EA034653B1 - Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv перед слиянием - Google Patents
Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv перед слиянием Download PDFInfo
- Publication number
- EA034653B1 EA034653B1 EA201690031A EA201690031A EA034653B1 EA 034653 B1 EA034653 B1 EA 034653B1 EA 201690031 A EA201690031 A EA 201690031A EA 201690031 A EA201690031 A EA 201690031A EA 034653 B1 EA034653 B1 EA 034653B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rsv
- seq
- amino acid
- domain
- protein
- Prior art date
Links
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 210
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 159
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 95
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 3
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 282
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 185
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 140
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 127
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 81
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims description 79
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 79
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 49
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 claims description 49
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 47
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 20
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 18
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 15
- 239000013638 trimer Substances 0.000 claims description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 abstract description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 101710189104 Fibritin Proteins 0.000 description 88
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 76
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 35
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 32
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 29
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 29
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 102220353319 c.196A>G Human genes 0.000 description 17
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 17
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 17
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 16
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 16
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 12
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 7
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 102400001093 PAK-2p27 Human genes 0.000 description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 5
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 5
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 5
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102220087238 rs541028076 Human genes 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241001120659 Furina Species 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 241000144282 Sigmodon Species 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ILYCWAKSDCYMBB-OPCMSESCSA-N dihydrotachysterol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)=C\C=C1/C[C@@H](O)CC[C@@H]1C ILYCWAKSDCYMBB-OPCMSESCSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 229960001521 motavizumab Drugs 0.000 description 3
- NXFQHRVNIOXGAQ-YCRREMRBSA-N nitrofurantoin Chemical compound O1C([N+](=O)[O-])=CC=C1\C=N\N1C(=O)NC(=O)C1 NXFQHRVNIOXGAQ-YCRREMRBSA-N 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 101100285518 Drosophila melanogaster how gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- -1 as described herein Substances 0.000 description 2
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220370332 c.200C>T Human genes 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 2
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003331 infrared imaging Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 101100491335 Caenorhabditis elegans mat-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100495256 Caenorhabditis elegans mat-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102220499787 Carbonic anhydrase 2_N67H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220499772 Carbonic anhydrase 2_N67L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220499774 Carbonic anhydrase 2_N67Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101710160621 Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000055008 Matrilin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010072582 Matrilin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102220509369 Myeloid differentiation primary response protein MyD88_N67A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124679 RSV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000018569 Respiratory Tract disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- SPUUKOIOZNVGHK-UHFFFAOYSA-N SSSSSSSSSSSSSSS Chemical compound SSSSSSSSSSSSSSS SPUUKOIOZNVGHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K aluminum;potassium;phosphate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 102220346476 c.199A>T Human genes 0.000 description 1
- 102220411695 c.201C>A Human genes 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000012395 formulation development Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 208000030500 lower respiratory tract disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 102220227375 rs200294578 Human genes 0.000 description 1
- 102220101251 rs377614167 Human genes 0.000 description 1
- 102220053377 rs727504500 Human genes 0.000 description 1
- 102220192067 rs886057201 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
- C07K14/135—Respiratory syncytial virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2999/00—Further aspects of viruses or vectors not covered by groups C12N2710/00 - C12N2796/00 or C12N2800/00
- C12N2999/002—Adverse teaching
Abstract
Изобретение относится к стабильным F-полипептидам респираторного синцитиального вируса (RSV) перед слиянием, иммуногенным композициям, содержащим указанные полипептиды, и их применениям для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной RSV.
Description
Изобретение относится к области медицины. Настоящее изобретение относится, в частности, к рекомбинантному F-полипептиду RSV перед слиянием и к его применениям, например, в иммуногенных композициях.
Предпосылки изобретения
Респираторный синцитиальный вирус (RSV) представляет собой оболочечный вирус с несегментированной одноцепочечной РНК с негативной полярностью из семейства Paramyxoviridae, рода Pneumovirus. По оценкам, в мире ежегодно наблюдается 64 миллионов инфекций RSV, которые приводят к 160000 смертей (WHO Acute Respiratory Infections Update September 2009). Наиболее тяжело заболевание протекает, в частности, у недоношенных детей, пожилых индивидуумов и индивидуумов с ослабленным иммунитетом. У детей младше 2 лет RSV является наиболее распространенным возбудителем заболеваний дыхательного тракта, который является причиной примерно 50% госпитализаций вследствие респираторных инфекций, с пиком госпитализации, наблюдающимся в 2-4-месячном возрасте. Сообщалось, что практически все дети к двухлетнему возрасту были инфицированы RSV. Повторные инфекции в течение жизни связаны с малоэффективным врожденным иммунитетом. У пожилых людей уровень тяжести заболевания, вызванного RSV, смертность и заболеваемость занимают второе место, уступая лишь инфекциям, вызванных непандемическим гриппом A.
Для инфицирования клетки-хозяина RSV, подобно другим оболочечным вирусам, таким как вирус гриппа и HIV, требуют слияния вирусной мембраны с мембраной клетки-хозяина. Что касается RSV, консервативный белок слияния (F-белок RSV) подвергает слиянию вирусные мембраны и клеточные мембраны клетки-хозяина. В современных моделях на основе исследований парамиксовирусов F-белок RSV исходно уложен в конформацию перед слиянием. Метастабильная структура была выяснена лишь недавно, в комплексе со стабилизирующим Fab-фрагментом нейтрализующего антитела (McLellan et al., Science 340 (6136) :1113-7, 2013). Во время входа в клетку, конформация перед слиянием претерпевает рефолдинг и конформационные изменения к ее конформации после слияния (McLellan, J. Virol 85(15):7788-96, 2010; Swanson, PNAS 108(23):9619-24, 2011). Таким образом, F-белок RSV представляет собой метастабильный белок, который управляет слиянием мембран путем сочетания необратимого рефолдинга белка с соединением мембран в метастабильную форму при помощи исходного фолдинга (конформация перед слиянием), которая в дальнейшем подвергается дискретным/стадийным конформационным изменениям до более низкоэнергетической конформации (конформации после слияния).
Эти наблюдения указывают на то, что F-белок RSV перед слиянием и после слияния отличается в антигенном отношении (Calder, L. J. et al. Virology 271, 122-131 (2000)).
Вакцина против инфекции RSV в настоящее время не доступна, хотя и очень желательна. Вакциныкандидаты на основе F-белка RSV оказались неэффективными вследствие проблем, связанных, например, со стабильностью, чистотой, воспроизводимостью и эффективностью. Как указывалось выше, кристаллические структуры обнаружили значительное конформационное изменение между состояниями перед слиянием и после слияния. Величина перестройки предполагала, что только часть антител, направленных на конформацию RSV-F после слияния, будет способна к перекрестной реакции с нативной конформацией шиловидного отростка перед слиянием на поверхности вируса. Соответственно, усилия для получения вакцины против RSV сосредотачивались на разработке вакцин, которые содержат формы Fбелка RSV перед слиянием (см., например, WO20101149745, WO2010/1149743, WO2009/1079796, WO2012/158613). Однако данные усилия не дали стабильных F-полипептидов RSV перед слиянием, которые можно было бы использовать в качестве кандидатов для испытания у людей.
Краткое описание настоящего изобретения
Настоящее изобретение представляет стабильные, рекомбинантные полипептиды слияния (F) респираторного синцитиального вируса (RSV) перед слиянием, т.е. F-полипептиды RSV, которые являются стабильными в конформации перед слиянием. F-полипептиды RSV по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка перед слиянием. В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV перед слиянием являются растворимыми. Настоящее изобретение также представляет молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие Fполипептиды RSV перед слиянием согласно настоящему изобретению и векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновых кислот.
Настоящее изобретение относится также к композициям, предпочтительно иммуногенным композициям, содержащим F-полипептид RSV, молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, а также к их применению в индуцировании иммунного ответа против F-белка RSV, в частности, их применению в качестве вакцины. Настоящее изобретение относится также к способам индуцирования у субъекта иммунного ответа против респираторного синцитиального вируса (RSV), включающим введение субъекту эффективного количества F-полипептида RSV перед слиянием, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый F-полипептид RSV и/или вектор, содержащий молекулу упомянутой нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, индуцированный иммунный ответ характеризуется выработкой нейтрализующих антител к RSV и/или защитным иммунитетом против RSV. В конкретных аспектах настоящее изобретение относится к способу индуцирования у субъекта выработки антител к F-белку респираторно
- 1 034653 го синцитиального вируса (RSV), включающему введение субъекту эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей F-полипептид RSV перед слиянием, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый F-полипептид RSV и/или вектор, содержащий молекулу упомянутой нуклеиновой кислоты.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с DM RSV перед слиянием, DM = двойной мутант (N67I+S215P = SEQ ID NO: 21) и DM+CC = двойной мутант + DE486CC = SEQ ID NO: 94).
Фиг. 2 - анализ супернатанта посредством NativePAGE из Линии 2: DM = двойной мутант (N67I + S215P = SEQ ID NO: 21) и Линия 1: DM+CC = двойной мутант + DE486CC = SEQ ID NO: 94).
Фиг. 3: А) Гельфильтрационная хроматограмма Superdex200 элюата PreF N67I E161P S215P, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 91) из ионообменной колонки. В) анализ SDS-PAGE F-белка перед слиянием, содержащего пик от хроматограммы SEC в восстанавливающих условиях. С) Анализ очищенного Fбелка RSV в фазе перед слиянием посредством NativePAGE (SEQ ID NO: 91, Линия 2), по сравнению с очищенным двойным мутантом F RSV в фазе перед слиянием (SEQ ID NO: 21, Линия 1).
Фиг. 4 - титры VNA у мышей на 6 неделе после прайм-буста на 0 и 4 неделе иммуногенами в дозах согласно табл. 14.
Фиг. 5 - титры VNA хлопковых крыс на 7 неделе после прайм-буста на 0 и 4 неделе иммуногенами и дозами согласно табл. 15.
Фиг. 6 - вирусная нагрузка в легких и носу на 5 день после i.n. контрольного заражения с использованием RSV.
Подробное описание изобретения
Белок слияния (F) респираторного синцитиального вируса (RSV) участвует в слиянии вирусной мембраны с мембраной клетки-хозяина, которое требуется для инфицирования. М-РНК белка F в RSV транслируется в белок-предшественник из 574 аминокислот, обозначенный F0, который содержит последовательность сигнального пептида на N-конце (например, аминокислотные остатки 1-26 с SEQ ID NO): 1), которая удаляется сигнальной пептидазой в эндоплазматическом ретикулуме. F0 расщепляется на два сайта (между аминокислотными остатками 109/110 и 136/137) клеточной протеазой (в особенности, фурином или фуриноподобным), удаляющей короткую гликозилированную вставочную последовательность (также относящуюся к области p27, содержащей аминокислотные остатки 110-136, и образующей два домена или субъединицы, обозначенные F1 и F2). Домен F1 (аминокислотные остатки 137-574) содержит гидрофобный пептид слияния на своем N-конце, а C-конец содержит трансмембранный (ТМ) (аминокислотные остатки 530-550) и цитоплазматический участок (аминокислотные остатки 551-574). Домен F2 (аминокислотные остатки 27-109) ковалентно связан с F1 двумя дисульфидными мостиками. Гетеродимеры F1-F2 подвергаются сборке в вирионе в виде гомотримеров.
Вакцины против инфекции RSV в настоящее время не существует, хотя она и очень желательна. Одним потенциальным подходом к получению вакцины является субъединичная вакцина на основе очищенного F-белка RSV. Однако, для этого подхода желательно, чтобы очищенный F-белок RSV находился в конформации, подобной конформации F-белка RSV в состоянии перед слиянием, который стабилен в течение продолжительного периода и может быть получен в достаточных количествах. Кроме того, для вакцины на основе субъединицы необходимо осуществить усечение F-белка RSV путем делеции трансмембранного (ТМ) и цитоплазматического участка с получением растворимого секретируемого Fбелка (sF). Поскольку участок ТМ отвечает за прикрепление к мембране и тримеризацию, дрейфующий растворимый F-белок является гораздо более лабильным, чем первичный продукт трансляции, и будет с легкостью подвергаться рефолдингу в конечное состояние после слияния. Для получения растворимого F-белка в стабильной конформации перед слиянием, который демонстрирует высокие уровни экспрессии и высокую стабильность, необходимо, таким образом, стабилизировать конформацию перед слиянием.
Стабилизация F-белка другого парамиксовируса в конформации перед слиянием была успешно выполнена для вируса парагриппа типа 5 (PIV5). Yin et al. (Nature 439: 38-44 (2006)), таким образом, стабилизировали структуру перед слиянием F-белка PIV-5 с помощью мутации сайта расщепления фурином в F0, что блокировало процессинг в F1 и F2. Кроме того, трансмембранный (ТМ) и цитоплазматический домен были замещены широко известным спиральным доменом тримеризации: GCN4pII. Этот домен образует тримерную геликоидальную суперспиральную структуру и является модификацией встречающегося в природе димерного спирального суперспирального пептида GCN4 (O'Shea et al., Science 243: 538-542 (1989)). Пептид GCN4-pII, в котором аминокислотная последовательность лейциновой застежки GCN4 была замещена изолейциновыми остатками в каждом положении a и d гептада, как показано, образует трехцепочечную параллельную альфа-петлевую суперспираль (Harbury et al., Science 262: 1401-1407 (1993)).
Для стабилизации F RSV в конформации перед слиянием была опробована такая же стратегия, т.е. мутация сайта расщепления фурина и слияние эктодомена RSV-F с доменом тримеризации GCN4pII (как раскрыто, например, в WO2010/149743, WO2010/149745, WO2009/079796, WO2012/158613) или доменом тримеризации фибритина (McLellan et al., Nature Struct. Biol.17: 2-248-250 (2010); McLellan et al., Science
- 2 034653
340(6136):1113-7 (2013)). Этот домен фибритина или 'Foldon' получен из фибритина Т4 и описан ранее в качестве искусственного природного домена тримеризации (Letarov et al., Biochemistry Moscow 64: 817823 (1993); S-Guthe et al., J. Mol. Biol. 337: 905-915. (2004)). Однако, эти усилия не привели к получению стабильного белка RSV-F перед слиянием. Более того, эти усилия даже не привели к получению кандидатов, пригодных для испытания у людей.
Настоящее изобретение далее представляет стабильные рекомбинантные F-полипептиды RSV перед слиянием, т.е. F-полипептиды RSV, которые являются стабилизированными в конформации перед слиянием. В исследовании, которое привело к настоящему изобретению, были введены и/или объединены несколько стадий модификации для получения упомянутых стабильных растворимых Fполипептидов RSV перед слиянием. Стабильные F-полипептиды RSV перед слиянием по настоящему изобретению находятся в конформации перед слиянием, т.е. они содержат (демонстрируют) по меньшей мере один эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка перед слиянием. Эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка перед слиянием, представляет собой эпитоп, который не представлен в конформации после слияния. Не ограничиваясь конкретной теорией, полагают, что конформация F-белка RSV перед слиянием может содержать эпитопы, которые являются такими же, как эпитопы на F-белке RSV, экспрессируемые на встречающихся в природе вирионах RSV и, таким образом, может предоставлять преимущества для активизации защитных нейтрализующих антител.
Полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один эпитоп, который распознается специфическим моноклональным антителом перед слиянием, содержащим CDR1-участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 54, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 55, CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 56 и CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 62, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 63 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 64 (далее в этом документе упоминаемый как CR9501), и/или специфическим моноклональным антителом перед слиянием, содержащим CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 58, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 59, CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 60 и CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 66, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 67 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 68 (упоминаемый как CR9502). CR9501 и CR9502 содержат вариабельные участки тяжелой и легкой цепи и, таким образом, связывающие специфичности антител 58С5 и 30D8, соответственно, как было показано ранее, специфично связывающиеся с F-белком RSV в его конформации перед слиянием, но не в конформации после слияния (см. WO2012/006596).
В определенных вариантах осуществления рекомбинантные F-полипептиды RSV перед слиянием содержат по меньшей мере один эпитоп, который распознается по меньшей мере одним специфичным моноклональным антителом перед слиянием, как описано выше, и полипептиды являются тримерными.
Стабильные F-полипептиды RSV перед слиянием по настоящему изобретению содержат домен F1 и домен F2, где полипептиды содержат по меньшей мере одну мутацию, по сравнению с доменами F1 и F2 дикого типа, выбранную из группы, состоящей из:
(a) мутации аминокислотного остатка в положении 161;
(b) мутации аминокислотного остатка в положении 182;
(c) мутации аминокислотного остатка в положении 173 и (d) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в C (D486C), в комбинации с мутацией аминокислотного остатка D в положении 489 в C (D489C) или мутацией аминокислотного остатка E в положении 487 в C (E487C).
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV перед слиянием содержат домен F1 и домен F2, где полипептиды содержат по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) мутации аминокислотного остатка в положении E 161 в P, Q или G (E161P, E161Q) или E161G);
(b) мутации аминокислотного остатка S в положении 182 в P (S182P);
(c) мутации аминокислотного остатка S, T или N в положении 173 в P (S173P) и (d) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в C (D486C), в комбинации с мутацией аминокислотного остатка D в положении 489 в C (D489C) или мутацией аминокислотного остатка E в положении 487 в C (E487C).
В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV содержат мутацию аминокислотного остатка в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка в положении 215.
В определенных вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV перед слиянием, таким образом, содержат домен F1 и домен F2, где полипептиды содержат мутацию аминокислотного остатка в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка в положении 215, а также по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) мутации аминокислотного остатка в положении 161;
(b) мутации аминокислотного остатка в положении 182;
(c) мутации аминокислотного остатка в положении 173 и (d) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в C (D486C), в комбинации с мутацией аминокислотного остатка D в положении 489 в C (D489C) или мутацией аминокислотного остатка E в положении 487 в C (E487C).
- 3 034653
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV перед слиянием содержат домен F1 и домен F2, где полипептиды содержат мутацию аминокислотного остатка N или T в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215, и в которых полипептиды дополнительно содержат по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) мутации аминокислотного остатка в положении E 161 в P, Q или G (E161P, E161Q) или E161G);
(b) мутации аминокислотного остатка S в положении 182 в P (S182P);
(c) мутации аминокислотного остатка S, T или N в положении 173 в P (S173P) и (d) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в C (D486C), в комбинации с мутацией аминокислотного остатка D в положении 489 в C (D489C) или мутацией аминокислотного остатка E в положении 487 в C (E487C).
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV перед слиянием содержат связывающую последовательность, содержащую от 1 до 10 аминокислот, связывающую домен F1 и домен F2.
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV перед слиянием в соответствии с настоящим изобретением содержат, таким образом, домен F1 и домен F2, а также связывающую последовательность, содержащую от 1 до 10 аминокислотных остатков, связывающую упомянутый домен F1 и упомянутый домен F2, где полипептиды содержат по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) мутации аминокислотного остатка в положении E 161 в P, Q или G (E161P, E161Q) или E161G);
(b) мутации аминокислотного остатка S в положении 182 в P (S182P);
(c) мутации аминокислотного остатка S, T или N в положении 173 в P (S173P), а также (d) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в C (D486C), в сочетании с мутацией аминокислотного остатка D в положении 489 в C (D489C) или мутацией аминокислотного остатка E в положении 487 в C (E487C).
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV перед слиянием дополнительно содержат мутацию аминокислотного остатка N или T в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215. В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV перед слиянием дополнительно содержат мутацию аминокислотного остатка N или T в положении 67 (N/T67I) в I и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215 в P (S215P).
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV перед слиянием в соответствии с настоящим изобретением содержат укороченный домен F1.
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV перед слиянием в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, содержат укороченный домен F1 и домен F2, а также необязательную связывающую последовательность, содержащую от 1 до 10 аминокислотных остатков, связывающую упомянутый укороченный домен F1 с доменом F2, где полипептиды содержат по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) мутации аминокислотного остатка в положении E 161 в P, Q или G (E161P, E161Q) или E161G);
(b) мутации аминокислотного остатка S в положении 182 в P (S182P);
(c) мутации аминокислотного остатка S, T или N в положении 173 в P (S173P) и (d) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в C (D486C), в сочетании с мутацией аминокислотного остатка D в положении 489 в C (D489C) или мутацией аминокислотного остатка E в положении 487 в C (E487C).
В некоторых вариантах осуществления полипептиды дополнительно содержат мутацию аминокислотного остатка N или T в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215. В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV перед слиянием дополнительно содержат мутацию аминокислотного остатка N или T в положении 67 (N/T67I) в I и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215 в P (S215P).
В соответствии с настоящим изобретением, полипептиды по данному изобретению, таким образом, содержат по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию в области F1 и/или F2, по сравнению с доменом F1 RSV и/или доменом F2 в F-белке RSV дикого типа. Известно, что RSV существуют в виде одного серотипа, имеющего две антигенные подгруппы: А и В. Аминокислотные последовательности зрелых процессированных F-белков двух групп являются идентичными приблизительно на 93%. Как используется во всей настоящей заявке, положения аминокислот приведены в отношении к последовательности F-белка RSV из штамма A2 (SEQ ID NO: 1). Как используется в настоящем изобретении, выражение аминокислота в положении x F-белка RSV, таким образом, означает аминокислоту, соответствующую аминокислоте в положении x в F-белке RSV штамма A2 RSV с SEQ ID NO: 1. Необходимо отметить, что в системе нумерации, используемой в настоящей заявке, 1 относится к N-концевой аминокислоте незрелого FO-белка (SEQ ID NO: 1). Если штамм RSV отличается от используемого штамма A2, аминокислотные положения F-белка должны быть пронумерованы со ссылкой на нумерацию F-белка штамма A2 SEQ ID NO: 1 с помощью выравнивания последовательностей другого штамма RSV с Fбелком с SEQ ID NO: 1 со вставкой гэпов, при необходимости. Выравнивание последовательностей можно выполнять с помощью способов, хорошо известных из уровня техники, например, с помощью
- 4 034653
CLUSTALW, Bioedit или CLC Workbench.
Аминокислота в соответствии с настоящим изобретением может быть любой из двадцати природных (или 'стандартных' аминокислот) или их вариантов, таких как, например, D-аминокислоты (Dэнантиомеры аминокислот с хиральным центром), или любыми вариантами, которые не встречаются в природе в белках, такими как, например, норлейцин. Стандартные аминокислоты можно разделить на несколько групп, исходя из их свойств. Важными факторами являются заряд, гидрофильность или гидрофобность, размер и функциональные группы. Эти свойства являются важными для структуры белков и белок-белковых взаимодействий. Некоторые аминокислоты обладают специфическими свойствами, такие как цистеин, который может образовывать ковалентные дисульфидные связи (или дисульфидные мостики) с другими цистеиновыми остатками, пролин, который индуцирует повороты полипептидного остова, и глицин, который более гибкий, чем другие аминокислоты. В табл. 17 представлены аббревиатуры и свойства стандартных аминокислот.
Опытному специалисту следует принять во внимание, что мутации можно осуществлять с белком при помощи стандартных методик молекулярной биологии. Результатом мутаций в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно являются повышенные уровни экспрессии и/или повышенные уровни стабилизации F-полипептидов RSV перед слиянием по сравнению с F-полипептидами RSV, которые не содержат данную (данные) мутацию (мутации).
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV перед слиянием являются полноразмерными.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV перед слиянием являются растворимыми.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV перед слиянием дополнительно содержат гетерологичный домен тримеризации, связанный с упомянутым усеченным доменом F1. В соответствии с настоящим изобретением было показано, что путем связывания гетерологичного тримеризационного домена с C-концевым аминокислотным остатком укороченной области F1, необязательно соединенной со связывающей последовательностью, которая связывает домены F1 и F2 и стабилизирующую мутацию (и), F-полипептиды RSV, при условии, что они проявили высокий уровень экспрессии и связаны со специфическими антителами перед слиянием, указывая, что полипептиды находятся в конформации перед слиянием. Кроме того, F-полипептиды RSV стабилизированы в конформации перед слиянием, т.е. даже после процессинга полипептидов они по-прежнему связаны со специфичными антителами CR9501 и/или CR9502 перед слиянием, указывая, что специфический эпитоп перед слиянием сохраняется.
В дополнительных вариантах осуществления F-полипептиды RSV перед слиянием содержат одну или несколько дополнительных мутаций (по сравнению с F-белком RSV дикого типа), выбранных из группы, состоящей из:
(a) мутации аминокислотного остатка в положении 46;
(b) мутации аминокислотного остатка в положении 77;
(c) мутации аминокислотного остатка в положении 80;
(d) мутации аминокислотного остатка в положении 92;
(e) мутации аминокислотного остатка в положении 184;
(f) мутации аминокислотного остатка в положении 185;
(g) мутации аминокислотного остатка в положении 201;
(h) мутации аминокислотного остатка в положении 209;
(i) мутации аминокислотного остатка в положении 421;
(j) мутации аминокислотного остатка в положении 426;
(k) мутации аминокислотного остатка в положении 465;
(l) мутации аминокислотного остатка в положении 486;
(m) мутации аминокислотного остатка в положении 487 и (n) мутации аминокислотного остатка в положении 508.
В предпочтительных вариантах осуществления одна или несколько дополнительных мутаций выбраны из группы, состоящей из:
(a) мутации аминокислотного остатка S в положении 46 в G (S46G);
(b) мутации аминокислотного остатка K в положении 77 в E (K77E);
(c) мутации аминокислотного остатка K в положении 80 в E (K80E);
(d) мутации аминокислотного остатка E в положении 92 в D (E92D);
(e) мутации аминокислотного остатка G в положении 184 в N (G184N);
(f) мутации аминокислотного остатка V в положении 185 в N (V185N);
(g) мутации аминокислотного остатка K в положении 201 в Q (K201Q);
(h) мутации аминокислотного остатка K в положении 209 в Q (K209Q);
(i) мутации аминокислотного остатка K в положении 421 в N (K421N);
(j) мутации аминокислотного остатка N в положении 426 в S (N426S);
(k) мутации аминокислотного остатка K в положении 465 в E или Q (K4 65Q);
- 5 034653 (l) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в N (D486N);
(m) мутации аминокислотного остатка E в положении 487 в Q, N или I (E487Q/N/I) и (n) мутации аминокислотного остатка K в положении 508 в E (K508E).
Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV перед слиянием содержат мутацию в остатке D аминокислоты в положении 486 в C (D486C) в комбинации с D489C или E487C. Эти двойные мутации в двух дополнительных цистеиновых остатках приводят к дисульфидному мостику между субъединицами белков F1 с установлением ковалентной связи между протомерами и стабилизированием F-структуры RSV перед слиянием.
Снова необходимо отметить, что для положений аминокислотных остатков отсчет выполняется по отношению к SEQ ID NO: 1. Специалист сможет определить соответствующие аминокислотные остатки в F-белках других штаммов RSV.
В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV перед слиянием содержат по меньшей мере две мутации (по сравнению с F-белком RSV дикого типа).
В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат по меньшей мере три мутации.
В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат по меньшей мере четыре, пять или шесть мутаций.
В определенных вариантах осуществления гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4).
Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат усеченный домен F1. Как используется в данном документе, усеченный домен F1 относится к домену F1, который не является доменом F1 полной длины, т.е. где на N-конце или C-конце один или несколько аминокислотных остатков были удалены. В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере трансмембранный домен и цитоплазматический хвост были удалены для обеспечения экспрессии продукта в виде растворимого эктодомена.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 усекают после аминокислотного остатка 495 в Fбелке RSV (обозначенного SEQ ID NO: 1), т.е. C-концевая часть домена F1, начиная с аминокислотного остатка 496 (обозначенного SEQ ID NO: 1) была удалена. В некоторых вариантах осуществления домен F1 усекают после аминокислотного остатка 513 в F-белке RSV. В некоторых вариантах осуществления домен F1 усекается после аминокислотного остатка 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 52 4 или 52 5.
В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации соединен с аминокислотным остатком 495 в F1-области RSV. В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации содержит SEQ ID NO: 4 и связан с аминокислотным остатком 495 домена F1 RSV.
В некоторых других вариантах осуществления домен тримеризации связан с аминокислотным остатком 513 домена F1 RSV. В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации содержит SEQ ID NO: 3 и связан с аминокислотным остатком 513 домена F1 RSV.
Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления домен F1, который является необязательно усеченным, а также домен F2 связаны связывающей последовательностью, которая связывает Cконцевую аминокислоту домена F2 с N-концевой аминокислотой (необязательно усеченной) домена F2. В некоторых вариантах осуществления связывающая последовательность (или линкер) содержит от 1 до 10 аминокислотных остатков, предпочтительно от 2 до 9 аминокислотных остатков, предпочтительно от 3 до 8 аминокислотных остатков, предпочтительно от 4 до 7 аминокислотных остатков, более предпочтительно линкер содержит 5 или 6 аминокислотных остатков. Из уровня техники известны несколько конформационно нейтральных линкеров, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением без нарушения конформации F-полипептидов RVS перед слиянием. В предпочтительных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GSGSG (SEQ ID NO: 5).
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или домен F происходят из штамма A RSV. В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или F2 происходят из штамма A2 RSV в SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма A2 RSV в SEQ ID NO: 69.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или домен F происходят из штамма В RSV. В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или F2 происходят из штамма В RSV в SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или F2 происходят из одного штамма RSV. В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV перед слиянием являются химерными полипептидами, т.е. содержат домены F1 и F2, которые происходят из разных штаммов RSV.
В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии F-полипептидов RSV перед слиянием настоящего изобретения повышен, по сравнению с эктодоменом F-полипептида RSV дикого типа (т.е. без трансмембранного или цитоплазматического участка) без мутации (мутаций). В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии повышен по меньшей мере в 5 раз, предпочтительно до 10 раз. В не
- 6 034653 которых вариантах осуществления уровень экспрессии повышен более чем в 10 раз.
F-полипептиды RSV перед слиянием в соответствии с настоящим изобретением являются стабильными, т.е. не изменяются с легкостью в конформацию после слияния при процессинге полипептидов, таком как, например, очистка, циклы замораживания-оттаивания и/или хранение и т.д.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV перед слиянием в соответствии с настоящим изобретением имеют повышенную стабильность при хранении при 4°С, по сравнению с Fполипептидом RSV без мутации (мутаций). В некоторых вариантах осуществления полипептиды являются стабильными при хранении при 4°С в течение по меньшей мере 30 дней, предпочтительно по меньшей мере 60 дней, предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев, даже более предпочтительно по меньшей мере 1 года. Стабильный при хранении означает, что полипептиды по-прежнему демонстрируют по меньшей мере один эпитоп, специфический для конкретных антител перед слиянием (например CR9501) при хранении полипептида в растворе (например, культуральной среде) при 4°С в течение, по меньшей мере 30 дней, например, как определено с использованием способа, описанного в примере 8 или 10. В некоторых вариантах осуществления полипептиды демонстрируют по меньшей мере один специфичный эпитоп до слияния в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно в течение по меньшей мере 1 года при хранении F-полипептидов RSV до слияния при 4°С.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV в соответствии с настоящим изобретением обладают повышенной стабильностью при воздействии теплом, по сравнению с F-полипептидами RSV без указанной (указанных) мутации (мутаций). В некоторых вариантах осуществления Fполипептиды REV перед слиянием термостабильны по меньшей мере 30 мин при температуре 55°С, предпочтительно при 58°С, более предпочтительно при 60°С. Термостабильный означает, что полипептиды по-прежнему демонстрируют по меньшей мере один специфический эпитоп перед слиянием после того, как их подвергали действию повышенной температуры по меньшей мере 30 мин (например, температуры 55°С или выше), например, как определено с использованием способа, описанного в примере 9.
В определенных вариантах осуществления полипептиды демонстрируют по меньшей мере один специфичный эпитоп перед слиянием после воздействия от 1 до 6 циклов замораживанияразмораживания в приемлемом буферном составе.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептид RSV перед слиянием по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 90-94. В определенных вариантах осуществления F-полипептид RSV перед слиянием по настоящему изобретению состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 90-94.
Как используется во всей настоящей заявке, нуклеотидные последовательности представлены в направлении от 5' до 3', и аминокислотные последовательности от N-конца к C-концу, как принято в уровне техники.
В некоторых вариантах осуществления кодируемые полипептиды в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержат лидерную последовательность, также называемую как сигнальная последовательность или сигнальный пептид, соответствующую аминокислотам 1-26 в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 69. Она представляет собой короткий (длиной, как правило, 5-30 аминокислот) пептид, присутствующий на N-конце большинства вновь синтезируемых белков, которые предназначены для поступления в секреторный путь. В некоторых вариантах осуществления полипептиды в соответствии с настоящим изобретением не содержат лидерную последовательность.
В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат HIS-метку. His-метка или полигистидиновая метка представляет собой аминокислотный мотив в белках, который состоит по меньшей мере из пяти остатков (H) гистидина, часто на N- или C-конце белка, который обычно используют для целей очистки.
В определенных вариантах осуществления полипептиды не содержат HIS-метку. В соответствии с настоящим изобретением неожиданно было показано, что при удалении HIS-метки уровень экспрессии и стабильность повышаются по сравнению с полипептидами с HIS-меткой.
Настоящее изобретение дополнительно представляет молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей F-полипептиды RSV в соответствии с настоящим изобретением.
В предпочтительных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды в соответствии с настоящим изобретением, являются оптимизированными по кодонам для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно клетках человека. Способы оптимизации по кодонам известны или были описаны ранее (например, WO 96/09378). Последовательность считается оптимизированной по кодонам, если по меньшей мере один кодон, не являющийся предпочтительным, по сравнению с последовательностью дикого типа замещен кодоном, который является более предпочтительным. В данном документе кодон, не являющийся предпочтительным, представляет собой кодон, который используется менее часто в организме, чем другой кодон, кодирующий такую же аминокислоту, и кодон, являющийся более предпочтительным, представляет собой кодон, который используется более часто в организме, чем кодон, не являющийся предпочтительным. Частоту использования кодонов для
- 7 034653 конкретного организма можно найти в таблицах частоты использования кодонов, таких как в http://www.kazusa.or.jp/codon. Предпочтительно более одного кодона, не являющегося предпочтительным, предпочтительно большинство или все кодоны, не являющиеся предпочтительными, замещают кодонами, которые являются более предпочтительными. Предпочтительно наиболее часто используемые кодоны в организме используются в оптимизированной по кодонам последовательности. Замещение предпочтительными кодонами, как правило, приводит к более высокому уровню экспрессии.
Специалисту в данной области будет понятно, что несколько различных молекул полинуклеотидов и нуклеиновых кислот могут кодировать один и тот же полипептид в результате вырожденности генетического кода. Также понятно, что специалисты в данной области могут при помощи традиционных методик проводить нуклеотидные замены, которые не влияют на последовательность полипептида, кодируемую молекулами нуклеиновых кислот, для отражения частоты использования кодонов любым конкретным организмом-хозяином, в котором полипептиды будут экспрессироваться. Следовательно, если конкретно не указано иное, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки и РНК могут содержать или могут не содержать интроны.
Последовательности нуклеиновых кислот можно клонировать с помощью стандартных методик молекулярной биологии или получать de novo с помощью синтеза ДНК, который можно проводить с использованием стандартных процедур при помощи компаний, предоставляющих услуги в области синтеза ДНК и/или молекулярного клонирования (например, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).
Настоящее изобретение также представляет векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, как описано выше. Таким образом, в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением является частью вектора. Такими векторами можно легко манипулировать с помощью способов, хорошо известных специалисту в данной области, и например, их можно сконструировать так, чтобы они были способны к репликации в прокариотических и/или эукариотических клетках. Кроме того, многие векторы можно использовать для трансформации эукариотических клеток, и они будут интегрироваться целиком или частично в геном таких клеток, что приведет в результате к стабильным клеткам-хозяевам, содержащим в их геноме необходимую нуклеиновую кислоту. Используемый вектор может представлять собой любой вектор, который подходит для клонирования ДНК и который можно использовать для транскрипции нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. Подходящими векторами в соответствии с настоящим изобретением являются, например, аденовекторы, такие как Ad26 или Ad35, альфавирус, парамиксовирус, вирус осповакцины, вирус герпеса, ретровирусные векторы и т.д. Специалист в данной области может выбрать подходящие векторы экспрессии и вставить последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения функциональным образом.
Клетки-хозяева, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие F-полипептиды RSV перед слиянием, также составляют часть настоящего изобретения. F-полипептиды RSV перед слиянием можно получить с помощью технологии рекомбинантной ДНК, включающей экспрессию молекул в клетках-хозяевах, например, клетках яичников китайского хомячка (CHO), линиях опухолевых клеток, клетках BHK, клеточных линиях человека, таких как клетки HEK293, клетки PER.C6 или клетках дрожжей, грибов, насекомых и т.п., или трансгенных животных, или растений. В некоторых вариантах осуществления клетки происходят из многоклеточного организма, в некоторых вариантах осуществления они происходят из позвоночных или беспозвоночных. В некоторых вариантах осуществления клетками являются клетки млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клетками являются клетки человека. В целом получение рекомбинантных белков, таких как F-полипептиды RSV перед слиянием по настоящему изобретению, в клетке-хозяине предусматривает введение гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид в экспрессируемом формате, в клетку-хозяина, культивирование клеток в условиях, способствующих экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты и обеспечение экспрессии полипептида в указанной клетке. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок в экспрессируемом формате, может находиться в форме кассеты экспрессии и обычно требует последовательностей, способствующих экспрессии нуклеиновой кислоты, таких как энхансер(ы), промотор, сигнал полиаденилирования и т.п. Специалист в данной области осведомлен о том, что разные промоторы можно использовать для обеспечения экспрессии гена в клетках-хозяевах. Промоторы могут быть конститутивными или регулируемыми, и их можно получать из разных источников, в том числе, вирусов, прокариотических или эукариотических источников, или получать искусственным путем.
Среды для культивирования клеток доступны от различных поставщиков, и подходящую среду можно стандартно выбрать для клетки-хозяина для экспрессии белка, представляющего интерес, в данном случае F-полипептидов RSV перед слиянием. Подходящая среда может содержать или может не содержать сыворотку.
Гетерологической молекулой нуклеиновой кислоты (также называемой в данном документе как 'трансген') является молекула нуклеиновой кислоты, которая в природе не присутствует в клеткехозяине. Ее вводят, например, в вектор с помощью стандартных методик молекулярной биологии.
- 8 034653
Трансген обычно функционально связан с последовательностями, контролирующими экспрессию. Это можно выполнить, например, путем помещения нуклеиновой кислоты, кодирующей трансген(ы), под контроль промотора. Можно добавлять дополнительные регуляторные последовательности. Многие промоторы можно использовать для экспрессии трансгена (трансгенов), и они известны специалисту, например, такие промоторы могут включать промоторы вирусов, млекопитающих, синтетические промоторы и т.п.
Неограничивающим примером подходящего промотора для получения экспрессии в эукариотических клетках является промотор CMV (патент США № 5385839), например, предранний промотор CMV, например, содержащий нуклеотиды от -735 до +95 из энхансера/промотора предраннего гена CMV. Сигнал полиаденилирования, например, сигнал polyA гена бычьего гормона роста (патент США № 5122458) может располагаться позади трансгена(ов). В качестве альтернативы, несколько широко используемых векторов экспрессии доступны в данной области и их получают из коммерческих источников, например, серии векторов pcDNA и pEF Invitrogen, pMSCV и pTK-Hyg от BD Sciences, pCMV-Script от Stratagene и т.д., которые можно использовать для рекомбинантной экспрессии белка, представляющего интерес, или для получения подходящих промоторов и/или последовательностей терминаторов транскрипции, последовательностей polyA и т.п.
Культура клеток может представлять собой любой тип культуры клеток, в том числе адгезивную культуру клеток, например, клетки, прикрепленные к поверхности культурального флакона или к микроносителям, а также суспензионную культуру. Манипуляции с суспензионными культурами наиболее крупного масштаба проводят в периодическом процессе или процессе с подпиткой, поскольку они являются наиболее простыми для управления и увеличения масштаба. В настоящее время непрерывные процессы на основе принципов перфузии становятся более распространенными, и они также являются подходящими. Подходящие питательные среды хорошо известны специалисту в данной области и могут, как правило, быть получены из коммерческих источников в больших количествах или произведены по заказу согласно стандартным протоколам. Культивирование можно проводить, например, в чашках, роллерфлаконах или в биореакторах, используя периодические, подпитываемые, непрерывные системы и т.п. Известны подходящие условия для культивирования клеток (см., например, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), и R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)).
Настоящее изобретение также представляет композиции, содержащие F-полипептиды RSV перед слиянием и/или молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, как описано выше. Настоящее изобретение также представляет композиции, содержащие F-полипептид RSV перед слиянием, который демонстрирует эпитоп, присутствующий в конформации F-белка RSV перед слиянием, но отсутствует в конформации после слияния. Настоящее изобретение также представляет композиции, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, кодирующие такой F-полипептид RSV перед слиянием. Настоящее изобретение также представляет иммуногенные композиции, содержащие F-полипептиды RSV перед слиянием и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор, как описано выше. Настоящее изобретение также представляет применение стабилизированного F-полипептида RSV перед слиянием, молекулы нуклеиновой кислоты и/или вектор в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования у субъекта иммунного ответа к F-белку RSV. Дополнительно представлены способы индуцирования у субъекта иммунного ответа к F-белку RSV, предусматривающие введение субъекту F-полипептида RSV до слияния и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор в соответствии с настоящим изобретением. Также представлены F-полипептиды RSV перед слиянием, молекулы нуклеиновой кислоты, и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования иммунного ответа у субъекта к Fбелку RSV. Также представлено применение F-полипептидов RSV перед слиянием, и/или молекул нуклеиновой кислоты, и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением для получения лекарственного средства для применения в индуцировании у субъекта иммунного ответа к F-белку RSV.
F-полипептиды RSV перед слиянием, молекулы нуклеиновой кислоты или векторы по настоящему изобретению можно использовать для предупреждения (профилактики) и/или для лечения инфекций RSV. В определенных вариантах осуществления профилактика и/или лечение могут быть направлены на группы пациентов, которые восприимчивы к RSV инфекции. Такие группы пациентов включают без ограничений, например, пожилых (например, >50 лет, >60 лет и предпочтительно >65 лет), молодых (например, <5 лет <1 лет), госпитализированных пациентов и пациентов, которые получали лечение противовирусными соединениями, но проявили недостаточный ответ на лечение противовирусными соединениями.
F-полипептиды RSV перед слиянием, молекулы нуклеиновых кислот и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением можно использовать, например, в самостоятельном лечении и/или профилактике заболевания или состояния, вызванного RSV, или в комбинации с другими профилактическими и/или терапевтическими средствами лечения, такими как (существующие или будущие) вакцины, противовирусные средства и/или моноклональные антитела.
Настоящее изобретение дополнительно представляет способы предупреждения и/или лечения у
- 9 034653 субъекта инфекции RSV с использованием F-полипептидов RSV перед слиянием, молекул нуклеиновых кислот и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением. В конкретном варианте осуществления способ предупреждения и/или лечения у субъекта инфекции RSV предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества F-полипептида RSV перед слиянием, молекулы нуклеиновой кислоты и/или вектора, описанных выше. Терапевтически эффективное количество относится к количеству полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, которое является эффективным для предупреждения, уменьшение интенсивности и/или лечения заболевания или состояния, возникшего в результате инфекции, вызванной RSV. Предупреждение охватывает подавление или уменьшение распространения RSV, или подавление или уменьшение проявления, развития или прогрессирования одного или нескольких симптомов, связанных с инфекцией, вызванной RSV. Уменьшение интенсивности, используемое в данном документе, может относиться к ослаблению видимых или заметных симптомов заболевания, вирусемии или любого другого заметного проявления инфекции RSV.
Для введения субъектам, таким как люди, в настоящем изобретении могут использоваться фармацевтические композиции, содержащие F-полипептид RSV перед слиянием, молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В настоящем контексте выражение фармацевтически приемлемый означает, что носитель или наполнитель в используемых дозировках и концентрациях не вызовет каких-либо нежелательных или вредных эффектов у субъектов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и наполнители хорошо известны из уровня техники (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; a также Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). F-полипептиды RSV или молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно составляют и вводят в виде стерильного раствора, хотя также возможно использование лиофилизированных препаратов. Стерильные растворы получают путем стерильной фильтрации или с помощью других способов, широко известных из уровня техники. Затем растворы лиофилизируют или расфасовывают по контейнерам, предназначенным для лекарственных форм. рН раствора обычно находится в диапазоне от рН 3,0 до рН 9,5, например, от рН 5,0 до рН 7,5. Fполипептиды RSV обычно находятся в растворе, имеющем подходящий фармацевтически приемлемый буфер, и композиция может также содержать соль. Необязательно может присутствовать стабилизирующее средство, такое как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляют детергент. В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV можно составлять в виде инъекционного препарата.
В некоторых вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит один или несколько адъювантов. Адъюванты, известные из уровня техники, дополнительно повышают иммунный ответ к применяемой антигенной детерминанте. Выражения адьювант и иммуностимулятор используют в данном документе взаимозаменяемо, и их определяют как одно или несколько веществ, вызывающих стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа к F-полипептидам RSV по настоящему изобретению. Примеры подходящих адъювантов включают соли алюминия, такие как гидроксид алюминия и/или фосфат алюминия; композиции на основе масляных эмульсий (или композиции типа масло в воде), в том числе сквален-водных эмульсий, таких как MF59 (см., например, WO 90/14837); составы с сапонинами, такие как, например, QS21 и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS) (см., например, US 5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); производные бактерий или микроорганизмов, примерами которых являются монофосфорил липид A (MPL), 3-O-деацилированный MPL (3dMPL), олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG, ADP-рибозилирующие токсины бактерий или их мутантные формы, такие как термолабильный энтеротоксин LT из E. coli, холерный токсин CT и т.п.; белки эукариотов (например, антитела или их фрагменты (например, направленные против самого антигена или CD1a, CD3, CD7, CD80) и лиганды к рецепторам (например, CD40L, GMCSF, GCSF и др.), которые стимулируют иммунный ответ при взаимодействии с клетками реципиентов. В определенных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат в качестве адъюванта алюминий, например, в форме гидроксида алюминия, фосфата алюминия, фосфата алюминия-калия или их комбинации в концентрациях 0,05-5 мг, например, 0,075-1,0 мг алюминия из расчета на дозу.
F-полипептиды RSV перед слиянием можно также вводить в комбинации с наночастицами или конъюгированными с наночастицами, такими как, например, полимеры, липосомы, виросомы, вирусподобные частицы. F-полипептиды перед слиянием можно комбинировать с наночастицами, инкапсулировать в наночастицах или конъюгировать с наночастицами с адъювантом или без него. Инкапсулирование в липосомы описано, например, в документе US 4235877. Конъюгирование с макромолекулами раскрыто, например, в документах US 4372945 или US 4474757.
В других вариантах осуществления композиции не содержат адъюванты.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение представляет способы получения вакцины против респираторного синцитиального вируса (RSV), включающие обеспечение композиции в соответствии с настоящим изобретением и помещение ее в фармацевтически приемлемую композицию.
- 10 034653
Выражение вакцина относится к средству или композиции, содержащим активный компонент, который является эффективным для индуцирования у субъекта определенной степени иммунитета к определенному патогенному микроорганизму или заболеванию, что приведет по меньшей мере к снижению (до полного отсутствия включительно) тяжести, продолжительности или другого проявления симптомов, связанных с инфекцией патогенным микроорганизмом или заболеванием. В настоящем изобретении вакцина содержит эффективное количество F-полипептида RSV перед слиянием и/или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей F-полипептид RSV перед слиянием и/или вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, который приводит к образованию иммунного ответа к F-белку RSV. Это обеспечивает способ предупреждения тяжелого заболевания нижних дыхательных путей, приводящего к госпитализации, и снижает частоту осложнений, таких как пневмония и бронхиолит у субъекта вследствие инфекции и репликации RSV. Выражение вакцина согласно настоящему изобретению подразумевает, что она представляет собой фармацевтическую композицию, и, таким образом, как правило, содержит фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель. Она может содержать или не содержать дополнительные активные ингредиенты. В определенных вариантах осуществления она может представлять собой комбинированную вакцину, которая дополнительно содержит другие компоненты, которые индуцируют иммунный ответ, например, против других белков RSV и/или против других возбудителей инфекции. Введение дополнительных активных компонентов можно, например, осуществлять путем отдельного введения или путем введения комбинации продуктов из вакцин по настоящему изобретению и дополнительных активных компонентов.
Композиции можно вводить субъекту, например, субъекту-человеку. Суммарная доза Fполипептидов RSV в композиции для однократного введения может, например, составлять от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 10 мг, например, 1 мкг 1 мг, например, 10 мкг - 100 мкг. Определение рекомендуемой дозы будет осуществляться в процессе эксперимента и является стандартным для специалистов в данной области.
Введение композиций в соответствии с настоящим изобретением можно осуществлять с использованием стандартных путей введения. Неограничивающие варианты осуществления включают парентеральное введение, такое как внутрикожное, внутримышечное, подкожное, чрескожное введение или введение через слизистые, например, интраназальное, пероральное и т.п. В одном варианте осуществления композицию вводят путем внутримышечной инъекции. Специалисту известны различные возможности введения композиции, например вакцины, для индуцирования иммунного ответа к антигену (антигенам), присутствующему в вакцине.
Субъект, как используется в данном документе, предпочтительно представляет собой млекопитающее, например, грызуна, например, мышь, хлопкового хомяка или примата, кроме человека, или человека. Предпочтительно субъект представляет собой субъекта-человека.
Полипептиды, молекулы нуклеиновых кислот, векторы и/или комбинации можно также вводить в виде прайма или в виде буста в гомологичном или гетерологичном режиме прайм-буст. При проведении бустерной вакцинации обычно такую бустерную вакцину будут вводить одному и тому же субъекту с промежутком от одной недели до одного года, предпочтительно от двух недель до четырех месяцев после введения композиции субъекту в первый раз (которое в данном случае называется первичной вакцинацией). В некоторых вариантах осуществления введение включает прайм и по меньшей мере одно бустерное введение.
Кроме того, полипептиды по настоящему изобретению можно использовать в качестве диагностического средства, например, для проверки иммунного статуса индивидуума путем определения способности антител в сыворотке такого индивида к связыванию с полипептидами по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к in vitro диагностическому способу выявления у пациента присутствия инфекции RSV, при этом указанный способ включает стадии a) приведения в контакт биологического образца, полученного от указанного пациента, с полипептидом в соответствии с настоящим изобретением; и b) выявления присутствия комплексов антитело-полипептид.
Настоящее изобретение относится также к способу стабилизации F-полипептида RSV в конформации перед слиянием, включающему внедрение в RSV домен F1 одной или нескольких мутаций, по сравнению с диким типом RSV домена F1, в котором выбирают одну или более мутаций из группы, состоящей из:
(a) стабилизирующей мутации в области HRA между элементами вторичной структуры в F перед слиянием, которые превращаются в одну большую суперспираль в F после слияния, а также (b) интродукции двух остатков цистеина близко к 3-кольцевой оси в нижней части головки N-конца RSV-F перед слиянием по отношению к предварительно сшитому стеблю (остатки 493-525), N-концевых HRB), который сшивает ковалентной связью F1-субъединицы в тример.
В определенных вариантах осуществления мутация в области HRA находится в положении 161. В определенных вариантах осуществления мутация в области HRA находится в положении 173. В определенных вариантах осуществления мутация в области HRA находится в положении 182.
В определенных вариантах осуществления введение двух остатков цистеина находится в положении 486 и 489.
- 11 034653
В определенных вариантах осуществления введение двух остатков цистеина находится в положении 486 и 487.
Стабилизированные F-полипептиды RSV перед слиянием, получаемые и/или полученные таким способом, тоже составляют часть настоящего изобретения, а также варианты их применения, как описано выше.
Далее настоящее изобретение поясняют следующими примерами. Данные примеры не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом. Они служат лишь для пояснения настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Получение стабильных F-полипептидов RSV перед слиянием - линкеры и домены тримеризации.
В совместно рассматриваемой заявке на патент PCT/EP2014/058353 стабилизированные варианты растворимого F-белка (sF) были разработаны путем стабилизации двух основных областей, которые инициируют повторную укладку. Первой стратегией было блокирование пептида слияния в его положении и предотвращение его высвобождения из головного участка путем фиксации и соединения доменов F1-F2 с помощью короткой петли. Высвобождение пептида слияния можно предотвратить с помощью перенесения ковалентного соединения N-конца F1 к C-концу F2. Как показано в этом примере, подвергли испытаниям ряд разных линкеров. Вставка 5-аминокислотной петли между F1 и F2, в частности, содержащей аминокислотную последовательность GSGSG (SEQ ID NO: 5), была наиболее успешной.
Другим нестабильным участком является второй гептадный повтор (HRB), который образует тримерный спиральный участок стебля в F-белке перед слиянием. Делеция трансмембранного домена (ТМ) в растворимом F-белке дополнительно дестабилизирует этот участок, что было восполнено добавлением различных гетерологических доменов тримеризации. Полностью процессированный зрелый эктодомен RSV-F сливали на C-конце с различными доменами тримеризации и в различных положениях (т.е. домен F1 усекали по различным аминокислотным остаткам).
Несколько конструкций получали на основе штаммов A2 или B1 RSV. Различные домены тримеризации связывали с доменом F1 RSV, который усекали по различным положениям. Домены тримеризации, которые исследовали, включали мотив фибритина (содержащий аминокислотную последовательность
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4), и мотив фибритин длинный, более длинный, растянутый на N-конце домен фибритина, который содержит его встречающиеся в природе спиральные участки (содержащие аминокислотную последовательность
SSLQGDVQALQEAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 6), которые добавляли к F1-домену RSV в рамке (в регистре) с предполагаемым гептадным повтором участка HRB.
Полученные дополнительные конструкции содержали гептадные идеальные спиральные тримерные суперспирали, или домен изолейциновой застежки (IZ) (Suzuki et al., Protein Engineering 11: 1051-1055 (1998)), содержащие аминокислотную последовательность
IEAIEKK (SEQ ID NO: 7).
В соответствии с настоящим изобретением использовали различные домены IZ, обозначенные как изолейциновая застежка (L), содержащая аминокислотную последовательность (I) EKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 8), и изолейциновая застежка (S), содержащая аминокислотную последовательность EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 3).
Эти домены IZ сопоставимы по структуре с GCN4, однако, домены IZ не являются природными последовательностями, а сконструированы для того, чтобы быть оптимальными доменами тримеризации, и поэтому более стабильными.
Дополнительные конструкции получали с другими известными доменами тримеризации:
GCN4II
EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA (SEQ ID NO: 9)
Оптимизированный GCN4II
EDKVEELLSKIYHIENRIARIEKLVGEA (SEQ ID NO: 10)
Матриллин -1 (длинная версия)
EEDPCECKSIVKFQTKVEELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID NO: 11)
Матриллин - 1 короткая версия, которая содержит только домен застежки:
EELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID NO: 12)
Получали следующие конструкции:
конструкция F18 содержала домен тримеризации фибритина (SEQ ID NO: 4), связанный с аминокислотным остатком 513 домена F1.
Конструкция F19 содержала домен тримеризации фибритина (SEQ ID NO: 4), связанный с аминокислотным остатком 499 домена F1.
Конструкция F20 содержала домен изолейциновой застежки (L) (SEQ ID NO: 8), связанный с аминокислотным остатком 516 домена F1 и содержащий дополнительные модификации в HRB для оптимизации гидрофобной природы гептадных положений и облегчения слияния с доменом IZ с сохранением
- 12 034653 рамки считывания.
Конструкция F21 также содержала домен изолейциновой застежки (L) (SEQ ID NO: 8), но связанный с аминокислотным остатком 501 домена F1 и без дополнительных модификаций в 32 участке HRB.
Конструкция F22 содержала домен изолейциновой застежки (L) (SEQ ID NO: 8), связанный с аминокислотным остатком 495 домена F1 и содержащий дополнительные модификации в HRB.
Конструкция F23 содержала домен изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3), связанный с аминокислотным остатком 495.
Конструкция F46 содержала домен изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3), но связанный с более длинным эктодоменом RSV-F, т.е. домен F1 усекали после аминокислотного остатка 513.
Все конструкции содержали HIS-метку.
Конструкции исследовали в отношении уровней экспрессии, стабильности при хранении и связывания с антителом CR9501. Аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепи и CDR тяжелой и легкой цепи этого антитела приведены ниже. CR9501 содержит связывающие участки антител, обозначенных как 58С5 в WO2012/006596.
Конструкции синтезировали и оптимизировали по кодонам в Gene Art (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Конструкции клонировали в pCDNA2004 или создавали при помощи стандартных способов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР, и секвенировали. Используемой системой экспрессии были клетки 293Freestyle (Life
Technologies). Клетки временно трансфицировали с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя и культивировали в течение 5 дней при 37°С и 10% CO2. Супернатант культуры собирали и центрифугировали в течение 5 мин при 300 g для удаления клеток и клеточного дебриса. Отцентрифугированный супернатант затем фильтровали в стерильных условиях с помощью 0,22 мкм вакуумного фильтра и хранили при 4°С до использования.
Супернатанты с 5 дня оценивали в отношении экспрессии F-белка с помощью вестерн-блоттинга, используя моноклональное антитело CR9503, которое содержит вариабельные участки тяжелой и легкой цепи антитела к F RSV мотавизумаб (обозначенного как CR9503). Приблизительные уровни экспрессии конструкций F-белка RSV перед слиянием определяли с использованием CR9503, вторичного антитела, конъюгированного с IR-красителем, к иммуноглобулину человека (Li-Cor, Линкольн, Небраска) или HRP-конъюгированного мышиного антитела к IgG человека (Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания). Затем определяли количества белка с помощью серии разбавлений очищенного стандартного белка RSV, или визуально на глаз, или с использованием системы Odyssey CLx для инфракрасной визуализации. Для определения стабильности конструкций и выявления положительных или отрицательных стабилизирующих эффектов введенных мотивов тримеризации, конструкции, способные к связыванию с CR9501, обрабатывали в диапазоне температур от 45 до 65°С в течение 30 мин для исследования стабильности эпитопа CR9501. Эта процедура подробно описана в примере 9. Результаты обобщены в табл. 1.
Таблица 1. Экспрессия и стабильность конструкций F RSV с различными мотивами тримеризации
| Белок RSV | Описание | Стабильность* | |||
| Мотив тримеризации | Модификации | Точка терминации | Экспрессия (мкг/мл) | ||
| F18 | Фибритин | Отсутствуют | 513 | 2 | Нестабильный |
| F19 | Фибритин | Отсутствуют | 499 | 0 | ND |
| F2 0 | Изолейциновая застежка (L) | 502 509 516 Не | 516 | 0 | ND |
| F21 | Изолейциновая застежка (L) | Отсутствуют | 501 | 0 | ND |
| F22 | Изолейциновая застежка (L) | К483Е + Е488К | 495 | 0 | ND |
| F23 | Изолейциновая застежка (S) | Отсутствуют | 495 | 0,3 1 | стабильный |
| F4 6 | Изолейциновая застежка (S) | Отсутствуют | 513 | Не экспрессировал | ND |
Стабильность определяли, как описано в примере 8; ND: не определено.
1. Уровень экспрессии определяли с помощью вестерн-блоттинга, как описано в примере 1.
Как можно увидеть в табл. 1, единственными конструкциями, которые экспрессировались, были варианты фибритина (F18) и F23. Несмотря на то, что F18 был тримерным и демонстрировал экспрессию, он был нестабильным при хранении при 4°С. В противоположность этому, F23 был стабильным при 4°С, связывался со специфичными антителами перед слиянием, но, по-видимому, был мономерным. Таким образом, оба варианта F18 и F23 использовали для оптимизации стабильности и тримеризации.
Затем получали несколько конструкций, в которых пептид слияния на N-конце F1 был прикреплен путем слияния с C-концом домена F2. Все конструкции содержали His-метку.
- 13 034653
Получали несколько конструкций, в том числе конструкции, в которых сайты расщепления фурином подвергали мутации, что приводило к образованию растворимого F-белка, который по-прежнему содержал пептид p27 (т.е. F12, F15.1 и F17). В других конструкциях область остатка 27 (петля P27), которая отщепляется от предшественника F0, была заменена альтернативным замкнутым контуром: либо путем замены области RSV-F на гомологичную область F PIV-5 F-белка перед слиянием, которая была произведена и успешно кристаллизована (F25), или путем замены области с помощью очень маленькой (GS)n петли, которая будет связывать перемычкой концы F2 и F1 (F24), или же путем замены участка центральной консервативной области PCB-G (F26). Моделирование гомологии RSV-F на основе PIV-5 и измерений in silico привело в результате к выбору минимальной петли из 5 аминокислотных остатков между остатками 108 и 136. В качестве линкера выбирали остатки Gly (G) и Ser (S), которые являются гибкими и полярными и имеют высокую вероятность быть внесенными (F24). Кроме того, F137 подвергали мутации в S, поскольку локальные модификации, вызванные петлей, могли смещать гидрофобный F и вызывать нестабильности. Это представлено ниже. Также R106 подвергали мутированию в Q и замещали 27 остатков (109-135), используя GSGSG.
PAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRR136FLGFLLGVG
PAANNQAR GSGSGRi36SLGFLLGVG
Как представлено в табл. 2, все варианты не демонстрировали экспрессию или демонстрировали очень низкую экспрессию, за исключением варианта с короткой петлей GSGSG (F24), которая демонстрировала намного более высокую экспрессию (44 мкг/мл) по сравнению с конструкцией на основе F дикого типа RSV, т.е. подобной конструкцией, но без указанного линкера (F11). F24, который являлся тримерным, был, однако, нестабильным при хранении подобно всем другими вариантам с C-концевым мотивом тримеризации фибритина. Все варианты содержали HIS-метку.
Таблица 2. Экспрессия и стабильность конструкций на основе F RSV с различными линкерами F1-F2
| Белок RSV | Вариант | Описание | Стабильность* | ||||
| Мотив тримеризации | Линкер F1, F2 | Модификации | Точка терминации | Экспрессия (мкг/мл) | |||
| Fll | Bl | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | 513 | 2,5 | стабильный |
| F18 | Bl | Фибритин | Отсутствуют | Отсутствует | 513 | 2 | нестабильный |
| F12 | Bl | Фибритин | р27 | КО сайта для фурина | 513 | 0, 1 | нестабильный |
| F15.1 | Bl | Отсутствует | р27 | КО сайта для фурина | 525 | 0,5 | ND |
| F17 | A2 | Фибритин | р27 | КО сайта для фурина | 513 | 0 | ND |
| F2 4 | Bl | Фибритин | Q__GSGSG_S | Отсутствует | 513 | 44 | нестабильный |
| F2 5 | Bl | Фибритин | PIV | Отсутствует | 513 | 0 | ND |
| F2 6 | Bl | Фибритин | G CR | Отсутствует | 513 | 0 | ND |
^Стабильность определяли, как описано в примере 8. Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1.
Затем наиболее подходящие модификации комбинировали для поиска оптимальных Fполипептидов перед слиянием. Комбинации получали из вариантов с петлей GSGSG, C-концевым усечением F1 и добавлением мотива фибритина (SEQ ID NO: 4) или изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3) (см. табл. 3).
Экспрессия и стабильность конструкций на основе F RSV с комбинациями оптимизаций согласно табл. 1 и 2
- 14 034653
Таблица 3
| Белок RSV | Вариант | Точка терминации | Описание | Стабильность эпитопа CR9501) | |||
| Мотив тримеризации | Линкер F1, F2 | (мкг/мл) | Термоста- бильность (°C) | Хранение | |||
| F11 | В1 | 513 | Отсутствует | Отсутствует | 2,5 | 48 | Стабильный |
| F2 3 | В1 | 495 | Изолейциновая застежка (S) | Отсутствуют | 0,3 | ND | Стабильный |
| F2 4 | В1 | 513 | Фибритин | Q__GSGSG_S | 44 | 51 | Нестабильный |
| F45 | В1 | 495 | Фибритин | Отсутствуют | 0 | ND | ND |
| F44 | В1 | 495 | Фибритин | Q__GSGSGJS | 0 | ND | ND |
| F4 9 | В1 | 495 | Отсутствует | Отсутствует | 2 | ND | Стабильный |
| F50 | А2 | 495 | Отсутствует | Отсутствует | 2 | ND | Стабильный |
| F43 | В1 | 495 | Изолейциновая застежка (S) | Q__GSGSG_S | 0,4 | 53 | Стабильный |
| F47 | А2 | 495 | Изолейциновая застежка (S) | Q__GSGSGJS | 5 | 52 | Стабильный |
| F56 | В1 | 513 | Изолейциновая застежка (S) | Q__GSGSGJS | 0,4 | ND | Стабильный |
| F4 6 | В1 | 513 | Изолейциновая застежка (S) | Отсутствуют | 0 | ND | Нестабильный |
| F42 | В1 | 513 | Отсутствует | Q__GSGSG_S | 20 | 54 | Стабильный |
| F57 | А2 | 513 | Отсутствует | Q__GSGSGJS | 2-10 | 54 | Стабильный |
ND - не определено.
*Стабильность при хранении, как определяли в примере 8. *Термостабильность, как определяли в примере 9. Уровень экспрессии определяли с помощью вестерн-блоттинга (описано в примере 1).
Добавление петли GSGSG всегда повышало экспрессию функциональных конструкций, а также термостабильность белка. Комбинация петли GSGSG с усеченным F и мотивом изолейциновой застежки (S) (F43, F47) продемонстрировала высокую экспрессию, термостабильность и значительную стабильность в хранении при 4°С. Однако эти варианты были по-прежнему мономерными. Мотив тримеризации с изолейциновой застежкой (S) демонстрировал более высокую экспрессию с вариантом F, который представлял собой F, усеченный на C-конце в положении 495 (сравните F43 с F56 и F23 с F46). В противоположность этому, для вариантов с доменом тримеризации фибритина усечение в положении 513 продемонстрировало высокую экспрессию по сравнению с усечением в положении 495, которое не демонстрировало экспрессии (сравните F24 с F44).
Поскольку HIS-метка могла нарушать нативный фолдинг тримеров, то конструировали варианты без HIS-метки для фибритина и вариант изолейциновой застежки (S) (табл. 4).
Таблица 4. Экспрессия и стабильность конструкций на основе F RSV с HIS-меткой и без HIS-метки
| Белок RSV | Вариант | Мотив тримеризации | Линкер F1, F2 | Точка терми- нации | Экспресс- сия мкг/мл | % тримери- зации | Термостабильность (°C) | Хранение | Метки |
| F2 4 | В1 | Фибритин | Q__GSGSG_S | 513 | 44 | Тримерный (SEC) | 51 | нестабильный | His-метка |
| F24- | В1 | Фибритин | Q__GSGSG_S | 513 | 55 | 100% (нативный) | ND | нестабильный | Отсутствует |
| F47 | А2 | Изолей- циновая застежка (S) | Q__GSGSG_S | 495 | 5 | 0% (Odyssey) | 52 | стабильный | His-метка |
| F47- | А2 | Изолей- циновая застежка (S) | Q__GSGSG_S | 495 | 10 | 2-5% (Odyssey) | 53 | стабильный | Отсутствует |
| A2_F24 | А2 | Фибритин | Q__GSGSGJS | 513 | 5,3 | Тримерный (нативный) | 48,75 | нестабильный | Отсутствует |
*Стабильность при хранении определяли, как описано в примере 8; термостабильность определяли, как описано в примере 9; Н.о.: не определено.
- 15 034653
Удивительным являлось то, что делеция HIS-метки повышала экспрессию в F47. Более того, для F47 она немного повышала содержание тримеров и для F24 она умеренно повышала только уровень экспрессии.
Затем, изучали несколько альтернативных доменов тримеризации и усечений в комбинации со стабилизированным петлей GSGSG вариантом F (F47) (см. табл. 5). Все варианты имеют петлю GSGSG и содержат HIS-метку.
Таблица 5. Экспрессия и стабильность вариантов на основе F RSV с альтернативными доменами тримеризации
| Белок RSV | Вариант | Описание | % тримеризации | Связывание антитела | ||||
| Мотив тримеризации | Модификации | Точка терминации | Экспрессия (мкг/мл) | CR9501 | CR9503 | |||
| F47 | А2 | Изолейциновая застежка (S) | Отсутствуют | 495 | 5 | 0% | + | + |
| Р1 | Bl | Изолейциновая застежка (S) | S502T | 502 | 3,5 | 0% | + | + |
| Matl | А2 | Матриллин длинный | Отсутствует | 520 | 12 | три- и гексадимеры | - | + |
| Mat2 | А2 | Матриллин короткий | Отсутствует | 516 | 0 | ND | - | - |
| Mat3 | А2 | Матриллин короткий | Отсутствует | 495 | 1,5 | ND | - | - |
| Оптимизированный GCN | А2 | Оптимизированный GCN4II | Отсутствует | 516 | 0 | ND | - | - |
| Оптимизированный GCN+L512K | А2 | Оптимизированный GCN4II | L512K | 516 | 1 | ND | + | - |
Связывание антитела определяли, как связывание в день сбора клеток (как описано в примере 8;
+ указывает связывание; - указывает отсутствие связывания.
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1. ND: не определено.
Только домен матриллина 1 (Dames-SA et. al., Nat. Struc. Biol., 5(8), 1998), который содержит и Nконцевой домен застежки, и C-концевую часть с остатками цистеина, которые могут потенциально образовывать дисульфидные мостики между тримерами, как было обнаружено, способен к более высоким уровням экспрессии, чем F47 (табл. 5, матриллин длинный). Более того, вариант с мотивом тримериации длинного матриллина демонстрирует тримерные F-белки. Продукт, однако, не связывался со специфическим Mab CR9501 перед слиянием и также демонстрировал гексамерные молекулы, которые делают домен тримеризации матриллина 1 не подходящим для получения тримерного нативного F-белка. Никакой из мотивов застежки на основе матриллина или на основе GCN4II не демонстрировал повышенной экспрессии или стабильности по отношению к F47 (табл. 5, матриллин короткий, GCN4IIоптимизированный). Снова усечение на 495 приводит к более высоким уровням экспрессии. Добавление мотива GCN4, который содержал оптимизированную триггерную последовательность, не продемонстрировало экспрессии.
GCN4 II представляет собой домен тримеризации, который успешно используют для стабилизации тримера вируса парагриппа типа 5 перед слиянием (Yin et al., Nature 439:38-44, 2006) и его испытывали другие для стабилизации F RSV перед слиянием (как раскрыто, например, в WO2010/149743, WO2010/14975, WO2009/079796, WO2010/158613). Домен тримеризации GCN4II оценивали и сравнивали с другими конструкциями, которые содержат домен изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3) или домен фибритина (SEQ ID NO: 4) (результаты представлены в табл. 6). Эти варианты также сравнивали с другими модификациями, т.е. коротким линкером на основе одной мутации лизина и L512K. Все варианты содержали HIS-метку.
- 16 034653
Таблица б.Экспрессия и стабильность вариантов F RSV с замещением GCN4II, L512K и p27 (один аминокислотный линкер (K) между F1 и F2)
| Белок RSV | Вариант | Описание | Стабильность | |||||
| Мотив тримериз ации | Линкер F1, F2 | Модификации | Точка терминации | Экспрессия (мкг/мл) | Термостабильность (оС) | Хранение* | ||
| F18 | В1 | Фибритин | Отсутствуют | Отсутствует | 513 | 2 | ND | нестабильный |
| F24 | В1 | Фибритин | Q__GSGSG_S | Отсутствует | 513 | 44 | 51 | нестабильный |
| F43 | В1 | Изолейциновая застежка (S) | Q__GSGSG_S | Отсутствует | 495 | 0, 4 | 53 | стабильный |
| Р1 | В1 | Изолейциновая застежка (S) | Q__GSGSG_S | S502T | 502 | 3, 5 | 54 | ND |
| F42 | В1 | Отсутствует | Q__GSGSG_S | Отсутствует | 513 | 16,1 | 54 | стабильный |
| Р2 | В1 | Отсутствует | К | Отсутствует | 513 | 14,3 | 54 | стабильный |
| РЗ | В1 | GCN4II | Отсутствует | L512K | 516 | 0 | ND | ND |
| Р4 | В1 | GCN4II | К | L512K | 516 | 0 | ND | ND |
| Р5 | В1 | GCN4II | К | L512K | 516 | 0 | ND | ND |
| Р6 | А2 I | GCN4II | К | L512K | 516 | 0 | ND | ND |
| Р7 | А2 II | GCN4II | К | L512K | 516 | 0 | ND | ND |
Стабильность при хранении определяли, как описано в примере 8; уровни экспрессии определяли, как описано в примере 1; термостабильность определяли, как описано в примере 9; ND: не определено.
Короткая связь между F1 и F2, по-видимому, сопоставима с петлей GSGSG. Добавление мотива GCN4II не приводит в результате к какой-либо экспрессии F-белка в какой-либо из исследованных конструкций (т.е. ни в последовательности F RSV A2, описанной в WO2010/149743 или WO2010/149745, ни в последовательности A2 F вируса RSV, используемой в соответствии с настоящим изобретением, ни в последовательности B1 F вируса RSV).
Было показано, что введение этих двух типов модификаций, т.е. введение связывающей последовательности и гетерологического домена тримеризации, было недостаточно для обеспечения экспрессии стабильного тримерного F-белка перед слиянием. Помимо этих двух основных участков нестабильности, которые были стабилизированы, т.е. HRB и пептида слияния, как описано выше, другие участки в Fбелке перед слиянием также способствуют значительному рефолдингу и/или вносят значительный рефолдинг в F после слияния, и можно оптимизировать больше положений в последовательности для остановки рефолдинга F-белка перед слиянием. Таким образом, разные аминокислотные остатки в домене HRA и HRB и во всех доменах, которые контактируют с этими участками в F перед слиянием, подвергали мутированию для повышения структурной стабильности перед слиянием, как описано в следующих примерах.
Пример 2. Получение стабильных F-полипептидов RSV перед слиянием стабилизирующие мутации.
Поскольку содержание тримеров (для конструкции F47) и стабильность при хранении (для конструкции F24) не были оптимальными, создавали дополнительные варианты, которые содержали точечные мутации для повышения уровней экспрессии, стабильности и нативной тримерной структуры. Результаты представлены в табл. 7 и 8.
Таблица 7. Экспрессия и стабильность F47- вариантов
| Белок RSV | Экспрессия (мкг/мл) | % тримеризации | Термостабильность (°C) |
| F47- | 10 | 2-5% | 53 |
| F47- + K465E | 6 | 2,4% | ND |
| F47- + D479K | 5 | 29% | 50,77 |
| F47- + K176M | 13 | 5% | ND |
| F47- + K209Q | 9 | 3% | 52,9 |
| F47- + S46G | 38 | 11% | 59, 38 |
| F47- + S215P | 8 | 1-2% | 57,21 |
| F47- + N671 | 15 | 2% | 59, 84 |
| F47- + K465Q | 18 | 2% | 54,3 |
| F47- S46G+N67I | 31 | 6% | >60 |
| F47- S46G+S215P | 38 | 6% | >60 |
| F47- K465Q+K209Q | 12 | 1% | 53,3 |
| F47- K465Q+S46G | 28 | 7% | 57,7 |
| F47- K465Q+N67I | 17 | 2% | 59 |
| F47- K209Q+N67I | 15 | 4% | >60 |
| F47- K209Q+S215P | 15 | 2% | 56, 7 |
- 17 034653
ND: не определено; уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1. Термостабильность определяли, как описано в примере 9.
Номенклатура мутаций на основе последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 1).
Все конструкции являются вариантами F47- : тип A2, мотив изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3), линкер GSGSG; точка терминации 495, без HIS-метки (SEQ ID NO: 16). Как представлено в табл. 7, многие мутации повышали экспрессию F47-, но только вариант F47_S46G одновременно демонстрировал более высокий уровень тримеров, помимо высокой экспрессии.
В табл. 8 представлены результаты экспрессии и стабильности вариантов для F24. Все варианты представляли собой RSV типа A2, с мотивом фибритина, линкером GSGSG; точкой терминации 513, без HIS-метки.
Т аблица 8. Экспрессия и стабильность вариантов A2_F24- (SEQ ID NO: 19)
| Белок RSV | Экспрессия (мкг/мл) | Хранение | |
| Конечная точка | Фаза ассоциации | ||
| A2_F24 | 5, 3 | 69 | ND |
| A2_F24 K508E | 5, 3 | 64 | ND |
| A2_F24 K498E | 1,7 | ND | ND |
| A2_F24 E487I | 25, 0 | 10 | ND |
| A2_F24 E487K | 7,1 | ND | ND |
| A2_F24 E487N | 42,4 | 22 | ND |
| A2_F24 E487P | 12,8 | 46 | ND |
| A2_F24 E487Q* | 14,8 | 50 | ND |
| A2_F24 E487R | 8,7 | 59 | ND |
| A2_F24 E487S | 6, 7 | 46 | ND |
| A2_F24 E487Y | 10,5 | 36 | ND |
| A2_F24 D486N | 31,2 | 19 | ND |
| A2_F24 D479N | 5, 2 | ND | ND |
| A2_F24 D479K | 1,5 | 62 | ND |
| A2_F24 E472Q | 1,9 | ND | ND |
| A2_F24 E472K | 0, 9 | ND | ND |
| A2_F24 K465E | 14,8 | 76 | ND |
| A2_F24 K465Q* | 13, 6 | 92 | Нестабильный |
| A2_F24 E463K | 3, 1 | ND | ND |
| A2_F24 E463Q | 6, 0 | ND | ND |
| A2_F24 G430S | 4,8 | ND | ND |
| A2_F24 N428R | 5, 2 | 35 | ND |
| A2_F24 N426S | 18, 6 | 71 | ND |
| A2_F24 K421N | 9, 2 | 75 | ND |
| A2_F24 E328K | 9, 5 | 21 | ND |
| A2_F24 T311S | 3,5 | 70 | ND |
| A2_F24 I309V | 11,3 | 69 | ND |
| A2_F24 D269V | 0, 0 | ND | ND |
| A2_F24 S215P* | 18,7 | 99 | Стабильный |
- 18 034653
| A2_F24 K209Q | 31,4 | 63 | ND |
| A2_F24 V207P | 3,3 | 79 | ND |
| A2_F24 I206P | 5, 4 | 55 | ND |
| A2_F24 L204P | 5, 9 | ND | ND |
| A2_F24 L203P | 0, 8 | ND | ND |
| A2_F24 Q202P | 4,4 | ND | ND |
| A2_F24 K201Q | 21,3 | 62 | ND |
| A2_F24 D194P | 1,9 | ND | ND |
| A2_F24 L193P | 6, 5 | 42 | ND |
| A2_F24 V192P | 0, 6 | 32 | ND |
| A2_F24 V185N | 50,2 | 38 | ND |
| A2_F24 GV184EG | 3,5 | ND | ND |
| A2_F24 G184N | 59, 8 | 37 | ND |
| A2_F24 V178P | 14,8 | 23 | ND |
| A2_F24 A177P | 2,0 | ND | ND |
| A2_F24 K176M | 14,7 | 58 | ND |
| A2_F24 K176E | 0,7 | ND | ND |
| A2_F24 N175P | 34,3 | 55 | ND |
| A2_F24 S169P | 0,5 | ND | ND |
| A2_F24 K168P | 0, 1 | ND | ND |
| A2_F24 K166P | 12,3 | 45 | ND |
| A2_F24 V157P | 0,2 | ND | ND |
| A2_F24 E92D | 47,4 | 94 | Нестабильный |
| A2_F24 K85E | 1, 1 | ND | ND |
| A2_F24 K80E | 51,9 | 60 | ND |
| A2_F24 K77E | 22,4 | ND | ND |
| A2_F24 N671* | 89, 8 | 101 | Стабильный |
| A2_F24 I57V | ND | ND | |
| A2_F24 VI56IV | 16, 5 | 54 | ND |
| A2_F24 S46G* | 40,7 | 96 | Нестабильный |
Помеченные * конструкции подвергали тестированию в отношении тримеризации, и было установлено, что все являлись тримерными.
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1. Стабильность конечного состояния показана здесь как процент связывания антитела (CR9501) перед слиянием после 5 дней хранения при 4°С по отношению к 1 дню; стабильность фазы ассоциации определяли, как описано в примере 10.
Многие мутации повышали экспрессию A2_F24-. Для большинства мутаций наблюдали видимую взаимосвязь между повышенной экспрессией на фоне F47- (табл. 7) и на фоне A2_F24- (табл. 8). N67I оказывала более положительное влияние на экспрессию F на фоне A2_F24-. Наиболее значимого повышения экспрессии достигали с использованием единичных точечных мутаций: S46G, S215P, N67I, K80E, E92D, D486N, G184N, V185N, E487N, N175P, K209Q, E487I, E487Q, K77E, K201Q, N426S и K465Q. При первичном скрининге с помощью анализа конечной стабильности (пример 8) варианты с наиболее высокой экспрессией также демонстрировали лучшую стабильность при хранении (E92D, K465Q, K465E, N426S, S46G, S215P и N67I). Для того чтобы оценить, действительно ли эти мутации стабилизировали конформацию перед слиянием, супернатанты культур разводили до 5 и 10 мкг/мл, исходя из результатов количественного вестерн-блоттинга, и их хранили до 33 дней при 4°С. В качестве точечных мутантов только N67I и S215P были полностью стабильны со временем (см. пример 10).
Затем несколько мутаций, которые демонстрировали высокую экспрессию и надлежащую стабильность конформации перед слиянием, комбинировали для того чтобы оценить, были ли стабилизации аддитивными или имели ли возможный синергетический эффект (табл. 9).
Таблица 9. Экспрессия и стабильность вариантов A2_F24 . с двумя дополнительными мутациями
| Белок RSV | Экспрессия (мкг/мл) | Стабильность* |
| A2_F24 K465Q + S46G | 21, 8 | Нестабильный |
| A2_F24 K465Q + N671 | 122,3 | Стабильный |
| A2_F24 K465Q + E92D | 10, 5 | Стабильный |
| A2_F24 K465Q + S215P | 59, 8 | Стабильный |
| A2_F24 S46G + N671 | 115, 5 | Стабильный |
- 19 034653
| A2_F24 S46G + E92D | 14,3 | Нестабильный |
| A2_F24 N671 + E92D | 134,2 | Стабильный |
| A2_F24 N671 + S215P | 152,1 | Стабильный |
| A2_F24 E92D + S215P | 49, 1 | Стабильный |
| A2_F24 K465Q+S215P | 53,3 | Стабильный |
| A2_F24 S46G+S215P | 43, 8 | Стабильный |
Стабильность при хранении относится к анализу фазы ассоциации, представленной в примере 10. Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1.
Все варианты являлись вариантами F24-: A2 типа, мотив фибритина, линкер GSGSG; точка терминации 513, связывание со всеми Mab, без HIS-метки (SEQ ID NO: 19).
При комбинировании ранее выявленных точечных мутаций можно было наблюдать очень интересные синергетические эффекты в отношении уровней экспрессии с комбинациями, включающими N67I в качестве наиболее эффективной. Все полученные двойные мутанты, независимо от того была ли включена N67I или S215P, были стабильными спустя более 30 дней при хранении при 4°С (пример 10). Неожиданным образом, было установлено, мутация N67I оказывала наиболее сильный эффект на уровни экспрессии F перед слиянием при включении в двойные мутанты. Также комбинации с мутациями S215P приводили к умеренной экспрессии. Сочетание N67I с S215P выбрали, поскольку оно приводило к очень высокому уровню экспрессии, а также потому, что обе точечные мутации были стабильными при хранении. Кроме того, было отмечено, что N67I и S215P обладали способностью стабилизировать некоторые мутанты, которые в качестве единичных мутаций были нестабильными, указывая на то, что участок, где эти две мутации встречались, является центральным для конформационных изменений, которым подвергается белок во время перехода к конформации после слияния.
Таким образом, было показано, что по меньшей мере некоторые мутации приводили в результате к повышенным уровням экспрессии и повышенной стабилизации белка RSV перед слиянием.
Предполагается, что эти явления связаны. Мутации, описанные в этом примере, все в результате приводили к повышенному продуцированию F-полипептидов перед слиянием. Только выбранные из этих полипептидов оставались стабильными при длительном хранении (смотри пример 10). Используемый анализ стабильности основывается на потере специфического эпитопа CR9501 перед слиянием в верхней части F- перед слиянием в анализе связывания и он может быть недостаточно чувствительным для определения всех вкладов в стабильность всего белка. Мутации, для которых наблюдали только повышенную экспрессию, являются, таким образом (вероятно стабилизирующими), потенциальными мутациями, которые можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями для получения Fконструкции перед слиянием с высокой стабильностью и высокими уровнями экспрессии.
Затем проверяли, была ли способна двойная мутация N67I -S215P, подобно единичным мутациям, стабилизировать точечные мутации, которые, как единичные мутации считались нестабильными на основании использованных критериев. Выбирали дополнительные мутации на основе подходящих уровней экспрессии и стабильности в соответствии с табл. 8. Разрабатывали и исследовали в отношении уровней экспрессии и стабильности варианты тройных мутантных RSV-F (табл. 10).
Таблица 10. Экспрессия и стабильность вариантов F24_N67I +S215P с одной дополнительной мутацией
| Белок RSV | Экспрессия (мкг/мл) | Стабильность* |
| А2_Е24 N671 + S215P+K507E | 344, 6 | + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+E487I | 239, 4 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+E487N | 285, 2 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+E487Q | 360,7 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+E487R | 130, 9 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+D486N | 292, 6 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+D479N | 97,1 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+K465Q | 283,3 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+N426S | 316, 3 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+K421N | 288,4 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+K209Q | 245, 0 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+K201Q | 231,9 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+V185N | 445, 1 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+G184N | 326, 7 | + + + |
| А2_Е24 N671 + S215P+E92D | 308,8 | + |
| А2_Е24 N671 + S215P+K80E | 210, 6 | + |
| А2_Е24 N671 + S215P+S46G | 199, 4 | + + + |
- 20 034653
Все варианты были вариантами A2_F24_N67I +S215P A2 типа, мотив фибритина, линкер GSGSG; точка терминации 513, связывание со всеми Mab, без HIS-метки (SEQ ID NO: 21).
Стабильность при хранении относится к анализу фазы ассоциации, представленной в примере 10.
+ означает <10% потерь связывания CR9501 за 5 дней; ++ означает <5% потерь связывания CR9501 за 5 дней; +++ означает 0% потерь связывания CR9501 за 5 дней.
Снова наблюдали аддитивный эффект в отношении уровней экспрессии. Как ожидалось, тройные мутанты D479N и E487R экспрессируют при несколько меньших уровнях, поскольку единичные мутанты также находились среди наиболее низких из выбранных мутаций (табл. 8). В связи со стабилизирующим эффектом мутации N67I+S215P, дополнительные мутации, которые являются нестабильными в качестве единичных мутаций, приводили к образованию стабильных вариантов F перед слиянием при добавлении к фону A2_F24 N67I+S215P. Некоторыми наиболее иллюстративными примерами являются тройные мутанты с дополнительной V185N, G184N или E487N, которые демонстрировали высокую экспрессию, но низкую стабильность в качестве единичных мутантов (табл. 8), но демонстрировали даже более высокую экспрессию и были высокостабильными при добавлении к фону A2_F24 N67I+S215P.
Стабилизирующие мутации также стабилизируют белок RSV-F из других штаммов и также в процессированном варианте F.
Некоторые мутации, которые показали высокий уровень экспрессии и хорошую стабильность конформации перед слиянием, применяли к F-белкам RSV других штаммов и применяли к A2-варианту F вируса RSV без мутаций сайта расщепления фурина (F18: SEQ ID NO: 71) для оценки, являются ли модификации универсальным решением для стабилизации F RSV перед слиянием (табл. 11).
Таблица 11. Экспрессия и стабильность вариантов A2_F18 с дополнительными мутациями и F из штамма
B1 (SEQ ID NO: 2) и CL57-v224 типа A (SEQ ID NO: 69)
| Белок RSV | Seq ID | Относительная* экспрессия (CR9503) | Стабильность** через 5 дней, |
| A2_F18 | 71 | 0, 018 | 0, 0 |
| A2_F18 N671 | 0,449 | 73,2 | |
| A2_F18 S215P | 0, 129 | 9, 1 | |
| A2_F18 E487Q | 0, 006 | ΝΑ | |
| A2_F18 N671, S215P | 72 | 0,484 | 103,4 |
| A2_F18 N671, E487Q | 0,340 | 92,1 | |
| A2_F18 N671, S215P, E487Q | 76 | 0,355 | 92,7 |
| A2_F18 N671, S215P, E92D | 78 | 0,318 | 96, 0 |
| A2_F18 N671, S215P, D4 8 6N | 79 | 0,522 | 101,3 |
| A2_F18 N671, S215P, K201N | 77 | 0, 643 | 102,7 |
| A2_F18 N671, S215P, K66E | 0, 800 | 103, 0 | |
| A2_F18 N671, S215P, S46G, K66E | 0, 820 | 103,5 | |
| A2_F18 N671, S215P, E487Q, K66E | 0,704 | 99, 5 | |
| A2_F18 N671, S215P, E92D, K66E | 0, 905 | 98,8 | |
| A2_F18 N671, S215P, D486N, K66E | 0,863 | 96, 6 | |
| A2_F18 N671, S215P, K201N, K66E | 1,021 | 105, 5 | |
| A2_F18 N671, S215P, D486N, K66E, I76V | 0,594 | 95, 0 | |
| Bl_ N671, S215P | 73 | 0, 434 | 90, 9 |
| Bl_ N671, S215P петлевой | 22 | 0, 552 | 108,2 |
| CL57v224_ N671, S215P | 74 | 0, 698 | 94,9 |
| CL57v224_ N671, S215P петлевой | 75 | 0, 615 | 98,4 |
- 21 034653
Экспрессию белка (концентрацию в супернатанте временно трансфицированных клеток) определяли с помощвю количественной методики Octet.
* Относителвная экспрессия нормализована к экспрессии A2_F24_N67I, S215P, E487Q (seq ID #33) ** Стабильность - выражают в виде % концентрации белка, определенного после хранения при 4°С в течение 5 дней, относителвно дня сбора клеток. Концентрации измеряли количественной методикой Octet, используя антитело CR9501. NA -данные не доступны: не обнаружено никакого связывания CR9501.
Когда ранее идентифицированные точечные мутации были введены в A2_F18 (SEQ ID NO. 71), стабильность и уровни экспрессии были очень схожи, по сравнению с одноцепочечным F24 (SEQ ID NO. 21) вариантом, который содержал короткую петлю между F1 и F2. Снова наблюдали синергизм, демонстрируя более высокую экспрессию и стабильность при добавлении мутаций к вариантам, которые содержали N67I или двойную мутацию N67I, S215P. Двойная точечная мутация N67I, S215P не только стабилизировала F перед слиянием штамма A2, но также F перед слиянием штамма B1 и CL57-v224 (табл. 11).
Стабилизирующие мутации также стабилизируют полноразмерный белок RSV-F.
Несколько мутаций, которые демонстрировали высокую экспрессию и значительную стабильность конформации перед слиянием в растворимой версии RSV-F, соответствующей эктодомену, использовали по отношению к полноразмерному белку RSV-F. Мутации вводили в полноразмерный RSV-F с наличием или без мутаций в сайте отщепления фурином. K этим вариантам не были присоединены никакие домены тримеризации (табл. 12).
Таблица 12. Экспрессия и стабильность вариантов полноразмерных версий A2_F18 и A2_F24 с дополнительными мутациями
| 1 | Вариант F-белка RSV* | Свойства | |||||
| Аминокислотные замены | SEQ ID No | Линкер Fl, F2 | Экспрессия, кратность увеличения* * | Термостабильность*** | |||
| Нет | (F А2 дикого типа, полноразмерный) | 1 | отсутствует | 1 | - | ||
| N671 | отсутствует | 1,4 | N.D. | ||||
| S215P | отсутствует | 1,4 | N.D. | ||||
| E92D | отсутствует | 1,4 | N.D. | ||||
| N671 | , K465Q | отсутствует | 1,4 | N.D. | |||
| N671 | , S46G | отсутствует | 0,2 | N.D. | |||
| N671 | , E92D | отсутствует | 1,4 | N.D. | |||
| N671 | , К80Е | отсутствует | 2,3 | N.D. | |||
| N671 | , G184N | отсутствует | 1,5 | N.D. | |||
| N671 | , V185N | отсутствует | 1,4 | N.D. | |||
| N671 | , E487Q | отсутствует | 2,5 | N.D. | |||
| N671 | , S215P, | V18 5N | отсутствует | 2,7 | N.D. | ||
| N671 | , S215P, | К508Е | отсутствует | 3, 0 | N.D. | ||
| N671 | , S215P, | К80Е | отсутствует | 3, 1 | N.D. | ||
| N671 | , S215P, | K465Q | отсутствует | 2,9 | N.D. | ||
| N671, | , S215P | 80 | отсутствует | 2,4 | + + | ||
| N671, | , S215P, | G184N | отсутствует | 7, 6 | + + | ||
| N671, | , S215P, | E92D | 82 | отсутствует | 6, 8 | N.D. | |
| N671, | , S215P, | S46G | 88 | отсутствует | 6, 8 | + | |
| N671, | , S215P, | D4 8 6N | 86 | отсутствует | 5, 9 | + + + | |
| N671, | , S215P, | E487Q | 84 | отсутствует | 6, 2 | N.D. | |
| N671, | , S215P, | S46G, | К66Е | отсутствует | 12,1 | + + + | |
| N671, | , S215P, | D486N, | К66Е | отсутствует | 9, 2 | + + + | |
| N671, | , S215P, | S46G, | E92D, К66Е | отсутствует | 11,8 | + + + | |
| N671, | , S215P, | S46G, | E487Q, К66Е | отсутствует | 11,0 | + + + | |
| N671, | , S215P, | S46G, | D486N, К66Е | отсутствует | 10,5 | + + + | |
| N671, | , S215P, | D486N, | К66Е, I76V | отсутствует | 7,2 | + + + | |
| N671, | , S215P, | S46G, | К66Е, I76V | отсутствует | 9, 7 | + + + | |
| N671, | , S215P, | S46G, | К80Е | отсутствует | 4,5 | N.D. | |
| N67I+S215P+G184N+K80E+E92D+E487Q+S46G | отсутствует | 9, 1 | N.D. | ||||
| Отсутствует | Q__GSGSGJS | 3, 8 | - | ||||
| N671, | , S215P | 81 | Q__GSGSG_S | 6,2 | N.D. | ||
| N671, | , S215P, | G184N | Q__GSGSG_S | 7,2 | + + | ||
| N671, | , S215P, | E92D | 83 | Q__GSGSGJS | 5, 9 | N.D. | |
| N671, | , S215P, | S46G | 89 | Q__GSGSGJS | 5, 3 | + + | |
| N671, | , S215P, | D4 8 6N | 87 | Q__GSGSGJS | 5, 2 | + + + | |
| N671, | , S215P, | E487Q | 85 | Q__GSGSG_S | 4, 6 | N.D. |
- 22 034653
| N671, S215P, S46G, К66Е | Q__GSGSG_S | 11,7 | + + + | |
| N671, S215P, D486N, К66Е | Q__GSGSG_S | 13, 8 | + + + | |
| N671, S215P, D486N, К66Е, I76V | Q__GSGSGJS | 6, 8 | + + + | |
| N67I+S215P+G184N+K80E+E92D+E487Q+S46G | Q__GSGSGJS | 3, 6 | N.D. |
Уровень экспрессии определяли с помощью FACS. N.D. - не определено.
*все варианты основаны на последовательности F-белка RSV A2.
** по сравнению с белком дикого типа кратность увеличения MFI в отношении 9503.
Стабильность определяли с помощью тепловой обработки клеток HEK293T в течение 5-10 мин при 46, 55,3, 60°С.
*** обозначение для данных стабильности.
- снижение связывания к специфическому Mab CR9501 перед слиянием, после нагревания до 46°С (например, дикого типа).
+ небольшое снижение связывания CR9501 после нагревания до 46°С, но не в той же степени, как дикого типа.
++ никаких изменений в связывании CR9501 после нагревания до 60°С, при 60°С небольшое снижение в связывании CR9501.
+++ никаких изменений в связывании CR9501 после нагревания до 60°С.
Ранее выявленные стабилизирующие точечные мутации также были стабилизирующими в полноразмерном F-белке. Повышение уровня экспрессии было менее выраженным, но демонстрировало ту же тенденцию. Это может быть вызвано различным фоном, при котором вводили мутации, но причина может также быть в различной методике количественной оценки (FACS по сравнению с вестернблоттингом) и биологическим максимумом экспрессии вследствие рециклинга поверхностных белков. Введение связывающей последовательности (или короткой петли) повышало экспрессию и стабильность, и точечные мутации оказывали то же действие. Точечные мутации не были или вряд ли были синергетическими с короткой петлей (подобно тому, как было обнаружено для растворимого белка (табл. 9-11).
Поскольку точечная мутация в положении 67 оказывала такой положительный эффект в отношении уровня экспрессии и стабильности, все аминокислотные замены исследовали в отношении этого положения для изучения того, были ли выбраны наиболее оптимальные положения или можно было бы улучшить эти положения (табл. 13).
Таблица 13. Анализ полной замены экспрессии и стабильности для положения 67 на фоне A2 F24
| Аминокислотная замена | Относительная экспрессия* |
| N67A | 1, 696 |
| N67C | 1,759 |
| N67D | 1,702 |
| N67E | 1,357 |
| N67F | 2,565 |
| N67G | 0, 853 |
| N67H | 1,509 |
| N671 | 3,773 |
| N67K | 0,487 |
| N67L | 3, 609 |
| N67M | 2,579 |
| N67P | 2,414 |
| N67Q | 0, 955 |
| N67R | 0,523 |
| N67S | 1,277 |
| N67T | 1,577 |
| N67V | 2,457 |
| N67W | 1,794 |
| N67Y | 1,830 |
| Стабильность** через 4 дня, % | Стабильность** через 10 дня, |
| 0, 0 | 0, 0 |
| 16, 7 | 0, 0 |
| 0, 0 | 0, 0 |
| 0, 0 | 0, 0 |
| 102,2 | 108,1 |
| NA | NA |
| 0, 0 | 0, 0 |
| 98,2 | 102,7 |
| NA | NA |
| 107,5 | 96, 4 |
| 87,3 | 78,7 |
| 14,3 | 0, 0 |
| NA | NA |
| NA | NA |
| 0, 0 | 0, 0 |
| 0, 0 | 0, 0 |
| 84,2 | 77,0 |
| 99, 9 | 104,3 |
| 61,3 | 45, 8 |
* Относительная экспрессия - концентрацию белка измеряли количественной методикой Octet с использованием антитела CR9503, и выражали по отношению к концентрации A2_F24 (SEQ ID #19) ** Стабильность - выражают в виде % концентрации белка, определенного после хранения при 4°С в течение 5 и 10 дней, относительно дня сбора клеток. Концентрации измеряли количественной методи- 23 034653 кой Octet, используя антитело CR9501. NA - данные не доступны: не обнаружено никакого связывания CR9501.
Как представлено в табл. 13, преимущественно гидрофобные остатки и, в частности, Ile, Leu и Met в положении 67 могли повышать экспрессию и стабильности. Не представляет собой остаток, который в наибольшей степени повышал экспрессию и стабильность. Остатки Glu и Gln, самый маленький остаток Gly и положительно заряженные остатки Arg и Lys обладали наибольшим дестабилизирующим эффектом в положении 67 в отношении конформации перед слиянием.
Пример 3. Приготовление стабильных F-полипептидов RSV перед слиянием в соответствии с настоящим изобретением.
В исследовании, которое привело к данному изобретению, дополнительно стабилизированные варианты растворимого F-белка (sF) перед слиянием были разработаны посредством стабилизирования двух основных областей, которые инициируют повторную укладку. Первая стратегия заключается в предотвращении повторной укладки области HRA в суперспираль. Вторая стратегия заключалась в постройке дисульфидных мостиков N-концевой части HRB для предотвращения перемещения HRB с целью формирования связки из шести спиралей путем докинга на суперспираль HRA.
Конструкции исследовали в отношении уровней экспрессии, стабильности при хранении и связывания с антителом CR9501. Аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепи и CDR тяжелой и легкой цепи этого антитела приведены ниже. CR9501 содержит связывающие участки антител, обозначенных как 58C5 в WO2012/006596.
Конструкции синтезировали и оптимизировали по кодонам в Gene Art (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Конструкции клонировали в pCDNA2004 или создавали при помощи стандартных способов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР, и секвенировали. Используемой системой экспрессии были клетки 293Freestyle (Life Technologies). Клетки временно трансфицировали с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя и культивировали в течение 5 дней при 37°С и 10% CO2. Супернатант культуры собирали и центрифугировали в течение 5 минут при 300 g для удаления клеток и клеточного дебриса. Отцентрифугированный супернатант затем фильтровали в стерильных условиях с помощью 0,22 мкм вакуумного фильтра и хранили при 4°С до использования.
Супернатанты с 5 дня оценивали в отношении экспрессии F-белка с помощью вестерн-блоттинга, используя моноклональное антитело CR9503, которое содержит вариабельные участки тяжелой и легкой цепи антитела к F RSV мотавизумаб (обозначенного как CR9503). Приблизительные уровни экспрессии конструкций F-белка RSV перед слиянием определяли с использованием CR9503, вторичного антитела, конъюгированного с IR-красителем, к иммуноглобулину человека (Li-Cor, Линкольн, Небраска) или HRP-конъюгированного мышиного антитела к IgG человека (Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания). Затем определяли количества белка с помощью серии разбавлений очищенного стандартного белка RSV, или визуально на глаз, или с использованием системы Odyssey CLx для инфракрасной визуализации. Чтобы оценить стабильность конструкции и определить положительные или отрицательные стабилизирующие эффекты введенных мотивов тримеризации, конструкции были протестированы на связывание со специфическим антителом перед слиянием после 5, 14 или 30 дней хранения при 4°С. Эта процедура подробно описана в примере 10.
Затем, наиболее подходящие модификации комбинировали для поиска оптимальных Fполипептидов перед слиянием. Комбинации получили из вариантов с петлей GSGSG, C-концевым усечением F1 и добавлением фибритина (SEQ ID NO: 4). Получили варианты, которые содержали точечные мутации, с целью увеличения уровней экспрессии, стабильность и нативную тримерную структуру. Все варианты представляли собой RSV типа A2, с мотивом фибритина, линкером GSGSG; точкой терминации 513, без HIS-метки.
В соответствии с настоящим изобретением мутации аминокислот, которые стабилизируют конформацию F-белка RSV перед слиянием, можно группировать в различные категории, которые стабилизируют конформацию различным образом.
Аминокислотные остатки 161, 173, 174, 182 и 214.
Для рефолдинга из конформации перед слиянием в конформацию после слияния участок между остатком 160 и 215 необходимо преобразовать из сборки спиралей, петель и нитей в длинную непрерывную спираль. Этот участок демонстрирует наиболее существенный структурный переход. Часть этого участка фактически имеет наиболее высокую степень прогнозирования образования альфа-спирали. Фактические спиральные структуры в модели перед слиянием представлены ниже выделением серого цвета. Весь данный участок преобразуется в одну большую спираль, когда он подвергается рефолдингу в конформацию после слияния. В нижней последовательности остатки выделены серым цветом с наиболее высокой степенью прогнозирования образования спирали на основе Agadir (http://agadir.crg.es/). Из этого сравнения ясно, что C-концевая часть, которая содержится в бета-шпильке, соединительная петля и спираль в конформации перед слиянием (остатки 187-202), имеет высокую тенденцию образовывать альфа64 спирали.
- 24 034653
150 160 170 180 190 200 210
SGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVN
KQSC
Hhhhhhhh hhhhhhhhhh sssssss ssssssss hhhhh hhhhh
SGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVN
KQSC
Подчеркнутые остатки имеют плохие углы, согласно карте Рамачандрана.
Последовательность остатков 150-212 RSV-F представлена выше. Во второй строке вторичные структуры верхней строки обозначены h (для спирали) и s (для нитей) на основе кристаллической структуры. Спирали выделены серым затенением. Нижняя строка является той же самой последовательностью, в которой спирали затенены серым цветом на основе свойств спирали последовательности.
Области, которые нужно оптимизировать, являются участками петель между вторичными структурными элементами (спирали и нити) в лабильной HRA белка RSV-F перед слиянием.
Одно из положений в HRA, которое нуждается в оптимизации с целью стабилизирования конформации RSV-F перед слиянием, является положением 161 в витке между спиралями α2 (остатки 148-157) и α3 (остатки 163-172). Есть несколько причин, почему оптимизация этого положения может повысить стабильность этой области:
отрицательный заряд положений витков Glu161 близок к отрицательному заряду Glu163, что приводит к дестабилизирующему отрицательному отталкиванию;
карта Рамачандрана показывает, что остаток 161 имеет плохие/неблагоприятные дигидральные углы;
остаток 161 имеет высокий B-фактор, который отражает высокую мобильность (и предполагает нестабильность);
остатки 160-172 проявляют высокую склонность к спирализации.
В этом примере остаток Glu161 заменили Pro, чтобы уменьшить отрицательное отталкивание, стабилизировать виток и предотвратить его повторную укладку, или остаток Glu161 заменили Gln, чтобы уменьшить отталкивание отрицательного заряда, либо же остаток Glu161 заменили Gly, потому что это допускает широкий диапазон дигидральных углов.
Для области α2 - виток - α2 (остатки 153-168) в базе данных Brookhaven искали структурно гомологичную спираль-виток-спираль из стабильного белка, который не рефолдирует, с тем, чтобы найти остаток, который мог бы заменить неблагоприятный Glu161. В витке из нескольких белков спираль-витокспираль обнаружили высокую структурную гомологию, все белки в гомологичной 161 позиции имели пролин (PDB-коды 2hgs, 3kal, 2o2z, 2zk3 и 2zqp). Согласно выверке, показанной ниже, замена Glu161 на Pro является хорошим структурным решением для стабилизации этого витка и предотвращения его повторной укладки.
AVSKVLHLEGEVNKIK RSV-F HRA 153-168
KVQQELSRPGMLEMLL 2hgs
KIQQELAKPGVLERFV 3kal
SVLPNLLVPGICEAIK 2o2z avSKVLH-LEGEVNKIK RSV-F HRA 153-168
IkTPLVDdLPGAEEAMS lzk3
AVSKVLH-LEGEVNKIK 2zqp
В некоторых вариантах осуществления остаток Ser173 заменили Pro для стабилизации витка и предотвращения его повторной укладки. В некоторых вариантах осуществления остаток Thr174 заменили Pro для стабилизации витка и предотвращения его повторной укладки.
Карта Рамачандрана показывает, что аминокислотный остаток 182 в витке между β3 и β4 тоже имеет плохие/неблагоприятные дигидральные углы. Оптимизация этой позиции может повысить стабильность витка и стабилизировать р-шпильку.
Для области β3 - виток - β4 (остатки 177-189), в базе данных Brookhaven искали структурно гомологичную β-шпильку из стабильного белка, который не рефолдирует, чтобы найти остаток, который мог бы заменить неблагоприятный Ser182. Из-за предполагаемого переноса электронов белка, который имел пролин в гомологичном положении 182, в витке внутри β-шпильки обнаружили высокую структурную гомологию (PDB-код 3me8). Согласно выверке, показанной ниже, замена Ser182 на Pro является хорошим структурным решением для стабилизации этого витка и предотвращения его повторной укладки.
AWSlSNgV-SVLT
VWLsPElQlKDYI
- 25 034653
Образование цистинового мостика в нижней части области головки между остатками 486, 487, 489.
Отрицательно заряженные аминокислотные остатки 486, 487 и 489 являются частью механизма переключения, который контролирует переход между структурами RSV-F перед слиянием и после слияния. Мутация Glu487 в Gln ослабит этот переключатель и стабилизирующий контакт между протомерами в тримере. Эти же положения остатков могут использоваться также для конструирования дисульфидных мостиков между протомерами. Мутации 2 остатков по цистеину, как описано выше, снизят отталкивание отрицательного заряда и обеспечат дисульфидные мостики, которые в дальнейшем стабилизируют тример перед слиянием.
Осуществляли варианты, которые содержали точечные мутации, стабилизирующие витки между вторичными структурными элементами в области HRA белка RSV-F перед слиянием, чтобы увеличить стабильность и уровни экспрессии конформации перед слиянием. Результаты показаны в табл. 14.
Таблица 14. Экспрессия и стабильность вариантов A2 F24- (SEQ ID NO: 19)
| экспрессия | Стабильность | ||
| обозначение белка | по отношению к А2 F24- | день 5-7 | день 30 |
| А2 F24- Е161Р | 2,739 | 75, 08 | 66, 24 |
| А2 F24- E161Q | 0,410 | 133,71 | N.A. |
| А2 F24- E161G | 0,391 | 106,42 | N.A. |
| А2 F24- S173P | 1,182 | 85,78 | N.A. |
| А2 F24- I214P | 0,288 | 80,20 | N.A. |
| А2 F24- Т174Р | 0,448 | 39, 82 | N.A. |
| А2 F24- S182P | 2,296 | 87,19 | N.A. |
| А2 F24- N671 S215P Е161Р | 35,766 | 97, 67 | 100,56 |
| А2 F24- N671 S215P E161Q | 9, 545 | 104,40 | 96, 60 |
| А2 F24- N671 S215P E161G | 12,035 | 93,70 | 81,91 |
| А2 F24- N671 S215P S173P | 21,747 | 103,43 | 71,89 |
| А2 F24- N671 S215P I214P | 8,053 | 99, 47 | 68,17 |
| А2 F24- N671 S215P Т174Р | 5, 431 | N.A. | N.A. |
| А2 F24- N671 S215P S182P | 14,948 | N.A. | N.A. |
Все варианты являются вариантами A2_F24 типа A2, которые содержат фибритиновый мотив и линкер GSGSG между F1 и F2; точку терминации 513, (SEQ ID NO: 19).
Устойчивоств выражается как концентрация белка в %, измеренная по Qoctet (Пример 10) после хранения при 4°С в течение 5-30 дней, относителвно дня сбора клеток. Концентрации измеряли количественной методикой Octet использованием антитела CR9502. NA: данные отсутствуют: не обнаружили никакой связи CR9502-связи.
ND: Не определено.
Из-за отдельных точечных мутаций замена положений 173, 182 и 161, особенно в пролине, привела к повышению уровней экспрессии и стабильности. Снятие заряда остатка 161 стабилизировало белки, но не увеличило уровень экспрессии. Те же точечные мутации давали подобный эффект в стабилизированной F-последовательности перед слиянием, которая содержала дополнительную стабилизирующую мутацию N67I и S215P. Мутация остатка 182, 173 и 161, особенно в пролине, выявила наибольшее увеличение уровней устойчивости и экспрессии.
Мутации E161P, которые проявили высокий уровень экспрессии и хорошую стабильность конформации перед слиянием, применили также к растворимым вариантам A2 F-эктодомена RSV без мутаций в сайте расщепления фурина (F18: SEQ ID NO 71) для оценки, являются ли модификации универсальным решением для стабилизации F RSV перед слиянием (таблица 15).
- 26 034653
Таблица 15. Экспрессия и стабильность вариантов A2_F18 (SEQ ID No: 71) с дополнительными мутациями
| белок RSV | SEQ ID | Относи- тельная экспрессия* | стабильность** после 15 дней (%) |
| A2_F18 | 71 | 0, 1 | 0, 0 |
| A2_F18 N671 | 19, 6 | 29 | |
| A2_F18 S215P | 8,4 | 4 | |
| A2_F18 E487Q | 0, 0 | ND | |
| A2_F18 E161P | 4,2 | 0 | |
| A2_F18 N671, S215P | 72 | 32,1 | 95 |
| A2_F18 N671, E161P | 34,2 | 72 | |
| A2_F18 N671, S215P, E161P | 56, 1 | 79 | |
| A2_F18 N671, S215P, E161P, E487Q | 55,5 | 91 | |
| A2_F18 N671, S215P, E487Q | 76 | 21,8 | 95 |
Экспрессию белка (концентрация в супернатанте временно трансфицированных клеток) определяли с помощвю количественной методики Octet.
* Относителвная экспрессия нормализована по отношению к экспрессии A2_F24_N67I, S215P, E487Q (seq ID #33).
** Стабильность выражается как концентрация белка в %, измеренная по Qoctet (Пример 10) после хранения при 4°С в течение 5 дней, по отношению к дню сбора клеток. Концентрации измеряли количественным методом Octet с использованием антитела CR9501. ND: Не определено.
Мутация E161P также выявила высокий рост уровней экспрессии в обработанном белке RSV-F. В сочетании со стабилизирующими точечными мутациями, например, в положении 67, 215 и 487, мутация E161P привела к вариантам F перед слиянием с высоким уровнем экспрессии и высокой стабильностью.
Образование цистинового мостика в нижней части области головки между остатками 486, 487, 489.
Отрицательно заряженные аминокислотные остатки 486, 487 и 489 являются частью механизма переключения, который контролирует переход между структурами RSV-F перед слиянием и после слияния. Мутация Glu487 в Gln ослабит переключатель и стабилизирует контакт между протомерами в тримере (предыдущий патент P00). Эти же положения остатков могут быть также использованы для конструирования дисульфидных мостиков между протомерами. Мутации 2 остатков цистеина, из которых один является отрицательно заряженным остатком 486, 486 или 489, снизит отталкивание негативного заряда и обеспечит дисульфидные мостики, которые в дальнейшем стабилизируют тример перед слиянием. Некоторые из таких вариантов исследовали на уровень экспрессии и стабильность конформации перед слиянием (табл. 16).
Таблица 16. Экспрессия и стабильность вариантов A2_F24- (SEQ ID NO: 19)
Экспрессия Стабильность
| обозначение белка | по отношению к А2 F24- | день 30 |
| А2 F24 D489C L481C | 0 | |
| А2 F24 D489C V482C | 0 | N.D. |
| А2 F24 D489C D479C | 0 | N.D. |
| А2 F24 D489C Т374С | 0 | N.D. |
| А2 F24 D489C L375C | 0 | N.D. |
| А2 F24 D489C Р376С | 0 | N.D. |
| А2 F24 D489C S377C | 0 | N.D. |
| А2 F24 D489C Т335С | 0 | N.D. |
| А2 F24 D489C D338C | 0 | N.D. |
| А2 F24 D489C S398C | 0 | N.D. |
| А2 F24 D486C Е487С | 0,524 | N.D. |
| А2 F24 D489C D486C | 0, 062 | N.D. |
| А2 F24 N671 S215P D489C D486C | 3, 875 | 76, 02 |
| А2 F24 N671 S215P D489C S398C | 0, 003 | N.D. |
| А2 F24 N671 S215P D486C Е487С | 7,315 | 79, 39 |
- 27 034653
Все варианты являются вариантами A2_F24- типа A2, которые содержат фибритиновый мотив и линкер GSGSG между F1 и F2; точку терминации 513, (SEQ ID NO: 19).
Стабильность выражается как концентрация белка в % по Qoctet (пример 10), измеренная после хранения при 4°С в течение 5-30 дней, относителвно дня сбора клеток. Концентрации измеряли количественным методом Octet с использованием антитела CR9502. На метастабильном фоне F24 (SEQ ID NO: 19), только дисульфидный мостик между остатками 486 и 487 дал в результате белок перед слиянием с приемлемой экспрессией и стабильностью. Поскольку в меж-протомерных дисульфидах нужно правильно выравнивать противоположные боковые цепи, связность дисульфида может быть успешнее в более стабильном F-белке, по сравнению с метастабильным вариантом F24. Таким образом, некоторые из дисульфидов также разработаны в варианте F24, который содержал 2 стабилизирующие мутации N67I и S215P. В самом деле, на стабильном фоне белки со встроенными дисульфидами экспрессировали на гораздо более высоких уровнях. Опять же, вариант с цистеиновыми мутациями в положении 486 и 487 экспрессировался на самом высоком уровне и уровень экспрессии был в 14 раз выше, по сравнению с нестабилизированным вариантом без мутации N67I и S215P. Стабильность протеина в надосадочной жидкости приемлема и все еще содержала 79% конформации перед слиянием. Высокая стабильность может быть достигнута, когда белок очищенный. Стабильность может и не достигать 100%, потому что межпротомерными связями были соединены не 100% цистеинов, как показано на примерах 4 и 5.
Пример 4. Вестерн-блоттинг.
Культуральные супернатанты прогоняли в 4-12% (вес/объем) градиентных гелях Bis-Tris NuPAGE (Life Technology) и проводили блоттинг с помощью технологии iBlot (Life Technology). Эти блоты зондировали с помощью CR9503 (последовательности приведены ниже в табл. 18) и выявляли либо с конъюгированным мышиным антителом против человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания), либо подобием очищенного конъюгированного IRDye800CW против человеческого IgG (кролик) (Rockland Immunochemicals, Гилберствилл, Пенсильвания). На фиг. 1 можно увидеть выражение DM = двойной мутант (N67I + S215P = SEQID 21) и DM + CC = двойной мутант + DE486CC = SEQID 94). Четкое различие между этими двумя белками могли наблюдать, когда анализировали их редуцированными и нередуцированными. При редукции, оба белка мигрируют как мономерные разновидности около 55 кДа. Нередуцированное подавляющее большинство DM по-прежнему находится в виде мономера, в то время как разновидности DM + CC преобладают гораздо больше, причем они преимущественно тримерные. Это доказывает, что замена остатка 486 и 487 в цистеине приводит к тримеру с преимущественно меж-протомерными дисульфидными мостиками.
Пример 5. NativePAGE.
Для исходного определения мультимерного состояния F-полипептидов перед слиянием в соответствии с настоящим изобретением супернатанты культур от временно трансфицированных клеток анализировали в гель-системе NativePAGE Bis-Tris (Life Technologies). Затем гели подвергали блоттингу с использованием iBlot technolog в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies). Специфическое F-белковое RSV-антитело CR9503 (последовательности, приведенные ниже в табл. 18) использовали в качестве первичного зонда для обнаружения F-белка RSV перед слиянием и последующим HRP конъюгированным мышиным антителом против человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch, Вест Гроув, Пенсильвания) или подобием очищенного конъюгированного IRDye800CW против человеческого IgG (кролик) (Rockland Immunochemicals, Гилберствилл, Пенсильвания). Блоты проявляли с использованием стандартной пленки (Codak) или с использованием инфракрасной системы для визуализации Odyssey CLx. На фиг. 2 изображен анализ супернатанта посредством нативного электрофореза в полиакриламидном геле (NativePAGE analysis) из Линии 2: DM = двойной мутант (N67I + S215P = SEQID 21) и Линия 1: DM+CC = двойной мутант + DE486CC = SEQID 5A). И DM, и DM+CC являются, прежде всего, тримерными при нативном электрофорезе, показывая, что введение дисульфидов не может привести к меж-тримерному перекрестному сшиванию. Поскольку DM+CC экспрессируется хуже, чем DM, недостающий мономер (шпилька) может быть из-за того, что он ниже предела обнаружения.
Пример 6. Экспрессия F-белка перед слиянием.
Плазмиды экспрессии, кодирующие рекомбинантный F-белок RSV перед слиянием, создавали с помощью стандартных способов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР. Используемой системой для экспрессии были клетки 293Freestyle (Life Technologies, Ренфрушир, Великобритания). Клетки временно трансфицировали с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя и культивировали во встряхивателе-инкубаторе в течение 5 дней при 37°С и 10% CO2. Супернатант культуры собирали и центрифугировали в течение 5 минут при 300 g для удаления клеток и клеточного дебриса. Отцентрифугированный супернатант затем фильтровали в стерильных условиях с помощью 0,22 мкм вакуумного фильтра и хранили при 4°С до использования.
Пример 7. Очистка F-белка RSV перед слиянием.
Рекомбинантные полипептиды очищали с помощью 2-стадийного протокола очистки с применением катион-обменной колонки для первичной очистки, а затем колонки superdex200 для завершающей стадии с удалением остаточных примесей. Для исходной ионобменной стадии супернатант культуры
- 28 034653 разбавляли 2 объемами по 50 мМ NaOAc, pH 5,0, и пропускали через 5 мл колонку HiTrap Capto S при скорости 5 мл в минуту. Затем колонки отмывали 10 объемами, соответствующими объему колонки (CV), по 20 мМ NaOAc, 50 мМ NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, pH 5 и элюировали 2 CV по 20 мМ NaOAc, 1M NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, pH 5. Элюат концентрировали с помощью концентратора-центрифуги, а затем белок очищали с помощью колонки superdex200 с использованием 40 мМ Tris, 500 мМ NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, pH 7,4, в качестве подвижного буфера. На фиг. 3A представлена хроматограмма с гель-фильтрационной колонки и главный пик содержит F-белок RSV перед слиянием. Фракции, содержащие этот пик, снова объединяли и концентрацию белка определяли при OD280 и хранили при 4°С до использования. На фиг. 3B представлен сокращенный результат анализа SDS-PAGE конечного препарата белка, и можно видеть, что чистота составляла >95%. Идентичность полосы подтверждали с помощью вестерн-блоттинга и специфических к F-белку антител (не показано). Далее, очищенный белок тестировали на нативном электрофорезе (NativePAGE) и сравнивали с контрольным стабильным тримером Fбелка перед слиянием (SEQ ID NO: 21) (фиг. 3C).
Пример 8. Анализ конечной стабильности.
Проверку конформации перед слиянием экспрессируемых полипептидов по настоящему изобретению делали с использованием технологии Octet, с использованием специфических антител CR9501 или CR9502 перед слиянием, или же неструктурированного специфического антитела CR9503, которое содержит изменчивые области с тяжелыми и легкими цепями коммерчески доступного антитела мотавизумаб. Антитела биотинилировали в соответствии со стандартными протоколами и иммобилизовали на стрептавидиновом биосенсоре (ForteBio, Портсмут, Великобритания). Процедура заключалась в следующем. После уравновешивания сенсоров в кинетическом буфере (ForteBio) в течение 60 с чипы переносили в PBS (натрий-фосфатный буфер) с 5 мкг/мл требуемого антитела. Загрузку проводили в течение 250 с. Затем включали другую стадию уравновешивания в течение 200 с в кинетическом буфере. В заключение, чипы переносили в экспрессивный супернатант культуры, содержащий F-полипептиды RSV перед слиянием и через 1200 сек записывали общий сигнал связывания. Эта фаза также обозначается как фазовая ассоциация. Это выполняли непосредственно после сбора клеток (1 день), а также спустя 5 дней (5 день), и разницу в связывании CR9501 использовали в качестве скринингового средства для выявления мутаций, способных стабилизировать конформацию перед слиянием. Конструкцию считали стабильной, если наблюдали менее 20% потери связывания на 5 день, также ее считали стабильной, если она не была признана неустойчивой. Стабильные конструкции затем подвергали более строгому исследованию при необходимости. Анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio).
Пример 9. Анализ термостабильности.
Стабилизирующий потенциал введенных характеристик в F-полипептиды RSV определяли по тепловому стрессу. Для этой цели супернатант культур от временно трансфицированных клеток или очищенный белок нагревали с использованием диапазона температур. Образцы затем охлаждали на льду для предотвращения дополнительных индуцированных теплом конформационных изменений и инкубировали с антителом CR9501 в системе по технологии Octet, как описано в примере 11. Ответы, полученные в конце фазовой ассоциации при различных температурах, изображали на графике в виде функции температуры и приближали с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения Prism. Это приводило к определению температуры, где уровень связывания антител составляет 50% от максимума, и эту величину можно было использовать для сравнения различных конструкций в отношении термостабильности перед слиянием.
Пример 10. Анализ стабильности фазовой ассоциации.
Для оценки стабильности различных точечных мутаций Octet анализ связывания разработали с использованием ассоциативного фазового анализа. Антитело CR9501 или антитело CR9502 использовали в качестве зондов для конформации белка RSV-F перед слиянием. Чтобы уменьшить потенциальное смещение концентрации анализа конечных точек, точки данных были использованы из всей фазы ассоциации эксперимента. Данные восполняли за счет количества связанного антитела на чипе. Измерения выполняли в 1, 5 и 33 дни, и сравнивали формы кривых по этим трем дням. Если получали идентичные кривые, то конструкцию считали стабильной, а если нет, то нестабильной.
Пример 11. Количественный анализ с использованием Octet.
Для определения концентрации F-белка RSV в супернатантах клеточных культур использовали количественный метод на основе Octet. Антитела CR9501 и CR9503 биотинилировали с помощью стандартных протоколов и иммобилизовали на стрептавидиновых биосенсорах (ForteBio, Портсмут, Великобритания). После этого покрытые биосенсоры блокировали в супернатанте ложно-трансфицированных клеточных культур. Количественный эксперимент выполняли следующим образом: температура 30°С, скорость встряхивания 1000 об./мин, время анализа 300 с. Концентрацию белка в супернатанте клеточной культуры рассчитывали с помощью стандартной кривой. Стандартную кривую получали для каждого покрытого антитела с использованием белка A2_F24_N67I+S215P (SEQ ID# 21), разбавленного в супернатанте ложно-трансфицированных клеточных культур. Измерения проводили в день сбора супернатанта (1 день) и после хранения супернатанта при 4°С в течение 5 дней или дольше. Разницу в концен- 29 034653 трации, определенную с помощью CR9501 или CR9502, использовали в качестве скринингового инструмента для выявления мутаций, способных стабилизировать конформацию перед слиянием.
Конструкция считалась стабильной, если наблюдалось менее, чем 20% снижения определяемой концентрации на 5 день. Анализ данных выполняли с помощью компьютерной программы ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio).
Пример 12. Доклиническая оценка иммуногенности F перед слиянием.
Для определения иммуногенности стабилизированного F RSV перед слиянием (A2F24,N67I, S215P) (SEQ ID NO: 21) мышей иммунизировали в соответствии с табл. 19 с 0,5 или 5 мкг в прайм-бустерном режиме на 0 неделе и на 4 неделе. Как представлено на фиг. 4, мыши, иммунизированные F перед слиянием, демонстрировали более высокие титры VNA, чем мыши, иммунизированные F после слияния RSV.
Таблица 19. Схема иммунизации
| Группа | Препарат | Доза | Адъювант | N |
| 1 | Г после слияния | 0,5 мкг | - | 9 |
| 2 | Г после слияния | 5 мкг | - | 9 |
| 3 | Г перед слиянием | 0,5 мкг | - | 9 |
| 4 | Г перед слиянием | 5 мкг | - | 9 |
| 5 | Г после слияния | 0,5 мкг | Поли(I:С) | 9 |
| 6 | Г перед слиянием | 0,5 мкг | Поли(I:С) | 9 |
| 8 | FI-RSV | 1/75 | - | 8 |
| 9 | PBS | - | 3 |
Затем хлопковых крыс иммунизировали двумя различными дозами RSV-F в конформации после слияния и перед слиянием (табл. 20). Животных иммунизировали i.m. на 0 неделе и 4 неделе. На фиг. 5 представлены высокие титры нейтрализующих антител в день контрольного заражения (7 неделя). Таблица 20. Группы, иммуноген и доза для определения иммуногенности и эффективности у хлопковых крыс
| Группа | Препарат | Доза | Адъювант |
| 1 | F после слияния | 0,5 мкг | - |
| 2 | F после слияния | 5 мкг | - |
| 3 | F перед слиянием | 0,5 мкг | - |
| 4 | F перед слиянием | 5 мкг | - |
| 9 | F перед слиянием | 0,5 мкг | Поли IC |
| 10 | F перед слиянием | 5 мкг | Поли IC |
| 11 | F перед слиянием | 0,5 мкг | Фосфатный адъювант |
| 12 | F перед слиянием | 5 мкг | Фосфатный адъювант |
| 13 | Ad2 6.RSV.FA2 | 10Л8 | - |
| 14 | PBS | - | - |
Вирусную нагрузку в легких и носу определяли через пять дней после контрольного заражения (см. фиг. 6). Показано, что F-полипептиды перед слиянием в соответствии с настоящим изобретением способны индуцировать мощный иммунный ответ, который снижал вирусную нагрузку в легких и даже в носу.
- 30 034653
Таблица 17. Стандартные аминокислоты, аббревиатуры и свойства
| Аминокислота | 3- буквенная | 1- буквенная | Полярность боковой цепи | Заряд боковой цепи (pH 7,4) |
| аланин | Ala | A | неполярная | Нейтральный |
| аргинин | Arg | R | полярная | Положительный |
| аспарагин | Asn | N | полярная | Нейтральный |
| аспарагиновая кислота | Asp | D | полярная | Отрицательный |
| цистеин | Cys | C | неполярная | Нейтральный |
| глутаминовая кислота | Glu | E | полярная | Отрицательный |
| глутамин | Gin | Q | полярная | Нейтральный |
| глицин | Gly | G | неполярная | Нейтральный |
| гистидин | His | H | полярная | положительный (10%) нейтральный (90%) |
| изолейцин | He | I | неполярная | Нейтральный |
| лейцин | Leu | L | неполярная | Нейтральный |
| лизин | Lys | К | полярная | Положительный |
| метионин | Met | M | неполярная | Нейтральный |
| фенилаланин | Phe | F | неполярная | Нейтральный |
| пролин | Pro | P | неполярная | Нейтральный |
| серин | Ser | S | полярная | Нейтральный |
| треонин | Thr | T | полярная | Нейтральный |
| триптофан | Trp | W | неполярная | Нейтральный |
| тирозин | Tyr | Y | полярная | Нейтральный |
| валин | Vai | V | неполярная | Нейтральный |
Таблица 18. Аминокислотные последовательности антител CR9501 и CR9502
| Антитело | Домен VH | CDR1 VH | CDR2 VH | CDR3 VH |
| CR9501 | Аминокислоты 1-125 в SEQ ID NO: 53 | GASINSDNYYWT (SEQ ID N0:54) | HISYTGNTY YTPSLKS (SEQ ID N0:55) | CGAYVLISN CGWFDS (SEQ ID N0:56) |
| CR9502 | Аминокислоты 1-121 в SEQ ID N0: 57 | GFTFSGHTIA (SEQ ID N0:58) | WVSTNNGNT EYAQKIQG (SEQ ID N0:59) | EWLVMGGF AFDH (SEQ ID N0:60) |
| Антитело | Домен VL | CDR1 VL | CDR2 VL | CDR3 VL |
| CR9501 | Аминокислоты 1-107 в SEQ ID N0: 61 | QASQDISTYLN (SEQ ID NO: 62) | GASNLET (SEQ ID N0:63) | QQYQYLPYT (SEQ ID N0:64) |
| CR9502 | Аминокислоты 1-110 в SEQ ID N0: 65 | GANNIGSQNVH (SEQ ID N0:66) | DDRDRPS (SEQ ID N0:67) | QVWDSSRD QAVI (SEQ ID N0:68) |
Аминокислотная последовательность нескольких конструкций F RSV перед слиянием приведена ниже. Следует отметить, что нумерация аминокислот в различных конструкциях, описанных в данном
- 31 034653 документе, основана на последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая означает, что все аминокислоты с 1 положения до 108 положения, включительно, конструкций перед слиянием соответствуют положениям аминокислот 1-108 последовательности дикого типа, где нумерация аминокислот с 138 положения до конца смещена на 22 аминокислоты, т.е. L138 в последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 1) соответствует L116 во всех конструкциях перед слиянием. Это связано с тем фактом, что была выполнена делеция в конструкциях перед слиянием, т.е. вставка линкера GSGSG, при этом фактическая нумерация F1 не является одинаковой между конструкциями. Таким образом, нумерация, используемая по отношению к специфическим мутациям в соответствии с настоящим изобретением, например, S215P, относится к положению аминокислоты в последовательности дикого типа.
Последовательности
Полноразмерная последовательность F-белка RSV А2 (SEQ ID
NO: 1)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI
ELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK
KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV
LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM
LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK
LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV
INLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS
NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIA FSN
Полноразмерная последовательность F-белка RSV Bl (SEQ ID
NO: 2)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITI
ELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTK
NLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSV
LTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYM
LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWK
LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV SLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR RSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIA FSK
SEQ ID NO: 3
EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA
SEQ ID NO: 4
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO: 5
GSGSG
F8: RSV A2, эктодомен дикого типа (SEQ ID NO: 13)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI
- 32 034653
ELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK
KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLHHHHHHHH
Fll: RSV Bl, эктодомен дикого типа (SEQ ID NO: 14)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITI ELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTK NLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSV LTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV SLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR RSDELLHHHHHHHH
F47: RSV A2, стабилизированный линкером, IZ(S) (SEQ ID NO
15)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGGIEGRHHHHHHHH
F47-: RSV A2, стабилизированный линкером, IZ(S) (SEQ ID NO
16)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD
- 33 034653
VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGG
F43: RSV Bl, стабилизированный линкером, IZ(S) (SEQ ID NO:
17)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITI ELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQ QSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTD ISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGK NLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGGIEGRHHHHHH
F24: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 18)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITI ELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQ QSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTD ISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGK NLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRHHHHHH
A2_F24: RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ
ID NO: 19)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24-: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID
NO: 20)
- 34 034653
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITI ELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQ QSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTD ISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGK NLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 21)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKJKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24-N67I+S215P: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 22)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITI ELSNIKEJKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQ QSCRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTD ISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGK NLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+E92D: RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 23)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK
- 35 034653
QSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24- N67I+E92D RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 24)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITI ELSNIKEJKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQ QSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTD ISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGK NLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+K465Q RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 25)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGQ SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24- N67I+K465Q RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 26)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITI ELSNIKEJKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQ QSCRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTD
- 36 034653
ISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGQ NLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S46G RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 27)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITI ELSNIKKJKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24- N67I+S46G RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 28)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFGALRTGWYTSVITI ELSNIKEJKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQ QSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTD ISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGK NLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 E92D+S215P: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 29)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
- 37 034653
F24-E92D+S215P: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 30)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITI ELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQ QSCRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTD ISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGK NLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K508E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 31)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKJKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E487I: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 32)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDJFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E487Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 33)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI
- 38 034653
ELSNIKKJKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E487N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 34)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDNFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+D486N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 35)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEEDAS ISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K465E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 36)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL
- 39 034653
MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGE SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K465Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 37)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKJKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGQ SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+N426S: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 38)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASSKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K421N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 39)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTNCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK
- 40 034653
SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K209Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 40)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNQ QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K201Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 41)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDQQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+V185N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 42)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGNSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+G184N: A2, стабилизированный линкером,
- 41 034653 фибритин (SEQ ID NO: 43)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKJKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNNVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+N175P: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 44)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKJKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTPKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E92D: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 45)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K80E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 46)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIEQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG
- 42 034653
SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K77E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 47)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIELIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+S46G: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 48)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV S4 6G A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 4 9)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITI ELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT
- 43 034653
DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV K4 65Q A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 50)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGQ SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV N671 A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 51)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV E92D A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 52)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA
- 44 034653
YVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
Полноразмерная последовательность белка F RSV CL57-v224 (SEQ ID NO: 69)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNI DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LHNVNVGKSTTNIMITTIIIVIIVILLLLIAVGLFLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Эктодомен, RSV CL57-v224 (SEQ ID NO: 70)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNI DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL L
PreF, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 71)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S215P, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 72)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV
- 45 034653
LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S215P, RSV Bl, фибритин (SEQ ID NO: 73)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITI ELSNIKEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTK NLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV SLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR RSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
RSV N671 S215P, RSV CL57-v224, фибритин (SEQ ID NO: 74)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNI DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreFL N671 S215P, RSV Bl, фибритин, петля (SEQ ID NO: 22)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITI ELSNIKEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQ QSCRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTD ISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGK NLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFL
- 46 034653
PreFL N671 S215P, RSV CL57-v224, фибритин, петля (SEQ ID
NO: 75)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQA YVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S215P E487Q, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 76)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S215P K201N, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 77)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDNQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S215P E92D, RSV A2, фибритин (SEQ ID N0:78
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM
- 47 034653
LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S215P D486N, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 79)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
Fwt N671 S215P, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO
80)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIA FSN
Fsl N671 S215P, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO
81)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK
- 48 034653
SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITT
IIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N671 S215P E92D, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 82
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIA FSN
Fsl N671 S215P E92D, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 83)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITT IIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N671 S215P E487Q, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID
NO: 84)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIA
- 49 034653
FSN
Fsl N671 S215P E487Q, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 85)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITT IIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N671 S215P D486N, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 86)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIA FSN
Fsl N671 S215P D486N, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 87)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEEDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITT IIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N671 S215P S46G, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID
- 50 034653
NO: 88)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIA FSN
Fsl N671 S215P S46G, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID
NO: 89)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVG SAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK QSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKL MSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTD VSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGK SLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITT IIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
CR9501, тяжелая цепь (SEQ ID NO: 53):
QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNT YYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
CR9501, легкая цепь (SEQ ID NO: 61):
EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVP SRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CR9502, тяжелая цепь (SEQ ID NO: 57):
EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTE YAQKIQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
- 51 034653
SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
CR9502, легкая цепь (SEQ ID NO: 65):
QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLWYDDRDRPSGIPD RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPP SSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS
PreF N671 E161P S215P E487Q, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO:
90)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLPGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 E161P S215P, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 91)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLPGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S173P S215P, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 92)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLPTNKAWSLSNGVSV LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR
- 52 034653
KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S182P S215P, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 93)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI
ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK
KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLPNGVSV
LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM
LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK
LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV
NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIR
KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S215P D486C E487C, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO:
94)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI
ELSNIKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAK
KTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSV
LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYM
LTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWK
LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEV
NLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSCCFDASISQVNEKINQSLAFIR
KSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
Claims (19)
1. Рекомбинантный полипептид слияния (F) респираторно-синцитиального вируса (RSV) перед слиянием, содержащий по меньшей мере один эпитоп, который является специфичным для конформации F-белка перед слиянием и распознается специфическим моноклональным антителом, содержащим CDR1-участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 54, CDR2-участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 55, CDRS-участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 56 и CDR1-участок легкой цепи SEQ ID NO: 62, CDR2-участок легкой цепи SEQ ID NO: 63 и CDRS-участок легкой цепи SEQ ID NO: 64, и/или специфичным моноклональным антителом, содержащим CDR1-участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 58, CDR2-участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 59, CDR3-участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 60 и CDR1-участок легкой цепи SEQ ID NO: 66, CDR2участок легкой цепи SEQ ID NO: 67 и CDR3-участок легкой цепи SEQ ID NO: 68, где полипептид содержит домен F1 и домен F2, и по меньшей мере одну замену, по сравнению с доменами F1 и F2 дикого типа, выбранную из группы, состоящей из:
(a) замены аминокислотного остатка E в положении 161 в P, Q или G (E161P, E161Q или E161G);
(b) замены аминокислотного остатка S в положении 182 в P (S182P);
(c) замены аминокислотного остатка S, T или N в положении 173 в P (S173P), а также (d) замены аминокислотного остатка D в положении 486 в C (D486C) в комбинации с заменой аминокислотного остатка D в положении 489 в C (D489C) SEQ ID NO: 1 из штамма A2.
2. F-полипептид RSV по п.1, отличающийся тем, что является тримером.
3. F-полипептид RSV по п.1 или 2, где полипептид дополнительно содержит замену аминокислотного остатка в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка в положении 215.
4. F-полипептид RSV по п.3, включающий замену аминокислотного остатка N или T в положении 67 и/или замену аминокислотного остатка S в положении 215.
5. F-полипептид RSV по любому из предыдущих пунктов, включающий связывающую последовательность, содержащую от 1 до 10 аминокислот, связывающих домен F1 и домен F2.
6. F-полипептид RSV по любому из предыдущих пунктов, где полипептид содержит усеченный домен F1.
7. F-полипептид RSV по п.6, где полипептид содержит гетерологичный домен тримеризации, свя
- 53 034653 занный с указанным усеченным доменом F1.
8. F-полипептид RSV по п.7, где гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4).
9. F-полипептид RSV по п.8, где домен тримеризации связан с аминокислотным остатком 513 Fбелка RSV.
10. F-полипептид RSV по любому из предыдущих пунктов, где домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма A RSV.
11. F-полипептид RSV по любому из предыдущих пунктов 1-9, где домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма RSV B.
12. F-полипептид RSV по любому из предыдущих пунктов, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 90 - SEQ ID NO: 94.
13. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая F-полипептид RSV по любому из предыдущих пп.1-12.
14. Молекула нуклеиновой кислоты по п.13, оптимизированная по кодону для экспрессии в клетках млекопитающих.
15. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.13 или 14.
16. Композиция, содержащая F-полипептид RSV перед слиянием по любому из пп.1-12, молекулу нуклеиновой кислоты по п.13 или 14 и/или вектор по п.15.
17. Применение F-полипептида RSV по любому из пп.1-12, молекулы нуклеиновой кислоты по п.13 или 14 и/или вектора по п.15 для индуцирования иммунного ответа против F-белка RSV.
18. Применение F-полипептида RSV по любому из пп.1-12, молекулы нуклеиновой кислоты по п.13 или 14 и/или вектора по п.15 в качестве вакцины.
19. Применение F-полипептида RSV по любому из пп.1-12, молекулы нуклеиновой кислоты по п.13 или 14 и/или вектора по п.15 для профилактики и/или лечения инфекции, вызванной RSV.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP13172256 | 2013-06-17 | ||
| PCT/EP2014/062655 WO2014202570A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-06-17 | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201690031A1 EA201690031A1 (ru) | 2016-07-29 |
| EA034653B1 true EA034653B1 (ru) | 2020-03-03 |
Family
ID=48625910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201690031A EA034653B1 (ru) | 2013-06-17 | 2014-06-17 | Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv перед слиянием |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10294279B2 (ru) |
| EP (1) | EP3010931B1 (ru) |
| JP (1) | JP6679475B2 (ru) |
| KR (1) | KR102313153B1 (ru) |
| CN (1) | CN105408348B (ru) |
| AP (1) | AP2015008893A0 (ru) |
| AU (1) | AU2014283334B2 (ru) |
| BR (1) | BR112015031509B1 (ru) |
| CA (1) | CA2914792C (ru) |
| CL (1) | CL2015003655A1 (ru) |
| EA (1) | EA034653B1 (ru) |
| HK (1) | HK1223949A1 (ru) |
| IL (1) | IL243053B (ru) |
| MX (1) | MX362792B (ru) |
| MY (1) | MY171210A (ru) |
| PE (1) | PE20160045A1 (ru) |
| PH (1) | PH12015502735B1 (ru) |
| SG (1) | SG11201510216RA (ru) |
| WO (1) | WO2014202570A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201509140B (ru) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105188745B (zh) | 2013-04-25 | 2019-10-18 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
| EP3010931B1 (en) | 2013-06-17 | 2018-06-13 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides |
| US10457708B2 (en) | 2015-07-07 | 2019-10-29 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides |
| PL3319633T3 (pl) | 2015-07-07 | 2021-04-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Szczepionka przeciwko rsv |
| AU2016379097C1 (en) | 2015-12-23 | 2021-04-08 | Pfizer Inc. | RSV F protein mutants |
| WO2017174564A1 (en) * | 2016-04-05 | 2017-10-12 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine against rsv |
| AU2017248021B2 (en) * | 2016-04-05 | 2021-08-12 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion RSV F proteins |
| JP2019523644A (ja) | 2016-05-30 | 2019-08-29 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． | 安定化された融合前ｒｓｖ ｆタンパク質 |
| WO2017207477A1 (en) | 2016-05-30 | 2017-12-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion rsv f proteins |
| MA47787A (fr) | 2017-03-15 | 2020-01-22 | Modernatx Inc | Vaccin contre le virus respiratoire syncytial |
| MA47790A (fr) | 2017-03-17 | 2021-05-05 | Modernatx Inc | Vaccins à base d'arn contre des maladies zoonotiques |
| CN115947873A (zh) | 2017-04-04 | 2023-04-11 | 华盛顿大学 | 显示副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白的自组装蛋白纳米结构及其用途 |
| WO2018211419A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
| US11306292B2 (en) | 2017-05-15 | 2022-04-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
| WO2018210871A1 (en) * | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection |
| CA3061278A1 (en) * | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection |
| WO2019053109A1 (en) * | 2017-09-15 | 2019-03-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | METHOD FOR SAFE INDUCTION OF IMMUNITY AGAINST RSV |
| MA54676A (fr) | 2018-01-29 | 2021-11-17 | Modernatx Inc | Vaccins à base d'arn contre le vrs |
| CR20210306A (es) * | 2018-11-13 | 2021-07-22 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Proteínas f de prefusión del vrs estabilizadas |
| AU2020275910A1 (en) | 2019-05-15 | 2021-11-04 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Prophylactic treatment of respiratory syncytial virus infection with an adenovirus based vaccine |
| WO2020229577A1 (en) | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine |
| WO2021046207A1 (en) | 2019-09-04 | 2021-03-11 | University Of Washington | Self-assembling protein nanostructures displaying paramyxovirus and/or pneumovirus f proteins and their use |
| CA3177062A1 (en) | 2020-04-02 | 2021-10-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized vaccine compositions |
| JP2022060169A (ja) | 2020-10-02 | 2022-04-14 | ファイザー・インク | Ｒｓｖ ｆタンパク質生産のための細胞培養工程 |
| CN115161344A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-10-11 | 北京智飞绿竹生物制药有限公司 | 一种针对呼吸道合胞病毒感染的疫苗的制备方法 |
| WO2024067725A1 (zh) * | 2022-09-29 | 2024-04-04 | 北京百邑无忧科技发展有限公司 | 一种融合前构象的呼吸道合胞病毒重组融合蛋白、其制备方法及用途 |
| WO2024069420A2 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-04 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising an rsv f protein trimer |
| WO2024067723A1 (zh) * | 2022-09-29 | 2024-04-04 | 北京百邑无忧科技发展有限公司 | 一种融合前构象的呼吸道合胞病毒重组融合蛋白、其制备方法及用途 |
| WO2024089633A1 (en) | 2022-10-27 | 2024-05-02 | Pfizer Inc. | Rna molecules encoding rsv-f and vaccines containing them |
| WO2024089634A1 (en) | 2022-10-27 | 2024-05-02 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions against influenza and rsv |
| CN117586358A (zh) * | 2024-01-19 | 2024-02-23 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（rsv）多肽 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012158613A1 (en) * | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Novartis Ag | Pre-fusion rsv f antigens |
Family Cites Families (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4235877A (en) | 1979-06-27 | 1980-11-25 | Merck & Co., Inc. | Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit |
| US4372945A (en) | 1979-11-13 | 1983-02-08 | Likhite Vilas V | Antigen compounds |
| IL61904A (en) | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
| EP0173552B1 (en) | 1984-08-24 | 1991-10-09 | The Upjohn Company | Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa |
| US5168062A (en) | 1985-01-30 | 1992-12-01 | University Of Iowa Research Foundation | Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence |
| US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
| NZ230747A (en) | 1988-09-30 | 1992-05-26 | Bror Morein | Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina |
| WO1990014837A1 (en) | 1989-05-25 | 1990-12-13 | Chiron Corporation | Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion |
| FR2705686B1 (fr) | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| US5851806A (en) | 1994-06-10 | 1998-12-22 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral systems and cell lines |
| ATE336587T1 (de) | 1994-06-10 | 2006-09-15 | Genvec Inc | Adenoviren-vektor systeme und zelllinien |
| US5965541A (en) | 1995-11-28 | 1999-10-12 | Genvec, Inc. | Vectors and methods for gene transfer to cells |
| US5846782A (en) | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| US5559099A (en) | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
| US5786464C1 (en) | 1994-09-19 | 2012-04-24 | Gen Hospital Corp | Overexpression of mammalian and viral proteins |
| AUPM873294A0 (en) | 1994-10-12 | 1994-11-03 | Csl Limited | Saponin preparations and use thereof in iscoms |
| US5837520A (en) | 1995-03-07 | 1998-11-17 | Canji, Inc. | Method of purification of viral vectors |
| SI0833934T2 (sl) | 1995-06-15 | 2013-04-30 | Crucell Holland B.V. | Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji |
| US5837511A (en) | 1995-10-02 | 1998-11-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Non-group C adenoviral vectors |
| US5891690A (en) | 1996-04-26 | 1999-04-06 | Massie; Bernard | Adenovirus E1-complementing cell lines |
| US6485958B2 (en) | 1996-07-01 | 2002-11-26 | Gencell Sa | Method for producing recombinant adenovirus |
| FR2751343B1 (fr) | 1996-07-16 | 1998-12-18 | Transgene Sa | Procede de conservation de virus recombinants infectieux, suspension aqueuse virale et utilisation comme medicament |
| US7732129B1 (en) | 1998-12-01 | 2010-06-08 | Crucell Holland B.V. | Method for the production and purification of adenoviral vectors |
| EP0968284B1 (en) | 1996-11-20 | 2006-12-13 | Introgen Therapeutics, Inc. | An improved method for the production and purification of adenoviral vectors |
| US6261823B1 (en) | 1996-12-13 | 2001-07-17 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
| EP0973866A4 (en) | 1997-03-04 | 2000-04-19 | Baxter Int | ADENOVIRUS E1-COMPLEMENTING CELL LINES |
| US6020191A (en) | 1997-04-14 | 2000-02-01 | Genzyme Corporation | Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression |
| US6210683B1 (en) | 1997-09-05 | 2001-04-03 | Merck & Co., Inc. | Stabilizers containing recombinant human serum albumin for live virus vaccines |
| ID28298A (id) | 1998-02-17 | 2001-05-10 | Schering Corp | Komposisi yang mengandung virus dan metode untuk memekatkan preparat-preparat virus |
| US5981225A (en) | 1998-04-16 | 1999-11-09 | Baylor College Of Medicine | Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same |
| US6113913A (en) | 1998-06-26 | 2000-09-05 | Genvec, Inc. | Recombinant adenovirus |
| ATE421337T1 (de) | 1998-11-16 | 2009-02-15 | Introgen Therapeutics Inc | Adenovirus-formulierungen zur gentherapie |
| US6225289B1 (en) | 1998-12-10 | 2001-05-01 | Genvec, Inc. | Methods and compositions for preserving adenoviral vectors |
| ATE519854T1 (de) | 1999-05-17 | 2011-08-15 | Crucell Holland Bv | Rekombinantes adenovirus auf basis von serotyp 48 (ad48). |
| US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| US6913922B1 (en) | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| DE19955558C2 (de) | 1999-11-18 | 2003-03-20 | Stefan Kochanek | Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren |
| WO2001066137A1 (en) | 2000-03-07 | 2001-09-13 | Merck & Co., Inc. | Adenovirus formulations |
| AUPR878401A0 (en) | 2001-11-09 | 2001-12-06 | Biota Holdings Ltd | Methods for identifying or screening anti-viral agents |
| JP2005517394A (ja) | 2001-12-12 | 2005-06-16 | エフ エイチ フォールディング アンド カンパニー リミテッド | ウイルス保存のための組成物 |
| CA2469721A1 (en) | 2002-01-18 | 2003-07-31 | Schering Aktiengesellschaft | Stabilized formulations of adenovirus |
| US20030180936A1 (en) | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Memarzadeh Bahram Eric | Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses |
| CA2477954C (en) | 2002-04-25 | 2012-07-10 | Crucell Holland B.V. | Means and methods for the production of adenovirus vectors |
| AU2003229060A1 (en) | 2002-05-14 | 2003-12-02 | Merck And Co., Inc. | Methods of adenovirus purification |
| SE0202110D0 (sv) | 2002-07-05 | 2002-07-05 | Isconova Ab | Iscom preparation and use thereof |
| US20040106184A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-06-03 | Introgen Therapeutics Inc. | Chromatographic methods for adenovirus purification |
| SE0301998D0 (sv) | 2003-07-07 | 2003-07-07 | Isconova Ab | Quil A fraction with low toxicity and use thereof |
| DK1780269T3 (da) | 2004-02-23 | 2009-10-12 | Crucell Holland Bv | Virusrensningsmetoder |
| DE602006003420D1 (de) | 2005-04-11 | 2008-12-11 | Crucell Holland Bv | Virusreinigung mit ultrafiltration |
| WO2007104792A2 (en) | 2006-03-16 | 2007-09-20 | Crucell Holland B.V. | Recombinant adenoviruses based on serotype 26 and 48, and use thereof |
| EP1998804B1 (en) | 2006-03-27 | 2014-04-16 | Crucell Holland B.V. | Compositions comprising a recombinant adenovirus and an adjuvant |
| US7901388B2 (en) | 2007-07-13 | 2011-03-08 | Bacoustics, Llc | Method of treating wounds by creating a therapeutic solution with ultrasonic waves |
| EP3508505A1 (en) | 2007-12-24 | 2019-07-10 | ID Biomedical Corporation of Quebec | Recombinant rsv antigens |
| KR101504392B1 (ko) | 2008-11-03 | 2015-03-19 | 크루셀 홀란드 비.브이. | 아데노바이러스 벡터의 제조방법 |
| SG176807A1 (en) | 2009-06-24 | 2012-01-30 | Id Biomedical Corp Quebec | Vaccine |
| PL2445526T3 (pl) | 2009-06-24 | 2017-08-31 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Rekombinowane antygeny rsv |
| WO2011008974A2 (en) | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Novartis Ag | Rsv f protein compositions and methods for making same |
| EP2464664B1 (en) | 2009-08-13 | 2015-09-23 | Crucell Holland B.V. | Antibodies against human respiratory syncytial virus (rsv) and methods of use |
| EP2488635B1 (en) | 2009-10-15 | 2013-11-20 | Crucell Holland B.V. | Process for adenovirus purification from high cell density cultures |
| CN102791852B (zh) | 2009-10-15 | 2014-05-07 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 纯化腺病毒颗粒的方法 |
| US20120315270A1 (en) | 2009-10-21 | 2012-12-13 | The United States Of America, As Represented By The | Rsv immunogens, antibodies and compositions thereof |
| AU2011214262B2 (en) | 2010-02-15 | 2015-05-21 | Crucell Holland B.V. | Method for the production of Ad26 adenoviral vectors |
| EP2591000B1 (en) * | 2010-07-09 | 2017-05-17 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use |
| DK2825640T3 (en) | 2012-03-12 | 2016-08-01 | Crucell Holland Bv | BATCHES OF RECOMBINANT ADENOVIRUS WITH CHANGED TERMINAL END |
| US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| AP2014007993A0 (en) | 2012-03-22 | 2014-10-31 | Crucell Holland Bv | Vaccine against RSV |
| JP2013247240A (ja) | 2012-05-25 | 2013-12-09 | Gigaphoton Inc | レーザ装置 |
| US9738689B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-08-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Prefusion RSV F proteins and their use |
| WO2014160463A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-02 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Prefusion rsv f proteins and their use |
| EP3567051A1 (en) | 2013-04-15 | 2019-11-13 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Human antibodies binding to rsv g protein |
| CN105164155B (zh) | 2013-04-15 | 2020-01-03 | 扬森疫苗与预防公司 | 结合到rsv g蛋白的人类抗体 |
| CN105188745B (zh) | 2013-04-25 | 2019-10-18 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
| EP3010931B1 (en) | 2013-06-17 | 2018-06-13 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides |
-
2014
- 2014-06-17 EP EP14731940.4A patent/EP3010931B1/en active Active
- 2014-06-17 MY MYPI2015704549A patent/MY171210A/en unknown
- 2014-06-17 KR KR1020167000649A patent/KR102313153B1/ko active IP Right Grant
- 2014-06-17 BR BR112015031509-7A patent/BR112015031509B1/pt active IP Right Grant
- 2014-06-17 WO PCT/EP2014/062655 patent/WO2014202570A1/en active Application Filing
- 2014-06-17 AU AU2014283334A patent/AU2014283334B2/en active Active
- 2014-06-17 EA EA201690031A patent/EA034653B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-06-17 MX MX2015017771A patent/MX362792B/es active IP Right Grant
- 2014-06-17 JP JP2016520435A patent/JP6679475B2/ja active Active
- 2014-06-17 CN CN201480034307.1A patent/CN105408348B/zh active Active
- 2014-06-17 CA CA2914792A patent/CA2914792C/en active Active
- 2014-06-17 AP AP2015008893A patent/AP2015008893A0/xx unknown
- 2014-06-17 US US14/899,531 patent/US10294279B2/en active Active
- 2014-06-17 SG SG11201510216RA patent/SG11201510216RA/en unknown
- 2014-06-17 PE PE2015002617A patent/PE20160045A1/es unknown
-
2015
- 2015-12-07 PH PH12015502735A patent/PH12015502735B1/en unknown
- 2015-12-13 IL IL243053A patent/IL243053B/en active IP Right Grant
- 2015-12-15 ZA ZA2015/09140A patent/ZA201509140B/en unknown
- 2015-12-17 CL CL2015003655A patent/CL2015003655A1/es unknown
-
2016
- 2016-10-24 HK HK16112203.0A patent/HK1223949A1/zh unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012158613A1 (en) * | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Novartis Ag | Pre-fusion rsv f antigens |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DATABASE EMBL [online] 28 August 1995 (1995-08-28), "Human respiratory syncytial virus, strain RSB89-1734, fusion protein (F) mRNA, complete cds.", XP002729919, retrieved from EBI * |
| J. S. MCLELLAN, M. CHEN, M. G. JOYCE, M. SASTRY, G. B. E. STEWART-JONES, Y. YANG, B. ZHANG, L. CHEN, S. SRIVATSAN, A. ZHENG, T. ZH: "Structure-Based Design of a Fusion Glycoprotein Vaccine for Respiratory Syncytial Virus", SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, vol. 342, no. 6158, 1 November 2013 (2013-11-01), pages 592 - 598, XP055132637, ISSN: 00368075, DOI: 10.1126/science.1243283 * |
| M. MAGRO, V. MAS, K. CHAPPELL, M. VAZQUEZ, O. CANO, D. LUQUE, M. C. TERRON, J. A. MELERO, C. PALOMO: "Neutralizing antibodies against the preactive form of respiratory syncytial virus fusion protein offer unique possibilities for clinical intervention", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 109, no. 8, 21 February 2012 (2012-02-21), pages 3089 - 3094, XP055067859, ISSN: 00278424, DOI: 10.1073/pnas.1115941109 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112015031509B1 (pt) | 2023-05-09 |
| EA201690031A1 (ru) | 2016-07-29 |
| AP2015008893A0 (en) | 2015-12-31 |
| CA2914792A1 (en) | 2014-12-24 |
| MX2015017771A (es) | 2016-10-04 |
| EP3010931A1 (en) | 2016-04-27 |
| AU2014283334A1 (en) | 2015-12-17 |
| CN105408348B (zh) | 2021-07-06 |
| CN105408348A (zh) | 2016-03-16 |
| IL243053B (en) | 2020-06-30 |
| CL2015003655A1 (es) | 2016-06-03 |
| CA2914792C (en) | 2024-02-27 |
| US20160176932A1 (en) | 2016-06-23 |
| PH12015502735A1 (en) | 2016-03-07 |
| JP6679475B2 (ja) | 2020-04-15 |
| KR20160021196A (ko) | 2016-02-24 |
| EP3010931B1 (en) | 2018-06-13 |
| PE20160045A1 (es) | 2016-02-18 |
| NZ714594A (en) | 2021-07-30 |
| JP2016522230A (ja) | 2016-07-28 |
| BR112015031509A2 (pt) | 2017-08-29 |
| SG11201510216RA (en) | 2016-01-28 |
| PH12015502735B1 (en) | 2016-03-07 |
| KR102313153B1 (ko) | 2021-10-15 |
| ZA201509140B (en) | 2022-03-30 |
| MX362792B (es) | 2019-02-13 |
| MY171210A (en) | 2019-10-02 |
| US10294279B2 (en) | 2019-05-21 |
| AU2014283334B2 (en) | 2018-10-18 |
| HK1223949A1 (zh) | 2017-08-11 |
| WO2014202570A1 (en) | 2014-12-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210101940A1 (en) | Stabilized Soluble Pre-Fusion RSV F Polypeptides | |
| CA2914792C (en) | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides | |
| AU2021232702B2 (en) | Stabilized pre-fusion RSV F proteins | |
| EA035909B1 (ru) | Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv до слияния | |
| BR112021008975A2 (pt) | proteínas f do rsv pré-fusão estabilizadas | |
| OA17598A (en) | Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides | |
| NZ714594B2 (en) | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides | |
| OA17539A (en) | Stabilized soluble prefusion RSV F polypeptides. | |
| NZ752808A (en) | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides | |
| NZ713371B2 (en) | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides | |
| NZ752808B2 (en) | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG TJ TM |