DE69836429T2 - Impstoffe gegen Hepatitis B die Öl in Wasser Emulsionen enthalten - Google Patents

Impstoffe gegen Hepatitis B die Öl in Wasser Emulsionen enthalten Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Öl-in-Wasser-Emulsionszusammensetzungen, ihre Verwendung in der Medizin, insbesondere ihre Verwendung zur Steigerung der Immunreaktionen gegen Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen, und Verfahren zu ihrer Herstellung; die Öl-in-Wasser-Emulsionen umfassen ein metabolisierbares Öl, ein Sponin und ein Sterin.
  • Die Induktion cytotoxischer T-Zell (CTL)-Antworten tritt natürlicherweise während der Infektion einer Zielzelle auf oder bei den unkontrollierten Synthese eines Tumorantigens, wobei die enzymatische Degradierung des Zielantigens im Cytoplasma der Zelle stattfindet. Dieses Phänomen ermöglicht cytoplasmischen Peptiden, die von einem Pathogen stammen, oder von einem tumorspezifischen Antigen, den Th1 (endogenen Antigenprozessierungs-)-Weg zu betreten, und auf der Oberfläche der Zelle in Assoziierung mit einem MHC-Klasse-I-Molekül präsentiert zu werden. Wenn ein Impfstoffantigen nicht in das Cytoplasma der Wirtszelle eindringt, dann kann es von der Zelle aufgenommen werden, und den exogenen Antigenprozessierungsweg beschreiten und schließlich auf der Oberfläche von Zellen in Assoziierung mit einem MHC-Klasse-II-Molekül präsentiert werden. Die alternative Route führt im allgemeinen zu T-Helfer-Reaktionen und Antigen-spezifischen Antikörper-Reaktionen.
  • Nach einer konventionellen Impfung mit einer Untereinheit oder nichtlebenden Impfstoffen, betritt das Antigen im allgemeinen nicht das Cytoplasma einer Wirtszelle und daher wird es den endogenen Antigenprozessierungsweg nicht betreten und schließlich keine CTL-Antwort induzieren. Die CTL-Induktion korreliert vermutlich mit Th-1-Cytokinprofil-Antworten, spezifisch mit der Sekretion von IFN-γ und IL-2. Die IFN-γ-Sekretion wird mit schützenden Reaktionen gegen intrazelluläre Pathogene, einschließlich Parasiten, Bakterien und Viren, in Verbindung gebracht. Die Aktivierung von Leukocyten durch IFN-γ verstärkt das Abtöten intrazellulärer Pathogene und erhöht die Expression von Fc-Rezeptoren. Direkte Cytotoxizität kann ebenfalls auftreten, insbesondre in Synergie mit Lymphotoxin (ein weiteres Produkt von TH1-Zellen). IFN-γ ist ebenfalls sowohl ein Induktor und ein Produkt von NK-Zellen, welche die intrinsischen Hauptschutzeffektoren sind. TH1-artige Reaktionen, entweder durch IFN-γ oder anderen Mechanismen, wie vorzugsweise Hilfe für Maus-IgG2a, und menschliches IgG1, Immunglobulin-Isotypen.
  • Die internationale Patentanmeldung Nr. WO 95/17210 offenbart ein Adjuvans-Emulsionsystem, basierend auf Squalin, α-Tocopherol und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (TWEEN 80), gegebenenfalls formuliert mit den Immunstimulantien QS21 und/oder 3D-MPL. Diese Adjuvansformulierung ist ein potenter Induktor eines breiten Spektrums an Immunreaktionen.
  • Diese Öl-in-Wasser-Emulsionen, sind potente Induktoren Th1-artiger Immunreaktionen, wenn sie mit 3 De-O-acyliertem Monophosphoryllipid A (3D-MPL) und QS21 formuliert werden. Daher stimuliert dieses System, wenn es mit einem Antigen assoziiert ist, vorzugsweise den Subisotypen von IgG, der mit Th1-Reaktion assoziiert ist (z.B. Maus-IgG2a und Menschen-IgG1) und wird signifikante Niveaus der IFN-γ-Produktion und der Antigen-spezifischen CTL-Reaktionen induzieren. Die Beobachtung, dass basische Öl-in-Wasser/QS21/3D-MPL-Formulierungen starke CTL-Reaktionen induzieren können, ist signifikant, da diese Reaktionen in einigen Tiermodellen gezeigt haben, dass sie gegen Erkrankungen einen Schutz auslösen.
  • Immunologisch aktive Saponinfraktionen (z.B. Quil A) mit Adjuvansaktivität, die aus der Rinde des südamerikanischen Baums Quillaja Saponaria Molina stammen, sind im Stand der Technik bekannt. Derivate von Quil A, z.B. QS21 (eine HPLC-gereinigte Fraktion, die von Quil A stammt) und das Verfahren zu dessen Herstellung ist im US-Patent Nr. 5,057,540 offenbart. Neben QS21 (bekannt als QA21) sind auch andere Fraktionen, wie QA17 offenbart. Die Verwendung solcher Saponine in isolierter Form wird vom Nachteil begleitet, dass lokale Necrose, d.h. lokalisierter Gewebstod, an der Injektionsstelle auftritt, und dadurch zu Schmerzen führt.
  • 3 De-O-acyliertes Monophosphoryllipid A ist ein gut bekanntes Adjuvans, dass von Ribi Immunochem, Montana hergestellt wird. Chemisch wird es häufig als Gemisch aus 3 De-O-acyliertem Monophosphoryllipid A entweder mit 4, 5 oder 6 acylierten Ketten geliefert. Es kann durch die Verfahren, die in GB 2122204 B erklärt werden, hergestellt werden. Eine bevorzugte Form von 3 De-O-acyliertem Monophosphoryllipid A ist in Form einer Emulsion mit kleiner Partikelgröße von weniger als 0,2 μm Durchmesser, und dessen Herstellungsverfahren ist offenbart im europäischen Patent Nr. EP 0 671 948 B1 .
  • Damit eine Öl-in-Wasser-Zusammensetzung für die Verabreichung an den Menschen geeignet ist, muss die Öl-Phase des Emulsionssystems ein metabolisierbare Öl umfassen. Squalen (2,6,10,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaen) ist ein ungesättigtes Öl, welches in großen Mengen in Hai leberöl gefunden wird und in geringeren Mengen in Olivenöl, in Weizenkeimöl, Reiskeimöl und Hefe und ist das Öl zur Verwendung in der Erfindung. Squalen in ein metabolisierbares Öl aufgrund der Tatsache, dass es ein Zwischenprodukt der Biosynthese von Cholesterin ist (Merck-Index, 10. Ausgabe, Eintrag Nr. 8619).
  • Öl-in-Wasser-Emulsionen sind per se im Fachgebiet bekannt und es wurde vorgeschlagen, dass sie als Adjuvanszusammensetzungen nützlich sind ( EP 0399843 ).
  • Die Öl-in-Wasser-Emulsionen, die in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 95/17210 beschrieben sind, haben offensichtlich größere Vorteile gegenüber konventionellen nicht-Th1-induzierenden Adjuvantien. Jedoch hat der Einschluss von QS21 dieses potente Adjuvans bisher reaktogen gemacht, was zu Schmerzen an der Injektionsstelle führt.
  • Formulierungen, die QS21 mit einem Sterin umfassen, sind aus der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/EP96/01464 bekannt, aber keine Öl-in-Wasser-Emulsion sind in diesem Dokument offenbart. Sterine sind im Fachgebiet gut bekannt, beispielsweise ist Cholesterin wohlbekannt und ist beispielsweise im Merck-Index, 11. Ausgabe, S. 341 als natürlich auftretendes Sterin, das in Tierfett gefunden wird, offenbart.
  • WO 97/01640 offenbart Impfstoffe gegen Hepatitis C-Virus, die auf Öl-in-Wasser-Emulsionen beruhen.
  • WO 96/33739 offenbart Impfstoffformulierungen, die ein Saponin und ein Sterin enthalten.
  • WO 90/03184 offenbart ISCOM-Matrices mit immunmodulierender Aktivität.
  • WO 98/15287 offenbart Impfstoffformulierungen, die Alaun, ein Antigen und eine immunologisch wirksame Saponinfraktion und ein Sterin enthalten.
  • Die vorstelligen Erfinder haben herausgefunden, dass Öl-in-Wasser-Formulierungen, die ein Sterin und QS21 enthalten, reduzierte lokale Reaktogenität nach Injektion in einem Wirt, bezogen auf vergleichbare Emulsionen haben, die ohne ein Sterin formuliert sind. Das ist überraschend, da Sterine, die öl-löslich sind, sich erwartungsgemäß im Kern des Öltröpfchens auflösen, während andererseits QS21 primär mit der wässrigen Phase assoziiert erwartet wird. Deswegen könnte erwartet werden, dass das Sterin physisch vom QS21 getrennt sei. Nichtsdestotrotz sind diese Formulierungen überraschend weniger reaktogen als solche Öl-in-Wasser-Emulsionen, die nicht Sterin enthalten.
  • Daher wird eine Impfstoffzusammensetzung, die ein Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen oder ein Derivat davon umfasst, bereitgestellt, eine Öl-in-Wasser-Emulsion und ein Saponin, wobei die Öltröpfchen dieser Öl-in-Was ser-Emulsion Squalen und ein Sterin umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cholesterin, β-Sitosterin, Stigmasterin, Ergosterin und Ergocalciferol. Besonders bevorzugte Ausführungsformen hiervon schließen Zusammensetzungen ein, in denen das Saponin die nicht-toxische Fraktion von Quil A ist, die als QS21 bekannt ist, und wobei das Sterin Cholesterin ist. Eine solche Zusammensetzung kann auch andere Immunmodulatoren umfassen einschließlich: α-Tocopherol und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (TWEEN 80) sowie 3D-MPL. Das Einschließen von Cholesterin in die Formulierung reduziert die lokale Reaktogenität der Zusammensetzung, sobald sie in einem Empfänger injiziert worden ist, stark. Andere Sterine, die leicht als Alternativen für Cholesterin dienen können, schließen β-Sitosterin, Stigmasterin, Ergosterin und Ergocalciferol ein.
  • Solche erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden als leistungsfähige Impfstoffe verwendet. Vorteilhafterweise induzieren sie bevorzugt eine Th1-Antwort.
  • Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schließen Zusammensetzungen ein, die (zusammen mit dem Antigen) eine Öl-in-Wasser-Emulsion, ein Saponin und ein Sterin umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass ein reduziertes Reaktogenizitätsprofil nach Verabreichung an einen Wirt im Vergleich mit dem Reaktogenizitätsprofil induziert wird, das nach der Verabreichung der gleichen Zusammensetzung beobachtet wird, bei der das Sterin weggelassen worden ist.
  • Vorhergehende Beispiele von Öl-in-Wasser-Adjuvans-Emulsionen, die in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 95/17210 offenbart sind, schlossen große Mengen an Squalen ein. Das Verhältnis von Squalen:Saponin (G/G) in solchen Impfstoffpräparaten lag im Bereich von 240:1. Ein zusätzlicher Nutzen, den die Zugabe von Cholesterin verleiht, ist die Gelegenheit, das Gesamtniveau der Öl-in-Wasser-Emulsion zu reduzieren. Das führt zu reduzierten Herstellungskosten, einer Verbesserung der Gesamtverträglichkeit der Impfung und auch qualitativer und quantitativer Verbesserungen der resultierenden Immunantworten wie beispielsweise verbesserter IFN-γ-Produktion. Dem gemäß umfasst das Adjuvanssystem der vorliegenden Erfindung typischerweise ein Squalen:Saponin-Verhältnis (G/G) im Bereich von 200:1 bis 300:1, und die vorliegende Erfindung kann auch in einer "Niedrig-Öl"-Form verwendet werden, wobei der bevorzugte Bereich 1:1 bis 200:1 ist, bevorzugt 20:1 bis 100:1 und am meisten bevorzugt im wesentlichen 48:1, wobei dieser Impfstoff die vorteilhaften Adjuvanseigenschaften aller Bestandteile bewahrt, mit einem stark reduzierten Reaktogenizitätsprofil. Dem gemäß haben die besonders bevorzugten Ausführungsformen ein Verhältnis von Squalen:QS21 (G/G) im Bereich von 1:1 bis 250:1, ein ebenfalls bevorzugter Bereich ist 20:1 bis 200:1, bevorzugt 20:1 bis 100:1 und am meisten bevorzugt im wesentlichen 48:1.
  • Die erfindungsgemäßen Emulsionssysteme haben eine kleine Öltröpfchengröße im Submikrometerbereich. Vorzugsweise werden die Öltröpfchengrößen in dem Bereich von 120 bis 750 nm liegen, und am meisten bevorzugt von 120 bis 600 nm Durchmesser.
  • Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind für monovalente oder polyvalente Impfstoffe geeignet. Zusätzlich kann die Öl-in-Wasser-Emulsion 3 De-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL) und/oder Polyoxyethylensorbitantrioleat (wie beispielsweise SPAN 85) enthalten. Zusätzlich ist die bevorzugte Form von 3 De-O-acyliertem Monophosphoryllipid A in der internationalen Patentanmeldung offenbart, die unter der Nr. 92116556 – SmithKline Beecham Biologicals s.a. veröffentlicht worden ist.
  • Derivate des Hepatitis B-Oberflächenantigens sind im Gebiet gut bekannt und schließen u.a. die PreS1-, PreS2-S-Antigene ein, die in den europäischen Patentanmeldungen EP-A-414 374; EP-A-0304 578 und EP 198-474 beschrieben sind.
  • Das Verhältnis des QS21 zu Cholesterin (G/G), welches in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vorhanden ist, wird in einem Bereich von 1:5 bis 1:20 sein, häufig im wesentlichen 1:10.
  • Das Verhältnis von QS21:3D-MPL (G/G) liegt typischerweise in einer Größenordnung von 1:10 bis 10:1, bevorzugt 1:5 bis 5:1 und häufig im wesentlichen 1:1. Der bevorzugte Bereich für eine optimale Synergie beträgt 2,5:1 bis 1:1 3D-MPL:QS21. Typisch für die Verabreichung an den Menschen sind QS21 und 3D MPL in einem Impfstoff in dem Bereich von 1 μg bis 100 μg, bevorzugt 10 μg bis 50 μg je Dosis vorhanden. Typischerweise wird die Öl-in-Wasser-Emulsion von 2 bis 10% Squalen, von 2 bis 10% α-Tocopherol und von 0,4 bis 2% Polyoxyetylensorbitanmonooleat (TWEEN 80) umfassen. Vorzugsweise ist das Verhältnis von Squalen:α-Tocopherol gleich oder weniger als 1, da dies stabilere Emulsionen ergibt. Sorbitantrioleat (SPAN 85) kann ebenfalls in einer Größenordung von 0,5 bis 1% vorhanden sein. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, dass die erfindungsgemäßen Impfstoffe weiter einen Stabilisator enthalten, z.B. andere Emulgatoren/Tenside, einschließlich Caprylsäure (Merck Index 10. Ausgabe, Eintrag Nr. 1739) von denen Tricaprylin eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist.
  • Die Impfstoffherstellung ist im allgemeinen in New Trends and Developments in Vaccines, herausgegebenen von Voller et al., University Park Press, Baltimor, Maryland, USA 1978, beschrieben. Die Konjugierung von Pro teinen in Makromoleküle ist von Likhite, US-Patent 4,372,995 und von Armor et al., US-Patent 4,474,757 offenbart.
  • Die Proteinmenge in jeder Impfstoffdosis wird als eine Menge ausgewählt, die eine immunprotektive Antwort ohne signifikante Nebenwirkungen typischer Impfstoffe ausgewählt. Eine solche Menge variiert in Abhängigkeit davon, welches spezifische Immunogen benutzt wird und wie es präsentiert wird. Im allgemeinen wird es erwartet, dass jede Dosis 1 bis 1.000 μg Protein umfasst, bevorzugt 1 bis 500 μg, bevorzugt 1 bis 100 μg, von denen 1 bis 50 μg der meist bevorzugte Bereich ist. Die optimale Menge eines bestimmten Impfstoffs kann durch Standardstudien, einschließlich der Beobachtung einer geeigneten Immunantwort in Individuen bestimmt werden. Nach einer ersten Impfung können die Individuen eine oder mehrere Booster-Immunisierungen, die in geeigneter Weise zeitlich getrennt sind, erhalten.
  • In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Impfstoff bereitgestellt, der wie hier geschrieben ist, zu Verwendung in der Medizin dient.
  • Ebenfalls durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zum Verhindern der Reaktogenizität eines Saponins, bevorzugt QS21, welches eine Öl-in-Wasser-Emulsion enthält, bereitgestellt, und umfasst die Zugabe eines Sterins, bevorzugterweise Cholesterin zur Ölphase der Öl-in-Wasser-Emulsion in einem erfindungsgemäßen Impfstoff.
  • QS21 in wässriger Lösung ist dafür bekannt, mit der Zeit in eine Adjuvans-inaktive Form, QS21-H, zersetzt zu werden, wobei die Zersetzung durch –OH-Hydrolyse des wässrigen Mediums verursacht wird. Ein solcher Zerfall kann auftreten, wenn das QS21 in der wässrigen Phase eines Öl-in-Wasser-Adjuvans vorhanden ist. Überraschenderweise ist gefunden worden, dass die Zugabe von Cholesterin zur Ölphase der Öl-in-Wasser-Emulsion die Wirkung hat, QS21 in seiner aktiven Form zu bewahren, mit den offensichtlichen Vorteilen für die Lagerfähigkeit der Adjuvans/Impfstoffformulierung. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Stabilisieren eines Saponinderivats, bevorzugterweise QS21, in seiner nicht-hydrolysierten Adjuvanzaktiven Form bereit, wenn das QS21 in einem Adjuvans vorhanden ist, das auf einer Öl-in-Wasser-Emulsion basiert. Dieses Verfahren umfasst die Zugabe von Sterin, bevorzugt Cholesterin zur Ölphase der Öl-in-Wasser-Emulsion in einem Impfstoff gemäß der Erfindung.
  • Ebenfalls durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird das Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffpräparats, umfassend die Zugabe von Cholesterin zu dem Squalen, gefolgt von der Emulgierung der Ölphase; wobei in die Emulsion QS21, und ein Antigen und gegebenenfalls 3D-MPL und α-Tocopherol zugegeben wird.
  • Das erfindungsgemäße Impfstoffpräparat kann verwendet werden, um einen Säuger, der für eine Hepatitis B-Infektion empfänglich ist oder daran leidet, zu schützen oder zu behandeln, indem der Impfstoff über den systemischen oder mukösen Weg verabreicht wird. Diese Verabreichungen können die Injektion via intramuskuläre, intraperitoneale, intradermale oder subkutane Wege einschließen; oder mittels muköser Verabreichung in die oralen/alimentär, respiratorischen, urogenitalen Trakte.
  • BEISPIEL 1
  • HERSTELLUNG DER ÖL-IN-WASSER-EMULSIONSADJUVANTIEN
  • Die Öl-in-Wasser-Emulsions-Adjuvansformulierungen, die in folgenden Beispielen verwendet werden, wurden jeweils so gemacht, dass sie den folgenden Öl-in-Wasser-Emulsionsbestandteil umfassen: 5% Squalen, 5% α-Tocopherol, 2,0% Polyoxyethylensorbitanmonooleat (TWEEN 80).
  • Die Emulsion wurde wie folgt als 2-Fach-Konzentrat hergestellt. Alle Beispiele, die in den immunologischen Experimenten verwendet wurden, sind durch die Zugabe von Extra-Bestandteilen und Verdünnungsmitteln verdünnt worden, um eine Einfachkonzentration zu ergeben (entsprechend einem Squalen:QS21-Verhätnis (G/G) von 240:1) oder weitere Verdünnungen davon.
  • Kurzgefasst wird TWEEN 80 in phosphatgepufferter Salzlösung gelöst, um eine 2%ige Lösung in PBS zu ergeben. Um 100 ml einer 2-fach-konzentrierten Emulsion zu ergeben, werden 5 ml DL-α-Tocopherol und 5 ml Squalen gevortext, um sie gut zu durchmischen. 95 ml PBS/TWEEN-Lösung wird zu dem Öl hinzugegeben und gut durchmischt. Die resultierende Emulsion wird dann durch eine Spritzennadel geleitet und schließlich unter Verwendung einer M110S-Mikrofluidics-Maschine mikrofluidisiert. Die resultierenden Öltröpfchen haben eine Größe von ungefähr 145 bis 180 nm (ausgedrückt als z av, gemessen durch PCS) und werden als "ganze Dosis" an SB62 bezeichnet.
  • Diese Formulierungen können durch einen 0,2 μl-Filter steril filtriert werden. Die anderen Adjuvans/Impfstoffbestandteile (QS21, 3D-MPL oder Antigen) werden zu der Emulsion in einer einfachen Zumischung hinzugegeben.
  • Die Antigen-haltigen Impfstoffe, die hier verwendet werden, werden entweder mit ganzer Dosis an SB62-Adjuvans formuliert, um ein hohes Squalen:QS21-Verhältnis (240:1) zu ergeben, oder mit einer geringeren Menge der Emulsion formuliert, um eine Formulierung mit geringem Verhältnis (48:1). Diese Adjuvansformulierungen werden als SB62 und SB62' bezeichnet. Andere Impfstoffe wurden durch die Zugabe von Cholesterin zur Ölphase der Emulsion vor dem Emulgierprozess formuliert, wobei das QS21:Cholesterinverhältnis 1:10 ist (bezeichnet durch die Zugabe des Buchstaben "c").
  • BEISPIEL 2
  • REAKTOGENITÄTSSTUDIEN MIT ÖL-IN-Wasser-EMULSIONS-ADJUVANTIEN MIT QS21 UNTER OPTIONALER ZUGABE VON CHOLESTERIN
  • Es wurde eine Studie durchgeführt, um die lokale und systemische Reaktogenität verschiedener Adjuvansformulierungen zu untersuchen. Öl-in-Wasser-Impfstoffadjuvanzien, die QS21 enthalten, sind dafür bekannt, dass sie nach der Verabreichung an einen Wirt moderate Nebenwirkungen als klinische Symptome hervorrufen. Diese Untersuchung verglich das resultierende reaktogene Profil mit dem, das durch die gleiche Adjuvansformulierung erzeugt wird, die außerdem Cholesterin enthält.
  • EXPERIMENTELLES VERFAHREN
  • Die getesteten Öl-in-Wasser-Emulsionen wurden unter Verwendung von Techniken, die im Beispiel 1 beschrieben sind, hergestellt. Gruppen von 5 SPF-gezüchteten Neuseeland White-Albino-Kaninchen wurde durch intramuskuläre Injektion in den rechten Hinterbeinmuskel (gastrocnemius) mit 0,5 ml der Adjuvanspräparate inokuliert. Vor und nach der Impfung wurden Proben genommen, um den Prozentsatz der Polymorpho-Neutrophilen im Blut (als Ausmaß der Entzündung, %PMN) und Creatinphosphokinase (als Maß für Muskelschäden, CPK) zu untersuchen. Die Tiere wurden 3 Tage nach der Impfung für die histologische Untersuchung der Injektionsstelle geopfert. Tabelle 1 GRUPPEN DER IN BEISPIEL 2 VERWENDETEN KANINCHEN
    Figure 00080001
  • Fußnoten:
    • SB62 = ganze Dosis der Öl-in-Wasser-Emulsion
    • SB62' = 1/5 Dosis SB62
    • SB62'c = SB62', enthaltend Cholesterin in der Ölphase
    • PBS0 = Phosphatgepufferte Salzlösung
  • Die CPK-Niveaus, in Einheiten pro Liter (E/L) wurden aus dem Serum zu verschiedenen Zeitpunkten während des Experiments unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien (Abbot) und eines Abbot Vision System-Analysers bestimmt. %PMN in Blutproben wurden gleichzeitig unter Verwendung ei nes Sysmex K-1000 Heamatology anaylser (Toa Medical Electronics Co.) bestimmt.
  • Drei Tage nach der Injektion bestimmte die Post-Mortem-Inspektion der Kaninchen die Läsionsgröße an der Injektionsstelle und die lokale Histopathologie.
  • ERGEBNISSE
  • CPK-NIVEAUS VOR UND NACH DER IMPFUNG
  • Tabelle 2 MITTLERE CPK-KONZENTRATIONEN IN KANINCHEN
    Figure 00090001
  • Aus der Tabelle 2 oben kann gesehen werden, dass Adjuvansformulierungen, die QS21 enthalten, einen merklichen Anstieg der Plasma-CPK-Niveaus am Tag 1 nach der Injektion zeigen, was auf ein signifikantes Niveau der Muskelschädigung an der Injektionsstelle hindeutet (Gruppen 19, 21 und 22).
  • Die Zugabe von Cholesterin zu Adjuvansformulierung verdrängt diese Wirkung und daher wurden keine Anstiege der CPK nach der Impfung gesehen (Gruppe 20). Die Ergebnisse, die unter Verwendung dieses Adjuvans erreicht wurden, sind sehr ähnlich denen, die mit PBS oder SB62 erzielt wurden, welches allein verabreicht wurde (siehe die Gruppen 23, 24 und 25).
  • PROZENTSATZ PMN
  • Tabelle 3 VERÄNDERUNGEN DER BLUT-%-PMN
    Figure 00100001
  • Der Prozentsatz an Blut-PMN wird als Indikator der Stärke der lokalen Entzündungsreaktion in Reaktion auf die Impfung herangezogen. Wie aus der Tabelle 3 gesehen werden kann, betrifft die Zugabe von Cholesterin zu der QS21-haltigen Adjuvansformulierung nicht signifikant des Entzündungsprozess am Tag 1 nach der Impfung, trotz der Abwesenheit von Muskelschäden, wie in Tabelle 2 gezeigt wird. Die Zugabe von Cholesterin betrifft nicht den Entzündungsprozess, der durch SB62 induziert wird. TABELLE 4 HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG
    Figure 00100002
    Figure 00110001
  • Fußnoten:
    • Läs = Läsion
    • Necro = Necrose
    • Infiltr = Lymphocyteninfiltration
    • Oedem = Ödem
    • Haemo = Hämorrhagie
    • Rhabdo = Rhabdomyolyse
  • Einteilung:
    • 0 = keine Anzeichen
    • 1 = sehr leicht
    • 2 = leicht
    • 3 = moderat
    • 4 = schwer
    • + = vorhanden
    • s = punktuell
    • – = kein Anzeichen
  • Die histologische Untersuchung an der Injektionsstelle bestätigt die früheren CPK-Daten, die in Tabelle 2 gezeigt werden, in der Hinsicht, dass die lokale Schädigung signifikant durch die Zugabe von Cholesterin zu der Adjuvansformulierung reduziert war.
  • Eine schwere Necrose, begleitet mit einer moderaten Rhabdomyolyse, Ödem und Hämorrhagie wurde bei allen Impfstoffadjuvantien beobachtet, die "nicht-gequenchtes" QS21 enthalten (Gruppen 19, 21 und 22). Diese Zeichen waren mit sehr großen Läsionen an der Injektionsstelle assoziiert.
  • Das Einschließen von Cholesterin (Gruppe 20) reduzierte das makroskopische Auftreten von Läsionen (in nur 2 der 5 Kaninchen), wenn es mit denen der Gruppe 19 verglichen wurde und reduzierte signifikant den Schweregrad anderer histopathologischer Anzeichen, wenn sie vorhanden waren.
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN
  • Aus den oben beschriebenen Ergebnissen wird klar, dass die Verwendung der Adjuvansformulierungen, die QS21 umfassen, oder sogar QS21 alleine, ein signifikantes Ausmaß lokaler Schädigung an der Injektionsstelle verursachen. Diese schädigende Wirkung kann erfolgreich durch das Einschließen von Cholesterin in der Adjuvansformulierung verhindert werden.
  • BEISPIEL 3
  • IMMUNOGENIZITÄTSSTUDIEN MIT REKOMBINANTEM ANTIGEN S,L*
  • In Balb/C-Mäusen wurde eine Studie durchgeführt, um die Immunogenizität der verschiedenen S,L*-haltigen Formulierungen zu vergleichen. S,L* ist ein zusammengesetztes Antigen, das ein modifiziertes Oberflächenantigen-L-Protein (L*) und ein S-Protein umfasst, die beide vom Hepatitis B-Virus stammen (HB). Dieses zusammengesetzte Antigen ist Gegenstand der europäischen Patentanmeldung Nr. EP 0 414 374 .
  • Zahlreiche Formulierungen mit verschiedenen Verhältnissen von Squalen:QS21, ggf. mit Cholesterin in einem QS21:Cholesterin-Verhältnis von 1:10 wurden mit S,L* kombiniert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit verglichen, humorale und zellvermittelte Immunantworten zu induzieren (Cytokinproduktion und CTL). Diese Öl-in-Wasser-Adjuvansemulsionen wurden unter Verwendung von Verfahren, die im Beispiel 1 beschrieben sind, hergestellt. S,L*, das auf Aluminiumhydroxid (AlOH3) induziert wurde, wurde als eine Th2-induzierende Kontrolle verwendet.
  • Kurz gefasst wurden Gruppen von 10 Mäusen intramuskulär 4-mal in 3-wöchigen Intervallen mit 2 μg lyophilisiertem S,L*, kombiniert mit verschiedenen Öl-in-Wasser-Emulsionssystemen (SB62), immunisiert. 14 Tage nach der vierten Immunisierung wurde die Produktion von Cytokinen (IL5 und IFN-γ) und die CTL-Aktivität nach der in vitro Restimulierung von Milz- und Lymphknotenzellen mit S,L*-Antigen analysiert. Die Antikörperantwort gegen S,L* und das Isotypenprofil, das induziert wurde, wurden mittels ELISA 21 Tage nach II und 14 Tage post IV überwacht.
  • GRUPPEN DER MÄUSE
  • Gruppen der 10 Balb/C-Mäuse wurden intramuskulär mit den Formulierungen, die unten beschrieben sind, immunisiert. SB62 wurde zusammen mit dem Antigen in einem normalen (240:1, SB62) oder niedrigen (48:1, SB62') Verhältnis von Squalin:QS21 formuliert, ggf. unter Zugabe von Cholesterin (c). TABELLE 5 GRUPPEN DER IN BEISPIEL 3 BESCHRIEBENEN MÄUSE
    Figure 00130001
  • IMMUNISIERUNGSSCHEMA
  • Die Tiere wurden an den Tagen 0, 21, 42 und 63 intramuskulär in das Bein immunisiert (50 μl bei allen Gruppen, außer bei der Gruppe 5, in der 100 μl injiziert wurden). Aus dem retrosorbitalen Sinus wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach den Immunisierungen Blut entnommen. Am Tag 77 wurden Tiere jeder Gruppe geopfert, die Milzen und Lymphknoten, die die Injektionsstelle umgeben (ileale Lymphnoten) wurden für die in vitro Restimulierung herausgenommen. Pools aus 3 oder 4 Milzen und 1 Pool aus 10 LN wurden für jede Gruppe gewonnen und separat in den in vitro Assays behandelt.
  • MAUS-SEROLOGIE
  • Die Quantifizierung der Anti-HBs-Antikörper wurde durch einen Elisa unter Verwendung von HB-Oberflächenantigen als Beschichtungsantigen durchgeführt. Antigen und Antikörperlösungen wurden zu 50 μl pro Vertiefung verwendet. Das Antigen wurde auf eine finale Konzentration von 1 μg/ml in PBS verdünnt und über Nacht bei 4°C auf die Vertiefungen einer 96 Well Mikrotiterplatte (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dänemark) adsorbiert. Die Platten wurden dann für 1 Stunde bei 37°C mit PBS, das 1% Rinderserumalbumin und 0,1% Tween 20 gewaschen (Sättigungspuffer) enthält, inkubiert. Zweifache Verdünnungen der Seren (ausgehend von einer 1/100-Verdünnung) in dem Sättigungspuffer, wurden zu den HBs-beschichteten Platten gegeben und für 1 Stunde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden viermal mit PBS 0,1% Tween 20 und Biotin-konjugierten Anti-Maus-IgG1, -IgG2a, -IgG2b oder -Ig (Amersham, UK), welche auf 1/1000 Sättigungspuffer verdünnt waren, wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 1 Stunde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden wie oben gewaschen und für 20 Minuten mit ei ner Lösung aus o-Phenylendiamin (Sigma) 0,04% H2O2 0,03% in 0,1% TWEEN 20, 0,05 M Citratpuffer pH 4,5 inkubiert. Die Reaktion wurde durch H2SO4 2N gestoppt und bei 492/620 nm ausgelesen Die ELISA-Titer wurden durch eine Referenz von SoftmaxPro (unter Verwendung von vier Parametergleichungen) berechnet und in EU/ml ausgedrückt.
  • T-ZELLENPROLIFERATION
  • 2 Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse getötet, die Milzen und Lymphknoten wurden aseptisch in Pools entfernt (3 oder 4 Organe pro Pool für Milzzellen, 1 Pool aus 10 Organen für LNC). Die Zellsuspensio nen wurden in RPMI 1640-Medium (GIBCO), enthaltend 2 mM L-Glutamin, Antibiotika, 5 × 10–5 M 2-Mercaptoethanol und 1% syngenes normales Mausserum hergestellt. Die Zellen wurden bei einer Endkonzentration von 2 × 106 Zellen pro ml (bei LNC oder SPC) in 200 μl in Rundboden-96 Well-Platten mit verschiedenen Konzentrationen (10-0,03 μg/ml) an S,L*-Antigen (25D84) kultiviert. Jeder Test wurde vierfach durchgeführt. Nach 96 Stunden Kultur bei 37°C unter 5% CO2 wurden die Zellen für 18 Stunden mit 3H-Thymidin beladen (Amersham, UK, 5 Ci/mmol) zu 0,5 μCi/Well und dann mit einem Zellernter auf Glasfaserfilter geerntet. Die eingebaute Radioaktivität wurde in einem Flüssig-Szintillationszählgerät gemessen. Die Ergebnisse werden als cpm ausgedrückt (mittlerer cpm in vier Wells) oder als Stimulationsindizes (mittlerer cpm in Kulturen der Zellen mit Antigen/mittlerer cpm in Zellkulturen ohne Antigen).
  • CYTOKINPRODUKTION
  • 2 Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse getötet, Milzen und Lymphknoten wurden aseptisch in Pools entfernt (3 oder 4 Organe pro Pool für Milzzellen, 1 Pool von 10 Organen für LNC). Es wurden Zellsuspensionen in RPMI 1640-Medium (GIBCO), enthaltend 2 mM L-Glutamin, Antibiotika, 5 × 10–5 M 2-Mercaptoethanol und 5% fötales Kälterserum hergestellt. Die Zellen wurden bei einer Endkonzentration von 2,5 bis 5 × 106 Zellen pro ml (jeweils für LNC bzw. SPC) in 1 ml in Rundboden-24-Wells mit verschiedenen Konzentrationen (1-0,01 μg/ml) an S,L* (25D84) kultiviert. Die Überstände wurden 96 Stunden später geerntet und bis sie auf das Vorhandensein von IFNg und IL-5 mittels Elisa getestet wurden, eingefroren.
  • IFN-γ-PRODUKTION
  • Die Quantifizierung von IFNγ wurde durch Elisa unter Verwendung von Reagenzien von Genzyme durchgeführt. Proben und Antikörperlösungen wurden zu 50 μl pro Well verwendet. 96 Well-Mikrotiterplatten (Maxisorb Immunoplate, Nunc, Dänemark) wurden über Nacht bei 4°C mit 50 μl Hamster-Anti-Maus-IFNg verdünnt auf 1,5 μg/ml in Carbonatpuffer, pH 9,5, beschichtet.
  • Die Platten wurden dann für 1 Stunde bei 37°C mit 100 μl PBS, enthaltend 1% Rinderserumalbumin und 0,1% Tween 20 (Sättigungspuffer) inkubiert. Zweifachverdünnungen des Überstands der in vitro Stimulation (beginnend bei 1/2) in Sättigungspuffer, wurden zu den Anti-IFNg-beschichteten Platten hinzugegeben und für 1 Stunde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden 4-mal mit PBS Tween 0,1% (Waschpuffer) gewaschen und Biotin-konjugierter Ziege-anti-Maus-IFNg, verdünnt in Sättigungspuffer, auf eine Endkonzentration von 0,5 μg/ml wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschschritt wurde AMDEX-Konjugat (Amersham) verdünnt auf 1/10.000 in Sättigungspuffer für, 30 Minuten bei 37°C zugegeben. Die Platten wurden wie oben gewaschen und mit 50 μl TMB (Biorad) für 10 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde mit 0,4 N H2SO4 gestoppt und bei 450 nm gelesen. Die Konzentrationen wurden unter Verwendung einer Standardkurve (Maus-IFNγ-Standard) mittels SoftmaxPro (Vier-Parametergleichung) berechnet und in pg/ml ausgedrückt.
  • Il-5-PRODUKTION
  • Die Quantifizierung von IL5 wurde durch Elisa unter Verwendung von Reagenzien von Pharmingen durchgeführt. Proben und Antikörperlösungen wurden zu 50 μl pro Well verwendet. 96 Well-Mikrotiterplatten (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dänemark) wurden über Nacht bei 4°C mit 50 μl Ratte-anti-Maus-IFNg verdünnt auf 1 μg/ml in Carbonatpuffer, pH 9,5, beschichtet. Die Platten wurden dann für 1 Stunde bei 37°C mit 100 μl PBS, enthaltend 1% Rinderserumalbumin und 0,1% Tween 20 (Sättigungspuffer) inkubiert. Zweifachverdünnungen des Überstands der in vitro Stimulation (beginnend bei 1/2) in Sättigungspuffer, wurden zu den Anti-IL5-beschichteten Platten hinzugegeben und für 1 Stunde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden 4-mal mit PBS Tween 0,1% (Waschpuffer) gewaschen und Biotin-konjugierter Ratte-anti-Maus-IL5 in Sättigungspuffer auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml verdünnt, wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde AMDEX-Konjugat (Amersham), verdünnt auf 1/10.000 in Sättigungspuffer, für 30 Minuten bei 37°C zugegeben. Die Platten wurden wie oben gewaschen und mit 50 μl TMB (Biorad) für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde mit 0,4 N H2SO4 gestoppt und bei 450 nm gelesen. Die Konzentrationen wurden unter Verwendung einer Standardkurve (Maus-IL5) durch SoftmaxPro (Vier-Parametergleichung) berechnet und in pg/ml ausgedrückt.
  • CTL-INDUKTION
  • 2 Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse getötet, die Milzen aseptisch in Pools von 3 oder 4 Mäusen entfernt (2 Pools von 3 und 1 Pool von 4 Mäusen je Gruppe). Die Zellsuspensionen wurden in RPMI 1640-Medium (GIBCO), enthaltend 2 mM L-Glutamin, Antibiotika, 5 × 10–5 M 2-Mercaptoethanol und 5% fötales Kälterserum hergestellt. Die Zellen wurden bei einer Endkonzentration von 2 × 106 Zellen pro ml in 10 ml Medium, enthaltend 2 μg/ml S,L* und 1,25% ConA sup (25 cm2 Falcon Flaschen) kultiviert und 8 Tage bei 37°C unter 5% CO2 inkubiert.
  • CTL-ASSAY
  • Am Tag vor dem CTL-ASSay (d7) wurden die Zielzellen durch Inkubation von P815-Zellen (106 Zellen/ml) mit S,L* oder Peptid S28-39 zu 10 μg/ml hergestellt. Nach 1 Stunde Inkubation in 15 ml Falcon-Röhrchen in einem geringen Volumen wurden die Zellen in 24 Well-Platten transferiert und ON bei 37°C inkubiert.
  • Am Tage des Assays wurden 2 × 104 S,L* und S28-39-gepulste P815-Zellen und P815-S zentrifugiert in 50 μl FCS resuspendiert und mit 75 μl 51Cr (375 μCi) für 1 Stunde bei 37°C (Schütteln alle 15') resuspendiert. Die Zellen werden dann 4-mal mit 10 ml Komplettmedium gewaschen und nach dem vierten Waschen für 30' bei 4°C inkubiert. Die Zellen werden dann zentrifugiert und auf eine Konzentration von 2 × 104 Zellen/ml resuspendiert.
  • Die Effektorzellen werden dann zentrifugiert, gezählt und auf 2 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Die dreifachen seriellen Verdünnungen der Effektorzellen werden in 96 V-Bodenplatten durchgeführt, beginnend bei einer Konzentration von 2 × 105 Zellen/Vertiefung/100 μl.
  • 2 × 103 Zielzellen in 100 μl werden zu den Effektorzellen in Triplikaten hinzugegeben. Spontane und maximale Freisetzung werden durch Inkubieren der Zielzellen mit Medium bzw. Triton X100 3% bestimmt.
  • Die Platten werden für 3' bei 700 Upm zentrifugiert und für 4 Stunden für 37°C inkubiert. Nach der Inkubationszeit werden 50 μl Überstand aus jeder Vertiefung in Luma-Platten überführt und über Nacht getrocknet, bevor sie in einem Top-Count-Szintillationszählgerät gezählt werden. Die Ergebnisse werden als spezifische Lyse ausgedrückt und wie folgt berechnet: %SR = (Durchschnitt cpm-Probe – Durchschnitt cpm-Medium/Durchschnitt cpm-Maximum – Durchschnitt cpm-Medium) × 100
  • ERGEBNISSE
  • SEROLOGIE
  • Die humoralen Reaktionen (Ig und Isotypen) wurden durch einen Elisa unter Verwendung von HB-Oberflächenantigen als Beschichtungsantigen gemessen. Nur der Zeitpunkt: 21 Tage post II wurde untersucht. Die Ergebnisse werden in 1 und 2 gezeigt.
  • 1 zeigt die Titer der Anti-Hepatitis B-Virus-Antikörperreaktionen (Ig), die sowohl für individuelle Mausseren und als Durchschnitt (21 Tage post II) ausgedrückt werden.
  • 2 zeigt die Sub-Isotypverteilung von HBs-spezifischem IgG im Serum der geimpften Mäuse.
    • – Wie in 1 gesehen werden kann, induzieren SB62-abhängige Formulierungen viel höhere Antikörpertiter als die S,L*-Alaun-Formulierung.
    • – Die Analyse der durchschnittlichen Titer der individuellen Seren legt nahe, dass höhere Antikörpertiter mit SB62c- und SB62'c-Formulierungen erzielt werden (ungefähr 2-fach höhere Antikörpertiter als SB62 und SB62').
    • – Die statistische Analyse der individuellen Seren (Anova1-Test Newman Keuls) zeigte keinen signifikanten Unterschied der Antikörpertiter, die durch SB62c und SB62'c induziert wurden oder gleichermaßen zwischen den Antikörpertitern, die durch SB62 und SB62'c induziert wurden.
    • – Das Sub-Isotypen-Verteilungsprofil (wie in 2 gezeigt ist) ist vergleichbar mit allen SB62-verwandten Formulierungen (25 bis 30% IgG2a), wobei Alaun nur 4% IgG2a induziert.
  • ZELLVERMITTELTE IMMUNANTWORTEN
  • Die zellvermittelten Immunreaktionen (Lymphoproliferation, IFNγ/IL5-Produktion und CTL) wurden am Tag 14 post IV nach in vitro Restimulierung von Milz und ilealen Lymphknotenzellen mit S,L*-Antigen gemessen.
  • CYTOKINPRODUKTION
  • Die Cytokinproduktion (IFN-γ und IL-5) ist nach 96 Stunden einer in vitro Restimulierung von Milzzellen und ilealen Lymphknotenzellen mit S,L* gemessen worden. Die Ergebnisse werden in den 3 bis 6 gezeigt.
  • 3 zeigt die Ergebnisse der Analyse von IFN-γ-Produktion durch Milzzellen (Mittelwert der mit drei Pools/Gruppe erhaltenen Daten).
  • 4 zeigt die Ergebnisse der Analyse der IL-5-Produktion durch Milzzellen (Mittelwert der mit drei Pools/Gruppe gewonnenen Daten).
  • 5 zeigt die Ergebnisse der Analyse der IFN-γ-Produktion durch ileale Lymphknotenzellen (Mittelwert der Daten, die mit drei Pools/Gruppe gewonnen werden).
  • 6 zeigt die Ergebnisse der Analyse der IL-5-Produktion durch ileale Lymphknotenzellen (Mittelwert der Daten, die mit drei Pools/Gruppe gewonnen werden). Tabelle 6 VERHÄLTNIS VON IFN-γ:IL-5-PRODUZIERENDEN ZELLEN, DIE IN MILZZELLEN NACHGE-WIESEN WERDEN
    Figure 00180001
  • Diskussion
  • Ein IFN-γ:IL-5-Verhältnis > 1 legt klar nahe, dass eine pro-TH1-Reaktion durch SB62-verwandte Formulierungen (berechnet auf 10 μg/ml S,L*) (siehe Tabelle 6) induziert wird.
  • Die stärkste IFN-γ-Produktion wird nach Restimulierung von Milzzellen von Tieren erzielt, die mit S,L* SB62' und SB62'c immunisiert wurden. SB62c-Formulierungen induzieren stärkere IFN-γ-Produktion als die entsprechenden SB62-Formulierungen (Milzzellen).
  • Höhere Konzentrationen an IL-5 werden durch Tiere produziert, die mit S,L* SB62c-Formulierungen statt S,L* SB62-Formulierungen, die kein Cholesterin enthalten, produziert. S,L* Alaun-immunisierte Tiere produzierten die höchsten IL-5-Konzentrationen.
  • Kein signifikanter Unterschied wird zwischen ilealen Lymphknotenzellen-IFN-γ-Produktion zwischen SB62- und SB62c-Formulierungen beobachtet.
  • Die Stärkste IFN-γ-Produktion wird nach Restimulierung von Milzzellen von mit S,L* SB62'c-immunisierten Tieren erzielt.
  • CYTOTOXISCHE T-ZELLENREAKTION
  • S,L*-spezifische CTL-Reaktionen, die in den Milzzellen von Mäusen zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung beobachtet werden, sind in 7 gezeigt.
  • 7 zeigt die CTL-Aktivität von Milz-T-Zellen, die in vitro für 7 Tage mit S,L*-Antigen stimuliert wurden (Mittelwert%-spezifische Lyse von drei Pools).
  • DISKUSSION
  • S,L*-spezifische CTL wird durch die Impfung mit allen Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierungen stimuliert.
  • Eine stärkere CTL-Reaktion wird mit Formulierungen beobachtet, die SB62'-Emulsionen enthalten, wenn auf das limitierende E/T-Verhältnis, wie 3/1, geschaut wird.
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN
    • 1. Das TH1-artige Profil der Immunreaktion, welches durch alle SB62-verwandten Formulierungen induziert wird, wird weiter durch das IFN-γ/IL-5-Verhältnis bestätigt.
    • 2. Ein vergleichbares Isotypenprofil (25 bis 30% IgG2a) wird mit allen SB62-verwandten Formulierungen erzielt, was die Induktion einer TH1-typischen HBs-spezifischen Immunreaktion nahe legt.
    • 3. Alle SB62-verwandten Formulierungen induzieren spezifische CTL mit einer leichten Verbesserung, die bei der Verabreichung von SB62' gesehen wird.
    • 4. Kein signifikanter Unterschied wird zwischen den Antikörpertitern gesehen, die auf die Immunisierung mit SB62c und SB62' folgen.
    • 5. Die stärkste IFN-γ-Produktion wird nach der Immunisierung mit SB62'c beobachtet.
  • Tabelle 7 ZUSAMMENFASSENDE TABELLE DER IMMUNPARAMETER, DIE DURCH DIE IMPFSTOFFFORMULIERUNG INDUZIERT WERDEN, DIE IN BEISPIEL 3 BESCHRIEBEN WIRD
    Figure 00190001
  • BEISPIEL 4: STABILISIERUNG VON QS21 DURCH ZUGABE VON CHOLESTERIN
  • Es ist zuvor beschrieben worden, dass QS21-H das Hydrolyseprodukt von QS21 ist, das als Adjuvans nicht länger wirksam ist. Es wird durch die Spaltung des QS21-Moleküls durch OH– in der wässrigen Lösung gebildet. Diese Reaktion tritt auf, wenn der pH-Wert des wässrigen Mediums über einem Wert von 6,5 liegt, und wird bei höherer Temperatur beschleunigt. Die Öl-in-Wasser-Emulsionen, die in dieser Patentanmeldung beschieben werden (z.B. SB62) sind dafür bekannt, dass sie eine stabilisierende Wirkung aufweisen, so dass die Hydrolyse von QS21 in QS21-H gehemmt wird. Durch die Verdünnung der Öl-in-Wasser-Emulsion in Gegenwart von konstantem QS21, verlieren sie ihre stabilisierende Eigenschaft und das QS21 degeneriert in die inaktive Form QS21-H. Überraschenderweise bewahren Emulsionen, die zusätzliches Cholesterin enthalten, welche bei einem 1/1-Verhältnis keine verbesserte QS21- Stabilität zeigen, die stabilisierende Wirkung selbst bei einer 1/5-Verdünnung.
  • QS21 und QS21-H werden direkt in der Emulsion untersucht. Dies wird durch das chemische Derivatisieren der vollständigen Formulierung erreicht, und durch Durchführen eines selektiven Extraktionsschritts, welcher das QS21 löst, aber die meisten interferierenden Matrixverbindungen zurück lässt. Dieser Test basiert auf HPLC, und die Verbindungen werden dansyliert. Die Dansylierung wird durch Trocknen einer Probe der Emulsion durchgeführt und durch das Zugeben von 100 μl von 3,5 mg Dansylhydrazin/ml C/M 2/1 und 100 μl 1:4 Essigsäure:C/M 2/1, in dieser Reihenfolge. Die Mischung wird gut gevortext und für 2 Stunden bei 60°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird in der Speedvac getrocknet. Es wird in 500 μl 30% ACN in H2O rekonstruiert und zweimal bei 14.000 Upm für 2 Minuten zentrifugiert. Dann werden die Überstände in einem Autosampler-Röhrchen gesammelt. Eine Standardkurve wird durch Herstellen von QS21 und QS21-H in einer Mischung erstellt, die die gleichen Verbindungen wie die Emulsion der Studie enthält.
  • Der HPLC-Test wird auf einer Vydac 218TP54 5 μm Partikelgröße C18RP-Säule, 250*4,6 mm laufen lassen. Die Lösungsmittel sind A:H20 + 0,05% TFA (Trifluoressigsäure) und B:Acetonitril + 0,05% TFA. Die Gradiententabelle ist:
    Figure 00200001
  • Die Fließrate beträgt 1 ml/min. Die Detektion wird mittels Fluoreszenz gemacht, bei einer Anregung von 345 nm und einer Emission bei 515 nm. 50 μl von sowohl der Probe und der Standards wird injiziert. Die Säulenerwärmung wird auf 37°C für diese Trennung eingestellt. Die Peaks für QS21, QS21-iso und QS21-H werden auf dem Chromatogramm unterscheidbar.
  • Eine Reihe von Proben mit der folgenden Zusammensetzung wurde analysiert:
    Figure 00210001
  • Der Test für QS21/QS21-H wurde nach Inkubation der Proben zu verschiedenen zeitlichen Intervallen und Temperaturen (4°C und 37°C) durchgeführt. Die Daten für 1 Monat bei 37°C in diesem Modell korrelieren gut mit der Stabilität von QS21 nach verlängerter Lagerung bei 4°C (z.B. 2 Jahre). TABELLE 8 HPLC QS21-ASSAY: % DES ÜBER DIE ZEIT ERZEUGTEN QS21-H
    Figure 00210002
  • Diese Ergebnisse in der oben gezeigten Tabelle zeigen klar (sowohl für 7 Tage und 1 Monat) die Wirkung der Zugabe eines Sterins, in diesem Fall Cholesterin, zum SB62' bei Aufrechterhaltung der Stabilität von QS21.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Aus den obigen Beispielen ist klar, dass die vorliegende Erfindung eine Öl-in-Wasser-Emulsion umfasst, die vorzugsweise starke Th1-artige Immunreaktionen induziert. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen beschrieben, schließen Zusammensetzungen ein, die eine Öl-in-Wasser-Emulsion, ein Saponin und ein Sterin umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass ein reduziertes Reaktogenitätsprofil nach Verabreichung an einen Wirt im Vergleich mit dem Reaktogenitätsprofil induziert wird, das nach Verabreichung der gleichen Zusammensetzung beobachtet wird, bei der das Sterin weggelassen wird. Die Zugabe von Cholesterin beeinflusst jedoch quantitativ oder qualitativ nicht die Immunreaktionen die induziert werden.

Claims (15)

  1. Impfstoffzusammensetzung, umfassend ein Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen oder ein Derivat davon, eine Öl-in-Wasser-Emulsion und ein Saponin, wobei die Öltröpfchen dieser Öl-in-Wasser-Emulsion Squalen und ein Sterin umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cholesterin, β-Sitosterin, Stigmasterin, Ergosterin und Ergocalciferol.
  2. Impfstoffzusammensetzung, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Sterin Cholesterin ist.
  3. Zusammensetzung, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2 beansprucht, wobei das Saponin ein Derivat von QuilA ist.
  4. Zusammensetzung, wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei dieses Derivat von QuilA QS21 ist.
  5. Impfstoffzusammensetzung, wie in Anspruch 4 beansprucht, wobei das Verhältnis von QS21:Cholesterin im Bereich von 1:1 bis 1:10 (G/G) liegt.
  6. Impfstoffzusammensetzung, wie in irgendeinem der Ansprüche 4 oder 5 beansprucht, wobei das Verhältnis von Squalen:QS21 im Bereich von 1:1 bis 250:1 (G/G) liegt.
  7. Impfstoffzusammensetzung, wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei das Verhältnis von Squalen:QS21 im wesentlichen 48:1 (G/G) ist.
  8. Impfstoffzusammensetzung, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, weiter enthaltend einen oder mehrere andere Immunmodulatoren.
  9. Impfstoffzusammensetzung, wie in Anspruch 8 beansprucht, in der einer oder mehrere andere Immunmodulatoren ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus 3D-MPL und α-Tocopherol.
  10. Impfstoffzusammensetzung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, wobei die Öl-in-Wasser-Emulsion Öltröpfchen umfasst, die einen Durchmesser haben, der weniger als 1 Mikrometer beträgt.
  11. Impfstoffzusammensetzung, wie in Anspruch 10 beansprucht, wobei die Öl-in-Wasser-Emulsion Öltröpfchen umfasst, deren Durchmesser im Bereich von 120 bis 750 nm liegt.
  12. Impfstoffzusammensetzung, wie in Anspruch 11 beansprucht, wobei die Öl-in-Wasser-Emulsion Öltröpfchen umfasst, deren Durchmesser im Bereich von 120 bis 600 nm liegt.
  13. Impfstoffzusammensetzung, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 beansprucht, zur Verwendung als Medikament.
  14. Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 beansprucht, umfassend das Mischen von (a) einer Öl-in-Wasser-Emulsion, wobei die Öltröpfchen Squalen und ein Sterin umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cholesterin, β-Sitosterin, Stigmasterin, Ergosterin und Ergocalciferol; (b) QS21; und (c) eines Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigens oder eines Derivats davon.
  15. Verwendung einer Zusammensetzung, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 beansprucht, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Menschen, der dafür anfällig ist, unter einer Hepatitis B-Virusinfektion zu leiden.
DE69836429T 1997-09-05 1998-09-02 Impstoffe gegen Hepatitis B die Öl in Wasser Emulsionen enthalten Expired - Fee Related DE69836429T2 (de)

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DE69836429T Expired - Fee Related DE69836429T2 (de) 1997-09-05 1998-09-02 Impstoffe gegen Hepatitis B die Öl in Wasser Emulsionen enthalten

Country Status (9)

Country Link
US (1) US6372227B1 (de)
EP (2) EP1723966A3 (de)
JP (1) JP2001515870A (de)
AU (1) AU9623898A (de)
CA (1) CA2302637A1 (de)
DE (1) DE69836429T2 (de)
ES (1) ES2276476T3 (de)
GB (1) GB9718901D0 (de)
WO (1) WO1999012565A1 (de)

Families Citing this family (141)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2646776B1 (fr) * 1989-05-12 1994-06-03 Pasteur Institut Utilisation de preparations vaccinantes a base d'adenyl cyclase ou de bacteries les produisant en tant qu'antigenes protecteurs contre les effets des bordetella
US6620414B2 (en) * 1992-03-27 2003-09-16 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US20010053365A1 (en) * 1995-04-25 2001-12-20 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines
UA56132C2 (uk) † 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
WO1999011241A1 (en) * 1997-09-05 1999-03-11 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
US7087236B1 (en) * 1998-09-01 2006-08-08 Merrion Research I Limited Method for inducing a cell-mediated immune response and improved parenteral vaccine formulations thereof
ES2242604T3 (es) 1999-02-26 2005-11-16 Chiron Corporation Microemulsiones con macroparticulas y microparticulas adsorbidas.
IL145982A0 (en) * 1999-04-19 2002-07-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
GB9908885D0 (en) * 1999-04-19 1999-06-16 Smithkline Beecham Biolog Vccine
GEP20053446B (en) 1999-05-13 2005-02-25 Wyeth Corp Adjuvant Combination Formulations
GB9923176D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US8017590B1 (en) 1999-10-22 2011-09-13 Sanofi Pasteur Limited Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens
DE60039715D1 (de) * 1999-11-19 2008-09-11 Csl Ltd Hcv-impfstoff zusammensetzungen
EP1282702B1 (de) 2000-05-10 2006-11-29 Sanofi Pasteur Limited Durch mage minigene kodierte immunogene polypeptide und ihre verwendungen
PL211151B1 (pl) 2000-10-18 2012-04-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Kompozycja immunogenna oraz zastosowanie połączenia saponiny, oligonukleotydu immunostymulującego i lipopolisacharydu
US20030138434A1 (en) * 2001-08-13 2003-07-24 Campbell Robert L. Agents for enhancing the immune response
US7361352B2 (en) 2001-08-15 2008-04-22 Acambis, Inc. Influenza immunogen and vaccine
US7351413B2 (en) 2002-02-21 2008-04-01 Lorantis, Limited Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis
US6861410B1 (en) * 2002-03-21 2005-03-01 Chiron Corporation Immunological adjuvant compositions
US20050250175A1 (en) * 2002-08-02 2005-11-10 Takehiko Nomura Bacterial cell wall skeleton component preparaion
WO2004037189A2 (en) 2002-10-23 2004-05-06 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Methods for vaccinating against malaria
WO2004060396A2 (en) 2002-12-27 2004-07-22 Chiron Corporation Immunogenic compositions containing phospholpid
PL378001A1 (pl) * 2003-01-29 2006-02-20 Pfizer Products Inc. Szczepionki przeciw Bordetella bronchiseptica dla psów
RU2541809C2 (ru) * 2003-04-04 2015-02-20 Зоетис Пи ЛЛК Микрофлюидизированные эмульсии "масло в воде" и композиции вакцины
US7972645B2 (en) * 2003-12-01 2011-07-05 Academia Sinica Dioscorea extracts for enhancing immune system
AU2005230708B2 (en) * 2004-04-05 2009-01-15 Zoetis Services Llc Microfluidized oil-in-water emulsions and vaccine compositions
CA2564180A1 (en) * 2004-04-22 2005-11-03 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Pharmaceutical preparation containing bacterial cell wall skeleton component
GB0417494D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
BRPI0608430A2 (pt) * 2005-02-16 2009-12-29 Novartis Vaccines & Diagnostics Inc composição adjuvante, processo para preparar a mesma e uso da mesma
ES2357968T3 (es) * 2005-02-16 2011-05-04 Cornell Research Foundation, Inc. Composiciones para desencadenar una respuesta inmunitaria contra mycobacterium avium subespecie paratuberculosis.
GB0503337D0 (en) 2005-02-17 2005-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions
GB0504436D0 (en) 2005-03-03 2005-04-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2006100110A1 (en) 2005-03-23 2006-09-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel composition
EP2305701A1 (de) * 2005-07-01 2011-04-06 Forsyth Dental Infirmary for Children Assays zur Detektion von Tuberkuloseantigenen und Impfstoffe
CN103690945A (zh) * 2005-08-02 2014-04-02 诺华疫苗和诊断有限公司 降低含油佐剂和含表面活性剂抗原之间的干扰
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
US10842867B2 (en) 2005-11-04 2020-11-24 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
KR20080069232A (ko) * 2005-11-04 2008-07-25 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 에스.알.엘. 스플리트 인플루엔자 백신에 대한 보조제로서 유리 수성상계면활성제를 갖는 에멀젼
GB0522765D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
KR101515078B1 (ko) 2005-12-22 2015-04-24 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
EA020459B1 (ru) 2006-03-30 2014-11-28 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Иммуногенная композиция
US9839685B2 (en) 2006-04-13 2017-12-12 The Regents Of The University Of Michigan Methods of inducing human immunodeficiency virus-specific immune responses in a host comprising nasally administering compositions comprising a naonemulsion and recombinant GP120 immunogen
US10138279B2 (en) 2006-04-13 2018-11-27 Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for Bacillus anthracis vaccination
MX2009000660A (es) 2006-07-17 2009-04-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna de influenza.
US20080014217A1 (en) * 2006-07-17 2008-01-17 Emmanuel Jules Hanon Influenza vaccine
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
AU2007354917B2 (en) 2006-09-26 2013-06-06 Access To Advanced Health Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
PT2086582E (pt) 2006-10-12 2013-01-25 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacina compreendendo uma emulsão adjuvante óleo em água
EP2433648A3 (de) 2006-10-12 2012-04-04 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Impfstoff mit einem Öl-in-wasser-emulsionshilfsstoff
LT2137210T (lt) 2007-03-02 2016-12-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Naujas būdas ir kompozicijos
CA2679720A1 (en) * 2007-03-09 2008-09-18 Merck & Co., Inc. Papillomavirus vaccine compositions
US9452209B2 (en) 2007-04-20 2016-09-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza vaccine
ES2552366T3 (es) 2007-06-26 2015-11-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacuna que comprende conjugados de polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae
WO2009016639A2 (en) 2007-08-02 2009-02-05 Biondvax Pharmaceuticals Ltd. Multimeric multiepitope influenza vaccines
KR20100068390A (ko) 2007-08-13 2010-06-23 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
CN106310293A (zh) 2007-09-27 2017-01-11 免疫疫苗技术有限公司 在包括连续疏水相的载体中的脂质体在体内输送多核苷酸中的应用
US20100209452A1 (en) * 2007-10-03 2010-08-19 Immunovaccine Technologies, Inc Compositions comprising an antigen, an amphipathic compound and a hydrophobic carrier, and uses thereof
PT2271360E (pt) 2008-04-16 2015-12-07 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacina
WO2009143524A2 (en) 2008-05-23 2009-11-26 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
AU2009253780B2 (en) * 2008-06-05 2014-08-14 Immunovaccine Technologies Inc. Compositions comprising liposomes, an antigen, a polynucleotide and a carrier comprising a continuous phase of a hydrophobic substance
GB0815872D0 (en) 2008-09-01 2008-10-08 Pasteur Institut Novel method and compositions
CN102223876A (zh) 2008-09-26 2011-10-19 纳米生物公司 纳米乳剂治疗性组合物及其使用方法
EA201500910A1 (ru) 2009-02-10 2016-04-29 Новартис Аг Вакцины против гриппа со сниженным количеством сквалена
US9265821B2 (en) * 2009-02-17 2016-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Inactivated dengue virus vaccine with aluminium-free adjuvant
WO2010132833A1 (en) 2009-05-14 2010-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Streptococcus vaccine compositions and methods of using the same
CA2764374C (en) 2009-06-05 2019-11-19 Infectious Disease Research Institute Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants
EP2442827B1 (de) 2009-06-16 2016-01-06 The Regents of the University of Michigan Nanoemulsionsimpfstoffe
GB0913680D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
GB0913681D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
EP2353609A1 (de) 2010-02-04 2011-08-10 Sanofi Pasteur Immunisierungszusammensetzungen und -verfahren
GB201003920D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Method of treatment
CA2800158C (en) * 2010-05-28 2020-07-21 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Vaccines comprising cholesterol and cpg as sole adjuvant-carrier molecules
GB201009671D0 (en) * 2010-06-10 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
US8658603B2 (en) 2010-06-16 2014-02-25 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for inducing an immune response
US9168292B2 (en) 2010-09-27 2015-10-27 Crucell Holland B.V. Heterologous prime boost vaccination regimen against malaria
CN103517713A (zh) 2011-02-22 2014-01-15 彼昂德瓦克斯医药有限公司 在改善的季节性和大流行性流感疫苗中的多聚体多表位多肽
NZ616304A (en) 2011-04-08 2016-01-29 Immune Design Corp Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
US10206996B2 (en) 2011-08-22 2019-02-19 Nanobio Corporation Herpes simplex virus nanoemulsion vaccine
CA2848163C (en) 2011-09-09 2020-10-27 Nanobio Corporation Nanoemulsion respiratory syncytial virus (rsv) subunit vaccine
PE20141547A1 (es) 2011-09-16 2014-10-25 Ucb Pharma Sa Anticuerpos neutralizantes frente a las exotoxinas principales tcda y tcdb de clostridium difficile
EP3311827B1 (de) * 2011-10-03 2023-01-04 Canqura Oncology Ab Nanopartikel, verfahren zur herstellung und verwendung davon als träger für amphipatische oder hydrophobe moleküle in bereichen der medizin mit verbindungen im zusammenhang mit der krebsbehandlung und lebensmitteln
SG11201401177WA (en) 2011-10-06 2014-04-28 Immunovaccine Technologies Inc Liposome compositions comprising an adjuvant that activates or increases the activity of tlr2 and uses thereof
US20130122038A1 (en) 2011-11-14 2013-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
WO2013083753A2 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Institut Pasteur Identification of a swine parecho-like virus and applications
TR201908003T4 (tr) 2012-02-07 2019-06-21 Infectious Disease Res Inst TLR4 agonistleri içeren gelişmiş adjuvan formülasyonları ve bunların kullanım metotları.
ES2702278T3 (es) 2012-04-01 2019-02-28 Technion Res & Dev Foundation Péptidos de inductor de metaloproteinasa de matriz extracelular (emmprin) y anticuerpos de unión
SI2850431T1 (en) 2012-05-16 2018-08-31 Immune Design Corp. Vaccine against HSV-2
KR20150036592A (ko) 2012-07-24 2015-04-07 사노피 파스퇴르 백신 조성물
WO2014016362A1 (en) 2012-07-24 2014-01-30 Sanofi Pasteur Vaccine compositions for prevention against dengue virus infection
EP2912186B1 (de) 2012-10-24 2021-01-06 Platelet Targeted Therapeutics LLC Gezielte thrombozytenbehandlung
BR112015012515B1 (pt) 2012-11-30 2023-04-11 Sanofi Pasteur Uso de antígenos, construções de ácido nucleico ou vetores virais capazes de expressar uma partícula do tipo vírus (vlp) da dengue e de uma vacina contra sarampo, uma vacina contra caxumba e uma vacina contra rubéola
EA032326B1 (ru) 2013-04-18 2019-05-31 Иммьюн Дизайн Корп. Монотерапия gla для применения в лечении рака
US9463198B2 (en) 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis
WO2015063611A2 (en) 2013-11-01 2015-05-07 University Of Oslo Albumin variants and uses thereof
WO2015070207A2 (en) 2013-11-11 2015-05-14 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Army Ama-1 epitopes, antibodies, compositions, and methods of making and using the same
WO2015071769A2 (en) 2013-11-13 2015-05-21 University Of Oslo Outer membrane vesicles and uses thereof
DK3069138T3 (en) 2013-11-15 2019-04-08 Univ Oslo Hf CTL PEPTID EPITOPES AND ANTIGEN-SPECIFIC T-CELLS, METHODS OF RECOGNITION THEREOF, AND APPLICATIONS THEREOF
US20160287696A1 (en) 2013-11-20 2016-10-06 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Pan pollen immunogens and methods and uses for immune response modulation
WO2015077442A2 (en) 2013-11-20 2015-05-28 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Grass pollen immunogens and methods and uses for immune response modulation
WO2015092710A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Contralateral co-administration of vaccines
BR112016015422A2 (pt) 2013-12-31 2017-10-24 Infectious Disease Res Inst formulações de vacina de frasco único
US20160030459A1 (en) 2014-01-21 2016-02-04 Immune Design Corp. Compositions and methods for treating allergic conditions
WO2015131053A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Alk-Abelló A/S Polypeptides derived from phl p and methods and uses thereof for immune response modulation
KR101696514B1 (ko) * 2014-08-18 2017-01-24 서울대학교산학협력단 신규한 온도 민감성 마이코박테리아 균주 및 이를 포함하는 마이코박테리아 감염증에 대한 백신 조성물
JP7158853B2 (ja) 2014-10-10 2022-10-24 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 対象における食物アレルギーまたは呼吸器アレルギーを処置するための、かつ上記対象の鼻腔内に投与するための免疫原性組成物
AU2015252119A1 (en) 2014-11-07 2016-05-26 Takeda Vaccines, Inc. Hand, foot, and mouth vaccines and methods of manufacture and use thereof
AR102547A1 (es) 2014-11-07 2017-03-08 Takeda Vaccines Inc Vacunas contra la enfermedad de manos, pies y boca y métodos de fabricación y su uso
WO2016141320A2 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Northwestern University Non-neuroinvasive viruses and uses thereof
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB201518668D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic Comosition
TN2018000301A1 (en) 2016-03-14 2020-01-16 Univ Oslo Engineered immunoglobulins with altered fcrn binding
WO2017158421A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 University Of Oslo Anti-viral engineered immunoglobulins
US11173207B2 (en) 2016-05-19 2021-11-16 The Regents Of The University Of Michigan Adjuvant compositions
GB201610599D0 (en) 2016-06-17 2016-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic Composition
WO2017221072A2 (en) 2016-06-21 2017-12-28 University Of Oslo Hla binding vaccine moieties and uses thereof
WO2018037045A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Fusion peptides with antigens linked to short fragments of invariant chain (cd74)
GB201614799D0 (en) 2016-09-01 2016-10-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions
BE1024774B1 (fr) 2016-09-29 2018-07-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions et procedes de traitement
WO2018096396A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 University Of Oslo Albumin variants and uses thereof
GB201620968D0 (en) 2016-12-09 2017-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adenovirus polynucleotides and polypeptides
SG11201911930SA (en) 2017-06-11 2020-01-30 Molecular Express Inc Methods and compositions for substance use disorder vaccine formulations and uses thereof
US11141377B2 (en) 2017-06-15 2021-10-12 Infectious Disease Research Institute Nanostructured lipid carriers and stable emulsions and uses thereof
US20220118076A1 (en) 2017-09-07 2022-04-21 University Of Oslo Vaccine molecules
EP3678699A1 (de) 2017-09-07 2020-07-15 University Of Oslo Impfstoffmoleküle
SG11202003800YA (en) 2017-11-03 2020-05-28 Takeda Vaccines Inc Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
GB201721582D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa S aureus antigens and immunogenic compositions
GB201721576D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hla antigens and glycoconjugates thereof
MX2020013553A (es) 2018-06-12 2021-02-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Polinucleotidos y polipeptidos de adenovirus.
MX2021001479A (es) 2018-08-07 2021-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novedosos procesos y vacunas.
WO2020128012A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Methods of inducing an immune response
TW202102256A (zh) 2019-03-05 2021-01-16 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 B型肝炎免疫法及組合物
WO2020243115A1 (en) 2019-05-25 2020-12-03 Infectious Disease Research Institute Composition and method for spray drying an adjuvant vaccine emulsion
EP3770269A1 (de) 2019-07-23 2021-01-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Quantifizierung von biokonjugatglykosylierung
WO2021205077A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Finncure Oy Mimetic nanoparticles for preventing the spreading and lowering the infection rate of novel coronaviruses
WO2024052882A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Access To Advanced Health Institute Immunogenic vaccine composition incorporating a saponin

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4806350A (en) * 1986-04-18 1989-02-21 Norden Laboratories, Inc. Vaccine formulation
NZ230747A (en) * 1988-09-30 1992-05-26 Bror Morein Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina
DE69225710T3 (de) 1991-07-25 2004-10-14 Idec Pharmaceuticals Corp., San Diego Anregung von antworten zytotoxischer t-lymphozyten
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
UA56132C2 (uk) * 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
GB9620795D0 (en) 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
GB9513261D0 (en) * 1995-06-29 1995-09-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccines

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Publication number Publication date
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