DE69838171T2

DE69838171T2 - Immunstimulierende chelatkomplexe

Info

Publication number: DE69838171T2
Application number: DE69838171T
Authority: DE
Inventors: Roderick Ian Balwyn MACFARLAN; Jim Carnegie MALLIAROS
Original assignee: CSL Ltd
Current assignee: CSL Ltd
Priority date: 1997-02-19
Filing date: 1998-02-13
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2018-02-14
Also published as: AUPO517897A0; ATE368474T1; HK1025910A1; WO1998036772A1; EP0986399A1; EP0986399A4; NZ501460A; JP2001512464A; CA2279935C; NZ336792A; CA2279935A1; EP0986399B1; DE69838171D1; US6428807B1; ZA981281B; US20020081329A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft immunstimulierende Komplex (immunostimulating complex, ISCOM) matrizes, die unter Verwendung von Saponinzubereitungen, insbesondere aus der Rinde von Quillaja saponaria (Molina) stammenden Saponinzubereitungen hergestellt werden. Die Erfindung erstreckt sich ferner auf immunogene immunstimulierende Komplexe, bei denen Immunogene in eine immunstimulierende Komplexmatrix gemäß dieser Erfindung eingearbeitet sind. Derartige Immunogene können Proteine oder Polypeptide, die von Bakterien, Viren oder anderen Mikroorganismen stammen, sein, doch können sie zusätzlich synthetische, insbesondere rekombinante Proteine oder Polypeptide, die eine Immunreaktion induzieren können, sein.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Adjuvanseigenschaften von Saponin sind seit langem bekannt, wie auch dessen Fähigkeit, Antikörpertiter gegenüber Immunogenen zu erhöhen. Der hier verwendete Ausdruck "Saponin" bezeichnet eine Gruppe oberflächenaktiver Glykoside pflanzlichen Ursprungs, die aus einer hydrophilen Region (üblicherweise mehrere Zuckerketten) in Verbindung mit einer hydrophoben Region von entweder Steroid- oder Triterpenoidstruktur bestehen. Obwohl Saponin aus einer Zahl verschiedener Quellen erhältlich ist, stammen Saponine mit verwendbarer Adjuvansaktivität von dem südamerikanischen Baum Quillaja saponaria (Molina). Saponin aus dieser Quelle wurde zur Isolierung einer "homogenen" Fraktion der Bezeichnung "Quil A" verwendet (Dalsgaard 1974).
Eine Dosis-Ort-Reaktivität ist ein Hauptproblem für sowohl die veterinärmedizinische als auch humane Verwendung von Quil A in Vakzinzubereitungen. Ein Weg zur Vermeidung dieser Toxizität von Quil A ist die Verwendung von immunstimulierenden Komplexen (die als ISCOMs, eine Abkürzung für Immuno Stimulating COMplexes, bekannt sind). Der Grund hierfür liegt primär darin, dass Quil A weniger reaktiv ist, wenn es in immunstimulierende Komplexe eingearbeitet ist, da dessen Assoziation mit Cholesterin in dem Komplex dessen Fähigkeit zur Bindung an Cholesterin in Zellmembranen und daher dessen Zelllysewirkungen verringert. Ferner ist eine geringere Menge von Quil A zur Erzeugung einer ähnlichen Höhe einer Adjuvanswirkung erforderlich. Immunstimulierende Komplexe sind kleine käfigähnliche Strukturen eines Durchmessers von 30 bis 40 nm, die diese Struktur bei Gefriertrocknen beibehalten. Die Größe kann jedoch in Abhängigkeit von der Zubereitungsart, der Zusammensetzung und dem zur Messung verwendeten Verfahren variieren. Die Fertigformulierung eines typischen immunstimulierenden Komplexes mit einer optimalen Menge eines immunogenen Proteins oder Polypeptids besteht aus einem Gewichtsverhältnis von Quil A, Cholesterin, Phospholipiden und Protein oder Polypeptid von 5:1:1:1. Ein derartiger typischer immunstimulierender Komplex enthält etwa 60 Gew.-% Quil A, etwa 10% an jeweils Cholesterin und Phospholipiden und zum Rest Protein oder Polypeptid. Proteine oder Polypeptide können in die immunstimulierende Komplexmatrix entweder direkt oder durch chemische Kopplung an ein Trägerprotein (beispielsweise Influenzahüllprotein) nach Einarbeitung des Trägerproteins in den immunstimulierenden Komplex eingearbeitet werden.
Als Adjuvans verleiht die immunstimulierende Komplexmatrix viele Vorteile, die kräftige immunstimulierende Wirkungen, niedrige Toxizität, Fähigkeit zur Induktion von sowohl zellulären (einschließlich CTL) als auch humoralen Antworten umfassen, und es ist kostengünstig in Bezug auf sowohl Reagens- als auch Herstellungskosten. Jedoch wiesen in der Vergangenheit immunstimulierende Komplexe zwei Hauptnachteile auf; erstens war das bei deren Zubereitung verwendete Quil A ein komplexes und schlecht definiertes Gemisch eines biologisch abgeleiteten Produkts und es sollte daher eine Variation von Charge zu Charge erwartet werden; und zweitens zeigten die Komplexe immer noch verringerte, jedoch messbare hämolytische Aktivität, von der angenommen werden kann, dass sie eine bestimmte Höhe einer Dosis-Ort-Reaktivität anzeigt.
Seit dem Erkennen der Adjuvansaktivität von Quil A (Dalsgaard, 1974) fraktionierten mehrere Gruppen dieses Material weiter in eine Zahl "gereinigter" Komponenten ( australische Patentschrift Nr. 632067 ; Kersten, 1990; Kensil, 1988; Kensil, 1991). Für diese Komponenten wurde anschließend gezeigt, dass sie variable Eigenschaften insbesondere im Hinblick auf Adjuvansaktivität, hämolytische Aktivität und die Fähigkeit zur Bildung immunstimulierender Komplexe aufweisen. Die Verwendung definierter oder gereinigter Saponinkomponenten bot zwei potentielle Vorteile für deren Verwendung in einem humanen Vakzin. Erstens könnten diese Komponenten charakterisiert und dadurch reproduzierbar gemacht werden und zweitens könnten die Komponenten zur optimalen Verwendbarkeit ausgewählt werden.
Die immunmodulatorischen Eigenschaften der Quil-A-Saponine und die von diesen Saponinen abgeleiteten zusätzlichen Vorteile, wenn sie in einen immunstimulierenden Komplex eingearbeitet sind, wurden in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben, beispielsweise Cox und Coulter, 1992; Dalsgaard, 1974; Morein et al., australische Patentschriften Nr. 558258 , 589915 , 590904 und 632067 .
In der australischen Patentschrift Nr. 632067 ist die Trennung einer Zubereitung von Quil A in drei verschiedene Fraktionen der Bezeichnung B4b, B3 und B2 zusammen mit HPLC-Chromatographieverfahren für diese Fraktionierung beschrieben.
Eines der günstigsten Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine oder Polypeptide für Vakzin (und andere) zwecke beruht auf der Einarbeitung einer Metallchelatbildungssequenz (üblicherweise Polyhistidin) am N- oder C-Terminus des rekombinanten Produkts. Dies ermöglicht eine leichte Reinigung des Produkts durch Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) und es ist besonders günstig in Fällen, in denen das Protein oder Polypeptid für Löslichkeit das Vorhandensein eines starken Denaturierungsmittels (wie Harnstoff) benötigt (Porath, 1992). Derartige Proteine oder Polypeptide sind jedoch schwierig als Vakzine unter Verwendung der Technologie immunstimulierender Komplexe (ISCOM) zu formulieren. Der Grund hierfür liegt darin, dass:

1. in vielen Fällen die Entfernung des Denaturierungsmittels zur Ausfällung des Proteins oder Polypeptids führt – die Alternative besteht darin, das Denaturierungsmittel nicht zu entfernen, jedoch kann dies zu inakzeptabler Toxizität des Vakzins oder einer geringen Stabilität von Vakzinformulierungen führen; und
2. es schwierig ist, derartige Proteine oder Polypeptide in immunstimulierende Komplexmatrizes effizient einzuarbeiten, da hierzu erforderlich ist, dass das Protein oder Polypeptid von amphipatischem Charakter ist – dies ist eine Eigenschaft von Proteinen, die Zellmembranen durchspannen, jedoch sehr wenigen anderen Proteinen.

Die Einarbeitung von Proteinen oder Polypeptiden in einen immunstimulierenden Komplex hat zwei Hauptvorteile:

1. der extrem hydrophile Charakter des Matrixteilchens verhindert die Ausfällung von hydrophoben Proteinen oder Polypeptiden, die in Abwesenheit eines Denaturierungsmittels unlöslich sind; und
2. die Einarbeitung des Proteins oder Polypeptids in immunstimulierende Komplexe ergibt die maximale Adjuvanswirkung. Dies gilt insbesondere für cytotoxische T-Lymphocytenreaktionen, wobei die gleichzeitige Zufuhr von Saponin und Immunogen in die gleiche antigenpräsentierende Zelle ein absolutes Erfordernis sein kann, um eine adäquate Immunreaktion zu erhalten. Ganz klar ist eine gleichzeitige Zufuhr viel effizienter, wenn das Protein oder Polypeptid in einem immunstimulierenden Komplex verankert ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und wirksamen Verfahrens zur Einarbeitung eines Proteins oder Polypeptids, insbesondere eines Metallchelatbildungsproteins oder -polypeptids in immunstimulierende Komplexmatrixteilchen.
Schneck et al. (1994) offenbaren ein Verfahren zur Zielführung von Proteinen auf Lipidgruppen, die als Liposome bekannt sind, unter Verwendung eines phospholipidähnlichen Moleküls, in dem die Kopfgruppe eine chelatbildende Iminodiessigsäure (IDA) ist, und sie zeigen, dass derartige Liposome histidinreiches Myoglobin in Gegenwart von Metallionen binden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bereitstellung einer immunstimulierenden Komplexmatrix, die eine Saponinzubereitung, ein Sterol und ein Phospholipid umfasst, wobei die Matrix ferner eine Metallchelatbildungseinheit, die zur Bindung eines Proteins oder Polypeptids mit mindestens einer chelatbildenden Aminosäuresequenz in Gegenwart von Metallionen fähig ist, umfasst.
In einem weiteren Aspekt erfolgt durch die vorliegende Erfindung ferner die Bereitstellung eines immunogenen immunstimulierenden Komplexes, der eine wie oben breit beschriebene Matrix und ein immunogenes Protein oder Polypeptid mit mindestens einer chelatbildenden Aminosäuresequenz umfasst, wobei das Protein oder Polypeptid an die Matrix in Gegenwart von Metallionen gebunden ist.
DETALLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben beschrieben ist, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Einarbeitung eines Proteins oder Polypeptids mit mindestens einer chelatbildenden Aminosäuresequenz in eine immunstimulierende Komplexmatrix bereit. In einem bevorzugten Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf die Einarbeitung eines rekombinanten Proteins oder Polypeptids, das eine Polyhistidin- oder andere Metallchelatbildungssequenz enthält, in eine immunstimulierende Komplexmatrix, was die Reinigung des rekombinanten Produkts durch IMAC ermöglicht, gerichtet.
Gemäß der Erfindung wird die immunstimulierende Komplexmatrix derart hergestellt, dass eine freiliegende Metallchelatbildungseinheit, die das rekombinante Produkt in Gegenwart geeigneter Metallionen spontan binden kann, vorhanden ist. Um eine derartige Metallchelatbildungseinheit bereitzustellen, wird ein entsprechendes Molekül in die Matrix eingearbeitet, wobei dieses vorzugsweise drei funktionale Domänen umfasst:

(a) eine hydrophobe Sequenz, die das Molekül in der Matrix verankert;
(b) eine Metallchelatbildungskopfgruppe und optional
(c) eine Spacerregion, die die Chelatbildungskopfgruppe von der Oberfläche der Matrix trennt.

Besonders geeignete Verbindungen umfassen phospholipidähnliche Moleküle, in denen die Metallchelatbildungskopfgruppe eine chelatbildende Iminodiessigsäure (IDA) ist, wie 1,2-Distearyl-rac-glycerin-3-(8-(3,6-dioxy)octyl-1-amino-N,N-diessigsäure (als DSIDA abgekürzt) mit der in Formel I gezeigten Struktur (Shnek et al., 1994; Ng et al, 1995): Formel I
Dies ist im wesentlichen ein phospholipidähnliches Molekül, in dem die Kopfgruppe eine chelatbildende Iminodiessigsäure (IDA) ist, die von einem Diacyl-C18-Schwanz durch einen Triethylenglykol-Spacer (10 Atome) getrennt ist.
Alternativ kann ein DSIDA ähnliches Molekül, wobei der Diacyl-C18-Schwanz durch einen Diacyl-C16-Schwanz ersetzt ist (Formel I, n = 15), das als DPIDA bekannt ist (Pack und Arnold, eingereicht), verwendet werden.
Eine weitere Gruppe von Komponenten, die zur Einarbeitung in immunstimulierende Komplexmatrizes gemäß dieser Erfindung geeignet sind, sind phospholipidähnliche Moleküle, in denen die Metallchelatbildungskopfgruppe N-Nitrilotriessigsäure ist (siehe beispielsweise Schmitt et al., 1994; Kubalek et al., 1994; Dietrich et al., 1995; Dietrich et al., 1996). Ferner können beliebige der Metallchelatbildungskopfgruppen, die für IMAC verwendet werden, verwendet werden. (Porath, 1992).
Es gibt viele frühere Versuche zur Einarbeitung von immunogenen Proteinen oder Polypeptiden in immunstimulierende Komplexe. Versuchte Techniken umfassen eine direkte kovalente chemische Kopplung an die immunstimulierende Komplexmatrix oder an Influenza-immunstimulierende-Komplexe, eine Behandlung des Proteins oder Polypeptids bei niedrigem pH-Wert oder mit chaotropen Ionen zur Freilegung hydrophober Regionen, die normalerweise internalisiert sind, und eine chemische Anbringung von Fettsäuren an dem Protein oder Polypeptid. Alle diese Verfahren leiden an dem Nachteil, dass sie entweder nicht steuerbar sind oder schwierig zu steuern sind und für Proteine oder Polypeptide, die nur in einem Denaturierungsmittel löslich sind, schwierig oder unmöglich zu verwenden sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein einfaches und generisches Verfahren bereit, wodurch ein beliebiges rekombinantes (oder tatsächlich natürliches) Protein, das chelatbildende Aminosäuresequenzen besitzt, in immunstimulierende Komplexe eingearbeitet werden kann, mit den draus folgenden Vorteilen einer verbesserten Immunogenität und Löslichkeit.
Für den Fall rekombinanter Proteine, die technisch derart verändert wurden, dass sie eine einzige Polyhistidinsequenz enthalten, ermöglicht die Erfindung einen geordneten und eindeutigen Aufbau des Protein-immunstimulierenden-Komplexes. Dies steht im Gegensatz zu Verfahren wie einer chemischen Modifikation der Lysinseitenketten eines Proteins durch eine Fettsäure, die zufällig und nicht steuerbar sind.
Die genaue Natur des Proteins oder Polypeptids ist für die vorliegende Erfindung unwesentlich und die Erfindung erstreckt sich auf immunogene Proteine oder Polypeptide aus bakteriellen, viralen oder anderen Quellen. Ferner ist die vorliegende Erfindung insbesondere für Krebsvakzine, die eine CTL-Reaktion induzieren, beispielsweise unter Verwendung unlöslicher rekombinanter Proteine, wie der MAGE-Familie von Tumorantigenen, geeignet.
Die Saponinzubereitung in der immunstimulierenden Komplexmatrix dieser Erfindung kann Quil A (Dalsgaard, 1974) oder gereinigte Komponenten derselben gemäß einer früheren Beschreibung in der australischen Patentschrift Nr. 632067 im Namen von Morein et al., Kersten, 1990, Kensil, 1988, oder Kensil 1990, sein. Alternativ kann die Zubereitung eine Zusammensetzung, die 50 bis 90 Gew.-% an der Fraktion A von Quil A und 50 bis 10 Gew.-% an der Fraktion C von Quil A umfasst, gemäß der Beschreibung in der internationalen Patentanmeldung PCT/AU95/00670 ( WO 96/01171 ) sein. Eine besonders bevorzugte Saponinzubereitung umfasst QH703 (70% Fraktion A, 0% Fraktion B, 30% Fraktion C), die als ISCOPREP703 bekannt ist. Die Fraktionierung eines rohen wässrigen Quil-A-Extrakts in die Fraktionen A, B und C ist detailliert in Beispiel 1 der internationalen Patentanmeldung PCT/AU95/00670 beschrieben.
Allgemein ausgedrückt werden bei diesem Fraktionierungsverfahren die Fraktionen A, B und C aus der lipophilen Fraktion, die bei chromatographischer Trennung des rohen wässrigen Quil-A-Extrakts und Elution mit 70% Acetonitril in Wasser zur Gewinnung der lipophilen Fraktion erhalten wird, hergestellt. Diese lipophile Fraktion wird dann durch semipräparative HPLC durch Flution unter Verwendung eines Gradienten von 25% bis 60% Acetonitril in saurem Wasser aufgetrennt. Die als "Fraktion A" oder "QH-A" bezeichnete Fraktion ist die Fraktion, die bei etwa 39% Acetonitril eluiert. Die als "Fraktion B" oder "QH-B" bezeichnete Fraktion ist die Fraktion, die bei etwa 47% Acetonitril eluiert. Die als "Fraktion C" oder "QH-C" bezeichnete Fraktion ist die Fraktion, die bei etwa 49% Acetonitril eluiert.
Das bei der Bildung einer immunstimulierenden Komplexmatrix gemäß dieser Erfindung verwendete Sterol kann Cholesterin oder ein beliebiges anderes, einschlägig bekanntes Sterol sein.
In ähnlicher Weise kann das in der Formulierung der Matrix verwendete Phopspholipid ein Phosphatidylcholin, wie Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), oder ein anderes einschlägig bekanntes Phospholipid sein. Alternativ kann ein Phospholipid mit einer Ethanolaminkopfgruppe, wie Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE) oder Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE), verwendet werden.
Die Matrix oder der immunogene immunstimulierende Komplex auf der Basis derselben kann ferner ein oder mehrere bekannte Adjuvantien, Immunsuppressiva oder andere Immunmodulatoren, die zur Verstärkung, Unterdrückung oder sonstigen Änderung des Immunsystems eines Menschen oder Tiers wirksam sind, umfassen.
Eine immunstimulierende Komplexmatrix oder ein immunogener immunstimulierender Komplex gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Techniken, die Fachleuten geläufig sind und detailliert in den Veröffentlichungen von Cox und Coulter, 1992, und den australischen Patentschriften Nr. 558258 , 589915 , 590904 und 632067 beschrieben sind, hergestellt werden.
Das Immunogen, das in die immunstimulierende Komplexmatrix gemäß dieser Erfindung eingearbeitet wird, kann eine beliebige chemische Einheit sein, die eine Immunreaktion induzieren kann, wobei diese, ohne hierauf beschränkt zu sein, Proteine und Polypeptide, die von Bakterien, Viren oder anderen Mikroorganismen stammen, umfassen.
Das Immunogen, das vorzugsweise ein rekombinantes Protein oder Polypeptid, das eine Polyhistidinsequenz oder eine andere Sequenz mit der Fähigkeit zur Chelatbildung mit Metallionen enthält, wird in Gegenwart von Metallionen, insbesondere zweiwertigen Metallionen, wie Cu⁺⁺, Ni⁺ ⁺, Zn⁺⁺ und Co⁺ ⁺, an die Matrix gebunden. Die Metallchelatbildungseinheit in der Matrix wird derart gewählt, dass sie die Metallionen fest bindet, jedoch Stellen zurücklässt, die zur Bindung an das Polyhistidin (beispielsweise Penta-his oder Hexa-his) oder eine andere chelatbildende Aminosäuresequenz an dem Protein oder Polypeptid zur Verfügung stehen.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner auf eine Vakzinzusammensetzung zur Verwendung zum Auslösen einer Immunreaktion bei Menschen oder Tieren, die als aktive Komponente derselben einen immunogenen immunstimulierenden Komplex gemäß der obigen breiten Beschreibung zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch und/oder veterinär medizinisch akzeptablen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln umfasst.
Geeignete pharmazeutisch und/oder veterinärmedizinisch akzeptable Träger und/oder Verdünnungsmittel zur Verwendung in derartigen Vakzinzusammensetzungen sind einschlägig bekannt und beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA, beschrieben.
Es ist insbesondere vorteilhaft, Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsform zur leichten Verabreichung und Gleichförmigkeit der Dosierung zu formulieren. Die hierin verwendete Dosierungseinheitsform bezeichnet physisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosierungen für die zu behandelnden humanen Subjekte geeignet sind; wobei jede Einheit eine vorgegebene Menge Wirkstoff, die derart berechnet wurde, dass sie die gewünschte therapeutische Wirkung hervorruft, in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält. Die Spezifizierungen der neuen Dosierungseinheitsformen der Erfindung werden von (a) den singulären Eigenschaften des Wirkstoffs und der zu erreichenden speziellen therapeutischen Wirkung und (b) den Beschränkungen, die der Technik der Compoundierung eines derartigen Wirkstoffs für die spezielle Behandlung innewohnen, diktiert und sind von diesen direkt abhängig.
Ein immunstimulierender Komplex der Erfindung kann in einem Verfahren zum Auslösen einer Immunreaktion bei Menschen oder Tieren, das die Verabreichung einer immunologisch wirksamen Menge eines immunogenen immunstimulierenden Komplexes umfasst, gemäß der obigen breiten Beschreibung verwendet werden.
Durch die Verwendung des Ausdrucks "immunologisch wirksame Mengen" hierin soll ausgedrückt werden, dass die Verabreichung dieser Menge an einen Menschen oder ein Tier entweder in einer Einzeldosis oder als Teil einer Reihe zum Auslösen einer Immunreaktion in dem Menschen oder Tier gegenüber dem Immunogen bzw. den Immunogenen in der Vakzinzusammensetzung wirksam ist. Diese Menge variiert in Abhängigkeit von der Gesundheit und dem physischen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums, der Fähigkeit des Immunsystems eines Individuums, auf die Vakzinzusammensetzung zu reagieren, dem gewünschten Schutzgrad, der Vakzinformulierung, der Feststellung der medizinischen Situation und anderen relevanten Faktoren. Es wird angenommen, dass die Menge in einen relativ breiten Bereich fällt, der durch Routineversuche bestimmt werden kann.
Die Erfindung erstreckt sich ferner auf die Verwendung eines immunogenen immunstimulierenden Komplexes gemäß der obigen breiten Beschreibung bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung zum Auslösen einer Immunreaktion bei Menschen oder Tieren.
Durchgängig in dieser Beschreibung wird, falls der Kontext dies nicht anders erfordert, das Wort "umfassen" oder Variationen wie "umfasst" oder "umfassend" so verstanden, dass impliziert wird, dass eine angegebene ganze Zahl oder Gruppe ganzer Zahlen eingeschlossen ist, jedoch eine andere Zahl oder Gruppe ganzer Zahlen nicht ausgeschlossen ist.
ISCOM, ISCOPREP, ISCOPREP703 und ISCOMATRIX, die hierin verwendet werden, sind Marken von CSL Limited, Melbourne, Australien.
Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung sind in den folgenden Beispielen vollständiger beschrieben. Selbstverständlich wird jedoch diese detaillierte Beschreibung nur für den Zweck von Beispielen für die vorliegende Erfindung gegeben und sie sollte in keinster Weise als Beschränkung der breiten Beschreibung der Erfindung, die oben angegeben ist, verstanden werden.
BEISPIEL 1
ISCOMATRIX besteht aus einem gereinigten und gut charakterisiertem Gemisch von Quillaja-Saponinen, bekannt als ISCOPREP703, Cholesterin und Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC). Diese Komponenten werden in einem Dertergens enthaltenden Puffer kombiniert und dialysiert, wobei ISCOMATRIX-Teilchen eines Durchmessers von typischerweise 40-80 nm gebildet werden.
Chelatbildendes ISCOMATRIX wurde auf ähnliche Weise gebildet, wobei jedoch DSIDA und Kupfer zu der Formulierung gegeben wurden. Im Detail:
Die folgenden Lösungen wurden hergestellt:

1. 5 mg/ml Cholesterin, 3,33 mg/ml DPPC, 160 mg/ml Mega-10 in Wasser
2. 50 mg/ml ISCOPREP703 in Wasser
3. 20 mM BisTRIS, 150 mM NaCl, pH 6,8 (über eine Chelex-Säule gegeben, um kontaminierende Metallionen zu entfernen)
4. 3,33 mg/ml DPPC, 1 mg/ml Cu(Cl)₂·2H₂O, in 90% Chloroform/10% Methanol
5. 3,83 mg/ml DSIDA, 1 mg/ml Cu(Cl)₂·2H₂O, in 90% Chloroform/10% Methanol

Diese Lösungen wurden kombiniert, wobei sie in der folgenden Reihenfolge gemischt wurden:
Zubereitung A

1,7 ml Nr. 3
0,2 ml Nr. 1
0,1 ml Nr. 4 (DPPC)
Chloroform durch Abdampfen mit einem Stickstoffstrom entfernt
0,1 ml Nr. 2

Zubereitung B

1,7 ml Nr. 3
0,2 ml Nr. 1
0,025 ml Nr. 4 (DPPC)
0,075 ml Nr. 5 (DSIDA)
Chloroform durch Abdampfen mit einem Stickstoffstrom entfernt
0,1 ml Nr. 2

Die Endzusammensetzung der Gemische war:

	Zubereitung A (kein DSIDA)	Zubereitung B (25% Molverhältnis von DSIDA zu DPPC)
ISCOPREP703	2,5 mg/ml	2,5 mg/ml
Cholesterin	0,5 mg/ml	0,5 mg/ml
DPPC	0,5 mg/ml	0,375 mg/ml
DSIDA	nicht zugegeben	0,144 mg/ml
Cu(Cl)₂·2H2O	0,05 mg/ml	0,05 mg/ml
Mega-10	16 mg/ml	16 mg/ml

Die Gemische wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, dann gegen 4 l phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 6,9, bei Raumtemperatur über 24 h unter Verwendung einer Dialysemembran mit Molekulargewichtsgrenze 10000 dialysiert. Dies wurde über weitere 24 h bei 4° wiederholt.
Die Zubereitungen wurden dann durch Photonenkorrelationsspektroskopie unter Verwendung eines Nicomp370-Analysators charakterisiert und der mittlere Teilchendurchmesser wurde nach einer Gauß-Analyse der intensitätsgewichteten Daten berechnet. Die Zubereitung A (kein DSIDA) zeigte 61,3 nm und die Zubereitung B (25 Molverhältnis von DSIDA zu DPPC) zeigte 67,2 nm. Diese Werte sind innerhalb des für ISCOMATRIX erwarteten Bereichs.
BEISPIEL 2
Um zu bestimmen, ob die ISCOMATRIX-Zubereitungen von Beispiel 1 Protein binden konnten, wurden 0,3 ml von jeweils der Zubereitung A oder der Zubereitung B mit 15 μg polyhistidinhaltigem Protein in 0,3 ml 8 M Harnstoff, 0,3 M NaCl, 50 mM BisTRIS pH 7,0 gemischt.
Das in diesem Beispiel verwendete polyhistidinhaltige Protein bestand aus den offenen Leserastern E6 und E7 des humanen Papillomavirus 16 als Fusionsprotein mit einer carboxyterminalen HexaHIStidinsequenz. Die primäre Aminosäuresequenz ist:
Die verwendete Zubereitung wurde ausgehend von E. coli-Einschlusskörpern nach Sulfonierung von Cysteinresten durch eine Kombination von IMAC und Größenausschlusschromatographie gereinigt. Die Analyse auf SDS-PAGE zeigte, dass das verwendete Material eine Reinheit von größer als 95% aufwies.
Nach 4 h Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Gemische auf die Oberseite eines 20-60% (Gew/Gew)-Saccharosegradienten in phosphatgepufferter Kochsalzlösung appliziert und mit 35000 Umin^-1 17 h in einem Beckman SW40-Rotor zentrifugiert. Individuelle Fraktionen wurden gewonnen und auf das Vorhandensein von ISCOMATRIX, das Vorhandensein des gesamten rekombinanten polyhistidinhaltigen HPV16 E6E7hh und auf das Vorhandensein von rekombinantem polyhistidinhaltigem HPV16 E6E7hh, das mit ISCOMATRIX assoziiert war, getestet.
Die verwendeten Assays waren:

1. Für ISCOMATRIX: die Zunahme der Quantenausbeute der fluoreszierenden Sonde Diphenylhexatrien (DPH) bei der Übertragung von der wässrigen Phase in die lipophile ISCOMATRIX-Umgebung wurde ermittelt.

Im Detail:

1. Abwiegen von etwa 1-2 mg DPH in eine Glasampulle und Lösen in Aceton mit 1 mg/ml.
2. Verdünnen der DPH/Acetonlösung 1 zu 50 in PBS 0,1% Azid, pH 7,2. Die Lösung sollte trüb werden.
3. Mischen von 50 μl jeder Fraktion und 50 μl des DPH in PBS in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte und Inkubieren bei Raumtemperatur über 150 min.
4. Ablesen im Fluoroskan unter Verwendung von ex 355 nm/em 460 nm (die Ergebnisse können an anderen Zeitpunkten abgelesen werden, jedoch nimmt das Signal mit der Zeit zu).
5. Ausdrücken der Ergebnisse als Fluoreszenzeinheiten. Dies ist zur Lokalisierung des Peaks in einem Zentrifugration/Gelfiltration-Experiment ausreichend.

2. Für gesamtes rekombinantes polyhistidinhaltiges HPV16 E6E7hh: Ein Zwei-Seiten-EIA wurde verwendet. Aliquots jeder Fraktion wurden in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die mit monoklonalem Antikörper LHIL-16E76D (für HPV16 E7 spezifisch) beschichtet waren, gegeben. Nach einer Reihe von Waschvorgängen und Inkubationen wurde gebundenes HPV16 E7 mit einem zweiten monoklonalen Antikörper (LHIL-16E78F, für HPV16 E7 spezifisch), der mit dem Enzym Meerrettichperoxidase (HRP) chemisch konjugiert worden war, detektiert. Die Menge von gebundenem HPV16 E7 ist proportional zu enzymatischen Aktivität von HRP, die in der Mikrotiterplatte nach zusätzlichen Waschvorgängen und Inkubationen verbleibt. Diese wird bequem durch eine Farbänderung nach der Inkubation mit einem Substrat für HRP ermittelt.
3. Für rekombinantes polyhistidinhaltiges HPV16 E6E7hh, das mit ISCOMATRIX assoziiert ist: Ein Zwei-Seiten-EIA wurde verwendet. Aliquots jeder Fraktion wurden in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die mit monoklonalem Antikörper LHIL-16E76D (für HPV16 E7 spezifisch) beschichtet waren, gegeben. Nach einer Reihe von Waschvorgängen und Inkubationen wurde gebundenes HPV16 E6E7hh, das mit ISCOMATRIX assoziiert war, mit einem zweiten monoklonalen Antikörper (DD15.5G11, für ein auf der Oberfläche von ISCOMATRIX detektierbares Epitop eines Quillaja-Saponin spezifisch), der mit dem Enzym Meerrettichperoxidase (HRP) chemisch konjugiert war, detektiert. Die Menge der Enzymaktivität von HRP, die in der Mikrotiterplatte nach zusätzlichen Waschvorgängen und Inkubationen verbleibt, zeigt die Menge von HPV16 E6E7hh, das mit ISCOMATRIX assoziiert ist, an. Diese wird bequem durch eine Farbänderung nach Inkubation mit einem Substrat von HRP ermittelt.

1 zeigt die Analyse von Saccharosegradientenfraktionen durch diese drei Assays. Für beide Zubereitungen A (0% DSIDA) und B (25% DSIDA) besteht ein einziger gut definierter ISCOMATRIX-Peak, der in den Fraktionen 9-10 zentriert ist. In der Zubereitung A (0% DSIDA) ist das gesamte E6E7hh über den Gradienten verteilt, mit einem Peak an der Oberseite des Gradienten, der Material in Harnstoff darstellt, das nicht in den Gradienten eingetreten ist. Es besteht kein Peak, der ISCOMATRIX-assoziiertem E6E7hh entspricht. Im Gegensatz dazu ist das gesamte detektierbare E6E7hh in Zubereitung B (25% DSIDA) mit dem ISOMATRIX-Peak verbunden und es besteht fast exaktes Zusammenfallen mit dem ISCOMATRIX-assoziierten E6E7hh. Dies ist ein klarer Beweis dafür, dass ISCOMATRIX, das mit DSIDA formuliert und mit Cu⁺⁺ beladen ist, polyhistidinhaltiges Protein bindet. Ferner wird unter diesen Versuchsbedingungen das gesamte zugesetzte Protein gebunden.
BEISPIEL 3
Das chelatbildende ISCOMATRIX, das in Beispiel 1 unter Verwendung von DSIDA hergestellt wurde, wurde auf dessen Fähigkeit, eine cytotoxische T-Lymphocyten(CTL)-Reaktion zu induzieren, getestet, um dessen Potential als Vakzinadjuvans aufzuzeigen.
Die E6E7hh-plus-chelatbildendes-ISCOMATRIX-Formulierung, die durch Dichtegradientenzentrifugation in Beispiel 2 analysiert wurde, wurde gegen 0,5 M Arginin, 0,5 M NaCl, 50 mM Natriumphopsphat, 10 mM TRIS analysiert. Die dialysierte Formulierung wurde auf eine Dosierungsmenge verdünnt, die aus 6 μg chelatbildendem ISCOMATRIX (als ISCOPREP703) und 2 μg E6E7hh in 50 μl bestand (dies wurde auf der Basis von 66% der theoretischen Rückgewinnung der der Formulierung zugesetzten Komponenten berechnet). Die Kontrollformulierung bestand aus 6 μg ISCOMATRIX (als ISCOPREP703), das mit 10 μg E6E7hh in 50 μl 8 M Harnstoff, 50 mM TRIS, 0,3 M NaCl, pH 7,0, gemischt war, und es war früher gezeigt worden, dass sie in diesem Assaysystem CTL induziert.
Vier Tage nach der Inokulation von C57BL/6-Mäusen im Fußballen mit 50 μl jeder Formulierung wurden Kniekehlenlymphknotenzellen von Gruppen von 4 Mäusen gepoolt und weitere 4 Tage mit 3 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640 mit 10%-igem fetalem Kälberserum (FCS) und 20 IU/ml IL-2 (BioSource CV 04010) kultiviert. Zellen wurden dann aus den Kulturen gewonnen und auf deren Fähigkeit zur Abtötung von HPV16 E7 exprimierenden EL4-Maustumorzellen (hergestellt durch Transfektion mit DNA mit Codierung für HPV16 E7) oder Ovalbumin (OVA) exprimierenden Kontroll-EL4-Zellen (EG7; eine EL4-Linie, die mit DNA mit Codierung für OVA transifiziert ist und von Dr. F. Carbone, Monash University, Melbourne, erhalten wurde) in einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay von 4 h getestet. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. In diesem Experiment waren die Grade der Cytotoxizität niedriger als normalerweise erhalten und tatsächlich wurde keine CTL-Aktivität in den Mäusen, die mit mit E6E7hh gemischtem ISCOMATRIX geimpft waren, detektiert. Jedoch ist klar, dass die chelatbildendes-ISCOMATRIX-Formulierung eine CTL-Reaktion induzierte, die in diesem Experiment besser als die durch mit E6E7hh gemischtem ISCOMATRIX induzierte war. Dies erfolgte trotz der Tatsache, dass die chelatbildendes-ISCOMATRIX-Formulierung weniger E6E7hh enthielt und nicht optimiert war.

In einem zweiten Experiment wurden individuelle C57BL/6-Mäuse subkutan mit entweder 6 μg chelatbildendem ISCOMATRIX (mit DSIDA hergestellt) plus 10 μg E6E7hh oder 6 μg ISCOMATRIX im Gemisch mit 10 μg E6E7hh inokuliert. Nach drei Wochen wurden die Mäuse einer Auffrischimpfung mit einer gleichen Dosis der Formulierung unterzogen. Die Dosiszusammensetzungen waren die folgenden:

	Chelatbildendes ISCOMATRIX plus E6E7hh	ISCOMATRIX im Gemisch mit E6E7hh
E6E7hh	10 μg/100 μl	10 μg/100 μl
Chelatbildendes ISCOMATRIX (Charge 970224)	6 μg/100 μl**
Kontroll-ISCOMATRIX (Charge 970227)	-	6 μg/100 μl**
Harnstoff	0,35 M	6,74 M
Arginin	0,46 M	-
TRIS	0,44 mM	0,44 mM
BisTRIS	45,6 mM	45,6 mM
Natriumphosphat	2,64 mM	2,64 mM
NaCl	0,3 M	0,3 M
pH	7,0	7,0

** gemessen als ISCOPREP703

Sieben Tage nach der letzten Dosis wurden die Mäuse auf deren Reaktionen auf E6E7hh beurteilt. Eine Maus wurde von den Ergebnissen auf der Grundlage, dass die gewonnenen Milzzellen eine geringe Lebensfähigkeit aufwiesen und in allen durchgeführten Assays einschließlich der Freisetzung von Cytokinen als Reaktion auf Stimulation mit dem T-Zellen-Mitogen Concanavalin A negativ waren, ausgeschlossen.
CTL wurde nach der In-vitro-Stimulation von Milzzellen von individuellen Mäusen mit Mitomycin-C-behandelten, E7 exprimierenden EL4-Zellen getestet. Die Kulturen erfolgten über 5 Tage bei 37° in 5% CO₂, befeuchtet, in einem Gesamtvolumen von 8 ml RPMI 1640 + 10% FCS und sie umfassten 2,5 × 10⁶ Responder-Milzzellen/ml und 0,125 × 10/ml Mitomycin-C-behandelte, E7 exprimierende EL4-Zellen als Stimulatoren. Am Ende des Kulturzeitraums wurden die Zellen aus den Kulturen gewonnen und auf CTL in einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay von 4 h unter Verwendung von E7 und OVA exprimierenden EL4-Zellen als Targets getestet.
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt und sie belegen klar, dass chelatbildendes ISCOMATRIX plus E6E7hh zur Induktion einer CTL-Reaktion wirksam ist.
Um Informationen im Hinblick auf die Fähigkeit der Formulierungen, T-Zellen zu stimulieren, was für andere Aspekte der Immunität wichtig sein kann, zu erhalten, wurden Cytokinkonzentrationen nach einer In-vitro-Stimulation mit E6E7hh ermittelt. 2 × 10⁶ Milzzellen wurden in einem Volumen von 1 ml RPMI 1640 + 5% FCS zusammen mit 2,5 μg/ml E6E7hh 48 h kultiviert. Die Kulturüberstände wurden dann auf γ-Interferon (γifn) und IL-5 durch Zwei-Seiten-EIAS getestet. Kontrollkulturen ohne Antigen zeigten, dass keine spontane Produktion von einem der beiden Cytokine erfolgte, und Kulturen mit Concanavalin A zeigten, dass alle Milzzellpräparationen sowohl IL-5 als auch γifn produzieren konnten. 4 (mittleres und unteres Diagramm) zeigt, dass sowohl die chelatbildendes-ISCOMATRIX- als auch die ISCOMATRIX-Formulierung zur Behandlung von T-Zellen zur Produktion von IL-5 und γifn wirksam waren, obwohl eine der ISCOMATRIX-geimpften Gruppen nur IL-5 produzierte. Die Tatsache, dass diese beiden Cytokine detektiert wurden, zeigt, dass keine der Formulierungen ausschließlich Th1- oder Th2-Subpopulationen von T-Zellen stimulierte, was frühere Erfahrungen mit ISCOMATRIX im Gemisch mit entweder E6E7hh oder anderen Antigenen bestätigt.
Antikörpertiter gegen E7 wurden in einem indirekten EIA ermittelt, wobei GST-E7 (ein Fusionsprotein, das aus Glutathion-S-Transferase und HPV16 E7 besteht) an Vertiefungen einer 96-Vertiefungen-Platte absorbiert wurde. Nach Inkubation mit Verdünnungen von Seren wurde gebundener Antikörper durch mit Meerrettichperoxidase markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Produkt 074-1802) detektiert. Titer, die als die reziproke Verdünnung von Seren, bei der das EIA-Signal zum Assayhintergrund plus 3 × Standardabweichung äquivalent war, sind in 4 gezeigt (oberes Diagramm). Es ist klar, dass trotz der großen Variabilität der Titer beide Formulierungen eine Antikörperreaktion auf E7 induzieren konnten und dass, falls überhaupt, die chelatbildendes-ISCOMATRIX-Formulierung stärker immunogen war.
Die Gesamtschlussfolgerung aus diesen Untersuchungen ist, dass chelatbildendes ISCOMATRIX als Adjuvans voll wirksam ist.
BEISPIEL 4
Das in Beispiel 1 hergestellte chelatbildende ISCOMATRIX verwendet das Molekül DSIDA zur Bildung einer Verknüpfung zwischen dem Teilchen und dem Protein. In diesem Beispiel wird eine alternative Verbindung, DPIDA (1,2-Dipalmitoylrac-glycerin-3-(8-(3,6-dioxy)octyl-1-amino-N,N-diessigsäure), zur Bildung von chelatbildendem ISCOMATRIX verwendet. DPIDA weist einen Diacyl-C16-Schwanz auf, während DSIDA einen Diacyl-C18-Schwanz aufweist. Es wurde im voraus angenommen, dass dies die Löslichkeitseigenschaften der Chelatverbindung derart verbessert, dass das chelatbildende ISCOMATRIX ohne die Verwendung eines organischen Lösemittels gebildet werden kann.
Ähnlich Beispiel 1 wurden ISCOPREP703, Cholesterin und Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) in einem Detergens enthaltenden Puffer kombiniert und dialysiert, wobei ISCOMATRIX-Teilchen eines Durchmessers von typischerweise 40-60 nm gebildet wurden. Chelatbildendes ISCOMATRIX wurde auf ähnliche Weise gebildet, wobei jedoch DPIDA und Kupfer zu der Formulierung gegeben wurden.
Im Detail:
Die folgenden Lösungen wurden hergestellt:

1. 8,49 mg/ml Cholesterin, 9,0 mg/ml DPPC, 180 mg/ml Mega-10 in 50 mM BisTRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9.
2. 8,5 mg/ml Cholesterin, 11,3 mg/ml DPIDA, 5,52 mg/ml CuCl₂·2H₂O, 180 mg/ml Mega-10 in 50 mM BisTRIS, 150 mM NaCl pH 6,9.
3. 50 mg/ml ISCOPREP703 in Wasser.

Diese Lösungen wurden unter Mischen in der folgenden Reihenfolge kombiniert:
Zubereitung A (ISCOMATRIX) (Charge 022A)

1,46 ml 50 mM BisTRIS,
150 mM NaCl, pH 6,9
0,205 ml Nr. 1
0,184 ml Nr. 3

Zubereitung B (chelatbildendes ISCOMATRIX) (Charge 022B)

4,05 ml 50 mM BisTRIS,
150 mM NaCl, pH 6,9
0,38 ml Nr. 1
0,12 ml Nr. 2
0,45 ml Nr. 3

Die Endzusammensetzung der Gemische war:

	Zubereitung A (ISCOMATRIX) Charge 022A	Zubereitung B (chelatbildendes ISCOMATRIX) Charge 022B
ISCOPREP703	5,0 mg/ml	4,5 mg/ml
Cholesterin	0,94 mg/ml	0,85 mg/ml
DPPC	1,0 mg/ml	0,68 mg/ml
DPIDA	nicht zugegeben	0,27 mg/ml
CuCl₂·2H₂O	nicht zugegeben	0,132 mg/ml
Mega-10	20 mg/ml	18 mg/ml

Die Gemische wurden 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, dann gegen zwei Chargen von 1 l 50 mM BisTRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9, bei Raumtemperatur unter Verwendung einer Dialysemembran einer Molekulargewichtsgrenze 10000 dialysiert.
Dies wurde über weitere 24 h bei 4° wiederholt.
Die Zubereitungen wurden dann durch Photonenkorrelationsspektroskopie unter Verwendung eines Nicomp370-Analysators charakterisiert und der mittlere Teilchendurchmesser wurde nach einer Gauß-Analyse der intensitätsgewichteten Daten bestimmt. Die Zubereitung A (ohne DPIDA, Charge 022A) zeigte 47 nm und die Zubereitung B (mit DPIDA, Charge 022B) zeigte 49 nm.
Um zu zeigen, dass das chelatbildende ISCOMATRIX tatsächlich Kupfer und daher DPIDA eingebaut hatte, wurden Proben von sowohl Zubereitung A als auch B reduziert und Kupfer(I)-Ionen unter Verwendung von Bicinchonsäure ermittelt. Dieser Assay war eine Modifikation des von Brenner und Harris (1995) beschriebenen.
CuCl·2H₂O wurde in Wasser mit 5865 μM zur Verwendung als Standard gelöst. Eine Verdünnungsreihe wurde in Wasser hergestellt und 50 μl jeder Verdünnung oder 50 μl der Testzubereitungen wurden mit 50 μl von 5 mg/ml Natriumascorbat in einer 96-Vertiefungen-Platte gemischt. 100 μl einer Bicinchonsäurelösung (Pierce Chemical Company, BCA Reagent A) wurden dann zugegeben und die Extinktion wurde bei 562 nm gemessen. Unter Verwendung dieses Assay betrug der für Zubereitung B erhaltene Wert 205,9 μM und der für Zubereitung A erhaltene Wert 30,9 μM (was vernachlässigbar war). Ganz klar enthält das chelatbildende ISCOMATRIX eine hohe Kupferkonzentration. Die Zahl 205,9 μM stellt 70,5% des maximal möglichen Werts unter der Annahme, dass das gesamte, der Formulierung zugesetzte DPIDA in die Teilchen eingebaut ist, 100% der Chelatbildungsstellen von Kupfer besetzt sind und der verwendete Assay chelatisiertes Kupfer so effizient wie freies Kupfer misst, dar.
BEISPIEL 5
Die Verwendung von Kupfer zur Bildung von chelatbildendem ISCOMATRIX weist mehrere günstige Merkmale auf, insbesondere die Bindung hoher Affinität an Proteine mit einem geeigneten Chelatbildungsmotiv und ein Toxizitätsprofil, das Eignung zur Verwendung in Vakzinen anzeigt. Jedoch hat nichtgebundenes Kupfer bei neutralem pH-Wert und in wässrigen Lösungen die Tendenz, als Hydroxid auszufallen. Phosphatpuffer sind ebenfalls zur Verwendung mit freiem Kupfer aufgrund einer Ausfällung als Kupferphosphat nicht geeignet. In Beispiel 1 wurde dies durch Zugabe des Kupfers zu DSIDA in einem organischen Lösemittel in einem kleinen Überschuss und in Beispiel 4 durch die Verwendung von BisTRIS, das Kupfer chelatisiert und das Metall in Lösung Puffern kann, bekämpft. TRIS kann auch Kupfer durch Chelatbildung Puffern und es ist für pharmazeutische Anwendungen geeigneter als BisTRIS, da es bereits als Komponente parenteraler Formulierungen verwendet wird. In diesem Beispiel wird gezeigt, dass ISCOMATRIX unter Verwendung von Puffern auf TRIS-Basis gebildet werden kann und dass das Kupfer vor einer Ausfällung als Phosphat geschützt ist, sobald es zu chelatbildendem ISCOMATRIX komplexiert ist.
Die folgenden Lösungen wurden hergestellt:

1. 200 mg/ml Mega-10, 10 mg/ml Cholesterin, 10 mg/ml DPPC in 150 mM NaCl, 50 mM TRIS, 0,23 mg/ml CuCl₂·2H₂O, pH 7,2
2. 200 mg/ml Mega-10, 10 mg/ml Cholesterin, 12,6 mg/ml DPIDA in 150 mM NaCl, 50 mM TRIS, 0,23 mg/ml CuCl₂·2H₂O, pH 7,2
3. 50 mg/ml ISOPREP703 in 150 mM NaCl, 50 mM TRIS, 0,23 mg/ml CuCl₂·2H₂O, pH 7,2

Diese Lösungen wurden unter Mischen in der folgenden Reihenfolge kombiniert:
Zubereitung A (ISCOMATRIX) (Charge 033A)

4,16 ml 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, 0,23 mg/ml CuCl₂·2H₂O, pH 7,2
0,416 ml Nr. 1
0,416 ml Nr. 3

Zubereitung B (chelatbildendes ISCOMATRIX) (Charge 033B)

4,16 ml 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, 0,23 mg/ml CuCl₂·2H₂O, pH 7,2
0,316 ml Nr. 1
0,100 ml Nr. 2
0,416 ml Nr. 3

Die Endzusammensetzung der Gemische war:

	Zubereitung A (ISCOMATRIX) Charge 033A	Zubereitung B (chelatbildendes ISCOMATRIX) Charge 033B
ISCOPREP703	4,16 mg/ml	4,16 mg/ml
Cholesterin	0,332 mg/ml	0,832 mg/ml
DPPC	0,832 mg/ml	0,632 mg/ml
DPIDA	nicht zugegeben	0,252 mg/ml
CuCl₂·2H₂O	0,23 mg/ml	0,23 mg/ml
Mega-10	20 mg/ml	20 mg/ml

Die Gemische wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, dann 16 h gegen 1 l 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 7,2 bei Raumtemperatur unter Verwendung einer Dialysemembran einer Molekulargewichtsgrenze 10000 und dann zweimal 24 h gegen 2 1 PBS, pH 6,9, dialysiert.
Die Zubereitungen wurden dann unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Tests analysiert, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:
Zubereitung A (Charge 033A):

weniger als 10 μM Kupfer
53 nm Durchmesser

Zubereitung B (Charge 033B):
247 μM Kupfer, was 101% des theoretischen Maximums darstellt (unter der Annahme, dass das gesamte der Formulierung zugesetzte DPIDA in die Teilchen eingebaut ist, 100% der Chelatbildungsstellen besetzt sind und der verwendete Assay chelatisiertes Kupfer ebenso effizient wie freies Kupfer ermittelt)
67 nm Durchmesser
BEISPIEL 6
Das in Beispiel 5 als Zubereitung B (Charge 033B) hergestellte chelatbildende ISCOMATRIX wurde auf die Fähigkeit, an ein synthetisches Peptid mit der Sequenz:
Biotin-SGSGKKYKK-beta-Alanin--HHHHHH-NH₂
zu binden, beurteilt.
Um eine Bindung zu detektieren, wurde das Peptid zunächst mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) umgesetzt. Das Peptid wurde in 0,4 ml 0,1 M Natriumcarbonat, pH 9,5, mit 7,5 mg/ml gelöst und dann wurden 48 ml FITC (mit 10 mg/ml in Dimethylsulfoxid) langsam unter Mischen zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur gehalten und dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 3 M TRIS, pH 8,2, beendet. Das markierte Peptid wurde dann durch Größenausschlußchromatographie auf Superdex 30 erhalten. Um das eluierte Peptid zu lokalisieren, wurden individuelle Fraktionen auf die Bindung an einen Festkörper-Chelatbildungsträger (Qiagen 96 Well NTA-Ni⁺+-Immunoassay Plates) getestet. Eine Bindung wurde mit peroxidasemarkiertem Streptavidin detektiert. Dieser Ansatz wurde gewählt, um sicherzustellen, dass das in Bindungsexperimenten verwendete Peptid intakt und ohne verkürzte Sequenzen war. 5 (Diagramm A) zeigt das durch diesen Assay erhaltene Elutionsprofil im Vergleich mit einer direkten Messung der Fluoreszenz (gebunden und ungebunden). Das Peptid enthält mehrere Lysinreste und es ist daher wahrscheinlich heterogen im Hinblick auf die Substitutionsrate von Fluorescein. Eine Folge hiervon ist die Molekulargewichtsheterogenität, die in 5 (Diagramm A) zu sehen ist.
Die bei der Spezies mit hohem Molekulargewicht beobachtete Verringerung der Fluoreszenz beruht möglicherweise auf Eigenlöschung bei hoher Substitutionsrate. Die Fraktion 21 wurde in Bindungsexperimenten verwendet.
Um zu bestimmen, ob das fluoreszierende, hexaHIS enthaltende Peptid an chelatbildendes ISCOMATRIX band, wurde Fluoreszenzpolarisation verwendet. Peptid wurde auf 284 nM (auf der Basis des Fluoresceingehalts, der spektrophotometrisch ermittelt wurde) in 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,9, verdünnt. Fluoreszenzdaten wurden von sowohl der horizontalen als auch der vertikalen Ebene nach Anregung mit polarisiertem Licht der Peptidlösung allein oder nach Zugabe von entweder ISCOMATRIX (Zubereitung A, Beispiel 5, Charge 033A) oder chelatbildendem ISCOMATRIX (Zubereitung B, Beispiel 5, Charge 033B) in Inkrementen erhalten. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 5 (Diagramm B) als Anisotropie (a) werte angegeben, wobei I(W) und I(VH) die parallel bzw. senkrecht zur vertikal polarisierten Anregung gemessenen Fluoreszenzintensitäten sind und G ein Gitterkorrekturfaktor ist:
Ganz klar führte die Zugabe von chelatbildendem ISCOMATRIX zu dem Peptid zu erhöhten Anisotropiewerten, was eine Bindung an die Teilchen und eine daraus folgende Verringerung der Rotationsfreiheitsgrade darstellt.
Die Fluoreszenzpolarisation ermittelt das Verhältnis von polarisiertem Licht in zwei Ebenen und sie ist daher unabhängig von der Intensität von emittiertem Licht.
Während dieser Messungen wurde festgestellt, dass die Intensität tatsächlich abnahm, wenn chelatbildendes ISCOMATRIX, jedoch nicht Kontroll-ISCOMATRIX zu dem Peptid gegeben wurde. Dies kann auf Umgebungseffekten auf die Quantenausbeute der Fluoresceinmarkierung, entweder direkt infolge der Bindung oder durch Fluorophor-Fluorophor-Löschung, da das Peptid auf der Oberfläche der Teilchen konzentriert ist, beruhen.
Um dies als zusätzlichen Indikator einer Bindung zu untersuchen, wurden 50 μl Peptid (Fraktion 21 von fluoresceiniertem Biotin-SGSGGKYKK-beta-Alanin-HHHHHH-NH₂ gemäß der obigen Beschreibung) mit 50 μl Verdünnungen von entweder ISCOMATRIX (Zubereitung A, Beispiel 5, Charge 033A) oder chelatbildendem ISCOMATRIX (Zubereitung B, Beispiel 5, Charge 033B) in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gemischt. Die Endligandkonzentration betrug 1,3 μM (bezogen auf den Fluoresceingehalt, spektrophotometrisch ermittelt) und alle Verdünnungen erfolgten in 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,9. Die Fluoreszenz wurde dann unter Verwendung eines Fluoroskan II Vertical Beam Fluoro Spectrophotometer mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 355 nm bzw. 460 nm ermittelt.
5 (Diagramm C) zeigt klar, dass chelatbildendes ISCOMATRIX, jedoch nicht Kontroll-ISCOMATRIX das Fluoreszenzsignal des markiertes (His)₆ enthaltenden Peptids löscht.
BEISPIEL 7
Es wurde gezeigt, das chelatbildendes ISCOMATRIX das rekombinante Molekül E6E7hh in Beispiel 2 bindet. Um die Eigenschaften von chelatbildenden ISCOMATRIX mit gebundenem Protein weiter zu untersuchen, wurden das in Beispiel 5 hergestellte Kontroll-ISCOMATRIX (Charge 033A) und die in den Beispielen 4 (Charge 022B) und 5 (Charge 033B) hergestellten chelatbildendes-ISCOMATRIX-Zubereitungen in Bezug auf die Bindung an zwei verschiedene, (His)₆ enthaltende Proteine: E6E7hh und Family-C-Protein von Helicobacter pylori (HpFC) analysiert. HpFC wurde aus E. coli-Einschlusskörpern durch IMAC und anschließende erschöpfende Dialyse gegen PBS, pH 7,2, hergestellt. Exprimiertes HpFC ist ein Protein mit 131 Aminosäureresten eines MG von etwa 14100, es umfasst ein C-terminales (His)₆-Tag und es weist folgende primäre Aminosäuresequenz auf:
In diesen Reaktionen wurden 50 μg Protein mit 400 μg ISCOMATRIX (bezogen auf den ISCOPREP703-Gehalt) gemischt und nach 1 h wurde die scheinbare Größe der Teilchen ermittelt. Der Endreaktionspuffer variierte entsprechend den Pufferkomponenten der individuellen Reaktionsteilnehmer und er ist in Tabelle 1 angegeben. Für alle Reaktionen betrug der pH-Wert 6,9-7,5. Die Reaktionen mit E6E7hh wurden in 4 M Harnstoff durchgeführt, um eine Ausfällung des Proteins zu verhindern, während diejenigen mit HpFC in Abwesenheit eines Denaturierungsmittels durchgeführt wurden.
Die Tabelle 1 zeigt, dass die zwei Zubereitungen von chelatbildendem ISCOMATRIX sich in Bezug auf die physikalischen Eigenschaften der Komplexe, die bei Zugabe von (His)₆ enthaltendem Protein gebildet wurden, völlig unterschiedlich verhielten. Die Charge 033B bildete Komplexe einer großen Größe mit sowohl HpFC (in Abwesenheit von Harnstoff) als auch E6E7hh (in 4 M Harnstoff), während die Charge 022B Komplexe mit E6E7hh bildete, die eine vergleichsweise moderate Größenzunahme zeigten.
Der Hauptunterschied zwischen den Chargen 022B und 033B von chelatbildendem ISCOMATRIX bestand in dem Verfahren zur Herstellung und insbesondere den Pufferkomponenten der Endformulierung. Um zu bestimmen, ob dies die Art von Komplexen, die mit (His)₆ enthaltenden Proteinen gebildet wurden, beeinflusste, wurde ein Kreuzdialyseexperiment durchgeführt. Wie in Tabelle 2 angegeben ist, wurde die Charge 022B aus 50 mM BisTRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9, und in entweder PBS-, TRIS- oder BisTRIS-Puffer (wie in Tabelle 2 spezifiziert ist) dialysiert und die Charge 033B aus PBS, pH 6,9, und in die gleichen drei Puffer dialysiert. Die dialysierten chelatbildendes-ISCOMATRIX-Zubereitungen wurden dann mit E6E7hh umgesetzt und Zunahmen in Bezug auf die Größe wurden beurteilt.
Es ist ersichtlich, dass die Dialyse von chelatbildendem ISCOMATRIX der Charge 033B in entweder BisTRIS- oder TRIS-Puffer eine dramatische Verringerungswirkung auf die Größe der mit E6E7hh gebildeten Komplexe im Vergleich zu den gleichen Zubereitungen, die in PBS gehalten wurden, aufwies. Im Gegensatz dazu bildete das chelatbildende ISCOMATRIX 022B ungeachtet des Puffers Komplexe ähnlicher Größe.
Funktional zeigt dies, dass die Größe der mit (His)₆ enthaltendem Protein gebildeten Protein-ISCOMATRIX-Komplexe durch Manipulation der Pufferkomponenten in der Formulierung gesteuert werden kann und dass BisTRIS und TRIS im Hinblick darauf besonders vorteilhaft sind. Dies wird sehr einfach durch die Fähigkeit dieser Puffer, Kupfer zu binden, erklärt. Veröffentlichte Assoziationswerte sind:
logK Cu / Cu-TRIS = 4,05 Fischer, et al. (1979).
logK Cu / Cu-bisTRIS = 5,27 Scheller, et al. (1989).
Eine Erklärung für diese Wirkung besteht darin, dass die Zunahme der Komplexgröße auf einer Vernetzung über sekundäre Metallbindungsstellen an dem Protein beruht, was zu einer Teilchenaggregation führt. Chelatbildner mit schwacher bis mäßiger Affinität zu Kupfer können zur Blockierung derartiger sekundärer Interaktionen fähig sein.

Dies ist auch konsistent mit der Erkenntnis, dass chelatbildendes ISCOMATRIX 022B, das aus BisTRIS in PBS dialysiert wurde, keine Komplexe großer Größe bildete. In diesem Fall wird erwartet, dass unter den verwendeten Dialysebedingungen BisTRIS aufgrund von dessen Affinität für an DPIDA gebundenes Kupfer nicht vollständig von dem ISCOMATRIX entfernt wurde. Tabelle 1 Variation der Größe von Proteinkomplexen, die durch chelatbildends-ISCOMATRIX-Zubereitungen gebildet werden

Zubereitung	Größe vor Zugabe von Protein	Reaktionsbedingungen	Größe nach Zugabe von Protein
ISCOMATRIX-Charge 022A in 50 mM BisTRIS, 150 mM NaCl pH 6,9	47 ± 4 nm	ND
chelatbildendes ISCOMATRIX-Charge 022B in 50 mM BisTRIS, 150 mM NaCl	49 ± 9 nm	50 μg/ml E6E7hh 4 M Harnstoff 5 mM TRIS 10 mM BisTRIS 280 mM NaCl	112 ± 47
pH 6,9
ISCOMATRIX-Charge 033A in PBS pH 6,9	53 ± 14 nm	50 μg/ml E6E7hh 4 M Harnstoff 5 mM TRIS 2 mM Natriumphosphat 280 mM NaCl	65 ± 27
chelatbildendes ISCOMATRIX-Charge 033B in PBS pH 6,9	67 ± 33 nm	50 μg/ml E6E7hh 4 M Harnstoff 5 mM TRIS 2 mM Natriumphosphat 280 mM NaCl	300 000
ISCOMATRIX-Charge 033A in PBS pH 6,9	53 ± 14 nm	50 μg/ml HpFC 10 mM Natriumphosphat 150 mM NaCl	59 ± 33
chelatbildendes ISCOMATRIX-Charge 033B in PBS pH 6,9	67 ± 33 nm	50 μg/ml HpFC 10 mM Natriumphosphat 150 mM NaCl	1100

Tabelle 2 Wirkung von Puffer in Kreuzdialyseexperiment

Zubereitung	→ neuer Puffer	→ Größe	Zugesetztes Protein*	→ Größe
chelatbildendes ISCOMATRIX-Charge 022B	PBS, pH 6,9	48 nm	50 μg/ml E6E7hh	124 nm
in 50 mM BisTRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9 49 nm	50 mM BisTRIS 150 mM NaCl, pH 6,9	48 nm	50 μg/ml E6E7hh	130 nm
in 50 mM BisTRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9 49 nm	50 mM TRIS 150 mM NaCl, pH 7,2	48 nm	50 μg/ml E6E7hh	116 nm
chelatbildendes ISCOMATRIX-Charge 033B in PBS, pH 6,9 67 nm	PBS, pH 6,9	71 nm	50 μg/ml E6E7hh	5300 nm
	50 mM BisTRIS 150 mM NaCl, pH 6,9	55 nm	50 μg/ml E6E7hh	202 nm
	50 mM TRIS 150 mM NaCl, pH 7,2	60 mm	50 μg/ml E6E7hh	172 nm

* Die Reaktionsbedingungen waren Matrix in Puffern nach den

Angaben in der Tabelle plus ein gleiches Volumen von 100 μg/ml E6E7hh in 10 mM TRIS, 0,5 M NaCl, 50 mM Na-Phosphat, pH 7,5. Die Proben wurden 1 h bei Raumtemperatur vor einer Analyse der Größenverteilung gehalten.
BEISPIEL 8
In diesem Beispiel wird gezeigt, dass die Proteinmenge eine zusätzliche Variable ist, die die Komplexgröße beeinflusst. ISCOMATRIX und chelatbildendes ISCOMATRIX wurden wie im folgenden hergestellt:
Die folgenden Lösungen wurden hergestellt:

1. 200 mg/ml Mega-10, 10 mg/ml Cholesterin, 10 mg/ml DPPC in 150 mM NaCl, 50 mM BisTRIS, pH 6,9
2. 200 mg/ml Mega-10, 10 mg/ml Cholesterin, 12,6 mg/ml DPIDA in 150 mM NaCl, 50 mM BisTRIS, 0,23 mg/ml CuCl₂·2H₂O, pH 6,9
3. 50 mg/ml ISCOPREP703 in 150 mM NaCl, 50 mM BisTRIS, pH 6,9.

Diese Lösungen wurden unter Mischen in der folgenden Reihenfolge kombiniert:
Zubereitung A (ISCOMATRIX (Chargen 040-2m, 040-3m)

0,8 ml 50 mM BisTRIS, 150 mM NaCl, 0,29 mg/ml CuCl₂·2H₂O, pH 6,9
0,1 ml Nr. 1
0,1 ml Nr. 3

Zubereitung B (chelatbildendes ISCOMATRIX (Chargen 040-2c, 040-3c)

0,8 ml 50 mM BisTRIS, 150 mM NaCl, 0,29 mg/ml CuCl₂·2H₂O, pH 6,9
0,076 ml Nr. 1
0,024 ml Nr. 2
0,1 ml Nr. 3

Die Endzusammensetzung der Gemische war:

	Zubereitung A (ISCOMATRIX) Charge 040-2m Charge 040-3m	Zubereitung B (chelatbildendes ISCOMATRIX) Charge 040-2c Charge 040-3c
ISCOPREP703	5 mg/ml	5 mg/ml
Cholesterin	1 mg/ml	1 mg/ml
DPPC	1 mg/ml	0,76 mg/ml
DPIDA	nicht zugegeben	0,30 mg/ml
CuCl₂·2H₂O	0,23 mg/ml	0,23 mg/ml
Mega-10	20 mg/ml	20 mg/ml

Die Gemische wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, dann 16 h bei Raumtemperatur unter Verwendung einer Dialysemembran der Molekulargewichtsgrenze 10000 gegen 1 l 50 mM BisTRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9 (Charge 040-2m, Charge 040-2c) oder 1 l 50 mM BisTRIS, 150 mM NaCl, 0,23 mg/ml CuCl₂·2H₂O, pH 6,9 (Charge 040-3m, Charge 040-3c) dialysiert. Alle Zubereitungen wurden dannn 8 h gegen 500 ml 50 mM Natriumphosphat, 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9, und dann 48 h gegen 500 ml von 50 mM Natriumphosphat, 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9, dialysiert. Die Chargen 040-2m und 040-3m von ISCOMATRIX und 040-2c und 040-3c von chelatbildendem ISCOMATRIX unterschieden sich nur durch das Vorhandensein von Kupfer in dem ersten Dialysepuffer.
Die Zubereitungen wurden dann unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Tests analysiert.

Für Charge 040-2m von ISCOMATRIX: 16 μm Kupfer, 52 nm Durchmesser
Für Charge 040-3m von ISCOMATRIX: 17 μm Kupfer, 52 nm Durchmesser
Für Charge 040-2c von chelatbildendem ISCOMATRIX: 220 μm Kupfer, 64 nm Durchmesser
Für Charge 040-3c von chelatbildendem ISCOMATRIX: 220 μm Kupfer, 62 nm Durchmesser

Um die Änderungen nach einer Kombination von chelatbildendem ISCOMATRIX mit Protein zu analysieren, wurden verschiedene Mengen ISCOMATRIX (gepoolte Chargen 040-2m und 040-3m) oder chelatbildendem ISCOMATRIX (gepoolte Chargen 040-2c und 040-3c) zu 100 μg E6E7hh gegeben, wobei eine Formulierung erhalten wurde, die 4 M Harnstoff, 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,9, enthielt. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurden die Größenverteilungen ermittelt. Der Harnstoff wurde dann aus den Formulierungen durch Dialyse gegen 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,9-Puffer entfernt und die Größenverteilungen wurden erneut sowohl unmittelbar nach der Dialyse als auch nach einer Lagerung bei 4° über 96 h ermittelt. 6 zeigt, dass E6E7hh zugesetztes ISCOMATRIX keine Wirkung auf die Größenverteilung von Teilchen hatte, dass jedoch deutliche Änderungen im Falle von chelatbildendem ISCOMATRIX bestanden. Ferner war die Größenverteilung von chelatbildendem ISCOMATRIX plus E7E6hh abhängig von dem Verhältnis von Protein zu Matrix (ausgedrückt als μg/ml) ISCOPREP703). Bei höheren Proteinkonzentrationen (Verhältnis 1:1) wurden größere Komplexe gebildet und die Größe der Komplexe nahm mit der Zeit zu. Im Gegensatz dazu wurden bei niedrigen Proteinkonzentrationen (1:4) stabile Komplexe einer mäßigen Größe beobachtet.
Es kann gefolgert werden, dass die Proteinkonzentration eine wichtige Determinante von sowohl Komplexgröße als auch -stabilität ist und dass bei einem Verhältnis von 100 μg E6E7hh zu 400 μg/ml ISCOPREP703 eine stabile gut definierte Formulierung erhalten werden kann. Dies liegt gut innerhalb des Bereichs, von dem erwartet wird, dass er zu wirksamen Vakzinformulierungen führt.
BEISPIEL 9
Um die allgemeine Verwendbarkeit von chelatbildendem ISCOMATRIX zur Formulierung von Vakzinen unter Verwendung einer Vielzahl von Antigenen zu belegen, wurde die Bindung eines zusätzlichen, (His)₆ enthaltenden Proteins untersucht. Das in dieser Untersuchung verwendete chelatbildende ISCOMATRIX wurde durch die in den vorhergehenden Beispielen entwickelte Methodik hergestellt.
Die folgenden Lösungen wurden hergestellt:

1. 200 mg/ml Mega-10, 10 mg/ml Cholesterin, 10 mg/ml DPPC in 150 mM NaCl, 50 mM TRIS, 0,6 mM CuCl₂·2H₂O, pH 7,2
2. 200 mg/ml Mega-10, 10 mg/ml Cholesterin, 9 mg/ml DPPC, 1,26 mg/ml DPIDA in 150 mM NaCl, 50 mM TRIS, 0,6 mM CuCl₂·2H₂O, pH 7,2
3. 50 mg/ml ISCOPREP703 in 150 mM NaCl, 50 mM TRIS, pH 7,2

Diese Lösungen wurden unter Mischen in der folgenden Reihenfolge kombiniert:
Zubereitung A (ISCOMATRIX) (Charge M-1207)

8 ml 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, 0,6 mM CuCl₂·2H₂O, pH 7,2
1 ml Nr. 1
1 ml Nr. 3

Zubereitung B (chelatbildendes ISCOMATRIX) (Charge ch10-1207)

8 ml 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, 0,6 mM CuCl₂·2H₂O, pH 7,2
1 ml Nr. 2
1 ml Nr. 3

Die Endzusammensetzung der Gemische war:

	Zubereitung A (ISCOMATRIX) Charge M-1207	Zubereitung B (chelatbildendes ISCOMATRIX) Charge ch10-1207
ISCOPREP703	5 mg/ml	5 mg/ml
Cholesterin	1 mg/ml	1 mg/ml
DPPC	1 mg/ml	0,9 mg/ml
DPIDA	nicht zugegeben	0,126 mg/ml
CuCl₂·2H₂O	5,4 mg/ml	5,4 mg/ml
Mega-10	20 mg/ml	20 mg/ml

Die Gemische wurden 90 min bei Raumtemperatur inkubiert, dann 16 h gegen 2 l 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 7,2, bei Raumtemperatur unter Verwendung einer Dialysemembran einer Molekulargewichtsgrenze von 12000 und dann zweimal 24 h bei 4° gegen 2 l von 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,9, dialysiert. Die Zubereitungen wurden dann durch Filtration über eine 0,22 μM Membran sterilisiert.
Die gebildeten Teilchen zeigten die "Soccerball"-Morphologie, die für ISCOMs bei Beobachtung durch Elektronenmikroskopie charakteristisch ist. Größenverteilungen und Kupferanalyse zeigten ebenfalls die erfolgreiche Bildung von chelatbildendem ISCOMATRIX:
Zubereitung A (Charge M-1207):

weniger als 10 μM Kupfer
60 nm Durchmesser

Zubereitung B (Charge ch10-1207):
101 μM Kupfer, was 80% des theoretischen Maximums darstellt (unter der Annahme, dass das gesamte, der Formulierung zugesetzte DPIDA in die Teilchen eingebaut ist, 100% der Chelatbildungsstellen besetzt sind und der verwendete Assay chelatisiertes Kupfer ebenso effizient wie freies Kupfer ermittelt).
52 nm Durchmesser
Die Größenverteilungen der Zubereitungen A und B sind als 7 gezeigt.
Um die Fähigkeit von chelatbildendem ISCOMATRIX, an ein anderes, (His)₆ enthaltendes Protein als E6E7hh zu binden, aufzuzeigen und dadurch die Allgemeingültigkeit des Bindungsmechanismus zu etablieren, wurde das Family-C-Protein von Helicobacter pylori (HpFC) (gemäß der Beschreibung in Beispiel 7) verwendet.
50 μg HpFC in PBS, pH 7,2, wurden mit 400 μg (bezogen auf den ISCOPREP703-Gehalt) ISCOMATRIX (Charge M-1207), chelatbildendem ISCOMATRIX (Charge ch10-1207) oder chelatbildendem ISCOMATRIX (Charge ch10-1207) in Gegenwart von 250 mM Imidazol gemischt. Die Gemische wurden 1 h inkubiert und dann auf die Oberseite eines 20-60% (Gew/Gew)-Saccharosegradienten in 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,9, appliziert und mit 35000 Umin^-1 15 h in einem Beckman SW40-Rotor zentrifugiert. Individuelle Fraktionen wurden gewonnen und unter Verwendung der im folgenden angegebenen Verfahren getestet:

1. Für ISCOMATRIX wurde die Zunahme der Quantenausbeute der fluoreszierenden Sonde Diphenylhexatrien (DPH) bei der Übertragung von der wässrige Phase in die lipophile ISCOMATRIX-Umgebung unter Verwendung des detailliert in Beispiel 2 angegebenen Verfahrens ermittelt.
2. Zur Ermittlung der Menge von mit ISCOMATRIX assoziiertem HpFC wurde ein Zwei-Seiten-EIA verwendet. Aliquots jeder Fraktion wurden zu Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die mit monoklonalem Antikörper GP2.3C9.1C5 (für HpFC spezifisch) beschichtet waren, gegeben. Nach einer Reihe von Waschvorgängen und Inkubationen wurde mit ISCOMATRIX assoziiertes gebundenes HpFC mit einem zweiten monoklonalen Antikörper (DD15.5G11), der mit dem Enzym Meerrettichperoxidase (HRP) chemisch konjugiert war, detektiert. Dieser Mab ist für ein Epitop eines Quillaia-Saponins spezifisch, das sowohl in der rohen QuilA(QA)-Fraktion als auch dem davon abgeleiteten, hoch gereinigten ISCOPREP703-Material vorhanden ist und auf der Oberfläche von ISCOMATRIX detektierbar ist. Die Menge enzymatischer Aktivität von HRP, das in der Mikrotiterplatte nach zusätzlichen Waschvorgängen und Inkubationen verbleibt, zeigt die Menge von mit ISCOMATRIX assoziiertem HpFC an. Diese wird bequem durch eine Farbänderung nach Inkubation mit einem Substrat von HRP ermittelt.
3. Die Gesamtmenge von HpFC wurde durch einen qualitativen direkten EIA ermittelt. Saccharosegradientenfraktionen wurden 1 zu 20 in 50 mM Natriumcarbonat, pH 9,5, verdünnt, an Vertiefungen von Immunoassayplatten absorbiert und dann wurde das gebundene HpFC mittels eines für HpFC spezifischen, peroxidasemarkierten Mab (GP2.3C9.1C5) detektiert. Diese Assaygestaltung ergibt keine quantitativen Daten und sie wurde verwendet, da nur ein für HpFC spezifisches Reagens verfügbar war.
4. Die Gesamtmenge von (His)₆ enthaltendem Protein wurde durch einen qualitativen indirekten EIA ermittelt. Saccharosegradientenfraktionen wurden 1 zu 20 in 50 mM Natriumcarbonat, pH 9,5, verdünnt, an Vertiefungen von Immunoassayplatten absorbiert und dann wurde das gebundene, (His)₆ enthaltende Protein mittels eines für (His)₆ spezifischen Mab (Dianova Gmb, Produkt HDIA-900) und eines peroxidasemarkierten Ziegen-Anti-Maus-IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Produkt 074-1802) detektiert. Diese Assaygestaltung ergibt keine quantitativen Daten.

8 zeigt die Analyse von Saccharosegradientenfraktionen durch diese vier Assays. Für alle drei Zubereitungen ist ein einziger gut definierter chISCOMATRIX- oder ISCOMATRIX-Peak, der in den Fraktionen 8-10 zentriert ist, vorhanden. In der Formulierung von chISCOMATRIX plus HpFC besteht eine klare Assoziation von HpFC mit dem chISCOMATRIX, was durch das Zusammenfallen von dem gesamten HpFC (direktes HpFC), dem gesamten, (His)₆ enthaltenden Protein (indirektes 6HIS) und dem ISCOMATRIX-assoziierten HpFC (HpFC/QA) deutlich wird. Von dem HpFC-Protein band nicht die Gesamtmenge an chISCOMATRIX, da in Fraktionen ohne chISCOMATRIX eine wesentliche Menge von Gesamt-HpFC vorhanden war, jedoch (His)₆ in diesen Fraktionen nicht detektiert werden konnte. Daher weist ein Teil des HpFC kein (His)₆ mit sterischer Verfügbarkeit zur Antikörperbindung auf und (in nicht überraschender Weise) ist dieses Material auch nicht zur Bindung an chISCOMATRIX fähig. Die Profile der Kontrollformulierung waren deutlich verschieden. Für sowohl ISCOMATRIX plus HpFC als auch chISCOMATRIX plus HpFC in Gegenwart von Imidazol war sehr wenig HpFC in den ISCOMATRIX enthaltenden Fraktionen vorhanden und ISCOMATRIX-assoziiertes HpFC (Hpy-C/QA) war tatsächlich nicht detektierbar. Das gesamte (His)₆ enthaltende Protein lag an der Oberseite des Gradienten.
Diese Analyse ergibt einen klaren Beweis für die Bindung von HpFC an chelatbildendes ISCOMATRIX und für die Bedeutung der Chelatbildung als Bindungsmechanismus.
BEISPIEL 10
Die zwei wichtigsten Eigenschaften einer Vakzinformulierung bestehen darin, dass sie immunogen ist und ein akzeptables Toxizitätsprofil aufweist. Um zu bestimmen, ob Formulierungen auf der Basis von chelatbildendem ISCOMATRIX diese Kriterien erfüllten, wurde ein Kaninchenimmunisierungsversuch durchgeführt, wobei sowohl die serologische Reaktion auf E6E7hh als auch lokale Toxizität beurteilt wurden.

Vakzinformulierungen waren die folgenden:

	chelatbildendes ISCOMATRIX	ISCOMATRIX
ISCOPREP703	200 μg/ml	200 μg/ml
E6E7hh	200 μg/ml	200 μg/ml
Harnstoff	1,6 M	4 M
TRIS	42 mM	11,0 mM
NaCl	0,22 mM	0,43 mM
Natriumphosphat	50 mM	42 mM
pH	6,9	7,5

Alle Puffer wurden frei von einem Konservierungsmittel und sterilfiltriert hergestellt. Die Charge 033B von chelatbildendem ISCOMATRIX (Beispiel 8) und die Charge 05523748 von ISCOMATRIX (Material klinischer Qualität, CSL Ltd) wurden zur Vakzinformulierung verwendet.
Alle Kaninchen erhielten intramuskulär 0,5 ml Vakzinformulierung. Die erste Dosis wurde in der rechten Hinterpfote und die zweite in der linken Hinterpfote gegeben. Am Tag vor der Dosierung wurden die Stellen mit Schneidezangen rasiert und feine Haare wurden unter Verwendung von Enthaarungscreme (Neplisoap-Cosmex International) entfernt. Die Stellen zeigten keine Zeichen einer Reizung, Schnitte, Abtragungen, Knötchen oder andere sichtbare Zeichen oder tastbare Knötchen. Die Injektion erfolgte durch eine 26G-Nadel und die Dosierungshöhen waren 100 μg ISCOPREP703 (als entweder ISCOMATRIX oder chelatbildendes ISCOMATRIX) und 100 μg E6E7hh oder nur Verdünnungsmittel. Das Dosierungs/Blutentnahmeprogramm war: Tag-1 (Vorblutentnahme und Stellenpräparation der 1. Dosis); Tag 0 (1. Dosis); Tag 6 (Stellenpräparation der 2. Dosis); Tag 7 (Blutentnahme, dann 2. Dosis); Tag 14 (Blutentnahme, dann Biopsie der Stelle der 2. Dosis).
Zur Überwachung lokaler Reaktionen wurden die Stellen 4 h nach der Injektion und dann täglich von zwei unabhängigen Betrachtern, von denen einer keinen Zugang zur Codierung der Versuchstiere hatte, untersucht. Nach Beendigung der Untersuchungen wurden Biopsien von der Stelle der zweiten Dosis auf histologische Anomalitäten untersucht. Auf der Basis einer Punktezahl von 0 bis 5 (wobei gilt: 0 = keine Reaktion, 1 = kleiner Rötungsbereich, 2 = erhöhter flacher Bereich mit großem Rötungsbereich, 3 = weiche Knötchen mit sehr großem Rötungsbereich, 4 = harte Knötchen, 5 = Abszess) wurden alle Dosisstellen durch beide Betrachter zu allen Zeitpunkten mit 0 beurteilt. Die Biopsien wurden als histologisch normal beurteilt.

Zur Überwachung serologischer Reaktionen wurden Seren durch EIA auf Antikörper gegen entweder E6E7hh oder GST-E7 (ein Fusionsprotein, das aus Glutathion-S-transferase und E7 besteht) getestet. Die Ergebnisse sind im folgenden in Tabelle 3 gezeigt. Es ist ersichtlich, dass sowohl chelatbildendes ISCOMATRIX mit E6E7hh als auch ISCOMATRIX plus E6E7hh eine starke spezifische Antikörperreaktion induzierten, die gegenüber sowohl GST-E7 als auch E6E7hh detektiert werden konnte. Tabelle 3

	chISCOMATRIX E6E7hh		ISCOMATRIX E6E7hh		Verdünnungs mittelkontrolle
	Kaninchen 940	Kanin chen 941	Kanin chen 910	Kanin chen 915	Kanin chen 919	Kanin chen 920
Vorblutentnahme (Assay gegen GST-E7)	3,0	3,0	3,1	3,1	3,0	2,6
Nach 2. Blutentnahme (Assay gegen GST-E7)	5,8	5,7	5,8	6,0	ND	ND
Vorblutentnahme (Assay gegen E6E7hh)	2,7	2,7	3,6	3,1	2,6	2,7
Nach 2. Blutentnahme (Assay gegen E6E7hh)	5,9	5,8	6,0	6,1	ND	ND

Die Titer sind als log10 der reziproken Verdünnungen von Seren, die ein EIA-Signal ergeben, das zum Versuchshintergrund plus die 3-fache Standardabweichung äquivalent ist, ausgedrückt.
BEISPIEL 11
Zur weiteren Untersuchung der Stabilität von E6E7hh-Vakzinformulierungen mit chelatbildendem ISCOMATRIX wurden die physikalischen Eigenschaften der Komplexe über die Zeit bei zwei verschiedenen Temperaturen und mit drei verschiedenen Verhältnissen von Protein zu ISCOPREP703 beurteilt. Für diese Analyse wurde die scheinbare Größe der Komplexe (die durch Photonenkorrelationsspektroskopie ermittelt wurde) und die Assoziation von Protein (die durch den Assay von Saccharosegradientenfraktionen ermittelt wurde) beurteilt.
Die Charge ch10-1207 von chelatbildendem ISCOMATRIX (Herstellung gemäß der Beschreibung in Beispiel 9) wurde verwendet. Um E6E7hh in einer Vielzahl von Valenzzuständen und physikalischen Zuständen genau zu ermitteln, umfassten die Formulierungen Protein, das mit Tritium unter Verwendung von N-Succinimidyl-[2,3-³H]-propionat markiert worden war. Zur Markierung von E6E7hh mit diesem Reagens in Abwesenheit von Harnstoff wurde die Reaktion mit E6E7hh, das an ein IMAC-Harz (Qiagen Ni-NTA Superflow) gebunden war, in 0,1 M Natriumphosphat, 0,2 M NaCl, pH 8,0, durchgeführt. Dies hat auch den Vorteil des Schützens der (His)₆-Sequenz. Sobald die Markierung durchgeführt war, wurde die feste Phase ausführlich mit 8 M Harnstoff, 0,1 M Natriumphosphat, 10 mM TRIS, 0,3 M NaCl, pH 8,0, gewaschen und das Protein dann mit dem gleichen, auf pH 4,4 eingestellten Puffer eluiert. Um sicherzustellen, dass das markierte Protein frei von Reaktionskomponenten eines niedrigen MG und von aus der festen Phase stammendem Ni (das möglicherweise die Bindung an chelatbildendes ISCOMATRIX stören könnte) war, wurde das Material gegen 8 M Harnstoff, 50 mM Natriumphosphat, 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 4,0, bei 4° über 16 h und dann gegen 8 M Harnstoff, 50 mM Natriumphosphat, 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9, dialysiert. Gewonnenes Material wurde als 370 μg/ml durch den Coomassie Plus Assay (Pierce Chemical Company) unter Verwendung der ursprünglichen E6E7hh-Zubereitung (durch Aminosäureanalyse quantitativ bestimmt) als Standard ermittelt. Die spezifische Aktivität des markierten Proteins betrug 925 cpm/μg.

Die getesteten Formulierungen wurden wie folgt hergestellt:

	Formulierungen (μg ISCOPREP703/μg E6E7hh)
Komponente	1400/125	1400/250	1400/500
8 M Harnstoff, 50 mM Natriumphosphat, 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9	1045 μl	855 μl	478 μl
unmarkiertes E6E7hh in 8 M Harnstoff, 50 mM Natriumphosphat, 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9	185 μl (305 μg)	375 μl (617 μg)	752 μl (1242 μg)
[³H]-E6E7hh in 8 M Harnstoff, 50 mM Natriumphosphat, 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9	20 μl (7,5 μg)	20 μl (7,5 μg)	20 μl (7,5 μg)
chelatbildendes ISCOMATRIX in 50 mM Natriumphosphat, 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 6,9	1250 μl (3500 μg)	1250 μl (3500 μg)	1250 μl (3500 μg)
cpm/20 μl (gemessen)	458	592	503
cpm/μg (berechnet)	183	118	50

Die Zubereitungen wurden 60 min bei Raumtemperatur inkubiert, und dann wurden Anfangsmessungen der Größenverteilung der Komplexe (in 4 M Harnstoff) durchgeführt. Nach einer Dialyse über 16 h bei 4° gegen 50 mM Natriumphosphat, 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, 0,5% 2-Phenoxyethanol, pH 6,9, wurden die Formulierungen in dem gleichen Puffer auf 318 μg/ml ISCOPREP703 verdünnt und in aliquoten Mengen von 0,6 ml in Glasbehälter zur Aufbewahrung bei entweder 4° oder 31° gegeben. Im Verlauf der Untersuchung betrug die ermittelte mittlere Rückgewinnung 87% für ISCOPREP703 (15 Bestimmungen durch Umkehrphasen-HPLC) und für E6E7hh, das als Tritium gewonnen wurde, 96,1% (1400/125-Formulierung – 5 Bestimmungen), 70,0% (1400/250-Formulierung – 5 Bestimmungen) und 84,3% ((1400/500-Formulierung – 5 Bestimmungen).
An verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben auf die Größenverteilung durch Photonenkorrelationsspektroskopie getestet, um große Änderungen der physikalischen Eigenschaften der Teilchen zu zeigen. Um feine Unterschiede im Hinblick auf die Zusammensetzung der Teilchen anzuzeigen, wurden Proben durch Dichtegradientenzentrifugation fraktioniert. 600 μl jeder Formulierung wurden auf die Oberseite eines linearen 20-60% (Gew/V) Saccharosegradienten in 50 mM Natriumphosphat, 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, 0,5% 2-Phenoxyethanol, pH 6,9, appliziert und in einem SW40-Rotor 17 h bei 4° zentrifugiert. Individuelle Fraktionen wurden dann getestet auf:

1. den E6E7hh-Gehalt durch EIA. Fraktionen wurden 1 zu 10 verdünnt und in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben, die mit monoklonalem Antikörper LHIL-16E76D (für HPV16 E7 spezifisch) beschichtet war. Nach einer Reihe von Waschvorgängen und Inkubationen wurde gebundenes HPV16 E7 mit einem zweiten monoklonalen Antikörper (LHIL-16E78F, für HPV16 E7 spezifisch), der mit dem Enzym Meerrettichperoxidase (HRP) chemisch konjugiert war, detektiert. HRP, das in der Mikrotiterplatte nach zusätzlichen Waschvorgängen und Inkubationen zurückblieb, wurde durch eine Farbänderung nach Inkubation mit einem Substrat von HRP ermittelt.
2. E6E7hh, das mit chelatbildendem ISCOMATRIX assoziiert ist, durch EIA. Fraktionen wurden 1 zu 10 verdünnt und in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die mit monoklonalem Antikörper LHIL-16E76D (Für HPV16 E7 spezifisch) beschichtet war, gegeben. Nach einer Reihe von Waschvorgängen und Inkubationen wurde gebundenes HPV16 E6E7hh, das mit ISCOMATRIX assoziiert war, mit einem zweiten monoklonalen Antikörper (DD15.5G11, der spezifisch für ein auf der Oberfläche von ISCOMATRIX detektierbares Epitop eines Quillaia-Saponins ist), der mit dem HPR chemisch konjugiert worden war, detektiert. HRP, das in der Mikrotiterplatte nach zusätzlichen Waschvorgängen und Inkubationen zurückblieb, wurde durch eine Farbänderung nach Inkubation mit einem Substrat von HRP ermittelt.
3. E6E7hh durch den Radioaktivitätsgehalt. 100 μl jeder Fraktion wurden mit 200 ml Wasser verdünnt, mit 1,2 ml Packard Insta-Gel (Produkt 6013009) emulgiert und die Zählrate pro min wurde unter Verwendung eines β-Szintillationsspektrometers bestimmt.
4. ISCOMATRIX wurde unter Verwendung der fluoreszierenden Sonde Diphenylhexatrien (DPH) ermittelt. Bei Übertragung von der wässrigen Phase in das lipophile ISCOMATRIX erfährt DPH eine Zunahme der Quantenausbeute, die unter Verwendung eines Fluoroskan II Plate Reader bei 460 nm nach Anregung bei 350 nm ermittelt wurde. Das verwendete Protokoll war gemäß Beispiel 2.

9 zeigt, dass für alle drei Verhältnisse von Protein zu chelatbildendem ISCOMATRIX die Zugabe von E6E7hh in 4 M Harnstoff zu einer Zunahme der scheinbaren Größe des Komplexes führte. Die zugesetzte Proteinmenge beeinflusste jedoch den scheinbaren Enddurchmesser (wie auch in Beispiel 5 ermittelt wurde). Für die 1400:125-μg-Formulierung erfolgte die Änderung von 52 nm zu 114 nm, von 52 nm zu 170 nm für 1400:250 μg und von 52 nm zu 545 nm für 1400:500 μg. Nach Entfernung des Harnstoffs durch Dialyse war eine weitere Größenzunahme offensichtlich, obwohl diese nicht groß war. Sobald die Komplexe gebildet waren, blieben jedoch die Komplexe in Bezug auf die scheinbare Größe bei sowohl 4° als auch 31° über mindestens 45 Tage stabil. Dies steht im Gegensatz zu den in Beispiel 8 präsentierten Daten, wobei höhere Verhältnisse von Protein zu chelatbildendem ISCOMATRIX untersucht wurden.
Die 10a-e zeigen die Analyse von Saccharosegradientenfraktionen von allen drei Formulierungen am Tag 0 (Zeit ab der Entfernung von Harnstoff durch Dialyse), Tag 6 für bei sowohl 4° als auch 31° aufbewahrte Proben (die Daten von Tag 28 waren im wesentlichen ähnlich und sind nicht angegeben) und am Tag 45 für bei sowohl 4° als auch 31° aufbewahrte Proben. Durch die Analyse der Größenverteilung ist klar, dass die Hauptvariable, die die Zusammensetzung der Teilchen beeinflusst, das Verhältnis von Protein zu chelatbildendem ISCOMATRIX ist. Dies wird in allen untersuchten Proben gezeigt und kann daher detailliert unter Bezugnahme auf lediglich 17a (Zeitpunkt Tag 0) beschrieben werden. Bei dem niedrigsten Verhältnis von Protein zu chelatbildendem ISCOMATRIX (1400:125) bildet sich eine einzige Komplexklasse, die durch das Zusammenfallen von allen vier Assays unter Bildung eines einzigen Peaks (Fraktionen 8-11) angezeigt wird. Das heißt, das gesamte E6E7hh war in den gleichen Fraktionen wie ISCOMATRIX lokalisiert und auch in dem EIA detektierbar, der physisch mit den Teilchen assoziiertes E6E7hh ermittelte. Im Gegensatz dazu bildeten sich bei dem höchsten Verhältnis von Protein zu chelatbildendem ISCOMATRIX (1400:500) zwei Komplexklassen. Die erste – an der gleichen Position in dem Gradienten wie die bei dem niedrigsten Verhältnis gebildete einzige Komplexklasse – enthielt relativ geringe Mengen E6E7hh (die sowohl durch EIA als auch cpm detektiert wurden) und auch weniger Teilchen (obwohl diese Folgerung auf der Annahme beruht, dass beide Komplexklassen mit ähnlicher Empfindlichkeit durch den DPH-Assay detektiert werden). Der größte Teil des Proteins war mit den Komplexen, die in Richtung des unteren Teils des Gradienten sedimentierten (Fraktionen 5-7), assoziiert. Es ist anzumerken, dass diese Gradienten nicht bis zum Gleichgewicht gefahren wurden, weshalb die Trennung auf einer Kombination von Größe und Dichte statt auf Dichte allein beruht. Trotz der Tatsache, dass der größte Teil des Proteins in dem zweiten Peak erschien (Fraktionen 5-7), wurde der größte Teil des ISCOMATRIX-assoziierten Proteins in dem ersten Peak (Fraktionen 8-11) detektiert. Dies beruht wahrscheinlich auf der Gestaltung des Assays, da ein positives Signal erfordert, dass ein HRP-markierter Mab an ein Saponinepitop auf der Oberfläche des Teilchens bindet. Ganz klar könnte dies im Falle eines Komplexes, der so viel E6E7hh enthält, dass der Zugang sterisch behindert ist, blockiert werden. Bei einem mittleren Verhältnis von Protein zu chelatbildendem ISCOMATRIX, 1400:250 μg, wird ein ähnliches Muster beobachtet, obwohl der niedrigere Peak weniger gut von dem ersten Peak (Fraktionen 8-11) unterschieden wird und besser durch den Assay für teilchenassoziiertes E6E7hh detektiert wird, was nahelegt, dass die Komplexe nicht so groß und/oder dicht wie die des niedrigeren Peaks der 1400:500-μg-Formulierung sind. Dies ist wiederum mit den ermittelten Größenverteilungen konsistent (9).
Im Hinblick auf die Eignung der Formulierungen zur Vakzinverwendung waren bei jedem der drei Verhältnisse von Protein zu chelatbildendem ISCOMATRIX die Formulierungen gleichförmig und homogen. Bei dem 1400:125-μg-Verhältnis war das optische Aussehen klar, bei 1400:240 μg leicht durchscheinend und bei 1400:500 μg trüb. Bei dem 1400:500-μg-Verhältnis verblieben die Komplexe über mindestens einen Tag als Suspension, bevor sie sich schließlich auf dem Boden des Containers absetzten. Sie wurden mit einer kurzen Bewegung des Handgelenks leicht resuspendiert und sie zeigten, sobald sie resuspendiert waren, das gleiche Absetzverhalten.
BEISPIEL 12
Eines der Merkmale des ISCOM-Adjuvanssystems ist dessen Fähigkeit der Zufuhr von Proteinen zu antigenpräsentierenden Zellen zur Behandlung durch Mechanismen, die zur Erzeugung von cytotoxischen T-Lymphocyten-Reaktionen führen. Dies ist offensichtlich von grundlegender Bedeutung für Vakzine, die von der Induktion von CTL zur Wirksamkeit abhängen. Das erste Erfordernis für ein Vakzin auf ISCOM-Basis zur Induktion einer CTL-Reaktion besteht darin, dass es (in gewisser Weise) an das Protein gebunden wird, so dass es die Rolle eines Katalysators spielen kann. Eine minimale Anforderung muss sein, dass das Protein und das ISCOM in die gleiche antigenpräsentierende Zelle eindringen. Dies wird durch experimentelle Beweisanzeichen von einer Zahl von Systemen gestützt, in denen gezeigt wurde, dass ISCOMs (mit eingebautem Antigen) ISCOMATRIX, das mit Antigen gemischt ist, zur Induktion von CTL-Reaktionen überlegen sind. Eine Hauptausnahme ist das E6E7hh-Protein, das tatsächlich CTL induziert, wenn es mit ISCOMATRIX gemischt wird. Jedoch sind hohe Dosen dieses Proteins erforderlich (mindestens 10 μg). Ferner bedeutet die Tatsache, dass E6E7hh nur in Gegenwart eines Denaturierungsmittels löslich ist, dass es bei der Injektion ausfällt, was die Möglichkeit nahe legt, dass die CTL-Reaktionen, die induziert werden, eine Folge des Einfangens von ISCOMATRIX in unlöslichen Proteinaggregaten sind. Daher können alle CTL-Reaktionen, die beobachtet werden, die Folge einer nichtspezifischen und nicht-steuerbaren physischen Assoziation zwischen ISCOMATRIX und Protein, die auftritt, sobald das Denaturierungsmittel nach der Injektion diffundiert, darstellen.
Die Eigenschaften von E6E7hh bedeuten, dass es nicht möglich war, dieses in ISCOMs durch herkömmliche Mittel einzubauen, weshalb die Verfügbarkeit von chelatbildendem ISCOMATRIX die erste Gelegenheit zum Testen der Vorteile einer Einarbeitung liefert. Praktisch ausgedrückt liefert eine verstärkte CTL-Reaktion aufgrund von chelatbildendem ISCOMATRIX gegenüber einer Formulierung, die bereits zumindest teilweise zur Induktion von CTL fähig ist, einen rigorosen und anspruchsvollen Test der immunogenen Vorteile von chelatbildendem ISCOMATRIX. In diesem Beispiel wurden die CTL-Reaktionen, die durch identische Dosen von E6E7hh (0,75 μg, 1,5 μg und 3 μg), die mit entweder 6 μg von chelatbildendem ISCOMATRIX (Charge ch10-1207, wie in Beispiel 9 hergestellt) formuliert oder mit 6 μg ISCOMATRIX (Charge M-1207, wie in Beispiel 9 hergestellt) gemischt formuliert wurden, induziert wurde, verglichen. Ebenfalls getestet wurden 10 μg E6E7hh im Gemisch mit 6 μg ISCOMATRIX, was eine Standardformulierung ist und von der erwartet wurde, dass sie zur Induktion von CTL führt. ISCOMs, die mit durch Palmitinsäure derivatisiertem Ovalbumin hergestellt wurden, wurden zur Induktion von für die Targetzelllinie spezifischem CTL als negative Kontrolle (OVA exprimierendes EL4) verwendet und dienten als Überprüfung, dass diese für Abtöten durch CTL empfindlich waren.
Die Dosen wurden durch Zugabe gleicher Volumina von E6E7hh in 8 M Harnstoff, 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,9, und entweder ISCOMATRIX oder chelatbildendem ISCOMATRIX in 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,9, und Mischen bei Raumtemperatur über 1 h hergestellt. Die chelatbildendes-ISCOMATRIX-Formulierungen wurden dann über Nacht bei 4° gegen 50 mM TRIS, 50 mM Pi, 150 mM NaCl, 0,5% 2-Phenoxyethanol, pH 6,9, dialysiert, um den Harnstoff zu entfernen, während die ISCOMATRIX-Formulierungen 4 M Harnstoff umfassten. Für jede Immunisierung wurden die Formulierungen auf eine Dosiskonzentration mit entweder 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,9, oder 4 M Harnstoff, 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,9, verdünnt.

Gruppen von 5 Mäusen wurden subkutan mit 0,1 ml nach dem folgenden Programm dosiert:

Tagnr.	Verfahren
0	Erste Dosis
21	Zweite Dosis
28	3 Mäuse/Gruppe auf serologische und CTL-Reaktionen getestet
29	Dritte Dosis
36	2 Mäuse/Gruppe auf serologische und CTL-Reaktionen getestet

Unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Milzzellen-in-vitro-Restimulationsprotokolls wurden individuelle Mäuse auf deren CTL-Reaktionen auf E6E7hh an den oben angegebenen Zeitpunkten beurteilt. 11 zeigt, dass nach zwei Immunisierungen chelatbildendes ISCOMATRIX ein signifikant stärker wirksames Adjuvans zur Erzeugung von CTL-Reaktionen auf E7 als herkömmliches ISCOMATRIX war.
Tatsächlich erzeugte keine der mit ISCOMATRIX-Formulierungen immunisierten Mäuse eine detektierbare Reaktion bei diesen niedrigen Dosen von E6E7hh (0,75 μg, 1,5 μg und 3 μg). Die einzige detektierte Reaktion erfolgte mit 10 μg E6E7hh, was auf einer Linie mit früheren Daten von diesem System liegt. Diese Folgerung war ähnlich, wenn CTL nach drei Immunisierungen untersucht wurde. 12 zeigt, dass tatsächlich die einzige CTL, die detektiert wurde, von Mäusen kam, die mit den chelatbildendes-ISCOMATRIX-Zubereitungen immunisiert worden waren.
Antikörper gegen E7 (gegen GST-E7 unter Verwendung von Festkörper-EIA getestet) wurde erst nach der dritten Immunisierung bei allen Mäusen detektiert, jedoch waren die chelatbildendes-ISCOMATRIX-Formulierungen an diesem Punkt mit einem großen Vorsprung überlegen (13, unteres Diagramm). Dieses Ergebnis wurde in einem EIA erhalten, in dem HPV16 GST-E7 an eine feste Phase gebunden war. Da die herkömmlichen ISCOMATRIX (jedoch nicht die chelatbildendes-ISCOMATRIX)-Formulierungen Harnstoff umfassten, bestand die Möglichkeit, dass in Harnstoff durch E6E7hh induzierte Antikörper nicht adäquat detektiert wurden, wenn sie gegen GST-E7-Protein getestet wurden. Um dies als Möglichkeit formal auszuschließen, wurden Seren auf Bindung gegenüber zwei synthetischen Peptiden aus der HPV16 E7-Sequenz getestet. In diesem Assay wurden 96-Vertiefungen-Platten mit Streptavidin beschichtet und zur Bindung von biotinylierten synthetischen Peptiden verwendet. Nach Blockierung mit Casein wurden Seren unter Verwendung des gleichen Protokolls, das für GST-E7 verwendet wurde, getestet.
13 (oberes Diagramm) zeigt Ergebnisse mit dem Peptid "Biotin-SGSGMGHGDTPTLHEYMLDQPE" (pep16649, das die Reste 1-18 der E7-Sequenz darstellt). 13 (mittleres Diagramm) zeigt die Ergebnisse mit dem Peptid "Biotin-SGSGEIDGPAGQAEPDRAHYNI" (pep16650, das die Reste 37-54 der E7-Sequenz darstellt). Chelatbildendes ISCOMATRIX induzierte Antikörper mit hohem Titer gegen beide dieser Peptide und es war wiederum herkömmlichem ISCOMATRIX klar überlegen.
IL-5- und γlfn-Reaktionen wurden nach einer In-vitro-Restimulation von Milzzellen mit entweder E6E7hh oder GST-E7 nach sowohl 2 als auch 3 Immunisierungen mit jeder der Formulierungen untersucht (14). Wiederum führte eine Immunisierung mit chelatbildendem ISCOMATRIX zu signifikant höheren Reaktionen für sowohl IL-5 als auch γlfn, als dies eine Immunisierung mit herkömmlichem ISCOMATRIX tat.
Die Folgerung aus dieser Reihe von Experimenten besteht darin, dass chelatbildendes ISCOMATRIX ein wesentlich besseres Adjuvans für sowohl CTL- als auch Antikörperreaktionen als herkömmliches ISCOMATRIX ist. Zusammengenommen mit den in den Beispielen 3 und 10 präsentierten Daten (die zeigten, dass chelatbildendes ISCOMATRIX ein wirksames Adjuvans war, jedoch die Reaktionen mit niedrigen Antigenkonzentrationen und/oder optimierten Formulierungen nicht untersuchten), kann gefolgert werden, dass chelatbildendes ISCOMATRIX eine signifikante Verbesserung gegenüber bestehender Technologie darstellt.
BEISPIEL 13
ISCOPREP703 ist eine hochgereinigte Fraktion, die von QuilA, das ein relativ roher Extrakt aus der Rinde des Quillaia saponaria Molina-Baums ist und im Handel erhältlich ist, abgeleitet ist. Chelatbildendes ISCOMATRIX kann ebenfalls unter Verwendung von QuilA anstelle von ISCOPREP703 unter Verwendung der in Beispiel 9 beschriebenen Methodik formuliert werden. Ferner konnte aus QuilA hergestelltes, chelatbildendes ISCOMATRIX vollständig (His)₆ enthaltendes Protein binden.
Die folgenden Lösungen wurden hergestellt:

1. 200 mg/ml Mega-10, 10 mg/ml Cholesterin, 10 mg/ml DPPC in 150 mM NaCl, 50 mM TRIS, 0,6 mM CuCl₂·2H₂O, pH 7,2.
2. 200 mg/ml Mega-10, 10 mg/ml Cholesterin, 9 mg/ml DPPC, 1,26 mg/ml DPIDA in 150 mM NaCl, 50 mM TRIS, 0,6 mM CuCl₂·2H₂O, pH 7,2.
3. 50 mg/ml Quil-A-Saponin in 150 mM NaCl, 50 mM TRIS, pH 7,2.

Diese Lösungen wurden unter Mischen in der folgenden Reihenfolge kombiniert:
Zubereitung 1 (ISCOMATRIX) Chargennr. QA00-1511

1600 μl 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, 0,6 mM CuCl₂·2H₂O, pH 7,2
200 μl Nr. 1
200 μl Nr. 3

Zubereitung 1 (chelatbildendes ISCOMATRIX) Chargennr. QA10-1511

1600 μl 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, 0,6 mM CuCl₂·2H₂O, pH 7,2
200 μl Nr. 2
200 μl Nr. 3

Die Endzusammensetzung von Gemischen war:

	Zubereitung A (ISCOMATRIX) Charge QA00-1511	Zubereitung B (chelatbildendes ISCOMATRIX) Charge QA100-1511
ISCOPREP703^TM	5 mg/ml	5 mg/ml
Cholesterin	1 mg/ml	1 mg/ml
DPPC	1 mg/ml	0,9 mg/ml
DPIDA	nicht zugegeben	0,126 mg/ml
CuCl₂·2H₂O	5,4 mM	5,4 mM
Mega-10	20 mg/ml	20 mg/ml

Die Gemische wurden 90 min bei Raumtemperatur inkubiert, dann über 16 h gegen 2 l 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 7,2, bei Raumtemperatur unter Verwendung einer Dialysemembran der Molekulargewichtsgrenze 12000 und dann zweimal über 24 h bei 4° gegen 2 l 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,9, dialysiert. Größenverteilungen und Kupferanalyse zeigten die erfolgreiche Bildung von chelatbildendem ISCOMATRIX:
Zubereitung 1 (Chargennr. QA00-1511)

17 μM Kupfer
42 nm Durchmesser

Zubereitung 2 (Chargennr. QA10-1511)
100 μM Kupfer, was 74% des theoretischen Maximums darstellt (unter der Annahme, dass das gesamte, der Formulierung zugesetzte DPIDA in die Teilchen eingebaut ist, 100% der Chelatbildungsstellen besetzt sind und der verwendete Assay chelatisiertes Kupfer so effizient wie freies Kupfer ermittelt).
38 nm Durchmesser
Die Fähigkeit von chelatbildendem ISCOMATRIX von QuilA zur Bindung von His₆-etikettiertem E6E7 wurde dann beurteilt. E6E7hh mit 1370 μg/ml in 10 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl, 8 M Harnstoff, pH 7,5, wurde auf 62,5 μg/ml mit 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 8 M Harnstoff, pH 7,9, verdünnt. 200 μl E6E7hh-Protein wurden dann gemischt mit einem gleichen Volumen von:

1. ISCOMATRIX (Chargennr. QA00-1511)
2. Chelatbildendem ISCOMATRIX (Chargennr. QA10-1511)
3. Chelatbildendem ISCOMATRIX (Chargennr. QA10-1511) in Gegenwart von 250 mM Imidazol.

Das Volumen der Formulierungen wurde dann auf 1 ml mit 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 4 M Harnstoff, pH 6,9, aufgefüllt, was einen Endgehalt von QuilA von etwa 500 μg/ml ergab.
Die Gemische wurden 1 h inkubiert, dann wurden 0,25 ml auf die Oberseite eines 20-60% (Gew/V) Saccharosegradienten in 50 mM TRIS, 50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,9, appliziert und mit 35000 Umin^-1 15 h in einem Beckman SW40-Rotor zentrifugiert. Individuelle Fraktionen wurden gewonnen und auf ISCOMATRIX, die Gesamtmenge von E6E7hh und ISCOMATRIX-assoziiertes E6E7hh (unter Verwendung der detailliert in vorhergehenden Beispielen beschriebenen Assays) getestet. Für alle vier Zubereitungen existiert ein einziger, gut definierter chISCOMATRIX- oder ISCOMATRIX-Peak, der in den Fraktionen 8-10 zentriert ist (15). Bei der Formulierung von chelatbildendem ISCOMATRIX plus E6E7 besteht eine deutliche Assoziation von E6E7 mit dem chISCOMATRIX, was durch das Zusammenfallen von Gesamt-E6E7 (E7/E7-EIA) und dem ISCOMATRIX-assoziierten E6E7 (E7/QA) gezeigt wird. Im Gegensatz dazu waren die Profile der zwei Kontrollformulierungen deutlich verschieden. Für sowohl ISCOMATRIX plus E6E7 als auch chelatbildendes ISCOMATRIX plus E6E7 in Gegenwart von Imidazol war sehr wenig E6E7 in den Fraktionen, die ISCOMATRIX enthielten, vorhanden und ISCOMATRIX-assoziiertes E6E7 wurde tatsächlich nicht detektiert.
Diese Analyse ergibt einen klaren Beweis für die Bindung von E6E7hh an chelatbildendes ISCOMATRIX, das mit Quil-A-Saponin formuliert ist.
VERWEISSTELLEN

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Immunstimulierende Komplexmatrix, die eine Saponinzubereitung, ein Sterol und ein Phospholipid umfasst, wobei die Matrix ferner eine Metallchelatbildungseinheit umfasst, die zur Bindung eines Proteins oder Polypeptids, das mindestens eine chelatbildende Aminosäuresequenz aufweist, in Gegenwart von Metallionen fähig ist.
Matrix nach Anspruch 1, wobei die Metallchelatbildungseinheit a. eine hydrophobe Sequenz, die das Molekül in der Matrix verankert, b. eine Metallchelatbildungskopfgruppe und optional c. eine Spacerregion, die die Chelatbildungskopfgruppe von der Oberfläche der Matrix trennt, umfasst.
Matrix nach Anspruch 2, wobei die Metallchelatbildungseinheit ein phospholipidähnliches Molekül, in dem die Metallchelatbildungskopfgruppe eine chelatbildende Iminodiessigsäure (IDA) ist, umfasst.
Matrix nach Anspruch 3, wobei die Metallchelatbildungseinheit 1,2-Distearyl-rac-glycerin-3-(8-(3,6-dioxy)octyl-1-amino-N,N-diessigsäure) (als DSIDA abgekürzt) oder 1,2-Dipalmitoyl-rac-glycerin-3-(8-(3,6-dioxy)octyl-1-amino-N,N-diessigsäure) (als DPIDA abgekürzt) ist.
Matrix nach Anspruch 3, wobei die Metallchelatbildungseinheit ein phospholipidähnliches Molekül, in dem die Metallchelatbildungskopfgruppe N-Nitrilotriessigsäure ist, umfasst.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Saponinzubereitung Quil A ist.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Saponinzubereitung eine gereinigte Saponinzubereitung, die von Quilaja saponaria abgeleitet ist, oder eine Fraktion oder ein Gemisch von Fraktionen derselben ist.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Sterol Cholesterin ist.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Phospholipid Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) ist.
Immunogener immunstimulierender Komplex, der eine Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und ein immunogenes Protein oder Polypeptid, das mindestens eine chelatbildende Aminosäuresequenz aufweist, umfasst, wobei das Protein oder Polypeptid in Gegenwart von Metallionen an die Matrix gebunden ist.
Komplex nach Anspruch 10, wobei das Protein oder Polypeptid eine Polyhistidinsequenz umfasst.
Komplex nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Protein oder Polypeptid ein rekombinantes Protein oder Polypeptid ist.
Komplex nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Protein oder Polypeptid ein natürlich vorkommendes Protein oder Polypeptid ist.
Komplex nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das Protein oder Polypeptid in Gegenwart von zweiwertigen Metallionen, wie Cu⁺⁺, Ni⁺ ⁺, Zn⁺⁺ oder Co⁺ ⁺, an die Matrix gebunden ist.
Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder Komplex nach einem der Ansprüche 10 bis 14, die bzw. der des weiteren ein oder mehrere Adjuvantien, Immunsuppressiva oder andere Immunmodulatoren umfasst.
Vakzinzusammensetzung zur Verwendung beim Auslösen einer Immunreaktion bei Menschen oder Tieren, die als aktive Komponente derselben einen immunogenen immunstimulierenden Komplex nach einem der Ansprüche 10 bis 14 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch und/oder veterinärmedizinisch akzeptablen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln umfasst.
Verwendung eines immunogenen immunstimulierenden Komplexes nach einem der Ansprüche 10 bis 14 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung beim Auslösen einer Immunreaktion bei Menschen oder Tieren.