JP2005508927A - Rsv遺伝子発現ワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は一般に、遺伝子発現ワクチンに関する。より具体的には、本発明は、鼻腔内にまたは経口的に投与できる遺伝子発現ワクチンに関する。
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、乳児および子供におけるウイルス性下気道感染の最大の原因であり、全世界的に約400万人の子供が発症し、米国だけで毎年、約10万人が入院し4千5百人が死亡している。RSV感染症は、子供においては細気管支炎、気管支閉塞の繰り返しと喘息の悪化を伴う。RSV感染誘発性の細気管支炎の発生率が増加している。RSV感染症に対する使用可能な効果的な予防法はない。ホルマリンにより不活化したRSVワクチンを用いてワクチンを開発する以前の試みは単に失敗しただけではなく、その後にRSV感染が起こった際に疾患を悪化させた(Chanockら, Serious respiratory tract disease caused by respiratory syncytial virus: prospects for improved therapy and immunization, Pediatrics 1992; 90:137〜43)。さらに、RSVに対する治療法の開発は、潜伏期間が短いことで限定されてきた。従って、RSVワクチンの開発は、世界的なレベルで最優先事項であった。
本発明により、対応するRSV抗原をコード化するプラスミドDNAの混合物をキトサンナノ粒子のかたちで含む、遺伝子発現ワクチン(GXV)が提供される。第1の態様として、混合物には、RSV抗原のF、GならびにM、M2、SH、NS1、NS2、N、およびPのうちの少なくとも1つを含有する組み合わせが含まれる。別の態様として、混合物は、RSV抗原のM2ならびにF、G、M、SH、NS1、NS2、N、およびPのうちの少なくとも1つを含有する組み合わせである。さらに別の態様として、混合物には、RSV抗原のF、G、M2ならびにM、SH、NS1、NS2、N、およびPのうちの少なくとも1つを含有する組み合わせが含まれる。GXVは、安全かつRSVに対して効果的であり、RSV感染誘発性の肺の炎症を有意に弱め、かつ鼻腔内または経口投与することができる。理論により限定されるわけではないが、加えてGXVの効果に対する正確な細胞および分子機構はこれから詳細に調査されるべきであるが、経路、免疫抗原の組み合わせおよび/またはキトサンとの結合がその効果に寄与している可能性が高い。
pVAXプラスミドのRSV遺伝子発現ライブラリーを構築し、このライブラリーをキトサンでコアセルベートとしてナノ粒子(本明細書ではRGCNワクチンと呼ぶ)を形成させる。
動物
6週齢雌BALB/cマウスは、Jackson laboratory(Bar Harbor, ME)から購入し、動物センターにて無菌状態で維持した。全ての手順は、南フロリダ大学(University of South Florida)およびジェームズA ハレーVA病院の動物実験に関する委員会(James A Haley VA Medical Center Committee on Animal Research)により審査かつ承認された。
RSV cDNAは、Ventポリメラーゼ(New England Biolabs社, Beverly, MA)を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、RSV感染マウス肺cDNAライブラリーから増幅し、哺乳類発現ベクターpVAX(Invitrogen社, San Diego, CA)中にクローニングした。得られたプラスミドを大腸菌(E. coli)DH5α細胞中で増殖させた。大量のプラスミドDNAは、Qiagenキット(Qiagen社, Chatsworth, CA)を用い、製造元の仕様書に従って調製した。これにより、内毒素の混入を最低限として十分に精製されたDNAが得られる。pDNAは、RSV cDNAの混合物を作製するために混合した。DNAキトサンナノ粒子は、Roy, Kら、1999, Oral gene delivery with chitosan-DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allegy, Nat Med 5:387により説明されているように作製した。鼻腔内ワクチン接種の場合、マウスにDNAキトサンナノ粒子の混合物を、軽い麻酔下で3回、鼻腔内接種させた。各マウスには、総DNAキトサンナノ粒子の混合物が計25μg接種された。対照用マウスには、PBSおよび裸のDNAを接種した。
マウスにGXV(総DNA 25μg/マウス)を、軽い麻酔下で鼻腔内(i.n.)投与した。対照用マウスには、PBSまたは等量の裸のDNAを投与した。ワクチン接種から16日後、マウスにヒトRSV A2菌株(ATCC, Rockville, MD)1×106 pfuを50μl容量で鼻腔内感染させた。感染後(p.i.)5日で、マウスを屠殺し、それからそれらの肺および脾臓をRT-PCR、病理組織学的研究、サイトカインおよびウイルスプラークの解析のために無菌的に採取した。血清を得るため、ワクチン接種から14日および21日後にマウスから採血した。
最後のワクチン接種から16日で、マウスにヒトRSV A2菌株(ATCC, Rockville, MD)1×106 pfuを50μl容量で鼻腔内感染させた。感染後(p.i.)5日で、マウスを屠殺し、それからそれらの肺および脾臓をRT-PCR、病理組織学的研究、サイトカインおよびウイルスプラークの解析のために無菌的に採取した。最後のワクチン接種から14日および21日にマウスから血清を採取した。
マウス肺におけるRSV力価を定量するため、肺全体を、まず初めに重量測定し、次いで10% FBSを添加したEMEM培地中に直ぐに入れた。肺をホモジナイズし、続いて10,000 RPMにて4℃で10分間遠心した。透明な上清を回収し、そして0.45μmのメチルセルロースフィルター(Gelman Sciences社, Ann Arbor, MI)に通した。プラークアッセイには、連続希釈した試料を使用した。24ウェルプレート中のカバースリップ上で増殖させたHep-2細胞(60〜70%密集)に希釈の異なる肺ホモジネート液を重層し、1000RPMにて1時間遠心した。これにより、ウイルスの細胞中への素早い吸着がもたらされる。細胞をCO2インキュベーター中、37℃で24時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞培養用の培地を吸引除去し、細胞をPBSで2回洗浄した。細胞を冷却した無水エタノールで固定し、乾燥させその後FITC標識抗RSVポリクローナル抗体(Light Diagnostics社, Tennecula, CA)と湿潤チャンバー中で30分間インキュベーションした。細胞を洗浄用緩衝液(PBST, PBS+0.05% Tween-20, pH 7.4)で2回洗浄し、カバースリップをスライド上にフルオロマウントG(Southern Biotechnology Associates社, Birmingham, AL)を用いてマウントした。RSVプラークを顕微鏡下で数え上げた。
細胞の総RNAを肺組織から、TRIZOL試薬(Life Technologies社, Gaithersburg, MD)を用い、製造元の使用説明書に従って単離した。Trizol試薬1 mlを肺組織50〜100 mgに添加し、ホモジナイズした。細胞溶解のため、肺ホモジネートをピペッティングにより懸濁し、そして室温に5分間放置した。クロロホルム(200μl)を各試験管に添加し、徹底的に混合した。5分後、細胞を12,000rpmにて15〜20℃で15分間遠心した。透明な水性の上清を新しい試験管に移し、そして等量のイソプロパノールを添加し、よく混ぜて、それから12,000rpmにて15〜20℃で15分間遠心した。RMA沈殿物を70%エタノールで洗浄し、風乾させそしてジエチルピロカーボネイト処理水に溶解させた。異なるRSV遺伝子に対して、RT-PCRをBehera, A.K.ら、2001, Blocking Intercellular Adhesion Molecule-1 on Human Epithelial Cells Decreases Respiratory Syncytial Virus Infection, Biochem Biophys Res Comm 280:188により説明されているように行った。
ワクチン接種群および対照群の肺機能を評価するため、マウスにGXVをワクチン接種した。3日後、気道反応性(即ち、気管支収縮)を、Matsuo K.ら、2000, Recurrent respiratory syncytial virus infection in allergen sensitized mice lead to persistent airway inflammation and hyperresponsiveness, J. Immunol 164:6583により説明されているように、全身プレチスモグラフ(Buxco Electronics社, Troy, NY)によって、意識があり、無拘束のマウスで非侵襲的に評価した。この系では、通常の呼吸サイクルの間に起こる体積変化を、動物の入ったチャンバーと呼吸基準チャンバーとの間の圧力差として記録する。結果として得られたシグナルを呼吸頻度、毎分換気量、1回換気量、および休止増加(Penh)を計算するために使用する。Penhは、気管支収縮の指標として使用され、以下の式から算出される: Penh = 休止(pause) × (最大呼気圧 / 最大吸気圧)、式中、休止(pause)は1回換気量の最後の30%を吐き出すのに必要とされる時間の呼気の総時間に対する比率である。マウスをプレチスモグラフ中に入れて、10分間、チャンバーを平衡化した。それらをエアロゾル化されたPBS(ベースラインを確立するため)にさらし、続けてメタコリン(Sigma Chemicals社, St. Louis, MO)を追加投与(6、12.5、25および50 mg/ml)した。メタコリンの各投与は、5分間、エアゾール散布により行われ、その後の5分間、呼吸の測定を記録した。記録時間の間、各変量の平均を呼吸30回(または30秒、いずれか早い方)毎に算出した。各投与後の最大Penh値のものを気管支収縮の程度を測定するために使用した。
気管支肺胞洗浄をワクチン接種マウスおよび対照マウスで行った。マウスは感染から5日後に、過剰量のペントバルビタール(ネンブタール(Abbot Laboratories社, North Chicago, IL))、(0.6 g/kg)を腹膜内注射することにより屠殺し、それから胸腔を開いた。肺血管床を冷却した生理食塩水2〜3 mlで洗い流した。気管を露出させ、そしてツベルクリン注射器に取付けた26Gの注射針を挿入した。次に、肺をPBS 0.5 mlで3回洗浄し、気管支肺胞洗浄溶液(BALF)を貯留した。回収されたBAL溶液の量は、注入したPBSの75%〜85%の範囲に及んでいた。対照群と実験群との間で、回収されたBAL溶液の量に統計学的に有意な相違は認められなかった。BAL溶液を遠心後、上清を回収し、サイトカインを定量するまで-70℃に保存した。
IgA抗体を鼻腔内洗浄液から、Matsuo Kら、2000, Induction of innate immunity by nasal influenza vaccine administered in combination with an adjuvant (cholera toxin), Vaccine, 18:2713により説明されているように回収した。注射器に付けた注射針を鼻咽頭の開口部後方に挿入し、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS) 1 ml総量を開口部に3回注入した; 流出液を鼻腔内洗浄液として採取した。鼻腔内洗浄液を遠心して細胞残屑を除去し、抗体定量に使用した。全IgA抗体のアッセイ法のため、ELISAプレートを抗マウスIgA抗体(02271D, Pharmingen社, San Diego, CA) 200 ng/ウェルにより4℃で一晩コーティングした。3回洗浄後、試料を添加し、室温で2時間インキュベートした。もう1回洗浄後、ビオチン化抗マウスIgA抗体(556978, Pharmingen社, San Diego, CA)を添加し、プレートをさらに2時間インキュベートした。3回洗浄後、アビジン・ペルオキシダーゼ複合物(10,000倍希釈、Sigma Chemicals社, St. Louis, MO)を添加し、プレートをもう1時間インキュベートした。基質としてテトラメチルベンジジン(Pharmingen社, San Diego, CA)を添加して発色させ、ELISAオートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
抗RSV抗体価を定量するため、ELISAプレートを精製RSV(200 ng/ウェル)により4℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、ブロッキング用緩衝液(1% BSAのPBS溶液, pH 7.4)により37℃で1時間ブロッキングした。試料をプレートに添加し、37℃で2時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、10,000倍希釈した抗マウスIgGペルオキシダーゼ複合物(Boehringer Manheim社, Germany)を添加し、1時間インキュベートした。3回洗浄後、基質を添加して20〜30分間発色させた。ELISAオートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
14日目に得られた血清を、希釈を変えて、RSV接種材料100μlと混合し、37℃で1時間インキュベートした。48ウェル培養プレート中で増殖しているHEp-2培養細胞を感染させるのにこれを使用した。RSVの力価を決定した。
RSVを感染させたHEp-2細胞の抽出液30μgを4〜20%の濃度勾配SDS-PAGEで分画し、次いでニトロセルロース膜に転写した。膜をブロッキング用緩衝液(5%(w/v)脱脂粉乳のTBS-0.1% Tween 20溶液, pH 7.6)でブロッキングし、次いで免疫マウスの種々の群由来のプール血清を250倍希釈したものと4℃で一晩インキュベートした。膜を洗浄用緩衝液(TBS-0.1% Tween-20, pH 7.6)中で4回洗浄し、次いでペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体と室温で1時間インキュベートした。さらに4回洗浄後、製造元の使用説明書(Amersham Life Sciences社, Arlington Heights, IL)に従い、ブロットをECL化学発光検出試薬(0.125 ml/cm2)の添加によって現像した。
PBSを気管内注入して肺を膨張させた後、膨張状態での肺構造を保護するために10%中性緩衝ホルマリン溶液(Sigma Chemicals社, St. Louis, MO)を注入した。1時間後、肺を80%エタノールに移し、それからパラフィン包埋した。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。肺胞腔、気管支血管束および間質を含む、肺切片中の炎症細胞を半定量的に評価した。炎症性浸潤を位置、厚さ、および細胞組成に関して形態学的に評価した。
PBS、GXV、および裸のDNAを免疫したマウスから得た脾細胞(2.5×106細胞/mL)を、10 U/mL IL-2および持続的にRSVを感染させたマイトマイシン(Sigma社, St Louis, MO)処理繊維芽細胞(BCH4細胞) 2.5×106細胞/mLを含む完全RPMI培地中でインキュベートした。培養物を6日目に、エフェクター細胞の数を変化させながら51Cr標識同系繊維芽細胞に添加することにより、持続的にRSVを感染させた標的細胞(BCH4)または非感染標的細胞(BC) (1×104)の抗原特異的な細胞溶解について試験した。37℃で5時間インキュベーション後、ガンマカウンター中で51Crを測定するため、細胞上清を集めた。特異的細胞溶解の割合を[(検査cpm − 自然放出cpm)/(総cpm − 自然放出cpm)]×100として算出した。自然放出および総放出は、それぞれ培地のみまたは2.5% Triton X-100を添加してインキュベートした標的細胞から決定した。
GXVワクチンの粘膜接種は安全かつ効果的である
プラスミド混合物の鼻腔内投与後の、肺におけるRSV抗原の発現を決定するため、全cDNAに対する発現をRT-PCR法によりmRNAレベルで測定した。mRNAの発現を9つのプラスミドのうち、NS1、NS2、M、SH、F、M2、およびNを含む7つのプラスミドで検出することができた。mRNAは全て、予想されたサイズであった。異なるmRNAの発現には質的な相違が認められた。これらの結果から、鼻腔内投与したプラスミドが、コード化する抗原を肺細胞中で容易に発現することが示唆された。
GXVワクチンおよび裸のプラスミドDNA混合物を受けたマウス群で、肺の炎症について調べ、これらを生理食塩水で処理した対照マウスと比較した。GXVワクチンを受けたマウス群では、裸のプラスミドをワクチン接種した群および対照と比較して、間質および気管支血管周囲束領域における上皮損傷、単核球(MNC)および多核白血球(PMNC)の浸潤が減少していた。肺の組織学は、PBS群では正常な非感染マウスと同様であり、裸のDNAのワクチン接種では上皮の破壊が示されたが、GXVをワクチン接種したマウスでは、正常マウスと同じような肺の表現型が示された。これらの結果から、GXVワクチンはマウスをRSV感染誘発性の肺の炎症から防御することが示唆された。
マウスでGXVワクチンの粘膜投与により特異抗体が誘発されるかどうか決定するため、裸のプラスミド混合物またはGXVワクチンのいずれかを投与したマウスで、RSV特異抗体価を測定した。GXVワクチンをワクチン接種した動物は、対照よりも有意に高い抗体価を示した。鼻はRSV進入の主用部位であることから、分泌型IgA抗体は、粘膜病原体を防御していると考えられる。ワクチン接種の結果として、このクラスの抗体が変化しているかどうか検証するため、鼻腔内洗浄液中の全IgA抗体の量を測定した。GXVワクチンをワクチン接種した動物は、対照よりも有意に高い抗体価を示した。これらの結果から、GXVワクチンにより血清中に抗体、特にIgAの分泌が引き起こされることが示唆された。
IFN-γは主要な抗ウイルス性サイトカインであり、従ってワクチンが効果的であるためには、IFN-γの発現を誘導する必要がある。GXVワクチンによりIFN-γの発現が誘導されるかを調べるため、マウスにGXVワクチンを投与し、それから16日目にRSVを感染させた。21日目に動物を屠殺し、気管支肺胞洗浄を行い、その脾細胞をインビトロで培養した。GXVをワクチン接種したマウスでは、そのBAL溶液中のIFN-γ産生量は対照よりも有意に高くなっていた。また、GXVをワクチン接種したマウスに対し、抗CD3抗体で刺激した培養脾細胞は、対照よりも多くのIFN-γを産生していた。
群どうしをスチューデントのt検定により比較した。群間の相違は、p<0.05で有意であると見なした。全測定値は、平均値±SDとして表した。データを表1に示した。表1の各値は、群(n = 4)内の各マウスから得た個別の6つの肺切片からの5つの領域の平均値±SDを示している。マウスの統計学的集団から、ワクチン接種したマウスでは、PBS対照と比較して、抗原負荷が大幅に減少(77%)していることが明らかとなった(図2B)。これらの結果から、キトサンがpDNAワクチンの性能を高めることおよびGXVによりRSV感染に対する効果的なワクチンが提供されることが示唆された。GXVの鼻腔内投与により気道過敏症が引き起こされるかどうか調べるため、動物の3群の全てにおいて、休止増加 (Penh)のベースライン(%)を測定した。GXVを受けた動物は、裸のDNAまたはPBSのみ(対照)を受けた動物と比較して、メタコリン負荷に対する同様の応答性を示した(図2C)。これらの結果から、GXV処置それ自体では、気道過敏症の有意な変化は引き起こされないことが示唆された。
Claims (20)
- 以下を含む、宿主に呼吸器合胞体ウイルス(RSV)により引き起こされる疾患に対する防御を与えるための免疫原性組成物:
F RSV抗原;
G RSV抗原;および
M、M2、SH、NS1、NS2、N、またはPのうちの少なくとも1つのRSV抗原。 - 粘膜ワクチンである、請求項1記載の免疫原性組成物。
- 以下を含む、宿主に呼吸器合胞体ウイルス(RSV)により引き起こされる疾患に対する防御を与えるための免疫原性組成物:
M2 RSV抗原;および
F、G、M、SH、NS1、NS2、N、またはPのうちの少なくとも1つのRSV抗原。 - 粘膜ワクチンである、請求項3記載の免疫原性組成物。
- 以下を含む、宿主に呼吸器合胞体ウイルス(RSV)により引き起こされる疾患に対する防御を与えるための免疫原性組成物:
F RSV抗原;
G RSV抗原;
M2 RSV抗原;および
M、SH、NS1、NS2、N、またはPのうちの少なくとも1つのRSV抗原。 - 粘膜ワクチンである、請求項5記載の免疫原性組成物。
- F、G、M、M2、SH、NS1、NS2、N、およびPからなる群より選択される少なくとも2つのRSV抗原の組み合わせを含むプラスミドDNA混合物を含む、宿主に呼吸器合胞体ウイルス(RSV)により引き起こされる疾患に対する防御を与えるための遺伝子発現ワクチンであって、該プラスミドDNA混合物がキトサンでコアセルベートとなってナノ粒子を形成する遺伝子発現ワクチン。
- 投与により気道過敏性を変化させない、請求項7記載の遺伝子発現ワクチン。
- 粘膜ワクチンである、請求項7記載の遺伝子発現ワクチン。
- 粘膜ワクチンが経口投与に対して伝導性である、請求項9記載の遺伝子発現ワクチン。
- 粘膜ワクチンが鼻腔内投与に対して伝導性である、請求項9記載の遺伝子発現ワクチン。
- ワクチン投与によりIFN-γの発現が誘導される、請求項7記載の遺伝子発現ワクチン。
- 組成物の免疫学的に有効な量を宿主に投与する段階を含む、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)による感染により引き起こされる疾患に対して宿主を免疫する方法であって、上記段階はF、G、M、M2、SH、NS1、NS2、N、およびPからなる群より選択される少なくとも2つのRSV抗原の組み合わせを含むプラスミドDNA混合物を含み、該プラスミドDNA混合物がキトサンでコアセルベートとなってナノ粒子を形成する方法。
- 投与する段階が経口投与または鼻腔内投与である、請求項13記載の方法。
- 投与する段階により気道過敏症が引き起こされない、請求項13記載の方法。
- 免疫学的に有効な量が単回投与で投与される、請求項13記載の方法。
- 免疫学的に有効な量が宿主の体重1 kg当たり約1mgである、請求項13記載の方法。
- 以下の段階を含む、遺伝子発現ワクチンを作製する方法:
プラスミドDNA混合物を形成するため、少なくとも2つの呼吸器合胞体ウイルス抗原に対するcDNAをpVAXプラスミド中にクローニングする段階;および
プラスミドDNA混合物をキトサンでコアセルベートにする段階。 - コアセルベートにする段階により結果的にナノ粒子が形成される、請求項18記載の方法。
- 呼吸器合胞体ウイルス抗原がF、G、M、M2、SH、NS1、NS2、N、およびPからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
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