ES2662716T3

ES2662716T3 - Inmunógenos conservados de Escherichia coli

Info

Publication number: ES2662716T3
Application number: ES10749686.1T
Authority: ES
Inventors: Laura Serino; Maria Rita Fontana; Danilo Gomes Moriel
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2009-07-07
Filing date: 2010-07-07
Publication date: 2018-04-09
Anticipated expiration: 2030-07-07
Also published as: US10988511B2; US20120207776A1; EP2451833B1; IL217412A0; WO2011004263A9; CN102666571A; CA2767536A1; ZA201200412B; JP2012532600A; MX2012000395A; WO2011004263A2; AU2010269961A1; SG177533A1; EP2451833A2; WO2011004263A3

Abstract

Un fragmento de polipéptido aislado o recombinante que comprende al menos los aminoácidos 595-1008 de las SEQ ID Nos: 3-18, en los que el fragmento es inmunogénico, comprende menos de 580 aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID Nos:2-18, presenta una mayor solubilidad en comparación con la proteína de longitud completa de una cualquiera de las SEQ ID Nos: 3-18 y genera una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la que genera la proteína de longitud completa de cualquiera de las SEQ ID Nos: 3-18.

Description

Inmunógenos conservados de Escherichia coli

Campo técnico

La presente invención se refiere a la inmunización contra cepas patógenas de Escherichia coli.

Antecedentes de la técnica

Tradicionalmente las cepas de E. coli se han clasificado ya sea como patógenas o comensales, y las cepas patógenas entonces se subclasifican como cepas intestinales o extraintestinales. Las E. coli patógenas se analizan en más detalle en la referencia 1, y caen en varios patotipos diferentes, es decir, un grupo de cepas de E. coli que provoca una enfermedad común usando un conjunto común de factores de virulencia. La determinación del patotipo de las cepas es una técnica habitual que se puede realizar de forma genotípica o fenotípicamente. Un procedimiento reciente [2] de determinación del patotipo basado en el genotipo usa una micromatriz de ADN.

Entre las cepas intestinales, se conocen al menos seis patotipos bien descritos: enteropatógeno (EPEC), enterohemorrágico (EHEC), enteroagregativo (EAEC), enteroinvasivo (EIEC), enterotoxigénico (ETEC) y de adhesión difusa (DAEC).

Las cepas patógenas extraintestinales (o cepas “ExPEC” [3, 4]) de E. coli incluyen cepas uropatógenas (UPEC), cepas de meningitis neonatal (NMEC), y cepas asociadas a septicemia (SEPEC). Las ExPEC son la causa más común de infecciones del tracto urinario y una de las causas principales de meningitis neonatal y sepsis neonatal en humanos, que puede conducir a serias complicaciones y a la muerte. Otros tipos de infecciones extraintestinales incluyen osteomielitis, infecciones pulmonares, intraabdominales, de tejido blando y asociadas a dispositivos intravasculares. Otro patotipo de ExPEC fuera de los humanos es el patógeno aviar (APEC), que provoca infecciones extraintestinales en aves de corral.

La mayoría de las vacunas anteriores de ExPEC se han basado en lisados celulares o en estructuras celulares. SOLCOUROVACTM incluye diez diferentes bacterias termoinactivadas que incluyen seis cepas ExPEC. URO-VAXOMTM es una vacuna de comprimido oral que contiene lisados bacterianos liofilizados de 18 cepas de E. coli seleccionadas. Baxter Vaccines desarrolló una vacuna de UTI en base a pilis de 6 a 10 diferentes cepas. MedImmune desarrolló un producto llamado MEDI 516 en base a complejo de adhesina FimH. En cambio, las referencias 5 y 6 describen inmunógenos específicos de las cepas ExPEC que se pueden usar como la base de vacunas definidas tanto contra cepas de NMEC como de UPEC.

El documento WO 2005/103073 desvela 1393 secuencias de ORF o de polipéptidos predichas. Las SEQ ID NO: 317 y 776 del documento WO 2005/103073 tienen el 100 % de identidad de secuencia sobre su longitud con las SEQ ID NO: 17 y 16 de a continuación, respectivamente.

Sin embargo, permanece la necesidad de proporcionar una vacuna que proteja contra un amplio espectro de cepas de E. coli intestinales y extraintestinales. E. coli es un microorganismo versátil con una mejor capacidad para adaptarse a nuevos nichos y para provocar un amplio espectro de enfermedades. Los factores de adaptación, de colonización y la virulencia pueden cambiar a fin de permitir al organismo adaptarse a diferentes tejidos y hospedadores. Por lo tanto, los posibles antígenos se someten a alta presión selectiva y como resultado pueden tener variabilidad de secuencia entre diferentes cepas.

La base de datos de genomas disponibles en ncbi.nlm.nih.gov de acuerdo a los genomas enumeró veintiún genomas de E. coli patógenos y no patógenos con tan pocas proteínas como 4126 proteínas hasta tantas proteínas como 5339 proteínas. Sin embargo, este listado no identifica cuáles se conservan a través de una fracción significante de E. coli patógena, cuáles son las regiones conservadas en las proteínas que así se conservan, o qué proteínas entre las miles de proteínas posibles se pueden usar en una vacuna para producir una respuesta inmunitaria suficiente para proteger contra E. coli patógena, lo que requiere examinar grandes cantides de proteínas para identificar los mejores candidatos.

Es un objeto de la invención proporcionar antígenos adicionales y mejores para su uso en la inmunización contra cepas patógenas de E. coli, y de manera más particular contra patotipos intestinales (por ejemplo, cepas EAEC, EIEC, EPEC y ETEC) así como patotipos de ExPEC.

Descripción de la invención

Uno de los muchos antígenos descritos en la referencia 5 se cita como “orf353” (SEQ ID 705 y 706 en la presente), que también se conoce como: “orf236” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC, “c0368” de la cepa CFT073 de E. coli y ecp_0248 de la cepa 536 de E. coli. Otro antígeno descrito en la referencia 5 se cita como proteína de dominio de tipo Ig bacteriana (grupo 1) (también como “orf405”, SEQ ID 809 y 810), que también se conoce como: “orf284” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC, “c0415” de la cepa CFT073 de E. coli y ecp_0367 de la cepa 536 de E. coli. Otro antígeno más descrito en la referencia 5 se cita como la antígeno 43 de fluproteína de antígeno 43 de Flu (también

como “orf1364”, SEQ ID 2727 y 2728), que también se conoce como: “orf1109” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC, “c1273” de la cepa CFT073 de E. coli y ecp_3009 de la cepa 536 de E. coli. Otro antígeno más descrito en la referencia 5 se cita como proteína transportadora de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia de NodTproteína transportadora de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia de NodT (también como “orf1767”, SEQ ID 3533 y 3534), que también se conoce como: “orf1488” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC, “c1765” de la cepa CFT073 de E. coli y ecp_1346 de la cepa 536 de E. coli. Otro antígeno más descrito en la referencia 5 se cita como proteína de ruta general de secreción de gspk (también como “orf3515”, SEQ ID 7029 y 7030), que también se conoce como: “orf3332” de la cepa de IHE3034 de E. coli NMEC, “c3702” de la cepa CFT073 de E. coli y ecp_3039 de la cepa 536 de E. coli. Otro antígeno más descrito en la referencia 5 se cita como proteína de ruta general de secreción de gspJ (también como “orf3516”, SEQ ID 7029 y 7030), que también se conoce como: “orf3333” de la cepa de IHE3034 de E. coli NMEC y ecp_3040 de la cepa 536 de E. coli. Otro antígeno más descrito en la referencia 5 se cita como receptor sideróforo dependiente de tonB (también como “orf3597”, SEQ ID 7193 y 7194), que también se conoce como: “orf3415” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC, “c3775” de la cepa CFT073 de E. coli y ecp_3121 de la cepa 536 de E. coli. Otro antígeno más descrito en la referencia 5 se cita como proteína Fimbrial (también conocido como “orf3613”, SEQ ID 7225 y 7226), que también se conoce como: “orf3431” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC y “c3791” de la cepa CFT073 de E. coli. Otro antígeno más descrito en el documento WO2008/020330 se cita como proteína de Hemolisina A (también como “recp3768”, SEQ ID 3), que también se conoce como: “c3570” de la cepa CFT073 de E. coli y ecp_3827 de la cepa 536 de E. coli. La proteína “upec948” de E. coli UPEC también se conoce como: “c0975” de la cepa CFT073 de E. coli. La proteína “upec1232” de E. coli UPEC se describe en la referencia 6 (SEQ ID 138) también conocida como: “c1275” de la cepa CFT073 de E. coli. Otro antígeno más descrito en la referencia 6 se cita como proteína fimbrial tipo 1, precursor de cadena A (también como “upec1875”, SEQ ID 221), que también se conoce como: “orf1642” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC y “c1936” de la cepa CFT073 de E. coli. Otro antígeno más descrito en la referencia 6 se cita como proteína homóloga YapH (también como “upec2820”, SEQ ID 307), que también se conoce como: “c2895” de la cepa CFT073 de E. coli. La referencia 5, la referencia 6, la WO2008/020330, y otras referencias describen las secuencias de la cepa IHE3034 de NMEC o las cepas UPEC, y ciertos aspectos de la presente invención se basan en variantes de “orf353” de ExPEC, la proteína del dominio de tipo Ig bacteriana (grupo I), la antígeno 43 de fluproteína de antígeno 43 de Flu, la proteína transportadora de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia de NodT, la proteína de ruta general de secreción de gspK, la proteína de ruta general de secreción de gspJ, el receptor sidéroforo dependiente de tonB, la proteína Fimbrial, la proteína “upec948”, la “upec1232”, la proteína fimbrial tipo 1, el precursor de cadena A y la proteína homóloga YapH que se han identificado en patotipos adicionales, incluyendo las cepas de APEC, UPEC, EAEC, EIEC, EPEC y ETEC. A diferencia de la descripción de la referencia 5, estas variantes pueden ser particularmente útiles para tratar patotipos intestinales. Por lo tanto, la invención proporciona estas variantes, conjuntamente con su uso en inmunización de pacientes contra infecciones de E. coli. Además, esta descripción incluye fragmentos de cada una de las proteínas, proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405), antígeno 43 de flu (orf1364), el transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia NodT (orf1767), gspK (orf3515), gspJ (orf3516), receptor sideróforo dependiente de tonB (orf3597), proteína fibrial (orf3613), upec-948, upec-1232, precursor de cadena A de proteína fimbrial tipo 1 (upec-1875), homólogo yapH (upec-2820), hemolisina A (recp-3768), y proteína que contiene repetición Sel1 (upec-5211), de todos los patotipos de E. coli donde los fragmentos se conservan entre múltiples cepas y por lo tanto pueden proporcionar una respuesta inmunitaria en un sujeto que proporciona protección contra varias cepas.

Polipéptidos usados en la invención

La invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se deriva de orf353, de la proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405), del antígeno 43 de flu (orf1364), del transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia NodT(orf1767), de gspK (orf3515), de gspJ (orf3516), del receptor sideróforo dependiente de tonB (orf3597), de la proteína fibrial (orf3613), de upec-948, de upec-1232, del precursor de cadena A de la proteína fimbrial tipo 1 (upec-1875), del homólogo de yapH (upec-2820), de hemolisina A (recp-3768) y de proteína que contiene repetición Sel1 (upec-5211), cada uno como se describe más completamente en el presente documento.

Proteína orf353

La proteína “orf353” de E. coli NMEC se describe en la referencia 5 (SEQ ID 705 y 706) también conocida como: “orf236” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC, “c0368” de CFT073 y ecp_0248 de 536.

Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteína orf353 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de orf353 tienen el 50 % o más identidad (por ejemplo el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con las SEQ ID NOs 1-2. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de orf353 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 1-2, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de orf353. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C

terminal y/o del N-terminal de las SEQ ID NOs 1-2. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia posterior.

Grupo A: cepa IHE3034, RS218, APECO1, S36, UTI89 y F11 (SEQ ID NO:1) cepa O42 (SEQ ID NO: 2)

SEQ ID NO: 213 SAAITGKESEVVSPLLMDVN *

SEQ ID NO: 214 SAAITSKESEVVSPLLMDVN

Epítopos de célula B

SEQ ID NO: 217 ITGKESEV

SEQ ID NO: 218 ELSTSSEPSQQG

Proteína orf405

La proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) se cita en el presente documento como “orf405”. La proteína “orf405” de E. coli NMEC se describe en la referencia 5 (SEQ ID 809 y 810) también conocida como: “orf284” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC, “c0415” de CFT073 y ecp_0367 de 536.

Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteína orf405 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de orf405 tienen el 50 % o más de identidad (por ejemplo el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con las SEQ ID NOs 3-18. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de orf405 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 3-18, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de orf405. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del Cterminal y/o del N-terminal de las SEQ ID NOs 3-18. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia posterior. Además, los tres fragmentos probados para solubilidad e inmunogenicidad, 405A, 405B, y 405C, están subrayados con “A”, “B” y “C”, respectivamente.

Cepas B,C y 8739 (SEQ ID NO: 3)

cepa H10407 (SEQ ID NO: 4)

cepa 101-1 (SEQ ID NO: 5)

cepa 536 (SEQ ID NO: 6)

cepa F11 (SEQ ID NO: 7)

cepa CFT073 (SEQ ID NO: 8)

Grupo A: cepa IHE3034, UTI89, RS218 y APECO1 (SEQ ID NO: 9)

cepa E2348-69 (SEQ ID NO: 10)

cepas B171 y E22 (SEQ ID NO: 11)

cepa B7A (SEQ ID NO: 12)

5 cepa E110019 (SEQ ID NO: 13)

cepa HS (SEQ ID NO: 14)

cepa E24377A (SEQ ID NO: 15)

cepa 042 (SEQ ID NO: 16)

Grupo B: cepa Sakai, EDL933, EC508, EC869, EC4024, EC4042, EC4045, EC4076, EC4113, EC4115, EC4196, 10 EC4206, EC4401, EC4496, EC4501 y TW14588 (SEQ ID NO: 17)

cepa SECEC (SEQ ID NO: 18)

SEQ ID NO: 222 NTTV(T/A)AD(N/S)NVEKNVAS SEQ ID NO: 223 NTTVAADNNVEKNVAS SEQ ID NO: 224 NTTVTADSNVEKNVAS

5 SEQ ID NO: 225 NTTVTADNNVEKNVAS SEQ ID NO: 232 RI(E/A)GKGGQT SEQ ID NO: 233 RIEGKGGQT SEQ ID NO: 234 RIAGKGGQT SEQ ID NO: 250 ASEGAT(V/I)S(S/G)WTEKG

10 SEQ ID NO: 251 ASEGATISSWTEKG SEQ ID NO: 252 ASEGATVSGWTEKG SEQ ID NO: 253 ASEGATVSSWTEKG SEQ ID NO: 257 NQLA NGQS(T/A)N SEQ ID NO: 258 NQLA NGQSTN

15 SEQ ID NO: 259 NQLA NGQSAN SEQ ID NO: 260 TLTVVD(S/T)YGNPLQGQ SEQ ID NO: 261 TLTVVDSYGNPLQGQ SEQ ID NO: 262 TLTVVDTYGNPLQGQ SEQ ID NO: 264 SVIAGIYEIT(A/V)SAGN

20 SEQ ID NO: 265 SVTAGTYEITASAGN SEQ ID NO: 266 SVTAGTYEITVSAGN SEQ ID NO: 269 PEGVTE(K/A)DYQFL SEQ ID NO: 270 PEGVTEKDYQFL SEQ ID NO: 271 PEGVTEADYQFL

25 Epítopos de célula B

SEQ ID NO: 272 TTVTADNNVEK SEQ ID NO: 273 FLSSQPDSDATR SEQ ID NO: 274 TAKANQE SEQ ID NO: 275 IHRTDDRTQSN

30 SEQ ID NO: 276 SGWKKSPDVEDYQERPANGWDIR SEQ ID NO: 277 YLPAWPQ SEQ ID NO: 278 KDKRQKDPHAI SEQ ID NO: 279 GHKQGKSGENDTR SEQ ID NO: 280 KQLDTDSI

35 SEQ ID NO: 281 IEGKGGQT SEQ ID NO: 282 DNKGNASKRV SEQ ID NO: 283 DAEGQPVTGMKDQ SEQ ID NO: 284 PTLGEFTETEAGV SEQ ID NO: 285 TTGTQSGEAT

40 SEQ ID NO: 286 TLSANEPSGDVVADG SEQ ID NO: 287 GNPVTGEA SEQ ID NO: 288 PQDTNGVT SEQ ID NO: 289 IKPGVYSATVSSTRA SEQ ID NO: 290 LNPDKPVVGG

45 SEQ ID NO: 291 GSTASGWTNNGDGTWTA SEQ ID NO: 292 GSTAGE

SEQ ID NO: 293 KLNGQDAAANA

SEQ ID NO: 294 LSSNQSKVSV

SEQ ID NO: 295 DHVKAGEST

SEQ ID NO: 296 ASEGATVSSWTEKG

SEQ ID NO: 297 TGGKTG

SEQ ID NO: 298 GQPAATEA

SEQ ID NO: 299 RVNGQNAV

SEQ ID NO: 300 QLANGQSTN

SEQ ID NO: 301 SYGNPLQGQ

SEQ ID NO: 302 GVTSKTGNTVTT

SEQ ID NO: 303 LMSTVAGE

SEQ ID NO: 304 TYEITASAGN

SEQ ID NO: 305 KQTYKVTVTDA

SEQ ID NO: 306 STKTAESKFVAD

SEQ ID NO: 307 PEGVTE

Proteína orf1364

La proteína de antígeno 43 de Flu se cita en el presente documento como “orf1364”. La proteína “orf1364” de E. coli NMEC se describe en la referencia 5 (SEQ ID 2727 y 2728) también se conoce como: “orf1109” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC, “c1273” de CFT073 y ecp_3009 de 536.

Cuando se usa de acuerdo a la presente invención, la proteína orf1364 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de orf1364 tienen el 50 % o más identidad (por ejemplo, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con las SEQ ID NOs 19-40. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de orf1364 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de SEQ ID NOs 19-40, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o un fragmento inmunogénico de orf1364. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o del N-terminal de las SEQ ID NOs 19-40. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia posterior.

cepa E110019 (SEQ ID NO: 19) Grupo A: cepa Sakai, EDL933, EC508, EC869, EC4024, EC4042, EC4045, EC4076, EC4113, EC4115, EC4196, EC4206, EC4401, EC4486, EC4501 y TW14588 (SEQ ID NO: 20) cepa B171 (SEQ ID NO: 21) cepa E22 (SEQ ID NO: 22) cepa B171 (SEQ ID NO: 23) cepa B171 (SEQ ID NO: 24) cepa E24377A y 042 (SEQ ID NO: 26) cepa E24377A (SEQ ID NO: 25) Grupo B: cepa UTI89, RS218 y IHE3034 (SEQ ID NO: 27) cepa E110019 (SEQ ID NO: 28) cepa E22 (SEQ ID NO: 29) cepa H10407 (SEQ ID NO: 30) cepa F11 y 536 (SEQ ID NO: 31) cepa SECEC (SEQ ID NO: 32) cepa H10407 (SEQ ID NO: 33) cepa W3110 y DH10B (SEQ ID NO: 34) cepa MG1655 (SEQ ID NO: 35) cepa 042 (SEQ ID NO: 36) cepa B7A (SEQ ID NO: 37) cepa CFT073 (SEQ ID NO: 38) cepa 042 (SEQ ID NO: 39) cepa CFT073 (SEQ ID NO: 40)

SEQ ID NO: 310 SRSHQ(T/S)GV(N/S)GENNS

SEQ ID NO: 311 SRSHQTGVNGENNS

SEQ ID NO: 312 SRSHQSGVSGENNS

SEQ ID NO: 313 SRSHQTGVSGENNS

Epítopos de célula B

SEQ ID NO: 322 RARGKRGG

SEQ ID NO: 323 GETVNGGTLAN

SEQ ID NO: 324 GLEYGPDNEANTGGQWVQDGGTANKTTVTSGGLQRVNPGGSVSDTVISAGGGQSLQGR

SEQ ID NO: 325 WQVVKPGTVATDTVVNTGAEGGPDAENGDTGQFV

SEQ ID NO: 326 AVRTTINKN

SEQ ID NO: 327 RAEGTANT

SEQ ID NO: 328 YAGGDQTVHG

SEQ ID NO: 329 QYVHNGGTASDTVVNS

SEQ ID NO: 330 GGVAGNTTVNQKGRLQVDAGGTATNVTLK

SEQ ID NO: 331 HTATNTRVDDGGTLDVRNGGTATTVSMG

SEQ ID NO: 332 GAAVSGTRSDGKAFSIGG

SEQ ID NO: 333 TLNAGDTATDTTV

SEQ ID NO: 334 GTLAGTTTLN

SEQ ID NO: 335 LTGNGSVEKSGSGTLTV

SEQ ID NO: 336 AIDPTNVTL

SEQ ID NO: 337 TWNIPDNATVQ

SEQ ID NO: 338 SHAGQI

SEQ ID NO: 339 NLNGQNG

SEQ ID NO: 340 DMAQNN

SEQ ID NO: 341 AGNSASGLATSGKG

SEQ ID NO: 342 NGATTEEGAFV

SEQ ID NO: 343 NRDSDESWY

SEQ ID NO: 344 HLGHDNNGGIARGATPESSGSY

SEQ ID NO: 345 YGAAGHSSVDVKDDDGSRAGTVRD

SEQ ID NO: 346 TRHSMKASSDNNDFRA

SEQ ID NO: 347 SLDDGKDNAGY

SEQ ID NO: 348 DMTFGEGTSSRAPLRDSAKHS

SEQ ID NO: 349 DMRVGTSTAGSGMTFSPSQNGTSL

SEQ ID NO: 350 YAHSVSGSSAEGYNGQAT

Proteína orf1767

La proteína transportadora de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia de NodT se cita en el presente documento “orf1767”. La proteína “orf1767” de E. coli NMEC se describe en la referencia 5 (SEQ ID 3533 y 3534) también se conoce como: “orf1488” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC, “c1765” de CFT073 y ecp_1346 de 536.

Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteína orf1767 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de orf1767 tienen el 50 % o más de identidad (por ejemplo el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con las SEQ ID NOs 41-47. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de orf1767 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de SEQ ID NOs 41-47, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de orf1767. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C

terminal y/o del N-terminal de SEQ ID NOs 41-47. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia posterior.

cepa UTI89 y IHE3034 (SEQ ID NO: 41)

cepa 536 y F11 (SEQ ID NO: 42)

5 cepa SECEC (SEQ ID NO: 43) cepa APECO1 (SEQ ID NO: 44) cepa CFT073 (SEQ ID NO: 45) cepa E2348-69 (SEQ ID NO: 46)

Grupo A: cepa Sakai, EDL933, EC508, EC869, EC4024, EC4042, EC4045, EC4076, EC4113, EC4115, EC4196, 10 EC4206, EC4401, EC4486, EC4501 y TW14588 (SEQ ID NO: 47)

Epítopos de células B

SEQ ID NO: 362 DPHYSTPESPIPATLPGAQGQGKAIS

SEQ ID NO: 363 SRSLANGTGTTAEADGTVS

SEQ ID NO: 364 QQVGTAAATDVSE

SEQ ID NO: 365 RASVAS

SEQ ID NO: 366 DIQEAEHNLKSANADIGA

SEQ ID NO: 367 SAGVGSD

SEQ ID NO: 368 QYVKAEQQTV

Proteína orf3515

La proteína de la ruta general de secreción de gspK se cita en el presente documento como “orf3515”. La proteína “orf3515” de E. coli NMEC se describe en la referencia 5 (SEQ ID 7029 y 7030) también se conoce como: “orf3332” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC, “c3702” de CFT073 y ecp_3039 de 536.

Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteína orf3515 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de orf3515 tienen el 50 % o más identidad (por ejemplo el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con las SEQ ID NOs 48-60. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de orf3515 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 4860, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de orf3515. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o del N-terminal de las SEQ ID NOs 48-60. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia a continuación.

cepa 536 (SEQ ID NO: 48)

cepa SECEC (SEQ ID NO: 49)

cepa E22 y B7A (SEQ ID NO: 50)

cepa HS (SEQ ID NO: 51)

cepa E24377A (SEQ ID NO: 52)

cepa 53638 (SEQ ID NO: 53)

cepa H10407 (SEQ ID NO: 54)

cepa E2348-69 (SEQ ID NO: 55)

Grupo A: cepa APECO1, UTI89, RS218 y IHE3034 (SEQ ID NO: 56)

cepa E110019 (SEQ ID NO: 57)

cepa F11 (SEQ ID NO: 58)

cepa 101-1 (SEQ ID NO: 59)

cepa 042 (SEQ ID NO: 60)

Epítopos de célula B

SEQ ID NO: 378 QLGRTRSQQEY

SEQ ID NO: 379 PWASGPRFFPL

SEQ ID NO: 380 AQPTTASRP

SEQ ID NO: 381 RLGREDSEY

SEQ ID NO: 382 YAANQPLA

SEQ ID NO: 383 RPAKGWED

SEQ ID NO: 384 DERTKK

Proteína orf3516

La proteína de la ruta general de secreción de gspJ se cita en el presente documento como “orf3516”. La proteína “orf3516” de E. coli NMEC se describe en la referencia 5 (SEQ ID 7031 y 7032) también se conoce como: “orf3333” de la cepa IHE3034 de E. coli NMEC y ecp_3040 de 536.

Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteína orf3516 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de orf3516 tienen el 50 % o más de identidad (por ejemplo el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con las SEQ ID NOs 61-71. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de orf3516 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 6171, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de orf3516. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o del N-terminal de las SEQ ID NOs 61-71. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia a continuación.

Grupo A: cepa E22, E24377A y B7A (SEQ ID NO: 61)

cepa E110019 (SEQ ID NO: 62)

cepa H10407 (SEQ ID NO: 63)

cepa HS y 53638 (SEQ ID NO: 64)

Grupo B: cepa APECO1, UTI89, RS218 y IHE3034 (SEQ ID NO: 65)

cepa F11 (SEQ ID NO: 66)

cepa SECEC (SEQ ID NO: 67)

cepa 536 (SEQ ID NO: 68)

cepa E2348-69 (SEQ ID NO: 69)

cepa 101-1 (SEQ ID NO: 70)

cepa 042 (SEQ ID NO: 71)

SEQ ID NO: 390 WPLTDAA(G/D)SVKPT

SEQ ID NO: 391 WPLTDAAGSVKPT

SEQ ID NO: 392 WPLTDAADSVKPT

Epítopos de célula B

SEQ ID NO: 395 TNGVTR

SEQ ID NO: 396 AVAGHD

SEQ ID NO: 397 PRPVRGDQGQREPA

SEQ ID NO: 398 TRWQESWSS

Proteína orf3597

La proteína de receptor sideróforo dependiente de tonB se cita en el presente documento como “orf3597”. La proteína “orf3597” de E. coli NMEC se describe en la referencia 5 (SEQ ID 7193 y 7194) también se conoce como: “orf3415” de E. coli NMEC cepa IHE3034, “c3775” de CFT073 y ecp_3121 de 536.

Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteína orf3597 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de orf3597 tienen el 50 % o más de identidad (por ejemplo el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con las SEQ ID NOs 72-79. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de orf3597 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 7279, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de orf3597. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o del N-terminal de SEQ ID NOs 72-79. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia a continuación.

cepa E2348-69 (SEQ ID NO: 72) cepa F11 (SEQ ID NO: 73) Grupo A: cepa APECO1, UTI89, CFT073, RS218 y IHE3034 (SEQ ID NO: 74) cepa SECEC (SEQ ID NO: 75) Grupo B: cepa EC508, EC869, EC4024, EC4042, EC4045, EC4076, EC4113, EC4115, EC4196, EC4206, EC4401 y EC4486 (SEQ ID NO: 76) cepa 042 (SEQ ID NO: 77) Grupo C: cepa Sakai, EDL933, EC4501 y TW14588 (SEQ ID NO: 78) cepa 536 (SEQ ID NO: 79)

Epítopos de célula B

SEQ ID NO: 408 SVTTKDGETITVTADANTATEATDGYQPLSTSTATL

SEQ ID NO: 409 VLENQNATTL

SEQ ID NO: 410 NTLGGTQDA

SEQ ID NO: 411 GANRDGSI

SEQ ID NO: 412 KRPEKTFHGSVSATSSSFGGGTGQLDITGPIEG

SEQ ID NO: 413 GEVQDEDYWRN

SEQ ID NO: 414 DYKTPFD

SEQ ID NO: 415 KQPVNV

SEQ ID NO: 416 FNITDGQSDL

SEQ ID NO: 417 SYSQDKYSDNQARVTAYDATTGTLT

SEQ ID NO: 418 VDATQGSTQRM

SEQ ID NO: 419 PVYGNTSKCTTVSASDSDQTIKQESYSAY

SEQ ID NO: 420 QYAGKGRPFNVNTDSRDEQWT

SEQ ID NO: 421 GDLPPESSNAYE

SEQ ID NO: 422 SVGDETIAKT

SEQ ID NO: 423 AKVLEDPDYAGKPLPNVPRH

SEQ ID NO: 424 NMPGNNTLTFGGGGHGVSRRSATNGADYY

SEQ ID NO: 425 IATNNLGNQIGDPREV

Proteína orf3613

La proteína Fimbrial se cita en el presente documento como “orf3613”. La proteína “orf3613” de E. coli NMEC se describe en la referencia 5 (SEQ ID 7225 y 7226) también se conoce como: “orf3431” de E. coli NMEC cepa IHE3034, y “c3791” de CFT073.

Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteína orf3613 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de orf3613 tienen el 50 % o más de identidad (por ejemplo el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con las SEQ ID NOs 80-81. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de orf3613 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 8081, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de orf3613. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o del N-terminal de las SEQ ID NOs 80-81. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia a continuación.

Grupo A: cepa UTI89, CFT073, APECO1, RS218 y IHE3034 (SEQ ID NO: 80) cepa 042 (SEQ ID NO: 81)

Epítopos de célula B

SEQ ID NO: 427 ADDANQGSGKIT SEQ ID NO: 428 CSIAPGDEDQTIN

5 SEQ ID NO: 429 ASVDATDS SEQ ID NO: 430 EGNIGGATD SEQ ID NO: 431 NFPTTNSY SEQ ID NO: 432 LGRTATPGNVQAQ

Proteína recp3768

10 La proteína de hemolisina A se refiere en el presente documento “recp3768”. La proteína “recp3768” de E. coli UPEC se describe en la referencia WO2008/020330 (SEQ ID 3) también se conoce como: “c3570” de CFT073 y ecp_3827 de 536.

Cuando se usa de acuerdo a la presente invención, la proteína recp3768 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de recp3768 tienen el 50 % o más de identidad (por ejemplo el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, 15 el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con las SEQ ID NOs 101-105. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de recp3768 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 101-105, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de recp3768. Otros

20 fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o el N-terminal de SEQ ID NOs 101-105. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia a continuación.

cepa 536 (SEQ ID NO: 101) cepa 536 (SEQ ID NO: 102)

25 cepa CFT073 (SEQ ID NO: 103) Grupo A: cepa RS218, UTI89 y F11 (SEQ ID NO: 104) cepa E110019 (SEQ ID NO: 105)

Epítopos de célula B

SEQ ID NO: 464 QSAKQSAANKLHSAGQSTKDALKKAAEQTRNA

5: SEQ ID NO: 465 DYKGQGSS

SEQ ID NO: 466 QYDEKNGTAI

SEQ ID NO: 467 QKAGNKLGGSAENIGDNLGK

SEQ ID NO: 468 IKKQKSGSNVSSSEL

SEQ ID NO: 469 ADADTGTKAAAG

10: SEQ ID NO: 470 AQGLSTSAA

SEQ ID NO: 471 SGISAA

SEQ ID NO: 472 EKKHGKNYFENGYDA

SEQ ID NO: 473 GVTRNGDKTLS

SEQ ID NO: 474 DYYEEGKRLEKKPDEFQK

15: SEQ ID NO: 475 IDLSDSKS

SEQ ID NO: 476 LTPGEEIRERRQSGKY

SEQ ID NO: 477 VKGVQDKGSVY

SEQ ID NO: 478 SVGNNQY

SEQ ID NO: 479 HLGDGDD

20: SEQ ID NO: 480 YDKTDTGYL

SEQ ID NO: 481 GTKATEAGNY

SEQ ID NO: 482 EVSVGKRTEKTQY

SEQ ID NO: 483 GTDLTET

SEQ ID NO:: 484

25: HGADGDDHIEGNDGNDRLYGDKGNDTLRGGNGDDQLYGGDGNDKLTGGVGNNYLNGGDGDDELQV

SEQ ID NO: 485 LSGGKGNDKLYGSEGADLLDGGEGNDLLKGGYGN

SEQ ID NO: 486 IDDDGGKDDKL

SEQ ID NO: 487 EKESGDISNH

SEQ ID NO: 488 GRVITPDSLK

30: SEQ ID NO: 489 EYQQSNNQANYV

SEQ ID NO: 490 YASTYADL

SEQ ID NO: 491 NFDVKEERS

SEQ ID NO: 492 GNASDFSY

Proteína upec948

La proteína “upec948” de E. coli UPEC también se conoce como: “c0975” de CFT073.

Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteína upec948 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de upec948 tienen el 50 % o más de identidad (por ejemplo el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 5 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con las SEQ ID NOs 82-84. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de upec948 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 8284, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de upec948. Otros

10 fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o el N-terminal de las SEQ ID NOs 82-84. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia a continuación.

Grupo A: cepa RS218, E2348-69 y CFT073 (SEQ ID NO: 82) cepa HS (SEQ ID NO: 83)

15 cepa B y C (SEQ ID NO: 84)

Epítopos de célula B

SEQ ID NO: 496 HNVSNGWRPVKNGGD SEQ ID NO: 497 AVGKPASTDF

20 SEQ ID NO: 498 VTTSTDMAVR SEQ ID NO: 499 VPRSAPDCG

Proteína upec1232

La proteína “upec1232” de E. coli UPEC se describe en la referencia 6 (SEQ ID 138) también se conoce como: “c1275” de CFT073.

25 Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteína upec1232 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de upec1232 tienen el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con las SEQ ID NOs 85-91. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de upec1232 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 85-91, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de upec1232. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más)

5 del C-terminal y/o el N-terminal de las SEQ ID NOs 85-91. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia posterior.

cepa H10407 (SEQ ID NO: 85) cepa H10407 (SEQ ID NO: 86) cepa B7A (SEQ ID NO: 87)

10 cepa 042 (SEQ ID NO: 88) cepa CFT073 (SEQ ID NO: 89) cepa 042 (SEQ ID NO: 90) cepa CFT073 (SEQ ID NO: 91)

Epítopos de célula B

SEQ ID NO: 503 DNGGNDEGFG

5 SEQ ID NO: 504 TEAFGDSNATRT SEQ ID NO: 505 KATEESNGHR SEQ ID NO: 506 FDPQDY

Proteína upec1875

La proteína fimbrial tipo 1, precursor de cadena A, se cita en el presente documento como “upec1875”. La proteína 10 “upec1875” de E. coli UPEC se describe en la referencia 6 (SEQ ID 221) también se conoce como: “orf1642” de E. coli NMEC cepa IHE3034, “c1936” de CFT073.

Cuando se usa de acuerdo a la presente invención, la proteína upec1875 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de upec1875 tienen el 50 % o más de identidad (por ejemplo el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con las SEQ ID NOs 92-98. Esto incluye variantes (por

15 ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de upec1875 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 92-98, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de upec1875. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más)

20 del C-terminal y/o el N-terminal de las SEQ ID NOs 92-98. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia a continuación.

Grupo A: cepa E22, E110019, B7A y B171 (SEQ ID NO: 92) Grupo B: cepa EDL933, SAKAI, EC508, EC869, EC4024, EC4042, EC4045, EC4076, EC4113, EC4115, EC4196, EC4206, EC4401, EC4486, EC4501 and TW14588 (SEQ ID NO: 93)

25 cepa SECEC (SEQ ID NO: 94) cepa 042 (SEQ ID NO: 95) Grupo C: cepa IHE3034, RS218, UTI89, F11 y APECO1 (SEQ ID NO: 96) cepa CFT073 (SEQ ID NO: 97) cepa E2348-69 (SEQ ID NO: 98)

Epítopos de célula B

SEQ ID NO: 511 VSAAEGDESVTTTV

5 SEQ ID NO: 512 DTNVSSN SEQ ID NO: 513 TVTSNDDTLA SEQ ID NO: 514 SAAGSAQN SEQ ID NO: 515 SVAGTANADA

Proteína upec2820

10 La proteína homóloga YapH se cita en el presente documento como “upec2820”. La proteína “upec2820” de E. coli NMEC se describe en la referencia 6 (SEQ ID 307) también se conoce como: “c2895” de CFT073.

Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteína upec2820 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de upec2820 tienen el 50 % o más de identidad (por ejemplo el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más) con la SEQ ID NOs 99-100. Esto incluye variantes (por

Otras secuencias preferidas de upec2820 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 99-100, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de upec2820. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o el N-terminal de las SEQ ID NOs 99-100. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia a continuación.

cepa CFT073 (SEQ ID NO: 99)

cepa SECEC (SEQ ID NO: 100)

Epítopos de célula B

5 SEQ ID NO: 544 DWRPGTNNSGVGAATVSGKTEYITGPNVVQSGG SEQ ID NO: 545 YTTGDN SEQ ID NO: 546 TGEKTKTITVKDEVTGASQ SEQ ID NO: 547 DSFSQRDAGTGGNETIPGFSGT SEQ ID NO: 548 TANNGGT

10 SEQ ID NO: 549 AVADGEGSSV SEQ ID NO: 550 GATMQGGGVT SEQ ID NO: 551 DMTAGGRIDSTPYKE SEQ ID NO: 552 PAYGNGGGIVATNGGTGVNEG SEQ ID NO: 553 NDKYAL

15 SEQ ID NO: 554 MVAGSNGSSAI SEQ ID NO: 555 AFAPEGI SEQ ID NO: 556 GGMATNKGTINITADASTNDNNGKTRGVNVGAG SEQ ID NO: 557 AEDKTATHSAV SEQ ID NO: 558 QNGANKVV

20 SEQ ID NO: 559 AGTVDVV SEQ ID NO: 560 TITIDGHDSDAPA

SEQ ID NO: 561 QLNSDGTINVGGKGISSG SEQ ID NO: 562 AWVEGAGSNVNV SEQ ID NO: 563 AKDGGSLTLS SEQ ID NO: 564 SAIHNTGSGVMDVSTE

5 SEQ ID NO: 565 ATFQGTADASSALTASGKN SEQ ID NO: 566 TGKSDGGVASTVTSG SEQ ID NO: 567 TGEGATATLIEGGAQGTIE SEQ ID NO: 568 GIADGNGYDI SEQ ID NO: 569 INPKDKTT SEQ ID NO: 570 QLSSTQDKVT SEQ ID NO: 571 TVGVRVEEGAVGTNSGNITVQDG SEQ ID NO: 572 TQDVTTINN SEQ ID NO: 573 GDNANRTTGIKASGTTTTVNM SEQ ID NO: 574 AIGVEASNKGTVNLDGSAVPNFAADGSGIT

15 SEQ ID NO: 575 ATIKTNIA SEQ ID NO: 576 LLDASGE SEQ ID NO: 577 SGTGSRGIWATGKGSNVLAD SEQ ID NO: 578 GATATLKQG SEQ ID NO: 579 AVVAEVDGNEYALD SEQ ID NO: 580 SITQTNTGSVITNEADISSPLNN SEQ ID NO: 581 IDFTTGTDN SEQ ID NO: 582 GRFENTGSRI SEQ ID NO: 583 QSQITSTGGDIVAV SEQ ID NO: 584 LGTIEGQKN

25 SEQ ID NO: 585 AGAVGHGIENRAE SEQ ID NO: 586 SLAKTNSGTINVDG SEQ ID NO: 587 KADGSETDNNLDMS SEQ ID NO: 588 GTDGTGIFANTKDGAVVK SEQ ID NO: 589 IQADGG SEQ ID NO: 590 ASKAQSFTNKGQIKAASTTGTAMA SEQ ID NO: 591 VLNDSGAEI SEQ ID NO: 592 LNGGDNTFTNKGSITGTVSAKEGN SEQ ID NO: 593 STLTGEVTAGNGNNNVTLN SEQ ID NO: 594 KTHVDQVTAGTGKNTFTIKGEGA

35 SEQ ID NO: 595 LDGGQGDSDS SEQ ID NO: 596 DGGNGPGSVDIESG SEQ ID NO: 597 LDADTSA SEQ ID NO: 598 NITTVGSGVQQ SEQ ID NO: 599 MPGDTIASNSIETSAAGT SEQ ID NO: 600 LEQDDAQ SEQ ID NO: 601 GTVTGTGG SEQ ID NO: 602 ENGQAIS SEQ ID NO: 603 TFDVTQGGEVVAQGN SEQ ID NO: 604 SDGIKG

45 SEQ ID NO: 605 LQGTGD SEQ ID NO: 606 RANAQGLQTD SEQ ID NO: 607 GAQLTGA SEQ ID NO: 608 SNGGNNYTGDTLV SEQ ID NO: 609 GYSQTVGALQTETG SEQ ID NO: 610 SGTQRQPGDDNGGI SEQ ID NO: 611 AQGLGSQGSI SEQ ID NO: 612 ADGSGVSSN SEQ ID NO: 613 SKSLSGEGS SEQ ID NO: 614 TLSGDNSNFS

55 SEQ ID NO: 615 TYTGDTTVE SEQ ID NO: 616 DSVTRAAGATLSG SEQ ID NO: 617 TVSGQVNNQGT SEQ ID NO: 618 GYETAEV SEQ ID NO: 619 GGKTGNTLTVNGDYTGG SEQ ID NO: 620 GDDTSTT SEQ ID NO: 621 NTSGDTGV SEQ ID NO: 622 VRGQGAQTAD SEQ ID NO: 623 GGQSDGNF SEQ ID NO: 624 GNAGGTDGNWY

65 SEQ ID NO: 625 ELPPEPQPQPQPQPQPQPQPQPQPQPQPQPHPTPDKPVQKVYRPEAGS SEQ ID NO: 626 DREGETYY

SEQ ID NO: 627 FTGEKKA

SEQ ID NO: 628 NRWKDSSSQLNTQ

SEQ ID NO: 629 AQWTDGQDRL

SEQ ID NO: 630 GYGNEKSSTTSSLSGYKSKGAINGY

SEQ ID NO: 631 GTWQQNDGNDNGAY

SEQ ID NO: 632 TVNGEKLAAESWKSRGFTGSVEAG

SEQ ID NO: 633 GEFTGSQGSH

SEQ ID NO: 634 ASEHTEKNGTKVQLSGDGNIQ

SEQ ID NO: 635 KGKSASDDNKAHQ

SEQ ID NO: 636 TALSQDGATNIAE

SEQ ID NO: 637 TGVQGKLS

SEQ ID NO: 638 GVQAGDKGYSD

Polipéptido upec-5211

La proteína que contiene la repetición Sel1 se cita en el presente documento como “upec-5211”. El polipéptido “epec-5211” de E. coli también se conoce como: “c5321” de CFT073; “ECEDI_5081” de EDIa y “EFER_4303” de E. fergusonii ATCC 35469.

Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteína upec-5211 puede tomar varias formas. Las secuencias preferidas de upec-5211 tienen el 50 % o más de identidad (por ejemplo el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 87,5 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, el 99,5 % o más) con las SEQ ID NOs 653-655. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc).

Otras secuencias preferidas de upec-5211 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 653-655, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de upec-5211. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o el N-terminal de SEQ ID NOs 653-655. Los fragmentos de ejemplo son los fragmentos conservados de las SEQ ID NOs identificados en la alineación de secuencia a continuación.

cepas CFT073 y 83972 (SEQ ID NO: 653)

cepa ED1a (SEQ ID NO: 654)

Escherichia fergusonii ATCC 35469 (SEQ ID NO: 655)

Epítopos de células B

SEQ ID NO: 665 FQGNETTKDLT

5 SEQ ID NO: 666 AEQGYTPA SEQ ID NO: 667 GEGVP(K/Q)DYA SEQ ID NO: 668 LPQAQQ SEQ ID NO: 669 EQGRDSGQQSMGDAYFEGDGVT SEQ ID NO: 670 SKAAEQGNV

10 SEQ ID NO: 671 YRKSATSGDEL SEQ ID NO: 672 TQDYT SEQ ID NO: 673 LAGAKEPL SEQ ID NO: 674 GVKKDEQQ SEQ ID NO: 675 TASTN

15 SEQ ID NO: 676 NRNIT

Polipéptidos específicos usados con la invención

Un aspecto de la invención incluye un polipéptido asilado o recombinante que comprende una proteína de E. coli seleccionada del grupo que consiste de orf353, proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405), antígeno 43 de flu (orf1364), el transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia

20 NodT(orf1767), gspK (orf3515), gspJ (orf3516), receptor sideróforo dependiente de tonB (orf3597), proteína fibrial (orf3613), upec-948, upec-1232, precursor de cadena A de la proteína fimbrial tipo 1 (upec-1875), homólogo yapH (upec-2820), y hemolisina A (recp-3768).

En ciertas realizaciones, el polipéptido aislado o recombinante puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un % de identidad con las SEQ ID NOs: 1-105.

En ciertas realizaciones, el polipéptido comprende un aminoácido que cuando se alinea con cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-105 usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana móvil de x aminoácidos del N-terminal al C—término tiene al menos xy aminoácidos idénticos alineados, donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si xy no es un número entero entonces se redondea al número entero más cercano.

En ciertas realizaciones, el polipéptido aislado o recombinante incluirá al menos b aminoácidos consecutivos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-105, en donde al menos b aminoácidos consecutivos son inmunogénicos.

En ciertas realizaciones cuando el polipéptido recombinante o asilado es orf353, el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 160, menos de 150, menos de 140 o menos de 130 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1-2. Los ejemplos preferidos incluirán las SEQ ID NOs: 211-218.

En ciertas realizaciones, en donde el polipéptido aislado o recombinante es proteína de dominio tipo Ig bacteriano (grupo 1) (orf405), el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 1410, menos de 1400, menos de 1390 o menos de 1380 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 3-18. Los ejemplos preferidos incluirán SEQ ID NOs: 219307 y 683.

En ciertas modalidades, en donde el polipéptido aislado o recombinante es antígeno 43 de flu (orf1364), el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 1040, menos de 1030, menos de 1020 o menos de 1010 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 19-40. Los ejemplos preferidos incluirán las SEQ ID NOs: 308-350.

En ciertas modalidades, donde el polipéptido aislado o recombinante es el transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia NodT (orf1767), el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 450, menos de 440, menos de 430 o menos de 420 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 41-47. Los ejemplos preferidos incluirán SEQ ID NOs: 351-368.

En ciertas realizaciones, en donde el polipéptido aislado o recombinante es gspK (orf3515), el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 320, menos de 310, menos de 300 o menos de 290 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 48-60. Los ejemplos preferidos incluirán las SEQ ID NOs: 369-384.

En ciertas realizaciones, en donde el polipéptido aislado o recombinante es gspJ (orf3516), el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 180, menos de 170, menos de 160 o menos de 150 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 61-71. Los ejemplos preferidos incluirán SEQ ID NOs: 385-398.

En ciertas realizaciones, en donde el polipéptido aislado o recombinante es receptor sideróforo dependiente de tonB (orf3597), el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 710, menos de 700, menos de 690 o menos de 680 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 72-79. Los ejemplos preferidos incluirán las SEQ ID NOs: 399-425.

En ciertas realizaciones, en donde el polipéptido aislado o recombinante es proteína fibrial (orf3613), el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 180, menos de 170, menos de 160 o menos de 150 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 80-81. Los ejemplos preferidos incluirán las SEQ ID NOs: 426-432.

En ciertas realizaciones, en donde el polipéptido aislado o recombinante es upec-948, el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 150, menos de 140, menos de 130 o menos de 120 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 82-84. Los ejemplos preferidos incluirán las SEQ ID NOs: 493-499.

En ciertas realizaciones, en donde el polipéptido aislado o recombinante es upec-1232, el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 150, menos de 140, menos de 130 o menos de 120 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 85-91. Los ejemplos preferidos incluirán las SEQ ID NOs: 500-506.

En ciertas realizaciones, en donde el polipéptido aislado o recombinante es precursor de cadena de la proteína fimbrial de tipo 1 (upec-1875), el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 180, menos de 170, menos de 160 o menos de 150 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 92-98. Los ejemplos preferidos incluirán las SEQ ID NOs: 507-515.

En ciertas realizaciones, donde el polipéptido aislado o recombinante es homólogo de yapH (upec-2820), el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 2640, menos de 2620, menos de 2600 o menos de 2580 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 99-100. Los ejemplos preferidos incluirán las SEQ ID NOs: 516-638.

En ciertas realizaciones modalidades, en donde el polipéptido aislado o recombinante es hemolisina A (recp-3768), el polipéptido aislado o recombinante comprenderá menos de 1020, menos de 1010, menos de 1000 o menos de 990 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 101-105. Los ejemplos preferidos incluirán las SEQ ID NOs: 433-492. En ciertas realizaciones, el polipéptido aislado o recombinante incluye un fragmento de una hemolisina A de E. coli (recp-3768) en donde el fragmento contiene una deleción en relación con la proteína AcfD de E. coli que aumenta la solubilidad del fragmento en comparación con la proteína de longitud completa y en donde el fragmento genera una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la proteína AcfD de E. coli.

En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polipéptido no comprende la correspondiente proteína de longitud completa (por ejemplo, orf353, proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405), antígeno 43 de flu (orf1364), el transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia NodT(orf1767), gspK (orf3515), gspJ (orf3516), receptor sideróforo dependiente de tonB (orf3597), proteína fibrial (orf3613), upec-948, upec-1232, precursor de cadena A de la proteína fimbrial tipo 1 (upec-1875), homólogo de yapH (upec-2820), y hemolisina A (recp-3768)). Los ejemplos de estas correspondientes proteínas de longitud completa incluyen las SEQ ID NOs: 1-105.

Un aspecto de la divulgación incluye un polipéptido aislado o recombinante que comprende una proteína que contiene la repetición Sel1 de Escherichia (upec-5211).

En ciertas realizaciones, el polipéptido aislado o recombinante puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un % de identidad con las SEQ ID NOs: 653-655.

En ciertas modalidades, el polipéptido comprende un aminoácido que cuando se alinea con cualquiera de las SEQ ID NOs: 653-655 usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana en movimiento de x aminoácidos del Nterminal al C—término tiene al menos xy aminoácidos idénticos alineados, donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si xy no es un número entero entonces se redondea al número entero más cercano.

En ciertas realizaciones, el polipéptido aislado o recombinante incluirá al menos b aminoácidos consecutivos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 653-655, en donde al menos los b aminoácidos consecutivos son inmunogénicos.

En ciertas realizaciones el polipéptido recombinante o aislado comprenderá menos de 480, menos de 470, menos de 460 o menos de 450, menos de 425, menos de 400, menos de 350, menos de 200, o menos de 250 aminoácidos de las SEQ ID NOs: 653-655. Los ejemplos preferidos incluirán las SEQ ID NOs: 656-676.

Cualquiera de los polipéptidos desvelados en el presente documento tendrá utilidad como componentes de vacunas. De esta manera, en otra realización, el polipéptido aislado o recombinante estará con un adyuvante.

Otro aspecto de la divulgación incluye un polipéptido que codifica cualquiera de los polipéptidos anteriores. En ciertas realizaciones, el polipéptido tiene un % de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 106-210.

Otro aspecto de la divulgación incluye un polipéptido inmunogénico que incluye un fragmento de una proteína orf405 en donde el fragmento contiene una deleción con relación con la orf405 de E. coli que aumenta la solubilidad del fragmento en comparación con la proteína de longitud completa y en donde el fragmento genera una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la orf405 de E. coli. Un ejemplo de esto es la SEQ ID NO:642. En ciertas realizaciones, el fragmento de una proteína orf405 tiene menos de 1200 aminoácidos, menos de 1100 aminoácidos, menos de 1000 aminoácidos, menos de 950 aminoácidos, menos de 900 aminoácidos, menos de 850 aminoácidos, menos de 800 aminoácidos, menos de 750 aminoácidos, menos de 700 aminoácidos, menos de 650 aminoácidos, menos de 600 aminoácidos, menos de 590 aminoácidos, menos de 580 aminoácidos de la proteína orf405. En ciertas realizaciones con las que se puede combinar con cualquiera de las modalidades anteriores, el fragmento de orf405 con solubilidad aumentada tiene (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs 3-18; (b) de 1 a 10 alteraciones individuales de aminoácido en comparación con las SEQ ID NOs: 3-18; (c) al menos un % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-18; y/o (d) cuando se alinea con cualquiera de las SEQ ID NOs: 3-18 usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana móvil de x aminoácidos de N-terminal a C—términal tiene al menos xy aminoácidos idénticos alineados, donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si xy no es un número entero entonces se redondea al entero más cercano. En ciertas realizaciones con las que se puede combinar con cualquiera de las modalidades anteriores, el fragmento de orf405 con solubilidad aumentada se aísla, se purifica o es recombinante. En ciertas realizaciones con las que se puede combinar con cualquiera de las modalidades anteriores, el polipéptido inmunogénico se puede combinar con un adyuvante.

Otro aspecto de la invención incluye un polipéptido inmunogénico que comprende un fragmento de unantígeno 43 de flu (orf1364) en donde el fragmento contiene una deleción en relación con el antígeno 43 de flu (orf1364) de E. coli que aumenta la solubilidad del fragmento en comparación con la proteína de longitud completa y en donde el fragmento genera una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como el antígeno 43 de flu de E. coli (orf1364). Un ejemplo de esto es la SEQ ID NO:652. En ciertas realizaciones, el antígeno 43 de flu de E. coli tiene menos de 950 aminoácidos, menos de 900 aminoácidos, menos de 850 aminoácidos, menos de 800 aminoácidos, menos de 750 aminoácidos, menos de 700 aminoácidos, menos de 650 aminoácidos, menos de 600 aminoácidos, menos de 550 aminoácidos, menos de 500 aminoácidos, menos de 450 aminoácidos, menos de 440 aminoácidos, o menos de 430 aminoácidos del antígeno 43 de flu (orf1364). En ciertas realizaciones con las que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el fragmento del antígeno 43 de flu (orf1364) con solubilidad aumentada tiene (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID

NOs 19-40; (b) de 1 a 10 alteraciones individuales de aminoácido en comparación con las SEQ ID NOs: 19-40; (c) al menos un % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 19-40; y/o (d) cuando se alinea con cualquiera de las SEQ ID NOs: 19-40 usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana móvil de x aminoácidos del N-terminal al C—términal tiene al menos xy aminoácidos idénticos alineados, donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si xy no es un número entero entonces se redondea al número entero más cercano. En ciertas modalidades con las que se pueden combinar con cualquiera de las modalidades anteriores, el fragmento del antígeno 43 de flu (orf1364) con solubilidad aumentada se aísla, se purifica o es recombinante. En ciertas realizaciones con las que se puede combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polipéptido inmunogénico se puede combinar con un adyuvante.

Otro aspecto de la invención incluye un polipéptido inmunogénico que comprende un fragmento de una proteína homóloga yapH (upec-2820) en donde el fragmento contiene una supresión con relación con el homólogo yapH de

E. coli (upec-2820) que aumenta la solubilidad del fragmento en comparación con la proteína de longitud completa y en donde el fragmento genera una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como el homólogo yapH de E. coli (upec-2820). Los ejemplos de estos son la SEQ ID NO:644, la SEQ ID NO:646, la SEQ ID NO:648, o la SEQ ID NO:650. En ciertas realizaciones, el fragmento de un homólogo yapH de E. coli tiene menos de 2500 aminoácidos, menos de 2000 aminoácidos, menos de 1750 aminoácidos, menos de 1500 aminoácidos, menos de 1400 aminoácidos, menos de 1300 aminoácidos, menos de 1200 aminoácidos, menos de 1100 aminoácidos, menos de 1000 aminoácidos, menos de 900 aminoácidos, menos de 850 aminoácidos, menos de 800 aminoácidos, menos de 750 aminoácidos, menos de 700 aminoácidos, menos de 650 aminoácidos, menos de 600 aminoácidos, menos de 550 aminoácidos, menos de 500 aminoácidos, menos de 450 aminoácidos, menos de 400 aminoácidos, o menos de 390 aminoácidos de la proteína de homólogo yapH (upec-2820). En ciertas realizaciones con las que se pueden combinar cualquiera de las realizaciones anteriores, el fragmento del homólogo yapH (upec-2820) con solubilidad aumentada tiene (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs 99-100;

(b) de 1 a 10 alteraciones individuales de aminoácido en comparación con las SEQ ID NOs: 99-100; (c) al menos un % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 99-100; y/o (d) cuando se alinea con cualquiera de las SEQ ID NOs: 99-100 usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana en movimiento de x aminoácidos del N-terminal al C—términal tiene al menos xy aminoácidos idénticos alineados, donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si xy no es un número entero entonces se redondea al número entero más cercano. En ciertas realizaciones con las que se pueden combinar cualquiera de las modalidades anteriores, el fragmento del homólogo yapH (upec-2820) con solubilidad incrementada se aísla, se purifica o es recombinante. En ciertas realizaciones con las que se puede combinar cualquiera de las realizaciones anteriores, el polipéptido inmunogénico se puede combinar con un adyuvante.

Otro aspecto de la invención incluye un polipéptido inmunogénico que comprende un fragmento de una proteína de hemolisina A (recp3768) en donde el fragmento contiene una deleci en relación con la hemolisina A de E. coli (recp3768) que aumenta la solubilidad del fragmento en comparación con la proteína de longitud completa y en donde el fragmento genera una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la hemolisina A de

E. coli (recp3768). Un ejemplo de esto es la SEQ ID NO:640. En ciertas ralizaciones, el fragmento de una hemolisina A de E. coli tiene menos de 1000 aminoácidos, menos de 950 aminoácidos, menos de 900 aminoácidos, menos de 850 aminoácidos, menos de 800 aminoácidos, menos de 750 aminoácidos, menos de 700 aminoácidos, menos de 650 aminoácidos, menos de 600 aminoácidos, menos de 550 aminoácidos, menos de 500 aminoácidos, menos de 450 aminoácidos, menos de 400 aminoácidos, menos de 390 aminoácidos, menos de 380 aminoácidos, menos de 350 aminoácidos, menos de 300 aminoácidos, menos de 250 aminoácidos, menos de 240 aminoácidos, menos de 230 aminoácidos, o menos de 220 aminoácidos de la proteína de hemolisina A (recp3768). En ciertas realizaciones con las que se pueden combinar cualquiera de las realizaciones anteriores, el fragmento de la hemolisina A (recp3768) con solubilidad aumentada tiene (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs 101-105; (b) de 1 a 10 alteraciones individuales de aminoácido en comparación con las SEQ ID NOs: 101-105; (c) al menos un % de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 101-105; y/o (d) cuando se alinea con cualquiera de las SEQ ID NOs: 101-105 usando un algoritmo de alineación en pares, cada ventana en movimiento de x aminoácidos del N-terminal al C—término tiene al menos xy aminoácidos idénticos alineados, donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si xy no es un número entero entonces se redondea al entero más cercano. En ciertas realizaciones con las que se pueden combinar cualquiera de las modalidades anteriores, el fragmento de hemolisina (recp3768) con solubilidad aumentada se aísla, se purifica o es recombinante. En ciertas realizaciones con las que se pueden combinar cualquiera de las realizaciones anteriores, el polipéptido inmunogénico se puede combinar con un adyuvante.

El algoritmo de alineación en pares preferido para determinar el porcentaje de identidad es el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch [7], que usa parámetros por defecto (por ejemplo con penalización de abertura de separación = 10,0, y con penalización de extensión de separación = 0,5, usando la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo se implementa de manera conveniente en la herramienta needle en el paquete EMBOSS [8].

Estos polipéptidos incluyen variantes de las SEQ ID NOs 1 a 105, incluyendo variantes alélicas, formas polimórficas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc., así como variantes de las SEQ ID NOs 653 a 655.

El valor de a se puede seleccionar del 50 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 87,5 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, el 99,5 % o más.

El valor de b se puede seleccionar de 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más. Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de las SEQ ID NOs 1 a 105, así como un epítopo o fragmento inmunogénico de las SEQ ID NOs 653 a 655. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o uno

o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del N-terminal de las SEQ ID NOs 1 a 105, mientras que retienen de manera preferente al menos un epítopo o fragmento inmunogénico de las SEQ ID NOs 1 a 105, o del N-terminal de las SEQ ID NOs 653 a 655, mientraso que retienen de manera preferente al menos un epítopo o fragmento inmunogénico de las SEQ ID NOs 653 a 655. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína, por ejemplo, omisión de un péptido de señal, de un dominio citoplásmico, de un dominio transmembrana, de un dominio extracelular, etc. El fragmento (B4) de hemolisina A (recp3768) se obtuvo al suprimir el dominio hidrófobo amino-terminal requerido para la inserción en membrana y la formación de poro (la región hélice hidrófoba), la secuencia de señal carboxil-terminal y dominios requeridos para la actividad formadora de poro después de la acilación post-transduccional. El fragmento soluble obtenido es una lámina  carboxilo-terminal y una región rica en glicina requerida para la unión a calcio. El fragmento de antígeno 43 de flu (orf1364) se obtuvo al delecionar el dominio de barril  de carboxil-terminal mientras quese retiene el dominio pasajero (aminoácidos 53620). El fragmento orf405 se obtuvo por deleción de un dominio translocalizador amino-terminal putativo mientras que se retienen cuatro dominios de tipo unión a inmunoglobulina predichos (aminoácidos 595-1008).

Un epítopo dentro de un fragmento puede ser un epítopo de célula B y/o un epítopo de linfocito T. Estos epítopos se pueden identificar de manera empírica (usando por ejemplo PEPSCAN [9, 10] o procedimientos similares), o se pueden predecir (por ejemplo usando el índice antigénico de Jameson-Wolf [11] , aproximaciones basadas en matriz [12], MAPITOPE [13], TEPITOPE [14, 15], redes neurales [16], OptiMer y EpiMer [17, 18], ADEPT [19], Tsites [20], hidrofilicidad [21], índice antigénico [22] o los procedimientos desvelados en las referencias 23, 24, etc.). Los epítopos son las partes de un antígeno que se reconocen por y se unen a los sitios de unión al antígeno de los anticuerpos o receptores de linfocitoslinfocitos T, y también se pueden citar como “determinantes antigénicos”.

Los fragmentos inmunogénicos de las SEQ ID NOs 1 a 105 o de las SEQ ID NOs 653 a 655 analizados anteriormente incluyen, sin limitación, fragmentos inmunogénicos que, cuando se administran a un sujeto en una composición adecuada que puede incluir un adyuvante (incluyendo sin limitación cualquiera de los adyuvantes enumerados o analizados en la sección “composiciones y medicamentos inmunogénicos”, a continuación), o un portador adecuado acoplado al polipéptido, induce un anticuerpo o una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T que reconoce el polipéptido aislado de longitud completa de las SEQ ID NOs 1 a 105 o de las SEQ ID NOs 653 a 655, respectivamente, de la cual deriva el fragmento inmunogénico.

Un polipéptido de la invención puede, en comparación a cualquiera de las SEQ ID NOs 1 a 105 o de las SEQ ID NOs 653 a 655, incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservativas (es decir, sustituciones de un aminoácido con otro que tiene una cadena lateral relacionada). Los aminoácidos idénticamente codificados se dividen en general en cuatro familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican algunas veces conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto principal en la actividad biológica.

Un polipéptido puede incluir una o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etcétera) deleciones individuales de aminoácido con relación con cualquiera de las SEQ ID NOs 1 a 105 o de las SEQ ID NOs 653 a 655. De manera similar, un polipéptido puede incluir una o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etcétera) inserciones (por ejemplo, cada uno de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos) en relación con cualquiera de las SEQ ID NOs 1 a 105 o de las SEQ ID NOs 653 a 655.

Dentro del grupo (c), las deleciones o sustituciones pueden estar en el N-terminal y/o en el C-terminal, o puede estar entre los dos extremos. De esta manera, un truncamiento es un ejemplo de una deleción. Los truncamientos pueden comprender la deleción de hasta 40 aminoácidos (o más) en el N-terminal y/o en el C-terminal. Como se mencionó anteriormente, por ejemplo, se puede usar el truncamiento para eliminar el N-terminal hasta la secuencia GGGSG.

En general, cuando un polipéptido de la invención comprende una secuencia que no es idéntica a una completa de las SEQ ID NOs 1 a 105 o de las SEQ ID NOs 653 a 655 (por ejemplo, cuando comprende un listado de secuencia con <100 % de identidad de secuencia con la misma, o cuando comprende un fragmento de la misma), se prefiere que el polipéptido pueda producir un anticuerpo que reconoce un polipéptido que consiste en la secuencia de la SEQ ID completa, es decir, el anticuerpo se une a una o más de las SEQ ID NOs 1 a 105 o delas SEQ ID NOs 653 a 655. Este anticuerpo puede unirse de manera específica a las SEQ ID NOs 1 a 105 o a las SEQ ID NOs 653 a 655, respectivamente, mientras que no se une a otras proteínas que no son homólogas con afinidad significativamente mayor que la afinidad más específica del anticuerpo a albúmina de suero humano como una norma de referencia de unión no específica.

Un polipéptido de la invención puede incluir un ion metálico, por ejemplo, un ion metálico que se coordine por uno o más aminoácidos en la cadena de polipéptido. Por ejemplo, el polipéptido puede incluir un catión metálico monovalente, divalente o trivalente. Los cationes divalentes son típicos, tales como Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, etcétera. El catión divalente es de manera preferente Zn2+. El ion se puede coordinar por una secuencia de aminoácidos de HEAGH o HEVGH.

Los polipéptidos usados con la invención pueden tomar varias formas (por ejemplo, natural, fusiones, glicosilada, no glicosilada, lipidada, no lipidada, fosforilada, no fosforilada, miristoilada, no miristoilada, monomérica, multimérica, en partículas, desnaturalizada, etcétera). Por ejemplo, un polipéptido de la invención puede tener un cisteína lipidada en N-terminal.

Los polipéptidos usados en la invención se pueden preparar por varios medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación de cultivo celular, síntesis química, etcétera). Se prefieren proteínas expresadas de manera recombinante.

Los polipéptidos usados con la invención se proporcionan de manera preferente en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libre de otros polipéptidos (por ejemplo, libres de polipéptidos que se presentan de forma natural), particularmente de otros polipéptidos de E. coli o de células hospedadoras, y en general son al menos aproximadamente el 50 % puros (en peso), y usualmente al menos aproximadamente el 90 % puros, es decir, menos de aproximadamente el 50 %, y de manera más preferente menos de aproximadamente el 10 % (por ejemplo el 5 %) de una composición está constituida por otros polipéptidos expresados. De esta manera, los antígenos en las composiciones se separan del organismo entero con el cual se expresa la molécula.

Los polipéptidos usados con la invención son preferentemente polipéptidos de E. coli. Estos polipéptidos se pueden seleccionar adicionalmente de polipéptidos de E. coli de NMEC, APEC, UPEC, EAEC, EIEC, EPEC y ETEC.

El término “polipéptido” se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los extremos también abarcan un polímero de aminoácido que se ha modificado de forma natural o por intervención, por ejemplo, formación de enlace de disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etcétera), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden presentarse como cadenas individuales o cadenas asociadas.

La invención proporciona polipéptidos que comprenden una secuencia –P-Q-o –Q-P-, en donde: -P-es una secuencia de aminoácidos tal como se define anteriormente y -Q-no es una secuencia tal como se define anteriormente, es decir, la invención proporciona proteínas de fusión. Cuando el codón de N-terminal de -P-no es ATG, pero este codón no está presente en N-terminal de un polipéptido, se traducirá como el aminoácido normal para ese codón, en lugar de como una Met. Cuando este codón esté en el N-terminal de un polipéptido, sin embargo, se traducirá como Met. Los ejemplos de porciones -Q-incluyen, pero no se limitan a, marcadores de histidina (es decir, Hisn, donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), una proteína de unión a maltosa, o glutatión-Stransferasa (GST).

La invención también proporciona una proteína oligomérica que comprende un polipéptido de la invención. El oligómero puede ser un dímero, un trímero, un tetrámero, etcétera. El oligómero puede ser un homooligómero o heterooligómero. Los polipéptidos en el oligómero se pueden asociar de manera covalente o de forma no covalente.

La invención también proporciona polipéptidos de E. coli que son fragmentos de la orf405 de longitud completa, antígeno 43 de flu (orf1364), homólogo yapH (upec-2820), y hemolisina A (recp3768) (de los cuales, las SEQ ID NOs: 3-18, las SEQ ID NOs: 19-40, las SEQ ID NOs: 99-100, y las SEQ ID NOs 101 a 105, respectivamente, son ejemplos representativos) que tienen solubilidad aumentada con respecto a la proteína de longitud completa, mientras que genera una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto como la formulada por la proteína de longitud completa. Los ejemplos de estos fragmentos de polipéptido inmunogénico incluyen cualquiera de las SEQ ID NOs 640, 642, 644, 646, 648, 650 y 652. La solubilidad aumentada se puede medir por cualquier medio disponible para el experto en la técnica. Un procedimiento simple comprende la sobreexpresión del fragmento en bacterias y correr muestras comparativas de lisado bacteriano total frente a sobrenadante de lisado bacteriano después de la centrifugación o muestras de sedimento de lisado bacteriano después de la centrifugación frente a muestras de sobrenadante de lisado bacteriano después de la centrifugación. Un experto en la técnica cultivará y expresará estos fragmentos de polipéptido inmunogénico usando técnicas normales (por ejemplo, transformar bacterias BL21(DE3) con un vector de expresión pET21 que expresa el fragmento, cultivar la bacteria a 0,6 OD600 en LB e inducir con IPTG 1 mM, y cultivar durante 3 horas después de la inducción). Estas muestras se pueden dejar correr en SDS-PAGE (por ejemplo, MOPS al 4,12 %) y cuantificar aproximadamente al explorar el gel teñido resultante y al medir el tamaño relativo de las bandas. La solubilidad aumentada tal como se usa en el presente documento es tal como se determina a 25 °C. Esta solubilidad aumentada puede ser un aumento del 10 % en el polipéptido soluble, un aumento del 20 % en el polipéptido soluble, un aumento del 30 % en el polipéptido soluble, un aumento del 50 % en el polipéptido soluble, un aumento del 75 % en el polipéptido soluble, un aumento del 100 % (es decir, dos veces) en el polipéptido soluble, un incremento de tres veces en el polipéptido soluble, un incremento de cuatro veces en el polipéptido soluble, un incremento de cinco veces en el polipéptido soluble, un incremento de siete veces en el polipéptido soluble, o un incremento de diez veces en el polipéptido soluble.

La comparación de la respuesta inmunitaria generada en un sujeto por el polipéptido con la respuesta inmunitaria generadaa por la proteína de longitud completa se puede llevar a cabo por el uso de cualquier medio disponible para al experto en la técnica. Un procedimiento simple tal como se usa en los ejemplos posteriores comprende la inmunización de un sujeto modelo tal como ratón y la estimulación posterior con una dosis letal de E. coli. Para una comparación apropiada, un experto en la técnica seleccionará de manera natural el mismo adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund. En esta prueba, los fragmentos de polipéptido inmunogénico de la presente invención generarán una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto (por ejemplo, proporcionará sustancialmente la misma protección contra la exposición letal) si, por ejemplo, el polipéptido proporciona al menos el 70 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos el 80 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos el 85 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos el 90 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos el 95 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos el 97 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos el 98 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, o al menos el 99 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa.

La proteína correspondiente contra la cual se compararía el fragmento de polipéptido inmunogénico (tanto para solubilidad como para la respuesta inmunitaria formulada) puede ser cualquier proteína de E. coli correspondiente representativa que incluye, sin limitación las SEQ ID NOs 1-105 y las SEQ ID NOs 653-655. En realizaciones preferidas, la proteína será la proteína de longitud completa correspondiente de la cual se obtiene el fragmento de polipéptido inmunogénico.

En algunas modalidades, el polipéptido inmunogénico contendrá una deleción en relación con la proteína correspondiente de E. coli que da como resultado la solubilidad aumentada. La deleción puede incluir la eliminación de sustancialmente todas las regiones altamente hidrófobas o transmembrana de las secuencias de longitud completa, por ejemplo, el dominio formador de poro amino-terminal para la proteína de hemolisina A (recp3768), el dominio de barril β de la proteína de antígeno 43 de Flu (orf1364), y el dominio translocador putativo para proteína orf405.

La invención también proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de la invención, que comprende la etapa de cultivar una célula hospedadora transformada con ácido nucleico de la invención bajo condiciones que induzcan la expresión del polipéptido. El polipéptido entonces se puede purificar, por ejemplo, a partir de sobrenadantes de cultivo.

La invención proporciona una célula de E. coli, que contiene un plásmido que codifica un polipéptido de la invención. El cromosoma de la célula de E. coli puede incluir un homólogo de la proteína aplicable (por ejemplo, orf353, proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo I), (orf405), antígeno 43 de flu (orf1364), transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia NodT (orf1767), gspK (orf3515), gspJ (orf3516), receptor de sideróforo dependiente de tonB (orf3597), proteína fibrial (orf3613), upec-948, upec-1232, precursor de cadena A de la proteína fimbrial tipo I (upec-1875), homólogo yapH (upec-2820), y hemolisina A (recp-3768)), o éste homólogo puede estar ausente, pero en ambos casos el polipéptido de la invención se puede expresar del plásmido. El plásmido puede incluir un gen que codifica un marcador, etcétera. Estos y otros detalles de los plásmidos solubles se dan a continuación.

Aunque la expresión de los polipéptidos de la invención puede tener lugar en una cepa de E. coli, la invención usará normalmente un hospedador heterólogo para la expresión. El hospedador heterólogo puede ser procariótico (por ejemplo, una bacteria) o eucariótico. Los hospedadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis), levaduras, etcétera.

La invención proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de la invención, que comprende el paso de sintetizar al menos parte del polipéptido por medios químicos.

Cualquiera y todas las anteriores proteínas, polipéptidos, polipéptidos híbridos, epítopos y fragmentos inmunogénicos pueden estar en cualquiera de varias formas que incluyen, sin limitación, recombinante, aislada o sustancialmente purificada (de materiales coexistentes con estas proteínas, polipéptidos, polipéptidos híbridos, epítopos y fragmentos inmunogénicos en su estado natural).

Ácidos nucleicos

La invención también proporciona ácido nucleico que codifica polipéptidos y polipéptidos híbridos de la invención. También proporciona ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más polipéptidos o polipéptidos híbridos de la invención.

La invención también proporciona ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos que tienen identidad de secuencia con estas secuencias de nucleótidos. La identidad entre secuencias se determina de manera preferente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman tal como se describe anteriormente. Estos ácidos nucleicos incluyen aquellos que usan codones alternativos para codificar el mismo aminoácido.

La invención también proporciona ácido nucleico que puede hibridar con estos ácidos nucleicos. Las reacciones de hibridación se pueden realizar bajo condiciones de diferente “rigurosidad”. Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y están publicadas en la técnica (por ejemplo, página 7.52 de Sambrook y col. (2001) Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3a edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden creciente de rigurosidad): temperaturas de incubación de 25 °C, 37 °C, 50 °C, 55 °C y 68 °C; concentraciones de tampón de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (en donde SSC es tampón de NaCl 0,15 M y citrato 15 mM) y sus equivalentes usando otros sistemas de tampón; concentraciones de formamida al 0 %, 25 %, 50 % y 75 %; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas, 1, 2, o más etapas de lavado; tiempos de incubación de lavado de 1, 2, o 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC, o agua desionizada. Las técnicas de hibridación y su optimización se conocen bien en la técnica (ver por ejemplo, referencias 25, 26, Sambrook y col. (2001), etcétera].

En algunas realizaciones, el ácido nucleico de la invención hibrida con una diana bajo condiciones de baja rigurosidad, en otras realizaciones, hibrida en condiciones de rigurosidad intermedia; en realizaciones preferidas, hibrida en condiciones de alta rigurosidad. Un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación de baja rigurosidad es 50 °C y 10 x SSC. Un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación de rigurosidad intermedia es 55 °C y 1 x SSC. Un conjunto de ejemplo de condiciones de hibridación de alta rigurosidad es 68 °C y 0,1 x SSC.

La invención incluye ácido nucleico que comprende secuencias complementarias a estas secuencias (por ejemplo, para antisentido o sondeo, o para el uso como cebadores).

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden usar en reacciones de hibridación (por ejemplo análisis por transferencias de Northen o de Southern, o en micromatrices de ácido nucleico o “chips génicos”) y reacciones de amplificación (por ejemplo, PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, etcétera) y otras técnicas de ácido nucleico.

El ácido nucleico de acuerdo a la invención puede tomar varias formas (por ejemplo, de cadena simple, de cadena doble, vectores, cebadores, sondas, marcado, etcétera). Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser circulares

o ramificados, pero en general serán lineales. A menos que se especifique o requiera de otro modo, cualquier realización de la invención que utilice un ácido nucleico puede utilizar tanto la forma de cadena doble como cada una de las dos formas de cadena simple complementarias que constituyen la forma de doble cadena. Los cebadores y sondas en general son de cadena simple, como son los ácidos nucleicos antisentido.

Los ácidos nucleicos de la invención se proporcionan de manera preferente en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos (por ejemplo, libres de ácidos nucleicos que se presentan de forma natural), particularmente de otros ácidos nucleicos de E. coli o célula hospedadora, en general, que son al menos aproximadamente el 50 % puros (en peso), y normalmente al menos aproximadamente el 90 % puros. Los ácidos nucleicos de la invención son de manera preferente ácidos nucleicos de E. coli. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar de muchas maneras, por ejemplo por síntesis química (por ejemplo, síntesis de fosforamidita de ADN) en su totalidad o en parte, al digerir ácidos nucleicos más largos usando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción), al unir ácidos nucleicos o nucleótidos más cortos (por ejemplo, usando ligasas o polimerasas), a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc, etcétera.

El ácido nucleico de la invención se puede unir a un soporte sólido (por ejemplo, una perla, placa, filtro, película, portaobjetos, soporte de micromatriz, resina, etcétera). El ácido nucleico de la invención se puede marcar por ejemplo, con un marcador radiactivo o fluorescente, o un marcador de biotina. Esto es particularmente útil cuando el ácido nucleico se va a usar en técnicas de detección, por ejemplo cuando el ácido nucleico es un cebador o como una sonda.

El término “ácido nucleico” incluye, en general, una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que contiene desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y/o sus análogos. Incluye ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN. También incluye análogos de ADN o ARN, tal como aquellos que contienen estructuras modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o fosforotioatos) o bases modificadas. De esta manera, la invención incluye ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADN, ADNc, ácidos nucleicos recombinantes, ácidos nucleicos ramificados, plásmidos, vectores, sondas, cebadores, etcétera. Cuando el ácido nucleico de la invención toma la forma de ARN, pueden tener o no un casquete de 5’.

Los ácidos nucleicos de la invención puede ser parte de un vector, es decir, parte de una construcción de ácido nucleico diseñada para transducción/transfección de uno o más tipos de células. Los vectores pueden ser, por ejemplo, “vectores de clonación”, que se diseñan para aislamiento, propagación y repetición de nucleótidos insertados, “vectores de expresión”, que se diseñan para la expresión de una secuencia de nucleótidos en una célula hospedadora, “vectores virales”, que se diseñan para dar como resultado la producción de un virus recombinante o partículas tipo vírico, o “vectores de transposición”, que comprenden los atributos de más de un tipo de vector. Los vectores preferidos son plásmidos, tal como se menciona anteriormente. Una “célula hospedadora”, incluye una célula individual o un cultivo celular que pueden ser o ha sido un receptor de ácido nucleico exógeno. Las células hospedadoras incluyen la progenie de una única célula hospedadora, y la progenie no necesariamente puede ser completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) a la célula progenitora original, debido al cambio y/o a la mutación natural, accidental o deliberada. Las células hospedadoras incluyen linfocitos Transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con ácido nucleico de la invención.

Cuando un ácido nucleico es ADN, se apreciará que “U” en una secuencia de ARN se reemplazará “T” en el ADN. De manera similar, cuando un ácido nucleico es ARN, se apreciará que “T” en una secuencia de ADN se reemplazará por “U” en el ARN.

El término “complemento” o “complementariedad” cuando se usa en relación con ácidos nucleicos se refiere a apareamiento de bases de Watson-Crick. De esta manera, el complementario de C es G, el complementario de G es C, el complementario de A es T (o U), y el complementario de T (o U) es A. También es posible usar bases tal como I (la purina inosina), por ejemplo para complementar pirimidinas (C o T).

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden usar, por ejemplo: para producir polipéptidos, como sondas de hibridación para la detección de ácidos nucleicos en muestras biológicas; para generar copias adicionales de los ácidos nucleicos; para generar ribozimas u oligonucleótidos antisentido; como sondas o cebadores de ADN de cadena simple; o como oligonucleótidos que forman triple hebra.

La invención proporciona un procedimiento para producir ácido nucleico de la invención, en el que el ácido nucleico se sintetiza en parte o en su totalidad usando medios químicos.

La invención proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo, vectores de clonación o de expresión) y las células hospedadoras transformadas con estos vectores.

La amplificación de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser cuantitativa y/o en tiempo real.

Para ciertas realizaciones de la invención, los ácidos nucleicos son de manera preferente de al menos 7 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300 nucleótidos o más largos).

Para ciertas realizaciones de la invención, los ácidos nucleicos son preferentemente como máximo de 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 nucleótidos o más cortos).

Los cebadores y sondas de la invención, y otros ácidos nucleicos usados para hibridación, son preferentemente de entre 10 y 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos).

Composiciones y medicamentos inmunogénicos

Los polipéptidos de la invención son útiles como ingredientes activos (inmunógenos) en composiciones inmunogénicas, y estas composiciones pueden ser útiles como vacunas. Las vacunas de acuerdo a la invención, pueden ser ya sea profilácticas (es decir, para impedir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero típicamente serán profilácticas.

Las composiciones inmunogénicas serán farmacéuticamente aceptables. Normalmente, incluirán componentes además de los antígenos por ejemplo, incluirán típicamente uno o más vehículos, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Un análisis completo de los vehículos y excipientes está disponible en la referencia 155. Los análisis completos de adyuvantes de vacunas están disponibles en las referencias 27 y 28.

Las composiciones se administrarán en general a un mamífero en forma acuosa. Antes de la administración, sin embargo, la composición puede haber estado en una forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se elaboran en forma acuosa, después se rellenan y se distribuyen y se administran también en una forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante la elaboración y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento de su uso. De esta manera, una composición de la invención puede estar seca, tal como una formulación liofilizada.

La composición puede incluir conservantes tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Sin embargo, se prefiere que la vacuna deba estar sustancialmente libre (es decir, menos de 5 μg/ml) material de mercurio por ejemplo, sin tiomersal. Las vacunas que no contienen mercurio son más preferidas. Se prefieren particularmente vacunas sin conservantes.

Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente protector de la temperatura.

Para la controlar la tonicidad, se prefiere una sal fisiológica, tal como una sal sódica. Se prefiere cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo aproximadamente 10±2 mg/ml de NaCl. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etcétera.

En general, las composiciones tendrán una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg, y estarán más preferentemente dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón de fosfato, un tampón Tris, un tampón de borato, un tampón de succinato, un tampón de histidina (particularmente, con un adyuvante de hidróxido de aluminio), o un tampón de citrato. Los tampones se incluirán típicamente en el intervalo de 5-20 mM.

El pH de una composición estará en general entre 5,0 y 8,1, y más típicamente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo 6,5 y 7,5

o entre 7,0 y 7,8.

La composición es preferentemente estéril. La composición es preferentemente no pirogénica por ejemplo, que contiene <1 UE (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y de manera preferente <0,1 UE por dosis. La composición es preferentemente sin gluten.

La composición puede incluir material para una inmunización individual, o puede incluir material para múltiples inmunizaciones (es decir, un kit “múltidosis”). La inclusión de un conservante se prefiere en disposiciones multidosis. Como una alternativa (o además) para incluir un conservante en las composiciones multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tiene un adaptador aséptico para eliminación del material.

Las vacunas humanas se administran típicamente en un volumen de dosis de aproximadamente 0,5 ml, aunque se pueden administrar medias dosis (es decir, aproximadamente 0.25 ml) a niños.

Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. Preferentemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2, analizados adicionalmente a continuación

Los adyuvantes que se pueden usar en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales adecuadas para el uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio (o mezclas de estas). Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas “CAP” descritas en la referencia 29). Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etcétera, con las sales que toman cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etcétera). Se prefiere la adsorción a estas sales. Las composiciones que contienen mineral también se pueden formular como una partícula de sal de metálica [30].

Se pueden usar los adyuvantes conocidos tales como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. Estos nombres son convencionales, pero se usan sólo por conveniencia, puesto que no es una descripción precisa del compuesto químico real que está presente (véase por ejemplo, el capítulo 9 de la referencia 27). La invención puede usar cualquiera de los adyuvantes de “hidróxido” o “fosfato” que son de uso en general como adyuvantes. Los adyuvantes conocidos como “hidróxido de aluminio” son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, que normalmente son al menos parcialmente cristalinas. Los adyuvantes conocidos como “fosfato de aluminio” son típicamente hidroxifosfatos de aluminio, que también contienen frecuentemente una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato de hidroxifosfato de aluminio). Se pueden obtener por precipitación, y las condiciones de reacción y concentraciones durante la precipitación influyen en el grado de sustitución de hidroxilo por fosfato en la sal.

Una morfología fibrosa (por ejemplo, como se ve en micrografías electrónicas de transmisión) es típica para adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pI de los adyuvantes de hidróxido de aluminio es típicamente de aproximadamente 11, es decir, el propio adyuvante tiene una carga superficial positiva a pH fisiológico. Se han documentado capacidades absorbentes de entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de hidróxido de aluminio.

Los adyuvantes de fosfato de aluminio tienen en general una relación molar de PO4/Al entre 0,3 y 1,2, preferentemente entre 0,8 y 1,2 y más preferentemente de 0,95±0,1. El fosfato de aluminio en general, será amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato. Un adyuvante típico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de PO4/Al entre 0,84 y 0,92, incluido a 0,6 mg de Al3+/ml. El fosfato de aluminio está en general en partículas (por ejemplo, morfología tipo placa tal como se ve en micrografías electrónicas de transmisión). Los diámetros típicos de las partículas están en el intervalo de 0,5-20 μm (por ejemplo, aproximadamente de 5-10 μm) después de cualquier adsorción de antígeno. Las capacidades adsorbentes de entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg Al+++ a pH 7,4 se han documentado para adyuvantes de fosfato de aluminio.

El punto de carga cero (PZC, por sus siglas en inglés) de fosfato de aluminio está inversamente relacionado con el grado de sustitución de hidroxilo por fosfat y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y de la concentración de los reactivos usados para preparar la sal por precipitación. El PZC también se altera al cambiar la concentración de iones libres de fosfato en solución (más fosfato = más PZC ácido) o al añadir un tampón tal como un tampón de histidina (que hace al PZC más básico). Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo con la invención tendrán en general un PZC de entre 4,0 y 7,0, más preferentemente entre 5,0 y 6,5, por ejemplo aproximadamente de 5,7.

Las suspensiones de sales de aluminio usadas para preparar las composiciones de la invención pueden contener un tampón (por ejemplo, un tampón de fosfato o de histidina o de Tris), pero esto no siempre es necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y sin pirógenos. Una suspensión puede incluir iones fosfato, acuosos, libres, por ejemplo presentes a una concentración de entre 1,0 y 20 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM, y más preferentemente de aproximadamente 10 mM. Las suspensiones también pueden comprender cloruro de sodio.

La invención puede usar una mezcla tanto de un hidróxido de aluminio como de un fosfato de aluminio. En este caso, puede haber más fosfato de aluminio que hidróxido, por ejemplo una proporción en peso de al menos 2:1 por ejemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etcétera.

La concentración de Al+++ en una composición para la administración a un paciente es de manera preferente menos de 10 mg/ml por ejemplo < 5 mg/ml, < 4 mg/ml, < 3 mg/ml, < 2 mg/ml, < 1 mg/ml, etcétera. Un intervalo preferido está entre 0,3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0,85 mg/dosis.

B. Emulsiones de aceite

Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tal como MF59 [Capítulo 10 de la referencia 27, véase también la referencia 31] (escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 %, formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador). El adyuvante completo de Freund (CFA, por sus siglas en inglés) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés), también se pueden usar.

Se conocen varios adyuvantes de emulsión de aceite en agua, y típicamente incluyen al menos un aceite y al menos un agente tensioactivo, siendo los aceites y agentes tensioactivos biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Las gotas de aceite en la emulsión en general son de menos de 5 µm de diámetro, y de manera ideal tiene un diámetro submicrométrico, alcanzando estos tamaños pequeños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren gotas con un tamaño menor de 220 nm, puesto que se pueden someter a esterilización en filtro.

La emulsión puede comprender aceites, tales como aquellos de origen animal (tales como pescado) o vegetal. Las fuentes para aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de frutos secos. Se puede usar aceite de jojoba por ejemplo, obtenido de frijol de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de ajonjolí, y similares. En el grupo de granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también se puede usar el aceite de otros cereales de grano tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, triticale y similares. Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no son aceites de semilla de origen natural, se pueden preparar por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de los aceites de frutos secos y de semillas. Las grasas y aceites de leche de mamífero son metabolizables y por lo tanto se pueden usar en la práctica de la presente invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son bien conocidos en la técnica. La mayoría de los animales marinos contienen aceites metabolizables que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón y el aceite ballena tal como el esperma ejemplifican varios de los aceites de animales marinos que se pueden usar en el presente documento. Se sintetizan bioquímicamente varios aceites de cadena ramificada en unidades de isopreno de 5 carbonos y en general se refieren como terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene terpenoides ramificados, insaturados conocidos como escualeno, 2,6,10,15,19,23hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que es particularmente preferido en la presente. El escualano, el análogo saturado de escualeno, también es un aceite preferido. Los aceites de animales marinos, que incluyen escualeno y escualano, están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o se pueden obtener por procedimientos conocidos en la técnica. Otros aceites preferidos son los tocoferoles (véase a continuación). Se pueden usar mezclas de aceites.

Los agentes tensioactivos se pueden clasificar por su “HLB”, por sus siglas en inglés (equilibrio hidrófilo/lipófilo). Los agentes tensioactivos preferidos de la invención tienen un HLB de al menos 10, preferentemente al menos 15, y más preferentemente al menos 16. La invención se puede usar con agentes tensioactivos, que incluyen pero no se limitan a: los agentes tensioactivos de ésteres de polioxietilen-sorbitán (citados comúnmente como los Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (OE), óxido de propileno (OP), y/o óxido de butileno (OB), vendidos bajo el nombre comercial DowfaxTM, tal como copolímeros de bloque lineales de OE/OP; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos repetitivos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo), con octoxinol-9 (Triton X-100 o t-octilfenoxipolietoxietanol) que es de interés particular; (octilfenoxi) polietoxietanol (IGEPAL CA630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina), etoxilatos de nonilfenol, tales como la serie TergitolTM NP; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes láurico, cetílico, esteárico y oleílico (conocidos como agentes tensioactivos Brij), tales como éter monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30) y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como los SPAN), tales como trioleato de sorbitan (Span 85) y monolaurato de sorbitan. Se prefieren agentes tensioactivos no iónicos. Los agentes tensioactivos preferidos para incluir en emulsión son Tween 80 (monooleato de polioxietilen sorbitán), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Triton X-100.

Se pueden usar mezclas de agentes tensioactivos, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85. Una combinación de un éster de polioxietilen-sorbitan tal como monooleato de polioxietilen-sorbitan (Tween 80) y también es adecuado un octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietilen-sorbitan y/o un octoxinol.

Las cantidades preferidas de agentes tensioactivos (% en peso) son: éster de polioxietilen-sorbitan (tal como Tween 80) del 0,01 al 1 %, en particular aproximadamente el 0,1 %; octil-o nonilfenoxi-polioxietanoles (tales como Triton X100, u otros detergentes en la serie Triton) del 0,001 al 0,1 %, en particular del 0,005 al 0,02 %; éteres de polioxietileno (tales como laureth 9) del 0,1 al 20 %, preferentemente del 0,1 al 10 % y en particular, del 0,1 al 1 % o aproximadamente el 0,5 %.

Los adyuvantes de emulsión preferidos tienen un tamaño promedio de gota de <1 μm por ejemplo 750nm, 500nm, 400nm, 300nm, 250nm, 220nm, 200nm, o más pequeño. Estos tamaños de gota se pueden alcanzar de manera conveniente por técnicas tal como microfluidización.

Los adyuvantes específicos de emulsión de aceite en agua útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a:

 Una emulsión submicrométrica de escualeno, Tween 80, y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser aproximadamente de escualeno al 5 %, polisorbato 80 a aproximadamente el 0,5 % y Span 85 al 0,5 %. En términos de peso, estas relaciones llegan a ser del 4,3 % de escualeno, el 0,5 % de polisorbato 80 y el 0,48 % de Span 85. Este adyuvante se conoce como ‘MF59’ [32-33], tal como se describe en más detalle en el capítulo 10 de la referencia 34 y en el capítulo 12 de la referencia 35. La emulsión MF59 incluye de manera ventajosa iones citrato, por ejemplo tampón de citrato de sodio 10 mM.

 Una emulsión de escualeno, un tocoferol, y Tween 80. La emulsión puede incluir solución salina tamponada con fosfato. También puede incluir Span 85 (por ejemplo al 1 %) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener del 2 al 10 % de escualeno, del 2 al 10 % de tocoferol y del 0,3 al 3 % de Tween 80, y la relación en peso de escualeno:tocoferol es preferentemente 1 puesto que esto proporciona una emulsión más estable. El escualeno y el Tween 80 pueden estar presentes a una proporción volumétrica de aproximadamente 5:2. Esta emulsión se puede producir al disolver Tween 80 en PBS para dar una solución al 2 %, después mezclar 90 ml de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-α-tocoferol y 5 ml de escualeno), luego microfluidizar la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotas submicrométricas de aceite, por ejemplo con un diámetro promedio de entre 100 y 250 nm, preferentemente de aproximadamente 180 nm.

 Una emulsión de escualeno, un tocoferol, y un detergente Triton (por ejemplo Triton X-100). La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (ver posteriormente). La emulsión puede contener un tampón de fosfato.

 Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo polisorbato 80), un detergente Triton (por ejemplo Triton X-100) y un tocoferol (por ejemplo un succinato de α-tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes a una relación en masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo 750 μg/ml de polisorbato 80, 110 μg/ml de Triton X-100 y 100 μg/ml de succinato de α-tocoferol), y estas concentraciones deben incluir cualquier contribución de estos componentes a partir de antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (ver posteriormente). La fase acuosa puede contener un tampón de fosfato.

 Una emulsión de escualeno, polisorbato 80 y poloxámero 401 (“PluronicTM L121”). La emulsión se puede formular en solución salina tamponada con fosfato, a pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de distribución útil para muramil-dipéptidos, y se ha usado con treonil-MDP en el adyuvante “SAF-1” [36] (Thr-MDP al 0,05-1 %, escualeno al 5 %, Pluronic L 121 al 2,5 % y polisorbato 80 al 0,2 %). También se puede usar sin el Thr-MDP, como en el adyuvante “AF”: [37] (escualeno al 5 %, Pluronic L 121 al 1,25 % y polisorbato 80 al 0,2 %). Se prefiere la microfluidización.

 Una emulsión que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un agente tensioactivo no iónico hidrófilo de polioxietileno-alquil-éter (por ejemplo éter cetoestarílico de polioxietileno (12) y un agente tensioactivo no iónico hidrófobo (por ejemplo éster de sorbitan o éster de manida, tal como monoleato de sorbitan o “Span 80”). La emulsión es preferentemente termoreversible y/o tiene al menos el 90 % de gotas de aceite (en volumen) con un tamaño menor de 200 nm [38]. La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo un azúcar tal como dodecilmaltosida y/o sacarosa); y/o un alquilpoliglicósido. Estas emulsiones se pueden liofilizar.

 Una emulsión de escualeno, poloxámero 105 y Abil-Care [39]. La concentración final (en peso) de estos componentes en vacunas con adyuvante son el 5 % de escualeno, el 4 % de poloxámero 105 (poliol plurónico) y el 2 % de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicérido caprílico/cáprico).

 Una emulsión que tiene el 0,5-50 % de un aceite, el 0,1-10 % de un fosfolípido, y el 0,05-5 % de un agente tensioactivo no iónico. Tal como se describe en la referencia 40, los componentes preferidos de fosfolípidos son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina. Los tamaños submicrométricos de las gotas son ventajosos.

 Una emulsión de aceite en agua submicrométrica de un aceite no metabolizable (tal como aceite mineral ligero) y al menos un agente tensioactivo (tal como lecitina, Tween 80 o Span 80). Se pueden incluir aditivos, tales como saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina-lipofilo (tal como GPI-0100, descrito en la referencia 41, producido por la adición de amina alifática a desacilsaponina mediante el grupo carboxilo de ácido glucurónico), bromuro de dimetiidioctadecilamonio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil)propanodiamina.

 Una emulsión en la cual están asociados una saponina (por ejemplo QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo un colesterol) como micelas helicoidales [42].

 Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol grado etoxilado lipófilo no iónico, y un agente tensioactivo hidrófilo no iónico (por ejemplo un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietilenpolioxipropileno) [43].

 Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado, hidrófilo, no iónico, y un agente tensioactivo lipófilo no iónico (por ejemplo un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietilenopolioxipropileno [43].

En algunas realizaciones, se puede mezclar una emulsión con antígeno de forma extemporánea, en el momento de la administración, y de esta manera, el adyuvante y el antígeno se puede mantener de forma separada en una vacuna envasada o distribuida, lista para formulación final en el momento del uso. En otras realizaciones, una emulsión se mezcla con antígeno durante la elaboración, y de esta manera la composición se envasa en una forma líquida con adyuvante. El antígeno estará en general en una forma acuosa, de manera que la vacuna se prepare finalmente al mezclar los líquidos. La relación en volumen de los dos líquidos para mezclado puede variar (por ejemplo entre 5:1 y 1:5) pero en general es aproximadamente 1:1. Cuando se dan concentraciones de componentes en las descripciones anteriores de emulsiones específicas, estas concentraciones son típicamente para una composición no diluida, y la concentración después del mezclado con una solución de antígeno disminuirá de esta manera.

Cuando una composición incluye un tocoferol, se puede usar cualquiera de los α, β, , , ε o ξ tocoferoles, pero se prefieren los α-tocoferoles. El tocoferol puede tomar varias formas, por ejemplo, diferentes sales y/o isómeros. Las sales incluyen sales orgánicas, tales como succinato, acetato, nicotinato, etc. Se pueden usar tanto D-α-tocoferol como DL-α-tocoferol. Los tocoferoles se incluyen de manera ventajosa en vacunas para uso en pacientes de edad avanzada (por ejemplo con edad de 60 años o más) debido a que se ha documentado que la vitamina E tiene un efecto positivo en la respuesta inmunitaria en este grupo de pacientes [44]. También tienen propiedades antioxidantes que pueden ayudar a estabilizar las emulsiones [45]. Un α-tocoferol preferido es DL-α-tocoferol, y la sal preferida de este tocoferol es el succinato. Se ha descubierto que la sal de succinato coopera con ligandos relacionados con TF in vivo.

C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de referencia 27]

También se pueden usar formulaciones de saponina como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterogéneo de glucósidos de esterol y glucósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una amplia variedad de especies vegetales. La saponina de la corteza del árbol de Molina Quillaia saponaria se ha estudiado ampliamente como adyuvante. La saponina también se puede obtener de forma comercial de Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia), y Saponaria officianalis (raíz de jabón). Las formulaciones con adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tal como QS21, así como formulaciones de lípidos, tal como ISCOM. El QS21 se comercializa como StimulonTM.

Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones purificadas específicas usando estas técnicas, que incluyen QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C.

Preferentemente, la saponina es QS21. Un procedimiento de producción de QS21 se describe en la referencia 46. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [47].

Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden usar para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimuladores (ISCOM) [capítulo 23 de la referencia 27]. Los ISCOM incluyen también típicamente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Se puede usar cualquier saponina conocida en los ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las referencias 47-48. Opcionalmente, los ISCOMS pueden estar desprovisto de detergente adicional [49].

En la referencia 50 y 51 se puede encontrar una revisión de desarrollo de adyuvantes basados en saponina.

D. Virosomas y partículas de tipo virus

También se pueden usar virosomas y partículas tipo virus (VLP) como adyuvantes en la invención. Estas estructuras contienen en general una o más proteínas de un virus opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolípido. En general no son patógenos, no son replicantes y en general no contienen nada del genoma vírico natural. Las proteínas víricas se pueden producir de manera recombinante o se aíslan de los virus completos. Estas proteínas víricas adecuadas para su uso en los virosomas o VLP incluyen proteínas que derivan del virus de la gripe (tal como HA o NA), del virus de la hepatitis B (tal como proteínas del núcleo o de la cápside), del virus de la hepatitis E, del virus del sarampión, del virus Sindbis, de rotavirus, del virus de la enfermedad de pies y boca, de retrovirus, del virus de Norwalk, de virus de papiloma humano, del VIH, de ARN-fagos, del fago Q (tales como proteínas de la cubierta), de fago GA, de fago fr, de fago AP205, y de Ty (tal como proteína p1 de Ty de retrotransposon). Las VLP se analizan adicionalmente en las referencias 52-53. Los virosomas se analizan adicionalmente por ejemplo en la referencia 54.

E. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), derivados de lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas ADP-ribosilantes y derivados detoxificados de estos.

Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil-lípido A (MPL) y MPL 3-O-deacilado (3dMPL). El 3dMPL es una mezcla de monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma preferida de “partícula pequeña” del monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado se describe en la referencia 55. Estas “partículas pequeñas” de 3dMPL son suficientemente pequeñas para esterilizarlas por filtración a través de una membrana de 0,22 µm [55]. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen imitadores de monofosforil-lípido A, tal como derivados de aminioalquil-glucosaminida-fosfato, por ejemplo RC-529 [56,57].

Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tales como OM-174. El OM-174 se describe por ejemplo en las referencias 58 y 59.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para su uso, adyuvantes de la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una citocina no metilada enlazada por un enlace de fosfato a una guanosina). Los ARN de cadena doble y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) también han demostrado ser inmunoestimuladores.

El CpG puede incluir modificaciones de nucleótidos/análogos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble cadena o de cadena simple. Las referencias 60, 61 y 62 describen posibles sustituciones análogas por ejemplo reemplazo de guanosina con 2’-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos de CpG se analiza adicionalmente en las referencias 63-64.

La secuencia de CpG se puede dirigir a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [65]. La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria de Th1, tal como un CpG-AODN, o puede ser más específico para inducir una respuesta de células B, tal como CpG-B ODN. CpG-A y CpG-B ODN se analizan en las referencias 66-67. Preferentemente, el CpG es un CpG-A ODN.

Preferentemente, el oligonucleótido está construido tal forma que el extremo 5’ es accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, se pueden unir dos secuencias de oligonucleótidos de CpG en sus extremos 3’ para formar “inmunómeros”. Véase, por ejemplo, las referencias 65 y 68-69.

Un adyuvante útil de CpG es CpG7909, también conocido como ProMuneTM (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Otro es CpG1826. Como alternativa, o adicionalmente, al uso de la secuencia de CpG, se pueden usar secuencias de TpG [70], y estos oligonucleótidos pueden estar sin de motivos de CpG no metilados. El oligonucleótido inmunoestimulador puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido consecutivo de timidina (por ejemplo TTTT, tal como se describe en la referencia 70), y/o puede tener una composición de nucleótidos con >25 de timidina (por ejemplo >35 %, >40 %, >50 %, >60 %, >80 %, etc.). Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido consecutivo de citosina (por ejemplo CCCC, tal como se describe en la referencia 70), y/o puede tener una composición de nucleótidos con >25 % de citosina (por ejemplo >35 %, >40 %, >50 %, >60 %, >80 %, etc.). Estos oligonucleótidos pueden estar sin motivos de CpG no metilados. Típicamente los oligonucleótidos inmunoestimuladores comprenderán al menos 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos.

Un adyuvante particularmente útil basado en oligonucleótidos inmunoestimuladores se conoce como IC-31TM [71]. De esta manera, un adyuvante usado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo entre 15-40 nucleótidos) que incluye al menos un (y preferentemente muchos) motivo Cpl (es decir, una citosina enlazada a una inosina para formar un dinucleótido), y (ii) un polímero catiónico tal como un oligopéptido (por ejemplo entre 5-20 aminoácidos) que incluyen al menos una (y preferentemente muchas) secuencia tripeptídica de Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende la secuencia 26-meros 5’-(IC)13-3' (SEQ ID NO: 684). El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 11mero KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 685).

Se pueden usar toxinas ADP-ribosilantes bacterianas y derivados desoxificados de las mismas, adyuvantes en la invención. Preferentemente, la proteína deriva de E. coli (enterotoxina “LT” térmicamente lábil de E. coli), cólera (“CT”), o pertussis (“PT”). El uso de toxinas ADP-ribosilantes destoxificadas, adyuvantes mucosos se describe en la referencia 72 y como adyuvantes parenterales en la referencia 73. La toxina o toxoide está preferentemente en la forma de una holotoxina, que comprende tanto subunidades A como B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación destoxificante; preferentemente, la subunidad B no está mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72, y LT-G192. El uso de toxinas ADP-ribosilantes y derivados destoxificados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes se puede encontrar en la referencia 74-75. Un mutante CT útil es CT-E29H [76]. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácido se basa preferentemente en las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas ADP-ribosilantes expuestas en la referencia 77, incorporada específicamente en el presente documento como referencia en su totalidad sólo para el propósito de la alineación y numeración de aminoácidos de la presente.

F. Inmunomoduladores humanos

Los inmunomoduladores humanos adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas tales como interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [78], etc.) [79], interferones (por ejemplo interferon-), factor estimulante de colonia de macrófagos, y factor de necrosis tumoral. Un inmunomodulador preferido es IL-12.

G. Bioadhesivos y mucoadhesivos

También se pueden usar bioadhesivos y mucoadhesivos como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas esterificadas de ácido hialurónico [80] o mucoadhesivos tal como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinil-pirolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. También se pueden usar quitosan y derivados del mismo como adyuvantes en la invención [81].

H. Micropartículas

También se pueden usar micropartículas como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (es decir, una partícula con un diámetro de ~100 nm a ~ 150 μm, preferentemente de ~ 200 nm a ~ 30 μm, y más preferentemente un diámetro de ~ 500 nm a ~ 10 μm) formadas de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo un poli(α-hidroxi-ácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactido-co-glucolida) son preferidos, opcionalmente tratados para tener una superficie de carga negativa (por ejemplo con SDS) o una superficie positivamente cargada (por ejemplo con un detergente catiónico, tal como CTAB).

I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la referencia 27)

Los ejemplos de formulaciones de liposoma adecuadas para su uso como adyuvantes se describen en las referencias 82-83.

J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno

Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [84]. Tales formulaciones incluyen además agentes tensioactivos de éster de polioxietileno-sorbitan en combinación con un octoxinol [85] así como agentes tensioactivos de éster o éter de polioxietileno-alquilo en combinación con al menos un agente tensioactivo no iónico adicional tal como octoxinol [86]. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: éter de polioxietilen-9-lauril (laureth 9), éter de polioxietilen-9-esteorilo, éter de polioxitileno-8-esteorilo, éter de polioxietilen-4-laurilo, éter de polioxietilen-35-laurilo, y éter de polioxietilen-23-laurilo.

K. Fosfazenos

Se puede usar un fosfazeno, tal como poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno] (“PCPP”) tal como se describe, por ejemplo, en las referencias 87 y 88.

L. Péptidos de muramilo

5 Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para su uso como adyuvantes de la invención incluyen N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), y Nacetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).

M. Compuestos de Imidazoquinolona

Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso como adyuvantes de la invención

10 incluyen Imiquimod (“R-837”) [89,90], Resiquimod (“R-848”) [91], y sus análogos; y sales de los mismos (por ejemplo, las sales de clorhidrato). Los detalles adicionales a cerca de las imidazoquinolinas inmunoestimuladoras se pueden encontrar en referencias 92 a 93.

N. Ureas Sustituidas

Las ureas sustituidas útiles como adyuvantes incluyen compuestos de la fórmula I, II o III, o sales de los mismos:

como se define en la referencia 94, tal como ‘ER 803058’, ‘ER 803732’, ‘ER 804053’, ER 804058’, ‘ER 804059’, ‘ER 804442’, ‘ER 804680’, ‘ER 804764’, ER 803022 o ‘ER 804057’ por ejemplo:

O. Adyuvantes Adicionales

Los adyuvantes adicionales que se pueden usar con la invención incluyen:

 Un derivado de fosfato de aminoalquil-glucosaminida, tal como RC-529 [95,96].

5  Un compuesto de tiosemicarbazona, tales como los descritos en la referencia 97. Los procedimientos para formular, elaborar y examinar compuestos activos también se describen en la referencia 97. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tal como TNF-α.

 Un compuesto de triptantrina, tal como aquellos descritos en la referencia 98. Los procedimientos para formular,

10 elaborar y examinar compuestos activos también se describen en la referencia 98. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tal como TNF-α.

 Un análogo de nucleósido, tal como: (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):

15 y profármacos de los mismos; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) los compuestos descritos en las referencias 99 a 100, Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) [101].

 Compuestos descritos en la referencia 102, que incluyen: compuestos de acilpiperazina, compuestos de indolediona, compuestos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compuestos de benzociclodiona, compuestos de aminoazavinilo, compuestos de aminobenzimidazol-quinolinona (ABIQ) [103, 104], compuestos de

20 hidraftalamida, compuestos de benzofenona, compuestos de isoxazol, compuestos de esterol, compuestos de quinazilinona, compuestos de Pirrol [105], compuestos de antraquinona, compuestos de quinoxalina, compuestos de triazina, compuestos de pirazalopirimidina, y compuestos de benzazol [106].

 Compuestos que contienen lípidos enlazados a una estructura acíclica que contiene fosfato, tal como el antagonista de TLR4 E5564 [107,108]:

25  Polímero de polioxidonio [109, 110] u otro derivado de polietileno-piperazina N-oxidado.

 5’-monofosfato de metil-inosina (“MIMP”) [111].

 Un compuesto de pirrolizidina polihidroxilado [112], tal como uno que tiene la fórmula: cuando R se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, grupos acilo, alquilo, (por ejemplo cicloalquilo), alquenilo, alquinilo y arilo, rectos o ramificados, insustituidos o sustituidos, saturados o insaturados, o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado del mismo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: casuarina, casuarina-6-α-D-glucopiranosa, 3-epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3,7-diepi/-casuarina, etc.

5  Un ligando de CD1d, tal como α-glicosilceramida [113-114] (por ejemplo α-galactosilceramida), αglicosilceramidas que contienen fitoesfingosina, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-galactopiranosil)-2-(Nhexacosanoilamino)-1,3,4-octadecanotriol], CRONY-101, 3”-O-sulfo-galactosilceramida, etc.

 Una gamma-inulina [115] o derivado de la misma, tal como algammulina.

10 Combinaciones de adyuvantes

La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar las siguientes composiciones de adyuvantes en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [116]; (2) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) [117]; (3) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 15 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [118];

(5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [119]; (6) SAF, que contiene escualano al 10 %, Tween 80TM al 0,4 %, polímero de bloque plurónico L121 al 5 %, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometido a agitación vorticial para generar una emulsión con tamaño más grande de partícula. (7) sistema adyuvante RibiTM (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al

20 2 %, Tween 80 al 0,2 %, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y estructura de pared celular (CWS), de manera preferente MPL + CWS (DetoxTM): y (8) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).

Otras sustancias que actúan como agentes inmunomoduladores se describen en el capítulo 7 de la referencia 27.

25 El uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio se prefiere en particular, y los antígenos se adsorben en general en estas sales. El fosfato de calcio es otro adyuvante preferido. Otras combinaciones preferidas de adyuvantes incluyen combinaciones de adyuvantes de Th1 y Th2 tal como CpG y alumbre o resiquimod y alumbre. Se puede usar una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL.

Las composiciones de la invención pueden generar tanto una respuesta inmunitaria mediada por células así como

30 una respuesta inmunitaria humoral. Esta respuesta inmunitaria inducirá preferentemente anticuerpos de larga duración (por ejemplo neutralizantes) y una inmunidad mediadas por células que pueda responder rápidamente en la exposición a neumococos.

En general, se piensa que son necesarios dos tipos de linfocitos T, linfocitos CD4 y CD8, para iniciar y/o mejorar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral. Los linfocitos T CD8 pueden expresar un co-receptor de

35 CD8 y se refieren comúnmente como linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés). Los linfocitos T CD8 son capaces de ser reconocidas o interactuar con antígenos presentados en las moléculas de MHC de clase I.

Los linfocitos T CD4 pueden expresar un co-receptor de CD4 y se citan comúnmente como linfocitos T colaboradores. Los linfocitos T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a moléculas del MHC clase II. En la interacción con una molécula de MHC de clase II, las células CD4 pueden segregar factores tales

40 como citocinas. Estas citocinas segregadas pueden activar células B, linfocitos T citotóxicos, macrófagos, y otras células que participan en una respuesta inmunitaria. Los linfocitos T colaboradores o las células CD4+ positiva se pueden dividir adicionalmente en dos subconjuntos funcionalmente distintos: el fenotipo TH1 y el fenotipo TH2 que difieren en su función efectora y de citocina.

Los linfocitos TH1 activados mejoran la inmunidad celular (incluyendo un aumento en la producción de CTL específicas del antígeno) y por lo tanto son de especial valor en la respuesta a infecciones intracelulares. Los linfocitos TH1 activados pueden segregar uno o más de IL-2, IFN-, y TNF-β. Una respuesta inmunitaria de TH1 puede dar como resultado reacciones inflamatorias locales al activar macrófagos, células NK (células citolíticas naturales), y linfocitos T citotóxicos CD8 (CTL). Una respuesta inmunitaria de TH1 también puede actuar para expandir la respuesta inmunitaria al estimular el crecimiento de células B y T con IL-12. Las células B estimuladas con TH1 pueden segregar IgG2a.

Los linfocitos TH2 activados mejoran la producción de anticuerpos y por lo tanto son de valor a responder a infecciones extracelulares. Las linfocitos TH2 activadas pueden segregar una o más de IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10. Una respuesta inmunitaria de TH2 puede dar por resultado la producción de IgG1, IgE, IgA y células B de memoria para protección futura.

Una respuesta inmunitaria mejorada puede incluir una o más de una respuesta inmunitaria de TH1 mejorada y una respuesta inmunitaria de TH2.

Una respuesta inmunitaria de TH1 puede incluir uno o más de un aumento en la CTL, un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria con TH1 (tal como IL-2, IFN-, e TNF-β), un aumento en macrófagos activados, un aumento en la actividad de NK, o un aumento en la producción de IgG2a. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de TH1 mejorada incluirá un aumento en la producción de IgG2a.

Una respuesta inmunitaria de TH1 se puede producir usando un adyuvante de TH1. Un adyuvante de TH1 producirá en general niveles aumentados de producción de IgG2a en relación con la inmunización del antígeno sin el adyuvante. Los adyuvantes de TH1 adecuados para el uso en la invención pueden incluir por ejemplo formulaciones de saponina, virosomas y partículas tipo virus, derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), oligonucleótidos inmunoestimuladores. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores, tal como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG, son adyuvantes de TH1 preferidos para su uso en la invención.

Una respuesta inmunitaria de TH2 puede incluir uno o más de un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria de TH2 (tal como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10), o un aumento en la producción de IgG1, IgE, IgA y células B de memoria. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de TH2 mejorada incluirá un aumento en la producción de IgG1.

Se puede producir una respuesta inmunitaria de TH2 usando un adyuvante de TH2. En general un adyuvante de TH2 producirá niveles aumentados de producción de IgG1 en relación con la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH2 adecuados para su uso en la invención incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite, y toxinas ADP-ribosilantes y derivados destoxificados de las mismas. Las composiciones que contienen minerales tales como sales de aluminio son adyuvantes de TH2 preferidos para su uso en la invención.

Preferentemente, la invención incluye una composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y un adyuvante de TH2. Preferentemente, esta composición produce una respuesta de TH1 mejorada y de TH2 mejorada, es decir, un aumento en la producción tanto de IgG1 como de IgG2a en relación con la inmunización sin un adyuvante. Preferentemente, la composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y de TH2 produce una respuesta inmunitaria de TH1 aumentada y/o de TH2 aumentada en relación con la inmunización con un adyuvante individual (es decir, en relación con la inmunización con un adyuvante de TH1 solo o inmunización con un adyuvante de TH2 solo).

La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria de TH1 y una respuesta de TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria proporciona una o ambas de una respuesta de TH1 mejorada y una respuesta de TH2 mejorada.

La respuesta inmunitaria mejorada puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica y de mucosa. Preferentemente, la respuesta inmunitaria proporciona una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica mejorada y de mucosa mejorada. Preferentemente la respuesta inmunitaria de mucosa es una respuesta inmunitaria de TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de mucosa incluye un aumento en la producción de IgA.

E. coli puede provocar enfermedad en varias localizaciones anatómicas [4] y de este modo las composiciones de la invención se pueden preparar de diversas formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como productos inyectables, ya sea como suspensiones o soluciones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección también se pueden preparar (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición secada por liofilización). La composición se puede preparar para la administración tópica, por ejemplo, como un ungüento, crema o polvo. La composición se puede preparar para administración oral, por ejemplo, como un comprimido o cápsula, como un pulverizador o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición se puede preparar para administración pulmonar por ejemplo como un inhalador, usando un polvo fino o un pulverizador. La composición se puede preparar como un supositorio o un óvulo vaginal. La composición se puede preparar para administración nasal, ótica u ocular, por ejemplo, como gotas. La composición puede estar en forma de kit, diseñado de manera que se reconstituya una composición combinada justo antes de la administración a un paciente. Estos kits pueden comprender uno o más antígenos en forma líquida

o uno o más antígenos liofilizados.

Cuando se va a preparar extemporáneamente una composición antes de su uso, (por ejemplo, cuando se presenta un componente en forma liofilizada) y se presenta como un kit, el kit puede comprender dos frascos, o puede comprender una jeringa ya rellena y un frasco, con los contenidos de la jeringa que se usan para reactivar los contenidos del frasco antes de la inyección.

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaza de antígenos, así como cualquiera de otros componentes, tal como sea necesario. Por “cantidad inmunológicamente eficaz” se quiere decir que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis individual o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo que se va a tratar, de la edad, del grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), de la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección deseado, de la formulación de la vacuna, de la valoración de la situación médica por parte del doctor que trata, y de otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad esté dentro de un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos habituales.

Procedimientos de tratamiento, y administración de la vacuna

La invención también proporciona un procedimiento para formular una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende el paso de administrar una cantidad eficaz de una composición de la invención. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y comprende preferentemente anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El procedimiento puede generar una respuesta de refuerzo.

La invención también proporciona un polipéptido de la invención para su uso como un medicamento, por ejemplo, para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un mamífero.

La invención también proporciona el uso de un polipéptido de la invención en la elaboración de un medicamento para genearar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

La invención también proporciona un dispositivo de administración relleno previamente con una composición inmunitaria de la invención.

Al generar una respuesta inmunitaria en el mamífero mediante estos usos y procedimientos, el mamífero se puede proteger contra la infección de E. coli, incluyendo las cepas ExPEC y las que no son de ExPEC. La invención es particularmente útil para proporcionar una amplia protección contra E. coli, patógeno, incluyendo los patotipos intestinales tales como los patotipos de EPEC, EAEC, EIEC, ETEC y DAEC. De esta manera, el mamífero se puede proteger contra enfermedades que incluyen, pero no se limitan a peritonitis, pielonefritis, cistitis, endocarditis, prostatitis, infecciones del tracto urinario (UTI, por sus siglas en inglés), meningitis (particularmente meningitis neonatal), sepsis (o SIRS), deshidratación, neumonía, diarrea (infantil, de viajero, aguda, persistente, etc.), disentería bacilar, síndrome urémico hemolítico (HUS, por sus siglas en inglés), pericarditis, bacteriuria, etc.

El mamífero es preferentemente un ser humano pero puede ser por ejemplo una vaca, un cerdo, un pollo, un gato o un perro, puesto que la enfermedad de E. coli también es problemática en estas especies [4]. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo un niño que empieza a andar o un lactante) o un adolecente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolecente o un adulto. Una vacuna propuesta para niños también se puede administrar a adultos por ejemplo para valorar la seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc.

Un modo de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico comprende el control de la infección de E. coli después de la administración de las composiciones de la invención. Un modo de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico comprende el control de las respuestas inmunitarias, de manera sistemática (tal como mediante el control del nivel de producción de IgG1 e IgG2a) y/o de forma mucosa (tal como mediante el control del nivel de producción de IgA), contra los antígenos en las composiciones de la invención después de la administración de la composición. Típicamente, las respuestas de anticuerpos en suero específicas de antígeno se determinan tras la inmunización pero antes de la exposición mientras que las respuestas de antígeno de mucosa específicas de antígeno se determinan tras la inmunización y tras la exposición.

Otro modo de valorar la inmunogenicidad de las composiciones de la presente invención es expresar las proteínas de manera recombinante para examinar sueros de pacientes o secreción de mucosas por inmunotransferencia y/o micromatrices. Una reacción positiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha generado una respuesta inmunitaria a la proteína en cuestión. Este procedimiento también se puede usar para identificar antígenos inmunodominantes y/o epítopos dentro de antígenos. La eficacia de las composiciones de vacuna también se puede determinar in vivo al exponer modelos animales de infección de E. coli, por ejemplo, cobayas o ratones, a las composiciones de vacuna. Un modelo murino de ExPEC y sepsis letal se describe en la referencia 120. En la referencia 121 se describe un modelo de rata de algodón.

Las composiciones de la invención se administrarán en general directamente a un paciente. La administración directa se puede lograr mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o al espacio intersticial de un tejido), o por vía mucosal, tal como medianteadministración rectal, oral (por ejemplo comprimido, pulverizador), vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, ótica, pulmonar u otra administración mucosal. Las nuevas formas de administración directa también pueden incluir la expresión transgénica de los polipéptidos descritos en el presente documento en alimentos por ejemplo, expresión transgénica en una patata.

La invención se puede usar para producir inmunidad sistémica y/o de mucosa, preferentemente para producir una inmunidad sistémica y/o de mucosa mejorada.

Preferentemente, la inmunidad sistémica y/o de mucosa mejorada se refleja en una respuesta inmunitaria de TH1 y/o TH2 mejorada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria mejorada incluye un aumento en la producción de IgG1 y/o IgG2a y/o IgA.

La dosis puede ser por un programa de dosis individual o un programa de múltiples dosis. Se pueden usar múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de múltiples dosis, se pueden dar las varias dosis por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, una primera vacuna en mucosa y un refuerzo parenteral, una primera vacuna parenteral y un refuerzo en mucosa, etc. Las múltiples dosis se administrarán típicamente con al menos 1 semana de separación (por ejemplo aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

Las vacunas de la invención se pueden usar para tratar tanto niños como adultos. De esta manera, un paciente humano puede ser de menos de 1 año de edad, de 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad, o de al menos 55 años de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los pacientes de edad avanzada (por ejemplo 50 años de edad, 60 años de edad, preferentemente 65 años), los pacientes jóvenes (por ejemplo 5 años de edad), los pacientes hospitalizados, los trabajadores de cuidado de la salud, personal militar y de servicio armado, las mujeres embarazadas, los pacientes inmunodeficientes o enfermos crónicos. Las vacunas no son adecuadas solo para estos grupos, sin embargo, y se pueden usar de manera más general en una población.

Las vacunas de la invención son particularmente útiles para pacientes que están esperando una operación quirúrgica, u otros pacientes del hospital. También son útiles en pacientes a los que se les pondrá catéter. También son útiles en mujeres adolecentes (por ejemplo de una edad de 11-18) y en pacientes con infecciones crónicas del tracto urinario.

Las vacunas de la invención se pueden administrar a pacientes sustancialmente en el mismo momento como (por ejemplo durante la misma consulta médica o visita a un profesional de cuidado de la salud o centro de vacunación) otras vacunas por ejemplo sustancialmente al mismo tiempo como una vacuna de sarampión, una vacuna de paperas, una vacuna de rubeola, una vacuna de SPR, una vacuna de varicela, una vacuna de SPRV, una vacuna de difteria, una vacuna de tétanos, una vacuna de pertussis, una vacuna de DTP, una vacuna de H. influenzae de tipo b conjugada, una vacuna de poliovirus inactivado, una vacuna de virus de hepatitis B, una vacuna de conjugado meningocócico (tal como la vacuna tetravalente A-C-W135-Y), una vacuna de virus sincicial respiratorio, etc.

Inmunización de ácido nucleico

Las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente incluyen antígenos de polipéptido. En todos los casos, sin embargo, los antígenos de polipéptido se pueden reemplazar por ácidos nucleicos (típicamente ADN) que codifican estos polipéptidos, para dar composiciones, procedimientos y usos basados en la inmunización de ácido nucleico. La inmunización de ácido nucleico ahora es un campo desarrollado (por ejemplo ver referencias 122 a 123 etc.).

El ácido nucleico que codifica un inmunógeno se expresa in vivo después de la administración a un paciente y el inmunógeno expresado entonces estimula el sistema inmunitario. El ingrediente activo tomará típicamente la forma de un vector de ácido nucleico que comprende: (i) un promotor; (ii) una secuencia que codifica el inmunógeno, unida de manera operativa al promotor; y opcionalmente (iii) un marcador seleccionable. Los vectores preferidos pueden comprender además (iv) un origen de replicación; y (v) un terminador de transcripción aguas abajo de y unido de manera operativa a (ii). En general, (i) y (v) serán eucarióticos y (iii) y (iv) serán procarióticos.

Los promotores preferidos son promotores víricos, por ejemplo, de citomegalovirus (CMV). El vector también puede incluir secuencias reguladoras de transcripción (por ejemplo, potenciadores) además del promotor y que interactúan de manera funcional con el promotor. Los vectores preferidos incluyen el potenciador/promotor de CMV inmediatamente temprano, y los vectores más preferidos también incluyen el intrón A de CMV. El promotor está unido de manera operativa a una secuencia en la dirección 3’ que codifica un inmunógeno, de manera que la expresión de la secuencia que codifica el inmunógeno está bajo el control del promotor.

Cuando se usa un marcador, preferentemente funciona en un hospedador microbiano (por ejemplo en un procariota, en una bacteria, en una levadura). El marcador es preferentemente un marcador seleccionable procariótico (por ejemplo, transcrito bajo el control de un promotor procariótico). Por conveniencia, los marcadores típicos son genes de resistencia a antibióticos.

El vector de la invención es preferentemente un vector extracromosómico o episómico autónomamente replicante, tal como un plásmido.

El vector de la invención comprende preferentemente un origen de replicación. Se prefiere que el origen de replicación esté activo en procariotas pero no en eucariotas.

Los vectores preferidos incluyen de esta manera un marcador procariótico para la selección del vector, un origen procariótico de replicación, pero un promotor eucariótico para activar la transcripción de la secuencia que codifica el inmunógeno. Los vectores por lo tanto se (a) amplificarán y seleccionarán en hospedadores procarióticos sin expresión de polipéptido, pero (b) se expresarán en hospedadores eucarióticos sin que se amplifiquen. Esta disposición es ideal para vectores de inmunización de ácido nucleico.

El vector de la invención puede comprender una secuencia de terminación de la transcripción eucariótica aguas abajo de la secuencia codificante. Esto puede mejorar los niveles de transcripción. Cuando la secuencia codificante no tiene en sí misma, el vector de la invención comprende de manera preferente una secuencia de poliadenilación. Una secuencia de poliadenilación preferida es de hormona de crecimiento bovino.

El vector de la invención puede comprender un sitio de clonación múltiple.

Además de las secuencias que codifican el inmunógeno y un marcador, el vector puede comprender una segunda secuencia codificante eucariótica. El vector también puede comprender un IRES en dirección 5’ de la segunda secuencia con el fin de permitir la traducción de un segundo polipéptido eucariótico del mismo transcrito como el inmunógeno. Como alternativa, la secuencia que codifica el inmunógeno puede estar en dirección 3’ de un IRES.

El vector de la invención puede comprender motivos de CpG no metilados, por ejemplo secuencias de ADN no metiladas que tienen en común una citosina que precede una guanosina, flanqueada por dos purinas 5’ y dos pirimidinas 3’. En su forma no metilada, se ha demostrado que estos motivos de ADN son potentes estimuladores de varios tipos de célula inmunitaria.

Se pueden administrar vectores de una manera dirigida. Las técnicas de administración de ADN mediada por receptor se describen, por ejemplo, en la referencia 124 a 125. Las composiciones terapéuticas que contienen un ácido nucleico se administran en un intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de ADN para administración local en un protocolo de terapia génica. Los intervalos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 5 μg a aproximadamente 500 μg, y de aproximadamente 20 µg a aproximadamente 100 µg de ADN también se pueden usar durante un protocolo de terapia génica. Los factores tales como el procedimiento de acción (por ejemplo para potenciar o inhibir los niveles del producto génico codificado) y la eficiencia de transformación y expresión son consideraciones que afectarán la dosis requerida para eficiencia final. Cuando se desea mayor expresión sobre una mayor área de tejido, se vuelven a administrar mayores cantidades del vector o las mismas cantidades en un protocolo sucesivo de administraciones o se pueden requerir varias administraciones a diferentes porciones de tejido adyacentes o cercanas para efectuar un resultado terapéutico positivo. En todos los casos, la experimentación habitual en ensayos clínicos determinará los intervalos específicos para el efecto terapéutico óptimo.

Se pueden administrar vectores usando vehículos de administración génica. El vehículo de administración génica puede ser de origen vírico o no vírico (véase en general, las referencias 126 a 127).

Los vectores de base vírica para la administración de un ácido nucleico deseado y para la expresión en una célula deseada son bien conocidos en la técnica. Los vehículos de base vírica de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, retrovirus recombinantes (por ejemplo, las referencias 128 a 129), vectores basados en alfavirus (por ejemplo los vectores del virus Sindbis, del virus del bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), del virus de Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y del virus de encefalitis equina Venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532); también se pueden usar híbridos y quimeras de estos virus), vectores del virus de la viruela (por ejemplo vaccinia, viruela de aves de corral, viruela de canario, vaccinia Ankara modificado, etc.), vectores de adenovirus, y vectores de virus adeno-asociados (AAV) (véase, por ejemplo, las referencias 130 a 131). También se puede emplear la administración de ADN unido a virus eliminados [132].

También se pueden emplear vehículos de administración y procedimientos no víricos y , incluyendo, pero sin limitación, ADN condensado policatiónico unido o no a adenovirus eliminado solo [por ejemplo 132], ADN unido a ligando [133], vehículos de administración de células eucarióticas [por ejemplo referencias 134 a 135] y neutralización de carga nucleica o fusión con otras membranas celulares. También se puede emplear ADN desnudo. Los procedimientos ejemplares de introducción de ADN desnudo se describen en las referencias 136 y 137. Los liposomas (por ejemplo inmunoliposomas) que pueden actuar como vehículos de administración génica se describen en la referencia 138 a 139. Los planteamientos adicionales se describen en la referencia 140 y 141.

La administración no vírica adicional adecuada para su uso incluye sistemas de administración mecánica tal como el planteamiento descrito en la referencia 141. Además, la secuencia codificante y el producto de expresión de esta se pueden administrar a través del depósito de materiales de hidrogel fotopolimerizados o el uso de radiación ionizante [por ejemplo, las referencias 142 y 143]. Otros procedimientos convencionales para administración génica que se pueden usar para la administración y distribución de la secuencia codificadora incluyen, por ejemplo, el uso de pistola de partículas portátil de transferencia génica [144] o el uso de radiación ionizante para activar los genes transferidos [142y 143].

El ADN de administración usando micropartículas de PLG {poli(láctido-co-glicólido)} es un procedimiento particularmente preferido por ejemplo mediante adsorción a las micropartículas, que se tratan opcionalmente para tener una superficie cargada negativamente, (por ejemplo tratada con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo tratada con un detergente catiónico, tal como CTAB).

Anticuerpos

Los anticuerpos contra antígenos de E. coli se pueden usar para inmunización pasiva [145]. De esta manera, la invención proporciona un anticuerpo que se une a ambas proteínas orf353 que consisten en las SEQ ID NOs: 1-2. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento de orf353 seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 211-218.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a al menos 2 (por ejemplo a 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o a todas las 16) de las 16 proteínas de dominio tipo Ig bacterianas (grupo 1) (orf405) que consisten en las SEQ ID NOs: 3-18. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento de la proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 219-307 y 683.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a al menos 2 (por ejemplo a 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o toda las 16) de las 22 proteínas de antígeno 43 de flu (orf1364) que consisten en las SEQ ID NOs: 19-40. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento del antígeno 43 de flu (orf1364) seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 308-350.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a al menos 2 (por ejemplo a 3, 4, 5, 6, o todos los 7) de los 7 transportadores de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia de NodT (orf1767) que consiste en las SEQ ID NOs: 41-47. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento del transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia NodT(orf1767) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 351-368.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a al menos 2 (por ejemplo a 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o todas las 13) de las 13 proteínas gspK (orf3515) que consiste en las SEQ ID NOs: 48-60. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento de gspK (orf351) seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 369-384.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a al menos 2 (por ejemplo a 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o todas las 11) de las 11 proteínas gspJ (or0516) que consisten en las SEQ ID NOs: 61-71. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento de gspJ (orf3516) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 385

398.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a al menos 2 (por ejemplo a 3, 4, 5, 6, 7, o todos los 8) de los 8 receptores de sideróforo dependientes de tonB (orf3597) que consiste en las SEQ ID NOs: 72-79. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento del receptor de sideróforo dependiente de tonB (orf3597) seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 399-425.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a ambas proteínas fibriales (orf3613) que consiste en las SEQ ID NOs: 80-81. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento de una proteína fibrial (or3613) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 426-432.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a al menos 2 (o todas las 3) de las 3 proteínas upec-948 que consiste en las SEQ ID NOs: 82-84. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento de upec-948 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 493-499.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a al menos 2 (por ejemplo a 3, 4, 5, 6, o todas las 7) de las 7 proteínas upec-1232 que consiste en las SEQ ID NOs: 85-91. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento de upec-1232 seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 500-506.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a al menos 2 (por ejemplo a 3, 4, 5, 6, o a todos los 7) de los 7 precursores de cadena A de las proteínas fimbriales tipo 1 (upec-1875) que consiste en las SEQ ID NOs: 92-98. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento del precursor de cadena A de la proteína fimbrial tipo 1 (upec-1875) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 507-515.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a ambas proteínas del homólogo yapH que consiste en las SEQ ID NOs: 99-100. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento del homólogo yapH seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 516-638.

La invención también proporciona un anticuerpo que se une a al menos 2 (por ejemplo a 3, 4 o a todas las 5) de las 5 hemolisinas A (recp-3768) que consiste en las SEQ ID NOs: 101-105. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se unirá a un fragmento de hemolisina A (recp-3768) seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 433-492.

La invención también proporciona el uso de estos anticuerpos en terapia. La invención también proporciona el uso de esos anticuerpos en la elaboración de un medicamento. La invención también proporciona un procedimiento para tratar un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención. Tal como se describe anteriormente para las composiciones inmunogénicas, estos procedimientos y usos permiten que un mamífero se proteja contra la infección de E. coli.

El término “anticuerpo” incluye moléculas intactas de inmunoglobulina, así como fragmentos de las mismas que son capaces de unirse a un antígeno. Estas incluyen moléculas híbridas (quiméricas) de anticuerpo [146, 147]; fragmentos F(ab’)2 y F(ab) y moléculas Fv; heterodímeros no covalentes [148, 149]; moléculas de Fv de cadena simple (sFv) [150]; construcciones de fragmentos de anticuerpo diméricas y triméricas; minicuerpos [151, 152]; moléculas humanizadas de anticuerpo [153-154]; y cualquiera de los fragmentos funcionales obtenidos de estas moléculas, así como anticuerpos obtenidos a través de procesos no convencionales tales como presentación en fago. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. En la técnica son bien conocidos los procedimientos para obtener anticuerpos monoclonales. Se prefieren anticuerpos humanizados o completamente humanos.

Aspectos generales

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, las referencias 155-156, etc.

El término “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste” por ejemplo una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y.

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x+ 10 %.

La numeración “GI” se usa en el presente documento. Un número GI, o “Identificador GenInfo”, es una serie de dígitos asignados consecutivamente a cada registro de secuencia procesado por el NCBI cuando las secuencias se añaden a sus bases de datos. El número GI no tiene semejanza al número de acceso del registro de secuencia. Cuando se actualiza una secuencia (por ejemplo para una corrección o para añadir más anotaciones o información), entonces recibe un nuevo número GI. De esta manera, la secuencia asociada con un número GI dado nunca se cambia.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significan que, cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos son los mismos al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se pueden determinar usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo los descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 157. Se determina una alineación preferida por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de separación de afinidad con una penalización de abertura de separación de 12 y una penalización de extensión de separación de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se describe en la referencia 158.

Un experto en la técnica entenderá que “aislado” significa alterado “por la mano del hombre” a partir de su estado natural, es decir, si se presenta en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo no está “aislado” cuando está en este organismo vivo, pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está “aislado”, tal como se usa el término en la presente descripción. Adicionalmente, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o por cualquier otro procedimiento de recombinación se entenderá que está “aislado” aún si está presente en este organismo, organismo que puede estar vivo o no vivo, excepto en donde esta transformación, manipulación genética u otro procedimiento recombinante produce un organismo que de otro modo es indistinguible del organismo que se presenta de forma natural.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1-13 muestran la identidad de aminoácidos para las proteínas de E. coli descritas. Para todas las figuras, ## = 100 % de identidad.

La Figura 1 muestra la identidad de aminoácidos entre pares de secuencias de orf353. La Figura 1 muestra el % de identidad entre las secuencias de aminoácidos de orf353. Las etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: IHE3034 (una cepa NMEC); RS218 (una cepa NMEC); APEC01 (una cepa APEC); CFT073 (una cepa UPEC); 536 (una cepa UPEC); UTI89 (una cepa UPEC); F11 (una cepa UPEC); 101 -1 (una cepa EAEC); O42 (una cepa EAEC); 53638 (una cepa EIEC); B171 (una cepa EPEC); E22 (una cepa EPEC); E2348/69 (una cepa EPEC); E110019 (una cepa EPEC); B7A (una cepa ETEC); E24377A (una cepa ETEC); H10407 (una cepa ETEC); y SECEC (una cepa resistente a antibióticos).

La Figura 2 muestra la identidad de aminoácidos entre pares de secuencias de la proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405). Las etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: HS (una cepa comensal); B (una cepa no patógena); 8739 (una cepa no patógena); C (una cepa no patógena); IHE3034 (una cepa NMEC); RS218 (una cepa NMEC); APEC01 (una cepa APEC); CFT073 (una cepa UPEC); 536 (una cepa UPEC); UT189 (una cepa UPEC); F11 (una cepa UPEC); EDL333 (una cepa EHEC); Sakai (una cepa EHEC); EC508 (una cepa EHEC); EC863 (una cepa EHEC); EC4024 (una cepa EHEC); EC4042 (una cepa EHEC); EC4054 (una cepa EHEC); EC4076 (una cepa EHEC); EC4113 (una cepa EHEC); EC4115 (una cepa EHEC); EC4196 (una cepa EHEC); EC4206 (una cepa EHEC); EC4401 (una cepa EHEC); EC4486 (una cepa EHEC); EC4501 (una cepa EHEC); TW14588 (una cepa EHEC); 101-1 (una cepa EAEC); O42 (una cepa EAEC); B171 (una cepa EPEC); E22 (una cepa EPEC); E2348/69 (una cepa EPEC); E110019 (una cepa EPEC); B7A (una cepa ETEC); E24377A (una cepa ETEC); H10407 (una cepa ETEC); y SECEC (una cepa resistente a antibióticos).

La Figura 3 muestra la identidad de aminoácidos entre pares de secuencias del antígeno 43 de flu (orf1364). Las etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: MG1655 (una cepa no patógena); DH10B (una cepa no patógena); HS (una cepa comensal); B (una cepa no patógena); 8739 (una cepa no patógena); C (una cepa no patógena); IHE3034 (una cepa NMEC); RS218 (una cepa NMEC); APEC01 (una cepa APEC); CFT073 (una cepa UPEC); 536 (una cepa UPEC); UTI89 (una cepa UPEC); F11 (una cepa UPEC); EDL333 (una cepa EHEC); Sakai (una cepa EHEC); EC508 (una cepa EHEC); EC863 (una cepa EHEC); EC4024 (una cepa EHEC); EC4042 (una cepa EHEC); EC4054 (una cepa EHEC); EC4076 (una cepa EHEC); EC4113 (una cepa EHEC); EC4115 (una cepa EHEC); EC4196 (una cepa EHEC); EC4206 (una cepa EHEC); EC4401 (una cepa EHEC); EC4486 (una cepa EHEC); EC4501 (una cepa EHEC); TW14588 (una cepa EHEC); 101-1 (una cepa EAEC); O42 (una cepa EAEC); 53638 (una cepa EIEC); B171 (una cepa EPEC); E22 (una cepa EPEC); E2348/69 (una cepa EPEC); E110019 (una cepa EPEC); B7A (una cepa ETEC); E24377A (una cepa ETEC); H10407 (una cepa ETEC); y SECEC (una cepa resistente a antibióticos).

La Figura 4 muestra la identidad de aminoácidos entre pares de secuencias del transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia NodT (orf1767). Las etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: IHE3034 (una cepa NMEC); RS218 (una cepa NMEC); APEC01 (una cepa APEC); CFT073 (una cepa UPEC); 536 (una cepa UPEC); UTI89 (una cepa UPEC); F11 (una cepa UPEC); EDL333 (una cepa EHEC); Sakai (una cepa EHEC); EC508 (una cepa EHEC); EC863 (una cepa EHEC); EC4024 (una cepa EHEC); EC4042 (una cepa EHEC); EC4054 (una cepa EHEC); EC4076 (una cepa EHEC); EC4113 (una cepa EHEC); EC4115 (una cepa EHEC); EC4196 (una cepa EHEC); EC4206 (una cepa EHEC); EC4401 (una cepa EHEC); EC4486 (una cepa EHEC); EC4501 (una cepa EHEC); TW14588 (una cepa EHEC); E2348/69 (una cepa EPEC); y SECEC (una cepa resistente a antibióticos).

La Figura 5 muestra la identidad de aminoácidos entre pares de secuencias gspK (orf3515). Las etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: HS (una cepa comensal); B (una cepa no patógena); 8739 (una cepa no patógena); C (una cepa no patógena); IHE3034 (una cepa NMEC); RS218 (una cepa NMEC); APEC01 (una cepa APEC); CFT073 (una cepa UPEC); 536 (una cepa UPEC); UTI89 (una cepa UPEC); Fl1 (una cepa UPEC); 101-1 (una cepa EAEC); O42 (una cepa EAEC); 53638 (una cepa EIEC); B171 (una cepa EPEC); E22 (una cepa EPEC); E2348/69 (una cepa EPEC); E110019 (una cepa EPEC); B7A (una cepa ETEC); E24377A (una cepa ETEC); H10407 (una cepa ETEC); y SECEC (una cepa resistente a antibióticos).

La Figura 6 muestra la identidad de aminoácidos entre pares de secuencias de gspJ (orf3516). Las etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: HS (una cepa comensal); IHE3034 (una cepa NMEC); RS218 (una cepa NMEC); APEC01 (una cepa APEC); CFT073 (una cepa UPEC); 536 (una cepa UPEC); UTI89 (una cepa UPEC); F11 (una cepa UPEC); 101-1 (una cepa EAEC); O42 (una cepa EAEC); 53638 (una cepa EIEC); B171 (una cepa EPEC); E22 (una cepa EPEC); E2348/69 (una cepa EPEC); E110019 (una cepa EPEC); B7A (una cepa ETEC); E24377A (una cepa ETEC); H10407 (una cepa ETEC); y SECEC (una cepa resistente a antibióticos).

La Figura 7 muestra la identidad de aminoácidos entre pares de secuencias del receptor de sideróforo dependiente de tonB (orf3597). Las etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: IHE3034 (una cepa NMEC); RS218 (una cepa NMEC); APEC01 (una cepa APEC); CFT073 (una cepa UPEC); 536 (una cepa UPEC); UTI89 (una cepa UPEC); F11 (una cepa UPEC); EDL333 (una cepa EHEC); Sakai (una cepa EHEC); EC508 (una cepa EHEC); EC869 (una cepa EHEC); EC4024 (una cepa EHEC); EC4042 (una cepa EHEC); EC4045 (una cepa EHEC); EC4076 (una cepa EHEC); EC4113 (una cepa EHEC); EC4115 (una cepa EHEC); EC4196 (una cepa EHEC); EC4206 (una cepa EHEC); EC4401 (una cepa EHEC); EC4486 (una cepa EHEC); EC4501 (una cepa EHEC); TW 14588 (una cepa EHEC); O42 (una cepa EAEC); E2348/69 (una cepa EPEC); y SECEC (una cepa resistente a antibióticos).

La Figura 8 muestra la entidad de aminoácidos entre pares de secuencias de la proteína fibrial (orf3613). Las

5 etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: 1HE3034 (una cepa NMEC); RS218 (una cepa NMEC); APEC01 (una cepa APEC); CFT073 (una cepa UPEC); 536 (una cepa UPEC); y O42 (una cepa EAEC).

La Figura 9 muestra la identidad de aminoácidos entre pares de secuencias de upec-948. Las etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: HS (una cepa comensal); B (una cepa no patógena); C (una

10 cepa no patógena); RS218 (una cepa NMEC); CFT073 (una cepa UPEC); y E2348/69 (una cepa EPEC).

La Figura 10 muestra la identidad de aminoácidos entre pares de secuencias de upec-1232. Las etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: CFT073 (una cepa UPEC); 042 (una cepa EAEC); B7A (una cepa ETEC); y H10407 (una cepa ETEC).

La Figura 11 muestra la identidad de aminoácidos entre pares de secuencias del precursor de cadena A de la

15 proteína fimbrial tipo 1 (upec-1875). Las etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: IHE3034 (una cepa NMEC); RS218 (una cepa NMEC); APEC01 (una cepa APEC); CFT073 (una cepa UPEC); UTI89 (una cepa UPEC); Fl1 (una cepa UPEC); EDL333 (una cepa EHEC); Sakai (una cepa EHEC); EC508 (una cepa EHEC); EC869 (una cepa EHEC); EC4024 (una cepa EHEC); EC4042 (una cepa EHEC); EC4045 (una cepa EHEC); EC4076 (una cepa EHEC); EC4113 (una cepa EHEC); EC4115 (una cepa

20 EHEC); EC4196 (una cepa EHEC); EC4206 (una cepa EHEC); EC4401 (una cepa EHEC); EC4486 (una cepa EHEC); EC4501 (una cepa EHEC); TW14588 (una cepa EHEC); O42 (una cepa EAEC); B171 (una cepa EPEC); E22 (una cepa EPEC); E2348/69 (una cepa EPEC); El10019 (una cepa EPEC); B7A (una cepa ETEC); y SECEC (una cepa resistente a antibióticos).

La Figura 12 muestra la identidad de aminoácidos entre pares de secuencias del homólogo yapH (upec

25 2820). Las etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: CFT073 (una cepa UPEC) y SECEC (una cepa resistente a antibióticos).

La Figura 13 muestra la identidad de aminoácidos entre pares de secuencias de hemolisina A (recp-3768). Las etiquetas son de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo: RS218 (una cepa NMEC); APEC01 (una cepa APEC); CFT073 (una cepa UPEC); 536 (una cepa UPEC); UTI89 (una cepa UPEC); Fl1 (una cepa

30 UPEC); E110019 (una cepa EPEC); B7A (una cepa ETEC); E24377A (una cepa ETEC); H10407 (una cepa ETEC); y SECEC (una cepa resistente a antibióticos).

Breve descripción del listado de secuencias

SEQ ID: Descripción

1-2: Variantes de Orf353

211-216: Fragmentos conservados de Orf353

217-218: Epítopos de células B lineales, conservados de Orf353

3-18: Variantes de proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405)

219-271: Fragmentos de proteína de dominio tipo Ig bacteriana conservada (grupo 1) (orf405)

272-307: Epítopos de células B lineales de proteína de dominio tipo Ig bacteriana conservadas (grupo 1) (orf405)

19-40: Variantes de antígeno 43 de flu (orf1364)

308-311: Fragmentos de antígeno 43 de flu conservados (orf1364)

312-350: Epítopos de células B lineales de antígeno 43 de flu conservados (orfl364)

41-47: Variantes de transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia NodT (orf1767)

351-361: Fragmentos de el transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia NodT conservados (orf1767)

(continuación) (continuación)

SEQ ID: Descripción

362-368: Epítopos de células B, lineales de el transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia NodT conservados (orf1767)

48-60: Variantes de gspK (orf3515)

369-377: Fragmentos conservados de gspK (orf3515)

378-384: Epítopos de células B lineales conservados de (orf3515)

61-71: Variantes de gspJ (orf3516)

385-389: Fragmentos conservados de gspJ (orf3516)

390-398: Epítopos de células B lineales conservados de gspJ (orf3516)

72-79: Variantes de receptor de sideróforo dependiente de tonB (orf3597)

399-407: Fragmentos de receptor de sideróforo dependiente de tonB conservados (orf3597)

408-425: Epítopo de células B lineales de receptor de sideróforo dependiente de tonB conservados (orf3597)

80-81: Variantes de proteína fibrial (orf3613)

426: Fragmento de proteína fibrial conservado (orf3613)

427-432: Epítopos de células B lineales de proteína fibrial conservados (orf36l3)

82-84: Variantes de upec-948

493-495: Fragmento conservado de upec-948

496-499: Epítopos de células B lineales conservados de upec-948

85-91: Variantes de upec-1232

500-502: Fragmento conservado de upec-1232

503-506: Epítopos de células B lineales conservados de upec-1232

92-98: Variantes de precursor de cadena A de la proteína fibrial tipo 1 (upec-1875)

507-510: Fragmento de precursor de cadena A de la proteína fimbrial tipo 1 conservado (upec-1875)

511-515: Epítopos de células B lineales de precursor de cadena A de la proteína fimbrial tipo 1 conservados (upec-1875)

99-100: Variantes de homólogo yapH (upec-2820)

516-543: Fragmento de homólogo yapH conservado (upec-2820)

544-638: Epítopos de células B lineales de homólogo yapH conservados (upec-2820)

101-105: Variantes de hemolisina A (recp-3768)

433-463: Fragmento de hemolisina A conservado (recp-3768)

464-492: Epítopos de células B lineales de hemolisina A conservados (recp-3768)

639: Secuencia de polinucleótido para pUPEC-3768B4 que codifica para un fragmento de hemolisina A (recp-3768)

640: Secuencia de polipéptido del fragmento 3768B4 de hemolisina A (recp-3768)

SEQ ID: Descripción

641: Secuencia de polinucleótido para pK1-0405B que codifica un fragmento de proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405)

642: Secuencia de polipéptido de fragmento 0405B de la proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405)

643: Secuencia de polinucleótido de pCFT-2820A que codifica un fragmento de homólogo yapH (upec-2820)

644: Secuencia de polipéptido del fragmento 2820-A de homólogo yapH (upec-2820)

645: Secuencia de polinucleótido para pCFT-2820B que codifica un fragmento de homólogo yapH (upec-2820)

646: Secuencia del polipéptido del fragmento 2820-B de homólogo yapH (upec-2820)

647: Secuencia de polinucleótido para pCFT-2820C que codifica un fragmento de homólogo yapH (upec-2820)

648: Secuencia del polipéptido del fragmento 2820-C de homólogo yapH (upec-2820)

649: Secuencia de polinucleótido para pCFT-2820D que codifica un fragmento homólogo yapH (upec-2820)

650: Secuencia del polipéptido del fragmento 2820-D de homólogo yapH (upec-2820)

651: Secuencia de polinucleótido para pK 1-1364 que codifica un fragmento de antígeno 43 de flu (orf1364)

652: Secuencia del polipéptido del fragmento K1-1364 de antígeno 43 de flu de dominio tipo Ig bacteriano (orf1364)

653-655: Variante de proteína que contiene repetición Sel 1 de Escherichia (upec-5211)

656-664: Fragmentos de proteína que contiene repetición Sel 1 de Escherichia (upec-5211)

665-676: Epítopos de células B lineales de proteína que contiene repetición Sel 1 de Escherichia (upec-5211)

677: Secuencia de polinucleótido para pK1-0405AB que codifica un fragmento de proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405AB)

678: Secuencia de polinucleótido para pK1-0405C que codifica un fragmento de la proteína de domino tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405C)

679: Secuencia de polinucleótido para pKl-0405BC que codifica un fragmento de proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405BC)

680: Secuencia de polipéptido del orf405AB de la proteína de domino tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405)

681: Secuencia del polipéptido de la orf405C de la proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405)

682: Secuencia del polipéptido de la orf405BC de la proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405)

683: Fragmento de proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) conservado (orf405)

Modos de llevar a cabo la invención

La orf353, la proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405), el antígeno 43 de flu (orf1364), el transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia NodT(orf1767), la gspK (orf3515), la gspJ (orf3516), el receptor de sideróforo dependiente de tonB (orf3597), la proteína fibrial (orf3613), la upec-948, la upec-1232, el precursor de cadena A de la proteína fimbrial tipo 1 (upec-1875), el homologo de yapH (upec-2820), la hemolisina A (recp-3768), y la proteína que contiene la repetición Sel 1 (upec-5211), cada uno tal como se describe más completamente en el presente documento, se han expresado y purificado, y confieren

5 protección contra cepas ExPEC en un modelo de animal con sepsis.

Se obtuvieron secuencias para los ortólogos en otras diversas cepas de E.coli.

Los antígenos de ejemplo para cada una de la proteína orf353 (SEQ ID NO: 1 -aminoácidos 21-162), proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405) (SEQ ID NO:9 -aminoácidos 595-1008), antígeno 43 de flu (orf1364) (SEQ ID NO: 27 -aminoácidos 53-629), el transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de 10 la familia NodT(orf1767) (SEQ ID NO: 41 -aminoácidos 15-457), gspK (orf3515) (SEQ ID NO: 56 -aminoácidos 32325), gspJ (orf3516) (SEQ ID NO:65 -aminoácidos 16-189), receptor de sideróforo dependiente de tonB (orf3597) (SEQ ID NO:74 -aminoácidos 29-713), proteína fibrial (orf3613) (SEQ ID NO:80 -aminoácidos 28-187), upec-948 (SEQ ID NO: 82 -aminoácidos 24-151), upec-1232 (SEQ ID NO:89 -aminoácidos 26-151), precursor de cadena A de la proteína fimbrial tipo 1 (upec-1875) (SEQ ID NO:97 -aminoácidos 25-187), homólogo yapH (upec-2820) (SEQ ID

15 NO:99), hemolisina A (recp-3768) (SEQ ID NO: 103 -aminoácidos 24-1024), y proteína que contiene repetición Sel 1 (upec-5211) (SEQ ID NO:653) -se clonaron en vectores pET-21b (Novagen) y se transformaron en células químicamente competentes DH5α-T1 para propagación (Invitrogen). Se usaron células químicamente competentes BL21 (DE3) para la expresión. Todos los candidatos se clonaron y expresaron sin la secuencia de señal y como proteínas de fusión marcadas con his. Los candidatos se purificaron por cromatografía de afinidad.

20 La protección se evaluó en un modelo animal de sepsis. Se inmunizaron ratones hembras cruzados CD1 (de 5 semanas de vida) de Charles River, Italia mediante inyecciones subcutáneas en el 1º, 21º y 35º días con 20 µg de proteína recombinante en adyuvante de Freund. El control positivo se inmunizó con 108 bacterias térmicamente inactivadas (65°C durante 30 minutos) en 0,15 ml de solución fisiológica en adyuvante de Freund (Sigma), mientras que el control negativo se inmunizó con solución fisiológica en adyuvante de Freund. Se realizó la exposición en el

25 49º día con una dosis de 107 de cultivo bacteriano fresco/ratón (LD80) por inyección intraperitoneal (para las cepas IHE3034 y CFT073) o intravenosa (para la cepa 536). Se recolectaron muestras sanguíneas heparinizadas de ratones supervivientes a las 24 horas después de la exposición para determinar los niveles de bacteremia y la mortalidad se observó durante cuatro días después del estímulo.

Candidato: Modelo animal de sepsis

Supervivencia con vacunación ( %): Supervivencia sin vacunación ( %) p-valor

hemolisina A (recp-3768): 18/23 (78) 2/26 (7) <0,0001

upec-1232: 15/30 (50) 3/36 (8) 0,0002

gspK (orf35l5): 30/110 (27) 11/116 (9) 0,0005

upec-52l I: 30/83 (36) 14/91 (15) 0,003

Receptor de sideróforo dependiente de tonB (orf3597): 12/40 (32) 5/48 (10) 0,03

orf353: 19/76 (25) 7/67 (10) 0,03

gspJ (orf3516): 10/46 (21) 3/50 (6) 0,03

transportador de eflujo de lipoproteína de factor de membrana externa de la familia NodT(orf1767): 15/74 (20) 6/80 (7) 0,03

Precursor de cadena A de la proteína fimbrial tipo 1 (upec-1875): 11/23 (47) 5/26 (19) 0,06

Proteína fimbrial (orf36l3): 24/89 (27) 13/81 (16) 0,09

upec-948: 12/31 (38) 7/38 (18) 0,1

30 Ciertos candidatos anteriores presentan solubilidad limitada o ninguna solubilidad como las proteínas de longitud completa (hemolisina A (recp-3768), fragmento de antígeno 43 de flu (orf1364), proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405), y homólogo yapH (upec-2820)). Por lo tanto, se construyeron los fragmentos y se ensayó su solubilidad. Aquellos que demostraron solubilidad aumentada se ensayaron adicionalmente para su capacidad para proporcionar protección en el modelo de animal de sepsis tal como se describe anteriormente.

Fragmento Candidato: Modelo animal de sepsis

Supervivencia con vacunación (%): Supervivencia sin vacunación (%) pvalor

2820-D (Fragmento D de homólogo yapH) (SEQ ID NO: 650): 10/34 (29) 3/36 (8) 0,03

1364 (fragmento de antígeno 43 de flu) (SEQ ID NO: 652): 21/77 (27) 8/84 (9) 0,004

405B (fragmento de proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1)) (SEQ ID NO: 642): 25/81 (30,8) 14/86 (16) 0,03

3768-B4 (con Alumbre) (fragmento B4 de hemolisina A) (SEQ ID NO: 640): 13/24 (54) 6/24 (25) 0,07

2820-C (fragmento C de homólogo yapH) (SEQ ID NO: 648): 9/32 (28) 4/38 (10) 0,07

2820-A (fragmento A de homólogo yapH) (SEQ ID NO: 644): 8/24 (33) 5/28 (17,8) 0,2

2820-B (fragmento B de homólogo yapH) (SEQ ID NO: 646): 10/31 (32) 10/38 (26) 0,6

Para demostrar la capacidad del fragmento B4 de proteína de hemolisina A (3768-B4) para proporcionar protección cruzada entre otras cepas, se expusieron los ratones inmunizados con el fragmento B4 de proteína de hemolisina A anterior (3768-B4) a diferentes cepas de E. coli, tal como se muestra en la siguiente tabla.

Cepa de E. coli: Protección en modelo animal de sepsis

3768-B4 20 µg/Alumbre: 3768 (insol.) 20 µg/Alumbre

Supervivencia con vacunación (%): Supervivencia sin vacunación (%) Supervivencia con vacunación (%) Supervivencia sin vacunación (%)

536: 13/24 (54) 6/24 (25) 10/16 (62,5) 0/16 (0)

CFT073: 3/8 (37,5) 2/8 (25) - -

BK658: 1/8 (12,5) 1/8 (12,5) 6/8 (75) 1/8 (12,5)

Se ensayaron varias combinaciones de los tres fragmentos del fragmento de proteína de dominio tipo Ig bacteriana (grupo 1) (orf405) en el modelo de ratón de sepsis tal como se describe anteriormente. Los resultados se 10 proporcionan en la siguiente tabla.

Fragmento candidato: Modelo de Animal de Sepsis

Supervivencia con vacunación (%): Supervivencia sin vacunación (%) p-valor

405AB (SEQ ID NO: 680): 2/8 (25) 0/8 (0) 0,4

405BC (SEQ ID NO: 682): 0/8 (27) 0/8 (0) -

405B (SEQ ID NO: 642): 25/81 (30,8) 14/86 (16) 0,03

405C (SEQ ID NO: 681): 0/10 (0) 1/10 (1) -

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SEQ ID NO: 639

SEQ ID NO: 640 40 SEQ ID NO: 641 SEQ ID NO: 642

SEQ ID NO: 643

SEQ ID NO: 644 SEQ ID NO: 645

SEQ ID NO: 646

SEQ ID NO: 647

SEQ ID NO: 648 SEQ ID NO: 649

SEQ ID NO: 650

SEQ ID NO: 651

SEQ ID NO: 652 SEQ ID NO: 677

SEQ ID NO: 678 SEQ ID NO: 679

SEQ ID NO: 680

SEQ ID NO: 681

SEQ ID NO: 682

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un fragmento de polipéptido aislado o recombinante que comprende al menos los aminoácidos 595-1008 de las SEQ ID Nos: 3-18, en los que el fragmento es inmunogénico, comprende menos de 580 aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID Nos:2-18, presenta una mayor solubilidad en comparación con la proteína de longitud completa de

5 una cualquiera de las SEQ ID Nos: 3-18 y genera una respuesta inmune sustancialmente similar en un sujeto como la que genera la proteína de longitud completa de cualquiera de las SEQ ID Nos: 3-18.
2. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 1, en el que los aminoácidos 595-1008 se corresponden con la SEQ ID NO: 642.
3. El polipéptido aislado o recombinante de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el fragmento se 10 corresponde con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 642.
4.

El polipéptido inmunogénico aislado o recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que el fragmento de polipéptido está purificado.
5.

El polipéptido inmunogénico aislado o recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que comprende adicionalmente un adyuvante.

15 6. Un polipéptido que codifica el polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7.

Una célula hospedadora que comprende un plásmido que codifica el polipéptido inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
8.

Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
9. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la composición inmunogénica de la reivindicación 8 para 20 su uso en la generación de una respuesta inmune en un mamífero.
10. El polipéptido o la composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la respuesta inmune es protectora frente a infección por E. coli con cepas ExPEC y no ExPEC.