DE60032250T2

DE60032250T2 - Behandlung von Allergien

Info

Publication number: DE60032250T2
Application number: DE60032250T
Authority: DE
Inventors: Dr. Vera Mahler; Dr. Susanne Vrtala; Dr. Roland Suck; Dr. Oliver Cromwell; Dr. Helmut Fiebig; Dr. Dietrich Kraft; Dr. Rudolf Valenta
Original assignee: Biomay AG
Current assignee: Biomay AG
Priority date: 2000-12-28
Filing date: 2000-12-28
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2020-12-29
Also published as: HK1045941B; EP1219300B1; EP1219300A1; DE60032250D1; ATE347376T1; HK1045941A1; DK1219300T3; US20020187158A1

Description

Eine Allergie vom Typ I, eine genetisch determinierte Überempfindlichkeitserkrankung, befällt fast 25% der Bevölkerung. Die Symptome einer Allergie vom Typ I, die durch die Erzeugung von IgE-Antikörper gegen an sich harmlose Antigene verursacht wird, rangieren von allergischer Rhinokonjunktivitis, Asthma bronchiale, Dermatitis, gastroenterologischen Problemen bis zum anaphylaktischen Schock. Eine spezifische Immuntherapie, der einzige heilende Ansatz bezüglich einer Allergiebehandlung basiert auf der Verabreichung zunehmender Dosen der die Krankheit hervorrufenden Allergene, um einen Zustand des "Nichtansprechens" auf die verabreichten Allergene zu induzieren. Obwohl die klinische Wirksamkeit einer spezifischen Immuntherapie in zahlreichen kontrollierten klinischen Studien dokumentiert wurde, war es schwierig, den zugrunde liegenden Immunmechanismus zu untersuchen. Dies ist teilweise der Tatsache zuzuschreiben, dass sowohl die Behandlung allergischer Krankheiten als auch die Analyse klinischer und immunologischer Wirkungen mit natürlichen Allergenextrakten durchgeführt wurde, die aus Mischungen von Allergenen und nichtallergenen Komponenten bestehen, die schwierig zu standardisieren sind.
Ein Hauptnachteil einer spezifischen Immuntherapie ist das Risiko, lebensbedrohende anaphylaktische Nebenwirkungen aufgrund der Verabreichung von Allergenen zu erzeugen. Die anaphylaktischen Nebenwirkungen zu verringern und gleichzeitig die immunogenen Eigenschaften therapeutischer Allergenpräparate beizubehalten ist daher ein lange verfolgtes Ziel. Ein Weg, um die Immunogenizität eines therapeutischen Allergenpräparats zu erhöhen und die systemische Freisetzung an der Verabreichungsstelle zu verzögern, ist die Adsorption von Allergenextrakten an Adjuvantien (R. F. Sledge, US Naval Med. Bull. 1938, 36: 18, M. T. Mellerup et al., Clin. Exp. Allergy 2000, 30: 1423–1429). Alternativ vermindert auch eine chemische Modifikation von Allergenextrakten durch Konjugation mit Monomethoxypolyethylenglycol (mPEG) oder die Behandlung mit Glutaraldehyd oder Formaldehyd die allergene Aktivität (W. Y. Lee und A. H. Sehon, Nature 1977, 267: 618–619, D. G. Marsh et al., Immunol. 1970, 18: 705–722, W. J. Metzger et al., J Allergy Clin. Immunol. 1981, 68: 442–448).
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel zur Behandlung oder Verhütung von allergischen Leiden bereitzustellen.
Von den Erfindern wurde unerwarteterweise gefunden, dass es zur Induktion schützender blockierender Antikörper möglich ist, die Anzahl von Injektionen zu verringern und das Zeitintervall zwischen den einzelnen Verabreichungen zu erhöhen, wenn hohe Dosen modifizierter hypoallergener Derivate der allergischen Wildtypproteine verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch Methoden zur Behandlung von Menschen und Tieren in solchen Ländern, in denen solche Arten von Ansprüchen zulässig sind.
Die Erfindung betrifft daher die Verwendung eines Derivats eines allergenen Proteins, wobei das Derivat eine reduzierte allergene Aktivität hat im Vergleich zu einem allergenen Protein, aus dem es abgeleitet ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhütung eines allergischen Leidens, wobei das Medikament einem Patienten viermal verabreicht wird mit dem Vorbehalt, dass die Zeitintervalle zwischen den Verabreichungen mindestens 14 Tage sind.
Das allergene Protein kann irgendein bekanntes allergenes Protein sein, z.B. ein allergenes Protein aus einer pflanzlichen Allergenquelle. Allergene Proteine, die in Betracht gezogen werden können, sind bevorzugt Bet V 1, Hauptgraspollen (z.B. Gruppe 1, Gruppe 2, Gruppe 5 etc.), Milben (z.B. Der p 2), Bienengift (z.B. Phospholipase) und Tierhaarschuppenallergene (z.B. Cat: Fel d 1) oder Oligomere davon. Das verwendete Derivat kann irgendein Derivat eines allergenen Wildtypproteins sein. Z.B. kann das Derivat ein Fragment des Wildtypproteins oder ein Oligomer davon sein. Das Derivat kann auch ein Peptid oder ein Molekül sein, das durch Punktmutagenese erhalten wurde. Es ist auch möglich, natürlich vorkommendes allergenes Wildtypprotein chemisch zu modifizieren.
Das Derivat, das erfindungsgemäß verwendet wird, kann auf verschiedenen Wegen hergestellt werden. Es ist jedoch bevorzugt, dass das Derivat durch Expression einer rekombinanten DNA in einer Wirtszelle oder durch chemische Synthese hergestellt wird. Wenn die erste Methode verwendet wird, wird ein Polynucleotid, das das Derivat codiert, bereitgestellt und in eine Wirtszelle eingeführt. Die Wirtszelle kann eine prokaryotische Zelle, wie E. coli, oder eine eukaryotische Zelle, wie Hefe sein. Nach Transfektion oder Transformation der jeweiligen Zelle wird die Zelle kultiviert unter solchen Bedingungen, dass das gewünschte Derivat exprimiert wird. Schließlich wird das Expressionsprodukt aus den Zellen mit im Stand der Technik bekannten Methoden gewonnen.
Wenn letztere Methode verwendet wird, können auch bekannte Methoden zur Peptidsynthese, wie Festphasensynthese, verwendet werden.
Erfindungsgemäß wird das Medikament bzw. Arzneimittel an einen Patienten viermal verabreicht.
Es ist wesentlich für die vorliegende Erfindung, dass die Zeitintervalle zwischen den einzelnen Verabreichungen mindestens 14 Tage sind. Bevorzugt sind die Zeitintervalle mindestens 16 Tage, bevorzugter mindestens 18 Tage, am meisten bevorzugt mindestens 20 Tage. Es ist möglich, dass die Zeitintervalle zwischen den einzelnen Verabreichungen nicht variieren. Es ist jedoch bevorzugt, dass das Zeitintervall zwischen der vorletzten Anwendung und der letzten Anwendung des Medikaments länger ist als vorhergehende Zeitintervalle. Bei der am meisten bevorzugten Ausführungsform wird das Medikament an einen Patienten viermal verabreicht, wobei das Zeitintervall zwischen der dritten und vierten Verabreichung länger ist als das Zeitintervall zwischen der ersten und der zweiten bzw. der zweiten und der dritten Verabreichung.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird bei jeder Verabreichung im Wesentlichen die gleiche Dosis des Derivats, das in dem Medikament enthalten ist, dem Patienten verabreicht. Die Dosis kann mindestens 5 μg des Derivats, bevorzugt mindestens 10 μg und am meisten bevorzugt mindestens 20 μg sein.
Es ist auch bevorzugt, dass das Medikament weiterhin ein Adjuvans, wie Al(OH)₃ oder eine andere Verbindung oder Zusammensetzung, die die Immunantwort stimuliert, enthält.
Das Derivat eines allergenen Proteins, das erfindungsgemäß verwendet wird, hat eine verminderte allergene Aktivität im Vergleich zu dem jeweiligen allergenen Wildtypprotein, aus dem es abgeleitet ist. In der vorliegenden Anmeldung wird die allergene Aktivität eines Proteins oder einer Probe auf folgende Art und Weise bestimmt:
Die allergene Aktivität einer Probe wird bestimmt, indem die IgE-Antikörper, die in einem Testtier nach Verabreichung der Probe induziert werden, bestimmt werden. Die allergene Aktivität wird bevorzugt in geeigneten in-vitro- oder in-vivo-Tests definiert. Ein bevorzugter in-vitro-Test ist der Test zur Freisetzung basophilen Histamins, wie von Vrtala et al. in J. Clin. Invest. 1997, 99, Seiten 1673–1681 beschrieben. Alternativ wird die allergene Aktivität mit einem Hauttest bestimmt, wie bei van Hage-Hamsten et al. in J. Allergy Clin. Immunol. 1999, 104, Seiten 969–977 oder bei Pauli et al. in Clin. Exp. Allergy 2000, 30, Seiten 1076–1084, beschrieben.
Bevorzugt ist die allergene Aktivität des Derivats geringer als 50% der allergenen Aktivität des jeweiligen Wildtypproteins, aus dem es abgeleitet ist. Bevorzugter ist die allergene Aktivität des Derivats geringer als 25% des Wildtypproteins. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform hat das Derivat im Wesentlichen keine allergene Aktivität.
Es ist bevorzugt, dass das Derivat eines allergenen Proteins zur Induktion von IgG-Antikörpern führt. Es ist auch bevorzugt, dass das Derivat des allergenen Proteins bei Verabreichung keine signifikante IgE-Antwort hervorruft. Am meisten bevorzugt führt das Derivat eines allergenen Proteins bei Verabreichung zur Induktion von IgG-Antikörpern, die mindestens teilweise "schützende Antikörper" sind, d.h. Antikörper, die verhindern, dass IgE-Antikörper an das jeweilige Wildtypprotein binden, aus dem das Derivat abgeleitet ist.
Das Risiko, anaphylaktische Nebenwirkungen zu induzieren, stellt einen Hauptnachteil der allergenspezifischen Immuntherapie dar (M. T. Mellerup et al., Clin. Exp. Allergy 2000, 30: 1423–1429).
Die Impfpräparate, die modifizierte Allergenderivate enthalten, induzieren gewöhnlich starke IgG₁- und IgG_2a/b- und IgG₁-, IgG₂- und IgG₄-(Mensch)-Antworten auf das Wildtypallergen, wenn sie im Verlauf von acht wöchentlichen Injektionen mit zunehmenden Dosen gefolgt von einer weiteren Injektion mit der Erhaltungsdosis nach drei weiteren Wochen verabreicht werden. Sie induzieren keine signifikante IgE-Produktion.
Bemerkenswerterweise wurde gefunden, dass eine Reihe von drei Injektionen mit der Erhaltungsdosis, die in wöchentlichen Intervallen gegeben wurde, auch starke IgG₁- und IgG_2a/b-Antworten auf den Wildtyp induzierte, aber geringere IgE-Antworten als das Schema mit zunehmenden Dosen. Es kann daher möglich sein, Patienten mit einer Reihe von nur drei Injektionen zu behandeln, ähnlich wie bei anderen therapeutischen Impfstoffen.
Die Erkenntnis, dass genetisch modifizierte rBet-v-1-Derivate IgG1-Antikörper bei Mäusen induzierten, die mit den Hauptallergenen von Erlen- und Haselnusspollen kreuzreagierten, zeigt, dass sie nicht nur nützlich sind zur Behandlung von Birkenpollen, sondern auch zur Behandlung von mit Birke verwandten Allergien (z.B. Allergie gegen Erlen- und Haselnusspollen. In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass klinische Immuntherapiestudien mit Birkenpollenextrakt darauf hindeuten, dass die Behandlung mit Birkenpollenextrakt allergische Symptome auf Pollen von Bäumen der Ordnung Fagales und sogar Allergien auf Äpfel verringerten.
Noch wichtiger als die Tatsache, dass genetisch modifizierte rBet-v-1-Derivate IgG-Antikörper gegen rBet-v-1-Wildtyp und mit Bet v 1 homologe Allergene induzierten, ist vielleicht die Erkenntnis, dass von der Maus abgeleitete Antikörper die Bindung von IgE von gegen Birkenpollen allergischen Patienten an Bet v 1 stark hemmten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass genetisch modifizierte rBet-v-1-Derivate ausreichend strukturelle Elemente enthalten, um schützende IgG-Antworten in vivo zu induzieren, die entweder Epitope, die von menschlichen IgE-Antikörpern definiert werden, binden oder in der Nähe davon binden und dadurch die IgE-Bindung an das Wildtypallergen verhindern. Diese Erkenntnis ist wichtig im Hinblick auf die Bedeutung von allergenspezifischen blockierenden Antikörpern des IgG-Isotyps für ein erfolgreiches Ergebnis einer spezifischen Immuntherapie. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass blockierende Antikörper nicht nur allergeninduzierte Effektorzellaktivierung unterdrücken, sondern auch wirksam sind bei der Hemmung der durch IgE vermittelten Allergenpräsentation an T-Zellen und damit die Proliferation und Cytokinfreisetzung aus allergenspezifischen T-Zellen vermindern können.
Ein Vorteil der neuen Form der Impfung mit rekombinanten Allergenderivaten ist die Möglichkeit, die Behandlung so zuzuschneiden, dass sie der Empfindlichkeit des Patienten angepasst ist. Patienten erhalten ein pharmazeutisch definiertes Allergenpräparat anstelle von Allergenextrakten, die eine Vielzahl allergener und nichtallergener Komponenten enthalten. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Verabreichung hypoallergener Allergenderivate geringere anaphylaktische Nebenwirkungen induziert und daher die Behandlung mit wenigen Injektionen mit hoher Dosis zulässt. Letzteres begünstigt die Induktion einer Bet-v-1-spezifischen TH1/Th0-Antwort, die Erzeugung von blockierenden IgG-Antikörpern und vielleicht die Toleranz.
Die Erfindung bildet somit die Basis für Versuche zur klinischen Immuntherapie, die die Sicherheit und Wirksamkeit von hypoallergenen Allergenformulierungen basierend auf rekombinanter DNA oder synthetischer Technologie untersuchen und daher für eine neue Generation von rBet-v-1-Derivat-Impfformulierungen für gegen Birkenpollen allergische Patienten.
Beschreibung der Tabellen und Figuren:
Tabelle 1: Hemmung der Bindung von IgE-Antikörpern des Patienten an rBet v 1 durch Maus-Antiseren. An ELISA-Platte gebundenes rBet v 1 wurde mit einem repräsentativen Serum einer männlichen (m) oder weiblichen (f) Maus präinkubiert (zunehmend, Hochdosisschema), die mit Fragmenten, Trimer, rBet v 1 bzw. Al(OH)₃ immunisiert waren. Der Prozentanteil der Hemmung der IgE-Bindung wird für 10 Seren aus gegen Birkenpollen allergischen Patienten (P1 bis P10) dargestellt. Die rechte Spalte zeigt den Durchschnitt der Hemmung in Prozent der IgE-Bindung für die Patienten.
1: Immunisierungsschema. Gruppen von Mäusen erhielten entweder eine Reihe von 8 wöchentlichen Injektionen, die zunehmende Antigendosen enthielten (I) gefolgt von einer letzten Injektion am Tag 70 oder drei Hochdosisimmunisierungen (H) am Tag 0, 21 und 42. Serumproben wurden von allen Mäusen an den Tagen 0, 21, 42 und 77 gesammelt.
2: Mit Commassie gefärbtes Gel enthaltend rBet-v-1-Derivate nach unterschiedlichen Lagerbedingungen.
3a–c: IgG₁-, IgG_2a/b-, IgE-Antworten auf rBet v 1. Gruppen von jeweils 16 Mäusen wurden mit rBet-v-1-Fragmenten, Trimer, rBet-v-1-Wildtyp oder Al(OH)₃ (Insert) gemäß einem Schema mit zunehmender Dosis immunisiert. Mittlere OD-Werte (y-Achse) von 16 immunisierten Mäusen entsprechend den Antikörperpegeln sind dargestellt für die verschiedenen Blutentnahmen (x-Achse).
4: Induktion von IgG₁ auf Fragment 1 und 2. Mausseren, die von Mäusen erhalten wurden, die mit einer äquimolaren Mischung von rBet-v-1-Fragmenten (Gruppe I-1) immunisiert worden waren, wurden auf fragmentspezifische Antikörperantworten untersucht. ELISA-Platten wurden mit rBet-v-1-Fragment 1 oder Fragment 2 beschichtet. Mittlere OD-Werte (y-Achse) entsprechend der IgG₁-Reaktivität von Präimmun- und Immunseren von 16 Mäusen auf die Fragmente wurden mit der Standardabweichung dargestellt.
5: IgG₁-Antwort auf rBet v 1 nach Immunisierung gemäß dem Hochdosisschema. Gruppen von jeweils 16 Mäusen wurden mit rBet-v-1-Fragmenten, Trimer, rBet-v-1-Wildtyp oder Al(OH)₃ (Insert) gemäß dem Hochdosisschema immunisiert. Mittlere OD-Werte (y-Achse) von 16 immunisierten Mäusen entsprechend den Antikörperpegeln werden für die verschiedenen Blutentnahmen (x-Achse) dargestellt.
6: Induktion von IgE-Antworten auf rBet v 1 in verschiedenen Mausgruppen. Mittlere OD-Werte entsprechend Bet-v-1-spezifischen IgE-Pegeln (y-Achse) werden, für die unterschiedlichen Blutentnahmen (x-Achse), dargestellt für die Mausgruppen, die mit zunehmender Dosis oder gemäß Hochdosisschema behandelt wurden.
7: IgG₁-Reaktivität von Mäusen auf auf Nitrocellulose geblottete Pollenextrakte. Seren (p: Präimmunseren; i: Immunseren) von Mäusen, die mit rBet-v-1-Fragmenten, Trimer, rBet-v-1-Wildtyp oder Al(OH)₃ allein immunisiert worden waren, wurden auf Nitrocellulose geblotteten Birkenpollen-(7a), Erlenpollen-(7b) und Haselnusspollen-(7c)-Extrakten ausgesetzt. Molekularmassen sind in kDa auf der linken Seite gezeigt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1: Charakterisierung rekombinanter Allergenadsorbate
Rekombinante rBet-v-1-Fragmente, Trimer und rBet-v-1-Wildtyp ebenso wie Al(OH)₃-Adsorbate der Proteine wurden auf Stabilität bei drei unterschiedlichen Temperaturen getestet. SDS-PAGE lieferte keinen Hinweis auf einen Abbau der einzelnen Proteine im Verlauf der Untersuchung (2). Im Fall der Proteinadsorbate konnte kein Protein in den Überständen der zentrifugierten Proben der Aluminiumhydroxidsuspensionen unter Verwendung der Lowry-Methode nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Der pH-Wert der Fragmente war im Bereich zwischen 7,9 und 8,2 und der der Trimeradsorbate zwischen 8,0 und 8,3.
Wiederholte Dosistoxizitätsstudien lieferten keinen Hinweis auf histopathologische Veränderungen, die durch Allergenadsorbate an der Injektionsstelle oder systemisch induziert wurden außer denen, die durch das Adjuvans alleine induziert wurden. Bei einem Vergleich der hämatologischen Parameter in den unterschiedlichen Gruppen wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen gefunden, die aktive Präparate oder Adjuvans alleine erhielten.
Versuchsprotokoll
Erzeugung von Adsorbaten, die rekombinante Antigene enthalten
Rekombinantes Bet v 1a wurde in E. coli exprimiert und wie beschrieben (Hoffmann-Sommergruber et al., Protein Expr. Purif. 1997, 9: 33–39) gereinigt. Rekombinante Bet-v-1-Fragmente, F1 und F2, die aa 1–73 (MW 8100 Dalton) und aa 74–159 (MW 9461 Dalton) von Bei v 1 enthielten, wurden in E. coli exprimiert und gereinigt (S. Vrtala et al., J. Clin. Invest. 1997, 99: 1673–1681). Ein stabiles rekombinantes Trimer, das aus drei kovalent verbundenen Kopien von Bet v 1a bestand, wurde durch Ligierung von drei Kopien der Bet v 1a codierenden cDNA in Plasmid pET-17b und Expression des rekombinanten Trimers in E. coli BL21 (DE3) erzeugt (S. Vrtala et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 1999, 118: 218–219).
Rekombinantes Bet-v-1- und rBet-v-1-Trimer wurden in 144 mM Natriumchlorid, 10 mM Natriumhydrogencarbonat, 0,25% G/V Phenol pH 8,0 gelöst und mit steriler Aluminiumhydroxidsuspension (Superfos Biosector, Kopenhagen, Dänemark) gemischt, um Endkonzentrationen von 1 mg Al³⁺/ml und 100 μg Protein/ml zu erreichen. Ein Adsorbat, das eine äquimolare Mischung aus zwei Fragmenten enthielt, wurde erzeugt, indem die Adsorbate, die mit jedem Fragment hergestellt worden waren, vermischt wurden, wie vorher beschrieben, für rBet v 1 und Trimer im Verhältnis von 0,46 F1:0,54 F2, um äquimolare Konzentrationen der zwei Fragmente zu erzielen. Die entstehenden Adsorbate enthielten eine Endgesamtproteinkonzentration von 100 μg/ml.
Charakterisierung der Adsorbate:
Al(OH)₃-Adsorbate von rBet-v-1-Fragmenten, Trimer und rBet-v-1-Wildtyp wurden auf ihre Stabilität bei drei verschiedenen Temperaturen über längere Zeiträume getestet (5°C: 16 Wochen; 25°C: 12 Wochen; 40°C: 4 Wochen). Während der Lagerzeiträume wurde der Proteingehalt im Überstand der zentrifugierten Proben der Aluminiumhydroxidsuspensionen bestimmt unter Verwendung der Lowry-Methode (O. Lowry et al., J. Biol. Chem. 1951, 193: 265–275).
Beispiel 2: Antikörperantworten auf genetisch modifizierte hypoallergene rBet-v-1-Derivate, die im Verlauf von 9 Injektionen mit zunehmender Konzentration verabreicht wurden
Um zu untersuchen, ob Impfstoffe, die genetisch modifizierte rBet-v-1-Derivate enthielten, Antikörperantworten auf Bet v 1 induzierten, wurden Seren aus verschieden immunisierten Gruppen von Mäusen auf die Gegenwart von rBet-v-1-spezifischen IgG₁-, IgG_2a/b- und IgE-Antikörpern (3a bis c) analysiert. Die 3a bis c zeigen die mittleren OD-Werte, die für 16 Tiere aus jeder Gruppe bestimmt wurden, die das Schema mit zunehmender Dosis erhalten hatten.
Serumproben, die bei der vierten Blutentnahme (Tag 77) erhalten worden waren, enthielten die höchsten Gehalte an Bet-v-1-spezifischen IgG₁-Antikörpern (3a). Die stärkste IgG₁-Antwort wurde induziert durch wiederholte Impfung mit der rBet-v-1-Fragmentmischung und unmodifiziertes rBet v 1 gefolgt von Trimer (3a). Die mittlere rBet-v-1-spezifische IgG₁-Antikörperantwort (Werte für die optische Dichte: Mittelwert der kleinsten Fehlerquadrate) am Tag 77 waren 0,622 (Fragmente), 0,593 (rBet v 1), 0,411 (Trimer), 0,03 (Al(OH)₃). Alle Antworten waren signifikant höher als für Al(OH)₃ allein (p < 0,00001).
Von rekombinantem Allergen abgeleitete Impfstoffformulierungen induzierten auch IgG_2a/b-Antikörper (3b). rBet-v-1-Fragmentmischung und rBet-v-1-Wildtyp induzierten höhere Anteile an rBet-v-1-spezifischem IgG_2a/b als die Trimerformulierung (3b). Die mittleren IgG_2a/b-Antikörperantworten (Werte für die optische Dichte: Mittelwert der kleinsten Fehlerquadrate), die bei der vierten Blutentnahme erhalten wurden (Tag 77) waren 0,136 (rBet v 1), 0,103 (Fragmente), 0,065 (Trimer) und 0,049 (Al(OH)₃).
Messungen der rBet-v-1-spezifischen IgE-Antworten zeigten, dass alle drei rekombinanten auf Allergen basierenden Impfstoffe nur geringe IgE-Pegel induzierten (3c). Die mittlere rBet-v-1-spezifische IgE-Antikörperantwort (Mittelwert der kleinsten Fehlerquadrate), die bei der vierten Blutentnahme gemessen wurde (Tag 77) war 0,078 (Trimer), 0,060 (Fragmente, rBet v 1) und 0,042 (Al(OH)₃). Fragment-(p = 1,0), rBet-v-1-(p = 1,0) und Trimer-(p = 0,114) induzierten keine signifikante IgE-Induktion im Vergleich zu einer Adjuvans-Immunisierung.
Als nächstes wurde die Immunogenizität der zwei rBet-v-1-Fragmente verglichen, die als äquimolare Mischung in der Fragmentformulierung vorhanden waren. Mäuse, die mit der Fragmentmischung immunisiert worden waren, zeigten signifikant höhere IgG₁-Antworten auf Fragment 2, als auf Fragment 1 (p < 0,0001) (4).
Versuchsprotokoll für Beispiel 2 und 3:
Immunisierung der Mäuse:
144 (72 männliche, 72 weibliche) 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden von Charles River (Kislegg, Deutschland) erworben. Die Tiere wurden in der Tierpflegeeinheit des Departments für Pathophysiologie der Universität Wien nach den lokalen Richtlinien für Tierhaltung gehalten. Gruppen von jeweils 16 Mäusen (8 männlich, 8 weiblich) erhielten subcutane Immunisierungen in den Hals entweder in steigenden Dosen (I) oder als Hochdosis-(H)-Schema (1). Mäuse mit dem (I)-Schema mit steigender Dosis erhielten steigende Dosen (0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,25, 2,5, 5, 10 μg) entweder von an Al(OH)₃ adsorbierten rBet-v-1-Fragmenten 1 und 2, rBet-v-1-Trimer oder rBet v 1 in wöchentlichen Intervallen (Tage 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49) bis die Erhaltungsdosis von 10 μg (äquivalent 1/10 der möglichen Humandosis) erreicht war (Tag 49). Eine Kontrollgruppe erhielt entsprechende Injektionen einer Al(OH)₃-Suspension. Nach einem Intervall von 1 Monat wurde die letzte Injektion mit der Erhaltungsdosis am Tag 70 gegeben (1). Mäuse im Hochdosis-(H)-Schema erhielten dreimal in 3-wöchigen Intervallen (Tag 0, 21, 42) die Erhaltungsdosis (10 μg) injiziert (1).
Klinische, Labor- und histologische Untersuchungen der Mäuse
Das Wohlergehen aller Tiere wurde regelmäßig untersucht. Vor jeder Injektion wurde das Körpergewicht der Tiere bestimmt und die Injektionsstellen wurden auf lokale Antworten untersucht. Blutproben wurden an den Tagen 0, 21, 42 und nach Abschluss der Studie am Tag 77 gesammelt, um die humorale Antikörperantwort zu bestimmen. Am Tag 77 wurden die Mäuse nach der Blutentnahme getötet. Leber, Herz, Nieren, Milz und Lungen von allen Tieren wurden gewogen und die Histopathologie für Leber, Milz, Lungen, Lymphknoten, Thymus, Haut von den Injektionsstellen und entfernt von den Injektionsstellen entnommen. Blutproben vom Tag 77 wurden analysiert auf Hämatokrit, Hämoglobin, Erythrozytenzahl, mittleres Korpuskelvolumen (MCV), mittlere Korpuskelhämoglobinkonzentration (MCHC), Leukozyten-, Neutrophilen- und Thrombozytenzahlen.
ELISA-Messung spezifischer IgE-, IgG₁- und IgG_2a/b-Antikörper:
Mausantikörper mit Spezifität für rBet v 1 (3a bis c) und rBet-v-1-Fragmente (4) wurden mit ELISA gemessen. Kurz gesagt wurden ELISA-Platten (Nunc-Maxisorb^®, Nunc, Roskilde, Dänemark) mit 100 ml/Napf Antigen (verdünnt in PBS auf 10 μg/ml) über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden zweimal mit 200 ml PBS, 0,05% V/V Tween gewaschen und mit 200 ml Blockierungslösung (PBS, 0,05% V/V Tween, 1% G/V BSA) 2,5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann den Mausseren (100 ml/Napf verdünnt 1:5 für IgE-, 1:1000 für IgG₁-Messungen und 1:50 für IgG_2a/b in PBS, 0,05% V/V Tween, 0,5% G/V BSA) über Nacht bei 4°C ausgesetzt. Nach fünf Waschungen mit 200 ml PBS, 0,05% V/V Tween, wurden gebundene Maus-IgE-, IgG₁- oder IgG_2a/b-Antikörper mit monoklonalen Antimaus-IgE-, -IgG₁- oder -IgG_2a/b-Antikörpern von der Ratte (PharMingen, San Diego, CA), verdünnt 1:1000 in PBS, 0,05% V/V Tween, 0,5% G/V BSA, über Nacht bei 4°C nachgewiesen. Die Platten wurden fünfmal mit 200 ml PBS, 0,05% V/V Tween gewaschen und gebundene Rattenantikörper wurden mit mit Meerrettichperoxidase gekuppeltem Antiratten-Ig-Antiserum vom Schaf (Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Wien, Österreich) verdünnt 1:2000 in PBS, 0,05% V/V Tween, 0,5% G/V BSA nachgewiesen und mit ABTS-Substrat sichtbar gemacht (Sigma, St. Louis). Die optischen Dichten (OD) entsprechend den Mengen an gebundenen Antikörpern wurden bei 405 nm in einem ELISA-Lesegerät (Dynatech MR 7000, Guernsey, Channel Islands) bestimmt. Die OD-Werte für die einzelnen Platten wurden nach den gleichen Inkubationszeiträumen bestimmt. Um Unterschiede von Platte zu Platte auszuschließen, waren Referenzseren bei jeder der unterschiedlichen Platten enthalten. Die Ergebnisse sind dargestellt als mittlere Werte der OD-Messungen von Seren von allen 16 Tieren jeder Gruppe und jeder Blutentnahme (3).
Statistische Analyse:
Die Ergebnisse sind angegeben als Mittelwerte. Die statistische Signifikanz von Unterschieden bei der Antikörperinduktion (IgG₁, IgG₂, IgE) wurde untersucht mit einer wiederholten 4-Faktor-Messungs-Varianzanalyse (ANOVA), wenn nicht anders angegeben. Enthaltene Faktoren waren Zeit der Blutentnahme, Art des Impfstoffs, Allergendosis, die zur Immunisierung verwendet wurde, und Geschlecht. Zur Auswertung der Immunisierungsschemata (I gegenüber H) über Impfstoffe wurde ein zusätzlicher Interaktionsterm zwischen Impfstoff und Dosisschema aufgenommen. Alle paarweisen Vergleiche waren gemäß Bonferroni eingestellt, um eine Inflation des α-Fehlers zu vermeiden. Die beobachtete Differenz wurde als statistisch signifikant angesehen, wenn der p-Wert kleiner als 0,05 war.
Beispiel 3: Antikörperantworten im Verlauf von 3 Injektionen mit hohen Dosen von genetisch veränderten rBet-v-1-Derivaten
Bei einem Vergleich von Bet-v-1-spezifischen IgG₁- und IgG_2a/b-Antikörperpegeln bei Mäusen mit dem Schema mit ansteigenden Dosen (umfassend eine Reihe von 9 Injektionen mit Antigenmengen, die nach und nach auf 10 μg anstiegen) mit Mäusen mit Hochdosisschema (bestehend aus 3 Injektionen mit der Erhaltungsdosis von 10 μg Antigen) wurden keine signifikanten Unterschiede bei der dritten Blutentnahme gefunden (3a und 5).
Außerdem wurde gefunden, dass die Immunisierung gemäß dem Hochdosisschema signifikant (p < 0,00001) geringere IgE-Pegel induzierte als das Schema mit steigender Dosis zum Zeitpunkt der dritten und vierten Blutentnahme (6).
Beispiel 4: Hypoallergene rBet-v-1-Derivate induzieren IgG₁-Antikörper, die mit natürlichen Bet-v-1- und mit Bet-v-1-verwandten Allergenen kreuzreagieren
Seren von Mäusen, die mit rBet-v-1-Fragmenten, Trimer und rBet-v-1-Wildtyp behandelt worden waren, zeigten IgG₁-Reaktivität mit auf Nitrocellulose geblottetem natürlichen Bet v 1 in einem Birkenpollenextrakt bei 17 kDa (7a, Bahnen 1i–4i). Präimmunseren, die von den gleichen Mäusen erhalten worden waren, ebenso wie Seren von Mäusen, die mit Adjuvans alleine behandelt worden waren, enthielten keine Bet-v-1-spezifischen IgG₁ (7a, Bahnen 1p–4p; Al(OH)₃). Die Immunseren wurden auf IgG₁-Reaktivität gegenüber auf Nitrocellulose geblotteten Erlen- und Haselnusspollenextrakten getestet und es wurde gefunden, dass sie das Haupterlenpollenallergen Aln g 1 mit 17 kDa (7b) erkannten und IgG₁ gegen das Haupthaselnusspollenallergen, Cor a 1 (7c) enthielten.
SDS-PAGE und Immunblotting:
Proteinextrakte aus Birken-(Betula verrucosa), Erlen-(Alnus glutinosa), Haselnuss-(Corylus avelana)-Pollen (Allergon AB, Välinge, Schweden) wurden hergestellt, wie beschrieben (V. Niederberger et al., J. Allergy Clin. Immunol. 1998, 102: 579–591). Proteingehalte und Qualität der Extrakte wurden analysiert mit analytischer 12,5% SDS-PAGE und Coomassie-Blaufärbung. Ein Regenbogenmarker (Amersham, Buckinghamshire, GB) wurde als Molekulargewichtsstandard verwendet. Vergleichbare Mengen (100 μg/cm präparatives Gel) von jedem Proteinextrakt wurden auf Nitrocellulosemembranen (Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) geblottet. Nitrocellulosemembranen wurden zweimal 15 Minuten lang und einmal 30 Minuten lang in Puffer A (50 mM Na-Phosphat, pH 7,5, 0,5% G/V BSA, 0,5% V/V Tween, 0,05% G/V NaN₃) blockiert. Von jeder Behandlungsgruppe wurden zwei repräsentative Immunseren (vierte Blutentnahme, Tag 77) und die entsprechenden Präimmunseren für das Immunblotting verwendet. Nach dem Blockieren wurden die Folien mit Mausseren, die 1:1000 in Puffer A verdünnt waren, über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Membranen wurden in Puffer A gewaschen und mit monoklonalen Antimaus-IgG₁-Antikörpern von der Ratte, verdünnt 1:1000 in Puffer A, über Nacht bei 4°C inkubiert. Gebundene Rattenantikörper wurden mit 1:1000 verdünnten ¹²⁵I-markierten Antiratten-Antikörpern aus Schaf (Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Wien, Österreich) nachgewiesen und mit Autoradiographie (X-OMAT Film, Kodak, Heidelberg, Deutschland) sichtbar gemacht.
Beispiel 5: Gentechnisch veränderte hypoallergene rBet-v-1-Derivate induzieren Antikörper, die die Bindung von IgE von allergischen Patienten auf rBet-v-1-Wildtyp hemmen
Ein kompetitiver ELISA-Test wurde etabliert, um zu untersuchen, ob Mausantikörper die durch Impfung mit hypoallergenen rBet-v-1-Derivaten induziert worden waren, die Bindung von Serum-IgE von zehn verschiedenen gegen Birkenpollen allergischen Patienten an rBet-v-1-Wildtyp hemmen können. Zwei repräsentative Serumproben (eine männlich, eine weiblich) von jeder Mausgruppe, die aus der vierten Blutentnahme erhalten worden waren, wurden zusammen mit den entsprechenden Präimmunseren als Kontrollen auf ihre Fähigkeit, die Human-IgE-Bindung an rBet v 1 zu blockieren, analysiert.
Trotz der Tatsache, dass die Mausseren 1:100 für die Konkurrenzversuche verdünnt waren, blockierten sie die IgE-Bindung an Bet v 1 wirksam. Seren von mit rBet-v-1-Fragment immunisierten Mäusen (I-Schema) hemmten die IgE-Bindung der Patienten zwischen 58,36 und 89,38% (Mittelwert 74,69%) (Tabelle 1). Die Vorinkubation mit Seren von mit Trimer immunisierten Mäusen (I-Schema) lieferte eine Hemmung der IgE-Bindung zwischen 14,65 und 85,26% (Mittelwert 50,28%) und Seren von Mäusen, die mit rBet-v-1-Wildtyp immunisiert worden waren, erreichten eine Hemmung der IgE-Bindung des Patienten von 32,8 bis 84,01% (Mittelwert 62,89%). Eine wesentliche Hemmung der IgE-Bindung von rBet v 1 wurde auch erhalten mit Seren aus Mäusen, die gemäß dem Hochdosisschema immunisiert worden waren (Fragmente: 18,18 bis 59,53%, Mittelwert 48,28%; Trimer: 11,63 bis 46,66%, Mittelwert 27,45%; Wildtyp: 0 bis 52,93%, Mittelwert 24,96%) (Tabelle 1).
Versuchsprotokoll
Kompetitiver ELISA für die Untersuchung der Hemmung der IgE-Bindung des Patienten an rBet v 1 mit Mausseren
ELISA-Platten (Nunc-Maxisorb^®, Nunc, Roskilde, Dänemark) wurden mit 100 μl/Napf 0,5 μg rBet v 1/ml über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach fünf TBST-Waschungen wurden die Platten mit TBST, 1% G/V BSA 2 Stunden lang bei 37°C blockiert. Dann wurden die Platten mit Mausseren aus jeder Behandlungsgruppe (Seren der vierten Blutentnahme, Tag 77, und entsprechende Präimmunseren, Tag 0), jeweils verdünnt 1:100 in TBST, 0,5% G/V BSA, inkubiert. Nach fünf TBST-Waschungen wurden die Platten mit Humanseren von gegen Birkenpollen allergischen Patienten, verdünnt 1:5 in TBST, 0,5% G/V BSA, über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach fünf TBST-Waschungen wurde gebundenes Human-IgE mit mit alkalischer Phosphatase (AP) gekuppelten monoklonalen Maus-Antihuman-IgE-Antikörpern (PharMingen, San Diego, CA), verdünnt 1:1000 in TBST, 0,05% G/V BSA, nachgewiesen, wobei bei 37°C und dann 1 Stunde bei 4°C inkubiert wurde. Nach weiteren fünf Waschungen mit TBST wurde das ELISA-Substrat (Sigma, St. Louis) zugefügt und die OD der Farbreaktion bei 405 nm nach 15 Minuten abgelesen. Alle Messungen wurden im Doppelversuch durchgeführt.
Der Prozentanteil Hemmung von IgE nach Vorinkubation mit Immunseren wurde berechnet wie folgt: % Hemmung = 100 – (ODimmun × 100)/ODpräimmun.

OD_präimmun und OD_immun: bedeuten die optische Dichte nach der Vorinkubation mit Mauspräimmun- bzw. Immunseren (S. Denepoux et al., FEBS Lett. 2000, 465: 39–46).

Charakterisierung von gegen Birkenpollen allergischen Patienten:
Patienten mit Birkenpollenallergie (n = 10) wurden charakterisiert durch die Fallhistorie, die auf Birkenpollenallergie hindeutete, positive Ergebnisse für den Haut-Prick-Test, RAST und IgE-Immunblotting. Immunblots wurden durchgeführt wie beschrieben (V. Niederberger et al., J. Allergy Clin. Immunol. 1998, 102: 579–591, L. Kazemi-Shirazi et al., J. Allergy Clin. Immunol. 2000, 105: 116–125). Zwei Patienten (P1, P2) zeigten CAP RAST FEIA (Pharmacia, Uppsala, Schweden) Klasse 6, vier Patienten (P3 bis 6) Klasse 5 und vier Patienten (P7 bis 10) Klasse 4.

Claims

Verwendung eines Derivats von Bet v 1, wobei das Derivat ein Fragment oder ein Oligomer von Bet v 1 ist und im Vergleich zu Bet v 1 eine verminderte allergene Aktivität hat, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhütung eines allergischen Leidens, wobei das Medikament Al(OH)₃ enthält und an einen Patienten viermal verabreicht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitintervalle zwischen den Verabreichungen mindestens 14 Tage sind und das Zeitintervall zwischen der dritten und vierten Verabreichung länger ist als die Zeitintervalle zwischen den ersten drei Verabreichungen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei während jeder Verabreichung im Wesentlichen die gleiche Dosis des Derivats verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei während jeder Verabreichung eine Dosis von mindestens 5 μg des Derivats verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei während jeder Verabreichung eine Dosis von mindestens 100 μg des Derivats verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die allergene Aktivität des Derivats weniger als 50% der allergenen Aktivität des allergenen Proteins, aus dem es abgeleitet ist, beträgt.