DE60012711T2 - Adjuvanszusammensetzungen zur erhöhung der immunantwort auf polynukleotid-basierende impfstoffe - Google Patents

Adjuvanszusammensetzungen zur erhöhung der immunantwort auf polynukleotid-basierende impfstoffe Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Adjuvantien und immunogene Zusammensetzungen, die für eine Polynukleotid-basierte Impfung nützlich sind. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die zum Erhöhen einer Immunantwort, insbesondere der humoralen Immunantwort von Vertebraten, auf Polynukleotidbasierte Impfstoffe nützlich sind. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Adjuvans eines Cytofectin:Ko-Lipid Gemisches bereit, worin das Cytofectin ein Salz von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium, vorzugsweise ein Bromid, ist.
  • Ende der Achtziger Jahre des zwanzigsten Jahrhunderts wurde entdeckt, dass eine direkte intramuskuläre (i. m.) Injektion von Lipid-DNA-Komplexen zu einer erfassbaren Protein-Expression führt und dass "Naked" ("nackte") -Plasmid-DNA (pDNA) aufgenommen wird und im Muskel in größerem Ausmaß als Lipid-DNA-Komplexe exprimiert wird (Felgner, Scientific American, 276 (6), 102–106 (1997)).
  • Eine der ersten Anwendungen der pDNA-Injektionstechnologie war die Induktion einer Immunantwort. Im Jahre 1991 wurde erstmals berichtet, dass Mäuse gegen HIVgp120 durch eine i.m. Impfung mit gp120 Plasmid-DNA immunisiert werden könnten (Felgner et al., Nature, 349, 351–352 (1991)) und dass Mäuse vor einer tödlichen Herausforderung eines Influenza-Virus nach einer DNA-Immunisierung mit Influenza-Nucleoprotein (NP)-Antigen geschützt werden könnten. Der nach einer Immunisierung mit dem hoch-konservierten NP-Antigen erhaltene Schutz erstreckte sich über zwei unterschiedliche virale Stämme (Ulmer et al., Current Opinions In Immunology, 8, 531–536 (1996)). Zahlreiche Veröffentlichungen auf dem Gebiet einer Polynukleotid-basierten Impfung folgten anschließend nach (beispielsweise Boyer et al., J. Med. Primatology, 25 (3), 242–250 (1996); Boyer et al., Nature Medicine, 3(5), 526–532 (1997); Davis et al., Vaccine, 15 (8), 849–852 (1997); Wang et al., Vaccine, 15(8), 821–825 (1997); Agadjanyan et al., Current Topics In Microbiology And Immunology, 226, 175–192 (1998); Heppell et al., Fish & Shellfish Immunology, 8 (4), 271–286 (1998); Lodmell et al., Nature Medicine, 4 (8), 949–952 (1998); Vanderzanden et al., Virology, 246(1), 134–144 (1998)).
  • Ein Hauptproblem, das häufig während einer Polynukleotid-basierten Impfung auftritt, ist eine unzureichende oder suboptimale humorale Antwort. Häufig werden die Antigene oder die Immunogene, die durch das Polynukleotid kodiert werden, in vivo exprimiert, wobei sie jedoch nicht ausreichend immunogen sind, um den Antikörper-Titer in dem Organismus auf ausreichende Niveaus anzuheben, um einen Schutz gegen eine nachfolgende Herausforderung bereitzustellen und/oder das Potential zum Erzeugen therapeutisch aktiver Antikörper-Niveaus über längere Zeitspannen aufrecht zu erhalten. Zum Erhalten einer stärkeren humoralen und/oder zellulären Antwort, werden gewöhnlich derartige Impfstoffe in einer immunogenen Zusammensetzung verabreicht, die ein Adjuvans, ein Material das die Immunantwort des Patienten auf den Impfstoff erhöht, enthält. Adjuvantien sind im Allgemeinen zur Verbesserung der Immunantwort eines Organismus auf ein bestimmtes Immunogen nützlich und sind gewöhnlich in Impfzusammensetzungen enthalten, um die Menge der hergestellten Antikörper zu erhöhen und/oder die Menge an Immunogen und die Verabreichungshäufigkeit zu verringern.
  • Von verschiedenen Adjuvantien wurde berichtet, dass sie unterschiedliche Immunantworterhöhungs-Niveaus auf eine Polynukleotid-basierte Impfung bewirken. Beispiele für derartige Adjuvans-Materialien umfassen semi-synthetisches Bakterien-Zellwand-abgeleitetes Monophosphoryl-Lipid A (Sasaki, S., et al., Infection und Immunity 65 (9), 3250–3258 (1997)), kleine Molekül-Immunostimulatoren (Sasaki, S., et al., Clin. Exp. Immunol. 111,30–35 (1998)) und Saponine (Sasaki, S., et al., J. Virology 72 (6), 4391–4939 (1998)). Die Immunantwort aus einer i.m. pDNA-Impfung wurde ebenfalls durch die Verwendung kationischer Lipide erhöht (Ishii, N., et al., Aids Res. Hum. Retroviruses 13 (16), 1421–1428 (1997)), Okada, E., et al., J. Immunology 159, 3638–3647 (1997); Yokoyama, M., et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 14, 221–230 (1996); Gregoriadis, G., et al., FEBS Letters 402, 107–110 (1997); Gramzinski, R. A., et. al., Molecular Medicine 4, 109–118 (1998); Klavinskis, L. S., et al., Vaccine 15(8), 818–820 (1997); Klavinskis, L. S., et al., J. Immunology 162, 254–262 (1999); Etchart, N., et al., J. Gen. Virology 78, 1577–1580 (1997); Norman, J., et al., in: Methods in Molecular Medicine, Band 9; DNA Vaccines: Methods and Protocols, D. B. Lowrie und R. Whalen, Hrsg., Kapitel 16, S. 185-196 (1999)). Ursprünglich wurden kationische Lipide als Cytofektine zur Erhöhung der pDNA-Zuführung in vitro in Zellen untersucht, jedoch ergab eine weitere Entwicklung erfolgreiche spezifische Anwendungen einer in vivo Protein-Zuführung (Wheeler, C. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11454–11459 (1996); Stephan, D. J., et al., Human GeneTherapy 7, 1803-1812 (1996); DeBruyne, L. A., et al., GeneTherapy 5, 1079–1087 (1998)). Demgemäß können Cytofektine bei Impfanwendungen durch Erhöhung der pDNA-Zuführung in für die Entstehung des humoralen Arms der Immunantwort verantwortlichen Zellen nützlich sein, wobei dadurch die Antikörper-Titer-Niveaus erhöht werden.
  • Gewöhnlich verwendete Adjuvantien zeigen niedrige Niveaus an Immunantwort-Erhöhung bei einer Impfung (gewöhnlich weniger als 3-fach) und weisen unerwünschte toxikologische Profile und Herstellungsprofile auf. Zusätzlich zeigen die zuvor für eine Impfung verwendeten kationischen Lipide lediglich niedrige Niveaus an humoraler Erhöhung. Daher besteht ein Bedarf nach weiteren Adjuvantzusammensetzungen, die zum Erhöhen der Immunantwort von Vertebraten auf eine Immunisierung, insbesondere auf eine pDNA-Impfung, nützlich sind.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Adjuvantzusammensetzung, welche ein Salz von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und ein oder mehrere Ko-Lipide umfasst, wobei die Adjuvantzusammensetzung zum Erhöhen der humoralen Immunantwort eines Vertebraten auf ein Immunogen nützlich ist. Vorzugsweise ist auch das Ko-Lipid ein neutrales Lipid, derart wie beispielsweise ein Phosphatidylethanolamin. Noch bevorzugter ist das Ko-Lipid 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DPyPE) und/oder 1,2-Dimyristoylglycer-3-phosphoethanolamin (DMPE). Besonders bevorzugt ist, dass das Ko-Lipid DPyPE ist.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine immunogene Zusammensetzung, welche eines oder mehrere Immunogene und die erfindungsgemäße Adjuvantzusammensetzung umfasst. Bei bestimmten Ausführungsformen ist die Quelle des Immunogens ein Immunogen-kodierendes Polynukleotid, derart wie im Falle eines pDNA-Impfstoffs. Bei diesen Ausführungsformen ist vorzugsweise die pDNA oder das Polynukleotid mit einer Adjuvantzusammensetzung komplexiert, welche ein Salz von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und ein oder mehrere Ko-Lipide umfasst.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bildet die Verwendung der immunogenen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung eines Erkrankungszustandes in einem Vertebraten, wobei die Zusammensetzung an den Vertebraten in ein Gewebe oder einen Hohlraum des Vertebraten verabreicht wird, wo das Immunogen in einer ausreichenden Menge exprimiert wird, um eine Immunantwort auf das kodierte Immunogen zu erzeugen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Adjuvant- und immunogene Zusammensetzungen. Die Polynukleotid-basierte Impfung eines Vertebraten hilft den Vertebraten vor einer Erkrankung zu schützen, ist für eine Behandlung des erkrankten Vertebraten geeignet oder beides. Das Immunogen-kodierende Polynukleotid produziert bei einer Inkorporierung in die Zellen des Vertebraten eine immunologisch wirksame Menge eines Immunogens (beispielsweise eines immunogenen Proteins).
  • Die erfindungsgemäße Adjuvantzusammensetzung erhöht die Immunantwort des Vertebraten auf das Immunogen.
  • Im Gegensatz zum Stand der Technik ist die vorliegende Erfindung zum Erhöhen der humoralen Immunantwort eines Vertebraten auf einen Polynukleotid-basierten Impfstoff durch die Verwendung eines Salzes von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium nützlich.
  • Eine Erhöhung von Antikörper-Niveaus ist insbesondere bei Anwendungen vorteilhaft, bei denen Antikörper-Niveaus von dem Immunogen-kodierenden Polynukleotid allein suboptimal sind. Ein verwandter Vorteil ist, falls das erwünschte Antikörper-Niveau mit einer gegebenen Dosis an pDNA hergestellt wird, dass die Menge an pDNA, die notwendig ist, um ...
  • Die erfindungsgemäße Adjuvantzusammensetzung erhöht die Immunantwort des Vertebraten auf das Immunogen.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Adjuvantzusammensetzung, welche ein Gemisch von einem oder mehreren Cytofektinen und ein oder mehrere Ko-Lipide umfasst, wobei die Adjuvantzusammensetzung zum Erhöhen der humoralen Immunantwort eines Vertebraten auf ein Immunogen nützlich ist. Vorzugsweise enthält die Adjuvantzusammensetzung das Cytofektin (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und ein oder mehrere Ko-Lipide. Ebenso vorzugsweise ist das Ko-Lipid ein neutrales Lipid, derart wie beispielsweise ein Phosphatidylethanolamin. Bevorzugter ist das Ko-Lipid 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DPyPE) und/oder 1,2-Dimyristoyl-glycer-3-phosphoethanolamin (DMPE). Besonders bevorzugt ist, dass das Ko-Lipid DPyPE ist.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine immunogene Zusammensetzung, welche umfasst, ein oder mehrere Immunogene und eine Adjuvantzusammensetzung, welche das Cytofektin (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und ein oder mehrere Ko-Lipide kompromittiert bzw. umfasst. Bei bestimmten Ausführungsformen ist die Quelle des Immunogens ein Immunogen kodierendes Polynukleotid, wie im Fall eines pDNA-Impfstoffs. Bei diesen Ausführungsformen ist vorzugsweise die pDNA oder das Polynukleotid mit einer Adjuvantzusammensetzung komplexiert, welche ein Salz von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und ein oder mehrere Ko-Lipide umfasst.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer immunogenen Zusammensetzung, welche umfasst, einen Komplex aus einem oder mehreren Immunogenkodierenden Polynukleotiden und ein bzw. einem Salz von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium in einer ausreichenden Menge zum Erzeugen einer Immunantwort auf das kodierte Immunogen zum Immunisieren eines Vertebraten, wobei die Zusammensetzung an den Vertebraten zu verabreichen ist. Vorzugsweise enthält die immunogene Zusammensetzung weiter ein oder mehrere Ko-Lipide, derart wie beispielsweise DOPE und/oder DPyPE. Besonders bevorzugt ist, dass das Ko-Lipid DPyPE ist.
  • Im Gegensatz zum Stand der Technik, ist die vorliegende Erfindung zum Erhöhen der humoralen Immunantwort eines Vertebraten auf einen Polynukleotid-basierten Impfstoff durch die Verwendung eines Salzes von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9- tetradecenyloxy)-1-propanaminium nützlich. Eine Erhöhung von Antikörper-Niveaus ist insbesondere bei Anwendungen vorteilhaft, bei denen Antikörper-Niveaus durch das Immunogen-kodierende Polynukleotid allein suboptimal sind. Falls das erwünschte Antikörper-Niveau mit einer gegebenen Dosis an pDNA hergestellt wird, so ist ein verwandter Vorteil, dass die Menge an pDNA, die notwendig ist, um das bestimmte Antikörper-Titer-Niveau zu erreichen, unter Verwendung einer geringeren pDNA-Dosis erreicht werden kann. Bei pDNA-Impf-Anwendungen bildet dies einen wichtigen. Vorteil, da annehmbare Impfvolumina, gekoppelt mit funktionalen Grenzen bezüglich der pDNA-Konzentration, eine obere Grenze bei einer gegebenen Impfstoff-Dosis definieren. Dieser Vorteil ist insbesondere von Nutzen bei Impfstoffen, die mehrere bzw. multiple Plasmide enthalten, wovon jedes in ausreichender Menge zum Hervorrufen einer Immunantwort auf sein bestimmtes Transgen vorliegen muss.
  • Die vorstehend genannten Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden einem Fachmann unter Bezugnahme auf die Figuren und die folgende detaillierte Beschreibung einfach klar.
  • 1 erläutert die Plasmid-DNA-Diagramme. Jeder Vektor weist einen pUC19 Replikationsursprung und ein Kanamycin-Resistenzgen zum Plasmidwachstum in E. coli Bakterien auf. CMV = Human Cytomegalovirus Promotor und Enhancer; CMV-A = Human Cytomegalovirus Intron A; mRGB = modifiziertes Kaninchen-β-Globin-Polyadenylierungssignal; BGH = Rinder-Wachstumshormon-Polyadenylierungssignal.
  • 2 erläutert die chemischen Strukturen für das Cytofektin (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und die Ko-Lipide DOPE und DPyPE, zusammen mit strukturell verwandten Cytofektinen.
  • 3 ist ein Säulen-Graph, der zeigt, dass die strukturellen Elemente von Cytofektinen das Niveau der Antikörper-Stimulierung bei Verabreichung bestimmen. Mäuse wurden unter Verwendung von pDNA immunisiert, die für das Influenza-Nuclear-Protein (NP) kodiert, die mit verschiedenen Cytofektinen (welche auf der waagrechten Achse angegeben sind) in einer Formulierung als ein 1 : 1 (mol : mol) – Gemisch mit DOPE Ko-Lipid komplexiert ist. Jedem Tier in der Testgruppe (fünf Tiere pro Gruppe) wurde am Tag "0" und an Woche 3 bzw. nach drei Wochen (Boost-Injektion) 5 μg pDNA in 50 μl physiologischer Salzlösung pro Bein in den Rectus femoris Muskel, entweder allein oder als ein Komplex mit einem Cytofectin : Ko-Lipid-Adjuvans, injiziert. Nach sechs Wochen (3 Wochen nach dem Boost), wurde den Tieren Serum entnommen und die NP Antikörper-Titer wurden durch eine serielle Verdünnung bzw. Verdünnungsreihe unter Verwendung eines ELISA-Assays bestimmt. Die Cytofectin: Ko-Lipid-Erhöhung wurde bewertet, unter Verwendung des Verhältnisses von (i) dem geometrischen mittleren Titer (GMT, geometric mean titer) von einer Cytofektin-erhöhten Transfektionsgruppe zu (ii) dem GMT von einer pDNA-Transfektion allein, wobei eine äquivalente Kontrollgruppe von Tieren verwendet wurde.
  • 4 ist ein Säulen-Graph, der die differentielle Erhöhung von anti-NP Antikörper-Antworten auf Cytofektine unter Verwendung von DPyPE statt DOPE als das Ko-Lipid in der Adjuvantzusammensetzung zeigt. Mäuse wurden immunisiert und wie vorstehend im Zusammenhang mit 2 beschrieben analysiert.
  • 5 erläutert eine Antwort auf eine pDNA-Vaxfectin-Impfdosis und einen zeitlichen Verlauf. BALB/c Mäuse (8–10 Wochen alt) erhielten bilaterale intramuskuläre Injektionen von 1 μg, 5 μg oder 25 μg VR4700 Naked-Plasmid-DNA, die für Influenza Nuclear Protein (NP) kodiert, in 50 μl PBS pro Muskel (folglich 2 μg, 10 μg oder 50 μg Gesamt-pDNA pro Zeitpunkt). Ein zweiter Satz an Mäusen erhielt die gleichen pDNA-Dosen, die mit Vaxfectin formuliert waren, wobei ein konstantes molares Verhältnis pDNA: kationisches Lipid von 4: 1 verwendet wurde. Boost-Injektionen wurden an den Tagen 21 und 42 verabreicht (Pfeile). Anti-NP-Titer wurden aus Serumproben bei Woche 3, 6 und 9 bestimmt. Die Linien veranschaulichen durchschnittliche anti-NP Antikörpertiter + S. E. M. (n = 5 Mäuse pro Gruppe).
  • 6A und 6B veranschaulicht eine Vaxfectin-Formulierungsoptimierung. Kontroll-Mäuse erhielten bilaterale intramuskuläre Injektionen von 5 μg VR4700 Naked-Plasmid-DNA, die für Influenza Nuclear Protein (NP) kodiert, in 50 μl PBS pro Muskel (weiße Säulen). Die Testgruppen erhielten eine äquivalente pDNA-Dosis, die mit Vaxfectin in den angegebenen molaren Verhältnissen pDNA: kationisches Lipid (schwarze Säulen) formuliert war. Boost-Injektionen waren mit den anfänglichen Injektionen identisch und wurden an Tag 21 gegeben. Gesamt NP-spezifische IgG Antikörpertiter wurden aus Serumproben an Tag 42 (3 Wochen nach dem Boost) bestimmt. Die Säulen stellen durchschnittliche Anti-NP-Titer von zwei getrennten Experimenten dar (n = 5–15 Mäuse pro Gruppe).
  • 7A and 7B erläutern die Dauer erhöhter Antikörpertiter, die durch Vaxfectin induziert wurden. Mäuse erhielten bilaterale, intramuskuläre Injektionen von entweder 5 μg VR4700 Naked-Plasmid-DNA, die für Influenza Nuklearprotein (NP) kodiert, in 50 μl PBS pro Muskel, oder die gleiche Menge an pDNA, die mit Vaxfectin in einem molaren Verhältnis pDNA: kationisches Lipid von 4: 1 formuliert ist. Identische Boost-Injektionen wurden entweder an Tag 21 (A) oder an Tag 21 und wieder bei Monat 3 (B) gegeben (Pfeile). NP-spezifische Gesamt-IgG-Antikörpertiter wurden von Serumproben zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Die Linien zeigen durchschnittliche anti-NP Titer + S. E. M. (n = 4–10 Mäuse pro Zeitpunkt).
  • 8A, 8B und 8C erläutern, dass mit Vaxfectin formulierte pDNA zytotoxische T-Lymphozyten (CTL, cytotoxic T lymphocyte) – Antworten induziert, die ebenso kräftig sind wie jene, die mit Naked-pDNA induziert sind. (A) Mäuse erhielten bilaterale intramuskuläre Injektionen von 5 μg VR4700 Plasmid-DNA, die für Influenza nuclear Protein (NP) kodiert, in 50 μl PBS pro Muskel an Tag 0, 21, 42 und 63. Ein zweiter Satz von Mäusen erhielt die gleiche pDNA-Dosis, die mit Vaxfectin in den angegebenen molaren Verhältnissen pDNA: kationisches Lipid formulier war. (B) Mäuse erhielten bilaterale intramuskuläre Injektionen von 1 oder 25 μg VR4700 Plasmid in 50 μl PBS pro Muskel an Tag 0, 21, 42 und 63. Ein zweiter Satz von Mäusen erhielt die gleichen pDNA-Dosen, die mit Vaxfectin in einem molaren Verhältnis pDNA: kationisches Lipid von 4:1 formuliert waren. (C) Mäuse erhielten bilaterale intramuskuläre Injektionen von 5 μg VR4700 Plasmid in 50 μl 150 μM Nap pro Muskel an Tag 0 und 21. Ein zweiter Satz von Mäusen erhielt die gleiche pDNA-Dosis, die mit Vaxfectin in einem molaren Verhältnis pDNA: kationisches Lipid von 4: 1 formuliert war. Alle CTL-Assays wurden 4–4,5 Monate nach der ersten Injektion durchgeführt. Die Linien zeigen eine durchschnittliche spezifische Lysis (n = 4–5 Mäuse pro Gruppe).
  • 9 erläutert die Wirkung von Vaxfectin auf β-Galactosidase (β-Gal) Expression im Muskel. Mäuse erhielten intramuskuläre Injektionen von 5 μg VR1412 Naked-Plasmid, das für β-Galactosidase kodiert. Einer zweiten Gruppe von Mäusen wurden 5 μg VR1412 injiziert, das mit Vaxfectin in einem molaren Verhältnis pDNA: kationisches Lipid von 4: 1 formuliert war. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Quadriceps Muskeln gewonnen und ein Assay hinsichtlich β-Gal-Aktivität wurde durchgeführt. Die Linien zeigen die durchschnittliche Reportergen-Expression pro Muskel ± S. E. M. (n = 10–20 Muskeln pro Gruppe).
  • 10 erläutert, dass Vaxfectin die humorale Immunantwort in Kaninchen erhöht. Gesamt-IgG-Antikörpertiter in Kaninchenserum nach i. m. Injektion von VR4700 Plasmid-DNA, die für Influenza-Nuklearprotein (NP) kodiert, werden gezeigt. Weiße Neuseeland-Kaninchen (5–6 Monate alt) erhielten eine einzelne, unilaterale Injektion von entweder 150 μg VR4700 Plasmid allein oder mit (pDNA: kationisches Lipid, molares Verhältnis = 4: 1) in 300 μl PBS formuliert. In einer Gruppe von Tieren (Dreiecke) wurde sowohl pDNA, als auch pDNA-Vaxfectin unter Verwendung von Nadel und Spritze injiziert. Bei einer anderen Gruppe von Kaninchen (Kreise), wurden pbNA und pDNA-Vaxfectin unter Verwendung einer nadellosen Biojector Injektionsvorrichtung injiziert. An Tag 42 (Pfeil) erhielten Kaninchen eine identische Boost Injektion in den contralateralen Quadriceps-Muskel. Anti-NP Titer wurden aus Serumproben bestimmt, die vor Immunisierung und bei Woche 3, 6, 7, 9 und 13 gesammelt sind. Die Linien zeigen durchschnittliche Anti-NP-Titer ± S. E. M. (n = 4 Kaninchen pro Gruppe).
  • 11A, 11B, 11C, 11D und 11E erläutern, dass Vaxfectin Antigen-spezifische Serum-Antikörperantworten auf 5 verschiedene pDNA-kodierte Modell-Antigene erhöht. BALB/c Mäuse wurden mit Injektionen von 5 μg pDNA +/–Vaxfectin in jeden Rectus femoris Muskel bei Woche 0 und bei Woche 3 immunisiert. Die Daten zeigen die mittleren Antigen-spezifischen IgG-Titer (+/–SEM) für Sera, die 1 Tag vor dem Boost bei Woche 3 und bei Woche 6 gesammelt sind. (n = 20 für alle Gruppen, außer für NP, worin n = 29 für Naked-NP-pDNA; n = 30 für NP pDNA/Vaxfectin und Maus-Id, wobei n = 19 für Naked-pDNA.) A) anti-Influenza NP IgG Titer; B) anti-Influenza HEL IgG Titer; C) anti-β-gal IgG Titer; D) anti-Maus Id IgG Titer; E) anti-Faktor IX IgG Titer. *Statistisch signifikanter Unterschied von Titern, die mit Naked-pDNA erhalten wurden, p < 0,05.
  • 12A, 12B, 12C und 12D erläutern, dass eine Immunisierung mit pDNA, die mit Cytofektin formuliert ist, eine Antigen-spezifische CTL-Lysis von mit Antigen-abgeleiteten Peptiden beschichteten Target-Zellen induziert. BALB/c Mäuse wurden mit Injektionen von 5 μg pDNA +/–Vaxfectin in jeden Rectus femoris Muskel bei Woche 0 und Woche 3 immunisiert. Milzen wurden 11–12 Wochen nach den anfänglichen Immunisierungen gewonnen und für 5–6 Tage mit 1 μM NP147-155 oder β-gal876-884 Peptid und 0.5 U/ml an rekombinanter Maus-IL2 stimuliert. Die Daten zeigen die durchschnittliche %-Lysis für 5 Milzen in jeder Gruppe. Ähnliche Ergebnisse wurden bei einem zweiten Assay sowohl für NP, als auch β-gal-spezifische CTL erhalten. A) P815 Target-Zellen mit NP147-155 Peptid gepulst; B) Nicht-gepulste P815 Target-Zellen; C) P815 Target-Zellen mit β-gal876-884 Peptid gepulst; D) Nicht-gepulste P815 Target-Zellen.
  • 13A und 13B erläutern die Th1-Typ Isotyp-Profile von Antigen-spezifischen Antikörpern, die mit 5 unterschiedlichen pDNA-kodierten Modell-Antigenen induziert wurden. Serum-Titer von Antigen-spezifischen Sub-Isotypen werden als Prozentsatz der Summe von IgG1 und IgG2a Titern gezeigt. (n = 20 für alle Gruppen, außer für NP wobei n = 29 für Naked-NP-pDNA; n = 30 für NP pDNA/Vaxfectin und Maus Id, wobei n = 19 für Naked-pDNA.) A) Prozentsatz an IgG1 und IgG2a bei Woche 6 nach Immunisierungen mit Naked-pDNA. B) Prozentsatz an IgG1 und IgG2a bei Woche 6 nach pDNA/Vaxfectin-Immunisierungen.
  • 14A und 14B erläutern Cytokinsekretionsprofile vom Th1-Typ von Splenozyten von pDNA/Vaxfectin-immunisierten Mäusen. Milzen wurden 11–12 Wochen nach den anfänglichen Immunisierungen gewonnen und wurden für 72 Stunden mit 5 μg/ml an gereinigtem NP oder β-gal-Protein stimuliert. IFN-γ und IL-4 in Kulturüberständen wurden durch ELISA bestimmt. Die Daten zeigen die durchschnittliche Konzentration an Cytokin aus Kulturen von stimulierten Splenozyten abzüglich der Konzentration an Cytokin aus Kulturen von nicht-stimulierten Splenozyten (+/–SEM). A) Antigen-spezifische IFN-γ Antwort von Splenozyten von Mäusen, die mit Naked-pDNA und pDNA/Cytofectin immunisiert sind (n=10 für jede Gruppe). B) Antigen-spezifische IL-4 Antwort von Splenozyten von Mäusen, die mit Naked-pDNA und pDNA/Vaxfectin immunisiert sind (n=10 für jede Gruppe).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Polynukleotid-basierte Immunisierung eines vor einem Erkrankungszustand zu schützenden Vertebraten oder zum Behandeln eines Vertebraten, der einen Erkrankungszustand aufweist. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von Cytofektin, insbesondere von (+)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium in Adjuvantien und immunogenen Zusammensetzungen zur Immunisierung eines Vertebraten, insbesondere mit einem Polynukleotid-basierten Immunogen.
  • Die Adjuvantzusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthält ein Cytofektin, welches ein Salz von (+)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium ist, und ein oder mehrere Ko-Lipide. Cytofektine sind kationische Lipide und das in der vorliegenden Erfindung verwendete Cytofektin weist eine Struktur auf, die einem 2,3-Dialkoxypropanaminium-Skelett entspricht, das eine einzigartige Kombination von zwei einfach ungesättigten, linearen Alkylketten mit 14 Kohlenstoffen und einem Propylamin-Substituent am quaternären Stickstoff aufweist (siehe 2).
  • (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium enthält einen Satz an synergistischen Strukturmerkmalen, wovon keines bei alleiniger Inkorporierung in das Skelett eine optimale Aktivität bereitstellt. Durch Untersuchen der Gruppe DMRIE ((±)-N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaminium-bromid), DLRIE ((±)-N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)-1-propanaminium-bromid) und DDRIE ((±)-N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(decyloxy)-1-propanaminium-bromid) und Vergleichen der Gruppe GAP-DMRIE ((±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-(bis-tetradecyloxy)-1-propanaminium-bromid), GAP-DLRIE ((±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-(bis-dodecyloxy)-1-propanaminium-bromid) und GAP-DPRIE ((±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-(bis-hexadecyloxy)-1-propanaminium-bromid), ist folglich unter Bezugnahme auf 3 ersichtlich, dass Ketten mit vierzehn Kohlenstoffen verglichen mit Ketten anderer Längen aktiver sind (d.h. sie rufen höhere Niveaus an Antikörperstimulierung hervor), ob der quaternäre Stickstoff mit einer Hydroxyethyl-Baueinheit (erstere Gruppe) oder mit einer Propylamino-Baueinheit (letztere Gruppe) substituiert ist. Bei einem Vergleich von DMRIE mit GAP-DMRIE (siehe 3), erscheint es, als ob eine Inkorporierung einer Propylamino-Gruppe anstelle einer Hydroxyethyl-Gruppe keinen ersichtlichen Vorteil bietet. In ähnlicher Weise zeigen DMRIE und DMORIE eine gleiche Aktivität trotz der Inkorporierung eines Olefins in die Kette mit vierzehn Kohlenstoffen. Durch Inkorporieren der Kombination eines Propylamino-Substituenten und einer Olefin-Baueinheit scheint jedoch (+)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium auf Basis des geometrischen mittleren Titers (GMT) in Relation zu jenem für pDNA allein (3), aktiver als entweder DMORIE oder GAP-DMRIE zu sein. Zusätzlich ist DOSPA (2,3-Dioleyloxy-N-(2-(sperminecarboxamido)-ethyl)-N,N-dimethyl-1-propanaminium-pentahydrochlorid), das sowohl ein Olefin in seinen Alkylketten mit achtzehn Kohlenstoffen, als auch einen aminosubstituierten quaternären Ammoniumsubstituenten inkorporiert, nicht weniger aktiv als DORIE ((±)-N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-octadecenyloxy)-1-propanaminium-bromid), das mit Ausnahme der quaternären Ammonium-Substitution äquivalent ist, wobei jedoch die Antikörper-Titer-Niveaus verglichen mit den für pDNA allein Erhaltenen drastisch verringert sind. Das für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugte Salz von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium ist das Bromidsalz; jedoch umfasst der Begriff "(±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium" alle geeigneten Salze von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium.
  • Aus Definitionsgründen betrifft der Begriff "Ko-Lipid" jegliches hydrophobe Material, das mit der Cytofektin-Komponente kombiniert werden kann, beispielsweise (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium. Bei dem Ko-Lipid der vorliegenden Erfindung kann es sich um amphipathische Lipide und neutrale Lipide handeln. Amphipathische Lipide umfassen Phospholipide, beispielsweise Phosphatidylethanolamine und Phosphatidylcholine. Neutrale Lipide umfassen Cholesterol. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Phosphatidylethanolamine DOPE, DMPE und DPyPE. DOPE und DPyPE sind insbesondere bevorzugt; das am meisten bevorzugte Ko-Lipid ist DPyPE, das zwei Phytanoylsubstituenten umfasst, die in das Diacylphosphatidylethanolamin-Skelett inkorporiert sind. Wie in 3 erläutert, bewirkt die Kombination des Cytofektins (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium mit dem Ko-Lipid DPyPE, wie durch das Antikörper-Titer-Niveau einer pDNA-Immunisierung ersichtlich, eine synergistische Wirkung, um weiter die humorale Immunantwort zu erhöhen.
  • Erfindungsgemäß können Cytofektine und Ko-Lipide auf zahlreiche Weisen gemischt oder kombiniert werden, um mehrere Adjuvantzusammensetzungen von nicht-kovalent gebundenen makroskopischen Strukturen, beispielsweise Liposome, multilamellare Vesikel, unilamellare Vesikel, Mizellen und einfache Filmen, herzustellen. Die Cytofektine und Ko-Lipide können in verschiedenen molaren Verhältnissen gemischt werden. Vorzugsweise beträgt das molare Verhältnis von (+)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und Ko-Lipid von 9: 1 bis 1: 9, bevorzugterweise beträgt das molare Verhältnis von 4: 1 bis 1: 4 oder von 2: 1 bis 1: 2. Am meisten bevorzugt ist, dass das molare Verhältnis 1: 1 beträgt.
  • Die Cytofektine und Ko-Lipide können in einem Lösungsmittel gelöst sein, um die Homogenität des Gemisches zu erhöhen. Geeignete Lösungsmittel umfassen Chloroform. Beispielsweise kann (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium mit einem oder mehreren Ko-Lipiden in Chloroform gemischt werden, wobei das Gemisch anschließend unter Vakuum eingeengt wird, um eine getrocknete, dünne Filmschicht auf der Innenfläche des Glasgefäßes, beispielsweise eines Rotovap-Rundkolbens zu bilden. Ein derartiges getrocknetes Gemisch kann in einem wässrigen Solvens suspendiert werden, wobei sich die amphipathischen Lipidkomponentenmoleküle sich zu homogenen Lipidvesikeln selbstzusammenlagern. Diese Lipidvesikel können anschließend mit jeglichen im Stand der Technik bekannten Verfahren bearbeitet werden, um einen gewählten mittleren Durchmesser mit gleichförmiger Größe vor einer Komplexierung mit anderen Stoffen bzw. Einheiten, beispielsweise pDNA, aufzuweisen. Eine Beschreibung der Schallbehandlung einer Lipidlösung findet sich in Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413–7417 (1987) und in US 5,264,618 .
  • Die erfindungsgemäßen Adjuvantzusammensetzungen können Additive, derart wie hydrophobe und amphiphile Additive umfassen. Beispielsweise kann die Adjuvantzusammensetzung Sterole, Fettsäuren, Ganglioside, Glycolipide, Lipopeptide, Liposaccharide, Neobee-Verbindungen, Niosome, Prostaglandine oder Sphingolipide umfassen. Die in dem Adjuvans enthaltene Menge an Additiven kann eine beliebige Menge sein, einschließlich von etwa 0,1 mol % bis etwa 99,9 mol %, von etwa 1 mol % bis etwa 50 mol %, und von etwa 2 mol % bis etwa 25 mol % sein, bezogen auf die Lipidgesamtmenge. Diese Additive können auch in einer immunogenen Zusammensetzung enthalten sein, welche die erfindungsgemäße Adjuvantzusammensetzung enthält.
  • Die erfindungsgemäße immunogene Zusammensetzung umfasst eine Adjuvantzusammensetzung wie vorstehend beschrieben und ein Immunogen. Ein "Immunogen" soll jegliche antigenen oder immunogenen Polypeptide umfassen, einschließlich Poly-Aminosäuren-Materialien mit Epitopen oder Kombinationen von Epitopen und immunogen-kodierenden Polynukleotiden. Zusätzlich soll ein "Immunogen" auch jegliches Polysaccharidmaterial umfassen, das zum Erzeugen einer Immunantwort nützlich ist. Gemäß der Verwendung hierin, ist ein antigenes Polypeptid oder ein immunogenes Polypeptid ein Polypeptid, das bei einer Einführung in einen Vertebraten mit den Immunsystemmolkülen des Vertebraten reagiert, das heißt antigen ist, und/oder eine Immunantwort in dem Vertebraten induziert, das heißt immunogen ist. Es ist ziemlich wahrscheinlich, dass ein immunogenes Polypeptid auch antigen sein wird, jedoch muss ein antigenes Polypeptid aufgrund seiner Größe oder Konformation nicht notwendigerweise immunogen sein. Beispiele für antigene und immunogene Polypeptide umfassen Polypeptide von infektiösen Agenzien, derart wie Bakterien, Viren, Parasiten oder Pilze, Allergene, derart wie jene von Haustier-Hautschuppen bzw. -Haaren, Pflanzen, Staub und von anderen Umweltquellen, ebenso wie bestimmte Self-Polypeptide (self polypeptides), beispielsweise tumorassoziierte Antigene.
  • Antigene und immunogene Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind nützlich zum Vorbeugen oder Behandeln, das heißt zum Heilen, Verbessern, Verringern der Stärke von, oder zum Verhindern oder Verringern einer Ansteckung von viralen, bakteriellen, pilzlichen und parasitären Infektionserkrankungen, ebenso wie zum Behandeln von Allergien.
  • Zudem sind antigene und immunogene Polypeptide der vorliegenden Erfindung nützlich zum Vorbeugen oder Behandeln; das heißt Heilen, Verbessern oder Verringern der Stärke von Krebs, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Krebserkrankungen von Oralhöhlung und Pharynx (das heißt von Zunge, Mund, Pharynx), vom Verdauungssystem (das heißt von Ösophagus, Magen, Dünndarm, Kolon, Rektum, Anus, Analkanal, Anorektum, Leber, Gallenblase, Pankreas), vom Atmungssystem (das heißt von Larynx, Lunge), von Knochen, Gelenken, Weichgeweben (einschließlich des Herzes), von Haut, Melanomen, Brust, reproduktiven Organen (das heißt von Zervix, Endometrium, Ovarium, Vulva, Vagina, Prostata, Testis, Penis), vom Harnsystem (das heißt von Harnblase, Niere, Ureter und anderen Harnorganen), von Auge, Gehirn, vom endokrinen System (das heißt von Thyroidea und anderen endokrinen Organen), von Lymphomen (das heißt einer Hodgkin-Erkrankung, von Non-Hodgkin-Lymphomen), von multiplen Myelomen, Leukämien (das heißt von akuten lymphozytischen Leukämien, chronischen lymphozytischen Leukämien, akuten myeloischen Leukämien, chronischen myeloischen Leukämien).
  • Beispiele von viralen antigenen und immunogenen Polypeptiden umfassen Adenovirus-Polypeptide, Alphavirus-Polypeptide, Calicivirus-Polypeptide, beispielsweise ein Calicivirus-Capsid-Antigen, Coronavirus-Polypeptide, Staupevirus-Polypeptide, Ebolavirus-Polypeptide, Enterovirus-Polypeptide, Flavivirus-Polypeptide, Hepatitisvirus (AE)-Polypeptide, beispielsweise ein Hepatitis B Kern- bzw. core- oder Oberflächen-Antigen, Herpesvirus-Polypeptide, beispielsweise ein Herpes simplex-Virus oder Varicella zoster-Virus-Glycoprotein, Immunodefizienz-Virus-Polypeptide, beispielsweise die Humanimmunodefizienzvirus-Virusmembran bzw. -Hülle oder -Protease, infektiöse Peritonitisvirus-Polypeptide, Influenzavirus-Polypeptide, beispielsweise ein Influenza A Hemagglutinin, Neuraminidase oder Nucleoprotein, Leukämievirus-Polypeptide, Marburg-Virus-Polypeptide, Orthomyxovirus-Polypeptide, Papilloma-Virus-Polypeptide, Parainfluenzavirus-Polypeptide, beispielsweise die Hemagglutinin/Neuraminidase, Paramyxovirus-Polypeptide, Parvovirus-Polypeptide, Pestivirus-Polypeptide, Picornavirus-Polypeptide, beispielsweise ein Poliovirus-Capsid-Polypeptid, Pockenvirus-Polypeptide, beispielsweise ein Vakziniavirus-Polypeptid, Tollwutvirus-Polypeptide, beispielsweise ein Tollwutvirus-Glycoprotein G, Reovirus-Polypeptide, Retrovirus-Polypeptide und Rotavirus-Polypeptide.
  • Beispiele von bakteriellen, antigenen und immunogenen Polypeptiden umfassen Actinomyces-Polypeptide, Bacillus-Polypeptide, Bacteroides-Polypeptide, Bordetella-Polypeptide, Bartonella-Polypeptide, Borrelia-Polypeptide, beispielsweise B. burgdorferi OspA, Brucella-Polypeptide, Campylobacter-Polypeptide, Capnocytophaga-Polypeptide, Chlamydia-Polypeptide, Clostridium-Polypeptide, Corynebacterium-Polypeptide, Coxiella-Polypeptide, Dermatophilus-Polypeptide, Enterococcus-Polypeptide, Ehrlichia-Polypeptide, Escherichia-Polypeptide, Francisella-Polypeptide, Fusobacterium-Polypeptide, Haemobartonella-Polypeptide, Haemophilus-Polypeptide, beispielsweise H. influenzae Typ b-Außenmembranprotein, Helicobacter-Polypeptide, Klebsiella-Polypeptide, L-Form-Bakterien-Polypeptide, Leptospira-Polypeptide, Listeria-Polypeptide, Mycobacteria-Polypeptide, Mycoplasma-Polypeptide, Neisseria-Polypeptide, Neorickettsia-Polypeptide, Nocardia-Polypeptide, Pasteurella-Polypeptide, Peptococcus-Polypeptide, Peptostreptococcus-Polypeptide, Pneumococcus-Polypeptide, Proteus-Polypeptide, Pseudomonas-Polypeptide, Rickettsia-Polypeptide, Rochalimaea-Polypeptide, Salmonella-Polypeptide, Shigella-Polypeptide, Staphylococcus-Polypeptide, Streptococcus-Polypeptide, beispielsweise S. pyogenes M Proteine, Treponema-Polypeptide und Yersinia-Polypeptide, beispielsweise Y. pestis F1 und V Antigene.
  • Beispiele von immunogenen und antigenen Pilzpolypeptiden umfassen Absidia-Polypeptide, Acremonium-Polypeptide, Alternaria-Polypeptide, Aspergillus-Polypeptide, Basidiobolus-Polypeptide, Bipolaris-Polypeptide, Blastomyces-Polypeptide, Candida-Polypeptide, Coccidioides-Polypeptide, Conidiobolus-Polypeptide, Cryptococcus-Polypeptide, Curvalaria-Polypeptide, Epidermophyton-Polypeptide, Exophiala-Polypeptide, Geotrichum-Polypeptide, Histoplasma-Polypeptide, Madurella-Polypeptide, Malassezia-Polypeptide, Microsporum-Polypeptide, Moniliella-Polypeptide, Mortierella-Polypeptide, Mucor-Polypeptide, Paecilomyces-Polypeptide, Penicillium-Polypeptide, Phialemonium-Polypeptide, Phialophora-Polypeptide, Prototheca-Polypeptide, Pseudallescheria-Polypeptide, Pseudomicrodochium-Polypeptide, Pythium-Polypeptide, Rhinosporidium-Polypeptide, Rhizopus-Polypeptide, Scolecobasidium-Polypeptide, Sporothrix-Polypeptide, Stemphylium-Polypeptide, Trichophyton-Polypeptide, Trichosporon-Polypeptide und Xylohypha-Polypeptide.
  • Beispiele für immunogene und antigene Protozoenparasit-Polypeptide umfassen Babesia-Polypeptide, Balantidium-Polypeptide, Besnoitia-Polypeptide, Cryptosporidium-Polypeptide, Eimeria-Polypeptide, Encephalitozoon-Polypeptide, Entamoeba-Polypeptide, Giardia-Polypeptide, Hammondia-Polypeptide, Hepatozoon-Polypeptide, Isospora-Polypeptide, Leishmania-Polypeptide, Microsporidia-Polypeptide, Neospora-Polypeptide, Nosema-Polypeptide, Pentatrichomonas-Polypeptide, Plasmodium-Polypeptide, beispielsweise P. falciparum circumsporozoite (PfCSP), Sporozoit-Oberflächenprotein 2 (PfSSP2), Carboxylterminus von liver state – Antigen 1(PfLSA1 c-term) und Exportprotein 1 (PfExp-1), Pneumocystis-Polypeptide, Sarcocystis-Polypeptide, Schistosoma-Polypeptide, Theileria-Polypeptide, Toxoplasma-Polypeptide und Trypanosoma-Polypeptide.
  • Beispiele für immunogene und antigene Helminthparasiten-Polypeptide umfassen Acanthocheilonema-Polypeptide, Aelurostrongylus-Polypeptide, Ancrylostoma-Polypeptide, Angiostrongylus-Polypeptide, Ascaris-Polypeptide, Brugia-Polypeptide, Bunostomum-Polypeptide, Capillaria-Polypeptide, Chabertia-Polypeptide, Cooperia-Polypeptide, Crenosoma-Polypeptide, Dictyocaulus-Polypeptide, Dioctophyme-Polypeptide, Dipetalonema-Polypeptide, Diphyllobothrium-Polypeptide, Diplydium-Polypeptide, Dirofilaria-Polypeptide, Dracunculus-Polypeptide, Enterobius-Polypeptide, Filaroides-Polypeptide, Haemonchus-Polypeptide, Lagochilascaris-Polypeptide, Loa-Polypeptide, Mansonella-Polypeptide, Muellerius-Polypeptide, Nanophyetus-Polypeptide, Necator-Polypeptide, Nematodirus-Polypeptide, Oesophagostomum-Polypeptide, Onchocerca-Polypeptide, Opisthorchis-Polypeptide, Ostertagia-Polypeptide, Parafilaria-Polypeptide, Paragonimus-Polypeptide, Parascaris-Polypeptide, Physaloptera-Polypeptide, Protostrongylus-Polypeptide, Setaria-Polypeptide, Spirocerca-Polypeptide Spirometra-Polypeptide, Stephanofilaria-Polypeptide, Strongyloides-Polypeptide, Strongylus-Polypeptide, Thelazia-Polypeptide, Toxascaris-Polypeptide, Toxocara-Polypeptide, Trichinella-Polypeptide, Trichostrongylus-Polypeptide, Trichuris-Polypeptide, Uncinaria-Polypeptide und Wuchereria-Polypeptide.
  • Beispiele für immunogene und antigene Ectoparasiten-Polypeptide umfassen Polypeptide (einschließlich schützenden Antigenen, ebenso wie Allergenen) von Flöhen; Zecken bzw. Lausfliegen (ticks), einschließlich harten Zecken (hard ticks) und weichen Zecken (soft ticks); Fliegen, derart wie kleine Mücken bzw. Zuckmücken (midges), Mosquitos, Sandfliegen (sand flies), Kriebelmücken (black flies), Bremsen (horse flies), Hornfliegen (horn flies), Viehfliegen bzw. Bremsen (deer flies), Tsetse-Fliegen, Stallfliegen bzw. Wadenstechern (stable flies), Myiasis-verursachenden Fliegen und Mücken bzw. Stechmücken (biting gnats); Ameisen; Spinnen, Läusen; Milben; und wahre Wanzen bzw. Käfern, derart wie Wanzen bzw. Bettwanzen (bed bugs) und Große Bettwanzen bzw. Schwarzwanzen (kissing bugs).
  • Beispiele für immunogene und antigene Tumor-assoziierte Polypeptide umfassen tumorspezifische, Immunoglobulin-variable Regionen, GM2, Tn, sTn, Thompson-Friedenreich Antigen (TF), Globo H, Le (y), MUC 1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, karzinoembryonische Antigene, beta-Kette von Human Chorion-Gonadotropin (hCG beta), HER2/neu, PSMA, EGFRvIII, KSA, PSA, PSCA, GP100, MAGE 1, MAGE 2, TRP1, TRP 2, Tyrosinase, MART-1, PAP, CEA, BAGE, MAGE, RAGE und verwandte Proteine.
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen ebenfalls Fragmente oder Varianten der obigen Polypeptide und jegliche Kombination der obigen Polypeptide. Weitere Polypeptide finden sich beispielsweise in "Foundations in Microbiology,"Talaro, et al., Hrsg., McGraw-Hill Companies (Okt., 1998), Fields, et al.,"Virology," 3. Aufl., Lippincott-Raven (1996), "Biochemistry and Molecular Biology of Parasites", Marr et al., Hrsg., Academic Press (1995) und Deacon, J., "Modern Mycology", Blackwell Science Inc. (1997).
  • Das Immunogen-kodierende Polynukleotid soll sowohl ein einzelnes "Polynukleotid", als auch mehrere "Polynukleotide" umfassen und nimmt auf ein isoliertes Molekül. oder Konstrukt Bezug. Die Immunogen-kodierenden Polynukleotide umfassen Nukleotidsequenzen, Nukleinsäuren, Nukleinsäure-Oligomere, messenger RNA (mRNA), DNA (beispielsweise pDNAs, Derivative von pDNA, lineare DNA) oder Fragmente von Jeglicher hiervon. Die Immunogen-kodierenden Polynukleotide können in linearer, zirkulärer, beispielsweise ein Plasmid, oder verzweigter Form, ebenso wie in doppelsträngiger oder einzelsträngiger Form bereitgestellt werden. Die Immunogen-kodierenden Polynukleotide können eine gewöhnliche Phosphodiester-Bindung oder eine ungewöhnliche Bindung aufweisen, beispielsweise eine Amid-Bindung, derart wie sie in Peptidnukleinsäuren (PNA) aufgefunden wird.
  • Erfindungsgemäß kann das Immunogen-kodierende Polynukleotid Teil eines zirkulären oder linearisierten Plasmids sein, das ein nicht-infektiöses und nicht-integrierendes Polynukleotid enthält. Ein nicht-infektiöses Polynukleotid ist ein Polynukleotid, das Vertebraten-Zellen nicht infiziert, während ein nicht-integrierendes Polynukleotid sich nicht. in das Genom von Vertebraten-Zellen integriert. Ein linearisiertes Plasmid ist ein Plasmid, das zuvor zirkulär war, jedoch linearisiert wurde, beispielsweise durch Verdau mit einer Restriktions-Endonuklease. Das Immunogen-kodierende Polynukleotid kann eine Sequenz umfassen, welche die Sekretion eines Polypeptids steuert.
  • Die Form von Immunogen-kodierenden Polynukleotiden hängt teilweise von der gewünschten Expressionskinetik und -dauer ab. Falls eine Langzeitzuführung eines durch ein Polynukleotid kodierten Proteins gewünscht ist, so ist die bevorzugte Form DNA. Falls alternativ eine Kurzzeit-Transgenprotein-Zuführung gewünscht ist, so ist die bevorzugte Form mRNA, da mRNA rasch in ein Polypeptid translatiert werden kann, wobei jedoch RNA schneller als DNA abgebaut werden kann.
  • Bei einer Ausführungsform ist das Immunogen-kodierende Polynukleotid RNA, beispielsweise messenger RNA (mRNA). Verfahren zum Einführen von RNA-Sequenzen in Säugetierzellen sind in der US 5,580,859 beschrieben. Ein viraler Alphavektor, ein nicht-infektiöser Vektor, der zum Verabreichen von RNA nützlich ist, kann zum Einführen von RNA in Säugetierzellen verwendet werden. Verfahren zur in vivo Einführung von alphaviralen Vektoren in Säugetiergewebe werden in Altman-Hamamdzic, S., et al., GeneTherapy 4, 815–822 (1997) beschrieben.
  • Vorzugsweise ist das Immunogen-kodierende Polynukleotid DNA. Im Falle von DNA ist ein Promotor vorzugsweise in funktionsfähiger Weise mit der für das Immunogen kodierenden Nukleotidsequenz verknüpft. Der Promotor kann ein zell-spezifischer Promotor sein, der eine substantielle Transkription der DNA lediglich in bestimmten Zellen steuert. Andere Transkriptionssteuerungselemente, abgesehen von einem Promotor, können mit dem Polynukleotid zum Steuern einer zell-spezifischen Transkription der DNA enthalten sein. Eine funktionsfähige bzw. betriebsfähige Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der ein für ein immunogenes Molekül kodierendes Polynukleotid derart mit einer oder mehreren Regulationssequenzen verbunden ist, dass eine Expression des Immunogens unter den Einfluss oder die Steuerung der Regulationssequenz(en) gestellt ist. Zwei DNA-Sequenzen (derart wie eine kodierende Sequenz und eine Promotorregionsequenz, die mit dem 5'-Ende der kodierenden Sequenz verknüpft ist) sind in funktionsfähiger Weise verknüpft, falls eine Induktion einer Promotorfunktion zur Transkription von mRNA führt, die für das gewünschte Immunogen kodiert, und falls die Art der Verknüpfung zwischen den zwei DNA-Sequenzen nicht (1) zur Einführung einer Frame-shift-Mutation führt, (2) mit der Fähigkeit der Expressionsregulationssequenzen zum Steuern der Expression des Immunogens interferiert, oder (3) mit der Fähigkeit der Template-DNA transkribiert zu werden interferiert. Folglich würde eine Promotorregion in funktionsfähiger Weise mit einer DNA-Sequenz verknüpft sein, falls der Promotor eine Transkription jener DNA-Sequenz bewirken kann.
  • Das Immunogen-kodierende Polynukleotid, beispielsweise pDNA, mRNA, Polynukleotid oder Nukleinsäure-Oligomer, kann in verschiedenen Puffern vor einem Mischen oder Komplexieren mit den Adjuvantkomponenten, beispielsweise Cytofectinen und Ko-Lipiden, gelöst werden. Geeignete Puffer umfassen Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, phosphate buffered saline), normale Salzlösung, Tris-Puffer und Natriumphosphat. Unlösliche Polynukleotide können in einer schwachen Säure oder einer schwachen Base gelöst werden und dann auf das gewünschte Volumen mit einem Puffer verdünnt werden. Der pH des Puffers kann in geeigneter Weise eingestellt werden. Zusätzlich kann ein in pharmazeutischer Hinsicht akzeptables Additiv verwendet werden, um eine geeignete Osmolarität bereitzustellen. Derartige Additive liegen im Rahmen der fachmännischen Kenntnisse.
  • Erfindungsgemäß können die Immunogen-kodierenden Polynukleotide mit den Adjuvantzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch jegliches im Stand der Technik bekannte Mittel komplexiert sein, beispielsweise durch Mischen einer pDNA-Lösung und einer Lösung von Cytofectin/Ko-Lipid-Liposomen. Bei einer Ausführungsform wird die Konzentration jeder der Bestandteillösungen vor einem Mischen eingestellt, derart dass das gewünschte Endverhältnis von pDNA/Cytofectin: Ko-Lipid und die gewünschte pDNA-Endkonzentration beim Mischen der zwei Lösungen erhalten wird. Falls die gewünschte Endlösung beispielsweise eine physiologische Salzlösung ist (0.9% Gewicht/Volumen), so werden sowohl pDNA, als auch Cytofectin: Ko-Lipid-Liposome in 0.9% Salzlösung zubereitet und anschließend einfach gemischt, um den gewünschten Komplex herzustellen. Die Cytofectin: Ko-Lipid-Liposomen können durch jegliches im Stand der Technik bekannte Mittel hergestellt werden. Beispielsweise kann ein dünner Film von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium- und Ko-Lipid-Gemisch in einem geeigneten Volumen eines wässrigen Lösungsmittels durch Vortex-Mischen bei Raumtemperaturen während etwa einer Minute hydratisiert werden. Die Herstellung eines dünnen Films von Cytofektin- und Ko-Lipid-Gemisch ist einem Fachmann bekannt und kann mit jeglichen geeigneten Techniken erfolgen. Beispielsweise können Chloroformlösungen der einzelnen Komponenten gemischt werden, um ein äquimolares Verhältnis gelöster Stoffe zu erhalten, und anschließend wird ein gewünschtes Volumen der Lösungen in geeignete Behälter aliquotiert bzw. aufgeteilt, wobei das Solvens durch Verdampfen entfernt werden kann, beispielsweise zunächst mit einem Strom eines trockenen Inertgases, derart wie Argon, und dann durch eine Hochvakuumbehandlung.
  • Die immunogene Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann erfindungsgemäß zum Immunisieren eines Vertebraten verwendet werden. Der Begriff "Vertebrat" soll einen einzelnen "Vertebraten", ebenso wie mehrere "Vertebraten" umfassen, und umfasst Säuger- und Vögel-Spezies, ebenso wie Fische. Zum Immunisieren eines Vertebraten ist eine erfindungsgemäße immunogene Zusammensetzung in ausreichender Menge um eine Immunantwort auf das Immunogen zu erzeugen an den Vertebraten zu verabreichen.
  • Die immunogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können gemäß verschiedener, im Stand der Technik bekannter Verfahren verabreicht werden. Beispielsweise beschreibt die US 5,676,954 eine Injektion von genetischem, mit kationischen Lipid-Trägern komplexiertem Material in Mäusen. Ebenso stellen die US 5,589,466 , US 5,693,622 , US 5,580,859 , US 5,703,055 und die PCT-Anmeldung PCT/US94/06069 (WO 94/29469), Verfahren zum Zuführen von DNA-kationischen Lipid-Komplexen an Säugetiere bereit.
  • Spezifisch können die immunogenen Zusammensetzungen der vorliegende Erfindung jeglichem Gewebe eines Vertebraten verabreicht werden, einschließlich Muskel, Haut, Gehirn, Lunge, Leber, Splen bzw. Milz, Knochenmark, Thymus, Herz, Lymphe bzw. Lymphgewebe (lymph), Blut, Knochen, Knorpel, Mukosa-Gewebe, Pankreas, Niere, Gallenblase, Magen, Intestinum, Testis, Ovarium, Uterus, Vaginalgewebe, Rektum, Nervensystem, Auge, Glandula, Zunge und Bindegewebe. Vorzugsweise sind die Zusammensetzungen in einen Skelettmuskel zu verabreichen. Die erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzungen können auch in eine Körperhöhlung einschließlich Lunge, Mund, Nasalhöhlung, Magen, Peritoneum, Intestinum, Herzkammer, Vene, Arterie, Kapillare, Lymph-Körperhöhlung, Uterus, Vagina, Rektum und Augenhöhle verabreicht werden.
  • Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzungen auf intramuskuläre (i.m.) oder subkutane (s.c.) Weise zu verabreichen. Andere geeignete Verabreichungsweisen umfassen transdermale, intranasale, Inhalations-, intratracheale, transmucosale (das heißt durch eine Mucosamembran bzw. Schleimhaut), intrakavitäre (beispielsweise orale, vaginale, oder rektale), intraokuläre, vaginale, rektale, intraperitonale, intraintestinale und intravenöse (i. v.) Verabreichung.
  • Jegliche Verabreichungsweise kann verwendet werden, solange die Verabreichung zu der erwünschten Immunantwort führt. Erfindungsgemäße Verabreichungsmittel umfassen Nadel-Injektion, Katheter-Infusion, biolistische bzw. biologisch ballistische Injektoren, Teilchenbeschleunigungsvorrichtungen (das heißt "Gen-Pistolen" oder pneumatische "nadellose" Injektoren, beispielsweise Med-E-Jet (Vahlsing, H., et al., J. Immunol. Methods 171, 11–22 (1994)), Pigjet (Schrijver, R., et al., Vaccine 15, 1908–1916 (1997)), Biojector (Davis, H., et al., Vaccine 12, 1503–1509 (1994); Gramzinski, R., et al., Mol. Med. 4, 109–118 (1998)), AdvantaJet, Medijector, Gelschaum-Schwamm-Depots, andere im Handel erhältliche Depotmaterialien (beispielsweise Hydrojels), osmotische Pumpen (beispielsweise Alza-Minipumpen), oraler oder suppositorialer Feststoff (Tablette oder Pille) pharmazeutische Formulierungen, topische Hautcremen und Abgießung (decanting), Verwendung einer Polynukleotid-beschichteten Sutur (Qin et al., Life Sciences 65, 2193–2203 (1999)) oder topische Anwendungen während Operationen. Die bevorzugten Verabreichungsweisen sind eine intramuskuläre Injektion auf Nadel-Basis und eine intranasale Anwendung als eine wässrige Lösung.
  • Eine Bestimmung einer wirksamen Menge einer immunogenen Zusammensetzung hängt von zahlreichen Faktoren ab, einschließlich beispielsweise der chemischen Struktur und biologischen Aktivität der Substanz, dem Alter und Gewicht des Subjekts und der Verabreichungsweise. Die genaue Menge, die Anzahl an Dosen und die zeitliche Abstimmung der Dosen kann einfach durch Fachleute bestimmt werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist die immunogene Zusammensetzung als pharmazeutische Zusammensetzung zu verabreichen. Eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung kann gemäß bekannter Verfahren formuliert werden, wodurch die zuzuführende Substanz mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägervehikel kombiniert ist. Eine Beschreibung geeigneter Vehikel und ihrer Herstellung findet sich beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol, Hrsg., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980) und Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. Auflage, A. R. Gennaro, Hrsg., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). Die pharmazeutische Zusammensetzung kann als Emulsion, Gel, Lösung, Suspension, lyophilisierte Form oder als jegliche andere im Stand der Technik bekannte Form formuliert sein. Zusätzlich kann die pharmazeutische Zusammensetzung ebenfalls pharmazeutisch akzeptable Additive, einschließlich beispielsweise Verdünnungsmittel, Binder, Stabilisierungsmittel und Konservierungsmittel, enthalten. Eine Verabreichung pharmazeutisch akzeptabler Salze der hierin beschriebenen Polynukleotid-Konstrukte wird bevorzugt. Derartige Salze können aus pharmazeutisch akzeptablen nicht-toxischen Basen, einschließlich organischen Basen und anorganischen Basen hergestellt werden. Von anorganischen Basen abgeleitete Salze umfassen Natrium, Kalium, Lithium, Ammonium, Calcium, Magnesium, und dergleichen. Von pharmazeutisch akzeptablen organischen nicht-toxischen Salze abgeleitete Salze umfassen Basen von primären, sekundären und tertiären Aminen und basischen Aminosäuren.
  • Für in vivo verwendete, wässrige pharmazeutische Zusammensetzungen wird eine Verwendung von sterilem, pyrogenfreiem Wasser bevorzugt. Derartige Formulierungen werden eine wirksame Menge an immunogener Zusammensetzung zusammen mit einer geeigneten Menge an Vehikel enthalten, um pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzungen herzustellen, die für eine Verabreichung an einen Vertebraten geeignet sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Kits für eine Verwendung zum Zuführen eines Polypeptids an einen Vertebraten bereit. Jeder Kit enthält einen Behälter, der 1 ng bis 30 mg eines immunogen-kodierenden Polynukleotids enthält, das in funktionsfähiger Weise für ein Immunogen in Vertebraten-Zellen in vivo kodiert. Weiterhin enthält jeder Kit in dem gleichen oder in einem unterschiedlichen Behälter eine Adjuvantzusammensetzung, welche umfasst, (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und ein Ko-Lipid. Jegliche Komponente der pharmazeutischen Kits kann in einem einzelnen Behälter oder in mehreren Behältern bereitgestellt werden. Vorzugsweise enthält der Kit von etwa 1 ng bis etwa 30 mg eines Immunogen-kodierenden Polynukleotids, bevorzugterweise enthält der Kit von etwa 100 ng bis etwa 10 mg eines Immunogen-kodierenden Polynukleotids.
  • Bei den pharmazeutischen Kits kann jeglicher geeigneter Behälter oder können jegliche geeigneten Behälter verwendet werden. Beispiele für Behälter umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Glasbehälter, Kunststoffbehälter oder Streifen bzw. Strips aus Kunststoff oder Papier.
  • Jeder der pharmazeutischen Kits kann weiter ein Verabreichungsmittel umfassen. Verabreichungsmittel umfassen Spritzen und Nadeln, Katheter, biolistische Injektoren, Teilchenbeschleunigungsvorrichtungen, das heißt "Gen-Pistolen", pneumatische "nadellose" Injektoren, Gelschaum-Schwamm-Depots, andere im Handel erhältliche Depotmaterialien, beispielsweise Hydrojels, osmotische Pumpen und Abgießung oder topische Anwendungen während einer Operation. Jeder der pharmazeutischen Kits kann weiter Suturen umfassen, die beispielsweise mit der immunogenen Zusammensetzung beschichtet sind (Qin et al., Life Sciences (1999) 65: 2193–2203).
  • Der Kit kann weiter ein Anleitungsblatt für eine Verabreichung der Zusammensetzung an einen Vertebraten umfassen. Die Polynukleotid-Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung werden vorzugsweise als eine flüssige Lösung bereitgestellt oder sie können in lyophilisierter Form als ein getrocknetes Pulver oder ein Kuchen bereitgestellt werden. Falls das Polynukleotid in einer lyophilisierten Form bereitgestellt ist, so kann das getrocknete Pulver oder der Kuchen ebenfalls Salze, Eintrittsförderungsmittel, Transfektion-erleichternde Mittel und Additive der pharmazeutischen Zusammensetzung in getrockneter Form enthalten. Ein derartiger Kit kann weiter einen Behälter mit einer genauen Menge an sterilem, Pyrogen-freiem Wasser für eine genaue Rekonstitution der lyophilisierten Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung umfassen.
  • Der Behälter, in den die pharmazeutische Zusammensetzung vor einer Verwendung verpackt ist, kann umfassen, einen hermetisch verschlossenen Behälter, der umfasst, eine Menge der lyophilisierten Formulierung oder einer Lösung, welche die Formulierung enthält, die für eine pharmazeutisch wirksame Dosis davon geeignet ist, oder Mehrfache einer wirksamen Dosis. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist in einem sterilen Behälter verpackt und der hermetisch verschlossene Behälter ist derart entworfen, dass er die Sterilität der pharmazeutischen Formulierung bis zur Verwendung bewahrt. Optional können dem Behälter Verabreichungsmittel und/oder eine Verwendungsanleitung beigefügt sein.
  • Die nachstehenden Beispiele sind lediglich aus erläuternden Gründen beigefügt.
  • Beispiele
  • Die nachstehenden Beispiele erläutern, dass überraschenderweise aufgefunden wurde, dass verschiedene (+)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium: Ko-Lipid, die mit einer Antigen-kodierenden pDNA komplexiert sind, eine nachfolgende Immunantwort im Vergleich zu gegenwärtig bekannten Nukleinsäure- Immunisierungsverfahren bei einer Verabreichung an Maus- oder Kaninchengewebe erhöhen können.
  • Materialien und Verfahren
  • Die nachstehenden Materialien und Verfahren werden allgemein bei allen hier offenbarten Beispielen verwendet. Falls notwendig sind spezifische Materialien und Verfahren in den jeweiligen Beispielen offenbart.
  • Reagenzien
  • Steriles USP Wasser und Salzlösungen wurden von Baxter (Deerfield, IL) erworben. Alle anderen Chemikalien und Lösungsmittel wurden entweder von Sigma Chem. Corp. (St. Louis, MO) oder Gallade Chemical (Escondido, CA) erworben. Sowohl 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE), als auch 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DPyPE) wurden als Chloroform-Lösungen von Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, Alabama) erworben.
  • Zubereitung von Adjuvantzusammensetzungen und immunogenen Zusammensetzungen
  • (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid (auch VC 1052 genannt) wurde unter Verwendung des veröffentlichten Darstellungsverfahrens für das analoge Cytofectin GAP-DLRIE synthetisiert (Wheeler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 11454–11459 (1996)). In spezifischer Weise ergab ein Substituieren von syn-9-Tetradecenylmethan-sulfonat mit Dodecenyl-methan-sulfonat bei der anfänglichen Bis-alkylierung von 3-Dimethylamino-1,2-propandiol das erwünschte Dialkenylamin. Eine Quaternisierung mit 3-Brompropylphthalimid, gefolgt von einer Entschützung des geschützten primären Amins mit Hydrazin und einer Extraktionsreinigung und einer Submicron-Filtration ergaben gemäß einer Beurteilung durch analytische Dünnschichtchromatographie reines (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid. Die Produktidentität wurde unter Verwendung von hochauflösenden Proton-NMR- und Infrarot (IR) – Spektroskopien bestätigt.
  • Cytofectin: Ko-Lipid-Gemische wurden unter Verwendung des rehydratisierten Dünnfilmverfahren (rehydrated thin-film method) dargestellt. Kurz gesagt, wurden getrocknete Filme in sterilen 2 ml-Glasampullen erhalten, indem das Chloroform unter einem Stickstoffstrom verdampft wurde und die Ampullen über Nacht unter Vakuum zum Entfernen von Lösungsmittelspuren gehalten wurden. Jede Ampulle enthielt 1,5 μmol jeweils eines Cytofectins und eines Ko-Lipids. Liposome wurden dargestellt, indem 1 ml SWFI (sterile water for injektion, steriles Wasser zur Injektion, VWR, Philadelphia, PA) pro Ampulle zugefügt wurden, gefolgt von einer kontinuierlichen Vortex-Vermischung während 5 min bei der höchsten Einstellungsstufe eines Genie-Vortex-Mixers (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Die erhaltene Liposom-Lösung enthielt 1,5 mM Cytofectin. Formulierungen mit molaren Endverhältnissen von pDNA (Phosphat): kationisches Lipid von 8:1, 4:1 und 2:1 wurden hergestellt. Die molare Konzentration an pDNA-Phosphat wird berechnet, indem die pDNA-Konzentration (in mg/ml) durch 330, die durchschnittliche Nukleotid-Molekülmasse, geteilt wird. Liposome (in SWFI) und pDNA (in 2× Vehikel) wurden bei dem Doppelten der Endkonzentration in der Formulierung hergestellt. Ein gleiches Volumen an Liposomen wurde zu pDNA unter Verwendung einer Spritze und einer 26- oder 28-Gauge-Nadel zugegeben. Liposome wurden in einem ständigem Strom zugegeben, gefolgt von einem kurzen, sanften Vortex-Vorgang zum Mischen (wenige Sekunden bei der Einstellungsstufe #4 eines Genie-Vortex-Mixers).
  • Alle in dieser Studie verwendeten Cytofectin/Ko-Lipid-Formulierungen verblieben während einigen Stunden nach der Herstellung bei Raumtemperatur ohne sichtbare Aggregation gleichförmig opak. Formulierungen wurden 20 min-1,5 Stunden nach Komplexierung injiziert. Bei einer typischen Injektion wurden 5 μg an pDNA mit einem Cytofectin in einem molaren Verhältnis pDNA: Cytofectin von 4: 1 formuliert, wobei jeder Muskel 2,4 μg Cytofectin und 3,0 μg neutrales Ko-Lipid in 50 μl an Vehikel erhielt. Sogar die höchste in dem Maus-Modell getestete pDNA+Cytofectin: Ko-Lipid-Dosis (die 100 μg VR4700 Plasmid + 48 μg (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid + 60 μg DPyPE pro Maus entspricht) rief ersichtlich kein Unbehagen hervor oder führte bei einer Injektion in den Maus-Muskel zu irgendwelchen Nebenwirkungen.
  • Herstellung von pDNAs
  • Das VR4700 Plasmid wurde unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Standardtechniken hergestellt. Kurz gesagt, VR1255, ein optimiertes Plasmid, das für Leuchtkäfer Luciferase kodiert (Hartikka, J., et al., Human Gene Therapy 7, 1205–1217 (1996)), wies die kodierende Sequenz für Influenza-Nuclear-Protein (NP) auf, das anstelle der Luciferase kodierenden Sequenz eingefügt war. Die Influenza-Nuclear-Protein-Sequenz wurde von einem als nCMVint-tpaPRNP bezeichneten Plasmid abgeleitet (Vahlsing, L., et al., J. Immunol. Methods 174, 11–22 (1994)). In spezifischerer Weise beschrieben, wurde das VR4700 Plasmid durch die nachstehende Vorgehensweise erzeugt. Das VR1255 Plasmid wurde mit einem Acinetobacter calcoaceticus Restriktionsenzym (Acc I) + Bacillus amyloliquefaciens HI Restriktionsenzym (Bam HI) verdaut, anschließend wurden die Enden einem Klenow-Blunt-Vorgang unterworfen, wodurch das gewünschte Vektor-Fragment erhalten wurde. Die für das Nuclear-Protein kodierende Sequenz wurde erhalten, indem nCMVintTPAPRNP mit Acc I + Escherichia coli I Restriktionsenzym (Eco RI) verdaut wurde und die Enden einem Klenow-Blunt-Vorgang unterworfen wurden. Sowohl das Vektor-Fragment, als auch das Insert-Fragment wurden gereinigt und anschließend erfolgte eine Ligation mit T4 DNA Ligase. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli hinsichtlich Kanamycin-Resistenz transformiert, wonach geeignete Plasmid-tragende Klone auf Basis von Restriktions-Verdau-Profilen identifiziert wurden. Standardzellkulturtechniken wurden verwendet, um einen geeigneten Klon auszubreiten, von dem anfänglich das Plasmid isoliert wurde und unter Verwendung einer wohlbekannten, im Handel erhältlichen Technologie gereinigt wurde (Qiagen, Valencia, CA).
  • VR1412 LacZ Plasmid wurde durch Subklonieren eines als Cytoplasma-Target fungierenden (cytoplasmatic targeted) β-Galactosidase-Gens in den VR1012 Vektor konstruiert (Doh, S.G., et al., Gene Therapy 4(7):268–263 (1997)). Der VR1012 Backbone-Vektor enthält den Human-Cytomegalovirus (CMV), unmittelbar früh 1 Promotor/Enhancer, CMV Intron A, Rinderwachstumshormon-Terminator und Kanamycin-Resistenz-Gen (Hartikka, J., et al., Human Gene Therapy 7 (10):1205–17 (1996)).
  • VR5900 ist eine für Hühnerei-Lysozym kodierende pDNA. Zur Konstruktion dieser pDNA wurde Gallus-Lysozym-cDNA mit überlappenden Oligonukleotiden unter Verwendung von Deep Vent DNA Polymerase (NEB, Boston, MA) synthetisiert. Die Nukleotidsequenz wurde von GENBank, Zugang V00428 erhalten. Die Sequenz wurde mit dem OLIGO 5.0 Programm humanisiert und die entsprechenden Oligonukleotide wurden von Retrogen (San Diego, CA) erworben. Das PCR-Produkt wurde in pCRII Blunt Topo (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert, in seiner Gesamtheit sequenziert und in VR1055 subkloniert. VR1055 ist ein Vical CMV Promotor/Enhancer-basierender Expressionsvektor, der mit VR1012 identisch ist, abgesehen von der Verwendung eines Minimal-Rabbit-β-Globin-Terminators in VR1055 (Hartikka, J., et al., Human Gene Therapy 7, 1205–17 (1996)). HEL-Expression wurde durch Western Blot mit einem Kaninchen Anti-Eiweiß-Lysozym bestätigt (Biodesign, Kennebunk, ME).
  • VR1904 ist eine pDNA, die für Human-Faktor IX kodiert. Zur Herstellung wurde das Faktor IX-cDNA-Insert von Plasmid GT50 (freundlicherweise von Steven Josephs von Baxter Healthcare Corp., Round Lake, IL zur Verfügung gestellt) in den VR1012 Vektor subkloniert.
  • VR1623 exprimiert ein chimäres Immunoglobulin mit variablen Mausregionen, das mit konstanten Humanregionen fusioniert ist. Konstante kappa- und gamma- (IgG1) Humanregionen wurden von Human-Peripher-Blut-Lymphozyten PCR-amplifiziert und in VR1031, einem von VR1012 durch Insertion einer CITE Sequenz abgeleiteten Bicistron-Vektor, kloniert. Dieses neue Konstrukt wurde als VR1605 bezeichnet. Die variablen Region-Sequenzen von 38c13, einem B-Zell-Maus-Lymphom (Bergman und Haimovich, 1977), wurden mittels PCR von dem Plasmid pId (Tao und Levy, 1993, freundlicherweise von Dr. Ronald Levy, Stanford University Medical Center, CA zur Verfügung gestellt) amplifiziert und in VR1605 kloniert, um VR1623 herzustellen.
  • Bulk-pDNA-Herstellung und Reinigung
  • Plasmid-DNA wurde in Escherichia coli DH10B oder Escherichia coli DH5α kompetenten Zellen transformiert und in mit 50 mg/ml Kanamycin ergänzter Terrific Broth in einem 1 L Schüttel-Kolben wachsen gelassen (Sambrook, J., et al., in Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. A. 2 (1989)). Zellen wurden durch Zentrifugation am Ende der exponentiellen Wachstumsphase (etwa 16 Stunden) isoliert, wobei gewöhnlich 10 Gramm an Biomasse-Netto-Gewicht pro Liter gewonnen wurden. Kovalent geschlossene zirkuläre pDNA wurde durch ein modifiziertes Lysisverfahren gewonnen (Horn, N. A., et al., Human Gene Therapy 6, 565–573 (1995)), gefolgt von einer doppelten Standard-CsCl-Ethidiumbromid-Gradienten-Ultrazentrifugation mit einer durchschnittlichen Ausbeute von etwa 5 mg pro Liter. Plasmide wurden mit Ethanol ausgefällt und in Salzlösung bei 4 °C wieder in Lösung gebracht und gegen Salzlösung dialysiert. Der Endotoxin-Gehalt wurde durch den Limulus-Amebocyte-Lysat-Assay (Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth, MA) bestimmt. Alle Plasmid-Herstellungen waren frei von nachweisbarer RNA. Die Endotoxin-Niveaus betrugen weniger als 7.0 Endotoxin Units (Endotoxin-Einheiten) /mg an Plasmid-DNA. Die spektrophotometrischen A260/A280-Verhältnisse betrugen zwischen 1,75 und 2,0. Die Plasmide wurden mit Ethanol ausgefällt und in dem Injektionsvehikel bei 4 °C bis zur vollständigen Lösung resuspendiert. DNA wurde bei –20 °C bis zur Verwendung gelagert.
  • Tier-Immunisierung
  • Die Quadriceps-Muskeln von gebändigten, wachen Mäusen (weibliche 8–12 Wochen alte BALB/c Mäuse von Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) erhielten eine Injektion von pDNA in 50 μl eines Vehikels unter Verwendung einer Wegwerf-Insulinspritze und einer 28 Gauge-1/2 Inch-Nadel (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, Cat. No. 329430), die mit einem Kunststoffkragenabschnitt (plastic collar cut) von einer Mikropipettenspitze zusammengefügt ist. Die Kragenlänge wurde angepasst, um die Eindringung der Nadelspitze auf eine Entfernung von etwa 2 mm in den zentralen Teil des Rectus femoris Muskels zu begrenzen. Injektionsfluide und Spritzen wurden auf Raumtemperatur äquilibriert und die Injektion eines einzelnen 50 μl Volumens wurde innerhalb von 1–2 Sekunden ausgeführt.
  • Mit Ketamin/Xylazin anästhesierte weibliche Weiße Neuseeland Kaninchen (5–6 Monate alt, etwa 3 kg) erhielten eine Injektion in den Quadriceps-Muskel mit 150 μg pDNA in 300 μl PBS unter Verwendung einer 22 Gauge-1 Inch-Nadel. Vor den Injektionen wurde die Injektionsstelle rasiert und mit Alkohol gereinigt. Die nadellose Injektionsvorrichtung Biojector®2000 (Bioject Inc., Portland, OR) wurde an Kaninchen getestet. Der Biojector®2000 ist ein CO2-betriebenes Jet-Injektionssystem. Bei einem Pilotversuch wurde bestätigt, dass der Biojector®2000 eine Indian-Ink-Lösung durch die Haut und in das Muskelgewebe zuführen kann.
  • Die Tierpflege während der Studie erfolgte gemäß "Guide for the Use and Care of Laboratory Animals", Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National Research Council, National Academy Press, Washington; D. C., 1996 und ebenso gemäß dem Vical's Institutional Animal Care and Use Committee.
  • Anti-NP-ELISA
  • Platten mit 96 Wells bzw. Vertiefungen (Corning Incorporated, Cat. No. 3690, Corning, NY) wurden beschichtet, mit 71–125 ng/Well an Influenza A/PR/8/34 Nucleoprotein (NP), das gereinigt wurde, aus rekombinanten baculoviralen Extrakten in 100 μl BBS (89 mM Borsäure + 90 mM NaCl + 234 mM NaOH, pH 8.3). Die Platten wurden über Nacht bei +4 °C gelagert und die Wells wurden zweimal mit BBST (BBS ergänzt mit 0.05 % Tween 20, vol/vol) gewaschen. Die Wells wurden anschließend während 90 Minuten mit BB (BBS ergänzt mit 5 % Nicht-Fett-Milch bzw. fettfreierMilch, Gew./Vol.) inkubiert und wieder zweimal mit BBST gewaschen. Zweifache serielle Verdünnungen von Maus- oder Kaninchen-Serum in BB, bei 1: 20 beginnend, erfolgten in aufeinanderfolgenden Wells und die Lösungen wurden während 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Wells wurden anschließend vier Mal mit BBST gespült. Sera von mit VR4700 NP-Plasmid-DNA hyperimmunisierten Mäusen wurden als Positiv-Kontrolle verwendet und Pre-immun-Sera von Mäusen und Kaninchen wurden als Negativ-Kontrollen verwendet.
  • Zum Erfassen NP-spezifischer Antikörper wurde bei 50 μl/Well in einer Verdünnung von 1: 5000 in BBS entweder, mit alkalischer Phosphatase konjugiert, Ziege anti-Maus IgG Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Cat. No. 115-055-008, West Grove, PA) oder Ziege anti-Kaninchen IgG Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Cat. No. 111-055-008, West Grove, PA) zugegeben und die Platten wurden bei Raumtemperatur während 2 Stunden inkubiert. Nach viermaligen Waschen in BBST wurden 50 μl an Substrat (1 mg/ml p-Nitrophenyl-phosphat, Calbiochem Cat. No. 4876 in 50 mM Natriumbicarbonat-Puffer, pH 9.8 und 1 mM MgCl2) während 90 min bei Raumtemperatur inkubiert und bei 405 nm wurden Extinktionsablesungen durchgeführt. Die Sera-Titer wurden unter Verwendung des Kehrwerts der letzten Verdünnung bestimmt, die noch ein Signal ergab, welches zweifach über dem Hintergrund lag. Der Hintergrund wurde unter Verwendung eines Pre-Immun-Serums bestimmt, das 1: 20 verdünnt ist.
  • 51Cr-Freisetzungs-Splenozyten-Assays
  • Single-Cell-Suspensionen von Splenozyten wurden pelletiert und in einem RPMI 1640 Medium resuspendiert, das L-Glutamin und 25 mM HEPES enthält und mit Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100μg/ml), 55 μM β-Mercaptoethanol und 10 % FBS ergänzt ist. Falls nicht anders angegeben, so wurden alle Gewebekulturmedien und Reagenzien von Gibco BRL Life Technologies (Rockville, MD) bezogen. Anschließend erfolgte während 5 Tagen eine Kultur von 2,5 × 107 Splenozyten in 25 cm2 Gewebekulturgefäßen in insgesamt 10 ml Medien mit NP147-155 Peptid (H-2Kd TYQRTRALV) oder β-gal876-884 Peptid (H-2LdTPHPARIGL) bei 1 μg/ml und rekombinanten Maus-IL-2 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) bei 0,5 U/ml.
  • Für den CTL Assay wurden P815 Zellen mit 0,15 mCi Na2 51CrO4 (NENLife Science Products, Boston, MA) in 30 μl Salzlösung bei 37 °C während 35 Minuten markiert. Markierte Zellen wurden mit 20 μg NP Peptid oder β-gal-Peptid (H-2Ld TPHPARIGL) in 1 ml RPMI 1640 Medien bei 37 °C während 40 Minuten gepulst oder wurden nicht-gepulst verwendet. Doppelte Titrationen von Splenozyten wurden durch serielles Verdünnen der Zellen 1: 3 in Round-bottomplates (Rundbodenpatten) mit 96 Wells durchgeführt (ICN Biomedicals, Aurora, OH). Target-Zellen wurden bei 1 ×104 Zellen/Well in einem End-Volumen von 200 μl/Well in den angegebenen Effektor: Target Verhältnissen (E: T) zugegeben. Die Platten wurden zentrifugiert und während 4 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Die Zählungen pro Minute wurden für 100 μl an Überstand von jedem Well bestimmt. Spezifische Lysis wurde als % spezifische Lysis = [(a–b)/(c–b)] 100 berechnet, wobei a die durchschnittliche cpm ist, die in Gegenwart von Effektoren freigesetzt wird, b die durchschnittliche cpm ist, die von lediglich in Medien inkubierten Target-Zellen freigesetzt wird und c die cpm ist, die von Target-Zellen in Gegenwart von 1 % Triton-X 100 freigesetzt wird.
  • Beispiel 1
  • (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid / Ko-Lipid erhöht die humorale Immunantwort auf pDNA-kodiertes Influenza-Nucleoprotein (NP) in Mäusen
  • Das vorliegende Beispiel zeigt einen quantitativen Vergleich der Wirkungen der Verabreichung von verschiedenen (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid:Ko-Lipid-Komplexen mit pDNA gegenüber pDNA allein bei der Bereitstellung von anti-NP Antikörper-Antworten.
  • Eine Transfektion von Muskeln mit pDNA, die für ein Immunogen kodiert, ruft sowohl humorale, als auch zelluläre Immunantworten hervor. Zur Bestimmung des Ausmaßes der Transfektionssteigerung in einem die humorale Immunantwort bewertenden Assay wurden Veränderungen in anti-NP Antikörper-Niveaus nach einer Immunisierung mit einer Immunogenkodierenden pDNA allein, und mit der gleichen pDNA, die mit verschiedenen Adjuvantzusammensetzungen komplexiert ist, quantifiziert. Die allgemeinen Merkmale des Immunisierungsassays sind im Wesentlichen wie bei Ulmer et al. (Science, 259, 1745–1749 (1993)) beschrieben, wobei Standard-ELISA-Technologie zum Quantifizieren der Antikörper-Titer verwendet wird.
  • Mäuse wurden unter Verwendung von für Influenza-Nuclear-Protein (NP) kodierender pDNA immunisiert, welche mit Cytofectinen komplexiert ist, die als ein 1: 1 (mol:mol)-Gemisch mit einem Ko-Lipid formuliert sind. Die Cytofectine wurden bei einem molaren Verhältnis pDNA/Cytofectin von 4: 1 analysiert. Jedes Tier in der Testgruppe (fünf Tiere pro Gruppe) erhielt eine Injektion mit 5 μg pDNA in 50μl physiologischer Salzlösung (0.9% NaCl Gewicht/Volumen in Wasser) pro Bein in den Rectus femoris Muskel (10 μg Gesamt-pDNA pro Tier) allein oder als ein Cytofectin: Ko-Lipid-Komplex. Die Injektionen wurden an Tag "0" und bei Woche 3 durchgeführt.
  • Eine Cytofectin : Ko-Lipid – Immunantwort-Erhöhung wurde analysiert, auf Basis des Verhältnisses des geometrischen mittleren Titers (GMT) von einer Cytofectin-gesteigerten Transfektionsgruppe geteilt durch den GMT von einer pDNA-Verabreichung allein (siehe 3 und 4). Wie in 3 und 4 gezeigt, erhöht das bevorzugte Cytofectin (+)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid bei einer Kopplung mit einem Ko-Lipid (insbesondere DOPE oder DPyPE) deutlich die Antikörper-Antworten auf das kodierte Immunogen, sowohl über pDNA allein, als auch über pDNA, die mit anderen Cytofectin:Ko-Lipid-Kombinationen komplexiert ist. Äußerst überraschend ist, dass die Maus anti-NP Antikörper-Titer bei Woche 6 post-i.m. Injektion von mit (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid: DPyPE komplexiertem VR4700 (4) zu einer 10-fachen Zunahme des geometrischen mittleren anti-NP Titers führten.
  • Beispiel 2
  • (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminiumbromid / DPyPE erhöht die Humorale Immunantwort auf pDNA kodiertes Influenza-Nucleonrotein (NP) in Mäusen
  • Der Zweck des vorliegenden Beispiels ist es die Fähigkeit des bevorzugten Cytofectin: Ko-Lipids, (+)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminiumbromid / DPyPE für ein Erhöhen der humoralen Immunantwort auf ein pDNA-kodiertes NP-Antigen zu zeigen. Das am meisten bevorzugte Cytofectin: Ko-Lipid – Gemisch ist (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid / DPyPE bei einem molaren Verhältnis von 1 : 1. Statt die unhandliche formelle chemische Nomenklatur zu verwenden und das spezifische molare Verhältnis für das Gemisch festzulegen, wird diese neue Formulierung als "Vaxfectin" bezeichnet.
  • β-Galactosidase-Assay
  • Die Muskelgewebe wurden wie zuvor beschrieben gewonnen, pulverisiert und extrahiert (Manthorpe, M., et al, Gene Quantification. Boston, Birkhauser 343–368 (1998)). Das Niveau der β-Galactosidase-Expression in Muskelextrakten wurde unter Verwendung eines Chemilumineszenz-Assays gemäß den Herstellervorschriften quantifiziert (Boehringer Mannheim, Cat. No. 1758241, Indianapolis, IN). Eine Standardkurve, die in gepooltem Extrakt von nicht-injizierten Muskeln hergestellt ist, ist auf jeder Platte unter Verwendung des in dem Kit enthaltenen β-Galactosidase-Enzym-Standards enthalten.
  • Quantifizierung von Zellen die anti-NP-spezifischen Antikörper sezernieren durch ELISPOT-Assay
  • Zellen, die anti-NP-spezifischen Antikörper sezernieren wurden durch das ELISPOT-Verfahren unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Protokolls quantifiziert (Slifka, M. K., et al., J. Virol. 69 (3), 1895–1902 (1995)). Aus dein Knochenmark (Femur und Tibia) erhaltene Zellen wurden mit 0,83 % NH4Cl zum Lysieren roter Blutzellen behandelt. Die Zellen wurden dann in einem RPMI 1640 Medium resuspendiert, welches enthält, 5 % fötales Kälberserum (Hyclone, Logan, Utah), L-Glutamin, HEPES, Penicillin und Streptomycin (LTI, Bethesda, Maryland). 96- Well-Multiscreen-Filtrationsplatten mit Nitrocelluloseboden (Millipore Corporation, San Francisco, CA) wurden mit 100 μl pro Well an 5 μg/ml von NP Antigen (Influenza-Nucleoprotein Stamm A/PR/8/34) in PBS beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden mit RPMI 1640, das 5 % FBS enthält, während 2 h bei Raumtemperatur geblockt. Das Blocking-Medium wurde durch 100 μl/Well an Blocking-Medium ersetzt, das eine Knochenmarkzellsuspension enthält, die von Mäusen erhalten wurde, die mit Influenza-NP-kodierender pDNA (mit oder ohne Vaxfectin) immunisiert sind, wobei bei 106 Zellen begonnen wird, wobei dann dreimalig reihenweise die Platte herunter verdünnt wird. Kontroll-Wells enthielten von naiven Mäusen erhaltenen Zellen, die wie vorstehend beschrieben verdünnt sind (frühere Kontrollen enthielten ein irrelevantes Antigen). Die Platten wurden während 5 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator bei 7 % CO2 inkubiert. Die Platten wurden sechsmal gewaschen und über Nacht bei 4 °C mit 100 μl pro Well an biotinylierter Pferd anti-Maus IgG (H+L, 1/1000 Verdünnung, Vektor Laboratories, Burlingame, CA) in PBS-T, das 1% FBS enthält, inkubiert. Die Platten wurden weiter während 1 h bei Raumtemperatur mit 100 μl/Well an 5 μg/ml Meerettichperoxidase-konjugatiertem Avidin D inkubiert (Vektor Laboratories, Burlingame, CA). Antikörper sezernierende Zellen wurden erfasst, indem 100 μl pro Well an Substrat (3-Amino-9-ethylcarbazol und H2O2) zu den Platten während 3–5 Minuten zugesetzt wurden. Die Reaktion wurde durch ausgiebiges Waschen mit Leitungswasser beendet. Spots wurden unter einem Präpariermikroskop gezählt. Anti-NP-spezifische Antikörper sezernierende Zellen wurden als Anzahl an Spots pro 106 Knochenmarkzellen dargestellt.
  • Statistische Bewertungen
  • Alle statistischen Vergleiche wurden unter Verwendung des nicht-parametrischen Mann-Whitney-Rang-Summen-Test (Mann-Whitney rank sum test, SigmaStat Version 2.03, Jandel Scientific Software, San Rafael, CA) durchgeführt. Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, falls der p Wert weniger als 0,05 betrug.
  • pDNA/Vaxfectin-Dosis-Antwort
  • Zum Vergleichen der Wirkungen einer Erhöhung einer pDNA-Dosis und der Wirkung von Boost- Injektionen erhielten Mäuse bilateral i. m. Injektionen von 1 μg, 5 μg oder 25 μg an VR4700 Naked-Plasmid pro Muskel (folglich wurde eine Gesamt-pDNA-Dosis von 2, 10 und 50 μg jeweils pro Tier gegeben) bei dreiwöchigen Intervallen. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
  • Höhere anti-NP Titer wurden erreicht, wenn mehr Naked-pDNA pro Muskel injiziert wurde, und die Titer nahmen nach der ersten und zweiten Boost-Injektion zu. Es wurde jedoch keine weitere Zunahme bei den anti-NP Titern mit einer der pDNA-Dosen beobachtet, wenn eine dritte Boost-Injektion bei Woche 9 verabreicht wurde (Daten nicht gezeigt), was darauf schließen lässt, dass Plateau-Antikörper-Titer-Niveaus mit Naked-pDNA erreicht worden sind.
  • Ein zweiter Satz an Mäusen erhielt äquivalente, mit Vaxfectin formulierte pDNA-Dosen. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Hier wurde eine 7-bis 20-fache Zunahme der Antikörper-Titer bei allen drei pDNA-Dosen beobachtet. Die höchsten durchschnittlichen anti-NP Titer pro Gruppe in diesem Experiment (204,800±56,087, n = 5 Mäuse) wurden bei Woche 9 bei einer mit Vaxfectin formulierten 25 μg pDNA-Dosis beobachtet. Wie bei den Naked-pDNA-Injektionen beobachtet, wurde keine weitere Zunahme an anti-NP Titern bei irgendeiner der Vaxfectin-Gruppen beobachtet, wenn eine dritte Boost-Injektion bei Woche 9 gegeben wurde (Daten nicht gezeigt). Folglich erhöhte Vaxfectin Antikörper-Titer auf Niveaus, die mit Naked-pDNA allein nicht erreicht werden konnten, sei es durch Erhöhen entweder der pDNA-Dosis oder der Anzahl an Injektionen. Die überraschendste Feststellung war, dass bereits 1 μg an mit Vaxfectin formulierter pDNA pro Muskel zu anti-NP Titern führte, die 5-fach höher als jene sind, die mit 25 μg Naked-VR4700 allein erreicht werden.
  • Ein getrenntes Experiment wurde durchgeführt, um zu klären, ob mehrere bilaterale Injektionen erforderlich sind, um eine Vaxfectin-vermittelte Erhöhung bei der humoralen Immunantwort zu erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Bei einer Formulierung von 5 μg VR4700 pDNA mit Vaxfectin wurde eine signifikante 6-fache Zunahme an anti-NP Titern 20 Tage nach einer einzelnen unilateralen i. m. Injektion in Mäusen erhalten, was anzeigt, dass Vaxfectin die Antikörper-Antwort nach einer einzelnen Dosis erhöhen kann.
  • TABELLE 1 Antikörper-Titer in Mausserum nach einer unilateralen i. m. Injektion von pDNA, die für Influenza Nuclear Protein (NP) Proteina kodiert.
    Figure 00360001
  • Formulierungsoptimierung
  • Unterschiedliche Verhältnisse an pDNA : kationischem Lipid wurden in dem Mausimmunisierungs-Modell zum Optimieren von Vaxfectin-Formulierungen getestet. Die in 6 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass ein Injizieren von mehr pDNA-Vaxfectin-Komplex (folglich eine gleichzeitige Erhöhung sowohl der Menge an Plasmid, als auch der Menge an Vaxfectin) die Antikörper-Titer in einer Dosis-abhängigen Weise erhöhte. Dieser Trend wurde für das molare Verhältnis von pDNA : kationischem Lipid von sowohl 2:1, als auch 4:1 beobachtet. Wenn die gleiche 5 μg pDNA-Dosis mit einer zunehmenden Dosis an Vaxfectin injiziert wurde (wobei folglich das molare Verhältnis von pDNA : kationischem Lipid verringert wurde), so stiegen die Antikörper-Titer wieder in einer Vaxfectin-Dosis-abhängigen Weise an (6B). Höhere Dosen an pDNA wurden ebenfalls untersucht, wobei jedoch ein Injizieren von 50 μg pDNA pro Gliedmaß, die mit Vaxfectin in einem molaren Verhältnis von pDNA:kationischem Lipid von 4:1 formuliert ist, nicht zu einem weiteren Anstieg bei den anti-NP Titern führte, verglichen mit 25 μg pDNA, die mit Vaxfectin im gleichen 4:1-Verhältnis formuliert ist (Daten nicht gezeigt).
  • Dauer der erhöhten humoralen Antwort
  • Zur Untersuchung der Dauer der Vaxfectin-erhöhten humoralen Antwort, wurden NP-spezifische Antikörper-Titer während 9 Monaten nach einer anfänglichen Injektion in dem Maus-Impfungs-Modell verfolgt. Die Ergebnisse sind in 7A gezeigt. Drei Wochen nach der Boost-Injektion, die an Tag 21 verabreicht wurde, waren die anti-NP Titer in der Vaxfectin-Gruppe 9-fach höher als in der Naked-pDNA-Kontrollgruppe. Während der nachfolgenden Wochen nahmen die Antikörper-Titer in der Vaxfectin-Gruppe graduell ab, verblieben jedoch signifikant höher als in den Kontrollen während des Laufs des Experiments. Vierzig Wochen nach dein Start des Experiments, waren die anti-NP Titer in der Vaxfectin-Gruppe noch viermal höher als in der Naked-pDNA-Gruppe.
  • In einem Parallel-Experiment erhielt ein anderer Satz an Mäusen eine Boost-Injektion bei Woche 3, und einen zweiten identischen Boost bei Monat 3. Die Ergebnisse sind in 7B gezeigt. Die zweite Boost-Injektion erhöhte die Antikörper-Titer in beiden Gruppen um das Zwei- bis Dreifache. Die anti-NP Titer in der Vaxfectin-Gruppe schienen jedoch bei diesen erhöhten Niveaus während einiger Monate zu verbleiben, während die Naked-pDNA-Gruppe Titer ergab, die mit jenen nach einem einzelnen Boost am Ende des Experiments vergleichbar sind. Folglich waren die anti-NP Titer in der Vaxfectin-Gruppe neun Monate nach Beginn des Experiments 17-fach höher als in der pDNA-Kontroll-Gruppe.
  • Vaxfectin bewahrt eine starke CTL-Antwort
  • Es wäre sehr wünschenswert, dass ein Adjuvans, das in Kombination mit pDNA-Impfstoffen zum Erhöhen einer humoralen Immunantwort verwendet wird, nicht gleichzeitig die Zellvermittelte Immunität verringern würde. Um dies zu bewerten, wurden CTL-Assays durchgeführt, nachdem Mäuse eine Injektion mit verschiedenen Dosen an pDNA mit oder ohne Vaxfectin erhalten haben. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Vaxfectin hatte keine signifikante Wirkung auf eine CTL-Antwort bei Formulierungen in verschiedenen Verhältnissen von pDNA und kationischem Lipid (8A) nach einem einzelnen Boost (8C) oder mehreren Boost-Injektionen (8A und 8B), oder bei einer Zuführung in PBS (8A) oder 150 mM NaP-Vehikel (8C). Ein Injizieren von 25 μg an Naked-pDNA pro Muskel scheint zu stärkeren CTL-Antworten als eine 1 μg pDNA-Dosis zu führen. Wiederum hatte Vaxfectin keine signifikante Wirkung auf eine CTL-Antwort bei beiden pDNA-Dosen (8B).
  • Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Vaxfectin zum Erhöhen einer humoralen Immunantwort mit pDNA-Impfstoffen verwendet werden könnte, während die starke CTL-Antwort-Charakteristik von einer pDNA-Immunisierung bewahrt bleibt.
  • Vaxfectin erhöht nicht die Muskel-Transfektion
  • Zur Aufklärung des Mechanismus über den Vaxfectin Antikörper-Antworten erhöht, wurde die Wirkung von Vaxfectin auf eine Muskel-Expression in vivo untersucht. Bei diesen Experimenten wurde entweder β-Galactosidase kodierende pDNA (VR1412) allein oder in einer Formulierung mit Vaxfectin injiziert und einzelne Muskeln wurden in periodischer Weise einem Assay hinsichtlich einer Reportergen-Expression unterworfen. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Ein Tag nach den Injektionen war die β-Galactosidase-Expression in beiden Gruppen die gleiche, was anzeigt, dass Vaxfectin die initiale Transfektion eines Muskels mit pDNA nicht beeinflusst. Zwischen Tag 1 und Tag 7 stieg die Muskel-Expression in der Naked-pDNA-Gruppe um das Siebenfache an. Im Gegensatz hierzu, nahm die Expression in der Vaxfectin-Gruppe um 25 % während der gleichen Zeitspanne ab. Zwischen Tag 7 und 21 verblieben die Reporter-Gen-Niveaus die gleichen in der Naked-pDNA-Gruppe, während eine β-Galactosidase-Expression im Muskel in der Vaxfectin-Gruppe weiter abnahm und mehr als 20-fach geringer als in der pDNA-Kontrollgruppe an Tag 21 war. Folglich war zu späteren Zeitpunkten eine Transgen-Expression in einem Muskel in der Vaxfectin-Gruppe merklich verringert, während Antikörper-Niveaus höher waren. Diese fehlende Korrelation zwischen einer Muskelexpression und Antikörper-Titern zeigt, dass eine Vaxfectin-vermittelte Erhöhung einer Antikörper-Antwort nicht durch eine erleichterte Transfektion von Myofasern und/oder eine erhöhte Synthese des Antigens im Muskelgewebe erklärt werden kann.
  • Der Mechanismus durch den Vaxfectin die Antigen-spezifische Antikörper-Antwort erhöht ist unklar. Es ist möglich, dass Vaxfectin die pDNA mehreren Zelltypen in dem Muskelgewebe, einschließlich Antigen-aufweisenden Zellen, zuführt, während eine Nadelinjektion von pDNA ohne Vaxfectin prinzipiell zu einer Transfektion von Muskelfasern führen könnte. Alternativ kann der pDNA-Lipid-Komplex besser in der Lage sein den Muskel zu verlassen und zu einer Transduktion von distalen Geweben, einschließlich Zellen in den drainierenden Regional-Lymphknoten, zu führen. Vaxfectin könnte das Plasmid gegen Nukleasen schützen, wobei ermöglicht wird, dass der pDNA-Lipid-Komplex Gewebe erreicht, die von der Injektionsstelle entfernt sind. Vaxfectin kann auch eine Entzündung induzieren, was zu der Beschädigung von vielen transduzierten Muskelfasern führt und dadurch zu einer Freisetzung von mehr löslichem Antigen bald nach einer Injektion führt. Eine Abnahme in der Antigen-Herstellung in den folgenden Tagen kann durch Begrenzen eines Antigens zu einer Selektion hinsichtlich Antigenspezifischen B-Zellen mit höherer Affinität führen, was zu einem Anstieg an Antikörper-Titern führt.
  • Vaxfectin erhöht die Anzahl an Antigen-spezifischen Plasmazellen im Knochenmark Erhöhte anti-NP Titer in mit Vaxfectin behandelten Tieren wurden während einiger Monate nach der Boost-Injektion (7) aufrechterhalten. Da gezeigt worden ist, dass langlebige Plasmazellen im Knochenmark den Hauptmechanismus darstellen, durch den eine persistente Antikörper-Produktion nach einer viralen Infektion aufrechterhalten bleibt (Slifka, M.K., et al., J. Virol. 69(3), 1895–1902 (1995), Slifka, M.K., et al., Curr. Opin. Immunol 10(3), 252–258 (1998)), wurde die Anzahl an anti-NP Antikörper sezernierenden Zellen aus dem Knochenmark unter Verwendung eines ELISPOT-Assays quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass Vaxfectin eine statistisch signifikante 3- bis 5-fache Zunahme bei der Anzahl an NP-spezifischen Plasmazellen im Knochenmark herstellte. Weiterhin korrelierten die Antikörper-Titer, sowohl bei der Naked-pDNA-Gruppe, als auch bei der Vaxfectin-Gruppe (Tabelle 2), in einzelnen Mäusen grob mit der Anzahl an anti-NP Antikörper sezernierenden Zellen im Knochenmark.
  • TABELLE 2 Quantifizierung von anti-NP Antikörper sezernierenden Zellen im Knochenmark mittels ELISPOT-Assay
    Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Die Daten der ELISPOT-Assays zeigen, dass die Verwendung von Vaxfectin die Anzahl an Antigen-spezifischen Plasmazellen in dem Knochenmark erhöht. Diese Zunahme an Plasma-Zellen kann durch die Adjuvans-Eigenschaften der pDNA-Lipid-Komplexe bedingt sein. Eine Injektion von Leerwert (blank) – pDNA, die mit einem kationischen Lipid komplexiert ist, in das Peritoneum von C3H/HeN-Mäusen mit Maus-Ovarial-Tumor induziert die Produktion von Interleukin-6 (IL-6), Interferon-γ (IFN-γ) und Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α) (Horton, H.M., et al., J. Immunol. 163(12): 6378–6385 (1999)). Diese Cytokine wurden nicht in Mäusen induzier, die lediglich mit pDNA oder Lipid behandelt waren, was zu der Schlussfolgerung führt, dass die pDNA-Lipid-Komplexe in vivo immunstimulierend sind. Die immunstimulierenden Eigenschaften von pDNA-Lipid-Komplexen wurden auch bei Experimenten berichtet, bei denen Mäusen mit kationischem Lipid komplexierte pDNA intravenös injiziert wurde (Dow, S. W., et al., J. Immunol. 163(3):1552–1561 (1999)). Wie bei intraperitonaler und intravenöser Injektion von pDNA-Lipid-Komplexen, kann eine intramuskuläre Injektion von pDNA-Vaxfectin ebenfalls Cytokine, einschließlich IL-6, eines Cytokins, das die Differenzierung von aktivierten B-Zellen zu Plasmazellen fördert, induzieren. Folglich können die pDNA-Vaxfectin-Komplexe indirekt Antikörper-Titer erhöhen, indem die Anzahl an Antikörper-herstellenden B-Zellen erhöht wird.
  • Ebenso ist möglich, dass Vaxfectin-Komponenten natürlich vorkommende Mitogene nachahmen könnten, die direkt eine polyklonale Expansion von B-Zellen stimulieren können. Dies könnte die spezifische Immunantwort gegen das durch die Muskelzellen exprimierte Transgen erhöhen, indem die Anzahl der ansprechenden B-Zellen erhöht wird. Folglich könnten jeweils eine gesteigerte Transfektion von APCs oder eine Zuführung von pDNA an die drainierenden Lymphknoten mit einer Transfektion von Zellen in den Lymphknoten, eine Muskel-Beschädigung, die zu einer erhöhten Verfügbarkeit von löslichem Antigen führt, und die immunostimulatorischen Eigenschaften der pDNA-Vaxfectin-Komplexe zu der Adjuvans-Wirkung von Vaxfectin beitragen.
  • Beispiel 3
  • Vaxfectin erhöht Antikörper-Titer in Kaninchen
  • Der Zweck des vorliegenden Beispiels ist es die Adjuvans-Wirkung von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid:Ko-Lipiden (beispielsweise Vaxfectin) in Kaninchen bei einer Formulierung in Polynukleotid-basierten Impfstoffen zu zeigen.
  • Weibliche weiße Neuseeland-Kaninchen (5–6 Monate alt) wurden anästhesiert, anschließend in ein Hinterbein mit 300 μl eine PBS-Lösung injiziert, welche enthält, entweder 150 μg an VR4700 Plasmid-DNA oder einer PBS-Lösung, die einen Komplex von 150 μg VR4700 Plasmid-DNA mit (+)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid:DPyPE (1:1) enthält, der in einem pDNA : (+)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid-Verhältnis von 4:1 mol:mol hergestellt ist. Jedes Kaninchen erhielt eine einzelne Injektion unter Verwendung einer sterilen, Wegwerf-Kunststoff-Insulin-Spritze und einer 22 Gauge- 1 Inch-Nadel an Tag 0 und eine identische Boost-Injektion in das gegenüberliegende Hinterbein bei Woche 6. Die Tiere wurden vor der Immunisierung und bei Woche 3, 6, 7, 9 und 13 aus einer Ohrvene bluten gelassen. Die Woche 6-Blutung erfolgte am selben Tag, jedoch bevor die Boost-Injektion verabreicht wurde.
  • Unter Verwendung einer einzelnen unilateralen i.m.-Injektion, die mit Nadel und Spritze durchgeführt wurde, produzierte Vaxfectin eine robuste 20-fache Zunahme an Antikörper-Titern bei Woche 3, verglichen mit einer Injektion von Naked-pDNA. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Nach einer Boost-Injektion, die bei Woche 6 gegeben wurde, nahmen anti-NP Titer in beiden Gruppen um etwa eine Größenordung zu, wobei die Antikörper-Titer in der Vaxfectin-Gruppe 20- bis 50-fach höher als in der Naked-pDNA-Gruppe während des Verlaufs des Experiments verblieben. Wenn Kaninchen mit der Biojektor®2000-Vorrichtung immunisiert wurden, schien Vaxfectin nicht die Antikörper-Antwort nach einer einzelnen unilateralen Injektion zu erhöhen. Nach einer Boost-Injektion, die bei Woche 6 gegeben wurde, waren anti-NP Titer in der Biojector-Vaxfectin-Gruppe bis zu 8-mal höher als in der entsprechenden Naked-pDNA-Gruppe.
  • Beispiel 4
  • Vaxfectin erhöht eine Antikörper-Produktion und fördert eine Immunantwort vom Th1-Typ auf verschiedene Plasmid-DNA-kodierte Antigene
  • Der Zweck des vorliegenden Beispiels ist es die Adjuvans-Wirkung von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid:Ko-Lipid (beispielsweise Vaxfectin) bei einer Formulierung mit verschiedenen Modell-Antigenen zu zeigen und weiter die Immunantworten auf (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid:Ko-Lipid enthaltende pDNA-Formulierungen zu charakterisieren.
  • Immunisierung und Serum-Sammlung
  • Gebändigte, wache Mäuse erhielten 5 μg an pDNA, die kodiert für A/PR/8/34 NP (VR4700), Hühnerei-Lysozym (HEL, VR5900), E.coli Lac Z (β-gal, VR1412), Maus Id/Human Fc (variable Immunoglobulin Regionen aus 38C13, einer Mauslymphomzelllinie, die an eine konstante Human IgG1 Region, VR1623, fusioniert ist) oder Human Faktor IX (VR1904), die in PBS mit und ohne Vaxfectin (50 μl) zubereitet ist und in den Rectus femoris von 8–10 Wochen alten weiblichen Mäusen injiziert wird. Die Mäusen erhielten einen Boost bei Woche 3 mit der gleichen Dosis und Formulierung. Die Mäuse wurden vor der ersten Injektion, einen Tag vor dem Boost, und bei Woche 6 nach der ersten Injektion aus dem Augenvenengeflecht bluten gelassen.
  • IgG-Antikörper-ELISAs
  • Antikörper-Titer wurden bestimmt, indem 96-Well-1/2-Bereich-Flach-Well-Mikrotiterplatten (Corning/Costar, Inc., Corning, NY) mit 0,035 μg Influenza-Nucleoprotein (aus rekombinanten baculoviralen Extrakten gereinigt), 0,25 μg Hühnerei-Lysozym (HEL, Sigma, St. Louis, MO), 0,25 μg E.Coli β-Galactosidase (β-gal, Sigma, St. Louis, MO), 2,2 μg Maus-Id (Southern Biotech, Birmingham, AL) oder 0,3 μg Human Faktor IX (Calbiochem, La Jolla, CA) in 50 μl BBS (89 mM Borsäure, 90 mM NaCl pH 8.3) pro Well beschichtet werden. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert und dann 4 Mal mit BBST (BBS mit 0. 1 % Tween 20) gewaschen. NP-beschichtete Wells wurden dann mit 100 μl an NP-Assay-Puffer (5% Nicht-Fett-Milch in BBS) geblockt und Wells anderer Platten wurden mit 100 μl an BSA-Assay-Puffer (1% Rinderserumalbumin in BBS) während einer Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Zweifache serielle Verdünnungen von Sera in Assay-Puffern, bei 1:25 beginnend, wurden zubereitet und 50 μl Aliquots wurden zu jedem Well zugegeben. Nach einer 2-Stunden-Inkubation bei Raumtemperatur und 4 Waschungen wurden bei 50 μl/Well mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziege anti-Maus IgG-Fc (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) in einer Verdünnung von 1:5000 in Assay-Puffer zugegeben. Die Platten wurden während 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, vier Mal gewaschen und 50 μl an p-NPP-Substrat (1 mg/ml para-Nitrophenyl-phosphat, Calbiochem, La Jolla, CA, in 50 mM Natriumbicarbonat-Puffer, pH 9.8 und 1 mM MgCl2) wurden pro Well zugegeben. Die Extinktion bei 405 nm wurde nach 1,5 Stunden bei Raumtemperatur abgelesen. Der Titer ist der Kehrwert der letzten Verdünnung bei einem Signal, welches das Zweifache von Jenem von Vor-Blutungs-Proben (pre-bleed samples) beträgt.
  • Antigen-spezifische IgG1- und IgG2a-ELISAs
  • Mit alkalischer Phosphatase-konjugierte, Maus-Sub-Isotyp-spezifische monoklonale Antikörper wurden mit Standards vortitriert, um die Verdünnung zu bestimmen, bei der gleiche Extinktionswerte für gleiche Mengen an Standard erhalten wurden. Für die Titrationen wurden Platten über Nacht bei 4°C mit 0,1 μg/50 μl/Well an Affinitäts-gereinigtem Ziege anti-Mauskappa-Antisera in BBS beschichtet. Die Platten wurden gewaschen und wie für den NP-ELISA vorstehend beschrieben, geblockt. Gereinigtes Maus IgG1, κ oder IgG2a, κ wurde seriell verdünnt und den Platten bei 50 μl/Well zugesetzt. Nach einem Inkubieren während 2 Stunden bei Raumtemperatur, wurden mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ratte anti-Maus IgG1 und IgG2a (Pharmingen, La Jolla, CA) seriell verdünnt und den gewaschenen Platten zugesetzt. Der Assay wurde wie bei dem NP-Antikörper-ELISA vervollständigt. Der Assay zur Erfassung von Antigen-spezifischen Sub-Isotyp-Serumtitern erfolgte wie hinsichtlich der Gesamt IgG-Niveaus beschrieben mit den folgenden Modifikationen: mit alkalischer Phosphatase konjugiertes anti-Maus IgG 1 und anti-Maus IgG2a wurden auf 1:1500 beziehungsweise 1:200 verdünnt.
  • Stimulation von CTL
  • Milzen wurden von euthanisierten Mäusen bei Woche 11–12 nach der ersten Injektion entfernt und 2,5 × 107 Splenozyten wurden während 5 Tagen in 6 Well-Platten in insgesamt 5 ml an RPMI 1640 Medium (falls nicht anders angegeben, so wurden alle Gewebekulturreagenzien von Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD erhalten) in Kultur gehalten, welches enthält, L- Glutamin und 25 mM HEPES, und ergänzt ist mit, Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml), 5.5 × 10–5 M β-Mercaptoethanol und 10% FBS (10% Medien) mit entweder NP147–155 Peptid (H-2Kd TYQRTRALV) oder β-gal876-884 Peptid (H-2LdTPHPARIGL) bei 1 μg/ml und rekombinantem Maus-IL-2 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) bei 0,5 U/ml.
  • 51Cr-Freisetzungs-Assay
  • Zum Erfassen spezifischer Antigen-Lysis wurden P815-Zellen mit 0,15 mCi Na2 51CrO4 markiert (NENLife Science Products, Boston, MA) und entweder mit 20 μg NP147–155 Peptid oder 50 μg β-gal876-884 Peptid in 1 ml RPMI 1640 Medien gepulst oder ungepulst verwendet. Doppelte Aliquots an stimulierten Splenozyten wurden in Round-bottom-plates (Rundbodenplatten) mit 96 Wells (ICN Biomedicals, Aurora, OH) seriell verdünnt und Target-Zellen wurden in den angegebenen Effektor: Target Verhältnissen (E : T) in einem End-Volumen von 200 μl/Well zugegeben. Die Platten wurden zentrifugiert und während 4 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Nach einer Inkubation wurden 100 μl an Überstand aus jedem Well analysiert. Spezifische Lysis wurde als % spezifische Lysis =[(a–b)/(c–b)] 100 berechnet, wobei a die durchschnittliche cpm ist, die in Gegenwart von Effektoren freigesetzt ist, b die durchschnittliche cpm ist, die von Target-Zellen freigesetzt wird, die lediglich in Medien inkubiert werden und c die cpm ist, die von Target-Zellen in Gegenwart von 1 % Triton-X 100 freigesetzt wird.
  • Cytokin-Profile
  • Zum Bestimmen von Cytokin-Sekretionsprofilen von Milzzellen, die in vitro mit Antigen restimulatiert sind, wurden Splenozyten im Doppel bei 4 × 105 Zellen/100 μl/Well in Flat-bottom (Flachboden) – Kulturplatten mit 96 Wells mit gereinigtem NP (aus rekombinanten baculoviralen Extrakten gereinigt) oder β-gal-Protein (Sigma, St.Louis, MO) bei 5 μg/ml plattiert. Kultur-Überstände wurden nach 72 Stunden bei 37°C mit 5% CO2 gewonnen. Cytokine in Kultur-Überständen wurden mit einem Maus IFN-γ ELISA-Kit (Pharmingen, La Jolla, CA) und einem Maus IL-4 ELISA-Mini-Kit (Endogen, Woburn, MA) gemäß den Anweisungen der Hersteller quantifiziert.
  • Statistische Analysen
  • Statistische Analysen wurden mit dem "2-tailed Student t-test" durchgeführt.
  • Wirkung von Vaxfectin auf antigen-spezifische IgG-Titer
  • Antigen-spezifische Antikörper-Titer für Seren, die einen Tag vor dem Boost bei Woche 3 gesammelt wurden und für Seren, die bei Woche 6 nach der ersten Injektion gesammelt wurden, werden in 11 gezeigt. Eine Immunisierung mit pDNA/Vaxfectin hatte eine bescheidene Wirkung auf die Woche 3-Titer der anti-NP und anti-Faktor IX Antikörper und eine sogar noch größere Wirkung auf anti-Maus Id und anti-HEL Antikörper-Titer. Vaxfectin hatte keine Wirkung auf die Serumtiter von anti-β-gal Antikörpern bei Woche 3. Drei Wochen nach den Boost-Immunisierungen, lagen bei allen fünf Antigenen Titer für Mäuse, die pDNA/Vaxfectin erhalten, erhöht über jenen die lediglich Naked-pDNA erhalten. Tabelle 3 fasst die Antigen- spezifischen IgG-Antworten bei Woche 6 für alle 5 Modell-Antigene zusammen. Vaxfectin erhöhte die Titer an pDNA induzierten anti-NP und anti-HEL Antikörpern 8-fach beziehungsweise 10-fach über Naked-pDNA und erhöhte die Titer an anti-β-gal, anti-Faktor IX und anti-Maus Id 3-fach über Naked-DNA.
  • Tabelle 3. IgG Antikörper-Titer bei Woche 6*
    Figure 00460001
  • Wirkung von Vaxfectin auf CTL-Antwort
  • Eine Plasmid-DNA-Impfung auf dem intramuskulären Weg führt gewöhnlich zu starken CTL-Antworten auf das kodierte Antigen (Ulmer et al.. 1993, Raz et al., 1996, Donnelly et al., 1997). Ein mögliches Ergebnis des Formulierens von pDNA mit einen Adjuvans um einen Boost der Antikörper-Antworten zu erhalten ist eine Induktion einer Antwort vom Th2-Typ, die zu einer schwächeren zellvermittelten Immunantwort führen könnte. Zum Bestimmen der Wirkung von Vaxfectin auf die pDNA-induzierte CTL-Antwort, wurden Milzen von Mäusen, die mit NP- oder β-gal-pDNA immunisiert sind, 8–9 Wochen nach der Boost-Injektion gewonnen. Ein Assay hinsichtlich einer CTL-Lysis von mit NP oder β-gal-Peptid gepulsten P815 Target-Zellen wurde an Splenozyten durchgeführt, die während 5–6 Tagen mit NP oder β-gal-Peptid in Kultur gehalten wurden. Nicht-gepulste P815 Target-Zellen wurden verwendet, um eine nichtspezifische Lysis zu erfassen. Die Antigen-spezifischen CTL-Effektor-Titrationsskurven für % – Lysis von mit Peptid gepulsten Target-Zellen sind in 12 gezeigt. Die Ergebnisse sowohl für NP-, als auch für β-gal-pDNA zeigen, dass eine Formulierung von pDNA mit Vaxfectin keine signifikante Wirkung auf die CTL-Antwort bei einem der getesteten Effektor : Target-Verhältnisse hat (p > 0,05 bei allen E:T-Verhältnissen).
  • Wirkung von Vaxfectin auf IgG1- und IgG2a-Antikörper-Titer
  • Die Immunantworten vom T Helfer 1 (Th1) – Typ, die durch intramuskuläre pDNA-Immunisierung induziert sind, fördern einen "heavy chain switch" – Vorgang eines Antikörpers zum IgG2a Sub-Isotyp in ansprechenden B-Zellen (Raz et al., 1996). Folglich ist eine Produktion von Antigen-spezifischem IgG2a größer als die von Antigen-spezifischem IgG1. Die Verwendung eines Adjuvants in pDNA-Impfstoffen könnte die Immunantwort qualitativ verändern, was zu einer höheren Produktion an entweder IgG1 oder IgG2a führt. Zur Bestimmung der Wirkung von Vaxfectin auf das relative Verhältnis antigen-spezifisches Serum-IgG1 zu -IgG2a bei Formulierungen mit verschiedenen Antigen-Plasmid-DNAs wurden 6 Wochen Sera bzw. Woche 6-Sera hinsichtlich Antigen-spezifischer Sub-Isotyp-Titer untersucht.
  • Wie in 13a gezeigt, führen Immunisierungen mit für unterschiedliche Antigene kodierender Naked-pDNA zu Sub-Isotyp-Profilen, die für jedes Antigen einzigartig sind. Obwohl das relative Verhältnis von IgG1 und IgG2a für verschiedene Antigene variiert, so war IgG2a der prädominant hergestellte Sub-Isotyp, der mit einer Immunantwort vom Th1-Typ konsistent ist.
  • Vaxfectin, das mit allen fünf Modell-Antigen-pDNAs formuliert ist, führt zu einer Zunahme beider Antigen-spezifischer Antikörper-Sub-Isotypen (Tabelle 4). Die Zunahmen an Antigenspezifischem IgG1 und IgG2a waren für mit Vaxfectin formulierte pDNA für 4 der Modell – Antigene ungefähr in der gleichen Größenordnung. Verglichen mit Titern, die mit Naked-pDNA erhalten wurden, erhöhte ein Formulieren von pDNA mit Vaxfectin anti-HEL IgG1 Titer 9-fach und IgG2a Titer 11-fach. Vaxfectin erhöhte anti-β-gal, anti-Maus Id/Human Fc und anti-Faktor IX IgG1 Titer 2- bis 5-fach und IgG2a-Titer 2- bis 4-fach über Naked-DNA. Mit NP-pDNA formuliertes Vaxfectin erhöhte den durchschnittlichen anti-NP IgG1 Antikörper-Titer um das 15-fache über Naked-pDNA. Jedoch war der durchschnittliche anti-NP IgG2a Antikörper-Titer lediglich um das Dreifache erhöht. Folglich verbleiben die durch Immunisierung von pDNA/Vaxfectin hervorgerufenen, relativen Verhältnisse von IgG1 und IgG2a ähnlich zu den Verhältnissen, die erzeugt werden, wenn Naked-pDNA zum Immunisieren von Mäusen verwendet wird, außer im Falle von NP pDNA/Vaxfectin (13b). In diesem Fall liegt eine viel größere Zunahme bei dem Antikörper-Titer von anti-NP IgG1 als von anti-NP IgG2a vor. Bei allen mit Vaxfectin formulierten pDNAs waren die Titer an Antigen-spezifischem IgG2a höher als an Antigen-spezifischem IgG1, was eine Antwort vom Th1-Typ nahe legt.
  • Figure 00490001
  • Wirkung von Vaxfectin auf das Cytokin-Profil
  • Die Antigen-spezifischen Antikörper Sub-Isotyp Analysen legen nahe, dass die mit Vaxfectin formulierter pDNA induzierten Antworten, wie die bei Naked-pDNA, Antworten vom Th1-Typ sind. Um zu bestätigen, dass Vaxfectin keine Wirkung auf das T-Helfer (Th) – Cytokin-Profil in einer Antigen-spezifischen in vitro Recall-Antwort hat, wurden Milzen von Mäusen, die mit ohne oder mit Vaxfectin formulierter NP- oder β-gal-pDNA immunisiert sind, nach 8–9 Wochen nach der Boost-Injektion gewonnen. Die Splenozyten wurden kultiviert und mit NP oder β-gal-Protein stimuliert. Von den kultivierten Zellen gewonnene Überstände wurden einem Assay hinsichtlich einer Produktion von IFN-γ und Interleukin-4 (IL-4) unterworfen. Immunisierungen mit NP- oder β-gal-Plasmid-DNA, die mit oder ohne Vaxfectin formuliert ist, führen zu einer Produktion von IFN-γ in Splenozyten-Kulturen bei allen Gruppen von immunisierten Mäusen (14). Geringe Niveaus an IL-4 wurden in allen Mäusegruppen produziert; jedoch war IFN-γ das prädominante produzierte Cytokin, was eine Th1-beeinflusste (biased) Antwort nahe legt.
  • Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die vorstehenden Beispiele die kräftigen Adjuvans-Wirkungen einer einzigartigen Formulierung für Nukleinsäuren-Impfstoffe auf Basis eines kationischen Lipids zeigen. Die Stimulierung der humoralen Antwort kann erfolgen, ohne die starken zytolytischen Antworten, die für Nukleinsäuren-basierte Impfstoffe typisch sind, zu verringern. Die Adjuvans-Wirkung ist sowohl bei Mäusen, als auch bei Kaninchen ersichtlich, was pharmazeutische Anwendungen bei anderen Säugetieren impliziert und einen potentiellen Nutzen bei der Nukleinsäure-basierten Herstellung von monoklonaklen und polyklonalen Antikörpern bietet. Eine (+)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid / Ko-Lipid- (beispielsweise Vaxfectin-) vermittelte Verstärkung der Antikörper-Antworten konnte einfach nach einer einzelnen unilateralen intramuskulären Injektion beobachtet werden. Dies ist für die Immunisierung von Farm-Tieren bzw. Nutztieren, bei denen Single-Shot- bzw. Einmalgabe-Impfstoffe in hohem Maße erwünscht sind, wichtig, da ein Zusammentrieb von frei laufenden Tieren kostspielig ist und zu Produktionsverlusten aufgrund von Stress führen kann (Beard, C. W., et al., Nat. Biotechnol 16 (13), 1325–1328 (1998)).
  • Beispiel 5
  • Human-Verabreichung
  • Immunogene Zusammensetzungen, die für Hemagglutinin (HA) kodierende pDNA umfassen, die mit einem Adjuvans gemischt ist, das (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium-bromid enthält, das als ein 1: 1 (mol: mol)-Gemisch mit DPyPE formuliert ist, werden gemäß dein vorstehend beschriebenen Verfahren zubereitet. Das molare Verhältnis von pDNA/Adjuvans beträgt 4: 1. Drei Injektionen von 0,1, 0,5, 1,0 oder 2,5 mg pDNA in physiologischer Salzlösung als ein Komplex mit dem Adjuvans werden in vierwöchigen Intervallen in Menschen in wechselnde Deltamuskel injiziert. Dem Menschen wird Serum abgenommen und die HA-Antikörper-Niveaus werden wie vorstehend beschrieben durch serielle Verdünnung unter Verwendung eines Standard-ELISA-Assays bestimmt. Immunantworten der menschlichen Subjekte auf den HA-Antikörper werden induziert, wie durch GMT-Antikörper-Titerwerte angegeben.

Claims (30)

  1. Adjuvantzusammensetzung umfassend, ein Salz von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und ein oder mehrere Ko-Lipide.
  2. Adjuvantzusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Ko-Lipid ein neutrales Lipid ist.
  3. Adjuvantzusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Ko-Lipid ein Phosphatidylethanolamin ist.
  4. Adjuvantzusammensetzung nach Anspruch 3, worin das Phosphatidylethanolamin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DPyPE) und 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DMPE).
  5. Adjuvantzusammensetzung nach Anspruch 4, worin das Phosphatidylethanolamin 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) ist.
  6. Adjuvantzusammensetzung nach Anspruch 4, worin das Phosphatidylethanolamin 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DPyPE) ist.
  7. Adjuvantzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–6, worin das Salz von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und das Ko-Lipid in einem molaren Verhältnis von 9:1 bis 1:9 vorliegen.
  8. Adjuvantzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–6, worin das Salz von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und das Ko-Lipid in einem molaren Verhältnis von 4:1 bis 1:4 vorliegen.
  9. Adjuvantzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–6, worin das Salz von (+)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und das Ko-Lipid in einem molaren Verhältnis von 2:1 bis 1:2 vorliegen.
  10. Adjuvantzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–6, worin das Salz von (+)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und das Ko-Lipid in einem molaren Verhältnis von 1:1 vorliegen.
  11. Immunogene Zusammensetzung umfassend, ein Immunogen oder ein Immunogen-kodierendes Polynukleotid und die Adjuvantzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–10.
  12. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin die immunogene Zusammensetzung ein Immunogen-kodierendes Polynukleotid umfasst.
  13. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin das Immunogen-kodierende Polynukleotid aus DNA, RNA oder Nukleinsäure-Oligomer besteht.
  14. Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 oder 13, worin das Immunogen-kodierende Polynukleotid vollständig oder teilweise aus einer Plasmid-DNA besteht.
  15. Verwendung der immunogenen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12–14 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung eines Erkrankungszustandes in einem Vertebraten, wobei die Zusammensetzung in ein Gewebe oder einen Hohlraum des Vertebraten verabreicht wird, wo das Immunogen in einer ausreichenden Menge exprimiert wird, um eine Immunantwort auf das Immunogen zu erzeugen.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Vertebrat ein Säuger ist.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Säuger ein Mensch ist.
  18. Verwendung nach einem der Ansprüche 15–17, wobei das Gewebe Muskel ist.
  19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Gewebe Skelettmuskel ist.
  20. Verwendung nach einem der Ansprüche 15–19, wobei die Verabreichung intravenös erfolgt.
  21. Verwendung nach einem der Ansprüche 15–20, wobei die immunogene Zusammensetzung ein oder mehrere Immunogen-kodierende Polynukleotide umfasst, die ein oder mehrere antigene oder immunogene Polypeptide eines infektiösen bakteriellen Agens kodieren, und wobei das Medikament zur Behandlung oder Vorbeugung einer bakteriellen Infektionserkrankung ist.
  22. Verwendung nach einem der Ansprüche 15–20, wobei die immunogene Zusammensetzung ein oder mehrere Immunogen-kodierende Polynukleotide umfasst, die ein oder mehrere antigene oder immunogene Polypeptide eines infektiösen viralen Agens kodieren, und wobei das Medikament zur Behandlung oder Vorbeugung einer viralen Infektionserkrankung ist.
  23. Verwendung nach einem der Ansprüche 15–20, wobei die immunogene Zusammensetzung ein oder mehrere Immunogen-kodierende Polynukleotide umfasst, die ein oder mehrere Tumor-assoziierte, antigene oder immunogene Polypeptide kodieren, und wobei das Medikament zur Behandlung oder Vorbeugung von Krebs ist.
  24. Verwendung nach einem der Ansprüche 15–20, wobei die immunogene Zusammensetzung ein oder mehrere Immunogen-kodierende Polynukleotide umfasst, die ein oder mehrere antigene oder immunogene Polypeptide eines infektiösen Pilzagens kodieren, und wobei das Medikament zur Behandlung oder Vorbeugung einer Erkrankung durch infektiöse Pilze ist.
  25. Verwendung nach einem der Ansprüche 15–20, wobei die immunogene Zusammensetzung ein oder mehrere Immunogen-kodierende Polynukleotide umfasst, die ein oder mehrere antigene oder immunogene Polypeptide eines infektiösen Parasitenagens kodieren, und wobei das Medikament zur Behandlung oder Vorbeugung einer Erkrankung durch infektiöse Parasiten ist.
  26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Erkrankung durch infektiöse Parasiten eine Erkrankung durch infektiöse Protozoen ist.
  27. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Erkrankung durch infektiöse Parasiten eine Erkrankung durch infektiöse Helminthen ist.
  28. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Erkrankung durch infektiöse Parasiten eine Erkrankung durch infektiöse Ektoparasiten ist.
  29. Verwendung nach einem der Ansprüche 15–20, wobei die immunogene Zusammensetzung ein oder mehrere Immunogen-kodierende Polynukleotide umfasst, die ein oder mehrere antigene oder immunogene Polypeptide eines allergenen Agens kodieren, und wobei das Medikament zur Behandlung oder Vorbeugung von Allergie ist.
  30. Pharmazeutischer Kit umfassend: a) einen Behälter, der 1 ng bis 30 mg eines Immunogen-kodierenden Polynukleotids enthält, das in vivo ein Immunogen in einer Vertebratenzelle betriebsfähig kodiert; und b) eine Adjuvantzusammensetzung, die ein Salz von (±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium und ein oder mehrere Ko-Lipide umfasst, um das Immunogen in einer prophylaktisch oder therapeutisch wirksamen Menge bereitzustellen, um einen Vertebraten zu behandeln.
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