DE69710476T2

DE69710476T2 - Alkaloidglykoside zur verwendung als arzneimittel

Info

Publication number: DE69710476T2
Application number: DE69710476T
Authority: DE
Inventors: George Simon Attard; William John Woodroofe Morrow; Palasingam Rajananthanan
Original assignee: University of Southampton; Queen Mary and Westfiled College University of London
Current assignee: University of Southampton; Queen Mary University of London
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-27
Publication date: 2002-10-10
Anticipated expiration: 2017-08-28
Also published as: US20020155118A1; AU4123297A; EP0928199A1; US6673357B2; GB9618119D0; AU741098B2; WO1998008544A1; DE69710476D1; EP0928199B1; ATE213167T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung ein Adjuvans für die Verwendung in einem Vaccin. In einer spezielleren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Glycosidadjuvans.
In den meisten Vaccinen, die heute verwendet werden, sind Antikörper gegen Proteine gerichtet, die auf der Oberfläche von krankheitsverursachenden (pathogenen) Organismen vorhanden sind (z. B. Viren, Bakterien). Vaccinformulierungen enthalten typischerweise inaktivierte oder abgetötete Pathogene. In vielen Situationen ist es erwünscht, eine Antikörperreaktion gegen einen bestimmten Satz von Proteinen, Peptiden oder Kohlenwasserstoffen, die in dem Pathogen vorhanden sind, hervorzurufen. Dies führt zu einer gut definierten Reaktion, welche gegen Proteine gerichtet werden kann, die zwischen verschiedenen Stämmen des Pathogens hochgradig konserviert sind, wobei man eine Immunität auf breiterer Basis erzielt.
Darüber hinaus erachtet man die Fähigkeit, sowohl Klasse I- und Klasse II-beschränkte Immunreaktionen zu stimulieren, als wichtig, da sie zu einem umfassenderen Grad an Immunität führt, als dies derzeit mit vorhandenen Vaccinen erreicht wird.
Kurz gefaßt umfassen Klasse II-beschränkte Reaktionen die Produktion von Antikörpern, die für die in dem Vaccin verwendeten Proteine oder Peptide spezifisch sind - dies wird häufig als die humorale Immunreaktion bezeichnet.
Klasse I-beschränkte Immunreaktionen sind zellvermittelte Reaktionen, die für das Feststellen und den Umgang mit viralen Infektionen verantwortlich sind. Im Gegensatz zu den Klasse IIbeschränkten Reaktionen umfassen Klasse I-Reaktionen die Aktivierung von CD8+ cytotoxischen T- Lymphozyten (CTLs). Diese CTLs werden von oligomeren Peptiden aktiviert, die von nicht selbständigen Proteinen abgeleitet sind. Diese Peptide werden auf der Oberfläche von Zellen in Verbindung mit den Produkten des Haupthistokompatibilitätskomplexes I (MHC-I) präsentiert. Aktivierte CTLs sind in der Lage, mit Virus infizierte Zellen, die auf ihren Oberflächen nicht selbständige Oligopeptide haben, zu erkennen und zu zerstören.
Die Verwendung von Adjuvanzien in Vaccinformulierungen führt zu verstärkten Immunreaktionen, insbesondere gegen lösliche Proteine und Peptide, die nur Schwach immunogen sind.
In der Literatur wurden mehrere Adjuvanzien beschrieben (z. B. vollständiges oder unvollständiges Freundsches Adjuvans), jedoch sind die meisten wegen ihrer schweren inflammatorischen Nebenwirkungen nur von experimentellem Interesse. Diesbezüglich werden auf Saponin basierende Adjuvanzien von einigen wegen ihrer Aktivität und ihrer relativ geringen Toxizität und inflammatorischen Nebenwirkungen als zu den meistversprechendsten gehörend angesehen.
Beispielhaft offenbart die EP-A-0 231 039 die Verwendung eines Saponin-Glycosides als ein Adjuvans für Vaccine. Diese speziellen Adjuvanzien, die in der Form von Nanopartikeln vorliegen, sind durch ihre einzigartigen Bauarten gekennzeichnet und werden häufig als immunstimulierende Komplexe (ISCOMs) bezeichnet. Diese werden durch Mischen eines Saponin-Glycosides und Cholesterin in wäßrigen Lösungen, häufig in Gegenwart eines Lipides und eines Detergens, gefolgt von einer oder mehreren Reinigungsstufen, hergestellt. Das Saponin ist in wenigstens seiner kritischen mizellaren Konzentration (CMC) vorhanden. Die Fähigkeit von ISCOMs, hohe Antikörpertiter gegen einen breiten Bereich antigener Proteine und Peptide hervorzurufen, wurde demonstriert, wie auch ihre Fähigkeit, CTL-Aktivität zu induzieren (d. h. die ISCOM-Nanopartikel können sowohl Klasse I- als auch Klasse II-beschränkte Immunantworten stimulieren).
Es besteht jedoch nach wie vor ein anhaltender Bedarf, Adjuvanzien für Vaccine zu entwickeln, insbesondere Adjuvanzien, die Klasse I-beschränkte und/oder Klasse II-beschränkte Immunantworten gegen natürlich auftretende oder synthetische Proteine und Oligopeptide stimulieren können.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Alkaloidglycosid zur Verwendung in einem Arzneimittel bereitgestellt, wobei das Alkaloidglycosid unter Tomatin, Chaconin, Commersonin und Demissin ausgewählt ist.
Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Alkaloidglycosid für die Stimulation einer Klasse I-beschränkten Immunantwort und/oder einer Klasse II-beschränkten Immunantwort bereitgestellt, wobei das Alkaloidglycosid eine Aglykongruppe enthält, welche ein Steroid ist, das wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält.
Gemäß einem dritten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Alkaloidglycosid für die Verwendung als ein Vaccinadjuvans bereitgestellt, wobei das Alkaloidglycosid eine Aglykongruppe enthält, welche ein Steroid ist, das wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält.
Gemäß einem dritten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Alkaloidglycosides zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung als ein Vaccin bereitgestellt, wobei das Alkaloidglycosid eine Aglykongruppe enthält, welche ein Steroid ist, das wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält.
Gemäß einem vierten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Alkaloidglycosides als ein Adjuvans zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung als ein Vaccin bereitgestellt, wobei das Alkaloidglycosid eine Aglykongruppe enthält, welche ein Steroid ist, das wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält.
Gemäß einem fünften Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Alkaloidglycosides zur Herstellung eines Arzneimittels zum Stimulieren einer Klasse I-beschränkten Immunantwort und/oder einer Klasse II-beschränkten Immunantwort bereitgestellt, wobei das Alkaloidglycosid eine Aglykongruppe enthält, welche ein Steroid ist, das wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält.
Gemäß einem sechsten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird eine Kombination aus einem Alkaloidglycosid und einem Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, bereitgestellt, wobei das Alkaloidglycosid eine Aglykongruppe enthält, welche ein Steroid ist, das wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält.
Somit beruht die vorliegende Erfindung auf der überraschenden Entdeckung, daß es möglich ist, ein Alkaloidglycosid, ausgewählt unter Tomatin, Chaconin, Commersonin und Demissin, für eine medizinische Verwendung, insbesondere ein Alkaloidglycosid, das eine Aglykongruppe enthält, welche ein Steroid ist, das wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält, für die Stimulation einer Klasse I-beschränkten Immunantwort und/oder einer Klasse II-beschränkten Immunantwort einzusetzen. Dieses Ergebnis ist in hohem Maße überraschend, da R. Bomford, M. Stapleton, J. E. Beesley, E. A. Jessup, K. R. Price, G. R. Fenwick (in "Adjuvanticity and ISCOM formation by structurally divests saponins"; Vaccine, Band 10, (1992), 572-577) ausführen, daß Glycoalkaloide (d. h. Alkaloidglycoside) keine Adjuvansaktivität besitzen.
Der Begriff "Subjekt" umfaßt jede Art von Tieren, einschließlich Menschen. Vorzugsweise bezeichnet der Begriff einen Menschen.
Der Begriff "Glycosid", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein Derivat eines Zuckers (der ein einfacher Zucker oder ein komplexer Zucker sein kann), in welchem die an den Kohlenstoff 1 des Zuckers gebundene Hydroxylgruppe durch eine alkoholische oder eine andere Aglykongruppe substituiert ist.
Der Begriff "Glycosid", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein chemisches Gebilde/eine chemische Substanz mit einer Steroid-, Triterpen- oder einer anderen polyzyklischen aliphatischen Struktur und einem oder mehreren Kohlenwasserstoffen.
Der Begriff "Alkaloidglycosid", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein Glycosid, das in der Lage ist, mit Säuren unter Bildung von Salzen eine Verbindung einzugehen.
Der Begriff "Alkaloidglycosid", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein Glycosid, bei dem die Aglykongruppe ein Steroid ist, welches wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält (d. h. eine heterozyklische Gruppe, die wenigstens N enthält).
Vorzugsweise ist der Stickstoffheterozyklus ein Derivat von Pyrrolidin, Piperidin, Imidazolin, Piperazin, Morpholin, Pyridin, Chinolin, Isochinolin oder Pyrimidin.
Vorzugsweise ist das Alkaloidglycosid im wesentlichen (so gut wie) wasserunlöslich.
Vorzugsweise bedeutet der Begriff "im wesentlichen (so gut wie) wasserunlöslich", daß eine Löslichkeit von weniger als 300 mg pro Liter H&sub2;O vorhanden ist.
Beispiele für geeignete Alkaloidglycoside können Tomatin, Chaconin, Commersonin, Demissin, Solanin und Solasonin umfassen.
Für die vorliegende Erfindung kann das Alkaloidglycosid ein spezifisches Alkaloidglycosid oder ein Gemisch von Alkaloidglycosiden sein.
Vorzugsweise ist das Alkaloidglycosid Tomatin (d. h. (3ß,5α,22ß,25S)-Spirosolan-3-yl-O-β-Dglucopyranosyl-(1-2)-O-[β-D-xylopyranosyl-(1-3)]-O-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-β-Dgalaktopyranosid).
Gemäß jedem der Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung kann das Alkaloidglycosid in Kombination mit einem oder mehreren anderen Adjuvanzien, wie Saponinglycosid, verwendet werden.
Gemäß jedem der Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung kann das Alkaloidglycosid in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder Verdünnern und/oder Bindemitteln verwendet werden.
Gemäß jedem der Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung kann das Alkaloidglycosid in Kombination mit einem oder mehreren anderen aktiven Mitteln verwendet werden.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann für eine prophylaktische Behandlung oder für einen heilende Behandlung verwendet werden.
Vorzugsweise kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung für eine prophylaktische Behandlung verwendet werden.
Vorzugsweise ist die Zusammensetzung eine Vaccinzusammensetzung.
Vorzugsweise ist die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung durchscheinend.
Vorzugsweise wird die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Vaccinierung oder Immunisierung verwendet.
Das Alkaloidglycosid kann an einer anderen Stelle an oder in einem Subjekt verabreicht oder ausgeliefert werden als ein Teil oder alles von dem Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren.
Vorzugsweise besteht die Immunantwort wenigstens teilweise aus Vaccinierung oder Immunisierung.
Besonders bevorzugt besteht die Immunantwort im wesentlichen aus Vaccinierung oder Immunisierung.
Gemäß einem bevorzugten Gesichtspunkt ist das Mittel, welches in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, ein Protein oder ein Oligopeptid.
Typischerweise ist das Protein oder Oligopeptid aus einem Virus, einem Bakterium, einem Parasiten oder einer tierischen Zelle isolierbar.
Gemäß einem besonders bevorzugten Gesichtspunkt ist das Mittel, welches in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, ein natürlich auftretendes Protein oder Oligopeptid oder ein synthetisches Protein oder Oligopeptid.
Hierin umfaßt der Begriff "synthetisch" Proteine oder Oligopeptide, die mittels rekombinanter DNA- Techniken hergestellt wurden, und/oder Proteine oder Oligopeptide, die mittels synthetischer chemischer Techniken hergestellt wurden.
Vorzugsweise ist das Protein oder Oligopeptid zu einem T-Zell-Epitop äquivalent.
Für einige Anwendungen kann das Protein oder Oligopeptid wasserlöslich sein.
Vorzugsweise bedeutet der Begriff "wasserlöslich", daß eine Löslichkeit von wenigstens 300 mg pro L H&sub2;O vorhanden ist.
Für einige Anwendungen kann das Protein oder Oligopeptid besser wasserlöslich sein als das Alkaloidglycosid.
Besonders bevorzugt ist das Protein oder Oligopeptid schwach immunogen. Der Begriff "schwach immunogen" bedeutet, daß das Mittel, wenn es in der Abwesenheit von Adjuvanzien verabreicht wird, weniger als eine zehnfache Zunahme der Antikörpertiter oder weniger als 45% Zellysierung in einem Test auf CTL-Aktivität induziert.
Für einige Anwendungen wird das Protein oder Oligopeptid vorzugsweise vor dem Mischen mit dem Alkaloidglycosid gereinigt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Alkaloidglycosid in Kombination mit einem oder mehreren Mitteln, die in der Lage sind, eine Immunantwort zu induzieren, verwendet werden.
Für einige Anwendungen wird das Alkaloidglycosid vorzugsweise in Kombination mit einem speziellen Typ eines Mittels verwendet, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren.
Vorzugsweise wird das Alkaloidglycosid der vorliegenden Erfindung verwendet, um sowohl Klasse I- beschränkte als auch Klasse II-beschränkte Immunantworten zu stimulieren.
Besonders bevorzugt wird das Alkaloidglycosid der vorliegenden Erfindung dazu verwendet, sowohl Klasse I-beschränkte als auch Klasse II-beschränkte Immunantworten gegen natürlich auftretende oder synthetische Proteine und Oligopeptide zu stimulieren.
Gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung als Kombination braucht das Alkaloidglycosid nicht notwendigerweise mit dem Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, gemischt zu sein. Vorzugsweise wird das Alkaloidglycosid jedoch mit dem Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, gemischt.
Gemäß einem bevorzugten Gesichtspunkt kann das Alkaloidglycosid mit einem Mittel gemischt werden, das in der Lage ist, die hämolytische Aktivität des Alkaloidglycosids zu unterdrücken.
Ein bevorzugtes Mittel, das in der Lage ist, die hämolytische Aktivität des Alkaloidglycosids zu unterdrücken, ist ein Steroid.
Bevorzugte Steroide, die in der Lage sind, die hämolytische Aktivität des Alkaloidglycosids zu unterdrücken, sind Steroide von tierischem oder pflanzlichem Ursprung und können eines oder mehrere von Cholesterol, Stigmasterol und Lumisterol umfassen.
Ein besonders bevorzugtes Mittel, das in der Lage ist, die hämolytische Aktivität des Alkaloidglycosids zu unterdrücken, ist Cholesterol.
Gemäß einem bevorzugten Gesichtspunkt kann das Alkaloidglycosid mit einem Lösungsverbesserer für das Alkaloidglycosid gemischt werden - insbesondere wenn das Alkaloidglycosid in Wasser im wesentlichen unlöslich ist.
Gemäß einem bevorzugten Gesichtspunkt ist der Lösungsverbesserer ein Detergens.
Geeignete Detergenzien umfassen eines oder mehrere von einem nichtionischen Detergens, einem ionischen Detergens und einem zwitterionischen Detergens.
Vorzugsweise ist das Detergens wenigstens ein nichtionisches Detergens.
Vorzugsweise ist das Detergens ein nichtionisches Detergens.
Ein bevorzugtes Detergens ist β-Octylglucopyranosid.
Wenn ein Detergens verwendet wird, dann wird das Detergens vorzugsweise aus der Zusammensetzung, die für das Behandlungsverfahren verwendet werden soll, entfernt. In diesem Zusammenhang ist das Gebiet reich an Techniken zur Entfernung von Detergenzien. Zum Beispiel wird das Detergens durch Dialyse, Chromatographie oder Gradientenzentrifugation entfernt. Vorzugsweise wird das Detergens durch Dialyse entfernt.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch andere Bestandteile enthalten, wie ein oder mehrere Lipide.
Gemäß einem besonders bevorzugten Gesichtspunkt enthält die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung daher Tomatin, Cholesterol, ein nichtionisches Detergens und Kochsalzlösung. Cholesterol ist zugegen, um die hämolytische Aktivität von Tomatin zu unterdrücken. Da Tomatin in Wasser so gut wie unlöslich ist, wird das nichtionische Detergens verwendet, um es löslich zu machen. Das Gemisch wird gegen Kochsalzlösung dialysiert, um das Detergens zu entfernen. Auf diese Weise wird die Adjuvansformulierung als eine durchscheinende Dispersion erhalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Alkaloidglycosid nach und/oder gleichzeitig mit und/oder vor der Verabreichung des Mittels, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, verabreicht werden. Vorzugsweise wird wenigstens etwas von dem Alkaloidglycosid gleichzeitig mit wenigstens etwas von dem Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, verabreicht.
Für einige Anwendungen wird vorzugsweise wenigstens ein wesentlicher Anteil des Alkaloidglycosids gleichzeitig mit wenigstens einem wesentlichen Anteil des Mittels, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, verabreicht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Anteil oder alles von dem Alkaloidglycosid in der gleichen Zusammensetzung wie ein Anteil oder alles von dem Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, verabreicht werden.
Alternativ kann das Alkaloidglycosid in einer anderen Zusammensetzung verabreicht werden als das Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren.
Vorzugsweise wird das Alkaloidglycosid in der gleichen Zusammensetzung wie das Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, verabreicht.
Die vorliegende Erfindung wird nun nur anhand von Beispielen beschrieben. In den folgenden Beispielen entsprach Raumtemperatur 20ºC.

Beispiel 1

{Herstellung der Zusammensetzung RAM-1* - welche ein Adjuvans gemäß der vorliegenden Erfindung und ein Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, enthält.}

Teil A:

25 mg Tomatin, 3,1 mg Phosphatidylethanolamin und 125 mg β-Octylglucopyranosid wurden zu 4 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung) hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf 60ºC erwärmt und intensiv über einen Zeitraum von zwei Stunden unter Verwendung eines Vortex-Mischers geschüttelt, bis man eine gleichmäßige, schwach trübe Dispersion erhielt. Das Gemisch wurde vor der Verwendung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.

Teil B:

6,25 mg Cholesterol, 3,1 mg Phosphatidylethanolamin und 125,0 mg β-Octylglucopyranosid wurden zu 3 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung) hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf 50ºC erwärmt und intensiv unter Verwendung eines Vortex-Mischers geschüttelt, bis man eine klare Lösung erhielt. Das Gemisch wurde vor der Verwendung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.

Teil C:

25 mg Ovalbumin (OVA) wurden in 3 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung) bei Raumtemperatur gelöst.
Teil A wurde mit Teil B gemischt und intensiv für einen Zeitraum von zwei Stunden geschüttelt. Zu diesem Gemisch wurde Teil C hinzugefügt, gefolgt von intensivem Schütteln. Das Gemisch wurde in einem mit Thermostat ausgestatteten Wasserbad bei 35ºC für 12 Stunden plaziert und während dieses Zeitraums regelmäßig geschüttelt. Nachdem das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde es in einen Dialyseschlauch (Mr 10000 Ausschluß) gegeben und für 24 Stunden gegen Kochsalzlösung dialysiert, um die Adjuvansformulierung RAM-1* herzustellen.

Beispiel 2

{Herstellung der Zusammensetzung RAM-1 - welche ein Adjuvans gemäß der vorliegenden Erfindung enthält (aber kein Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren).}

Teil A:

25 mg Tomatin, 3,1 mg Phosphatidylethanolamin und 125 mg β-Octylglucopyranosid wurden zu 4 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung) hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf 60ºC erwärmt und intensiv für einen Zeitraum von 2 Stunden unter Verwendung eines Vortex-Mischers geschüttelt, bis man eine gleichmäßige, schwach trübe Dispersion erhielt. Das Gemisch wurde vor der Verwendung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.

Teil B:

6,25 mg Cholesterol, 3,1 mg Phosphatidylethanolamin und 125,0 mg β-Octylglucopyranosid wurden zu 3 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung) hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf 50ºC erwärmt und intensiv unter Verwendung eines Vortex-Mischers geschüttelt, bis man eine klare Lösung erhielt. Das Gemisch wurde vor der Verwendung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.
Teil A wurde mit Teil B gemischt und intensiv über einen Zeitraum von zwei Stunden geschüttelt. Zu diesem Gemisch wurden 3 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung) hinzugegeben, gefolgt von intensivem Schütteln. Das Gemisch wurde für 12 Stunden in einem mit Thermostat ausgestatteten Wasserbad bei 35ºC plaziert und während dieses Zeitraums gleichmäßig geschüttelt. Nachdem das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde es in einen Dialyseschlauch (Mr 10000 Ausschluß) gegeben und für 24 Stunden gegen Kochsalzlösung dialysiert, um die Adjuvansformulierung RAM-1 herzustellen.

Beispiel 3

{Herstellung der Zusammensetzung RAM-2* - welche ein Adjuvans gemäß der vorliegenden Erfindung und ein Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, enthält.}

Teil A:

99 mg Tomatin, 12,5 mg Phosphatidylethanolamin und 495 mg β-Octylglucopyranosid wurden zu 4 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung) hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf 50ºC erwärmt und intensiv über einen Zeitraum von zwei Stunden unter Verwendung eines Vortex-Mischers geschüttelt, bis man eine gleichmäßige, schwach trübe Dispersion erhielt. Das Gemisch wurde vor der Verwendung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.

Teil B:

25 mg Cholesterol, 12,5 mg Phosphatidylethanolamin und 495 mg β-Octylglucopyranosid wurden zu 3 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung) hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf 50ºC erwärmt und intensiv unter Verwendung eines Vortex-Mischers geschüttelt, bis man eine klare Lösung erhielt. Das Gemisch wurde vor der Verwendung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.

Teil C:

10 mg Ovalbumin (OVA) wurden in 3 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung) bei Raumtemperatur gelöst.
Teil A wurde mit Teil B gemischt und intensiv über einen Zeitraum von zwei Stunden geschüttelt. Zu diesem Gemisch wurde Teil C hinzugegeben, gefolgt von intensivem Schütteln. Das Gemisch wurde in einem mit Thermostat ausgestatteten Wasserbad bei 35ºC plaziert und während dieses Zeitraums intensiv geschüttelt. Nachdem das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde es in einen Dialyseschlauch (Mr 3000 Ausschluß) gegeben und für 24 Stunden gegen Kochsalzlösung dialysiert, um die Adjuvansformulierung RAM-2* herzustellen.

Beispiel 4

{Herstellung der Zusammensetzung RAM-2 - welche ein Adjuvans gemäß der vorliegenden Erfindung enthält (aber kein Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren).}

Teil A:

99 mg Tomatin, 12,5 mg Phosphatidylethanolamin und 495 mg β-Octylglucopyranosid wurden zu 4 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung) hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf 50ºC erwärmt und intensiv für einen Zeitraum von zwei Stunden unter Verwendung eines Vortex-Mischers geschüttelt, bis man eine gleichmäßige, schwach trübe Dispersion erhielt. Das Gemisch wurde vor der Verwendung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.

Teil B:

25 mg Cholesterol, 12,5 mg Phosphatidylethanolamin und 494 mg β-Octylglucopyranosid wurden zu 3 ml Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung) hinzugegeben. Das Gemisch wurde auf 50ºC erwärmt und intensiv unter Verwendung eines Vortex-Mischers geschüttelt, bis man eine klare Lösung erhielt. Das Gemisch wurde vor der Verwendung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.
Teil A wurde mit Teil B gemischt und intensiv über einen Zeitraum von zwei Stunden geschüttelt. Zu diesem Gemisch wurden 3 ml Kochsalzlösung (Natriumchloridlösung) hinzugegeben, gefolgt von intensivem Rühren. Das Gemisch wurde für 12 Stunden in einem mit Thermostat ausgestatteten Wasserbad bei 35ºC plaziert und während dieses Zeitraums gleichmäßig geschüttelt. Nachdem das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde es in einen Dialyseschlauch (Mr 3000 Ausschluß) gegeben und für 24 Stunden gegen Kochsalzlösung dialysiert, um die Adjuvansformulierung RAM-2 herzustellen.

Antikörpertiter-Tests

Es wurden vier Sätze von Experimenten durchgeführt, wie sie in Tabelle 1 gezeigt sind. Jede Gruppe bestand aus sechs Mäusen.

TABELLE 1

Gruppe I Subkutan (sc) verabreichtes Antigen bei t = 0 (keine Adjuvanzien)
Gruppe II Subkutan verabreichtes RAM-1* oder RAM-2* bei t = 0
Gruppe III Subkutan verabreichtes RAM-1 oder RAM-2 bei t = 0, gefolgt von separater Injektion von Antigen an einer anderen Stelle drei Stunden später
Gruppe IV Subkutan verabreichtes RAM-1 oder RAM-2 bei t = 0 (kein Antigen)
Das Immunisierungs-/Ausblutungssystem ist nachfolgend in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2
Die Ergebnisse der Experimente waren folgende. Die Titer von spezifischem Anti-OVA-Antikörper im Blutserum, welches man am Tag 35 aus C57BL/6-Mäusen erhielt, sind in Tabelle 3 gezeigt. Diese Titer wurden unter Verwendung von Standard-ELISA-Verfahren gemessen und sind als Logarithmus zur Basis 10 der höchsten Verdünnung ausgedrückt, was eine optische Dichte (OD) -Ablesung von > 0,1 liefert. Die Hintergrund-OD wurde bestimmt, indem man den Mittelwert von Proben aus 6 nicht immunisierten Mäusen nahm. TABELLE 3
Die Ergebnisse zeigten, daß alle Adjuvanzien während des Verlaufs der Immunisierung zu hohen Titern an antigenspezifischen Antikörpern führten. Ein Vergleich der Daten aus den Experimenten der Gruppe II und der Gruppe 111 zeigt, daß die Adjuvanswirkung durch unabhängige Verabreichung von Antigen enthaltender und antigenfreier Adjuvansformulierung erzielt werden kann. Keines der Experimente der Gruppe I oder IV zeigte Zunahmen der antigenspezifischen Antikörpertiter.

Antizytotoxizitätstests

Die von T-Lymphozyten vermittelte zytotoxische Aktivität wurde unter Verwendung der Ovalbumintransfizierten EL4 (C57BL/6, H-2b-Thymoma) monoklonalen Mauszellinie als Ziel gemessen. Nicht transfizierte EL4-Zellen wurden als Negativkontrollen verwendet. Milzzellen (3 · 10&sup7;) aus normalen oder immunisierten Mäusen, welche 14 Tage früher gestartet worden waren, wurden mit 1,5 · 10&sup6; bestrahlten (200 Gy) 15-12 Zellen (gp160-Transfektanten) oder 3T3-Zellen (welche als Kontrollen dienten) für 5 Tage inkubiert. Zielzellen (1 · 10&sup6;) wurden mit 100 uCi&sup5;¹Cr markiert. Die Zielzellen wurden dreimal in RPMI 1640-Medium gewaschen, auf 2 · 10&sup5; Zellen/ml verdünnt, und 50 u (10&sup4;) Zielzellen wurden zu jeder Mikrotitervertiefung hinzugegeben, welche Antigen oder Peptid (10 uM) enthielten, und für 30 Minuten vorinkubiert. Effektorzellen wurden in Complete Medium (CM) unter Erhalt eines Bereiches von Effektor : Ziel (E : T) -Verhältnissen resuspendiert. Zielzellen (10&sup4;) wurden anschließend bei verschiedenen E : T-Verhältnissen in einem Gesamtvolumen von 200 ul 10% cm für weitere 4 h inkubiert. Die Überstände (100 ul) wurden gesammelt und hinsichtlich &sup5;¹Cr-Strahlung gezählt. Spontane Strahlungs- und maximale Strahlungswerte wurden durch Inkubieren der Zielzellen in 10% cm alleine oder mit 0,1% Triton X-100 bestimmt. Die prozentuale Zytotoxizität wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet:
100 · (ER - SR)/(MR - SR),
worin ER die experimentelle Strahlung, SR die spontane Strahlung und MR die maximale Strahlung ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt und repräsentieren die Mittelwerte von Dreifachbestimmungen. TABELLE 4

ZUSAMMENFASSUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung haben wir herausgefunden, daß Alkaloidglycoside - wie Tomatin - in der Lage sind, eine starke Klasse I- und Klasse II-beschränkte Immunantwort hervorzurufen, wenn sie mit löslichen Proteinen verabreicht werden.
Andere Modifikationen werden dem Fachmann auf dem Gebiet deutlich werden. Zum Beispiel können Solanin oder Chaconin anstelle oder zusätzlich zu Tomatin verwendet werden. Beispielhaft kann anstelle oder zusätzlich zu OVA eines oder mehrere der folgenden verwendet werden: Gp120 aus humanem Immunschwächevirus, Nukleoprotein aus Influenzavirus, PI-Außenmembranprotein von Neisseria gonorrhoeae oder 055 : B5-Polysaccharid aus Escherichia coli.

Claims

1. Alkaloidglycosid zur Verwendung in einem Arzneimittel, wobei das Alkaloidglycosid unter Tomatin, Chaconin, Commersonin und Demissin ausgewählt ist.

2. Alkaloidglycosid zur Stimulation einer Klasse I beschränkten Immunantwort und/oder einer Klasse II beschränkten Immunantwort, wobei das Alkaloidglycosid eine Aglykongruppe enthält, welche ein Steroid ist, das wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält.

3. Alkaloidglycosid zur Verwendung als ein Vaccinadjuvans, wobei das Alkaloidglycosid eine Aglykongruppe enthält, welche ein Steroid ist, das wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält.

4. Alkaloidglycosid nach einem der vorrangegangenen Ansprüche, wobei das Alkaloidglycosid im wesentlichen wasserunlöslich ist.

5. Alkaloidglycosid nach einem der vorrangegangenen Ansprüche, wobei das Alkaloidglycosid Tomatin ist.

6. Verwendung eines Alkaloidglycosides zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung als ein Vaccin, wobei das Alkaloidglycosid eine Aglykongruppe enthält, welche ein Steroid ist, das wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält.

7. Verwendung eines Alkaloidglycosides zur Herstellung eines Arzneimittels zum Stimulieren einer Klasse I beschränkten Immunantwort und/oder einer Klasse II beschränkten Immunantwort, wobei das Alkaloidglycosid eine Aglykongruppe enthält, welche ein Steroid ist, das wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält.

8. Verwendung eines Alkaloidglycosides nach einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei das Alkaloidglycosid im wesentlichen wasserunlöslich ist.

9. Verwendung eines Alkaloidglycosides nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Alkaloidglycosid Tomatin ist.

10. Kombination aus einem Alkaloidglycosid und einem Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, wobei das Alkaloidglycosid eine Aglykongruppe enthält, welche ein Steroid ist, das wenigstens einen Stickstoffheterozyklus enthält.

11. Kombination nach Anspruch 10, wobei das Alkaloidglycosid im wesentlichen wasserunlöslich ist.

12. Kombination nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, wobei das Alkaloidglycosid Tomatin ist.

13. Kombination nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, ein Protein oder Oligopeptid ist.

14. Kombination nach Anspruch 13, wobei das Protein oder Oligopeptid zu einem T-Zellepitop äquivalent ist.

15. Kombination nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei das Mittel, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren, schwach immunogen ist.