BR112015031509B1

BR112015031509B1 - Polipeptídeo de fusão (f) do vírus sincicial respiratório (rsv) pré- fusão recombinante e composição que o compreende

Info

Publication number: BR112015031509B1
Application number: BR112015031509-7A
Authority: BR
Inventors: Johannes Petrus Maria Langedijk; Anders Krarup
Original assignee: Janssen Vaccines & Prevention B.V.
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2023-05-09
Also published as: JP2016522230A; NZ714594A; EA201690031A1; CN105408348B; WO2014202570A1; JP6679475B2; MX362792B; KR102313153B1; AU2014283334A1; HK1223949A1; BR112015031509A2; AP2015008893A0; EP3010931B1; CL2015003655A1; MX2015017771A; US20160176932A1; MY171210A; EA034653B1; US10294279B2; AU2014283334B2

Abstract

POLIPEPTÍDEO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, E, COMPOSIÇÃO. A presente invenção proporciona polipeptídeos F do vírus sincicial respiratório (RSV) pré-fusão estáveis, composições imunogênicas compreendendo os referidos polipeptídeos e seus usos para a prevenção e/ou tratamento de infecção por RSV.

Description

Pré-fusão solúveis estabilizado

[001] A presente invenção refere-se ao domínio da medicina. A invenção refere-se, em particular, a polipeptídeos RSV F pré-fusão recombinantes e seus usos, por exemplo, em composições imunogênicas.

Antecedentes da invenção

[002] O vírus sincicial respiratório (RSV) é um vírus RNA de fita negativa não segmentado com envelope da família Paramyxoviridae, gênero Pneumovirus. Se estima que, em todo o mundo, ocorram 64 milhões de infeções por RSV a cada ano, resultando em 160.000 mortes (OMS Atualização das Infecções Respiratórias Agudas, setembro de 2009). A doença mais grave ocorre particularmente em lactentes prematuros, nos mais idosos e indivíduos imunocomprometidos. Em crianças com menos de 2 anos de idade, o RSV é o patógeno mais comum do trato respiratório, sendo responsável por aproximadamente 50 % das hospitalizações devido a infecções respiratórias, com um pico de hospitalização ocorrendo aos 2-4 meses de idade. Foi relatado que quase todas as crianças foram infectadas com o RSV aos dois anos de idade. A infecção repetida durante a vida é atribuída a imunidade natural ineficaz. O nível de fardo de doença, mortalidade e morbidez devido ao RSV nos mais idosos são antecedidos apenas pelos causados por infecções não pandêmicas por influenza A.

[003] Para infectar uma célula hospedeira, o RSV, tal como outros vírus com envelope, como o vírus influenza e HIV, requer fusão da membrana viral à membrana de uma célula hospedeira. Para o RSV, a proteína de fusão conservada (proteína RSV F) funde as membranas celulares viral e da célula hospedeira. Em modelos correntes, com base em estudos de paramixovírus, a proteína RSV F inicialmente se dobra em uma conformação "pré-fusão". A estrutura metaestável foi recentemente resolvida em complexo com um fragmento Fab de anticorpo neutralizador estabilizador (McLellan et al., Science 340(6136): 1113-7, 2013). Durante a entrada na célula, a conformação pré-fusão sofre redobramento e alterações conformacionais na sua conformação "pós-fusão". (McLellan, J. Virol 85(15): 7788-96, 2010; Swanson, PNAS 108(23): 9619-24, 2011). Assim, a proteína RSV F é uma proteína metaestável que conduz a fusão membranar por acoplamento do redobramento irreversível da proteína a justaposição membranar por dobramento inicial em uma forma metaestável (conformação pré-fusão) que subsequentemente sofre alterações conformacionais discretas/em passos para uma conformação de menor energia (conformação pós-fusão).

[004] Estas observações sugerem que as proteínas RSV F pré- fusão e pós-fusão são antigenicamente distintas (Calder, L. J. et al. Virology 271, 122-131 (2000)).

[005] Uma vacina contra infecção por RSV não está presentemente disponível, mas é desejada. Candidatos a vacinas baseados na proteína RSV F falharam devido a problemas, por exemplo, com a estabilidade, pureza, reprodutibilidade e potência. Como indicado acima, as estruturas cristalinas revelaram uma grande alteração conformacional entre os estados pré-fusão e pós-fusão. A magnitude do rearranjo sugeriu que somente uma porção dos anticorpos dirigidos à conformação pós-fusão de RSV-F serão capazes de reagir de modo cruzado com a conformação nativa da proteína spike pré-fusão na superfície do vírus. Em conformidade, esforços para produzir uma vacina contra o RSV se centraram no desenvolvimento de vacinas que contêm formas pré-fusão da proteína RSV F (ver, por exemplo, WO20101149745, WO2010/1149743, WO2009/1079796, WO2012/158613). No entanto, estes esforços ainda não originaram polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis que possam ser usados como candidatos para testes em humanos.

Sumário da invenção

[006] A presente invenção proporciona polipeptídeos de fusão (F) do vírus sincicial respiratório (RSV) pré-fusão recombinantes e estáveis, isto é, polipeptídeos RSV F recombinantes que estão estabilizados na conformação pré-fusão. Os polipeptídeos RSV F da invenção compreendem pelo menos um epítopo que é específico da proteína F na conformação pré-fusão. Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão são solúveis. A invenção também proporciona moléculas de ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos RSV F pré-fusão de acordo com a invenção e vetores compreendendo tais moléculas de ácidos nucleicos.

[007] A invenção também se refere a composições, preferencialmente composições imunogênicas, compreendendo um polipeptídeo RSV F, uma molécula de ácido nucleico e/ou um vetor, e ao seu uso na indução de uma resposta imune contra a proteína RSV F, em particular o seu uso como vacina. A invenção também se refere a métodos de indução de uma resposta imune anti-vírus sincicial respiratório (RSV) em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um polipeptídeo RSV F pré-fusão, uma molécula de ácido nucleico codificando o referido polipeptídeo RSV F, e/ou um vetor compreendendo a referida molécula de ácido nucleico. Preferencialmente, a resposta imune induzida é caracterizada por anticorpos neutralizadores para o RSV e/ou imunidade protetora contra o RSV. Em aspectos particulares, a invenção refere-se a um método para indução de anticorpos neutralizadores anti-proteína F do vírus sincicial respiratório (RSV) em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma composição imunogênica compreendendo um polipeptídeo RSV F pré-fusão, uma molécula de ácido nucleico codificando o referido polipeptídeo RSV F, e/ou um vetor compreendendo a referida molécula de ácido nucleico.

Breve descrição das Figuras

[008] FIG. 1: SDS-PAGE reduzida e não reduzida com RSV pré- Fusão DM = Mutante duplo (N67I+S215P = SEQ ID NO:21) e DM+CC = Mutante duplo + DE486CC = SEQ ID NO:94).

[009] FIG.2: Análise NativePAGE de sobrenadantes da Via 2: DM = Mutante duplo (N67I+S215P = SEQ ID NO 21) e Via 1: DM+CC = Mutante duplo + DE486CC = SEQ ID NO: 94).

[0010] FIG. 3: A) Cromatograma de filtração em gel Superdex200 do eluato Pre N67I E161P S215P, RSV A2, fibritina (SEQ ID NO: 91) da coluna de troca iônica. B) Análise de SDS-PAGE da proteína F pré- fusão contendo pico do cromatograma SEC em condições redutoras. C) Análise NativePAGE da proteína RSV F pré-fusão purificada (SEQID NO: 91, Via 2) em comparação com mutante duplo RSV F pré- fusão purificado (SEQ ID NO: 21, Via 1).

[0011] FIG. 4: Títulos de VNA de camundongos na semana 6 após um reforço primário na semana 0 e 4 com imunogênios e doses de acordo com a Tabela 14.

[0012] FIG. 5: Títulos de VNA de ratos de algodão na semana 7 após um reforço primário na semana 0 e 4 com imunogênios e doses de acordo com a Tabela 15.

[0013] FIG. 6: Carga viral no pulmão e nariz aos 5 dias após provocação com RSV i.n.

Descrição detalhada da invenção

[0014] A proteína de fusão (F) do vírus sincicial respiratório (RSV) está envolvida na fusão da membrana viral a uma membrana da célula hospedeira, o que é requerido para infecção. O mRNA de RSV F é traduzido em uma proteína precursora de 574 aminoácidos designada F0, que contém uma sequência de peptídeo sinal no terminal N (por exemplo, resíduos de aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 1) que é removida por uma peptidase sinal no retículo endoplasmático. F0 é clivada em dois locais (entre os resíduos de aminoácidos 109/110 e 136/137) por proteases celulares (em particular furina, ou tipo furina)), removendo uma pequena sequência interveniente glicosilada (também denominada região p27, compreendendo os resíduos de aminoácidos 110 até 136, e gerando dois domínios ou subunidades denominadas F1 e F2. O domínio F1 (resíduos de aminoácidos 137-574) contém um peptídeo de fusão hidrofóbico no seu terminal N e o terminal C contém a região de transmembrana (TM) (resíduos de aminoácidos 530-550) e citoplasmática (resíduos de aminoácidos 551-574). O domínio F2 (resíduos de aminoácidos 27-109) é ligado de modo covalente a F1 por duas pontes dissulfeto. Os heterodímeros F1-F2 são montados como homotrímeros no vírion.

[0015] Uma vacina contra infecção por RSV não está presentemente disponível, mas é desejada. Uma abordagem potencial para produzir uma vacina é uma vacina de subunidade baseada em proteína RSV F purificada. No entanto, para esta abordagem é desejável que a proteína RSV F purificada esteja em uma conformação que se assemelhe à conformação do estado pré-fusão da proteína RSV F, que é estável ao longo do tempo, e que possa ser produzida em quantidades suficientes. Adicionalmente, para uma vacina à base de subunidade, é necessário que a proteína RSV F seja truncada por deleção da região de transmembrana (TM) e citoplasmática para criar uma proteína F secretada solúvel (sF). Uma vez que a região TM é responsável pela ancoragem de membrana e trimerização, a proteína F solúvel sem ancoragem é consideravelmente mais lábil do que a proteína completa e irá prontamente sofrer redobramento no estado final pós-fusão. Para obter proteína F solúvel na conformação pré-fusão estável que exibe níveis elevados de expressão e elevada estabilidade, é assim necessário estabilizar a conformação pré-fusão.

[0016] Foi alcançada com êxito estabilização de outra proteína F de paramixovírus na conformação pré-fusão para o tipo parainfluenza 5 (PIV5). Assim, Yin et al. (Nature 439: 38-44 (2006)) estabilizaram a estrutura pré-fusão da proteína PIV-5 F por mutação do local de clivagem de furina em F0 que bloqueou o processamento em F1 e F2. Adicionalmente, os domínios de transmembrana (TM) e citoplasmático foram substituídos por um domínio de trimerização helicoidal bem conhecido: GCN4pII. Este domínio forma uma estrutura de super- hélice helicoidal trimérica e é uma modificação do peptídeo de super- hélice helicoidal dimérico natural GCN4 (O’Shea et al., Science 243: 538-542 (1989)). Foi mostrado que o peptídeo GCN4-pII, no qual a sequência de aminoácidos do zíper de Leucina GCN4 foi substituída por resíduos Isoleucina em cada posição a e d da estrutura heptavalente, forma uma super-hélice alfa-helicoidal paralela de fita tripla (Harbury et al., Science 262: 1401-1407 (1993)).

[0017] Para a estabilização de RSV F na conformação pré-fusão, foi tentada a mesma estratégia, isto é, mutação do local de clivagem de furina, e fusão do ectodomínio de RSV-F a um domínio de trimerização GCN4pII (como divulgado, por exemplo, em WO2010/149743, WO2010/149745, WO2009/079796, WO2012/158613) ou ao domínio de trimerização de fibritina (MCLellan et al., Nature Struct. Biol.17: 2-248-250 (2010) McLellan et al., Science 340(6136):1113-7 (2013)). Este domínio de fibritina ou ‘Foldon’ é derivado de fibritina de T4 e foi descrito anteriormente como um domínio de trimerização natural artificial (Letarov et al., Biochemistry Moscow 64: 817-823 (1993); S-Guthe et al., J. Mol. Biol. 337: 905-915. (2004)). No entanto, estes esforços não resultaram em proteína RSV-F pré-fusão estável. Além disso, estes esforços ainda não resultaram em candidatos adequados para a realização de testes em humanos.

[0018] A presente invenção proporciona agora polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis recombinantes, isto é, polipeptídeos RSV F que estão estabilizados na conformação pré-fusão. Na pesquisa que conduziu à presente invenção, várias etapas de modificação foram introduzidas e/ou combinadas para obter os referidos polipeptídeos RSV F pré-fusão solúveis estáveis. Os polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis da invenção estão na conformação pré-fusão, isto é, compreendem (exibem) pelo menos um epítopo que é específico da proteína F na conformação pré-fusão. Um epítopo que é específico da proteína F na conformação pré-fusão é um epítopo que não é apresentado na conformação pós-fusão. Sem pretender ficar restringido por qualquer teoria particular, se crê que a conformação pré-fusão da proteína RSV F pode conter epítopos que são os mesmos que estão presentes na proteína RSV F expressa em vírions RSV naturais, e em consequência podem proporcionar vantagens para induzir anticorpos neutralizadores protetores.

[0019] Os polipeptídeos da invenção compreendem pelo menos um epítopo que é reconhecido por um anticorpo monoclonal específico para a pré-fusão, compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 54, uma região CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 55, uma região CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 56 e uma região CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 62, uma região CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 63, e uma região CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 64 (daqui em diante denominado CR9501) e/ou um anticorpo monoclonal específico para a pré-fusão, compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 58, uma região CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 59, uma região CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 60 e uma região CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 66, uma região CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 67, e uma região CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 68 (denominado CR9502). CR9501 e CR9502 compreendem as regiões variáveis de cadeia pesada e leve, e assim as especificidades de ligação, dos anticorpos 58C5 e 30D8, respectivamente, que foi previamente mostrado que se ligam especificamente à proteína RSV F na sua conformação pré-fusão e não à conformação pós-fusão (ver WO2012/006596).

[0020] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão recombinantes compreendem pelo menos um epítopo que é reconhecido por pelo menos um anticorpo monoclonal específico para a pré-fusão como descrito acima e são triméricos.

[0021] Os polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis de acordo com a invenção compreendem um domínio F1 e um domínio F2, em que os polipeptídeos compreendem pelo menos uma mutação, em comparação com os domínios F1 e F2 de tipo selvagem, selecionada do grupo consistindo de: (a) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 161; (b) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 182; (c) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 173; e (d) uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 486 em C (D486C) em combinação com uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 489 em C (D489C) ou uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 487 em C (E487C).

[0022] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis compreendem um domínio F1 e um domínio F2, em que os polipeptídeos compreendem pelo menos uma mutação selecionada do grupo consistindo de: (a) uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 161 em P, Q ou G (E161P, E161Q) ou E161G); (b) uma mutação do resíduo de aminoácido S na posição 182 em P (S182P); (c) uma mutação do resíduo de aminoácido S, T ou N na posição 173 em P (S173P); e (d) uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 486 em C (D486C) em combinação com uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 489 em C (D489C) ou uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 487 em C (E487C).

[0023] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão também compreendem uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 67 e/ou uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 215.

[0024] Em certas modalidades, polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis compreendem assim um domínio F1 e um domínio F2, em que os polipeptídeos compreendem uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 67 e/ou uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 215, e pelo menos mais uma mutação selecionada do grupo consistindo de: (a) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 161; (b) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 182; (c) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 173; e (d) uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 486 em C (D486C) em combinação com uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 489 em C (D489C) ou uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 487 em C (E487C).

[0025] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis compreendem um domínio F1 e um domínio F2, em que os polipeptídeos compreendem uma mutação do resíduo de aminoácido N ou T na posição 67 e/ou uma mutação do resíduo de aminoácido S na posição 215, e em que os polipeptídeos também compreendem pelo menos uma mutação adicional selecionada do grupo consistindo de: (a) uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 161 em P, Q ou G (E161P, E161Q) ou E161G); (b) uma mutação do resíduo de aminoácido S na posição 182 em P (S182P); (c) uma mutação do resíduo de aminoácido S, T ou N na posição 173 em P (S173P); e (d) uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 486 em C (D486C) em combinação com uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 489 em C (D489C) ou uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 487 em C (E487C).

[0026] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis compreendem uma sequência ligadora compreendendo desde 1 até 10 aminoácidos, que liga o domínio F1 e domínio F2

[0027] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis de acordo com a invenção compreendem assim um domínio F1 e um domínio F2, e uma sequência ligadora compreendendo desde 1 até 10 resíduos de aminoácidos, que liga o referido domínio F1 ao referido domínio F2, em que os polipeptídeos compreendem pelo menos uma mutação selecionada do grupo consistindo de: (a) uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 161 em P, Q ou G (E161P, E161Q) ou E161G); 5 (b) uma mutação do resíduo de aminoácido S na posição 182 em P (S182P); (c) uma mutação do resíduo de aminoácido S, T ou N na posição 173 em P (S173P), e (d) uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 486 em C (D486C) em combinação com uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 489 em C (D489C) ou uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 487 em C (E487C).

[0028] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis compreendem adicionalmente uma mutação do resíduo de aminoácido N ou T na posição 67 e/ou uma mutação do resíduo de aminoácido S na posição 215. Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis compreendem adicionalmente uma mutação do resíduo de aminoácido N ou T na posição 67 (N/T67I) em I e/ou uma mutação do resíduo de aminoácido S na posição 215 em P (S215P).

[0029] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis de acordo com a invenção compreendem um domínio F1 truncado.

[0030] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis de acordo com a invenção compreendem assim um domínio F1 truncado e um domínio F2, e opcionalmente uma sequência ligadora compreendendo desde 1 até 10 resíduos de aminoácidos, que liga o referido domínio F1 truncado ao referido domínio F2, em que os polipeptídeos compreendem pelo menos uma mutação adicional selecionada do grupo consistindo de: (a) uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 161 em P, Q ou G (E161P, E161Q) ou E161G); (b) uma mutação do resíduo de aminoácido S na posição 182 em P (S182P); (c) uma mutação do resíduo de aminoácido S, T ou N na posição 173 em P (S173P); e (d) uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 486 em C (D486C) em combinação com uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 489 em C (D489C) ou uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 487 em C (E487C).

[0031] Em certas modalidades, os polipeptídeos compreendem adicionalmente uma mutação do resíduo de aminoácido N ou T na posição 67 e/ou uma mutação do resíduo de aminoácido S na posição 215. Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis compreendem adicionalmente uma mutação do resíduo de aminoácido N ou T na posição 67 (N/T67I) em I e/ou uma mutação do resíduo de aminoácido S na posição 215 em P (S215P).

[0032] De acordo com a invenção, os polipeptídeos da invenção compreendem pelo menos uma mutação estabilizadora no domínio F1 e/ou F2 em comparação com o domínio RSV F1 e/ou F2 em uma proteína RSV F de tipo selvagem. É conhecido que o RSV existe como um único serótipo tendo dois subgrupos antigênicos: A e B. As sequências de aminoácidos das proteínas F processadas maduras dos dois grupos são cerca de 93 % idênticas. Como usado ao longo do presente pedido, as posições de aminoácido são apresentadas com referência à sequência da proteína RSV F da cepa A2 (SEQ ID NO: 1). Como usado na presente invenção, a frase "o aminoácido na posição "x" da proteína RSV F significa, assim, o aminoácido correspondente ao aminoácido na posição "x" na proteína RSV F da cepa de RSV A2 de SEQ ID NO: 1. Note que, no sistema de numeração usado ao longo deste pedido, 1 se refere ao aminoácido N-terminal de uma proteína F0 imatura (SEQ ID NO: 1). Quando é usada uma cepa de RSV diferente da cepa A2, as posições de aminoácidos da proteína F devem ser numeradas com referência à numeração da proteína F da cepa A2 de SEQ ID NO: 1 por alinhamento das sequências da outra cepa de RSV com a proteína F de SEQ ID NO: 1 com a inserção de intervalos consoante o necessário. Os alinhamentos de sequências podem ser efetuados usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por CLUSTALW, Bioedit ou CLC Workbench.

[0033] Um aminoácido de acordo com a invenção pode ser qualquer um dos vinte que ocorrem naturalmente (ou "aminoácidos comuns") ou suas variantes, tais como, por exemplo, D-aminoácidos (os D-enantiômeros de aminoácidos com um centro quiral), ou quaisquer variantes que não se encontrem naturalmente em proteínas, tais como, por exemplo, norleucina. Os aminoácidos padrão podem ser divididos em vários grupos baseados nas suas propriedades. Fatores importantes são carga, hidrofilicidade ou hidrofobicidade, tamanho e grupos funcionais. Estas propriedades são importantes para a estrutura da proteína e interações proteína-proteína. Alguns aminoácidos têm propriedades especiais, tais como cisteína, que podem formar ligações dissulfeto (ou pontes dissulfeto) covalentes com outros resíduos de cisteína, prolina, que induz voltas da estrutura principal do polipeptídeo, e glicina, que é mais flexível do que outros aminoácidos. A Tabela 17 mostra as abreviaturas e propriedades dos aminoácidos padrão.

[0034] Será apreciado pelo perito na técnica que as mutações podem ser efetuadas na proteína por procedimentos de rotina de biologia molecular. As mutações de acordo com a invenção resultam preferencialmente em níveis de expressão acrescidos e/ou estabilização acrescida dos polipeptídeos RSV F pré-fusão em comparação com polipeptídeos RSV F que não compreendem esta(s) mutação(mutações).

[0035] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão são completos.

[0036] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão são solúveis.

[0037] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão compreendem adicionalmente um domínio de trimerização heterólogo ligado ao referido domínio F1 truncado. De acordo com a invenção, foi mostrado que por ligação de um domínio de trimerização heterólogo ao resíduo de aminoácido C-terminal de um domínio F1 truncado, opcionalmente combinado com uma sequência ligadora que liga o domínio F1 e F2, e a(s) mutação(mutações) estabilizadora(s), são proporcionados polipeptídeos RSV F que exibem expressão elevada e que se ligam a anticorpos pré-fusão-específicos, indicando que os polipeptídeos estão na conformação pré-fusão. Adicionalmente, os polipeptídeos RSV F são estabilizados na conformação pré-fusão, isto é, mesmo após processamento dos polipeptídeos ainda se ligam aos anticorpos específicos da pré-fusão CR9501 e/ou CR9502, indicando que o epítopo específico da pré-fusão é retido.

[0038] Em modalidades adicionais, os polipeptídeos RSV F pré- fusão compreendem uma ou mais mutações adicionais (em comparação com a proteína RSV F de tipo selvagem), selecionadas do grupo consistindo de: (a) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 46; (b) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 77; (c) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 80; (d) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 92; (e) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 184; (f) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 185; (g) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 201; (h) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 209; (i) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 421; (j) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 426; (k) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 465; (l) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 486; (m) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 487; e (n) uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 508.

[0039] Em modalidades preferenciais, a uma ou mais mutações adicionais são selecionadas do grupo consistindo de: (a) uma mutação do resíduo de aminoácido S na posição 46 em G (S46G); (b) uma mutação do resíduo de aminoácido K na posição 77 em E (K77E); (c) uma mutação do resíduo de aminoácido K na posição 80 em E (K80E); (d) uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 92 em D (E92D); (e) uma mutação do resíduo de aminoácido G na posição 184 em N (G184N); (f) uma mutação do resíduo de aminoácido V na posição 185 em N (V185N); (g) uma mutação do resíduo de aminoácido K na posição 201 em Q (K201Q); (h) uma mutação do resíduo de aminoácido K na posição 209 em Q (K209Q); (i) uma mutação do resíduo de aminoácido K na posição 421 em N (K421N); (j) uma mutação do resíduo de aminoácido N na posição 426 em S (N426S); (k) uma mutação do resíduo de aminoácido K na posição 465 em E ou Q (K465Q); (l) uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 486 em N (D486N); (m) uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 487 em Q, N ou I (E487Q/N/I); e (n) uma mutação do resíduo de aminoácido K na posição 508 em E (K508E).

[0040] Como descrito acima, em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão compreendem uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 486 em C (D486C) em combinação com D489C ou E487C. Estas mutações duplas para dois resíduos cisteína extra dão origem a uma ponte dissulfeto intersubunidades entre as proteínas F1 que estabelece uma ligação covalente entre os promotores e estabiliza a estrutura RSV F pré- fusão.

[0041] É novamente notado que para as posições dos resíduos de aminoácidos é feita referência à SEQ ID NO: 1. O perito será capaz de determinar os resíduos de aminoácidos correspondentes em proteínas F de outras cepas do RSV.

[0042] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão compreendem pelo menos duas mutações (em comparação com uma proteína RV F de tipo selvagem).

[0043] Em certas modalidades, os polipeptídeos compreendem pelo menos três mutações.

[0044] Em certas modalidades, os polipeptídeos compreendem pelo menos quatro, cinco ou seis mutações.

[0045] Em certas modalidades, o domínio de trimerização heterólogo compreende a sequência de aminoácidos EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 3). Em certas modalidades diferentes, o domínio de trimerização heterólogo compreende a sequência de aminoácidos GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4).

[0046] Como descrito acima, em certas modalidades os polipeptídeos da invenção compreendem um domínio F1 truncado. Como usado aqui, um domínio F1 "truncado" refere-se a um domínio F1 que não é um domínio F1 completo, isto é, em que na porção N- terminal ou C-terminal um ou mais resíduos de aminoácidos foram deletados. De acordo com a invenção, pelo menos o domínio de transmembrana e cauda citoplasmática foram deletados para permitir expressão na forma de um ectodomínio solúvel.

[0047] Em certas modalidades diferentes, o domínio F1 é truncado após o resíduo de aminoácido 495 da proteína RSV F (com referência à SEQ ID NO: 1), isto é, a parte C-terminal do domínio F1 partindo do resíduo de aminoácido 496 (com referência à SEQ ID NO: 1) foi deletada. Em certas modalidades diferentes, o domínio F1 é truncado após o resíduo de aminoácido 513 da proteína RSV F. Em certas modalidades, o domínio F1 é truncado após o resíduo de aminoácido 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524 ou 525.

[0048] Em certas modalidades, o domínio de trimerização é ligado ao resíduo de aminoácido 495 do domínio F1 de RSV. Em certas modalidades, o domínio de trimerização compreende a SEQ ID NO: 4 e é ligado ao resíduo de aminoácido 495 do domínio F1 de RSV.

[0049] Em certas modalidades diferentes, o domínio de trimerização é ligado ao resíduo de aminoácido 513 do domínio F1 de RSV. Em certas modalidades, o domínio de trimerização compreende a SEQ ID NO: 3 e é ligado ao resíduo de aminoácido 513 do domínio F1 de RSV.

[0050] Como descrito acima, em certas modalidades, o domínio F1, que é opcionalmente truncado, e o domínio F2 são ligados por uma sequência ligadora, que liga o aminoácido C-terminal do domínio F2 ao aminoácido N-terminal do domínio F2 (opcionalmente truncado). Em certas modalidades, a sequência ligadora (ou ligador) compreende entre 1-10 resíduos de aminoácidos, preferencialmente entre 2-9 resíduos de aminoácidos, preferencialmente entre 3-8 resíduos de aminoácidos, preferencialmente entre 4-7 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente o ligador compreende 5 ou 6 resíduos de aminoácidos. São conhecidos na técnica numerosos ligadores conformacionalmente neutros que podem ser usados de acordo com a invenção sem destruir a conformação dos polipeptídeos RVS F pré- fusão. Em modalidades preferenciais, o ligador compreende a sequência de aminoácidos GSGSG (SEQ ID NO: 5).

[0051] Em certas modalidades, o domínio F1 e/ou o domínio F2 provêm de uma cepa RSV A. Em certas modalidades, o domínio F1 e/ou F2 provêm da cepa RSV A2 de SEQ ID NO: 1.

[0052] Em certas modalidades, o domínio F1 e/ou F2 provêm da cepa RSV A2 de SEQ ID NO: 69.

[0053] Em certas modalidades, o domínio F1 e/ou o domínio F provêm de uma cepa RSV B. Em certas modalidades, o domínio F1 e/ou F2 provêm da cepa RSV B de SEQ ID NO: 2.

[0054] Em certas modalidades, o domínio F1 e F2 provêm da mesma cepa de RSV. Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão são polipeptídeos quiméricos, isto é, compreendendo domínios F1 e F2 que provêm de diferentes cepas do RSV.

[0055] Em certas modalidades, o nível de expressão dos polipeptídeos RSV F pré-fusão da invenção é aumentado, em comparação com um polipeptídeo RSV F de tipo selvagem completo ou um ectodomínio de tipo selvagem (isto é, sem a região de transmembrana e citoplasmática) sem a(s) mutação(mutações). Em certas modalidades, o nível de expressão é aumentado pelo menos 5 vezes, preferencialmente até 10 vezes. Em certas modalidades, o nível de expressão é aumentado mais do que 10 vezes.

[0056] Os polipeptídeos RSV F pré-fusão de acordo com a invenção são estáveis, isto é, não são alterados facilmente para a conformação pós-fusão por processamento dos polipeptídeos, como, por exemplo, purificação, ciclos de congelação-descongelação, e/ou armazenamento, etc.

[0057] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão de acordo com a invenção têm estabilidade acrescida por armazenamento a 4 °C em comparação com um polipeptídeo RSV F sem a(s) mutação(mutações). Em certas modalidades, os polipeptídeos são estáveis por armazenamento a 4 °C por pelo menos 30 dias, preferencialmente pelo menos 60 dias, preferencialmente pelo menos 6 meses, ainda mais preferencialmente pelo menos 1 ano. É pretendido que "estáveis por armazenamento", signifique que os polipeptídeos ainda exibem o pelo menos um epítopo específico para um anticorpo específico de pré-fusão (por exemplo, CR9501) por armazenamento do polipeptídeo em solução (por exemplo, meio de cultura) a 4 °C por pelo menos 30 dias, por exemplo, determinado usando um método como descrito no Exemplo 8 ou 10. Em certas modalidades, os polipeptídeos exibem o pelo menos um epítopo específico de pré-fusão durante pelo menos 6 meses, preferencialmente durante pelo menos 1 ano por armazenamento dos polipeptídeos RSV F pré-fusão a 4 oC.

[0058] Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F pré-fusão de acordo com a invenção têm estabilidade aumentada quando sujeitos a calor, em comparação com polipeptídeos RSV F sem a(s) referida(s) mutação(mutações). Em certas modalidades, os polipeptídeos REV F pré-fusão são termicamente estáveis por pelo menos 30 minutos a uma temperatura de 55 °C, preferencialmente a 58 °C, mais preferencialmente a 60 °C. É pretendido que "termicamente estáveis" signifique que os polipeptídeos ainda exibem o pelo menos um epítopo específico de pré-fusão depois de terem sido sujeitos durante pelo menos 30 minutos a uma temperatura acrescida (isto é, uma temperatura de 55 °C ou mais), por exemplo, determinado usando um método como descrito no Exemplo 9.

[0059] Em certas modalidades, os polipeptídeos exibem o pelo menos um epítopo específico de pré-fusão após terem sido sujeitos a 1 até 6 ciclos de congelação-descongelação em um tampão de formulação apropriado.

[0060] Em certas modalidades preferenciais, o polipeptídeo RSV F pré-fusão da invenção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 90-94. Em certas modalidades, o polipeptídeo RSV F pré-fusão da invenção consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 90-94.

[0061] Como usado ao longo do presente pedido, sequências de nucleotídeos são proporcionadas na direção 5’ para 3’, e sequências de aminoácidos do terminal N para o terminal C, como é habitual na técnica.

[0062] Em certas modalidades, os polipeptídeos codificados de acordo com a invenção compreendem adicionalmente uma sequência líder, também designada sequência sinal ou peptídeo sinal, correspondente aos aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 69. Este é um peptídeo curto (tipicamente 5-30 aminoácidos de comprimento) presente no terminal N da maior parte de proteínas sintetizadas de novo que são destinadas para a via secretora. Em certas modalidades, os polipeptídeos de acordo com a invenção não compreendem uma sequência líder.

[0063] Em certas modalidades, os polipeptídeos compreendem uma Cauda HIS. Uma Cauda His ou cauda polihistidina é um motivo de aminoácidos em proteínas que consiste de pelo menos cinco resíduos histidina (H), muitas vezes no terminal N ou C da proteína, que é geralmente usada para propósitos de purificação.

[0064] Em certas modalidades, os polipeptídeos não compreendem uma Cauda HIS. De acordo com a invenção, foi surpreendentemente mostrado que quando a cauda HIS é deletada, o nível de expressão e a estabilidade são aumentados em comparação com polipeptídeos com uma cauda HIS.

[0065] A presente invenção proporciona adicionalmente moléculas de ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos RSV F de acordo com a invenção.

[0066] Em modalidades preferenciais, as moléculas de ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos de acordo com a invenção são otimizados quanto a códons para expressão em células de mamífero, preferencialmente células humanas. Métodos de otimização de códons são conhecidos e foram descritos previamente (por exemplo, WO 96/09378). Uma sequência é considerada como tendo códons otimizados se pelo menos um códon não preferencial em comparação com uma sequência de tipo selvagem for substituído por um códon que é mais preferencial. Aqui, um códon não preferencial é um códon que é usado menos frequentemente em um organismo do que outro códon codificando o mesmo aminoácido, e um códon que é mais preferencial é um códon que é usado mais frequentemente em um organismo do que um códon não preferencial. A frequência do uso de códons para um organismo específico pode ser encontrada em tabelas de frequências de códons, como em http://www.kazusa.or.jp/codon. Preferencialmente, mais do que um códon não preferencial, preferencialmente a maior parte ou todos os códons não preferenciais, são substituídos por códons que são mais preferenciais. Preferencialmente, os códons mais frequentemente usados em um organismo são usados em uma sequência de códons otimizados. A substituição por códons preferenciais conduz geralmente a expressão mais elevada.

[0067] Será entendido pelo perito que numerosos polinucleotídeos e moléculas de ácidos nucleicos diferentes podem codificar o mesmo polipeptídeo devido à degenerescência do código genético. Também é entendido que peritos, usando técnicas de rotina, podem fazer substituições de nucleotídeos que não afetem a sequência polipeptídica codificada pelas moléculas de ácidos nucleicos para refletir o uso de códons de qualquer organismo hospedeiro particular onde é pretendido expressar os polipeptídeos. Em consequência, a menos que especificado em contrário, uma "sequência de nucleotídeos codificando uma sequência de aminoácidos" inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. Sequências de nucleotídeos que codificam proteínas e RNA podem ou não incluir íntrons.

[0068] Sequências de ácidos nucleicos podem ser clonadas usando técnicas de rotina de biologia molecular, ou geradas de novo por síntese de DNA, o que pode ser efetuado usando procedimentos de rotina por empresas de serviços tendo atividade no domínio da síntese de DNA e/ou clonagem molecular (por exemplo, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).

[0069] A invenção também proporciona vetores compreendendo uma molécula de ácido nucleico como descrito acima. Assim, em certas modalidades, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção faz parte de um vetor. Tais vetores podem ser facilmente manipulados por métodos bem conhecidos da pessoa perita na técnica, e podem por exemplo ser desenhados para serem capazes de replicação em células procarióticas e/ou eucarióticas. Adicionalmente, muitos vetores podem ser usados para transformação de células eucarióticas e se integrarão, na totalidade ou em parte, no genoma de tais células, resultando em células hospedeiras estáveis compreendendo o ácido nucleico desejado em seu genoma. O vetor usado pode ser qualquer vetor que seja adequado para clonagem de DNA e que possa ser usado para transcrição de um ácido nucleico de interesse. Vetores adequados de acordo com a invenção são, por exemplo, adenovetores, como, por exemplo, Ad26 ou Ad35, alfavírus, paramixovírus, vírus vacínia, vírus herpes, vetores retrovirais, etc. O perito na técnica é capaz de escolher vetores de expressão adequados, e de inserir as sequências de ácidos nucleicos da invenção de um modo funcional.

[0070] Células hospedeiras compreendendo as moléculas de ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos RSV F pré-fusão também fazem parte da invenção. Os polipeptídeos RSV F pré-fusão podem ser produzidos através de tecnologia de DNA recombinante envolvendo expressão das moléculas em células hospedeiras, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO), linhagens de células tumorais, células BHK, linhagens de células humanas, tais como células HEK293, células PER.C6, ou células de leveduras, fungos, insetos, e similares, ou animais ou plantas transgênicas. Em certas modalidades, as células provêm de um organismo multicelular, em certas modalidades são originárias de vertebrados ou invertebrados. Em certas modalidades, as células são células de mamífero. Em certas modalidades, as células são células humanas. Em geral, a produção de proteínas recombinantes, como os polipeptídeos RSV F pré-fusão da invenção, em uma célula hospedeira compreende a introdução de uma molécula de ácido nucleico heteróloga codificando o polipeptídeo em formato expressável na célula hospedeira, cultivo das células em condições conducentes à expressão da molécula de ácido nucleico e permitindo a expressão do polipeptídeo na referida célula. A molécula de ácido nucleico codificando uma proteína em formato expressável pode estar na forma de um cassete de expressão, e habitualmente requer sequências capazes de causar a expressão do ácido nucleico, como intensificador(es), promotor, sinal de poliadenilação, e similares. A pessoa perita na técnica está ciente de que podem ser usados vários promotores para obter expressão de um gene em células hospedeiras. Os promotores podem ser constitutivos ou regulados, e podem ser obtidos de várias fontes, incluindo vírus, fontes procarióticas, ou eucarióticas, ou artificialmente desenhados.

[0071] Meios de cultura de células são disponibilizados por vários vendedores, e um meio adequado pode ser rotineiramente escolhido para uma célula hospedeira para expressar a proteína de interesse, aqui os polipeptídeos RSV F pré-fusão. O meio adequado pode ou não conter soro.

[0072] Uma "molécula de ácido nucleico heteróloga" (também denominada aqui ‘transgene’) é uma molécula de ácido nucleico que não está naturalmente presente na célula hospedeira. É introduzida, por exemplo, em um vetor por técnicas comuns de biologia molecular. Um transgene está, geralmente, operacionalmente ligado a sequências de controlo de expressão. Tal pode, p. ex., ser realizado através da colocação do ácido nucleico que codifica o(s) transgene(s) sob o controlo de um promotor. Podem ser adicionadas outras sequências regulatórias. Muitos promotores podem ser usados para expressão de transgene(s), e são conhecidos do perito, por exemplo, estes podem compreender promotores virais, de mamífero, sintéticos, e similares. Um exemplo não limitativo de um promotor adequado para a obtenção de expressão em células eucarióticas é um promotor de CMV (US 5385839), p. ex., o promotor precoce imediato de CMV, p. ex., que compreende os nt. -735 a +95 potenciador/promotor do gene precoce imediato do CMV. Um sinal de poliadenilação, p. ex., o sinal poliA do hormônio de crescimento bovino (US 5122458), pode estar presente por detrás do(s) transgene(s). Em alternativa, vários vetores de expressão amplamente usados são disponibilizados na técnica e por fontes comerciais, por exemplo, a série de vetores pcDNA e pEF da Invitrogen, pMSCV e pTK-Hyg da BD Sciences, pCMV-Script da Stratagene, etc., que podem ser usados para expressar de modo recombinante a proteína de interesse, ou para obter promotores e/ou sequências terminadoras da transcrição adequadas, sequências poliA, e similares.

[0073] A cultura de células pode ser qualquer tipo de cultura de células, incluindo cultura de células aderentes, por exemplo, células ligadas à superfície de um recipiente de cultura ou a microtransportadores, bem como cultura em suspensão. A maioria das culturas em suspensão em grande escala são operadas como processos descontínuos ou descontínuos alimentados, porque são os mais simples de operar e ampliar de escala. Presentemente, processos contínuos baseados em princípios de perfusão estão se tornando mais comuns e também são adequados. Meios de cultura adequados também são bem conhecidos do perito e podem ser geralmente obtidos de fontes comerciais em grandes quantidades, ou preparados de modo personalizado de acordo com protocolos comuns. A cultura pode ser feita, por exemplo, em placas, frascos rotativos ou em biorreatores, usando sistemas descontínuos, descontínuos alimentados, contínuos e semelhantes. São conhecidas as condições apropriadas para a cultura de células (p. ex., ver Tissue Culture, Academic Press, Kruse e Paterson, editores (1973), e RI Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, quarta edição (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).

[0074] A invenção proporciona adicionalmente composições compreendendo um polipeptídeo RSV F pré-fusão e/ou uma molécula de ácido nucleico, e/ou um vetor, como descrito acima. Assim, a invenção proporciona composições compreendendo um polipeptídeo RSV F pré-fusão que exibe um epítopo que está presente em uma conformação pré-fusão da proteína RSV F mas que está ausente na conformação pós-fusão. A invenção também proporciona composições compreendendo uma molécula de ácido nucleico e/ou um vetor, codificando tal polipeptídeo RSV F pré-fusão. A invenção proporciona adicionalmente composições imunogênicas compreendendo um polipeptídeo RSV F pré-fusão, e/ou uma molécula de ácido nucleico, e/ou um vetor, como descrito acima. A invenção também proporciona o uso de um polipeptídeo RSV F pré-fusão estabilizado, uma molécula de ácido nucleico, e/ou um vetor, de acordo com a invenção, para induzir uma resposta imune contra a proteína RSV F em um sujeito. São adicionalmente proporcionados métodos para induzir uma resposta imune contra a proteína RSV F em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito um polipeptídeo RSV F pré- fusão, e/ou uma molécula de ácido nucleico, e/ou um vetor, de acordo com a invenção. Também são proporcionados polipeptídeos RSV F pré-fusão, moléculas de ácidos nucleicos, e/ou vetores, de acordo com a invenção para uso na indução de uma resposta imune contra a proteína RSV F em um sujeito. É adicionalmente proporcionado o uso dos polipeptídeos RSV F pré-fusão, e/ou moléculas de ácidos nucleicos, e/ou vetores de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento destinado a uso na indução de uma resposta imune contra a proteína RSV F em um sujeito.

[0075] Os polipeptídeos RSV F pré-fusão, moléculas de ácidos nucleicos, ou vetores da invenção podem ser usados para prevenção (profilaxia) e/ou tratamento de infecções por RSV. Em certas modalidades, a prevenção e/ou tratamento podem ser dirigidos a grupos de pacientes que são suscetíveis a infecção por RSV. Tais grupos de pacientes incluem os, mas não estão limitados aos, p.ex., idosos (p.ex. > 50 anos de idade, > 60 anos de idade, e preferencialmente > 65 anos de idade), os novos (p.ex. < 5 anos de idade, < 1 ano de idade), pacientes hospitalizados e pacientes que foram tratados com um composto antiviral mas mostraram uma resposta antiviral inadequada.

[0076] Os polipeptídeos RSV F pré-fusão, moléculas de ácidos nucleicos e/ou vetores de acordo com a invenção podem ser usados, por exemplo, em tratamento e/ou profilaxia autônomos de uma doença ou estado clínico causado por RSV, ou em combinação com outros tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos, como vacinas (existentes ou futuras), agentes antivirais e/ou anticorpos monoclonais.

[0077] A invenção proporciona adicionalmente métodos de prevenção e/ou tratamento de infecção por RSV em um sujeito usando os polipeptídeos RSV F pré-fusão, moléculas de ácidos nucleicos e/ou vetores de acordo com a invenção. Em uma modalidade específica, um método de prevenção e/ou tratamento de infecção por RSV em um sujeito compreende administrar a um sujeito necessitado uma quantidade eficaz de um polipeptídeo RSV F pré-fusão, molécula de ácido nucleico e/ou um vetor, como descrito acima. Uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma quantidade de um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico ou vetor, que é eficaz para prevenir, melhorar e/ou tratar uma doença ou estado clínico resultante de infecção por RSV. Prevenção abrange inibição ou redução da disseminação de RSV ou inibição ou redução do surgimento, desenvolvimento ou progressão de um ou mais dos sintomas associados a infecção pelo RSV. Melhoria, como usado aqui, pode se referir à redução de sintomas da doença visíveis ou perceptíveis, viremia, ou qualquer outra manifestação mensurável de infecção por RSV.

[0078] Para administração a sujeitos, como humanos, a invenção pode empregar composições farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo RSV F pré-fusão, uma molécula de ácido nucleico e/ou um vetor como descrito aqui, e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. No presente contexto, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa que o transportador ou excipiente, às dosagens e concentrações empregues, não irá causar quaisquer efeitos indesejados ou nocivos nos sujeitos aos quais é administrado. Tais transportadores e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica (ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, A. R. Gennaro, Editor, Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer e L. Hovgaard, Editores, Taylor & Francis [2000]; e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edição, A. Kibbe, Editor, Pharmaceutical Press [2000]). Os polipeptídeos RSV F, ou moléculas de ácidos nucleicos, são preferencialmente formulados e administrados na forma de uma solução estéril, apesar de também ser possível usar preparações liofilizadas. As soluções estéreis são preparadas por filtração estéril ou por outros métodos conhecidos per se na técnica. As soluções são depois liofilizadas ou enchidas em contentores de dosagem farmacêutica. O pH da solução está geralmente na gama de pH 3,0 a 9,5, p.ex. pH 5,0 a 7,5. Os polipeptídeos RSV F estão tipicamente em uma solução tendo um tampão farmaceuticamente aceitável adequado, e a composição também pode conter um sal. Opcionalmente, o agente de estabilização pode estar presente, tal como a albumina. Em certas modalidades, é adicionado detergente. Em certas modalidades, os polipeptídeos RSV F podem ser formulados em uma preparação injetável.

[0079] Em certas modalidades, uma composição de acordo com a invenção compreende adicionalmente um ou mais adjuvantes. Adjuvantes são conhecidos na técnica para aumentar adicionalmente a resposta imune a um determinante antigênico aplicado. Os termos "adjuvante" e "estimulante imune" são aqui utilizados indiscriminadamente, e são definidos como uma ou mais substâncias que provocam a estimulação do sistema imunológico. Neste contexto, um adjuvante é usado para intensificar uma resposta imune aos polipeptídeos RSV F da invenção. Exemplos de adjuvantes adequados incluem sais de alumínio, tais como hidróxido de alumínio e/ou fosfato de alumínio; composições de emulsão em óleo (ou composições óleo- em-água), incluindo emulsões de esqualeno-água, tais como MF59 (ver, por exemplo, WO 90/14837); formulações de saponina, tais como, por exemplo, QS21 e Complexos Imunoestimulantes (ISCOMS) (ver, por exemplo, US 5,057,540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); derivados bacterianos ou microbianos, exemplos dos quais são monofosforil lipídeo A (MPL), MPL 3-O-desacilado (3dMPL), oligonucleotídeos contendo o motivo CpG, toxinas bacterianas de ADP-ribosilação ou seus mutantes, tais como enterotoxina lábil ao calor LT de E. coli, toxina CT da cólera, e similares; proteínas eucarióticas (por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos (por exemplo, dirigidos contra o próprio antígeno ou CD1a, CD3, CD7, CD80) e ligantes para receptores (por exemplo, CD40L, GMCSF, GCSF, etc.), que estimulam a resposta imune por interação com células receptoras. Em certas modalidades as composições da invenção compreendem alumínio como adjuvante, p. ex., sob a forma de hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, fosfato de alumínio e potássio, ou suas combinações, em concentrações de 0,05 - 5 mg, p. ex., 0,075-1,0 mg de teor de alumínio por dose.

[0080] Os polipeptídeos RSV F pré-fusão também podem ser administrados em combinação ou conjugados a nanopartículas, como, por exemplo, polímeros, lipossomos, virossomos, partículas do tipo vírus. Os polipeptídeos F pré-fusão podem ser combinados, encapsidados ou conjugados às nanopartículas com ou sem adjuvante. A encapsulação em lipossomos é descrita, por exemplo, em US 4,235,877. A conjugação a macromoléculas é divulgada, por exemplo, em US 4,372,945 ou US 4,474,757.

[0081] Em outras modalidades, as composições não incluem adjuvantes.

[0082] Em certas modalidades, a invenção proporciona métodos de preparação de uma vacina contra o vírus sincicial respiratório (RSV), compreendendo proporcionar uma composição de acordo com a invenção e formulá-la em uma composição farmaceuticamente aceitável. O termo "vacina" refere-se a um agente ou composição contendo um componente ativo eficaz para induzir um certo grau de imunidade em um sujeito contra um certo patógeno ou doença, que irá originar pelo menos um decréscimo (até à ausência completa) da gravidade, duração ou outra manifestação de sintomas associados a infecção pelo patógeno ou doença. Na presente invenção, a vacina compreende uma quantidade eficaz de um polipeptídeo RSV F pré- fusão e/ou uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo RSV F pré-fusão, e/ou um vetor compreendendo a referida molécula de ácido nucleico, que origina uma resposta imune contra a proteína F do RSV. Isto proporciona um método de prevenção de doença grave do trato respiratório inferior conducente a hospitalização e decréscimo da frequência de complicações como pneumonia e bronquiolite devido a infecção por RSV e replicação em um sujeito. O termo "vacina" de acordo com a invenção implica que é uma composição farmacêutica, e assim tipicamente inclui um diluente, transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Pode ou não compreender outros ingredientes ativos. Em certas modalidades, pode ser uma vacina de combinação que compreende adicionalmente outros componentes que induzem uma resposta imune, por exemplo, contra outras proteínas do RSV e/ou contra outros agentes infecciosos. A administração de outros componentes ativos pode ser efetuada, por exemplo, por administração separada ou por administração de produtos de combinação das vacinas da invenção e dos outros componentes ativos.

[0083] As composições podem ser administradas a um sujeito, por exemplo, um sujeito humano. A dose total dos polipeptídeos RSV F em uma composição para administração isolada pode ser, por exemplo, cerca de 0,01 μg até cerca de 10 mg, por exemplo, 1 μg - 1 mg, por exemplo, 10 μg - 100 μg. A determinação da dose recomendada será efetuada por experimentação e é rotineira para os peritos na técnica.

[0084] A administração das composições de acordo com a invenção pode ser efetuada usando vias de administração comuns. Modalidades não limitativas incluem administração parentérica, como administração intradérmica, intramuscular, subcutânea, transcutânea, ou em mucosas, por exemplo, intranasal, oral e similares. Em uma modalidade, uma composição é administrada por injeção intramuscular. O perito conhece as várias possibilidades para administrar uma composição, p. ex., uma vacina, de modo a induzir uma resposta imunitária ao(s) antigênio(s) na vacina.

[0085] Um sujeito, como usado aqui, é preferencialmente um mamífero, por exemplo, um roedor, por exemplo, um camundongo, um rato do algodão, ou um primata não humano, ou um humano. Preferencialmente, o sujeito é um sujeito humano.

[0086] Os polipeptídeos, moléculas de ácidos nucleicos, vetores, e/ou composições também podem ser administrados, como primário, ou como reforço, em um regime de primário-reforço homólogo ou heterólogo. Se for efetuada uma vacinação de reforço, tipicamente, tal vacinação de reforço será administrada ao mesmo sujeito em um momento entre uma semana e um ano, preferencialmente entre duas semanas e quatro meses, após a administração da composição ao sujeito pela primeira vez (que, em tais casos, é denominada ‘vacinação primária’). Em certas modalidades, a administração compreende uma administração primária e pelo menos uma de reforço.

[0087] Adicionalmente, os polipeptídeos da invenção podem ser usados como ferramenta de diagnóstico, por exemplo para testar o estado imune de um indivíduo por estabelecimento de se existem anticorpos no soro de tal indivíduo capazes de ligação ao polipeptídeo da invenção. Assim, a invenção também se refere a um método de diagnóstico in vitro para detectar a presença de uma infecção por RSV em um paciente, em que o referido método compreende as etapas de a) contatar uma amostra biológica obtida do referido paciente com um polipeptídeo de acordo com a invenção; e b) detectar a presença de complexos anticorpo-polipeptídeo.

[0088] A invenção proporciona adicionalmente um método de estabilização da conformação pré-fusão de um polipeptídeo RSV F, compreendendo introduzir uma ou mais mutações em um domínio RSV F1 e/ou F2, em comparação com o domínio RSV F1 e/ou F2 de tipo selvagem, em que a uma ou mais mutações são selecionadas do grupo consistindo de: (a) uma mutação estabilizadora na região HRA entre os elementos da estrutura secundária em F pré-fusão que são transformados em uma grande super-hélice em F pós-fusão; e (b) introdução de dois resíduos cisteína próximos do eixo ternário na base da cabeça de RSV-F pré-fusão de modo N-terminal à haste pré-fusão (resíduos 493 - 525), N-terminal de HRB) que ligam covalentemente de modo cruzado as subunidades F1 no trímero.

[0089] Em certas modalidades, a mutação estabilizadora na região HRA ocorre na posição 161.

[0090] Em certas modalidades, a mutação na região HRA ocorre na posição 173.

[0091] Em certas modalidades, a mutação na região HRA ocorre na posição 182.

[0092] Em certas modalidades, a introdução de dois resíduos cisteína ocorre na posição 486 e 489.

[0093] Em certas modalidades, a introdução de dois resíduos cisteína ocorre na posição 486 e 487.

[0094] Polipeptídeos RSV F pré-fusão estabilizados que podem ser obtidos e/ou são obtidos por tal método também fazem parte da invenção, bem como os seus usos como descrito acima.

[0095] A invenção é adicionalmente explicada nos seguintes exemplos. Os exemplos não limitam a invenção de qualquer modo. Servem apenas para clarificar a invenção.

Exemplos EXEMPLO 1 Preparação de polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis - ligadores e domínios de trimerização

[0096] No pedido de patente copendente PCT/EP2014/058353, variantes estabilizadas da proteína F pré-fusão solúvel (sF) foram planejadas por estabilização das duas regiões principais que iniciam o redobramento. A primeira estratégia foi travar o peptídeo de fusão nesta posição e evitar a sua liberação da região de cabeça por fixação e união dos domínios F1-F2 por uma alça curta. A liberação do peptídeo de fusão pode ser evitada por restabelecimento de uma conexão covalente do terminal N de F1 ao terminal C de F2. Como mostrado neste exemplo, foram tentados vários ligadores diferentes. A inserção de uma alça de 5 aminoácidos entre F1 e F2, em particular compreendendo a sequência de aminoácidos GSGSG (SEQ ID NO: 5), foi muito bem sucedida.

[0097] A outra região instável é a segunda região de repetições heptavalentes (HRB) que forma a região de haste helicoidal trimérica na proteína F pré-fusão. A deleção do domínio transmembrana (TM) na proteína F solúvel desestabiliza adicionalmente esta região, o que foi compensado pela adição de diferentes domínios de trimerização heterólogos. O ectodomínio de RSV-F maduro totalmente processado foi fundido de modo C-terminal a diferentes domínios de trimerização e em diferentes posições (isto é, o domínio F1 foi truncado em diferentes resíduos de aminoácidos).

[0098] Foram preparadas várias construções com base em cepas do RSV A2 ou B1. Diferentes domínios de trimerização foram ligados ao domínio F1 de RSV, que foi truncado em diferentes posições. Os domínios de trimerização que foram testados incluíram o motivo de Fibritina (compreendendo a sequência de aminoácidos: GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4), e o motivo "longo de Fibritina", um domínio de Fibritina maior, com extensão N- terminal que inclui suas regiões helicoidais naturais (compreendendo a sequência de aminoácidos: SSLQGDVQALQEAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 6), que foram adicionados ao domínio F1 de RSV na estrutura (no registro) com a repetição heptavalente presumida da região HRB.

[0099] Outras construções que foram preparadas compreenderam super-hélices triméricas helicoidais ideais heptavalentes, ou domínios Zíper de Isoleucina (IZ) (Suzuki et al., Proteína Engineering 11: 10511055 (1998)), compreendendo a sequência de aminoácidos: IEAIEKK (SEQ ID NO: 7). De acordo com a invenção, foram usados diferentes domínios IZ, denominados Zíper de Isoleucina (L), compreendendo a sequência de aminoácidos: (I)EKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 8) e Zíper de Isoleucina (S), compreendendo a sequência de aminoácidos EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 3).

[00100] A estrutura destes domínios IZ é comparável a GCN4, no entanto, os domínios IZ não são sequências naturais mas são planejados para serem domínios de trimerização ótimos e em consequência mais estáveis.

[00101] Foram preparadas outras construções com outros domínios de trimerização conhecidos:

GCN4II EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA (SEQ ID NO: 9) GCN4II Otimizado EDKVEELLSKIYHIENRIARIEKLVGEA (SEQ ID NO: 10) Matrilina -1 (versão longa) EEDPCECKSIVKFQTKVEELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID NO: 11) Versão curta de Matrilina- 1 que contém somente domínio zíper: EELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID NO: 12)

[00102] Foram preparadas as seguintes construções:

[00103] A construção F18 compreendeu o domínio de trimerização de Fibritina (SEQ ID NO: 4) ligado ao resíduo de aminoácido 513 do domínio F1.

[00104] A construção F19 compreendeu o domínio de trimerização de Fibritina (SEQ ID NO: 4) ligado ao resíduo de aminoácido 499 do domínio F1.

[00105] A construção F20 compreendeu o domínio Zíper de Isoleucina (L) (SEQ ID NO: 8) ligado ao resíduo de aminoácido 516 do domínio F1 e compreendendo modificações adicionais em HRB para otimizar a natureza hidrofóbica das posições heptavalentes e facilitar a fusão na estrutura ao domínio IZ.

[00106] A construção F21 também compreendeu o domínio Zíper de Isoleucina (L) (SEQ ID NO: 8), mas ligado ao resíduo de aminoácido 501 do domínio F1 e sem modificações adicionais na região HRB.

[00107] A construção F22 compreendeu o domínio Zíper de Isoleucina (L) (SEQ ID NO: 8) ligado ao resíduo de aminoácido 495 do domínio F1 e compreendendo modificações adicionais em HRB.

[00108] A construção F23 compreendeu o domínio Zíper de Isoleucina (S) (SEQ ID NO: 3) ligado ao resíduo de aminoácido 495.

[00109] A construção F46 também compreendeu o domínio Zíper de Isoleucina (S) (SEQ ID NO: 3) mas ligado a um ectodomínio de RSV-F mais longo, isto é, o domínio F1 foi truncado após o resíduo de aminoácido 513.

[00110] Todas as construções compreenderam uma cauda HIS.

[00111] As construções foram testadas quanto aos níveis de expressão, estabilidade por armazenamento e ligação a anticorpos com o anticorpo CR9501. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve, e das CDRs de cadeia pesada e leve deste anticorpo são apresentadas embaixo. CR9501 compreende as regiões de ligação dos anticorpos designados 58C5 em WO2012/006596.

[00112] As construções foram sintetizadas e otimizadas quanto a códons na Gene Art (Life Technologies, Carlsbad, CA). As construções foram clonadas em pCDNA2004 ou geradas por métodos comuns amplamente conhecidos no domínio envolvendo mutagênese sítio- dirigida e PCR e foram sequenciadas. A plataforma de expressão usada foi a 293Freestyle cells (Life Technologies). As células foram transfectadas de modo transitório usando 293Fectin (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante e foram cultivadas por 5 dias a 37 oC e 10 % de CO2. O sobrenadante da cultura foi recolhido e submetido a rotação por 5 min a 300 g para remover células e detritos celulares. O sobrenadante submetido a rotação foi subsequentemente filtrado de modo esterilizado usando um filtro de vácuo de 0,22 um e foi armazenado a 4 oC até ser usado.

[00113] Sobrenadantes do dia 5 foram avaliados quanto a expressão de proteína F por Western blot usando o anticorpo monoclonal CR9503, que compreende as regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo para RSV F Motavizumab (denominado CR9503). Os níveis de expressão aproximados das construções da proteína RSV F pré-fusão foram avaliados usando CR9503, um anticorpo secundário anti-humano conjugado ao corante IR (Li-Cor, Lincoln, NE) ou um IgG anti-humano de camundongo conjugado a HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). As quantidades de proteína foram então estimadas usando uma série de diluições da proteína RSV comum purificada, visualmente ou usando o sistema de imagiologia de infravermelhos Odyssey CLx. Para avaliar a estabilidade das construções e para identificar efeitos estabilizadores positivos ou negativos dos motivos de trimerização introduzidos, as construções capazes de ligação a CR9501 foram tratadas em um intervalo de temperaturas entre 45-65 °C por 30 minutos para testar a estabilidade do epítopo de CR9501. Este procedimento é descrito em detalhe no Exemplo 9. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Tabela 1. Expressão e estabilidade de construções RSV F com diferentes motivos de trimerização

[00114] Como pode ser observado na Tabela 1, as únicas construções que foram expressas foram a variante de Fibritina (F18) e F23. Apesar de F18 ser trimérica e ter exibido expressão, foi instável por armazenamento a 4 °C. Em contraste, F23 foi estável a 4 °C, ligase aos anticorpos pré-fusão-específicos, mas aparentou ser monomérica. Em consequência, ambas as variantes F18 e F23 foram usadas para otimização quanto à estabilidade e trimerização.

[00115] Em seguida, foram preparadas várias construções nas quais o peptídeo de fusão no terminal N de F1 foi fixado por fusão ao terminal C do domínio F2. Todas as construções compreenderam uma cauda His. Foram preparadas várias construções incluindo construções nas quais ambos os locais de clivagem de furina foram mutados, originando uma proteína F solúvel que ainda continha o peptídeo p27 (isto é, F12, F15.1, e F17). Em outras construções, a região do resíduo 27 (alça P27) que é clivada do precursor F0 foi substituída por uma alça fechada ou sequência ligadora alternativa: por substituição da região de RSV-F pela região ‘homóloga’ de PIV-5 F, a proteína F pré-fusão que havia sido produzida e cristalizada com êxito (F25), ou por substituição da região por uma alça (GS)n mínima que faz a ponte entre os terminais de F2 e F1 (F24), ou por substituição da região pela região conservada central de RSV-G (F26). A modelagem de homologia de RSV-F com base em PIV-5 e medições in silico levou à escolha de uma alça mínima de 5 resíduos de aminoácidos entre os resíduos 108 e 136. Como ligador, foram escolhidos os resíduos Gly (G) e Ser (S) que são flexíveis e polares e têm elevada probabilidade de serem acomodados (F24). Adicionalmente, F137 foi mutado em S porque as modificações locais causadas pela alça podiam deslocar o F hidrofóbico e causar instabilidades. Tal é mostrado embaixo. Também o R106 é mutado em Q e 27 resíduos (109-135) são substituídos por GSGSG.

PAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRR136FLGFLLGVG PAANNQAR GSGSGR136SLGFLLGVG

[00116] Como mostrado na Tabela 2, todas as variantes exibiram expressão nula ou muito baixa excetuando a variante com a alça GSGSG curta (F24) que exibiu uma expressão muito mais elevada (44 μg/mL) em comparação com a construção RSV F do tipo selvagem, isto é, uma construção similar, sem o referido ligador (F11). F24 que foi trimérica, no entanto, foi instável por armazenamento tal como todas as outras variantes com um motivo de trimerização de Fibritina C-terminal. Todas as variantes continham uma cauda HIS. Tabela 2. Expressão e estabilidade de construções RSV F com diferentes ligadores F1-F2

*Estabilidade é definida como descrito no Exemplo 8. Nível de expressão determinado como descrito no Exemplo 1.

[00117] Em seguida, as modificações mais favoráveis foram combinadas para encontrar os polipeptídeos F pré-fusão ótimos. Foram feitas combinações de variantes com a alça GSGSG, truncamento C-terminal de F1, e a adição de fibritina (SEQ ID NO: 4) ou do motivo Zíper de Isoleucina (S) (SEQ ID NO: 3) (ver Tabela 3). Tabela 3. Expressão e estabilidade de construções RSV F com combinações de otimizações de acordo com as Tabelas 1 e 2.

ND é não determinado *Estabilidade por armazenamento determinada no Exemplo 8. *Estabilidade térmica determinada no Exemplo 9. Nível de expressão determinado por Western blotting (descrito no Exemplo 1)

[00118] A adição da alça GSGSG aumentou sempre a expressão de construções funcionais bem como a estabilidade térmica da proteína. A combinação da alça GSGSG com o F truncado e motivo zíper de isoleucina (S) (F43, F47) exibiu boa expressão, estabilidade térmica e boa estabilidade por armazenamento a 4 °C. No entanto, estas variantes ainda eram monoméricas. O motivo de trimerização zíper de isoleucina (S) exibiu expressão mais elevada com uma variante F que consistiu de F truncado de modo C-terminal na posição 495 (comparar F43 com F56 e F23 com F46). Em contraste, para variantes com o domínio de trimerização de Fibritina, um truncamento na posição 513 exibiu expressão elevada em comparação com truncamento na posição 495 que não exibiu expressão (comparar F24 com F44).

[00119] Uma vez que a cauda HIS podia interferir no dobramento nativo dos trímeros, prepararam-se variantes sem a cauda HIS para a variante de Fibritina e de zíper de isoleucina (S) (Tabela 4). Tabela 4. Expressão e estabilidade de construções RSV F com e sem cauda HIS

[00120] tEstabilidade por armazenamento determinada como descrito no Exemplo 8; Estabilidade térmica determinada como descrito no Exemplo 9; ND: não determinado.

[00121] De modo surpreendente, a deleção da cauda HIS aumentou a expressão em F47. Além disso, para F47 aumentou ligeiramente o teor trimérico e para F24 aumentou apenas moderadamente o nível de expressão.

[00122] Em seguida, vários domínios de trimerização e truncamentos alternativos foram testados em combinação com a variante F estabilizada com a alça GSGSG (F47) (ver Tabela 5). Todas as variantes têm uma alça GSGSG e contêm uma cauda HIS. Tabela 5. Expressão e estabilidade de variantes RSV F com domínios de trimerização alternativos

[00123] A ligação de an ticorpos é dei finida como ligação no dia da recolha (como descrito no Exemplo 8; + indica ligação; - indica ausência de ligação. O nível de expressão é determinado como descrito no Exemplo 1. Não determinado

[00124] Verificou-se que apenas o domínio matrilina 1 (Dames-SA et. al., Nat. Struc. Biol., 5(8), 1998) que contém o domínio zíper N- terminal e a parte C-terminal com os resíduos cisteína que potencialmente podem formar pontes dissulfeto inter triméricas permite níveis de expressão mais elevados do que F47 (Tabela 5, Matrilina longa). Além disso, a variante com o motivo de trimerização Matrilina longa exibe proteínas F triméricas. No entanto, o produto não se ligou ao Mab CR9501 específico para a pré-fusão e também exibiu espécies hexaméricas, o que torna o domínio de trimerização Matrilina 1 não adequado para a produção de proteína F nativa trimérica. Nenhum dos motivos à base de matrilina ou zíper à base de GCN4II exibiu expressão ou estabilidade acrescida relativamente a F47 (Tabela 5, Matrilina curta, GCN4II otimizado). Mais uma vez, o truncamento em 495 origina níveis de expressão mais elevados. A adição de um motivo GCN4 que continha uma sequência de desencadeamento otimizada não exibiu expressão.

[00125] GCN4 II é um domínio de trimerização que é usado com êxito para estabilizar o trímero de pré-fusão de parainfluenza do tipo 5 (Yin et al., Nature 439:38-44, 2006) e também foi tentado por outros para estabilizar RSV F pré-fusão (como divulgado, por exemplo, em WO2010/149743, WO2010/14975, WO2009/079796, WO2010/158613). O domínio de trimerização GCN4II foi avaliado e comparado com as construções que contêm o domínio de Zíper de Isoleucina (S) (SEQ ID NO: 3) ou o domínio de Fibritina (SEQ ID NO: 4) (resultados mostrados na Tabela 6). Estas variantes também foram comparadas com outras modificações, isto é, um ligador curto baseado em uma única Lisina e a mutação L512K. Todas as variantes continham uma cauda HIS. Tabela 6. Expressão e estabilidade de variantes RSV F com GCN4II, L512K e substituição de p27 (ligador de aminoácido único (K) entre F1 e F2)

*Estabilidade por armazenamento determinada como descrito no Exemplo 8; Níveis de expressão determinados como descrito no Exemplo 1; Estabilidade térmica determinada como descrito no Exemplo 9; ND: não determinado.

[00126] A ligação curta entre F1 e F2 aparenta ser comparável à alça GSGSG. A adição do motivo GCN4II não origina qualquer expressão de proteína F em nenhuma das construções testadas (isto é, a sequência RSV A2 F descrita em WO2010/149743 ou WO2010/149745, a sequência RSV A2 F usada de acordo com a invenção, nem a sequência RSV B1 F).

[00127] Foi mostrado que a introdução destes dois tipos de modificações, isto é, introdução de uma sequência ligadora e o domínio de trimerização heterólogo, não foi suficiente para permitir a expressão de proteína F pré-fusão trimérica estável. Para além das duas regiões principais de instabilidade que foram estabilizadas, isto é, a HRB e o peptídeo de fusão, como descrito acima, outras regiões na proteína F pré-fusão também contribuem e/ou acomodam o redobramento dramático em F pós-fusão, e mais posições na sequência podem ser otimizadas para evitar o redobramento da proteína F pré-fusão. Em consequência, diferentes resíduos de aminoácidos no domínio HRA e HRB e em todos os domínios que contatam estas regiões em F pré- fusão foram mutados para aumentar a estabilidade da estrutura pré- fusão, como descrito nos Exemplos seguintes.

EXEMPLO 2 Preparação de polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis - mutações estabilizadoras

[00128] Uma vez que o teor trimérico (para a construção F47) e estabilidade por armazenamento (para a construção F24) não foram ótimos, prepararam-se outras variantes que continham mutações pontuais para aumentar os níveis de expressão, estabilidade e estrutura trimérica nativa. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 7 e 8. Tabela 7. Expressão e estabilidade de variantes F47

ND: não determinado; Nível de expressão determinado como descrito no Exemplo 1. Estabilidade térmica determinada como descrito no Exemplo 9.

[00129] Nomenclatura de mutações baseadas na sequência ts (SEQ ID NO: 1).

[00130] Todas as construções são variantes de F47- : do tipo A2, motivo Zíper de Isoleucina (S) (SEQ ID NO: 3), ligador GSGSG; ponto de terminação 495, sem cauda HIS (SEQ ID NO: 16). Como mostrado na Tabela 7, muitas mutações aumentaram a expressão de F47-, mas somente a variante F47_S46G também exibiu um nível mais elevado de trímeros para além da expressão elevada.

[00131] A Tabela 8 mostra os resultados da expressão e estabilidade de variantes F24. Todas as variantes foram de RSV do tipo A2, com motivo de fibritina, ligador GSGSG; ponto de terminação 513, sem cauda HIS. Tabela 8. Expressão e estabilidade de variantes A2_F24- (SEQ ID NO: 19)

[00132] As construções *marcadas foram testadas quanto a trimerização e verificou-se que todas eram triméricas.

[00133] Nível de expressão determinado como descrito no Exemplo 1. A estabilidade do ponto final é mostrada aqui como a percentagem de ligação de anticorpo para a pré-fusão (CR9501) após 5 dias de armazenamento a 4 oC relativamente ao dia 1; Estabilidae da fase de associação é determinada como descrito no Exemplo 10.

[00134] Muitas mutações aumentaram a expressão de A2_F24-. Para a maior parte das mutações observou-se uma correlação aparente entre expressão melhorada em fundo de F47- (Tabela 7) e fundo de A2_F24- (Tabela 8). N67I teve um impacto mais positivo na expressão de F em fundo de A2_F24-. O aumento mais significativo da expressão foi obtido com as mutações pontuais únicas: S46G, S215P, N67I, K80E, E92D, D486N, G184N, V185N, E487N, N175P, K209Q, E487I, E487Q, K77E, K201Q, N426S e K465Q. No rastreio inicial usando o ensaio de estabilidade de ponto final (Exemplo 8), as variantes com a expressão mais elevada também exibiram a melhor estabilidade por armazenamento (E92D, K465Q, K465E, N426S, S46G, S215P e N67I). Para avaliar se estas mutações estabilizaram de fato a conformação pré-fusão, sobrenadantes de cultura foram diluídos para 5 e 10 μg/mL com base em resultados de Western quantitativo e estes foram armazenados até 33 dias a 4 °C. Como mutantes pontuais únicos, somente N67I e S215P foram completamente estáveis ao longo do tempo (ver Exemplo 10).

[00135] Subsequentemente, várias mutações que exibiram expressão elevada e boa estabilidade da conformação pré-fusão foram combinadas para avaliar se as estabilizações foram aditivas ou se ocorreu um possível efeito sinérgico (Tabela 9). Tabela 9. Expressão e estabilidade de variantes de A2_F24 com duas mutações adicionais.

[00136] Estabilidade por armazenamento refere-se à análise da fase de associação ilustrada no Exemplo 10.

[00137] O nível de expressão foi determinado como descrito no Exemplo 1.

[00138] Todas as variantes são variantes de F24-: do tipo A2, motivo de fibritina, ligador GSGSG; ponto de terminação 513, ligação a todos os Mabs, sem cauda HIS (SEQ ID NO: 19).

[00139] Quando as mutações pontuais previamente identificadas foram combinadas, foi possível observar efeitos sinérgicos muito interessantes especialmente em termos dos níveis de expressão, com as combinações envolvendo N67I sendo as mais potentes. Todas produziram mutantes duplos em que um de N67I e S215P foi incluído, foram estáveis após mais de 30 dias de armazenamento a 4 °C (Exemplo 10). De modo notável, verificou-se que a mutação N67I tem o efeito mais forte em níveis de expressão de F pré-fusão quando incluída nos mutantes duplos. Em seguida, combinações com as mutações S215P originaram uma expressão razoável. A combinação de N67I com S215P foi selecionada pois conduziu a um nível de expressão muito elevada, e porque ambas as mutações pontuais foram estáveis por armazenamento. Adicionalmente observou-se que N67I e S215P tiveram a capacidade de estabilizar alguns dos mutantes que, como mutações únicas, foram instáveis, indicando que a região onde se encontram estas duas mutações é central para as alterações conformacionais que a proteína sofre durante a transição para a conformação pós-fusão.

[00140] Assim, foi mostrado que pelo menos algumas mutações originaram níveis de expressão acrescidos e estabilização aumentada da proteína RSV pré-fusão. É esperado que estes fenômenos estejam ligados. Todas as mutações descritas neste Exemplo originaram produção acrescida de polipeptídeos F pré-fusão. Somente uma seleção destes polipeptídeos permaneceu estável por armazenamento prolongado (ver Exemplo 10). O ensaio de estabilidade que foi usado é baseado na perda do epítopo de CR9501 específico da pré-fusão no topo da proteína F pré-fusão em um ensaio de ligação e pode não ser suficientemente sensível para medir todas as contribuições para a estabilidade da proteína completa. As mutações para as quais só é observada expressão acrescida são, em consequência, mutações potenciais (muito provavelmente estabilizadoras) que podem ser combinadas com outras mutações estabilizadoras para obter uma construção F pré-fusão com elevada estabilidade e níveis de expressão elevados.

[00141] Em seguida, verificou-se se a mutação dupla N67I - S215P, tal como as mutações únicas, foi capaz de estabilizar mutações pontuais que, como mutantes únicos, foram consideradas instáveis com base nos critérios usados. Foram selecionadas mutações extra com base nos níveis de expressão e estabilidade favoráveis de acordo com a Tabela 8. Variantes RSV-F mutantes triplos foram construídas e testadas quanto a níveis de expressão e estabilidade (Tabela 10). Tabela 10. Expressão e estabilidade de variantes de F24_N67I +S215P com uma mutação adicional.

[00142] Todas as variantes são variantes de A2_ F24_N67I +S215P do tipo A2, motivo de fibritina, ligador GSGSG; ponto de terminação 513, ligação a todos os Mabs, sem cauda HIS (SEQ ID NO: 21). *estabilidade refere-se à análise da fase de associação ilustrada no Exemplo 10. + significa <10 % de perda de ligação de CR9501 após 5 dias; ++ significa <5 % de perda de ligação de CR9501 após 5 dias; +++ significa 0 % de perda de ligação de CR9501 após 5 dias.

[00143] Mais uma vez, foi observado um efeito aditivo nos níveis de expressão. Como esperado, mutantes triplos D479N e E487R expressam a níveis um pouco menores porque os mutantes únicos também estiveram entre os mais baixos das mutações selecionadas (Tabela 8). Devido ao efeito estabilizador da mutação N67I+S215P, mutações adicionais que são instáveis como mutantes únicos, originaram variantes F pré-fusão estáveis quando foram adicionadas ao fundo A2_F24 N67I+S215P. Alguns exemplos muito ilustrativos são os mutantes triplos com V185N, G184N ou E487N adicional que exibiram expressão elevada mas baixa estabilidade como mutantes únicos (Tabela 8) mas exibiram expressão ainda mais elevada e foram altamente estáveis quando adicionados ao fundo A2_F24 N67I+S215P.

Mutações estabilizadoras também estabilizam a proteína RSV-F de outras cepas e também na variante F processada.

[00144] Várias mutações que exibiram expressão elevada e boa estabilidade da conformação pré-fusão foram aplicadas às proteínas RSV F de outras cepas (SEQ ID NOs 69 e 70) e foram aplicadas a uma variante RSV F A2 sem mutações de locais de clivagem de furina (F18: SEQ ID NO 71) para avaliar se as modificações são uma solução universal para estabilizar RSV F pré-fusão (Tabela 11). Tabela 11. Expressão e estabilidade de variantes de A2_F18 com mutações adicionais e F da cepa B1 (SEQ ID NO: 2) e do tipo A CL57- v224 (SEQ ID NO: 69).

[00145] A expressão de proteína (concentração no sobrenadante de células transfectadas de modo transitório) foi medida pelo método Octet Quantitativo. 1 Expressão relativa é normalizada para expressão de A2_F24_N67I, S215P, E487Q (seq ID #33) 2 * Estabilidade - é expressa como % da concentração de proteína medida após armazenamento a 4 C por 5 dias, relativamente ao dia da recolha. As concentrações foram medidas pelo método Octet Quantitativo usando anticorpo CR9501. NA - dados não disponíveis: não foi detectada ligação de CR9501.

[00146] Quando as mutações pontuais previamente identificadas foram introduzidas em A2_F18 (SEQ ID NO. 71), a estabilidade e níveis de expressão foram muito similares em comparação com a variante F24 de cadeia simples (SEQ ID NO. 21) que continha uma alça curta entre F1 e F2. Mais uma vez, foi observada sinergia, mostrando expressão e estabilidade mais elevadas quando mutações foram adicionadas a variantes que continham N67I ou a mutação dupla N67I, S215P. A mutação pontual dupla N67I, S215P não só estabilizou F pré-fusão da cepa A2 mas também pré-fusão da cepa B1 e CL57-v224 (Tabela 11).

Mutações estabilizadoras também estabilizam a proteína RSV-F completa.

[00147] Várias mutações que exibiram expressão elevada e boa estabilidade da conformação pré-fusão na versão solúvel de RSV-F correspondente ao ectodomínio, foram aplicadas à proteína RSV-F completa. As mutações foram introduzidas em RSV-F completa com ou sem mutações de locais de clivagem de furina. Nenhum domínio de trimerização foi fundido a estas variantes (Tabela 12). Tabela 12. Expressão e estabilidade de variantes de versões completas de A2_F18 e A2_F24 com mutações adicionais.

Nível de expressão determinado usando FACS. N.D. - não determinado. *todas as variantes são baseadas na sequência da proteína RSV F A2. ** comparação com a proteína do tipo selvagem, aumento em número de vezes de MFI em 9503. A estabilidade foi avaliada por tratamento térmico das células HEK293T por 5 - 10 minutos a 46, 55,3, 60 oC. 3 ** legenda para a leitura da estabilidade - decréscimo da ligação a Mab CR9501 pré-fusão - específico ligação após 46 oC (por exemplo, do tipo selvagem) + aumento ligeiro da ligação de CR9501 após 46 oC mas não na mesma extensão forte do tipo selvagem ++ nenhuma alteração da ligação de CR9501 até 60 oC, a 60 oC algum decréscimo na ligação de CR9501 +++ nenhuma alteração da ligação de CR9501 a 60 oC

[00148] As mutações pontuais estabilizadoras previamente identificadas também foram estabilizadoras na proteína F completa. O aumento do nível de expressão foi menos pronunciado mas exibiu a mesma tendência. Tal pode ser causado pelo fundo diferente onde foram introduzidas as mutações, mas também pode ser causado pelo diferente método de quantificação (FACS versus Western blot) e um máximo biológico de expressão devido a reciclagem de proteínas de superfície. A introdução da sequência ligadora (ou alça curta) aumentou a expressão e estabilidade e as mutações pontuais também o fizeram. As mutações pontuais não foram ou foram muito pouco sinérgicas com a alça curta (similar ao que encontrámos para a proteína solúvel (Tabela 9-11)).

[00149] Uma vez que a mutação pontual na posição 67 teve tal efeito positivo no nível de expressão e estabilidade, todas as substituições de aminoácidos foram testadas para esta posição para estudar se foram escolhidas as melhores ou se estas posições podem ser melhoradas. (Tabela 13) Tabela 13. Análise de substituição total de expressão e estabilidade para a posição 67 no fundo A2_F24.

* Expressão relativa - a concentração de proteína foi medida pelo método Octet Quantitativo usando anticorpo CR9503 e expressa relativamente à concentração de A2_F24 (SEQ ID #19) ** Estabilidade - é expressa como % da concentração de proteína medida após armazenamento a 4 C por 5 e 10 dias, relativamente ao dia da recolha. As concentrações foram medidas pelo método Octet Quantitativo usando anticorpo CR9501. NA - dados não disponíveis: não foi detectada ligação de CR9501.

[00150] Como mostrado na Tabela 13, resíduos maioritariamente hidrofóbicos e particularmente Ile, Leu e Met na posição 67 foram capazes de aumentar a expressão e estabilidade. Ile é o resíduo que mais aumentou a expressão e estabilidade. Os resíduos Glu e Gln, o resíduo mais pequeno Gly e os resíduos de carga positiva Arg e Lys tiveram o efeito mais desestabilizador na posição 67 na conformação pré-fusão.

EXEMPLO 3 Preparação de polipeptídeos RSV F pré-fusão estáveis de acordo com a presente invenção

[00151] Na pesquisa que conduziu à presente invenção, variantes adicionalmente estabilizadas de proteína F pré-fusão solúvel (sF) foram planejadas por estabilização das duas regiões principais que iniciam o redobramento. A primeira estratégia foi prevenir o redobramento da região HRA em uma super-hélice. A segunda estratégia foi construir pontes dissulfeto N-terminais a HRB para prevenir a relocalização da HRB para formar o feixe de seis hélices por ancoragem à super-hélice de HRA.

[00152] As construções foram testadas quanto a níveis de expressão, estabilidade por armazenamento e ligação de anticorpos com o anticorpo CR9501. As sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e leve, e das CDRs de cadeia pesada e leve deste anticorpo são mostradas embaixo. CR9501 compreende as regiões de ligação dos anticorpos denominados 58C5 em WO2012/006596. As construções foram sintetizadas e otimizadas quanto a códons na Gene Art (Life Technologies, Carlsbad, CA). As construções foram clonadas em pCDNA2004 ou geradas por métodos comuns amplamente conhecidos no domínio envolvendo mutagênese sítio-dirigida e PCR e foram sequenciadas. A plataforma de expressão usada foi a 293Freestyle cells (Life Technologies). As células foram transfectadas de modo transitório usando 293Fectin (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante e foram cultivadas por 5 dias a 37 °C e 10 % de CO2. O sobrenadante da cultura foi recolhido e submetido a rotação por 5 min a 300 g para remover células e detritos celulares. O sobrenadante submetido a rotação foi subsequentemente filtrado de modo esterilizado usando um filtro de vácuo de 0,22 um e foi armazenado a 4 °C até ser usado. Sobrenadantes do dia 5 foram avaliados quanto a expressão de proteína F por western blot usando o anticorpo monoclonal CR9503, que compreende as regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo para RSV F Motavizumab (denominado CR9503). Os níveis de expressão aproximados das construções da proteína RSV F pré- fusão foram avaliados usando CR9503, um anticorpo secundário anti- humano conjugado ao corante IR (Li-Cor, Lincoln, NE) ou um IgG anti- humano de camundongo conjugado a HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). As quantidades de proteína foram então estimadas usando uma série de diluições da proteína RSV comum purificada, visualmente ou usando o sistema de imagiologia de infravermelhos Odyssey CLx. Para avaliar a estabilidade das construções e para identificar efeitos estabilizadores positivos ou negativos dos motivos de trimerização introduzidos, as construções foram testadas quanto a ligação a anticorpos pré-fusão-específicos após 5, 14 ou 30 dias de armazenamento a 4 °C. Este procedimento é descrito em detalhe no Exemplo 10.

[00153] Em seguida, as modificações mais favoráveis foram combinadas para descobrir os polipeptídeos F pré-fusão ótimos. Foram efetuadas combinações de variantes com a alça GSGSG, truncamento C-terminal de F1, e a adição de fibritina (SEQ ID NO: 4). Foram preparadas variantes que continham mutações pontuais para aumentar os níveis de expressão, estabilidade e estrutura trimérica nativa. Todas as variantes eram de RSV do tipo A2, com motivo de fibritina, ligador GSGSG; ponto de terminação 513, sem cauda de HIS.

[00154] De acordo com a invenção, as mutações de aminoácidos que estabilizam a conformação pré-fusão da proteína RSV F podem ser agrupadas em diferentes categorias que estabilizam a conformação de modos diferentes.

Resíduos de aminoácidos 161, 173, 174, 182 e 214:

[00155] Para operar o redobramento da conformação pré-fusão para a pós-fusão, a região entre o resíduo 160 e 215 tem de ser transformado de uma montagem de hélices, alças e fitas em uma longa hélice contínua. Esta região exibe a transição estrutural mais dramática. Parte desta região tem, de fato, a previsão mais elevada de hélice alfa. As estruturas helicoidais reais na estrutura cristalina pré- fusão estão apresentadas embaixo salientadas a cinzento. Toda esta região é transformada em uma grande hélice quando sofre redobramento para a conformação pós-fusão. Na sequência de baixo, os resíduos que estão salientados a cinzento têm a previsão de hélice mais elevada com base em Agadir (http://agadir.crg.es/). É claro desta comparação que a parte C-terminal que é mantida em um grampo beta, uma alça conectora e uma hélice na conformação pré-fusão (resíduos 187-202) tem uma tendência elevada para formar uma hélice alfa.

[00156] Os resíduos sublinhados têm maus ângulos de acordo com o gráfico de Ramachandran.

[00157] A sequência de resíduos 150 - 212 de RSV-F está mostrada acima. Na segunda linha, as estruturas secundárias da linha de topo estão indicadas por h (para hélice) e s (para fitas) com base na estrutura cristalina. As hélices estão salientadas com sombreado cinzento. A linha de baixo é a mesma sequência na qual as hélices estão sombreadas a cinzento com base na propensão da sequência para hélice.

[00158] As regiões que necessitam de otimização são as regiões de alça entre os elementos estruturais secundários (hélices e fitas) na HRA lábil de RSV-F pré-fusão. Uma das posições na HRA que necessita de otimização para estabilizar a conformação pré-fusão de RSV-F é a posição 161 na volta entre as hélices α2 (resíduos 148-157) e α3 (resíduos 163-172). Há vários motivos pelos quais a otimização desta posição pode aumentar a estabilidade desta região: - A volta posiciona a carga negativa de Glu161 próximo da carga negativa de Glu163, resultando em repulsão negativa desestabilizadora; - O gráfico de Ramachandran mostra que o resíduo 161 tem ângulos diédricos maus/desfavoráveis; - O resíduo 161 tem um fator B elevado que reflete elevada mobilidade (e sugere instabilidade); - Os resíduos 160 - 172 exibem elevada propensão para hélices.

[00159] Neste exemplo, o resíduo Glu161 foi substituído por Pro para reduzir a repulsão negativa e estabilizar a volta e evitar o seu redobramento, ou o resíduo Glu161 foi substituído por Gln para reduzir a repulsão de cargas negativas, ou o resíduo Glu161 foi substituído por Gly porque permite uma gama mais ampla de ângulos diédricos.

[00160] Para a região de α2 - volta - α3 (resíduos 153 - 168), a base de dados Brookhaven foi pesquisada quanto a uma hélice-volta- hélice estruturalmente homóloga de uma proteína estável que não sofre redobramento para descobrir um resíduo que possa substituir o Glu161 desfavorável. Foi descoberta uma elevada homologia estrutural com uma volta em uma hélice-volta-hélice de várias proteínas, todas as quais tinham uma Prolina na posição 161 homóloga (códigos PDB 2hgs, 3kal, 2o2z, 2zk3, e 2zqp). De acordo com o alinhamento mostrado embaixo, a substituição de Glu161 por Pro é uma boa solução estrutural para estabilizar esta volta e evitar o seu redobramento.

[00161] Em certas modalidades, resíduo Ser173 foi substituído por Pro para estabilizar a volta e evitar o seu redobramento. Em certas modalidades, o resíduo Thr174 foi substituído por Pro para estabilizar a volta e evitar o seu redobramento.

[00162] O gráfico de Ramachandran mostra que o resíduo de aminoácido 182 na volta entre β3 e β4 também tem ângulos diédricos maus/desfavoráveis. A otimização desta posição pode aumentar a estabilidade da volta e estabilizar o grampo β.

[00163] Para a região de β3 - volta - β4 (resíduos 177-189), a base de dados de Brookhaven foi pesquisada quanto a um grampo β estruturalmente homólogo de uma proteína estável que não sofre redobramento para descobrir um resíduo que possa substituir o Ser182 desfavorável. Foi descoberta uma elevada homologia estrutural com uma volta em um grampo β de uma proteína de transferência eletrônica putativa que tinha uma Prolina na posição 182 homóloga (código PDB 3me8). De acordo com o alinhamento mostrado embaixo, a substituição de Ser182 por Pro é uma boa solução estrutural para estabilizar esta volta e evitar o seu redobramento.

Formação de ponte de cistina na base da região de cabeça entre os resíduos 486, 487, 489

[00164] Os resíduos de aminoácidos de carga negativa 486, 487 e 489 fazem parte de um mecanismo comutador que controla a transição entre a estrutura RSV-F pré-fusão e pós-fusão. A mutação de Glu487 em Gln irá enfraquecer este comutador e estabilizar o contato entre os protômeros no trímero. Estas mesmas posições de resíduos também podem ser usadas para preparar pontes dissulfeto entre os protômeros. Mutações de 2 resíduos por cisteínas como descrito acima irão reduzir a repulsão de cargas negativas e permitir pontes dissulfeto que irão estabilizar adicionalmente o trímero pré-fusão.

[00165] Foram preparadas variantes que continham mutações pontuais que estabilizam as voltas entre os elementos estruturais secundários na região HRA da proteína RSV-F pré-fusão para aumentar a estabilidade e níveis de expressão da conformação pré- fusão. Os resultados estão apresentados na Tabela 14. Tabela 14. Expressão e estabilidade de variantes A2_F24- (SEQ ID NO: 19)

Todas as variantes são variantes de A2_F24 tipo A2 que contêm um motivo de fibritina e ligador GSGSG entre F1 e F2; ponto de terminação 513, (SEQ ID NO: 19). A estabilidade é expressa como % da concentração de proteína medida por Qoctet (Exemplo 10) após armazenamento a 4 °C por 5 - 30 dias, relativamente ao dia da colheita. As concentrações foram medidas pelo método Quantitative Octet usando anticorpo CR9502. NA: dados não disponíveis: não foi detectada ligação a CR9502.

ND: Não determinado

[00166] Das mutações pontuais únicas, a substituição da posição 173, 182 e especialmente 161 em Prolina originaram níveis de expressão e estabilidade mais elevados. A remoção da carga do resíduo 161 estabilizou as proteínas mas não aumentou os níveis de expressão. As mesmas mutações pontuais tiveram um efeito similar em uma sequência F pré-fusão estabilizada que continha a mutação estabilizadora adicional N67I e S215P. A mutação do resíduo 182, 173 e especialmente 161 em Prolina exibiu o aumento mais elevado na estabilidade e níveis de expressão.

[00167] As mutações E161P que exibiram expressão elevada e boa estabilidade da conformação pré-fusão também foram aplicadas em variantes do ectodomínio de RSV A2 F solúvel sem mutações do local de clivagem de furina (F18: SEQ ID NO 71) para avaliar se as modificações são uma solução universal para estabilizar RSV F pré- fusão (Tabela 15). Tabela 15. Expressão e estabilidade de variantes de A2_F18 (SEQ ID No: 71) com mutações adicionais

A expressão de proteína (concentração no sobrenadante de células transfectadas de modo transitório) foi medida pelo método Quantitative Octet. 1 A expressão relativa está normalizada para a expressão de A2_F24_N67I, S215P, E487Q (seq ID #33) 2 * Estabilidade - é expressa como % da concentração de proteína medida por Qoctet (Exemplo 10) após armazenamento a 4 °C por 5 dias, relativamente ao dia da colheita. As concentrações foram medidas pelo método Quantitative Octet usando anticorpo CR9501.

ND: Não determinado

[00168] A mutação E161P também exibiu um aumento elevado dos níveis de expressão na proteína RSV-F processada. Quando combinada com mutações pontuais estabilizadoras, por exemplo, na posição 67, 215 e 487, a mutação E161P originou variantes F pré- fusão com elevados níveis de expressão e elevada estabilidade.

Formação de pontes de cistina na base da região de cabeça entre os resíduos 486, 487, 489

[00169] Os resíduos de aminoácidos de carga negativa 486, 487 e 489 fazem parte de um mecanismo comutador que controla a transição entre a estrutura de RSV-F pré-fusão e pós-fusão. A mutação de Glu487 em Gln irá enfraquecer este comutador e estabilizar o contato entre os protômeros no trímero (patente prévia P00). Estas mesmas posições de resíduos também podem ser usadas para preparar pontes dissulfeto entre os protômeros. Mutações de 2 resíduos em cisteínas dos quais um é um resíduo de carga negativa 486, 486 ou 489, irão reduzir a repulsão de cargas negativas e permitir pontes dissulfeto que irão estabilizar adicionalmente o trímero pré- fusão. Várias de tais variantes foram testadas quanto ao nível de expressão e estabilidade da conformação pré-fusão (Tabela 16). Tabela 16. Expressão e estabilidade de variantes A2_F24- (SEQ ID NO: 19)

Todas as variantes são variantes de A2_F24- tipo A2 que contêm um motivo de fibritina e ligador GSGSG entre F1 e F2; ponto de terminação 513, (SEQ ID NO: 19). Estabilidade - é expressa como % da concentração de proteína por Qoctet (Exemplo 10) medida após armazenamento a 4 °C por 5 -30 dias, relativamente ao dia da colheita. As concentrações foram medidas pelo método Quantitative Octet usando anticorpo CR9502.

ND: Não determinado.

[00170] No fundo F24 metaestável (SEQ ID NO: 19), somente uma ponte dissulfeto entre os resíduos 486 e 487 originou uma proteína pré-fusão com expressão e estabilidade razoáveis. Uma vez que dissulfetos inter-protoméricos necessitam de um alinhamento correto de cadeias laterais opostas, a conectividade de dissulfeto pode ser mais bem sucedida em uma proteína F mais estável em comparação com a variante F24 metaestável. Em consequência, vários dos dissulfetos também foram preparados na variante F24 que continha as 2 mutações estabilizadoras N67I e S215P. De fato, no fundo estabilizado, as proteínas com dissulfetos manipulados expressaram em níveis muito mais elevados. Mais uma vez, a variante com as mutações de cisteína na posição 486 e 487 expressou no nível mais elevado e o nível de expressão foi 14 vezes mais elevado em comparação com a variante não estabilizada sem a mutação N67I e S215P. A estabilidade da proteína no sobrenadante foi razoável e ainda continha 79 % da conformação pré-fusão. Pode ser alcançada estabilidade mais elevada quando a proteína é purificada. A estabilidade pode não ter alcançado 100 % porque não foram 100 % das cisteínas que foram conectadas de modo inter-protomérico, como mostrado no exemplo 4 e 5.

EXEMPLO 4 Western blotting

[00171] Sobrenadantes de cultura foram processados reduzidos em géis Bis-Tris NuPAGE 4-12 % (p/v) (Life Technology) e corados usando a tecnologia iBlot (Life Technology). As colorações foram sondadas com CR9503 (sequências apresentadas embaixo na Tabela 18) e desenvolvidas com um IgG anti-humano de camundongo conjugado (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) ou um IgG anti-humano purificado por afinidade conjugado a IRDye800CW (coelho) (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA). Na Figura 1, pode ser observada a expressão de DM = Mutante duplo (N67I+S215P = SEQID 21) e DM+CC = Mutante duplo + DE486CC = SEQID 94). Foi possível observar uma diferença clara entre as duas proteínas quando analisadas reduzidas e não reduzidas. Reduzidas, ambas as proteínas migram como uma espécie monomérica em redor de 55 kDa. Não reduzidas, a vasta maioria do DM ainda se encontra como um monômero, ao passo que a espécie predominante DM+CC é muito mais elevada e predominantemente trimérica. Isto prova que a substituição do resíduo 486 e 487 em cisteína origina um trímero com pontes dissulfeto predominantemente inter-protoméricas.

EXEMPLO 5 NativePAGE

[00172] Para a determinação inicial do estado multimérico dos polipeptídeos F pré-fusão de acordo com a invenção, sobrenadantes de cultura de células transfectadas de modo transitório foram analisados em um sistema de gel NativePAGE Bis-Tris (Life Technologies). Subsequentemente, os géis foram corados usando a tecnologia iBlot de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies). Um anticorpo específico para a proteína RSV F CR9503 (sequências apresentadas embaixo in Tabela 18) foi usado como sonda primária para a detecção da proteína RSV F pré-fusão e foi seguido de um IgG anti-humano de camundongo conjugado a HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) ou um IgG anti-humano purificado por afinidade conjugado a IRDye800CW (coelho) (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA). As colorações foram desenvolvidas com filme padrão (Codak) ou usando o sistema de imagiologia de infravermelhos Odyssey CLx. A Figura 2 mostra a análise NativePAGE de sobrenadantes da Via 2: DM = Mutante duplo (N67I+S215P = SEQID 21) e Via 1: DM+CC = Mutante duplo + DE486CC = SEQID 5A). Tanto o DM quanto o DM+CC são maioritariamente triméricos em native page, mostrando que a introdução de dissulfetos pode não conduzir a ligação cruzada intertrimérica. Uma vez que o DM+CC expressa menos bem do que o DM, o monômero em falta (seta) pode se dever ao fato de estar abaixo do limite de detecção.

EXEMPLO 6 Expressão de proteína F pré-fusão

[00173] Plasmídeos de expressão codificando a proteína RSV F pré-fusão recombinante foram gerados por métodos comuns amplamente conhecidos na técnica, envolvendo mutagênese sítio- dirigida e PCR. A plataforma de expressão usada foi a 293Freestyle cells (Life Technologies, Renfreshire, RU). As células foram transfectadas de modo transitório usando 293Fectin (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante e cultivadas em uma incubadora com agitação por 5 dias a 37 oC e 10 % de CO2. O sobrenadante da cultura foi recolhido e submetido a rotação por 5 min a 300 g para remover células e detritos celulares. O sobrenadante submetido a rotação foi subsequentemente filtrado de modo esterilizado usando um filtro de vácuo de 0,22 um e foi armazenado a 4 oC até ser usado.

EXEMPLO 7 Purificação de proteína RSV F pré-fusão

[00174] Os polipeptídeos recombinantes foram purificados por um protocolo de purificação em duas etapas aplicando uma coluna de troca catiônica para a purificação inicial e subsequentemente uma coluna superdex200 para a etapa de polimento com a finalidade de remover contaminantes residuais. Para a etapa inicial de troca catiônica, o sobrenadante da cultura foi diluído com 2 volumes de NaOAc 50 mM pH 5,0 e foi passado por uma coluna de 5 mL HiTrap Capto S a 5 mL por minuto. Subsequentemente, a coluna foi lavada com 10 volumes de coluna (CV) de NaOAc 20 mM, NaCl 50 mM, tween20 0,01 % (v/v), pH 5 e eluiu com 2 CV de NaOAc 20 mM, NaCl 1 M, tween20 0,01 % (v/v), pH 5. O eluato foi concentrado usando um concentrador por rotação e a proteína foi adicionalmente purificada usando uma coluna superdex200 usando Tris 40 mM, NaCl 500 mM, tween20 0,01 % (v/v), pH 7,4 como tampão de separação. Na Figura 3A é apresentado o cromatograma da coluna de filtração em gel e o pico dominante contém a proteína RSV F pré-fusão. As frações contendo este pico foram novamente reunidas e a concentração da proteína foi determinada usando OD280 e foi armazenada a 4 oC até ser usada. Na Figura 3B é apresentada uma análise de SDS-PAGE reduzida da preparação de proteína final e, como pode ser observado, a pureza foi >95 %. A identidade da banda foi verificada usando Western blotting e anticorpos específicos para a proteína F (não mostrado). Em seguida, a proteína purificada foi testada em NativePAGE e comparada com uma proteína F pré-fusão trimérica estável de referência (SEQID NO: 21) (Fig 3C).

EXEMPLO 8 Ensaio de estabilidade de ponto final

[00175] A verificação da conformação pré-fusão dos polipeptídeos expressos de acordo com a invenção foi efetuada usando a tecnologia octet usando os anticorpos específicos para a pré-fusão CR9501 ou CR9502, ou o anticorpo não específico para a conformação CR9503, que compreende as regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo disponível no mercado Motavizumab. Os anticorpos foram biotinilados por protocolos comuns e foram imobilizados em biossensores de estreptavidina (ForteBio, Portsmouth, RU). O procedimento foi o seguinte. Após equilibração dos sensores em tampão cinético (ForteBio) por 60 s, os chips foram transferidos para PBS com 5 ug/mL do anticorpo desejado. A carga foi efetuada por 250 s. Subsequentemente foi incluída outra etapa de equilibração por 200 s em tampão cinético. Por fim, os chips foram transferidos para o sobrenadante de cultura de expressão contendo os polipeptídeos RSV F pré-fusão e o sinal de ligação total após 1200 s foi registrado. Esta fase também é denominada fase de associação. Isto foi efetuado imediatamente após a recolha (dia 1) bem como 5 dias mais tarde (dia 5) e a diferença na ligação de CR9501 foi usada como ferramenta de rastreio para identificar mutações capazes de estabilizar a conformação pré-fusão. Uma construção foi considerada estável se tiver sido observada menos do que 20 % de perda de ligação no dia 5 foi considerada estável, e se não, foi considerada instável. Construções estáveis podem então ser submetidas a um teste de estabilidade mais restrito, se necessário. A análise dos dados foi efetuada usando o "software" ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio).

EXEMPLO 9 Ensaio de estabilidade térmica

[00176] O potencial estabilizador de características introduzidas nos polipeptídeos RSV F foi estimado por estresse térmico. Para esse propósito, sobrenadante de cultura de células transfectadas de modo transitório ou proteína purificada foi aquecido usando um intervalo de temperaturas. As amostras foram subsequentemente esfriadas em gelo, para prevenir alterações conformacionais adicionais termicamente induzidas, e foram sondadas usando o anticorpo CR9501 na plataforma de tecnologia Octet como descrito no Exemplo 11. As respostas obtidas no final da fase de associação às diferentes temperaturas foram representadas graficamente em função da temperatura e foram ajustadas por regressão não linear usando o "software" Prism. Tal originou uma estimativa da temperatura à qual o nível de ligação do anticorpo é 50 % do máximo e este valor pode ser usado para comparar diferentes construções em termos da estabilidade térmica pré-fusão.

EXEMPLO 10 Ensaio de estabilidade da fase de associação

[00177] Para avaliar a estabilidade de várias mutações pontuais foi desenvolvido o ensaio de ligação octet, usando análise da fase de associação. Foi usado o anticorpo CR9501 ou anticorpo CR9502 como sondas para a conformação pré-fusão da proteína RSV-F. Para reduzir distorções potenciais da concentração do ensaio de ponto final, foram usados os dados de toda a fase de associação do experimento. Os dados foram compensados quanto à quantidade de anticorpo ligado no chip. As medições foram efetuadas nos dias 1, 5 e 33, e as formas das curvas dos três dias foram comparadas. Quando foram obtidas curvas idênticas, a construção foi considerada estável; quando não foi esse o caso, instável.

EXEMPLO 11 Octet Quantitativo

[00178] Para medir a concentração da proteína RSV F pré-fusão em sobrenadantes de cultura de células, foi usado um método à base de Octet quantitativo. Os anticorpos CR9501 e CR9503 foram biotinilados por protocolos comuns e foram imobilizados em biossensores de Estreptavidina (ForteBio, Portsmouth, RU). Em seguida, os biossensores revestidos foram bloqueados em sobrenadante de pseudocultura de células. O experimento quantitativo foi realizado do modo seguinte: temperatura 30 C, velocidade de agitação 1000 rpm, tempo do ensaio 300 seg. A concentração da proteína no sobrenadante de cultura de células foi calculada usando uma curva padrão. A curva padrão foi preparada para cada anticorpo revestido usando a proteína A2_F24_N67I+S215P (SEQ ID# 21), diluída em sobrenadante de pseudocultura de células. A medição foi feita no dia da recolha do sobrenadante (dia 1) e após armazenamento do sobrenadante a 4 C por 5 dias ou mais. A diferença na concentração determinada com o CR9501 ou CR9502 foi usada como ferramenta de rastreio para identificar mutações capazes de estabilizar a conformação pré-fusão. Uma construção foi considerada estável se menos do que 20 % de decréscimo da concentração medida foi observado no dia 5. A análise de dados foi efetuada usando o "software" ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio).

EXEMPLO 12 Avaliação pré-clínica da imunogenicidade de F pré-fusão

[00179] Para avaliar a imunogenicidade de uma RSV F pré-fusão estabilizada (A2F24,N67I, S215P) (SEQ ID NO: 21) imunizámos camundongos de acordo com Tabela 19 com 0,5 ou 5 ug em um regime primário - reforço na semana 0 e semana 4. Como mostrado na Figura 4, camundongos imunizados com F pré-fusão exibiram títulos mais elevados de VNA do que camundongos imunizados com RSV F pós-fusão. Tabela 19. Esquema de imunização

[00180] Em seguida, ratos do algodão foram imunizados com duas doses diferentes de RSV-F na conformação pós-fusão ou pré-fusão (Tabela 20). Os animais foram imunizados i.m. na semana 0 e semana 4. A Figura 5 demonstra títulos elevados de anticorpos neutralizadores no dia da provocação (semana 7). Tabela 20. Grupos, imunogênio e dose para avaliação da imunogenicidade e eficácia em ratos do algodão

[00181] Cinco dias após a provocação, foi medida a carga viral no pulmão e nariz (ver Figura 6).

[00182] Como mostrado, os polipeptídeos F pré-fusão de acordo com a invenção são capazes de induzir uma resposta imune protetora forte que reduziu a carga viral no pulmão e mesmo no nariz. Tabela 17. Aminoácidos padrão, abreviaturas e propriedades

Tabela 18. Sequências de aminoácidos dos anticorpos CR9501 e CR9502

[00183] A sequência de aminoácidos de várias das construções RSV F pré-fusão é apresentada embaixo. De notar que a numeração de aminoácidos nas diferentes construções descritas aqui é baseada na sequência de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1), o que significa que todos os aminoácidos desde a posição 1 até e incluindo a posição 108 das construções pré-fusão correspondem às posições de aminoácidos 1-108 da sequência de tipo selvagem, ao passo que a numeração dos aminoácidos desde a posição 138 até ao final é deslocada em 22 aminoácidos, isto é, L138 na sequência de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) corresponde a L116 em todas as construções pré-fusão. Tal se deve ao fato de ter sido efetuada uma deleção nas construções pré-fusão, isto é, a inserção do ligador GSGSG a numeração real em F1 não é a mesma entre construções. Assim, a numeração usada relativamente às mutações específicas de acordo com a invenção, por exemplo, S215P, refere-se à posição do aminoácido na sequência do tipo selvagem. Sequências Proteína RSV F A2 sequência completa (SEQ ID NO: 1) MELLILKANAΠTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVJTIELS NKKNKCNGTDAKKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLN NAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKJKSALLSTNKAW SLSNGVSVLTSKVLDLKNYJDKQLLPIVNKQSCS1SMETV1LFQQKNNRLLEITREFSVNA GVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPTTNDQKKLMSNNVQrVRQQSYSlMSlIKEEVLAYW QLPLYGVIDTPCWKLErrSPLCTrNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKV QSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDlFNPRYDCKIMTSKTDVSSSVrrSLGAlVSCYGKT KCTASMGMRGIIKI FSNGCDYVSNKGVDTVSVGN ] LYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYD PLVFPSDEFD/YSISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTMMΠTIIIVIIVILLSLIAV GLLLYCKARS J PVTLSKDQI .SGTNN1AFSN Proteína RSV F B1 sequência completa (SEQ ID NO: 2) MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSV1T1ELS N1KETKCNGTDTK VKLIKQ ELDKYKNAVTELQLL MQNTP AANNRARRE APQ YMN YTIN TIKNLNVSTSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNK1KNALLSTNKAWS L S N G V S V L TSKV L DLKN YIN N Q L L Pl VNQ QSC f US KI E T V IEFQQKNS R L L FIN REFS V N AG VTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQL PIYGV1DTPCWKT liTSPLCTENlKEGSMCI-TRTDRGWYCDNAGSVSrFPQADTCKVQSN RVFCDTMNSLTLPS E VS LCNTDIFNSK YDC KIMTSKTD IS SSVTI S LG AIVSC YGK'I KCTA SNKNRGIIKΠ’FSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPΠNYYDPLVF PS D E F D ASISQ VN EK INQ S L AFIRR S D ELL ] IN VNTG KSTT N1M ITT 111V11V V L LSLIAIGLI I YCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK SEQ ID NO: 3 EKKI t-: Al FKK1F AIEKKIEA SEQ ID NO: 4 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVI I STF1 SEQ ID NO: 5 GSGSG F8: RSV A2, ectodomínio ts (SEQ ID NO: 13) MELLILKANAITIILTAVTFCFASGQNIJ EEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVπJELS NlKKNKCNGTDAKlKLlKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRÊLPRFMNYTLN N AKK'l N V IL S KK RK RRH L í i 1 L LO VGS AI ASG V A VSK V L11 Lb GE VN KIKS A L LSTN K A V V Si .SNGVS V] ,TS K VLDLKNYIDKQLL .PFVNKQSCSlSNTETVJEFQQKNNRE .1 ETTREFSVNA GVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYW QLPLYGVIDTPCWKLHTSPLÍ ITTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKV QSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCN VDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSS VITSLG AIVSCYGK.T KCTASNKNRGΠKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYD PLVFPSDEFDASJSQVNEKINQSLAFIRKSDELl.nl Uli IIIHIIH F11: RSV B1, ectodomínio ts (SEQ ID NO: 14) MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELS NKETKCNGTDTKVKLIKQ ELD KYKN A VTELQLLMQNTP A ANNRARREAPQ YMNYTIN ITKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWS LSNGVS v LTSKV LDLKN Y [ N \ QLL Í’I VNQ QSC fUSN [ b J V ÍEFQQKNS RLL EIN REFS V N AG VTTPLSTYMLTNSELLSIJNDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSΠKEEVLAYVVQL PI ¥ GVIDTPCWK LHTS PLCTTN1KEGSN1CI .TR T DRGWYC DNAG SVSF FPQADTCKVQSN RVFCDTMNSLTLPS EVS LCNTD J FN SK.Y DC KIMTSKTD IS SS VIIS LGAIVSCYGKT KCTA SNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVF PSDEFDASISQVNEKINQSI .AHRRSDELLf IHHHHHHH F47: RSV A2, estabilizada por ligador, IZ(S) (SEQ ID NO: 15) MELLILKANAΠTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVTΠELS NIKKNKTXGTDAKIKIJKQ1J JJKYKNAVTEI QLLMQSI l’A INNQARGSGSGRSLGFLLÜ VGS AIASGVAVSKVLH LEOE VNKIKSALLSTNKAVVSLSNG VS 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IZ(S) (SEQ ID NO: 17) MELLTHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNTTEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELS N IKE'FKC NGTDTK VKL1KQELDKY KNAVTELQLL MQ N IT A AN NQARG S GSGRS LGFLL GVGSAIASGIAVSKVLI ll.l-GEVNK.IKNAJ LS1 NKAVVSLSNGVSVLTSKVL1JLKN YlNX QLLP1VNQQSCJUSN1ETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSL1ND MPimDQKKLMSSN VQIVRQQSYSIMSΠKEEV L A Y WQL PIYGYIDTPCWKLHTSPLCTT NIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDIMNSLTLPSEVSLCN TDIFNSKYDC K1MTSKTD1SSSVITSLG Al VS C YG KTKCTASNKX RGU KTFSNGCDY VSN KGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPΠNYYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEK KIEAIEKKIEAGGIEGKHHHHHH F24: RSV B1, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 18) MEI.I.IIIRLSAIELTI.AINAI.YLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGVFSAI-RTGWYTSVITIELS NlKFTKCNGTDTKVKLJKQF.t DKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLL GVGSA1ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINN QU PIVNQQSCRISMETVIEFQQKNSRLI .EIXREFSVNAÜVTTPI .STYMI TNSFf f SI IND MPπWQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMS]IKEEVLAYVVQLP[YGVIDTPCWKLHTSPLCrT NIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCN TDTFN SKYDCKIMTSKTDISSS VrrSLGAl VSCYGKTKCTASN KNRGT1KTFSNGCDYVSN KGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPΠNYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRRSDELLSA1GGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGJEGRHHHEIHH A2_F24: RSV A2, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 19) ML-LI .ILKANAITTHJAVTIT 'FASGQNITEEFYQSTÍSAVSKGYl SALRTGWYTSVITIELS N1KKN KCN GTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQL LMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCS1SNIETV1EFQQKNNRLLETTREFSVNAGVTTPVSTYML1NSEI1SL1NDM PITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTT NIKI iG S N1C1 TRTDRG WYC DN AGS V S FFPQAEI ’Cl K VQS NRVFCDTMN SITE PSEVN IA h VD1FNPKYDCK1MTSKTDVSSSVITSLGA1VSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSN KGVDT VS VGNTL Y YVNKQEGKS LYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FTRKSDELLSAIGGYIPEA PRDGQAY VRKDG EWVLLST FLGG1EGR F24-: RSV B1, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 20) ME LLIE TRLS AIFLTI -AINA I. YI T SSQNITEE F YQSTC SA VS RGYFSAIJVTG W YT S VITIE LS N1KETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKN AVTELQLLMQN’ IP AANN QARGSGSGRSLGFLL GVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKJKNALLSTMKAWSl SNGVSVLTSKVLDI.KNY1NX QLLPlVNQQSCMSN]ETVIEFQQKNSf<LLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSEL[.SL]ND MPITNDQKKLMSSNVQIVKQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLP[YGVIDTPCWKLHTSPLCTT NKEGSNKLTRTDRG W YC DNAGSVSFFPQ ADTCKVQSNRVFC LHMNSLTLP S EVSLCN TDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKXRGIIKTFSNGCDYVSN KCiVDl•VSVGNTLYYVNKI.FXiKNLYVKGkPDNYYDPLVI PSDEI DASISQVNEKINQS1.A FIRRSDELLS AIGGYIPEAPRDGQAYVRKDG E W VLLSTFLGG1EGR A2_F24 N67I+S215P: A2, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 21) MEL r JLKAN AITTILT AVTFCF ASGQN1T EEF YQSTCS AVSK G YLS AL RTG W YTS VIT1 ELS NKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSffNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSl YMLTNSELLSLtNDM PITNDQKKLMSNN VQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPC WKLHTS PLCTT NTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE^LCN VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTESNGCDYVSN KGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGBPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA F1RKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGG1EGR F24-N67I+S215P: RSV B1, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 22) MFLLIHRLSAD LTLAINAI YI rSSQMnEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVH ]ELS NIKE IKC l\ GTDTK VKL1KQ E L DK YKN A VTELQLL M QN 111A A N NQ A KG SGS G RSL G FL L G VGSAIASGIAVSKVLHI EGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQL LPIVNQQSCRIPMETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPI TNDQKKLMSSNVQIVRQQS YSIMSHKEEVL AYWQLPIYG VIDTPC W KLHTSPLCTTN1K EGSN1CI .TRTDRGWYCDNAGS VS FFPQ ADTCK VQSN R VFCDTMNSLTI .PS EVS [ ..CNTD1 ENSKYDCKIMTSKTDISSSVΠ SLGAJVSC YGKTKCTASNKK RG] [ KTFSNGCDYVSNKGV DTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPI1NYYDPLVFPSDEFDAS1SQVNEK1NQSLAFIRR SDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKIXJEWVLLSTFI GGIEGR A2_F24 N67I+E92D: RSV A2, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 23) MELLILKANAΠTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVJTIELS N1KKJKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATONQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLH LEGE VNKIKSALLSTN K AWSLS NGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEΠREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDM Pl'l NDQKKLM SNN VQ] V RQQ S Y SI MS 11KIi IÍ V L A Y V VQITI YG V ] [ 31 P(" W KLHTS PLCIT NTKEGSNICLTRTDRGW Y C DNAGSVSFFPQAETCKVQSN RVFCDTMNSLTLPSEVNI C N VOIFNPKYDCKIM rSKTDVSSSVlTSLGAJVSCYGKTKCTASNKNRGlIKlFSNGCDYVSN KGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPΠNFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA HRKSDELLS AJ GGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR F24- N67I+E92D RSV B1, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 24) ME LLIEUILS AIFLTLA1NAL YLTSSQNITEEF YQSTCSA VSRG YFSA LRTG W YTS V111 ELS NlKEIKCNGTDTKVKLlKQELDKYKNAVTDLQlLMQNTPAANNQARGSGSGRSr.Gπi- GVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKJKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINN QLLP1VNQQSCKISN1ETVIEFQQKNSRLI EINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSL1ND MPΠWQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTT NIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCN TDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLG AIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCD YVSN KGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPΠNYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FTRRSDELLSAÍGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR A2_F24 N67I+K465Q RSV A2, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 25) MELLILKANArmLTAVTFÍTASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVJTlELS NKKIKCNGTDAKIKLΠCQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKKSAELSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEIIREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDM PUNDQKKLMSNN VQIVRQQSYSIMSIIKEE VLAY WQLPLYG VIDTPC W KLHTS PLCTT NTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEWLCN VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVirSLGAIVSCYGKTKCTASNKMRG[IKTFSNGCDYVSN KGVDT V S VGNTLYYVN KQEGQS LYVKGEP1INFYDPL VFPSDEFDASISQ VN FKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGG1EGR F24- N67I+K465Q RSV B1, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 26) Ml LI IIIRLSAII I.ilAINALYLTSSQN1TEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSV1TIELS NKEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQL I PlVNQQSCRLPNIETVTEFQQKNSRLLErNREFSVNAGVTTPLSTYMLINSELLSI TNDMPI TNDQKKLMSSNVQIVRQQSYS1MSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIK E6SNICLTRTDRG W YCDNAGS VSFFPQADTCK VQSN RVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDI FXSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGV DIVSVGNTLYYVNKLEGQNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSEAFIRR SDELL SAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVL1.S 11 LGG1EGR A2_F24 N67I+S46G RSV A2, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 27) MELLILKANArrriLTAVTFCFASGQNlTEEFYQSTCSAVSKGYLÜALRTGWYTSVTriELS NKKKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLHLEGEVMKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ L LPIVNKQSCSISN1ET V1EFQQKNNRL L EI f REFS VN AG VI FP VS IY MLTNSELLS LIN DM PITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSΠKEEVLAYWQLPLYGVIDTTCWKLHTSPLCΠT NTKEGSNKLJRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLJLPSEVNLCN VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSS VrrSLG AIV SCYGKTKCTASNKNRG 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IAVTFCl ’ASGQNHLEI YQS TCSAVSKGYLGALRTGWYTSVTTIELS NKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTEIJQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLIXJ VGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ I LPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLI-EITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSEI.Í.SLINDM PITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTT NTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCN VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSS VITSLGAIVSCYGKTKCTASN KN RGIIRTFS NGCDYVSN KGVDT vs VGNTLY YVNKQEGKSLYVKGEPΠNFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLS A (GGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGI liGR A2_F24: RSV K465Q A2, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 50) MELLILKANArTTILTAVTFCFASGQNlTEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVlTlELS NKKN K CNG TD AKJKLIKQELDKYKN AVTELQLLMQSTPATNN Q ARG SGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSISN1ET VIEFQQKNNRLLEITRBFS VN AGVTTPVSTYMLTNSELLS LIN DM P1TNDQKKLMSNNVQIVRQQSYS1MSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTT NTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCN V □ IF NPK Y DCKIM J’S KTD V S S S VITS LG AIVSC YGKTKCTASN KN RG11KTFSN G( D Y VSN KGVDT VSVGKILYYVNKQEGQJJI. 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V FPS DEI •’ D A SIS Q VN F KINQSIA ΠRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGG IEGR A2_F24: RSV N67I A2, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 51) MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQN1TEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVIT1ELS NIKKJKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPA'INNQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLH LEGEVNKKSALLSTN KAWSLS N G VS VLTSK V L DLKN YIDKQ LLPIVNKQSCSISNIEI VIEFQQKNNRLLEI IIIEFSVNAGVTTPVS I YMLTNSELLSLINDM PITNDQKKLMSNN VQIVRQQS Y SIMSIIKEE VL A YWQLFL YG VIDTPCWKLHTS PLCTT NTKEG SNICITRTDR GWYC DN AGS VS FFPQ A ETCKVQSN R V FC DTMNS L T LPSEVNI C N VD1FNPKYDCK1MTSKTDVSSSVITSLGA1VSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSN KG VDTVSVGNTLYYVNKQ EGKS LYVKG EPI IN F YD PL VFPSDEFD ASTS Q VN E KINQS LA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR A2_F24: RSV E92D A2, estabilizada por ligador, fibritina (SEQ ID NO: 52) MELI JLKAN A1TT1 LT AVTFCFASGQN1T E EF YQSTC SA VS KG YLS ALRTGWYTS VIT1 ELS X IK KX KC X G I DA KJ K LJ KQ ELD K Y KNAVTDLQLLMQS’ 111 ATX NQ A RGSG S GRS LG FLLG VGSAIASGVAVSKVLHIEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVIDLKNWKQ LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDM PΠWQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSΠKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTT NTKEGSNICLTRTDRGWYCDN AGSVSFFPQ AETCKVQSN R VFCDTMNS LTLPSEVNLCN VTflFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSN KGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPDNFYDPLVFPSDEFDASISQVNEK1NIQSLA FIRKS DELLS AJ GG Y11 lE APR.DGQ A Y VRKDG E W VLLSTFL GGI EG R proteína RSV F CL57-v224 sequência completa (SEQ ID NO: 69) MELPILKTNArπiLAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVπiELS NIKENKC X GI DAKVKUKQELD KYKNAV IELQLLMQSTPA A NX KA RJCELPRFMNYI L X NTKNNNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASG1AVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAW SLSNiiVSVI.TSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSGSlSMETVIEFQQKMNRLLI’IITRI’IE-’SVNA GVTTPVSTYMI I X SEI .LSLINhMJ’ITN DQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMS [ IKEEVLAYW QLPLYG VIDTPCWKL H Í SPI C í Í X IK EG SNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFI PQAETCKV QSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNFKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTK CTASNKNRGI1KTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEF1INFYDP LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNVGKSTTNIMITΠIIVIIVILLLLIAV GLFLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN Ectodomínio, RSV CL57-v224 (SEQ ID NO: 70) MEL PILKTX AmiLA A VTLCF ASSQNITEE FYQSTCS A VS KG YJ-S ALRTG WYTS VITIE1 S MKENKCNGTDAKVKL1KQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLX XTKNNNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVV SLSNGVSVLI’SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVJIJ QQKNNRLJ.EI IRLLSVNA GVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMS] IKE E VLAYW QLPL Y G VI DTPC W KL HTSPLCπ’M K EG S XI CL I’RT DRG W Y GI )N AGS V S FFP Q AETC K V QSNRVrt’DTMNSI,T1 .PSF.VNT CNIDIFNPK YDCKTMTSKTDVSSSVTTSLGAIVSCYGKTK CTASNKNRGI1KTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEP1INFYDP LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL PreF, RSV A2, fibritina (SEQ ID NO: 71) MELLILEÍANAnTlLTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVlTlEI .8 NKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLN NAKKTNTVTESKKRKRRFLGFl I .GVGSA1ASGVAVSK VIJIIJ■GEVNKIKSAI ISTNKAW SLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPrVNKQSCSlSNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNA GVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYW QLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAErCK.V QSNRVFCDTMNSLTL PSE VNLCN VDIF N P K YDCKIMTSKTD VSSS VITS LG AIVSCYG KT KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPllNFYD PLVFPSDEFDASISQYNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLL STFL PreF N67I S215P, RSV A2, fibritina (SEQ ID NO: 72) MELLILKANArniLTAVTFCFASGQNlTEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVJTlELS NlKKlKC N G1DAKIKLIKQELDKYKNAV FE LQLL MQSI PAT N NRA:RRE LPRFMNYTLNN AKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSA1ASGVAVSKVLHLEGEVNK1KSALLSTNKAVVS [.SNÍiVSVI. I SKVI.DLKNYIDKQI.l.PIVNKQSCSIPNIL J VIFI QQKNNRLLFII REFSVNAG VTTP V ST YM LT N SELLSLINDMPITN DQ K KLMSNN VQ1VRQQS Y SIMS1IK E E VI. A Y V VQ LPL YGVU) TPC WKLl 11SPI .CTTNTK EGSMCI .TRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQ SNRVFCDTMNSI JLPSEVNl .CNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSl ,GAJVSCYGKTK CTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPUNFYDP LVFPSDEFD ASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIG G YIPEAERDGQ AYVRKDGEWVLLS TFL PreF N67I S215P, RSV B1, fibritina (SEQ ID NO: 73) MFI l.lITRLSAIFLTr AINAI.YI TSSQNITFEFYQSTCSAVSRGYFSAI.RTGWYTSVITTELS NIKEIKCNGTDTK VKLIKQELDKYKN A VTELQLLMQN TI^ANN RARREAPQY MN YTI \ TTKNI NVSISKKRKRRFLGFÍ FGVGSAIASGIAVSKVLHI.EGEVNK1KKA1.I .STNKAWS LSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLP1VNQQSCRIPMETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAG VTTPLSTYMLTKSELLSUNDMPITNDQKKLMSSNVQ1VRQQSYSIMSI1KEEVLAYWQL PIYGV1DTTCWKLHTSPLCTTN1KEGSN1CLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSN RVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMrSKTDISSSVrrSLGAIVSCYGKTKCTA SNKNRGHKTFS NGCDYVSN KGVDTVSVGN TLYYVKKLEGKNLYVKGLPIINYYDPLVF PSDEFDASISQVNEKINQSLAHRRSDELLS AJGGYIPEA PRDGQAYVRKDGE WVLL STFL RSV N67I S215P, RSV CL57-v224, fibritina (SEQ ID NO: 74) ME LPILKTNAΠTILA AVTLCFASSQNITEEFYQSTCS AVSKGYLS ALRTG WYTS VIT1E LS N1KETKCNGTDAKVKLTKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLN NTKN NNXT'LSKKBKRRFLGFLLGVG S AIASGIAVSKVLH LEGE VNKIKS ALLSTOKAW SLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCS1KN1ETVIEFQQKNNRLLE1TREFSVNA Ü VTT P VST YMt TN S E r LSLINDM PI TN DQKKLMSNN VQT V R Q(?S YSIM SI 1K F E VLAY V V QLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKV QSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNJDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTK CTASNKNRGπKTFSNGCDYVSNKGWrVSVGNTL Y Y VNKQEGKS LYVKGEPIINFYDP LVFPSDEFDASISQVNEKJNQSLAHRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKBGEWVLLS TFL PreFL N67I S215P, RSV B1, fibritina, Alça (SEQ ID NO: 22) ME LL11 TRLS AIF LT I. A1N AI. YI T SSQN1TEE F YQSTC SA VS R G YES AI. RTGWYTSV IT I ELS NIKEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFIIJG VGSAIASGIAVSKVI .HI FGF.VNKTKNAl I STNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYTNNQL LP1VNQQSCRIPNIETV1EFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPI TNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSÍMSIIKEEVLAYVVQI PIYGV1DTPCWKLHTSPI CTTN1K EGSMCLTRTERGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRYFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDI FNSK.YDCKIMTSKTDISSSV1TSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGV DTVS VGNTL Y Y VN KLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFD AS1SQVN EKTNQS LAFIRR SDπ LS A IGGY IPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL PreFL N67I S215P, RSV CL57-v224, fibritina, Alça (SEQ ID NO: 75) MELPILKTNAΠTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELS NKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNQARGSGSGRSLGFLLG VGS AIA SGI A VS K V L HLEGE VNKJ KS A LLS r NKA WS LS NG V S V LTSK V LDLKN Y L DKQL LP1VNKQSCS IPNHETVl EFQQKNN RLLE1TREFS VNAGVTTP VSTYMLTNSELLS LI N DMPI TNDQKKLMSNNVQlVRQQSYSlMSIIKhEVLAYWQl.1’1 YGVIIHI’CWKLI I I SPLCT IN I K EG SNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFI ’Q AEICKVQSNRV FCDT MNSL I L PS E VN LCNIDI FNPKYDCKIMTSKTDVSSSVπSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKG VDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPHNFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELI .S A1GG Y1P E APRDGQ AYVR K DGE W VLLSTFL PreF N67I S215P E487Q, RSV A2, fibritina (SEQ ID NO: 76) MELLILKANArrriLTAVTFCFASGQNlTEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVlTIELS N1KKIKCNGTOAKIKLKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNN AKKTNVTLSKKRKKRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWS Í SNGVSVLTSKVLDLKNY1DKQ1 LPIYNKQSCSIPNIETVIEFQQKKNRLLEITREFSVNAG VTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPrrNDQKKLMSNNVQlVRQQSYSlMSlIKEEVLAYWQ LPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKBGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQ SN RVFCDTMNS LTLPSEVN LG N VDIFNPKYDCKJMTSKTDVSSSV1TSLG AIVSC YGKT K CTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGXILYYVNKQEGKSLYVKGEPUNFYDP LVFPSDQFDASISQVNEKJNQSI AFIliKSDELLS Δ1GGYIP1ÍAPRDüQAYVRKDGEWVU S TFL PreF N67I S215P K201N, RSV A2, fibritina (SEQ ID NO: 77) MEir ILKANAΠTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVJTIELS NKKKCNGTDAKIKLKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNN AKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSA1ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWS LSNGVSVLTSKVLDLKNYIDNQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAG VTTPVSTYMI TNSELLSLINDM PITX DQKKLMSNN VQIVRQQ SY SIM SDK E EV I AY WQ LPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRIDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQ SNRVFCDTMKSI TÍ.P&EVM .CNVD1FNPKYDCKIMTSKTDVSSSV1TSLGA1VSCYGKTK CTASNKNRGI1KTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPHNFYDP LVFPSDEFDASISQVWBKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS TFL PreF N67I S215P E92D, RSV A2, fibritina (SEQ ID NO:78) ME L LI LKANAITTIL FAVTEC F ASGQN1TEEFYQSTCS AVSKG Y LS ALRTG WYTSVJTl ELS NIKKIKCNGTDAKIKI 1KQJ LDKYKNAVTDLQLI MQS i’PA I SNRARRELPRFMNYTI XN AKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWS LSNG VSVLTSKVL DLKNY1DKQLLPIVNKQSCSIPNIETV] EFQ QKNNRLL EFTREFSVNAG VTTPVSTYMLTNSEL LSLINDMP1TNDQKKLMSNNVQIVRQQSYS1M SI1KEFVLAYWQ LPLYGVIDTPCWKLHISPLCI IM KEGSMCLTR1 DRGWYGDNAGSVSFFFQAE I'CKVQ SNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV1TSLGA1VSCYGKTK CTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEP1INFYDP LVFP SI )E FDASISQVNBKINQS L AFIRKSI JELLS AIG G YIPE APRDGQ AY VRKDGE W VL L S TFL PreF N67I S215P D486N, RSV A2, fibritina (SEQ ID NO: 79) MELLILKANAITTJLTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELS NKKKCNGTDAKKLKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNN AKKTNV FLSKKRKRRF’LGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWS [ SNGVSVLTSKVT DLKNY1DKQ[.I.PIVNKQSCSIPNIET\ ÍFFQQKNNRLLTITREFSVNAG VTTPVSTYMLTNSELLSLlNDMPrTNDQKKLMSNNVQlVRQQSYSlMSllKEEVLAYWQ I PLYGVIDTPCWKLHTSPIGTTNTKEGSNICITRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQ SNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCEIMTSKTDVSSSV1TSLGAIVSCYGKTK CTASNKNRGHKTFSNGC DYVSNKGVDWSVGNTT YYVNKQrGKSLYVKGEPlINFYDP LVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAHRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKIXJEWVLLS TFL Fwt N67I S215P, RSV F ligado a membrana, A2, (SEQ ID NO: 80) MELL ILKAN AIT T J LTA V I F C1 ASGQN [ IT L LF Y QSTCS A VS KG Y LS A LRTG W Y J S V111ELS NKKIKCNGTDAKKLKQFLDKYKNAVTELQLIMQSTPATNNRARREI PRFMNYTLNN AKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSWKAWS LSNGVSVLTSKVLDIKNY1DKQLLPIVNKQSCSIPN1ETV1EFQQKNNRLLE1TREFSVNAG VTTPVST YM LIN SELLSLINDMPITN DQ K K L MSNN VQIVRQQS Y SIM SIIK E E V L A Y WÇ LPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQ SNRVFCDTMNSL rLPSEVKLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVl rSLGAIVSCYGKTK C ] AS NKNRG) IK'I FS NGC’DYVSNKGVDTVSVGM LYYVNKQEGKSLYVKGEP1INFYDP LVFPSDEFD AS1SQ VNEKINQS ] AF1RKSDEI .LHNVN AVKSTTNlMimilVIIVILLSLIAVG LLLYCKARSTPVTLSKDQLSG1NN1AFSN Fsl N67I S215P, RSV F ligado a membrana, A2, (SEQ ID NO: 81) MELLILKANAI I I IL IAVTFCFASGQXI ] EEFYQS1 CSAVSKGYLSALRTGWY'J SV] I ILLS NIKK1KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLG VGS AIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKS ALLSTNK AWSLSNG VS VLTSKVLDLKNYIDKQ L L Pl VNKQSCS1PN1ET V1LFQQKNNRL L EITREFS VN AG VI TP V ST Y ML' I N SE LL S L IN DM P1TNDQKKI MSNNVQ1VRQQSYSIMSI1KEI VLAYVVQI PI.YGVIDTPCWKLL11SPLCTT NTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAEICKVQSN RVFCDTMNSI T LPSEVN LCN 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A L RTG W Y'J’S VI11 ELS N1KK1KCNGTDAKIK] IKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLP1VNKQSCS1PN1 ETXαEFQQKNNRLLEITREFS VN AGVTTFVSTYMLTNSELL S LIN DM PTTNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQL PLYGV1DTPCWKLHTSPLCTT NTKEGS NIC LI 'RTDRG W YC D N AGS VS FFPQ A EICK VQS NRVFC DTMNS LTLPSE VN LC N VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSN KG VDT VS VGNTLY Y VNKQEGKS I. Y VKGEPIIN F Y DPLVF PS D E F D A SI S Q VN EKIN QS LA EIRKSDELLHNVNAVKS I IMMI] ] IHVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGIN NIAFSN Fwt N67I S215P E487Q, RSV F ligado a membrana, A2, (SEQ ID NO: 84) M E L LI LKAN AITIJ LIAVTF€ F ASGQN1TEEF YQSTCS AVS KG Y LS ALRTG W YTS VI11 ELS NIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNN AKKTNVTLiiKKRKRRFLGFLLGVGSAlASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWS [ SNGVSVLTSKVLDLKNY1DKQI I PI VNKQSCS IPN1 FT Vi FFQQKNNRI ITITREFSVNAG VTTPVSTYMLTNSEI LSL1NDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYS1MS1IKEÊVLAYVVQ IPLYGVIDTPCWKLHTSPI .CTTNTKEGSNICITRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQ SNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCEIMTSKTDVSSSV1TSLGAIVSCYGKTK CTASNKNRJ3ÍIIKTFSNG CDYVSNKGVDT VSVGNTL YYVNKQEGKSLYVKGEPUNFYDP LVFPSDQFDASKQVNEKINQSLAHRKSDELLHNWAVKSITNIMlTTIllVllVILLSLIAV GLLLYCKARSTPVTLSKIX?LSGINNIAFSN Fsl N67I S215P E487Q, RSV F ligado a membrana, A2, (SEQ ID NO: 85) M E LLILKÀNAITTILTAVTFCF ASGQN1TEEF YQS'I CS A VSKG YLSALR.TG W YTSV11ÍELS NKKKCNGTOAKIKLKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKJKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LLPIVNKQSCSIPN1ETVIEFQQKNNRLLE1TREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDM PICNDQ K K LMSNN VQ1VRQQ SY SIMS I1K EE VL A Y WQLPL YGVIDTPCWKLHTS PLCTT NTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCRVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCN VDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVlTSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIlKTf'SNGCDYVSN KGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKS LYVKGEPI1NFYDPLVFPSDQFDASISQVN EKINQSL A f IKKSDEI.LHNVNAVKSTTNIMI’1 ’TIÍIVIIVII I SI lAVGl.t LYCKARSTPVTI3KDQLSGIN N1AFSN Fwt N67I S215P D486N, RSV F ligado a membrana, A2, (SEQ ID NO: 86) MELLlLKANArrriLTAVTFCFASGQNJrEEFYQSlCSAVSKGYLSALItTGWYTSVπiELS NIKKIKCNGTDAK1KLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATWNRARRELPRFMNYTLNN AKKTNVTI. SKKRKRRFLGFLLG VGSAIASGVAVSK VLH LEG EVNKIKSALLSTNKAWS LSKGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIE TVIEFQQKNNRLLEΠ R.EFSVNAG VTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPrrNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSlIKEEVLAYWQ LPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRG WYCDNAGS VSFFPQAETCK VQ SNRVFCDTMbSLTLPSEVNLC^VDlFNPKYDCKlMTSKTDVSSSVlTSLGAlVSCYGKTK CTASNKNRGI1KTFS NGC DYVSNKGVDTVSVG NILYYVNKQEGKSLYVKGEP1INFYDP LVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMrrπilVIIVILLSLIAVG [ J. ]. Y (’ K A RS I I’ VILS K [ 5QLSGI NN 1AFSN Fsl N67I S215P D486N, RSV F ligado a membrana, A2, (SEQ ID NO: 87) MELI ILKANAπTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITlELS NIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ LL Pl VNKQSCS1PN1ET V IE F'QQKNNRL I.IJTREI SVNAGVIT P VST Y MLTNSIiLL S L IN DM PITNDQK KLM SNN VQ] VRQQS Y S1MSIIKEE VL A Y V VQ I. 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Claims

1. Polipeptídeo de Fusão (F) do vírus sincicial respiratório (RSV) pré-fusão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um epítopo que é específico da proteína F na conformação pré-fusão, em que o pelo menos um epítopo é reconhecido por um anticorpo monoclonal pré-fusão-específico, compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 54, uma região CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 55, uma região CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 56 e uma região CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 62, uma região CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 63, e uma região CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 64 e/ou um anticorpo monoclonal pré-fusão-específico, compreendendo uma região CDR1 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 58, uma região CDR2 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 59, uma região CDR3 de cadeia pesada da SEQ ID NO: 60 e uma região CDR1 de cadeia leve da SEQ ID NO: 66, uma região CDR2 de cadeia leve da SEQ ID NO: 67, e uma região CDR3 de cadeia leve da SEQ ID NO: 68, em que o polipeptídeo compreende um domínio F1 e um domínio F2, e em que os polipeptídeos compreendem pelo menos uma mutação, em comparação com os domínios F1 e F2 de tipo selvagem, em que a pelo menos uma mutação é selecionada do grupo consistindo em: (a) uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 161 em P, Q ou G (E161P, E161Q) ou E161G); (b) uma mutação do resíduo de aminoácido S na posição 182 em P (S182P); (c) uma mutação do resíduo de aminoácido S, T ou N na posição 173 em P (S173P); e (d) uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 486 em C (D486C) em combinação com uma mutação do resíduo de aminoácido D na posição 489 em C (D489C) ou uma mutação do resíduo de aminoácido E na posição 487 em C (E487C), e em que as posições de aminoácidos são dadas em referência à sequência da proteína F de RSV da cepa A2 (SEQ ID NO: 1).

2. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é trimérico.

3. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo também compreende uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 67 e/ou uma mutação do resíduo de aminoácido na posição 215.

4. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma mutação do resíduo de aminoácido N ou T na posição 67 e/ou uma mutação do resíduo de aminoácido S na posição 215.

5. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma sequência ligadora compreendendo de 1 a 10 aminoácidos, que liga o domínio F1 e o domínio F2.

6. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende um domínio F1 truncado.

7. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende um domínio de trimerização heterólogo ligado ao referido domínio F1 truncado.

8. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o domínio de trimerização heterólogo compreende a sequência de aminoácidos GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4).

9. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o domínio de trimerização é ligado ao resíduo de aminoácido 513 da proteína RSV F.

10. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o domínio F1 e/ou o domínio F2 provêm de uma cepa RSV A.

11. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o domínio F1 e/ou o domínio F2 provêm de uma cepa RSV B.

12. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo da SEQ ID NO: 90 - SEQ ID NO: 94.

13. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo RSV F pré-fusão como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

14. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para uso na indução de uma resposta imune contra a proteína RSV F.

15. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para uso como vacina.

16. Polipeptídeo RSV F pré-fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para uso na profilaxia e/ou tratamento de infecção por RSV.