DE69426077T3

DE69426077T3 - Adjuvantien für impfstoffe gegen das respiratorische synzitialvirus

Info

Publication number: DE69426077T3
Application number: DE69426077T
Authority: DE
Inventors: Gerald E. Hancock; Dan J. Speelman; Patrick J. Frenchick
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1993-05-25
Filing date: 1994-05-24
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2014-05-25
Also published as: RU2160119C2; JP3734263B2; AU6957194A; ES2150493T3; EP0705109B2; ES2150493T5; GR3034785T3; AU676340B2; US5723130A; EP0705109A4; EP0705109B1; DK0705109T3; NO954786L; NO954786D0; FI955667A0; ATE196737T1; CA2163550A1; DK0705109T4; EP0705109A1; JPH08510749A

Description

Hintergrund der Erfindung
Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist eine Hauptursache für Erkrankungen der unteren Atemwege im Säuglings- und frühen Kindesalter (McIntosh and Chanock, 1985, in Virology, Fields, B. (Hg.), Raven, NY, S. 1285–1304). In allen geographischen Gebieten ist es die Hauptursache für Bronchiolitis und Lungenentzündung bei Säuglingen und Kleinkindern. Das Virus führt während der Kindheit immer wieder zu Infektionen, aber eine durch Reinfektion hervorgerufene Erkrankung ist im Allgemeinen schwächer als jene im Zusammenhang mit der Erstinfektion und verursacht nur selten größere Probleme.
Das RS-Virus ist ein umhülltes RNA-Virus der Familie Paramyxoviridae und des Genus Pneumovirus. Die beiden wichtigsten Hüllenproteine sind das G-Protein, das für das Anlagern des Virus an die Wirtszellenmembran verantwortlich ist, und das Fusionsprotein (F-Protein), das für die Fusion des Virus mit Zellmembranen verantwortlich ist. Die Virus-Zellen-Fusion ist ein notwendiger Schritt für die Infektion. Fusionsprotein ist auch für die Zellen-Zellen-Fusion notwendig, die ein anderer Weg ist, um die Infektion von einer infizierten Zelle auf eine nicht infizierte Zelle zu übertragen.
Antikörper gegen das Fusionsprotein oder gegen das G-Protein können das Virus neutralisieren. Nur Antikörper gegen das Fusionsprotein blockieren jedoch die Verbreitung des Virus zwischen Zellen, d. h. sie haben Antifusions-Aktivität. Daher schützen Antikörper gegen das Fusionsprotein vor dem zirkulierenden Virus und inhibieren die Verbreitung einer bestehenden Infektion unter den Zellen. Es ist gefunden worden, dass Antikörper gegen das Fusionsprotein (sowohl polyklonale Antiseren gegen gereinigtes Fusionsprotein als auch monoklonale Antikörper, die sowohl neutralisierende als auch Antifusions-Aktivität beinhalten) in Tiermodellen gegen Infektion schützen (Walsh et al., 1984, Infect. Immun. 43: 756–758).
Ein praktisches Mittel zum Schutz von Säuglingen und Kleinkindern gegen Erkrankungen der oberen und unteren Atemwege wäre eine Schutzimpfung gegen RS-Virus. Die Impfung von werdenden Müttern (aktive Immunisierung) würde Kleinkinder durch passiven Immunitätstransfer entweder durch die Plazenta oder durch die Muttermilch schützen. Es sind mehrere Ansätze zu einem RS-Virusimpfstoff möglich, wobei sich einige jedoch in der Vergangenheit als nicht erfolgreich erwiesen haben.
Es ist die Impfung mit Vakzinen mit abgetöteten RS-Viren versucht und als unwirksam befunden worden (Kim et al., 1969, Am. J. Epid. 89: 422). Die Kinder waren nicht nur nicht geschützt, sondern in einigen Fällen führten Folgeinfektionen mit RS-Virus sogar zu atypischen und schwereren Erkrankungen als bei den nicht immunisierten Kontrollgruppen. Dieses Phänomen ist nicht auf das RS-Virus beschränkt und ist auch bei Impfstoffen mit abgetötetem Paramyxovirus, wie Masern, beobachtet worden. Es ist darauf hingewiesen worden, dass die Ursache für das Versagen des früheren Impfstoffs mit inaktiviertem RS-Virus in der Inaktivierung der biologisch funktionellen Epitope auf einem oder beiden viralen Hüllen-Glycoproteinen liegt. Das heißt, die Neutralisations- und Fusionsepitope am abgetöteten Virus des Vakzins waren „denaturiert". Infolgedessen erhielt die geimpfte Testperson keine biologisch funktionierenden Neutralisations- und Fusionsepitope. Als daher die geimpfte Testperson mit einem lebenden Virus in Berührung kam, brachte die resultierende Antikörperantwort keine schützende Immunität. Statt dessen kam es zu einer Antikörper-mediierten Entzündungs-Antwort, die oft zu einer schwereren Erkrankung führte (Choppin and Scheid, 1980, Rev. Inf. Dis. 2: 40–61).
Der zweite Ansatz für einen RS-Virusimpfstoff bestand darin, lebende Viren abzuschwächen. Es hat sich gezeigt, dass temperaturempfindliche Mutanten (Wright et al., 1982, Infect. Immun. 37: 397–400) und Passage-abgeschwächtes Virus (Belshe et al., 1982, J. Inf. Dis. 145: 311–319) nur schwach infektiös und bei der Verhütung einer Erkrankung nicht wirksam sind, wenn sie als Immunogene in RS-Virusvakzinen verwendet werden. In diesen Fällen kam es jedoch nicht zu einer atypischen Erkrankung in Folge der Impfung.
Auf Grund unseres derzeitigen Wissens über die Struktur des RS-Virus und die Immunantwort auf eine Infektion ist klar, dass eine brauchbare Impfung gegen dieses Virus bei der Induzierung der Bildung von Antikörpern gegen das Fusionsprotein und/oder das G-Protein wirksam sein muss. Von besonderer Bedeutung für die schützende Immunität ist die Bildung von Antikörpern, die die Fusion inhibieren und daher die Verbreitung des Virus unter den Zellen in den Atemwegen unterbinden können. Außerdem ist es hilfreich, eine Zellen-mediierte Immunantwort hervorzurufen, einschließlich der Stimulation von cytotoxischen T-Zellen (CTLs), die gegen mit dem RS-Virus infizierte Zellen nützlich sind. Die verschiedenen Vakzinformulierungen der vorliegenden Erfindung sind darauf ausgerichtet, diese beiden Ziele zu erreichen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung bestimmter Hilfsstoffe, die in der Lage sind, die Immunantwort gegen Hüllenproteine des Respiratory Syncytial Virus zu verstärken, insbesondere gegen RSV-Glycoprotein F und RSV-Glycoprotein G. Insbesondere wird hier gezeigt, dass der Hilfsstoff QS-21 oder alternativ dazu 3D-Monophosphoryllipid A plus Alaun die Fähigkeit von gegen RSV-Glycoprotein F und/oder G gebildeten Antikörpern, das Virus zu neutralisieren, signifikant erhöht und über die Zellen-mediierte Antwort gegen das Virus einen immunologischen Schutz bietet. Außerdem ist gezeigt worden, dass diese Hilfsstoffe in von Viren infizierten Zellen die Syncytiabildung verhindern. Auf Grund dieser Erkenntnisse können Untereinheits-Vakzinformulierungen hergestellt werden, die Hüllenprotein (e) von RSV und ein Adjuvans, ausgewählt aus QS-21, 3D-MPL und Kombinationen, umfassen. Die Formulierung kann gegebenenfalls Alaun enthalten. Die Zugabe von Alaun kann die Immunantwort gegen das (die) RSV-Antigen(e) noch verstärken, wenn es mit diesen Adjuvantien verabreicht wird. Das Vorhandensein dieser Adjuvantien bringt erhöhte Immunogenizität gegen das Antigen durch Erweiterung der Immunantwort, insbesondere Komplement-mediierte Plaquereduktions-Neutralisation im Vergleich zu Alaun. Außerdem ermöglicht das Vorhandensein eines Adjuvans die Herstellung einer Untereinheits-Vakzine mit einer reduzierten Menge Antigen(en).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Ergebnisse der Zellen-mediierten Cytotoxizität der Versuche von Beispiel 5, das hier besprochen wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Vakzinformulierungen und therapeutische Verwendungen dafür zur Verhinderung einer RSV-Infektion. Die erfindungsgemäße Untereinheits-Vakzinformulierung umfasst (a) ein Respiratory Syncytial Virus-(RSV-)Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) RSV-Glycoprotein G, (ii) RSV-Glycoprotein F, (iii) einem chimären Polypeptid, das mindestens ein immunogenes Fragment von sowohl RSV-Glycoprotein F als auch G umfasst, und (iv) Kombinationen davon, und (b) ein Adjuvans, von dem gezeigt worden ist, dass es die Immunantwort auf das RSV-Protein verstärkt, wobei die in (a) genannten Respiratory Syncytial Virus (RSV) Proteine die einzigen immunogenen Proteine in der Vakzine sind. Das Adjuvans ist ausgewählt aus QS-21, 3-deacyliertem Monophosphoryllipid A und Kombinationen davon, und gegebenenfalls Alaun. Die Gegenwart von Alaun im Vakzin wirkt synergistisch mit 3D-MPL, um eine Neutralisationsantwort auf RSV herzurufen.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist QS-21 mit RSV-Hülhenprotein G und/oder F formuliert. QS-21 ist ein Saponin, das von einem rohen Extrakt von Quillaja saponaria gereinigt wird, und ist von Kensil and Marciani, U.S. Patent 5,057,540, beschrieben worden. Antikörper, die gegen Formulierungen gebildet werden, die QS-21 und RSV-Protein F oder RSV-Protein G und F enthalten, können RS-Virus neutralisieren. Die Immunogenizität von RSV-F- und G-Proteinen wird durch die Verwendung von QS-21 als Adjuvans im Vergleich zu Formulierungen, die kein Adjuvans oder andere bekannte Adjuvantien enthalten, wie Alaun, wenn es alleine als Adjuvans verwendet wird, stark erhöht.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist der, dass die Adjuvantien in einem Untereinheits-Vakzin mit RSV-G-Protein oder F-Protien verwendet werden können, um eine Immunantwort auszulösen, wie eine Antikörperantwort, die sowohl Untergruppe A als auch Untergruppe B des RSV-Virus neutralisiert. Dies ist eine signifikante Entdeckung, da gefunden worden ist, dass andere Adjuvantien, insbesondere Alaun, mit G-Protein nur jene Untergruppe neutralisieren, aus der das Protein gereinigt worden ist.
In einer weiteren Ausführungsform kann 3D-MPL in Kombination mit Alaun verwendet werden, um eine Untereinheits-Vakzinformulierung herzustellen, die die Stimulierung von Komplementabhängigen neutralisierenden Antikörpern gegen RSV verstärken kann. Die Immuno genizität von Komponenten von RSV-Untereinheiten wird mit diesem Adjuvans im Vergleich zu Formulierungen, die kein Adjuvans oder Alaun als das einzige Adjuvans enthalten, stark erhöht.
Proteine und Polypeptide, die mit einem neutralisierenden und/oder Fusionsepitop(en) des Fusionsproteins und/oder G-Proteins des RS-Virus in Zusammenhang stehen, sind als Immunogene in einem Untereinheits-Vakzin nützlich, um gegen Erkrankungen der unteren Atemwege und andere Krankheitssymptome einer RS-Virusinfektion zu schützen, und können in den erfindungsgemäßen Vakzinen formuliert werden. Untereinheits-Vakzine umfassen das relevante immunogene Material, das notwendig ist, um einen Wirt zu immunisieren, und die Adjuvantien, die hier als potente Immunmodulatoren bezeichnet sind. Vakzine, die aus gentechnisch veränderten Immunogenen, chemisch synthetisierten Immunogenen und/ oder Immunogenen hergestellt sind, die authentisches, im Wesentlichen reines RS-Virus-Fusionsprotein oder Fragmente davon allein oder in Kombination mit ähnlich hergestellten RS-Virus-G-Proteinen oder Fragmenten davon umfassen, und die in der Lage sind, eine schützende Immunantwort hervorzurufen, sind von besonderem Vorteil, weil kein Risiko einer Infektion der Empfänger besteht. Chimäre Polypeptide, die mindestens ein immunogenes Fragment von den beiden RSV-Glycoproteinen F und G umfassen, können in erfindungsgemäßen Vakzinformulierungen ebenfalls verwendet werden. Solche chimäre RSV-Polypeptide sind von Wathen, U.S. Patent 5,194,595, beschrieben worden.
Das RS-Virus-Fusionsprotein und/oder G-Protein und Polypeptide können aus Rekombinanten gereinigt werden, die die neutralisierenden und/oder Fusionsepitope exprimieren. Solche Rekombinanten schließen jegliche bakterielle Transformanten, Hefetransformanten, kultivierte Insektenzellen, die mit rekombinanten Baculoviren infiziert sind, oder kultivierte Säugetierzellen, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, ein, wie zum Beispiel Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters, die die Epitope des RS-Virus-Fusionsproteins exprimieren. Das rekombinante Protein oder Polypeptide können multiple Kopien des Epitops, an dem Interesse besteht, umfassen.
Das Protein oder Polypeptid, das mit dem RS-Virus-Fusionsprotein und/oder G-Protein in Zusammenhang steht, kann chemisch synthetisiert werden. Alternativ dazu können das Protein oder Polypeptid, das mit dem RS-Virus-Fusionsprotein in Zusammenhang steht, oder das Protein, das mit G in Zusammenhang steht, in im Wesentlichen reiner Form aus dem RS-Virus oder Kulturen von Zellen isoliert werden, die mit RS-Virus infiziert sind, und mit den neuen Adjuvantien als Impfstoff gegen RSV formuliert werden.
Unabhängig vom Verfahren zur Herstellung wird das RS-Virus-Fusionsprotein oder G-Protein, verwandtes Protein oder Polypeptid in eine geeignete Konzentration gebracht und kann mit einem Adjuvans formuliert werden, ausgewählt aus QS-21 oder 3D-MPL plus Alaun. 3-Deacyliertes MPL (3D-MPL) kann mit TDM und Squalen koformuliert und in erfindungsgemäßen Vakzinformulierungen verwendet werden. 3D-MPL kann gemäß den im britischen Patent Nr. 2220211 (Ribi Immunochem.) beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Die Menge Protein in jeder Vakzindosis wird als eine Menge gewählt, die eine immunprotektive Antwort ohne signifikante negative Nebenwirkungen auslöst. Eine solche Menge ist je nach dem verwendeten Immunogen verschieden. Im Allgemeinen wird jede Dosis etwa 0,1 bis etwa 100 μg Protein umfassen, wobei etwa 5 bis etwa 50 μg bevorzugt werden und etwa 5 bis etwa 25 μg/Dosis alternativ bevorzugt werden. Die Menge Adjuvans wird eine Menge sein, die eine immunmodulierende Antwort ohne signifikante negative Nebenwirkungen auslöst. Eine optionale Menge für ein bestimmtes Vakzin kann durch Standardstudien festgestellt werden, die die Beobachtung der Antikörpertiter eines Vakzins und ihre Fähigkeiten, Virus zu neutralisieren, beinhalten. Die Menge Adjuvans wird etwa 1 bis etwa 100 μg/Dosis betragen, wobei etwa 5 bis etwa 50 μg/Dosis bevorzugt werden und etwa 20 bis etwa 50 μg/Dosis alternativ bevorzugt werden.
Die Immunpotenz von Vakzinen, die RS-Virus-Fusions- oder G-Protein oder immunologische Fragmente davon und genetische oder physikalische Mischungen davon enthalten, kann durch Beobachtung der Immunantwort von Versuchstieren nach der Immunisierung mit dem gereinigten Protein, synthetischen Peptid oder rekombinanten Protein bestimmt werden. Versuchstiere können Mäuse, Ratten, Hasen, Primaten und schließlich menschliche Testpersonen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Verfahren zur Einfüh rung des Immunogens können intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subcutane, intranasale oder jegliche andere Standardwege der Immunisierung einschließen. Die Immunantwort der Testsubjekte kann durch mehrere Ansätze analysiert werden: (a) die Reaktivität des resultierenden Immunserums. auf authentische RS-Virus-Antigene, wie sie durch bekannte Techniken getestet wird, z. B. Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA), Immunblots, Radioimmunpräzipitationen etc., (b) die Fähigkeit des Immunserums, die RS-Virus-Infektivität in vitro zu neutralisieren, (c) die Fähigkeit des Immunserums, die Virusfusion in vitro zu inhibieren, die Fähigkeit immunisierter Tiere, Antigen-abhängige cytotoxische T-Lymphozyten- (CTL-)Aktivität zu entwickeln, und (e) der Schutz vor einer RS-Virusinfektion.
Es können zahlreiche Verfahren verwendet werden, um die hier beschriebenen Vakzinformulierungen für prophylaktische Zwecke an Menschen zu verabreichen. Diese beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subcutane und intranasale Routen. Die sekretorischen IgA-Antikörper, die vom Mucosa-assoziierten Lymphoidgewebe produziert werden, können beim Schutz gegen eine RS-Virusinfektion eine Hauptrolle spielen, indem sie die anfängliche Wechselwirkung der Pathogene mit der Mucosaoberfläche verhindern, oder indem sie die wichtigen Epitope der Pathogene neutralisieren, die an der Infektion oder Verbreitung der Krankheit beteiligt sind. Die Stimulierung der Mucosa-Immunantworten einschließlich der Produktion von sekretorischen IgA-Antikörpern kann beim Verleihen von Schutz gegen Infektionen der unteren und oberen Atemwege von großer Wichtigkeit sein.
Die Polypeptide und Proteine können im Allgemeinen in Konzentrationen im Bereich von etwa 0,1 μg bis etwa 100 μg pro Dosis formuliert sein.
Physiologisch annehmbare Medien können als Träger verwendet werden. Diese schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf steriles Wasser, Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung u. ä. Andere geeignete Adjuvantien können den erfindungsgemäßen, neuartigen Vakzinformulierungen zugesetzt werden und schließen Mineralgele, z. B. Aluminiumhydraxid, Aluminiumphosphat etc. ein. Das Immunogen kann zur Verwendung in einer Vakzinfor mulierung auch in Liposome eingebunden oder an Polysaccharide und/oder andere Polymere konjugiert sein.
Die Polypeptide und Proteine, die in erfindungsgemäße Vakzinformulierungen eingebunden sein können, können mit einem löslichen makromolekularen Träger verbunden sein. Vorzugsweise haben der Träger und die Polypeptide und Proteine nach dem Verbinden mehr als 5000 Dalton, und mehr bevorzugt hat der Träger mehr als 5 Kilodalton. Vorzugsweise ist der Träger eine Polyaminosäure, entweder natürlich oder synthetisch, die bei Tieren einschließlich Menschen immunogen ist. Die Art der Verbindung ist herkömmlich. Viele Verbindungstechniken sind im U.S. Patent Nr. 4,629,783 geoffenbart. Viele Vernetzungsmittel sind im 1986–87 Handbook and General Catalog, Pierce Chemical Company (Rockford, Illinois), S. 311–340, geoffenbart.
Die erfindungsgemäßen Vakzine können an ein Individuum verabreicht werden, um eine Infektion oder Krankheitssymptome, die mit RSV in Zusammenhang gebracht werden, zu verhindern. Eine solche Verabreichung kann durch eine Einzeldosis oder durch mehrere Dosen erfolgen, um bei dem Individuum eine primäre Immunantwort auszulösen. Typischerweise wird eine Mehrfachimpfung für Menschen 3 Mal im Abstand von im Wesentlichen 2 Monaten gegeben. Auffrischungsdosen können gegeben werden, um eine existierende Immunantwort aus einer früheren Impfung oder einer natürlichen Infektion zu stimulieren.
Die folgenden Beispiele werden gegeben, um die vorliegende Erfindung darzustellen, und sollen nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränkend interpretiert werden.
Beispiele
Beispiel 1: RSV-Proteinpräparat
A. Immunaffinität-Fusionsprotein-1 (PFP-1)
PFP-1 wird nach dem Verfahren von Walsh et al., J. Gen. Virol. 66: 409–415 (1985) mit den folgenden Modifikationen hergestellt. Das Immunaffinität-eluierte Material wird über eine DEAE-Säule geleitet, und der Durchfluss wird gesammelt, gegen PBS/0,1% Triton X-100 dialysiert und durch ein 0,2 μm Filter steril filtriert.
B. Ionenaustausch-Fusionsprotein-2 (IF)
IF wird hergestellt, indem ein geklärtes, RSV-infiziertes Zelllysat über eine DEAE-Säule geleitet wird. Der Durchfluss wird gesammelt und über eine Hydroxyapatit- (HA-)Säule geleitet. Nach dem HA-Eluieren wird das eluierte F-Protein gegen PBS/0,1% Triton^® X-100 dialysiert und durch ein 0,2 m Filter steril filtriert.
C. Immunaffinität-G-Protein (G)
G-Protein wird nach dem Verfahren von Walsh et al., J. Gen. Virol. 66: 761–767 (1984) mit den folgenden Modifikationen hergestellt. Nach dem Eluieren wird das G-Protein über eine Immunaffinitätssäule geleitet, die für das RSV-F-Protein spezifisch ist. Der Durchfluss wird gesammelt, gegen PBS/0,1% Triton^® X-100 dialysiert und durch ein 0,2 um Filter steril filtriert.
D. F/G-Protein-Chimär
F/G-Protein-Chimär ist nach dem U.S. Patent Nr. 5,194,595 hergestellt und wird von der Upjohn Corporation zur Verfügung gestellt.
Beispiel 2: Enzymimmunoassay (EIA)
Der Antikörpertiter in Serumproben wird unter Verwendung eines Enzymimmunoassays (EIA) bestimmt, der wie folgt durchgeführt wird:
RS-Virus-Fusionsprotein wird in Carbonat-Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, auf 200 ng/ml verdünnt. 100 μl des verdünnten Antigens werden jeder Vertiefung der Reihen B bis G einer NUNC^TM Testplatte mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden zugesetzt. In den Reihen A und H werden jeder Vertiefung nur 100 μl Carbonat-Bicarbonat-Puffer alleine zugesetzt. Die Platte wird zugedeckt, 2 Stunden lang bei 37°C unter Schütteln inkubiert und über Nacht bei 4°C gelagert, um das Antigen zu immobilisieren.
Die Überstände werden von der NUNC^TM Testplatte entfernt, und die Platte wird mit 0,1% Tween/PBS, pH 7,4, gewaschen und trocken getupft.
3 Antikörperproben werden auf jeder Platte einem Assay unterzogen. Jede Probe wird zuerst zu einer Primärverdünnung in 0,2% Tween, 0,01 M EDTA/PBS, pH 7,5 (0,2% TWN), verdünnt. Die Primärverdünnungen werden wie folgt in einer FALCON^TM Platte mit 96 Vertiefungen mit U-förmigem Boden weiter seriell verdünnt:

(a) Die Primärverdünnungen der Proben werden zu 200 μl/Vertiefung in Reihe 2 geimpft. Probe 1 wird dreifach geimpft, z. B. in Vertiefungen A2, B2 und C2; Probe 2 doppelt, z. B. in Vertiefungen D2, E2; Probe 3 dreifach, z. B. in Vertiefungen F2, G2 und H2.
(b) 100 μl von 0,2% TWN wurden in jede Vertiefung der Reihen 3 bis 12 geimpft.
(c) Serielle Verdünnungen wurden hergestellt, indem 100 μl sequenziell von einer Vertiefung in Reihe 2 zur korrespondierenden Vertiefung in Reihe 3 (z. B. B2 zu B3; C2 zu C3), einer Vertiefung in Reihe 3 zur korrespondierenden Vertiefung in Reihe 4 transferiert wurden, bis Reihe 12 erreicht wurde.
(d) In Reihe 1 wurden zu jeder Vertiefung als Kontrolle 100 μl 0,2% TWN zugesetzt.

100 μl der Primärverdünnungen werden von jeder Vertiefung der FALCON^TM Platte zur korrespondierenden Vertiefung in der NUNC^TM Platte transferiert, z. B. A2 (FALCON^TM) zu A2 (NUNC^TM). Die NUNC^TM Testplatte wird zugedeckt und 1 Stunde lang bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Überstände werden von der Testplatte entfernt, und die Platte wird mit 0,1% Tween/PBS gewaschen und trocken getupft.
Ziegen-anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat (TAGO^TM) wird mit 0,3% Tween/PBS, pH 7,0 (0,3% TWN), zu einer Arbeitsverdünnung verdünnt, z. B. 1 : 1500. Das verdünnte Konjugat (100 μl) wird zu jeder Vertiefung in den Reihen 2 bis 12 zugesetzt. In Reihe 1 werden 100 μl 0,3% TWN zu jeder Vertiefung als Kontrolle zugesetzt. Die Platte wird zugedeckt und 1 Stunde lang bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Inokula werden dann entfernt, und die Platte wird mit 0,1% Tween/PBS, pH 7,4, gewaschen und trocken getupft.
Jeder Vertiefung werden 100 μl Substratlösung, 1 mg/ml in Diethanolaminpuffer, pH 9,8 (SIGMA-104^TM), zugesetzt. Die Enzymreaktion wird bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang geschehen gelassen. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 100 μl 3 N NaOH zu jeder Vertiefung beendet. Das Ausmaß der Enzymreaktion wird durch Ablesen der optischen Dichte von 410 nm bestimmt.
Die Reihen A und H dienen als negative Kontrollen, da kein Antigen vorhanden ist; Reihe 1 dient. auch als negative Kontrolle, da keine Antikörper vorhanden sind.
Beispiel 3: Virusneutralisations-Assay (Plaquereduktions-Neutralisationstest, PRNT)
Testserumproben, die seriell verdünnt sind, und das positive Kontrollserum werden bei 56°C 30 Minuten lang hitzeinaktiviert. Alle Seren werden dann mit einem gleichen Volumen verdünnt, das etwa 30 plaquebildende Einheiten (PFU) von RS-Virus enthält, und bei 37°C 1 Stunde lang mit (C' plus PRNT) oder ohne (PRNT) Zugabe von 5% Hasenkomplement inkubiert. Ein Pool von menschlichen Erwachsenenseren, die vorher durch Enzymimmunoassay, Neutralisations- und Antifusionsassay charakterisiert worden sind, wird für die positive Kontrolle verwendet. Seren, die vorher charakterisiert worden sind und von denen bekannt war, dass sie nicht-immun sind, werden als negative Kontrolle verwendet.
Jede inkubierte Serum-Virus-Mischung wird in separaten Vertiefungen von Platten mit 96 Vertiefungen auf HEp-2-Zellen (ATCC Nr. CCL23) geimpft, und die Virusabsorption wird 2 Stunden lang bei 37°C erfolgen gelassen. Die Inokula werden entfernt. Die Zellen-Monoschichten werden gewaschen, mit modifiziertem Eagle's Medium plus 5% bovinem Fetalserum und 1% SEPHADEX^® überschichtet und bei 37°C 3 Tage lang inkubiert. Das Überschichtungsmedium wird entfernt, und die Zellen werden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.
200 μl gekühlte PBS-Methanol-Lösung (1 : 5) werden jeder Vertiefung zugesetzt, und die Zellen werden 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur fixiert. Das PBS-Methanol-Fixativ wird entfernt, und 200 μl 5% CARNATION^® Instantmilch in PBS, pH 6,8, (BLOTTO) werden jeder Vertiefung zugesetzt. Die Platte wird 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert.
BLOTTO wird entfernt. 50 μl monoklonale Antikörper gegen RS-Virus (vorher titriert und mit BLOTTO zu einer Arbeitskonzentration verdünnt) werden pro Vertiefung zugesetzt, und die Platte wird bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert. Die Antikörper werden entfernt, und die fixierten Zellen werden 2 Mal jeweils 30 Minuten lang mit BLOTTO gewaschen.
50 μl/Vertiefung Merrettichperoxidase-konjugiertes Ziegenanti-Maus-IgG (verdünnt 1 : 250 in BLOTTO) werden zugesetzt, und die Platte wird 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Ziegen-Antikörper werden entfernt, und die fixierten Zellen werden wieder 2 Mal jeweils 30 Minuten lang mit BLOTTO gewaschen.
50 μl/Vertiefung einer Peroxidasesubstratlösung (0,05% 4-Chlor-1-naphthol, 0,09 H₂O₂ in PBS, pH 6,8) werden zugesetzt, und während 15 bis 30 Minuten bei Zimmertemperatur wird Farbe entwickeln gelassen. Die Substratlösung wird entfernt, und die Vertiefungen werden mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Anzahl der Plaques in jeder Vertiefung wird festgestellt.
Die Neutralisationsfähigkeit einer Testserumprobe wird als jene Verdünnung ausgedrückt, die zu einer 60% Reduktion der Plaquebildung im Vergleich zu einem nicht-immunen Kontrollserum führt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 bis 4 tabellarisch zusammengefasst.
Die Daten in den Tabellen 1, 2, 3 und 4, die die Ergebnisse des EIA und des Plaquereduktions-Neutralisationstests darstellen, zeigen die Verbesserung der biologischen Immunantwort mit der Verwendung dieser neuen Adjuvantien im Vergleich zu Alaun alleine. Die Vakzinformulierungen von RS-Virus-Fusionsprotein, G-Protein, Mischungen davon und F/G-chimärem Protein mit den neuen Adjuvantien (mit oder ohne zusätzliches Alaun) waren im Vergleich zu den Formulierungen, die nur Alaun enthielten, signifikant verstärkt.
Beispiel 4: Virus und Zelllinien
Die Stämme A2 und 18537 von RSV werden verwendet, und Virusvorräte werden nach Standardverfahren entweder in Vero-Zellen [American Type Culture Collection (ATCC) Nr. CCL 81] oder HEp-2-Zellen (ATTC Nr. CCL 23) gezüchtet, über Sorbit-Dichtegradienten gereinigt und bis zur Verwendung bei –70°C gelagert. Eine BCH4-Zelllinie, die ständig mit dem langen Stamm von RSV infiziert ist, und die nicht infizierte BALB/c-Zelllinie (für beide Zelllinien siehe Fernie et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1981, 167: 83–86) sind ein Geschenk von Dr. Bruce F. Fernie. Die letzteren Zelllinien werden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) mit 10% (V/V) hitzeinaktiviertem FBS (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT) gehalten.
Beispiel 5: Bestimmung der Anti-F-Protein-Antikörper-Unterklasse
Der Titer von Anti-F-Protein-Antikörper-Unterklasse von Mäusen, vorbehandelt mit 5 μg F-Protein gemischt mit QS-21, ALOH oder natürlicher Infektion, wird mittels ELISA bestimmt. Kurz gesagt werden Platten mit 96 Vertiefungen mit 20 ng F-Protein oder 5 μg RSV A2 wie folgt vorbereitet. Gereinigtes F-Protein (200 ng/ml) oder RSV A2 (50 μg/ml) in Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) werden während 2 Stunden bei 37°C auf Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Roskilde, Dänemark) geschichtet und über Nacht bei 4°C gelagert. Danach werden die Platten 5 Mal mit PBS/0,05% Tween^® 20 (Sigma) gewaschen, gefolgt von 2 zusätzlichen Spülungen nur mit PBS alleine. Serielle dreifache Verdünnungen des Serums, hergestellt in PBS/0,3% Tween^® 20/0,01 M EDTA-Puffer (pH 7,0) werden dann den Vertiefungen zugesetzt und 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach 5 Mal Waschen mit PBS/0,1% Tween^® 20 werden 100 μl biotinyliertes Ziegen-anti-Maus-IgG (1 : 4000, Kirkegaard and Perry Laboratories), Igel (1 : 3000, Zymed) oder IgG2a (1 : 5000, Zymed) zugesetzt, und die Platten werden 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach einer weiteren Serie von Waschungen werden den Vertiefungen 100 μl Streptavidin, konjugiert an Merrettichperoxidase (1 : 10 000 Verdünnung in PBS/0,3% Tween^® 20, Zymed) zugesetzt und bei Zimmertemperatur weitere 30 Minuten lang inkubiert. Peroxidasesubstrat (2,2'-Azino-di-[3-ethyl-benzthiazolinsulfonat (6)], Kirkegaard and Perry Laboratories) wurde den Vertiefungen nach dem Waschen zugesetzt und bei Zimmertemperatur 20 Minuten lang inkubiert, wonach die Reaktion mit 100 μl 1% Natriumdodecylsulfat (Pierce, Rockford, IL) beendet wird. Endpunkttiter werden bei 410 nM bestimmt.
Virusneutralisationsassay (PRNT) wird wie in Beispiel 3 durchgeführt.
Die erhöhten Komplement-unterstützten, Serumneutralisierenden Antikörpertiter, die durch F/QS-21 hervorgerufen wurden, korrelierten mit der Induzierung von Anti-F-Protein-Antikörpern der IgG2a-Unterklasse (Tabelle 5). 3 Wochen nach der Primärimmunisierung gab es eine QS-21-dosisabhängige Steigerung sowohl der proteinspezifischen IgG2a- als auch der IgG1-Antikörper. Im Vergleich dazu ruft eine einzelne Injektion von F-Protein gemischt in Kochsalzlösung allein oder F/ALOH primär proteinspezifische Antikörper der IgG1-Unterklasse hervor (Tabelle 5). Die Daten weisen darauf hin, dass F/QS-21 humorale Immunantworten auslöst, die jenen ähnlich sind, die von einer experimentellen Infektion erzeugt werden und sowohl aus Komplement-fixierenden IgG2a- als auch IgG1-Antikörpern bestehen.
Beispiel 6: Bestimmung der kreuzneutralisierenden Antikörpertiter und RSV-Infektivität
Das Titrieren von serumneutralisierendem Antikörper wird doppelt auf HEp-2-Zellen-Monoschichten in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben.
In diesem Beispiel wird beobachtet, wie in der Tabelle unten dargestellt ist, dass ein Adjuvans das RSV-Protein in die Lage versetzen kann, eine Komplement-abhängige IgG-Antikörperantwort hervorzurufen, die Viren sowohl der Untergruppe A als auch der Untergruppe B neutralisiert (diese Untergruppen werden in der Tabelle unten als A2 bzw. 18537 bezeichnet). Diese kreuzneutralisierende Immunantwort des RS-Virus vom heterologen Subtyp ist früher unter Verwendung von gereinigtem G-Protein alleine nicht erreicht worden. Ein Impfstoff, der mit Adjuvans QS-21 und RS-Virus-G-Protein formuliert ist, erzeugt eine wünschenswerte heterotypische neutralisierende Antikörperantwort, die wesentlich größer ist als jene, die durch Alaun alleine oder eine natürliche Infektion ausgelöst wird.
Tabelle 6: Heterotypische neutralisierende Antikörperantwort, ausgelöst durch RSV-G-Protein mit Adjuvans QS-21¹
Beispiel 7: Vergleich von QS-21 und ALOH bezüglich der Fähigkeit, lokal F-Protein-abhängige Killerzellenaktivität hervorzurufen
Die Fähigkeit von QS-21, lokal F-Protein-abhängige Killerzellenaktivität hervorzurufen, wird ebenfalls untersucht und mit der Zellen-mediierten Cytotoxizität verglichen, die durch die Immunisierung mit F/ALOH oder eine experimentelle Infektion ausgelöst wird.
Isolierung pulmonaler Mononuklearzellen (PMC): Die PMC werden aus den Lungen nach Kollagenase-Verdau isoliert (siehe Hancock et al., Vaccine, 12: 267–279, 1994 und Anderson et al., J. Gen. Virol., 71: 1561–1570, 1990). Kurz gesagt werden die herausgeschnittenen Lungen in kaltes DMEM gegeben und von peripherem Blut reingespült. Die Lungen werden dann in frischem DMEM zerkleinert, in eine 50 ml Zentrifugalröhre gegeben und bei 37°C in Gegenwart von Kollagenase (Kollagenase Typ IV, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei einer Endkonzentration von 2 mg/ml 10 mM HEPES-Puffer und 1% (V/V) hitzeinaktiviertem FBS rotiert. Nach 90 Minuten Inkubation werden die Fragmente durch ein Gewebekulturfilter (Sigma) von 100 mesh aus rostfreiem Stahl gegeben. Die resultierende Suspension wird pelletiert (400 g), in Metrizamid (16%, W/V, Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY) resuspendiert, mit RPMI 1640 (Gibco BRL) überlagert, das 10% hitzeinaktiviertes FBS enthält, und 20 Minuten lang bei 5°C zen trifugiert (150 g). Die PMC-Schichten werden dann gesammelt, von Gradient reingewaschen und ex vivo auf ihre cytolytische Fähigkeit getestet.
Bestimmung der prozentuellen Cytotoxizität: Die Antigen-abhängige zelluläre Cytotoxizität wird in einem 4 Std. ⁵¹Cr (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) Freisetzungsassay bestimmt. Kurz gesagt werden 50 μl (5000 Zellen) syngeneische ⁵¹Cr-markierte Kontrolle oder RSV-infizierte (BCH4) Targetzelllinien dreifach in Mikrovertiefungen mit V-förmigem Boden (Costar, Cambridge, MA) mit 100 μl mononuklearen Milz- oder Lungenzellen (seriell 2-fach verdünnt in RPMI 1640, das 10% hitzeinaktiviertes FBS, V/V, enthält) inkubiert (37°C, 5% CO₂). Das Endvolumen beträgt 150 μl pro Vertiefung. Nach der Inkubation werden die Überstände gesammelt (Skatron Harvester, Skatron Inc., Sterling, VA), die Freisetzung von ⁵¹Cr in einem ClinGamma-Zähler (Pharmacia LKB) gemessen und mit der spontanen Freisetzung (Targets nur mit Medium, 20–25%, inkubiert) und der Gesamtfreisetzung (Targets in Kulturmedium mit 1,0% Triton^® X-100, V/V, in PBS inkubiert) verglichen. Die prozentuelle spezifische Freisetzung wird berechnet: 100 × [(mittl. cpm Versuch) – (mittl. cpm Spontanfreisetzung)]/ [(mittl. cpm Gesamtfreisetzung) – (mittl. cpm Spontanfreisetzung)].
Studien der Antikörper-Blockade: Gereinigte monoklonale Antikörper, gerichtet gegen die Antigene des Major Histocompatibility Complex (MHC) H2K^d (Klon SF1-1.1, IgG 2a), H-2D^d (Klon AF4-62.4, IgG 2b) und H-2K^b (Klon AF6-88,5, IgG 2a), werden von PharMingen, San Diego, CA, erworben. Ein monoklonaler Antikörper (E37-10, IgG 2b), der gegen Diphtherietoxoid-Antigen gerichtet ist, dient als Unterklassenkontrolle. Der gegen CD8-Oberflächenmoleküle von Mäusen (53-6.72, ATCC Nr. TIB 105) gerichtete monoklonale Antikörper wird aus Hybridomkultur-Überständen über einer rekombinanten Protein G-Säule (Pharmacia) gereinigt. Gereinigtes Ratten-IgG wird von Calbiochem (San Diego, CA) erworben. Um die Zellen-mediierte Cytolyse zu unterbinden, werden zu 50 μl Effektorzellen vor der Zugabe von 50 μl Targetzellen 50 μl Antikörper zugesetzt. Das Endverhältnis von Effektor zu Target betrug 60 : 1.
Balb/c-Mäuse werden in Woche 0 und 3 mit 5 μg F-Protein, gemischt mit entweder 20 μg QS-21 () oder 100 μg ALOH (Δ) geimpft und mit Mäusen verglichen, die durch experimentelle Infektion immunisiert wurden (•). Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung werden die Mäuse dem Virus ausgesetzt. 4 Tage danach sind die PMC von BALB/c-Mäusen, die mit F/QS-21 geimpft wurden, in der Lage, RSV-infizierte Targets (durchgehende Linien in der Zeichnung) in Antigen-abhängiger Weise abzutöten (siehe 1A). Es ist am bemerkenswertesten, dass diese cytotoxische Aktivität genauso wirksam ist wie jede der PMC von Mäusen, die vorher mit RSV infiziert wurden, und fast 3 Mal größer ist als die Aktivität, die in den PMC von Mäusen induziert wurde, die mit F/ALOH geimpft wurden. Syngeneische Kontroll-Targets (strichlierte Linien), die nicht mit RSV infiziert sind, werden nicht abgetötet (1A). Die Aktivität ist lokal, da die Milzzellen von den selben Mäusen nicht cytolytisch sind.
Die Ergebnisse wiesen weiters darauf hin, dass die lokale Killerzellenaktivität, die durch die Impfung mit F/QS-21 ausgelöst wurde, durch T-Zellen des CD8-Phänotyps mediiert wird. Die Cytolyse war inhibiert, wenn der Assaymischung steigende Dosen von monoklonalem Antikörper gegen Zellen, die CD8-Oberflächendeterminanten aufweisen (ausgefülltes Symbol), zugesetzt wurden (1B). Ebenso blockieren steigende Konzentrationen von anti-H2D^d und H2K^d monoklonalen Antikörpern (ausgefülltes Symbol) die Cytolyse (1C). Kontrollimmunglobulin (offene Symbole) sind nicht inhibierend (1B und C).

Claims

UntereinheitsßVakzinformulierung, umfassend (a) ein Repiratory Syncytial Virus (RSV)-Protein ausgewählt aus der Grunde bestehend aus (i) RSV-Glycoprotein G, (ii) RSV-Glykoprotein F, (iii) einem chimären Polypeptid, das mindestens ein immunologenes Fragment von sowohl RSV-Glykoprotein F als auch G umfaßt, und (iv) Kombinationen davon, und (b) ein Adjuvans ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus QS-21, 3-deacyliertem Monophosphoryllipid A und Kombinationen davon, in einem, physiologische annehmbaren Träger, wobei die unter (a) aufgelisteten Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Proteine die Immunogenen Proteine in der Vakzin sind.
Untereinheits-Vakzinformulierung, umfassend (a) ein Respiratory Syncytial Virus (RSV-)Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) RSV Glycoprotein G, (ii) RSV-Glycoprotein F, (iii) einem chimären Polypeptid, das mindestens ein immunogenes Fragment von sowohl RSV-Glycoprotein F als auch G umfaßt, und (iv) Kombinationen davon, und (b) QS-21 in einem physiologisch annehmbaren Träger, wobei die unter (a) aufgelisteten Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Proteine die einzigen Immunogenen Proteine in der Vakzin sind.
Vakzinformulierung gemäß Anspruch 1, die weiters Alaun enthält.
Vakazinformulierung gemäß Anspruch 2, die weiters Alaun enthält.
Untereinheits-Vakzinformulierung, umfassend (a) ein Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) RSV-Glycoprotein G, (ii) RSV-Glykoprotein F, (iii) einem chimären Polypeptid, das minedestens ein immunogenes Fragment von sowohl RSV-Glycoprotein F als auch G umfaßt, und (iv) Kombinationen davon, und (b) Alaun und 3-deacyliertes Monophosphoryllipid A in einem physiologisch annehmbaren Träger, wobei die unter (a) aufgelisteten Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Proteine die einzigen immunogenen Proteine in der Vakzin sind.
Vakzine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung zum Schutz gegen Erkrankungen der unteren Atemwege und andere Kranheitssymptome einer RSV-Infektion.
Verwendung einer Vakzinformulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 bei der Herstellung eines Medikaments zum Schutz gegen Erkrankungen der unteren Atemwege und andere Krankheitssymptome einer RSV-Infektion.