CN1301131C - 一种病毒性心肌炎基因疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种病毒性心肌炎基因疫苗，由B3型柯萨奇病毒结构蛋白VP1基因与pcDNA3载体共同构建，并且其外包裹一种生物多糖；本发明还公开了制备该基因疫苗的方法；本发明还公开了该基因疫苗在制备防治病毒性心肌炎的药物中的应用。

Description

一种病毒性心肌炎基因疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属免疫学领域，具体涉及一种由天然生物多糖脱乙酰壳多糖和B3型柯萨奇病毒结构蛋白VP1基因共同构建的、可用于病毒性心肌炎预防和治疗的新型基因疫苗及其制备方法。

背景技术

粘膜免疫是近年来免疫学以及疫苗研究的重点方向之一。许多病毒和细菌自粘膜部位感染后，由于机体未能诱导有效的粘膜免疫应答而使病毒进一步扩散至全身血液及细胞内，使机体诱导的特异CTL应答不足够以清除大量扩散的胞外及胞内病毒，导致病毒等持续性感染。

病毒性心肌炎是主要由粘膜感染的B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染所致，在各年龄组，尤其是青壮年中发病较高，是一常见、多发的心血管系统疾病。目前尚无有效的疫苗进行防治，尤其是缺乏可诱导特异性粘膜免疫应答的疫苗。

1990年Wolff等以裸露DNA注射肌肉局部，在观察到蛋白表达的同时发现诱导了抗原特异性免疫应答，从此开创了基因免疫的时代。基因疫苗具有同时诱导体液、细胞免疫应答的特点，尤其有利于诱导CTL应答，使其成为许多病原体尤其是胞内感染病毒新型疫苗研制的热点候选。

但对于粘膜感染病毒而言，仅诱导特异性CTL应答可能还不足以有效地控制病毒感染，诱导特异性粘膜免疫可能是首要的关键环节。单独以基因疫苗注射机体通常不易诱导粘膜免疫应答，如何改造基因疫苗的结构及形式，使之有利于诱导粘膜免疫，成为部分学者们研究的重点。基因疫苗诱生粘膜免疫应答的困难主要存在于裸露DNA在粘膜局部难于持久保留而易被迅速清除或降解，使基因疫苗因未能有效进入组织局部而不能有效发挥其免疫效能。

基因疫苗若能在粘膜局部被缓慢释放，且避免被粘膜黏液降解，则有可能在粘膜充分地摄入和表达，从而诱生有效的粘膜免疫以及全身免疫应答。我们设想如果能在基因疫苗的外部包裹一层生物外壳，可同时起到粘膜靶向、缓释和防止降解的作用，就可能增强基因疫苗诱生粘膜免疫的效果。甲壳类动物来源的天然生物多糖脱乙酰壳多糖(几丁质(chitin)的脱乙酰衍生物，化学名为β-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，chitosan)证实具有增强粘膜吸收、促进胞间运输、缓释和生物可降解等多种良好特性，已被用于药物赋形剂与缓释剂。为此，本发明中，我们选择CVB3主要结构蛋白VP1编码基因作为基因疫苗的靶抗原，以chitosan多糖包裹基因疫苗，制备了chitosan-DNA复合物疫苗，在B3型柯萨奇病毒(CVB3)感染的小鼠病毒性心肌炎模型上，证实以滴鼻方式将该疫苗免疫小鼠，可综合基因疫苗诱导体液及细胞免疫的优势和chitosan增强粘膜吸收和缓释的特性，增强粘膜免疫应答效应，特异性预防和治疗病毒性心肌炎。

发明内容

本文发明所要解决的技术问题在于提供一种新型病毒性心肌炎基因疫苗，可用于病毒性心肌炎预防和治疗。本发明的病毒性心肌炎基因疫苗由B3型柯萨奇病毒结构蛋白VP1基因与pcDNA3载体共同构建，并且其外包裹一种生物多糖。本发明使用的生物多糖可以是脱乙酰壳多糖(chitosan)，或是其他在体内可起到粘膜靶向、缓释和防止降解作用的物质。

本发明所要解决的技术问题还在于提供一种制备本发明所述的基因疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)以CVB3主要结构蛋白VP1编码基因作为基因疫苗的靶抗原；

(2)以脱乙酰壳多糖包裹基因疫苗，制备复合物疫苗。

本发明所要解决的技术问题还在于提供一种将病毒性心肌炎基因疫苗用于制备防治病毒性心肌炎的药物的应用。本发明的疫苗可在体内外有效表达目的基因CVB3 VP1，并在粘膜局部表达目的抗原。本发明的疫苗可以采用多种免疫方式，包括但不限于滴鼻、口服等。作为一种优选方式，可以采用滴鼻方式免疫。在体内实施免疫后，表达的抗原蛋白可有效诱导CVB3特异性体液(抗体)和细胞(CTL)免疫应答，尤其是可诱导以分泌型IgA为特点的特异性粘膜免疫。这些特异性全身免疫应答和局部粘膜免疫应答比单纯pcDNA3-VP1疫苗显著性强。

在本发明的一个实施例中，由该疫苗诱导的特异性粘膜免疫应答可保护免疫小鼠免受CVB3的攻击，不发生病毒性心肌炎，从而具有防治病毒性心肌炎的作用。

本发明所要解决的技术问题还在于提供一种药物组合物，含有药学上有效量的所述的病毒性心肌炎基因疫苗以及药学上可接受的载体。

附图说明

图1显示了pcDNA3-VP1质粒的鉴定。其中，A显示了pcDNA3-VP1构建示意图；B显示了pcDNA3-VP1的酶切和PCR鉴定电泳图，其中M为DNA marker，1为pcDNA3-VP1的HindIII/BamHI双酶切产物，2～5为质粒pcDNA3-VP1的PCR鉴定示意图(其中2为T7u/T7d引物，3为KV1/KV2引物，4为T7-1/KV2引物，5为KV1/T7-2引物)。

图2显示了chitosan-pcDNA3-VP1透射电镜照片。

图3显示了chitosan-pcDNA3-VP1在Hela细胞中的表达。

图4显示了chitosan-pcDNA3-VP1疫苗滴鼻免疫诱生的CVB3特异性IgG、IgM和IgA应答。

图5显示了chitosan-pcDNA3-VP1滴鼻免疫诱生的CTL杀伤活性，其中*表示P＜0.05。

图6显示了chitosan-pcDNA3-VP1疫苗免疫后的免疫保护力，小鼠3次免疫后4周，以5LD₅₀致死剂量的CVB3 100ul腹腔注射小鼠，逐日观察小鼠存活情况至攻击后28天。

图7显示了小鼠心肌组织的病理学改变，A是正常小鼠的心肌，B是正常小鼠经CVB3攻击后4天的心肌(随后死亡)，C是

chitosan-pcDNA3-VP1免疫组经CVB3攻击后存活28天小鼠的心肌。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：

实施例1.pcDNA3-VP1的构建

1)首先进行Hela细胞的培养及CVB3病毒的培养和传代，方法如下：人宫颈癌细胞系Hela细胞按常规方法培养，以含10％NBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和硫酸卡那霉素的RPMI-1640培养基在37℃、6％CO₂条件下培养，隔天传代一次，传代时以0.02％EDTA消化液37℃温和消化细胞，吹打均匀后1∶2至1∶4传代。以100 1 CVB3病毒冻存液感染约5×10⁶Hela细胞，培养40hr后80％细胞被复制病毒裂解，将液体及细胞碎片以3000rpm/min离心20min，所得上清即新鲜CVB3悬液。

2)自新鲜培养的CVB3中经RT-PCR获得CVB3 VP1基因。方法如下：根据文献报道的CVB3 VP1 cDNA序列(参考Klump WM，Bergmann I，MullerBC，et al.Complete nucleotide sequence of infectious Coxsackievirus B3cDNA：Two initial 5′uridine residues are regained during plus-strand RNAsynthesis[J].J Virol，1990，64(4)：1573-1583.)，设计了VP1上下游引物：KV1：5′-CCCAAGCTTGCCACCATGGGCCCAGTGGAAGACGCG-3′；KV2：5′-CGGGATCCTTACTAAAATGCGCCCGTATTTGTC-3′。并合成pcDNA3载体中克隆位点上下游引物T7-1：5’-CGATGAAGATCTCT-3′；T7-2：5’-CGATGAAGATCTCT-3’。按上海华舜生物公司RNAex Reagent & System Kit提取液相病毒RNA：取200μl CVB3悬液，加入800μl RNAex Reagent LS液体，快速颠倒混匀，室温放置5min，加入200μl氯仿，彻底颠倒混匀，室温放置5min，离心后取上层水相，加500μl异丙醇，室温沉淀10min，离心后以70％乙醇洗涤，最后以20μl DEPC H₂O溶解，此即CVB3总RNA，-70℃保存备用。cDNA合成按上海生工生物公司2-N First Strand cDNA Synthesis Kit进行：总体积20μl，5μl RNA中加入1μl Oligo dT和DEPC水6ul，70℃孵育5min后于4℃加缓冲液4μl、dNTP2μl、Rnase抑制剂1μl(20U/μl)，混匀后37℃孵育5min，随后加入MMLV逆转录酶1μl(20U/μl)，混匀后37℃孵育60min，70℃ 10min，得cDNA，-20℃保存备用。随后进行特异引物PCR扩增：反应总体积25μl，含水13.3ul、10×PCR缓冲液2.5μl、50mmol/L MgCl₂1.5μl、2.5mmol/L dNTP 0.5μl、10pmol/μl KV-1/KV-2引物各0.5μl、TaqDNA聚合酶0.15μl(5U/ul)以及cDNA模板5μl。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火2min，72℃延伸2min，35个循环最后72℃延链10min。取10μl PCR产物走1.0％琼脂糖凝胶电泳，以天能凝胶成像系统拍摄处理。RT-PCR产物即为VP1基因。

3)胶回收经RT-PCR所得VP1基因，方法如下：电泳琼脂糖内RT-PCR产物以Golden Beads DNA Gel Purification Kit纯化回收，割胶称重，按每10mg加400μl Solution S液和20μl Golden Beads，65℃水浴10min，其间每2min混匀一次，使胶彻底溶解；以12000rpm/min离心1min，去上清，加500μl Wash Solution，以手指轻弹混匀，12000rpm/min离心1min，小心吸去上清，以枪头将Beads搅散，50℃5min使干燥；以20μl ElutionBuffer洗脱，37℃2min，12000rpm/min离心1min，小心取上清，其中即含胶回收VP1 DNA。

4)回收VP1 DNA以HindIII、BamHI双酶切，方法如下：酶切总体积20μl，其中H₂O13μl，10×K缓冲液2μl，DNA5μl，HindIII、BamHI各0.1μl(12U/μl)，37℃5hr，将20μl酶切产物全部走1.0％琼脂糖电泳，在紫外灯下小心割下含DNA条带琼脂，称重后按3)所述方法经Golden Beads回收VP1双酶切产物；同理将pcDNA3质粒(购于Invitrogen公司)以HindIII、BamHI双酶切，酶切产物经Golden Beads回收；将Golden Beads回收的经双酶切的VP1和pcDNA3各取5μl跑1.0％琼脂糖电泳，与标准品稀释液比较后粗略定量。

5)VP1酶切片段与pcDNA3酶切载体的连接，方法如下：两者按摩尔比3∶1比例连接，连接反应总体积10μl，其中H₂O 7.5μl，10×缓冲液1μl，pcDNA3双酶切产物1μl，VP1酶切产物0.51，Ligase 1μl(1U/μl)，16℃5hr，而后转化DH5a大肠杆菌，转化过程如下：取5ul连接DNA，加入100-150μl感受态DH5α中，混匀，冰浴45min，42℃热休克90秒，立即置冰浴5min，加入1ml无氨苄青霉素(Amp^r)LB液体培养基，37℃120rpm振荡培养1hr，3000rpm离心5min，弃上清，留约100μl液体悬浮菌体，均匀涂布于含Ap^r LB平板上，37℃温箱培养16-20hr，挑其单克隆菌落培养后小量提取质粒DNA进行鉴定。质粒DNA的小量抽提方法如下：自转化平板或保存平板上挑取单菌落，接种于含Amp^r的2ml LB液体培养基中，37℃ 280rpm振荡培养14-16hr，以NaOH裂解法小量抽提质粒DNA：将1.5ml菌液无菌倒入1.5ml塑料离心管，8000rpm离心2min收集菌体，以100μl SolI(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)悬浮；加入200μl新鲜配制的Sol II(0.2N NaOH，1％SDS)，充分混匀裂解菌体，冰浴10min；加入150μl预冷的Sol III(3M KAc，pH4.8)，轻柔而充分混匀，冰浴10min，令质粒DNA复性；12000rpm室温离心5min弃沉淀，上清移入另一1.5ml塑料离心管，加入2倍体积-20℃预冷无水乙醇，充分混匀，-20℃置20min，15000rpm室温离心20min弃上清，沉淀以70％乙醇洗一次，室温干燥后以50μl无菌三蒸水(含RNase A 50μg/ml)溶解。

6)重组pcDNA3-VP1的筛选和鉴定，分别经电泳、PCR、酶切和DNA测序来鉴定，方法如下：VP1的插入及插入方向由PCR方法初步鉴定：以T7-1/T7-2为正反向引物进行PCR反应鉴定是否有VP1编码基因的插入；以T7-1/KV-2以及T7-2/KV-1为正反向引物进行PCR反应鉴定插入方向是否正确。PCR反应条件为：反应总体积25ul，含H2O 18μl、10×缓冲液2.5μl、25mM MgCl₂1.5μl、10mMdNTP 0.5μl、10mM正反向引物各0.5μl、Taq酶0.125μl/1U、质粒DNA 0.5μl。程序为：94℃变性5min，进入PCR循环：94℃变性45秒、48℃复性45秒、72℃延链45秒，重复35个循环，最后延链10min。进一步分别以Hind III和Bam HI对pcDNA3-VP1进行双酶切，鉴定VP1插入与否以及插入片段大小。最终经DNA测序鉴定，由上海申友DNA测序服务中心采用ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer测序仪测序(图1)。

实施例2.新型病毒性心肌炎基因疫苗chitosan-pcDNA3-VP1的制备

1)分别制备chitosan溶液和pcDNA3-VP1溶液，方法如下：首先制备0.02％、pH5.7的chitosan溶液，称取0.02g chitosan(Sigma，MW＝39000)，先以500μl～1ml 1％ HAc溶液将其缓慢溶解，37℃放置1hr。而后称取0.042gNaAc，以80ml H₂O溶解，加入上述已彻底溶解的chitosan溶液，混匀后，以1N NaOH调节pH值至5.7等，此即0.02％、pH5.7的chitosan溶液。PcDNA3质粒以50mM Na₂SO₄溶解，DNA浓度为1mg/ml，-20℃保存备用。

2)采用复合物共沉淀法制备chitosan-pcDNA3-VP1复合物，方法如下：在55℃水浴中，将0.02％、pH5.7的chitosan溶液逐滴滴入80ug/ml质粒DNA溶液中，同时高速振荡20秒，即可形成均一略带混浊的chitosan-pcDNA3-VP1复合物。

3)以透射电镜观察新鲜制备的chitosan-pcDNA3-VP1复合物，方法如下：将新鲜制备的chitosan-pcDNA3-VP1复合物滴于铜网上，室温5min，以醋酸铀负染，以透射电镜观察并拍照。发现新鲜制备的溶液中含球型或椭圆型、形态均一的颗粒，直径约为80～100nm(图2)。

实施例3.新型病毒性心肌炎基因疫苗chitosan-pcDNA3-VP1的体外表达

以含1μg pcDNA3-VP1 DNA的chitosan-DNA溶液100ul直接滴加于2×10⁵Hela细胞表面，以1μg pcDNA3-VP1 DNA加2μlLipofectamine^TM-2000转染复合物为对照(转染前一天以1-3×10⁵细胞数种入24孔板，前4hr换2ml新鲜无抗生素培养液，细胞密度90-95％为宜。取2ul FuGENE6^TM真核细胞转染试剂加入45μl无血清1640中，小心混匀，室温5min，同时取1μg经QIAGEN纯化试剂盒纯化的质粒pcDNA3-VP1DNA加入50μl无血清1640中，小心混匀，室温5min，将50μl FuGENE6^TM真核细胞转染试剂逐滴加入到50μl DNA中，轻轻拍匀，室温20min促复合物形成；以无血清1640将Hela细胞洗3次，加入100μl无血清1640，而后将100μl pcDNA3-VP1-Lipofectamine^TM-2000转染复合物逐滴加入Hela细胞上，旋转混匀。37℃ 6％CO₂培养24hr后即可收集上清进行检测)收集24hr、48hr、96hr后细胞培养上清及细胞裂解液，与包被液(0.1M Na₂CO₃，pH9.6)等量混合包板过夜，洗板3次后，以1％ BSA-PBS封闭，洗板3次后，依次加入100μl 1∶20稀释鼠抗VP1抗体、100μl HRP-羊抗小鼠IgG和100μl OPD底物，室温避光显色，以2N H₂SO4中止，于490nm测OD值。

结果显示：在强阳离子转染试剂Lipofactamine^TM-2000的辅助下，pcDNA3-VP1质粒在24、48、72hr均可表达，而单独chitosan-pcDNA3-VP1同样能在Hela中获得较好表达，48、72hr的表达与Lipofectamine-pcDNA3-VP1的表达相近，无统计学差异，且在转染24hr表达水平显著高于pcDNA3-VP1(图3)，提示被chitosan包裹的质粒DNA可被细胞正常摄入和表达，且具增强DNA体外表达的功能。免疫组化结果显示chitosan-pcDNA3-VP1可在小鼠鼻咽部有效的表达。

实施例4.新型病毒性心肌炎基因疫苗chitosan-pcDNA3-VP1可诱导增强的CVB3特异性全身免疫和粘膜免疫

1)质粒pcDNA3-VP1的大量制备：依照QIAGEN Plasmid Mega Kit推荐程序进行。取-70℃冻存菌种50μl接种入2ml LB(Amp 100ug/ml)液体培养基，37℃活化8hr，各取活化菌液250ul(1∶1000)加入两瓶各250ml的LB(Amp 100ug/ml)液体培养基中，37℃280rpm振荡培养15hr，6000g、4℃离心15min，收集菌体，在4个高速离心管中各以12.5ml预冷P1(50mMTris-HCl，10mM EDTA/pH8.0，100ug/ml Rnase A)充分悬浮菌体，缓缓加入各12.5ml P2(0.2N NaOH，1％SDS)，轻柔颠倒混匀若干次，室温静置5min，使菌体完全裂解，呈粘稠状，各缓慢加入12.5ml预冷P3(3M KAc，pH5.5)，极轻柔颠倒混匀3次，置于冰上20min，20000g、4℃离心30min，取上清再度20000g、4℃离心15min，此时将tip-2500阴离子交换柱垂直固定，以35ml QBT(750mM NaCl，50mM MOPS，pH7.0，15％异丙醇，0.15％ TritonX-100)过柱使pH值平衡，将离心上清分多次过柱，待液体自然流干后，以100ml QC洗液(1.0mM NaCl，50mM MOPS，pH7.0，15％异丙醇)洗柱2次，去杂蛋白、细菌内毒素，最后以35ml QF洗脱液(1.25M NaCl，50mM Tris-HCl，pH8.5，15％异丙醇)将质粒DNA从柱上洗下，分装于2个50ml高速离心管，各加入24.5ml异丙醇，颠倒混匀后立即以20000rpm、4℃离心30min，仔细弃上清，以7ml 70％乙醇洗涤DNA，去盐份，再以20000rpm、4℃离心20min，仔细弃上清，以空气干燥DNA约20min，最后以少量无菌生理盐水溶解DNA。以紫外分光光度计测DNA溶液的OD260/OD280比值，比值接近1.9认为达到纯度，以OD260＝0.1时的DNA含量为50ug/ml来计算DNA的浓度，将质粒DNA浓度调整为1ug/ul，冻存备用。

2)以chitosan-pcDNA3-VP1疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠诱生CVB3特异性免疫应答，方法如下：将BALB/c雄鼠分为chitosan-pcDNA3-VP1组、pcDNA3-VP1组和pcDNA3组3组，每组6只小鼠。以含50μg质粒DNA的chitosan-DNA、pcDNA3-VP1和pcDNA3于0天、10天、30天滴鼻免疫小鼠。免疫方法是：以0.75％戊巴比妥钠100～130μl经腹腔注射小鼠，使小鼠在30min内轻微麻醉，将小鼠腹面向上平卧，鼻腔向上暴露，以枪头吸取20～40μl新鲜制备的chitosan-pcDNA3-VP1溶液逐滴滴入小鼠鼻孔，歇息5min后再滴加若干chitosan-pcDNA3-VP1溶液，两鼻孔交替进行，直至滴完。

.3)隔周采集血液及粪便样品提取IgM、IgG和IgA。于0周、2周、4周、6周、8周分别收集小鼠血清和粪便，以毛细吸管经小鼠眼眶后皉静脉采血12滴，于4℃放置过夜后以5000rpm/min离心15min后，吸取上消分装20μl/管，-70℃冻存；收集小鼠新鲜粪便，以100mg/ml浓度溶解于含5％脱脂牛奶、10mM Leupeptin、1ug/ml aprotinin、1mM PMSF的PBS溶液中，室温放置1～2hr，以15000rpm/min离心10min后分装200μl/管，-70℃冻存。

4)ELISA检测chitosan-pcDNA3-VP1滴鼻免疫诱生的全身和肠道Ig应答：以含10ug/ml CVB4 VP1_237～249多肽、0.1％BSA的包被液(0.1M Na₂CO₃，pH9.6)4℃过夜包板，PBST洗3遍；以0.5％ BSA-PBS封闭，37℃2hr，洗3遍；加入100ul 1∶20稀释血清及粪便溶液原液，37℃2hr，洗3遍；加入100ul HRP-羊抗小鼠IgG、IgM、IgA，37℃1.5hr，洗4遍；加入100ulOPD底物，室温避光显色7min，加50ul 2N H₂SO4中止，于490nm测OD值。

5)IgM、IgG和IgA的诱生结果：pcDNA3-VP1滴鼻免疫仅在第6周诱生了微弱的IgG(P/N＝2.3)；而chitosan-DNA组在4周后诱生了较高水平的特异性IgM和IgG，第6周P/N值达3.5。更有意义的是，仅有chitosan-基因疫苗组诱生了粘膜IgA的分泌，且IgA水平随时间不断升高，第6周P/N值达3.5(图4)。提示该基因疫苗经滴鼻免疫不仅可诱生较高水平的IgM和IgG，还可诱生肠道局部IgA的产生。

6)特异性CTL的体外刺激培养：处死免疫第8周小鼠，无菌取脾脏。小鼠脾细胞首先在体外经灭活CVB3再刺激培养：首先制备同系未免疫小鼠孵育细胞铺24孔板：无菌取同系未免疫小鼠脾脏，放入尼龙指套中以玻璃针芯碾磨后制成悬液，加入3ml Tris-NH₄Cl/pH7.2室温置3min，去除红细胞，洗涤2次，计数，浓缩于1.6ml无血清1640营养液中，加入400ul0.5mg/ml丝裂霉素C，终浓度100ug/ml，37℃水浴、避光作用45-60min(每10min混匀1次)，洗3次，以完全1640营养液(10％ FCS，pH7.2)悬浮，计数，调浓度为1×10⁶/ml，加入经UV近距离照射灭活2hr的CVB3溶液，终浓度60μl/ml，以1×10⁶/1ml/孔加入24孔培养板，于6％ CO₂、37℃静置2hr。以同样方法制备免疫小鼠脾细胞悬液，调浓度为5×10⁶/ml，以100ul/孔加入96孔U形板进行杀伤实验后，将余细胞以5×106/1ml/孔加入上述含孵育细胞的24孔板，灭活CVB3终浓度30μl/ml，于6％ CO₂、37℃静置培养。48hr后，每孔仔细吸去100μl上清，补加含IL-2、anti-CD28单抗的100ul新鲜完全培养液，终浓度分别为20U/ml、0.1μg/ml。继续培养至96hr，视上清变黄程度，每孔吸去200-500μl营养液，补加含IL-2的新鲜培养液，终浓度20U/ml。体外培养6-7天后进行二次杀伤实验。

.7)特异性CTL活性的检测：以³H-TdR标记法检测特异性CTL，方法如下：靶细胞(4×10⁶)以40uCi³H-TdR(0.8ml体积)在37℃水浴中标记2.5hr(每30min混匀细胞1次)，洗3次，计数，取约2.5×10⁶靶细胞，在3-5ml体积内加入1mg/ml CVB3 VP1_1-15多肽30-50μl(VP1_1-15多肽溶液配制：干燥条件下快速称取多肽0.01g，因多肽含较多疏水氨基酸，加入1.ml DMSO室温溶解3hr，加生理盐水至10ml，多肽终浓度1mg/ml，DMSO含量10％。分装冻-70℃。细胞体外培养时多肽终浓度20-100μg/ml，DMSO量＜0.2％)，终浓度10ug/ml，混匀后同未加入肽的1.5×10⁶靶细胞置孵箱CO₂孵箱中2hr(每30min混匀1次)。取出靶细胞(肽⁺)，洗1次，与靶细胞(肽-)一起计数，调整浓度为2×10⁵/ml，按50ul/1×10⁴/孔加入96孔U底板。免疫小鼠脾细胞即效应细胞，调整浓度为5×10⁶/ml，以该浓度为起始(即效靶比50∶1)在板外作倍比稀释，依次为2.5×10⁶/ml(25∶1)、1.25×10⁶/ml(12.5∶1)、0.625×10⁶/ml(6∶1)，各按100μl/孔加入96孔板中，加样均为三复孔。板以500rpm离心30s，置孵箱CO₂孵箱中5.5hr，取出每孔加入50μl双酶溶液(DNase I 100μg/ml，胰蛋白酶1.2％)，在微量搅拌器上振荡30s，置CO₂孵箱中0.5hr，取出用多头细胞收集仪将各孔内容抽滤于玻璃纤维滤纸上，纸片经40℃烘烤过夜，将纸片撕下，放入塑料小管，加约600μl闪烁液(PPO2.5g，POPOP 0.25g，二甲苯500ml，提前2周前配好)，将小管放入玻璃套管，旋盖，以液体闪烁计数器测量CPM值。杀伤活性计算：设自发释放(靶细胞+营养液)、最大释放(靶细胞+1％Triton X-100)。三复孔计平均值。

同时要求：自然释放率＜10％，结果较为可靠。

8)特异性CTL活性结果：在体外经特异抗原刺激培养一周后作为效应细胞；以VP1多肽孵育SP2/0细胞为靶细胞，进行特异性CTL杀伤测定，结果显示：效靶比为25∶1时，chitosan-pcDNA3-VP1组特异性杀伤率达25％，而pcDNA3-VP1组和pcDNA3组杀伤为10％以下(图5)，统计显示有显著差异(P＜0.05)。提示pcDNA3-VP1基因疫苗诱生了较强的CVB3特异性细胞免疫应答。

实施例5.新型病毒性心肌炎基因疫苗chitosan-pcDNA3-VP1可防治病毒性心肌炎

1)CVB3病毒的LD₅₀(半数致死量)滴定：取出生48hr的BALB/c乳鼠，分为8组，每组5只小鼠，将新鲜制备的CVB3悬液以NS以10倍递次稀释法依次稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，分别取40μl经腹腔注射8组乳鼠，逐日观察乳鼠存活情况，按病毒学常规方法计算该批次CVB3病毒的LD₅₀效价。

距离比例＝(＞50％的死亡百分数-50)/(＞50％的死亡百分数-＜50％的死亡百分数)

LD₅₀＝＞50％的死亡率稀释度的对数(Log)+距离比例

本试验中同一批次内CVB3的LD₅₀效价为10^-5.5/100μl

.2)5×LD50CVB3攻击试验：以chitosan-pcDNA3-VP1末次免疫小鼠后28天(3次免疫后第4周)，以致死剂量5LD50活CVB3病毒100ul经腹腔攻击小鼠，逐日观察小鼠存活情况至攻击后28天，而后取不同处理组小鼠左心室组织，制备石蜡切片，HE染色后以普通光镜观察其组织病理学改变。发现pcDNA3和pcDNA3-VP1组小鼠分别在12和22天以内死亡，平均存活天数分别为8.5天和10.8天，而chitosan-pcDNA3-VP1滴鼻免疫组发病较晚、症状显著减轻，存活延长，并有33.3％小鼠实现长期存活(图6)。心肌细胞HE染色显示：chitosan-pcDNA3-VP1滴鼻小鼠的心肌细胞间质偶尔见有水肿，但无明显病变及炎性细胞浸润，类似于正常小鼠心肌；而pcDNA3-VP1组心肌细胞呈严重的灶性坏死，伴弥漫性淋巴细胞浸润，显示小鼠心肌遭CVB3严重破坏(图7)。提示chitosan-pcDNA3-VP1疫苗滴鼻诱导的CVB3特异性免疫应答可较好地清除CVB3，使心肌不受感染或感染程度较轻。

Claims (5)

1.一种病毒性心肌炎基因疫苗，其特征在于，它是由B3型柯萨奇病毒结构蛋白VP1基因与pcDNA3载体共同构建，并且其外包裹脱乙酰壳多糖，构建后的复合物的颗粒直径在80～100nm之间。

2.根据权利要求1所述的基因疫苗，其特征在于，它以滴鼻方式或者口服方式实施免疫。

3.一种制备权利要求1所述的基因疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以CVB3主要结构蛋白VP1编码基因作为基因疫苗的靶抗原；

(2)以脱乙酰壳多糖包裹基因疫苗，制备复合物疫苗。

4.权利要求1所述的病毒性心肌炎基因疫苗在制备预防和治疗病毒性心肌炎的药物中的应用。

5.一种药物组合物，其特征在于，它含有药学上有效量的权利要求1所述的病毒性心肌炎基因疫苗以及药学上可接受的载体。

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