DE69731659T3 - Impfstoffzubereitung bestehend aus untereinheiten des respiratorischen synzytialvirus (rsv) - Google Patents

Impfstoffzubereitung bestehend aus untereinheiten des respiratorischen synzytialvirus (rsv) Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie und ist insbesondere auf Impfstoffzubereitungen gegen respiratorische Syncytialvirusinfektion gerichtet.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Humaner respiratorischer Syncytialvirus ist die Hauptursache von Infektionen des niederen Atmungstrakts bei Kleinkindern und kleinen Kindern (siehe 1 bis 3 – einer Liste von Literaturstellen, die am Ende der Offenbarung erscheint, und jede von den Literaturstellen in der Liste ist hierin durch Hinweis dafür einbezogen). Weltweit gibt es jährlich 65 Millionen Infektionen, die zu 160 000 Todesfällen führen (Literatur 4). Allein in den USA kann in einem einzigen Jahr für 100 000 Kinder ein Krankenhausaufenthalt erforderlich werden, wegen Lungenentzündung und Bronchitis, die durch RS-Virus verursacht werden (Literatur 5, 6). Die stationäre und ambulante Versorgung von Kindern mit RS-Virusinfektionen übersteigt in den USA jährlich die Kosten von 340 Millionen $ (Literatur 7). Schwerere Erkrankung des unteren Atmungstrakts aufgrund von RS-Virusinfektion tritt vorwiegend bei Kleinkindern im Alter von zwei bis sechs Monaten auf (Literatur 8). Ungefähr 4 000 Kinder in den USA sterben jährlich an den Komplikationen, die aus schwerer Atmungstrakterkrankung, die durch Infektion mit RS-Virus und Virus vom Parainfluenzatyp 3 (PIV-3) verursacht wird, erwachsen. Die Impfanweisungskomitees der Weltgesundheitsorganisation (WHO) und des Nationalen Instituts von Allergie- und Infektionskrankheiten-(NIAID) haben das RS-Virus auf den zweiten Platz nach HIV zur Impfstoffentwicklung eingestuft.
  • Die Struktur und Zusammensetzung von RSV wurde geklärt und wird im Einzelnen in dem Lehrbuch „Fields Virology", Fields, B. N. et al., Raven Press, N. Y. (1996), insbesondere Kapitel 44, Seiten 1313–1351, „Respiratory Syncytial Virus" von Collins, P., McIntosh, K. und Chanock, R. M. beschrieben (Literatur 9).
  • Die zwei Hauptschutzantigene von RSV sind die Entwicklungsfusions-(F)- und Bindungs-Glycoproteine (G) (Literatur 10). Das F-Protein wird als ein etwa 68 kDa Vorstufenmolekül (F0) synthetisiert, das in Disulfid-gebundene F1-(etwa 48 kDa) und F2-(etwa 20 kDa)-Polypeptidfragmente proteolytisch gespalten wird (Literatur 11). Das G-Protein (etwa 33 kDa) ist stark O-glycosyliert, was ein Glycoprotein von scheinbarem Molekulargewicht von etwa 90 kDa (Literatur 12) ergibt. Zwei breite Untertypen von RS-Virus wurden als A und B definiert (Literatur 13). Die antigenen Hauptunterschiede zwischen diesen Untertypen werden in dem G-Glycoprotein gefunden, während das F-Glycoprotein konservierter ist (Literatur 7, 14).
  • Zusätzlich zu der Antikörperreaktion, die durch die F- und G-Glycoproteine erzeugt wird, wurde von humancytotoxischen T-Zellen, die durch RSV-Infektion erzeugt werden, gezeigt, dass sie RSV-F-Protein, Matrixprotein M, Nucleoprotein N, kleines hydrophobes Protein SH und das nicht-strukturelle Protein lb erkennen (Literatur 15).
  • Ein sicherer und wirksamer RSV-Impfstoff ist nicht verfügbar und wird dringend benötigt. Ansätze für die Entwicklung von RSV-Impfstoffen haben Inaktivierung von Virus mit Formalin (Literatur 16), Isolierung von kalt-angepassten und/oder temperaturempfindlichen Mutantenviren (Literatur 17) und gereinigten F- oder G-Glycoproteinen (Literatur 18, 19, 20) eingeschlossen. Klinische Versuchsergebnisse haben gezeigt, dass sowohl lebende abgeschwächte bzw. attenuierte als auch Formalin-inaktivierte Impfstoffe Impfstoffe gegen RSV-Infektion nicht hinreichend schützen (Literatur 21 bis 23). Probleme, die mit abgeschwächten kalt-angepassten und/oder temperaturempfindlichen RS-Virusmutanten, die intranasal verabreicht werden, auftreten, schlossen klinische Morbidität, genetische Instabilität und Überabschwächung ein (Literatur 24 bis 26). Ein Lebend-RS-Virusimpfstoff, der subkutan verabreicht wird, war auch nicht wirksam (Literatur 27). Inaktivierte RS-virale Impfstoffe wurden typischerweise unter Verwendung von Formaldehyd als dem Inaktivierungsmittel hergestellt. Murphy et al. (Literatur 28) haben Daten auf die Immunreaktion von Kleinkindern und Kindern, die mit Formalin-inaktiviertem RS-Virus immunisiert wurden, angeführt. Kleinkinder (2 bis 6 Monate im Alter) entwickelten einen hohen Titer von Antikörpern zu dem F-Glycoprotein, hatten jedoch eine schlechte Reaktion auf das G-Protein. Ältere Individuen (7 bis 40 Monate im Alter) entwickelten Titer von F- und G-Antikörpern, die mit jenen bei Kindern vergleichbar waren, welche mit RS-Virus infiziert waren. Jedoch entwickelten sowohl Kleinkinder als auch Kinder einen niedrigen neutralisierenden Antikörperspiegel als Personen vergleichbaren Alters mit natürlichen RS-Virusinfektionen. Die nichtausgeglichene Immunreaktion kann bei hohen Titern von Antikörpern zu den hauptimmunogenen RS-Virusproteinen F-(Fusions)- und G-(Bindungs)-Proteinen, jedoch einem niedrigen neutralisierenden Antikörpertiter, teilweise aufgrund von Änderungen von wichtigen Epitopen in den F- und G-Glycoproteinen durch die Formalinbehandlung vorliegen. Weiterhin entwickelten einige Kinder, die den Formalin-inaktivierten RS-Virusimpfstoff empfingen, eine schwerere Erkrankung des unteren Atmungstrakts nach anschließender Exposition von natürlichem RS-Virus als nicht-immunisierte Personen (Literatur 22, 23). Die Formalin- inaktivierten RS-Virusimpfstoffe wurden deshalb als unannehmbar zur Humanverwendung betrachtet.
  • Klarheit einer anormalen Immunreaktion war auch bei Baumwollratten ersichtlich, die mit Formalin-inaktiviertem RS-Virus immunisiert wurden (Literatur 29). Weiterhin zeigte auch Bewertung von RS-Virus-Formalin-inaktiviertem Impfstoff bei Baumwollratten, dass nach Lebendvirusreizung immunisierte Tiere verstärkte pulmonare Histopathologie entwickelten (Literatur 30).
  • Der Mechanismus der Erkrankungspotenzierung, die durch Formalin-inaktivierte RS-Virusimpfstoffzubereitungen verursacht wurde, bleibt zu definieren, jedoch ist es bei der Entwicklung eines wirksamen RS-Virusimpfstoffs ein Haupthindernis. Die Potenzierung kann teilweise aufgrund der Wirkung von Formalin auf die F- und G-Glycoproteine vorliegen. Außerdem wurde ein Nicht-RS-Virus-spezifischer Mechanismus für die Erkrankungspotenzierung vorgeschlagen, worin eine immunologische Reaktion auf verunreinigende zelluläre oder Serumkomponenten, die in der Impfstoffzubereitung vorliegen, teilweise zu der verschlimmernden Erkrankung beitragen könnten (Literatur 31). Tatsächlich entwickelten Mäuse und Baumwollratten, die mit einem Lysat von HEp-2-Zellen beimpft wurden und mit RS-Virus, gewachsen auf HEp-2-Zellen, gereizt wurden, eine erhöhte entzündliche Luftwegsreaktion.
  • Weiterhin waren RS-Virus-Glycoproteine, die durch Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung von Elution bei saurem pH-Wert gereinigt wurden, immunogen und schützend, jedoch induzierten sie auch Immunopotenzierung bei Baumwollratten (Literatur 29, 32).
  • In dem Beitrag von Mary E. Ewasyshyn und Michel H. Klein (Vaccine Research, Band 2, Nummer 4, 1993, Seite 263–272), welcher sich mit den Aussichten für eine Immunisierung gegen respiratorischen Syncytialvirus befasst, wird ausgeführt, dass es einen dringenden Bedarf zum Entwickeln eines sicheren und wirksamen Impfstoffs gibt, der in der Lage ist, Kleinkinder und junge Kinder gegen die schweren Atmungstraktinfektionen, die durch respiratorischen Syncytialvirus (RSV) verursacht werden, zu schützen und dass es bis jetzt noch nicht möglich ist, eine Strategie auszuwählen, die eine Impfstoffzubereitung ergibt, welche für die klinische Bewertung von seronegativen Kleinkindern geeignet ist. Dies wird fortgesetztes Bestreben nach einem vielseitigen Ansatz zur RSV-Impfstoffentwicklung erfordern.
  • Es verbleibt deutlich ein Bedarf für immunogene Zubereitungen, einschließlich Impfstoffe, die nicht nur beim betreffenden Schutz gegen die Erkrankung wirksam sind, welche durch RSV verursacht wurde, sondern auch keine unerwünschten Nebenwirkungen erzeugen, wie Immunopotenzierung. Es gibt auch einen Bedarf für Antigene zum Diagnostizieren von RSV-Infektion und Immunogene für die Erzeugung von Antikörpern (einschließlich monoklonalen Antikörpern), die spezifisch RSV-Proteine zur Verwendung, beispielsweise bei der Diagnose von durch RS-Virus verursachte Erkrankung, erkennen.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Erzeugung eines respiratorischen Syncytialvirus (RSV) auf einer Impfstoffqualitätszelllinie, beispielsweise VERO-, MRC5- oder WI38-Zellen, Reinigung von dem Virus aus Fermentorernten, Extraktion von den F-, G- und M-Proteinen von dem gereinigten Virus und gemeinsame Reinigung der F-, G- und M-Proteine, ohne Einbezug von Immunoaffinität oder Linsenlectin- oder Concanavalin-A-Affinitätsschritten, bereit. Insbesondere könnte das Lectinaffinitätsverfahren, das beispielsweise in WO 91/00104 ( US 07/773 949 , eingereicht am 28. Juni 1990), zugeordnet dem Anmelder hiervon, und deren Offenbarung hierin durch Hinweis einbezogen ist, zum Auslaugen des Liganden in das Produkt führen.
  • Zusätzlich wird hierin zum ersten Mal ein Verfahren für die gemeinsame Isolierung und gemeinsame Reinigung der F-, G- und M-Proteine von RSV und auch immunogenen Zusammensetzungen, die gemeinsam gereinigte Gemische der RSV-Proteine umfassen, bereitgestellt.
  • Die gemeinsam isolierten und gemeinsam gereinigten F-, G- und M-RSV-Proteine sind nicht-pyrogen, nicht-immunopotenzierend und im Wesentlichen frei von Serum und zellulären Verunreinigungsmitteln. Die isolierten und gereinigten Proteine sind immunogen, frei von infektiösem RSV und anderen zufällig hinzukommenden Erregern.
  • Folglich wird in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein gemeinsam isoliertes und gemeinsam gereinigtes Gemisch von gereinigtem Fusions-(F)-Protein, Bindungs-(G)-Protein und Matrix-(M)-Protein von respiratorischem Syncytialvirus (RSV) bereitgestellt, wobei das Gemisch frei von Lentillectin, Concanavalin A. und monoklonalen Antikörpern ist, und die Mischung erhältlich ist durch das die folgenden Schritte umfassende Verfahren: Züchten von RSV auf Zellen in einem Kulturmedium; Abtrennen des gezüchteten Virus aus dem Kulturmedium; Solubilisieren von mindestens dem Fusions-(F)-Protein, dem Bindungs-(G)-Protein und dem Matrix-(M)-Protein von dem abgetrennten Virus; Auftragen der solubilisierten Proteine auf eine Hydroxyapatitmatrix; und selektives gemeinsames Eluieren der F-, G- und M-Proteine.
  • Das Fusions-(F)-Protein kann multimere Fusions-(F)-Proteine umfassen, die, wenn analysiert unter nicht-reduzierenden Bedingungen, Heterodimere von einem Molekulargewicht von ungefähr 70 kDa und dimere und trimere Formen einschließen.
  • Das Bindungs-(G)-Protein kann, wenn unter nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert, oligomeres G-Protein, G-Protein von einem Molekulargewicht von ungefähr 95 kDa und G- Protein von einem Molekulargewicht von ungefähr 55 kDa umfassen.
  • Das Matrix-(M)-Protein kann, wenn unter nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert, Protein von einem Molekulargewicht von ungefähr 28 bis 34 kDa umfassen.
  • Das hierin bereitgestellte Proteingemisch kann, wenn durch reduzierte SDS-PAGE-Analyse analysiert, das Fusions-(F)-Protein, umfassend F1 mit einem Molekulargewicht von ungefähr 48 kDa und F2 von etwa 23 kDa, das Bindungs-(G)-Protein, umfassend ein G-Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 95 kDa und ein G-Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 55 kDa, und das Matrix-(M)-Protein, umfassend ein M-Protein von ungefähr 31 kDa, umfassen.
  • Das gemäß diesem Aspekt der Erfindung bereitgestellte Gemisch kann die F-, G- und M-Proteine in relativen Anteilen umfassen von:
    F etwa 35 bis etwa 70 Gewichtsprozent
    G etwa 5 bis etwa 30 Gewichtsprozent,
    M etwa 10 bis etwa 40 Gewichtsprozent.
  • Wenn durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und densitometrischem Scannen nach Silberanfärben analysiert, kann das Verhältnis von F1 mit einem Molekulargewicht von ungefähr 48 kDa zu F2 mit einem Molekulargewicht von ungefähr 23 kDa in diesem Gemisch ungefähr zwischen 1:1 und 2:1 liegen. Das Gemisch von F-, G- und M-Proteinen kann eine Reinheit von mindestens etwa 75%, vorzugsweise mindestens etwa 85%, aufweisen.
  • Das hierin gemäß diesem Aspekt der Erfindung bereitgestellte Gemisch, mit bezüglich dem Verfahren der hierin angewendeten, wie nachstehend beschriebenen Isolierung, ist frei von monoklonalen Antikörpern und frei von Linsenlectin und Concanavalin A.
  • Die in dem Gemisch der hierin bereitgestellten Proteine der bereitgestellten RSV-Proteine sind im Wesentlichen im Allgemeinen durch die milden Herstellungsbedingungen nicht-denaturiert und können RSV-Proteine von einem oder beiden Untertypen RSV A und RSV B umfassen.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine immunogene Zubereitung bereitgestellt, umfassend eine immunowirksame Menge der hierin bereitgestellten Gemische.
  • Die hierin bereitgestellten, immunogenen Zusammensetzungen können als ein Impfstoff formuliert werden, der die F-, G- und M-Proteine zur in-vivo-Verabreichung an einen Wirt enthält, welcher ein Primat, speziell ein menschlicher Wirt, sein kann, um Schutz gegen durch RSV verursachte Erkrankung zu liefern.
  • Die erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzungen können als Mikroteilchen, Kapseln, ISCOMs oder Liposomen formuliert werden. Die immunogenen Zusammensetzungen können weiterhin mindestens ein anderes immunogenes oder immunostimulierendes Material umfassen, das mindestens ein Hilfsmittel oder mindestens ein Immunomodulator, wie Cytokine, einschließlich ILK, sein kann.
  • Das mindestens eine Hilfsmittel kann ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, QS21, Quil A oder Derivaten oder Komponenten davon, Calciumphosphat, Calciumhydroxid, Zinkhydroxid, einem Glycolipidanalogen, einem Octodecylester einer Aminosäure, einem Muramyldipeptid, Polyphosphazen, einem Lipoprotein, ISCOM-Matrix, DC-Chol, DDA und anderen Hilfsmitteln und bakteriellen Toxinen, Komponenten und Derivaten davon, wie beispielsweise in USSN 08/258 228, eingereicht am 10. Juni 1994, übertragen auf die Anmelder hiervon, und deren Offenbarung hierin durch Hinweis darauf eingeschlossen ist ( WO 95/34323 ). Unter besonderen Umständen sind Hilfsstoffe, die eine Th1-Reaktion induzieren, erwünscht.
  • Die hierin bereitgestellten immunogenen Zusammensetzungen können formuliert werden, um mindestens ein zusätzliches Immunogen zu umfassen, welches geeigneterweise ein Human-Parainfluenza-Virus-(PIV)-Protein von PIV-1, PIV-2 und/oder PIV-3, wie die PIV-F- und HN-Proteine, umfassen kann. Jedoch können auch andere Immunogene, wie von Chlamydia, Polio, Hepatitis-B, Diphtheria toxoid, Tetanus toxoid, Influenza, Haemophilus, B. pertussis, Pneumococci, Mycobacteria, Hepatitis-A und Moraxella, in die Zusammensetzungen als polyvalente (Kombinations-)Impfstoffe eingearbeitet werden.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Erzeugen einer Immunreaktion in einem Wirt durch Verabreichen einer immunowirksamen Menge der hierin bereitgestellten immunogenen Zusammensetzung bereit. Vorzugsweise wird die immunogene Zusammensetzung als ein Impfstoff zur in-vivo-Verabreichung an den Wirt formuliert und die Verabreichung an den Wirt, einschließlich Menschen, liefert Schutz gegen die durch RSV verursachte Erkrankung. Die Immunreaktion kann humorale oder eine zellvermittelte Immunreaktion sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt davon ein Verfahren zum Erzeugen eines Impfstoffs zum Schutz gegen durch Atmungs-syncytiale-Virus-(RSV)-Infektion verursachte Erkrankungen bereit, umfassend Verabreichen der hierin bereitgestellten immunogenen Zusammensetzung an einen Testwirt, um die Menge von und Häufigkeit der Verabreichung davon zu bestimmen, um Schutz gegen durch eine RSV verursachte Erkrankung bereitzustellen; und Formulieren der immunogenen Zusammensetzung in einer Form, die zur Verabreichung an einen behandelten Wirt gemäß der bestimmten Menge und Häufigkeit der Verabreichung geeignet ist. Der behandelte Wirt kann ein Mensch sein.
  • Die Anmeldung offenbart ein Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens in einer Probe von Antikörpern, die spezifisch reaktiv mit einem F-, G- oder M-Protein des respiratorischen Syncytialvirus (RSV) sind, umfassend die Schritte von:
    • (a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Gemisch, wie hierin bereitgestellt, zur Erzeugung von Komplexen, die ein respiratorisches Syncytialvirusprotein und irgendwelche der in der Probe vorliegenden Antikörper, die spezifisch reaktiv damit sind, umfassen; und
    • (b) Bestimmen der Erzeugung der Komplexe.
  • Die Anmeldung offenbart auch ein Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens in einer Probe von einem F-, G- oder M-Protein von respiratorischem Syncytialvirus (RSV), umfassend die Schritte von:
    • (a) Immunisieren einer Person mit der wie hierin bereitgestellten immunogenen Zusammensetzung, unter Erzeugung von Antikörpern, die für die F-, G- und M-Proteine von RSV spezifisch sind;
    • (b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit den Antikörpern zur Erzeugung von Komplexen, die ein beliebiges RSV-Protein, das in der Probe vorliegt, und die Proteinspezifischen Antikörper umfassen; und
    • (c) Bestimmen der Erzeugung der Komplexe.
  • Die Anmeldung offenbart auch ein diagnostisches Kit zum Bestimmen des Vorliegens von Antikörpern in einer Probe, die mit einem F-, G- oder M-Protein von respiratorischem Syncytialvirus (RSV) spezifisch reaktiv sind, umfassend:
    • (a) ein wie hierin bereitgestelltes Gemisch;
    • (b) Mittel zum In-Kontakt-Bringen des Gemisches mit der Probe, zur Bereitstellung von Komplexen, die ein respiratorisches Syncytialvirusprotein und beliebige in der Probe vorliegende Antikörper umfasst; und
    • (c) Mittel zum Bestimmen der Erzeugung der Komplexe.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Erzeugen von monoklonalen Antikörpern, die für F-, G- oder M-Proteine von respiratorischem Syncytialvirus (RSV) spezifisch sind, bereitgestellt, umfassend:
    • (a) Verabreichen einer wie hierin bereitgestellten immunogenen Zusammensetzung an mindestens eine Maus zur Erzeugung von mindestens einer immunisierten Maus;
    • (b) Entfernen von B-Lymphozyten aus der mindestens einen immunisierten Maus;
    • (c) Fusionieren der B-Lymphozyten von der mindestens einen immunisierten Maus mit Myelomzellen, wodurch Hybridoma erzeugt werden;
    • (d) Klonieren der Hybridoma, die einen ausgewählten Anti-RSV-Protein-Antikörper erzeugen;
    • (e) Kultivieren der ausgewählten Anti-RSV-Protein-Antikörper-erzeugenden Klone; und
    • (f) Isolieren von Anti-RSV-Protein-Antikörpern aus den ausgewählten Kulturen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Erzeugen eines gemeinsam isolierten und gemeinsam gereinigten Gemisches von Proteinen von respiratorischem Syncytialvirus bereit, das Züchten von RSV auf Zellen in einem Kulturmedium, Abtrennen des gewachsenen Virus von dem Kulturmedium, Solubilisieren von mindestens den F-, G- und M-Proteinen von dem abgetrennten Virus, und gemeinsames Isolieren und gemeinsames Reinigen der solubilisierten RSV-Proteine umfasst.
  • Die gemeinsame Isolierung und gemeinsame Reinigung wird durch Beladen der solubilisierten Proteine auf eine Hydroxyapatitmatrix, und selektives gemeinsames Eluieren der F-, G- und M-Proteine bewirkt. Das gezüchtete Virus wird zuerst mit Harnstoff gewaschen, um Verunreinigungen, ohne wesentliches Entfernen von F-, G- und M-Proteinen, zu entfernen.
  • Die Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen ein:
    • – gemeinsam isolierte und gemeinsam gereinigte Gemische von F-, G- und M-Proteinen von RSV;
    • – immunogene Zusammensetzungen, die solche Proteine enthalten;
    • – Verfahren zum Isolieren von solchem Protein; und
    • – diagnostische Kits zur Identifizierung von RSV und damit befallenen Wirten.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1, enthaltend Platte a und b, zeigt SDS-PAGE-Analyse von gereinigter RSV-A-Untereinheitszubereitung, unter Verwendung von Acrylamidgelen, angefärbt mit Silber, unter sowohl reduzierten (Platte (a))- und nicht-reduzierten (Platte(b))-Bedingungen;
  • 2, enthaltend Platte a, b, c und d, zeigt Western-Blot-Analyse einer gereinigten RSV-Untereinheitszubereitung unter reduzierten Bedingungen;
  • 3, enthaltend Platte a, b, c und d, zeigt Western-Blot-Analyse einer gereinigten RSV-Untereinheitszubereitung unter nicht-reduzierten Bedingungen; und
  • 4 zeigt SDS-PAGE-Analyse von einer gereinigten RSV-B-Untereinheitszubereitung, unter Verwendung von Acrylamidgelen, angefärbt mit Silber, unter reduzierten Bedingungen.
  • ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Wie vorstehend offenbart, sind F-, G- und M-Proteine von aus RS-Virus gemeinsam isoliertem und gemeinsam gereinigtem RSV. Das Virus wird in einer Impfstoffqualitätszelllinie, wie VERO-Zellen und humane diploide Zellen, wie MRC5 und WI38, gezüchtet, und das gezüchtete Virus wird geerntet. Die Fermentation kann in Gegenwart von fötalem Rinderserum (FBS) und Trypsin bewirkt werden.
  • Die virale Ernte wird filtriert und dann typischerweise unter Verwendung von tangentialer Fluss-Ultrafiltration mit einer Membran von gewünschtem Molekulargewichts-cut-off aufkonzentriert und diafiltriert. Das Viruserntekonzentrat kann zentrifugiert werden und der Überstand wird verworfen. Das Pellet kann nach Zentrifugierung zuerst mit einem Puffer-enthaltenden Harnstoff gewaschen werden, um lösliche Verunreinigungen zu entfernen, unter Hinterlassen der F-, G- und M-Proteine, die im Wesentlichen unbeeinflusst sind, und wird dann erneut zentrifugiert. Das Pellet aus der Zentrifugierung ist dann ein Waschmittel, das extrahiert wird, um die F-, G- und M-Proteine von dem Pellet zu solubilisieren. Solche Waschmittelextraktion kann durch erneutes Suspendieren des Pellets zu dem ursprünglichen Erntekonzentratvolumen in einem ein Waschmittel enthaltenden Extraktionspuffer, wie ein nichtionisches Tensid, einschließlich TRITON® X-100, ein nichtionisches Waschmittel, das Octadienylphenol(ethylenglycol)10 darstellt, bewirkt werden.
  • Nach Zentrifugierung zum Entfernen von nicht-löslichen Proteinen wird der F-, G- und M-Proteinextrakt durch chromatographische Verfahren gereinigt. Der Extrakt wird zuerst auf eine Ionenaustauscher-Chromatographiematrix aufgetragen, um das Binden der F-, G- und M-Proteine an die Matrix zu erlauben, während Verunreinigungen durch die Säule fließen können. Die Ionenaustauscher-Chromatographiematrix ist Hydroxyapatitmatrix.
  • Die gebundenen F-, G- und M-Proteine werden dann aus der Säule durch ein geeignetes Elutionsmittel gemeinsam eluiert. Die erhaltenen, gemeinsam gereinigten F-, G- und M-Proteine können zum Erhöhen von ihrer Reinheit weiter verarbeitet werden.
  • Die hierin angewendeten, gereinigten F-, G- und M-Proteine können in Form von Homo- und Heterooligomeren, einschließlich F:G-Heterodimeren und einschließlich Dimere, Te tramere und höhere Spezies, vorliegen. Die gemäß diesem Verfahren hergestellten RSV-Proteinzubereitungen zeigten kein Vorliegen von irgendwelchem zufällig hinzukommenden Erreger, hem-adsorbierenden Erreger oder Lebendvirus.
  • Gruppen von Baumwollratten wurden mit hierin, in Kombination mit Alaun oder IscomatrixTM als Hilfsmittel, bereitgestellten Zubereitungen, intramuskulär immunisiert. Starke Anti-Fusions- und Neutralisationstiter wurden erhalten, wie in nachstehenden Tabellen 1 und 2 gezeigt. Vollständiger Schutz gegen Virusinfektion wurde in den oberen und unteren Atmungstrakten, wie nachstehend in Tabellen 3 und 4 gezeigt, erhalten.
  • Zusätzlich wurden Gruppen von Mäusen intramuskulär mit hierin, in Kombination mit Alaun, IscomatrixTM, Polyphosphazen und DC-Chol als Hilfsmittel, bereitgestellten Zubereitungen, immunisiert. Starke neutralisierende und Anti-F-Antikörpertiter wurden, wie in Tabellen 5 und 6 nachstehend gezeigt, erhalten. Zusätzlich wurde vollständiger Schutz gegen Virusinfektion, wie in Abwesenheit von Virus in Lungenhomogenisaten gezeigt (nachstehende Tabelle 7), erhalten.
  • Gruppen von Affen wurden auch mit den hierin, in Kombination mit Alaun oder IscomatrixTM als Hilfsmittel, bereitgestellten Zubereitungen, immunisiert. Starke neutralisierende Titer und Anti-F-Antikörpertiter wurden erhalten, wie in nachstehenden Tabellen 8 und 9 gezeigt.
  • Die hierin, im Allgemeinen angeführten tierischen Immunisierungsdaten zeigen, dass man durch Anwenden von milder Waschmittelextraktion der Haupt-RSV-Proteine aus Virus und milder Salzelution der Proteine aus der Ionenaustauschmatrix, gemeinsam gereinigte Gemische von den F-, G- und M-RSV-Proteinen erhält, die eine Immunreaktion in experimentellen Tiermodellen hervorrufen können, was den Schutz gegen RSV-Reizung bestätigt.
  • Die Erfindung erstreckt sich auf das gemeinsam isolierte und gemeinsam gereinigte Gemisch von F-, G- und M-Proteinen aus Atmungs-syncytialem Virus (RSV), wobei das Gemisch frei von Lentillectin, Concanavalin A. und monoklonalen Antikörpern ist, und die Mischung erhältlich ist durch das die folgenden Schritte umfassende Verfahren: Züchten von RSV auf Zellen in einem Kulturmedium; Abtrennen des gezüchteten Virus aus dem Kulturmedium; Solubilisieren von mindestens dem Fusions-(F)-Protein, dem Bindungs-(G)-Protein und dem Matrix-(M)-Protein von dem abgetrennten Virus; Auftragen der solubilisierten Proteine auf eine Hydroxyapatitmatrix; und selektives gemeinsames Eluieren der F-, G- und M-Proteine, zur Verwendung als eine pharmazeutische Substanz als einen Wirkbestandteil in einem Impfstoff gegen durch Infektion mit respiratorischem Syncytialvirus verursachte Erkrankung.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung von gemeinsam isoliertem und gemeinsam gereinigtem Gemisch von F-, G- und M-Proteinen aus respiratorischem Syncytialvirus (RSV), wobei das Gemisch frei von Lentillectin, Concanavalin A. und monoklonalen Antikörpern ist, und die Mischung erhältlich ist durch das die folgenden Schritte umfassende Verfahren: Züchten von RSV auf Zellen in einem Kulturmedium; Abtrennen des gezüchteten Virus aus dem Kulturmedium; Solubilisieren von mindestens dem Fusions-(F)-Protein, dem Bindungs-(G)-Protein und dem Matrix-(M)-Protein von dem abgetrennten Virus; Auftragen der solubilisierten Proteine auf eine Hydroxyapatitmatrix; und selektives gemeinsames Eluieren der F-, G- und M-Proteine, für die Zubereitung einer Impfstoffzusammensetzung für die Immunisierung gegen durch Infektion mit respiratorischem Syncytialvirus verursachte Erkrankung bereit.
  • Es wird dem Fachmann deutlich klar, dass die verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen Anwendungen auf den Gebieten der Impfung, Diagnose und Behandlung von re spiratorischen Syncytialvirusinfektionen und die Generierung von immunologischen Mitteln haben. Eine weitere, nicht-begrenzende Erörterung für einen solchen Fall wird nachstehend weiter angeführt.
  • 1. Impfstoffzubereitung und Verwendung
  • Immunogene Zusammensetzungen, die geeigneterweise als Impfstoffe verwendet werden sollen, können aus immunogene F-, G- und M-Proteine von RSV, wobei das Gemisch frei von Lentillectin, Concanavalin A. und monoklonalen Antikörpern ist, und die Mischung erhältlich ist durch das die folgenden Schritte umfassende Verfahren: Züchten von RSV auf Zellen in einem Kulturmedium; Abtrennen des gezüchteten Virus aus dem Kulturmedium; Solubilisieren von mindestens dem Fusions-(F)-Protein, dem Bindungs-(G)-Protein und dem Matrix-(M)-Protein von dem abgetrennten Virus; Auftragen der solubilisierten Proteine auf eine Hydroxyapatitmatrix; und selektives gemeinsames Eluieren der F-, G- und M-Proteine, wie hierin offenbart, umfassenden, gemeinsam isolierten und gemeinsam gereinigten Gemischen hergestellt werden. Die immunogene Zusammensetzung bringt eine Immunreaktion hervor, die Antikörper, einschließlich Anti-RSV-Antikörper, einschließlich Anti-F-, Anti-G- und Anti-M-Antikörper, erzeugt. Solche Antikörper können viral neutralisierende und/oder Anti-Fusionsantikörper sein.
  • Immunogene Zusammensetzungen, einschließlich Impfstoffe, können als injizierbare, wie flüssige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, hergestellt werden. Der immunogene Wirkbestandteil oder Bestandteile können mit pharmazeutisch verträglichen Exzipienten, die damit verträglich sind, vermischt werden. Solche Exzipienten können Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon einschließen. Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe können weiterhin Hilfssubstanzen, wie benetzende oder emul gierende Mittel, pH-puffernde Mittel, sowie Hilfsstoffe zur Verstärkung der Wirksamkeit davon, enthalten. Immunogene Zusammensetzungen und Impfstoffe können parenteral, durch Injektion, wie subkutane, intradermale oder intramuskuläre Injektion, verabreicht werden. Alternativ können die gemäß der vorliegenden Erfindung gebildeten, immunogenen Zusammensetzungen formuliert und in einer Weise abgegeben werden, um eine Immunreaktion an der Schleimhautoberfläche hervorzurufen. Somit kann die immunogene Zusammensetzung auf Schleimhautoberflächen durch beispielsweise die nasalen oder oralen (intragastrischen) Wege verabreicht werden. Alternativ können andere Verabreichungsarten, einschließlich Suppositorien und orale Formulierungen, erwünscht sein. Für Suppositorien können Bindemittel und Träger, beispielsweise Polyalkalenglycole oder Triglyceride, einschließen. Solche Suppositorien können in Gemischen, die den/die immunogene(n) Wirkbestandteil(e) im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 10%, vorzugsweise etwa 1 bis 2%, enthalten, gebildet werden. Orale Formulierungen können üblicherweise angewendete Träger, wie Saccharin, Cellulose und Magnesiumcarbonat, in pharmazeutischen Qualitäten einschließen. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen zur verzögerten Freisetzung oder Pulver annehmen und enthalten etwa 1 bis 95% des/der Wirkbestandteils/e, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 75%.
  • Die immunogenen Zubereitungen und Impfstoffe werden in einer mit der Dosierungsformulierung kompatiblen Weise verabreicht, und in einer solchen Menge, um therapeutisch wirksam, immunogen und schützend zu sein. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Patienten, einschließlich beispielsweise der Aufnahmefähigkeit des individuellen Immunsystems zum Synthetisieren von Antikörpern, und, falls benötigt, zur Erzeugung von einer zellvermittelten Immunreaktion, ab. Genaue Mengen an zum Verabreichen erforder lichen Wirkbestandteil hängen von der Einschätzung des Arztes ab. Jedoch sind geeignete Dosierungsbereiche leicht durch den Fachmann bestimmbar und können in der Größenordnung von Mikrogramm bis Milligramm des/der Wirkbestandteils/e pro Impfstoff liegen. Geeignete Regime zur anfänglichen Verabreichung und Verstärkerdosen sind auch variabel, können jedoch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von anschließenden Verstärkungsverabreichungen, einschließen. Die Dosierung wird auch von dem Verabreichungsweg abhängen und wird gemäß der Größe des Wirts variieren.
  • Die Konzentration des Wirkbestandteilproteins in einer erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzung ist im Allgemeinen etwa 1 bis 95%. Ein Impfstoff, der antigenes Material von nur einem Pathogen enthält, ist ein einwertiger Impfstoff. Impfstoffe, die Antigenmaterial von verschiedenen Pathogenen enthalten, sind kombinierte Impfstoffe und gehören auch zu der vorliegenden Erfindung. Solche kombinierten Impfstoffe enthalten beispielsweise Material von verschiedenen Pathogenen oder von verschiedenen Stämmen des gleichen Pathogens oder von Kombinationen von verschiedenen Pathogenen. In der vorliegenden Erfindung werden, wie vorstehend angeführt, F-, G- und M-Proteine von RSV-A und RSV-B in einer einzelnen mehrwertigen, immunogenen Zusammensetzung kombiniert, welche auch andere Immunogene enthalten kann.
  • Die Immunogenizität kann wesentlich verbessert werden, wenn die Antigene mit Hilfsmitteln gemeinsam verabreicht werden. Hilfsmittel verstärken die Immunogenizität des Antigens, sind jedoch nicht notwendigerweise selbst immunogen. Hilfsmittel können zum Zurückhalten des Antigens örtlich nahe der Verabreichungsstelle wirken, um einen Depoteffekt zu erzeugen, unter Erleichtern einer langsamen, verzögerten Freisetzung des Antigens an Zellen des Immunsystems. Hilfsmittel können auch Zellen des Immunsystems an ein Antigendepot an ziehen und solche Zellen stimulieren, um Immunreaktionen hervorzurufen.
  • Immunostimulatorische Mittel oder Hilfsmittel wurden seit vielen Jahren verwendet, um die Wirtsimmunreaktionen auf beispielsweise Impfstoffe zu verbessern. Intrinsische Hilfsmittel, wie Lipopolysaccharide, sind normalerweise die Komponenten der getöteten oder abgeschwächten Bakterien, die als Impfstoffe verwendet werden. Extrinsische Hilfsmittel sind Immunomodulatoren, die formuliert werden, um die Wirtsimmunreaktionen zu verstärken. Somit wurden Hilfsmittel identifiziert, die die Immunreaktion auf parenteral freigesetzte Antigene verstärken. Einige von diesen Hilfsmitteln sind jedoch toxisch und können unerwünschte Nebenwirkungen verursachen, was sie zur Verwendung bei Menschen und vielen Tieren ungeeignet macht. Tatsächlich werden nur Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (insgesamt gemeinhin als Alaun bezeichnet) routinemäßig als Hilfsmittel in Human- und Veterinärimpfstoffen verwendet. Die Wirksamkeit von Alaun in erhöhenden Antikörperreaktionen auf Diphtherie- und Tetanustoxoide ist gut bekannt und ein HBsAg-Impfstoff wurde mit Alaun unterstützt. Während die Verwendbarkeit von Alaun für einige Anwendungen gut bekannt ist, hat sie Begrenzungen. Beispielsweise ist Alaun für Influenzaimpfung unwirksam und ruft gewöhnlich keine zellvermittelte Immunreaktion hervor. Die durch Alaununterstützte Antigene hervorgerufenen Antikörper sind hauptsächlich vom IgG1-Isotyp bei der Maus, welche nicht optimal für den Schutz durch einige Impfstoffmittel sein können.
  • Ein breiter Bereich von extrinsischen Hilfsmitteln kann starke Immunreaktionen auf Antigene anregen. Diese schließen Saponine, komplexiert mit Membranproteinantigenen (immunstimulierende Komplexe), Pluronicpolymere mit Mineralöl, getötete Mycobakterien in Mineralöl, Freund'sches unvollständiges Adjuvants, bakterielle Produkte, wie Muramyldipep tid (MDP) und Lipopolysaccharid (LPS) sowie Lipid A und Liposome, ein.
  • Um wirksam humorale Immunreaktionen (HIR) und zellvermittelte Immunität (CMI) zu induzieren, werden Immunogene häufig in Hilfsmitteln emulgiert. Viele Hilfsmittel sind toxisch, einschließlich Granuloma, akute und chronische Entzündungen (Freund'sches vollständiges Adjuvants, FCA), Cytolyse (Saponine und Pluronicpolymere) und Pyrogenizität, Arthritis und Anterior-Uveitis (LPS und MDP). Obwohl FCA ein ausgezeichnetes Hilfsmittel darstellt und breit in der Forschung verwendet wird, ist es aufgrund seiner Toxizität nicht zur Verwendung in Human- oder Veterinärimpfstoffen erlaubt.
  • 2. Immunoassays
  • Die F-, G- und M-Proteine von RSV der vorliegenden Erfindung sind als Immunogene für die Erzeugung von Antikörpern dazu, als Antigene in Immunoassays, einschließlich Enzym-gebundene Immunosorbentassays (ELISA), RIAS und andere Nicht-Enzym-gebundene Antikörperbindungsassays und Zubereitungen, die auf dem Fachgebiet für den Nachweis von Antikörpern bekannt sind, verwendbar. In ELISA-Assays wird das ausgewählte F-, G- oder M-Protein oder ein Gemisch von Proteinen auf einer ausgewählten Oberfläche, beispielsweise einer Oberfläche, die Proteine binden kann, wie die Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte, immobilisiert. Nach Waschen zum Entfernen von unvollständig adsorbiertem Material kann ein nichtspezifisches Protein, wie eine Lösung von Rinderserumalbumin (BSA), das bekanntlich bezüglich der Testprobe antigen neutral ist, an die ausgewählte Oberfläche gebunden werden. Dies erlaubt das Blockieren von nichtspezifischen Adsorptionsstellen an der immobilisierenden Oberfläche und vermindert somit, dass der Hintergrund veranlasst wird, Proteine in den Antiseren auf der Oberfläche nichtspezifisch zu binden.
  • Die immobilisierende Oberfläche wird dann mit einer zu testenden Probe, wie klinischen oder biologischen Materialien, in einer für die Immunkomplex-(Antigen/Antikörper)bildung nützlichen Weise in Kontakt gebracht. Dies kann Verdünnen der Probe mit Verdünnungsmitteln, wie Lösungen von BSA, Rinder-gamma-globulin (BGG) und/oder Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)/Tween, einschließen. Die Probe wird dann für etwa 2 bis 4 Stunden bei Temperaturen, wie in der Größenordnung von etwa 25° bis 37°C, inkubieren lassen. Nach Inkubation wird die Proben-kontaktierte Oberfläche zum Entfernen von nicht-immunokomplexiertem Material gewaschen. Das Waschverfahren kann Waschen mit einer Lösung, wie PBS/Tween oder einem Boratpuffer, einschließen. Nach Bildung von spezifischen Immunokomplexen zwischen der Testprobe und gebundenem Protein und anschließendem Waschen können das Auftreten und auch die Menge von Immunokomplexbildung durch Unterziehen des Immunokomplexes einem zweiten Antikörper mit Spezifizität für den ersten Antikörper bestimmt werden. Wenn die Testprobe von Humanursprung ist, ist der zweite Antikörper ein Antikörper mit Spezifizität für Humanimmunoglobuline und im Allgemeinen IgG. Um Nachweismittel bereitzustellen, kann der zweite Antikörper eine assoziierte Aktivität, wie eine enzymatische Aktivität, aufweisen, die beispielsweise eine Farbentwicklung nach Inkubieren mit einem geeigneten chromogenen Substrat erzeugen wird. Die Quantifizierung wird dann durch Messen des Farberzeugungsgrades unter Verwendung von beispielsweise einem Spektrophotometer erreicht.
  • BEISPIELE
  • Die vorstehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung im Allgemeinen. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Bezug auf die nachstehenden, speziellen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele werden nur zu Erläuterungszwecken beschrieben und sind nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung zu begrenzen. Änderungen in Form und Substitution von Äquivalenten sind denkbar, wenn die Umstände dies vorschlagen oder zweckmäßig erscheinen lassen. Obwohl spezielle Begriffe hierin angewendet wurden, sind solche Begriffe in einem beschreibenden Sinne und zur Begrenzung vorgesehen.
  • Verfahren zum Bestimmen von Gewebskulturinfektionsdosis50 (TCID50/ml), Plaque- und Neutralisationstiter, die in dieser Offenbarung nicht ausgesprochen beschrieben sind, werden ausführlich in der wissenschaftlichen Literatur mitgeteilt und liegen innerhalb des Wissens des Fachmanns. Proteinkonzentrationen werden durch das Bicinchoninsäure-(BCA)-Verfahren, wie in dem Pierce Manual (23220, 23225; Pierce Chemical Company, USA) beschrieben, hierin durch Hinweis einbezogen, bestimmt.
  • CMRL 1969 und Iscove's Modified Dulbecco's Medium-(IMDM)-Kulturmedien wurden für Zellkultur und Viruszüchtung verwendet. Die in dieser Studie verwendeten Zellen sind Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO lot M6) von Impfstoff-Qualität, erhalten vom Institut Mérieux. Die verwendeten RS-Viren waren der RS-Virus-Untertyp A (Lang- und A2-Stränge), erhalten von der American Type Culture Collection (ATCC), ein neueres Untertyp A-klinisches Isolat und RSV-Untertyp B-klinisches Isolat von Baylor College of Medicine.
  • Beispiel 1:
  • Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von RSV auf einer Säugerzelllinie auf Mikroträgerkugeln in einem gesteuerten 150-Liter-Fermentor.
  • Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze von Impfstoff-Qualität (VERO), bei einer Konzentration von 105 Zellen/ml, wurden zu 60 Liter CMRL 1969-Medium, pH 7,2, in einem 360 g Cytodex-1-Mikroträgerkugeln enthaltenden 150-Liter-Bioreaktor gegeben und 2 Stunden gerührt. Weitere 60 Liter CMRL 1969 wurden zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 120 Litern zu ergeben. Fötales Rinderserum wurde zum Erreichen einer Endkonzentration von 3,5% zugegeben. Glucose wurde zu einer Endkonzentration von 3 g/l zugegeben und L-Glutamin wurde zu einer Endkonzentration von 0,6 g/l zugegeben. Gelöster Sauerstoff (40%), pH (7,2), Rühren (36 U/min) und Temperatur (37°C) wurden gesteuert. Zellwachstum, Glucose-, Lactat- und Glutaminspiegel wurden verfolgt. Am Tag 4 wurde das Kulturmedium von dem Fermentor entwässert und 100 Liter E199-Medien (kein fötales Rinderserum) wurden zugegeben und 10 Minuten gerührt. Der Fermentor wurde entwässert und erneut mit 120 Liter E199 gefüllt.
  • Ein RSV-Inokulum vom RSV-Untertyp A wurde bei einer Multiplizität der Infektion (M. O. I.) von 0,001 zugegeben und die Kultur wurde dann 3 Tage gehalten, bevor ein Drittel bis eine Hälfte von dem Medium entwässert wurde und durch frisches Medium ersetzt wurde. Am Tag 6 nach Infektion wurde das Rühren beendet und die Kugeln absetzen lassen. Das virale Kulturfluid wurde entwässert und durch ein 20 μm-Filter filtriert, gefolgt von einem 3 μm-Filter vor weiterem Verarbeiten.
  • Die geklärte virale Ernte wurde 75- bis 150-fach unter Verwendung von tangentialer Fließ-Ultrafiltration mit 300 NMWL-Membranen aufkonzentriert und mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 10% Glycerin enthält, diafiltriert. Das virale Konzentrat wurde bei –70°C vor weiterer Reinigung gefroren gelagert.
  • Beispiel 2:
  • Dieses Beispiel erläutert das Verfahren zum Reinigen von RSV-Untereinheit von einem viralen Konzentrat vom RSV-Untertyp A.
  • Eine Lösung von 50% Polyethylenglycol-8000 wurde zu einer aliquoten Menge von Viruskonzentrat, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, gegeben, um eine Endkonzentration von 6% zu ergeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für eine Stunde wurde das Gemisch bei 15 000 U/min 30 min in einem Sorvall SS-34-Rotor bei 4°C zentrifugiert. Das virale Pellet wurde in 1 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, 2 M Harnstoff, 0,15 M NaCl, suspendiert, 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann erneut bei 15 000 U/min 30 min in einem Sorvall SS-34-Rotor bei 4°C zentrifugiert. Das virale Pellet wurde dann in 1 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1% Triton X-100, suspendiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der unlösliche Viruskern wurde durch Zentrifugierung bei 15 000 U/min für 30 min in einem Sorvall SS-34-Rotor bei 4°C entfernt. Der lösliche Proteinüberstand wurde auf eine Säule aus keramischem Hydroxyapatit (Typ II, Bio-Rad Laborstories) aufgetragen und die Säule wurde dann mit fünf Säulenvolumen 1 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 50 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, gewaschen. Die RSV-Untereinheitszusammensetzung von RSV-Untertyp A, enthaltend die F-, G- und M-Proteine, wurde durch Eluieren der Säule mit 10 Säulenvolumen von 1 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 400 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, erhalten.
  • Beispiel 3:
  • Dieses Beispiel erläutert die Analyse der RSV-Untereinheit-Zubereitung, die aus RSV-Untertyp A durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) und durch Immunoblotten erhalten wurde.
  • Die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellte RSV-Untereinheitszusammensetzung wurde durch SDS-PAGE unter Verwendung von 12,5% Acrylamidgelen analysiert. Proben wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 2-Mercaptoethanol (Reduktionsmittel) elektrophoretisiert. Gele wurden mit Silberfarbe angefärbt, um virale Proteine (1, Platte a und b) nachzuweisen. Immunoplotts von Wiederholungsgelen wurden hergestellt und mit einem monoklonalen Mausantikörper (mAb 5353C75) auf F-Glycoprotein (2, Platte a und 3, Platte a) oder einem monoklonalen Mausantikörper (mAb 131-2G) auf G-Glycoprotein (2, Platte b und 3, Platte b) oder Meerschweinchen-Antiserum (gpl78) gegen ein RSV-M-Peptid (Peptidsequenz: LKSKNMLTTVKDLTMKTLNPTHDIIALCEFEN – SEQ ID Nr.: 1) (2, Platte c und 3, Platte c) oder Ziege-Antiserum (Virostat #0605) gegen Ganz-RSV (2, Platte d und 3, Platte d) untersucht. Densitometrische Analyse von dem Silber-angefärbten Gel der RSV-Untereinheitszubereitung, elektrophoretisiert unter reduzierenden Bedingungen, wies eine Zusammensetzungsverteilung wie nachstehend auf:
    G Glycoprotein (95 kDa-Form) = 10%
    F1 Glycoprotein (48 kDa) = 30%
    M-Protein (31 kDa) = 23%
    F2 Glycoprotein (23 kDa) = 19%
  • Das F-Glycoprotein wandert unter nicht-reduzierenden Bedingungen als ein Heterodimer von ungefähr 70 kDa (F0) sowie höheren oligomeren Formen (Dimeren und Trimeren) (3, Paneel a).
  • Beispiel 4:
  • Dieses Beispiel erläutert die Immunogenizität der RSV-Untereinheitszubereitung in Baumwollratten.
  • Gruppen von fünf Baumwollratten wurden intramuskulär (0,1 ml an Tagen 0 und 28 mit 1 μg oder 10 μg der RSV-Untereinheitszubereitung, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben und formuliert mit entweder 1,5 mg/Dosis Alaun oder 5 μg/Dosis IscomatrixTM (Iscotec, Schweden), immunisiert. Blutproben wurden am Tag 41 erhalten und auf Anti-Fusionstiter und Neutralisationstiter bestimmt. Die Ratten wurden intranasal am Tag 43 mit RSV gereizt und vier Tage später geopfert. Waschungen der Lungen und Nasenpharynx wurden gesammelt und auf RSV-Titer abgesucht. Starke Anti-Fusions- und neutralisierende Antikörpertiter wurden, wie in Tabellen 1 und 2 nachstehend gezeigt, induziert. Zusätzlich wurde vollständiger Schutz gegen Virusinfektion erhalten, mit der Ausnahme von einer Ratte, in sowohl den oberen als auch unteren Atmungstrakten (nachstehende Tabellen 3 und 4).
  • Beispiel 5:
  • Dieses Beispiel erläutert die Immunogenizität der RSV-Untereinheitszubereitung bei Mäusen.
  • Gruppen von sechs BALB/c-Mäusen wurden intramuskulär (0,1 ml) an Tagen 0 und 28 mit verschiedenen Dosen der RSV-Untereinheitszubereitung, erzeugt wie in Beispiel 2 beschrieben und formuliert mit entweder 1,5 mg/Dosis Alaun, 10 μg/Dosis IscomatrixTM, 200 μg/Dosis Polyphosphazen (PCPP) oder 200 μg/Dosis DC-Chol, immunisiert. Die verschiedenen getesteten Zubereitungen werden in Tabellen 5, 6 und 7 nachstehend angeführt. Blutproben wurden an Tagen 28 und 42 erhalten und auf neutralisierende Antikörpertiter und Anti-F-Antikörpertiter abgesucht. Die Mäuse wurden am Tag 44 mit RSV gereizt und vier Tage später geopfert. Die Lungen wurden entfernt und homogenisiert, um Virustiter zu bestimmen. Starke Neutralisationstiter und Anti-F-Antikörpertiter wurden, wie in Tabellen 5 und 6 nachstehend gezeigt, hervorgerufen. Zusätzlich wurde vollständiger Schutz gegen Virusinfektion, wie in Abwesenheit von Virus in Lungenhomogenisaten und nasalen Waschungen (nachstehende Tabelle 7) gezeigt, erhalten.
  • Beispiel 6:
  • Dieses Beispiel erläutert die Immunogenizität von RSV-Untereinheitszubereitung in Afrikanischen Grünen Meerkatzen.
  • Gruppen von vier Meerkatzen wurden intramuskulär (0,5 ml an Tagen 0 und 21 mit 100 μg der RSV-Untereinheitszubereitung, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben und formuliert mit entweder 1,5 mg/Dosis Alaun oder 50 μg/Dosis IscomatrixTM) immunisiert. Blutproben wurden an Tagen 21, 35 und 49 erhalten und auf neutralisierende und Anti-F-Antikörpertiter abgesucht. Stark neutralisierende und Anti-F-Antikörpertiter wurden, wie in Tabellen 8 und 9 nachstehend gezeigt, erhalten.
  • Beispiel 7:
  • Dieses Beispiel erläutert weiterhin die Erzeugung von RSV oder ein Säugerzellenleben oder Mikrokugeln in einem gesteuerten 150-Liter-Fermentor.
  • Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze von Impfstoff-Qualität (Vero-Zellen) wurden zu 150 Liter Iscove's Modifiziertem Dulbecco's Medium (IMDM), enthaltend 3,5% fötales Rinderserum, pH 7,2, zu einer Endkonzentration von 2 × 105 Zellen/ml (Bereich 1,5 bis 3,5 Zellen/ml), in einem 150 Liter Bioreaktor, enthaltend 450 g Cytodex-1-Mikroträgerkugeln (3 g/l), gegeben. Nach Zellinokulation wurden gelöster Sauerstoff (40 Prozent Luftsättigung (Bereich 25 bis 40%), pH (7,1 ± 0,2)), Rühren (36 ± 2 U/min) und Temperatur (37° ± 0,5°C) gesteuert. Anfängliche Zellbindung an Kugeln, Zellzüchtung (Zellzahlbestimmung) und Wachstumsmediumspiegel von Glucose und Lactat wurden auf täglicher Basis verfolgt. Infektion der Vero-Zellkultur fand drei bis vier Tage nach Beginn des Zellwachstums statt, wenn die Konzentration von Zellen im Bereich 1,5 bis 2,0 × 106 Zellen/ml war. Rühren wurde gestoppt und die Mikroträgerkugeln wurden 60 Minuten absetzen lassen und das Kulturmedium wurde von dem Bioreaktor unter Verwendung von entwässerter Linie entwässert, angeordnet ungefähr 3 cm oberhalb des abgesetzten Kugelvolumens. Fünfundsiebzig Liter IMDM ohne fötales Rinderserum (Waschmedium) wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei 36 U/min für 10 Minuten gerührt. Das Rühren wurde beendet und die Mikroträgerkugeln für 30 Minuten absetzen lassen. Das Waschmedium wurde unter Verwendung der Entwässerungslinie entfernt und dann wurde der Bioreaktor auf 75 Liter (halbes Volumen) mit IMDM ohne fötales Rinderserum gefüllt.
  • Zur Infektion wurde ein RSV-Inokulum vom RSV-Untertyp B bei einer Multiplizität der Infektion (M. O. I.) von 0,001 zugegeben und Virusadsorption von Zellen bei einem halben Volumen wurde 2 Stunden unter Rühren bei 36 U/min ausgeführt. Fünfundsiebzig Liter IMDM wurden dann zu dem Bioreaktor zu einem Endvolumen von 150 Liter gegeben. Nach Infektion wurden gelöster Sauerstoff (40 Prozent Luftsättigung (Bereich 10 bis 40%)), pH (7,25 ± 0,1), Rühren (36 ± 2 U/min) und Temperatur (37° ± 0,5°C) gesteuert. Nach Infektion, Zellwachstumsmedium (Zellzahlbestimmung), Glucose- und Lactatspiegel, RSV F- und G-Antigene und RSV-Infektivität wurden auf einer täglichen Basis verfolgt. Am Tag 3 nach Infektion wurde das Rühren beendet, die Mikroträgerkugeln wurden 60 Minuten absetzen lassen und 75 Liter (50%) des Mediums wurden über die Entwässerungslinie entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Acht Tage (Bereich sieben bis neun Tage) nach Infektion, wenn vollständig, wurde Virus-induzierter cytopathischer Effekt beobachtet (d. h. Zellen wurden von den Mikroträgerkugeln entfernt und Sauerstoff wurde nicht mehr durch die Kultur verbraucht), wurde der Rührer gestoppt und die Mikroträgerkugeln wurden 60 Minuten absetzen lassen. Das Virus-enthaltende Kulturfluid wurde von dem Bioreaktor entfernt und zu einem Lagerungsgefäß überführt. Fünfundsiebzig Liter IMDM ohne fötales Rinderserum wurden zu dem Bioreaktor gegeben und bei 75 U/min 30 Minuten gerührt. Die Mikroträgerkugeln wurden 30 Minuten absetzen lassen. Das Spülfluid wurde von dem Bioreaktor entfernt und mit dem geernteten Material in dem Lagerungsgefäß vereinigt.
  • Das geerntete Material wurde auf ungefähr 20-fach durch tangentiale Fließfiltration (d. h. Virus-enthaltendes Material wurde durch die Membran zurückgehalten), unter Verwendung einer 500 oder 1000 Kilodalton (K) Ultrafiltrations membran, oder alternativ einer 0,45 μM Mikrofiltrationsmembran, zu einem Endvolumen von 10 Litern aufkonzentriert. Das konzentrierte Material wurde mit 10 Volumen Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,2, diafiltriert. Das diafiltrierte virale Konzentrat wurde vor weiterer Reinigung bei –70°C gefroren gelagert.
  • Beispiel 8:
  • Dieses Beispiel erläutert das Verfahren des Reinigens von RSV-Untereinheit von einem viralen Konzentrat vom RSV-Untertyp B.
  • Ein virales Konzentrat, hergestellt wie in Beispiel 7 beschrieben, wurde bei 15 000 U/min für 30 min in einem Sorvall SS-34-Rotor bei 4°C zentrifugiert. Ein virales Pellet wurde dann in 1 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 300 mM NaCl, 2% Triton X-100 suspendiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der unlösliche Viruskern wurde durch Zentrifugierung bei 15 000 U/min für 30 Minuten in einem Sorvall SS-34-Rotor bei 4°C entfernt. Der lösliche Proteinüberstand wurde auf eine Säule aus keramischem Hydroxyapatit (Typ I, Bio-Rad Laboratories) aufgetragen und die Säule wurde dann mit zehn Säulenvolumen 1 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 10 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, gewaschen. Die RSV-Untereinheitszusammensetzung, enthaltend das F-, G- und M-Protein, wurde durch Eluieren der Säule mit 10 Säulenvolumen 1 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 600 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, erhalten. In einigen Fällen wurde die RSV-Untereinheitszusammensetzung durch zuerst Verdünnen des Eluats von der ersten keramischen Hydroxyapatitsäule hinunter zu der NaCl-Konzentration von 400 mM NaCl und dann Auftragen der verdünnten Untereinheit auf eine Säule von keramischem Hydroxyapatit (Typ II, Bio-Rad Laboratories) weiter gereinigt. Der Durchsatz durch diese Säule wird dann durch RSV-Untereinheitszusammensetzung vom RSV-Untertyp B gereinigt.
  • Beispiel 9:
  • Dieses Beispiel erläutert die Analyse von RSV-Untereinheitszubereitung, erhalten aus RSV-Untertyp B durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE).
  • Die RSV-Untereinheitszusammensetzung, hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben, wurde durch SDS-PAGE, unter Verwendung von 15,0% Acrylamidgel, analysiert. Die Probe wurde in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol (Reduktionsmittel) elektrophoretisiert. Das Gel wurde mit Silberfarbe angefärbt, um die viralen Proteine nachzuweisen (4). Densitometrische Analyse des Silber-angefärbten Gels von der RSV-Untereinheitszubereitung, unter reduzierenden Bedingungen, wies eine Zusammensetzungsverteilung der Proteine wie nachstehend aus:
    G Glycoprotein (95 kDa-Form) = 21%
    F1 Glycoprotein (48 kDa) = 19%
    M-Protein (31 kDa) = 22%
    F2 Glycoprotein (23 kDa) = 20%
  • ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENBARUNG
  • Zur Zusammenfassung der Offenbarung stellt die vorliegende Erfindung ein gemeinsames isoliertes und gereinigtes Gemisch von F-, G- und M-Proteinen von RSV bereit, wobei das Gemisch frei von Lentillectin, Concanavalin A. und monoklonalen Antikörpern ist, und die Mischung erhältlich ist durch das die folgenden Schritte umfassende Verfahren: Züchten von RSV auf Zellen in einem Kulturmedium; Abtrennen des gezüchteten Virus aus dem Kulturmedium; Solubilisieren von mindestens dem Fusions-(F)-Protein, dem Bindungs-(G)-Protein und dem Matrix-(M)-Protein von dem abgetrennten Virus; Auftragen der solubilisierten Proteine auf eine Hydroxyapatitmatrix; und selektives gemeinsames Eluieren der F-, G- und M-Proteine, das in der Lage ist, in relevanten Tierinfektionsmodellen ge gen RSV zu schützen. Modifizierungen sind innerhalb des Umfangs dieser Erfindung möglich. Tabelle 1 – Serum-Anti-Fusions-Titer in Baumwollratten
    Gruppe Mittlerer Titer (log2) Standard-Abweichung (log2)
    Alaun Plazebo 2,0 0,0
    IscomatrixTM Plazebo 2,3 0,5
    RSV Untereinheit 1 μg mit Alaun 8,0 1,0
    RSV Untereinheit 10 μg mit Alaun 7,5 1,0
    RSV Untereinheit 1 μg mit IscomatrixTM 10,4 1,3
    RSV Untereinheit 10 μg mit IscomatrixTM 10,0 1,6
    Tabelle 2 – Serum-Neutralisations-Titer in Baumwollratten
    Gruppe Mittlerer Titer (log2) Standard-Abweichung (log2)
    Alaun Plazebo 2,0 0,0
    IscomatrixTM Plazebo 2,0 0,0
    RSV Untereinheit 1 μg mit Alaun 9,6 1,3
    RSV Untereinheit 10 μg mit Alaun 10,0 1,4
    RSV Untereinheit 1 μg mit IscomatrixTM 10,6 1,1
    RSV Untereinheit 10 μg mit IscomatrixTM 11,2 1,1
    Tabelle 3 – Pulmonares Waschen von RSV-Titern in Baumwollratten
    Gruppe Mittlerer Titer (log10/g Lunge) Standard-Abweichung (log10/g Lunge)
    Alaun Plazebo 3,8 0,4
    IscomatrixTM Plazebo 3,7 0,5
    RSV Untereinheit 1 μg mit Alaun 0,4 0,8
    RSV Untereinheit 10 μg mit Alaun 0,0 0,0
    RSV Untereinheit 1 μg mit IscomatrixTM 0,0 0,0
    RSV Untereinheit 10 μg mit IscomatrixTM 0,0 0,0
    Tabelle 4 – Nasales Waschen von RSV-Titern in Baumwollratten
    Gruppe Mittlerer Titer (log10/g Lunge) Standard-Abweichung (log10/g Lunge)
    Alaun Plazebo 3,2 0,5
    IscomatrixTM Plazebo 3,1 0,3
    RSV Untereinheit 1 μg mit Alaun 0,0 0,0
    RSV Untereinheit 10 μg mit Alaun 0,0 0,0
    RSV Untereinheit 1 μg mit IscomatrixTM 0,0 0,0
    RSV Untereinheit 10 μg mit IscomatrixTM 0,0 0,0
    Tabelle 5 – Serum-Neutralisationstiter in Balb/c Maus
    Gruppe 4 Wochen Blut 6 Wochen Blut
    Mittlerer Titer (log2) Standard-Abweichung (log2) Mittlerer Titer (log2) Standard-Abweichung (log2)
    Alaun Plazebo 3,01 0,0 3,0 0,0
    IscomatrixTM Plazebo 3,0 0,0 3,0 0,0
    PCPP Plazebo (200 μg) ND ND 3,0 0,0
    DC-Chol Plazebo (200 μg) ND ND 3,0 0,0
    RSV Untereinheit 0,1 μg ohne Hilfsmittel ND ND 3,0 0,0
    RSV Untereinheit 0,1 μg mit Alaun ND ND 10,3 0,9
    RSV Untereinheit 1 μg mit Alaun 6,5 0,6 8,7 1,0
    RSV Untereinheit 10 μg mit Alaun 8,0 1,1 9,5 1,1
    RSV Untereinheit 1 μg mit IscomatrixTM 8,2 0,8 13,2 1,0
    RSV Untereinheit 10 μg mit IscomatrixTM 10,4 1,3 13,4 0,6
    RSV Untereinheit 1 μg mit PCPP (200 μg) ND ND 15,0 0,6
    RSV Untereinheit 0,5 μg mit DC-Chol (200 μg) ND ND 11,7 1,1
    • 1 minimal nachweisbarer Titer in Assay
    • ND = nicht bestimmt
    Tabelle 6 – Serum-Anti-F-Titer in Balb/c Maus
    Gruppe 4 Wochen Blut 6 Wochen Blut
    Mittlerer Titer log2 Titer/100 Standard-Abweichung log2 Titer/100 Mittlerer Titer (log2 Titer/100) Standard-Abweichung (log2 Titer/100)
    Alaun Plazebo 0,5 1,2 0,0 0,0
    IscomatrixTM Plazebo 1,0 0,0 0,0 0,0
    PCPP Plazebo (200 μg) 0,0 0,0 0,0 0,0
    DC-Chol Plazebo (200 μg) 0,0 0,0 0,0 0,0
    RSV Untereinheit 0,1 μg ohne Hilfsmittel 0,0 0,0 0,0 0,0
    RSV Untereinheit 0,1 μg mit Alaun 7,0 1,0 12,4 0,9
    RSV Untereinheit 1 μg mit Alaun 8,7 0,8 11,2 0,8
    RSV Untereinheit 10 μg mit Alaun 9,7 0,8 12,3 1,0
    RSV Untereinheit 1 μg mit IscomatrixTM 8,5 0,6 13,3 0,5
    RSV Untereinheit 10 μg mit IscomatrixTM 10,0 0,0 13,0 0,0
    RSV Untereinheit 1 μg mit PCPP (200 μg) 10,2 0,8 14,0 0,7
    RSV Untereinheit 0,5 μg mit DC-Chol (200 μg) 9,7 1,4 13,0 1,0
    Tabelle 7 – Lungen-Virus-Titer in Balb/c Mäusen
    Gruppe Mittlerer Titer (log10/g Lunge) Standard-Abweichung (log10/g Lunge)
    Alaun Plazebo 4,1 0,2
    IscomatrixTM Plazebo 3,5 0,1
    PCPP Plazebo (200 μg) 5,2 0,2
    DC-Chol Plazebo (200 μg) 5,0 0,3
    RSV Untereinheit 0,1 μg ohne Hilfsmittel 5,3 0,1
    RSV Untereinheit 0,1 μg mit Alaun < 1,71 < 1,7
    RSV Untereinheit 1 μg mit Alaun < 1,7 < 1,7
    RSV Untereinheit 10 μg mit Alaun < 1,7 < 1,7
    RSV Untereinheit 1 μg mit IscomatrixTM < 1,7 < 1,7
    RSV Untereinheit 10 μg mit IscomatrixTM < 1,7 < 1,7
    RSV Untereinheit 1 μg mit PCPP (200 μg) < 1,7 < 1,7
    RSV Untereinheit 0,5 μg mit DC-Chol (200 μg) < 1,7 < 1,7
    • 1 minimal nachweisbarer Virustiter in Assay
    Tabelle 8 – Serum-Neutralisations-Titer in Afrikanischen Grünen Meerkatzen
    Gruppe 3 Wochen Blut 5 Wochen Blut 7 Wochen Blut
    Mittlerer Titer (log2) Standard-Abweichung (log2) Mittlerer Titer (log2) Standard-Abweichung (log2) Mittlerer Titer (log2) Standard-Abweichung (log2)
    Alaun Plazebo 3,3 0,0 3,3 0,0 3,3 0,0
    IscomatrixTM Plazebo 3,3 0,0 3,3 0,0 3,3 0,0
    RSV Untereinheit 100 μg mit Alaun 11,3 1,3 14,6 1,3 11,5 1,4
    RSV Untereinheit 100 μg mit IscomatrixTM 10,8 0,7 15,1 0,1 11,9 0,5
    Tabelle 9 – Serum-Anti-F-Titer in Afrikanischen Grünen Meerkatzen
    Gruppe 3 Wochen Blut 5 Wochen Blut 7 Wochen Blut
    Mittlerer Titer log2 Titer/100 Standard-Abweichung log2 Titer/100 Mittlerer Titer log2 Titer/100 Standard-Abweichung log2 Titer/100 Mittlerer Titer log2 Titer/100 Standard-Abweichung log2 Titer/100
    Alaun Plazebo 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
    IscomatrixTM Plazebo 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
    RSV Untereinheit 100 μg mit Alaun 6,5 1,9 9,3 1,0 9,0 1,2
    RSV Untereinheit 100 μg mit IscomatrixTM 5,5 1,0 9,8 0,5 9,5 1,0
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Claims (18)

  1. Gemeinsam isoliertes und gemeinsam gereinigtes Gemisch von Fusions-(F)-Protein, Bindungs-(G)-Protein und Matrix-(M.)-Protein vom respiratorischen Syncytialvirus (RSV), wobei das Gemisch frei von Lentillectin, Concanavalin A. und monoklonalen Antikörpern ist, und die Mischung erhältlich ist durch das die folgenden Schritte umfassende Verfahren: Züchten von RSV auf Zellen in einem Kulturmedium; Abtrennen des gezüchteten Virus aus dem Kulturmedium; Solubilisieren von mindestens dem Fusions-(F)-Protein, dem Bindungs-(G)-Protein und dem Matrix-(M)-Protein von dem abgetrennten Virus; Auftragen der solubilisierten Proteine auf eine Hydroxyapatitmatrix; und selektives gemeinsames Eluieren der F-, G- und M-Proteine.
  2. Gemisch nach Anspruch 1, worin das Fusions-(F)-Protein multimere Fusions-(F)-Proteine umfasst.
  3. Gemisch nach Anspruch 2, worin, wenn durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert, das multimere Fusions-(F)-Protein Heterodimere mit einem Molekulargewicht von ungefähr 70 kDa und dimere und trimere Formen einschließt.
  4. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin, wenn durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert, das Bindungs-(G)-Protein G-Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 95 kDa und G-Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 55 kDa und oligomeres G-Protein umfasst.
  5. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin, wenn durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert, das Matxix-(M)-Protein M-Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 28 bis 34 kDa umfasst.
  6. Gemisch nach Anspruch 1, worin, wenn durch reduzierte SDS-PAGE-Analyse analysiert, das Fusions-(F)-Protein F1 mit einem Molekulargewicht von etwa 48 kDa und F2 mit einem Molekulargewicht von etwa 23 kDa umfasst, das Bindungs-(G)-Protein ein G-Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 95 kDa und ein G-Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 55 kDa umfasst, und das Matrix-(M)-Protein ein M-Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 31 kDa umfasst.
  7. Gemisch nach Anspruch 1, worin die Proteine in den relativen Anteilen vorliegen von: F 35 bis 70 Gewichtsprozent, G 5 bis 30 Gewichtsprozent, M 10 bis 40 Gewichtsprozent.
  8. Gemisch nach Anspruch 7, worin, wenn durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert und Silber-angefärbt, das Verhältnis von F1 mit einem Molekulargewicht von ungefähr 48 kDa zu F2 mit einem Molekulargewicht von ungefähr 23 kDa zwischen 1:1 bis 2:1 durch scanningdensitometrie ist.
  9. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das mindestens 75% rein ist.
  10. Gemisch nach Anspruch 1, worin die RSV-Proteine nichtdenaturiert sind.
  11. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die RSV-Proteine von einem oder beiden Untertypen RSV A und RSV B sind.
  12. Immunogene Zusammensetzung, umfassend eine immunowirksame Menge des Gemisches nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
  13. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 12, weiterhin umfassend mindestens ein zusätzliches Immunogen.
  14. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin das mindestens eine zusätzliche Immunogen mindestens ein humanes Parainfluenzavirusprotein (PIV), ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus PIV-1, PIV-2 und PIV-3, umfasst.
  15. Verfahren zur Erzeugung eines gemeinsam isolierten und gemeinsam gereinigten Gemisches von Proteinen des respiratorischen Syncytialvirus (RSV), umfassend die Schritte von: Züchten von RSV auf Zellen in einem Kulturmedium; Abtrennen des gezüchteten Virus aus dem Kulturmedium; Solubilisieren von mindestens dem Fusions-(F)-Protein, dem Bindungs-(G)-Protein und dem Matrix-(M)-Protein von dem abgetrennten Virus; Auftragen der solubilisierten Proteine auf eine Hydroxyapatitmatrix; und selektives gemeinsames Eluieren der F-, G- und M-Proteine von der Ionenaustauschmatrix.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der gezüchtete Virus mit Harnstoff gewaschen wird, um Verunreinigungen ohne wesentliche Entfernung von F-, G- und M-Proteinen vor dem Solubilisierungsschritt zu entfernen.
  17. Gemeinsam isoliertes und gemeinsam gereinigtes Gemisch von gereinigtem Fusions-(F)-Protein, Bindungs-(G)-Protein und Matrix-(M)-Protein vom RSV, wobei das Gemisch frei von Lentillectin, Concanavalin A und monoklonalen Antikörpern ist, und die Mischung erhältlich ist durch das die folgenden Schritte umfassende Verfahren: Züchten von RSV auf Zellen in einem Kulturmedium; Abtrennen des gezüchteten Virus aus dem Kulturmedium; Solubilisieren von mindestens dem Fusions-(F)-Protein, dem Bindungs-(G)-Protein und dem Matrix-(M)-Protein von dem abgetrennten Virus; und Auftragen der solubilisierten Proteine auf eine Hydroxyapatitmatrix; und selektives gemeinsames Eluieren der F-, G- und M-Proteine von der Ionenaustauschmatrix; zur Verwendung als eine pharmazeutische Substanz in einem Impfstoff gegen Erkrankung, die durch Infektion mit respiratorischem Syncytialvirus verursacht wird.
  18. Verwendung eines gemeinsam isolierten und gemeinsam gereinigten Gemisches von gereinigtem Fusions-(F)-Protein, Bindungs-(G)-Protein und Matrix-(M)-Protein vom RSV, wobei das Gemisch frei von Lentillectin, Concanavalin A und monoklonalen Antikörpern ist, und die Mischung erhältlich ist durch das die folgenden Schritte umfassende Verfahren: Züchten von RSV auf Zellen in einem Kulturmedium; Abtrennen des gezüchteten Virus aus dem Kulturmedium; Solubilisieren von mindestens dem Fusions-(F)-Protein, dem Bindungs-(G)-Protein und dem Matrix-(M)-Protein von dem abgetrennten Virus; Auftragen der solubilisierten Proteine auf eine Hydroxyapatitmatrix; und selektives gemeinsames Eluieren der F-, G- und M-Proteine von der Ionenaustauschmatrix; für die Zubereitung einer Impfstoffzusammensetzung für die Immunisierung gegen durch Infektion mit RSV verursachten Erkrankung.
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