JP2001514857A

JP2001514857A - Ｒｎａ呼吸合包体ウイルスワクチン

Info

Publication number: JP2001514857A
Application number: JP2000508816A
Authority: JP
Inventors: マークパリントン、
Original assignee: コノートラボラトリーズリミテッド
Priority date: 1997-09-04
Filing date: 1998-09-03
Publication date: 2001-09-18
Also published as: US6060308A; US6428324B1; AU9056998A; CA2301891C; AU742046B2; WO1999011808A1; BR9815642B1; EP1009846B1; DE69837708D1; BR9815642A; DE69837708T2; CA2301891A1; EP1009846A1; ATE361368T1

Abstract

(57)【要約】少なくともアルファウイルスのＲＮＡゲノムの一部を補い、完全なアルファウイルスのＤＮＡゲノム複製領域の補体を有する第一のＤＮＡ配列と、パラミクソウイルス蛋白、特に呼吸合包体ウイルス融合（ＲＳＶＦ）蛋白またはＲＳＶＦ蛋白と特異的に反応する抗体を生成するＲＳＶＦ蛋白フラグメントをコードした第二のＤＮＡ配列とからなり、第一および第二のＤＮＡ配列がプロもターの複写制御のもとにあるベクターを記載する。当該ベクターは、宿主に投与することによってパラミクソウイルス、特に呼吸合包ウイルスに起因する疾病から宿主を保護するために、ヒトを含む宿主に免疫を誘導するために使用することのできるＲＮＡトランスクリプトの製造に使用することができる。ＲＮＡトランスクリプトは、プラスミドベクター上の特異的な制限部位の解裂についで、線形分子を転写し、ベクターを線形とすることによって形成させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

（発明の技術分野）本発明は、パラミクソイルス科ワクチン、特に呼吸合包体ウイルス（ＲＳＶ）
の融合（Ｆ）蛋白をコードしたＲＮＡからなるワクチンの分野に関する。（発明の背景）ヒト呼吸合包体ウイルス（ＲＳＶ）は、乳幼児、幼児および施設入居老人にお
ける重度な気道感染の主要病原体であるとされている（参考文献１，２，３，４
−本特許出願では本発明に関係する技術水準を十分に記載するため、参考文献を
括弧内に引用する。引用した文献の詳細は詳細な説明と請求項の間に記載する。
これら引用文献で開示されている技術内容は、参考例として本発明の開示と比較
する）。世界的な死亡率および罹患率は、有効なＲＳＶワクチンが早急に必要で
あることを示している（参考文献５，６）。米国だけでも、年間約１００，００
０人の幼児がＲＳＶ感染による重度の肺炎および細気管支炎で入院している。Ｒ
ＳＶ感染幼児の入院および通院医療費は、米国で毎年３億４千万ドル以上である
と推定されている。世界保健機構（ＷＨＯ）および米国国立アレルギー・伝染病
研究所（ＮＩＡＩＤ）のワクチン諮問委員会は、ワクチンの開発が必要な疾病と
してＲＳＶをＨＩＶについで二番目に指定している。年間罹患率および死亡率な
らびにＲＳＶ感染管理の莫大な健康管理経費は、有効なＲＳＶワクチンの開発を
積極的に進める上で刺激になっている。しかし、ワクチンは依然として得られて
いない。

【０００１】ホルマリン不活性化（ＦＩ−ＲＳＶ）および弱毒化ＲＳＶワクチンは、臨床試
験で有効性が認められていない（参考文献７，８，９，１０）。さらに、ホルマ
リン不活性化ＲＳＶワクチンは、野生型のＲＳＶに暴露した一部の幼児で疾病を
促進する（参考文献７，８，９，１０）。ＲＳＶ発病の相乗作用にかかわる作用
機構の解明は、特に血清学的に陰性の患者を対象とした安全なＲＳＶワクチンの
設計に有用である。最近の実験データから、細胞介在反応の平衡失調が免疫増強
に関与していると考えられている。ＦＩ−ＲＳＶを免疫投与し、ウイルスを抗原
投与したマウスで認められた病理組織学的変化の進行は、ＣＤ４＋細胞またはイ
ンターロイキン−４（ＩＬ−４）およびＩＬ−１０の枯渇によって消失する。

【０００２】当該ウイルスの主要免疫原蛋白の一つは、ＲＳＶ融合（Ｆ）糖蛋白である。こ
の外被糖蛋白は、ウイルスと宿主細胞膜の癒合およびウイルスの細胞から細胞へ
の広がりを仲介する（参考文献１）。Ｆ蛋白は、前駆体（Ｆ₀）分子として合成し、それを蛋白加水分解によって解裂し、Ｎ−末端Ｆ₂とＣ−末端Ｆ₁部分からな
るジスルフイッド結合ダイマーを形成させる（参考文献１１）。Ｆ蛋白のアミノ
酸配列は、ＲＳＶサブグループＡとＢの間で高度に保全されており、干渉効果を
有する抗原である（参考文献６，１２）。バキュロウイルス表現系では、ＲＳＶ
蛋白のトランケート分泌型が昆虫のＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの細胞に表
現されている（参考文献１３）。この遺伝子組み換え蛋白は、コットンラットで
保護効果を有することが実証されている（参考文献１３）。

【０００３】パラインフルエンザウイルス感染に対して有効な生ウイルスワクチンおよび糖
蛋白サブユニットワクチンの開発が行われている。ホルマリン不活性化ＰＩＶ１
，２，３型ワクチンを用いた臨床試験で、このワクチンの効果は認められていな
い（参考文献１４，１５，１６）。ホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンを用いた
臨床試験で当該ワクチンはＲＳＶ感染に対して効果がないのみならず、ワクチン
の接種を受けた者の多くが後にＲＳＶに感染するとさらに重度の発症を示すこと
が確認されて以来化学的に不活性化したワクチンの開発は中止された。パライン
フルエンザワクチン研究の殆どはＰＩＶ−３ワクチンを中心に行われており（参
考文献１７）、ＰＩＶ−１およびＰＩＶ−２に関する研究報告はきわめて少ない
。ＰＩＶ−３ワクチンに対する最近のアプローチとして、近縁のウシパラインフ
ルエンザウイルス３型およびウイルスの低温適応によって弱毒化したウイルスの
使用が試みられている（参考文献１８，１９，２０，２１）。

【０００４】パラインフルエンザウイルス３型ワクチン開発の別のアプローチとして、表面
糖蛋白血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ）蛋白に注目した
サブユニットアプローチが行われている（参考文献２２，２３，２４）。典型的
なＩＩ型糖蛋白であるＨＮ抗原は血球凝集およびノイラミニダーゼ活性を有し、
宿主細胞受容体に含まれるシアル酸に対するウイルスの結合に関与する。Ｉ型Ｆ
糖蛋白はウイルス外被と細胞膜の融合ならびにウイルスの細胞から細胞への広が
りを仲介する。最近になって、膜融合にはＮＨおよびＦ糖蛋白を要求することが
実証されている。Ｆ糖蛋白は不活性前駆体（Ｆ）として合成し、それを蛋白加水
分解によってジスルフイッド結合Ｆ２およびＦ１部分に解裂する。ＰＩＶ−１、
−２および−３のＨＮおよびＦ蛋白は構造的に相似であるが、抗原としては識別
される。ＰＩＶのいずれかの型のＨＮおよびＦ蛋白に対する抗体を中和すると、
干渉効果がなくなる。したがって、有効なＰＩＶサブユニットワクチンは、パラ
インフルエンザウイルスの３種類の型からのＨＮおよびＦ糖蛋白を含む必要があ
る。いずれかの糖蛋白に対する抗体をｉｎｖｉｔｒｏで中和する。中和抗体力価と乳幼児におけるＰＩＶ−３感染抵抗性の間に、直接的な相関が認められてい
る。パラインフルエンザウイルス３型の未変性サブユニットワクチンを用い、２
種類の表面糖蛋白保護作用が試験されている。典型的に、非イオン性界面活性剤
でウイルスから糖蛋白を抽出し、レクチンアフィニティーまたは免疫アフィニテ
ィークロマトグラフ法でさらに精製する。しかし、これらの方法は、あらゆる状
況下で、ワクチンの大量生産には適切ではない。小型動物モデル（ハムスターお
よびコットンラット）では、糖蛋白の免疫投与によって生ＰＩＶ−３感染の防止
が実証されている（参考文献２５，２６，２７，２８，２９）。ＰＩＶ−３のＨ
ＮおよびＦ糖蛋白の製造は、ＤＮＡ組み換え技術によっても行われている。バキ
ュロウイルス表現系、およびワクシニアウイルスおよびアデノウイルス遺伝子組
み換え株を用い、昆虫の細胞でＨＮおよびＦ糖蛋白が生産されている（参考文献
３０，３１，３２，３３，３４）。バキュロウイルス表現系では、ＰＩＶ−３糖
蛋白の完全長およびトランケート型ならびにキメラＦ−ＨＮ融合蛋白が表現され
ている。遺伝子組み換え蛋白は、小型動物モデルで保護作用を有することが実証
されている（Ｗ０９１/００１０４、１９９１年１１月２９日出願、当出願人に譲渡された米国特許出願第０７/７７３，９４９号参照）。

【０００５】セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）は、トガウイルス科のアルファウイルス属
のウイルスである。成熟したウイルス粒子は、ｓｓＲＮＡゲノムの単一コピーを
含み、５′−末端にキャップ構造および３′−末端にポリアデニル酸が付加され
た陽性極性を有する。それはｍＲＮＡとしての機能を有し、細胞に導入すると裸
のＲＮＡが感染を開始する。感染が起こると、ゲノムの５′２/３がポリ蛋白に翻訳され、自己解裂によって４種類の非構造蛋白（ｎｓＰ１から４）にまで翻訳
が進行する。一旦ｎｓ蛋白が合成されると、正鎖（４２Ｓ）ゲノムの完全長負鎖
への複製に関与する（参考文献３５）。ついで、これらの負鎖は新しい正鎖（４
２Ｓ）ゲノムおよび２６ＳサブゲノムｍＲＮＡの合成のテンプレートとして作用
する（参考文献３５）。このサブゲノムｍＲＮＡはゲノムの最終１/３と共直線性であり、ＳＦＶ構造蛋白をコードしている。ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａ
ｒｏｆｆ（参考文献３６）は、１９９１年にＳＦＶｃＤＮＡ複製単位に基づい
て一連の表現ベクターを命名した。これらのアルファウイルスベクターはＷＯ９２/１０５７８にも記載されており、その開示内容を参考例としてここで比較する。これらのベクターは非相同的に挿入できるようにウイルスの構造蛋白遺伝
子が除去されているが、ｎｓＰ１〜４レプリカーゼ複合体を産生するための非構
造的コード領域は保存されている。ＲＮＡの複製に必要な短い５′および３′配
列要素も保存されている。３枠すべての翻訳停止部位の近くの２６Ｓプロモータ
ーの下流に、ポリリンカー部位を挿入した。ＳｐｅＩ部位は、ｉｎｖｉｔｒｏ転写反応に使用するプラスミドの直線化のために、ＳＦＶｃＤＮＡの３′末端
のすぐ後に挿入した。

【０００６】多くの試験で、非相同蛋白をコードしたＳＦＶＲＮＡを挿入すると外因性蛋
白の表現および抗体の誘導が認められている（参考文献３７，３８）。免疫投与
を目的とした外因性蛋白の表現にＳＦＶＲＮＡ接種を用いると、プラスミドＤ
ＮＡ免疫投与に関連したいくつかの利点がある。例えば、ウイルス抗原をコード
したＳＦＶＲＮＡは、ウイルスに対する抗体による中和によって活性を失うこ
となく、抗体の存在下でそのウイルスに導入することができる。また、蛋白はｉ
ｎｖｉｖｏで表現されるので、蛋白はウイルス自体によって表現される蛋白と同じ立体配置を有している。したがって、核酸免疫投与を用いると、蛋白の精製
の過程で起こり、免疫原性、防御エピトープの喪失および場合によっては免疫活
性化につながるおそれのある立体配置の変化を避けることができる。

【０００７】また、ＳＦＶＲＮＡ免疫投与は、プラスミドＤＮＡ免疫投与と比較していく
つかの利点がある。ＳＦＶは、現在知られている最も複写効率の高いウイルスの
一つである。数時間で、単一細胞内に最高２００，０００個の正ＲＮＡのコピー
ができる。これらのＳＦＶＲＮＡはこのように豊富であり、細胞リボソームほ
とんど全てがＳＦＶコード蛋白の合成に動員され、したがって宿主細胞の蛋白合
成を圧倒する（参考文献３６）。したがって、プラスミドＤＮＡ免疫投与と比較
して、ＳＦＶＲＮＡの用量が少なくても、短時間で保護効果を上げることがで
きる。第二に、ＤＮＡとは異なって、ＲＮＡは細胞ゲノムに取りこまれる恐れが
ない。第三に、ＳＦＶＲＮＡの複製および表現は細胞の細胞質でのみ起こる。
したがって、核に基づく表現系（ＤＮＡ免疫投与）でみられるような核の移動お
よびスプライシングの問題は起こらない。第四に、ＳＦＶＲＮＡの複製は一過
性であり、ＲＮＡはきわめて不安定であり、ＳＦＶＲＮＡはＤＮＡプラスミド
のように免疫投与後長時間持続しない。

【０００８】ここでも参考例として引用したＷＯ９５/２７０４４で、アルファウイルスの
ＲＮＡ配列に補足的なｃＤＮＡに基づくアルファウイルスｃＤＮＡベクターの利
用が開示されている。非相同性プロモーターの転写制御の下でｃＤＮＡから転写
されると、アルファウイルスのＲＮＡは自身のレプリカーゼによって自己複製を
起こすことができ、それによって転写された遺伝子組み換えＲＮＡ分子のコピー
数が増幅する。

【０００９】ここでも参考例として引用した米国特許出願第０８/４７６，３９７、１９９５年６月７日出願、（ＷＯ９６/４０９４５）、本出願人に譲渡、でＤＮＡ免疫
投与に用いたＲＳＶＦ遺伝子の形態を含むある種のプラスミド構築物が開示さ
れている。この開示で明らかなように、１種類のプラスミドｐＸＬ２はマウスに
鼻腔内投与したとき、生ＲＳＶの攻撃投与に対して完全な防御を示した。このプ
ラスミドは蛋白の膜透過性部分を欠くトランケートＲＳＶＦ蛋白をコードした
遺伝子、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即初期プロモーターエンハンサ
ーおよびイントロン配列、および異常スプライシングを防止するためのウサギβ
−グロビンのイントロンＩＩ配列を含む。ウサギのβ−グロビンのイントロンＩ
Ｉ配列を含まない同じプラスミド構築物、すなわちｐＸＬ１は、部分的な防御を
示したに過ぎなかった。同様に、完全長ＲＳＶ蛋白をコードしたＲＳＶＦ遺伝
子を除きｐＸＬ２と同じプラスミド構築物ｐＸＬ４も部分的な防御を示したに過
ぎなかったが、ウサギβ−グロビンのイントロンＩＩ配列を欠く対応する構築物
、すなわちｐＸＬ３は防御を示さなかった。

【００１０】これらのデータから、異常スプライシングを軽減する要素を欠くと、プラスミ
ドの防御能に悪影響があると考えられる。異常スプライシングは、ＤＮＡからＲ
ＮＡへの核の転写の過程で起こる。免疫投与にＲＮＡ転写物を用いると、核の処
理が不要になり、異常スプライシングが起こらない。これにより、ヒト以外のイ
ントロンＩＩ配列を使用しなくてすむ。

【００１１】宿主への投与にＲＮＡ転写物を用いると、ＵＳＡＮ０８/４７６，３９７（ＷＯ９６/４０９４５）に記載されているＤＮＡプラスミドを用いた場合に比較して低用量を用い、短時間で攻撃投与に対する完全な防御が得られる。ＲＮＡ
転写物を用いると、免疫投与した宿主におけるＤＮＡの残留および取り込みを避
けることができる。

【００１２】ＲＳＶＦ蛋白をコードした裸のＳＦＶＲＮＡ、特にＲＳＶＦ蛋白の分泌
型を免疫投与するとＲＳＶに起因する疾病に対して免疫効果があることは本発明
以前には知られておらず、従来の技術に基づいて予測することはできなかった。
ＲＳＶに感染すると、重度の疾病が起こる。ＲＳＶによって起こる疾病を防御す
るためにワクチンを含む免疫原性調製物をｉｎｖｉｖｏ投与するための改良ベクターの提供は有用であり、望まれている。特に、老人および血清陰性乳幼児を
含む幼児に免疫を誘導し、防御効果があり、疾病を増強（免疫増強）しないワク
チンの提供が望まれている。（発明の要約）本発明は、呼吸合包体ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスを含むパラ
ミクソイルスによる疾病に対して免疫を与えるための新規な免疫原性物質および
当該新規物質を用いた免疫投与手順を提供するものである。特に、本発明は、パ
ラミクソイルス科の感染によって起こる疾病に対して有効なＲＮＡワクチンを提
供することを目的とするものである。

【００１３】本発明の一側面によると、少なくともアルファウイルスのＲＮＡゲノムの一部
を補い、完全なアルファウイルスのＤＮＡゲノム複製領域の補体を有する第一の
ＤＮＡ配列と、パラミクソウイルス蛋白、またはパラミクソイルス蛋白と特異的
に反応する抗体を生成する蛋白フラグメントをコードした第二のＤＮＡ配列とか
らなり、第二のＤＮＡ配列を複製に必須ではない第一のＤＮＡ配列の領域に挿入
し、第一および第二のＤＮＡ配列がプロモーターの複写制御のもとにあるベクタ
ーを提供する。

【００１４】パラミクソイルス蛋白は、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）および呼吸
合包体ウイルス（ＲＳＶ）からなる群から選ぶことができる。ＰＩＶ蛋白は、Ｐ
ＩＶ−１、ＰＩＶ−２、ＰＩＶ−３またはＰＩＶ−４、特にＰＩＶ−３のＨＮま
たはＦ糖蛋白である。ＲＳＶ蛋白は、特にＲＳＶのＦまたはＧ糖蛋白であっても
よい。

【００１５】第二のＤＮＡ配列は、完全長ＲＳＶ蛋白をコードしてもよいし、膜透過アンカ
ーおよび細胞質テールを欠くＲＳＶＦ蛋白をコードしていてもよい。膜透過ア
ンカーおよび細胞質テール領域のコードを欠くことによって、ＲＳＶＦ蛋白の
分泌型が得られる。

【００１６】第二のＤＮＡ配列は、ＲＳＶＦ蛋白をコードし、ＳｐｅＩ制限部位を欠くこ
とが望ましく、膜透過アンカーおよび細胞質テールコード領域を欠いていてもよ
い。ＳｐｅＩ制限部位の欠失は、ＲＳＶＦ遺伝子のヌクレオチド１９４（Ｔ）
のＣへの突然変異によって、アミノ酸配列を変化させることなく、ＳｐｅＩを除
去して調製する。突然変異を起こさせたトランケートＲＳＶＦ遺伝子のヌクレ
オチド配列（配列識別番号１）およびコードアミノ酸配列（配列識別番号２）は
、図２に示す。

【００１７】好ましくは、アルファウイルスはセムリキ森林ウイルスで、第一のＤＮＡ配列
はプラスミドｐＳＦＶ１に含まれるセムリキ森林ウイルス配列である。用いるプ
ロモーターは、ＳＰ６プロモーターであることが好ましい。

【００１８】ベクターは、第二のヌクレオチド配列を失うことなく、プロモーターの転写制
御のもとで第一および第二のヌクレオチド配列を維持しながら、ベクターの直線
化が可能なように独特な制限部位を含んでいてもよい。独特な制限部位は、Ｓｐ
ｅＩであることが好ましく、特にｐＳＦＶ１に由来することが好ましい。ベクタ
ーの直線型は、実施例で述べる。

【００１９】ベクターはプラスミドベクターであり、特に図１Ｃに示すようにプラスミドｐ
ＭＰ３７（ＡＴＣＣ９７９０５）の識別特性を有するものであることが好まし
く、プラスミドｐＭＰ３７が特に好ましい。

【００２０】ＲＳＶＦ蛋白またはそのフラグメントをコードした突然変異ＤＮＡ配列は、
ＲＳＶＦ蛋白と特異的に反応する抗体を誘導し、本来のＤＮＡ配列に存在する
ＳｐｅＩ制限部位を欠き、本発明の別の側面を構成する。本来の配列のＳｐｅＩ
部位を欠く当該突然変異ＤＮＡ配列は、図２（配列識別番号１）に示すもの、あ
るいは図２（配列識別番号２）に示すアミノ酸配列をコードしたものが望ましい
。

【００２１】ここに提供する新規ベクターは、特異的な制限部位で解裂することによって直
線とし、ＲＮＡ転写に転写する。本発明の別の側面によると、ここで直線化およ
び転写により製造して提供したようにベクターのＲＮＡ転写物を提供する。

【００２２】ここで提供するＲＮＡ転写物は、宿主においてパラミクソウイルス蛋白に対す
る抗体を誘導するために宿主にｉｎｖｉｖｏで投与するための免疫原性組成物の形態で提供することができる。当該免疫原性組成物は、その有効成分として、
ここで提供するＲＮＡ転写物からなる。本発明の別の側面にしたがっ
て提供される当該免疫原性組成物は、ｉｎｖｉｖｏで投与するに適した薬理学的に許容される担体を用いて製剤することができ、防御免疫応答を誘導する。

【００２３】さらに本発明の別の側面によると、ここで提供するＲＮＡ転写物の有効量を宿
主に投与することからなるパラミクソウイルス感染疾病に対する免疫を宿主に賦
与する方法を提供する。

【００２４】また、本発明は、ＲＳＶＦ蛋白またはＲＳＶＦ蛋白のフラグメントをコー
ドし、呼吸合包体ウイルスの感染による疾病に対して宿主を防御するためにＲＳ
ＶＦ蛋白と特異的に反応する抗体を誘導する遺伝子を用いる新規な方法であっ
て、前記遺伝子を単離し、アルファウイルスのＲＮＡゲノムの少なくとも一部を
補い、プラスミドベクターを形成するための複製には必須でない前記ＤＮＡ配列
の部位におけるアルファウイルスの完全なＲＮＡゲノムの複写領域の補体を有す
るＤＮＡ配列に前記遺伝子を効果的に結合させることからなり、前記遺伝子およ
びＤＮＡ配列がプロモーターの転写制御のもとにあり、プラスミドベクターは直
線化されるが、前記遺伝子およびＤＮＡ配列は依然として前記プロモーターの転
写制御のもとにあり、前記直線化ベクターのＲＮＡ転写物を形成し、前記ＲＮＡ
転写物を前記の宿主に導入することを特徴とする方法を含む。

【００２５】プラスミドベクターの直線化は、プラスミドベクターを特異的な制限部位、す
なわち遺伝子およびＤＮＡ配列がプロモーターの転写制御のもとに保たれるよう
な位置で除去することによって行う。特異的制限部位は、プラスミドｐＳＦＶ１
に由来するようなＳｐｅＩ部位であってもよい。

【００２６】用いるプラスミドベクターはプラスミドｐＭＰ３７であることが望ましく、直
線化段階はプラスミドｐＭＰ３７のＳｐｅＩ部位で解裂させることによって行う
（図１Ｃ参照）。

【００２７】さらに、本発明は、呼吸合包体ウイルス（ＲＳＶ）感染によって起こる疾病か
ら宿主を防御するためのワクチンの製造法であって、膜透過アンカーおよび細胞
質テールが存在せず、あらゆるＳｐｅＩ制限部位を欠くＲＳＶＦ蛋白をコード
した第一のＤＮＡ配列を単離し、アルファウイルスのＲＮＡゲノムの少なくとも
一部を補い、プラスミドベクターを形成するための複製には必須でない第二のＤ
ＮＡ配列の領域におけるアルファウイルスの完全なＲＮＡゲノムの複写領域の補
体を有する前記第二のＤＮＡ配列に前記第一のＤＮＡ配列を効果的に結合させる
ことからなり、前記第一および第二のＤＮＡ配列がプロモーターの転写制御のも
とにあり、プラスミドベクターは直線化されるが、前記第一および第二のＤＮＡ
配列は依然として前記プロモーターの転写制御のもとにあり、前記直線化ベクタ
ーのＲＮＡ転写物を形成し、ｉｎｖｉｖｏ投与のためのワクチンとして前記ＲＮＡ転写物を製剤することを特徴とする方法を含む。

【００２８】プラスミドベクターの直線化は、プラスミドベクターを特異的な制限部位、す
なわち遺伝子およびＤＮＡ配列がプロモーターの転写制御のもとに保たれるよう
な位置で除去することによって行う。特異的制限部位は、プラスミドｐＳＦＶ１
に由来するようなＳｐｅＩ部位であってもよい。

【００２９】用いるプラスミドベクターはプラスミドｐＭＰ３７であることが望ましく、直
線化段階はプラスミドｐＭＰ３７のＳｐｅＩ部位で解裂させることによって行う
。本発明の利点は、ｉｎｖｉｖｏ投与によって免疫反応を誘導する上で有用なＲＮＡ転写物を提供することを含む。

【００３０】以下の図面を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。

【００３１】（発明の一般的説明）上記のように、本発明は一般に直線化および直線化したベクターの転写によっ
てＤＮＡベクターから形成させたＲＮＡ転写物を用いてＲＮＡ免疫投与を行うこ
とによるパラミクソウイルス感染に起因する疾病から宿主を防御することに関す
る。特に、本発明は呼吸合包体ウイルス（ＲＳＶ）の感染による疾病から宿主を
防御することに関するが、特にこれに限るものではない。以下の説明は、特にＲ
ＳＶＦ蛋白およびそのフラグメントをコードし、ＲＳＶＦ蛋白と特異的に反
応する抗体を誘導するＤＮＡ配列およびＲＮＡ転写物について行う。

【００３２】本願では、“ＲＳＶＦ蛋白”という用語は天然の各種系統のＲＳＶおよびコ
ード遺伝子のＰＣＲ増幅を行い、免疫原性を維持しているものを含むアミノ酸配
列の異なる蛋白、膜透過アンカーおよび細胞質テールを欠くＲＳＶＦ蛋白の分
泌型、ならびにＲＳＶＦ蛋白と特異的に反応する抗体を誘導し、ＲＳＶＦ蛋
白と同様な機能を有するＲＳＶＦ蛋白のフラグメントを含む完全長ＲＳＶＦ
蛋白を規定するために用いる。本願で、第一の蛋白が第二の蛋白と免疫学的に関
連があるか、または同じ機能を有する限り、第一の蛋白は第二の蛋白と“機能的
に同じ”である。機能的相同体は、例えば蛋白のフラグメント、置換体、または
その付加または欠失変異体である。

【００３３】ベクターは、アルファウイルス特にセムリキ森林ウイルスのＲＮＡゲノムの少
なくとも一部を補い、完全なアルファウイルスのＲＮＡゲノム複写領域の補体を
有する第一のＤＮＡ配列を含むように構築する。第二のＤＮＡ配列はＲＳＶＦ
蛋白をコードし、第一のＤＮＡ配列の複写には必須でない領域に挿入する。第一
および第二のＤＮＡ配列は、プロモーターの転写制御下にある。得られたベクタ
ーは直線であり、この直線化ベクターからＲＮＡ転写物を形成させる。

【００３４】ここで提供するＲＮＡ転写物は、これを投与した動物で認められたＲＶＦ蛋白
に特異的な抗体反応で明らかなように、ヒトを含む動物に投与すると、急速に複
写され、ｉｎｖｉｖｏでＲＳＶＦ蛋白の表現が起こる。当該抗体は、必要であれば、試料中のＲＳＶ蛋白の検出に使用することができる。

【００３５】以下の実施例で述べる結果からも明らかなように、ＲＮＡ転写物は高い抗−Ｆ
ＩｇＧ抗体力価を提供し、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は生のウイルスで免疫化し
た場合に得られる比に近い。ＲＮＡ転写物を免疫投与すると、生のＲＳＶを攻撃
投与した動物を保護する。

【００３６】当該分野の専門家にとっては、本発明の各種実施例がＲＳＶ感染のワクチン、
診断および治療の分野に適用できることを想定することは容易なことである。こ
のような用途の非限定的な考察を以下に示す。ワクチンの調製および使用ワクチンとして適当な免疫原性組成物は、ここで開示したＲＳＶＦ遺伝子お
よびベクターから調製することができる。当該ワクチンは、被験者に抗−ＲＳＶ
Ｆ抗体の生産を含む免疫反応を示す。ワクチンを含む免疫原性組成物は、ＲＮＡ
転写物を含み、ポリヌクレオチドを投与するための注射剤、生理学的に許容され
る液剤または乳剤として調製することができる。ＲＮＡ転写物はレシチンリボソ
ームまたは従来知られている核酸リボソーム等その他のリボソーム（例えば、Ｗ
Ｏ９３/２４６４０、参考文献３８）等のリボソームと混合するか、または以下に詳しく述べるようにアジュバントと混合してもよい。カチオン性脂質からな
るリポソームは、ＤＮＡおよびＲＮＡ等のポリアニオンと自然に、容易に相互作
用してリポソーム／核酸複合体を形成し、ポリヌクレオチドを略奪する。さらに
、ポリアニオン性複合体は細胞膜と融合してポリヌクレオチドの細胞内供給が起
こり、ポリヌクレオチドがリポソームコンパートメントの分解酵素を迂回する。
ＰＣＴ公開公報ＷＯ９４/２７４３５には、カチオン性脂質とポリヌクレオチドからなる遺伝子免疫投与組成物が記載されている。細胞による核酸の取り込み
を助けるカルシウムイオン、ウイルス蛋白およびその他のトランスフェクション
助長剤等を使用すると有利である。

【００３７】また、ポリヌクレオチド免疫原性調製物は、生分解性の徐放性粒子を含むマイ
クロカプセルとして製剤することができる。例えば、米国特許第５，１５１，２
６４号には、ＢｉｏＶｅｃｔｅｕｒｓＳｕｐｒａＭｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ
ｓ（ＢＶＳＭ）と呼ばれるリン脂質／糖脂質／多糖類の性質を有する粒状担体が
記載されている。当該粒状担体は、生物活性を有する多くの分子をその層の一つ
に運ぶことを目的としている。

【００３８】米国特許第５，０７５，１０９号には、ポリ（ＤＬ−ラクチデコグリコライド
）を用い、抗体のトリニトロフェニル化キーホールリンペットヘモシアニンとス
タフィロコッカス腸炎毒Ｂを５０：５０の比でカプセル化する方法が開示されて
いる。カプセル化に用いるその他のポリマーとしては、ポリ（グリコライド）、
ポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコライド）、コポリオキサレート、ポリカプロラ
クトン、ポリ（ラクチド−コカプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポリ
オルソエステル、ポリ（８−ヒドロキシ酪酸）およびポリアンハイドライド等が
ある。

【００３９】ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１/０６２８２号には、多くの生物付着性ミクロスフェアと抗原とからなる運搬担体が記載されている。ミクロスフェアは、澱粉、ゼ
ラチン、デキストリン、コラーゲンまたはアルブミンである。この運搬担体は、
特に鼻粘膜によるワクチンの取り込みを目的にしている。運搬担体は、さらに吸
着促進剤を含んでいてもよい。

【００４０】ＲＮＡ転写物は、薬理学的に許容され、相容性のある添加物と混合してもよい
。当該添加物は、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール
およびそれらの混合物である。免疫原性組成物およびワクチンは、さらに湿展剤
または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバント等効果を増強するための補助剤
を含んでいてもよい。免疫原性組成物およびワクチンは、注射部位を局所麻酔剤
で前処置した後、皮下注射、静脈内注射、皮内注射または筋肉内注射等非経口的
に投与してもよい。さもなくば、本発明にしたがって調製した免疫原性組成物は
、粘膜表面に免疫反応を起こさせるように製剤化し、処置してもよい。すなわち
、免疫組成物を例えば経鼻的または経口的（胃内）経路で、粘膜表面に投与して
もよい。さもなくば、坐薬および経口製剤を含むその他の投与モードが望ましい
。坐薬のバインダーおよび担体としては、例えばポリアルカレングリコールまた
はトリグリセリドが含まれる。経口製剤は、通常用いられる添加剤、例えば医薬
品級のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウム等が含まれる。

【００４１】免疫原性組成物およびワクチンは、用量製剤に矛盾しないように治療的に有効
で、防御効果があり、免疫原性が得られる量で投与する。投与量は、例えば個人
のＲＳＶＦ蛋白およびそれに対する抗体を合成する免疫系の能力、および必要
であれば細胞仲介免疫反応を誘導する免疫系の能力を含み、治療対象患者によっ
て異なる。投与する有効成分の正確な量は、医師の判断による。しかし、適切な
用量範囲は当該技術分野の専門家であれば容易に決定することができ、ＲＳＶ
ＦＲＮＡとして約１μｇ〜約１０ｍｇである。１回目投与およびブースター投
与の投与方法も固定的ではなく、１回目投与後さらに数回投与してもよい。また
、用量は投与経路に依存するが、宿主の体重によっても異なる。１種類の病原菌
のみを防御するワクチンは、単価ワクチンである。数種類の病原菌に対して抗原
性を有するワクチンは複合ワクチンであり、本発明のワクチンもこれに属する。
当該複合ワクチンは、例えば各種病原菌、または同じ病原菌の各種系統、または
各種病原菌の組み合わせから得られた物質を含む。

【００４２】ベクターをアジュバント（一般にリン酸緩衝生理食塩水中０．０５〜０．１％
で使用）と一緒に投与すると、免疫原性は著しく改善される。アジュバントは抗
原の免疫原性を増強するが、それ自体は必ずしも免疫原性を有さない。アジュバ
ントは、投与部位の近くの局部に抗原を保持し、デポー効果によって免疫系の細
胞に抗原を徐々に、長時間放出する作用がある。また、アジュバントは免疫系の
細胞を抗原デポーに誘引し、これらの細胞を刺激して免疫応答を高める。

【００４３】免疫刺激剤またはアジュバントは、宿主の例えばワクチンに対する免疫応答を
高めるために長年使用されている。このように、アジュバントは抗原に対する免
疫応答を高めることが知られている。しかし、これらのアジュバントの一部は毒
性があり、望ましくない副作用を起こし、したがってヒトおよび多くの動物への
使用に適さないものがある。事実、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウ
ム（これらを包括して、アルムと呼ばれている）のみがヒトおよび家畜用ワクチ
ンのアジュバントとして定常的に使用されているに過ぎない。

【００４４】広い範囲の外因性アジュバントおよびその他の免疫調節剤が、抗原に対する強
い免疫応答を刺激する。これらには、サポニンと膜蛋白抗原を複合化した免疫刺
激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、鉱物油の深成ポリマー、マイコバクテリア死菌の鉱
物油懸濁液、フロイントの完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）お
よびリポ多糖類（ＬＰＳ）等の細菌産物、ならびにモノホリルリピドＡ、ＱＳ
２１およびポリホスファゼンが含まれる。

【００４５】本発明の特定の実施例では、ＲＳＶのＦ蛋白をコードした第一のヌクレオチド
配列からなるＲＮＡ転写物を、ベクターを標的とした標的分子とともに、免疫系
の細胞を含む特定の細胞に供給することもできる。

【００４６】ＲＮＡ転写物は、各種の手順で宿主に供給することができる。例えば、Ｔａｎ
ｇら（参考文献３９）は、仔ウシの成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードしたＤＮＡ
をコーティングした金の微放出体をマウスの皮膚に植入すると、マウスで抗−Ｂ
ＧＨ抗体が生産されることを開示している。一方、Ｆｕｒｔｈら（参考文献４０
）は、生きた動物の皮膚、筋肉、脂肪および乳腺組織の形質移入にジェットイン
ジェクターが使用できることを認めている。

【００４７】生物供託ＲＳＶＦ蛋白をコードした遺伝子を含み、ここで引用したある種のベクター
は、本発明の出願前に、ブタペスト条約にしたがってアメリカン・タイプカルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（10801 University Boulevard, Manassas, Ve
rginia 20110-2209,米国）に供託した。

【００４８】供託したプラスミドの試料は、本米国特許出願に基づく特許が確立した時点で
公開され、その時点で入手制限が解除される。ＡＴＣＣが同一物を分与できない
場合は、変化のないもので交換する。供託した実施例は発明を説明するためのも
のであり、ここで開示し、請求する発明は供託したプラスミドによってその範囲
を制限されるものではない。本願で開示したものと同等または相同な抗原をコー
ドした相同または同等のプラスミドは、本発明の範囲に含まれる。（供託の要約）プラスミドＡＴＣＣ番号供託日ｐＭＰ３７９７９０５１９９７年２月２７日（実施例）上記の開示は、本発明の一般的な説明である。以下の実施例を引用し、本発明
をさらに詳細に説明する。これらの実施例は説明のためのみであり、発明の範囲
を限定するためのものではない。態様の変更および同等なものとの置換は、状況
から容易に予想できるものとみなす。ここでは特殊な用語を用いるが、このよう
な用語は説明のために用いたものであり、発明を限定するためのものではない。

【００４９】分子遺伝学、蛋白生化学および免疫学的方法を用いたが、本開示では明確には
記載されていない。また、これらの実施例は科学文献に広く報告されており、当
該技術分野の専門家にとっては容易に実施できることである。実施例１この実施例では、ＲＳＶＦ遺伝子のトランケート型を含むセムリキ森林ウイ
ルス（ＳＦＶ）表現ベクターの構築を記載する。

【００５０】トランケート型ＲＳＶＦ遺伝子は、図１に示す手順にしたがってＳＦＶ表現
ベクターｐＳＦＶ１に挿入する（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ、ＭＤ、米国）。ＲＳＶＦ遺伝子は、その開示内容を参考例としてここに引
用した関連米国特許出願第０８/００１，５５４号（１９９３年１月６日出願、本出願人に譲渡）（参考文献４１、ＷＯ９３/１４２０７号）で詳細に記載されているように、臨床的に単離したＲＳＶサブタイプＡをプラスミドｐＲＳＶ
Ｆにクローン化したものであった。ＢｓｐＨＩおよびＥｃｏＲＩでプラスミドを
消化し、ＲＳＶＦ遺伝子フラグメントをプラスミドＲＳＶＦから切断した。
制限酵素ＢｓｐＨＩでＲＳＶＦ遺伝子のコード領域を切断し、Ｆ蛋白のＣ−末
端から４８アミノ酸を除去した。これらのアミノ酸は膜透過ドメインのほとんど
および細胞質テール全体を構成している。得られた１．６ＫｂのトランケートＲ
ＳＶＦ遺伝子フラグメントを、上記ＵＳＡＮ第０８/００１，５５４号（ＷＯ９３/１４２０７）に記載されているように、以下の配列に基づくリンカーを用いた三段階結紮でブルースクリプトベース哺乳類細胞表現ベクターｐＭＣＲ２
０のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＥＳ１３Ａを
得た。

【００５１】５′ＣＡＴＧＡＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＧ３′（配列識別番号３）３′ ＴＧＡＡＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＡＧ５′（配列識別番号４）このリンカーは、非テンプレートコードスレオニンをトランケートＲＳＶＦ蛋
白のＣ−末端に付加し、トランケート遺伝子の末端に連続した３つのストップコ
ドンを挿入する。

【００５２】ついで、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより、１．６Ｋｂのト
ランケートＲＳＶＦ遺伝子フラグメントをプラスミドｐＥＳ１３Ａから切除し
た。さらに３段階結紮を行い、以下の配列に基づいた別のリンカーによって１．
６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩＲＳＶＦ遺伝子フラグメントをＳＦＶ表現
ベクターｐＳＦＶ１のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＭＰ３５
を得た。

【００５３】５′ＧＡＴＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧ３′（配列識別番号５）３′ＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＴＴＡＡ５′（配列識別番号６）このプラスミドは、１．６ＫｂのＢａｍＨＩＲＳＶＦ遺伝子フラグメントの
コピー２つを有する。このとき、ＳｐｅＩ部位がＲＳＶＦ遺伝子フラグメント
のＢａｍＨＩ部位から１９３ｂｐ上流に存在していることを発見した。ｐＳＦＶ
１に基づくプラスミドは、以下に記載するｉｎｖｉｔｒｏ転写反応に使用する前にＳｐｅＩで直線化する必要がある。したがって、ＲＳＶＦ遺伝子のＳｐｅ
Ｉ部位を除去する必要があり、これは以下のように行った。

【００５４】ＢａｍＨＩで消化することによりプラスミドｐＭＰ３５から１．６Ｋｂのトラ
ンケートＲＳＶＦ遺伝子フラグメントを切除し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位
に結紮してプラスミドｐＭＰ３６を得た。トランスホーマー^TM部位−指向突然変
異キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ、米国）およびプラ
イマー５′−ＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＡＣＣＡＧＴＧＴＴＡＴＡＡＣＴ（配列識別
番号７）を製造業者の指針にしたがって使用し、ヌクレオチド１９４をＴからＣ
に変更した。この変更によって、コードしたＲＳＶＦ蛋白のアミノ酸配列に影
響をおよぼすことなく、ＲＳＶＦ遺伝子のＳｐｅＩ部位を除去した。修正ＲＳ
ＶＦ遺伝子を含むプラスミドｐＭＰ３６Ａの配列を、ＤＮＡ配列分析で測定し
た。ＢａｍＨＩで消化して１．６ＫｂトランケートＲＳＶＦ遺伝子フラグメン
トをプラスミドｐＭＰ３６Ａから切除し、ｐＳＦＶ１のＢａｍＨＩ部位に結紮し
、プラスミドｐＭＰ３７を得た（ＡＴＣＣ９７９０５）。トランケートＲＳＶ
Ｆ遺伝子が適切に定位していることは、制限マップの作成およびＤＮＡ配列分
析によって確認した。図２は、ＳｐｅＩ部位が除去され、分泌ＲＳＶＦ蛋白の
アミノ酸配列がコードされたトランケートＲＳＶＦ遺伝子のＢａｍＨＩフラグ
メントのヌクレオチド配列（配列識別番号１）を示す。

【００５５】Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、米国）製プラスミドＤＮＡミド
キットを用い、製造業者の指針にしたがってプラスミドＤＮＡを精製した。実施例２この実施例では、ｉｎｖｉｔｒｏ転写反応でＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡの生成に必要とするＳｐｅＩ直線化ｐＭＰ３７の調製およびＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮ
Ａの調製を記載する。

【００５６】２０ＭＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭのＫＣｌおよび３０単位のＳｐｅＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ、ＭＤ、米国）を含む反応液１００μＬ中で、実施例１に記載したように
調製したプラスミドｐＭＰ３７２０μｇをＳｐｅＩで切断した。

【００５７】以下の材料を用い、３００μＬのｉｎｖｉｔｒｏ転写反応液中で、直線化プラスミドからＳＦＶ−ＲＮＡを調製した。

【００５８】４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）６ｍＭのＭｇＣｌ₂ ２ｍＭのスーパーミジン−（ＨＣｌ）₃ １ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレオノール）１ｍＭのＡＴＰ（アデノシン三リン酸）１ｍＭのＧＴＰ（グアノシン三リン酸）１ｍＭのＣＴＰ（シチジン三リン酸）１ｍＭのＵＴＰ（ウリジン三リン酸）１ｍＭのｍ⁷Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）ＧＲＮＡキャップアナログ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏ
ｎｔ．、カナダ）３６０単位のＲＮａｓｉｎ^R酵素阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）２７０単位のＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂ
ｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、米国）反応混合液を、３７℃で５０分間インキュベーションした。ＣＨＲＯＭＡＳ
ＰＩＮ^TM−２００ＤＥＰＣ−Ｈ₂Ｏカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ、米国）に反応混合液を通し（７５μＬ／カラム）、製造業者の
指針にしたがって、このようにして調製したＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡを精製し
た。

【００５９】ついで、精製したＲＮＡを免疫投与直前に等量の２ＸＰＢＳと混合した。実施例３この実施例では、ＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡのマウスに対する免疫投与および
得られた免疫原性結果を記載する。

【００６０】マウスはＲＳＶ感染に敏感であり（参考文献４２）、信頼性の高い動物モデル
であることがすでに明らかにされている。実施例２に記載したように調製したＳ
ＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡを、筋肉内（ｉ．ｍ．）経路によりマウスに免疫投与し
た。ＢＡＬＢ／ｃ系マウス５匹（雌、６〜８週齢）（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂ．
，ＢａｒＨａｒｂｏｕｒ、ＭＥ、米国）の前脛骨筋の両側に、ＰＢＳ−指向性
ＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡを２ｘ２５μｇ（０．５μｇ/μＬ）の用量で注射した。ＲＮＡ免疫投与の５日前に、カージオトキシン（ＰＢＳ中１０μＭ）（Ｌａ
ｔｏｘａｎ、フランス）２ｘ５０μＬを筋肉に処置した。カージオトキシンを筋
肉に処置するとＤＮＡの吸収が促進され、免疫応答が高くなるが知られている（
参考文献４３）。４週間後に、これらのマウスに同様な方法でブースター投与し
た（下表１）。対照群には、（１）ＳＦＶＲＮＡ表現β−ガラクトシダーゼ（
ＳＦＶ−ＬａｃＺＲＮＡ）、（２）ここで調製したＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡ
、（３）ＲＳＶ生菌、（４）アルム含有ＰＢＳおよびアルム含有ＲＳＶサブユニ
ット調製物を免疫投与した。また、これらのマウスには、４週間後に同様にブー
スター投与した（表１）。ＲＳＶＦ、ＧおよびＭ蛋白からなるＲＳＶサブユニ
ット調製物は、その開示内容をここで参考例として引用した関連米国特許出願第
０８/６７９，０６０号（１９９６年７月１２日出願、本出願人に譲渡）に記載されている（ＷＯ９８/０２４５７）。

【００６１】２回目の免疫投与から２週間後に、ＲＳＶのＡ２株（ＢＧ→４Ａ）１０⁶プラーク形成単位をマウスの鼻腔内に攻撃投与した。４日後に、動物を屠殺した。無
菌的に肺を摘出し、重量を測定し、完全培養培地２ｍＬとともにホモジナイズし
た。すでに報告されている方法（参考文献４４）にしたがい、ベロ細胞を用い、
３反復で肺ホモジネート中のウイルス力価を測定した。

【００６２】４および６週間後にマウスから血清を採取し、実施例４に記載したように酵素
結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）でこれら血清中の抗−ＲＳＶＦ抗体力価（Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）を測定した。すでに報告されている方法（参考
文献４４）にしたがい、これら血清のＲＳＶ−特異性プラーク減数力価を測定し
た。

【００６３】表１に示したように免疫投与したＢＡＬＢ／ｃ系マウス血清の抗−ＲＳＶＦ
抗体反応を図３に要約する。ＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡ、ＲＳＶ生菌、またはＲ
ＳＶサブユニット調製物＋アルムを免疫投与した動物では、４および６週で血清
中の総抗−ＲＳＶＦＩｇＧ抗体力価が高かった（図３，パネルＡ）。しかし
、図３のパネルＢおよびＣから明らかなように、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａの比には
顕著な差が認められた。ＲＳＶ生菌を免疫投与した動物の血清では、６週間後の
抗−ＦＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比が約０．６９であった。この値は、アルム−ア
ジュバント添加ＲＳＶサブユニット調製物を一次およびブースター投与したマウ
スから６週間後に得られた抗−ＲＳＶＦＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比と対称的で
あった。この場合、抗−ＲＳＶＦＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は約４．３であっ
た。ＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡを免疫投与したマウスから６週間後に得られた抗
−ＲＳＶＦＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は、０．７９であった。これらの結果は
、ＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡをマウスに免疫投与すると、アルム−アジュバント
添加ＲＳＶサブユニット調製物で認められるＴｈ−２型の反応よりも、ＲＳウイ
ルス生菌で得られる反応と同様にＴｈ−１型の反応が高くなることを示唆してい
る。

【００６４】図４に示したように、表１に示した各種ＲＳＶ調製物を一次およびブースター
投与したマウスの血清では、いずれも顕著な濃度のＲＳＶ−特異性中和抗体が認
められた（群２、３および５）。プラセボ対照動物とは対称的に、ＳＦＶ−ＲＳ
ＶＦＲＮＡ、ＲＳＶ生菌またはアルム−アジュバント添加ＲＳＶサブユニット
調製物を免疫投与したマウスでは、表２に示すようにＲＳウイルス生菌の攻撃投
与に対する下気道の完全な防御が認められた。

【００６５】ＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡをマウスに免疫投与すると、ＲＳＶ生菌の攻撃投与
に対するマウスの防御が認められた。このＳＦＶレプリコンの防御能は、ＲＳＶ
生菌またはアルム−アジュバントＲＳＶサブユニットの接種で誘導される防御能
と同等であった。得られた免疫反応の型は、ＲＳＶ生菌で発現する免疫反応の型
と同様にＴｈ−１様反応が高かった。実施例４この実施例では、抗−ＲＳＶＦ抗体力価の測定を記載する。

【００６６】免疫アフィニティー精製ＲＳＶＦ蛋白２．５ｎｇを０．０５Ｍ炭酸−重炭酸
緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、室温で一夜Ｎｕｎｃ−ＭａｘｉＳｏｒｐプレ
ートのウエルをコーティングした。ＰＢＳ中０．１％のＢＳＡを室温で３０分間
ウエルに添加した後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋０．１％ツイン２０洗浄用緩衝
液で２回洗浄し、ウエルの非特異的結合をブロックした。マウス血清を２倍また
は４倍に連続希釈し、ウエルに添加した。室温で１時間インキュベーションした
後、洗浄用緩衝液でプレートを５回洗浄し、洗浄用緩衝液で最適濃度にきしゃく
したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抱合体を添加した。
総ＩｇＧ検定には、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＩｎｃ．（ＢａｌｔｉｍｏｒｅＭＤ、米国）製Ｆ（ａｂ′） ₂ ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ特異性）−ＨＲＰを用いた。ＩｇＧ１のけんていにはＳｅｒｏｔｅｃ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）製ヒツジ抗マ
ウスＩｇＧ１−ＨＲＰを用い、ＩｇＧ２ａの検定にはＣａｌｔａｇＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ（ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）製ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ２ａを用いた。室温で１時間インキュベーションした後、洗浄用緩衝液でプ
レートを５回洗浄し、テトラメチルベンズイミドの存在下で過酸化水素（基質）
を添加した。反応は、２Ｍの硫酸を添加して停止させた。Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ
Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用い、吸光度（ＯＤ）４５０ｎｍで比色し
た。力価は、ＯＤが約２倍になる最終希釈率の逆数とした。このＯＤは、最初の
希釈時に検定の陰性対照よりも高くなければならない。陰性対照には、各動物の
免疫投与前の血清を用いた。

【００６７】開示の要約この開示を要約すると、パラミクソイルス蛋白、特にＲＳＶＦ蛋白をコード
したＤＮＡ配列を含み、ｉｎｖｉｖｏ投与のために直線化し、ＲＮＡに転写されたベクターであって、パラミクソイルス、特に呼吸合包体ウイルスの感染によ
って起こる疾病に対する防御免疫反応を誘導する新規なベクターを提供する。本
発明の範囲で、改良が可能である。

【００６８】

【表１】

【００６９】

【表２】

【００７０】文献リスト

【００７１】

【表３】

【００７２】

【表４】

【００７３】

【表５】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａ、１Ｂおよび1Ｃは、ＲＳＶ−ＦＲＮＡの調製に用いたプラスミドｐＭＰ３７の構築スキームを示す。

【図２】図２は、膜透過アンカーおよび細胞質テールを欠き、本来の遺伝子に存在する
ＳｐｅＩ制限部位を除去するためにヌクレオチド１９４で突然変異を起こさせた
トランケートＲＳＶＦ遺伝子のヌクレオチド配列（配列識別番号１）および推
定アミノ酸配列（配列識別番号２）を示す。

【図３】図３は、パネルＡ、ＢおよびＣからなり、ＲＳＶＦＲＮＡ一次免疫投与４
週間後およびブースター投与２週間後にマウスから採取した血清における抗−Ｒ
ＳＶＦ力価を示す。パネルＡ、ＢおよびＣは、それぞれ総ＩｇＧ反応、ＩｇＧ
１反応およびＩｇＧ２ａ反応を示す。

【図４】図４は、各種ＲＳＶ調製物に対するプラーク減数力価として表示したＲＳＶ−
特異性中和抗体力価を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月６日（２０００．３．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項９

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１３

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１４

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１５

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１６

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１８

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正１１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１９

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正１２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２０

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正１３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２１

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正１４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２２

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正１５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正１６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２４

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正１７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正１８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正１９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２７

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２９

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項３０

【補正方法】変更

【補正内容】

【請求項３０】前記ベクターにおいて、前記の第二のＤＮＡ配列がＰＩＶ
−３のＨＮまたはＦ糖蛋白のいずれかであるパラミクソウイルス科蛋白をコード
していることを特徴とする請求項２９に記載のＲＮＡ転写物。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年４月３日（２０００．４．３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】ＲＮＡ呼吸合包体ウイルスワクチン

【特許請求の範囲】

【化１】のプラスミドｐＳＦＶ１の有するセムリキ森林ウイルス配列である請求項１１に記載のベクター。

【化２】のプラスミドｐＳＦＶ１由来のものである請求項１５に記載のベクター。

【化３】のプラスミドｐＭＰ３７（ＡＴＣＣ９７９０５）である請求項１〜１６のいずれかに記載のベクター。

【化４】のプラスミドｐＭＰ３７（ＡＴＣＣ９７９０５）であり、ＳｐｅＩ部位で解裂することにより直線化を行う請求項２７〜２９のいずれかに記載のワクチンの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の技術分野）本発明は、パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）ワクチン、特に呼吸合包体ウイルス（ＲＳＶ）の融合（Ｆ）蛋白をコードしたＲＮＡからなるワクチン
の分野に関する。（発明の背景）ヒト呼吸合包体ウイルス（ＲＳＶ：Respiratory Syncytial Virus）は、乳幼児、幼児および施設入居老人における重度な気道感染の主要病原体であるとされ
ている（参考文献１，２，３，４−本特許出願では本発明に関係する技術水準を
十分に記載するため、参考文献を括弧内に引用する。引用した文献の詳細は、詳細な説明の項の最後に記載する。これら引用文献で開示されている技術内容は、
参考例として本発明の開示と比較する）。世界的な死亡率および罹患率は、有効
なＲＳＶワクチンが早急に必要であることを示している（参考文献５，６）。米
国だけでも、年間約１００，０００人の幼児がＲＳＶ感染による重度の肺炎およ
び細気管支炎で入院している。ＲＳＶ感染幼児の入院および通院医療費は、米国
で毎年３億４千万ドル以上であると推定されている。世界保健機構（ＷＨＯ）お
よび米国国立アレルギー・伝染病研究所（ＮＩＡＩＤ）のワクチン諮問委員会は
、ワクチンの開発が必要な疾病としてＲＳＶをＨＩＶについで二番目に指定して
いる。年間罹患率および死亡率ならびにＲＳＶ感染管理の莫大な健康管理経費は
、有効なＲＳＶワクチンの開発を積極的に進める上で刺激になっている。しかし
、ワクチンは依然として得られていない。

【０００２】ホルマリン不活性化（ＦＩ−ＲＳＶ）および弱毒化ＲＳＶワクチンは、臨床試
験で有効性が認められていない（参考文献７，８，９，１０）。さらに、ホルマ
リン不活性化ＲＳＶワクチンは、野生型のＲＳＶに暴露した一部の幼児で疾病を
促進する（参考文献７，８，９，１０）。ＲＳＶ発病の相乗作用にかかわる作用
機構の解明は、特に血清学的に陰性の患者を対象とした安全なＲＳＶワクチンの
設計に有用である。最近の実験データから、細胞介在反応の平衡失調が免疫増強
に関与していると考えられている。ＦＩ−ＲＳＶを免疫投与し、ウイルスを抗原
投与したマウスで認められた病理組織学的変化の進行は、ＣＤ４＋細胞またはイ
ンターロイキン−４（ＩＬ−４）およびＩＬ−１０の枯渇によって消失する。

【０００３】当該ウイルスの主要免疫原蛋白の一つは、ＲＳＶ融合（Ｆ）糖蛋白である。こ
の外被糖蛋白は、ウイルスと宿主細胞膜の癒合およびウイルスの細胞から細胞へ
の広がりを仲介する（参考文献１）。Ｆ蛋白は、前駆体（Ｆ₀）分子として合成し、それを蛋白加水分解によって解裂し、Ｎ−末端Ｆ₂とＣ−末端Ｆ₁部分からな
るジスルフイッド結合ダイマーを形成させる（参考文献１１）。Ｆ蛋白のアミノ
酸配列は、ＲＳＶサブグループＡとＢの間で高度に保全されており、干渉効果を
有する抗原である（参考文献６，１２）。バキュロウイルス発現系では、ＲＳＶ
蛋白のトランケート（末端領域削除型のもの）分泌型が昆虫のＴｒｉｃｈｏｐｌ
ｕｓｉａｎｉの細胞に発現されている（参考文献１３）。この遺伝子組み換え
蛋白は、コットンラットで保護効果を有することが実証されている（参考文献１
３）。

【０００４】パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ：Parainfluenza Virus）感染に対して有効な生ウイルスワクチンおよび糖蛋白サブユニットワクチンの開発が行われて
いる。ホルマリン不活性化ＰＩＶ１，２，３型ワクチンを用いた臨床試験で、こ
のワクチンの効果は認められていない（参考文献１４，１５，１６）。ホルマリ
ン不活性化ＲＳＶワクチンを用いた臨床試験で当該ワクチンはＲＳＶ感染に対し
て効果がないのみならず、ワクチンの接種を受けた者の多くが後にＲＳＶに感染
するとさらに重度の発症を示すことが確認されて以来化学的に不活性化したワク
チンの開発は中止された。パラインフルエンザワクチン研究の殆どはＰＩＶ−３
ワクチンを中心に行われており（参考文献１７）、ＰＩＶ−１およびＰＩＶ−２
に関する研究報告はきわめて少ない。ＰＩＶ−３ワクチンに対する最近のアプロ
ーチとして、近縁のウシパラインフルエンザウイルス３型およびウイルスの低温
適応によって弱毒化したウイルスの使用が試みられている（参考文献１８，１９
，２０，２１）。

【０００５】パラインフルエンザウイルス３型ワクチン開発の別のアプローチとして、表面
糖蛋白血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ）蛋白に注目した
サブユニットアプローチが行われている（参考文献２２，２３，２４）。典型的
なＩＩ型糖蛋白であるＨＮ抗原は血球凝集およびノイラミニダーゼ活性を有し、
宿主細胞受容体に含まれるシアル酸に対するウイルスの結合に関与する。Ｉ型Ｆ
糖蛋白はウイルス外被と細胞膜の融合ならびにウイルスの細胞から細胞への広が
りを仲介する。最近になって、膜融合にはＮＨおよびＦ糖蛋白を要求することが
実証されている。Ｆ糖蛋白は不活性前駆体（Ｆ）として合成し、それを蛋白加水
分解によってジスルフイッド結合Ｆ２およびＦ１部分に解裂する。ＰＩＶ−１、
−２および−３のＨＮおよびＦ蛋白は構造的に相似であるが、抗原としては識別
される。ＰＩＶのいずれかの型のＨＮおよびＦ蛋白に対する抗体を中和すると、
干渉効果がなくなる。したがって、有効なＰＩＶサブユニットワクチンは、パラ
インフルエンザウイルスの３種類の型からのＨＮおよびＦ糖蛋白を含む必要があ
る。いずれかの糖蛋白に対する抗体をｉｎｖｉｔｒｏで中和する。中和抗体力価と乳幼児におけるＰＩＶ−３感染抵抗性の間に、直接的な相関が認められてい
る。パラインフルエンザウイルス３型の未変性サブユニットワクチンを用い、２
種類の表面糖蛋白保護作用が試験されている。典型的に、非イオン性界面活性剤
でウイルスから糖蛋白を抽出し、レクチンアフィニティーまたは免疫アフィニテ
ィークロマトグラフ法でさらに精製する。しかし、これらの方法は、あらゆる状
況下で、ワクチンの大量生産には適切ではない。小型動物モデル（ハムスターお
よびコットンラット）では、糖蛋白の免疫投与によって生ＰＩＶ−３感染の防止
が実証されている（参考文献２５，２６，２７，２８，２９）。ＰＩＶ−３のＨ
ＮおよびＦ糖蛋白の製造は、ＤＮＡ組み換え技術によっても行われている。バキ
ュロウイルス発現系、およびワクシニアウイルスおよびアデノウイルス遺伝子組
み換え株を用い、昆虫の細胞でＨＮおよびＦ糖蛋白が生産されている（参考文献
３０，３１，３２，３３，３４）。バキュロウイルス発現系では、ＰＩＶ−３糖
蛋白の完全長およびトランケート型（末端領域削除型）ならびにキメラＦ−ＨＮ
融合蛋白が発現されている。遺伝子組み換え蛋白は、小型動物モデルで保護作用
を有することが実証されている（Ｗ０９１／００１０４、１９９１年１１月２９
日出願、当出願人に譲渡された米国特許出願第０７／７７３，９４９号参照）。

【０００６】セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ：Semliki Forest Virus）は、トガウイルス
科のアルファウイルス属のウイルスである。成熟したウイルス粒子は、ｓｓＲＮ
Ａゲノムの単一コピーを含み、５′−末端にキャップ構造および３′−末端にポ
リアデニル酸が付加された陽性極性を有する。それはｍＲＮＡとしての機能を有
し、細胞に導入すると裸のＲＮＡが感染を開始する。感染が起こると、ゲノムの
５′２/３がポリ蛋白に翻訳され、自己解裂によって４種類の非構造蛋白（ｎｓＰ１から４）にまで翻訳が進行する。一旦ｎｓ蛋白が合成されると、正鎖（４２
Ｓ）ゲノムの完全長負鎖への複製に関与する（参考文献３５）。ついで、これら
の負鎖は新しい正鎖（４２Ｓ）ゲノムおよび２６ＳサブゲノムｍＲＮＡの合成の
テンプレートとして作用する（参考文献３５）。このサブゲノムｍＲＮＡはゲノ
ムの最終１/３と共直線性であり、ＳＦＶ構造蛋白をコードしている。ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ（参考文献３６）は、１９９１年にＳＦＶｃ
ＤＮＡ複製単位に基づいて一連の発現ベクターを命名した。これらのアルファウ
イルスベクターはＷＯ９２／１０５７８にも記載されており、その開示内容を
参考例としてここで比較する。これらのベクターは非相同的に挿入できるようにウイルスの構造蛋白遺伝
子が除去されているが、ｎｓＰ１〜４レプリカーゼ複合体を産生するための非構
造的コード領域は保存されている。ＲＮＡの複製に必要な短い５′および３′配
列要素も保存されている。３枠すべての翻訳停止部位の近くの２６Ｓプロモータ
ーの下流に、ポリリンカー部位を挿入した。ＳｐｅＩ部位は、ｉｎｖｉｔｒｏ転写反応に使用するプラスミドの直線化のために、ＳＦＶｃＤＮＡの３′末端
のすぐ後に挿入した。

【０００７】多くの試験で、非相同蛋白をコードしたＳＦＶＲＮＡを挿入すると外因性蛋
白の発現および抗体の誘導が認められている（参考文献３７，３８）。免疫投与
を目的とした外因性蛋白の発現にＳＦＶＲＮＡ接種を用いると、プラスミドＤ
ＮＡ免疫投与に関連したいくつかの利点がある。例えば、ウイルス抗原をコード
したＳＦＶＲＮＡは、ウイルスに対する抗体による中和によって活性を失うこ
となく、抗体の存在下でそのウイルスに導入することができる。また、蛋白はｉ
ｎｖｉｖｏで発現されるので、蛋白はウイルス自体によって発現される蛋白と同じ立体配置を有している。したがって、核酸免疫投与を用いると、蛋白の精製
の過程で起こり、免疫原性、防御エピトープの喪失および場合によっては免疫活
性化につながるおそれのある立体配置の変化を避けることができる。

【０００８】また、ＳＦＶＲＮＡ免疫投与は、プラスミドＤＮＡ免疫投与と比較していく
つかの利点がある。ＳＦＶは、現在知られている最も複写効率の高いウイルスの
一つである。数時間で、単一細胞内に最高２００，０００個の正ＲＮＡのコピー
ができる。これらのＳＦＶＲＮＡはこのように豊富であり、細胞リボソームほ
とんど全てがＳＦＶコード蛋白の合成に動員され、したがって宿主細胞の蛋白合
成を圧倒する（参考文献３６）。したがって、プラスミドＤＮＡ免疫投与と比較
して、ＳＦＶＲＮＡの用量が少なくても、短時間で保護効果を上げることがで
きる。第二に、ＤＮＡとは異なって、ＲＮＡは細胞ゲノムに取りこまれる恐れが
ない。第三に、ＳＦＶＲＮＡの複製および発現は細胞の細胞質でのみ起こる。
したがって、核に基づく発現系（ＤＮＡ免疫投与）でみられるような核の移動お
よびスプライシングの問題は起こらない。第四に、ＳＦＶＲＮＡの複製は一過
性であり、ＲＮＡはきわめて不安定であり、ＳＦＶＲＮＡはＤＮＡプラスミド
のように免疫投与後長時間持続しない。

【０００９】ここでも参考例として引用したＷＯ９５／２７０４４で、アルファウイルス
のＲＮＡ配列に補足的なｃＤＮＡに基づくアルファウイルスｃＤＮＡベクターの
利用が開示されている。非相同性プロモーターの転写制御の下でｃＤＮＡから転
写されると、アルファウイルスのＲＮＡは自身のレプリカーゼによって自己複製
を起こすことができ、それによって転写された遺伝子組み換えＲＮＡ分子のコピ
ー数が増幅する。

【００１０】ここでも参考例として引用した米国特許出願第０８／４７６，３９７、１９９
５年６月７日出願、（ＷＯ９６／４０９４５）、本出願人に譲渡、でＤＮＡ免
疫投与に用いたＲＳＶＦ遺伝子の形態を含むある種のプラスミド構築物が開示
されている。この開示で明らかなように、１種類のプラスミドｐＸＬ２はマウス
に鼻腔内投与したとき、生ＲＳＶの攻撃投与に対して完全な防御を示した。この
プラスミドは蛋白の膜透過性部分を欠くトランケートＲＳＶＦ蛋白をコードし
た遺伝子、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即初期プロモーターエンハン
サーおよびイントロン配列、および異常スプライシングを防止するためのウサギ
β−グロビンのイントロンＩＩ配列を含む。ウサギのβ−グロビンのイントロン
ＩＩ配列を含まない同じプラスミド構築物、すなわちｐＸＬ１は、部分的な防御
を示したに過ぎなかった。同様に、完全長ＲＳＶ蛋白をコードしたＲＳＶＦ遺
伝子を除きｐＸＬ２と同じプラスミド構築物ｐＸＬ４も部分的な防御を示したに
過ぎなかったが、ウサギβ−グロビンのイントロンＩＩ配列を欠く対応する構築
物、すなわちｐＸＬ３は防御を示さなかった。

【００１１】これらのデータから、異常スプライシングを軽減する要素を欠くと、プラスミ
ドの防御能に悪影響があると考えられる。異常スプライシングは、ＤＮＡからＲ
ＮＡへの核の転写の過程で起こる。免疫投与にＲＮＡ転写物を用いると、核の処
理が不要になり、異常スプライシングが起こらない。これにより、ヒト以外のイ
ントロンＩＩ配列を使用しなくてすむ。

【００１２】宿主への投与にＲＮＡ転写物を用いると、ＵＳＡＮ０８/４７６，３９７（ＷＯ９６/４０９４５）に記載されているＤＮＡプラスミドを用いた場合に比較して低用量を用い、短時間で攻撃投与に対する完全な防御が得られる。ＲＮＡ
転写物を用いると、免疫投与した宿主におけるＤＮＡの残留および取り込みを避
けることができる。

【００１３】ＲＳＶＦ蛋白をコードした裸のＳＦＶＲＮＡ、特にＲＳＶＦ蛋白の分泌
型を免疫投与するとＲＳＶに起因する疾病に対して免疫効果があることは本発明
以前には知られておらず、従来の技術に基づいて予測することはできなかった。
ＲＳＶに感染すると、重度の疾病が起こる。ＲＳＶによって起こる疾病を防御す
るためにワクチンを含む免疫原性調製物をｉｎｖｉｖｏ投与するための改良ベクターの提供は有用であり、望まれている。特に、老人および血清陰性乳幼児を
含む幼児に免疫を誘導し、防御効果があり、疾病を増強（免疫増強）しないワク
チンの提供が望まれている。（発明の要約）本発明は、呼吸合包体ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスを含むパラミクソウイルスによる疾病に対して免疫を与えるための新規な免疫原性物質およ
び当該新規物質を用いた免疫投与手順を提供するものである。特に、本発明は、パラミクソウイルス科の感染によって起こる疾病に対して有効なＲＮＡワクチン
を提供することを目的とするものである。

【００１４】本発明の一側面によると、少なくともアルファウイルスのＲＮＡゲノムの一部
を相補性を有する部分と、完全なアルファウイルスのＤＮＡゲノム複製領域の相補性を有する部分を有する第一のＤＮＡ配列と、パラミクソウイルス蛋白、また
はパラミクソウイルス蛋白と特異的に反応する抗体を生成する蛋白フラグメント（蛋白断片）をコードした第二のＤＮＡ配列とからなり、第二のＤＮＡ配列を複
製に必須ではない第一のＤＮＡ配列の領域に挿入し、第一および第二のＤＮＡ配
列がプロモーターの複写制御のもとにあるベクターを提供する。

【００１５】パラミクソウイルス蛋白は、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）および呼
吸合包体ウイルス（ＲＳＶ）からなる群から選ぶことができる。ＰＩＶ蛋白は、
ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２、ＰＩＶ−３またはＰＩＶ−４、特にＰＩＶ−３のＨＮ
またはＦ糖蛋白である。ＲＳＶ蛋白は、特にＲＳＶのＦまたはＧ糖蛋白であって
もよい。

【００１６】第二のＤＮＡ配列は、完全長ＲＳＶ蛋白をコードしてもよいし、膜透過アンカ
ー（transmembrane anchor）および細胞質テール（cytoplasmic tail）を欠くＲ
ＳＶＦ蛋白をコードしていてもよい。膜透過アンカーおよび細胞質テール領域
のコードを欠くことによって、ＲＳＶＦ蛋白の分泌型が得られる。

【００１７】第二のＤＮＡ配列は、ＲＳＶＦ蛋白をコードし、ＳｐｅＩ制限酵素切断部位（以下、制限部位と略称する場合がある）を欠くことが望ましく、膜透過アンカ
ーおよび細胞質テールコード領域を欠いていてもよい。ＳｐｅＩ制限部位の欠失
は、ＲＳＶＦ遺伝子のヌクレオチド１９４（Ｔ）のＣへの突然変異によって、
アミノ酸配列を変化させることなく、ＳｐｅＩを除去して調製する。突然変異を
起こさせたトランケートＲＳＶＦ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１、以下「配列識別番号１」と表記し、他の配列識別番号も同様に表記する。）およ
びコードアミノ酸配列（配列識別番号２）は、図２に示す。

【００１８】好ましくは、アルファウイルスはセムリキ森林ウイルス（Semliki Forest Vir us）で、第一のＤＮＡ配列はプラスミドｐＳＦＶ１に含まれるセムリキ森林ウイ
ルス配列である。用いるプロモーターは、ＳＰ６プロモーターであることが好ま
しい。

【００１９】ベクターは、第二のヌクレオチド配列を失うことなく、プロモーターの転写制
御のもとで第一および第二のヌクレオチド配列を維持しながら、ベクターの直線
化が可能なように独特な制限部位を含んでいてもよい。独特な制限部位は、Ｓｐ
ｅＩであることが好ましく、特にｐＳＦＶ１に由来することが好ましい。ベクタ
ーの直線型は、実施例で述べる。

【００２０】ベクターはプラスミドベクターであり、特に図１Ｃに示すようにプラスミドｐ
ＭＰ３７（ＡＴＣＣ９７９０５）の識別特性を有するものであることが好まし
く、プラスミドｐＭＰ３７が特に好ましい。

【００２１】ＲＳＶＦ蛋白またはそのフラグメントをコードした突然変異ＤＮＡ配列は、
ＲＳＶＦ蛋白と特異的に反応する抗体を誘導し、本来のＤＮＡ配列に存在する
ＳｐｅＩ制限部位を欠き、本発明の別の側面を構成する。本来の配列のＳｐｅＩ
部位を欠く当該突然変異ＤＮＡ配列は、図２（配列識別番号１）に示すもの、あ
るいは図２（配列識別番号２）に示すアミノ酸配列をコードしたものが望ましい
。

【００２２】ここに提供する新規ベクターは、特異的な制限部位で解裂することによって直
線とし、ＲＮＡ転写に転写する。本発明の別の側面によると、ここで直線化およ
び転写により製造して提供したようにベクターのＲＮＡ転写物を提供する。

【００２３】ここで提供するＲＮＡ転写物は、宿主においてパラミクソウイルス蛋白に対す
る抗体を誘導するために宿主にｉｎｖｉｖｏで投与するための免疫原性組成物の形態で提供することができる。当該免疫原性組成物は、その有効成分として、
ここで提供するＲＮＡ転写物からなる。本発明の別の側面にしたがって提供され
る当該免疫原性組成物は、ｉｎｖｉｖｏで投与するに適した薬理学的に許容される担体を用いて製剤することができ、防御免疫応答を誘導する。

【００２４】さらに本発明の別の側面によると、ここで提供するＲＮＡ転写物の有効量を宿
主に投与することからなるパラミクソウイルス感染疾病に対する免疫を宿主に賦
与する方法を提供する。

【００２５】また、本発明は、ＲＳＶＦ蛋白またはＲＳＶＦ蛋白のフラグメントをコー
ドし、呼吸合包体ウイルスの感染による疾病に対して宿主を防御するためにＲＳ
ＶＦ蛋白と特異的に反応する抗体を誘導する遺伝子を用いる新規な方法であっ
て、前記遺伝子を単離し、アルファウイルスのＲＮＡゲノムの少なくとも一部に相補性を有し、プラスミドベクターを形成するための複製には必須でない前記Ｄ
ＮＡ配列の部位におけるアルファウイルスの完全なＲＮＡゲノムの複写領域の相補体を有するＤＮＡ配列に前記遺伝子を効果的に結合させることからなり、前記
遺伝子およびＤＮＡ配列がプロモーターの転写制御のもとにあり、プラスミドベ
クターは直線化されるが、前記遺伝子およびＤＮＡ配列は依然として前記プロモ
ーターの転写制御のもとにあり、前記直線化ベクターのＲＮＡ転写物を形成し、
前記ＲＮＡ転写物を前記の宿主に導入することを特徴とする方法を含む。

【００２６】プラスミドベクターの直線化は、プラスミドベクターを特異的な制限部位、す
なわち遺伝子およびＤＮＡ配列がプロモーターの転写制御のもとに保たれるよう
な位置で除去することによって行う。特異的制限部位は、プラスミドｐＳＦＶ１
に由来するようなＳｐｅＩ部位であってもよい。

【００２７】用いるプラスミドベクターはプラスミドｐＭＰ３７であることが望ましく、直
線化段階はプラスミドｐＭＰ３７のＳｐｅＩ部位で解裂させることによって行う
（図１Ｃ参照）。

【００２８】さらに、本発明は、呼吸合包体ウイルス（ＲＳＶ）感染によって起こる疾病か
ら宿主を防御するためのワクチンの製造法であって、膜透過アンカーおよび細胞
質テールが存在せず、あらゆるＳｐｅＩ制限部位を欠くＲＳＶＦ蛋白をコード
した第一のＤＮＡ配列を単離し、アルファウイルスのＲＮＡゲノムの少なくとも
一部に相補性を有し、プラスミドベクターを形成するための複製には必須でない
第二のＤＮＡ配列の領域におけるアルファウイルスの完全なＲＮＡゲノムの複写
領域の相補体を有する前記第二のＤＮＡ配列に前記第一のＤＮＡ配列を効果的に
結合させることからなり、前記第一および第二のＤＮＡ配列がプロモーターの転
写制御のもとにあり、プラスミドベクターは直線化されるが、前記第一および第
二のＤＮＡ配列は依然として前記プロモーターの転写制御のもとにあり、前記直
線化ベクターのＲＮＡ転写物を形成し、ｉｎｖｉｖｏ投与のためのワクチンとして前記ＲＮＡ転写物を製剤することを特徴とする方法を含む。

【００２９】プラスミドベクターの直線化は、プラスミドベクターを特異的な制限部位、す
なわち遺伝子およびＤＮＡ配列がプロモーターの転写制御のもとに保たれるよう
な位置で除去することによって行う。特異的制限部位は、プラスミドｐＳＦＶ１
に由来するようなＳｐｅＩ部位であってもよい。

【００３０】用いるプラスミドベクターはプラスミドｐＭＰ３７であることが望ましく、直
線化段階はプラスミドｐＭＰ３７のＳｐｅＩ部位で解裂させることによって行う
。本発明の利点は、ｉｎｖｉｖｏ投与によって免疫反応を誘導する上で有用なＲＮＡ転写物を提供することを含む。

【００３１】以下の図面を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。

【００３２】（発明の一般的説明）上記のように、本発明は一般に直線化および直線化したベクターの転写によっ
てＤＮＡベクターから形成させたＲＮＡ転写物を用いてＲＮＡ免疫投与を行うこ
とによるパラミクソウイルス感染に起因する疾病から宿主を防御することに関す
る。特に、本発明は呼吸合包体ウイルス（ＲＳＶ）の感染による疾病から宿主を
防御することに関するが、特にこれに限るものではない。以下の説明は、特にＲ
ＳＶＦ蛋白およびそのフラグメントをコードし、ＲＳＶＦ蛋白と特異的に反
応する抗体を誘導するＤＮＡ配列およびＲＮＡ転写物について行う。

【００３３】本願では、“ＲＳＶＦ蛋白”という用語は天然の各種系統のＲＳＶおよびコ
ード遺伝子のＰＣＲ増幅を行い、免疫原性を維持しているものを含むアミノ酸配
列の異なる蛋白、膜透過アンカーおよび細胞質テールを欠くＲＳＶＦ蛋白の分
泌型、ならびにＲＳＶＦ蛋白と特異的に反応する抗体を誘導し、ＲＳＶＦ蛋
白と同様な機能を有するＲＳＶＦ蛋白のフラグメントを含む完全長ＲＳＶＦ
蛋白を規定するために用いる。本願で、第一の蛋白が第二の蛋白と免疫学的に関
連があるか、または同じ機能を有する限り、第一の蛋白は第二の蛋白と“機能的
に同じ”である。機能的相同体は、例えば蛋白のフラグメント、置換体、または
その付加または欠失変異体である。

【００３４】ベクターは、アルファウイルス特にセムリキ森林ウイルスのＲＮＡゲノムの少
なくとも一部と相補性を有する部分と、完全なアルファウイルスのＲＮＡゲノム
複写領域に相補性を有する部分を有する第一のＤＮＡ配列を含むように構築する
。第二のＤＮＡ配列はＲＳＶＦ蛋白をコードし、第一のＤＮＡ配列の複写には
必須でない領域に挿入する。第一および第二のＤＮＡ配列は、プロモーターの転
写制御下にある。得られたベクターは直線であり、この直線化ベクターからＲＮ
Ａ転写物を形成させる。

【００３５】ここで提供するＲＮＡ転写物は、これを投与した動物で認められたＲＶＦ蛋白
に特異的な抗体反応で明らかなように、ヒトを含む動物に投与すると、急速に複
写され、ｉｎｖｉｖｏでＲＳＶＦ蛋白の発現が起こる。当該抗体は、必要であれば、試料中のＲＳＶ蛋白の検出に使用することができる。

【００３６】以下の実施例で述べる結果からも明らかなように、ＲＮＡ転写物は高い抗−Ｆ
ＩｇＧ抗体力価を提供し、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は生のウイルスで免疫化し
た場合に得られる比に近い。ＲＮＡ転写物を免疫投与すると、生のＲＳＶを攻撃
投与した動物を保護する。

【００３７】当該分野の専門家にとっては、本発明の各種実施例がＲＳＶ感染のワクチン、
診断および治療の分野に適用できることを想定することは容易なことである。こ
のような用途の非限定的な考察を以下に示す。ワクチンの調製および使用ワクチンとして適当な免疫原性組成物は、ここで開示したＲＳＶＦ遺伝子お
よびベクターから調製することができる。当該ワクチンは、被験者に抗−ＲＳＶ
Ｆ抗体の生産を含む免疫反応を示す。ワクチンを含む免疫原性組成物は、ＲＮＡ
転写物を含み、ポリヌクレオチドを投与するための注射剤、生理学的に許容され
る液剤または乳剤として調製することができる。ＲＮＡ転写物はレシチンリボソ
ームまたは従来知られている核酸リボソーム等その他のリボソーム（例えば、Ｗ
Ｏ９３／２４６４０、参考文献３８）等のリボソームと混合するか、または以
下に詳しく述べるようにアジュバントと混合してもよい。カチオン性脂質からな
るリポソームは、ＤＮＡおよびＲＮＡ等のポリアニオンと自然に、容易に相互作
用してリポソーム／核酸複合体を形成し、ポリヌクレオチドを略奪する。さらに
、ポリアニオン性複合体は細胞膜と融合してポリヌクレオチドの細胞内供給が起
こり、ポリヌクレオチドがリポソームコンパートメントの分解酵素を迂回する。
ＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／２７４３５には、カチオン性脂質とポリヌクレオチ
ドからなる遺伝子免疫投与組成物が記載されている。細胞による核酸の取り込み
を助けるカルシウムイオン、ウイルス蛋白およびその他のトランスフェクション
助長剤等を使用すると有利である。

【００３８】また、ポリヌクレオチド免疫原性調製物は、生分解性の徐放性粒子を含むマイ
クロカプセルとして製剤することができる。例えば、米国特許第５，１５１，２
６４号には、ＢｉｏＶｅｃｔｅｕｒｓＳｕｐｒａＭｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ
ｓ（ＢＶＳＭ）と呼ばれるリン脂質／糖脂質／多糖類の性質を有する粒状担体が
記載されている。当該粒状担体は、生物活性を有する多くの分子をその層の一つ
に運ぶことを目的としている。

【００３９】米国特許第５，０７５，１０９号には、ポリ（ＤＬ−ラクチデコグリコライド
）を用い、抗体のトリニトロフェニル化キーホールリンペットヘモシアニンとス
タフィロコッカス腸炎毒Ｂを５０：５０の比でカプセル化する方法が開示されて
いる。カプセル化に用いるその他のポリマーとしては、ポリ（グリコライド）、
ポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコライド）、コポリオキサレート、ポリカプロラ
クトン、ポリ（ラクチド−コカプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポリ
オルソエステル、ポリ（８−ヒドロキシ酪酸）およびポリアンハイドライド等が
ある。

【００４０】ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／０６２８２号には、多くの生物付着性ミクロスフ
ェアと抗原とからなる運搬担体が記載されている。ミクロスフェアは、澱粉、ゼ
ラチン、デキストリン、コラーゲンまたはアルブミンである。この運搬担体は、
特に鼻粘膜によるワクチンの取り込みを目的にしている。運搬担体は、さらに吸
着促進剤を含んでいてもよい。

【００４１】ＲＮＡ転写物は、薬理学的に許容され、相容性のある添加物と混合してもよい
。当該添加物は、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール
およびそれらの混合物である。免疫原性組成物およびワクチンは、さらに湿展剤
または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバント等効果を増強するための補助剤
を含んでいてもよい。免疫原性組成物およびワクチンは、注射部位を局所麻酔剤
で前処置した後、皮下注射、静脈内注射、皮内注射または筋肉内注射等非経口的
に投与してもよい。さもなくば、本発明にしたがって調製した免疫原性組成物は
、粘膜表面に免疫反応を起こさせるように製剤化し、処置してもよい。すなわち
、免疫組成物を例えば経鼻的または経口的（胃内）経路で、粘膜表面に投与して
もよい。さもなくば、坐薬および経口製剤を含むその他の投与モードが望ましい
。坐薬のバインダーおよび担体としては、例えばポリアルカレングリコールまた
はトリグリセリドが含まれる。経口製剤は、通常用いられる添加剤、例えば医薬
品級のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウム等が含まれる。

【００４２】免疫原性組成物およびワクチンは、用量製剤に矛盾しないように治療的に有効
で、防御効果があり、免疫原性が得られる量で投与する。投与量は、例えば個人
のＲＳＶＦ蛋白およびそれに対する抗体を合成する免疫系の能力、および必要
であれば細胞仲介免疫反応を誘導する免疫系の能力を含み、治療対象患者によっ
て異なる。投与する有効成分の正確な量は、医師の判断による。しかし、適切な
用量範囲は当該技術分野の専門家であれば容易に決定することができ、ＲＳＶ
ＦＲＮＡとして約１μｇ〜約１０ｍｇである。１回目投与およびブースター投
与の投与方法も固定的ではなく、１回目投与後さらに数回投与してもよい。また
、用量は投与経路に依存するが、宿主の体重によっても異なる。１種類の病原菌
のみを防御するワクチンは、単価ワクチンである。数種類の病原菌に対して抗原
性を有するワクチンは複合ワクチンであり、本発明のワクチンもこれに属する。
当該複合ワクチンは、例えば各種病原菌、または同じ病原菌の各種系統、または
各種病原菌の組み合わせから得られた物質を含む。

【００４３】ベクターをアジュバント（一般にリン酸緩衝生理食塩水中０．０５〜０．１％
で使用）と一緒に投与すると、免疫原性は著しく改善される。アジュバントは抗
原の免疫原性を増強するが、それ自体は必ずしも免疫原性を有さない。アジュバ
ントは、投与部位の近くの局部に抗原を保持し、デポー効果によって免疫系の細
胞に抗原を徐々に、長時間放出する作用がある。また、アジュバントは免疫系の
細胞を抗原デポーに誘引し、これらの細胞を刺激して免疫応答を高める。

【００４４】免疫刺激剤またはアジュバントは、宿主の例えばワクチンに対する免疫応答を
高めるために長年使用されている。このように、アジュバントは抗原に対する免
疫応答を高めることが知られている。しかし、これらのアジュバントの一部は毒
性があり、望ましくない副作用を起こし、したがってヒトおよび多くの動物への
使用に適さないものがある。事実、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウ
ム（これらは包括して、アルムと呼ばれている）のみがヒトおよび家畜用ワクチ
ンのアジュバントとして定常的に使用されているに過ぎない。

【００４５】広い範囲の外因性アジュバントおよびその他の免疫調節剤が、抗原に対する強
い免疫応答を刺激する。これらには、サポニンと膜蛋白抗原を複合化した免疫刺
激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、鉱物油の深成ポリマー、マイコバクテリア死菌の鉱
物油懸濁液、フロイントの完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）お
よびリポ多糖類（ＬＰＳ）等の細菌産物、ならびにモノホリルリピドＡ、ＱＳ
２１およびポリホスファゼンが含まれる。

【００４６】本発明の特定の実施例では、ＲＳＶのＦ蛋白をコードした第一のヌクレオチド
配列からなるＲＮＡ転写物を、ベクターを標的とした標的分子とともに、免疫系
の細胞を含む特定の細胞に供給することもできる。

【００４７】ＲＮＡ転写物は、各種の手順で宿主に供給することができる。例えば、Ｔａｎ
ｇら（参考文献３９）は、仔ウシの成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードしたＤＮＡ
をコーティングした金の微放出体をマウスの皮膚に植入すると、マウスで抗−Ｂ
ＧＨ抗体が生産されることを開示している。一方、Ｆｕｒｔｈら（参考文献４０
）は、生きた動物の皮膚、筋肉、脂肪および乳腺組織の形質移入にジェットイン
ジェクターが使用できることを認めている。

【００４８】生物供託ＲＳＶＦ蛋白をコードした遺伝子を含み、ここで引用したある種のベクター
は、本発明の出願前に、ブタペスト条約にしたがってアメリカン・タイプカルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（10801 University Boulevard, Manassas, Ve
rginia 20110-2209,米国）に供託した。

【００４９】供託したプラスミドの試料は、本米国特許出願に基づく特許が確立した時点で
公開され、その時点で入手制限が解除される。ＡＴＣＣが同一物を分与できない
場合は、変化のないもので交換する。供託した実施例は発明を説明するためのも
のであり、ここで開示し、請求する発明は供託したプラスミドによってその範囲
を制限されるものではない。本願で開示したものと同等または相同な抗原をコー
ドした相同または同等のプラスミドは、本発明の範囲に含まれる。（供託の要約）プラスミドＡＴＣＣ番号供託日ｐＭＰ３７９７９０５１９９７年２月２７日（実施例）上記の開示は、本発明の一般的な説明である。以下の実施例を引用し、本発明
をさらに詳細に説明する。これらの実施例は説明のためのみであり、発明の範囲
を限定するためのものではない。態様の変更および同等なものとの置換は、状況
から容易に予想できるものとみなす。ここでは特殊な用語を用いるが、このよう
な用語は説明のために用いたものであり、発明を限定するためのものではない。

【００５０】分子遺伝学、蛋白生化学および免疫学的方法を用いたが、本開示では明確には
記載されていない。また、これらの実施例は科学文献に広く報告されており、当
該技術分野の専門家にとっては容易に実施できることである。実施例１この実施例では、ＲＳＶＦ遺伝子のトランケート型を含むセムリキ森林ウイ
ルス（ＳＦＶ）発現ベクターの構築を記載する。

【００５１】トランケート型ＲＳＶＦ遺伝子は、図１に示す手順にしたがってＳＦＶ発現ベクターｐＳＦＶ１に挿入する（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ、ＭＤ、米国）。ＲＳＶＦ遺伝子は、その開示内容を参考例としてここに引
用した関連米国特許出願第０８／００１，５５４号（１９９３年１月６日出願、
本出願人に譲渡）（参考文献４１、ＷＯ９３/１４２０７号）で詳細に記載されているように、臨床的に単離したＲＳＶサブタイプＡをプラスミドｐＲＳＶ
Ｆにクローン化したものであった。ＢｓｐＨＩおよびＥｃｏＲＩでプラスミドを
消化し、ＲＳＶＦ遺伝子フラグメントをプラスミドＲＳＶＦから切断した。
制限酵素ＢｓｐＨＩでＲＳＶＦ遺伝子のコード領域を切断し、Ｆ蛋白のＣ−末
端から４８アミノ酸を除去した。これらのアミノ酸は膜透過ドメインのほとんど
および細胞質テール全体を構成している。得られた１．６ＫｂのトランケートＲ
ＳＶＦ遺伝子フラグメントを、上記ＵＳＡＮ第０８／００１，５５４号（ＷＯ
９３／１４２０７）に記載されているように、以下の配列に基づくリンカーを
用いた三段階結紮でブルースクリプトベース哺乳類細胞発現ベクターｐＭＣＲ２
０のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＥＳ１３Ａを
得た。

【００５２】５′ＣＡＴＧＡＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＡＧ３′（配列識別番号３）
３′ ＴＧＡＡＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＡＧ５′（配列識別番号４）
このリンカーは、非テンプレートコードスレオニンをトランケートＲＳＶＦ蛋
白のＣ−末端に付加し、トランケート遺伝子の末端に連続した３つのストップコ
ドンを挿入する。

【００５３】ついで、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより、１．６Ｋｂのト
ランケートＲＳＶＦ遺伝子フラグメントをプラスミドｐＥＳ１３Ａから切除し
た。さらに３段階結紮を行い、以下の配列に基づいた別のリンカーによって１．
６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩＲＳＶＦ遺伝子フラグメントをＳＦＶ発現ベクターｐＳＦＶ１のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＭＰ３５
を得た。

【００５４】５′ＧＡＴＣＣＧＣＧＣＧＣＧＣＧ３′（配列識別番号５）
３′ ＧＣＧＣＧＣＧＣＧＣＴＴＡＡ５′（配列識別番号６）
このプラスミドは、１．６ＫｂのＢａｍＨＩＲＳＶＦ遺伝子フラグメント
のコピー２つを有する。このとき、ＳｐｅＩ部位がＲＳＶＦ遺伝子フラグメン
トのＢａｍＨＩ部位から１９３ｂｐ上流に存在していることを発見した。ｐＳＦ
Ｖ１に基づくプラスミドは、以下に記載するｉｎｖｉｔｒｏ転写反応に使用する前にＳｐｅＩで直線化する必要がある。したがって、ＲＳＶＦ遺伝子のＳｐ
ｅＩ部位を除去する必要があり、これは以下のように行った。

【００５５】ＢａｍＨＩで消化することによりプラスミドｐＭＰ３５から１．６Ｋｂのトラ
ンケートＲＳＶＦ遺伝子フラグメントを切除し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位
に結紮してプラスミドｐＭＰ３６を得た。トランスホーマー^TM部位−指向突然変
異キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ、米国）およびプラ
イマー５′−ＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＡＣＣＡＧＴＧＴＴＡＴＡＡＣＴ（配列識
別番号７）を製造業者の指針にしたがって使用し、ヌクレオチド１９４をＴから
Ｃに変更した。この変更によって、コードしたＲＳＶＦ蛋白のアミノ酸配列に
影響をおよぼすことなく、ＲＳＶＦ遺伝子のＳｐｅＩ部位を除去した。修正Ｒ
ＳＶＦ遺伝子を含むプラスミドｐＭＰ３６Ａの配列を、ＤＮＡ配列分析で測定
した。ＢａｍＨＩで消化して１．６ＫｂトランケートＲＳＶＦ遺伝子フラグメ
ントをプラスミドｐＭＰ３６Ａから切除し、ｐＳＦＶ１のＢａｍＨＩ部位に結紮
し、プラスミドｐＭＰ３７を得た（ＡＴＣＣ９７９０５）。トランケートＲＳ
ＶＦ遺伝子が適切に定位していることは、制限マップの作成およびＤＮＡ配列
分析によって確認した。図２は、ＳｐｅＩ部位が除去され、分泌ＲＳＶＦ蛋白
のアミノ酸配列がコードされたトランケートＲＳＶＦ遺伝子のＢａｍＨＩフラ
グメントのヌクレオチド配列（配列識別番号１）を示す。

【００５６】Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、米国）製プラスミドＤＮＡミド
キットを用い、製造業者の指針にしたがってプラスミドＤＮＡを精製した。実施例２この実施例では、ｉｎｖｉｔｒｏ転写反応でＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡの生成に必要とするＳｐｅＩ直線化ｐＭＰ３７の調製およびＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮ
Ａの調製を記載する。

【００５７】２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭのＫＣｌおよび３０単位のＳｐｅＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ、ＭＤ、米国）を含む反応液１００μＬ中で、実施例１に記載したように
調製したプラスミドｐＭＰ３７２０μｇをＳｐｅＩで切断した。

【００５８】以下の材料を用い、３００μＬのｉｎｖｉｔｒｏ転写反応液中で、直線化プ
ラスミドからＳＦＶ−ＲＮＡを調製した。

【００５９】４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）６ｍＭのＭｇＣｌ₂ ２ｍＭのスーパーミジン−（ＨＣｌ）₃ １ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレオノール）１ｍＭのＡＴＰ（アデノシン三リン酸）１ｍＭのＧＴＰ（グアノシン三リン酸）１ｍＭのＣＴＰ（シチジン三リン酸）１ｍＭのＵＴＰ（ウリジン三リン酸）１ｍＭのｍ⁷Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）ＧＲＮＡキャップアナログ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔ．、
カナダ）３６０単位のＲＮａｓｉｎR酵素阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）２７０単位のＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ（ＧｉｂｃｏＢ
ＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、米国）反応混合液を、３７℃で５０分間インキュベーションした。ＣＨＲＯＭＡＳ
ＰＩＮ^TM−２００ＤＥＰＣ−Ｈ₂Ｏカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ、米国）に反応混合液を通し（７５μＬ／カラム）、製造業者の
指針にしたがって、このようにして調製したＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡを精製し
た。

【００６０】ついで、精製したＲＮＡを免疫投与直前に等量の２ＸＰＢＳと混合した。実施例３この実施例では、ＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡのマウスに対する免疫投与および
得られた免疫原性結果を記載する。

【００６１】マウスはＲＳＶ感染に敏感であり（参考文献４２）、信頼性の高い動物モデル
であることがすでに明らかにされている。実施例２に記載したように調製したＳ
ＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡを、筋肉内（ｉ．ｍ．）経路によりマウスに免疫投与し
た。ＢＡＬＢ／ｃ系マウス５匹（雌、６〜８週齢）（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂ．
，ＢａｒＨａｒｂｏｕｒ、ＭＥ、米国）の前脛骨筋の両側に、ＰＢＳ−指向性
ＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡを２ｘ２５μｇ（０．５μｇ/μＬ）の用量で注射した。ＲＮＡ免疫投与の５日前に、カージオトキシン（ＰＢＳ中１０μＭ）（Ｌａ
ｔｏｘａｎ、フランス）２ｘ５０μＬを筋肉に処置した。カージオトキシンを筋
肉に処置するとＤＮＡの吸収が促進され、免疫応答が高くなるが知られている（
参考文献４３）。４週間後に、これらのマウスに同様な方法でブースター投与し
た（下表１）。対照群には、（１）ＳＦＶＲＮＡ発現β−ガラクトシダーゼ（
ＳＦＶ−ＬａｃＺＲＮＡ）、（２）ここで調製したＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡ
、（３）ＲＳＶ生菌、（４）アルム含有ＰＢＳおよびアルム含有ＲＳＶサブユニ
ット調製物を免疫投与した。また、これらのマウスには、４週間後に同様にブー
スター投与した（表１）。ＲＳＶＦ、ＧおよびＭ蛋白からなるＲＳＶサブユニ
ット調製物は、その開示内容をここで参考例として引用した関連米国特許出願第
０８／６７９，０６０号（１９９６年７月１２日出願、本出願人に譲渡）に記載
されている（ＷＯ９８／０２４５７）。

【００６２】２回目の免疫投与から２週間後に、ＲＳＶのＡ２株（ＢＧ→４Ａ）１０⁶プラーク形成単位をマウスの鼻腔内に攻撃投与した。４日後に、動物を屠殺した。無
菌的に肺を摘出し、重量を測定し、完全培養培地２ｍＬとともにホモジナイズし
た。すでに報告されている方法（参考文献４４）にしたがい、ベロ細胞を用い、
３反復で肺ホモジネート中のウイルス力価を測定した。

【００６３】４および６週間後にマウスから血清を採取し、実施例４に記載したように酵素
結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）でこれら血清中の抗−ＲＳＶＦ抗体力価（Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）を測定した。すでに報告されている方法（参考
文献４４）にしたがい、これら血清のＲＳＶ−特異性プラーク減数力価を測定し
た。

【００６４】表１に示したように免疫投与したＢＡＬＢ／ｃ系マウス血清の抗−ＲＳＶＦ
抗体反応を図３に要約する。ＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡ、ＲＳＶ生菌、またはＲ
ＳＶサブユニット調製物＋アルムを免疫投与した動物では、４および６週で血清
中の総抗−ＲＳＶＦＩｇＧ抗体力価が高かった（図３，パネルＡ）。しかし
、図３のパネルＢおよびＣから明らかなように、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａの比には
顕著な差が認められた。ＲＳＶ生菌を免疫投与した動物の血清では、６週間後の
抗−ＦＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比が約０．６９であった。この値は、アルム−ア
ジュバント添加ＲＳＶサブユニット調製物を一次およびブースター投与したマウ
スから６週間後に得られた抗−ＲＳＶＦＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比と対称的で
あった。この場合、抗−ＲＳＶＦＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は約４．３であっ
た。ＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡを免疫投与したマウスから６週間後に得られた抗
−ＲＳＶＦＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は、０．７９であった。これらの結果は
、ＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡをマウスに免疫投与すると、アルム−アジュバント
添加ＲＳＶサブユニット調製物で認められるＴｈ−２型の反応よりも、ＲＳウイ
ルス生菌で得られる反応と同様にＴｈ−１型の反応が高くなることを示唆してい
る。

【００６５】図４に示したように、表１に示した各種ＲＳＶ調製物を一次およびブースター
投与したマウスの血清では、いずれも顕著な濃度のＲＳＶ−特異性中和抗体が認
められた（群２、３および５）。プラセボ対照動物とは対称的に、ＳＦＶ−ＲＳ
ＶＦＲＮＡ、ＲＳＶ生菌またはアルム−アジュバント添加ＲＳＶサブユニット
調製物を免疫投与したマウスでは、表２に示すようにＲＳウイルス生菌の攻撃投
与に対する下気道の完全な防御が認められた。

【００６６】ＳＦＶ−ＲＳＶＦＲＮＡをマウスに免疫投与すると、ＲＳＶ生菌の攻撃投与
に対するマウスの防御が認められた。このＳＦＶレプリコンの防御能は、ＲＳＶ
生菌またはアルム−アジュバントＲＳＶサブユニットの接種で誘導される防御能
と同等であった。得られた免疫反応の型は、ＲＳＶ生菌で発現する免疫反応の型
と同様にＴｈ−１様反応が高かった。実施例４この実施例では、抗−ＲＳＶＦ抗体力価の測定を記載する。

【００６７】免疫アフィニティー精製ＲＳＶＦ蛋白２．５ｎｇを０．０５Ｍ炭酸−重炭酸
緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、室温で一夜Ｎｕｎｃ−ＭａｘｉＳｏｒｐプレ
ートのウエルをコーティングした。ＰＢＳ中０．１％のＢＳＡを室温で３０分間
ウエルに添加した後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋０．１％ツイン２０洗浄用緩衝
液で２回洗浄し、ウエルの非特異的結合をブロックした。マウス血清を２倍また
は４倍に連続希釈し、ウエルに添加した。室温で１時間インキュベーションした
後、洗浄用緩衝液でプレートを５回洗浄し、洗浄用緩衝液で最適濃度に希釈した
ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抱合体を添加した。総Ｉ
ｇＧ検定には、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＩｎｃ．（ＢａｌｔｉｍｏｒｅＭＤ、米国）製Ｆ（ａｂ′）₂ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ特異性）−ＨＲＰを用いた。ＩｇＧ１の検定にはＳｅ
ｒｏｔｅｃ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）製ヒツジ抗マウスＩｇ
Ｇ１−ＨＲＰを用い、ＩｇＧ２ａの検定にはＣａｌｔａｇＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ（ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）製ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ
を用いた。室温で１時間インキュベーションした後、洗浄用緩衝液でプレートを
５回洗浄し、テトラメチルベンズイミドの存在下で過酸化水素（基質）を添加し
た。反応は、２Ｍの硫酸を添加して停止させた。ＭｕｌｔｉｓｃａｎＴｉｔｅ
ｒｔｅｋプレートリーダーを用い、吸光度（ＯＤ）４５０ｎｍで比色した。力価
は、ＯＤが約２倍になる最終希釈率の逆数とした。このＯＤは、最初の希釈時に
検定の陰性対照よりも高くなければならない。陰性対照には、各動物の免疫投与
前の血清を用いた。

【００６８】開示の要約この開示を要約すると、パラミクソウイルス蛋白、特にＲＳＶＦ蛋白をコー
ドしたＤＮＡ配列を含み、ｉｎｖｉｖｏ投与のために直線化し、ＲＮＡに転写されたベクターであって、パラミクソウイルス、特に呼吸合包体ウイルスの感染
によって起こる疾病に対する防御免疫反応を誘導する新規なベクターを提供する
。本発明の範囲で、改良が可能である。

【００６９】

【表１】

【００７０】

【表２】

【００７１】文献リスト

【００７２】

【表３】

【００７３】

【表４】

【００７４】

【表５】

【図面の簡単な説明】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/135 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 BA51 BA80 CA04 CA10 CA11 EA04 FA02 4B065 AA90X AA95Y AB01 BA02 CA24 CA45 4C085 AA03 BA57 DD62 DD63 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB33 4H045 AA10 BA10 CA01 DA86 EA31 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部を補い、ア
ルファウイルスＲＮＡゲノムの完全な複製領域の補体を有する第一のＤＮＡ配列
と、パラミクソイルス蛋白またはパラミクソイルス蛋白と特異的に反応する抗体
を誘導する蛋白フラグメントをコードした第二のＤＮＡ配列とからなり、前記第
二のＤＮＡ配列が前記第一のＤＮＡ配列の複製には必須でない領域に挿入されて
おり、前記の第一および第二のＤＮＡ配列がプロモーターの転写制御のもとにあ
るベクター。
【請求項２】前記のパラミクソイルス蛋白がパラインフルエンザウイルス
（ＰＩＶ）蛋白または呼吸合包ウイルス（ＲＳＶ）蛋白であることを特徴とする
請求項１に記載のベクター。
【請求項３】前記のパラミクソイルス科の蛋白がＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２
、ＰＩＶ−３、またはＰＩＶ−４蛋白から選んだＰＩＶ蛋白であることを特徴と
する請求項２に記載のベクター。
【請求項４】ＰＩＶ蛋白がＰＩＶ−３のＨＮまたはＦ糖蛋白であることを
特徴とする請求項３に記載のベクター。
【請求項５】前記のパラミクソイルス科の蛋白がＲＳＶ蛋白であることを
特徴とする請求項２に記載のベクター。
【請求項６】前記のＲＳＶ蛋白がＲＳＶのＦまたはＧ糖蛋白であることを
特徴とする請求項５に記載のベクター。
【請求項７】前記の第二のＤＮＡ配列が完全長ＲＳＶＦ蛋白をコードして
いることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項８】前記の第二のＤＮＡ配列が膜透過アンカーおよび細胞質テー
ルを欠くＲＳＶＦ蛋白をコードしていることを特徴とする請求項１に記載のベ
クター。
【請求項９】前記の第二のＤＮＡ配列がＲＳＶＦ蛋白をコードし、Ｓｐ
ｅＩ制限領域を欠くことを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項１０】前記の第二のＤＮＡ配列がＲＳＶＦ蛋白をコードし、Ｓ
ｐｅＩ制限領域を欠き、膜透過アンカーおよび細胞質テールコード領域を欠くこ
とを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項１１】ＲＳＶＦ遺伝子のＳｐｅＩ部位を除去するためにＲＳＶ
Ｆ遺伝子のヌクレオチド１９４（Ｔ）がＣに突然変異していることを特徴とす
る請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】前記のアルファウイルスがセムリキ森林ウイルスであるこ
とを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項１３】前記の第一のＤＮＡ配列がプラスミドｐＳＦＶ１に含まれ
るセムリキ森林ウイルス配列であることを特徴とする請求項１２に記載のベクタ
ー。
【請求項１４】前記のプロモーターがＳＰ６プロモーターであることを特
徴とする請求項１２に記載のベクター。
【請求項１５】プラスミドベクターが第二のＤＮＡ配列を除去することな
くベクターの直線化を可能にする独特な制限部位を有することを特徴とする請求
項１に記載のベクター。
【請求項１６】独特な制限部位がＳｐｅＩ部位であることを特徴とする請
求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】ＳｐｅＩ部位がプラスミドｐＳＦＶ１に由来することを特
徴とする請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】ベクターが直線型である請求項１に記載のベクター。
【請求項１９】図１Ｃに示すプラスミドｐＭＰ３７（ＡＴＣＣ９７９０
５）の特徴を有する請求項１に記載のベクター。
【請求項２０】ベクターがプラスミドｐＭＰ３７（ＡＴＣＣ９７９０５
）である請求項１に記載のベクター。
【請求項２１】ＲＳＶＦ蛋白またはＲＳＶＦ蛋白と特異的に反応する
抗体を誘導することができるそのフラグメントをコードし、非突然変異配列に存
在するＳｐｅＩ制限部位がａｂｏｕｔである突然変異ＤＮＡ配列。
【請求項２２】膜透過アンカーおよび細胞質テールコード領域を欠く請求
項２１に記載の突然変異ＤＮＡ配列。
【請求項２３】非突然変異ＲＳＶＦ遺伝子のＳｐｅＩ部位を除去するた
めに非突然変異ＲＳＶＦ遺伝子のヌクレオチド１９４（Ｔ）がＣに突然変異し
ていることを特徴とする請求項２１に記載の突然変異体。
【請求項２４】非突然変異配列に存在するＳｐｅＩ部位を欠き、トランケ
ートＲＳＶＦ蛋白をコードし、図２に示すＤＮＡ配列（配列識別番号１（ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１））または図２に示すアミノ酸配列（配列識別番号２）をコ
ードしたＤＮＡ配列を有する突然変異ＤＮＡ分子の配列。
【請求項２５】請求項１に記載するベクターのＲＮＡ転写物。
【請求項２６】請求項１に記載するプラスミドベクターをベクターに存在
する独特な制限部位で直線化することに由来し、第二のＤＮＡ配列を除去するこ
となくベクターの直線化を可能にし、直線化ベクターの転写を行う請求項２５に
記載のＲＮＡ転写物。
【請求項２７】独特な制限部位がＳｐｅＩ部位であることを特徴とする請
求項２６に記載のＲＮＡ転写物。
【請求項２８】前記ベクターにおいて、前記の第二のＤＮＡ配列がパライ
ンフルエンザウイルス（ＰＩＶ）蛋白または呼吸合包体ウイルス（ＲＳＶ）蛋白
のいずれかをコードしていることを特徴とする請求項２５に記載のＲＮＡ転写物
。
【請求項２９】前記ベクターにおいて、前記の第二のＤＮＡ配列がＰＩＶ
−１、ＰＩＶ−２、ＰＩＶ−３またはＰＩＶ−４のいずれかであるパラミクソイ
ルス科蛋白をコードしていることを特徴とする請求項２８に記載のＲＮＡ転写物
。
【請求項３０】前記ベクターにおいて、前記の第二のＤＮＡ配列がＰＩＶ
−３のＨＮまたはＦ糖蛋白のいずれかであるパラミクソイルス科蛋白をコードし
ていることを特徴とする請求項２９に記載のＲＮＡ転写物。
【請求項３１】前記ベクターにおいて、前記の第二のＤＮＡ配列がＲＳＶ
蛋白をコードしていることを特徴とする請求項２８に記載のＲＮＡ転写物。
【請求項３２】前記ベクターにおいて、ＲＳＶ蛋白がＲＳＶのＦまたはＧ
糖蛋白であることを特徴とする請求項３１に記載のＲＮＡ転写物。
【請求項３３】前記ベクターにおいて、前記第二のＤＮＡ配列が完全長Ｒ
ＳＶＦ蛋白をコードしていることを特徴とする請求項２５に記載のＲＮＡ転写
物。
【請求項３４】前記ベクターにおいて、前記第二のＤＮＡ配列が膜透過ア
ンカーおよび細胞質テールを欠くＲＳＶＦ蛋白をコードしていることを特徴と
する請求項２５に記載のＲＮＡ転写物。
【請求項３５】前記ベクターにおいて、前記第二のＤＮＡ配列がＲＳＶ
Ｆ蛋白をコードし、ＳｐｅＩ制限部位を欠くことを特徴とする請求項２５に記載
のＲＮＡ転写物。
【請求項３６】前記ベクターにおいて、前記第二のＤＮＡ配列がＲＳＶ
Ｆ蛋白をコードし、ＳｐｅＩ制限部位を欠き、膜透過アンカーおよび細胞質テー
ルのコード領域を欠くことを特徴とする請求項２５に記載のＲＮＡ転写物。
【請求項３７】前記ベクターにおいて、在来ＲＳＶＦ遺伝子のＳｐｅＩ
部位を除去するためにＲＳＶＦ遺伝子のヌクレオチド１９４（Ｔ）がＣに突然
変異していることを特徴とする請求項３６に記載のＲＮＡ転写物。
【請求項３８】前記ベクターにおいて、前記のアルファウイルスがセムリ
キ森林ウイルスであることを特徴とする請求項２５に記載のＲＮＡ転写物。
【請求項３９】前記ベクターにおいて、前記の第一のＤＮＡ配列がプラス
ミドｐＳＦＶ１に含まれるセムリキ森林ウイルス配列であることを特徴とする請
求項３８に記載のＲＮＡ転写物。
【請求項４０】前記ベクターにおいて、前記のプロモーターがＳＰ６プロ
モーターであることを特徴とする請求項３８に記載のＲＮＡ転写物。
【請求項４１】前記ベクターが図１Ｃに示すプラスミドｐＭＰ３７（ＡＴ
ＣＣ９７９０５）の特徴を有することを特徴とする請求項２５に記載のＲＮＡ
転写物。
【請求項４２】前記ベクターがプラスミドｐＭＰ３７（ＡＴＣＣ９７９
０５）であることを特徴とする請求項２５に記載のＲＮＡ転写物。
【請求項４３】宿主にパラミクソイルス科蛋白に対する抗体を誘導するた
めに宿主にｉｎｖｉｖｏ投与するための免疫原性組成物であって、その有効成分として請求項２５に記載したＲＮＡ転写物からなる組成物。
【請求項４４】宿主に防護抗体を誘導するための請求項４３に記載の免疫
原性組成物。
【請求項４５】パラミクソイルスの感染によって起こる疾病に対する免疫
を宿主に賦与する方法であって、請求項２５に記載したＲＮＡ転写物の有効量を
宿主に投与することからなる方法。
【請求項４６】ＲＳＶＦ蛋白をコードした遺伝子を用いる方法であって
、前記遺伝子を単離し、アルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部を補い
、プラスミドベクター形成の複写には必須でない前記ＤＮＡ配列の領域にアルフ
ァウイルスＲＮＡゲノムの完全な複製領域の補体を有するＤＮＡ配列と前記遺伝
子をプロモーターの転写制御下にあるように結合させ、前記遺伝子とＤＮＡ配列
をプロモーターの転写制御下に保ちながらプラスミドベクターを直線化し、前記
直線化ベクターのＲＮＡ転写物を形成させ、前記ＲＮＡ転写物を前記宿主に導入
することからなる方法。
【請求項４７】遺伝子およびＤＮＡ配列をプロモーターの転写制御下に保
たれるような独特の制限部位でプラスミドベクターを除去することによって、前
記プラスミドベクターの直線化を行うことを特徴とする請求項４６に記載の方法
。
【請求項４８】独特な制限部位がＳｐｅＩ部位であることを特徴とする請
求項４７に記載の方法。
【請求項４９】前記ベクターがプラスミドｐＭＰ３７（ＡＴＣＣ９７９
０５）であそのＳｐｅＩ部位で解裂することにより直線化を行うことを特徴とす
る請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】呼吸合包体ウイルス（ＲＳＶ）感染によって起こる疾病か
ら宿主を防御するためのワクチンの製造法であって、ＲＳＶＦ蛋白をコードし
、膜透過アンカーおよび細胞質テールを含まず、ＳｐｅＩ制限部位を欠く第一の
ＤＮＡ配列を単離し、アルファウイルスＲＮＡゲノムの少なくとも一部を補い、
プラスミドベクター形成の複写には必須でない前記ＤＮＡ配列の領域にアルファ
ウイルスＲＮＡゲノムの完全な複製領域の補体を有するＤＮＡ配列と前記遺伝子
をプロモーターの転写制御下にあるように結合させ、前記遺伝子とＤＮＡ配列を
プロモーターの転写制御下に保ちながらプラスミドベクターを直線化し、前記直
線化ベクターのＲＮＡ転写物を形成させ、前記ＲＮＡ転写物をｉｎｖｉｖｏ投与用ワクチンに製剤することからなる方法。
【請求項５１】遺伝子およびＤＮＡ配列をプロモーターの転写制御下に保た
れるような独特の制限部位でプラスミドベクターを除去することによって、前記
プラスミドベクターの直線化を行うことを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】独特な制限部位がＳｐｅＩ部位であることを特徴とする請求
項５１に記載の方法。
【請求項５３】前記ベクターがプラスミドｐＭＰ３７（ＡＴＣＣ９７９０
５）であり、ＳｐｅＩ部位で解裂することにより直線化を行うことを特徴とする
請求項５０に記載の方法。