(「opt」) (SEQ ID NO:16)とのアラインメントを示す。 完全長野生型HCMV gBをコードする野生型ヌクレオチド配列(「wt」)(SEQ ID NO:11)と完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(「opt」) (SEQ ID NO:16)とのアラインメントを示す。 完全長野生型HCMV gBをコードする野生型ヌクレオチド配列(「wt」)(SEQ ID NO:11)と完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(「opt」) (SEQ ID NO:16)とのアラインメントを示す。 完全長野生型HCMV gBをコードする野生型ヌクレオチド配列(「wt」)(SEQ ID NO:11)と完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(「opt」) (SEQ ID NO:16)とのアラインメントを示す。 完全長野生型HCMV gBをコードする野生型ヌクレオチド配列(「wt」)(SEQ ID NO:11)と完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(「opt」) (SEQ ID NO:16)とのアラインメントを示す。 完全長野生型HCMV gBをコードする野生型ヌクレオチド配列(「wt」)(SEQ ID NO:11)と完全コドン最適化型ヌクレオチド配列(「opt」) (SEQ ID NO:16)とのアラインメントを示す。 完全長天然型IE1の野生型IE1ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:19)及びアミノ酸翻訳(SEQ ID NO:20)を示す。 完全長天然型IE1の野生型IE1ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:19)及びアミノ酸翻訳(SEQ ID NO:20)を示す。 図8は、熱サイクルを利用することによって、0.3 mM BAK、7.5 mg/ml CRL 1005、及び5 mg/mlのDNAを含む配合物を最終容積3.6 mlで調製するためのプロトコルを示す。 図9は、熱サイクルを利用することによって、0.3 mM BAK、34 mg/ml又は50 mg/ml CRL 1005、及び2.5 mg/mlのDNAを含む配合物を最終容積4.0 mlで調製するためのプロトコルを示す。 図10は、0.3 mM BAK、7.5 mg/ml CRL 1005、及び5 mg/mlのDNAを含む配合物を単純化して調製する(熱サイクルなしで)ためのプロトコルを示す。
発明の詳細な説明
本発明は、HCMVポリペプチドをコードするヒト・コドン最適化型コード領域を含むポリヌクレオチド、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチドを、ヒトの組織内にin vivo投与することにより、HCMV感染に対する保護を必要とするヒトの免疫応答を高める組成物及び方法に関する。ポリヌクレオチドは、in vivoのヒトの細胞中に統合され、免疫学的に効果的な量のHCMVポリペプチド、又は断片又は変異体がin vivo生成される。
本発明は、コドン最適化及び/又はその他の操作を通して最適な発現及び安全性が与えられた、ポリヌクレオチド系ワクチン、及びHCMVコード配列のヒトへの送達方法に関する。これらのポリヌクレオチド系ワクチンは、コード化遺伝子生成物がヒトにおいて最適に発現されるように、調製され投与される。結果として、これらの組成物及び方法は、HCMV感染に対する免疫応答を刺激するのに有用である。また、本発明には、発現系、送達系及びコドン最適化型HCMVコード領域も含まれる。
本発明のポリヌクレオチド・ワクチンは、ヒトに投与されると、HCMVに対するそのヒトにおける免疫応答を誘発することができる。このようなポリヌクレオチドは、本明細書中ではポリヌクレオチド・ワクチンと呼ばれる。
なお、存在物は、1つ又は2つ以上のその存在物を意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、1つ又は2つ以上のポリヌクレオチドを表すと理解される。このようなものとして、「1つ又は2つ以上の」及び「最小1つ(1つ以上)」は本明細書中では互いに置き換え可能に使用することができる。
「核酸」又は「核酸断片」は、ポリヌクレオチド又は構造内に存在する任意の1つ又は2つ以上の核酸セグメント、例えばDNA断片又はRNA断片を意味する。本明細書中に使用される「核酸」という用語は、任意の核酸を含むものとし、これに対して「核酸断片」という用語は、ポリペプチド、その断片、変異体又は誘導体をコードする、設計された又は合成のコドン最適化型コード領域の断片を具体的に意味するように本明細書では使用され、この断片は、所与の種のコドン使用頻度に応じて最適化されている。本明細書中に使用される「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されたコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」(TAG, TGA又はTAA)はアミノ酸には翻訳されないが、コード領域の一部として考えることができる。しかし任意の側方配列、例えばプロモーター、リボソーム、結合部位、及び転写ターミネーターなどは、コード領域の一部ではない。本発明の2つ又は3つ以上の核酸又は核酸セグメントは、単一のポリヌクレオチド構造内に、例えば単一のプラスミド上に存在することができ、或いは、別個のポリヌクレオチド構造内に、例えば別個のプラスミド上に存在することができる。さらに、任意の核酸又は核酸断片が単一のポリペプチド、例えば単一の抗原、サイトカイン、又は調節ポリペプチドをコードしてよく、或いは、2つ以上のポリペプチドをコードしてよく、例えば核酸は2つ又は3つ以上のポリペプチドをコードしてよい。加えて、核酸は、調節要素、例えばプロモーター又は転写ターミネーターをコードしてよく、或いは、異種コード領域、例えば特殊化された要素又はモチーフ、例えば分泌シグナル・ペプチド又は機能ドメインをコードしてよい。
「断片」、「変異体」、「誘導体」及び「類似体」という用語は、本発明のHCMVポリペプチドに言及する場合、対応する天然型ポリペプチドの免疫性又は抗原性の少なくともいくつかを保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のHCMVポリペプチドの断片は、タンパク質分解断片、欠失断片、及び具体的には、動物に送達されたときに細胞からの分泌の増大を示すか、又はより高い免疫原性を示すHCMVポリペプチド断片を含む。ポリペプチド断片はさらに、天然型ポリペプチドの抗原性又は免疫原性エピトープを含むポリペプチドの任意の部分を含む。このエピトープは線状エピトープ並びに三次元エピトープを含む。本発明のHCMVポリペプチドの変異体は、上記のような断片、及びアミノ酸置換、欠失又は挿入による改変アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。変異体、例えば対立遺伝子変異体は自然発生することができる。「対立遺伝子変異体」は、生物又はウィルスの染色体又はゲノム上の所与の遺伝子座を占める遺伝子の代替形を意図するものとする。Genes II, Lewin, B編、John Wiley & Sons, New York (1985)。この文献を参考のため本明細書中に引用する。例えば、本明細書中に使用される所与の遺伝子生成物、例えばHCMV株(例えばTown及びAD169)の間のpp65における変異が、「対立遺伝子変異体」であると考えられる。当業者によく知られた突然変異技術を用いて、非自然発生型変異体を生成することができる。変異型ポリペプチドは、保守的又は非保守的アミノ酸置換、欠失又は付加を含んでよい。本発明のHCMVポリペプチドの誘導体は、天然型ポリペプチド上では見いだされない付加的な特徴を示すように改変されているポリペプチドである。その例は融合タンパク質を含む。類似体は本発明のHCMVポリペプチドの別の形である。その例は、プロタンパク質である。プロタンパク質は、プロタンパク質の切断によって活性化することにより、活性成熟ポリペプチドを生成することができる。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸又は核酸断片、並びに複数の核酸又は核酸断片を包含するものとし、そして分離された分子又は構造、例えばウィルス・ゲノム(例えば非感染性ウィルス・ゲノム)、メッセンジャーRNA(mRNA)、プラスミドDNA(pDNA)、又はポリヌクレオチドを含むpDNAの誘導体(例えば(Darquet, A-M他、Gene Therapy 4:1341-1349(1997))に記載された小環)を意味する。核酸は、線状(例えばmRNA)、環状(例えばプラスミド)、又は分岐状の形態、並びに二本鎖又は一本鎖の形態で提供することができる。ポリヌクレオチドは、コンベンショナルなホスホジエステル結合又は非従来型結合(例えばペプチド核酸(PNA)に見いだされるようなアミド結合)を含んでよい。
「感染性ポリヌクレオチド」又は「感染性核酸」という用語は、許容性細胞による取込み時に完全な感染性ウィルス粒子の合成を媒介するのに十分なだけの分離型ウィルス性ポリヌクレオチド及び/又は核酸を包含するものとする。「分離型」は、ウィルス核酸が、ポリペプチドのいずれかの前合成コピーを必要とせず、これが例えばウィルス・レプリカーゼをコードすることにより、その複製サイクルを開始することを意味する。
本明細書中に定義された「非感染性ポリヌクレオチド」又は「非感染性核酸」という用語は、付加的な材料、例えばポリペプチドを添加することなしには、許容性細胞による取込み時に完全感染性ウィルス粒子の合成を媒介することができないポリヌクレオチド又は核酸である。感染性ポリヌクレオチド又は核酸は、これが非許容性細胞によって取り込まれるというだけの理由から非感染性にされることはない。例えば、宿主範囲が限定されたウィルスに由来する感染性ウィルス性ポリヌクレオチドは、許容性宿主(すなわちウィルス自体に対して許容性の宿主)に由来する細胞によって取り込まれたときに、完全感染性ウィルス粒子の合成を媒介することができるならば、感染性である。非許容性宿主に由来する細胞による取込みの結果として完全感染性ウィルス粒子の合成をもたらすことはないという事実が、その核酸を「非感染性」にすることはない。換言すれば、この用語は、宿主細胞、組織タイプ又は種の性質によって限定されることはない。
いくつかの事例において、分離型感染性ポリヌクレオチド又は核酸は、ウィルス粒子のための受容体を欠く宿主細胞個体群において、すなわちウィルス進入に対して非許容性である宿主細胞個体群において、完全感染性ウィルス粒子を形成することができる。こうして、生成されたウィルスは、周りの細胞に感染することはない。しかし、ウィルス粒子を含有する上澄みが、ウィルスに対して許容性の細胞に移されるならば、感染が行われることになる。
「複製ポリヌクレオチド」又は「複製核酸」という用語は、許容性宿主細胞による取込み時に、同じポリヌクレオチド又は核酸の複数のコピー、例えば1つ又は2つ以上のコピーを生成することができる。感染性ポリヌクレオチド及び核酸は、複製ポリヌクレオチド及び核酸の部分集合であり、これらの用語は同義ではない。例えばウィルス・コート・タンパク質に対応する遺伝子を欠いている欠陥ウィルス・ゲノムは複製することができ、それ自体の複数のコピーを生成することができるが、しかしこれは感染性ではない。なぜならばこのウィルス・ゲノムは、コート・タンパク質、またはコート・タンパク質をコードする別の核酸が外部から提供されるのでなければ、完全感染性ウィルス粒子の合成を媒介することができないからである。
或る実施態様の場合、ポリヌクレオチド、核酸、又は核酸断片はDNAである。DNAの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常はやはり、ポリペプチド・コード核酸と作業連携するプロモーターを含む。作業連携は、遺伝子生成物、例えばポリペプチドをコードする核酸を、1つ又は2つ以上の調節配列と連携させて、調節配列の影響下又は制御下に遺伝子生成物の発現を置くようにするときに生じる。2つのDNA断片(例えばポリペプチド・コード核酸及び核酸の5'末端と連携するプロモーター)は下記の場合、すなわち、プロモーター機能を誘発する結果、所望遺伝子生成物をコードするmRNAを転写する場合、そして、2つのDNA断片間のリンケージの性質が、(1)結果としてフレーム-シフト突然変異の導入をもたらさないか、又は(2)遺伝子生成物の発現を導く発現調節配列の能力を妨害しないか、又は(3)DNA鋳型の転写される能力を妨害しない場合に、「作業連携」される。こうして、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができるならば、ポリペプチドをコードする核酸と作業連携されることになる。プロモーターは、予め決められた細胞だけにおけるDNAの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写末端シグナルは、ポリヌクレオチドと作業連携し、これにより、細胞特異的転写を導くことができる。好適なプロモーター及びその他の転写制御領域がここに開示される。
種々の転写制御領域が当業者に公知である。これらの転写制御領域は、例えば、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えばサイトメガロウィルス(イントロン-Aとの関連における前初期プロモーター)、シミアン・ウィルス40(初期プロモーター)、レトロウィルス(例えばラウス肉腫ウィルス)、及びピコルナ・ウィルス(具体的には内部リボソーム進入部位、又はCITE配列とも呼ばれるIRES)に由来するプロモーター・セグメントを及びエンハンサー・セグメントを含む。他の転写制御領域は、脊椎動物遺伝子から誘導された領域、例えばアクチン、熱ショック・タンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ-グロブリン、並びに、真核細胞中の遺伝子発現を制御することができるその他の配列を含む。付加的な好適な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びにリンフォカイン誘発性プロモーター(例えばインターフェロン又はインターロイキンによって誘発可能なプロモーター)を含む。
1実施態様の場合、本発明のDNAポリヌクレオチドは環状又は線状化プラスミド、又は或る実施態様において、非感染性及び非統合性(すなわち、脊椎動物細胞のゲノム中に統合しない)であるその他の線状DNAである。線状化プラスミドは、以前は環状であったが、しかし例えば制限エンドヌクレアーゼによる消化によって、線状化されているプラスミドである。
或いは、DNAウィルス・ゲノムを使用することにより、DNAポリヌクレオチドを脊椎動物細胞中に投与することもできる。或る実施態様の場合、本発明のDNAウィルス・ゲノムは非感染性であり、且つ非統合性である。好適なDNAウィルス・ゲノムは、ヘルペスウィルス・ゲノム、アデノウィルス・ゲノム、アデノ随伴ウィルス・ゲノム及びポックスウィルス・ゲノムを含む。非感染性ウィルス・ゲノムを脊椎動物組織にin vivo導入する方法を引用する文献は、当業者によく知られており、上に引用する。
他の実施態様の場合、本発明のポリヌクレオチドはRNAである。好適な実施態様の場合、RNAは、メッセンジャーRNA(mRNA)の形態を成す。RNA配列を脊椎動物中に導入する方法が、米国特許第5,580,859号明細書に記載されている。この開示内容全体を参考のため、本明細書中に引用する。
本発明のポリヌクレオチド、核酸及び核酸断片は、分泌ペプチド又はシグナル・ペプチドをコードする付加的な核酸と連携させることができる。これらのペプチドは、本発明の核酸又はポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの分泌を導く。シグナル仮説に応じて、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質は、信号ペプチド又は分泌リーダー配列を有する。分泌リーダー配列は、成長タンパク質鎖が粗面小胞体を横切って輸出開始されると、成熟タンパク質から切断される。当業者であれば明らかなように、脊椎動物細胞によって分泌されたポリペプチドが一般に、ポリペプチドのN-末端に融合されたシグナル・ペプチドを有する。このポリペプチドのN-末端は、ポリペプチドの分泌形又は「成熟」形を生成するために、完全又は「完全長」ポリペプチドから切断される。或る実施態様の場合、天然型リーダー配列又はその配列の機能性誘導体が使用される。機能性誘導体は、この配列と作業連携されたポリペプチドの分泌を導く能力を維持している。或いは、異種哺乳動物リーダー配列、又はその機能性誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲン・アクチベーター(TPA)又はマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
本発明の1観点によれば、ヒト細胞中での発現のために最適化されたHCMV gB誘導型又はpp65誘導型のコード配列を発現させるためのプラスミドであって、治療又は免疫化されるべきヒトに送達されるためのプラスミドが提供される。付加的なHCMV誘導型コード配列、例えばIE1をコードする配列を、このプラスミド上又は別個のプラスミド上に含み、そして天然型コドン、又は治療又は免疫化されるべきヒトにおける発現のために最適化されたコドンを使用して、これらの付加的なHCMV誘導型コード配列を発現させることもできる。1つ又は2つ以上の最適化HCMV配列をコードするこのようなプラスミドが、治療又は免疫化されるべきヒトの組織にin vivo送達されると、転写ユニットはこうして1つ又は2つ以上のコード化遺伝子生成物を発現させることになる。遺伝子生成物の発現レベルは、有意な程度まで、連携プロモーターの強度、及び連携エンハンサー要素の存在及び活性化、並びにコード領域の最適化に依存することになる。
本明細書中に使用される「プラスミド」という用語は、遺伝物質(すなわち核酸)から形成される構造を意味する。典型的には、プラスミドは、細菌宿主細胞、例えばEschericha coli中で機能性を有する複製起点と、プラスミドを含む細菌宿主細胞を検出するための選択マーカーとを含有する。本発明のプラスミドは、本明細書中に記載された遺伝要素を含んでよい。これらの遺伝要素は、挿入されたコード配列を真核細胞中で転写して翻訳することができるように配列される。また、プラスミドは、ウィルス性核酸に由来する配列を含んでよいが、このようなウィルス性配列は通常、ウィルス粒子内へのプラスミドの統合を引き起こすことはなく、従ってこのプラスミドは非ウィルス性ベクターである。本明細書中に記載された或る実施態様の場合、プラスミドは、閉じた環状のDNA分子である。
「発現」という用語は、コード配列によってコードされた生成物の生物学的生成を意味する。たいていの場合、コード配列を含むDNA配列は転写されて、メッセンジャーRNA(mRNA)を形成する。メッセンジャーRNAは翻訳されて、当該生体活性を有するポリペプチド生成物を形成する。また、発現プロセスは、RNA転写生成物に対する更なるプロセッシング・ステップ、例えばイントロンを除去するためのスプライシング・ステップ、及び/又は、ポリペプチド生成物の翻訳後プロセッシングを伴うことができる。
本明細書中に使用される「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」並びに複数の「ポリペプチド」を包含するものとし、そして2つ又は3つ以上のアミノ酸から成る任意の鎖を含む。こうして、例えば「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は、2つ又は3つ以上のアミノ酸から成る鎖を意味するために使用される任意の他の用語を含む、本明細書中に使用される用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、また、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、又はこれと置き換え可能に使用することができる。この用語はさらに、翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化、アミド化、既知の保護/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、又は非自然発生型アミノ酸による修飾を施されたポリペプチドを含む。
また、本発明のポリペプチドとして、前記ポリペプチドの断片、誘導体化、類似体又は変異体、及びこれらの任意の組み合わせも含まれる。本発明のポリペプチド、その断片、誘導体化、類似体又は変異体は、HCMVポリペプチドに関連する抗原性及び免疫原性ポリペプチドであってよい。これらのポリペプチドは、HCMVによって引き起こされた感染性疾患を予防又は治療するために、すなわちこの疾患の重症性を治療し、改善し、軽減するか、或いは、この疾患の感染を防止又は低減するために使用される。
本発明書に使用された抗原性ポリペプチド又は免疫原性ポリペプチドは、ヒト内への導入時に、ヒトの免疫系分子と反応し(すなわち抗原性)、且つ/又は、ヒト内の免疫応答を誘発する(すなわち免疫原性)ペプチドである。おそらく、免疫原性ポリペプチドは抗原性にもなるが、しかし抗原性ポリペプチドはそのサイズ又は配座により、必ずしも免疫原性にはならないと考えられる。本発明の抗原性及び免疫原性ポリペプチドの一例としては、HCMV pp65又はその断片又は変異体、例えばpp65-delArg435-Lys468；gB、又は例えばアミノ酸1-713から成る断片、又はその変異体；及びIE1又はその断片又は変異体、例えばex4-IE1-delATP及びその誘導体、例えばTPAシグナル・ペプチドに融合された前記ポリペプチドのいずれか、が挙げられる。
本明細書中に使用される「エピトープ」という用語は、動物、例えば哺乳動物、例えばヒトにおける抗原又は免疫原活性を有するポリペプチド部分を意味する。本明細書中で使用される「免疫原性エピトープ」は、当業者に知られた任意の方法で見極められるような、動物における免疫応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。本明細書中に使用される「抗原性エピトープ」という用語は、抗体が、当業者によく知られた任意の方法によって見極められるその抗原を免疫特異的に結合することができるタンパク質の一部として定義される。免疫特異的な結合は、非特異的結合を排除するが、しかし、他の抗原との交差反応を必ずしも排除するわけではない。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。
本発明において、抗原性エピトープは好ましくは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内部に含有された最小4個、最小5個、最小6個、最小7個、最小8個、最小9個、最小10個、最小15個、最小20個、最小25個、又は約15〜約30個のアミノ酸から成る配列を含有する。免疫原性又は抗原性エピトープを含む特定のポリペプチドは、最小10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100個のアミノ酸残基長である。抗原性並びに免疫原性エピトープは線状、すなわち、ポリペプチド内の連続アミノ酸から成っていてよく、或いは、三次元的であってもよい。三次元的エピトープの場合、エピトープは非連続アミノ酸から成り、これらのアミノ酸はポリペプチドの二次構造又は三次構造により一緒になり、これによりエピトープを形成する。
抗原エピトープを担持するペプチド又はポリペプチド(抗体又はT細胞受容体が結合することができるタンパク質分子領域を含有する)の選択に関しては、タンパク質配列部分を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を規定通りに誘発することができることが、当業者に知られている。例えば、Sutcliffe, J.G.,他、Science 219:660-666(1983)を参照されたい。
タンパク質反応性血清を誘発することができるペプチドがタンパク質の一次配列内にしばしば示され、これらのペプチドは、単純な化学的法則の集合によって特徴付けることができ、そして、無傷のタンパク質の免疫優性領域(すなわち免疫原性エピトープ)にも、アミノ又はカルボキシル末端にも限定されない。著しく疎水性のペプチド、及び6つ以下の残基のペプチドは一般に、模倣されたタンパク質に結合する抗体を誘発するときには効果がなく、より長いペプチド、特にプロリン残基を含有するペプチドが通常、効果的である。Sutcliffe他(前出、661)。例えば、インフルエンザ・ウィルス血球凝集素HA1ポリペプチド鎖の配列の75%を占める8〜39個の残基を含有する、これらの指針に従って設計された20個のうちの18個のペプチドが、無傷ウィルスのHA1タンパク質と反応する抗体を誘発し、そしてMuLVポリメラーゼに由来する12/12個のペプチド、及び狂犬病糖タンパク質に由来する18/18個のペプチドが、それぞれのタンパク質を析出する抗体を誘発した。細胞性又は体液性免疫応答を誘発することが知られている、HCMV pp65、gB及びIE1エピトープに対応する抗原性ポリペプチド又はペプチドの一例を表1に挙げる。
本発明の抗原エピトープ担持ペプチド及びポリペプチドは、従って、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を生じさせるのに有用である。従って、抗原エピトープ担持ペプチドで免疫化されたドナーに由来する脾臓細胞を融合することにより得られたハイブリドーマの高い比率が、天然型タンパク質と反応性の抗体を概ね分泌する。Sutcliffe他(前出、663)。抗原エピトープ担持ペプチド及びポリペプチドによって生じさせられた抗体は、模倣タンパク質を検出するのに有用であり、種々異なるペプチドに対する抗体を使用することにより、翻訳後プロセッシングを施されるタンパク質前駆体の種々の領域の最終結果を追跡することができる。ペプチド及び抗ペプチド抗体を、模倣タンパク質に関する種々の定性及び定量アッセイにおいて、例えば競合アッセイにおいて使用することができる。それというのも、短いペプチド(例えば9個のアミノ酸)でも、免疫沈降アッセイにおいてより大きなペプチドと結合してこれを変位させることができることが判っているからである。例えば、Wilson他、Cell 37:767-778(1984)777を参照されたい。本発明の抗ペプチド抗体はまた、例えば当業者によく知られた方法を用いて吸着クロマトグラフィによって模倣タンパク質を精製するのに有用である。
或る実施態様の場合、本発明は、HCMVのポリペプチド、具体的にはHCMV gB又はpp65、及びその断片、変異体、又は誘導体をコードするコドン最適化型コード領域を単独で、又は付加的なコドン最適化型又は非コドン最適化型のHCMV誘導型コード配列、例えばIE1(SEQ ID NO:19)と組み合わせて含む核酸及びその断片を含むポリヌクレオチドに関する。
「コドン最適化」は、天然型配列のコドンの1つ以上、2つ以上又は有意な数を、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンと置換することにより、当該脊椎動物、例えばヒトの細胞中での発現を高めるために核酸配列を修飾するものとして、定義される。種々の種は、特定アミノ酸の或るコドンに対して特定のバイアスを示す。
本発明は、HCMVポリペプチド、又はその断片、変異体又は誘導体をコードするコドン最適化型コード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチドであって、コドン使用頻度が、ヒト細胞における最適化発現に合わせて適合されている。これらのポリヌクレオチドは、ヒト遺伝子中で使用するのに好ましいコドンをDNA配列内に統合することにより調製される。また、ポリヌクレオチド発現構造、ベクター、及びHCMVポリペプチド、その断片、変異体又は誘導体をコードするコドン最適化型コード領域の核酸断片を含む宿主細胞、及びヒトにおけるHCMV疾患を治療又は予防するために、ポリヌクレオチド発現構造、ベクター、宿主細胞を使用する種々の方法も提供される。
ヒト以外のサイトメガロウィルス、その断片、変異体又は誘導体に由来するポリペプチドをコードするコドン最適化型コード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチドは、本明細書中に記載した方法を用いてヒト以外のサイトメガロウィルスを感染させられ得る脊椎動物の細胞中での発現のために最適化することができる。既知の脊椎動物サイトメガロウィルスの部分リストは、マウスCMV(MCMV)、ハムスターCMV、テンジクネズミCMV、ラットCMV、ウサギCMV、ブタCMV、ウシCMV、ウマCMV、アカゲザルCMV、アフリカ・ミドリザルCMV、及びチンパンジーCMV、並びにその他のものを含む(Staczek, J., Am. Soc. Microbiol. 545:247-265(1990))。例えば、MCMV遺伝子は、マウス細胞内で発現させるために最適化されることになり、またウマCMV遺伝子は、ウマ細胞内で発現させるために最適化されることになる。
コドン最適化
本明細書中に使用される「コドン最適化型コード領域」は、コドンの1つ以上、2つ以上又は有意な数を、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に使用される1つ又は2つ以上のコドンと置換することにより、所与の脊椎動物の細胞中での発現のために適合された核酸コード領域を意味する。
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列の偏差は、遺伝子をコードする配列の変異を可能にする。各コドンは3つのヌクレオチドから成り、DNAを含むヌクレオチドは、4つの特異的塩基に限定されるので、ヌクレオチドの64通りの組み合わせが可能である。これらのうち61通りは、アミノ酸をコードする(残りの3つのコドンは、翻訳終了シグナルである)。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝子コード」を、本明細書において表2に再現する。結果として、2つ以上のコドンによって、多くのアミノ酸が指定される。例えばアミノ酸アラニン及びプロリンは、4つのトリプレットによって、またセリン及びアルギニンは6つのトリプレットによってコードされるのに対し、トリプトファン及びメチオニンは唯1つのトリプレットによってコードされる。この縮重は、DNAによってコードされたタンパク質のアミノ酸配列を変更させることなしに、DNA塩基組成物が広範囲にわたって変化するのを可能にする。
多くの生物は、成長中のペプチド鎖内への特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定コドンを使用することに対してバイアスを示す。コドン優先順位又はコドン・バイアス、生物間のコドン使用頻度の差は、遺伝子コードの縮重によってもたらされ、また多くの生物間で十分に記録されている。コドン・バイアスは、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率としばしば相関し、mRNAの翻訳効率はとりわけ、翻訳されるコドンの特性、及び特定の転移RNA(tRNA)分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞内で選択されたtRNAが優勢であることは一般には、ペプチド合成時に極めて頻繁に使用されるコドンを反映したものである。従って、コドン最適化に基づいて所与の生物内に最適遺伝子が発現されるように、遺伝子を調整することができる。
種々多様な動物種、植物種及び微生物種に対して利用可能な多数の遺伝子配列を前提として、コドン使用の相対頻度を計算することができる。例えばhttp://www.kazusa.or.jp/codon/(2002年7月9日訪問)で入手可能な「Codon Usage Database」で、コドン使用頻度テーブルが容易に入手可能であり、これらのテーブルは、多様に適合することができる。Nakamura, Y.,他「国際DNA配列データベースからテーブル化されたコドン使用頻度：2000年度の状況(Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000) Nucl. Acids Res. 28:292(2000)参照。GenBank Release 128.0[2002年12月15日]から計算されたヒトに関するコドン使用頻度テーブルを、下記表3に再現する。これらの表はmRNA命名基準を使用し、従ってDNA中に見いだされるチミン(T)の代わりに、RNA中に見いだされるウラシル(U)を使用する。これらの表は、頻度を64個のコドン全てに対してではなく、それぞれのアミノ酸に対して計算するように適合されている。比較のため、ヒト・サイトメガロウィルスに関するコドン使用テーブルを、下記表4に再現する。
これらの表又は同様の表を利用することにより、当業者は頻度を任意の所与のポリペプチド配列に当てはめ、コドン最適化型コード領域の核酸断片を生成することができる。このコドン最適化型コード領域はポリペプチドをコードするが、しかし所与の種に対してより最適なコドンを使用する。コドン最適化型コード領域は、種々異なる方法によって設計することができる。
「均一最適化」と呼ばれる1方法の場合、コドン使用頻度テーブルを使用することにより、任意の所与のアミノ酸に対して使用される最高頻度の単独のコドンを見いだし、そしてそしてコドンは、ポリペプチド配列中に特定のアミノ酸が現れるたびごとに使用される。例えば、ロイシンに関して、上記表3を参照すると、最高頻度のコドンはCUGであり、CUGは時間の41%にわたって使用される。従って、所与のアミノ酸配列におけるロイシン残基全ては、コドンCUGに割り当てられることになる。HCMV株AD169に由来する天然型pp65(SEQ ID NO:2)(図1)、及び株AD169に由来する完全長gB株AD169(SEQ ID NO:12)(図4)をコードするヒト「均一」コドン最適化型ヌクレオチド配列を、それぞれSEQ ID NO:7及びSEQ ID NO:15として本明細書中に示す。
「完全最適化」と呼ばれる別の方法において、コドンの実際の頻度は、コード領域全体にわたってランダムに分布される。このように、この最適化法を用いると、仮説ポリペプチド配列が100個のロイシン残基を有する場合、ヒトにおける使用頻度に関して表3を参照すると、ロイシン・コドンのうちの約7個又は7%がUUAであり、ロイシン・コドンのうちの約13個又は13%がUUGとなり、ロイシン・コドンのうちの約13個又は13%がCUUとなり、ロイシン・コドンのうちの約20個又は20%がCUCとなり、ロイシン・コドンのうちの約7個又は7%がCUAとなり、そしてロイシン・コドンのうちの約41個又は41%がCUGとなる。これらの頻度は、仮説ポリペプチドをコードするコード領域においてロイシン・コドン全体にわたってランダムに分配されることになる。当業者に理解されるように、この方法を用いると、配列内のコドンの分布が著しく変化することが可能であるが、しかし配列は常に同じポリペプチドをコードする。この方法を用いて最適化されている天然型pp65(SEQ ID NO:2)をコードする3つの異なるヒト・コドン最適化型ヌクレオチド配列が、本明細書中にSEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及びSEQ ID NO:10として提供される。この方法を用いて完全最適化されている天然型gB(SEQ ID NO:12)をコードする3つの異なるヒト・コドン最適化型配列が、それぞれ本明細書中にSEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17及びSEQ ID NO:18として提供される。
「完全最適化」法を用いる場合、ポリペプチド配列全体、又はその断片、変異体又は誘導体が、本明細書中に記載された方法のいずれかによって、コドン最適化される。種々の所望の断片、変異体又は誘導体が設計され、そして次いでそれぞれが個別にコドン最適化される。或いは、完全長ポリペプチド配列は、所与の種に対してコドン最適化され、その結果として、ポリペプチド全体をコードするコドン最適化コード領域が生じ、次いで、元のコドン最適化コード領域から、ポリペプチドの断片、変異体及び誘導体をコードするコドン最適化コード領域の核酸断片が形成される。当業者には明らかなように、コドンが所与の種における使用頻度に基づいて完全長コード領域にランダムに割り当てられているならば、断片、変異体又は誘導体をコードする核酸断片は、所与の種に対して、必ずしも完全コドン最適化されない。しかしこのような配列はそれでも、天然型コドン使用頻度よりも、所望種のコドン使用頻度に著しく近い。このアプローチの利点は、所与のポリペプチドのそれぞれの断片、変異体及び誘導体をコードするコドン最適化型核酸断片の合成が、日常的な作業であることであるが、しかしこのような合成は、時間がかかり、結果として著しく高価になってしまう。
「完全最大化」法を用いる場合、「約」という用語は、所与のアミノ酸に対応するコドン頻度の端数パーセンテージを占めるように正確に使用される。本明細書中に使用される「約」は、所与の値よりも大きい1つのアミノ酸又は所与の値よりも小さい1つのアミノ酸として定義される。アミノ酸の整数値は、端数使用頻度が0.5以上の場合には切り上げられており、端数使用頻度が0.49以下の場合には切り下げられている。62個のロイシン残基を有する仮説ポリペプチドに対応するヒト遺伝子中のロイシンの使用頻度例をここでまた使用すると、端数コドン使用頻度は、62を種々のコドンの頻度で掛算することにより計算されることになる。従って、62個の7.28パーセントは、4.51個のUUAコドン又は「約5個」すなわち4, 5, 6個のUUAコドンに等しく、62個の12.66パーセントは、7.85個のUUGコドン又は「約85個」すなわち7, 8, 9個のUUGコドンに等しく、62個の12.87パーセントは、7.98個のCUUコドン又は「約8個」すなわち7, 8, 9個のCUUコドンに等しく、62個の19.56パーセントは、12.13個のCUCコドン又は「約12個」すなわち11, 12又は13個のCUCコドンに等しく、62個の7.00パーセントは、4.34個のCUAコドン又は「約4個」すなわち3, 4又は5個のCUAコドンに等しく、そして62個の40.62パーセントは、25.19個のCUGコドン又は「約25個」すなわち24, 25又は26個のCUGコドンに等しい。
「最小最適化」と呼ばれる第3の方法の場合、コード領域は部分的にのみ最適化される。例えば、本発明は、ポリペプチドをコードするコドン最適化型コード領域の核酸断片を含み、このコード領域内ではコドン位置の最小約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は約100%が所与の種に対してコドン最適化されている。すなわち、コード領域は、天然型核酸配列内で通常使用されるコドンの代わりに、所望種、例えば脊椎動物、例えばヒトの遺伝子内で優先的に使用されるコドンを含有する。ヒト遺伝子において見いだされるのが稀であるコドンは、ヒト・コード領域内でより一般的に利用されるコドンに変化させられる。この方法を説明するために、ヒト・コード領域及びHCMVコード領域1000個当たりのコドン使用頻度を示す比較チャートを、表5に示す。データは、コドン1000個当たり、所与のコドンが使用された回数として表される。例えば、アラニン、アルギニン、プロリン、セリン、及びスレオニンに対応する表5においてアスタリスクがつけられたコドンは、HCMVのゲノムにおいて頻繁に使用されるが、しかしヒト遺伝子においてはさほど頻繁には使用されない。当該HCMV遺伝子の天然型コード配列で始めて、ヒト遺伝子内でより頻繁に使用されるコドンのうちの1つを代わりに用いることにより、低使用頻度の1つ又は2つ以上のコドンを、より一般的に使用されるヒト・コドンに変えることができる。この方法に従って、HCMV遺伝子と比較してヒト遺伝子における使用頻度が同じか又はより高いHCMVコドンは、変化させられないまま残される。
こうして、ヒト遺伝子よりもHCMVゲノムにおいてより頻繁に使用されるコドンが、最高使用頻度のヒト・コドンと置換される。HCMVコドンが置換される際の頻度の差は、下記多数のファクターに応じて変化してよい。例えば、ヒト遺伝子と比較してHCMV遺伝子において1000個当たり2倍以上多く使用されるコドンが、そのアミノ酸に対応する最高使用頻度のヒト・コドンと置換される。この比は、下記のような種々のファクターに応じてより高く又はより低く調節することができる。従って、ヒト・コード領域よりもHCMVコード領域において、コドンが1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4.0倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、10.5倍、11.0倍、11.5倍、12.0倍、12.5倍、13.0倍、13.5倍、14.0倍、14.5倍、15.0倍、15.5倍、16.0倍、16.5倍、17.0倍、17.5倍、18.0倍、18.5倍、19.0倍、19.5倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍又はそれ以上、より頻繁に使用される場合に、HCMV天然型コード領域内のコドンが、ヒト・コーディング領域内のそのアミノ酸に対して最も頻繁に使用されるコドンと置換されることになる。
高変異コドンのためのこの最小ヒト・コドン最適化は、例えば下記の例を含むいくつかの利点を有している。当該遺伝子のヌクレオチド配列に施される変化が少なくなるので、必要な操作も少なくなる。このことは、不所望な突然変異の導入のリスクを低減し、コストを下げ、また商業的に利用可能な部位特異的突然変異誘発キットの使用を可能にし、高価なオリゴヌクレオチド合成の必要を低減する。さらに、ヌクレオチド配列の変化数が減少することにより、或る宿主細胞内の遺伝子発現に対して著しい影響を与え得る、配列の二次構造の変化の可能性が低減する。不所望な制限部位の導入も低減され、プラスミド発現ベクター内への遺伝子のサブクローニングが容易になる。
所与のポリペプチド配列をコードするために、最適化された頻度でコドンをランダムに割り当てることは、各アミノ酸に対応するコドン頻度を計算し、次いでペプチド配列にコドンをランダムに割り当てることにより、手動で行うことができる。加えて、種々のアルゴリズム及びコンピューター・ソフトウェア・プログラムが当業者には容易に利用可能である。加えて、種々様々なアルゴリズム及びコンピューター・ソフトウェア・プログラムが当業者に容易に入手可能である。例えばDNAstar, Inc., Madison, WIから入手可能なLasergene Packageにおける「EditSeq」機能、InforMax, Inc., Bethesda, MDから入手可能なVectorNTI Suiteにおける戻し翻訳機能、及びAccelrys, Inc., San Diego, CAから入手可能なGCG--Wisconsin Packageにおける「戻し翻訳」機能である。加えて、コード領域配列をコドン最適化するために、種々の資源が公的に利用可能である。例えば、http://www/entelechon.com/eng/bactranslation.html(2002年7月9日付け訪問)における「戻し翻訳」機能、http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/index.html(2002年10月15日付け訪問)で入手可能な「backtranseq」がある。所与の頻度に基づいてコドンを割り当てるための初歩的なアルゴリズムを、当業者によって基礎数学機能を用いて容易に構成することもできる。
当業者によく知られた標準的で日常的な分子生物学的操作を用いて、上記方法のいずれかによって設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、多数の選択肢が利用可能である。1つのアプローチにおいて、それぞれ80-90ヌクレオチド長の、所望の配列の長さにわたる一連の相補オリゴヌクレオチド対が、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニール時に、付着末端を含有する80-90塩基対の二本鎖断片を形成するように合成される。例えば対内の各オリゴヌクレオチドは、対内の他方のオリゴヌクレオチドに対して相補的な領域を超えて3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10個又はそれ以上の塩基分だけ延びるように合成される。各オリゴヌクレオチド対の一本鎖末端は、別のオリゴヌクレオチド対の一本鎖末端とアニールするように設計される。オリゴヌクレオチド対はアニールするのを可能にされ、そしてこれらの二本鎖断片のうちのほぼ5〜6つが次いで、付着一本鎖末端を介してアニールし合うのを可能にされ、次いでこれらはライゲートし合わされ、そして標準的な細菌クローニング・ベクター、例えばInvitrogen Corporation, Carlsbad, CAから入手可能なTOPO（登録商標）ベクター内にクローニングされる。次いでこの構造は標準的な方法によって配列決定される。ライゲートし合わされた5〜6つの80-90塩基対断片、すなわち約500塩基対の断片から成るこれらの構造が調製され、所望の配列全体が一連のプラスミド構造内に示されるようになる。次いで、これらのプラスミドの挿入体を好適な制限酵素で切断し、そしてライゲートし合わせることにより、最終構造が形成される。次いで、最終構造が標準細菌クローニング・ベクター内にクローニングされ、そして配列決定される。付加的な方法は当業者には直ちに明らかになる。さらに、遺伝子合成は商業的に容易に利用可能である。
コドン最適化コード領域は、HCMVの任意の株に由来する任意の遺伝子生成物、又はこのような遺伝子生成物の断片、変異体又は誘導体をコードするバージョンであってよい。本明細書中には、HCMV pp65ポリペプチドとHCMV糖タンパク質B(gB)ポリペプチドとをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片、完全ポリペプチドをコードする核酸断片、並びにその種々の断片、変異体及び誘導体が記載されているが、その他のpp65又はgBコード核酸源が排除されるわけではない。その他のHCMVポリペプチド(例えばIE1)、又はその断片、変異体又は誘導体をコードするコドン最適化コード領域が、本発明の範囲内に含まれる。HCMVポリペプチドをコードする付加的な非コドン最適化ポリヌクレオチドを含むこともできる。
本発明は、HCMVポリペプチドをコードするコドン最適化型コード領域を含むポリヌクレオチド、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチドを、ヒトの組織内にin vivo投与することにより、HCMV感染に対する保護を必要とするヒトの免疫応答を高める組成物及び方法に関する。ヒト・コドン最適化は、本明細書中に記載された方法において実施される。例えば、或る実施態様の場合、HCMVポリペプチドをコードするコドン最適化型コード領域、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片が、ヒト・コドン使用頻度に従って最適化される。本発明のポリヌクレオチドは、in vivoのヒトの細胞中に統合され、そしてHCMVポリペプチドの免疫学上有効な量がin vivo生成される。
具体的には、本発明は、ヒト・コドン使用頻度に従って最適化された、HCMVポリペプチドをコードするコドン最適化型コード領域、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片に関する。例えば、HCMVポリペプチドをコードするDNA配列内で自然の状態で使用されるコドンの代わりに、ヒト遺伝子内で使用するのに好ましい1つ又は2つ以上のコドンを使用することにより、HCMVポリペプチドをコードするヒト・コドン最適化型コード領域、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片が調製される。また、HCMVポリペプチドをコードするコドン最適化型コード領域、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチド、ベクター及びその他の発現構造、及びこのようなポリヌクレオチド、ベクター及びその他の発現構造の種々の使用方法も提供される。HCMVポリペプチドをコードするコード領域には、本明細書中に記載されているように、均一最適化、完全最適化、又は最小最適化を施すことができる。
本発明はさらに、HCMV抗原、例えばHCMV pp65, gBのポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域を、任意にはその他のHCMV抗原、例えばIE1との関連において含むポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、これらのポリペプチドの断片、変異体及び誘導体をコードするコドン最適化核酸断片を含むポリヌクレオチドに関する。
本発明は、HCMV pp65、又はその断片、変異体及び誘導体のコドン最適化コード領域を含む分離型ポリヌクレオチドを提供する。本明細書中に記載された或る実施態様の場合、SEQ ID NO:2をコードするコドン最適化コード領域が、ヒト(Homo sapiens)におけるコドン使用頻度に従って最適化される。
コード使用頻度に従って完全最適化されるSEQ ID NO:2をコードするコドン最適化コード領域が、下記の通り設計される。SEQ ID NO:2のアミノ酸組成物は表6に示されている。
表6に示されたアミノ酸組成物、及び表3に示されたヒト・コドン使用頻度表を使用して、SEQ ID NO:2をコードするヒト・コドン最適化コード領域は、本明細書中で論じた方法のいずれかによって設計することができる。
「均一最適化」アプローチの場合、各アミノ酸には、表3に示したように、そのアミノ酸に対してヒト・ゲノムにおいて使用される最高頻度コドンが割り当てられる。この方法に従って、SEQ ID NO:2をコードするコード領域に、コドンが下記のように割り当てられる：19個のフェニルアラニン・コドンはTTCであり、41個のロイシン・コドンはCTGであり、25個のイソロイシン・コドンはATCであり、16個のメチオニン・コドンはATGであり、44個のバリン・コドンはGTGであり、41個のセリン・コドンはAGCであり、38個のプロリン・コドンはCCCであり、37個のスレオニン・コドンはACCであり、38個のアラニン・コドンはGCCであり、15個のチロシン・コドンはTACであり、24個のヒスチジン・コドンはCACであり、31個のグルタミン・コドンはCAGであり、18個のアスパラギン・コドンはAACであり、22個のリシン・コドンはAAGであり、28個のアスパラギン酸コドンはGACであり、33個のグルタミン酸コドンはGAGであり、10個のシステイン・コドンはTGCであり、9個のトリプトファン・コドンはTGGであり、36個のアルギニン・コドンはCGG, AGA, 又はAGG(ヒト・ゲノムにおけるこれら3つのコドンの使用頻度は有意には異なっていない)であり、そして36個のグリシン・コドンはGGCである。この方法によって設計されたコドン最適化pp65コード領域は、SEQ ID NO:7として本明細書中に示されている。
或いは、SEQ ID NO:2をコードする「完全コドン最適化」コード領域は、ヒト・ゲノムにおいてそのコドンが使用される頻度に基づいて、所与のアミノ酸のそれぞれにコドンをランダムに割り当てることによって設計することができる。これらの頻度は上記表3に示されている。この後者の方法を使用すると、SEQ ID NO:2をコードするコード領域に、コドンが下記のように割り当てられる：19個のフェニルアラニン・コドンのうち約9個はTTTであり、そしてフェニルアラニン・コドンのうち約10個はTTCであり；41個のロイシン・コドンのうち約3個はTTAであり、ロイシン・コドンのうち約5個はTTGであり、ロイシン・コドンのうち約5個はCTTであり、ロイシン・コドンのうち約8個はCTCであり、ロイシン・コドンのうち約3個はCTAであり、そしてロイシン・コドンのうち約17個はCTGであり；25個のイソロイシン・コドンのうち約9個はATTであり、イソロイシン・コドンのうち約12個はATCであり、そしてイソロイシン・コドンのうち約4個はATAであり；16個のメチオニン・コドンはATGであり；44個のバリン・コドンのうち約8個はGTTであり、バリン・コドンのうち約10個はGTCであり、バリン・コドンのうち約5個はGTAであり、そしてバリン・コドンのうち約21個はGTGであり；41個のセリン・コドンのうち約8個はTCTであり、セリン・コドンのうち約9個はTCCであり、セリン・コドンのうち約6個はTCAであり、セリン・コドンのうち約2個はTCGであり、セリン・コドンのうち約6個はAGTであり、そしてセリン・コドンのうち約10個はAGCであり；38個のプロリン・コドンのうち約11個はCCTであり、プロリン・コドンのうち約12個はCCCであり、プロリン・コドンのうち約10個はCCAであり、そしてプロリン・コドンのうち約4個はCCGであり；37個のスレオニン・コドンのうち約9個はACTであり、スレオニン・コドンのうち約13個はACCであり、スレオニン・コドンのうち約11個はACAであり、そしてスレオニン・コドンのうち約4個はACGであり；38個のアラニン・コドンのうち約10個はGCTであり、アラニン・コドンのうち約15個はGCCであり、アラニン・コドンのうち約9個はGCAであり、そしてアラニン・コドンのうち約4個はGCGであり；15個のチロシン・コドンのうち約7個はTATであり、そしてチロシン・コドンのうち約8個はTACであり；24個のヒスチジン・コドンのうち約10個はCATであり、そしてヒスチジン・コドンのうち約14個はCACであり；31個のグルタミン・コドンのうち約8個はCAAであり、そしてグルタミン・コドンのうち約23個はCAGであり；18個のアスパラギン・コドンのうち約8個はAATであり、そしてアスパラギン・コドンのうち約10個はAACであり；22個のリシン・コドンのうち約9個はAAAであり、そしてリシン・コドンのうち約13個はAAGであり；28個のアスパラギン酸コドンのうち約13個はGATであり、そしてアスパラギン酸コドンのうち約15個はGACであり；33個のグルタミン酸コドンのうち約14個はGAAであり、そしてグルタミン酸コドンのうち約19個はGAGであり；10個のシステイン・コドンのうち約4個はTGUであり、そしてシステイン・コドンのうち約6個はTGCであり；9個のトリプトファン・コドンはTGGであり；36個のアルギニン・コドンのうち約3個はCGTであり、アルギニン・コドンのうち約7個はCGCであり、アルギニン・コドンのうち約4個はCGAであり、アルギニン・コドンのうち約8個はCGGであり、アルギニン・コドンのうち約7個はAGAであり、そしてアルギニン・コドンのうち約7個はAGGであり；そして36個のグリシン・コドンのうち約6個はGGTであり、グリシン・コドンのうち約12個はGGCであり、グリシン・コドンのうち約9個はGGAであり、そしてグリシン・コドンのうち約9個はGGGである。
上述のように、「約」という用語は、或るコドンによってコードされたアミノ酸の数が、所与の数よりも多いか又は少ない数であり得ることを意味する。当業者には明らかなように、ペプチド配列における任意のアミノ酸の総数は一定のままでなければならず、従って、所与のアミノ酸をコードする1つ多い或るコドンがある場合には、同じアミノ酸をコードする1つ少ない別のコドンがなければならない。
この方法により設計された代表的な完全コドン最適化型pp65コード領域は、SEQ ID NO:8〜10として本明細書中に提供される。
加えて、SEQ ID NO:2をコードする最小コドン最適化型ヌクレオチド配列は、表5に示すように、ヒト遺伝子よりもHCMV遺伝子においてより頻繁に見いだされる特定のコドンだけを変えることによって設計することができる。例えば、HCMV遺伝子において最小2.7倍だけより頻繁に発生するコドンの代わりに、ヒトにおいてより頻繁に使用されるコドンを用いることが望ましい場合、ヒト遺伝子よりもHCMV遺伝子において2.75倍だけより頻繁に発生するAla CGCが、例えばGCCに変化させられ；ヒトよりもHCMV遺伝子において3.0倍だけより頻繁に発生するPro CCGが、例えばCCCに変化させられ；ヒトよりもHCMV遺伝子において3.2倍だけより頻繁に発生するArg CGTが、例えばCGCに変化させられ；ヒトよりもHCMV遺伝子において4.2倍だけより頻繁に発生するSer TCGが、例えばTCCに変化させられ；そしてヒトよりもHCMV遺伝子において4.3倍だけより頻繁に発生するThr ACGが、例えばACCに変化させられる。天然型HCMV pp65をコードするこの方法によって設計された最小コドン最適化型pp65コード領域が、SEQ ID NO:3として本明細書中に提供される。当業者によく知られた方法によって、他の「最小」最適化法を実施することができる。
或る実施態様の場合、本発明は、SEQ ID NO:2の最小10個、最小20個、最小30個、最小40個、最小50個、最小60個、最小70個、最小80個、最小90個、最小95個、最小100個又はそれ以上の連続アミノ酸をコードする核酸断片を含む分離型ポリヌクレオチドを提供し、核酸断片は、SEQ ID NO:2をコードするコドン最適化型コード領域の断片である。ヒト・コドン最適化型コード領域は、本明細書に記載された方法のいずれかによって最適化することができる。
或る実施態様の場合、本発明は、SEQ ID NO:2に対して最小60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%だけ同一のポリペプチドをコードする核酸断片を含む分離型ポリヌクレオチドを提供し、核酸断片は、SEQ ID NO:2をコードするヒト・コドン最適化型コード領域の変異体である。ヒト・コドン最適化型コード領域は、本明細書に記載された方法のいずれかによって最適化することができる。
さらに、最小コドン最適化型核酸(SEQ ID NO:5)を含む分離型ポリヌクレオチドが提供される。この分離型ポリヌクレオチドは、pp65のポリペプチド変異体、すなわちSEQ ID NO:6をコードする。SEQ ID NO:6においては、SEQ ID NO:2のアミノ酸435-438が欠失している。pp65のアミノ酸配列におけるこの欠失は、アミノ酸配列内に存在するキナーゼ活性に対する推定上の偶発性基質を除去する。この変異体をコードするヒト・コドン最適化型コード領域は、本明細書中に記載された方法のいずれかによって最適化することができる。或いは、アミノ酸435-438を異なるアミノ酸で置換することもでき、又は挿入を行うことにより、モチーフを除去することもできる。SEQ ID NO:2の付加的な断片、変異体又は誘導体も同様に利用することができる。
本発明はさらに、HCMV gB、又はその断片、変異体及び誘導体のヒト・コドン最適化コード領域を含む分離型ポリヌクレオチドを提供する。本明細書中に記載された或る実施態様の場合、SEQ ID NO:12をコードするコドン最適化コード領域が、ヒト(Homo sapiens)におけるコドン使用頻度に従って最適化される。ヒト・コドン最適化コード領域は、本明細書中に記載された方法のいずれかによって最適化することができる。
ヒトにおけるコード使用頻度に従って最適化されるSEQ ID NO:12をコードするコドン最適化コード領域が、下記の通り設計される。SEQ ID NO:12のアミノ酸組成物は表7に、そして切断された分泌gB(SEQ ID NO:14)のアミノ酸組成物は表8に示されている。
表7に示されたアミノ酸組成物、及び表3に示されたヒト・コドン使用頻度表を使用して、SEQ ID NO:12をコードするヒト・コドン最適化コード領域は、本明細書中で論じた方法のいずれかによって設計することができる。「均一最適化」アプローチの場合、各アミノ酸には、例えば表3に示したように、そのアミノ酸に対してヒト・ゲノムにおいて使用される最高頻度コドンが割り当てられる。この方法に従って、SEQ ID NO:12をコードするコード領域に、コドンが下記のように割り当てられる：34個のフェニルアラニン・コドンはTTCであり、70個のロイシン・コドンはCTGであり、48個のイソロイシン・コドンはATCであり、17個のメチオニン・コドンはATGであり、71個のバリン・コドンはGTGであり、87個のセリン・コドンはAGCであり、30個のプロリン・コドンはCCCであり、71個のスレオニン・コドンはACCであり、62個のアラニン・コドンはGCCであり、51個のチロシン・コドンはTACであり、20個のヒスチジン・コドンはCACであり、37個のグルタミン・コドンはCAGであり、52個のアスパラギン・コドンはAACであり、39個のリシン・コドンはAAGであり、45個のアスパラギン酸コドンはGACであり、49個のグルタミン酸コドンはGAGであり、16個のシステイン・コドンはTGCであり、8個のトリプトファン・コドンはTGGであり、53個のアルギニン・コドンはCGG, AGA, 又はAGG(ヒト・ゲノムにおけるこれら3つのコドンの使用頻度は有意には異なっていない)であり、そして46個のグリシン・コドンはGGCである。この方法によって設計されたコドン最適化完全長gBコード領域は、SEQ ID NO:15として本明細書中に示されている。
或いは、SEQ ID NO:12をコードする「完全コドン最適化」コード領域は、ヒト・ゲノムにおいてそのコドンが使用される頻度に基づいて、所与のアミノ酸のそれぞれにコドンをランダムに割り当てることによって設計することができる。これらの頻度は上記表3に示されている。この後者の方法を使用すると、SEQ ID NO:12をコードするコード領域に、コドンが下記のように割り当てられる：34個のフェニルアラニン・コドンのうち約15個はTTTであり、そしてフェニルアラニン・コドンのうち約19個はTTCであり；70個のロイシン・コドンのうち約5個はTTAであり、ロイシン・コドンのうち約9個はTTGであり、ロイシン・コドンのうち約9個はCTTであり、ロイシン・コドンのうち約10個はCTCであり、ロイシン・コドンのうち約5個はCTAであり、そしてロイシン・コドンのうち約28個はCTGであり；48個のイソロイシン・コドンのうち約17個はATTであり、イソロイシン・コドンのうち約23個はATCであり、そしてイソロイシン・コドンのうち約8個はATAであり；17個のメチオニン・コドンはATGであり；71個のバリン・コドンのうち約13個はGTTであり、バリン・コドンのうち約17個はGTCであり、バリン・コドンのうち約8個はGTAであり、そしてバリン・コドンのうち約33個はGTGであり；87個のセリン・コドンのうち約16個はTCTであり、セリン・コドンのうち約19個はTCCであり、セリン・コドンのうち約13個はTCAであり、セリン・コドンのうち約5個はTCGであり、セリン・コドンのうち約13個はAGTであり、そしてセリン・コドンのうち約21個はAGCであり；30個のプロリン・コドンのうち約9個はCCTであり、プロリン・コドンのうち約10個はCCCであり、プロリン・コドンのうち約8個はCCAであり、そしてプロリン・コドンのうち約3個はCCGであり；71個のスレオニン・コドンのうち約17個はACTであり、スレオニン・コドンのうち約26個はACCであり、スレオニン・コドンのうち約20個はACAであり、そしてスレオニン・コドンのうち約8個はACGであり；62個のアラニン・コドンのうち約16個はGCTであり、アラニン・コドンのうち約25個はGCCであり、アラニン・コドンのうち約14個はGCAであり、そしてアラニン・コドンのうち約7個はGCGであり；51個のチロシン・コドンのうち約22個はTATであり、そしてチロシン・コドンのうち約29個はTACであり；20個のヒスチジン・コドンのうち約8個はCATであり、そしてヒスチジン・コドンのうち約12個はCACであり；37個のグルタミン・コドンのうち約9個はCAAであり、そしてグルタミン・コドンのうち約28個はCAGであり；52個のアスパラギン・コドンのうち約24個はAATであり、そしてアスパラギン・コドンのうち約28個はAACであり；39個のリシン・コドンのうち約16個はAAAであり、そしてリシン・コドンのうち約23個はAAGであり；45個のアスパラギン酸コドンのうち約21個はGATであり、そしてアスパラギン酸コドンのうち約24個はGACであり；49個のグルタミン酸コドンのうち約20個はGAAであり、そしてグルタミン酸コドンのうち約29個はGAGであり；16個のシステイン・コドンのうち約7個はTGTであり、そしてシステイン・コドンのうち約9個はTGCであり；8個のトリプトファン・コドンはTGGであり；53個のアルギニン・コドンのうち約4個はCGTであり、アルギニン・コドンのうち約10個はCGCであり、アルギニン・コドンのうち約6個はCGAであり、アルギニン・コドンのうち約11個はCGGであり、アルギニン・コドンのうち約11個はAGAであり、そしてアルギニン・コドンのうち約11個はAGGであり；そして46個のグリシン・コドンのうち約7個はGGTであり、グリシン・コドンのうち約16個はGGCであり、グリシン・コドンのうち約12個はGGAであり、そしてグリシン・コドンのうち約11個はGGGである。
上述のように、「約」という用語は、或るコドンによってコードされたアミノ酸の数が、所与の数よりも多いか又は少ない数であり得ることを意味する。当業者には明らかなように、ペプチド配列における任意のアミノ酸の総数は一定のままでなければならず、従って、所与のアミノ酸をコードする1つ多い或るコドンがある場合には、同じアミノ酸をコードする1つ少ない別のコドンがなければならない。完全長HCMV gBをコードするこの方法により設計された代表的な完全コドン最適化型gBコード領域は、SEQ ID NO:16〜18として本明細書中に提供される。
加えて、SEQ ID NO:14をコードする最小コドン最適化型ヌクレオチド配列は、表8のアミノ酸組成物を参照し、そしてヒト遺伝子を高発現させる上でより頻繁に見いだされる特定のコドンだけを変えることによって設計することができる。例えば、HCMV遺伝子において最小2.7倍だけより頻繁に発生するコドンの代わりに、ヒトにおいてより頻繁に使用されるコドンを用いることが望ましい場合、ヒト遺伝子よりもHCMV遺伝子において2.75倍だけより頻繁に発生するAla CGCが、例えばGCCに変化させられ；ヒトよりもHCMV遺伝子において3.0倍だけより頻繁に発生するPro CCGが、例えばCCCに変化させられ；ヒトよりもHCMV遺伝子において3.2倍だけより頻繁に発生するArg CGTが、例えばCGCに変化させられ；ヒトよりもHCMV遺伝子において4.2倍だけより頻繁に発生するSer TCGが、例えばTCCに変化させられ；そしてヒトよりもHCMV遺伝子において4.3倍だけより頻繁に発生するThr ACGが、例えばACCに変化させられる。この方法によって設計されたSEQ ID NO:14をコードする最小コドン最適化型分泌gBコード領域が、SEQ ID NO:13として本明細書中に提供される。
或る実施態様の場合、本発明は、SEQ ID NO:12又はSEQ ID NO:14の最小10個、最小20個、最小30個、最小40個、最小50個、最小60個、最小70個、最小80個、最小90個、最小95個、最小100個又はそれ以上の連続アミノ酸をコードする核酸断片を含む分離型ポリヌクレオチドを提供し、核酸断片は、SEQ ID NO:12又はSEQ ID NO:14をコードするヒト・コドン最適化型コード領域の断片である。ヒト・コドン最適化型コード領域は、本明細書に記載された方法のいずれかによって最適化することができる。
或る実施態様の場合、本発明は、gB、すなわちSEQ ID NO:12又はSEQ ID NO:14に対して最小60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%だけ同一のポリペプチドをコードする核酸を含む分離型ポリヌクレオチドを提供する。核酸は、SEQ ID NO:12又はSEQ ID NO:14をコードするコドン最適化型コード領域の変異体である。ヒト・コドン最適化型コード領域は、本明細書に記載された方法のいずれかによって最適化することができる。
こうして、本発明は、in vivoで送達されたポリヌクレオチドからのポリペプチド発現レベルを高め、且つ/又は、所望の種、例えば脊椎動物種、例えば哺乳動物種、例えばヒトの細胞による、ポリヌクレオチドの取込みを容易にする方法を提供する。従って、本発明は、HCMV感染に対する治療及び予防の方法を提供する。
方法及び投与
本発明はさらに、本明細書中に記載された組成物のうちの1つ又は2つ以上をヒトに投与して、本明細書中に記載されたような組成物が投与されると、HCMVに対して免疫応答を生成するのに十分な量で、HCMVポリペプチドがヒト細胞内に発現されるようにすることを含む、ヒトにHCMVポリペプチドを送達する方法を提供する。
「脊椎動物」は、単数の「脊椎動物」並びに複数の「脊椎動物」を包含するものとし、哺乳動物及び鳥類、並びに魚類、は虫類、及び両生類を含む。
哺乳動物という用語は、単数の「哺乳動物」並びに複数の「哺乳動物」を包含するものとし、例えばヒト；霊長類、例えば類人猿、サル、オランウータン及びチンパンジー；イヌ科動物、例えばイヌ及びオオカミ；ネコ科動物、例えばネコ、ライオン、及びトラ；ウマ科動物、例えばウマ、ロバ及びシマウマ、食料用動物、例えばウマ、ブタ、及びヒツジ；有蹄動物、例えばシカ及びキリン；及びクマ科動物、例えばクマを含む。具体的には、哺乳動物はヒト患者、食料用動物、又は伴侶動物であってよい。
本発明はさらに、本明細書中に記載された組成物の1つ又は2つ以上を脊椎動物に投与することを含む、HCMVに対する免疫応答を生成、増強又は調節する方法を提供する。この方法の場合、組成物は、HCMVのポリペプチドをコードするヒト・コドン最適化コード領域を含む分離型ポリヌクレオチド、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片を含む分離型ポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、in vivoの脊椎動物細胞中に統合され、そして抗原量のHCMVポリペプチド、又はその断片、変異体又は誘導体がin vivo生成される。この方法に従って組成物が投与されると、HCMVポリペプチドは、免疫応答を誘発するのに十分な量で脊椎動物内に発現される。このような免疫応答を用いることにより、例えば診断アッセイにおいて使用するための、又はラボラトリー試薬として、HCMVに対する抗体を生成することもできる。
本発明はさらに、ヒトにおけるHCMVに対する予防的及び/又は治療的な免疫応答を生成、増強又は調節する方法であって、予防的及び/又は治療的な免疫を必要とするヒトに、本明細書中に記載された組成物の1つ又は2つ以上を投与することを含む方法を提供する。この方法の場合、組成物は、HCMVのポリペプチドをコードするヒト・コドン最適化コード領域を含む分離型ポリヌクレオチド、又はポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするこのようなコード領域の核酸断片を含む分離型ポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、in vivoのヒト細胞中に統合され、そして免疫学的に効果的な量のHCMVポリペプチド、又はその断片又は変異体がin vivo生成される。この方法に従って組成物が投与されると、HCMVポリペプチドは、治療上又は予防上効果的な量でヒト内に発現される。
本明細書中に使用される「免疫応答」という用語は、脊椎動物に送達された組成物に対する免疫反応を誘発する、その脊椎動物の能力を意味する。免疫応答の例は、抗体応答又は細胞性応答、例えば細胞毒性T-細胞性応答を含む。本発明の1つ又は2つ以上の組成物を使用することにより、例えば予防ワクチンとしてヒトにおけるHCMV感染を予防し、HCMVに対する暴露前又はHCMV罹患前に健常個体においてHCMVに対する免疫性を確立又は増強し、こうして、疾患を予防するか又は疾患症状の重症性を低減することができる。
本発明の1つ又は2つ以上の組成物を使用することにより、すでにHCMVに暴露された個体、又はHCMV疾患を既に患っている個体を治療して、ヒトの免疫系をさらに刺激し、こうして、疾患又は障害と関連する症状を低減又は排除することもできる。本明細書中に使用される「治療」という用語は、本発明の1つ又は2つ以上の組成物を使用することにより、ヒトにおけるHCMV疾患症状の重症性を予防、治療、遅延又は低減すること、及び/又は、特定時間にわたってHCMV疾患の悪化を引き起こさないことを意味する。本発明のいずれかの組成物がHCMVに対する完全な免疫性を提供するか、又は全てのHCMV疾患症状を完全に治療又は排除することは必要とされない。本明細書中に使用される「治療的及び/又は予防的免疫を必要とするヒト」とは、HCMV疾患症状の重症性を治療、すなわち予防、治療、遅延又は低減すること、及び/又は、特定時間にわたってHCMV疾患の悪化を引き起こさないことが望ましい個体を意味する。
別の実施態様の場合、本発明の1つ又は2つ以上の組成物は、「プライム・ブースト」投与計画において利用される。「プライム・ブースト」投与計画の例は、Yang, Z.他、J. Virol. 77:799-803(2002)に見いだすことができる。これらの実施態様の場合、本発明の1つ又は2つ以上のポリヌクレオチド・ワクチン組成物をヒトに送達することにより、HCMVにヒトの免疫応答をプライムし、次いでブースト・ワクチン接種として第2の免疫原性組成物を利用する。本発明の1つ又は2つ以上のポリヌクレオチド・ワクチン組成物を使用することにより、免疫をプライムし、次いで第2の免疫原性組成物、例えば組換えウィルス・ワクチン、異なるポリヌクレオチド・ワクチン、付加的なHCMV抗原、例えばIE1を含む又は含まない、1つ又は2つ以上の精製サブユニットHCMVタンパク質、例えばgB又はpp65、又はその断片、変異体又は誘導体を使用することにより、抗HCMV免疫応答をブーストする。ポリヌクレオチド・ワクチン組成物は、本明細書中に記載された1つ又は2つ以上のHCMV遺伝子の発現のために1つ又は2つ以上のベクターを含んでよい。加えて、ポリヌクレオチド・プライム・ワクチン及び後期ブースト・ワクチンは、同じ又は類似の抗原に対する免疫応答を誘発してよく、或いは異なる抗原に対する応答を誘発してよい。
別の実施態様の場合、組換えウィルス・ワクチン中、及びポリヌクレオチド・ワクチンの一部としてのトランスフェクト済哺乳動物細胞中での発現のために、、ベクターが調製される。
「プライミング」又は「一次」及び「ブースト」又は「ブースティング」という用語は、これらの用語が通常、免疫学において有する定義に従って、それぞれ、最初及び後続の免疫化を意味する。
本発明はさらに、HCMVポリペプチドをコードする、そしてまたHCMVポリペプチド又はその断片、変異体又は誘導体をコードする1つ又は2つ以上のコドン最適化型コード領域を含む1つ又は2つ以上のポリヌクレオチド；又は、HCMVポリペプチド、その断片、変異体又は誘導体をコードする1つ又は2つ以上の非最適化型ポリヌクレオチドを、ヒトの組織に投与することによって、HCMVに対するヒト患者の免疫応答を高める方法を提供する。
HCMVポリペプチド、又はHCMVポリペプチド、その断片、変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドと、コドン最適化型核酸組成物との組み合わせは、投与量節約濃度で、治療上有益な効果を提供する。例えば、適量のコドン最適化型核酸を補足するか又はこの核酸で増強すると、従来型ワクチン(これは、免疫原性ポリペプチド、又は免疫原性ポリペプチド、その断片、変異体又は誘導体をコードするヌクレオチドを含むワクチンであり、これらのヌクレオチドは、本明細書中に記載されたようなコドン最適化型生成物ではなく、或いは本明細書中に記載されたようにはコドン最適化されていない)の使用量をより少なくして、治療上有益な効果を得るのに十分な免疫応答を得ることができる。
従来型ワクチンは、ウィルス又は細菌の死んだ又は不活性の断片、或いは細菌タンパク質又はウィルス・タンパク質又はタンパク質断片を含むワクチン組成物を含み、このワクチンを患者に注射することにより、免疫系による作用を誘発する。本発明に関連して、従来型ワクチンは、免疫原性ポリペプチド、又は免疫原性ポリペプチド、その断片、変異体又は誘導体をコードするヌクレオチドを含む組成物と、免疫原性ポリペプチド、その断片、変異体又は誘導体をコードするヌクレオチドを含むベクターとを含み、これらは、本明細書中に記載されたコドン最適化型ポリヌクレオチドの生成物ではなく、又はこれらのコドン最適化型ポリヌクレオチドを含有しない。こうして、従来型ワクチン中には、遺伝子操作型ワクチン、例えば遺伝子操作型生ワクチン、キメラ生ワクチン、複製欠陥生ワクチン、サブユニット・ワクチン、免疫原性の改善のために個々の成分として送達された、又はウィルス様粒子内に統合された一価、多価又はキメラ・サブユニット・ワクチンの種々の変異形のペプチド・ワクチン、及びポリヌクレオチド・ワクチンが含まれる。本明細書中に記載された助剤も、従来型ワクチンの考えられる成分である。
こうして、本発明の複合ポリヌクレオチド・ワクチン組成物の投与によって、投与量の節約が考えられる。
具体的には、従来型ワクチンの投与量は、本発明のコドン最適化型核酸組成物と組み合わせて投与すると、最小5%、最小10%、最小20%、最小30%、最小40%、最小50%、最小60%又は最小70%だけ低減することができる。
同様に、DNA系薬剤単独によってもたらされる所望の免疫応答レベルも、従来型DNAワクチンを含むことによって、より少ないDNAを用いて達成することができる。さらに、従来型DNAワクチンと、コドン最適化型DNA系ワクチンとを組み合わせることによって、両材料はより少ない量で使用されることが可能になる一方、いずれの成分も単独でより多量に投与することから生じる免疫応答の所望レベルが依然として提供される(例えば、組み合わせで使用すると、どちらの免疫生成物も使用量を少なくすることができる)。送達される材料量のこのような低減は、ワクチン接種計画において、それぞれの投与の際に、投与の数を低減するのに加えて行うことができる(例えば3回又は4回の注射に対して2回の注射)。さらに、この組み合わせは、免疫応答キネティクスを軽減することをも可能にする(例えば所望応答レベルは、免疫化後6週間の代わりに3週間で達成される)。
具体的には、DNA系薬剤の投与量は、従来型IVワクチンと組み合わせて投与すると、最小5%、最小10%、最小20%、最小30%、最小40%、最小50%、最小60%又は最小70%だけ低減することができる。
DNA系薬剤及び従来型抗原の正確な量は、本明細書中に記載された多数のファクターに応じて見極められ、当業者によって容易に見極められる。
投与量節約に加えて、主張された複合組成物は、免疫応答を広げ、且つ/又は有益な免疫応答を高めることを可能にする。免疫応答のこのような拡大又は増強は：従来型ワクチンに対する細胞性応答を高めるためにDNAを添加し；体液性応答を高めるために、DNA薬剤に従来型ワクチンを添加し；付加的なエピトープ(体液性及び/又は細胞性の両方)が認識されるように且つ/又はより望ましく応答されるようにする(エピトープを広げる)組み合わせを使用し；特定の所望の免疫応答スペクトルに合わせて設計されたDNA-従来型ワクチン複合体を採用し；どちらかの成分をより多量に使用することによって所望の免疫応答スペクトルを獲得することにより、達成される。広げられた免疫応答は、所望の応答スペクトルに対して特異的な種々の標準免疫アッセイによって、当業者により測定することができる。
免疫応答拡大及び投与量節約の双方を同時に達成することができる。
特定の実施態様の場合、本発明の1つ又は2つ以上の組成物が、本明細書に記載された方法によってヒトに送達され、これにより、効果のある治療的免疫応答及び/又は効果のある予防的免疫応答を達成する。
より具体的には、本発明の組成物はヒトの任意の組織に投与することができる。組織の一例としては、筋肉、皮膚、脳組織、肺組織、肝臓組織、脾臓組織、骨髄組織、胸腺組織、心臓組織(例えば心筋、心内膜、及び心膜)、リンパ組織、血液組織、骨組織、膵臓組織、腎臓組織、胆嚢組織、胃組織、腸組織、睾丸組織、卵巣組織、子宮組織、膣組織、直腸組織、神経系組織、眼組織、腺組織、舌組織、及び結合組織、例えば軟骨が挙げられる。
さらに、本発明の組成物は、ヒトの任意の内腔に投与することができる。この内腔の一例としては、肺、口、鼻腔、胃、腹腔、腸、任意の心腔、静脈、動脈、毛細血管、リンパ管腔、子宮腔、膣腔、直腸腔、関節腔、脳室、脊髄内の脊柱管、眼窩、唾液腺管腔、又は肝臓が挙げられる。本発明の組成物を唾液腺管腔又は肝臓に投与されると、所望のポリペプチドが唾液腺及び肝臓内で発現されるので、ポリペプチドは、唾液腺又は肝臓のそれぞれからヒトの血流中に送達される。
血流中に所望のポリペプチドを放出するために、唾液腺、肝臓及び膵臓を使用して胃腸系の分泌器官に投与する或る様式が、米国特許第5,837,693号明細書及び同第6,004,944号明細書に開示されている(これら双方の全体を参考のため、本明細書中に引用する)。
1実施態様の場合、組成物は、筋肉、骨格筋又は心筋に、又は肺組織に投与される。肺組織への具体的な投与様式の一例が、Wheeler, C.J.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11454-11459 (1996)に開示されており、この内容全体を参考のため本明細書中に引用する。
開示された方法に従って、本発明の組成物は、筋内(i.m.)、皮下(s.c.)又は肺内経路で投与することができる。他の好適な投与経路の一例としては、気管内、経皮、眼内、鼻腔内、吸入、腔内、静脈内(i.v.)、管内(例えば膵臓内投与)、及び実質内(例えば任意の組織への投与)投与が挙げられる。経皮送達の一例としては皮内(真皮内又は表皮内への投与)、経皮(例えば皮膚を通した投与)及び経粘膜投与(すなわち皮膚又は粘膜組織の中への、又は皮膚又は粘膜組織を通しての投与)が挙げられる。腔内投与の一例としては、口腔、膣腔、直腸腔、鼻腔、腹腔、又は腸腔内への投与、並びに、脊椎(すなわち脊柱管内投与)、室内(すなわち脳室内又は心室内投与)、心房内(すなわち心房内投与)、及びくも膜下(脳のくも膜下空間内投与)が挙げられる。
任意の投与様式が結果として、HCMVに対する免疫応答を生成し、且つ/又は、このような応答を必要とするヒトにおけるHCMVに対する予防上又は治療上効果的な免疫応答を生成するのに十分な量で、所望の組織内に所望のペプチド又はタンパク質を発現させる限り、このような投与様式を用いることができる。本発明の投与手段は、針注射、カテーテル輸液、バイオリスティック注射器、粒子加速器(例えば「遺伝子銃」又は空気圧「無針」注射器)、Med-E-Jet(Vahlsing, H.他、J. Immunol Method 171:11-22(1994)、Pigjet(Schriver, R.他、Vaccine 15: 1908-1916(1997))、Biojector(Davis, H.他、Vaccine 12: 1503-1509(1994))；Gramzinski, R.他、Mol. Med. 4:109-118(1998))、AdvantaJet(Linmayer, I.他、Diabetes Care 9:294-297(1986))、Medi-jector(Martins, J.及びRoedl, E. J. Occup. Med. 21: 821-824(1979))、ゲルフォーム・スポンジ・デポ剤、その他の商業的に入手可能なデポ材料(例えばヒドロゲル)、浸透圧ポンプ(例えばAlza ミニポンプ)、経口用又は座剤用の固形(錠剤又は丸剤)製薬配合物、局所用皮膚クリーム、及びデカンティング、ポリヌクレオチド・コーティング済縫合糸(Qin,, Y.他、Life Sciences 65: 2193-2203(1999))、又は外科手術中の局所的適用を含む。或る投与様式は、針に基づく筋内注射、及びカテーテル輸液を介した肺適用である。エネルギー支援型プラスミド送達(EAPD)法を採用することにより、本発明の組成物を投与することもできる。このような1方法は、注射された組織に、短い電気パルスを加えることを伴う。この手順はエレクトロポレーションとして一般に知られている。全体的には、Mir, L.M.他、Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4262-7(1999)；Hartikka, J.他、Mol. Ther. 4:407-15(2001)；Mathiesen, I., Gene Ther.6:508-14(1999)；Rizzuto G.他、Hum. Gen. Ther. 11:1891-900(2000)。この段落で引用した参考文献のそれぞれを全体的に、参考のため本明細書中に引用する。
さらに、単独又は組み合わせで抗原構造を調製することにより、その特定の抗原に対応する宿主内で開始するのに最も有益と考えられるタイプの免疫応答(例えば体液性、細胞性、粘膜性など)を高めることができる。このような配合物はそれぞれ、宿主内の別個の部位に個別に投与し、且つ/又は、宿主内の1つ又は2つ以上の部位に、他の抗原配合物のうちのいくつか又は全てと共に投与することができる。同じ又は異なる物理的投与手段を用いてそれぞれの投与を達成することができる。このように一例としては、無針器具を使用してpp65のポロキサマー配合物を1肢の皮膚及び筋肉内に投与すると共に、そして、コンベンショナルなシリンジ及び針を使用して、PBS中のIE1プラスミドを第2肢に経皮筋内投与するとともに、gBプラスミドをカチオン性脂質と配合して、ミストとして鼻腔投与することができる。
本発明の1つ又は2つ以上の組成物の有効量は、多数のファクターに応じて見極められる。これらのファクターは、例えば発現される抗原、例えばpp65又はIE1；又はその断片、変異体及び誘導体、患者の年齢及び体重、治療を必要とする正確な状態及びその重症性、及び投与経路を含む。上記ファクターに基づいて、正確な投与量、投与回数及び投与タイミングを決定することは、当業者の技術範囲内にあり、主治医によって容易に決定されることになる。
本発明の組成物は、2002年2月14日付けで発行された米国特許出願公開第2002/0019358号明細書に開示されているような種々の塩、賦形剤、送達ビヒクル、及び/又は助剤を含むことができる。前記明細書全体を参考のため本明細書中に引用する。
さらに、本発明の組成物は、1つ又は2つ以上のトランスフェクション促進化合物を含んでよい。トランスフェクション促進化合物は、細胞内部への、及び/又は細胞内の所望の位置へのポリヌクレオチドの送達を容易にする。本明細書中に使用される「トランスフェクション促進化合物」、「トランスフェクション促進剤」及び「トランスフェクション促進材料」は同義であり、置き換え可能に使用することができる。なお、或るトランスフェクション促進化合物は、例えば細胞の内部へのポリヌクレオチドの送達を容易にすることに加えて、下記のような「アジュバント」であってもよい。化合物はそのポリヌクレオチドによってコードされた抗原に対する免疫応答を変化又は増大させるように作用する。トランスフェクション促進化合物の一例としては、無機材料、例えばリン酸カルシウム、ミョウバン(硫酸アルミニウム)、及び金粒子(例えば「粉末」タイプの送達ビヒクル)；例えばカチオン性、(或る細胞型への選択的送達に関して)細胞間標的性、(核局在化又はエンドソーム逃避に関して)細胞内標的性、及び両親媒性(螺旋形成性又は孔形成性)であるペプチド；例えば塩基性(例えば正荷電型)、例えばヒストン、標的性(例えばアシアロタンパク質)、ウィルス性(Sendaiウィルス外皮タンパク質)及び孔形成性であるタンパク質；例えばカチオン性(例えばDMRIE, DOSPA, DC-Chol)、塩基性(例えばステリル・アミン)、中性(例えばコレステロール)、アニオン性(例えばホスファチジルセリン)、及び両性イオン性(例えばDOPE, DOPC)である脂質；及びポリマー、例えばデンドリマー、星形ポリマー、「同種」ポリ-アミノ酸(例えばポリ-リシン、ポリ-アルギニン)、「異種」ポリ-アミノ酸(例えばリシンとグリシンとの混合物)、コ-ポリマー、ポリビニルピロリジノン(PVP)、ポロキサマー(例えばCRL 1005)及びポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。トランスフェクション促進材料は単独で、又は1つ又は2つ以上の他のトランスフェクション促進材料との組み合わせにおいて使用することができる。2つ又は3つ以上のトランスフェクション促進材料を、化学結合(脂質化されたポリリシン、PEGイル化されたポリリシンにおけるような共有結合及びイオン結合)(Toncheva他、Biochem. Biophys. Acta 1380(3):354-368(1988))、機械的混合(例えば液相又は固相における自由運動材料、例えば「ポリリシン + カチオン性脂質」)(Gao及びHuang, Biochemistry 35:1027-1036(1996))；Trubetskoy他、Biochem. Biophys. Acta 1131:311-313(1992))、及び凝集(例えば共沈、カチオン性脂質+ポリラクチド、及びポリリシン + ゼラチンにおけるようなゲル形成)によって合体させることができる。
トランスフェクション促進材料の1カテゴリーはカチオン性脂質である。カチオン性脂質の例は、5-カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド(DOGS)及びジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン-5-カルボキシスペルミルアミド(DPPES)である。｛3β-[N-N',N'-ジメチルアミノ)エタン]-カルボモイル｝-コレステロール(DC-Chol)を含むカチオン性コレステロール誘導体も有用である。ジメチルジオクトデシル-アンモニウムブロミド(DDAB)、N-(3-アミノプロピル)-N,N-(ビス-(2-テトラデシクロキシエチル))-N-メチル-アンモニウムブロミド(PA-DEMO)、N-(3-アミノプロピル)-N,N-(ビス-(2-ドデシルオキシエチル))-N-メチル-アンモニウムブロミド(PA-DELO)、N,N,N-トリス-(2-ドデシルオキシ)エチル-N-(3-アミノ)プロピル-アンモニウムブロミド(PA-TELO)、及びN1-(3-アミノプロピル)((2-ドデシルオキシ)エチル)-N2-(2-ドデシルオキシ)エチル-1-ピペラジンアミニウムブロミド(GA-LOE-BP)を含むカチオン性コレステロール誘導体も有用である。
非ジエーテルカチオン性脂質、例えばDL-1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアミノプロピル-β-ヒドロキシエチルアンモニウム(DORIジエステル)、1-O-オレイル-2-オレオイル-3-ジメチルアミノプロピル-β-ヒドロキシエチルアンモニウム(DORIエステル/エーテル)、及びこれらの塩はin vivo遺伝子送達を促進する。いくつかの実施態様の場合、カチオン性脂質は、異種原子を介して頭基内の第四アンモニウム部分に結合された基を含む。グリシル・スペーサーが、リンカーとヒドロキシル基とを結合することができる。
本発明の或る実施態様に使用するための具体的なカチオン性脂質の一例としては、DMRIE ((±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)、GAP-DMORIE ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(syn-9-テトラデセンイルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)、及びGAP-DLRIE ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-(ビスドデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド))が挙げられる。
本発明の或る実施態様に使用するための他の具体的なカチオン性界面活性剤の一例としては、Bn-DHRIE、DhxRIE、DhxRIE-OAc、DhxRIE-OBz及びPr-DOctRIE-OAcが挙げられる。これらの脂質は、同時係属中の米国特許出願第60/435,303号明細書に開示されている。本発明の別の観点において、カチオン性界面活性剤はPr-DOctRIE-OAcである。
他のカチオン性脂質は、(±)-N,N-ジメチル-N-[2-(スペルミンカルボキサミド)エチル]-2,3-ビス(ジオレイルオキシ)-1-プロパンイミニウムペンタヒドロクロリド(DOSPA)、(±)-N-(2-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンイミニウムブロミド(β-アミノエチル-DMRIE又はβAE-DMRIE)(Wheeler他、Biochim. Biophys. Acta 1280:1-11(1996))、及び(±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(ドデシルオキシ)-1-プロパンイミニウムブロミド(GAP-DLRIE)(Wheeler他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11454-11459 (1996))を含み、これらはDMRIEから開発されている。
本発明にとって有用なDMRIE誘導型カチオン系脂質の他の例は、(±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-(ビスデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド(GAP-DDRIE)、(±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-(ビス-テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド(GAP-DMRIE)、(±)-N-((N''-メチル)-N'-ウレイル)プロピル-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド(GMU-DMRIE)、(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(ドデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド(DLRIE)、及び(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス([Z]-9-オクタデセニルオキシ)プロピル-1-プロパンイミニウムブロミド(HP-DORIE)である。
免疫原性組成物がカチオン性脂質を含む実施態様の場合、カチオン性脂質は1つ又は2つ以上の共脂質(co-lipid)と混合することができる。定義に関しては、共脂質という用語は、任意の疎水性材料であって、カチオン性脂質成分と合体させることができ、そして両親媒性脂質、例えばリン脂質、及び中性脂質、例えばコレステロールを含むものを意味する。カチオン性脂質と共脂質とは多数の方法で混合又は合体することにより、種々の非共有結合型の巨視的構造を生成することができる。これらの巨視的構造は例えば、リポソーム、多重ラメラ小胞、単ラメラ小胞、ミセル及び単純膜を含む。共脂質の1つのクラスは例えば、両性リン脂質である。両性リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンを含む。ホスファチジルエタノールアミンの例はDOPE、DMPE及びDPypEを含む。或る実施態様の場合、共脂質はDPyPEである。DPyPEは、ジアシルホスファチジルエタノールアミン骨格内に統合された2つのフタノイル置換基を含む。その他の実施態様の場合、共脂質はDOPE、CAS名称1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンである。
本発明の組成物がカチオン性脂質と共脂質とを含む場合、カチオン性脂質：共脂質のモル比は、約9:1〜約1:9、約4:1〜約1:4、約2:1〜約1:2、約1:1であってよい。
均質性を最大化するために、プラスミド成分と共脂質成分とを溶剤、例えばクロロホルム中に溶解し、続いて、カチオン性脂質/共脂質溶液を真空下で蒸発させて、ガラス容器(例えばRotovap丸底フラスコ)の内面上で膜として乾燥させることができる。水性溶剤中に懸濁させると、両親媒性脂質成分分子は自己集合して均質な脂質小胞となる。これらの脂質小胞を引き続き処理することにより、本発明のコドン最適化型ポリヌクレオチドとの複合前に、当業者に知られた方法に従って、均一サイズの選択された平均直径を有するようにする。例えば、脂質溶液の超音波処理に関して、Felgner他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417(1987)及び米国特許第5,264,618号明細書に記載されている。これらの開示内容を参考のため本明細書中に引用する。
組成物がカチオン性脂質を含むこれらの実施態様の場合、水溶液中のプラスミドと、本明細書中で調製されたカチオン性脂質：共脂質の溶液とを混合することにより、本発明のポリヌクレオチドを脂質と複合する。成分溶液のそれぞれの濃度は混合前に調節することができるので、プラスミド/カチオン性脂質：共脂質の所望の最終比、及びプラスミドの所望の最終濃度は、2つの溶液の混合時に得られることになる。カチオン性脂質：共脂質混合物は、約1分間にわたって周囲温度で渦流混合することによって好適な容積の水性溶剤中で混合済液体材料から成る薄膜を水和することにより、好適に調製される。個々の成分のクロロホルム溶液を混和することにより薄膜を調製して、これにより所望のモル溶質比を提供し、続いて所望の容積の溶液を好適な容器内にアリコートする。先ず乾燥不活性ガス流(アルゴン)を用いて、続いて高容積処理を用いて蒸発させることにより、溶剤を除去する。
他の疎水性添加剤及び両親媒性添加剤、例えばステロール、脂肪酸、ガングリオシド、糖脂質、リポペプチド、リポ糖、ネオビー、ニオソーム、プロスタグランジン及びスフィンゴ脂質を、本発明の組成物中に含むこともできる。このような組成物の場合、これらの添加剤は、約0.1モル%〜約99.9モル%(総脂質を基準とする)、約1モル%〜約50モル%、約2モル%〜約25モル%の量で含むことができる。
本発明の付加的な実施態様は、ポリヌクレオチドの前、後、又はこれと同時に投与される助剤を含む組成物に関する。本明細書中に使用される「助剤」という用語は、助剤を含むこと以外では同一である組成物と比べて、in vivoでの脊椎動物細胞内へのポリヌクレオチドの進入、及び/又は、このようなポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドのin vivo発現を増強する能力のために、組成物中に含まれる物質である。或る助剤は、細胞内へのポリヌクレオチドの進入を増強するのに加えて、ポリヌクレオチドによってコードされた免疫原に対する免疫応答を高めることができる。本発明の助剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性又は両性界面活性剤又は洗剤；キレート剤、DNAse阻害剤、ポロキサマー、核酸凝集剤又は核酸縮合剤、乳化剤又は可溶化剤、湿潤剤、ゲル形成剤及び緩衝剤を含む。
本発明の組成物中に使用するための助剤の一例としては、非イオン性洗剤及び界面活性剤IGEPAL CA 630（登録商標）CA 630、NONIDET NP-40、Nonidet（登録商標） P40、Tween-20（登録商標）、Tween-80（登録商標）、Pluronic F68（登録商標）、Pluronic F77（登録商標）、Pluronic P65（登録商標）、Triton X-100（登録商標）、及びTriton X-114（登録商標）；アニオン性洗剤ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)；糖スタキオース；縮合剤DMSO；及びキレート剤/DNAse阻害剤EDTA、CRL 1005、及びBAKが挙げられる。或る特定の実施態様の場合、助剤は、DMSO、Nonidet P40、Pluronic F68（登録商標）、Pluronic F77（登録商標）、Pluronic P65（登録商標）、Pluronic L64（登録商標）、及びPluronic F108（登録商標）である。例えば、2002年2月14日付けで発行された米国特許出願公開第20020019358号明細書を参照されたい。この内容全体を参考のため本明細書中に引用する。
本発明の特定の組成物はさらに、ポリヌクレオチドの前、後又はこれと同時に1つ又は2つ以上のアジュバントを含むことができる。「アジュバント」という用語は、(1)特定の抗原に対する免疫応答を変化又は増大させるか、又は(2)薬物の効果を増大させ又は補助する能力を有する任意の材料を意味する。なお、ポリヌクレオチド・ワクチンに関しては、「アジュバント」が「トランスフェクション促進材料」であってよい。同様に上記特定の「トランスフェクション促進材料」が「アジュバント」であってもよい。アジュバントは、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物と一緒に使用することができる。本明細書中に記載されたプライム-ブースト計画において、アジュバントをプライミング免疫化、ブースター免疫化、又はその両方と一緒に使用することができる。好適なアジュバントの一例としては、サイトカイン及び成長因子；細菌成分(例えば内毒素、具体的には超抗原、外毒素及び細胞壁成分)；アルミニウム系塩；カルシウム系塩；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質、ウィルス及びウィルス誘導型物質、毒物、毒、ポロキサマー、及びカチオン性脂質が挙げられる。
多種多様の材料が、種々のメカニズムを通してアジュバント活性を有することが判っている。ポリペプチドの発現、抗原性又は免疫原性を増大させることができる任意の化合物が潜在的アジュバントである。本発明は、潜在的アジュバントに対する改善された免疫応答に関してスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明に従って、免疫応答を高める能力に関してスクリーニングすることができる潜在的アジュバントの一例としては、不活性キャリヤ、例えばミョウバン、ベントナイト、ラテックス及びアクリル粒子；プルロニック・ブロック・ポリマー、例えばTiterMax（登録商標）；デポ形成剤、例えばフロイント・アジュバント、界面活性剤、例えばサポニン、リソレシチン、レチナール、Quil A、リポソーム、及びプルロニック・ポリマー配合物；マクロファージ刺激剤、例えば細菌リポ多糖；代替経路補体活性剤、例えばインスリン、ザイモサン、内毒素及びレバミゾール；及び非イオン性界面活性剤、例えばポロキサマー、ポリ(オキシエチレン)-ポリ(オキシプロピレン)トリ-ブロック・コポリマーが挙げられる。また、アジュバントとして、トランスフェクション促進材料、例えば上述の材料も含まれる。
本発明に従って免疫応答を高める能力に関してスクリーニングすることができるポロキサマーの一例としては、商業的に入手可能なポロキサマー、例えばPluronic（登録商標） L121(平均MW: 4400；疎水性物質の概算MW, 3600；親水性物質の概算wt. %, 10%)、Pluronic（登録商標） L101(平均MW: 3800；疎水性物質の概算MW, 3000；親水性物質の概算wt. %, 10%)、Pluronic（登録商標） L81(平均MW: 2750；疎水性物質の概算MW, 2400；親水性物質の概算wt. %, 10%)、Pluronic（登録商標） L61(平均MW: 2000；疎水性物質の概算MW, 1800；親水性物質の概算wt. %, 10%)、Pluronic（登録商標） L31(平均MW: 1100；疎水性物質の概算MW, 900；親水性物質の概算wt. %, 10%)、Pluronic（登録商標） L122(平均MW: 5000；疎水性物質の概算MW, 3600；親水性物質の概算wt. %, 20%)、Pluronic（登録商標） L92(平均MW: 3650；疎水性物質の概算MW, 2700；親水性物質の概算wt. %, 20%)、Pluronic（登録商標） L72(平均MW: 2750；疎水性物質の概算MW, 2100；親水性物質の概算wt. %, 20%)、Pluronic（登録商標） L62(平均MW: 2500；疎水性物質の概算MW, 1800；親水性物質の概算wt. %, 20%)、Pluronic（登録商標） L42(平均MW: 1630；疎水性物質の概算MW, 1200；親水性物質の概算wt. %, 20%)、Pluronic（登録商標） L63(平均MW: 2650；疎水性物質の概算MW, 1800；親水性物質の概算wt. %, 30%)、Pluronic（登録商標） L43(平均MW: 1850；疎水性物質の概算MW, 1200；親水性物質の概算wt. %, 30%)、Pluronic（登録商標）L64(平均MW: 2900；疎水性物質の概算MW, 1800；親水性物質の概算wt. %, 40%)、Pluronic（登録商標）L44(平均MW: 2200；疎水性物質の概算MW, 1200；親水性物質の概算wt. %, 40%)、Pluronic（登録商標）L35(平均MW: 1900；疎水性物質の概算MW, 900；親水性物質の概算wt. %, 50%)、Pluronic（登録商標）P123(平均MW: 5750；疎水性物質の概算MW, 3600；親水性物質の概算wt. %, 30%)、Pluronic（登録商標）P103(平均MW: 4950；疎水性物質の概算MW, 3000；親水性物質の概算wt. %, 30%)、Pluronic（登録商標）P104(平均MW: 5900；疎水性物質の概算MW, 3000；親水性物質の概算wt. %, 40%)、Pluronic（登録商標）P84(平均MW: 4200；疎水性物質の概算MW, 2400；親水性物質の概算wt. %, 40%)、Pluronic（登録商標）P105(平均MW:6500；疎水性物質の概算MW, 3000；親水性物質の概算wt. %, 50%)、Pluronic（登録商標）P85(平均MW: 4600；疎水性物質の概算MW, 2400；親水性物質の概算wt. %, 50%)、Pluronic（登録商標）P75(平均MW: 4150；疎水性物質の概算MW, 2100；親水性物質の概算wt. %, 50%)、Pluronic（登録商標）P65(平均MW: 3400；疎水性物質の概算MW, 1800；親水性物質の概算wt. %, 50%)、Pluronic（登録商標）F127(平均MW: 12600；疎水性物質の概算MW, 3600；親水性物質の概算wt. %, 70%)、Pluronic（登録商標）F98(平均MW: 13000；疎水性物質の概算MW, 2700；親水性物質の概算wt. %, 80%)、Pluronic（登録商標）F87(平均MW: 7700；疎水性物質の概算MW, 2400；親水性物質の概算wt. %, 70%)、Pluronic（登録商標）F77(平均MW: 6600；疎水性物質の概算MW, 2100；親水性物質の概算wt. %, 70%)、Pluronic（登録商標）F108(平均MW: 14600；疎水性物質の概算MW, 3000；親水性物質の概算wt. %, 80%)、Pluronic（登録商標）F98(平均MW: 13000；疎水性物質の概算MW, 2700；親水性物質の概算wt. %, 80%)、Pluronic（登録商標）F88(平均MW: 11400；疎水性物質の概算MW, 2400；親水性物質の概算wt. %, 80%)、Pluronic（登録商標）F68(平均MW: 8400；疎水性物質の概算MW, 1800；親水性物質の概算wt. %, 80%)、Pluronic（登録商標）F38(平均MW: 4700；疎水性物質の概算MW, 900；親水性物質の概算wt. %, 80%)が挙げられる。
本発明の逆ポロキサマーの一例としては、Pluronic（登録商標）R 31R1(平均MW: 3250；疎水性物質の概算MW, 3100；親水性物質の概算wt. %, 10%)、Pluronic（登録商標）R 25R1(平均MW: 2700；疎水性物質の概算MW, 2500；親水性物質の概算wt. %, 10%)、Pluronic（登録商標）R 17R1(平均MW: 1900；疎水性物質の概算MW, 1700；親水性物質の概算wt. %, 10%)、Pluronic（登録商標）R 31R1(平均MW: 3300；疎水性物質の概算MW, 3100；親水性物質の概算wt. %, 20%)、Pluronic（登録商標）R 25R2(平均MW: 3100；疎水性物質の概算MW, 2500；親水性物質の概算wt. %, 20%)、Pluronic（登録商標）R 17R2(平均MW: 2150；疎水性物質の概算MW, 1700；親水性物質の概算wt. %, 20%)、Pluronic（登録商標）R 12R3(平均MW: 1800；疎水性物質の概算MW, 1200；親水性物質の概算wt. %, 30%)、Pluronic（登録商標）R 31R4(平均MW: 4150；疎水性物質の概算MW, 3100；親水性物質の概算wt. %, 40%)、Pluronic（登録商標）R 25R4(平均MW: 3600；疎水性物質の概算MW, 2500；親水性物質の概算wt. %, 40%)、Pluronic（登録商標）R 22R4(平均MW: 3350；疎水性物質の概算MW, 2200；親水性物質の概算wt. %, 40%)、Pluronic（登録商標）R 17R4(平均MW: 3650；疎水性物質の概算MW, 1700；親水性物質の概算wt. %, 40%)、Pluronic（登録商標）R 25R5(平均MW: 4320；疎水性物質の概算MW, 2500；親水性物質の概算wt. %, 50%)、Pluronic（登録商標）R 10R5(平均MW: 1950；疎水性物質の概算MW, 1000；親水性物質の概算wt. %, 50%)、Pluronic（登録商標）R 25R8(平均MW: 8550；疎水性物質の概算MW, 2500；親水性物質の概算wt. %, 80%)、Pluronic（登録商標）R 17R8(平均MW: 7000；疎水性物質の概算MW, 1700；親水性物質の概算wt. %, 80%)、及びPluronic（登録商標）R 10R8(平均MW: 4550；疎水性物質の概算MW, 1000；親水性物質の概算wt. %, 80%)が挙げられる。
本発明に従って免疫応答を高める能力に関してスクリーニングすることができる、その他の商業的に入手可能なポロキサマーは、ポリエチレンとポリプロピレングリコールとのブロック・コポリマー、例えばSynperonic（登録商標）L121、Synperonic（登録商標）L122、Synperonic（登録商標）L104、Synperonic（登録商標）L105、Synperonic（登録商標）L123、Synperonic（登録商標）P85及びSynperonic（登録商標）P94；及びノニルフェニルポリエチレングリコールである化合物、例えばSynperonic（登録商標）NP10、Synperonic（登録商標）NP30及びSynperonic（登録商標）NP5を含む。
本発明に従って免疫応答を高める能力に関してスクリーニングすることができるその他のポロキサマーは、A型セグメントとB型セグメントとを含むポリエーテル・ブロック・コポリマーを含む。A型セグメントは、相対的に親水性特性を有する線状高分子セグメントを含み、その反復単位は、約-0.4以下の平均Hansch-Leoフラグメンタル定数を付与し、分子量付与分は約30〜約500であり、B型セグメントは、相対的に疎水性特性を有する線状高分子セグメントを含み、その反復単位は、約-0.4以上の平均Hansch-Leoフラグメンタル定数を付与し、分子量付与分は約30〜約500であり、高分子セグメントのそれぞれに対応する反復単位を接合するリンケージの約80%以上は、エーテル・リンケージ；(b)ポリエーテル・セグメントとポリカチオン・セグメントとを有するブロック・コポリマー(ポリエーテル・セグメントは少なくともA型ブロックを含み、ポリカチオン・セグメントは複数のカチオン性反復単位を含む)；及び(c)ポリマー、ポリエーテル・セグメントと、式-NH-R0(R0は、置換され得る炭素原子数2〜6の直鎖脂肪族基である)の複数のカチオン性反復単位を含むポリカチオン性セグメントとを含むポリエーテル-ポリカチオン・コポリマー(前記ポリエーテル・セグメントはA型セグメント又はB型セグメントのうちの少なくとも一方を含む)を含む。Kabonov他による米国特許第5,656,611号明細書を参照されたい(この全体を参考のため本明細書中に引用する)。
本発明に従って免疫応答を高める能力に関してスクリーニングすることができるその他の助剤の一例としては、アカシア(アラビアゴム)；ポリオキシエチレンエーテルR-O-(C2H4O)x-H(BRIJ（登録商標）)、例えばポリエチレングリコールドデシルエーテル(BRIJ（登録商標）35, x=23)、ポリエチレングリコールドデシルエーテル(BRIJ（登録商標）30, x=4)、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル(BRIJ（登録商標）52, x=2)、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル(BRIJ（登録商標）56 x=10)、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル(BRIJ（登録商標）58P, x=20)、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル(BRIJ（登録商標）72, x=2)、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル(BRIJ（登録商標）76, x=10)、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル(BRIJ（登録商標）78P, x=20)、ポリエチレングリコールオレイルエーテル(BRIJ（登録商標）92V, x=2)、及びポリオキシル10オレイルエーテル(BRIJ（登録商標）97, x=10)；ポリ-D-グルコサミン(キトサン)；クロルブタノール；コレステロール；ジエタノールアミン；ジギトニン；ジメチルスルホキシド(DMSO)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)；グレセリルモノステアレート；ラノリンアルコール；モノ-及びジ-グリセリド；モノエタノールアミン；ノニルフェノールポリオキシエチレンエーテル(NP-40（登録商標）)；オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(Ameresco製NONIDET NP-40)；エチルフェノールポリ(エチレングリコールエーテル)n、n=11(Roche製Nonidet（登録商標）P40)；約9個のエチレンオキシド単位を有するオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物(nonidet P40)；IGEPAL CA 630（登録商標）((オクチルフェノキシ)ポリエトキシエタノール；NONIDET NP-40と構造的に同じ)；オレイン酸；オレイルアルコール；ポリエチレングリコール8000；ポリオキシル20セトステアリルエーテル；ポリオキシル35ひまし油；ポリオキシル40水素化ひまし油；ポリオキシル40ステアレート；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(ポリソルベート20、又はTWEEN-20（登録商標）)；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(ポリソルベート80、又はTWEEN-80（登録商標）)；プロピレングリコールジアセテート；プロピレングリコールモノステアレート；プロタミンスルフェート；タンパク質分解酵素；ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)；ナトリウムモノラウレート；ステアリン酸ナトリウム；ソルビタン誘導体(SPAN（登録商標）)、例えばソルビタンモノパルミテート(SPAN（登録商標）40)、ソルビタンモノステアレート(SPAN（登録商標）60)、ソルビタントリステアレート(SPAN（登録商標）65)、ソルビタンモノオレエート(SPAN（登録商標）80)、及びソルビタントリオレエート(SPAN（登録商標）85)；2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエン(スクアレン)；スタキオース；ステアリン酸；スクロース；スルファクチン(Bacillus subtilisに由来するリポペプチド抗生物質)；ドデシルポリ(エチレングリコールエーテル)9(Thesit（登録商標）)MW 582.9；約9-10エチレンオキシド単位を有するオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物(Triton X-100（登録商標）)；約7-8エチレンオキシド単位を有するオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物(Triton X-114（登録商標）)；トリス(2-ヒドロキシエチル)アミン(トロラミン)；及び乳化ワックスが挙げられる。
或るアジュバント組成物の場合、アジュバントはサイトカインである。本発明の組成物は、1つ又は2つ以上のサイトカイン、ケモカイン、又はサイトカイン及びケモカインの生成を誘発する化合物、又は1つ又は2つ以上のサイトカイン、ケモカイン、又はサイトカイン及びケモカインの生成を誘発する化合物をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。一例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、コロニー刺激因子(CSF)、エリスロポエチン(EPO)、インターロイキン2(IL-2)、インターロイキン3(IL-3)、インターロイキン4(IL-4)、インターロイキン5(IL-5)、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン7(IL-7)、インターロイキン8(IL-8)、インターロイキン10(IL-10)、インターロイキン12(IL-12)、インターロイキン15(IL-15)、インターロイキン18(IL-18)、インターフェロン・アルファ(IFNα)、インターフェロン・ベータ(IFNβ)、インターフェロン・ガンマ(IFNγ)、インターフェロン・オメガ(IFNω)、インターフェロン・タウ(IFNτ)、インターフェロン・ガンマ誘導因子I(IGIF)、形質転換成長因子ベータ(TGF-β)、RANTES(活性化時に調節され、発現されて推定上分泌される正常T細胞)、マクロファージ炎症タンパク質(例えばMIP-1アルファ及びMIP-1ベータ)、Leishmania延長開始因子(LEIF)、及びFit-3リガンドが挙げられる。
本発明の或る組成物の場合、ポリヌクレオチド構造は、((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(syn-9-テトラデセンイルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)(GAP-DMORIE)を含むアジュバント組成物と複合することができる。この組成物は、1つ又は2つ以上の共脂質、例えば1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPyPE)、及び/又は1,2-ジミリストイル-グリセル-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)を含むこともできる。GAP-DMORIEとDPyPEとを1:1のモル比で含むアジュバント組成物は、Vaxfectin（登録商標）と呼ばれる。例えば国際公開第00/57917号パンフレットを参照されたい(この内容全体を参考のため本明細書中に引用する)。
抗原に対する免疫応答を増大するアジュバントの能力は、典型的には、免疫の介在による保護の有意な増大によって明示される。例えば体液性免疫の増大は、典型的には、抗原に対して引き起こされる抗体の力価を有意に増大させることによって明示され、またT-細胞活性の増大は、典型的には、増大した細胞増殖、増大したサイトカイン生成及び/又は抗原特異的細胞溶解活性において明示される。アジュバントは、例えば、Th2応答をTh1応答に変化させることにより、免疫応答を変えることもできる。
本発明の核酸分子及び/又はポリヌクレオチド、例えばpDNA、mRNA、線状DNA又はオリゴヌクレオチドを、種々の緩衝液のいずれかにおいて可溶化することができる。好適な緩衝液は例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、正常食塩水、Tris緩衝液、及びリン酸ナトリウム(例えば150mMリン酸ナトリウム)を含む。不溶性ポリヌクレオチドを弱酸又は弱塩基中に可溶化させ、次いで緩衝剤で所望の容積まで希釈することができる。緩衝液のpHは必要に応じて調節することができる。加えて、製薬上許容可能な添加剤を使用することにより、好適なオスモル濃度を提供することができる。このような添加剤は当業者の視野に含まれる。in vivoで使用される水性組成物に関しては、発熱物質なしの滅菌水を使用することができる。このような配合物は、適量の水溶液と一緒に効果的な量のポリヌクレオチドを含有することになり、これによりヒトへの投与に適した製薬上許容可能な組成物が調製される。
本発明の組成物を周知の方法によって調製することができる。好適な調製法は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版、A. Osol編、Mack Publishing Co., Easton, PA(1980)、及びRemington's Pharmaceutical Sciences, 第19版、A.R. Gennaro編、Mack Publishing Co., Easton, PA(1995)(これら双方の内容全体を参考のため本明細書中に引用する)に記載されている。組成物は水溶液として投与することができるが、エマルジョン、ゲル、溶液、懸濁液、凍結乾燥形態、又は当業者に知られた任意の他の形態として調製することもできる。加えて、組成物は、例えば希釈液、バインダー、安定剤及び保存剤を含む製薬上許容可能な添加物を含有することができる。
下記実施例は、説明を目的としたものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。実施例に引用された全ての参考文献全体を参考のため、本明細書中に引用する。
実施例
材料及び方法
下記材料及び方法を、本明細書中に開示された実施例全てに全般的に適用する。特定の材料及び方法を必要に応じて各実施例において開示する。
本発明の実施に際して、特に断りのないかぎり、細胞生物学、細胞培養、分子生物学(PCRを含む)、ワクチン学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学のコンベンショナルな技術を採用する。これらの技術は当業者の技術範囲内に含まれる。このような技術は文献において十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual、第2版、Sambrook他編、Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989)；DNA Cloning、第I及びII巻(D.N.Glover編、1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait編、1984)；Mullis他、米国特許第4,683,195号明細書；Nucleic Acid Hybridization (B.D. Harnes & S. J. Higgins編、1984)；Transcription And Translation (B.D. Harnes & S. J. Higgins編、1984)；Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guid To Molecular Cloning (1984)；学術論文Method In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J. H. Miller and M. P. Calos編、1987、Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology, 第154及び155巻(Wu他編)、Immunochemical Metods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker編、Academic Press, London, 1987)；及びAusubel他、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989)を参照されたい。
遺伝子構造
本発明の構造は、標準的な分子生物学技術を用いて、本明細書中又は当業者において提供された配列情報に基づいて構成される。これらの分子生物学技術は下記のものを含む。先ず、それぞれ80-90ヌクレオチド長の、構造の長さにわたる一連の相補オリゴヌクレオチド対が、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニール時に、付着末端を含有する80-90塩基対の二本鎖断片を形成するように合成される。それぞれのオリゴヌクレオチド対の一本鎖末端は、隣接するオリゴヌクレオチド・デュプレックスの一本鎖末端とアニールするように設計される。このように調製されたいくつかの隣接するオリゴヌクレオチド対は、アニールすることを可能にされ、ほぼ5〜6つの隣接オリゴヌクレオチド・デュプレックス断片が次いで、付着単鎖末端を介してアニールし合うのを可能にされる。この一連のアニール済オリゴヌクレオチド・デュプレックス断片は一緒にライゲートし合わせれ、そして好適なプラスミド、例えばInvitrogen Corporation, Carlsbad, CAから入手可能なTOPO（登録商標）ベクター内にクローニングされる。次いでこの構造は標準的な方法によって配列決定される。ライゲートし合わされた5〜6つの80-90塩基対断片、すなわち約500塩基対の断片を含む構造がこのように調製され、所望の配列全体が一連のプラスミド構造内に示されるようになる。次いで、これらのプラスミドの挿入体を好適な制限酵素で切断し、そしてライゲートし合わせることにより、最終構造が形成される。次いで、最終構造が標準細菌クローニング・ベクター内にクローニングされ、そして配列決定される。或いは、当該遺伝子を増幅させるPCRプライマーを使用して、HCMV感染済細胞(例えば、American Type Culture Collection, Manassas, VAから入手可能なATCC寄託番号CCL-171のMRC-5細胞)から、野生型配列を直接的にクローニングすることができる。本明細書中で言及されたオリゴヌクレオチド及びプライマーは、本明細書中及び当業者において提供された配列情報に基づいて、当業者であれば容易に設計することができ、そして数多くの商業的なヌクレオチド供給元のいずれか、例えばRetrogen, San Diego, CA及びGENEART(ドイツ国Regensburg)によって合成することができる。
プラスミド・ベクター
本発明の構造を、真核発現ベクターV10551内に挿入した。ベクターは、改質pUC18バックグラウンド上で形成され(Yanisch-Perron, C.,他, Gene 33:103-119(1989))、そしてカナマイシン耐性遺伝子、ヒト・サイトメガロウィルス前初期1プロモーター/エンハンサー及びイントロンA、及びウシ成長ホルモン転写終止シグナル、及び外来遺伝子を挿入するためのポリリンカーを含有する。Hartikka, J.他、Num. Gene Ther. 7:1205-1217(1996)を参照されたい。しかし、商業的に入手可能なその他の真核発現ベクターを本発明に使用することもできる。これらのベクターの一例としては、プラスミドpcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、及びpZeoSV2(Invitrogen, San Diego, CAから入手可能)、及びプラスミドpCI(Promega, Madison, WIから入手可能)が挙げられる。
プラスミドDNA精製
プラスミドDNAをEsherichia coli DH5α能力細胞中に形質転換し、そして高精製された、共有結合により閉じられた環状プラスミドDNAを、改質溶解手順によって分離し(Horn, N.A.他、Hum. Gene Ther. 6:565-573(1995))、続いて、標準的な二重CsCl-エチジウムブロミド勾配超遠心分離を施した(Sambrook他、Molecular Cloning A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989))。或いは、Qiagen(Valencia, CA)製のGigaカラムを使用して、キット指示書に従って、プラスミドDNAを調製した。全てのプラスミド調製物には、ゲル分析及びビシンコニン酸タンパク質アッセイ(Pierce Chem. Co., Rockford IL)に基づいて、検出可能な染色体DNA、RNA及びタンパク質の不純物はなかった。Limulusアメーバ状細胞溶解物アッセイ(LAL、Associates of Cape Cod, Falmouth, MA)を使用して内毒素レベルを測定し、このレベルは、プラスミドDNA 1mg当たり0.6内毒素単位を下回った。DNA溶液の分光光度A260/A280比は、典型的には1.8を上回った。プラスミドは、好適な溶液、例えば150mMリン酸ナトリウム(他の好適な賦形剤及び助剤に関しては、2002年2月14日付けで発行された米国特許第20020019358号明細書を参照されたい)中に沈澱され再懸濁されたエタノールであった。DNAを使用するまで-20℃で保存した。300mM塩溶液と混合することにより、そして適量のUSP水を添加することにより、DNAを希釈して、所望のモル濃度で所望の塩中の1mg/ml プラスミドDNAを得た。
哺乳動物セルラインにおけるプラスミド発現
American Type Culture Collection, Manassas, VAから入手可能な、良く特徴付けされたマウス・メラノーマ細胞系(UM-499としても知られているVM-92)中にプラスミドをトランスフェクトすることにより、発現プラスミドをin vitro分析した。良く特徴付けされた他のヒト細胞系、例えばMRC-5細胞(ATCC寄託番号CCL-171のMRC-5細胞)を使用することもできる。当業者によく知られた、カチオン系脂質に基づくトランスフェクション手順を使用して、トランスフェクションを実施した。他のトランスフェクション手順も当業者によく知られており、そして例えばエレクトロポレーション及び塩化カルシウム媒介性トランスフェクションを用いることができる(Graham F.L.及びA.J. van der Eb Virology 52:456-67(1973))。トランスフェクションに続いて、トランスフェクトされた細胞の細胞溶解物及び培養上澄みを評価して、HCMV抗原タンパク質の相対発現レベルを比較した。商業的に入手可能な抗pp65及び抗gBモノクローナル抗体(例えばResearch Diagnostics Inc., Flanders NJから入手可能な入手可能)を使用して、ウェスタン・ブロット及びELISAによって試料をアッセイし、これにより、発現された抗原の質及び量の双方を比較した。これに加えて、in vitroトランスフェクション・アッセイを用いて、HCMV pp65及びgBをコードするコドン最適化型コード領域を含む種々のプラスミドを混合することが、ヒト細胞中の発現レベルに与える効果を見極めた。
種々のポリヌクレオチド構造をトランスフェクトされたヒト細胞に由来する発現生成物を、分子量、及び免疫反応性抗原に関して試験した(すなわち、HCMV抗血清と反応させた)。加えて、発現プラスミドのそれぞれのクラス(例えば野生型対ヒト・コドン最適化型；切断型対完全長型)の発現レベル(細胞内及び細胞外)の比較を行った。
プラスミドDNAの注射
拘束された覚醒マウス(例えばHarlan Sparague Dawley, Indianapolis, INから入手可能な雌の週齢6-12のBALB/cマウス)の大腿四頭筋に、マイクロピペット・チップから切り取られたプラスチック・カラーを備えた、使い捨て式滅菌プラスチック・インスリン・シリンジ及び28G 1/2針(Becton-Dickinson, Franklin Lake, NJ, カタログ番号329430)(これらは全て既述の通りである(Hartikka, J.他、Num. Gene Ther. 7:1205-1217(1996))を使用して注射した。マウスの大腿直筋に左右対称に、塩溶液(例えば150mM リン酸ナトリウム又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS))中に調製された25μgのプラスミドDNA(1マウス当たり合計で50μg)、又は脂質を基剤とする送達系を注射した。
この研究中の動物の世話は、「Guide for the Use and Care of Laboratory Animals」、Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council, National Academy Press, Washington, D.C., 1996、並びにVical's Institutional Animal Care and Use Committeeに従う。
免疫相関
HCMVはヒト細胞にだけ感染させることができるが、Staczekによって概要が述べられているように、HCMV感染に対する信頼性の高い数多くの動物モデルが当業者に知られており、また、これらの動物モデルは本発明の方法と一緒に用いることにより、例えば免疫原性又は発現を試験することができる(Staczek, J. Microbiol. Rev 54:247-65(1990))。例えば、トランスジェニック・ヒト白血球抗原(HLA) A*0201.Kbマウス・モデルを使用することができる(Gallez-Hawkins, G.他、Scand J Immunol 55:592-8(2002))。垂直HCMV感染のマウス・モデルがTang他において記載されている(Tang, JL他、Arch Virol 147:1189-95(2002))。免疫不全SCID又はヌードマウス上に埋め込まれたヒト組織に感染するいくつかのモデルが記載されている(Bidanset, DJ他、J Infect Dis 184:192-5(2001)；Pari, GS.他、J Infect Dis 177:523-8(1998)；Mocarsiki, ES.他 Proc Natl Acad Sci. USA 90:104-8(1993))。胸腺欠損マウスを使用することにより、HCMVを用いてサイトメガロウィルス性網膜炎がモデル化されている(Laycock, KA他、Am J Ophthalmol 124:181-9(1997))。加えて、HCMV感染を模倣するための、動物サイトメガロウィルスを使用した動物モデルが記載されている。これらの動物モデルは、アカゲザルがアカゲザル・サイトメガロウィルスに感染させられた霊長類モデル、及びマウス・サイトメガロウィルスに感染させられたマウス・モデルを含む(Sequar, G他、J Virol 76:7661-71 (2002)；Lockridge, KM他、J. Virol 73:9576-83(1999)；Minamishima, Y.他、Microbiol Immunol 22:693-700(1978))。
実施例1
キナーゼ部位が欠失したヒト・サイトメガロウィルスpp65をコードする、最小ヒト・コドン最適化型pp65コード領域を含む単離（分離型）ポリヌクレオチドの構成
VCL-6368は、上記発現ベクターVR10551内にクローニングされたヒトCMV抗原pp65の最適化形及び突然変異形をコードする。このプラスミドは、557アミノ酸タンパク質(SEQ ID NO:6)をコードする。このタンパク質の場合、ヒトCMV pp65抗原のアミノ酸Arg435-Lys438が欠失させられている。ヒトにおいて稀にしか使用されない5つのコドンを、より頻繁に使用される対応コドンに変化させることにより、このコード配列をヒトにおける発現に関して最小最適化した。5つのコドン及び変化は次の通りである：Ala GCGからGCCへ、Arg CGTからCGCへ、Pro CCGからCCC及びCCAへ、Ser TCGからTCCへ、そしてThr ACGからACCへ。最適化された配列はSEQ ID NO:5である。
Retrogen Inc.(San Diego)で合成された最適化型hCMV pp65プラスミドのPCR増幅によって、VCL-6368のpp65delArg435-Lys438挿入体を2つのステップで構成した。プライマー・セットT7(Invitrogen カタログ番号N650-02)(SEQ ID NO:21)及び65-デルタ-rev(SEQ ID NO:22)を使用して、TOPO-hCMV-opti-pp65プラスミド(Retrogen Inc.製品番号8041-8081-4)をExpand DNAポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)で増幅し、そして、その結果生じた生成物を1330 bp断片としてゲル精製した。プライマー・セットM13rev(Invitrogen カタログ番号18430017)(SEQ ID NO:23)及び65-デルタ-for(SEQ ID NO:24)を使用して、オーバーラップする400bp断片を、同じ親TOPOプラスミドから増幅し、そして生成物をゲル精製した。2つのPCR断片のそれぞれ10μlを第2PCR反応において合体させ、そしてT7(SEQ ID NO:21)及びM13rev(SEQ ID NO:23)で増幅し、そして1704bp断片をゲル精製した。この断片を、制限酵素Avr II及びNhe Iで切断し、同様に消化されたプラスミド主鎖DNAとライゲートした。ライゲーション混合物をE.coli(Stratagene, INC.から入手可能なXL-2)中に形質転換し、そしてプライマーVR10051FOR(SEQ ID NO:25)及びhCMVpp65-R(SEQ ID NO:26)を使用して、組換えクローンに関してPCRによってスクリーニングした。いくつかのPCR陽性クローンを選んで配列決定した。ヒトCMV pp65抗原の正確なArg435-Lys438欠失形をコードする最小ヒト・コドン最適化型クローンを選択し、更なる分析のために使用した。
VM92細胞のトランスフェクションと、モノクローナル抗pp65抗体(ViroGen,ロット番号hCMV-pp65-4)を使用したウェスタン・ブロット分析によって、VR6368の発現が示された。予測サイズのタンパク質が上澄み及び細胞溶解物中に検出された。この構造が細胞内タンパク質をコードするとしても、有意な量が結局上澄みになる。このことは独自の、又は特に珍しい現象ではない。
実施例2
分泌ヒト・サイトメガロウィルス糖タンパク質Bをコードする、最小ヒト・コドン最適化型糖タンパク質Bコード領域を含む分離型ポリヌクレオチドの構成
VCL-6365は、上記発現ベクターVR10551内にクローニングされたヒトCMV抗原gBの分泌形をコードする。このプラスミドは、ヒトCMV gB抗原(SEQ ID NO:14)のアミノ酸1-713をコードする。ヒトにおいて稀にしか使用されない5つのコドンを、より頻繁に使用される対応コドンに変化させることにより、野生型gBコード配列(SEQ ID NO:11)のヌクレオチド1-2139を、ヒトにおける発現に関して最小最適化した。5つのコドン及び変化は次の通りである：Ala GCGからGCCへ、Arg CGTからCGCへ、Pro CCGからCCC, CCT及びCCAへ、Ser TCGからTCCへ、そしてThr ACGからACCへ。最適化された配列はSEQ ID NO:13である。
ヒトCMV gB抗原のアミノ酸1-713をコードする2160 pb合成型断片を、発現ベクターVR-10551内に挿入することにより、VR6365を構成した。具体的には、VR-10551を制限酵素Nhe I及びAvr IIで消化し、そして4.5kb線状ベクターをゲル生成した。Retrogen Inc.(San Diego、製品番号7981-8031(2)-1を)によって合成された分泌gB断片をコードする最小ヒト・コドン最適化型コード領域を、制限酵素Nhe I及びAvr IIで消化し、次いでその結果生じた2160 bp断片をゲル精製することにより、gB挿入体を得た。ベクター及び挿入断片をライゲートし合わせ、E.coli(Stratagene, Inc.から入手可能なXL-2)中に形質転換し、そしてプライマーVR10551F (SEQ ID NO:25)及びhCMVgB-R(SEQ ID NO:27)を使用して、組換えクローンに関してPCRによってスクリーニングした。正確なヌクレオチド配列を有するクローンをVR6365と指定した。このクローンは、発現ベクターVR10551のNhe I-Avr II部位内にクローニングされたヒトCMV抗原gBの分泌形をコードする。
精製プラスミドDNAを使用してマウス細胞系VM92にトランスフェクトすることにより、最小ヒト・コドン最適化型gBの分泌を見極めた。
トランスフェクト済VM92細胞から得られた上澄みをコーティングされたプレートを使用して、最小ヒト・コドン最適化型gBの分泌をELISAアッセイによって確認した。ポリクローナル抗gB血清及び商業的に利用可能な抗gBモノクローナル抗体(Research Diagnostics Inc., Flanders NJから入手可能)を用いて、発現及び分泌を視覚化した。
実施例3
ヒト・サイトメガロウィルスIE1をコードする、ヒト・コドン最適化型CMV IE1コード領域を含む分離型ポリヌクレオチドの構成
プラスミドVCL-6520は、発現ベクターVR-10551内に挿入されたヒトCMV IE1遺伝子のエクソン2及び4をコードする1236塩基対のヒト・コドン最適化型合成DNA構造を含む。ヒトCMV IE1遺伝子のエクソン2及び4の野生型配列は下記の通りである(SEQ ID NO:50)
VCL-6250構造内の挿入体を、GENEART(http://www.geneart.de/、ドイツ国 Regensburg)によって合成した。VCL-6250は下記の配列を有する(SEQ ID NO:28)：
EcoR5-BamHI IE1合成挿入体を分離し、そしてこれを上述の発現ベクターVR-10551内にライゲートすることにより、VCL-6250を構成した。具体的には、前記実施例に記載したようにVR-10551を制限酵素で消化し、そしてゲル精製した。ベクターと挿入体断片とをライゲートし合わせ、E. coli DH10B細胞(例えばInvitrogenから入手可能)中に形質転換した。下記表：
に従って合成されたプライマーを使用して、完全に配列決定した。
精製VCL-6250 DNAを使用してマウス細胞系VM92にトランスフェクトすることにより、IE1タンパク質の発現を見極めた。IE1の発現をウェスタン・ブロット・アッセイで確認した。商業的に利用可能な抗IE1モノクローナル抗体(Chemicon International, Temecula, CAから入手可能)で視覚化した。
実施例4
ワクチン配合物の調製
下記方法のそれぞれにおいて、本発明のHCMV抗原コード・プラスミドを、VF-P1205-02Aとして本明細書中で説明されたポロキサマー系と配合する。VF-P1205-02Aは、非イオン性ブロック・コポリマー、CRL 1005及びカチオン性界面活性剤BAK(塩化ベンザルコニウム50%溶液、Ruger Chemical Co. Inc.)から成るポロキサマー系送達系を意味する。配合物の各成分の具体的な最終濃度を下記方法において説明するが、これらの方法のいずれに関しても、各成分の濃度は、当業者によって知られた基本的な化学量論計算によって変化させることにより、所望の濃度を有する最終溶液を形成することができる。
例えば、CRL 1005の濃度を、例えばトランスフェクション効率、発現効率、又は免疫原性に応じて調節することにより、CRL1005最終濃度約1mg/ml〜約75mg/ml、例えば約1mg/ml、約2mg/ml、約3mg/ml、約4mg/ml、約5mg/ml、約6.5mg/ml、約7mg/ml、約7.5mg/ml、約8mg/ml、約9mg/ml、約10mg/ml、約15mg/ml、約20mg/ml、約25mg/ml、約30mg/ml、約35mg/ml、約40mg/ml、約45mg/ml、約50mg/ml、約55mg/ml、約60mg/ml、約65mg/ml、約70mg/ml又は約75mg/mlを達成する。
同様に、DNAの濃度も、送達されるべき配合物の量、患者の年齢及び体重、送達方法及び送達されるべき抗原の経路及び免疫原性を含む多くのファクターに応じて調節される。一般に、本発明の配合物は、プラスミド(又は他のポリヌクレオチド)最終濃度1ng/ml〜30mg/mlを有するように調節される。例えば、本発明の配合物は、プラスミド最終濃度約1ng/ml、約5ng/ml、約10ng/ml、約50ng/ml、約100ng/ml、約500ng/ml、約1μg/ml、約5μg/ml、約10μg/ml、約50μg/ml、約200μg/ml、約400μg/ml、約600μg/ml、約800μg/ml、約1mg/ml、約2mg/ml、約2.5mg/ml、約3mg/ml、約3.5mg/ml、約4mg/ml、約4.5mg/ml、約5mg/ml、約5.5mg/ml、約6mg/ml、約7mg/ml、約8mg/ml、約9mg/ml、約10mg/ml、約20mg/ml又は約30mg/mlを有するように調節される。
本発明の或る配合物は、プラスミドのカクテル、例えば本発明のプラスミドVCL-6365、VCL-6368、又はVCL-6520のうちの2つ又は3つ以上の混合物、及び任意には、その他のHCMV抗原をコードするコドン最適化型又は非コドン最適化型コード領域、例えばHCMV IE1の場合には抗原部分、及び/又は免疫促進タンパク質、例えばサイトカインをコードするプラスミドを含む。カクテル中に望まれる種々のプラスミドは、これらをその他の成分に添加する前に、PBS又はその他の希釈液中で合体させる。さらに、プラスミドは等しい比率でカクテル中に存在してよく、或いは、例えば抗原の相対発現レベル又はコード化抗原の相対免疫原性に応じて、比を調節することができる。このように、1つのプラスミドがその他のプラスミドに比べて多くカクテル中に含まれていてよいので、カクテル中の種々のプラスミドは等しい比率で、又は2倍又は3倍まで、又はそれ以上の比率で存在してよい。
さらに、BAKの濃度は、例えば所望の粒子サイズ及び改善された安定性に応じて調節することができる。事実、或る実施態様の場合、本発明の配合物は、CRL 1005及びDNAを含むが、しかしBAKを含まない。一般に、本発明のBAK含有配合物は、約0.05 mM〜約0.5 mMのBAK最終濃度を有するように調節される。例えば、本発明の配合物の最終BAK濃度は、約0.05 mM、0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM又は0.5 mMであってよい。
下記方法により生成された配合物の総容積は、比例的なサイズの装置を選択することにより、拡大又は縮小することができる。最後に、下記方法のいずれかを実施する際に、配合物の3つの成分であるBAK、CRL 1005及びプラスミドDNAを任意の順序で添加することができる。下記方法のそれぞれにおいて、「曇り点」という用語は、透明な溶液が曇ってくる際の、すなわち、溶液中に溶解された成分が溶液から析出し始めるときの温度シフト、又はその他の滴定における点を意味する。
A. 予混合された配合物の熱サイクル処理
この実施例では、総容積3.6 ml中、0.3 mM BAK、7.5 mg/ml CRL 1005、及び5 mg/mlのDNAを含む配合物の調製が説明される。成分を曇り点未満の温度で合体させ、次いで、図8に概要を示したプロトコルに従って、配合物に数回にわたって室温(曇り点を上回る温度)まで熱サイクル処理を施した。
1.28 mMのBAK溶液をPBS中で調製し、溶液846 μlを、磁気撹拌棒を備えた15ml丸底フラスコ内に入れ、そして、撹拌器/熱板(熱板はオフ)の頂部の氷浴内で、10分間にわたって、溶液を適度の速度で撹拌する。次いで、100μlの容積式ピペットを使用して、CRL 1005(27μl)を添加し、溶液を氷上でさらに60分間にわたって撹拌する。プラスミドVCL-6365及びVCL-6368、及び任意には、例えば付加的なHCMV抗原、例えばVLC-6520をコードする付加的なプラスミドを、PBS中で所望の比率で混ぜ合わせる。この実施例の場合、3.2 mg/ml VCL-6365及び3.2 mg/ml VCL-6368(6.4 mg/mlの総DNA)を含有する溶液2.73 mlを、5mlのピペットを使用して液滴状にゆっくりと、1分間にわたって撹拌溶液に添加する。この点での(氷上での)溶液は、ポロキサマーの曇り点未満にあるので透明であり、15分間にわたって氷上でさらに撹拌する。次いで氷浴を除去し、そして15分間にわたって周囲温度で溶液を攪拌することにより、ポロキサマーが曇り点を通過するのに伴って曇り溶液を生成する。
次いで、フラスコを氷浴内に戻し、そしてさらに15分間にわたって攪拌することにより、混合物がポロキサマー曇り点未満の温度で冷却されるのにつれて、透明溶液を生成する。氷浴を再び取り除き、そして溶液をさらに15分間にわたって周囲温度で攪拌する。曇り点を上回る温度で15分間、そして曇り点を下回る温度で15分間にわたって(合計で30分間)撹拌することを1熱サイクルと定義する。混合物にさらに6回サイクル処理を施す。結果として生じる配合物はただちに使用してよく、或いは、ガラス・バイアル内に入れ、曇り点未満の温度で冷却し、そして後で使用するために-80℃で凍結させてもよい。
B. 増大した濃度のCRL 1005を用いた、予混合済配合物の熱サイクル処理、希釈及び濾過
この実施例では、最終容積4.0ml中に0.3 mM BAK、34 mg/ml又は50 mg/ml CRL 1005、及び2.5 mg/mlのDNAを含む配合物の調製が説明される。成分を曇り点未満の温度で合体させ、次いで、図9に概要を示したプロトコルに従って、配合物に数回にわたって室温(曇り点を上回る温度)まで熱サイクル処理を施し、これを希釈し、そして濾過した。
プラスミドVCL-6365及びVCL-6368、及び任意には、例えば付加的なHCMV抗原、例えばVLC-6520をコードする付加的なプラスミドを、PBS中で所望の比率で混ぜ合わせる。34 mg/ml CRL 1005を含有する配合物の場合、約3.2 mg/ml VCL-6365及び約3.2 mg/ml VCL-6368(約6.4 mg/mlの総DNA)を含有する溶液1.55 mlを、磁気撹拌棒を備えた15ml丸底フラスコ内に入れ、また50 mg/ml CRL 1005を含有する配合物の場合、約3.2 mg/ml VCL-6365及び約3.2 mg/ml VCL-6368(約6.4 mg/mlの総DNA)を含有する溶液1.52 mlを、磁気撹拌棒を備えた15ml丸底フラスコ内に入れ、そして、撹拌器/熱板(熱板はオフ)の頂部の氷浴内で、10分間にわたって、溶液を適度の速度で撹拌する。次いで、100μlの容積式ピペットを使用して、CRL 1005(最終濃度が34 mg/mlの場合には68μl、及び最終濃度が50 mg/mlの場合には100μl)を添加し、溶液を氷上でさらに30分間にわたって撹拌する。BAKの1.6 mM溶液をPBS中で調製し、次いで375 μlを、1mlのピペットを使用して液滴状にゆっくりと、1分間にわたって撹拌中の34 mg/ml又は50 mg/ml混合物に添加する。この点での溶液は、ポロキサマーの曇り点未満にあるので透明であり、30分間にわたって氷上でさらに撹拌する。次いで氷浴を除去し、そして15分間にわたって周囲温度で溶液を攪拌することにより、ポロキサマーが曇り点を通過するのに伴って曇り溶液を生成する。
次いで、フラスコを氷浴内に戻し、そしてさらに15分間にわたって攪拌することにより、混合物がポロキサマー曇り点未満の温度で冷却されるのにつれて、透明溶液を生成する。氷浴を再び取り除き、そして溶液をさらに15分間にわたって攪拌する。曇り点を上回る温度で15分間、そして曇り点を下回る温度で15分間にわたって(合計で30分間)撹拌することを1熱サイクルと定義する。混合物にさらに2回サイクル処理を施す。
そうしているうちに、それぞれが0.22 μmのMillipore Express（登録商標）膜(Millipore、カタログ番号SCGP00525)を有する2つのSteriflip（登録商標）50ml 使い捨て式真空濾過装置をアイスバケット内に入れるとともに、真空ラインを取り付け、そして1時間にわたって放置して、装置が氷の温度に対して平衡するようにしておく。次いで、ポロキサマー配合物をPBSで2.5 mg/ml DNAまで希釈し、そして真空下で濾過する。
結果として生じる配合物はただちに使用してよく、或いは、ガラス・バイアル内に移し、曇り点未満の温度で冷却し、そして後で使用するために-80℃で凍結させてもよい。
C. 熱サイクル処理なしの単純化された方法
この実施例では、総容積3.6 ml中に0.3 mM BAK、7.5 mg/ml CRL 1005、及び5 mg/mlのDNAを含む配合物の単純化された調製が説明される。成分を曇り点未満の温度で合体させ、次いで、図10に概要を示したプロトコルに従って、配合物を単に濾過し、次いで使用又は保存する。
0.77 mMのBAK溶液をPBS中で調製し、溶液780 μlを、磁気撹拌棒を備えた15ml丸底フラスコ内に入れ、そして、撹拌器/熱板(熱板はオフ)の頂部の氷浴内で、15分間にわたって、溶液を適度の速度で撹拌する。次いで、100μlの容積式ピペットを使用して、CRL 1005(15μl)を添加し、溶液を氷上でさらに60分間にわたって撹拌する。プラスミドVCL-6365及びVCL-6368、及び任意には、例えば付加的なHCMV抗原、例えばVLC-6520をコードする付加的なプラスミドを、PBS中で所望の比率で混ぜ合わせる。この実施例の場合、約4.1 mg/ml VCL-6365及び約4.2 mg/ml VCL-6368(約8.3 mg/mlの総DNA)を含有する溶液約1.2 mlを、5mlのピペットを使用して液滴状にゆっくりと、1分間にわたって撹拌溶液に添加する。この点での(氷上での)溶液は、ポロキサマーの曇り点未満にあるので透明であり、そして15分間にわたってさらに攪拌する。
そうしているうちに、それぞれが0.22 μmのMillipore Express（登録商標）膜(Millipore、カタログ番号SCGP00525)を有する2つのSteriflip（登録商標）50ml 使い捨て式真空濾過装置をアイスバケット内に入れるとともに、真空ラインを取り付け、そして1時間にわたって放置して、装置が氷の温度に対して平衡するようにしておく。次いで、ポロキサマー配合物を真空下で、曇り点未満の温度で濾過し、次いで曇り点を上回る温度で温めておいた。結果として生じる配合物はただちに使用してよく、或いは、ガラス・バイアル内に移し、曇り点未満の温度で冷却し、そして後で使用するために-80℃で凍結させてもよい。
実施例5
動物免疫化
実施例1、2及び3に記載されたコドン最適化型ポリヌクレオチド、及び任意には、実施例4に記載されたコドン最適化型ポリヌクレオチドのうちの1つ又は2つ以上によってコードされた発現生成物の免疫原性を、免疫応答をin vivoで開始するそれぞれのプラスミドの能力に基づいて評価する。単一の構造並びに多数の構造を注射することによって、プラスミドを個別に、そして組み合わせで試験する。動物、例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、霊長類、又は他の好適な動物において、筋内(IM)注射により、免疫化を最初に行う。免疫化動物から血清を捕集し、そして免疫応答を定量する。免疫原性の試験はさらに、抗体力価の測定、抗体力価の中立化、T細胞サイトカイン生成、及びT細胞の細胞溶解活性を含む。ヒトにおける保護レベルとの相関は、当業者によってよく知られた方法に従って行われる。上記「免疫相関」を参照されたい。
A. DNA調製
実施例4に記載された方法のいずれかによって、プラスミドDNAを調製する。或いは、プラスミドDNAを上記のように調製し、そして、4:1 のDNA：脂質質量比のトランスフェクション促進カチオン性脂質、例えばDMRIE/DOPEと伴う又は伴わないPBS中に約0.1 mg/ml〜約10 mg/ml、好ましくは約1 mg/mlの濃度で溶解させる。別のDNA配合物は、PBSの代わりの150mM リン酸ナトリウム、アジュバント、例えばVaxfectin（登録商標）(4:1のDNA: Vaxfectin（登録商標）の質量比)、2% 油(スクアレン)-Tween 80-水中のS. minnesota(MPL)及びトレハロースジコリノミコレートAF (TDM)(MPL + TDM, Sigma/Aldrich, St. Louis, MOから入手可能、(カタログ番号M6536))に由来するモノ-ホスホリル脂質A(解毒された内毒素)、可溶化モノ-ホスホリル脂質A配合物(AF、Corixaから入手可能)、又は(±)-N-(3-アセトキシプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(オクチルオキシ)-1-プロパンアミニウムクロリド(化合物番号VC1240)(Shriver, J.W.他、Nature 415:331-335(2002)、及び国際公開02/00844号パンフレット参照、これらのそれぞれの全体を参考のため、本明細書中に引用する)。
B. 動物免疫化
分泌されたgB及びpp65をコードするコドン最適化型DNAプラスミド、及び野生型DNAプラスミド、及び上述のような突然変異体を、PBS中のDNAとして、又はポロキサマー系送達系：3 mg/ml DNA、34又は50 mg/ml CRL 1005、及び0.3 mM BAKと配合されたDNAとして、BALB/cマウス内に単一プラスミドとして注射する。隔週のインターバルで3回、10匹のマウスから成る群を免疫化し、そして血清を得ることにより、抗原のそれぞれに対する抗体力価を見極める。3つのプラスミドのそれぞれを等しい質量で含有する3価調製物でマウスが免疫化される群も含まれる。それぞれのプラスミドの研究デザインを表10に示し、そして典型的な免疫プロトコルを表11に示す。
組換えタンパク質及びトランスフェクション上澄み及びトランスフェクト済VM-92細胞からの溶解物又はウィルス感染済細胞溶解物を用いたELISAにより、血清抗体力価を見極める。
C. 動物におけるHCMV pp65及びgB抗血清の生成
上述の免疫化スキームに従って、HCMV pp65、gB、IE1をコードするプラスミドDNA、又はその断片、変異体又は誘導体を調製し、そしてこれを、ポリクローナル抗体を生成するのに適した動物中に注射する。血清を捕集し、そして上述のように抗体を滴定する。免疫化動物から得られた血清中の抗HCMVペプチド抗体の力価は、例えば、当業者に知られた方法に従って、固体支持体上のペプチドに吸着させること、又は選択された抗体を溶離することによって増大させることができる。
ハイブリドーマ技術を用いて、モノクローナル抗体を生成する(Kohler他、Nature 256:495(1975)；Kohler他、Eur. J. Immunol. 6:511(1976)；Kohler他、Eur. J. Immunol. 6:292 (1976)；Hammerling他、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., (1981)、第563-681頁、これらのそれぞれの全体を参考のため本明細書中に引用する)。一般に、このような手順は上記の動物(好ましくはマウス)を免疫化することを伴う。抗HCMV pp65、gB抗体、又はIE1抗体と結合するキャパシティによって、好適な細胞を認識することができる。このような細胞は、任意の好適な組織培地中で培養することができるが、しかし、10%ウシ胎仔血清(約56℃で不活性化)と、約10 g/lの非必須アミノ酸と、約1,000 U/mlのペニシリンと、約100g/mlのストレプトマイシンとを補足されたEarleの変性Eagle培地中で細胞を培養するのが好ましい。このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして好適な骨髄腫細胞系と融合する。本発明に従って任意の好適な骨髄腫細胞系を採用することができるが、American Type Culture Collection, Rockville, Marylandから入手可能な親骨髄腫細胞系(SP2/0)を採用することが好ましい。融合後、結果として生じるハイブリドーマ細胞をHAT培地内で選択的に維持し、そして次いで、Wands他、Gastroenterology 80:225-232(1981)(この内容全体を参考のため本明細書中に引用する)によって記載されたような限界希釈法によってクローニングする。このような選択を通して得られたハイブリドーマ細胞を次いでアッセイすることにより、HCMV pp65又はgBと結合することができる抗体を分泌するクローンを同定する。
或いは、抗イディオタイプ抗体を使用することによって、HCMV PP65又はgBと結合することができる付加的な抗体を、2ステップ手順で生成することもできる。このような方法は、抗体自体が抗原であり、従って第2の抗体に結合する抗体を得ることが可能である、という事実を利用する。この方法に従えば、HCMV PP65又はgB特異的抗体を使用して、動物、好ましくはマウスを免疫化する。次いでこのような動物の脾細胞を使用することにより、ハイブリドーマ細胞を生成し、そしてハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、HCMVタンパク質特異的抗体に結合する能力がHCMV PP65又はgBによってブロックできるような抗体を生成するクローンを同定する。このような抗体は、HCMVタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてこのような抗体を使用して動物を免疫化することにより、更なるHCMV PP65又はgB特異的抗体の形成を誘発することができる。
言うまでもなく、Fab及びF(ab')2、及び本発明の抗体のその他の断片を本明細書中に開示された方法に従って使用することができる。このような断片は典型的には、酵素、例えばパパイン(Fab断片を生成するため)又はペプシン(F(ab')2断片を生成するため)を使用して、タンパク質分解的切断によって生成される。或いは、HCMV PP65又はgB結合断片は、組換えDNA技術の適用、又は合成化学によって生成することもできる。
「ヒト化」されたキメラ・モノクローナル抗体を使用することが好ましい場合がある。このような抗体は、上述のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞から誘導された遺伝子構造を使用して生成することができる。キメラ抗体を生成する方法は当業者に知られている。検討に当たっては、Morrison, Science 229:1202(1985)；Oi他、BioTechniques 4:214(1986)；Cabilly他、米国特許第4,816,567号明細書；Taniguchi他、欧州特許第171496号明細書；Morrison他、欧州特許第173494号明細書；Neuberger他、国際公開第86/01533号パンフレット；Robinson他、国際公開第87/02671号パンフレット；Boulianne他、Nature 312:643 (1984)；Neuberger他、Nature 314:268(1985)を参照されたい。
これらの抗体は例えば診断アッセイにおいて、検査試薬として使用され、或いは、動物をさらに免疫化することにより、HCMV特異的抗イディオタイプ抗体を生成するために使用される。抗HCMV抗体のために使用する例としては、ウェスタン・ブロット、ELISA(競合、サンドイッチ及び直接)、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、凝集アッセイ、免疫拡散、免疫電気泳動、及びエピトープ・マッピングにおいて使用することを含む(Weir, D.編、Handbook of Experimental Immunology、第4版、第I及びII巻、Blackwell Scientific Publications (1986))。
実施例6
HCMV pp65及びgB、及びその断片、変異体及び誘導体をコードする構造のmRNA発現のリアルタイムRT-PCR定量分析
HCMV pp65及びgB及びIE1構造から発現されたmRNAレベルの定量は、遺伝子活性に対する価値の高い生物学的マーカーである。種々の方法、例えばノーザン・ブロット、スロット・ブロット、及び当業者に知られたその他の技術を用いて、mRNAのレベルを測定することができる。しかし、リアルタイムRT-PCRに基づく迅速法が、遺伝子活性をモニタリングするための効率的な信頼性の高い手段をもたらす。このような1つのシステムは、ABI PRISM（登録商標）配列検出システムとともに使用されるTaqMan（登録商標）RT-PCRアッセイである。これらは両方とも、Applied Biosystem, Inc.(Foster City, CA)から入手可能である。
手短に言えば、コンベンショナルな技術又は商業的に利用可能な技術を用いて、RNAを抽出する。抽出後、RNAを光学的に透明な管内にアリコートするか、或いは好適なキット、例えばTaqMan（登録商標）Gold RT-PCR Kit(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)とともに提供される添付の緩衝液、酵素、及び試薬を含有するマイクロタイター・プレートのウェル内にアリコートする。加えて、構造特異的なプライマー及びプローブを添加する。これらのプライマー及びプローブは、本明細書中に記載された配列に基づいて、当業者によって設計することができ、或いは商業的に、例えばABI PRISM（登録商標） Primers & TaqMan（登録商標） プローブ合成サービス(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)によって設計することができる。ABI PRISM（登録商標）配列検出システム内に試料を入れる。このシステムは、プローブ上に存在するフルオロフォアを励起させることができるレーザーにカップリングされた熱サイクラー、及び好適な検出システムである。最初に、RNAをDNAに逆転写し、次いで反応溶液中に含有される熱安定性DNAポリメラーゼ及び配列特異的プライマーは、温度制御された増幅サイクルを開始する。増幅生成物の検出のために使用されるプローブには、低エネルギー・フルオロフォア(レポーター)及び高エネルギー・フルオロフォア(クエンチャー)とを標識付けする。クエンチャーは、これが蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)によってレポーターと密接に連携する場合、レポーターの放射が検出されるのを防止する。反応サイクル開始時、プローブは過剰であるので、大部分がハイブリッド形成されずに無傷のままであり、その結果としてシグナルを生じさせない。しかし、DNA生成物が蓄積するのにつれて、DNAに結合されるプローブの比率は高くなる。結合されたプローブを次いで、増幅のために使用されるDNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によって分解する。DNAポリメラーゼはクエンチャーからレポーターを放出し、検出可能なシグナルを形成する。PCR反応が進み、増幅生成物が蓄積するにつれて、プローブの大部分が分解され、記録されるより大きなシグナルを誘発する。シグナル(Ct)を検出するのに必要な増幅サイクル数は、開始鋳型又は構造mRNAの量に対して正比例する。既知量のRNAで開始する試料と対照との間でCt値を比較することによって、HCMV構造を含有するプラスミドをトランスフェクトされた細胞内で発現されたmRNAの量を計ることが可能である。http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/(2002年11月5日付け訪問)におけるApplied Biosystem, Inc.の指導書「Real-Time PCR Vs. Traditional PCR」を参照されたい。その他のリアルタイム検出システムは、「分子ビーコン(Molecular Beacon)」プローブを含む。例えば、Kramer及びTyagiの米国特許第6,103,476号明細書を参照されたい(これを参考のため、本明細書中に引用する)。
in vitro研究のために、最適な細胞を24ウェル組織培養プレート内に播種する。細胞が好適な細胞密度になると、コドン最適化型及び非コドン最適化型のHCMV構造又は好適な対照、例えばHCMV構造を有さないプラスミド主鎖を含有する負の対照を使用して、細胞にトランスフェクトする。トランスフェクション後の種々の時点で、4M グアニジニウムチオシアネートを用いてRNA抽出のために細胞を捕集し、続いてフェノール抽出を行う。in vivo研究から捕集された細胞も、RNA抽出のために使用する。試料の吸光度を260nmで測定することにより、抽出された総RNAを定量し、TaqMan（登録商標）キット指示書(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)に従って希釈し、そして、緩衝液、ヌクレオチド及び必要な酵素を含有するリアルタイムPCRに適した386ウェル・プレート内にアリコートする。既知量の開始RNAを含有する対照をアッセイに含み、また任意には、内部標準を品質保証のために試料中に含むことができる。この内部標準は無関連の遺伝子生成物、通常は豊富な内在性RNAである。構造及び任意には内部標準に対して特異的なプライマー及びプローブも含まれる。プライマーを設計し、そしてコンベンショナルなPCRプライマーと同じように合成する。このことは当業者にとって日常的な作業である。再現性及び特異性を保証するために、複数のプライマー・セットを反応において使用する。これらのプライマー・セットはそれぞれ構造の種々異なる領域を標的とする。プライマーも同様に合成するが、しかしコンベンショナルな方法によって、フルオロフォア、例えばFAM及びTAMRAを共有結合する。反応は上述のように進み、そして結果として生じた試料のCt値を、対照のCt値と比較する。mRNAの開始量を、対照Ct値を用いて補間する。
mRNA定量後、mRNAレベルを、細胞内発現及び分泌発現の双方に関してタンパク質と相関する。組織培地から(又はin vivoで捕集された遠心分離済細胞の上澄みから)、トランスフェクション後の種々の時点において捕集する。加えて、好適な数の細胞を採取後、タンパク質抽出時に使用するために保持する。ウェスタン・ブロット、スロット・ブロット、ELISA及びその他のタンパク質定量技術を用いることにより、トランスフェクト済細胞によって生成されたHCMVタンパク質レベルを測定する。
実施例7
ヒトCMV抗原をコードする免疫原性プラスミドの実証
一般試験手順
下記実施例のための試験手順は上述の通りであり、本明細書中に記載されているような特定のパラメーター及び材料が採用される。
プラスミド
上述のように、本発明の構造を発現ベクターVR 10551中に挿入した。
VR 10551は、いかなるトランス遺伝子挿入体をも有さない発現ベクターである(HDMVプラスミドに対応する主鎖)。
VR 6365は、VR 10551発現ベクター内にクローニングされたヒトCMV gB(アミノ酸1-713)の分泌バージョンに対応するコード配列を含有する(図1)。Qiagenプラスミド精製キットを使用してDNAを調製し、そしてこれを特徴付けし、VF-P1205-02Aポロキサマー系送達系と配合した。
VR 6368は、VR 10551発現ベクター内にクローニングされた、推定上のキナーゼ・ドメインにおける残基435RKRK438が欠失させられた完全長HCMV pp65のコード配列を含有する(実施例2)。上述のように、Qiagenプラスミド精製キットを使用して、DNAを調製し、そしてこれを特徴付けし、VF-P1205-02Aポロキサマー系送達系と配合した。
ポロキサマー配合物
VF-P1205-02Aポロキサマー系送達系を、実施例4Bと同等のプロトコルを用いて調製し、この場合、DNA、ポロキサマー及びBAKの初期濃度はそれぞれ5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、0.3 mMであった。配合物を室温でPBSで希釈して、注射前の所要の試験濃度にした。
ワクチン接種計画
週齢6-8の9匹の雌BALB/cマウス(Harlan Sparague Dawley)から成る群が、PBS又は上述のCRL 1005ポロキサマー配合物と一緒に送達される、100μgのpp65 DNA、100μgのgB DNA、又は、それぞれ100μgのpp65 DNA及びgB DNAを含有する筋内(大腿直筋)注射を受容した。対照マウスは、100μgのpp65 DNA又は100μgのgB DNAを、PBS又はVF-P1205-02Aと一緒に送達される100μgの非コードベクターDNA(VR10051)と混合された状態で受容した。全てのマウスは、合計200μgのDNA、すなわち100μgのpp65 DNA及び100μgのgB DNAを含有するワクチン化接種を2回受容した(0日目及び13日目に投与)。第1回ワクチン接種後(11日目)及び第2回ワクチン接種後(22日目)に血清を捕集し、そして、gB特異的抗体及びpp65特異的抗体をそれぞれELISA及び免疫ブロット分析によって測定した。
組換えgB酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)
上記接種計画に従ってワクチン接種されたマウスから、血清を捕集した。組換えCMV gB酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)を用いて、抗gB IgG力価を見極めた。
96ウェル型の半部領域の高結合EIA(酵素免疫アッセイ)プレートに、ホウ酸緩衝生理食塩水(BBS)中の濃度0.05μg/ウェル(50μL/ウェル)の組換えCMV gBを4℃で一晩にわたってコーティングした。全てのインキュベーションのために接着プレート・シーラーでプレートを覆った。コーティング後、プレートを紙タオル上でブロットし、そして100μLのブロッキング緩衝液(BBS中0.1% [w/v]のBSA)を各ウェルに添加した。室温で2時間にわたってシール済プレートをインキュベートし、次いで、血清が希釈されるまで4℃で貯蔵した。エッペンドルフ管内のBBS中の0.5%(w/v) BSA中に血清を希釈し、そして反転させて短時間渦流形成することにより混合した。ブロックされたプレートをブロットし、そして100μLの希釈済血清を各ウェルに添加した。プレートをシールして一晩にわたって4℃でインキュベートした。次いで、BBS中の0.1%(v/v)Tween-20を用いて、自動プレート洗浄装置上でプレートを4洗浄サイクルで洗浄し、そして紙タオル上でブロットした。アルカリ性リン酸塩で標識付けされた抗マウスIgG Fc二次抗体を、BBS中の0.5%(w/v)BSA中で1/2000で希釈し、そして希釈された二次抗体80μLを各ウェルに添加した。プレートをシールし、そして室温で2時間にわたってインキュベートした。自動プレート洗浄装置上で4洗浄サイクルでプレートを再び洗浄し、そして紙タオル上でブロットした。50μLの展開溶液(50 mM重炭酸ナトリウム緩衝液、pH 9.8及び1mM MgCl2中の1mg/ml パラ-ニトロフェニルホスフェート)を各ウェルに添加し、プレートをシールし、そして室温でインキュベートした。405nmにおける吸光度A405(単一波長)をプレート・リーダー上で読む。免疫血清の平均吸光度値は、1:100の希釈率で、免疫前血清の平均吸光度値の2倍以上であった。
pp65を検出するための免疫ブロット
VR6368又はVR10551をトランスフェクトされたマウス・メラノーマVM92細胞から、1X NuPAGE LDS試料緩衝液中で直接的に溶解物を形成し、これらの溶解物を、必要になるまで-80℃で保存した。室温で解凍した後、0.5 MMジチオスレイトールの試料容積の10分の1を各試料に添加した。次いで、試料を10分間にわたって85℃で加熱し、そして、NuPAGE 4-12% Bis-Trisゲル上でのローディング前に、氷上で直ちに冷却した。室温で60分間にわたって、200Vで、電気泳動を実施した。タンパク質の移動のために、先ずポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜を30秒間にわたってメタノール中に浸し、次いで20%(v/v)メタノールを含有する1X NuPAGE移動緩衝剤中で平衡させた。室温で60分間にわたって、タンパク質をゲルからPVDF膜へ移動させた。タンパク質移動後に、膜をmilli-Q water 中ですすぎ、次いでオービタル震盪器上においてBBS中1%(w/v)BSA中で、45分間にわたって室温でブロックした。ブロック後、24時間以下の時間にわたって、膜をBBS中1%(w/v)BSA中で4℃で貯蔵した。ブロットを分断してストリップを形成し、これらを、オービタル震盪器上において一晩にわたって室温で、BBS中0.5%(w/v)BSA中に希釈されたマウス免疫血清中でインキュベートした。BBS中で洗浄した後、ストリップを室温で2.5時間にわたって、二次抗体(アルカリ性ホスファターゼに接合されたヤギ抗マウスIgG Fcγ)中にインキュベートした。次いでストリップをBBS中で再び洗浄し、そして、室温で10分間にわたってアルカリ性ホスファターゼ基質溶液中で展開させた。次いでストリップを蒸留水中で十分にすすぎ、そして紙タオル間で室温で乾かしておいた。
上述のように、gBプラスミド(VR 6365)又はgB/pp65プラスミド複合体を、マウスにワクチン接種した。gBプラスミド(VR 6365)を単独で、又はpp65プラスミド(VR6368)との組み合わせでワクチン接種されたマウスにおける、2回のワクチン接種後に測定された抗-gB IgG力価を下記に示す。
VF-P1205-02Aを伴って又は伴わずに、HCMV gBを単独で又は組み合わせにおいてコードするプラスミドDNAをワクチン接種された全てのマウスは、2回にわたるDNA注射後に、検出可能な抗-gB IgG力価を有した。pp65 DNAだけを注射されたマウスの血清をプールし、そして試験した。pp65のみの群の結合活性は、前採血血清に対応する結合活性と同じであった。このことはgB特異的抗体が検出されないことを示す。
pp65免疫ブロット
第2DNAワクチン接種後に捕集されたマウス血清を、上述のようにpp65 プラスミド(VR 6368)をトランスフェクトされた細胞から得られた溶解物の免疫ブロットにおいて試験することにより、VR 6368単独をワクチン接種されたマウス、及びプラスミド複合体をワクチン接種されたマウスにおける抗体応答の差を定性的に見極めた。免疫ブロットの第1の集合の場合、VR 6368をワクチン接種されたマウスの各群からプールされた血清を、希釈率1:200、1:400、1:800、1:1000及び1:2000で試験した。VF-P1205-02A中で調製されたVR 6365(gB)をワクチン接種されたマウスからプールされた血清試料を、負の対照として含んだ。pp-65特異的マウス・モノクローナル抗体を正の対照として含んだ。各免疫ブロット・ストリップは、分子量標準のレーン、VR 6368をトランスフェクトされた細胞溶解物を含有するレーン、及びVR10551をトランスフェクトされた細胞溶解物対照レーンを有する。VF-P1205-02Aと配合されたpp65 DNAをワクチン接種された全てのマウス(9匹中9匹)が、1:200の希釈率で血清を試験したときに、免疫ブロットによってpp65に対する検出可能な抗体を有した。VF-P1205-02Aと配合された二価HCMVプラスミド・ワクチンをワクチン接種された9匹のマウス中6匹が、1:200の希釈率で試験したときに、免疫ブロットによってpp65に対する検出可能な抗体を有した。VF-P1205-02Aと配合されたpp65 DNAをワクチン接種されたマウス、又は、VF-P1205-02Aと配合された二価HCMVプラスミド・ワクチンをワクチン接種されたマウスからプールされた血清の免疫ブロット滴定は、群の間でpp65に対する抗体応答の際立った差を明らかにしなかった。gB DNA単独をワクチン接種されたマウス内に、検出されたpp65抗体はなかった。
こうして、プラスミドVR6365(gB)及びVR6368(pp65)は、単独又は組み合わせでのプラスミドの注射を2回にわたって受容したマウスにおける抗原特異性抗体の生成を誘発した。我々は、免疫ブロットを用いて抗pp65抗体応答を定量化することはできないが、マウスの大部分が、pp65に対する検出可能な抗体応答を有し、また、2つのプラスミドの組み合わせが、pp65に対する応答の完全な抑制をもたらさないことを示した。この研究におけるpp65に対する抗体応答は、VR6368のワクチン接種後に、このタンパク質がin vivoで生成されることを確認するための付加的な読み出しとして役立った。
pp65特異的IFN-γ ELISpotアッセイ
IFN-γ ELISpotアッセイによって、DNAコード化pp65に対するT細胞応答を見極めた。ワクチン接種済マウスの脾細胞を、オーバーラップするペプチドの2つの別個のプールで刺激した。これらのペプチドはともにpp65タンパク質全体にわたり、そして可能な全てのT細胞エピトープを含有するはずである。従って、ペプチド刺激に応答してIFN-γを生成するタイプのT細胞(例えばCD8+又はCD4+)は、このアッセイ法によって区別することはできない。理論上は、これらのペプチドは、クラスI又はクラスII MHCとの関連において提供され、こうして、同じ脾細胞調製物内部のCD8+T細胞及びCD4+T細胞双方を刺激することができる。
これらのアッセイの場合、抗原特異的スポットの数は通常、対照ウェル内の数よりも10倍超だけ多い。ペプチド・プールで刺激されたVR6368ワクチン接種済マウスから得られた脾細胞調製物中では、いずれもIFN-γ生成細胞が検出されたが、しかし、プールIIに応答する場合と比較してプールIに応答した場合に、ほぼ3倍も多いスポットが検出された。ペプチド・プールによる刺激に応答して、gBワクチン接種済マウスの脾細胞によって生成されたスポットは、いずれのペプチド・プールに関しても、ほとんど又は全くなかった。
これらのデータは、HCMV DNAワクチン成分pp65が、これがVF-P1205-02A配合物中で単独又は組み合わせで投与されると、細胞免疫応答を誘発するのに十分なレベルでin vivo発現されたことを実証する。
実施例8
ヒトCMV抗原をコードする免疫原性プラスミドの確認
一般試験手順
下記実施例のための試験手順は上述の通りであり、本明細書中に記載されているような特定のパラメーター及び材料が採用される。
プラスミド
上述のように、発現ベクターVR10551内に好適な挿入体を挿入することにより、本発明の構造VR6365及びVR6368を構成し、これらの構造を、上記ポロキサマー配合物VF-P1205-02A配合物と配合した。
ワクチン接種計画
週齢6-8の9匹の雌BALB/cマウス(Harlan Sparague Dawley)から成る群が、pp65、gB、又はpp65及びgBをコードするプラスミドDNAを、VF-P1205-02Aを伴って又は伴わずに含有する左右対称の筋内(大腿直筋)注射(50μl/脚)を、0、21及び49日目に受容した。各マウスはワクチン接種1回当たり200μgのDNAを受容した。単独のgB又はpp65コード・プラスミドを含有する配合物の場合、充填剤として役立つブランクDNA(VCL10551)100μgを含んだ。充填剤DNAの不在において、VF-P1205-02Aを伴って又は伴わずに送達される100μgの単一プラスミドDNAをマウスにワクチン接種することにより、ブランクDNAの効果を試験した。第1ワクチン接種前(-1日目)及び各ワクチン接種後(20, 48及び63日目)に、血清試料を捕集し、そしてgB特異的抗体をELISAによって測定した。
組換えgB酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)
ワクチン接種されたマウスから、血清を捕集し、そして実施例7で説明したように、組換えCMV gB酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)を用いて、抗gB IgG力価を見極めた。
VCL-6365を単独で、又はVCL-6368との組み合わせでワクチン接種されたマウスから得られた血清中の抗gB IgG力価を、以下に示す。
プラスミドVCL6365(gB)は、単独又は組み合わせでのプラスミドの注射を3回にわたって受容したマウスにおけるgB特異性抗体の生成を誘発した。VCL6365をワクチン接種された全てのマウスは、2回にわたるDNA注射後に、検出可能な抗-gB IgG力価を有した。これらのデータは、VCL-6365がVF-P1205-02A配合物中でVCL-6368との組み合わせで送達されたときの、in vivoでのgBプラスミド生成物の免疫原性を確証する。
実施例9
ヒトCMV IE1をコードするプラスミドは免疫原性である。
一般試験手順
下記実施例のための試験手順は上述の通りであり、本明細書中に記載されているような特定のパラメーター及び材料が採用される。
ワクチン接種計画
マウスは、IE1プラスミドVR6250の大腿直筋内への筋内注射を受容した。下に示すような総DNA投与量はそれぞれPBS中100μlの容積であるが、ただし、等容積の注射として2回にわたって投与され、1回の投与は、それぞれのマウスの各大腿直筋内に行われる。負の対照群は5匹のマウスを含み、そして他の全ての群は10匹の含んだ。マウスは0日目と14日目とに注射を受容した。ELISpotアッセイによって脾細胞を、IE1反応性に関して分析した。このアッセイの場合、オーバーラップする98個の15量体ペプチド(11個のアミノ酸だけオーバーラップ)のプールで、脾細胞を刺激した。これらのペプチドは、VR6250構造上でコードされるIE1タンパク質全体にわたる。負の対照群から脾細胞を24日目に採取し、そしてIE1ペプチド・プールによってIFN-γ分泌T細胞に与えられる非特異的な刺激を分析した。抗原特異的なIFN-γ分泌T細胞の分析のために、IE1 DNAを注射された群から、27-29日目に、脾細胞を採取した。各群からアッセイのために2つの脾臓をプールした。各群から2つのプールを27日目及び28日目に分析し、各群から1つのプールを29日目に分析した。下記に報告された値は、1試験群当たり5つの脾臓プールの平均を表す。
IFN-γ ELISpotアッセイ
IFN-γ ELISpotアッセイによって測定された抗原特異的刺激に応答したIFN-γ分泌脾細胞の数を定量化することにより、DNAワクチンに対するT細胞応答を見極めた。ImmunoSpotプレート(Cellular Technology Limited, Cleveland, OH)に、ラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体(BD Biosciences, San Diego, CA)をコーティングし、このプレートをRPMI-1640培地でブロックした。個々のワクチン接種済マウスから脾細胞懸濁液を分離し、これをELISpotプレートに、RPMI培地中1 x 106又は3.3 x 105細胞/ウェルで添加した。RPMI培地は刺激性抗原としてオーバーラップIE1ペプチドをそれぞれ5μg/mLを含有した。対照ウェルは、培地(抗原なし)中でインキュベートされた1 x 106脾細胞を含有した。37℃で20時間にわたってインキュベートした後、ビオチンで標識付けされたラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体及びアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼを順次添加することにより、捕捉されたIFN-γを検出した。比色分析基質3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)の変換によって生成されたスポットを、ImmunoSpot Analyzer(Cellular Technology Limited, Cleveland, OH)によって定量化した。その結果を、細胞106個当たりのスポット形成ユニット(SFU)として表す。
データは、IE1プラスミドVR6250の投与が抗原特異的免疫応答を誘発すること、そして免疫応答がDNA投与量依存性であることを示す。加えて、このデータはIE1タンパク質がin vitroで発現されたことを間接的に確証した。
実施例10
配合物選択研究
マウスCMV M84を使用した2つの試験マウス免疫原性研究において、種々異なるワクチン配合物の効力を評価した。マウスCMV M84はヒトCMV pp65の同族体と考えられ、ひいてはpp65抗原の代わりとして役立つ。第1の研究は、固定量のDNAを使用して脂質投与量応答を測定するのに対し、第2の研究は、投与量を増大させることにより、臨床的に適切なDNA投与量を評価した。
配合物
46.2重量% DMRIEと53.8重量% DOPEとを含有する脂質膜として、1:1モル比のDMRIE/DOPEを生成した(総乾燥脂質5.14 mg)。注射前に、混合脂質膜を注射用滅菌水中で水和することにより、カチオン性リポソームを形成した。次いで、これらのリポソームを2 x PBS中の好適な濃度のDNAに添加した。DNAを下記のようにDMRIE/DOPEと配合した：
脂質投与量応答研究に際して、上記DMRIE/DOPE配合物を希釈して、M84 DNAの最終ワクチン接種濃度を0.5 mg/mLにした。DNA投与量増大研究に際しては、配合物を注射前に希釈しない。
脂質投与量応答研究のためのポロキサマー配合物を、5mg/mLのM84 DNA、7.5 mg/mLのCRL 1005、及び0.3mMの塩化ベンジルアルコニウム(BAK)界面活性剤で生成した。注射前に、脂質投与量応答研究のための配合物を希釈して、M84 DNAの最終ワクチン接種濃度を0.5 mg/mLにした。DNA投与量増大研究の場合、3mg/mLの好適なプラスミドDNA、4.5 mg/mLのCRL 1005、及び0.18mMのBAKで配合物を生成した。これらの配合物は注射前に希釈しない。
ワクチン接種計画
週齢6-8の9匹のBALB/cマウス(Harlan Sparague Dawley)から成る群が、PBS中のDMRIE/DOPE又はCRL 1005と配合されたプラスミドDNAの左右対称(50μl/脚)の筋内(大腿直筋)注射を受容した。対照マウスはPBSだけの中のDNAを受容した。全てのマウスをほぼ21日目と49日目とにブーストした。最後の免疫化から2週間後に、3日連続してマウス3匹/群/日から脾細胞を採取し、そして抗原特異的T細胞応答を、IFN-γ ELISpotアッセイによって測定した。
細胞培地
25mM HEPES緩衝液とL-グルタミンとを含有するRPMI-1640培地中で、脾細胞培養を成長させた。RPMI-1640培地には、10%(v/v) FBS、55 μM β-メルカプトエタノール、100 U/mLのペニシリンGナトリウム塩、及び100μg/mLの硫酸ストレプトマイシンが補足されている。
IFN-γ ELISpotアッセイ
IFN-γ ELISpotアッセイによって測定された抗原特異的刺激に応答したIFN-γ分泌脾細胞の数を定量化することにより、DNAワクチンに対するT細胞応答を見極めた。ImmunoSpotプレート(Cellular Technology Limited, Cleveland, OH)に、ラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体(BD Biosciences, San Diego, CA)をコーティングし、このプレートをRPMI-1640培地でブロックした。個々のワクチン接種済マウスから脾細胞懸濁液を生成し、これをELISpotプレートに、RPMI培地中1 x 106、3 x 105又は1 x 105細胞/ウェルで播種した。RPMI培地は1μg/mLの好適なMHCクラスI-制限ペプチド(M84, 297AYAGLFTPL305、(SEQ ID NO:32)Imgenex, San Diego, CA)、1 U/mlの組換えマウスIL-2(Roche, Indianapolis, IN)を含有した。対照ウェルは、IL-2(抗原なし)中でインキュベートされた1 x 106脾細胞を含有した。37℃で20時間にわたってインキュベートした後、ビオチンで標識付けされたラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体及びアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼを順次添加することにより、捕捉されたIFN-γを検出した。比色分析基質3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)の変換によって生成されたスポットを、ImmunoSpotリーダー(Cellular Technology Limited, Cleveland, OH)によって定量化した。ポロキサマー配合DNAをワクチン接種されたマウス及びネイクドDNAをワクチン接種されたマウスのT細胞応答間の統計的に有意な差を、α=0.05でスチューデントt-検定を用いて見極めた。
DNA:脂質の指示モル比のDMRIE/DOPE(「D/D」)、CRL1005、又はPBSだけと配合された50μgのM84 DNAをワクチン接種されたマウスのM84特異的CD8 + T細胞応答を以下に示す。
DNA:脂質の指示モル比のDMRIE/DOPE(「D/D」)と配合されたM84 DNAを、その投与量を増大しながらワクチン接種されたマウスのM84特異的CD8 + T細胞応答と、これに対して、CRL1005、又はPBSだけと配合されたM84 DNAをワクチン接種されたマウスのM84特異的CD8 + T細胞応答とを以下に示す。
実施例11
HCMV抗原採用試験
ワクチン接種計画
週齢6-8の9匹の雌BALB/cマウス(Harlan Sparague Dawley)から成る群が、pp65、gB、又はpp65及びgBをコードするプラスミドDNAを、CRL 1005(VF-P1205-02A配合物)を伴って又は伴わずに含有する左右対称の筋内(大腿直筋)注射(50μl/脚)を、0及び13日目に受容した。各マウスはワクチン接種1回当たり200μgのDNAを受容した。単独のgB又はpp65コード・プラスミドを含有する配合物の場合、100μgのブランクDNA(VR10551)を添加することにより、200μgの総DNAを産出した。第1ワクチン接種からほぼ3週間後(22日目)から開始して、ワクチン接種済マウスから脾臓細胞を採取し、IFN-γ ELISpotアッセイによってpp65特異的T細胞応答を測定した。3つのELISpotアッセイを実施した：アッセイ1では、1群当たり3匹のマウスから得られた脾臓細胞プールからの免疫応答を測定し、アッセイ2及び3では、1群当たり2匹のマウスから得られた脾臓細胞プールからの免疫応答を測定した。各群における付加的な2匹のマウスの免疫応答は、この一連のアッセイでは測定されなかった。
IFN-γ ELISpotアッセイ
pp65誘導型ペプチド(Bio-Synthesis, Lewisvill, TX)による刺激に応答したIFN-γ分泌脾細胞の数を定量化することにより、DNAコード化pp65に対するT細胞応答を見極めた。ImmunoSpotプレート(Millipore, Billerica, MA)に、ラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体(BD Biosciences, San Diego, CA)をコーティングし、このプレートを、25mM HEPES緩衝液とL-グルタミンとを含有するRPMI-1640培地でブロックした。この培地には、10%(v/v) 熱不活性化FBS、55 μM b-メルカプトエタノール、100 U/mLのペニシリンGナトリウム塩、及び100μg/mLの硫酸ストレプトマイシン(10%)が補足されている。ワクチン接種済マウスから、脾細胞懸濁液を生成し、これを2 x 107細胞/mLの密度で10% RPMI培地中に再懸濁させ、そして5 x 105細胞/mL又は2.5 x 105細胞/mLの密度で、2つの別個のImmunoSpotプレートの3部ずつのウェル内に播種した。脾細胞を、オーバーラップするpp65ペプチドの2つの別個のプールで刺激した(1プレート当たり1プール)。これらのペプチドはともにpp65タンパク質全体にわたり、そして可能な全てのT細胞エピトープを含有するはずである。従って、ペプチド刺激に応答してIFN-γを生成するタイプのT細胞(例えばCD8+又はCD4+)は、このアッセイ法によって区別することはできない。理論上は、これらのペプチドは、クラスI又はクラスII MHCとの関連において提供され、こうして、同じ脾細胞調製物内部のCD8+T細胞及びCD4+T細胞双方を刺激することができる。ペプチド・プールは、15個のアミノ酸それぞれの68個(プールI)又は69個(プールII)のペプチドを含有し(プールII中の1つの13アミノ酸ペプチドを除く)、それぞれのペプチドはアッセイ・ウェル内で5μg/mLの最終濃度で表された。対照ウェルは、培地だけ(ペプチド抗原なし)の中で5 x 105細胞を含有した。37℃で21時間にわたってインキュベートした後、ビオチンで標識付けされたラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体(BD Biosciences, San Diego, CA)及びアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼを順次添加することにより、捕捉されたIFN-γを検出した。比色分析基質3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)の変換によって生成されたスポットを、ImmunoSpotリーダー(Cellular Technology Limited, Cleveland, OH)によって定量化した。データは、アッセイされた細胞100万個当たり、抗原特異的刺激に応答して生成されたスポット形成ユニット(SFU)として提供される。pp65誘導型ペプチドのプールと一緒にインキュベートされた同一の脾細胞調製物を含有するウェル内のスポット数から、培地だけの中でインキュベートされた脾細胞を含有するウェル内の平均スポット数を差し引くことにより、抗原特異的刺激を計算した。3つの複製ウェルを使用して、平均非特異的バックグラウンド応答を見極めた。各SFUは、1つのpp65特異的T細胞に応答する。試料サイズが小さいので(n=3)、平均値の差に関する統計的分析は行わなかった。
試験1-表18及び19参照
試験2
上記試験を繰り返した。また、ペプチド・プールIに対するpp65 + gB群の応答は、上記に詳細に報告した研究において測定された応答よりも2.4倍高かったが、結果は同様であった。
試験3
ワクチン接種計画
週齢6-8の9匹の雌BALB/cマウス(Harlan Sparague Dawley)から成る群が、pp65、gB、又はpp65及びgBをコードするプラスミドDNAを、CRL 1005(VF-P1205-02A配合物)を伴って又は伴わずに含有する左右対称の筋内(大腿直筋)注射(50μl/脚)を、0、21及び49日目に受容した。各マウスはワクチン接種1回当たり200μgのDNAを受容した。単独のgB又はpp65コード・プラスミドを含有する配合物の場合、100μgのブランクDNA(VR10551)を添加することにより、200μgの総DNA投与量を産出した。ブランクDNAの不在において、CRL 1005を伴って又は伴わずに送達される100μgの単一プラスミドDNAをマウスにワクチン接種することにより、ブランクDNAの効果を試験した。66日目から開始して脾細胞を採取し、そしてpp65特異的T細胞応答を上記IFN-γ ELISpotによって分析した。前の結果に基づいて、gB + ブランクDNA又はgB + ブランクDNA + CRL 1005をワクチン接種されたマウスに関して、pp65特異的T細胞応答は予期されなかった。従って、これらのマウスはELISpotアッセイでは評価されなかった。ワクチン接種済マウスと、pp65 + gBとの平均T細胞応答の統計的に有意な差を、α=0.05でスチューデントt-検定を用いて見極めた。
実施例12
ワクチンの組み合わせ-DNAとタンパク質との組み合わせ
一般試験手順
下記実施例のための試験手順は上述の通りであり、本明細書中に記載されているような特定のパラメーター及び材料が採用される。
ワクチン接種計画
下記のような、50μl容積+/-のポロキサマーVF-P1205-02A(「02A」)、DMRIE:DOPE(「D/D」)及び/又はgBタンパク質中の20μgのHCMV二価DNAワクチンを、雌BALB/cマウス6匹/群の各大腿直筋に注射した。プラスミドVR6365はHCMV gBをコードし、プラスミドVR6368はHCMV pp65をコードする。CHO細胞から精製された完全長gBタンパク質を、Austral Biologicals(San Ramon, CA)から入手した。マウスは0日目と14日目とに注射を受容し、そして13日目と26日目とにgB抗体力価を見極めるために採血した。1群当たり2匹のマウスから、脾細胞を26, 27及び28日目に、pp65 IFN-γ ELISpot分析のために採取した(個々のマウスから得られた脾細胞をアッセイした。群1つ当たりn=6)。
組換えgB酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)
gB特異的血清抗体を検出するためのELISAを、96ウェル型Costar 1/2ウェルEIAプレートで実施した。このプレートには、ホウ酸緩衝生理食塩水(BBS)中の濃度0.1μg/ウェルの組換えCMV gBをコーティングした。抗原をコーティングした後、プレートをシールし、そして4℃で一晩にわたってインキュベートした。自動プレート洗浄装置を使用して、0.1% Tween-20(BBST)を含有するBBSで4回洗浄した。100 μLのアッセイ緩衝液(BBS中10%のウシ胎仔血清)と一緒に、室温で1時間にわたってプレートをインキュベートすることにより、非特異結合をブロックした。次いで、ブロッキング緩衝液をデカントし、次いで、連続希釈された血清(アッセイ緩衝液中に希釈)を50 μL/ウェルで添加した。プレートをシールし、2時間にわたって室温でインキュベートし、次いで、自動プレート洗浄装置を使用して、0.1% Tween-20(BBST)を含有するBBSで4回洗浄した。アッセイ緩衝液中に1:5000で希釈されたヤギ抗マウスIgG Fc特異的二次抗体を、50 μL/ウェルで添加し、プレートをシールし、そして室温で2時間にわたってインキュベートした。自動プレート洗浄装置を使用して、0.1% Tween-20(BBST)を含有するBBSで、プレートを4回洗浄した。50 mM重炭酸ナトリウム緩衝液、pH 9.8及び1mMのMgCl2中1 mg/mlのp-ニトロフェニルホスフェートから成る基質を、50μL/ウェルで添加し、プレートをシールし、そして室温で60分間にわたってインキュベートした。各ウェルの吸光度を405 nmで見極めた。終点力価 = 最終希釈の逆数であり、最終希釈は、バックグラウンド・ウェルの平均吸光度値以上〜2倍である平均吸光度値をもたらす。
ポロキサマー中に調製された二価gB, pp65 DNAワクチンに、gBタンパク質を加えると、二価ワクチン単独の場合に比べて、抗gB抗体応答が14倍まで上昇し(二価ワクチン + 02A + 1.5 μg gBタンパク質(C群)対二価ワクチン単独(F群)、p=0.005)、そしてポロキサマー中の二価DNAに対して4倍まで上昇した(二価ワクチン + 02A + 1.5 μg gBタンパク質(C群)対二価ワクチン + 02A(A群)、p=0.01)。カチオン性脂質中に調製された二価DNAワクチンにgBタンパク質を添加すると、二価ワクチン単独の場合に比べて、抗gB抗体応答が101倍まで上昇し(二価ワクチン + D/D + 4.5 μg gBタンパク質(E群)対二価ワクチン単独(F群)、p=0.00006)、そしてポロキサマー中の二価DNAに対して32倍まで上昇した(二価ワクチン + D/D + 4.5 μg gBタンパク質(E群)対二価ワクチン + 02A(A群)、p=0.00005)。pp65応答は全ての群に関して同様であり、このことは、応答の抗体成分を改善するためにタンパク質と二価DNAとの組み合わせることによって、応答の細胞成分が減小することはなかったことを示す。
実施例13
ワクチンの組み合わせ-三価ワクチンの組み合わせ
ワクチン接種計画
下に示すような複数のDNAプラスミドを含有する50μLのPBSを、10匹のマウスから成る群の各大腿直筋に注射した。プラスミドVR6365はHCMV gBをコードし、プラスミドVR6368はHCMV pp65をコードし、プラスミドVR6250はHCMV IE1をコードし、そして「ブランク」は等価のプラスミド主鎖ではあるが、いかなる抗原コード配列をも欠いていることを意味する。全てのDNAを、実施例4に記載されたような「02A」ポロキサマー系配合物と配合した。2つの注射セットを0日目と14日目とに実施した。gB抗体力価を見極めるために血清を26日目に採取した。
組換えgB酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)
上記実施例7に記載された上記接種計画に従ってワクチン接種されたマウスから、血清を捕集した。上記実施例12に記載されているように、組換えCMV gB酵素結合イムノソルベント・アッセイ(ELISA)を用いて、抗gB IgG力価を見極めた。
IFN-γ ELISpotアッセイ
27-29日目に抗原特異的IFN-γ分泌性T細胞応答を分析するために、脾臓を捕集した。各群から2つの脾臓をアッセイのためにプールした。各群から2つのプールを27日目と28日目とに分析し、各群から1つのプールを29日目に分析した。脾臓細胞を処理し、そして実施例7に記載されたようなELISpotアッセイによって、pp65反応性に関して分析した。pp65 ELISpotアッセイに関して説明したように、ELISpotアッセイによってIE1反応性に関して脾臓細胞を分析した。ただしこの場合、オーバーラップする98個の15量体ペプチド(11個のアミノ酸だけオーバーラップ)のプールで、脾細胞を刺激した。これらのペプチドは、VR6250構造上でコードされるIE1タンパク質全体にわたる(実施例3参照)。
これより前の試験は、各抗原をコードするDNAを単独で投与すると、in vivoでの免疫応答を誘発することを示した。このデータは、各抗原をコードするDNAが、他の抗原と組み合わされたときに特異的免疫応答を誘発することを示す。このように、抗原を組み合わせると同時に、複数の抗原をコードするDNAを投与することにより、抗原全てに対する免疫応答の生成が同時に可能になる。
実施例14
電気支援型プラスミド送達
注射された組織に短時間の電気パルスを加えることにより、in vivo遺伝子送達を増強することができる。この手順を本明細書中では、電気支援型プラスミド送達と呼ぶ。例えば、Aihara, H. & Miyazaki, J. Nat. Biotechnol. 16:867-70(1998); Mir, L.M.他、Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 4262-67 (1999); Hartikka, J.他、Mol. Ther. 4:407-15 (2001)；及びMir, L.M.他；Rizzuto, G.他、Hum Gene Ther 11:1891-1900 (2000)；Widera, G.他、J of Immuno. 164: 4635-4640 (2000)を参照されたい。細胞電気透過性化するために電気パルスを用いることにより、in vitroの原核細胞及び真核細胞内へ外来DNAが導入されている。細胞透過性化は、電極、及び生存細胞に匹敵する最適な電気的なパラメーターを用いて、in vivoで局所的に達成することもできる。
エレクトロポレーション処置は、種々のエレクトロポレーション装置を用いて実施することができる。これらの装置は、外部プレート型電極、又は侵襲的な針/棒電極を含み、そして、アレイ内に配置された2つの電極又は複数の電極を有することができる。プレート型又は針型の電極相互間の距離は、電極の数、標的領域のサイズ及び処理対象に応じて変わることができる。
本明細書中に記載されたTriGrid針アレイは、ほぼ幾何学的三角形の形状で3つの細長い電極を含む3電極アレイである。針アレイは、種々のアレイ構造を成して配列された1, 2, 3, 4, 5, 6つ又は7つ以上の針を含むことができる。電極は、導電性ケーブルを介して高電圧切換え装置に接続されており、この装置は電源に接続されている。
電極アレイは、核酸注射部位の周りの筋肉組織内に、約3mm〜3cmの深さまで挿入する。挿入深さは、標的組織及びエレクトロポレーションを受容する患者の大きさに応じて変わる。外来核酸、例えばプラスミドDNAを注射してから核酸の分配に十分な時間の後、方形波電気パルスを組織に加える。各パルスの振幅は、電極間隔に応じて、約100ボルト〜約1500ボルト、例えば約100ボルト、約200ボルト、約300ボルト、約400ボルト、約500ボルト、約600ボルト、約700ボルト、約800ボルト、約900ボルト、約1000ボルト、約1100ボルト、約1200ボルト、約1300ボルト、約1400ボルト、約1500ボルト又は1-1.5kV/cmであってよい。各パルスの継続時間は約1μ秒〜1000μ秒、例えば約1μ秒、約10μ秒、約50μ秒、約100μ秒、約200μ秒、約300μ秒、約400μ秒、約500μ秒、約600μ秒、約700μ秒、約800μ秒、約900μ秒又は約1000μ秒であり、またパルス周波数は約1-10Hzのオーダーにある。パルスの極性は、コネクターをパルス発生器に切換えることによりエレクトロポレーション処置中に逆転することができる。パルスは複数回繰り返される。エレクトロポレーション・パラメーター(例えば電圧振幅、パルスの継続時間、電極挿入深さ及び周波数)は、当業者には明らかなように、標的組織タイプ、使用される電極数、及び電極間隔に応じて変わることになる。
パルス付与計画の完了直後に、エレクトロポレーションを受容する患者を、任意には膜安定剤で処理して、エレクトロポレーションの結果としての細胞膜透過性を延長することができる。膜安定剤の一例としては、ステロイド(例えばデキサメタゾン、メチルプレドニゾン及びプロゲステロン)、アンギオテンシンII及びビタミンEが含まれる。デキサメタゾンの単回投与量は、有益な効果を達成するには、体重1kg当たりほぼ0.1mgで十分であるはずである。
EAPD技術、例えばエレクトロポレーションを、リポソーム構造内に含有されたプラスミドのために使用することもできる。リポソーム-プラスミド懸濁液を動物又は患者に投与し、そして例えばTriGrid針アレイ又は4ニードル・アレイによって発生させられた安全でしかも効果的な電界を用いて、注射部位を処理する。エレクトロポレーションは、リポソーム二分子層を不安定化して、リポソームと標的細胞構造との間に膜融合が生じるようにすることにより、細胞へのプラスミド送達を助ける。標的細胞の表面のリポソームから高濃度のプラスミドが放出されるのをトリガして、プラスミドがエレクトロポレーションの結果として細胞膜内に形成された孔を介して、濃度勾配によって細胞膜を横切って動かされようになる。
ウサギにおけるエレクトロポレーション研究
CMV gB DNAを使用してNew Zealand White Rabbitモデルにおいて、エレクトロポレーションで支援されたDNAワクチン送達を、DMRIE:DORE又はCRL 1005と配合されたDNA、及びPBS中のDNAと比較した。ウサギ(1群当たり5匹)の脛骨筋に、50μg DNA/500μl/脚を0日目と28日目とに注射した。注射直後に、200V(232 V/cm)、60m秒、2パルス及び2Hzの5 mm x 8.6 mm 4針アレイを有するBTX-ECM 830パルス発生器を使用して、エレクトロポレーションを実施した。
血清終点力価を、gB ELISAによって2, 14, 28, 42及び56日目に測定した。gB特異的血清抗体を検出するためのELISAを、96ウェル型Costar 1/2ウェルEIAプレートで実施した。このプレートには、ホウ酸緩衝生理食塩水(BBS)中の濃度0.1μg/ウェルの組換えCMV gBをコーティングした。抗原をコーティングした後、プレートをシールし、そして4℃で一晩にわたってインキュベートした。自動プレート洗浄装置を使用して、0.1% Tween-20(BBST)を含有するBBSで4回洗浄した。100 μLのアッセイ緩衝液(BBS中10%のウシ胎仔血清)と一緒に、室温で1時間にわたってプレートをインキュベートすることにより、非特異結合をブロックした。次いで、ブロッキング緩衝液をデカントし、次いで、連続希釈された血清(アッセイ緩衝液中に希釈)を50 μL/ウェルで添加した。プレートをシールし、2時間にわたって室温でインキュベートし、次いで、自動プレート洗浄装置を使用して、0.1% Tween-20(BBST)を含有するBBSで4回洗浄した。アッセイ緩衝液中に1:5000で希釈されたヤギ抗マウスIgG Fc特異的二次抗体を、50 μL/ウェルで添加し、プレートをシールし、そして室温で2時間にわたってインキュベートした。自動プレート洗浄装置を使用して、0.1% Tween-20(BBST)を含有するBBSで、プレートを4回洗浄した。50 mM重炭酸ナトリウム緩衝液、pH 9.8及び1mMのMgCl2中1 mg/mlのp-ニトロフェニルホスフェートから成る基質を、50μL/ウェルで添加し、プレートをシールし、そして室温で60分間にわたってインキュベートした。自動96ウェル型プレート・リーダーを使用して、吸光度を405 nmで見極めた。終点力価 = 最終希釈の逆数であり、最終希釈は、バックグラウンド・ウェルの平均吸光度値以上〜2倍である平均吸光度値をもたらす。
CRL 1005群の平均抗gBの力価は、PBS群の力価よりも僅かに高い(最大3倍だけ高い)が、しかしその差はいかなる時点においても統計的には有意でなかった。DMRIE:DOPE群の平均抗gB力価は、PBS中gB DNAよりも2-10倍だけ高かった(注射後の全ての時点においてp<0.05)。PBS中gB DNAの注射後のエレクトロポレーションは、エレクトロポレーションなしのPBS中gB DNAと比べて53-588倍だけ(注射後の全ての時点においてp<0.05)、CRL 1005群と比べて34-189倍だけ(注射後の全ての時点においてp<0.05)、そしてDMRIE:DOPE群と比べて8-58倍だけ(注射後の全ての時点においてp<0.05)、抗gB力価を増大させた。
実施例15
ヒト・コドン最適化型HCMV pp65及びgB、及びその断片及び変異体を含む組成物を使用した、患者の治療
現行のFDA 優良製造手順(Good Manufactureing Procedures)(GMP)に従って、プラスミド免疫治療製品を製造し、認可された研究用新薬(Investigational New Drug)申請の下で、ヒト患者に投与する。
A. 最初の研究
別個のプラスミド上の最適化型gB及びpp65をコードするプラスミドDNAのそれぞれを0, 2及び8週目に、0.5mg又は2.5mgだけ筋内注射することにより、32人の健常成人を免疫化する。CD4+及びCD8+T細胞応答、及びHCMV gBの抗体力価を測定するためのELISpotアッセイを含む免疫原性研究のために、血液試料を免疫化前と、2, 4, 8, 10及び16週目とに採取する。
B. 造血幹細胞(HSC)移植ドナー及びレシピエントへの投与
上記処置に続いて、健常HSCドナーを、供与の4週間前と2週間前とに、プラスミド組成物で免疫化する。免疫化前、及び免疫化後16週間にわたって2週間毎に、ドナーから採取された血液を使用して、免疫原性アッセイを実施する。レシピエントを2つの群に分ける。第1群は免疫化済ドナーからHSCを受容するが、しかし彼等自身は免疫化されない。第2群は免疫化済ドナーからHSCを受容し、そしてHSC移植からほぼ4週間後に、ドナーと同じプラスミド組成物で免疫化する。そして移植前及び上述のように2週間毎に、免疫原性アッセイを実施する。ドナー及びレシピエント双方に対して2週間毎に免疫化を繰り返すことができる。

Claims (8)

  1. 以下の：
    （ａ）配列番号１３を含む単離ポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号５を含む単離ポリヌクレオチド；並びに
    （ｃ）ＣＲＬ１００５及び塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、アジュバント及びトランスフェクション促進剤であって該ＣＲＬ１００５及びＢＡＫが、以下の：
    ０．３ｍＭ ＢＡＫ及び７．５ｍｇ／ｍｌＣＲＬ１００５、
    ０．３ｍＭ ＢＡＫ及び３４ｍｇ／ｍｌＣＲＬ１００５、及び
    ０．３ｍＭ ＢＡＫ及び５０ｍｇ／ｍｌＣＲＬ１００５、
    から成る群から選ばれる濃度で存在する、
    を含む組成物であって、前記（ａ）のポリヌクレオチドは作用可能な状態でプロモーターに連結されたＤＮＡであり、かつ、前記（ｂ）のポリヌクレオチドも作用可能な状態でプロモーターに連結されたＤＮＡである前記組成物。
  2. 前記（ａ）のポリヌクレオチドと前記（ｂ）のポリヌクレオチドは、単一のプラスミド上に存在する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記（ａ）のポリヌクレオチドと前記（ｂ）のポリヌクレオチドは、別々のプラスミド上に存在する、請求項１に記載の組成物。
  4. ＨＣＭＶポリペプチド又はその免疫学的断片、変異体若しくは誘導体をコードする追加のポリヌクレオチド、あるいは不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、単離ＨＣＭＶポリペプチドを発現するウイルスベクター、ＨＣＭＶウイルス蛋白質又はその免疫学的断片若しくは誘導体からの単離ポリぺプチドから成る群から選ばれる慣用型のワクチン成分をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記追加のポリヌクレオチドが、前記ＨＣＭＶポリペプチド又はその免疫学的断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化型コード領域を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記ＨＣＭＶポリペプチドが、前初期−１蛋白質（ＩＥ−１）である、請求項５に記載の組成物。
  7. ヒトにおけるＣＭＶ感染の治療又は予防方法に使用するための、請求項１又は４に記載の組成物。
  8. ヒトにおけるＣＭＶ感染の治療又は予防用医薬の製造における、請求項１又は５に記載の組成物の使用。
JP2010101904A 2002-12-23 2010-04-27 ヒト・サイトメガロウィルス感染に対するコドン最適化型ポリヌクレオチド系ワクチン Expired - Fee Related JP5129292B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43554902P 2002-12-23 2002-12-23
US60/435,549 2002-12-23

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004563851A Division JP2006511221A (ja) 2002-12-23 2003-12-19 ヒト・サイトメガロウィルス感染に対するコドン最適化型ポリヌクレオチド系ワクチン

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2010227101A JP2010227101A (ja) 2010-10-14
JP2010227101A5 JP2010227101A5 (ja) 2010-12-16
JP5129292B2 true JP5129292B2 (ja) 2013-01-30

Family

ID=32682258

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004563851A Pending JP2006511221A (ja) 2002-12-23 2003-12-19 ヒト・サイトメガロウィルス感染に対するコドン最適化型ポリヌクレオチド系ワクチン
JP2010101904A Expired - Fee Related JP5129292B2 (ja) 2002-12-23 2010-04-27 ヒト・サイトメガロウィルス感染に対するコドン最適化型ポリヌクレオチド系ワクチン

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004563851A Pending JP2006511221A (ja) 2002-12-23 2003-12-19 ヒト・サイトメガロウィルス感染に対するコドン最適化型ポリヌクレオチド系ワクチン

Country Status (13)

Country Link
US (5) US7410795B2 (ja)
EP (2) EP2311848B1 (ja)
JP (2) JP2006511221A (ja)
AT (1) ATE471335T1 (ja)
AU (1) AU2003301148A1 (ja)
CA (2) CA2756797C (ja)
DE (1) DE60333035D1 (ja)
DK (1) DK2311848T3 (ja)
ES (1) ES2429338T3 (ja)
HK (1) HK1152945A1 (ja)
PT (1) PT2311848E (ja)
SI (1) SI2311848T1 (ja)
WO (1) WO2004058166A2 (ja)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7105574B1 (en) * 1999-03-26 2006-09-12 Vical Incorporated Adjuvant compositions and methods for enhancing immune responses to polynucleotide-based vaccines
ATE272410T1 (de) * 1999-03-26 2004-08-15 Vical Inc Adjuvanszusammensetzungen zur erhöhung der immunantwort auf polynukleotid-basierende impfstoffe
AU2003278776A1 (en) * 2002-09-10 2004-04-30 Vical Incorporated Codon-optimized polynucleotide-based vaccines against bacillus anthracis infection
EP1578193A4 (en) * 2002-12-23 2011-06-15 Vical Inc FREEZING PROCESS FOR NUCLEIC ACID / BLOCK COPOLYMER / CATION SIDE COMPLEXES
WO2004060363A1 (en) * 2002-12-23 2004-07-22 Vical Incorporated Method for producing sterile polynucleotide based medicaments
CA2756797C (en) * 2002-12-23 2015-05-05 Vical Incorporated Codon-optimized polynucleotide-based vaccines against human cytomegalovirus infection
EP1607485A1 (en) * 2004-06-14 2005-12-21 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method for quantifying VEGF121 isoform in a biological sample
WO2006060723A2 (en) * 2004-12-03 2006-06-08 Vical Incorporated Methods for producing block copolymer/amphiphilic particles
CN1307423C (zh) * 2005-01-08 2007-03-28 王明丽 重组抗原pp65包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒
JP2006223194A (ja) * 2005-02-17 2006-08-31 Tosoh Corp スタニオカルシン１（ＳＴＣ１）ｍＲＮＡの測定方法
CA2598884A1 (en) * 2005-02-24 2006-10-05 University Of Massachusetts Influenza nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
AU2007207785B2 (en) 2006-01-13 2013-11-14 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Codon optimized IL- 15 and IL- 15R-alpha genes for expression in mammalian cells
US9182398B2 (en) 2006-04-01 2015-11-10 Medical Service Consultation International, Llc Methods and compositions for detecting fungi and mycotoxins
HRP20181319T4 (hr) * 2007-03-30 2024-02-16 The Research Foundation Of The State University Of New York Oslabljeni virusi koji su korisni kao cjepiva
WO2009005917A2 (en) * 2007-05-29 2009-01-08 Vical Incorporated Methods of treating measles infectious disease in mammals
EP2185195A2 (en) 2007-08-16 2010-05-19 Tripep Ab Immunogen platform
EP2303319B1 (en) 2008-06-20 2016-10-05 Duke University Compositions, methods and kits for eliciting an immune response
EP2313503A4 (en) * 2008-08-01 2014-01-08 Merck Sharp & Dohme Variant HCMV-PP65, IE1 and IE2 polynucleotides, and uses thereof
US20100068718A1 (en) 2008-08-22 2010-03-18 Hooper Dennis G Methods and Compositions for Identifying Yeast
EP2451475A2 (en) 2009-07-06 2012-05-16 Novartis AG Self replicating rna molecules and uses thereof
ES2918381T3 (es) 2009-07-15 2022-07-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones de proteína F de VRS y métodos para producir las mismas
WO2011024482A1 (ja) * 2009-08-29 2011-03-03 株式会社バイオメッドコア 抗原特異的ｔ細胞誘導能測定法
US8962251B2 (en) 2009-10-08 2015-02-24 Medical Service Consultation International, Llc Methods and compositions for identifying sulfur and iron modifying bacteria
CA2779459A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Peptide compositions and methods for inhibiting herpesvirus infection
WO2011100443A1 (en) * 2010-02-11 2011-08-18 Intelligent Medical Devices, Inc. Oligonucleotides relating to clostridium difficile genes encoding toxin b, toxin a, or binary toxin
LT3243526T (lt) 2010-07-06 2020-02-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Rnr pristatymas, skirtas keleto imuninio atsako paleidimui
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
ES2649896T3 (es) 2010-07-06 2018-01-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Emulsiones catiónicas de aceite en agua
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
SI4005592T1 (sl) 2010-07-06 2023-03-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Virionom podobni dostavni delci za samopodvojene molekule RNA
WO2012006378A1 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Novartis Ag Liposomes with lipids having an advantageous pka- value for rna delivery
DK2591114T3 (en) 2010-07-06 2016-08-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunization of large mammals with low doses of RNA
DK2611461T3 (da) 2010-08-31 2022-05-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegylerede liposomer til afgivelse af RNA, der koder immunogen
US9127321B2 (en) * 2010-10-06 2015-09-08 The Translational Genomics Research Institute Method of detecting Coccidioides species
WO2012051211A2 (en) 2010-10-11 2012-04-19 Novartis Ag Antigen delivery platforms
PT2667892T (pt) 2011-01-26 2019-06-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Regime de imunização contra o vsr
JP2014519819A (ja) 2011-05-13 2014-08-21 ノバルティス アーゲー 融合前ｒｓｖｆ抗原
CN111671918A (zh) 2011-06-08 2020-09-18 川斯勒佰尔公司 Mrna递送的脂质纳米颗粒组合物和方法
EP3508219A1 (en) 2011-07-06 2019-07-10 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Self-replicating rna prime - protein boost vaccines
EP2729125B1 (en) 2011-07-06 2017-12-13 GlaxoSmithKline Biologicals SA Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids
ES2656050T3 (es) 2011-07-06 2018-02-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones de combinación inmunogénica y usos de las mismas
TWI570240B (zh) 2011-09-09 2017-02-11 默沙東公司 作為細胞巨大病毒疫苗之條件式複製ｃｍｖ
MX2014004214A (es) 2011-10-11 2014-05-07 Novartis Ag Moleculas de acido ribonucleico policistronicas auto-replicantes recombinantes.
KR102301463B1 (ko) 2011-11-11 2021-09-14 배리에이션 바이오테크놀로지스 아이엔씨. 사이토메갈로바이러스의 치료를 위한 조성물 및 방법
CN104321444A (zh) 2012-03-27 2015-01-28 变异生物技术公司 用于检测抗巨细胞病毒中和抗体的方法
EP2869842A1 (en) 2012-07-06 2015-05-13 Novartis AG Immunogenic compositions and uses thereof
US9770491B2 (en) 2012-07-11 2017-09-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania AAV-mediated gene therapy for RPGR X-linked retinal degeneration
WO2014055624A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 The General Hospital Corporation D/B/A Massachusetts General Hospital Methods relating to dna-sensing pathway related conditions
JP2016506416A (ja) 2013-01-10 2016-03-03 ノバルティス アーゲー インフルエンザウイルス免疫原性組成物およびその使用
EP2765137A1 (en) 2013-02-07 2014-08-13 Sanofi Pasteur Induction of cross-reactive cellular response against rhinovirus antigens
ES2797547T3 (es) 2013-03-15 2020-12-02 Applied Food Biotech Inc Receptores del sabor amargo felino y métodos.
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3110401A4 (en) 2014-02-25 2017-10-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
WO2017011773A2 (en) * 2015-07-15 2017-01-19 Modernatx, Inc. Codon-optimized nucleic acids encoding antibodies
EP4218805A1 (en) 2015-07-21 2023-08-02 ModernaTX, Inc. Infectious disease vaccines
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
JP2018531290A (ja) 2015-10-22 2018-10-25 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド 性感染症ワクチン
SG11201803360UA (en) 2015-10-22 2018-05-30 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (vzv)
WO2017070613A1 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
US10611800B2 (en) 2016-03-11 2020-04-07 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
EP3481958A4 (en) 2016-07-08 2019-12-25 The Trustees of The University of Pennsylvania METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF RDH12-RELATED DISORDERS AND DISEASES
US20190314486A1 (en) 2016-10-21 2019-10-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Influenza hemagglutinin protein vaccines
AU2017345766A1 (en) 2016-10-21 2019-05-16 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
US10925958B2 (en) 2016-11-11 2021-02-23 Modernatx, Inc. Influenza vaccine
WO2018107088A2 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
MA47515A (fr) 2017-02-16 2019-12-25 Modernatx Inc Compositions immunogènes très puissantes
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
WO2018170245A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINE
EP3624856B1 (en) 2017-05-17 2024-04-03 The General Hospital Corporation Gene therapy for tuberous sclerosis
KR102673794B1 (ko) 2017-06-15 2024-06-11 액세스 투 어드밴스드 헬스 인스티튜트 나노구조 지질 담체 및 안정적인 에멀션 그리고 이들의 용도
MA50253A (fr) 2017-09-14 2020-07-22 Modernatx Inc Vaccins à arn contre le virus zika
CN111655715A (zh) 2018-01-29 2020-09-11 默沙东公司 稳定化的rsv f蛋白及其用途
WO2019148101A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 Modernatx, Inc. Rsv rna vaccines
CN109082413B (zh) * 2018-09-18 2023-01-10 四川安可瑞新材料技术有限公司 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
US11629172B2 (en) 2018-12-21 2023-04-18 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
EP3938379A4 (en) 2019-03-15 2023-02-22 ModernaTX, Inc. HIV RNA VACCINE
TW202140069A (zh) 2020-02-14 2021-11-01 美商默沙東藥廠 Hpv疫苗
AU2021264465A1 (en) 2020-04-27 2022-12-15 University Of Iowa Research Foundation Compositions and methods for the treatment of cystic fibrosis
US20230193212A1 (en) 2020-05-06 2023-06-22 Orchard Therapeutics (Europe) Limited Treatment for neurodegenerative diseases
TWI810589B (zh) 2020-06-21 2023-08-01 美商輝瑞股份有限公司 人巨細胞病毒糖蛋白Ｂ（ｇＢ）多肽
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
WO2022051023A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Infectious Disease Research Institute Live-attenuated rna hybrid vaccine technology
CA3174411A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Ryan M. Kramer Co-lyophilized rna and nanostructured lipid carrier
US20230310569A1 (en) 2020-09-04 2023-10-05 Access To Advanced Health Institute Genetically-adjuvanted rna vaccines
TW202245835A (zh) 2021-02-04 2022-12-01 美商默沙東有限責任公司 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物
EP4323525A2 (en) 2021-04-16 2024-02-21 Genentech, Inc. Optimized tlr7 ligands and uses thereof
EP4355766A1 (en) 2021-06-14 2024-04-24 Bridgebio Gene Therapy Research, Inc. Gene therapy for tuberous sclerosis
EP4384195A2 (en) 2021-08-11 2024-06-19 King's College London Compositions and methods for improved treatment of disorders affecting the central nervous system
US20230118665A1 (en) 2021-08-19 2023-04-20 Merck Sharp & Dohme Llc Novel thermostable lipid nanoparticle and methods of use thereof
WO2023228116A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Access To Advanced Health Institute Intranasal administration of thermostable rna vaccines
WO2024052882A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Access To Advanced Health Institute Immunogenic vaccine composition incorporating a saponin
WO2024068898A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Centre National De La Recherche Scientifique Therapy by trans-splicing of opa1 pre-messenger rnas for the treatment of diseases associated with opa1 gene mutations
WO2024147114A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Bloomsbury Genetic Therapies Limited Compositions and methods for treating parkinson's disease

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6100064A (en) * 1984-04-06 2000-08-08 Chiron Corporation Secreted viral proteins useful for vaccines and diagnostics
US6242567B1 (en) * 1984-07-27 2001-06-05 City Of Hope Method for detection and prevention of human cytomegalovirus infection
US6133433A (en) 1984-07-27 2000-10-17 City Of Hope Method for detection and prevention of human cytomegalovirus infection
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
WO1987002671A1 (en) 1985-11-01 1987-05-07 International Genetic Engineering, Inc. Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US6162620A (en) * 1986-03-07 2000-12-19 Cogent Limited Processes for the production of HCMV glycoproteins, antibodies thereto and HCMV vaccines, and recombinant vectors therefor
US5124440A (en) * 1986-11-24 1992-06-23 The Childrens Hospital, Inc. Antibody and T cell recognition sites on glycoproteins comprising the GCI complex of human cytomegalovirus
US5547834A (en) * 1988-01-29 1996-08-20 Chiron Corporation Recombinant CMV neutralizing proteins
WO1989007143A1 (en) 1988-01-29 1989-08-10 Chiron Corporation Recombinant cmv neutralizing proteins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US6174666B1 (en) * 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5795737A (en) * 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
US5656611A (en) 1994-11-18 1997-08-12 Supratek Pharma Inc. Polynucleotide compositions
US5885971A (en) 1995-03-24 1999-03-23 The Regents Of The University Of California Gene therapy by secretory gland expression
US5837693A (en) 1995-03-24 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Intravenous hormone polypeptide delivery by salivary gland expression
US5721354A (en) * 1995-03-31 1998-02-24 Aviron Human cytomegalovirus DNA sequences
US5800981A (en) * 1996-02-22 1998-09-01 University Of Limburg Human cytomegalovirus antigen and its use
US6020481A (en) 1996-04-01 2000-02-01 The Perkin-Elmer Corporation Asymmetric benzoxanthene dyes
EP0914441A2 (en) * 1996-04-23 1999-05-12 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Novel human cytomegalovirus dna constructs and uses therefor
FR2753512B1 (fr) * 1996-09-19 1998-12-31 Sachs Ind Sa Chaine de transmission notamment pour cycle
US6074645A (en) * 1996-11-12 2000-06-13 City Of Hope Immuno-reactive peptide CTL epitopes of human cytomegalovirus
US6156317A (en) * 1996-11-12 2000-12-05 City Of Hope Immuno-reactive peptide CTL epitopes of human cytomegalovirus
WO1999002694A1 (en) * 1997-07-09 1999-01-21 The University Of Queensland Nucleic acid sequence and method for selectively expressing a protein in a target cell or tissue
KR100239879B1 (ko) * 1997-11-05 2000-02-01 김상조 간암 예방 및 치료용 생약제
JP3253590B2 (ja) * 1998-08-31 2002-02-04 シャープ株式会社 ハーフトーンマスクの製造方法
ATE272410T1 (de) * 1999-03-26 2004-08-15 Vical Inc Adjuvanszusammensetzungen zur erhöhung der immunantwort auf polynukleotid-basierende impfstoffe
FR2804028B1 (fr) * 2000-01-21 2004-06-04 Merial Sas Vaccins adn ameliores pour animaux de rente
US6835383B2 (en) * 2000-03-23 2004-12-28 City Of Hope Protein kinase deficient, immunologically active CMVpp65 mutants
WO2001080897A2 (en) 2000-04-21 2001-11-01 Vical Incorporated Compositions and methods for in vivo delivery of polynucleotide-based therapeutics
EP1156112B1 (en) 2000-05-18 2006-03-01 Geneart GmbH Synthetic gagpol genes and their uses
CA2411167A1 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Merck & Co., Inc. Polynucleotide vaccine adjuvants and formulations containing cationic surfactants, and methods of use
US20020110567A1 (en) * 2000-08-10 2002-08-15 Volker Gerdts In utero oral nucleic acid immunization
CA2756797C (en) 2002-12-23 2015-05-05 Vical Incorporated Codon-optimized polynucleotide-based vaccines against human cytomegalovirus infection
US20050283146A1 (en) 2004-06-17 2005-12-22 Lentz David J Thermally extended spiral cryotip for a cryoablation catheter

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004058166A3 (en) 2005-06-16
US20040209241A1 (en) 2004-10-21
US7410795B2 (en) 2008-08-12
EP2311848B1 (en) 2013-07-03
AU2003301148A1 (en) 2004-07-22
HK1152945A1 (en) 2012-03-16
US20140186382A1 (en) 2014-07-03
CA2756797C (en) 2015-05-05
ATE471335T1 (de) 2010-07-15
CA2508228C (en) 2013-12-17
DK2311848T3 (da) 2013-10-14
ES2429338T3 (es) 2013-11-14
AU2003301148A8 (en) 2004-07-22
EP1587816A4 (en) 2006-06-07
PT2311848E (pt) 2013-10-03
EP1587816A2 (en) 2005-10-26
US20110177124A1 (en) 2011-07-21
EP2311848A1 (en) 2011-04-20
US9180162B2 (en) 2015-11-10
EP1587816B1 (en) 2010-06-16
US8673317B2 (en) 2014-03-18
CA2508228A1 (en) 2004-07-15
US8278093B2 (en) 2012-10-02
JP2010227101A (ja) 2010-10-14
US7888112B2 (en) 2011-02-15
DE60333035D1 (de) 2010-07-29
WO2004058166A2 (en) 2004-07-15
JP2006511221A (ja) 2006-04-06
SI2311848T1 (sl) 2013-11-29
US20080085870A1 (en) 2008-04-10
CA2756797A1 (en) 2004-07-15
US20130017217A1 (en) 2013-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5129292B2 (ja) ヒト・サイトメガロウィルス感染に対するコドン最適化型ポリヌクレオチド系ワクチン
US9205146B2 (en) Compositions and methods for vaccinating against HSV-2

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101101

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120626

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120820

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20121002

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20121101

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151109

Year of fee payment: 3

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees