CN102512662B - 含有柯萨奇b3病毒2b蛋白中36-83位氨基酸基序的蛋白质及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有柯萨奇B3病毒2B蛋白中36-83位氨基酸基序(SEQ ID NO.1所示)的蛋白质及其应用，优选的，所述的蛋白质为柯萨奇B3病毒2B蛋白及其截短型蛋白，更优选为SEQ ID NO.1所示的蛋白质。本发明还涉及编码该所述的蛋白质的核苷酸序列，含有该核苷酸序列的载体，以及含有该载体的宿主细胞，将所述的载体转染至肿瘤细胞(HeLa细胞)，可进一步诱导肿瘤细胞发生自噬性细胞凋亡，证明所表达的蛋白具有引起肿瘤细胞自噬而抑制肿瘤细胞生长的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种引起肿瘤细胞发生自噬性细胞凋亡的蛋白质及其应用，特别涉及柯萨奇B3病毒2B蛋白在制备抗肿瘤药物或肿瘤治疗辅助药物中的应用，尤其是涉及柯萨奇病毒非结构蛋白2B中36-83位氨基酸基序在通过引起肿瘤细胞自噬而抑制肿瘤细胞生长中的应用，属于生物医学领域。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康以及生命的重要疾病，目前肿瘤的主要治疗手段是手术、放射治疗和化学治疗等，这些方法虽然取得一定的成效，但是还无法彻底根治肿瘤，且均存在一定副作用，例如化学治疗所造成的骨髓抑制、食欲减低、腹泻，放射治疗所引起的吞咽困难等。不仅如此，这些传统的治疗除具有副作用外，还有一些治疗的盲点，例如抗药性的产生等。随着现代分子生物学及其技术的发展，肿瘤的治疗更加多样化，出现了一些新的治疗或辅助治疗的方法，这其中就包括利用病毒制备抗肿瘤药物。2010年，中国国家知识产权局公开了一种植物病毒在制备恶性肿瘤的药物中的应用(CN101653462A)，其利用一种植物病毒(烟草花叶病毒)转染至恶性肿瘤细胞(HeLa细胞)中，在肿瘤细胞内发生复制并且诱导肿瘤细胞发生自噬与凋亡性死亡。某些病毒也可通过破坏肿瘤细胞的生长治疗肿瘤，柯萨奇病毒A组21型可作为潜在的抗多形性骨髓瘤的治疗手段。(Au GG，Lincz LF，Enno A，Shafren DR.Oncolytic CoxsackievirusA21as a novel therapy for multiple myeloma.Br J Haematol.2007；137(2)：133-141.)
对肿瘤细胞死亡以及抗死亡特性的研究，多集中于肿瘤细胞的凋亡机制，然而，肿瘤细胞中凋亡抗性的存在已经成为肿瘤治疗的主要障碍，而自噬与肿瘤作用的研究正是解决这一问题的关键。自噬是细胞利用溶酶体降解自身大分子物质和受损的细胞器的生物学过程。自噬可通过隔离受损细胞器促进蛋白的分解代谢或增加基因组稳定性而发挥抗肿瘤作用。细胞自噬有维持细胞稳态的作用，也影响肿瘤的发生和发展，成为肿瘤靶向治疗的潜在靶点，因此，如何在肿瘤治疗中发挥自噬的作用是当前研究的热点。目前已知一些抗肿瘤药物的作用途径与自噬有关，如他莫昔芬(tamoxifen)可诱导乳腺癌MCF-7细胞产生自噬性死亡(Bursch W，Ellinger A，KienzlH et al.Active cell death induced by theanti-estrogens tamoxifen and ICI 164 384in human mammary carcinoma cells(MCF-7)in culture：the role of autophagy.Carcinogenesis，1996，17(8)：1595-1607.)；长春新碱(vincristine)可以诱导肝癌细胞HepG2的自噬性凋亡，但直接发挥诱导自噬作用而抑制肿瘤的药物却很少。
在某些病毒性疾病中，也发现了自噬作用的发生，脊髓灰质炎病毒(poliovirus)2BC蛋白通过促进表达微管相关蛋白1的轻链3(LC3)，从而促进293T细胞的自噬发生(Jackson WT，Giddings TH Jr，Taylor MP，Mulinyawe S，Rabinovitch M，Kopito RR，Kirkegaard K.Subversion of cellular autophagosomalmachinery by RNA viruses.PLoS Biol.2005，3(5)：861-871.)；人类单纯疱疹病毒(HSV)通过激活蛋白激酶R(PKR)从而促进自噬小体的形成(Talloczy Z，VirginHW 4th.Levine B.PKR-dependent autophagic degradation of herpes simplex virustype 1.Autophagy.2006，2(1)：24-29.)。柯萨奇病毒B组3型(CVB3)可以引起HeLa细胞发生自噬(Wong J，Zhang J，Si X，Gao G，Mao I，McManus BM，Luo H.Autophagosome supports coxsackievirus B3replication in host cells.J Virol.2008；82(18)：9143-9153.)。但目前还没有通过病毒蛋白的真核表达载体，直接促进细胞自噬作用，从而抑制肿瘤的研究。
发明内容
本发明的目的在于通过利用柯萨奇病毒引起肿瘤细胞发生自噬，发现柯萨奇病毒2B蛋白中36-83位氨基酸基序可以引起肿瘤细胞发生自噬性细胞凋亡而死亡，进而提供柯萨奇病毒在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
因此，本发明所要解决的第一个技术问题是提供了含有SEQ ID NO.1所示序列的蛋白质在制备治疗肿瘤药物中的用途；
优选的，所述的蛋白质为柯萨奇B3病毒2B蛋白(用CVB3-2B表示)；
优选的，所述的蛋白质为截短型柯萨奇病毒2B重组蛋白，更优选的，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(用CVB3-2B36-83表示)；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质以及编码所述蛋白质的核苷酸序列。
优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供了一种表达载体，其特征在于含有以上所述的核苷酸序列。
优选的，所述的表达载体为真核表达载体，更优选的所述表达载体为pEGFP-C1。
本发明所要解决的第四个技术问题是提供了一种宿主细胞，其特征在于含有以上所述的表达载体。
优选的，所述宿主细胞为人宫颈癌细胞HeLa细胞。
本发明所要解决的第五个技术问题是提供了本发明所述的核苷酸序列在制备治疗肿瘤药物中的用途。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术措施：
(1)构建柯萨奇病毒CVB3-2B蛋白与绿荧光蛋白融合基因的表达载体；
(2)观察到柯萨奇病毒CVB3-2B蛋白与绿荧光蛋白融合蛋白可有效的在肿瘤细胞中表达；
(3)观察柯萨奇病毒CVB3-2B蛋白与绿荧光蛋白融合蛋白可诱导肿瘤细胞发生自噬；
(4)构建柯萨奇病毒CVB3-2B截短蛋白与绿荧光蛋白融合基因的表达载体；
(5)观察到柯萨奇病毒CVB3-2B截短蛋白与绿荧光蛋白融合蛋白可有效的在肿瘤细胞中表达；
(6)观察到柯萨奇病毒CVB3-2B截短蛋白与绿荧光蛋白融合蛋白可诱导肿瘤细胞发生自噬；
(7)构建柯萨奇病毒CVB3-2B36-83与绿荧光蛋白融合基因的表达载体；
(8)观察到柯萨奇病毒CVB3-2B36-83与绿荧光蛋白融合蛋白可有效的在肿瘤细胞中表达；
(9)观察到柯萨奇病毒CVB3-2B36-83与绿荧光蛋白融合蛋白可诱导肿瘤细胞发生自噬。
本发明提供的技术方案是：柯萨奇病毒在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用
本发明成功构建了柯萨奇病毒B组3型(CVB3)2B蛋白及CVB3-2B36-83与绿荧光蛋白(EGFP)融合基因的表达载体，转染至肿瘤细胞(HeLa细胞)，进一步这些表达载体在肿瘤细胞中表达病毒蛋白及绿荧光蛋白，最终诱导了肿瘤细胞发生自噬性细胞凋亡而死亡。
本发明尚属首创，将CVB3病毒蛋白(CVB3-2B)与绿荧光蛋白融合基因克隆至真核表达载体，构建得到融合蛋白的真核表达载体，将其转染至肿瘤细胞(HeLa细胞)，进一步诱导肿瘤细胞发生自噬性细胞凋亡，构建病毒蛋白2B截短蛋白与EGFP融合基因的表达载体，转染至肿瘤细胞(HeLa细胞)，进一步确定2B蛋白诱导细胞自噬性细胞凋亡的功能基序为aa36-aa83(SEQ ID NO.1所示)。针对柯萨奇病毒2B蛋白这一特性可将其用于肿瘤的治疗，如随后具体实施例结果所示，通过免疫荧光细胞定位与蛋白表达特点认定CVB3-2Baa36-aa83(SEQ ID NO.1所示)基序为引起肿瘤细胞自噬性凋亡的功能基序。
除编码CVB3-2B aa36-aa83氨基酸序列的核苷酸序列以外，还包括含有上述核苷酸序列的原核或真核表达载体以及含有原核或真核表达载体的宿主细胞也当然属于本发明的保护范畴之列。
该蛋白基序可应用于制备治疗肿瘤的药物，可将其制成活性成分，在肿瘤治疗中通过各种途径给药，包括但不限于肿瘤内给药以及局部肿瘤血管内给药或通过脂质体包装该病毒2B蛋白自噬功能基序为一种脂质体药物制剂直接导入肿瘤内发挥杀伤肿瘤效应。此外，该蛋白基序还可用于联合其他自噬功能蛋白或其自噬功能基序治疗肿瘤。也可用于联合其他治疗恶性肿瘤的手段如化学药物疗法、局部或肿瘤内放射疗法等手术治疗手段，而作为一种辅助治疗肿瘤的手段。以柯萨奇病毒蛋白为活性成分制备抗肿瘤药物具有以下优点：
(1)作为良好的自噬诱导剂，抑制肿瘤细胞的生长；
(2)此氨基酸基序为病毒蛋白的一段氨基酸，不含有活病毒，无致病性；
(3)此氨基酸基序分子量小，易于加工、吸收。
附图说明
图1是柯萨奇病毒B组3型2B与绿荧光蛋白融合蛋白真核表达质粒的构建模式图；
图2是荧光显微镜观察CVB3-2B36-83在HeLa细胞中的表达；
图3是荧光显微镜观察CVB3-2B36-83诱导HeLa细胞中LC3聚集情况；
图4是CVB3-2B36-83诱导HeLa细胞LC3的表达；
图5是电镜观察CVB3-2B36-83引起HeLa细胞凋亡。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1柯萨奇病毒B组3型2B融合蛋白真核表达质粒的构建及细胞表达鉴定
本实施例中的CVB3-2B36-83自噬功能基序氨基酸序列为(SEQ ID NO.1所示)：
Asp-Ser-Ile-Leu-Glu-Lys-Ser-Leu-Lys-Ala-Leu-Val-Lys-Ile-Ile-Ser-Ala-Leu-Val-Ile-Val-Val-Arg-Asn-His-Asp-Asp-Leu-Ile-Thr-Val-Thr-Ala-Thr-Leu-Ala-Leu-Ile-Gly-Cys-Thr-Ser-Ser-Pro-Trp-Arg-Trp-Leu
本实施例中的CVB3-2B36-83自噬功能基序核苷酸序列为(SEQ ID NO.2所示)：
GACTCCATCTTAGAGAAGTCTCTAAAAGCCTTAGTTAAGATAATATCAGCCTTAGTAATTGTGGTGAGGAACCACGATGACCTAATCACGGTGACTGCCACACTAGCCCTCATTGGTTGTACCTCGTCCCCATGGCGGTGGCTT
1.1CVB3-2B36-83与绿荧光蛋白(EGFP)融合基因的表达载体的构建
1.1.1CVB3-2B、CVB3-2B36-83核酸片段的制备
以含有CVB3全基因的质粒pMKS1(Mark K.Slifka，Robb Pagarigan，IgnacioMena，Ralph Feuer，J.Lindsay Whitton.Using recombinant coxsackievirus B3toevaluate the induction and protective efficacy of CD8+T cells during picornavirusinfection.J Virol.2001；75(5)：2377-2387.)为模板，引物为：
2B PF：5’ATATATAAGCTTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGGAGTGAAGGACTATGTGGAAC3’；
2B PR：5’ATAGCGTCTAGATTATTGGCGTTCAGCCATGGGTATTCCGT3’；
2B36-83PF：5’ATATATAAGCTTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACTCCATCTTAGAGAAGTCTCT3’；
2B36-83PR：5’ATATATTCTAGATTAAAGCCACCGCCATGGGGACGAGGTAC3’
引物2B PF、2B PR用于扩增CVB3-2B全长基因，引物2B36-83PF、2B36-83PR用于扩增CVB3-2B36-83基因。
用上述引物PCR扩增CVB3-2B基因、CVB3-2B36-83基因片段，DNA聚合酶为LA Taq DNA Polymerase(购自日本TaKaRa)。
反应条件：95℃5min，95℃45s，61℃45s，72℃1min，共30个循环，再72℃充分延伸10min。
1.1.2pEGFP-C1质粒平台的构建
以pcDNA3.1(+)(购自美国Invitrogen)作为基本质粒骨架，从pEGFP-N1质粒(购自美国Invitrogen)上扩增出EGFP的核酸片段，将绿荧光蛋白EGFP基因片段插入pcDNA3.1(+)质粒，构建pEGFP-C1质粒平台，用于CVB3各功能蛋白与EGFP的融合蛋白真核表达质粒的构建。
1.1.2.1EGFP核酸片段的制备
在上下游引物的5’端分别加入限制性内切酶核酸位点NheI(TAGCTA)和HindIII(AAGCTT)用于之后的载体连接。以pEGFP-N1为模板，利用引物PF-pEGFP-C1(5′-ATATATAGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3′)和PR-pEGFP-C1(5′-GCTTTAAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3′)PCR扩增3’端不含终止密码子的EGFP片段。反应条件为：95℃5min，95℃45s，56℃45s，72℃1min，共30个循环，再72℃充分延伸10min，DNA聚合酶为LA Taq DNA Polymerase(购自日本TaKaRa)。胶回收纯化EGFP片段(胶回收试剂盒购自中国华舜)，胶回收操作参考试剂说明书。
双酶切EGFP片段后再通过胶回收的方法进行纯化。双酶切反应条件为37℃4h，限制性内切酶NheI和HindIII(购自日本TaKaRa)，胶回收纯化酶切后的目的片段。
1.1.2.2克隆用载体的制备
所用载体由NheI和HindIII双酶切质粒pcDNA3.1(+)后胶回收而获得。双酶切反应条件为37℃4h，限制性内切酶NheI和HindIII(购自日本TaKaRa)，胶回收纯化酶切后的目的载体。
1.1.2.3目的片段与载体的连接
按目的片段与各自载体5∶1的质量比建立连接体系，混匀后，16℃过夜连接。T4DNA Ligase(购自日本TaKaRa)。
1.1.2.4将连接产物转化入感受态细胞中，筛选并鉴定阳性克隆
1.1.3pEGFP-2B、pEGFP-2B36-83融合重组质粒的构建：
应用限制性内切酶核酸位点HindIII(AAGCTT)和XbaI(TCTAGA)对pEGFP-C1进行双酶切处理并对酶切后开环质粒进行胶回收。再分别与CVB3-2B、CVB3-2B36-83核酸片段连接，并在EGFP读码框下游连接了保证两侧蛋白空间结构相对独立的柔性连接(5’-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-3’)，载体构建如图1所示，可分别得到所述的两种融合蛋白表达载体pEGFP-CVB3-2B36-83及pEGFP-CVB3-2B。载体测序结果正确。
1.2融合蛋白的表达
1.2.1真核细胞转染实验：将人宫颈癌细胞HeLa细胞(购自美国ATCC)以2×104个/孔的密度铺于48孔板内，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85％-90％时，将0.8μg的融合蛋白质粒pEGFP-CVB3-2B36-83及pEGFP-CVB3-2B分别转染至HeLa细胞内，所用的转染试剂为Lipofectamine 2000(购自美国Invitrogen)，转染操作参考试剂说明书。
1.2.2培养12h后在荧光显微镜下观察融合蛋白的表达
试验结果见图2，从试验结果可见，CVB3-2B、CVB3-2B36-83均与EGFP融合蛋白可以表达绿色荧光。
实施例2病毒蛋白表达载体引起HeLa细胞发生自噬性细胞凋亡
2.1.融合重组质粒与pmCherry-LC3质粒共转染HeLa细胞观察细胞自噬
2.1.1pmCherry-LC3质粒构建
2.1.1.1LC3目的片段的获取
应用限制性内切酶BglII和EcoRI(购自日本TaKaRa)酶切pEGFP-LC3(Kabeya Y，Mizushima N，Ueno T，Yamamoto A，Kirisako T，Noda T，KominamiE，Ohsumi Y，Yoshimori T.LC3，a mammalian homologue of yeast Apg8p，islocalized in autophagosome membranes after processing.EMBO J.2000；19(21)：5720-5728.)获取目的片段LC3，双酶切核酸片段反应条件为37℃4h。胶回收纯化酶切后的LC3目的片段。
2.1.1.2克隆用载体pmCherry-C1的制备
应用限制性内切酶BglII和EcoRI酶切载体pmCherry-C1(购自日本Clontech公司)，双酶切核酸片段反应条件为37℃4h。胶回收纯化酶切后的载体。
2.1.1.3目的片段与载体的连接
按目的片段与载体5∶1的质量比建立连接体系，混匀后，16℃过夜连接。T4DNA Ligase(购自日本TaKaRa)。
2.1.1.4将连接产物转化入感受态细胞中，筛选并鉴定阳性克隆
2.1.2融合重组质粒与pmCherry-LC3质粒共转染HeLa
将人宫颈癌细胞HeLa细胞(购自美国ATCC)以2×104个/孔的密度铺于48孔板内，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85％-90％时，将0.8μg的融合蛋白质粒pEGFP-CVB3-2B36-83及pEGFP-CVB3-2B，分别与0.8μg的pmCherry-LC3质粒，共转染至HeLa细胞内，所用的转染试剂为Lipofectamine 2000(购自美国Invitrogen)，转染操作参考试剂说明书。培养12h后在荧光显微镜下观察融合蛋白与LC3的定位情况。
试验结果见图3，从试验结果可见，带有红色荧光的LC3发生点状聚集，说明融合蛋白引起细胞自噬。
2.2融合基因表达载体诱导HeLa细胞中自噬相关蛋白LC3-II与LC3-I的表达
2.2.1融合重组质粒转染HeLa细胞：
将人宫颈癌细胞HeLa细胞(购自美国ATCC)以1×105个/孔的密度铺于6孔板内，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85％-90％时，将4μg的融合蛋白质粒pEGFP-CVB3-2B36-83，pEGFP-CVB3-2B及对照pEGFP-C1(NC)，分别转染至HeLa细胞内，所用的转染试剂为Lipofectamine 2000(购自美国Invitrogen)，转染操作参考试剂说明书。
2.2.2表达产物的收获：转染12h后，每孔加入200μL的1×PBS，用细胞刮刀将细胞刮下来，放入2ml离心管中，1500转离心5min。小心弃掉上清，在离心管中加入300μL已经放好蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，冰上裂解10min。离心14,000转4℃10min，用1.5mL离心管收取上清液，分装放入-20℃冰箱储存。
2.2.3利用特异性抗体通过western blotting方法检测LC3-II与LC3-I的表达
2.2.3.1聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳：向125μL收获的细胞上清中加入25μL6×loading buffer(0.35M Tris-HCl pH6.8，30％甘油，10％SDS，0.012％溴酚蓝，6％β-巯基乙醇)或6×non-reduced loading buffer(0.35M Tris-HCl pH6.8，30％甘油，10％SDS，0.012％溴酚蓝)，充分混匀，100℃煮沸2min，离心8000转，4℃10min，蛋白样品加载至8％SDS-PAGE凝胶中，80V电泳1h，120V电泳2h。
2.2.3.2Western blotting：电泳结束后，将蛋白质转印至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉于4℃封闭过夜。封闭后的PVDF膜与兔抗人LC3单克隆抗体(1∶500，购自美国MBL)于37℃孵育1h，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(购自中国中杉金桥)于37℃孵育1h。加入过氧化物酶底物，显示蛋白条带。
试验结果见图4，从试验结果可见，CVB3-2B、CVB3-2C、CVB3-3A组可以促进LC3II/LC3I的比值增加，但CVB3-3B无此作用。CVB3-2B36-83、CVB3-2C1-79、CVB3-3A51-89组也可促进LC3II/LC3I的比值增加。
2.3利用电镜观察融合基因表达载体诱导HeLa细胞凋亡
将人宫颈癌细胞HeLa细胞(购自美国ATCC)以1×105个/孔的密度铺于6孔板内，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85％-90％时，将4μg的融合蛋白质粒，5μL脂质体转染至HeLa细胞中，所用的转染试剂为Lipofectamine 2000(购自美国Invitrogen)，转染操作参考试剂说明书。培养12h后在荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。弃掉板内培养液，加入1mL 1×PBS(pH7.4)，静置5min，弃掉重复3次，用消化液消化，用500μL1×PBS(pH7.4)将细胞吹匀放入500μL离心管中，1500转离心10min弃上清。每个离心管中加入500μL戊二醛固定液，固定48h后，电镜观察。
试验结果见图5，从试验结果可见，pEGFP-CVB3-2B、pEGFP-CVB3-2B36-83转染组细胞出现核固缩，发生凋亡。
Claims (7)
1.柯萨奇B3病毒2B蛋白在制备治疗肿瘤药物中的用途。
2.截短型柯萨奇B3病毒2B重组蛋白在制备治疗肿瘤药物中的用途，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质。
4.编码权利要求3所述蛋白质的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
6.一种表达载体，其特征在于含有如权利要求4或5所述的核苷酸序列，所述的表达载体为pEGFP-C1。
7.权利要求4所述的核苷酸序列在制备治疗肿瘤药物中的用途。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |