JPH10508301A - サポニン製剤およびｉｓｃｏｍでのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】Quillaja saponariaのサポニンの製剤は、良好なアジュバント活性、低溶血活性、および免疫刺激複合体（ｉｓｃｏｍｓ）を形成する良好な能力を有するQuilAの画分を含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】 サポニン製剤およびＩＳＣＯＭでのその使用 発明の分野 本発明はサポニン製剤、特にQuillaja saponaria Molina の樹皮由来の精製し たサポニン画分の定義された組成物を基剤とするサポニン製剤に関する。本発明 は、これらのサポニン製剤を用いて製造した免疫刺激複合体(immnostimulating complex)（iｓｃｏｍ）マトリックス、並びに免疫原をｉｓｃｏｍマトリックス に配合しまたはこれと合同させた免疫原性ｉｓｃｏｍにも拡張される。このよう な免疫原は、通常は細菌、ウイルスまたは他の微生物由来のタンパク質またはペ プチドであるが、それらは免疫応答を誘発することができる任意の他のタンパク 質、ペプチドまたは他の化合物であることもできる。 本発明のサポニン製剤およびそれらを用いて製造したｉｓｃｏｍマトリックス は、アジュバントとして、すなわちワクチン成分の免疫原性を特異的に増加する 生成物としての特定の活性を有する。 発明の背景 サポニンのアジュバント特性は、免疫原に対する抗体力価を増加するその能力 を有するものとして以前から知られている。ここで用いられる「サポニン」とい う用語は、親水性領域（通常は、数個の糖鎖）をステロイドまたはトリテルペノ イド構造の疎水性領域と組み合わせてなる植物性の界面活性グリコシドの群を指 す。サポニンは多種多様な供給源から得られるが、有用なアジュバント活性を有 するサポニンは南米の樹木Quillaja saponaria Molina から誘導されている。こ の供給源からのサポニンは、「Quil A」と呼ばれる「均質な」画分を単離するの に用いられた（Dalsgaard，1974年）。 急性毒性は、ワクチン製剤におけるQuil Aの獣医およびヒトでの使用に関する 極めて重要な問題である。Quil A の急性毒性を回避する一つの方法は、ｉｓｃ ｏｍｓ（免疫刺激複合体(immuno stimulating complexs)の略号）の使用である 。これは、主として、Quil Aが、ｉｓｃｏｍｓに配合するときに余り毒性が高く なく、またｉｓｃｏｍにおいてこれをコレステロールと組み合わせたものは細胞 膜でのコレステロールに対するその親和性が減少し、従ってその細胞溶解作用が 減少するからである。更に、同様な水準のアジュバント効果を生じるには、Quil Aの量は少なくて済む。Ｉｓｃｏｍｓは、通常は直径が３０〜４０ｎｍの小さな ケージ（ｃａｇｅ）様構造であり、凍結乾燥時にこの構造を保持する。典型的な 免疫原性ｉｓｃｏｍと最適量の免疫原性タンパク質との最終的処方は、Quil A、 コレステロール、ホスファチジルコリン、およびタンパク質の重量比が（１：１ ：１：５）である。このような典型的なｉｓｃｏｍは、Quil A ５〜１０重量％ 、コレステロールおよびリン脂質１〜５重量％を含み、残りはタンパク質である 。ペプチドは直接ｉｓｏｃｏｍｓに配合することができ、またはｉｓｏｃｏｍｓ にキャリヤータンパク質（例えば、インフルエンザエンベロープタンパク質）を 配合した後、キャリヤータンパク質への化学的結合によってｉｓｃｏｍｓに配合 することができる。 アジュバントとしては、ｉｓｃｏｍは、強力な免疫刺激効果、低毒性、細胞（ ＣＴＬなど）および体液応答を誘発する能力などの多くの利点を有し、またこれ は試薬および製造コストが廉価である。しかしながら、従来は、ｉｓｃｏｍｓは ２つの主要な欠陥を有していたのであり、第一に、それらの製造に用いられるQu il Aは生物学的に誘導される生成物の複雑かつ不明瞭な混合物であり、従ってバ ッチ毎の変動が予想されたのであり、第二に、ｉｓｃｏｍｓは注射部位反応性お よび低いが検出可能なイン・ビボ毒性を示したのである。 Quil A（Dalsgaard，1974年）のアジュバント活性の認識以来、幾つかのグル ープがこの材料を更に分画して、多数の「精製した」成分とした(Morein et al. ,オーストラリア国特許第６３２０６７号明細書、Kersten，1990; Kensil,1988; Kensil，1991）。これらの成分は、次に特にアジュバント活性、溶血活性、お よびｉｓｃｏｍｓを形成する能力に関して様々な特性を有することが示された。 精製したQuil A成分を用いることによって、ヒトワクチンにおけるそれらの使用 について２種類の潜在的利点が得られた。第一は、精製した成分を特性決定する ことにより、再現性を有するようにすることができ、第二に、これらの成分を最 適有用性について選択できたことである。 Quil Aサポニンの免疫調節特性(immunomodulatory properties)、およびこれ らのサポニンがｉｓｃｏｍに配合されるときにこれらのサポニンから誘導される 追加の利点は様々な刊行物、例えばCox and Coulter，1992; Dalsgaard，1974; Morein et al.，オーストラリア国特許第５５８２５８号、第５８９９１５号、 第５９０９０４号、および第６３２０６７号明細書に記載されている。オースト ラリア国特許第６３２０６７号明細書には、Quil Aの製剤を分離して、Ｂ４Ｂ、 Ｂ３およびＢ２と呼ばれる３種類の異なる画分とすることが、この分画化のため のＨＰＬＣクロマトグラフィ手続きと共に記載されている。用いた精製系におい て疎水性の程度が増加した３種類の主要な画分を生じるQuil Aの分画化のための 更に慎重に定義されかつ制御可能な手順が考案された。 本発明に至る研究において、Quillaja saponaria由来のサポニンを、アジュバ ント活性、溶血活性、ｉｓｃｏｍｓを形成する能力およびイン・ビボ毒性の重要 な生物学的特性などの様々な化学的および生物学的特性を有する画分に分離する ことができ、これらの画分の特定の組成物を製造して、最適なアジュバント活性 を有するが、溶血および毒性活性は最小限である良好なｉｓｃｏｍｓを形成する ことができる新規なサポニン製剤を形成することができることを示した。 発明の概要 本発明によれば、Quillaja saponariaのサポニンを含んでなるサポニン製剤で あって、（本明細書で定義される）Quil Aの画分Ａ５０〜９０重量％、および（ 本明細書で定義される）Quil Aの画分Ｃ５０重量％〜１０重量％を含んでなる製 剤が提供される。 好ましくは、サポニン製剤は、画分Ａを５０重量％〜７０重量％と、画分Ｃを ５０重量％〜３０重量％を含んでなる。特に好ましい製剤は、画分Ａ約７０重量 ％と画分Ｃ約３０重量％を含んでいる。 「Quil A」という用語は、本明細書および請求の範囲において、Quillaja sap onaria の半精製サポニン画分の総称として用いられる。 サポニン製剤は、所望ならば、Quil Aの画分Ｂまたは他のサポニンの少量など の、所望な免疫調節特性(immunomodulatory properties)を有する他のアジュバ ント材料の少量（例えば、４０重量％まで）を含むことができる。本製剤に包含 するのに好適な他のサポニンまたは他のアジュバント材料の例は、オーストラリ ア国特許第６３２０６７号明細書に記載されており、上記特許明細書の内容は、 引用によって本明細書に包含される。 上記のように、免疫刺激複合体（ｉｓｃｏｍ）マトリックスを製造するには、 Quil A、コレステロールのようなステロール、場合によってはホスファチジルコ リンのような脂質が反応混合物に含まれなければならないことがわかっている。 本発明のもう一つの態様によれば、サポニン製剤、ステロールおよび場合によ っては脂質を含んでなる免疫刺激複合体（ｉｓｃｏｍ）マトリックスであって、 サポニン製剤が（本明細書で定義される）Quil Aの画分Ａ５０〜９０重量％およ び（本明細書で定義される）Quil Aの画分Ｃ５０重量％〜１０重量％を含むもの が提供される。 好ましくは、このようなｉｓｃｏｍマトリックスでは、ステロールはコレステ ロールであり、（場合によって含まれる）脂質はホスファチジルコリンのような リン脂質である。 更にもう一つの態様では、本発明は、ｉｓｃｏｍマトリックスに配合されまた はこれと合同される(associated)少なくとも１種類の免疫原を有する上記のｉｓ ｃｏｍマトリックスを含む免疫原性ｉｓｃｏｍを提供する。 本発明によるｉｓｃｏｍマトリックスまたは免疫原性ｉｓｃｏｍは、当業者に 周知であって、Cox and Coulter，1992 年の刊行物、およびMorein et al.,オー ストラリア国特許第５５８２５８号、第５８９９１５号、第５９０９０４号およ び第６３２０６７号明細書に詳細に記載されている技法によって製造することが でき、上記文献の開示内容は、引用によって本明細書に包含される。 本発明によるｉｓｃｏｍマトリックスに配合されまたはこれと組み合わせる免 疫原は、任意の化合物であって、ヒトまたは他の動物のような（これらに限定さ れない）個体において免疫応答であって、細菌、ウイルスまたは他の微生物に対 する体液および／または細胞によって媒介される免疫応答を含むが、これらに限 定されない免疫応答を誘発することができる化学物質であることができる。 特異的な免疫原は、タンパク質またはペプチド、多糖類、リポ多糖類、または リポペプチドであることができ、またはこれは、これらの任意のものの組み合わ せであることができる。特に、特異的な免疫原としては、天然タンパク質または タンパク質断片、または合成タンパク質またはタンパク質断片、またはペプチド を挙げることができ、これは、糖タンパク質、糖ペプチド、リポタンパク質、リ ポペプチド、核タンパク質、核ペプチドを挙げることができ、また、これはペプ チド−ペプチド抱合体を挙げることができ、これは、組換え核酸発現生成物を挙 げることができる。このような免疫原の例としては、ウイルス性または細菌性肝 炎、インフルエンザ、ジフテリア、破傷風、百日咳、麻疹、流行性耳下腺炎、風 疹、ポリオ、肺炎双球菌、疱疹、呼吸器合胞体性(respiratory syncytial)ウイ ルス、インフルエンザ菌、クラミジア菌、水痘−帯状疱疹ウイルス、狂犬病、ま たはヒト免疫不全ウイルスに対する免疫応答を誘発することができるものが挙げ られるが、これらに限定されない。 本発明は、(i)詳細に上記した免疫原性ｉｓｃｏｍ、または(ii)詳細に上記し たｉｓｃｏｍマトリックスおよび少なくとも１種類の免疫原のいずれかを活性成 分として、１または２種類以上の薬学上許容可能なキャリヤーおよび／または希 釈剤と共に含んでなるワクチン組成物にも拡張される。 このようなワクチン組成物の処方は、当業者には周知である。好適な薬学上許 容可能なキャリヤーおよび／または希釈剤としては、任意および総ての通常の溶 媒、分散媒、増量剤、固形キャリヤー、水溶液、コーティング剤、抗菌および抗 真菌剤、等張および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学活性物質についてのこの ような媒質および薬剤(agent)の使用は当該技術分野で周知であり、例えば、Rem ington の製薬科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)、第18版、Mack Pu blishing Company,ペンシルバニア州，米国に記載されている。任意の通常の媒 質または薬剤が活性成分と不相容性であることを除いては、本発明の医薬組成物 でのその使用がありうる。補足的な活性成分を、組成物に配合することもできる 。 投与を容易にし、投薬を均一にする目的で、組成物を投与単位形態で処方する のが特に有利である。ここで用いられる投与単位形態は、治療を受けるヒト被験 者に対する単一投与量として好適な物理的に分離されている単位であり、それぞ れの単位は、必要とされる薬学キャリヤーおよび／または希釈剤と組み合わせて 所望な治療効果を生成するのに計算された活性成分の所定量を含んでいる。本発 明の新規な投与単位形態の詳細は、(a)活性成分の特性および達成しようとする 特定の治療効果、および(b)特定の治療についてのこのような活性成分を配合す る当該技術分野に固有の制限によりかつこれらにより直接指示される。 更にもう一つの態様では、本発明は、個体での免疫応答を引きだしまたは誘導 する方法であって、個体に対して、詳細に上記したワクチン組成物の免疫学的に 有効量を投与することを含んでなる方法にも拡張される。 上記のように、個体は、ヒトまたは他の動物、例えば家畜動物（例えば、ヒツ ジ、ウシまたはウマ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ま たはモルモット）、愛玩動物（例えば、イヌまたはネコ）、または野生動物であ ることができる。 免疫学的に有効量は、所望な免疫応答を少なくとも部分的に達成し、または治 療を行なう特定の症状の開始を遅延させ、進行を抑制し、または開始または進行 を完全に停止させるのに必要な量を意味する。この量は、治療を受ける個体の健 康および肉体的条件、治療を受ける個体の分類学的群、抗体を合成する個体の免 疫系の能力、所望な保護の程度、ワクチンの処方、医学的状態の評価、および他 の関連因子によって変化する。この量は、日常の試験によって決定することがで きる比較的広い範囲にあることが予想される。 以下の本明細書および特許請求の範囲において、特に断らない限り「含む」と いう用語、または「含んでなる」または「含んでなり」のような変化体は、記載 した完全体(integer)または完全体の群を包含するが、任意の他の完全体または 完全体の群を除外しないことを意味するものと理解される。 発明の詳細な説明 粗製の水性Quil A抽出物を精製してQuil Aの画分Ａ、ＢおよびＣとすることを 、実施例１以後において詳細に説明する。この精製手順は単なる例として包含さ れ、画分Ａ、ＢおよびＣと機能的に類似しているまたは同等な画分は、多種多様 な他のクロマトグラフィ手順によって製造することができることを理解すべきで ある。 ここに示した画分Ａ、ＢおよびＣの同定のため、実施例１の精製手続きに関し て説明する。一般的条件では、この手順において画分Ａ、ＢおよびＣは粗製の水 性Quil A抽出物のクロマトグラフィ分離および７０％アセトニトリル／水での溶 出により親油性画分を回収するときに得られた親油性画分から製造される。次に 、この親油性画分を、２５％〜６０％アセトニトリル／酸性水のグラディエント を用いて溶出を行なう半調製用ＨＰＬＣによって分離する。本明細書で「画分Ａ 」または「ＱＨ−Ａ」と表される画分は、約３９％アセトニトリルで溶出される 画分であるかまたはそれに相当する。本明細書で「画分Ｂ」または「ＱＨ−Ｂ」 と表される画分は、約４７％アセトニトリルで溶出される画分であるかまたはそ れに相当する。本明細書で「画分Ｃ」または「ＱＨ−Ｃ」と表される画分は、約 ４９％アセトニトリルで溶出される画分であるかまたはそれに相当する。 Quil Aの画分Ａ、ＢおよびＣを本明細書のように製造するときには、それぞれ 定義可能な特性を有する化学的に関連性の高い分子の群または族を表す。これら が得られるクロマトグラフィ条件は、溶出曲線および生物学的活性によるバッチ 毎の再現性が極めて一貫しているようなものである。 上記の画分Ａ、ＢおよびＣを、アジュバント活性、溶血活性およびｉｓｃｏｍ ｓを形成する能力について検討し、結果を第１表に示す。 意外なことには、画分ＡとＣとの特定の組み合わせ、更に詳細には画分Ａを５ ０〜９０重量％と画分Ｃを５０〜１０重量％との組み合わせ（画分Ｂは０％）で は、Ａの所望な特性（良好なｉｓｃｏｍ形成および低溶血活性）とＣの利点（良 好なアジュバント活性）とを有するサポニン製剤が得られることが分かった。本 発明の特に好ましいサポニン製剤では、７部のＡ：０部のＢ：３部のＣの比率 （＝７，０，３、またはＱＨ７０３）は、極めて良好なアジュバント活性を提供 し、ｉｓｃｏｍｓを容易に形成して、これらの成分画分から予想されるよりも極 めて低い溶血活性を有することが見いだされた。しかしながら、本発明は、５部 のＡ：０部のＢ；５部のＣ（＝５，０，５、またはＱＨ５０５）〜９部のＡ：０ 部のＢ；１部のＣ（＝９，０，１、またはＱＨ９０１）の範囲の他のサポニン製 剤にも拡張されることを理解すべきである。 下記の実施例では、Ａ、ＢおよびＣの精製法を記載し、および純粋なＡ（１０ ，０，０）、純粋なＢ（０，１０，０）、純粋なＣ（０，０，１０）および混合 物ＱＨ７０３（７，０，３）をアジュバント活性、溶血活性、ｉｓｃｏｍ形成の 容易さ、および免疫調節活性のマーカーであるＩＬ−１の誘導について比較する 。また、本発明のサポニン製剤およびそれから作成したｉｓｃｏｍマトリックス の前臨床安全性プロフィール、並びにこのｉｓｃｏｍマトリックスの臨床的安全 性を証明するデーターも含まれる。このデーターからの総合的結論は、ＡとＣの 比率がほぼ７：３のＡとＣの混合物（＝７，０，３、またはＱＨ７０３）は精製 サポニンの最適比であり、これからｉｓｃｏｍマトリックスまたは免疫原性ｉｓ ｃｏｍｓが形成される。 本発明の他の特徴は、下記の実施例に更に詳細に説明する。しかしながら、こ の詳細な説明は単に本発明を例示する目的で包含されるものであり、上記の発明 の詳細な説明に対する制限と理解すべきではない。 添付図面において、 第１図は、ＨＰＬＣによる画分Ａ、ＢおよびＣの製造を示し、 第２〜４図は、ｉｓｃｏｍマトリックスの製造におけるスクロースグラディエ ント溶出曲線を示し、 第５図は、様々な量および組成物のQuil Aおよびその画分を投与した後のマウ スの血漿中ＩＬ−１濃度を示す。 実施例１ 粗製のQuil A抽出物の画分Ａ、ＢおよびＣへの精製 粗製Quillaja樹皮抽出物の水溶液（０．５ｇ／ｍｌ）（０．５ｍｌ）を、sep- pak カラム(Waters Associates，マサチューセッツ）上で前処理を行なう。 前処理は、充填したsep-pak カラムを１０％アセトニトリル／酸性水で洗浄し て親水性物質を除去することを含んでいる。次に、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱ Ｈ−Ｃを含む親油性物質を７０％アセトニトリル／水で溶出する。 次いで、sep-pak カラムからの親油性画分を、半調製用ＨＰＬＣカラム（CT-s il，C8，10 ｘ 250 mm，Chrom Tech，スウェーデン）によって分離する。試料を 、カラムから２５％〜６０％アセトニトリル／酸性水によって溶出する。分離の 際に、ＨＰＬＣカラムから３画分を集める。これらの３画分を蒸発させた後の残 渣は、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを構成している。 ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃと呼ばれる画分は、それぞれ約３９、４７ および４９％アセトニトリルで溶出した。抽出物溶出曲線および条件を、第１図 に示す。 実施例２ 精製したＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃの単独または組み合わせによるｉｓ ｃｏｍｓの形成 ｉｓｃｏｍｓのサブユニットは、Quillajaサポニンとコレステロールとの相互 作用によって得られる。この場合に、サブユニットのｉｓｃｏｍマトリックス構 造への組み立てには、リン脂質が含まれる。ｉｓｃｏｍマトリックスの製造のた めの典型的な反応混合物は、Quil Aが５ｍｇ／ｍｌ、およびコレステロールおよ びリン脂質がそれぞれ１ｍｇ／ｍｌである。下記の実験を行ない、各種のQuil A 画分についての最適反応条件を決定した。これらの実験では、Quil Aとコレステ ロール／リン脂質との相互作用が安定になれば、構造は免疫原を配合するのに一 層適し、分解および同時に溶血活性の増加はない、と思われる。 材料 コレステロールおよび³Ｈ−コレステロール（４２１１ｃｐｍ／μｇ） １０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）／２０％ＭＥＧＡ−１０（ｗ／ｗ）／Ｈ₂Ｏ、 ホスファチジルコリン(phosphatidyl choline)および³Ｈ−ホスファチジルコリ ン １０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）／２０％ＭＥＧＡ−１０（ｗ／ｗ）／Ｈ₂Ｏ、 ＱＨ−ＡおよびＱＨ−Ｃ １００ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｗ）／Ｈ₂Ｏ、 ＰＢＳ、 透析管(Dialysis tubing)、分子量カットオフ１２〜１4，０００ 方法 反応混合物を第２および３表に示すように設定し、室温で２時間インキュベー ションを行なった後、室温でＰＢＳに対して大量に透析した。 次いで、総ての試料を、スクロースグラディエント遠心分離を施した。１０〜 ５０％（ｗ／ｗ）スクロース、２００，０００×ｇ(Raver)、１０℃、１８時間 、１１．４ｍｌ試験管(Rotor TST 41.14 eq to SW-40)。 スクロースグラディエント曲線を、実験１〜３に対してそれぞれ第２〜４図に 示す。 これらの実験の結論を、下記にまとめる。 実験１ａ〜ｄ マトリックスの均質な製剤を生じるコレステロール(cholesterol)：ＱＨ−Ａ の比率は１ｃであり、すなわちＣＨＯＬ：ＱＨＡ＝１：４の初期比率（透析前） で行なったものであり、単離した最終生成物では１：２の比率となる。ＣＨＯＬ の比率が更に高い混合物（１ａ〜ｂ）は、乳白色〜若干乳白色の製剤であって総 てのコレステロールがＱＨによって結合されているのではないものを生じた。低 めのＣＨＯＬ：ＱＨＡの比率を有する製剤（１ｄ）はマトリックスの均質な製剤 を生成せず、この製剤は多数の小さな断片（上方ピーク）を含んでいた。 実験２ａ〜ｄ マトリックスの均質な製剤を生じるコレステロール：ＱＨ−Ｃの比率は２ｂで あり、すなわちＣＨＯＬ：ＱＨＣ＝１：２の初期比率（透析前）で行なったもの であり、単離した最終生成物では１：１．４の比率となる。ＣＨＯＬの比率が更 に高い混合物（２ａ−）は、乳白色製剤であって総てのコレステロールがＱＨに よって消費されているのではないものを生じた。低めのＣＨＯＬ：ＱＨＣの比率 を有する製剤（２ｃ〜ｄ）はマトリックスの均質な製剤を生成せず、製剤２ｃは 幾つかの小さな断片（上方ピーク）を含んでおり、製剤２ｄはかなりの量の断片 を含んでいた。 実験３ａ〜ｄ この実験では、同量のＱＨ−Ａおよびコレステロールを実験１ａ〜ｄと同様に 混合したが、ＣＨＯＬと同量のＰＣも加えた。ＱＨ二重混合物(QH Double mixtu res)は、ＣＨＯＬまたはＰＣ標識（³Ｈ）で製造した。第３ａ〜ｄ図に示される ように、ＣＨＯＬ：ＱＨＡの理想的比率は影響されず、混合物の初期比率は１： ４（３ｃ）となるべきであるが、ＰＣは実験１ｄと比較して３ｄでは複合体を一 緒に維持しておくのを補助する。 以上のことから、２つの結論を導くことができる。 i) 脂質およびコレステロール対ＱＨの比率は、１：４〜１：５が最適である。 ii) コレステロール対ＱＨの比率を極めて精確にバランスを採り、コレステロー ルもＱＨも過剰でなくするＱＨ−ＡおよびＱＨ−Ｃの混合物は、ＱＨ７０３であ る。例えば、１：５の比率を用いると、ｃｈｏｌ：ＱＨ−Ａの比率は１：３．５ であり、ｃｈｏｌ：ＱＨ−Ｃの比率は１：１．５であり、いずれも実験１および ２で決定した最適比率に極めて接近している。 実施例３ ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、ＱＨ−ＣおよびＱＨ７０３から形成したインフルエンザウ イルスｉｓｃｏｍｓについての免疫原性および効力の検討 目的： Ｉｓｃｏｍｓにおける「Quil Aヒト」（ＱＨ）成分Ａ、ＢおよびＣの各 種の組み合わせの相対的効力を決定するため。 実験条件 1. 粉末形態で供給されたQuil A成分Ａ、ＢおよびＣ。 2. 下記の処方でのＱＨ成分Ａ、ＢおよびＣのＩｓｃｏｍｓを作成した。 (a) １０：０：０、(b) ０：１０：０、(c) ０：０：１０、または(d) ７：０ ：３。 ｉｓｏｃｏｍ−マトリックスおよびタンパク質−ｉｓｃｏｍｓの製造 下記の溶液を調製する。 ２０％（ｗ／ｗ）ｍｅｇａ１０／蒸留水 １０ｍｇ／ｍｌコレステロールおよび１０ｍｇ／ｍｌ卵ＰＣ／２０％ｍｅｇａ− １０ １００ｍｇ／ｍｌＱＨ７０３／ｐＨ６．２ リン酸緩衝塩水。 タンパク質ｉｓｃｏｍｓを作成するときには、配合するタンパク質は約０．７ ５ｍｇ／ｍｌであるべきである。 方法： リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４の０．８ｍｌ（ｉｓｃｏｍマトリック スの場合）、または０．７５ｍｇ／ｍｌタンパク質／ＰＢＳ、ｐＨ７．４の０． ８ｍｌ（タンパク質−ｉｓｃｏｍｓの場合）に、コレステロール／卵ＰＣ／ｍｅ ｇａ−１０の８０μｌを加えて、混合する。１００ｍｇ／ｍｌＱＨ７０３の４０ μｌを加えて、混合する。室温（２２〜２４℃）で一晩撹拌。 ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して、室温で４時間透析後、ｐＨ６．２のＰＢＳに対し て４時間透析。 最後に、ｐＨ６．２のＰＢＳに対して、４℃で透析。 3. ワクチンは、投与量当たり０．１μｇまたは１．０μｇのインフルエンザウ イルスＨＡおよび投与量当たり６μｇまたは１５μｇのＱＨを用いて調製した。 用いた菌株はＡ／ＰＲ／８／３４のマウス伝染性菌株であった。 4. マウスは６〜８週齢であり、１群当たり１５匹のBalb/Cマウスを総ての群に 対して用いた。 5. マウスの背部に０．１ｍｌの投与量を皮下投与した。マウスの体重を、一次 免疫時、および３および７日後に測定した。 6. 総てのマウスは、一次免疫の４週間目に瀉血した。 7. 群１ａ〜２１ａ（５匹／群）のマウスをこの時点（４週目）で追加免疫し、 ７〜１０日後に瀉血した。 8. 群１〜２１を、５週間目にエアゾール抗原投与により免疫を行なった。群１ ａ〜２１ａは抗原投与しなかった。 9. 一次および二次瀉血を、全ウイルスに対する抗体応答について分析した。 結果を第４表に示す。純粋なＱＨ−Ａ＝１０，０，０から作成したｉｓｃｏｍ ｓ（群１〜４）に配合したインフルエンザウイルスＨＡは、総体的に７部のＱＨ −Ａおよび３部のＱＨ−Ｃの混合物から作成したもの＝７，０，３（群１３〜１ ６）よりも免疫原性は低かった。群４に対する一次力価は、群１６に対するもの より有意に低かった（ｐ＜．０１）。また、これらのｉｓｃｏｍ製剤は、引き続 く抗原投与について防御が１００％未満であることによって示されるように、防 御性はより低かった。群１における生存動物では、有意な体重減少も示され、体 重減少の程度は、ワクチン接種によって与えられる防御の程度のもう一つの指示 体であった。 同様に、群１４および１６に対する一次力価は、それぞれ群１０および１２の ものより有意に高かった。また、６μｇのＱＨ７０３／用量も、少なくとも１０ μｇの全Quil A／用量と同程度の効果を示した（群１３および１７を比較された い）。 まとめると、これらの実験は、ＱＨ７０３を用いることによって、Quil Aの毒 性の高い画分によって示されるのと少なくとも同じ免疫原性および効力を示し、 しかもこれらの毒性成分は遥かに低濃度であることを示している。 実施例４ ＱＨ７０３から形成したインフルエンザウイルスタンパク質ｉｓｏｃｏｍｓにつ いての免疫原性の検討 この実験では、ヒツジ（１０頭／群）に、分裂ウイルス(disrupted virus)(B/ Panama)ウイルス−ｉｓｃｏｍｓまたは分裂ウイルスとｉｓｃｏｍｐマトリック スとを合わせたものを、４週間の間隔をおいて深部筋肉内注射によって２回投与 した。総てのｉｓｃｏｍワクチンは、６０μｇ／用量のＱＨ７０３を含んでい た。ワクチンの２回目の投与の直前に動物を採血し、２回目の投与の１週間後に 再度採血した。血清を、ウイルスに対する抗体についてＥＩＡによって分析した 。結果を、第５表に示す。 実施例５ ネコにおけるＱＨ７０３ ＤＴ−ＬＨＲＨｉｓｃｏｍｓの免疫原性 ネコに、デカペプチドＬＨＲＨが、ペプチド対タンパク質の分子比が２０：１ で結合したジフテリアトキソイドの複合体５ｍｇを、４週間の間隔をおいて投与 した。７匹のネコの１群には、複合体だけを投与し、他の群の７匹のネコの群に は、複合体を１００μｇＱＨ７０３ｉｓｃｏｍマトリックスと混合した物を投与 した。ＥＩＡによって測定したＬＨＲＨペプチドに対する抗体の評価についての 結果を、第６表に示す。ＱＨ７０３ｉｓｃｏｍマトリックスは、有意なアジュバ ント効果を有し（ｐ＜．０１）、中間力価は６倍に増加することが分かる。 実施例６ Quillajaサポニンの様々な混合物によるＩＬ−１誘導 Quil A、ＱＨ−Ｃ、およびＱＨ−ＡおよびＱＨ−Ｃが７：３（＝ＱＨ７０３） 、５：５（＝ＱＨ５０５）および３：７（＝ＱＨ３０７）の比率での混合物の製 剤を用いて、標準的手順（実施例３を参照されたい）によるｉｓｃｏｍマトリッ クスを作成した。これらのｉｓｃｏｍｓを、マウスに１〜２０μｇ／マウスの用 量で皮下投与した。血漿試料を８時間後に採取し、ＥＩＡによってＩＬ−１につ いて試験した。第５図の結果は、ＱＨ７０３が、他の製剤がＩＬ−１産生を誘導 する能力において有意に異なっていたことを示している。この応答はこれらの各 種の成分および混合物から作成したｉｓｃｏｍｓの潜在的免疫調節活性について の有用なマーカーであると考えられる。 実施例７ Quil A、および各種のＱＨ画分および混合物の溶血活性 分析プロトコール ヒト血液（２０ｍｌ）を、リチウムヘパリン血液収集管に集め、グルコースク エン酸塩溶液中で３０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離することによって２回洗 浄した後、赤血球をグルコースクエン酸塩溶液に再懸濁する。 試験用のサポニン溶液を、９６穴マイクロ力価トレー中で８００μｇ／ｍｌか ら２倍に希釈することによって希釈する。これらのウェルのそれぞれに、十分な 量の赤血球懸濁液を加えて、全体的な溶血が起こる場合には、ＥＩＡプレートリ ーダー中の４０５ｎｍでの吸光度が約１．０となるようにする。 サポニン溶液と赤血球を緩やかに混合して、３７℃で１時間インキュベーショ ンした後、プレートを１０００ｇ、４℃で２分間遠心分離した後、４０５ｎｍの 吸光度をＥＩＡプレートリーダーで読み取った。結果は、５０％溶血を生じるの に要するサポニン製剤の濃度として表す。必要な濃度が高くなれば、製剤の溶血 性は低くなる。 ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、ＱＨ−ＣおよびＱＨ７０３の多数の各種試料を、溶液で のその溶血力価について試験し、代表的な試料を用いてインフルエンザｉｓｃｏ ｍｓおよびｉｓｃｏｍマトリックスを調製し、次にこれらを溶血活性について試 験した。結果を第７表に示す。溶液では、ＱＨ７０３は、ＱＨ−ＡとＱＨ−Ｃと の混合物のそれらの比率から予想される溶血活性を有することが分かる。最高か ら最低までの活性の順序は、下記の通りである。ＱＨ−Ｂ＞ＱＨ−Ｃ＞ＱＨ７０ ３＞ＱＨ−Ａ。 しかしながら、これらのサポニンを用いてｉｓｃｏｍｓを作成すると、溶血活 性が減少する程度は、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃについては約１０倍であり、ＱＨ −ＡおよびＱＨ７０３については４０倍の範囲で変動する。従って、ｉｓｃｏｍ ｓでＱＨ７０３を使用することは、このサポニンの溶血活性を最小限にしたまま ＱＨ−Ｃのアジュバント活性量を配合するための最適の方法であることが示され る。 実施例８ ＱＨ７０３の前臨床安全性 ＱＨ７０３、並びにＱＨ７０３から製造したｉｓｃｏｍマトリックスおよび免 疫原性ｉｓｃｏｍｓに、前臨床毒物学的および安全性試験を行ない、ヒトでの臨 床検討を開始する前にその安全性を確かめた。Ｉｓｃｏｍマトリックスおよびお よびインフルエンザｉｓｃｏｍｓは、実施例３の方法によって製造した。 下記の突然変異誘発試験を、ＱＨ７０３を用いて行なった。 エイムス試験 培養した哺乳動物細胞を用いる染色体異常の検討 ＣＤ−１マウスの骨髄での小核試験 マウスのリンパ腫突然変異分析。 下記の毒物学的検討を行なった。 単回投与： ＱＨ７０３、ラット筋肉内 ラットの筋肉内に投与したＱＨ７０３から調製したｉｓｃｏｍマトリックス ウサギでのＱＨ７０３から調製したインフルエンザｉｓｃｏｍｓの発熱性 繰返し投与検討： ＱＨ７０３、ラット筋肉内、毎日１４日間 ラットの筋肉内に毎日１４日間投与したＱＨ７０３から調製したｉｓｃｏｍマ トリックス ＱＨ７０３から調製したｉｓｃｏｍマトリックス、ウサギでの局所耐性、２週 間の間隔で６回投与 ＱＨ７０３から調製したインフルエンザｉｓｃｏｍｓ、ウサギでの局所耐性、 ２週間の間隔で６回投与。 ＱＨ７０３を用いる突然変異誘発の検討から、ＱＨ７０３は、用いた試験系に おいて突然変異誘発効果を生じるとは考えられず、またヒトで突然変異誘発効果 を生じるとはありそうもない、と結論された。 単回投与による毒物学的検討の結論は、ＱＨ７０３およびＱＨ７０３から調製 したｉｓｃｏｍマトリックスを用いるこれらの検討において「無毒効果水準(No Toxic Effect Level)」を明確に画定することは困難であり、高投与量（それぞ れ、１０ｍｇ・ｋｇ^-1および１．４ｍｇ・ｋｇ^-1）では限定された非特異的死亡 率を示していた。これらの投与量は、最大治療投与量と考えられる投与量の１０ ００倍より大きい。 ＱＨ７０３およびＱＨ７０３から調製したｉｓｃｏｍマトリックスの安全性を 、ラットおよびウサギでの他の検討で確かめた。高投与量では、観察された効果 は、部分的には、試験材料の免疫学的（アジュバント）活性に寄与できた。 インフルエンザｉｓｃｏｍワクチンは、全６回投与で、投与当たり（ＱＨ７０ ３として測定した）ｉｓｃｏｍマトリックス１００μｇの投与量でのウサギ局所 耐性研究で、十分な耐性を有することが示された。 ウサギでの（ＱＨ７０３として測定した）インフルエンザｉｓｃｏｍワクチン の単回投与量１００μｇでの発熱性試験では、このワクチンが発熱性でないこと を示した。 実施例９ ヒトでのＱＨ７０３から調製したｉｓｃｏｍマトリックスの臨床上の安全性 １８〜４５才で、検討のための包含／除外基準を満たす健康な男性および女性 志願者に、一重盲検プラシーボを対照とした下記の製剤の一つを含む０．５ｍｌ をそれぞれ筋肉内に注射した。 (i) プラシーボ（希釈剤） (ii) ＱＨ７０３から調製したｉｓｃｏｍマトリックス２５μｇ (iii) ＱＨ７０３から調製したｉｓｃｏｍマトリックス５０μｇ (iv) ＱＨ７０３から調製したｉｓｃｏｍマトリックス１００μｇ (v) ＱＨ７０３から調製したｉｓｃｏｍマトリックス２００μｇ。 Ｉｓｃｏｍマトリックスは、実施例３の方法によってＱＨ７０３から調製した 。この検討から、ＱＨ７０３から調製したｉｓｃｏｍマトリックスの総ての４種 類の投与量水準は、健康な男性および女性志願者で十分な許容度を示すと結論さ れた。 当業者であれば、本明細書に詳細に記載した発明に対して、発明の精神および 範囲から離反することなく特に記載したもの以外に、変更および改質を行なうこ とができることを理解されるであろう。本発明は、このような総ての変更および 改質を包含する目的で拡張されることを理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 モーレイン，ブロール スウェーデン国ウプサラ、ブレタ、オロン スティゲン、３ (72)発明者 ロブグレン−ベングトソン，カーリン スウェーデン国ウプサラ、リンズベルグス ガタン、８シー (72)発明者 サンドクイスト，ボー スウェーデン国ウプサラ、ベルマンスガタ ン、30

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． Quillaja saponariaのサポニンを含んでなるサポニン製剤であって、Qu il Aの画分Ａ（本明細書に定義）５０重量％〜９０重量％およびQuil Aの画分Ｃ （本明細書に定義）５０重量％〜１０重量％を含んでなる、製剤。 ２． 画分Ａの５０重量％〜７０重量％および画分Ｃの５０重量％〜３０重量 ％を含む、請求の範囲第１項に記載のサポニン製剤。 ３． 画分Ａ約７０重量％および画分Ｃ約３０重量％を含む、請求の範囲第１ 項に記載のサポニン製剤。 ４． 請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のサポニン製剤、ステロー ル、および場合によっては脂質を含んでなる、免疫刺激性複合体（ｉｓｃｏｍ） マトリックス。 ５． ステロールがコレステロールである、請求の範囲第４項に記載のｉｓｃ ｏｍマトリックス。 ６． 脂質が含まれているとき、ホスファチジルコリンのようなリン脂質であ る、請求の範囲第４項に記載のｉｓｃｏｍマトリックス。 ７． 上記ｉｓｃｏｍマトリックスに配合されまたはこれと合同させた少なく とも１種類の免疫原を有する、請求の範囲第４〜６項のいずれか１項に記載のｉ ｓｃｏｍマトリックスを含んでなる、免疫原性ｉｓｃｏｍ。 ８． 活性成分として、(i)請求の範囲第４〜６項のいずれか１項に記載のｉ ｓｃｏｍマトリックスおよび少なくとも１種類の免疫原、または(ii)請求の範囲 第７項に記載の免疫原性iｓｃｏｍと、１または２種類以上の薬学上許容可能な キャリヤーおよび／または希釈剤、を含んでなる、ワクチン組成物。 ９． 個体での免疫応答を引き出すかもしくは誘導する方法であって、上記個 体に請求の範囲第８項に記載のワクチン組成物の免疫学的に有効量を投与するこ とを特徴とする、方法。