DE69837708T2

DE69837708T2 - Von alphavirus abgeleitete vektoren als impfstoffe gegen eine paramyxovirusinfektion

Info

Publication number: DE69837708T2
Application number: DE69837708T
Authority: DE
Inventors: Mark Bradford PARRINGTON
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1997-09-04
Filing date: 1998-09-03
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2018-09-04
Also published as: BR9815642A; US6428324B1; JP2001514857A; WO1999011808A1; CA2301891A1; ATE361368T1; AU9056998A; BR9815642B1; CA2301891C; US6060308A; EP1009846B1; EP1009846A1; AU742046B2; DE69837708D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Paramyxoviridae-Impfstoffe und beschäftigt sich insbesondere mit Impfstoffen, welche RNA umfassen, die das Fusions(F)-Protein des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) codiert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das humane respiratorische Synzytialvirus (RSV) wurde als ein wesentlicher Krankheitserreger identifiziert, der für schwere Infektionen des Respirationstrakts bei Säuglingen, bei jungen Kindern und den institutionalisierten älteren Personen verantwortlich ist (Ref. 1, 2, 3, 4 – überall in dieser Anmeldung werden verschiedene Literaturhinweise in Klammern zitiert, um den Stand der Technik, den diese Erfindung betrifft, vollständiger zu beschreiben. Eine vollständige bibliographische Information für jedes Zitat findet man am Ende der Beschreibung, den Ansprüchen direkt vorausgehend. Die Offenbarungen dieser Literaturhinweise sind hiermit durch Bezugnahme in die vorliegende Offenbarung eingebracht). Die globalen Sterblichkeits- und Krankheitszahlen deuten darauf hin, dass es einen dringenden Bedarf für einen wirksamen RSV-Impfstoff gibt (Ref. 5, 6). Allein in den USA, werden jährlich etwa 100 000 Kinder mit schweren Fällen von Lungenentzündung und Bronchiolitis, die von einer RSV-Infektion verursacht werden, ins Krankenhaus eingeliefert. Es wurde geschätzt, dass die stationäre und ambulante Behandlung für Kinder mit RSV-Infektionen über $340 Millionen jedes Jahr in den USA kostet. Die Weltgesundheitsorganisati an (WHO) und die Impfstoff-Beratungskommissionen des nationalen Instituts für Allergie und ansteckende Krankheit (NIAID) haben RSV nur wegen HIV an zweiter Stelle für eine Impfstoffentwicklung eingestuft. Sowohl die jährlichen Krankheits- und Sterblichkeitszahlen, als auch die gigantischen Kosten im Gesundheitswesen für die Bewältigung von RSV-Infektionen haben den Anreiz für ein energisches Fortsetzen der Entwicklung von wirksamen RSV-Impfstoffen gegeben. Jedoch ist solch ein Impfstoff noch nicht erhältlich.
Formalin-inaktivierte (FI-RSV) und abgeschwächte RSV-Lebendimpfstoffe waren nicht in der Lage eine Wirksamkeit bei klinischen Studien zu zeigen (Ref. 7, 8, 9, 10). Darüber hinaus verursachte der formalin-inaktivierte RSV-Impfstoff bei einigen Kindern nach dem Aussetzen an einen Wildtyp-RSV eine verstärkte Erkrankung (Ref. 7, 8, 9, 10). Die Aufklärung des Mechanismus (der Mechanismen), die an der Verstärkung der RSV-Erkrankung beteiligt sind, ist für die Entwicklung von sicheren RSV-Impfstoffen wichtig, besonders für die seronegative Bevölkerung. Ein neuerer experimenteller Hinweis deutet darauf hin, dass ein Ungleichgewicht bei den zell-vermittelten Antworten zu einer Immunpotenzierung beitragen könnte. Eine verstärkte Histopathologie, die bei Mäusen beobachtet wurde, die mit dem FI-RSV immunisiert und mit dem Virus belastet wurden, konnte durch eine Depletion von CD4+-Zellen oder sowohl Interleukin-4 (IL-4) als auch IL-10 aufgehoben werden.
Das RSV-Fusions(F)-glycoprotein ist eines der wichtigsten immunogenen Proteine des Virus. Dieses Hüllglycoprotein vermittelt sowohl die Fusion des Virus mit der Wirtszellmembran als auch die Ausbreitung des Virus von Zelle zu Zelle (Ref. 1). Das F-Protein wird als ein Vorläufer(F₀)-Molekül synthetisiert, welches proteolytisch gespalten wird, um ein Disulfid-verbundenes Dimer zu bilden, das aus den N-terminalen F₂- und den C-terminalen F₁-Gruppen zusammengesetzt ist (Ref. 11). Die Aminosäuresequenz des F-Proteins ist innerhalb der RSV-Untergruppen A und B hoch konserviert und ist ein kreuzweise schützendes Antigen (Ref. 6, 12). Im Baculovirus- Expressionssystem wurde eine trunkierte, sekretierte Form des RSV-F-Proteins in Trichoplusia ni-Insektenzellen exprimiert (Ref. 13). Es wurde gezeigt, dass das rekombinante Protein bei den Baumwollratten schützend ist (Ref. 13).
Untersuchungen zur Entwicklung von viralen Lebendimpfstoffen und Glycoprotein-Untereinheits-Impfstoffen gegen eine Parainfluenza-Virusinfektion werden gegenwärtig fortgeführt. Ergebnisse klinischer Studien mit einem Formalin-inaktivierten Impfstoff der PIV-Typen 1, 2, 3 zeigten, dass dieser Impfstoff nicht wirksam war (Ref. 14, 15, 16). Eine weitere Entwicklung von chemisch inaktivierten Impfstoffen wurde abgebrochen, nachdem klinische Studien mit einem Formalin-inaktivierten RSV-Impfstoff zeigten, dass der Impfstoff nicht nur nicht wirksam in der Prävention einer RSV-Infektion war, sondern dass viele der Impflinge, die später mit RSV infiziert wurden, eine schwerere Erkrankung erlitten. Der größte Teil der Parainfluenza-Impfstoff-Forschung hat sich auf PIV-3-Impfstoff-Kandidaten konzentriert (Ref. 17), wobei über deutlich weniger Arbeit für PIV-1 und PIV-2 berichtet wird. Neuere Ansätze zu PIV-3-Impfstoffen schlossen die Verwendung des eng verwandten Rinder-Parainfluenza-Virus Typ 3 und die Erzeugung von abgeschwächten Viren durch Kälteadaption des Virus, ein (Ref. 18, 19, 20, 21).
Ein weiterer Ansatz zu einer Entwicklung eines Impfstoffs des Parainfluenza-Virus Typ-3 ist ein Untereinheiten-Ansatz, der sich auf die Oberflächen-Glycoproteine Hämagglutinin-Neuraminidase (HN) und das Fusions(F)-Protein konzentriert (Ref. 22, 23, 24). Das HN-Antigen, ein typisches Typ II-Glycoprotein, weist sowohl Hämagglutinations- als auch Neuraminidase-Aktivitäten auf und ist verantwortlich für das Anhaften des Virus an Sialinsäure enthaltende Rezeptoren der Wirtszelle. Das Typ I F-Glycoprotein vermittelt eine Fusion der viralen Hülle mit der Zellmembran sowie auch die Ausbreitung des Virus von Zelle zu Zelle. Es wurde vor kurzem gezeigt, dass sowohl die HN- als auch die F-Glycoproteine für eine Membranfusion benötigt werden. Das F-Glycoprotein wird als ein inaktiver Vorläufer (F) synthetisiert, der pro teolytisch zu Disulfid-gebundenen F2- und F1-Resten gespalten wird. Während die HN- und F-Proteine von PIV-1, -2, und -3 strukturell ähnlich sind, sind sie als Antigen verschieden. Neutralisierende Antikörper gegen die HN- und F-Proteine von einem der PIV-Typen sind nicht kreuzweise schützend. Daher muss ein wirksamer PIV-Untereinheits-Impfstoff die HN- und F-Glycoproteine aus den drei verschiedenen Typen von Parainfluenza-Viren enthalten. Ein Antikörper gegen jedes der beiden Glycoproteine ist in vitro neutralisierend. Es wurde eine direkte Korrelation zwischen dem Spiegel der Titer von neutralisierendem Antikörper und der Resistenz gegen PIV-3 Infektionen bei Säuglingen beobachtet. Mit nativen Untereinheits-Impfstoffen für Parainfluenza-Virus Typ 3 wurde die Protektivität der beiden Oberflächen-Glycoproteine beforscht. Typischerweise werden die Glycoproteine aus dem Virus unter Verwendung von nicht-ionischen Detergenzien extrahiert und weiter gereinigt unter Verwendung von Lectin-Affinitäts- oder Immunaffinitäts-chromatographischen Verfahren. Jedoch könnte keine dieser Techniken für die Produktion von Impfstoffen im großen Maßstab unter allen Umständen vollkommen geeignet sein. In Schutzmodellen mit Kleintieren (Hamster und Baumwollratten) wurde gezeigt, dass eine Immunisierung mit den Glycoproteinen eine Infektion mit lebenden PIV-3 verhindert (Ref. 25, 26, 27, 28, 29). Die HN- und F-Glycoproteine von PIV-3 wurden auch unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie hergestellt. HN- und F-Glycoproteine wurden in Insektenzellen unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems und durch die Verwendung von Vacciniavirus- und Adenovirus-Rekombinanten hergestellt (Ref. 30, 31, 32, 33, 34). Im Baculovirus-Expressionssystem wurden sowohl Volllängenformen als auch trunkierte Formen der PIV-3 Glycoproteine ebenso wie ein chimäres F-HN-Fusionsprotein exprimiert. Es wurde gezeigt, dass die rekombinanten Proteine in Kleintiermodellen schützend sind (siehe WO91/00104 , US-Anmeldung Nr. 07/773 949 , eingereicht am 29. November 1991, dem Rechtsnachfolger hiervon übertragen).
Das Semliki Forest Virus (SFV) ist ein Mitglied der Alphavirus-Gattung in der Familie der Togaviridae. Das reife Viruspartikel enthält eine einzelne Kopie eines ssRNA-Genoms mit einer positiven Polarität, die 5'-verkappt und 3'-polyadenyliert ist. Es wirkt als eine mRNA und nackte RNA kann eine Infektion auslösen, wenn sie in Zellen eingeführt wird. Nach einer Infektion/Transfektion werden die zwei Drittel vom 5' des Genoms in ein Polyprotein translatiert, welches durch eine Selbstspaltung in die vier nicht-strukturellen Proteine (nsP1 bis 4) prozessiert wird. Sobald die ns-Proteine synthetisiert sind, sind sie verantwortlich für die Replikation des Plus-Strang(42S)-Genoms zu Volllängen-Minus-Strängen (Ref. 35). Diese Minus-Stränge dienen dann als Matrizen für die Synthese von neuen Plus-Strang(42S)-Genomen und der subgenomischen 26S mRNA (Ref. 35). Diese subgenomische mRNA, die mit dem letzen Drittel des Genoms colinear ist, codiert die strukturellen Proteine von SFV. In Jahre 1991 entwarfen Liljestrom und Garoff (Ref. 36) eine Reihe von Expressionsvektoren, die auf dem SFV cDNA-Replikon basierten. Diese Alphavirus-Vektoren werden auch in der WO 92/10578 beschrieben, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingebracht ist. Diese Vektoren wiesen die Gene der viralen strukturellen Proteine deletiert auf, um den Weg für heterologe Inserts zu bereiten, bewahrten aber den nicht-strukturellen codierenden Bereich für die Erzeugung des nsP1 bis 4-Replikase-Komplexes. Kurze 5'- und 3'-Sequenzelemente, die für die RNA-Replikation benötigt werden, waren ebenfalls konserviert. Eine Polylinkerstelle wurde stromabwärts vom 26S Promotor eingefügt, gefolgt von Translations-Stopstellen in allen drei Rahmen. Eine Spe I-Stelle wurde gleich nach dem 3'-Ende der SFV cDNA für eine Linearisierung des Plasmids für eine Verwendung bei in vitro-Transkriptionsreaktionen eingefügt.
Es wurde gezeigt, dass Injektionen von SFV-RNA, welche ein heterologes Protein codiert, die Expression des fremden Proteins und die Antikörper-Induktion in einer Anzahl von Studien zur Folge hat (Ref. 37, 38). Die Anwendung einer SFV-RNA-Impfung, um fremde Proteine für den Zweck einer Immuni sierung zu exprimieren, würde mehrere der Vorteile aufweisen, die mit einer Plasmid-DNA-Immunisierung verbunden sind. Zum Beispiel kann SFV-RNA, welche ein virales Antigen codiert, in Anwesenheit eines Antikörpers gegen jenes Virus ohne einen Verlust in der Wirksamkeit auf Grund einer Neutralisation durch Antikörper gegen das Virus eingeführt werden. Auch sollte, da das Protein in vivo exprimiert wird, das Protein die gleiche Konformation wie das Protein aufweisen, das durch das Virus selbst exprimiert wird. Folglich könnten Bedenken über konformationelle Änderungen, die während einer Proteinreinigung eintreten könnten und zu einem Verlust bei der Immunogenität, schützenden Epitopen und vielleicht zu einer Immunpotenzierung führen, durch eine Nukleinsäure-Immunisierung vermieden werden.
Eine Immunisierung mit SFV-RNA hat auch mehrere einzigartige Vorteile gegenüber einer Plasmid-DNA-Immunisierung. SFV ist einer der sich am effizientesten replizierenden Viren, die bekannt sind. Nach wenigen Stunden können bis 200 000 Kopien der Plus-RNAs in einer einzelnen Zelle hergestellt werden. Diese SFV-RNAs sind so reichlich vorhanden, dass fast alle der Zell-Ribosomen in die Synthese der SFV-codierten Proteine eingebunden sind und damit die Proteinsynthese der Wirtszelle überholen (Ref. 36). Folglich sollte es eine kleinere Dosis von SFV-RNA und weniger Zeit erfordern, um einen schützenden Effekt, verglichen mit einer Plasmid-DNA-Immunisierung, zu erreichen. Zweitens stellt RNA, anders als DNA, kein mögliches Risiko einer Integration in das Zell-Genom dar. Drittens findet eine SFV-RNA-Replikation und -Expression nur im Zytoplasma der Zelle statt. Folglich sind die Probleme, die mit nukleärem Transport und Spleißen, die mit Kern-basierten Expressions-Systemen (DNA-Immunisierung) verbunden sind, einhergehen, nicht vorhanden. Da viertens die Replikation der SFV-RNA transient ist und RNA ziemlich labil ist, wird die SFV-RNA nicht wie DNA-Plasmide für lange Zeiträume nach einer Immunisierung persistieren.
In der WO 95/27044 , deren Offenlegung hierin durch Bezugnahme einbezogen wird, wird die Verwendung von Alphavirus-cDNA- Vektoren beschrieben, die auf cDNA basieren, die zur Alphavirus-RNA-Sequenz komplementär ist. Sobald sie von der cDNA unter der Transkriptionskontrolle eines heterologen Promotors transkribiert wurde, ist die Alphavirus-RNA in der Lage, sich durch ihre eigene Replicase selbst zu replizieren und dadurch die Kopienzahl der transkribierten rekombinanten RNA-Moleküle zu amplifizieren.
In der gleichzeitig anhängigen US-Patent-Anmeldung Nr. 08/476 397 , eingereicht am 7. Juni 1995, ( WO 96/40945 ), die an den Rechtsnachfolger hiervon übertragen ist und deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme einbezogen ist, werden bestimmte Plasmid-Konstrukte beschrieben, die für eine DNA-Immunisierung verwendet werden, welche Formen des RSV-F-Gens einschließen. Wie darin erkannt, verlieh ein Plasmid pXL2 einen vollständigen Schutz bei Mäusen gegen eine Belastung durch lebende RSV, wenn es intranasal verabreicht wurde. Dieses Plasmid enthält ein Gen, das ein trunkiertes RSV-F-Protein, dem der Transmembranteil des Proteins fehlt, den Immediate-Early-Promotor-Enhancer und Intron-Sequenzen des humanen Cytomegatrovirus (CMV) und die Intron II-Sequenzen des Kaninchen-β-Globins codiert, um anomales Spleißen zu verhindern. Das gleiche Plasmid-Konstrukt, aber ohne die Intron II-Sequenzen des Kaninchen-β-Globins, d. h. pXL1, sah nur einen partiellen Schutz vor. Ähnlich sah das Plasmid-Konstrukt pXL4, das das gleiche wie pXL2 ist, mit der Ausnahme, dass das RSV-F-Gen das Volllängen-RSV-Protein codiert, einen partiellen Schutz vor, während das entsprechende Konstrukt, dem die Intron II-Sequenz des Kaninchen-β-Globins fehlt, d. h. pXL3, keinen Schutz verlieh.
Diese Daten zeigen, dass das Fehlen von Elementen zur Reduzierung eines anomalen Spleißens das Schutzvermögen des Plasmids nachteilig beeinflusst. Anomales Spleißen tritt während einer nukleären Transkription von DNA zu RNA auf. Indem RNA-Transkripte für eine Immunisierung verwendet werden, wird die Notwendigkeit für eine nukleäre Prozessierung vermieden und anomales Spleißen kann nicht stattfinden. Dies ermöglicht, dass die Verwendung der Intron II-Sequenzen aus nicht-humanen Quellen vermieden wird.
Die Verwendung von RNA-Transkripten für eine Verabreichung an den Wirt ermöglicht es, dass dort ein vollständiger Schutz gegen eine Belastung erreicht wird, und zwar unter Verwendung einer geringeren Dosis in einer kürzeren Zeit, als wenn die DNA-Plasmide, die in der USAN 08/476 397 ( WO 96/40945 ) beschrieben sind, eingesetzt werden. Die Verwendung der RNA-Transkripte vermeidet eine Persistenz von DNA im immunisierten Wirt und eine mögliche Integration.
Die Fähigkeit gegen eine durch RSV verursachte Erkrankung durch eine Immunisierung mit nackter SFV-RNA zu immunisieren, welche das RSV-F-Protein, insbesondere die sekretierte Form des RSV-F-Proteins codiert, war vor der vorliegenden Erfindung unbekannt und konnte auf der Grundlage des bekannten Standes der Technik nicht vorausgesagt werden. Eine Infektion mit RSV führt zu einer schweren Erkrankung. Es wäre nützlich und wünschenswert, verbesserte Vektoren für eine in vivo-Verabreichung von immunogenen Präparationen, einschließlich Impfstoffen, für den Schutz gegen eine durch RSV verursachte Krankheit zur Verfügung zu stellen. Insbesondere wäre es wünschenswert, Impfstoffe zur Verfügung zu stellen, die bei den älteren und den pädiatrischen menschlichen Bevölkerungsgruppen, einschließlich seronegative Säuglinge, immunogen und schützend sind, welche keine Krankheitsverstärkung (Immunpotenziering) verursachen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue immunogene Materialien und Immunisierungsverfahren zur Verfügung, die auf solchen neuen Materialien für das Immunisieren gegen eine durch das respiratorische Synzytialvirus verursachte Erkrankung basieren. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf die Bereitstellung von RNA-Impfstoffen gegen eine Erkrankung ge richtet, die durch eine Infektion mit dem respiratorischen Synzytialvirus verursacht wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereit gestellt, der eine erste DNA-Sequenz umfasst, welche das Komplementäre zu den vollständigen SFV-RNA-Genom-Replikationsbereichen ist; eine zweite DNA-Sequenz, welche ein respiratorisches Synzytialvirus(RSV)-Fusionsglycoprotein F, welchem der Transmembrananker und der cytoplasmatische Schwanz fehlen, codiert; wobei die zweite DNA-Sequenz in einen Bereich der ersten DNA-Sequenz eingefügt ist, der für eine Replikation nicht essentiell ist; wobei die erste und zweite DNA-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors stehen.
Das Fehlen des codierenden Bereichs für den Transmembrananker und den cytoplasmatischen Schwanz führt zu einer sekretierten Form des RSV-F-Proteins.
Die zweite DNA-Sequenz codiert ein RSV-F-Protein, und ihr fehlt eine Spe I-Restriktionsstelle, und wobei wahlweise auch der den Transmembrananker und den cytoplasmatischen Schwanz codierende Bereich fehlt. Das Fehlen der Spe I-Restriktionsstelle kann erreicht werden, indem das Nukleotid 194 (T) des RSV-F-Gens zu einem C mutiert wird, was die Spe I eliminiert, ohne die Aminosäure-Sequenz zu verändern. Die Nukleotid-Sequenz (SEQ ID No: 1) und die codierte Aminosäure-Sequenz (SEQ ID No: 2) des mutierten trunkierten RSV-F-Gens sind in 2 gezeigt.
Die erste DNA-Sequenz ist die Semliki Forest Virus-Sequenz, die im Plasmid pSFV1 enthalten ist. Der bevorzugt verwendete Promotor ist der SP6-Promotor.
Der Vektor kann eine einmalige Restriktionsstelle enthalten, welche eine Linearisierung des Vektors erlaubt, ohne die zweite Nukleotid-Sequenz zu beseitigen, und wobei die erste und zweite Nukleotid-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle des Promotors gehalten werden. Die einmalige Restriktionsstelle ist vorzugsweise eine Spe I-Stelle, insbesondere jene, die aus pSFV1 stammt. Die linearisierte Form des Vektors bildet eine Ausführungsform hierin.
Der Vektor kann ein Plasmid-Vektor sein, vorzugsweise einer, der die kennzeichnenden Eigenschaften von Plasmid pMP37 (ATCC 97905) aufweist, wie in 1C gezeigt, und stärker bevorzugt ist er das Plasmid pMP37.
Die Sequenz der mutanten DNA, die ein RSV-F-Protein oder ein Fragment davon codiert, das in der Lage ist, Antikörper zu induzieren, die spezifisch mit einem RSV-F-Protein reagieren und der die Spe I-Restriktionsstelle, die in der nativen DNA-Sequenz vorhanden ist, fehlt, stellt einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Die Sequenz solch einer mutanten DNA, der die Spe I-Stelle der natürlichen Sequenz fehlt, ist vorzugsweise jene, die in 2 (SEQ ID No: 1) gezeigt ist, oder eine, welche die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz codiert (SEQ ID No: 2).
Der hierin bereit gestellte neue Vektor kann durch eine Spaltung an der einmaligen Restriktionsstelle linearisiert und zu einem RNA-Transkript transkribiert werden. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird dabei ein RNA-Transkript eines Vektors, wie hierin vorgesehen, bereit gestellt, welches durch eine Linearisierung und Transkription erzeugt wurde.
Die hierin bereit gestellten RNA-Transkripte können in der Form einer immunogenen Zusammensetzung zur in vivo-Verabreichung an einen Wirt für die Erzeugung von Antikörpern gegen das Paramyxovirus-Protein in dem Wirt bereit gestellt werden, wobei solche immunogenen Zusammensetzungen als ihren aktiven Bestandteil ein RNA-Transkript, wie hierin vorgesehen, umfassen. Solche immunogenen Zusammensetzungen, die gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung bereit gestellt werden, können mit einem beliebigen geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger für die in vivo-Verabreichung formuliert werden und können eine schützende Immunantwort hervorrufen.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird dabei ein Verfahren für die Immunisierung eines Wirts gegen eine Erkrankung bereit gestellt, welche durch eine Infektion mit einem Paramyxovirus verursacht wird, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge eines RNA-Transkripts, wie hierin bereit gestellt, an den Wirt umfasst.
Die vorliegende Erfindung schließt auch ein neues Verfahren der Verwendung eines Gens ein, welches ein RSV-F-Protein oder ein Fragment eines RSV-F-Proteins codiert, das in der Lage ist, Antikörper zu erzeugen, die spezifisch mit einem RSV-F-Protein reagieren, um einen Wirt gegen eine durch eine Infektion mit dem respiratorischen Synzytialvirus verursachte Erkrankung zu schützen, welches das Isolieren des Gens; das funktionsfähige Verknüpfen des Gens an eine DNA-Sequenz, welche mindestens zu einem Teil eines Alphavirus-RNA-Genoms komplementär ist und welche das Komplement der vollständigen Replikationsbereiche des Alphavirus-RNA-Genoms in einem Bereich der DNA-Sequenz, der für die Replikation nicht essentiell ist, aufweist, um einen Plasmidvektor zu bilden, in welchem das Gen und die DNA-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors stehen; das Linearisieren des Plasmidvektors, während das Gen und die DNA-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle des Promotors gehalten werden; das Bilden eines RNA-Transkripts des linearisierten Vektors; und das Einführen des RNA-Transkripts in den Wirt umfasst.
Die Linearisierung des Plasmidvektors wird bewirkt, indem der Plasmidvektor an einer darin einmaligen Restriktionsstelle an einem Ort, welcher die Beibehaltung des Gens und der DNA-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle des Promotors erlaubt, getrennt wird. Die einmalige Restriktionsstelle kann eine Spe I-Stelle sein, wie aus dem Plasmid pSFV1 abgeleitet.
Der vorzugsweise verwendete Plasmidvektor ist Plasmid pMP37 und der linearisierende Schritt wird durch eine Spaltung an der Spe I-Stelle von Plasmid pMP37 bewirkt (siehe 1C).
Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines Impfstoffs für den Schutz eines Wirts gegen eine Krankheit ein, die durch eine Infektion mit dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV) verursacht wird, welches das Isolieren einer ersten DNA-Sequenz, welche ein RSV-F-Protein, in welchem der Transmembrananker und der cytoplasmatische Schwanz fehlen, codiert und welcher jegliche Spe I-Restriktionsstelle fehlt; das funktionsfähige Verknüpfen der ersten DNA-Sequenz mit einer zweiten DNA-Sequenz, welche mindestens zu einem Teil eines Alphavirus-RNA-Genoms komplementär ist und welche die vollständigen Alphavirus-Genom-Replikationsbereiche in einem Bereich der zweiten DNA-Sequenz, der für die Replikation nicht essentiell ist, aufweist, um einen Plasmidvektor zu bilden, in welchem die erste und die zweite DNA-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors stehen; das Linearisieren des Plasmidvektors, während die erste und die zweite DNA-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle des Promotors gehalten werden; das Bilden eines RNA-Transkripts des linearisierten Vektors; und das Formulieren des RNA-Transkripts als einen Impfstoff für eine in vivo-Verabreichung umfasst.
Die Linearisierung des Plasmidvektors wird bewirkt, indem der Plasmidvektor an einer darin einmaligen Restriktionsstelle an einem Ort, welcher die Beibehaltung des Gens und der DNA-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle des Promotors erlaubt, getrennt (clearing) wird. Die einmalige Restriktionsstelle kann eine Spe I-Stelle sein, wie aus dem Plasmid pSFV1 abgeleitet.
Der vorzugsweise verwendete Plasmidvektor ist Plasmid pMP37 und der linearisierende Schritt wird durch eine Spaltung an der Spe I-Stelle von Plasmid pMP37 bewirkt.
Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen die Bereitstellung von RNA-Transkripten ein, welche bei der Erzeugung einer Immunantwort durch eine in vivo-Verabreichung nützlich sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die vorliegende Erfindung wird ferner aus der folgenden Beschreibung mit Bezug auf die Zeichnungen verstanden werden, in denen:
Die 1A, 1B und 1C ein Schema für die Konstruktion von Plasmid pMP37 zeigen, das verwendet wurde, um die RSV-F-RNA zu erzeugen;
die 2 die Nukleotid-Sequenz (SEQ ID No: 1) und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz (SEQ ID No: 2) eines trunkierten RSV-F-Gens zeigt, dem der Transmembrananker und der cytoplasmatische Schwanz fehlen und das bei Nukleotid 194 mutiert ist, um die SpeI-Restriktionsstelle, die im unmutierten Gen vorhanden ist, zu eliminieren;
die 3, umfassend die Tafeln A, B und C, die anti-RSV-F-Titer bei Seren aus Mäusen zeigt, welche 4 Wochen nach einer primären Immunisierung und 2 Wochen nach einer Boosterung mit der RSV-F-RNA abgenommen wurden. Die Tafeln A, B und C zeigen die Gesamt-IgG-Antwort, die IgG1-Antwort bzw. die IgG2a-Antwort; und
4 die Titer von RSV-spezifischem neutralisierendem Antikörper zeigt, ausgedrückt als Plaque-Verringerungstiter für verschiedene RSV-Präparationen.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen den Schutz von Wirten gegen eine Erkrankung, die durch eine Infektion durch einen Paramyxovirus verursacht wird, durch eine RNA-Immunisierung unter Verwendung von RNA-Transkripten, die aus DNA-Vektoren durch eine Linearisierung und Transkription des linearisierten Vektors gebildet werden. Insbesondere beschäftigt sich die Erfindung mit dem Schutz von Wirten gegen eine Erkrankung, die durch eine Infektion durch das respiratorische Synzytialvirus (RSV) verursacht wird, obwohl sie nicht speziell darauf begrenzt ist. Die Beschreibung, die folgt, bezieht sich besonders auf die Anwendung von DNA-Sequenzen und deren RNA-Transkripten, die ein RSV-F-Protein und Fragmente davon codieren, welche Antikörper erzeugen, die spezifisch mit einem RSV-F-Protein reagieren.
In dieser Anmeldung wird der Begriff „RSV-F-Protein" zur Definition eines Volllängen-RSV-F-Proteins verwendet, umfassend Proteine, die in ihren Aminosäure-Sequenzen Variationen aufweisen, was jene einschließt, die natürlicherweise in verschiedenen RSV-Stämmen vorkommen und jene, die durch eine PCR-Amplifikation des codierenden Gens eingeführt werden, während die immunogenen Eigenschaften erhalten bleiben, eine sekretierte Form des RSV-F-Proteins, welchem ein Transmembrananker und ein cytoplasmatischer Schwanz fehlen, sowie Fragmente eines RSV-F-Proteins, die in der Lage sind, Antikörper zu erzeugen, die spezifisch mit einem RSV-F-Protein und funktionellen Analoga eines RSV-F-Proteins zu reagieren. In dieser Anmeldung ist ein erstes Protein ein "funktionelles Analogon" eines zweiten Proteins, wenn das erste Protein immunologisch damit verwandt ist und/oder die gleiche Funktion besitzt wie das zweite Protein. Das funktionelle Analogon kann zum Beispiel ein Fragment des Proteins oder eine Substitutions-, Additions- oder Deletions-Mutante davon sein.
Ein Vektor wird konstruiert, um eine erste DNA-Sequenz zu enthalten, welche mindestens zu einem Teil eines Alphavirus-RNA-Genoms, insbesondere eines Semliki Forest Virus, komplementär ist und welche das Komplement der vollständigen Alphavirus-RNA-Genom-Replikationsbereiche aufweist. Eine zwei te DNA-Sequenz, die das RSV-F-Protein codiert, wird in einen Bereich der ersten DNA-Sequenz eingefügt, der für eine Replikation nicht essentiell ist. Die erste und zweite DNA-Sequenz stehen unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors. Der resultierende Vektor wird linearisiert, und ein RNA-Transkript wird aus dem linearisierten Vektor gebildet.
Die hierin bereit gestellten RNA-Transkripte, wenn sie an ein Lebewesen, was einen Menschen einschließt, verabreicht werden, replizieren sich schnell und bewirken eine in vivo-Expression von RSV-F-Protein, wie durch eine für ein RVF-Protein spezifische Antikörperantwort in dem Lebewesen, an das es verabreicht wurde, gezeigt wurde. Solche Antikörper können, wenn es erwünscht ist, bei der Detektion von RSV-Protein in einer Probe zur Anwendung kommen.
Wie aus den Ergebnissen, die in den Beispielen unten ausführlich beschrieben sind, erkannt werden kann, sahen die RNA-Transkripte einen hohen anti-F IgG-Antikorper-Titer vor, mit einem Verhältnis IgG1/IgG2a, das dem Verhältnis genau folgt, das durch eine Immunisierung mit einem lebenden Virus erhalten wurde. Eine Immunisierung mit den RNA-Transkripten schützte die Lebewesen gegen eine Belastung bzw. Herausforderung mit lebenden RSV.
Es ist für einen Fachmann im Fachbereich deutlich sichtbar, dass die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zahlreiche Anwendungen auf den Gebieten der Impfung, Diagnose und Behandlung von RSV-Infektionen aufweisen. Eine weitere, nicht einschränkende Diskussion solcher Anwendungen wird ferner unten dargelegt.
1. Impfstoff-Herstellung und -Verwendung
Immunogene Zusammensetzungen, die dafür geeignet sind, als Impfstoffe verwendet zu werden, können aus dem RSV-F-Gen und Vektoren, wie hierin offenbart hergestellt werden. Der Impfstoff löst eine Immunantwort in einem Probanden aus, was die Erzeugung von anti-RSVF-Antikörpern einschließt. Immunogene Zusammensetzungen, einschließlich Impfstoffe, welche die RNA-Transkripte enthalten, können als Injektionsmittel, in physiologisch akzeptablen flüssigen Lösungen oder Emulsionen für eine Polynukleotid-Verabreichung hergestellt werden. Die RNA-Transkripte, die mit Liposomen verbunden sind, wie Lecithin-Liposome oder andere im Fachbereich bekannte Liposome, wie ein Nukleinsäure-Liposom (zum Beispiel, wie beschrieben in der WO 93/24640 , Ref. 38) oder die RNA können mit einem Adjuvans verbunden sein, wie es unten ausführlicher beschrieben ist. Liposome, die kationische Lipide umfassen, Wechselwirken spontan und schnell mit Polyanionen wie DNA und RNA, was zu Liposom/Nukleinsäure-Komplexen führt, welche bis zur Entleerung des Polynukleotids aufnehmen. Darüber hinaus fusionieren die polykationischen Komplexe mit Zellmembranen, was zu einer intrazellulären Zuführung des Polynukleotids führt, das die abbauenden Enzyme des lyposomalen Kompartiments umgeht. Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 94/27435 beschreibt Zusammensetzungen für eine genetische Immunisierung, die kationische Lipide und Polynukleotide umfassen. Agenzien, die bei der zellulären Aufnahme von Nukleinsäure unterstützend wirken, wie Calcium-Ionen, virale Proteine und andere die Transfektion erleichternde Mittel, können in vorteilhafter Weise zur Anwendung kommen.
Immunogene Polynukleotid-Präparationen können auch als Mikrokapseln formuliert werden, was biologisch abbaubare, über einen Zeitraum freisetzende Teilchen einschließt. Dementsprechend beschreibt das US-Patent 5 151 264 einen partikulären Träger von einer Phospholipid/Glycolipid/Polysaccharid-Art, der als Bio Vecteurs Supra Moléculaires (BVSM) bezeichnet wurde. Die partikulären Träger sind dazu gedacht, eine Vielzahl von Molekülen, die eine biologische Aktivität aufweisen, in eine der Schichten davon zu transportieren.
Das US-Patent 5 075 109 beschreibt eine Einkapselung der Antigene trinitrophenyliertes Schlüsselloch-Napfschnecken (Key Hole Limpet)-Hämocyanin und Staphylokokken-Enterotoxin B in 50 : 50 Poly(DL-Lactidcoglycolid). Andere Polymere werden für die Einkapselung vorgeschlagen, wie Poly(Glycolid), Poly(DL-Lactid-coglycolid), Copolyoxalate, Polycaprolacton, Poly(Lactid-co-caprolacton), Poly(Esteramide), Polyorthoester und Poly(8-Hydroxybuttersäure) und Polyanhydride.
Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 91/06282 beschreibt ein Zuführungs-Vehikel, das eine Vielzahl von bioadhäsiven Mikrosphären und Antigenen umfasst. Wobei die Mikrosphären aus Stärke, Gelatine, Dextran, Kollagen oder Albumin bestehen. Dieses Zuführungs-Vehikel ist insbesondere für die Aufnahme von Impfstoff über die Nasenschleimhaut gedacht. Das Zuführungs-Vehikel kann darüber hinaus einen Absorptionsverstärker enthalten.
Die RNA-Transkripte können mit pharmazeutisch akzeptablen Exzipientien, die damit verträglich sind, gemischt werden. Solche Exzipientien können Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon einschließen. Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe können ferner Hilfs-Substanzen, wie Benetzungs- oder Emulgierungs-Mittel, pH-puffernde Mittel oder Adjuvantien enthalten, um deren Wirksamkeit zu erhöhen. Immunogene Zusammensetzungen und Impfstoffe können parenteral, durch eine subkutane, intravenöse, intradermale oder intramuskuläre Injektion, möglicherweise nach einer Vorbehandlung der Injektionsstelle mit einem Lokal-Anästhetikum verabreicht werden. Alternativ können die gemäß der vorliegenden Erfindung gebildeten immunogenen Zusammensetzungen in einer Art und Weise formuliert und zugeführt werden, um eine Immunantwort an Schleimhautoberflächen hervorzurufen. Dementsprechend kann die immunogene Zusammensetzung an Schleimhautoberflächen über zum Beispiel die nasalen oder oralen (intragastrische) Wege verabreicht werden. Alternativ können andere Arten der Verabreichung einschließlich Zäpfchen und orale Formulierungen wünschenswert sein. Für Zäpfchen können Bindemittel und Träger, zum Beispiel Polyalkalen-Glycole oder Triglyceride einschließen. Orale Formulierungen können normalerweise verwendete Inzipientien, wie zum Beispiel pharmazeutische Grade von Saccharin, Cellulose und Magnesiumcarbonat einschließen.
Die immunogenen Präparationen und Impfstoffe werden in einer Weise verabreicht, die mit der Dosierungs-Formulierung kompatibel ist, und in einer solchen Menge, wie sie therapeutisch wirksam, schützend und immunogen sein wird. Die zu verabreichende Menge hängt von der zu behandelnden Person ab, was zum Beispiel die Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, das RSV-F-Protein und die Antikörper dazu zu synthetisieren, und wenn nötig, eine Zell-vermittelte Immunantwort zu erzeugen, einschließt. Die genauen Mengen an aktivem Inhaltsstoff, die zur Verabreichung erforderlich sind, hängen vom Urteil des praktischen Arztes ab. Jedoch sind geeignete Dosierungsbereiche einfach durch einen Fachmann im Fachbereich bestimmbar und können von der Größenordnung von etwa 1 μg bis etwa 10 mg der RSV-F-RNA betragen. Geeignete Regime für eine initiale Verabreichung und Booster-Dosen sind ebenfalls variabel, können aber eine initiale Verabreichung, gefolgt von nachfolgenden Verabreichungen einschließen. Die Dosierung kann auch vom Weg der Verabreichung abhängen und wird entsprechend der Größe des Wirts variieren. Ein Impfstoff, der nur gegen ein Pathogen schützt, ist ein monovalenter Impfstoff. Impfstoffe, die antigenes Material von mehreren Pathogenen enthalten, sind kombinierte Impfstoffe und gehören ebenfalls zur vorliegenden Erfindung. Solche kombinierten Impfstoffe enthalten zum Beispiel Material aus verschiedenen Pathogenen oder aus verschiedenen Stämmen des gleichen Pathogens oder aus Kombinationen von verschiedenen Pathogenen.
Die Immunogenität kann maßgeblich verbessert werden, wenn die Vektoren mit Adjuvantien zusammen verabreicht werden, die im Allgemeinen als eine 0,05 bis 0,1-prozentige Lösung in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung eingesetzt werden. Adjuvantien erhöhen die Immunogenität eines Antigens, sind aber nicht notwendigerweise selbst immunogen. Adjuvantien können wirken, indem sie das Antigen örtlich nahe an der Stelle der Verabreichung halten, um einen Depot-Effekt zu erzeugen, der eine langsame, anhaltende Freisetzung des Antigens an die Zellen des Immunsystems ermöglicht. Adjuvan tien können auch Zellen des Immunsystems zu einem Antigen-Depot hin ziehen und solche Zellen dazu stimulieren Immunantworten hervorzurufen.
Immunstimulatorische Mittel oder Adjuvantien sind seit vielen Jahren angewandt worden, um die Immunantworten des Wirts auf zum Beispiel Impfstoffe zu verbessern. Demnach wurden Adjuvantien identifiziert, welche die Immunantwort gegen Antigene verstärken. Einige dieser Adjuvantien sind jedoch toxisch und können unerwünschte Nebenwirkungen verursachen, was sie für eine Anwendung bei Menschen und vielen Tieren ungeeignet macht. In der Tat werden nur Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (zusammengefasst im Allgemeinen als Alaun bezeichnet) routinemäßig als Adjuvantien bei menschlichen und tierischen Impfstoffen eingesetzt.
Ein weiter Bereich von extrinsischen Adjuvantien und anderem immunmodulierendem Material kann starke Immunantworten gegen Antigene hervorrufen. Diese schließen Saponine, die an Membranprotein-Antigene komplexiert sind, um immunstimulierende Komplexe (ISCOMS) zu erzeugen, plutonische Polymere mit Mineralöl, abgetötete Mycobakterien in Mineralöl, Freund's komplettes Adjuvans, bakterielle Produkte, wie Muramyl-Dipeptid (MDP) und Lipopolysaccharid (LPS), sowie Monophoryl-Lipid A, QS 21 und Polyphosphazen ein.
In besonderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann das RNA-Transkript, das eine erste Nukleotid-Sequenz umfasst, die ein F-Proteins von RSV codiert, in Verbindung mit einem Targeting-Molekül abgegeben werden, um den Vektor zu ausgewählten Zellen, was Zellen des Immunsystems einschließt, zielzusteuern.
Das RNA-Transkript kann an den Wirt durch eine Vielzahl von Vorgehensweisen zugeführt werden, zum Beispiel offenbarten Tang et al. (Ref. 39), dass eine Einführung von Gold-Mikroprojektilen, beschichtet mit DNA, die Rinderwachstumshormon (BGH) codiert, in die Haut von Mäusen eine Erzeugung von anti-BGH-Antikörpern bei den Mäusen zur Folge hatte, während Furth et al. (Ref. 40) zeigten, dass ein Düsen-Injektor dazu verwendet werden konnte, Haut-, Muskel-, Fett- und Brustgewebe von lebenden Tieren zu transfizieren.
Biologische Hinterlegungen
Bestimmte Vektoren, welche das Gen enthalten, welches das RSV-F-Protein codiert und auf die hierin Bezug genommen wird, sind bei der amerikanischen Kultur-Typ-Sammlung (ATCC = American Type Culture Collection), welche sich in 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA, befindet, in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag und vor dem Einreichen dieser Anmeldung hinterlegt worden.
Proben der hinterlegten Plasmide werden für die Öffentlichkeit nach der Erteilung eines Patents, das auf dieser Patentanmeldung der Vereinigten Staaten basiert, erhältlich werden, und alle Beschränkungen auf den Zugang zu den Hinterlegungen werden zu jener Zeit entfernt werden. Nicht lebensfähige Hinterlegungen werden in dem Fall, dass die ATCC nicht in der Lage ist, dieselben auszugeben, ersetzt werden. Die hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung soll im Umfang durch Plasmide, die hinterlegt sind, nicht eingeschränkt werden, da die hinterlegte Ausführungsform nur als eine Veranschaulichung der Erfindung gedacht ist. Beliebige äquivalente oder ähnliche Plasmide, die ähnliche oder äquivalente Antigene, wie sie in dieser Anmeldung beschrieben sind, codieren, liegen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Hinterlegungs-Zusammenfassung

Plasmid ATCC-Bezeichnung Datum der Hinterlegung

pMP37 97905 27. Feb., 1997
BEISPIELE
Die obige Offenlegung beschreibt die vorliegende Erfindung im Allgemeinen. Ein vollständigeres Verständnis kann durch die Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele werden einzig und allein für Zwecke der Veranschaulichung beschrieben und sind nicht dazu gedacht, den Umfang der Erfindung einzuschränken. Änderungen in der Form und Substitution von Äquivalenten werden eingehend betrachtet, wie es die Umstände nahe legen oder zweckdienlich machen können. Obwohl hierin bestimmte Begriffe verwendet wurden, sind solche Begriffe in einem beschreibenden Sinn und nicht zu Einschränkungszwecken gedacht.
Verfahren der molekularen Genetik, der Protein-Biochemie und der Immunologie, die in dieser Offenlegung und diesen Beispielen verwendet, aber nicht explizit beschrieben werden, sind umfänglich in der wissenschaftlichen Literatur berichtet und liegen gut in der Befähigung von Fachleuten im Fachbereich.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Semliki Forest Virus(SFV)-Expressionsvektors, der eine trunkierte Variante des RSV-F-Gens enthält.
Eine trunkierte Variante des RSV-F-Gens wurde in den SFV-Expressionsvektor pSFV1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) gemäß den Schritten, die in 1 dargestellt sind, eingefügt. Das RSV-F-Gen wurde ursprünglich aus einem klinischen RSV-Isolat vom Subtyp A in das Plasmid pRSV-F kloniert, wie es vollständig in der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung der Vereinigten Staaten Nr. 08/001 554 , eingereicht am 6. Januar 1993, beschrieben ist, welche an den Rechtsnachfolger hiervon übertragen ist und deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme (Ref. 41 und WO 93/14207 ) einbezogen ist. Ein Fragment des RSV-F-Gens wurde aus dem Plasmid RSV-F aus geschnitten, indem das Plasmid mit BspHI und EcoRI verdaut wurde. Das Restriktionsenzym BspHI schneidet innerhalb des Genbereichs, der das RSV-F codiert, wobei es 48 Aminosäuren vom C-Terminus des F-Proteins entfernt. Diese Aminosäuren bilden den größten Teil der Transmembran-Domäne und den gesamten cytoplasmatischen Schwanz. Das resultierende 1,6 kb große trunkierte RSV-F-Gen-Fragment wurde in die EcoRI-BamHI-Stellen des auf einem Bluescript basierten Säugerzell-Expressionsvektors pMCR20 (Stratagene, La Jolla, CA) in einer 3 Weg-Ligation mit einem Linker, der auf der folgenden Sequenz basierte, kloniert:
5' CATGACTTGATAATGAG 3' (SEQ ID NR.: 3)
3' TGAACTATTACTCCTAG5' (SEQ ID NR.: 4)
um Plasmid pES13A zu erzeugen, wie es in der oben erwähnten USAN 08/001 554 ( WO 93/14207 ) beschrieben ist. Dieser Linker fügt ein nicht in der Matrize codiertes Threonin zum C-Terminus des trunkierten RSV-F-Proteins hinzu und fügt drei aufeinander folgende Stop-Codons am Ende des trunkierten Gens ein.
Das 1,6 kb große trunkierte RSV-F-Genfragment wurde dann aus dem Plasmid pES13A durch einen Verdau mit EcoRI und BamHI ausgeschnitten. In einer weiteren 3 Weg-Ligation wurde das 1,6 kb große EcoRI-BamHI RSV-F-Genfragment in die BamHI-Stelle des SFV-Expressionsvektors pSFV1 mit einem weiteren Linker kloniert, welcher auf der folgenden Sequenz basierte:
5' GATCCGCGCGCGCG 3' (SEQ ID NR.: 5)
3' GCGCGCGCGCTTAA 5' (SEQ ID NR.: 6)
um Plasmid pMP35 zu erzeugen. Dieses Plasmid enthielt zwei Kopien des 1,6 kb großen BamHI RSV-F-Genfragments. Zu diesem Zeitpunkt wurde festgestellt, dass es eine SpeI-Stelle gab, welche sich im RSV-F-Genfragment 193 bp von der stromaufwärts gelegenen BamHI-Stelle befand. Es ist notwendig, ein pSFV1-basiertes Plasmid mit SpeI vor seiner Verwendung in der unten beschriebenen in vitro-Transkriptionsreaktion zu linearisieren. Daher musste die SpeI-Stelle im RSV-F-Gen entfernt werden, und dies wurde in der folgenden Art und Weise bewerkstelligt.
Das 1,6 kb große trunkierte RSV-F-Genfragment wurde aus Plasmid pMP35 durch Verdauen mit BamHI ausgeschnitten und in die BamHI-Stelle von pUC19 ligiert, um das Plasmid pMP36 zu erzeugen. Der Transformer^TM-Kit für ortsgerichtete Mutagenese (Clonetech, Palo Alto, CA, USA) und ein Primer, 5'-TGGTTGGTATACCAGTGTTATAACT (SEQ ID No: 7) wurden verwendet, gemäß den Anweisungen des Herstellers, um Nukleotid 194 von einem T zu einem C zu ändern. Dieser Austausch eliminiert die SpeI-Stelle im RSV-F-Gen, ohne die Aminosäuresequenz des codierten RSV-F-Proteins zu beeinflussen. Die Sequenz von Plasmid pMP36A, welche das veränderte RSV-F-Gen enthält, wurde durch eine DNA-Sequenzanalyse bestimmt. Das 1,6 kb große trunkierte RSV-F-Genfragment wurde aus Plasmid pMP36A durch Verdauen mit BamHI ausgeschnitten und in die BamHI-Stelle von pSFV1 ligiert, um das Plasmid pMP37 zu erzeugen (ATCC 97905). Die korrekte Orientierung des trunkierten RSV-F-Gens wurde durch eine Restriktionskartierung und eine DNA-Sequenzanalyse bestätigt. 2 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR.: 1) des BamHI-Fragments des trunkierten RSV-F-Gens, bei dem die SpeI-Stelle eliminiert wurde und die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR.: 2) des sekretierten RSV-F-Proteins, welches dadurch codiert ist.
Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Plasmid-DNA Mide Kits von Qiagen (Chatsworth, CA, USA), gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von SpeI-linearisiertem pMP37, das für die Erzeugung von SFV-RSVF-RNA bei in vitro-Transkriptionsreaktionen und der Herstellung von SFV-RSVF-RNA notwendig ist.
20 μg von Plasmid pMP37, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, wurden mit SpeI in einer 100 μl-Reaktion geschnitten, die 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgCl₂, 50 mM KCl und 30 Einheiten SpeI (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) enthielt.
SFV-RNA wurde aus dem linearisierten Plasmid in einer 300 μl-in vitro-Transkriptionsreaktion unter Verwendung der folgenden Materialien erzeugt:
40 mM Tris-HCl (pH 7.9)
6 mM MgCl₂
2 mM Spermidin-(HCl)₃
1 mM DTT (Dithiothreonol)
1 mM ATP (Adenosintriphosphat)
1 mM GTP (Guanosintriphosphat)
1 mM CTP (Cytidintriphosphat)
1 mM UTP (Uridintriphosphat)
1 mM m⁷G(5')ppp(5')G RNA-Cap-Analogon (New England Biolabs, Mississauga, Oft., Kanada)
360 Einheiten RNasin^® Enzyminhibitor (Promega, Madison, WI, USA)
270 Einheiten SP6-RNA-Polymerase (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)
Die Reaktion wurde bei 37°C 50 Minuten lang inkubiert. Die so hergestellte SFV-RSVF-RNA wurde vom Salz, den Enzymen, nicht eingebauten NTPs und Cap-Analogon gereinigt, indem die Reaktionsmischung durch CHROMA SPIN^TM-200 DEPC-H₂O-Säulen (Clonetech, Palo Alto, CA, USA) (75 μl/Säule) entsprechend den Anweisungen des Herstellers laufen gelassen wurde. Die gereinigte RNA wurde dann mit Ethanol präzipitiert und in mit DEPC behandeltem H₂O auf eine Endkonzentration von 1 μg/μl resuspendiert. Die gereinigte RNA wurde mit einem gleichen Volumen von 2 × PBS kurz vor der Immunisierung gemischt.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Immunisierung von Mäusen mit SFV-RSVF-RNA und die Ergebnisse hinsichtlich der Immunogenität, die erhalten wurden.
Es wurde früher gezeigt, dass Mäuse für eine Infektion mit RSV anfällig sind (Ref. 42) und ein relevantes Tiermodell sind. Die Mäuse wurden mit der SFV-RSVF-RNA, die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurde, auf dem intramuskulären (i. m.) Weg immunisiert. Den vorderen Schienbeinmuskeln von fünf BALB/c-Mäusen (weiblich, 6 bis 8 Wochen alt) (Jackson Lab., Bar Harbour, ME, USA) wurden beidseitig 2 × 25 μg (0,5 μg/μl) der PBS-gerichteten SFV-RSVF-RNA injiziert. Fünf Tage vor der RNA-Immunisierung wurden die Muskeln mit 2 × 50 μl Cardiotoxin (10 μM in PBS) (Latoxan, Frankreich) behandelt. Es wurde früher gezeigt, dass eine Behandlung der Muskeln mit Cardiotoxin die Aufnahme von DNA erhöht und die Immunantwort verstärkt (Ref. 43). Diese Mäuse wurden auf eine identische Art und Weise 4 Wochen später geboostert (Tabelle 1 unten). Die Kontrollgruppen wurden mit (1) SFV-RNA, die β-Galactosidase (SFV-LacZ-RNA) exprimiert, (2) SFV-RSVF-RNA, wie hierin hergestellt; (3) lebenden RSV, (4) PBS mit Alaun und einer RSV-Untereinheits-Präparation mit Alaun immunisiert. Diese Mäuse wurden ebenfalls auf eine identische Art 4 Wochen später geboostert (Tabelle 1). Die RSV-Untereinheits-Präparation, die RSV-F, -G und -M-Proteine umfasst, wird in der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung der Vereinigten Staaten Nr. 08/679 060 , eingereicht am 12. Juli 1996, beschrieben, die dem Rechtsnachfolger hiervon übertragen wurde und deren Offenlegung hierin durch Bezugnahme ( WO 98/02457 ) einbezogen ist.
Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden die Mäuse intranasal mit 10⁶ Plaque-bildendenden Einheiten (pfu) des A2-Stamms von RSV (BG-4A) belastet. Die Tiere wurden 4 Tage später getötet. Die Lungen wurden aseptisch entfernt, gewogen und in 2 ml von komplettem Kulturmedium homogenisiert. Der Virus-Titer in den Lungen-Homogenisaten wurde unter Ver wendung von Vero-Zellen, wie früher beschrieben (Ref. 44), in Duplikaten bestimmt.
Seren wurden aus den Mäusen nach 4 und 6 Wochen gewonnen. Die Anti-RSV-F-Antikörpertiter (IgG, IgG1 und IgG2a) wurden in diesen Seren durch einen Enzym-gekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA) wie in Beispiel 4 beschrieben, bestimmt. Die Titer der RSV-spezifischen Plaque-Reduzierung dieser Seren wurden wie früher beschrieben (Ref. 44) bestimmt.
Die anti-RSV-F-Antikörper-Antworten bei den Seren der BALB/c Mäuse, die wie in Tabelle 1 dargestellt immunisiert wurden, sind in 3 zusammengefasst. Die Tiere, die mit SFV-RSVF-RNA, lebenden RSV oder einer RSV-Untereinheits-Präparation + Alaun immunisiert wurden, wiesen alle hohe Antikörpertiter von Gesamt-anti-RSV-F-IgG in ihrem Serum bei sowohl 4 als auch 6 Wochen auf (3, Tafel A). Jedoch waren die Verhältnisse IgG1/IgG2a merklich unterschiedlich, wie man aus 3, Tafeln B und C sieht. Die Seren aus Tieren, die mit lebenden RSV immunisiert wurden, wiesen ein Verhältnis von anti-F IgG1/IgG2a von etwa 0,69 nach 6 Wochen auf. Dieser Wert steht in Kontrast zu dem Verhältnis von anti-RSV-F IgG1/IgG2a, das bei Mäusen nach 6 Wochen erhalten wurde, welche mit der mit Alaun ergänzten RSV-Untereinheits-Präparation geprimt und geboostert wurden. In diesem Fall war das anti-RSV IgG1/IgG2a-Verhältnis etwa 4,3. Die anti-RSV-F IgG1/IgG2a-Verhältnisse, die bei Mäusen erhalten wurden, die mit SFV-RSVF-RNA immunisiert wurden, betrugen nach 6 Wochen 0,79. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Immunisierung von Mäusen mit der SFV-RSVF-RNA mehr in einer Antwort vom Th-1-Typ resultiert, die zu jener ähnlich ist, die mit einem lebenden RS-Virus erhalten wird, statt der Antwort vom Th-2-Typ, die bei der mit Alaun unterstützten RSV-Untereinheits-Präparation beobachtet wird.
Wie in 4 gezeigt, wiesen die Seren von Mäusen, die mit den verschiedenen RSV-Präparationen, wie in Tabelle 1 dargestellt, geprimt und geboostert wurden, alle signifikante Spiegel von RSV-spezifischen neutralisierenden Antikörpern auf (Gruppen 2, 3 und 5). Im Gegensatz zu den Placebo-Kontrolltieren (Gruppen 1 und 4) waren die unteren Atemwege von Mäusen, die mit SFV-RSVF-RNA, lebenden RSV oder der mit Alaun ergänzten RSV-Untereinheits-Präparation immunisiert wurden, vollständig gegen eine Belastung mit lebendem RS-Virus, wie in Tabelle 2 gesehen, geschützt.
Eine Immunisierung von Mäusen mit der SFV-RSVF-RNA schützte Mäuse gegen eine Belastung mit lebenden RSV. Das Schutzvermögen dieses SFV-Replikons war zu jenem vergleichbar, das durch eine Impfung mit lebenden RSV oder mit Alaun adjuvantierten RSV-Untereinheiten induziert wurde. Der Typ der generierten Immunantwort schien mehr von einer Th-1-artigen Antwort zu sein, ähnlich zu jener, die durch lebende RSV ausgelöst wird.
Beispiel 4
Dieses Beispiel beschreibt die Bestimmung der anti-RSV-F-Antikörpertiter.
Mulden von Nunc-MaxiSorb-Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 2,5 ng immunaffinitätsgereinigtem RSV-F-Protein, verdünnt in 0,05 M Carbonat-Bicarbonat-Puffer, pH-Wert 9,6, beschichtet. Die Mulden wurden gegen eine nicht-spezifische Bindung durch Hinzufügen von 0,1 % BSA in PBS während 30 min bei Raumtemperatur geblockt, gefolgt von zweimaligem Waschen in einem Waschpuffer von 0,1 % BSA in PBS + 0,1 % Tween 20. Serielle Zwei- oder Vierfach-Verdünnungen von Maus-Serum wurden zu den Mulden hinzugegeben. Nach einer Inkubation von einer Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten fünfmal mit Waschpuffer gewaschen, und mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiertes Konjugat wurde in der geeigneten optimalen Verdünnung in Waschpuffer hinzugefügt. Der Gesamt-IgG-Assay verwendete F(ab')₂ Ziege-anti-Maus-IgG (H + L spezifisch)-HRP von Jackson Immuno Research Laboratory Inc. (Baltimore, MD, USA). Schaf-anti-Maus-IgG1-HRP von Serotec (Toronto, Ontario, Kanada) wurde bei dem IgG1-Assay verwendet, und Ziege-anti-Maus-IgG2a von Caltag Laboratories (San Francisco, CA, USA) wurde bei dem IgG2a-Assay verwendet. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten fünfmal mit Waschpuffer gewaschen, und Wasserstoffperoxid (Substrat) wurde in Gegenwart von Tetramethylbenzidin hinzugefügt. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 2 M Schwefelsäure gestoppt. Die Farbe wurde in einem Multiscan Titertek Plattenlesegerät bei einer optischen Dichte (CD) von 450 nm ausgelesen. Der Titer wurde als der reziproke Wert der letzten Verdünnung genommen, bei der die CD etwa doppelt so hoch war. Diese CD muss größer sein als die negative Kontrolle des Assays bei der Ausgangsverdünnung. Das PrÄ-Immun-Serum von jedem Tier wurde als die Negativkontrolle verwendet.
ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENBARUNG

In Zusammenfassung dieser Offenbarung werden dabei neue Vektoren bereit gestellt, die DNA-Sequenzen enthalten, welche ein RSV-F-Protein codieren, das linearisiert und zu RNA transkribiert werden kann für eine in vivo-Verabreichung, um eine schützende Immunantwort gegen eine Krankheit zu generieren, die durch eine Infektion durch das respiratorische Synzytialvirus verursacht wird. Tabelle 1. Immunisierungsprotokoll

GRUPPE	PRIMEN	WEG DER IMPFUNG	BOOSTERN	WEG DER IMPFUNG
1	SFV-LacZ RNA¹	Intramuskulär	SFV-LacZ RNA¹	intramuskulär
2	SFV-RSVF RNA¹	Intramuskulär	SFV-RSVF RNA¹	Intramuskulär
3	Lebende RSV²	Intranasal	Lebende RSV²	Intranasal
4	PBS + Alaun	Intramuskulär	PBS + Alaun	Intramuskulär
5	RSV-Untereinheiten + Alaun³	Intramuskulär	RSV-Untereinheiten + Alaun³	Intramuskulär

Mäuse wurden geimpft mit:

1 25 μg RNA wurde in jeden hinteren Beinmuskel in 50 μl PBS injiziert
2 2,5 × 10⁵ pfu von an Mäuse adaptiertem A2-Virus
3 1 μg des RSV-Untereinheits-Impfstoffs adsorbiert an Alaun (1,5 mg/Dosis)

Tabelle 2

GRUPPE	Antigenformulierung		Mittlerer Virustiter der Lunge (log₁₀/g ± SD)	% Schutz
GRUPPE	Primen	Bonstern
1	SFV-LacZ RNA	SFV-LacZ RNA	4,18 ± 0,06	0
2	SFV-RSVF RNA	SFV-RSVF RNA	≤ 1,83 ± 0	100
3	Lebende RSV	Lebende RSV	≤ 1,83 ± 0	100
4	PBS + Alaun	PBS + Alaun	4,17 ± 0,17	0
5	RSV-Untereinheiten + Alaun	RSV-Untereinheiten + Alaun	≤ 1,83 ± 0	100

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SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Ein Vektor, umfassend: eine erste DNA-Sequenz, welche das Komplementäre zu den vollständigen SFV-RNA-Genom-Replikationsbereichen ist, eine zweite DNA-Sequenz, welche ein respiratorisches Synzytialvirus(RSV)-Fusionsglycoprotein F, welchem der Transmembrananker und der cytoplasmatische Schwanz fehlen, codiert, wobei die zweite DNA-Sequenz in einen Bereich der ersten DNA-Sequenz eingefügt ist, der für dessen Replikation nicht essentiell ist, wobei die erste und zweite DNA-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle eines Promoters stehen.
Der Vektor, der in Anspruch 1 beansprucht wird, wobei der zweiten DNA-Sequenz, welche das RSV-F-Protein codiert, eine Spe I-Restriktionsstelle fehlt.
Der Vektor, der in Anspruch 2 beansprucht wird, wobei das Nukleotid 194 (T) des RSV-F-Gens zu einem C mutiert ist, um die Spe I-Stelle in dem RSV-F-Gen zu eliminieren.
Der Vektor, der in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht wird, wobei der Promoter der SP6-Promoter ist.
Der Vektor, der in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht wird, welcher ein Plasmidvektor ist, der eine einmalige Restriktionsstelle, vorzugsweise eine Spe I-Stelle, aufweist, welche die Linearisierung des Vektors erlaubt, ohne die zweite DNA-Sequenz zu spalten.
Der Vektor, der in Anspruch 5 beansprucht wird, wobei die Spe I-Stelle aus dem Plasmid pSFV1 stammt.
Der Vektor, der in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht wird, in einer linearisierten Form.
Der Vektor, der in Anspruch 1 beansprucht wird, welcher das Plasmid pMP37 (ATCC 97905) ist.
Ein lineares RNA-Transkript des Vektors, der in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht wird.
Das RNA-Transkript, das in Anspruch 9 beansprucht wird, welches durch Linearisierung eines Plasmidvektors, der in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht wird, an einer einmaligen Restriktionsstelle, vorzugsweise einer Spe I-Stelle, welche in dem Vektor bereit gestellt wird und eine Linearisierung des Vektors erlaubt, ohne die zweite DNA-Sequenz zu spalten, und Transkribieren des linearisierten Vektors gewonnen wird.
Eine immunogene Zusammensetzung zur in vivo-Verabreichung an einen Wirt zur Erzeugung von Antikörpern, vorzugsweise schützenden Antikörpern, gegen das RSV-F-Protein in dem Wirt, welche als ihren aktiven Bestandteil ein RNA-Transkript, wie es in Anspruch 9 oder 10 beansprucht wird, umfasst.
Ein lineares RNA-Transkript, wie es in Anspruch 9 oder 10 beansprucht wird, wenn dieses als Immunogen verwendet wird.
Die Verwendung eines linearen RNA-Transkripts, wie es in Anspruch 9 oder 10 beansprucht wird, bei der Herstellung eines Immunogens.
Ein Verfahren zur Erzeugung eines Impfstoffes zum Schutz eines Wirts vor einer Krankheit, welche durch die Infektion mit dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV) verursacht wird, welches umfasst: Isolieren einer ersten DNA-Sequenz, welche ein RSV-F-Protein, in welchem der Transmembrananker und der cytoplasmatische Schwanz fehlen, codiert und welcher jegliche Spe I-Restriktionsstelle fehlt, funktionsfähiges Verknüpfen der ersten DNA-Sequenz mit einer zweiten DNA-Sequenz, welche zu wenigstens einem Teil des Semliki Forest Virus(SFV)-RNA-Genoms komplementär ist und welche die vollständigen SFV-Genom-Replikationsbereiche aufweist und welche die SFV-Sequenz ist, die in dem Plasmid pSFV1 enthalten ist, in einem Bereich der zweiten DNA-Sequenz, der für die Replikation nicht essentiell ist, um einen Plasmidvektor zu bilden, in welchem die erste und zweite DNA-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle eines Promoters stehen, Linearisieren des Plasmidvektors, während die erste und zweite DNA-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle des Promoters gehalten werden, Bilden eines RNA-Transkripts des linearisierten Vektors und Formulieren des RNA-Transkripts als einen Impfstoff zur in vivo-Verabreichung.
Das Verfahren, das in Anspruch 14 beansprucht wird, wobei das Linearisieren des Plasmidvektors bewirkt wird, indem der Plasmidvektor an einer darin einmaligen Restriktionsstelle, vorzugsweise einer Spe I-Stelle, an einem Ort, welcher die Beibehaltung des Gens und der DNA-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle des Promoters erlaubt, gespalten wird.
Das Verfahren, das in Anspruch 14 oder 15 beansprucht wird, wobei der Vektor das Plasmid pMP37 (ATCC 97905) ist und durch Spaltung an der Spe I-Stelle linearisiert wird.