ES2308069T3 - Composiciones adyuvantes para realzar inmunorespuestas a las vacunas polinucleotido-basadas. - Google Patents
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Abstract
Sal (+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium.
Description
Composiciones adyuvantes para realzar
inmunorespuestas a las vacunas
polinucleótido-basadas.
La presente invención se refiere generalmente a
adyuvantes y composiciones inmunogénicas útiles para la vacunación
basada en polinucleótidos. La presente invención proporciona
composiciones útiles para mejorar la respuesta inmune,
especialmente la respuesta inmune humoral de los vertebrados a
vacunas con base de polinucleótidos. En particular, la presente
invención proporciona un adyuvante de mezcla de
citofectina:co-lípido en el cual la citofectina es
una sal de
(\pm)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceneiloxi)-1-propanaminio,
preferentemente bromuro.
A finales de los 1980, se descubrió que la
inyección intramuscular directa (i.m.) de complejos
lípido-ADN resultaban en expresión proteína
medible, y que el plásmido ADN "desnudo" (pADN) es tomado y
expresado en el músculo en una extensión mayor que los complejos
lípido-ADN (Felgner, Scientific American,
276(6), 102-106 (1997)).
Una de las primeras aplicaciones de la
tecnología de la inyección pADN fue la inducción de una respuesta
inmune. En 1991, se informó por primera vez que las ratas podían ser
inmunizadas contra el HIV gp120 mediante vacunación i.m. con gp120
plásmido ADN (Felgner et al., Nature, 349,
351-352 (1991)), y que las ratas podían ser
protegidas de una amenaza letal del virus de la influenza después de
la inmunización de ADN con antígeno nucleoproteína (NP) influenza.
La protección obtenida después de la inmunización con el antígeno
altamente conservado NP se extendía a través de 2 cepas virales
diferentes (Ulmer et al., Current Opinions In Immunology, 8,
531-536 (1996)). Numerosas publicaciones en el campo
de la vacunación con base de polinucleótido siguieron a
continuación (por ejemplo, Boyer et al., J. Med. Primatology,
25(3), 242-250 (1996); Boyer et al.,
Nature Medicine, 3(5), 526-532 (1997); Davis
et al., Vacuna, 15(8), 849-852 (1997);
Wang et al., Vacuna, 15(8), 821-825
(1997); Agadjanyan et al., Current Topics In Microbiology And
Immunology, 226, 175-192 (1998); Heppell et
al., Fish & Shellfish Immunology, 8(4),
271-286 (1998); Lodmell et al., Nature
Medicine, 4(8), 949-952 (1998); Vanderzanden
et al., Virology, 246(1), 134-144
(1998)).
Un gran problema frecuentemente encontrado en el
curso de la vacunación con base de polinucleótido es la
insuficiente o sub-óptima respuesta humoral. Con frecuencia, los
antígenos o inmunogenes codificados a través del polinucleótido son
expresados in vivo, pero no son suficientemente inmunogénicas
para elevar el título del anticuerpo en el organismo a niveles
suficientes para proporcionar protección contra la siguiente
amenaza y/o para mantener el potencial para generar niveles
terapéuticamente activos de anticuerpos a lo largo de períodos de
tiempo prolongados. Para obtener una respuesta humoral y/o celular
más fuerte, es común administrar dichas vacunas en una composición
inmunogénica que contenga un adyuvante, a material que mejora la
respuesta inmune del paciente a la vacuna. Los adyuvantes son
útiles generalmente para mejorar la respuesta inmune de un
organismo a un inmunogen particular y comúnmente se incluyen en
composiciones de vacunas para incrementar la cantidad de
anticuerpos producidos y/o para reducir la cantidad del inmunogen y
la frecuencia de administración.
Se han descrito una variedad de adyuvantes que
realizan diferentes niveles de mejora de la respuesta inmune a la
vacunación con base de polinucleótido. Ejemplos de dichos materiales
adyuvantes incluyen mono-fosforil lípido A
semi-sintético derivado de la pared bacteriana
(Sasaki, S., et al., Infection and Immunity 65(9),
3250-3258 (1997)), pequeñas moléculas
inmunoestimuladoras (Sasaki, S., et al., Clin. Exp. Immunol.
111, 30-35 (1998)), y saponinas (Sasaki, S., et
al., J. Virology 72(6), 4391-4939
(1998)). La respuesta inmune a partir de vacunación i.m. pADN
también se ha mejorado a través del uso de lípidos catiónicos
(Ishii, N., et al., Aids Res. Hum. Retroviruses
13(16), 1421-1428 (1997)), Okada, E., et
al., J. Immunology 159, 3638-3647 (1997);
Yokoyama, M., et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 14,
221-230 (1996); Gregoriadis, G., et al., FEBS
Letters 402, 107-110 (1997); Gramzinski, R.A.,
et al., Molecular Medicine 4, 109-118 (1998);
Klavinskis, L.S., et al., Vacuna 15(8),
818-820 (1997); Klavinskis, L.S., et al., J.
Immunology 162, 254-262 (1999); Etchart, N., et
al., J. Gen. Virology 78, 1577-1580 (1997);
Norman, J., et al., in Methods in Molecular Medicine, Vol.
9; ADN Vacunas: Methods and Protocols, D.B. Lowrie and R. Whalen,
eds., Chapter 16, pp. 185-196 (1999); WO 97/19675).
Los lípidos catiónicos fueron originalmente estudiados como
citofectinas para mejorar la entrega del pADN dentro de las células
in vitro; sin embargo, el desarrollo adicional ha conducido a
aplicaciones eespecíficaas exitosas de entrega de proteína in
vivo (Wheeler, C.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93, 11454-11459 (1996); Stephan, D.J., et
al., Human Gene Therapy 7, 1803-1812 (1996);
DeBruyne, L.A., et al., Gene Therapy 5,
1079-1087 (1998)). Por consiguiente, dichas
citofectinas pueden ser útiles para aplicaciones de vacunas
mediante la mejora en la entrega del pADN dentro de las células
responsables de dar lugar al brazo humoral de la respuesta inmune,
incrementando así los niveles título del anticuerpo.
Los adyuvantes comúnmente utilizados muestran
bajos niveles de mejora de la respuesta inmune para vacunación
(habitualmente menor a 3 veces) y poseen perfiles toxicológicos y de
fabricación indeseables. Por otra parte, los lípidos catiónicos
utilizados con anterioridad para la vacunación muestran solo bajos
niveles de mejora humoral. Existe una necesidad de más
composiciones adyuvantes útiles para mejorar la respuesta inmune de
los vertebrados para la inmunización, especialmente de vacunación
pADN.
Un aspecto de la presente invención es una
composición inmunogénica que comprende uno o más inmunogenes y la
composición adyuvante de la presente invención. En ciertas
realizaciones, la fuente del inmunogen es un polinucleótido que
codifica al inmunogen, tal como en el caso de una vacuna pADN.
Preferentemente, en aquellas realizaciones, el pADN o
polinucleótido está complejado con una composición adyuvante que
comprende una sal de
(\pm)-N-(1-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis-(sin-9-tetradeceneiloxi)-1-propanaminio
y uno o más co-lípidos.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de la composición inmunogénica en la fabricación de un medicamento
para tratar o prevenir una condición de enfermedad en un vertebrado
en el cual dicha composición debe administrarse dentro de un tejido
o cavidad del vertebrado donde el inmunogen se expresa en una
cantidad suficiente para generar una respuesta inmune al inmunogen
codificado.
La presente invención está dirigida a adyuvantes
y inmunogénicas composiciones. La vacunación con base de
polinucleótido de un vertebrado ayuda a proteger al vertebrado de
una enfermedad, es adecuada para tratar una enfermedad del
vertebrado, o ambos. El polinucleótido que codifica al inmunogen,
ante la incorporación dentro de las células del vertebrado, produce
una cantidad inmunológicamente efectiva de un inmunogen (por
ejemplo, una proteína inmunogénica).
La composición adyuvante de la presente
invención mejora la respuesta inmune del vertebrado al
inmunogen.
La presente invención, en contraste con la
técnica anterior, es útil para mejorar la respuesta humoral inmune
de un vertebrado a una vacuna a base de polinucleótido, a través del
uso de una sal de
(\pm)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceneiloxi)-1-propanaminio.
La elevación de los niveles de anticuerpos es particularmente
ventajosa en aplicaciones en las que los niveles de anticuerpo a
partir del que se codifica solo al polinucleótido inmunogen son
sub-óptimos. En una ventaja relacionada, si el nivel deseado de
anticuerpos se produce con una dosis dada de pADN, la cantidad de
pADN necesario para alcanzar el título predeterminado del nivel de
anticuerpos puede alcanzarse usando una dosis menor de pADN. Para
las aplicaciones de vacuna pADN, esta ventaja es importante porque
volúmenes aceptables de vacunación, acoplados a los límites
funcionales en la concentración de pADN, definen un límite superior
en una dosis dada de vacuna. Esta ventaja es particularmente
beneficiosa para las vacunas que contengan múltiples plásmidos,
cada uno de los cuales debe estar presente en suficiente cantidad
para provocar una respuesta inmune a este transgen particular.
Los siguientes aspectos y ventajas de la
presente invención serán fácilmente evidentes a un entendido en la
técnica haciendo referencia a las figuras y la descripción detallada
a continuación.
La figura 1 ilustra los diagramas de plásmido
ADNs. Cada vector tiene un origen de replicación pUC19 y un gen de
resistencia kanamicina para crecimiento plásmido en la bacteria
E. coli. CMV = promotor y mejorador del citomegalovirus
humano; CMV-A = intrón de citomegalovirus humano A;
mRGB = señal de poliadenilación de \beta-globina
modificada de conejo; BGH = señal de poliadenilación de hormona de
crecimiento bovina.
La figura 2 ilustra las estructuras químicas
para la citofectina
(\pm)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceneiloxi)-1-propanaminio
y los co-lípidos DOPE y DPyPE, junto con
citofectinas estructuralmente relacionadas.
La figura 3 es un gráfico de barras que
demuestra que los elementos estructurales de las citofectinas
determinan el nivel de la estimulación del anticuerpo con la
administración. Las ratas fueron inmunizadas usando pADN que
codificaba la proteína nuclear de la influenza (NP), complejado con
varias citofectinas (identificadas sobre el eje horizontal)
formuladas como una 1:1 (mol:mol) mezcla con DOPE
co-lípido. Cada animal en el grupo de ensayo (cinco
animales por grupo) se inyectó el día "0" y a las 3 semanas
(inyección de impulso) con 5 \mug pADN en 50 \mul de suero
salino fisiológico por pata en el músculo recto anterior , ya sea
solo o como un complejo con un adyuvante
citofectina:co-lípido. Después de 6 semanas (3
semanas después del impulso), se extrajo suero de los animales y se
determinó el título NP de los anticuerpos mediante dilución seriada
usando un ensayo ELISA. Se evaluó la mejora de
citofectina:co-lípido usando la relación de (i) la
media geométrica del título (GMT) de un grupo de
citofectina-transfección aumentado a (ii) la GMT de
la transfección pADN sola, usando un grupo equivalente de animales
de control.
La figura 4 es un gráfico de barras que ilustra
la mejora diferencial de las respuestas de anticuerpos
anti-NP a las citofectinas mediante el uso de DPyPE
en lugar de DOPE como el co-lípido en la composición
adyuvante. Las ratas fueron inmunizadas y analizadas como se
describió con anterioridad en relación con la figura 2.
La figura 5 ilustra la respuesta a la dosis de
vacunación de pADN-Vaxfectin y el transcurso del
tiempo. BALB/c las ratas (8-10 semanas de edad)
recibieron inyecciones intramusculares bilaterales de 1 \mug, 5
\mug o 25 \mug de VR4700 plásmido ADN desnudo que codifica la
proteína nuclear de la influenza (NP) en 50 \mul PBS por músculo
(por lo tanto, 2 \mug, 10 \mug o 50 \mug pADN total por punto
en el tiempo). Un segundo juego de ratas recibió las mismas dosis de
pADN formuladas con Vaxfectin usando una relación constante
pADN:catiónico lípido molar de 4:1. Las inyecciones de impulso se
dieron en los días 21 y 42 (flechas). Se determinaron los títulos
anti-NP a partir de muestras de suero a las 3, 6 y 9
semanas. Las líneas representan el título promedio
anti-NP de los anticuerpos + S.E.M. (n = 5 ratas por
grupo).
Las figuras 6A y 6B ilustran la optimización de
la formulación de Vaxfectin. Las ratas de control recibieron
inyecciones intramusculares bilaterales de 5 \mug VR4700 plásmido
ADN desnudo que codifica la proteína nuclear de la influenza (NP) en
50 \mul PBS por músculo (barras blancas). Los grupos de ensayo
recibieron una dosis equivalente pADN formulada con Vaxfectin en las
relaciones pADN:catiónico lípido molar indicadas (barras negras).
Las inyecciones de impulse fueron idénticas a las inyecciones
iniciales, y se dieron el día 21. Se determinó el título total de
NP-específico IgG de anticuerpos a partir de
muestras de suero el día 42 (3 semanas después del impulso). Las
barras representan los títulos promedio anti-NP de
dos experimentos separados (n = 5-15 ratas por
grupo).
Las figuras 7A y 7B ilustran la duración de
títulos elevados del anticuerpo inducido mediante Vaxfectin. Las
ratas recibieron inyecciones intramusculares bilaterales ya sea de 5
\mug VR4700 plásmido ADN desnudo que codifica a la proteína
nuclear de la influenza(NP) en 50 \mul PBS por músculo, o
la misma cantidad de pADN formulado con Vaxfectin a una relación
pADN: catiónico lípido molar de 4:1. Se dieron inyecciones de
impulse idénticas ya sea el día 21 (A), o el día 21 y nuevamente a
los 3 meses (B) (flechas). Se determine el título total de
anticuerpos NP-específicos IgG a partir de muestras
de suero en varios puntos en el tiempo. Las líneas representan los
títulos promedio anti-NP + S.E.M. (n =
4-10 ratas por punto en el tiempo).
Las figuras 8A, 8B, y 8C ilustran que el pADN
formulado con Vaxfectin induce respuestas CTL que son tan robustas
como aquellas inducidas con pADN desnudo. (A) Las ratas recibieron
inyecciones intramusculares bilaterales de 5 \mug VR4700 de ADN
plásmido que codifica a la proteína nuclear de la influenza (NP) en
50 \mul PBS por músculo el día 0, 21, 42 y 63. Un Segundo juego de
ratas recibieron la misma dosis de pADN formulada con Vaxfectin en
las relaciones pADN:catiónico lípido molar indicadas. (B) Las ratas
recibieron inyecciones intramusculares bilaterales de 1 o 25 \mug
VR4700 de plásmido en 50 \mul PBS por músculo el día 0, 21, 42 y
63. Un Segundo juego de ratas recibieron las mismas dosis de pADN
formuladas con Vaxfectin con una relación pADN:catiónico lípido
molar de 4:1. (C) Las ratas recibieron inyecciones intramusculares
bilaterales de 5 \mug de plásmido VR4700 en 50 \mul 150 mM NaP
por músculo el día 0 y 21. Un segundo juego de ratas recibieron la
misma dosis de pADN formulada con Vaxfectin con una relación molar
pADN:catiónico lípido de 4:1. Todos los ensayos CTL se realizaron
4-4,5 meses después de la primera inyección. Las
líneas representan la lisis específica promedio (n =
4-5 ratas por grupo).
La figura 9 ilustra el efecto del Vaxfectin en
la expresión de la \beta-galactosidasa
(\beta-Gal) en el músculo. Las ratas recibieron
inyecciones intramusculares de 5 \mug plásmido desnudo VR1412 que
codifica a la \beta-galactosidasa. Un segundo
grupo de ratas se inyectó con 5 \mug VR1412 formulado con
Vaxfectin a una relación molar pADN:catiónico lípido de 4:1. En los
puntos de tiempo indicados, se recogieron músculos cuádriceps y se
ensayó la actividad de la \beta-Gal. Las líneas
representan la expresión indicadora promedio del gene por músculo
\pm S.E.M. (n = 10-20 músculos por grupo).
La figura 10 ilustra que el Vaxfectin mejora
respuesta humoral inmune en conejos. Se muestra el título total IgG
de los anticuerpos en el suero de conejo después de la inyección
i.m. de ADN plásmido VR4700 que codifica la proteína nuclear de la
influenza (NP). Conejos blancos de Nueva Zelanda
(5-6 meses de edad) recibieron una única inyección
unilateral ya sea de 150 \mug plásmido VR4700 solo o formulado con
Vaxfectina (relación molar pADN:catiónico lípido = 4:1) en 300
\mul PBS. En un grupo de animales (triángulos), se inyectaron
tanto pADN como pADN-Vaxfectina usando aguja y
jeringa. En otro grupo de conejos (círculos), se inyectaron pADN y
pADN-Vaxfectina usando un dispositivo de inyección
Biojector sin aguja. El día 42 (flecha), se dio a los conejos una
inyección idéntica de impulso en el músculo cuádriceps
contralateral. Se determinaron los títulos anti-NP a
partir de muestras de suero recogidas antes de la inmunización, y a
las 3, 6, 7, 9, y 13 semanas. Las líneas representan los títulos
promedio anti-NP + S.E.M. (n = 4 conejos por
grupo).
Las figuras 11A, 11B, 11C, 11D, y 11E ilustran
que la Vaxfectina mejora las respuestas específicas del suero
antígeno anticuerpo a 5 diferentes modelos de antígenos pADN
codificados. BALB/c las ratas fueron inmunizadas con inyecciones de
5 \mug pADN +/- Vaxfectina en cada músculo recto anterior a las 0
y a las 3 semanas. Los datos que se muestran son los títulos medios
del antígeno específico IgG (+/- SEM) para el suero recogido 1 día
antes del impulso, a las 3 semanas y a las 6 semanas. (n = 20 para
todos los grupos, excepto para NP donde n = 29 para NP pADN desnudo;
n = 30 para NP pADN/Vaxfectina y ratón Id donde n = 19 para pADN
desnudo.) A) Títulos anti-influenza NP IgG; B)
Títulos anti-influenza HEL IgG; C) Títulos
anti-\beta-gal IgG; D) Títulos
anti-ratón Id IgG; E) Títulos
anti-Factor IX IgG. *Diferencia estadísticamente
significativa a partir de los títulos obtenidos con pADN desnudo,
p\leq0.05.
Las figuras 12A, 12B, 12C, y 12D ilustran que ña
inmunización con pADN formulado con citofectina induce la lisis del
antígeno específico CTL de células objetivo revestidas con péptidos
derivados antígeno. BALB/c las ratas fueron inmunizadas con
inyecciones de 5 \mug pADN +/- Vaxfectina en cada músculo recto
anterior a las 0 y 3 semanas. Se recogieron los bazos
11-12 semanas a continuación de las inmunizaciones
iniciales y se estimularon durante 5-6 días con 1
\muM NP_{147-155} o péptido
\beta-gal_{876-884} y 0,5 U/ml
de murina recombinante IL-2. Los datos presentados
son % promedio de lisis para 5 bazos en cada grupo. Se obtuvieron
resultados similares en un segundo ensayo tanto para NP como para
\beta-gal específica CTL. A) Células objetivo P815
impulsadas con péptido NP_{147-155}; B) Células
objetivo no impulsadas P815; C) células objetivo P815 impulsadas con
péptido \beta-gal_{876-884}; D)
Células objetivo P815no impulsadas.
Las figuras 13A y 13B ilustran perfiles del
isotipo Th1 de los anticuerpos antígenos específicos inducidos con 5
diferentes antígenos modelos codificados pADN. Títulos de suero de
sub-isotipos de antígeno específico están presentes
como un porcentaje de la suma de los títulos de IgG1 y IgG2a. (n =
20 para todos los grupos, excepto para NP donde n = 29 para NP pADN
desnudo; n = 30 para NP pADN/Vaxfectin y Id de ratón fue n = 19 para
pADN desnudo.) A) Porcentaje de IgG 1 y IgG2a a las 6 semanas a
continuación de las inmunizaciones de pADN desnudo. B) Porcentaje de
IgG 1 y IgG2a a las 6 semanas a continuación de las inmunizaciones
pADN/Vaxfectin.
Las figuras 14A y 14B ilustran perfiles de
secreción de citocina tipo Th1 de esplenocitos a partir de ratas
inmunizadas con pADN/Vaxfectina. Los bazos se recogieron
11-12 semanas a continuación de las inmunizaciones
iniciales y fueron estimuladas durante 72 horas con 5 \mug/ml de
NP purificado o proteína \beta-gal.
IFN-\gamma y IL-4 en cultivos
sobrenadantes fueron determinados mediante ELISA. Los datos
presentados son la concentración promedio de citocina a partir de
cultivos de esplenocitos estimulados menos la concentración de
citocina a partir de cultivos de esplenocitos no estimulados
(+/-SEM). A) Respuesta al antígeno específico IFN-y
de los esplenocitos a partir de ratas inmunizadas con pADN desnudo y
con pADN/citofectina (n=10 para cada grupo). B) Respuesta al
antígeno específico IL-4 de esplenocitos a partir de
ratas inmunizadas con pADN desnudo y pADN/Vaxfectin (n=10 para cada
grupo).
La presente invención está dirigida a la
inmunización con base de un polinucleótido de un vertebrado, para
proteger o para tratar a un vertebrado con una condición de
enfermedad. La presente invención incluye el uso de citofectina
(\pm)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceneiloxi)-1-propanaminio
en adyuvantes y composiciones inmunogénicas para inmunizar un
vertebrado, especialmente con un inmunogen con base de
polinucleótido.
La composición adyuvante de la presente
invención incluye una citofectina que es una sal de
(\pm)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis-(sin-9-tetradeceneiloxi)-1-propanimio
y uno y uno o más co-lípidos. Las citofectinas son
los lípidos catiónicos y la citofectina empleada en la presente
invención tiene una estructura que corresponde a un esqueleto
2,3-dialkoxy-propanaminio que posee
una única combinación de dos cadenas lineares de catorce alquilos de
carbono mono-insaturados y un sustituyente
propilamina en el nitrógeno cuaternario (Ver Fig. 2).
La composición adyuvante de la actual invención
incluye una citofectina que sea una sal
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
y uno o más co-lípidos. Citofectinas son lípidos
catiónicos y la citofectina empleada en la actual invención tiene
una estructura que corresponde a un esqueleto del
2,3-dialkoxi-propanaminium que posee
una combinación única de dos cadenas alquílicas mono no saturadas
de catorce carbón linear y de un substituyente de la propilamina en
el nitrógeno cuaternario (véase fig. 2).
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
contiene un grupo de características estructurales sinérgicas,
ninguno de los cuales cuando está incorporado individualmente en el
esqueleto produce actividad óptima. Así, referente a fig. 3,
examinando el grupo DMRIE
((+/-)-N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanaminium
bromuro), DLRIE
((+/-)-N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(dodeciloxi)-1-propanaminium
bromuro y DDRIE
((+/-)-N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(deciloxi)-1-propanaminium bromuro)
y comparando el grupo GAP-DMRIE
((+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-(bis-tetradeciloxi)-1-propanaminium
bromuro), GAP-DLRIE
((+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-(bis-dodeciloxi)-1-propanaminium
bromuro) y GAP-DLRIE
((+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-(bis-hexadeciloxi)-1-propanaminium
bromuro), es evidente que catorce cadenas de carbón son más activas
(es decir, saque mayores niveles de estímulo del anticuerpo)
concerniente a otras longitudes de cadena, si el nitrógeno
cuaternario está substituido con una fracción hidroxietílica (grupo
anterior) o con una fracción del propilamino (último grupo).
Comparando DMRIE contra GAP-DMRIE (véase fig. 3),
él aparece que la incorporación de un grupo del propilamino en lugar
de un grupo hidroxietílico no ofrece ninguna ventaja evidente.
Semejantemente, DMRIE y DMORIE son igualmente activos a pesar de la
incorporación de una olefina en en la cadena del
catorce-carbón. Sin embargo, incorporando la
combinación de un substituyente propilamino y una fracción de la
olefina,
((+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
aparece ser más activo que DMORIE o GAP-DMRIE,
basado en el título medio geométrico (GMT) concerniente a ése para
el pDNA solamente (fig. 3). Además, DOSPA
(2,3-dioleiloxi-N-(2-(esperminacarboxamido)etil)-N,N-dimetil-1-propanaminium
pentacloridrato), que incorpora una olefina en sus cadenas
alquílicas del dieciocho-carbón y un substituyente
del amonio de cuaternario conteniendo amino, es no sólo menos activo
que DORIE
((+/-)-N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-octadeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro), que es equivalente a excepción de la substitution del
amónio cuaternario, pero disminuye dramáticamente el nivel de
títulos del anticuerpo concerniente a ésos vistos para el pDNA
solamente. La sal preferida
((+/-)-N-(3-aminopropil)-N,
N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
para el uso en la actual invención es la sal del bromuro; sin
embargo, todas las sales convenientes
((+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
son abarcadas por el término
((+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium.
Con objeto de la definición, el término
"co-lípido" refiere a cualquier material
hidrofóbico que se pueda combinar con el componente de la
citofectina
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium.
El co-lípido de la actual invención puede ser
lípidos anfipáticos y lípidos neutrales. Los lípidos anfipáticos
incluyen los fosfolípidos, por ejemplo, fosfatidiletanolaminas y
fosfatidilcolinas. Los lípidos neutrales incluyen el colesterol. En
una incorporación preferible, fosfatidiletanolaminas incluyen DOPE,
DMPE, y DPyPE. DOPE y DpyPE son particulalry preferidos; el
co-lípido preferido es DpyPE, que abarca dos
substituyentes fitanoil incorporados en el
diacilfosfatidileanolamina. Según lo ilustrado por fig. 3, la
combinación de la citofectina
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
con el co-lípido DPyPE resulta en un efecto
sinérgico para realzar más la inmunorespuesta humoral, según lo
evidenciado por el nivel de títulos del anticuerpo de la
inmunización del pDNA.
Según la presente invención, las citofectinas y
los co-lípidos pueden ser mezclados o combinados de
un número de maneras de producir una variedad de composiciones
adyuvantes de las estructuras macroscópicas no covalentemente
consolidadas, por ejemplo, liposomas, vesícula multilamellar,
vesícula unilamellar, micelas, y películas simples. Las
citofectinas y los co-lípidos se pueden mezclar en
una variedad de cocientes molares. Preferiblemente, el cociente
molar
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
y el co-lípido es a partir del 9: 1 a 1: 9,
preferiblemente, el cociente molar es a partir del 4: 1 a 1: 4, o a
partir del 2: 1 a 1: 2. Más preferiblemente, el cociente molar es 1:
1.
Las citofectinas y los
co-lípidos se pueden disolver en un solvente para
aumentar el homogeneidad de la mezcla. Los solventes convenientes
incluyen el cloroformo. Por ejemplo,
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
se puede mezclar con uno o más co-lípidos en
cloroformo, la mezcla se evapora posteriormente bajo vacío para
formar una capa delgada secada de la película en la superficie
interna de un recipiente de cristal, por ejemplo, un frasco de
fondo redondo de Rotovap. Tal mezcla secada se puede suspender en un
solvente acuoso donde las moléculas del componente de lípido
anfipático se montan en las vesículas homogéneas del lípido. Estas
vesículas del lípido se pueden procesar posteriormente por
cualquier método usado en el arte para tener un diámetro medio
seleccionado del tamaño uniforme antes de complejar con otras
entidades, por ejemplo, pDNA. La sonicación de una solución del
lípido se describe en Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
Los E.E.U.U. 84.7413-7417 (1987) y en la patente US
No. 5.264.618.
Las composiciones adyuvantes de la actual
invención pueden incluir los añadidos tales como añadidos
hidrofóbicos y anfifílicos. Por ejemplo, la composición adyuvante
puede incluir los esteroles, los ácidos grasos, los gangliósidos,
los glicolípidos, los lipopéptidos, los liposacáridos, los neobees,
los niosomas, las prostaglandinas o los esfingolípidos. La cantidad
de añadidos incluidos en el coadyuvante puede ser cualquiera que
incluye de cerca de 0.1 mol % a cerca de 99.9 mol %, de cerca de 1
mol % a cerca de 50 mol %, y de cerca de 2 mol % a cerca de 25 mol
%, concerniente a la cantidad total de lípido. Estos añadidos se
pueden también incluir en una composición inmunogénica que contiene
la composición adyuvante de la actual invención.
La composición inmunogénica de la actual
invención incluye una composición adyuvante como se describe
anteriormente y un inmunógeno. Un "inmunógeno" se significa
abarcar cualquier polipéptido antigénicos o inmunogénico incluyendo
los materiales poli-aminoácidos que tienen epitopos
o combinaciones de epitopos, y polinucleótidos que codifican
inmunógeno. Además, un "inmunógeno" también se significa
abarcar cualquier material del polisacárido útil en la generación
de la respuesta inmune. Según lo utilizado adjunto, un polipéptido
antigénico o un polipéptido inmunogénico es un polipéptido que,
cuando está introducido en un vertebrado, reacciona con las
moléculas del sistema inmune del vertebrado, es decir, es
antigénico y/o induce una inmunorespuesta en el vertebrado, es
decir, es inmunogénico. Es absolutamente probable que un polipéptido
inmunogénico también sea antigénico, pero un polipéptido
antigénico, debido a su tamaño o conformación, puede necesariamente
no ser inmunogénico. Los ejemplos de polipéptidos antigénicos e
inmunogénicos incluyen, los polipéptidos de agentes infecciosos
tales como bacterias, virus, parásitos, u hongos, alergénicos tales
como ésos de pet dander, plantas, polvo, y otras fuentes
ambientales, así como ciertos auto polipéptidos, por ejemplo,
antígenos asociados a tumor.
Los polipéptidos antigénicos e inmunogénicos de
la actual invención son útiles para prevenir o para tratar, es
decir, curar, mejorar, disminuir la severidad de, o prevenir o para
reducir el contagio de enfermedades infecciosas virales,
bacterianas, fungicidas, y parásitas, así como para tratar
alergias.
Además, los polipéptidos antigénicos e
inmunogénicos de la actual invención son útiles para prevenir o
para tratar, es decir, curar, mejorar, o disminuir la severidad del
cáncer incluyendo, pero no limitado a, cánceres de la cavidad bucal
y de la faringe (es decir, lengüa, boca, faringe), sistema digestivo
(es decir., esófago, estómago, pequeño intestino, colon, recto,
ano, canal anal, anorectum, hígado, vesícula biliar, páncreas),
sistema respiratorio (es decir., laringe, pulmón), huesos, empalmes,
tejido blando (corazón incluyendo), piel, melanoma, pecho, órganos
reproductivos (es decir, cuello del útero, endometrio, ovario,
vulva, vagina, próstata, testículo, pene), sistema urinario (es
decir, vejiga urinaria, riñón, uréter, y otros órganos urinarios),
ojo, cerebro, sistema endocrino (es decir, la tiroides y la otra
endocrina), linfoma (es decir, enfermedad de hodgkin, linfoma
no-hodgkin), mieloma múltiple, leucemia (es decir,
leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia
mieloide aguda, leucemia mieloide crónica).
Los ejemplos de polipéptidos antigénicos e
inmunogénicos virales incluyen, los polipéptidos del adenovirus,
polipéptidos del alfavirus, polipéptidos del calicivirus, por
ejemplo, un antígeno del capsid del calicivirus, polipéptidos del
coronavirus, polipéptidos del virus de enfermedad, polipéptidos del
virus de Ebola, polipéptidos del enterovirus, polipéptidos del
flavivirus, polipéptidos del virus de hepatitis (AE), un antígeno
por ejemplo, de la hepatitis B de la base o de la superficie,
polipéptidos del herpesvirus, una glicoproteína del virus del
zoster por ejemplo, de herpes del simplex del virus o de la
varicela, polipéptidos del virus de la inmunodeficiencia, por
ejemplo, el sobre o la proteasa, polipéptidos infecciosos del virus
de la peritonitis, polipéptidos del virus de gripe, por ejemplo,
una hemaglutinina, una neuraminidasa, o una nucleoproteína de la
gripe A, polipéptidos del virus de la leucemia, los polipéptidos
del virus de inmunodeficiencia humana del virus de Marburg,
polipéptidos del ortomixovirus, polipéptidos del virus del
papiloma, polipéptidos del virus de parainfluenza, por ejemplo, el
hemaglutinina/la neuraminidasa, polipéptidos del paramixovirus,
polipéptidos del parvovirus, polipéptidos del pestivirus,
polipéptidos del virus del picoma, por ejemplo, un polipéptido del
capsid del virus de la polio, polipéptidos del virus de sífilis,
por ejemplo, un polipéptido del virus de la vacuna, polipéptidos
del virus de rabia, por ejemplo, una glicoproteína G del virus de
rabia, polipéptidos del reovirus, polipéptidos del retrovirus, y
polipéptidos del rotavirus.
Los ejemplos de polipéptidos antigénicos e
inmunogénicos bacterianos incluyen los polipéptidos de los
actinomicetos, bacilo polipéptidos, polipéptidos del bacteroide,
polipéptidos de Bordetella, polipéptidos de Bartonella,
polipéptidos del Borrelia, por ejemplo, burgdorferi OspA,
polipéptidos de la brucella, polipéptidos del Campylobacter,
polipéptidos de Capnocytophaga, polipéptidos del Chlamydia,
polipéptidos del clostridium, polipéptidos del corynebacterium,
polipéptidos del coxiella, polipéptidos del Dermatophilus,
polipéptidos del Enterococcus, polipéptidos del Ehrlichia,
polipéptidos del Escherichia, polipéptidos del Francisella,
polipéptidos del Fusobacterium, polipéptidos del Haemobartonella,
polipéptidos del Haemophilus, por ejemplo, proteína de membrana
externa H. influenzae tipo b, polipéptidos del Helicobacter,
polipéptidos del Klebsiella, polipéptidos del
L-form bacteria, polipéptidos del Leptospira,
polipéptidos del Listeria, polipéptidos del Mycobacteria,
polipéptidos del Mycoplasma, polipéptidos del Neisseria,
polipéptidos del Neorickettsia, polipéptidos del Nocardia,
polipéptidos del Pasteurella, polipéptidos del Peptococcus,
polipéptidos del Peptostreptococcus, polipéptidos del Pneumococcus,
polipéptidos del Proteus, polipéptidos del Pseudomonas, polipéptidos
del Rickettsia, polipéptidos del Rochalimaea, polipéptidos del
Salmonella, polipéptidos del Shigella, polipéptidos del
Staphylococcus, polipéptidos del Streptococcus, por ejemplo, S.
pyogenes M proteins, polipéptidos del Treponema, y polipéptidos del
Yersinia, por ejemplo, pestis F1 del Y. y antígenos de V.
Los ejemplos de polipéptidos inmunogénicos y
antigénicos fungicidas incluyen, los polipéptidos de la ábside,
polipéptidos de Acremonium, polipéptidos de la alternaria,
polipéptidos del aspergillus, polipéptidos de Basidiobolus,
polipéptidos de Bipolaris, polipéptidos del Blastomyces,
polipéptidos de la candida, polipéptidos de Coccidioides,
polipéptidos de Conidiobolus, polipéptidos del criptococo,
polipéptidos de Curvalaria, polipéptidos de Epidermophyton,
polipéptidos de Exophiala, polipéptidos de Geotrichum, polipéptidos
de Histoplasma, polipéptidos de Madurella, polipéptidos de
Malassezia, polipéptidos del microsporum, polipéptidos de
Moniliella, polipéptidos de Mortierella, polipéptidos del Mucor,
polipéptidos de Paecilomyces, polipéptidos del penicillium,
polipéptidos de Phialemonium, polipéptidos de Phialophora,
polipéptidos de Prototheca, polipéptidos de Pseudallescheria,
polipéptidos de Pseudomicrodochium, polipéptidos de Pythium,
polipéptidos de Rhinosporidium, polipéptidos de Rhizopus,
polipéptidos de Scolecobasidium, polipéptidos de Sporothrix,
polipéptidos de Stemphylium, polipéptidos de Trichophyton,
polipéptidos de Trichosporon, y polipéptidos de Xylohypha.
Los ejemplos del parásito del protozoario
inmunogénicos y los polipéptidos antigénicos incluyen los
polipéptidos de Babesia, polipéptidos de Balantidium, polipéptidos
de Besnoitia, polipéptidos de Cryptosporidium, polipéptidos de
Eimeria, polipéptidos de Encephalitozoon, polipéptidos de Entamoeba,
polipéptidos de Giardia, polipéptidos de Hammondia, polipéptidos de
Hepatozoon, polipéptidos de Isospora, polipéptidos de Leishmania,
polipéptidos de Microsporidia, polipéptidos de Neospora,
polipéptidos de Nosema, polipéptidos de Pentatrichomonas,
polipéptidos de Plasmodium, por ejemplo, P. falciparum
circumsporozoite (PfCSP), proteína de la superficie de esporozoite
2 (PfSSP2), terminal carboxil de antígeno de hígado 1 (PfLSA1
c-term), y proteína exportada 1
(PfExp-1), polipéptidos de Pneumocystis,
polipéptidos de Sarcocystis, polipéptidos de Schistosoma,
polipéptidos de Theileria, polipéptidos de Toxoplasma, y
polipéptidos de Trypanosoma.
Los ejemplos del parásito del helminto
inmunogénicos y los polipéptidos antigénicos incluyen el
polipéptidos de Acanthocheilonema, polipéptidos de
Aelurostrongylus, polipéptidos de Ancylostoma, polipéptidos de
Angiostrongylus, polipéptidos del ascaris, polipéptidos de Brugia,
polipéptidos de Bunostomum, polipéptidos de Capillaria,
polipéptidos de Chabertia, polipéptidos de Cooperia, polipéptidos de
Crenosoma, polipéptidos de Dictyocaulus, polipéptidos de
Dioctophyme, polipéptidos de Dipetalonema, polipéptidos de
Diphyllobothrium, polipéptidos de Diplydium, polipéptidos de
Dirofilaria, polipéptidos de Dracunculus, polipéptidos de
Enterobius, polipéptidos de Filaroides, polipéptidos de Haemonchus,
polipéptidos de Lagochilascaris, polipéptidos de Loa, polipéptidos
de Mansonella, polipéptidos de Muellerius, polipéptidos de
Nanophyetus, polipéptidos de Necator, polipéptidos de Nematodirus,
polipéptidos de Oesophagostomum, polipéptidos de Onchocerca,
polipéptidos de Opisthorchis, polipéptidos de Ostertagia,
polipéptidos de Parafilaria, polipéptidos de Paragonimus,
polipéptidos de Parascaris, polipéptidos de Physaloptera,
polipéptidos de Protostrongylus, polipéptidos de Setaria,
polipéptidos de Spirocerca, polipéptidos de Spirometra,
polipéptidos de Stephanofilaria, polipéptidos de Strongyloides,
polipéptidos de Strongylus, polipéptidos de Thelazia, polipéptidos
de Toxascaris, polipéptidos de Toxocara, polipéptidos de
Trichinella, polipéptidos de Trichostrongylus, polipéptidos de
Trichuris, polipéptidos de Uncinaria, y polipéptidos de
Wuchereria.
Los ejemplos del ectoparásito inmunogénicos y
los polipéptidos antigénicos incluyen, los polipéptidos (antígenos
protectores incluyendo así como los alergénicos) de pulgas; señales,
incluyendo señales duras y señales suaves; las moscas, tales como
jejenes, los mosquitos, arena vuelan, las moscas negras, tábano,
cuerno vuelan, los ciervos vuelan, tsetse vuelan, las moscas de los
establos, moscas y mosquitos penetrantes causando miasis; hormigas;
arañas, piojos; ácaros; e insectos verdaderos, tales como insectos
de cama e insectos que se besan.
Los ejemplos de polipéptidos antigénicos e
inmunogénicos tumor-asociados incluyen las regiones
variables de la inmunoglobulina tumor-específica,
GM2, Tn, sTn, antígeno de Thompson-Friedenreich
(TF), Globo H, Le (y), MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7,
antígenos carcinoembrionarios, cadena beta de la gonadotropina
coriónica humana (hCG beta), HER2/neu, PSMA, EGFRvIII, KSA, PSA,
PSCA, GP100, MAGE 1, MAGE 2, TRP 1, TRP 2, tirosinasa,
MART-1, PAP, el CEA, BAGE, MAGE, RABIA, y proteínas
relacionadas.
También incluidos como los polipéptidos de la
actual invención son fragmentos o variantes de los polipéptidos
precedentes, y cualquier combinación de los polipéptidos
precedentes. Los polipéptidos adicionales se pueden encontrar, por
ejemplo en "Fundations in Microbiology", Talaro, et al.,
eds., McGraw-Hill Companies Colina (el octubre de
1998), Fields, et al., "Virology", 3ª ed.,
Lippincott-Raven (1996), "Biochemistry and
Molecular Biology of Parasites", Marr, et al., eds.,
Academic Press (1995), y Deacon, J., "Modem Micology",
"Blackpozo Science Inc" (1997).
El polinucleótido que codifica inmunógeno se
piensa abarcar un "polinucleótido" singular así como
"polinucleótidos" plurales, y se refiere a una molécula o a un
constructo aislado. Los polinucleótidos que codifican inmunógeno
incluyen secuencias de nucleótido, los ácidos nucléicos, los
oligómeros del ácido nucléico, el RNA mensajero (mRNA), el DNA (por
ejemplo, pDNAs, derivados del pDNA, DNA linear), o fragmentos de
cualquiera de estos. Los polinucleótidos que codifican inmunógeno
se pueden proporcionar en forma linear, circular, por ejemplo,
plásmido, o ramificada así como forma de cadena doble o cadena
simples. Los polinucleótidos que codifican inmunógeno pueden
abarcar un enlace fosfodiéster convencional o un enlace fosfodiéster
no convencional, por ejemplo, un enlace de la amida, tal como
encontrado en los ácidos nucléicos del péptido (PNA).
Según la actual invención, el polinucleótido que
codifica inmunógeno puede ser parte de un plásmido circular o
linearizado que contiene un polinucleótido no contagioso y de
no-integración. Un polinucleótido no contagioso es
un polinucleótido que no infecta las células vertebradas mientras
que un polinucleótido de no-integración no integra
en el genoma de células vertebradas. Un plásmido linearizado es un
plásmido que era previamente circular pero ha sido linearizado, por
ejemplo, por la digestión con un endonuclease de la restricción. El
polinucleótido que codifica inmunógeno puede abarcar una secuencia
que dirige la secreción de un polipéptido.
La forma de polinucleótido que codifica
inmunógeno depende en parte de la cinética y de la duración
deseadas de la expresión. Cuando la entrega de largo plazo de una
proteína codificada por un polinucleótido se desea, la forma
preferida es DNA. Alternativamente, cuando se desea la entrega a
corto plazo de la proteína del transgén, la forma preferida es
mRNA, puesto que el mRNA se puede traducir rápidamente al
polipéptido, no obstante el RNA se puede degradar más rápidamente
que el DNA.
En una encarnación, el polinucleótido que
codifica inmunógeno es RNA, por ejemplo, RNA de mensajero (mRNA).
Los métodos para introducir secuencias del RNA en las células
mamíferas se describen en la patente No. 5.580.859 de los E.E.U.U.
Un alphavector viral, un vector no contagioso útil para administrar
el RNA, se puede utilizar para introducir el RNA en las células
mamíferas. Los métodos para la introducción in vivo de
vectores alphaviral a los tejidos mamíferos se describen en
Altman-Hamamdzic, S., et al., Gene Therapy 4,
815-822 (1997).
Preferiblemente, el polinucleótido que codifica
inmunógeno es DNA. En el caso de el DNA, un promotor
preferiblemente se une de manera operable a la secuencia de
nucleótido que codifica para el inmunógeno. El promotor puede ser
un promotor célula-específico que dirige la
transcripción substancial de el DNA solamente en células
predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción,
además de un promotor, se pueden incluir con el polinucleótido para
dirigir la transcripción célula-específica de el
DNA. Un acoplamiento operable es un acoplamiento en el cual una
codificación del polinucleótido para una molécula inmunogénica está
conectada con una o más secuencias reguladoras a fin de poner la
expresión del inmunógeno bajo influencia o el control de las
secuencias reguladoras. Dos secuencias de el DNA (tales como una
secuencia de codificación y una secuencia de la región del promotor
ligó el final 5' de la secuencia de codificación) se ligan de manera
operable si la inducción de la función del promotor da lugar a la
transcripción de la codificación del RNA de m para el inmunógeno
deseado y si no lo hace la naturaleza del acoplamiento entre las dos
secuencias de el DNA (1) resultado en la introducción de una
mutación de cambio de cuadro, (2) interfieren con la capacidad de
las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión
del inmunógeno, o (3) interfiere con la capacidad de la plantilla
de el DNA de ser transcrito. Así, una región del promotor
operativamente sería ligada a una secuencia de el DNA si el promotor
era capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de el
DNA.
El polinucleótido que codifica inmunógeno,
oligómero por ejemplo, del pDNA, del mRNA, del polinucleótido o del
ácido nucléico se puede solubilizar en cualesquiera de varios
almacenadores intermediarios antes de la mezcla o complexing con
los componentes adyuvantes, por ejemplo, citofectina s y
co-lípidos. Los almacenadores intermediarios
convenientes incluyen el almacenador intermediario salino, de Tris
salino (PBS), normal protegido fosfato, y el fosfato de sodio. Los
polinucleótidos insolubles se pueden solubilizar en un ácido débil o
una base débil, y después diluir al volumen deseado con un
almacenador intermediario. El pH del almacenador intermediario se
puede ajustar como apropiado. Además, un añadido aceptado
farmacéuticamente se puede utilizar para proporcionar una
osmolaridad apropiada. Tales añadidos están dentro del articulado de
la persona calificada.
Según la actual invención, los polinucleótido
que codifican inmunógeno pueden ser complejados con las
composiciones adyuvantes de la actual invención por cualquier medio
sabido en el arte, por ejemplo, mezclando una solución del pDNA y
una solución de los liposomas de citofectina
/co-lípido. En una encarnación, la concentración de
cada uno de las soluciones constitutivas se ajusta antes de mezclar
tales que el pDNA/citofectina final deseado: el cociente del
co-lípido y la concentración final deseada del pDNA
serán obtenidos sobre la mezcla de las dos soluciones. Por ejemplo,
si la solución final deseada es ser salina fisiológico (0,9%
peso/volumen), pDNA y los liposomas citofectina:
co-lípido se preparan en 0,9% salino y después se
mezclan simplemente para producir el complejo deseado. Los
liposomas citofectina: co-lípido se pueden preparar
por cualquier medio sabido en el arte. Por ejemplo, uno puede
hidratar una película fina
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
y mezcla del co-lípido en un volumen apropiado de
solvente acuoso por mezcla en vórtice en las temperaturas ambiente
para cerca de 1 minuto. La preparación de una película fina de la
mezcla de la citofectina y del co-lípido se sabe a
un artesano experto y se puede preparar por cualquier técnica
conveniente. Por ejemplo, se puede mezclar las soluciones del
cloroformo de los componentes individuales para generar un cociente
del soluto equimolar y posteriormente dosificar un volumen deseado
de las soluciones en un envase conveniente donde el solvente se
puede quitar por la evaporación, por ejemplo, primero con una
corriente del gas seco, inerte tal como argón y entonces por el
tratamiento del alto
vacío.
vacío.
Según la actual invención, la composición
inmunogénica de la actual invención se puede utilizar para
inmunizar un vertebrado. El del término "vertebrado" se piensa
abarcar un singular "vertebrado" así como plural
"vertebrados" y abarca especie mamífera y aviar, así como
pescados. Para inmunizar un vertebrado una composición inmunogénica
de la actual invención en cantidad suficiente para generar una
inmunorespuesta al inmunógeno debe ser administrada al
vertebrado.
Las composiciones inmunogénicas de la actual
invención se pueden administrar según cualesquiera de varios
métodos sabidos en el arte. Por ejemplo, patente No. 5.676.954 de
los E.E.U.U. revela la inyección del material genético, complejado
con los portadores catiónicos del lípido, en ratones. También, la
patente No. 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055 de los
E.E.U.U. y solicitud de patente internacional PCT/US94/06069 (WO
94/29469) del PCT proporciona los métodos para entregar complejos
DNA-catiónicos del lípido a los mamíferos.
Específicamente, las composiciones inmunogénicas
de la actual invención se pueden administrar a cualquier tejido de
un vertebrado, incluyendo el músculo, la piel, el cerebro, el
pulmón, el hígado, el bazo, la médula, el timo, el corazón, la
linfa, la sangre, el hueso, el cartílago, el tejido de la mucosa, el
páncreas, el riñón, la vejiga de rozadura, el estómago, el
intestino, el testículo, el ovario, el útero, el tejido vaginal, el
recto, el sistema nervioso, el ojo, la glándula, la lengüeta y el
tejido conectivo. Preferiblemente, las composiciones se administran
al músculo esquelético. Las composiciones inmunogénicas de la
invención se pueden también administrar a una cavidad de cuerpo,
incluyendo, al pulmón, a la boca, a la cavidad nasal, al estómago,
al peritoneo, al intestino, al compartimiento de corazón, a la vena,
a la arteria, al tubo capilar, al linfático, útero, vagina, recto, y
cavidad ocular.
Preferiblemente, las composiciones inmunogénicas
de la actual invención deben ser administradas por las rutas
intramusculares (i.m.) o subcutáneas (s.c.). Otras rutas de la
administración convenientes incluyen transdérmico, intranasal, la
inhalación, intratraqueal, transmucosal (es decir, a través de una
membrana mucosa), intra-cavidad (por ejemplo, oral,
vaginal, o rectal), intraocular, vaginal, rectal, intraperitoneal,
intraintestinal y la administración intravenosa (i.v.).
Cualquier modo de la administración puede ser
utilizado siempre y cuando la administración del lugar a
inmunorespuesta deseada. Los medios de la administración de la
actual invención incluyen la inyección de la aguja, infusión del
catéter, inyectores biolísticos, aceleradores de partícula (es
decir, inyector "pistola del gene" o inyector neumático "sin
aguja" - por ejemplo, MED-E-Jet
(Vahlsing, H., et al., J. Immunol. Methods 171,
11-22 (1994)), Pigjet (Schrijver, R., et
al., Vaccine 15, 1908-1916 (1997)), Biojector
(Davis, H., et al., Vaccine 12, 1503-1509
(1994); Gramzinski, R., et al., Mol. Med. 4,
109-118 (1998)), AdvantaJet, Medijector, los
depósitos de la esponja de espuma gel, otros materiales de depósito
disponibles en el comercio (por ejemplo, hidrogel), bombas
osmóticas (por ejemplo, minibombas Alza), formulaciones
farmacéuticas sólidas orales o suppositorial (tableta o píldora),
crema de piel tópica y decantando, uso de sutura cubierta de
polinucleótido (Qin et al., Life Sciences 65,
2193-2203 (1999)) o usos tópicos durante cirugía.
Los modos preferidos de la administración son inyección
aguja-basada intramuscular y uso intranasal como
solución acuosa.
La determinación de una cantidad eficaz de una
composición inmunogénica depende de un número de factores
incluyendo, por ejemplo, la estructura química y la actividad
biológica de la sustancia, la edad y el peso del tema, y la ruta de
la administración. La cantidad exacta, el número de dosis, y la
sincronización de dosis se pueden determinar fácilmente por los
expertos en la materia.
En ciertas incorporaciones, la composición
inmunogénica debe ser administrada como composición farmacéutica.
Una composición tan farmacéutica se puede formular según métodos
sabidos, por el que la sustancia que se entregará esté combinada
con un vehículo aceptado farmacéuticamente del portador. Los
vehículos convenientes y su preparación se describen, por ejemplo,
en las ciencias farmacéuticas de Remington, la décimosexto edición,
A. Osol, ed., Mack que publica el Co., Easton, PA (el an o 80), y
las Remington's Pharmaceutical Sciences, diecinueveavo edición,
A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). La
composición farmacéutica se puede formular como una emulsión, un
gel, una solución, una suspensión, una forma liofilizada, o
cualquier otra forma sabida en el arte. Además, la composición
farmacéutica puede también contener los añadidos aceptados
farmacéuticamente incluyendo, por ejemplo, los diluyentes, las
carpetas, los estabilizadores, y los preservativos. La
administración de las sales aceptadas farmacéuticamente de las
construcciones del polinucleótido descritas adjunto se prefiere.
Tales sales se pueden preparar de bases no tóxicas aceptadas
farmacéuticamente incluyendo bases orgánicas y bases inorgánicas.
Las sales derivaron de bases inorgánicas incluyen el sodio, potasio,
litio, amonio, calcio, magnesio, y similares. Las sales derivaron
de bases no tóxicas orgánicas aceptadas farmacéuticamente incluyen
las sales de aminas primarias, secundarias, y terciarias y de
aminoácidos básicos.
\newpage
Las composiciones farmacéutica acuosas refiere
utilizó in vivo, uso del agua pirógeno-libre
estéril se prefiere. Tales formulaciones contendrán una cantidad
eficaz de la composición inmunogénica junto con una cantidad
conveniente de vehículo para preparar las composiciones aceptadas
farmacéuticamente convenientes para la administración a un
vertebrado.
La actual invención también proporciona los
equipos para el uso en la entrega de un polipéptido a un
vertebrado. Cada equipo incluye un envase que sostiene 1 ng al 30 mg
de un polinucleótido que codifica inmunógeno que de manera operable
codifique un inmunógeno dentro de las células vertebradas in
vivo. Además, cada equipo incluye, en iguales o en un diverso
envase, una composición adyuvante que abarca
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
y un co-lípido. Cualesquiera de los componentes de
los equipos farmacéuticos se pueden proporcionar en un solo envase
o en envases múltiples. Preferiblemente, el equipo incluye de cerca
de 1 ng hasta cerca de 30 mg de un polinucleótido que codifica
inmunógeno, preferiblemente, el equipo incluye de cerca de 100 ng
hasta cerca de 10 mg de un polinucleótido que codifica
inmunógeno.
Cualquier envase o envase conveniente se puede
utilizar con los equipos farmacéuticos. Los ejemplos de envases
incluyen, pero no se limitan a, los envases de cristal, los envases
de plástico, o las tiras de plástico o de papel.
Cada uno de los equipos farmacéuticos puede
abarcar más lejos medios de una administración. Los medios para la
administración incluyen las jeringuillas y las agujas, catéteres,
inyectores biolísticos, aceleradores de partícula, es decir,
"armas del gene", inyectores "sin aguja", depósitos de la
esponja del gelfoam, otros materiales del depósito disponibles en
el comercio, por ejemplo, hidrogel, bombas osmóticas, y decantación
o usos tópicos durante cirugía. Cada uno de los equipos
farmacéuticos puede abarcar más lejos las suturas, por ejemplo,
cubiertas con la composición inmunogénica (Qin et al., Life
Sciences (1999) 65:21 93-2203).
El equipo puede abarcar más lejos una hoja de
instrucción para la administración de la composición a un
vertebrado. Los componentes del polinucleótido de la composición
farmacéutica se proporcionan preferiblemente mientras que una
solución líquida o ellos se puede proporcionar en forma liofilizada
mientras que un polvo secado o una torta. Si el polinucleótido se
proporciona en forma liofilizada, el polvo o la torta secado puede
también incluir cualquier sal, agentes de aumento de la entrada,
transfección que facilita agentes, y los añadidos de la composición
farmacéutica en forma secada. Un equipo puede comprender un
recipiente con una cantidad exacta de agua estéril libre de
pirógeno, para la reconstitución exacta de los componentes
liofilizados de la composición farmacéutica.
El envase en el cual la composición farmacéutica
se empaqueta antes de uso puede abarcar un envase sellado
herméticamente que incluye una cantidad de la formulación
liofilizada o de una solución que contiene la formulación
conveniente para una dosis farmacéutico efectiva de eso, o múltiplos
de una dosis efectiva. La composición farmacéutica se empaqueta en
un envase estéril, y el envase sellado herméticamente se diseña
para preservar la esterilidad de la formulación farmacéutica hasta
uso. Opcionalmente, el envase se puede asociar a medios y/o a la
instrucción de la administración para el uso.
Los ejemplos siguientes son incluidos con objeto
de la ilustración.
Los ejemplos siguientes demuestran la asombrosa
descubierta que varios
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium:
co-lípido complejado con en el pDNA de la
antígeno-codificación puede realzar la
inmunorespuesta subsecuente comparada a los métodos actualmente
sabidos de la inmunización del ácido nucléico cuando está
administrado en tejidos murino o del conejo.
Los materiales y los métodos siguientes se
aplican generalmente a todos los ejemplos divulgados adjunto. Los
materiales y los métodos específicos se divulgan en cada ejemplo,
cuanto sea necesario.
El agua estéril de USP y las soluciones salinas
fueron compradas de Baxter (Deerfield, IL). El resto de productos
químicos y de los solventes fueron comprados de Sigma Chem. Corp.
(St. Louis, MO) o del producto químico de Gallade (Escondido, CA).
Ambos 1,
2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfetanolamina
(DOPE) y 1,
2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfetanolamina
(DPyPE) fue comprado como soluciones del cloroformo de Avanti Polar
Lipids, Inc. (Alabaster, Alabama).
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro (también llamado VC 1052) fue sintetizado usando el
procedimiento publicado para preparar el citofectina análogo
GAP-DLRIE (Wheeler et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 93, 11454-11459 (1996)). Específicamente,
substituyendo el sulfonato del metano de
sin-9-tetradecenil para el sulfonato
dodecenil del metano en la bis-alquilación inicial
de
3-dimetilamino-1,2-propanediol
rindió la amina deseada del dialquenil. Quatranization con el
3-bromopropilftalimida, seguido por deproteción de
la amina primaria protegida con hidracina y purificación extractiva
y filtración sub micron rendió
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro puro según lo juzgado por cromatografía de capa delgada
analítica. La identidad del producto fue confirmada usando el protón
de alta resolución RMN y las espectroscopias infrarrojas (IR).
Citofectina: las mezclas del
co-lípido fueron preparadas usando el método filme
delgado rehidratado. En resumen filmes secados fueran preparados en
frascos de vidrio evaporando el cloroformo debajo de una corriente
del nitrógeno, y colocando los frascos bajo vacío durante la noche
para quitar rastros del solvente. Cada frasco contuvo 1,5 \mumol
cada uno de una citofectina y de un co-lípido. Los
liposomas fueron preparados agregando 1 ml SWFI (agua estéril para
inyección, VWR, Philadelphia, PA) por frasco seguido por vórtice
continuo por 5 minutos en el ajuste más alto de un mezclador Genie
Vortex Mixer (Fisher Scientific. Pittsburgh, PA). La solución
resultante del liposoma contuvo citofectina de 1,5 mM. Formulaciones
donde preparado en el pDNA final (fosfato): cocientes molares del
lípido catiónico de 8:1, 4:1, y 2: 1. La concentración molar de
fosfato del pDNA es calculada dividiendo la concentración del pDNA
(en mg/ml) por 330, la masa molecular de nucleótido media.
Liposomas (en SWFI) y pDNA (en vehículo 2x) fue preparado en dos
veces la concentración final en la formulación. Un volumen igual de
liposomas fue agregado al pDNA usando una jeringuilla y una aguja 26
o 28. Los liposomas fueron agregados en una corriente constante,
seguida por vórtice breve, suave a la mezcla (algunos segundos en el
ajuste #4 de un mezclador del vórtice Genie).
Todas las formulaciones de citofectina
/co-lípido usadas en este estudio seguían siendo
uniformemente opacas por varias horas después de la preparación en
la temperatura ampozoste sin cualquie agregación visible. Las
formulaciones fueron inyectadas 20 minutos -1,5 horas después de la
complejación. En una inyección típica, donde 5 \mug pDNA fue
formulado con una citofectina en cociente molar Pdna:citofectina
4:1, cada músculo recibió 2,4 \mug citofectina y 3,0 \mug
co-lípido en 50 \mul de vehículo. Mismo la dosis
más alta pDNA + citofecina: co-lípido probada en el
modelo del ratón (que corresponde 100 \mug plásmido VR4700 + 48
\mug
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro + 60 \mug DPyPE por ratón) no aparecía producir malestar
o resultado en ninguna reacciones adversa cuando estaba inyectado en
el músculo del ratón.
El plásmido VR4700 fue preparado usando las
técnicas estándar sabidas en el arte. Brevemente, VR1255,
luciferase de la luciérnaga optimizado de codificación del plásmido
(Hartikka, J., et al., Human Gene Terapy
7:1205-1217 (1996)), malo la secuencia de
codificación para la proteína nuclear de la gripe (NP) insertada en
lugar de la secuencia de codificación del luciferase. La secuencia
nuclear de la proteína de la gripe fue derivada de un plásmido
llamado nCMVint-tpaPRNP (Vahlsing, L., et
al., J. Immunol. Methods 174:11-22 (1994)). Más
específicamente, el plásmido VR4700 fue creado vía el procedimiento
siguiente. El plásmido VR1255 fue digerido con la enzima de la
restricción Acinetobacter calcoacetius (Acc I) + la enzima de la
restricción de los Bacillus amyloliquefaciens HI (Bam HI), entonces
los extremos fue embotada con Klenow, así produciendo el fragmento
deseado del vector. La secuencia de codificación nuclear de la
proteína fue obtenida digiriendo el nCMVintTPAPRNP con la enzima de
la restricción de AccI Escherichia coli I (Eco RI), y
embotando los extremos con Klenow. El fragmento del vector y el
fragmento del parte movible fueron purificados, después ligados con
la ligasa de el DNA T4. Los productos de la ligadura fueron
transformados en E. Coli a la resistencia de la canamicina,
después de lo cual las copias convenientes que contienen el plásmido
fueron identificadas basado en perfiles del resumen de la
restricción. Las técnicas estándar del cultivo celular fueron
utilizadas para ampliar una copia conveniente, de la cual el
plásmido fue aislado y purificado inicialmente usando la tecnología
pozos conocida, disponible en el comercio (Qiagen, Valencia,
CA).
El plásmido de VR1412 LacZ fue construido sub
clonando un gene citoplásmico-apuntado de la
\beta-galactosidasa en el vector VR1012 (Doh,
S.G., et al., Gene Teraphy 4 (7): 268-263
(1997)). El vector de la espina dorsal VR1O12 contiene
promotor/reforzador inmediatos humanos del citomegalovirus (CMV)
temprano 1, CMV en A, terminador hormonal de crecimiento bovino y
el gene de resistencia de la canamicina (Hartikka, J., et
al., Human Gene Therapy 7 (1 0): 1205-1 7
(1996)).
VR5900 es una lisozima del huevo de gallina de
la codificación del pDNA. Para la construcción de este pDNA, el
cDNA de la lisozima del gallus fue sintetizado con los
oligonucleótidos traslapados usando la polimerasa de DNA Deep Vent
(NEB, Boston, MA). La secuencia de nucleótido fue obtenida de
GENBank, accesión V00428. La secuencia fue humanizada con el
programa OLIGO 5.0 y los oligonucleótidos correspondientes comprados
de Retrogen (San Diego, CA). El producto de la polimerización en
cadena fue reproducido en el pCRII Topo embotado (Invitrogen,
Carlsbad, CA), ordenado en su totalidad y subclonado en VR1055.
VR1055 es un promotor de Vical CMV/un vector
reforzador-basado de la expresión que es idéntico a
VR1012 a excepción del uso de un mínimo terminador
\beta-globina de conejo em VR1055 (Hartikka, J.,
et al., Human Gene Therapy 7, 1205-17
(1996)). La expresión de los HEL fue confirmada por Western blot
con una lisozima blanca del anti-huevo del conejo
(Biodesign, Kennebunk, ME).
VR1904 es un pDNA que codifica el factor humano
IX. Para la construcción, el parte movible del cDNA del factor IX
del plásmido GT50 (proporcionado amablemente por Steven Josephs de
Baxter Healthcare Corp., Round Lake, IL) subclonado en el vector
VR1012.
VR1623 expresa una inmunoglobulina quimérica con
las regiones variables del ratón fundidas a las regiones constantes
humanas. Las regiones constantes humanas de la kappa y de la gamma
(IgG1) eran polimerización en cadena amplificada de linfocitos
periféricos humanos de la sangre y reproducido en VR1031, un vector
bicistronic derivó de VR1012 por la inserción de una secuencia de
la CITE. Esta nueva construcción fue señalada como VR1605. Las
secuencias de la región de la variable de 38c1 3, un linfoma murino
de la B-célula (Bergman y Haimovich, 1977), fueron
amplificadas por la polimerización en cadena del plásmido pId (Tao y
Levy, 1993, proporcionado amablemente por el Dr. Ronald Levy,
Stanford University Medical Center, CA) y reproducidas en VR1605
para hacer
VR1623.
VR1623.
El DNA del plásmido fue transformado en las
células competentes de Escherichia Coli DH10B o
Escherichia Coli DH5\alpha y crecido en Terrific Broth
(Sambrook, J., et al., en Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, p.A.2 (1989)) complementado con 50 mg/ml canamicina en un 1 L
frasco de la coctelera. Las células fueron cosechadas por la
centrifugación en el final de la fase de crecimiento exponencial
(aproximadamente 16 horas), rindiendo típicamente 10 gramos de peso
neto de la biomasa por litro. El pDNA circular covalente cerrado
fue aislado con un procedimiento modificado de la lisis (Horn,
N.A., et al., Human Gene Therapy 6, 565-573
(1995)) seguido por la ultracentrifugación doble estándar del
gradiente del bromuro del CsCI-etidio con una
producción media de aproximadamente 5 mg por litro. Los plásmidos
fueran precipitados del etanol y tornados solubles de nuevo en
salino en 4ºC y dializados contra salino. El contenido de la
endotoxina fue determinado por el análisis de Amebocyte Lysate del
Limulus (Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth, MA). Todas las
preparaciones del plásmido estaban libres del RNA perceptible. Los
niveles de la endotoxina eran menos de 7.0 Unidades de la
Endotoxina/mg del DNA del plásmido. Los cocientes
espectrofotométricos A260/A280 estaban entre 1.75 y 2.0. Los
plásmidos fueran precipitados del etanol y tornados en suspensión
de nuevo en el vehículo de la inyección en 4ºC hasta que estuvieron
disueltos totalmente. El DNA fue almacenado en -20ºC hasta uso.
Los músculos del cuádriceps de los ratones
despiertos refrenados (hembra ratones 8-12 semanas
de edad BALB/c de Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) fueron
inyectados con el pDNA en 50 \mul de vehículo usando una
jeringuilla de insulina desechable y una aguja 28 de fracción de la
pulgada (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, Cat
No. 329430) cabido con un corte plástico del collar de una
extremidad de la micropipeta. La longitud del collar fue ajustada
para limitar la penetración de punta de aguja a una distancia de
cerca de 2 mm en la pieza central del músculo femoral del músculo
recto. Los líquidos y las jeringuillas de la inyección fueron
equilibreados a la temperatura ampozoste y la inyección de un solo
volumen de 50 \mul fue realizada en 1-2
segundos.
Conejos New Zealand White hembra anestesiados
con cetamina/xilazina (5-6 meses de la edad,
aproximadamente 3 kg) fueron inyectados en el músculo del
cuadriceps con 150 \mug pDNA en 300 \mul PBS usando una aguja
22 de 1 pulgada. Antes de inyecciones, el sitio de la inyección fue
afeitado y limpiado con alcohol. El dispositivo libre de aguja de
inyección, Biojector®2000 (Bioject Inc., Portland, OR), fue probado
en conejos. El Biojector®2000 es un sistema de inyección accionado
por jacto de CO_{2}. En un experimento experimental, fue
confirmado que el Biojector®2000 puede entregar solución de tinta
Indian a través de piel y en tejido del músculo.
El cuidado animal a través del estudio estaba de
acuerdo con el "Guide for the use and Care of Laboratory
Animals", Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on
Life Sciences, National Research Council, National Academy Press,
Washington, D.C., 1996 así como con Vical's Institutional Animal
Care and Use Committee.
Noventa y seis placas de pozo (Coming
Incorporated, Cat. No. 3690, Corning, NY) fueron cubiertas con
71-125 ng/pozo de nucleoproteína de la gripe
A/PR/8/34 (NP) purificadas de los extractos baculoviral
recombinantes en 100 \mul BBS (89 mM ácido bórico + 90 mM NaCl +
234 mM NaOH, pH 8,3). Las placas fueron almacenadas durante la
noche en 4ºC y los pozos lavados dos veces con BBST (BBS
complementado con Tween 20 0,05%, vol./vol.). Los pozos después
fueron incubados por 90 minutos con el BB (BBS complementado con la
leche sin materias grasas 5%, p/vol) y lavados dos veces con BBST
otra vez. Las dobles dilusiones seriales del suero del ratón o del
conejo en BB, comenzando en 1:20, fueron hechas en pozos sucesivos y
las soluciones fueron incubadas por 2 horas en la temperatura
ampozoste. Los pozos entonces fueron aclarados cuatro veces con
BBST. Los sueros de los ratones hyperimmunized con el DNA del
plásmido de VR4700 NP fueron utilizados mientras que un control
positivo y los sueros pre-inmunes de ratones y de
conejos fueron utilizados como controles negativos.
Para detectar los anticuerpos
NP-específicos, o IgG-Fc
anti-ratón conjugada fosfatasa alcalina (Jackson
ImmunoResearch Laboratories, Cat. No.
115-055-008, West Grove, PA) o
IgG-Fc anti-conejo cabra (Jackson
ImmunoResearch Laboratories, Cat. No.
115-055-008, West Grove, PA) diluido
1:5000 en BBS fue agregado en 50 \mul/pozo y las placas fueron
incubadas en la temperatura ampozoste por 2 horas. Después de 4
lavados en BBST, 50 \mul del substrato (1 mg/ml fosfato
p-nitrofenilo, Calbiochem Cat. No. 4876 en 50 mM
amortiguador bicarbonato de sodio, pH 9,8 y 1 mM MgCl2) fue
incubado por 90 minutos en la temperatura ampozoste y las lecturas
de la absorbencia fueron realizadas en 405 nm. El título de los
sueros fue determinado usando el recíproco de la dilusión pasada
todavía que daba a una señal dos veces sobre fondo. El fondo fue
establecido usando 1:20 diluido suero
pre-inmune.
Las suspensiones unicelulares de esplenocitos
fueron granuladas y suspendidas de nuevo en medio RPMI 1640 que
contenía L-glutamina y 25 mM HEPES y complementadas
con penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), 55
\muM \beta-mercaptoetanol y 10% FBS. A menos que
se indicare en forma diferente, todos los medios de cultivo del
tejido y reactivos fueron obtenidos de Gibco BRL Life Technologies
(Rockville, MD). Entonces, 2,5 x 107 esplenocitos fueron cultivados
por 5 días en frascos de cultura de tejido de 25 cm^{2} en un
total de 10 ml de medios con el péptido de
NP_{147-155} (H-2Kd TYQRTRALV) o
el péptido \beta-gal_{876-884}
(H-2Ld TPHPARIGL) en 1 \mug/ml e
IL-2 murino recombinante (Roche Molecular
Biochemicals, Indianapolis, IN) en 0,5 U/ml.
Para el análisis de CTL, las células P815 fueron
etiquetadas con 0,15 mCi Na_{2}^{51}CrO_{4} (NEN Lite Science
Products, Boston, MA) en 30 \mul de salino en 37ºC por 35 minutos.
Las células etiquetadas fueron pulsadas con 20 \mug péptido NP o
péptido \beta-gal (H-2Ld
TPHPARIGL) en 1 ml medio RPMI 1640 en 37ºC por 40 minutos o
utilizadas no pulsadas. Las titulaciones duplicadas de esplenocitos
fueron preparadas en serie diluyendo las células 1:3 en 96 placas
de fondo redondo de 96 pozos (ICN Biomedicals, Aurora, OH). Las
células de blanco fueron agregadas en 1 x 10^{4} células/pozo en
un volumen final de 200 \mul/pozo en las proporciones
determinantes effector:blanco (E:T). Las placas fueron centrifugadas
e incubadas por 4 horas en 37ºC con CO_{2} 5%. Las cuentas por
minuto fueran determinadas para 100 \mul de sobrenadante de cada
pozo. Específica lisis fue calculada como % de específica lisis =
[(a-b)/(c-b)]100 donde a es cpm
media lanzada en presencia de effectores, b es cpm media lanzada de
las células de blanco incubadas en medios solamente y c es cpm
lanzada de las células de blanco en presencia de
Triton-X 100 1%.
El actual ejemplo demuestra una comparación
cuantitativa de los efectos de la administración de varios
complejos
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro co-lípido con pDNA contra pDNA solamente en
el abastecimiento de respuestas del anticuerpo
anti-NP.
La transfección de músculos con el pDNA que
codifica un inmunógeno saca respons inmunes humorales y celulares.
Para determinar el grado del aumento de la transfección en un
análisis que evaluaba inmunorespuesta humoral, los cambios en los
niveles del anticuerpo anti-NP subsecuentes a la
inmunización con un pDNA de la
inmunógeno-codificación solamente, y el mismo pDNA
complejado con las varias composiciones adyuvantes, fueron
cuantificados. Las características generales del análisis de la
inmunización están esencialmente según lo descrito por Ulmer y
otros (Science, 259, 1745-1749 (1993)) y tecnología
estándar de las aplicaciones ELISA para cuantificar títulos del
anticuerpo.
Los ratones fueron inmunizados usando la
proteína nuclear de la gripe de la codificación del pDNA (NP),
complejado con los citofectina s para formular com 1:1 (mol:mol)
mezcla con un co-lípido. Las citofectinas fueran
analizadas en un cociente molar de pDNA/citofectina de 4: 1. Cada
animal en el grupo de prueba (cinco animales por grupo) fue
inyectado con 5 \mug pDNA en 50 \mul salino fisiológico (0.9%
NaCl peso/volumen en agua) por la pierna en el músculo femoral del
músculo recto (10 \mug pDNA por animal) solamente o como
citofectina: complejo del co-lípido. Las inyecciones
fueron realizadas en el del dia "0" y en 3 semanas.
Citofectina: el co-lípido que el
realce de la inmunorespuesta era analizado basó en el cociente del
título del medio geométrico (GMT) de un grupo citofectina -aumentado
de la transfección dividido por el GMT de la administración del
pDNA solamente (véase las figs.as 3 y 4). Según las indicaciones de
las figs.as 3 y 4, el citofectina preferido
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro, cuando está juntada con un co-lípido
(especialmente DOPE o DPyPE), realza marcado respuestas del
anticuerpo al inmunógeno codificado sobre pDNA solamente y el pDNA
complejado con otras combinaciones de citofectina
.co-lípido. Lo más asombrosamente posible, los
títulos anticuerpo anti-NP murino en seis semanas
post inyección i.m. de VR4700 (fig. 4) complejado con
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro: DPyPE dio lugar a un aumento de diez veces en título
anti-NP medio geométrico.
El propósito del actual ejemplo es demostrar la
capacidad de la citofectina: co-lípido preferido,
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro/DPyPE, para realzar la inmunorespuesta humoral a antígeno
NP codificado pDNA. La mezcla citofectina: co-lípido
es (+/-)-N-(3-amino
aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro/DPyPE a un cociente molar 1:1. En lugar de emplear la
nomenclatura química formal más incómoda y estipular el cociente
molar específico para la mezcla, esta formulación nueva se ha
nombrado "Vaxfectin."
Los tejidos del músculo fueron cosechados,
pulverizados y extraídos como descrito previamente (Manthorpe, M.,
et al., cuantificación del gene. Boston. Birkhauser
343-368 (1998)). El nivel de expresión de la
\beta-galactosidasa en extractos del músculo fue
cuantificado usando un análisis quimioluminescente según las
instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim, gato. No.
1758241, Indianapolis, IN). Una curva estándar, preparada en
extracto reunido de los músculos uninjected, era incluida en cada
placa usando el incluido estándar de la enzima de la
\beta-galactosidasa en el equipo.
El anticuerpo específico Anti-NP
que secretaba las células fue cuantificado por el método de ELISPOT
usando un protocolo previamente descrito (Slifka, M.K., et
al., J. Virol. 69 (3), 1895-1902 (1995)). Las
células obtenidas de médula (fémur y tibia) fueron tratadas con
0.83% NH4Cl para lisis a los glóbulos rojos. Las células entonces
fueron suspendidas de nuevo en el suero fetal medio del becerro de
RPMI que contenía 1640 el 5% (Hyclone, Logan, Utah), la
L-glutamina, HEPES, la penicilina y la
estreptomicina (LTI, Bethesda, Maryland). Las placas de filtración
Multiscreen de 96 pozos de fondo de nitrocelulosa (Millipore
Corporation, San Francisco, CA) estuvieron cubiertas con 100 \mul
por pozo de 5 \mug/ml del antígeno NP (cepa A/PR/8/34 de la
nucleoproteína de la gripe) en PBS e incubadas durante la noche en
4ºC. Las placas fueron bloqueadas con RPMI 1640 que contenía FBS 5%
por 2 h en la temperatura ampozoste. El medio de bloqueo fue
substituido por 100 \mul/pozo de medio bloqueo que contenía la
suspensión de la célula de la médula obtenida de los ratones
inmunizados con la gripe NP de la codificación del pDNA (con o sin
Vaxfectin), comenzando en 106 células, después diluyó la llanura
fila-sabia triple la placa. Los pozos del control
contuvieron las células obtenidas de los ratones del naïve diluidos
como arriba (controles anteriores incluyeron un antígeno
inaplicable). Las placas fueron incubadas para 5 h en 37ºC en una
incubadora humedecida CO2 7%. Las placas fueron lavadas seis veces e
incubadas durante la noche en 4ºC con 100 \mul por pozo de IgG
anti-ratón biotinilada (H + L, 1/1000 dilusion,
Vector Laboratories, Burlingame, CA) en PBS-T que
contenía FBS 1%. Las placas fueron incubadas más a fondo por 1 h en
la temperatura ampozoste con 100 \mul/pozo de 5 \mug/ml de
avidina D peroxidasa-conjugada rábano picante
(Vector Laboratories, Burlingame, CA). Las células secretando
anticuerpo fueran detectadas agregando 100 \mul por pozo de
substrato
(3-amino-9-etilcarbazola
y H2O2) a las placas por 3-5 minutos. La reacción
fue terminada lavándose profusamente con agua de golpecito. Los
puntos fueron contados debajo de un microscopio de disección. Las
células secretando anticuerpo específico anti-NP
fueran representadas como número de puntos por 10^{6} células de
la médula.
Todas las comparaciones estadísticas fueron
realizadas usando la prueba de suma espesa no paramétrica de
Mann-Whitney (versión 2.03 de SigmaStat, Jandel
Scientific Software, San Rafael, CA). Las diferencias eran
consideradas estadísticas significativas cuando el valor de p era
menos de 0.05.
Para comparar los efectos de aumentar la dosis
del pDNA, y el efecto de alza las inyecciones, ratones fue dado
inyecciones bilaterales de i.m. de 1 \mug, 5 \mug o 25 \mug
del plásmido desnudo VR4700 por el músculo (así produciendo una
dosis total del pDNA 2, 10 y 50 \mug g por animal,
respectivamente) en los intervalos de tres semanas. Los resultados
se demuestran en fig. 5. Anti-NP más alto que los
títulos fueron alcanzados cuando un pDNA más desnudo fue inyectado
por el músculo, y los títulos aumentaron después del primer y el
segundo alce las inyecciones. Sin embargo, no se observó
cualesquiera aumento posterior en los títulos
anti-NP con las dosis unas de los del pDNA cuando
las terceras alzan la inyección fueron dadas en 9 semanas (datos no
demostrados), sugiriendo que el título del anticuerpo de la meseta
nivela había sido alcanzado con el pDNA desnudo.
Un segundo sistema de ratones recibió las dosis
equivalentes del pDNA formuladas con Vaxfectin. Los resultados se
demuestran en fig. 5. Aquí, 7 - al doblez 20 aumente de títulos del
anticuerpo con las tres dosis del pDNA fue observado. Los títulos
más altos de anti-NP del promedio por grupo en este
experimento (204,800 \pm 56,087, n =5 ratones) fueron medidos en
9 semanas con la dosis del pDNA 25 \mug formulada con Vaxfectin.
Como fue visto con las inyecciones desnudas del pDNA, no se observó
cualesquiera aumento posterior en los títulos
anti-NP con los grupos uces de los de Vaxfectin
cuando los terceros alzan la inyección fueron dados en 9 semanas
(datos no demostrados). Así, Vaxfectin realzó títulos del anticuerpo
a los niveles que no se podrían alcanzar con el pDNA desnudo solo,
aumentando la dosis del pDNA o el número de inyecciones. El
encontrar más llamativo era que tan poco como 1 \mug pDNA por el
músculo formulado con Vaxfectin dio lugar hasta al título más alto
de cinco veces anti-NP que lo obtenida con 25 \mug
VR4700 desnudo solamente.
Un experimento separado fue hecho para tratar si
las inyecciones bilaterales múltiples están requeridas para obtener
Vaxfectin realce mediado en inmunorespuesta humoral. Los resultados
se demuestran en el cuadro 1. Formulando 5 \mug pDNA VR4700 con
Vaxfectin produjo un aumento significativo de 6 dobleces en los
títulos anti-NP 20 días después de una sola
inyección unilateral de i.m. en los ratones, indicando que Vaxfectin
puede realzar respuesta del anticuerpo después de un de dósis
simple.
^{a} Los ratones amito recibieran
una sola inyección 5 \mug del plásmido desnudo VR4700 en 50 \mul
de NaP 150 mM en el músculo derecho del cuadriceps. Un segundo grupo
de ratones recibió 5 \mug del VR4700 formulado con Vaxfectin en un
cociente molar pDNA: lípido catiónico de 4: 1. El el día 21, los
ratones fueron dados una inyección de refuerzo singular en el mismo
músculo. Los títulos del anticuerpo IgG
NP-específicos totales eran resueltos de muestras
del suero el el día 20 y 42 (el promedio \pm S.E.M., n = 15
ratones).
^{b} diferente de manera
significativa del valor desnudo del control del pDNA (p <0,01
Prueba de suma clase
Mann-Whitney).
\vskip1.000000\baselineskip
Diverso pDNA: los cocientes catiónicos del
lípido fueron probados en el modelo murino de la inmunización para
optimizar el formulación de Vaxfectin. Los resultados, demostrados
en fig. 6, indican eso que inyecta más títulos crecientes complejos
del anticuerpo del pDNA-Vaxfectin (así, aumentando
la cantidad de plásmido y la cantidad de Vaxfectin simultáneamente)
de una manera del dependiente de la dosis. Esta tendencia fue
observada para el 2:1 y el pDNA del 4:1: cocientes catiónicos de la
muela del lípido. Cuando la misma dosis de 5 \mug pDNA fue
inyectada con el aumento de la cantidad de Vaxfectin (así
disminuyendo el pDNA: cociente molar del lípido catiónico), títulos
del anticuerpo crecientes otra vez de una manera dependiente de la
dosis de Vaxfectin (fig. 6B). Dosis más altas del pDNA también
fueron examinadas, pero inyectando 50 \mug pDNA por el miembro
formulado con Vaxfectin en el pDNA del 4:1: el cociente molar del
lípido catiónico no produjo cualesquiera aumento posterior en los
títulos anti-NP, comparados al 25 \mug pDNA
formulado con Vaxfectin en el mismo cociente del 4:1 (datos no
demostrados).
Para investigar la duración de la respuesta
humoral Vaxfectin-realzada, los títulos específicos
del anticuerpo de NP fueron seguidos por nueve meses después de la
inyección inicial en el modelo murino de la vacunación. Los
resultados se demuestran en fig. 7A. Tres semanas después de que la
inyección del alza dada el el día 21, títulos
anti-NP en el grupo de Vaxfectin era el doblez 9 más
arriba que en el grupo de control desnudo del pDNA. Durante las
semanas subsecuentes, los títulos del anticuerpo en el Vaxfectin
agrupan disminuido gradualmente pero seguían siendo
perceptiblemente más altos que en los controles a través del curso
del experimento. Cuarenta semanas después de que el comienzo del
experimento, títulos anti-NP en el grupo de
Vaxfectin era más alto todavía cuádruple que en el grupo desnudo del
pDNA.
En un experimento paralelo, otro sistema de
ratones recibió una inyección del alza el la semana 3, y una
segunda alza idéntica en 3 meses. Los resultados se demuestran en
fig. 7B. El segundo alza títulos crecientes inyección del
anticuerpo en ambos grupos por 2 - a tres veces. Sin embargo, los
títulos anti-NP en el grupo de Vaxfectin aparecían
permanecer en estos niveles elevados por varios meses, mientras que
el grupo desnudo del pDNA rindió los títulos comparables a ésos
después de una sola alza en el final del experimento. Por lo tanto,
nueve meses después de que el comienzo del experimento, títulos
anti-NP en el grupo de Vaxfectin era el doblez 17
más arriba que en el grupo de control del pDNA.
Sería altamente deseable que un coadyuvante
usado conjuntamente con vacunas del pDNA para realzar
inmunorespuesta humoral al mismo tiempo no disminuiría inmunidad
transmitida por células. Para evaluar esto, los análisis de CTL
fueron realizados después de que los ratones hubieran sido
inyectados con las varias dosis del pDNA con o sin Vaxfectin. Los
resultados se demuestran en fig. 8. Vaxfectin no tenían un efecto
significativo sobre respuesta de CTL cuando están formulados en
diverso pDNA y los cocientes catiónicos del lípido (fig. 8A),
después de que una sola alza (fig. 8C) o múltiple alce las
inyecciones (fig. 8A y 8B), o cuando está entregado en el vehículo
de la siesta de PBS (fig. 8A) o de 150 mM (fig. 8C). La inyección de
25 \mug del pDNA desnudo por el músculo aparecía dar lugar a
respuestas más fuertes de CTL que la dosis de 1 \mug del pDNA.
Una vez más Vaxfectin no tenía un efecto significativo sobre
respuesta de CTL con cualquier dosis del pDNA (fig. 8B). Tomados
juntos, estos resultados demuestran que Vaxfectin se podría utilizar
para realzar inmunorespuesta humoral con las vacunas del pDNA
mientras que mantenía la característica de respuesta fuerte de CTL
de la inmunización del pDNA.
Para aclarar el mecanismo por el cual Vaxfectin
realza respuestas del anticuerpo, el efecto de Vaxfectin sobre la
expresión del músculo in vivo fue estudiado. En estos
experimentos, la \beta-galactosidasa de la
codificación del pDNA (VR1412) fue inyectada o solamente o formulado
con Vaxfectin y los músculos individuales fueron probados
periódicamente para la expresión de gene del reportero. Los
resultados se demuestran en fig. 9. Un día después de inyecciones,
la expresión de la \beta-galactosidasa en ambos
grupos era igual, indicando que Vaxfectin no afectó a la
transfección inicial del músculo con el pDNA. Entre el día 1 y 7, la
expresión del músculo en el grupo desnudo del pDNA aumentó siete
veces. En cambio, la expresión en el grupo de Vaxfectin disminuyó
por el 25% durante el mismo plazo. Entre el día 7 y 21, los niveles
del gene del reportero seguían siendo iguales en el grupo desnudo
del pDNA, mientras que la expresión de la
\beta-galactosidasa en músculo continuó
disminuyendo en el grupo de Vaxfectin y era más el doblez de 20 más
bajo que en el grupo de control del pDNA en el día 21. Así, en
tiempo posterior señala, expresión del transgén en músculo fue
reducido marcado en el grupo de Vaxfectin, mientras que los niveles
del anticuerpo eran más altos. Esta carencia de la correlación
entre la expresión del músculo y los antibodytiters indica que el
realce mediado Vaxfectin en respuesta del anticuerpo no se puede
explicar byfacilitated la transfección de myofibers y/o aumentó la
síntesis del antígeno en tejido del músculo.
El mecanismo por el cual Vaxfectin realza la
respuesta antígeno-específica del anticuerpo es
confuso. Es posible que Vaxfectin entrega el pDNA a los tipos
múltiples de la célula dentro del tejido del músculo, incluyendo
las células de antígeno-presentación, mientras que
pudo la inyección de la aguja del pDNA sin Vaxfectin principalmente
las fibras de músculo del transfect. Alternativamente, el complejo
del pDNA-lípido puede poder mejor salir el músculo
y transduce el tejido distal, incluyendo las células en los nodos de
linfa de drenaje regionales. Vaxfectin podía proteger el plásmido
contra nucleases, permitiendo al complejo del
pDNA-lípido alcanzar los tejidos distantes del
sitio de la inyección. Vaxfectin puede también inducir la
inflamación, dando por resultado el daño de muchas fibras y de tal
modo de lanzar de músculo transduced un antígeno más soluble pronto
después de la inyección. Una disminución de la producción del
antígeno en los días siguientes puede seleccionar para las células
de B específicas de un antígeno más alto de la afinidad limitando el
antígeno, dando por resultado un aumento en títulos del
anticuerpo.
anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los títulos elevados anti-NP en
animales tratados Vaxfectin fueron mantenidos por varios meses
después de la inyección de refuerzo (fig. 7). Puesto que las
células de plasma duraderas en médula se han demostrado para ser el
mecanismo principal para mantener la producción persistente del
anticuerpo después de infección viral (Slifka, M.K., et al.,
J. Virol. 69 (3), 1895-1 902 (1995), Slifka, M.K.,
et al., Curr. Opin. Immunol 10 (3), 252-258
(1998)) el número del anticuerpo anti-NP que
secretaba las células de la médula fue cuantificado usando un
análisis de ELISPOT. Los resultados demostraron que Vaxfectin
produjo aumento estadístico significativo de 3-5
del número de células de plasma específicas de NP en médula. Además,
títulos del anticuerpo en ratones individuales correlacionados
áspero con el número del anticuerpo anti-NP que
secreta las células en médula, en el pDNA desnudo y en los grupos de
Vaxfectin (cuadro 2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
^{a} Los ratones recibieron las
inyecciones intramusculares bilaterales de 5 \mu del pDNA VR4700
en 50 \mul PBS, solamente o formulado con Vaxfectin en cociente
molar pDNA: lípido catiónico de 4:1. Idénticas inyecciones de
refuerzo fueron dadas en tres semanas y en tres meses. Los ratones
fueron sacrificados cuatro meses después del comienzo del
experimento (un mes después de la segunda inyección de refuerzo).
Los títulos del anticuerpo fueron medidos de la hemorragia terminal
y el número de células que formaban punto específico
anti-NP (SFC) por 10^{6} células de la médula ósea
fue
cuantificado.
^{b} Diferente de manera
significativa del valor del control del pDNA (p = 0.032, prueba de
suma clase
Mann-Whitney).
^{c} Los ratones recibieron las
inyecciones intramusculares bilaterales 5 \mug del pDNA VR4700 en
50 \mul PBS, solamente o formulado con Vaxfectin en cociente molar
pDNA: lípido catiónico de 4:1. Idénticas inyecciones de refuerzo
fueron dadas en tres semanas y en nueve meses. Los ratones fueron
sacrificados once meses después del comienzo del experimento (dos
meses después de la segunda inyección de refuerzo). Los títulos del
anticuerpo fueron medidos de la hemorragia terminal y las células
que secretaban anti-NP fueran cuantificadas de la
médula
ósea.
^{d} perceptiblemente diferente
del valor del control del pDNA (p = 0.029, prueba de suma clase
Mann-Whitney).
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos de los análisis de ELISPOT indican que
el uso de Vaxfectin aumenta el número de células de plasma
específicas del antígeno en la médula. Este aumento en células de
plasma puede ser debido a las características adyuvantes de los
complejos del pDNA-lípido. La inyección del pDNA en
blanco complejado con un lípido catiónico en el peritoneo de los
ratones ováricos murino del cojinete C3H/HeN del tumor induce la
producción de IL-6, de IFN-\gamma,
y de TNF-\alpha (Horton, H.M., et al., J.
Immunol. 163 (12), 6378-6385 (1999)). Estos
citosinas no fueron inducidos en los ratones tratados con el pDNA o
el lípido solamente, sugiriendo que los complejos del
pDNA-lípido son ines vivo immunostimulatory. Las
características immunostimulatory de los complejos del
pDNA-lípido también fueron divulgadas para los
experimentos en los cuales los ratones fueron inyectados
intravenoso con el pDNA complejado con el lípido catiónico (Dow,
S.W., et al., J. Immunol. 163 (3), 1552-1561
(1999)). En cuanto a la inyección intraperitoneal e intravenosa de
los complejos del pDNA-lípido, inyección
intramuscular del pDNA-Vaxfectin puede también
inducir citosinas, incluyendo IL-6, un citosina que
promueve el diferenciación de las células de B activadas a las
células de plasma. Así, los complejos del
pDNA-Vaxfectin pueden realzar indirectamente
títulos del anticuerpo aumentando el número de anticuerpo
produciendo las células de B.
Es también posible que los componentes de
Vaxfectin pudieron mímico los mitógenos naturales que pueden
estimular directamente la excepa policlonal de las células de B.
Esto podía realzar la inmunorespuesta específica contra el transgén
expresado por las células musculares aumentando el número de células
de B de respuesta. Así, la transfección creciente de los APCs o la
entrega del pDNA a los nodos de linfa de drenaje con la transfección
de células en los nodos de linfa, del daño del músculo dando por
resultado disponibilidad creciente del antígeno soluble y de las
características immunostimulatory de los complejos del
pDNA-Vaxfectin podía cada uno contribuir al efecto
adyuvante de Vaxfectin.
El propósito del actual ejemplo es demostrar el
efecto adyuvante
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro: co-lípidos, (Vaxfectin) en conejos cuando
está formulado en vacunas
polinucleótido-basadas.
Conejos hembra New Zealand White
(5-6 meses edad) fueron anestesiados, después
inyectados en una pierna trasera con 300 \mul de una solución de
PBS que contenía 150 \mug de plásmido VR4700 DNA o una solución
de PBS que contenía un complejo de 150 \mug plásmido VR4700 con
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro: DPyPE (1: 1) preparado en un cociente 4:1 mol: mol pDNA:
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro. Cada conejo recebió solamente una inyección usando una
jeringuilla de insulina plástica y aguja 22 de 1 pulgada en el día
cero, más una "idéntica" inyección en la pierna trasera opuesta
en 6 semanas. Los animales fueron sangrados a través de una vena
del oído antes de la inmunización, y en las semanas 3, 6, 7, 9, y
13. El corrimiento de seis semanas fue realizado el mismo día, pero
antes de que la inyección de refuerzo fue dada.
Usando solo i.m. unilateral una inyección se
realizó con la aguja y la jeringuilla, Vaxfectin produjo un aumento
robusto de 20 dobleces en títulos del anticuerpo en tres semanas
comparadas a la inyección del pDNA desnudo. Los resultados se
demuestran en fig. 10. Después de una inyección del alza dada en 6
semanas, que seguían hapozosdo los títulos anti-NP
en ambos grupos aumentaron aproximadamente en una orden de la
magnitud, con títulos del anticuerpo en el grupo 20 de Vaxfectin al
doblez 50 más arriba que en el grupo desnudo del pDNA a través del
curso del experimento. Cuando los conejos fueron inmunizados con el
dispositivo Biojector®2000, Vaxfectin no aparecía realzar respuesta
del anticuerpo después de una sola inyección unilateral. Después de
que una inyección del alza fuera dada en 6 semanas, los títulos
anti-NP en el grupo de Biojector Vaxfectin estaban
hasta ocho veces más alto que en el grupo desnudo correspondiente
del pDNA.
El propósito del actual ejemplo es demostrar el
efecto adyuvante
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro: co-lípido (por ejemplo, Vaxfectin) cuando
está formulado con el varios antígenos modelo y caracterizar más
lejos las inmunorespuestas a las formulaciones del pDNA que
contienen co-lípido
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro.
Los ratones refrenados, despiertos recibieron 5
\mug del pDNA que codifica A/PR/8/34 NP (VR4700), lisozima del
huevo de gallina (HEL, VR5900), de E. coli Lac Z
(\beta-gal, VR1412), Id del ratón/Fc humano
(regiones variables de 38C13, una variedad de células murino fundida
a una región constante humana IgG1, VR1 623 de la inmunoglobulina
del linfoma), o del factor humano IX (VR1 904) preparado en PBS con
y sin Vaxfectin (50 ml) e inyectado en el músculo recto femoral de
8-10 ratones femeninos viejos de la semana. Los
ratones fueron alzados en 3 semanas con la misma dosis y
formulación. Los ratones fueron sangrados del plexo venoso
oftálmico antes de la primera inyección, 1 día antes del alza, y en
6 semanas que seguían la primera inyección.
Los títulos del anticuerpo fueron determinados
cubriendo las placas de microtítulo de pozo plano de ½ área de 96
pozos (Corning/Costar, Inc., Corning, NY) con 0.035 \mug
nucleoproteína de la gripe (purificadas de los extractos
baculoviral recombinantes), 0.25 \mug lisozimas del huevo de
gallina (HEL, sigma, St. Louis, MO), 0.25 \mug
\beta-galactosidasa Escherichia Coli
(\beta-gal, sigma, St. Louis, MO), 2,2 \mug Id
ratón (Soputhern Biotech, Birmingham, AL), o 0,3 \mug Factor IX
humano (Calbiochem, La Jolla, CA) En BBS de 50 \mul (89 mM ácido
bórico, 90 mM NaCl pH 8.3) por pozo. Las placas fueron incubadas
durante la noche en 4ºC después lavadas 4 veces con BBST (BBS con
0,1% Tween 20). Los pozos cubiertos NP fueron bloqueados con 100
\mul de amortiguador de análisis de NP (leche sin materias grasas
5% en el BBS) y los pozos de el resto de las placas fueron
bloqueados con 100 \mul del amortiguador de análisis BSA (albúmina
del suero bovino 1% en BBS) para 1 hora en la temperatura
ampozoste. Las dobles dilusiones seriales de sueros en almacenadores
intermediarios del análisis, comenzando en el 1:25, fueron
preparadas y las partes alícuotas de 50 \mul agregadas a cada uno
pozos. Después de una incubación de 2 horas en la temperatura
ambiente y 4 lavados IgG-Fc
anti-ratón cabra conjugada fosfatasa alcalina
(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) diluido en amortiguador de
analisis 1:5000 fue agregado 50 \mul/pozo. Las placas fueron
incubadas por 2 horas en la temperatura ambiente, lavadas 4 veces y
50 \mul del substrato p-NPP (1 mg/ml
para-nitrofenil fosfato, Calbiochem, La Jolla, CA,
en 50 mM amortiguador bicarbonato de sodio, pH 9,8 y 1 mM MgCl2)
fueron agregados por pozo. La absorbencia en 405 nm fue leída
después de 1.5 horas en la temperatura ambiente. El título es el
recíproco de la dilusión pasada con una señal 2 veces de las cuales
pre-sangre las muestras.
La fosfatasa alcalina conjugó,
secundario-isotipo del ratón que los anticuerpos
monoclonales específicos pre-fueron titulados con
estándares para determinar la dilusión en la cual los valores
iguales de la absorbencia fueron obtenidos para las cantidades
iguales de estándar. Para las titulaciones, las placas estuvieron
cubiertas durante la noche en 4ºC con 0.1 \mug/50 \mul/pozo de
los antisueros purificados afinidad de la kappa del
anti-ratón de la cabra en el BBS. Las placas fueron
lavadas y bloquearon según lo para NP ELISA descrito arriba. IgG1
de ratón purificado, \kappa o IgG2a, \kappa fueron diluidos y
agregados en serie a las placas en 50 \mul/pozo. Después de
incubar por 2 horas en la temperatura ampozoste, el
anti-ratón conjugado fosfatasa alcalino IgG1 de la
rata e IgG2a (Pharmingen, La Jolla, CA) Fueron diluidos y agregados
en serie a las placas lavadas. El análisis fue terminado en cuanto
al anticuerpo ELISA de NP. El análisis para la medida de los
títulos específicos del suero del secundario-isotipo
del antígeno estaba según lo descrito para los niveles totales de
IgG con las modificaciones siguientes: la fosfatasa alcalina conjugó
el anti-ratón IgG1 y el anti-ratón
IgG2a era 1:1500 diluido y 1:200 respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los bazos fueron quitados de ratones euthanized
en 11-12 semanas después de la primera inyección, y
2.5 x 10^{7} esplenocitos fueron cultivados por 5 días en 6 placas
pozos en un total de 5 ml de medio RPMI 1640 (a menos que se
indicare en forma diferente, todos los reactivo de la cultura del
tejido fueron obtenidos de tecnologías de la vida de Gibco BRL, de
Rockville, MD) conteniendo la L-glutamina y 25 mM
HEPES y complementados con penicilina (100 U/ml), estreptomicina
(100 \mug/ml), de 5,5 de x 10^{-5} M
\beta-mercaptoetanol y FBS 10% (medios 10%) con
péptido NP147-155 (H-2K^{d}
TYQRTRALV) o péptido
\beta-gal_{876-884}
(H-2L^{d}TPHPARIGL) en 1 \mug/ml e
IL-2 murino recombinante (Roche Molecular
Biochemicals, Indianapolis, IN) en 0.5 U/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Para detectar lisis específica del antígeno, las
células P815 fueron etiquetadas con 0.15 mCi Na_{2}^{51} CrO4
(NEN Life Science Products, Boston, MA) y pulsado con 20 \mug
NP_{147-155} o 50 \mug péptido
\beta-gal_{876-884} en 1 ml
medio RPMI 1640 o utilizadas unpulsed. Las partes alícuotas
duplicados de esplenocitos estimulados fueron diluidas en serie en
96 chapas fondas redondas pozos (ICN Biomedicals, Aurora, OH) y las
células de blanco fueron agregadas en el determinante señalado:
apunte los cocientes en un volumen final de 200 \mul/pozo. Las
placas fueron centrifugadas e incubadas por 4 horas en 37ºC con CO2
del 5%. Después de la incubación, 100 \mul de sobrenadante de
cada uno eran analizados pozos. Específico lisis eran calculado como
% específico lisis =
[(a-b)/(c-b)]100 donde está el CPM a
medio lanzado en presencia de determinantes, b es el CPM medio
lanzado de las células de blanco incubadas en medios solamente y c
es el CPM lanzado de las células de blanco en presencia del
Triton-x 100 1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar perfiles de la secreción del
citosina de las células del bazo relanzó in vitro con el
antígeno, esplenocitos fueron plateados dos veces en 4 x105
cells/100 \mul/pozo en 96 placas de cultura pozos de la parte
inferior plana con la proteína purificada NP (purificado de los
extractos baculoviral recombinantes) o \beta-gal
(Sigma, St. Louis, MO) en 5 \mug/ml. Los sobrenadantes de la
cultura fueron cosechados después de 72 horas en 37ºC con CO2 del
5%. Citosinas en sobrenadantes de la cultura fue cuantificado con un
equipo de IFN-\gamma ELISA del ratón (Pharmingen,
La Jolla, CA) Y el mini-equipo del ratón
IL-4 ELISA (Endogen, Woburn, MA) según las
instrucciones de los fabricantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análisis estadísticos fueron realizados con
la t-prueba atada 2 del estudiante.
\vskip1.000000\baselineskip
Los títulos específicos del anticuerpo del
antígeno para los sueros recogieron 1 día antes del alza en 3
semanas, y para los sueros recogidos en 6 semanas que siguen la
primera inyección se demuestran en el cuadro 11 inmunización con
pDNA/Vaxfectin tenía un efecto modesto sobre los títulos de tres
semanas de anti-NP y de los anticuerpos del
anti-Factor IX y un efecto incluso mayor sobre los
títulos de la identificación del anti-ratón y del
anticuerpo de los anti-HEL. Vaxfectin no tenía
cualesquiera efecto sobre los títulos del suero de los anticuerpos
anti-\beta-gal en 3 semanas. Tres
semanas que seguían las inmunizaciones del alza, los títulos para
los ratones que recibían pDNA/Vaxfectin fueron aumentados sobre ésos
que recibían el pDNA desnudo para los cinco de los antígenos. El
cuadro 3 resume las respuestas específicas de IgG del antígeno en 6
semanas para los 5 antígenos modelo. Vaxfectin aumentó los títulos
de anti-NP inducido pDNA y los anticuerpos 8 de los
anti-HEL doblan y 10 doblan respectivamente sobre
pDNA desnudo y aumentaron los títulos de
anti-\beta-gal, factor anti- IX y
la identificación 3 del anti-ratón pliega el pDNA
desnudo.
el *Mice recibió una inyección
bilateral 5mg del pDNA /- Vaxfection en cada músculo femoral del
músculo recto en 0 y 3 semanas. Los títulos del anticuerpo eran
resueltos en 6 semanas (n = 20 para todos los grupos, a excepción de
NP donde n = 29 para el pDNA desnudo de NP, n = 30 para NP p
DNA/Vaxfectin, y para Mousde Idiotype donde n = 19 para el DNA
desnuda de la identificación p del
ratón).
\vskip1.000000\baselineskip
La vacunación de el DNA del plásmido por la ruta
intramuscular da lugar típicamente a respuestas fuertes de CTL al
antígeno codificado (Ulmer et al., 1993; Raz et al.,
1996; Donnelly et al., 1997). Un resultado posible de
formular el pDNA con un coadyuvante para alzar respuestas del
anticuerpo es inducción Th2 de un tipo respuesta que podría dar
lugar a una inmunorespuesta transmitida por células más débil. Para
determinar el efecto de Vaxfectin sobre el pDNA indujo la respuesta
de CTL, bazos del immu de los ratones con pDNA NP o
\beta-gal fue cosechado 8-9
semanas que seguían la inyección del alza. Esplenocitos cultivó con
NP o el péptido \beta-gal por 5-6
días fue probado para la lisis de CTL de las células de blanco P815
pulsó con el péptido NP o \beta-gal. Las células
de Unpulsed P815 fueron utilizadas para detectar lisis no
específica. Las curvas específicas de la titulación del
determinante del antígeno CTL para % de la lisis del péptido
pulsaron las células de blanco se demuestran en el cuadro 12. Los
resultados para el pDNA NP y \beta-gal indican
que la formulación del pDNA con Vaxfectin no tiene cualesquiera
efecto significativo sobre la respuesta de CTL en el determinante
un de los: los cocientes de la blanco probaron (p > 0,05 en toda
la E:
Cocientes de T).
Cocientes de T).
\vskip1.000000\baselineskip
El Th 1 tipo inmunorespuestas inducidas por la
inmunización intramuscular del pDNA promueve el interruptor de la
cadena pesada del anticuerpo en células de B de respuesta al
secundario-isotipo de IgG2a (Raz et al.,
1996). Así la producción del antígeno IgG2a específico es mayor que
el antígeno IgG1 específico. El uso de un coadyuvante en vacunas
del pDNA podía cambiar cualitativo la inmunorespuesta, dando por
resultado la mayor producción de IgG1 o de IgG2a. Para determinar
el efecto de Vaxfectin sobre la proporción relativa del suero
específico IgG1 del antígeno a IgG2a cuando estaban formulados con
el vario plásmido DNAs del antígeno, 6 sueros de la semana eran
analizados para los títulos específicos del
secundario-isotipo del antígeno.
\newpage
Según las indicaciones de la figura 13a,
inmunizaciones con el pDNA desnudo que codifica diverso resultado
de los antígenos en los perfiles del
secundario-isotipo que son únicos a cada antígeno.
Aunque la proporción relativa de IgG1 y de IgG2a variara para
diversos antígenos, IgG2a era el secundario-isotipo
predominante producido, constante con Th1 un tipo inmunorespuesta.
Vaxfectin formuló con los cinco resultados modelo de los pDNAs del
antígeno en un aumento de ambos secundario-isotipos
específicos del anticuerpo del antígeno (Cuadro 4). Los aumentos en
el antígeno IgG1 e IgG2a específicos eran aproximadamente la misma
magnitud para el pDNA formulado Vaxfectin para 4 de los antígenos
modelo. Con respecto a los títulos obtenidos con el pDNA desnudo,
formular el pDNA con Vaxfectin aumentó los títulos 9 de los
anti-HEL IgG1 dobla y los títulos de IgG2a once
veces. Vaxfectin aumentó
anti-\beta-gal, el
anti-ratón Id/human Fc y los títulos IgG1 2 a cinco
veces y los títulos 2 del anti-factor IX de IgG2a a
cuádruple sobre el DNA desnuda. Vaxfectin formuló con el pDNA de NP
aumentó el título medio del anticuerpo anti-NP IgG1
en el doblez 15 sobre pDNA desnudo. Sin embargo, el título medio
del anticuerpo de anti-NP IgG2a fue aumentado
solamente tres veces. Así, las proporciones relativas de IgG1 y de
IgG2a sacadas por la inmunización de pDNA/Vaxfectin siguen siendo
similares a las proporciones generadas cuando el pDNA desnudo se
utiliza para inmunizar ratones excepto en el caso de NP
pDNA/Vaxfectin (figura 13b). En este caso, hay un aumento mucho
mayor en el título del anticuerpo de anti-NP IgG1
que anti-NP IgG2a. Para todos los pDNAs formulados
con Vaxfectin, los títulos del antígeno IgG2a específico eran más
altos que el antígeno IgG1 específico, sugiriendo Th1 un tipo
respuesta.
\vskip1.000000\baselineskip
* Los ratones recibieron una
inyección bilateral 5 \mug del pDNA +/- Vaxfectin en cada músculo
femoral del músculo recto en 0 y 3 semanas. Los títulos del
anticuerpo eran resueltos en 6 semanas (n =20 para todos los grupos,
a excepción de NP donde n =29 para el NP pDNA desnudo, n =30 para el
NP pDNA/Vaxfectin, y para el idiotipo del ratón donde n = 19 para el
Id de ratón pDNA
desnudo).
\vskip1.000000\baselineskip
Los análisis del sub-isotipo del
anticuerpo específico del antígeno sugieren que las respuestas
inducidas con pDNA formulado con Vaxfectin, como para pDNA desnudo
son respuestas del tipo Th1. Para confirmar que Vaxfectin no tiene
cualquiera efecto sobre el perfil del citosina del adyuvante de T
(Th) en una respuesta in vitro específica de memoria del
antígeno, los bazos de grupos de ratones inmunizados con NP o el
pDNA \beta-gal formulado con o sin Vaxfectin
fueron cosechados 8-9 semanas que seguían la
inyección de refuerzo. Esplenocitos fueron cultivados y estimulados
con la proteína NP o \beta-gal. Sobrenadantes
cosechó de las células cultivadas fue probado para
IFN-\gamma y la producción de la
interleucina-4 (IL-4).
Inmunizaciones con el DNA del plásmido NP o
\beta-gal formulado con o sin Vaxfectin dio lugar
a la producción de IFN-\gamma en culturas del
splenocyt de todos los grupos de ratones inmunizados (cuadro 14).
Los niveles bajos de IL-4 fueron producidos en
todos los grupos de ratones; sin embargo,
IFN-\gamma era el citosina predominante producido,
sugiriendo una respuesta predispuesta Thl.
En resumen, los ejemplos precedentes demuestran
los efectos adyuvantes robustos de una formulación
lípido-basada catiónica única para las vacunas del
ácido nucléico. El estímulo de la respuesta humoral puede ser
realizado sin la disminución de las respuestas citolíticas fuertes
típicas de vacunas a base de ácidos nucléicos. La actividad
adyuvante se considera en ratones y conejos, así implicando los usos
farmacéuticos en otros mamíferos, así como el ofrecimiento de la
ventaja potencial en la preparación a base de ácido nucléica de
anticuerpos monoclonales y policlonales. Refuerzo mediado por
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro/co-lípido (por ejemplo, Vaxfectin) de las
respuestas del anticuerpo fue observado fácilmente después de una
sola inyección intramuscular unilateral. Esto es importante para la
inmunización de los animales del campo donde están las
solas-shor vacunas altamente deseables puesto que el
rodeo de los animales de lo pasto es costoso y puede dar lugar a la
pérdida de producción debido a tensión (Beard, C.W., et al.,
Nat. Biotechnol 16 (13): 1325-1328 (1998)).
Composiciones inmunogénicas que abarcan
hemaglutinina que codifica el pDNA (HA), mezcladas con un
coadyuvante que contiene
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro formuladas como 1:1 (mol: mol) de mezcla con DPyPE, se
preparan según el método descrito arriba. El cociente molar
pDNA/adyuvante es 4: 1. Tres inyecciones de 0,1, 0,5, 1,0 o 2,5 mg
pDNA en salino fisiológico, como complejo con el coadyuvante, se
inyectan en seres humanos en los intervalos de cuatro semanas en
deltoideo alternos. El suero se quita de los seres humanos y los
niveles del anticuerpo HA son determinados por la dilusión serial
usando un análisis estándar ELISA, como se describe anteriormente.
Las inmunorespuestas de los sujetos humanos al anticuerpo HA se
inducen, según lo indicado por valores del título del anticuerpo del
GMT.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Una composición adyuvante que abarca
GAP-DMORIE y uno o más
co-lípidos.
2. La composición adyuvante de la declaración 1
en donde el co-lípido es un lípido neutral.
3. La composición adyuvante de la declaración 1
en donde el co-lípido es un
fosfatidiletanolamina.
4. La composición adyuvante de la declaración 3
en donde el fosfatidiletanolamina se selecciona del grupo que
consiste en DOPE, DPyPE, y DMPE.
5. La composición adyuvante de la declaración 4
en donde el fosfatidiletanolamina es DOPE.
6. El coadyuvante de la declaración 4 en donde
el fosfatidiletanolamina es DPyPE.
7. El coadyuvante de la declaración 1 en donde
los GAP-DMORIE y el co-lípido son en
cociente molar alrededor del 9:1 alrededor al 1:9
8. El coadyuvante de la declaración 1 en donde
los GAP-DMORIE y el co-lípido son en
cociente molar alrededor del 4:1 alrededor al 1:4
9. El coadyuvante de la declaración 1 en donde
los GAP-DMORIE y el co-lípido están
en cociente molar alrededor del 2:1 alrededor al 1:2
10. El coadyuvante de la declaración 1 en donde
los GAP-DMORIE y el co-lípido están
en cociente molar de cerca de 1: 1.
11. El coadyuvante de la declaración 6 en donde
los GAP-DMORIE y el DPyPE están en cociente molar
alrededor del 2:1 a cerca de 1: 2.
12. El coadyuvante de la declaración 6 en donde
los GAP-DMORIE y el DPyPE están en cociente molar de
cerca de 1: 1.
13. Una composición inmunogénica que abarca un
inmunógeno y una composición adyuvante que abarca
GAP-DMORIE y uno o más
co-lípidos.
14. La composición inmunogénica de la
declaración 13 en donde el inmunógeno abarca un polinucleótido que
codifica inmunógeno.
15. La composición inmunogénica de la
declaración 14 en donde el polinucleótido que codifica inmunógeno es
DNA, RNA, u oligómero del ácido nucléico.
16. La composición inmunogénica de la
declaración 14 en donde el polinucleótido que codifica inmunógeno es
un polinucleótido linear o circular.
17. La composición inmunogénica de la
declaración 14 en donde el polinucleótido que codifica inmunógeno es
todo o una parte de una DNA del plásmido.
18. La composición inmunogénica de la
declaración 14 en donde el co-lípido se selecciona
del grupo que consiste en DOPE, DPyPE, y DMPE.
19. La composición inmunogénica de la
declaración 18 en donde el co-lípido es DOPE.
20. La composición inmunogénica de la
declaración 18 en donde el co-lípido es DPyPE.
21. La composición inmunogénica de la
declaración 14 en donde los GAP-DMORIE y el
co-lípido están en cociente molar alrededor del 9:1
a cerca de 1: 9.
22. La composición inmunogénica de la
declaración 14 en donde los GAP-DMORIE y el
co-lípido están en cociente molar alrededor del 4:1
a cerca de 1: 4.
23. La composición inmunogénica de la
declaración 14 en donde los GAP-DMORIE y el
co-lípido están en cociente molar alrededor del 2:1
a cerca de 1: 2.
24. La composición inmunogénica de la
declaración 14 en donde los GAP-DMORIE y el
co-lípido están en cociente molar de cerca de 1:
1.
25. La composición inmunogénica de la
declaración 20 en donde los GAP-DMORIE y el DPyPE
están en cociente molar alrededor del 2:1 a cerca de 1: 2.
26. La composición inmunogénica de la
declaración 20 en donde los GAP-DMORIE y el DPyPE
están en cociente molar de cerca de 1: 1.
27. Un método para inmunizar un vertebrado que
abarca la administración en un tejido o una cavidad del vertebrado
dicho una composición inmunogénica que abarca uno o más
polinucleótido que codifica inmunógeno y un adyuvante del
composition que abarca GAP-DMORIE, en donde un
inmunógeno se expresa en el vertebrado en cantidad suficiente para
generar una inmunorespuesta al inmunógeno.
28. El método de la declaración 27 en donde la
composición inmunogénica más futura abarca uno o más
co-lípidos.
29. El método de la declaración 28 en donde el
polinucleótido que codifica inmunógeno es DNA, RNA, u oligómero del
ácido nucléico.
30. El método de la declaración 28 en donde el
polinucleótido que codifica inmunógeno es todo o una parte de una
DNA del plásmido.
31. El método de la declaración 28 en donde el
co-lípido se selecciona del grupo que consiste en
DOPE, DPyPE, y DMPE.
32. El método de la declaración 28 en donde el
co-lípido es DOPE.
33. El método de la declaración 28 en donde el
co-lípido es DPyPE.
34. El método de la declaración 28 en donde los
GAP-DMORIE y el co-lípido están en
cociente molar alrededor del 9:1 a cerca de 1: 9.
35. El método de la declaración 28 en donde los
GAP-DMORIE y el co-lípido están en
cociente molar alrededor del 4:1 a cerca de 1: 4.
36. El método de la declaración 28 en donde los
GAP-DMORIE y el co-lípido están en
cociente molar alrededor del 2:1 a cerca de 1: 2.
37. El método de la declaración 28 en donde los
GAP-DMORIE y el co-lípido están en
cociente molar de cerca de 1: 1.
38. El método de la declaración 33 en donde los
GAP-DMORIE y el DPyPE están en cociente molar
alrededor del 2:1 a 20 cerca de 1: 2.
39. El método de la declaración 33 en donde los
GAP-DMORIE y el DPyPE están en cociente molar de
cerca de 1: 1.
40. El método de la declaración 27 en donde el
vertebrado es un mamífero.
41. El método de la declaración 40 en donde el
mamífero es un ser humano.
42. El método de la declaración 28 en donde la
composición inmunogénica es una composición farmacéutica.
43. El método de la declaración 28 en donde el
inmunógeno dicho se selecciona del grupo que consiste en un
polipéptido bacteriano, un polipéptido fungicida, un polipéptido del
parásito, un polipéptido alergénico, un polipéptido específico del
tumor, los fragmentos, los derivados, o los análogos inmunogénicos
de eso.
44. El método de la declaración 28 en donde el
tejido dicho se selecciona del grupo que consiste en el músculo, la
piel, el tejido de cerebro, el tejido pulmonar, el tejido del
hígado, el tejido del bazo, el tejido de la médula, el tejido del
timo, el tejido del corazón, el tejido de la linfa, el tejido de la
sangre, el tejido del hueso, el tejido conectivo, el tejido de la
mucosa, el tejido del páncreas, el tejido del riñón, el tejido de la
vejiga de rozadura, el tejido del estómago, el tejido intestinal, el
tejido testicular, el tejido ovárico, el tejido uterino, el tejido
vaginal, el tejido rectal, el tejido del sistema nervioso, el tejido
del ojo, el tejido glandular, y la lengüeta.
45. El método de la declaración 28 en donde la
cavidad dicha se selecciona del grupo que consiste en el pulmón, la
boca, la cavidad nasal, el estómago, el peritoneo, el intestino, el
compartimiento de corazón, la vena, la arteria, el tubo capilar,
linfático, útero, vagina, recto, y cavidad ocular.
46. El método de la declaración 28, en donde la
cavidad dicha abarca una superficie de la mucosa.
47. El método de la declaración 28, en donde el
tejido dicho es músculo.
48. El método de la declaración 47, en donde el
tejido dicho es músculo esquelético.
49. El método de la declaración 28, en donde la
administración dicha es intravenosa.
50. El método de la declaración 28, en donde la
administración dicha está al lado de una ruta seleccionada de
consistir en el grupo intramuscular, intratraqueal, intranasal,
transdémico, interdermal, subcutáneo, intraocular, vaginal, rectal,
intraperitoneal, intraintestinal e inhalación.
51. El método de cualquie de la declaración 28,
en donde la administración dicha es mediada por un dispositivo
seleccionado del grupo que consiste en un acelerador de partícula,
una bomba, un aplicador intradérmico, un inyector biolistic, un
inyector neumático, un depósito de la esponja, una píldora y una
tableta.
52. El método de la declaración 28, en donde la
administración dicha es mediada por un Biojector®2000.
53. Un método para proporcionar un mamífero un
tratamiento profiláctico o terapéutico asoció a una infección
bacteriana abarcar administrando al mamífero abarcar inmunogénico de
la composición uno o más del polinucleótido que codifica inmunógeno
se asociaron a la infección bacteriana y a una composición adyuvante
que abarcaban GAP-DMORIE y un
co-lípido, en donde un inmunógeno se expresa en el
mamífero en cantidad suficiente para generar una inmunorespuesta al
inmunógeno.
54. El método de la declaración 53 en donde el
co-lípido es DPyPE.
55. Un método para proporcionar un mamífero un
tratamiento profiláctico o terapéutico asoció a una infección viral
abarcar administrando al mamífero abarcar inmunogénico de la
composición uno o más del polinucleótido que codifica inmunógeno se
asociaron a la infección infección viral y una composición adyuvante
que abarca GAP-DMORIE y un
co-lípido, en donde un inmunógeno se expresa en el
mamífero en cantidad suficiente para generar una inmunorespuesta al
inmunógeno.
56. El método de la declaración 55 en donde el
co-lípido es DPyPE.
57. Un método para proporcionar un mamífero un
tratamiento profiláctico o terapéutico se asoció a un crecimiento
anormal de una población de la célula que abarcaba la administración
al mamífero que una composición inmunogénica que abarcaba uno o más
polinucleótido que codifica inmunógeno se asoció al crecimiento
anormal de la población de la célula y de una composición adyuvante
que abarcaban GAP-DMORIE y un
co-lípido, en donde un inmunógeno se expresa en el
mamífero en cantidad suficiente para generar una inmunorespuesta al
inmunógeno.
58. El método de la declaración 57 en donde el
crecimiento anormal de una población de la célula se asocia al
cáncer.
59. El método de la declaración 58 en donde el
co-lípido es DPyPE.
60. Un equipo farmacéutico que abarca
(a) un envase que sostiene 1 mg al 30 mg de un
polinucleótido que codifica inmunógeno que de manera operable
codifica un inmunógeno dentro de las células vertebradas in
vivo; y
(b) una composición adyuvante que abarca
GAP-DMORIE y un co-lípido,
por el que el inmunógeno dicho esté
proporcionado en cantidad profiláctica o terapéutica eficaz para
tratar un vertebrado.
61. El equipo farmacéutico de la declaración 60,
en donde (b) está en el envase de (a).
62. El equipo farmacéutico de la declaración 60,
en donde (b) está en el envase separado de (a).
63. El equipo farmacéutico de la declaración 60,
más futuro abarcar medios de una administración.
64. El equipo farmacéutico de la declaración 60,
en donde el co-lípido dicho es DPyPE.
65. El equipo farmacéutico de la declaración 64,
en donde los GAP-DMORIE y DPyPE dichos están en
cociente molar alrededor del 2:1 a cerca de 1: 2.
66. El equipo farmacéutico de la declaración 64,
en donde GAP-DMORIE y DPyPE dichos están en cociente
molar de cerca de 1: 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el
máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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Claims (39)
1. Sal
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium.
2. Sal según la reivindicación 1, en donde la
sal es
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro.
3. Composición farmacéutica que comprende la sal
de la reivindicación 1 y de un portador aceptado
farmacéuticamente.
4. Composición farmacéutica que comprende la sal
de la reivindicación 2 y de un portador aceptado
farmacéuticamente.
5. Composición adyuvante que comprende
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro y uno o más co-lípidos.
6. Composición adyuvante según la reivindicación
5 en donde el co-lípido es un lípido neutral.
7. Composición adyuvante según la reivindicación
6 en donde el co-lípido es un
fosfatidiletanolamina.
8. Composición adyuvante según la reivindicación
7 en donde el fosfatidiletanolamina se selecciona del grupo 1 que
consiste en
2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfetanolamina
(DOPE),
1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfetanolamina
(DPyPE), y 1,
2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfetanolamina
(DMPE).
9. Composición adyuvante según la reivindicación
8 en donde el fosfatidiletanolamina es 1,
2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfetanolamina
(DOPE).
10. Composición adyuvante según la
reivindicación 8 en donde el fosfatidiletanolamina es 1,
2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfetanolamina
(DPyPE).
11. Composición adyuvante según cualquiera de
las reivindicaciones 5-10 en donde
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro y el co-lípido están en cociente molar de a
partir del 9: 1 a 1: 9.
12. Composición adyuvante según cualquiera de
las reivindicaciones 5-10 en donde
((+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro y el co-lípido están en cociente molar de a
partir del 4: 1 a 1: 4.
13. Composición adyuvante según cualquiera de
las reivindicaciones 5-10 en donde
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro y el co-lípido están en cociente molar de a
partir del 2: 1 a 1: 2.
14. Composición adyuvante según cualquiera de
las reivindicaciones 5-10 en donde
(+/-)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis
(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro y el co-lípido están en el cociente
molar
de 1: 1.
de 1: 1.
15. Composición inmunogénica que comprende un
inmunógeno o un polinucleótido que codifica inmunógeno, y la
composición adyuvante según cualquiera de reivindicaciones
5-14.
16. Composición inmunogénica según la
reivindicación 15 en donde la composición inmunogénica comprende un
polinucleótido de la codificación del inmunógeno.
17. Composición inmunogénica según la
reivindicación 16 en donde el polinucleótido que codifica inmunógeno
es DNA, RNA, u oligómero del ácido nucléico.
18. Composición inmunogénica según cualquiera de
las reivindicaciones 16 ó 17, en donde el polinucleótido que
codifica inmunógeno es todo o una parte de una DNA del plásmido.
19. Uso de la composición inmunogénica según
cualquiera de las reivindicaciones 15-18 en la
fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una condición
de la enfermedad en un vertebrado en donde la composición dicha debe
ser administrada en un tejido o una cavidad del vertebrado donde el
inmunógeno se expresa en cantidad suficiente para generar una
inmunorespuesta al inmunógeno.
20. Uso según la reivindicación 19 en donde el
vertebrado es un mamífero.
21. Uso según la reivindicación 20 en donde el
mamífero es un ser humano.
22. Uso según cualquiera de reivindicaciones
19-21 en donde el tejido dicho es músculo.
23. Uso según la reivindicación 22 en donde el
tejido dicho es músculo esquelético.
24. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
19-23 en donde la administración dicha es
intravenosa.
25. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
19-24 en donde la composición inmunogénica dicha
abarca uno o más polinucleótidos de la codificación del inmunógeno
que codifican uno o más polipéptidos antigénicos o inmunogénicos de
un agente de las infecciones bacterianas, y en donde el medicamento
dicho está para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa
bacteriana.
26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
19-24, en donde la composición inmunogénica dicha
abarca uno o más polinucleótidos de la codificación del inmunógeno
que codifican uno o más polipéptidos antigénicos o inmunogénicos de
un agente de las infecciones viral, y en donde el medicamento dicho
está para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa viral.
27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
19-24, en donde la composición inmunogénica dicha
abarca uno o más polinucleótidos que codifican inmunógeno que
codifican uno o más polipéptidos antigénicos o inmunogénicos
tumor-asociados, y en donde el medicamento dicho
está para tratar o prevenir el cáncer.
28. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
19-24, en donde la composición inmunogénica dicha
abarca uno o más polinucleótidos de la codificación del inmunógeno
que codifican uno o más polipéptidos antigénicos o inmunogénicos de
una enfermedad infecciosa fungicida, y en donde el medicamento dicho
está para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa viral.
29. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
19-24, en donde la composición inmunogénica dicha
abarca uno o más polinucleótidos de la codificación del inmunógeno
que codifican uno o más polipéptidos antigénicos o inmunogénicos de
una enfermedad infecciosa parásita, y en donde el medicamento dicho
está para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa parásita.
30. Uso según la reivindicación 29 en donde la
enfermedad infecciosa parásita dicha es una enfermedad infecciosa
del protozoario.
31. Uso según la reivindicación 29 en donde la
enfermedad infecciosa parásita dicha es una enfermedad infecciosa
del helminto.
32. Uso según la reivindicación 29 en donde la
enfermedad infecciosa parásita dicha es una enfermedad infecciosa
ectoparásita.
33. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
19-24, en donde la composición inmunogénica dicha
abarca uno o más polinucleótidos de la codificación del inmunógeno
que codifican uno o más polipéptidos antigénicos o inmunogénicos de
un agente alergénico, y en donde el medicamento dicho está para
tratar o prevenir alergia.
34. Equipo farmacéutico que comprende:
(a) un envase que sostiene 1 ng al 30 mg de un
polinucleótido que codifica inmunógeno que de manera operable
codifica un inmunógeno dentro de las células vertebradas in
vivo; y
(b) una composición adyuvante que comprende
(+/-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceniloxi)-1-propanaminium
bromuro y uno o más co-lípidos, para proporcionar el
inmunógeno dicho en profiláctico o terapéutico cantidad eficaz para
tratar un vertebrado.
35. Equipo farmacéutico según la reivindicación
34 en donde el polinucleótido que codifica inmunógeno codifica un
inmunógeno viral.
36. Composición inmunogénica según cualquiera de
las reivindicaciones 15-18, en donde el
polinucleótido que codifica inmunógeno codifica un inmunógeno del
virus seleccionado del grupo que consiste en el adenovirus,
alphavirus, calicivirus, coronavirus, virus de enfermedad, virus de
Ebola, enterovirus, flavivirus, virus de hepatitis, herpesvirus,
virus de la inmunodeficiencia, virus infeccioso de la peritonitis,
virus de gripe, virus de la leucemia, virus de Marburg,
ortomixovirus, virus del papiloma, virus de parainfluenza,
paramixovirus, parvovirus, pestivirus, picorna, virus de sífilis,
virus de rabia, reovirus, retrovirus, y rotavirus.
37. Composición inmunogénica según cualquiera de
las reivindicaciones 15-18, en donde el
polinucleótido que codifica inmunógeno codifica un inmunógeno del
virus de gripe.
38. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
19-24, en donde la enfermedad dicha es causada por
un virus seleccionado del grupo que consiste en el adenovirus, el
alphavirus, el calicivirus, el coronavirus, el virus de enfermedad,
el virus de Ebola, el enterovirus, el flavivirus, el virus de
hepatitis, el herpesvirus, el virus de la inmunodeficiencia, el
virus infeccioso de la peritonitis, el virus de gripe, el virus de
la leucemia, el virus de Marburg, el ortomixovirus, el virus del
papiloma, el virus de parainfluenza, el paramixovirus, el
parvovirus, el pestivirus, el picoma, el virus de sífilis, el virus
de rabia, el reovirus, el retrovirus, y el rotavirus.
39. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
19-24, en donde la enfermedad dicha es causada por
un virus de gripe.
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