JP4361954B2 - アデノウィルス核酸を含有する医薬用組成物 - Google Patents

Description

本発明はアデノウィルス核酸を含有する核酸、この核酸を含有するアデノウィルス及びこれらの使用に関する。

現在、腫瘍治療には数多くの治療策が用いられている。外科的技法の使用に加え、化学療法や放射線療法が主に用いられている。しかし、これらの方法はどれも、患者にとってかなりの副作用を伴うものである。

複製選択的腫瘍溶解性ウィルスの使用は、腫瘍治療に新しい領域を創り出している。この方法では、作用ウィルスの複製が選択的に腫瘍内で誘発され、ウィルスが複製されると共に、感染腫瘍細胞が溶解し、周囲の腫瘍細胞へのウィルス感染が起こる。このウィルスは腫瘍細胞内でのみ複製されるため、正常組織はウィルスによる感染から防御され、よってウィルス性溶解からも防御される。このような複製選択的腫瘍溶解性ウィルスの例としては、遺伝子弱毒化アデノウィルスやヘルペスウィルスが挙げられる（マルトゥーサＲ．（Martuza, R.）ら、サイエンス（Science）、２５２、８５４〜８５８（１９９１）;フエヨＪ．(Fueyo, J.）ら、癌遺伝子（Oncogene）１９、２〜１２（２０００）)。

このようなアデノウィルスの一例として、臨床第Ｉ相と第ＩＩ相における使用が既に成功しているｄｌ １５２０（Ｏｎｙｘ−０１５）が挙げられる（クーリＦ．（Khuri, F.）ら、自然医学（Nature Medicine）、６、８７９〜８８５（２０００））。Ｏｎｙｘ−０１５は、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子が欠失したアデノウィルスである。Ｅ１Ｂ５５ｋＤａの遺伝子産物は、ｐ５３の阻害、ウィルスｍＲＮＡの輸送、及び宿主細胞のタンパク合成の停止に関与している。ここで、ｐ５３は、アデノウィルスがコードしているＥ１Ｂ５５ｋＤａタンパクがｐ５３と複合体を形成するために阻害される。ｐ５３はＴＰ５３にコードされており、複雑な調節機構の礎であり（ザンベッティＧ．Ｐ．（Zambetti, G.P.）ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、７、８５５〜８６５）、例えば、細胞内でのウィルス（アデノウィルス等）の効率的な複製を抑制する。ＴＰ５３遺伝子は、約５０％のヒト腫瘍中で欠失しているか変異しているため、化学療法や放射線療法の結果として望まれるアポトーシスが起こらず、通常、これらの腫瘍治療は効果が上がらない。

アデノウィルス等のＤＮＡ腫瘍ウィルスは、ウィルスのＤＮＡ複製を促進するために、その感染細胞を細胞周期のＳ期に進ませる。Ｏｎｙｘ−０１５はＥ１Ｂ５５ｋＤａタンパクを発現せず、選択的に腫瘍細胞内において複製されるが、正常細胞では複製されない。更に、別の選択性として、ｐ５３が欠損している腫瘍は、野生型ｐ５３を有する腫瘍より、ウィルスによる腫瘍細胞の溶解により壊死する程度が大きいという点がある（クーリ（Khuri）ら、前出)。ｐ５３欠損腫瘍の場合のウィルス誘導腫瘍溶解において、Ｏｎｙｘ−０１５は基本的には有効であるが、治療した腫瘍の１５％という成功率は極めて低い。

リーズらは、野生型ｐ５３の腫瘍に対してであってもＯｎｙｘ−０１５を使用できる基本的な手法を記載している（リーズＳ．Ｊ．（Ries, S.J.）ら、自然医学（Nature Medicine）、６、１１２８〜１１３２（２０００））。この場合、腫瘍抑制タンパクｐ１４ＡＲＦは発現しない。ｐ１４ＡＲＦが存在しないことによりウィルス感染に対するｐ５３システムの正常な反応が起こらないため、Ｏｎｙｘ−０１５が腫瘍内でも複製される。しかしながら、この知見を適用するには、腫瘍細胞において適切な遺伝子バックグラウンドが存在する、あるいは適切な治療手段によりこのようなバックグラウンドが供給される必要がある。前者の場合は、Ｏｎｙｘ−０１５を用いて治療され得る腫瘍の数が更に少なくなるであろうし、後者の場合は、腫瘍細胞の遺伝子バックグラウンドにおける複雑な改変が必要であろう。
マルトゥーサＲ．（Martuza, R.）ら、サイエンス（Science）、２５２、８５４〜８５８（１９９１） フエヨＪ．(Fueyo, J.）ら、癌遺伝子（Oncogene）１９、２〜１２（２０００） クーリＦ．（Khuri, F.）ら、自然医学（Nature Medicine）、６、８７９〜８８５（２０００） ザンベッティＧ．Ｐ．（Zambetti, G.P.）ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、７、８５５〜８６５ リーズＳ．Ｊ．（Ries, S.J.）ら、自然医学（Nature Medicine）、６、１１２８〜１１３２（２０００）

本発明の目的は、現存のウィルス誘導腫瘍溶解用アデノウィルスシステムを改良することである。特に、先行技術と比較して腫瘍治療の成功率を上昇させることが可能な医薬用組成物を提供することにある。

本発明の別の目的は、所望の効果を有するアデノウィルス核酸又はアデノウィルスの、上記医薬用組成物の製造のための使用、を提供することにある。

本発明において上述の目的は、ＹＢ−１をコードする核酸配列を含むアデノウィルス核酸を含むことを特徴とする医薬用組成物、さらに、当該アデノウィルス核酸の当該医薬用組成物の製造のための使用、によって達成される。

一態様においては、前記アデノウィルス核酸は、アデノウィルス核酸におけるＥ１をコードするアデノウィルス核酸配列が欠損し又は不活性化されていることを特徴とする。

他態様においては、前記Ｅ１はＥ１Ｂであることを特徴とする。

他態様においては、前記Ｅ１Ｂは、Ｅ５５ｋＤａタンパク質であることを特徴とする。

他態様においては、前記アデノウィルス核酸は、アデノウィルス核酸におけるＥ１Ａをコードする核酸配列が欠損し又は不活性化されていることを特徴とする。

他態様においては、アデノウィルス核酸に感染した腫瘍細胞において、当該アデノウィルス核酸が増幅することを特徴とする。

他態様においては、上記腫瘍細胞は、その細胞核内にＹＢ−１が存在することを特徴とする。

他態様においては、ＹＢ−１の腫瘍細胞核における存在は、外因性処置の影響下において達成されることを特徴とする。

他態様においては、上記外因性処置は、照射、細胞分裂抑制剤及び高熱、からなる群から選択される１種以上の処置であることを特徴とする。

他態様においては、上記アデノウィルス核酸の増幅が、Ｅ２プロモーターの活性化により行われることを特徴とする。

他態様においては、上記Ｅ２プロモーターが、後期Ｅ２プロモーターであることを特徴とする。

他態様においては、本発明の医薬用組成物は、上記のアデノウィルス核酸を有するアデノウィルスを含有することを特徴とする。

他態様においては、本発明の医薬用組成物は、腫瘍疾患の治療及び／又は予防に使用されることを特徴とする。

他態様においては、腫瘍疾患の基となる腫瘍は、ｐ５３陽性腫瘍、ｐ５３陰性腫瘍、悪性腫瘍、両性腫瘍並びにこれらの組み合わせの腫瘍、からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする。

他態様においては、本発明の医薬用組成物は、薬学的に腫瘍の治療及び／又は治療に有効な化合物を、更に含むことを特徴とする。

他態様においては、上記薬学的に腫瘍の治療及び／又は治療に有効な化合物は、細胞分裂抑制剤（cytostatic agents）であることを特徴とする。

他態様においては、上記細胞分裂抑制剤は、シスプラチン(cis-platinum)、タキソール(Taxol)、ダウノブラスチン(Daunoblastin)、アドリアマイシン(Adriamycin)及びミトキサントロン(Mitoxantron)からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする。

本明細書において、核酸は、核酸配列も意味するものとして用いる。本発明の核酸及び本発明のアデノウィルスは、特に、それらが野生型と比べて改変されたものである場合、組換え産物であることが好ましい。本発明においては、本発明の核酸及び本発明のアデノウィルスは通常、Ｅ１欠失、Ｅ１〜Ｅ３欠失及び／又はＥ４欠失である。即ち、本発明核酸や対応アデノウィルスは、機能的に活性を有するＥ１及び／又はＥ３及び／又はＥ４発現産物を産生することができない、言いかえれば、このような産物をそれらから産生することができない。これは通常、欠失又は適切な変異（点変異等）によって達成される。

本発明は、細胞（通常、腫瘍細胞）をアデノウィルスに感染させると、ＹＢ−１とアデノウィルス遺伝子産物Ｅ１Ｂ５５ｋＤａとの複合体が形成され、この複合体形成によりＹＢ−１が核内へ輸送され、細胞核内でウィルスの複製をインビボで効率良く行うことができる、という驚くべき知見に基づいている。また、Ｅ４ｏｒｆ６もＥ１Ｂ−５５Ｋに結合することも明らかになった（ウェイゲルＳ．（Weigel, S.）、ドベルステインＭ．Ｊ．（Dobbelstein, M.J.）、ウィルス学（Virology）、７４、７６４〜７７２、２０００）。アデノウィルス５型のＥ４ｏｒｆ６タンパク内の核外輸送シグナルは、ウィルスの複製及びウィルスｍＲＮＡの細胞質内蓄積を支えるものであり（ケイスＮ．レパード(Keith N. Leppard)、ウィルス学（Virology）セミナー、８、３０１〜３０７、１９９８、「アデノウィルス感染における制御されたＲＮＡプロセッシング及びＲＮＡ輸送（Regulated RNA processing and RNA transport during adenovirus infection）」）、核内へのＥ１Ｂ−５５Ｋの輸送や分散を仲介する。従って、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ及びＹＢ−１又はＥ１Ｂ−５５Ｋ、ＹＢ−１及びＥ４ｏｒｆ６の間の相互作用により、ウィルスを効果的に複製することができ、これにより細胞の溶解、ウィルスの放出、隣接する細胞の感染及び溶解をもたらす。このため、腫瘍細胞や腫瘍が感染すると、その腫瘍が完全に溶解する、即ち、腫瘍溶解（oncolysis）が起こる。

本発明は、ＹＢ−１が転写因子としてアデノウィルスの後期Ｅ２プロモーターに結合し、その結果、アデノウィルスの複製が活性化される、という別の知見にも基づいている。これを利用して、腫瘍溶解用の新規アデノウィルス及びアデノウィルスシステムを提供する。

また、本発明はアデノウィルスベクター中で導入遺伝子ＹＢ−１が発現することによりウィルスを複製することができる、という驚くべき知見にも基づいている。このプロセスにおいては、各ウィルス遺伝子Ｅ１Ｂ、Ｅ３及びＥ４は活性化されないが、これはアデノウィルスベクター中でＥ１及び／又はＥ３が欠失していることに主に起因する。しかしながら、これらの遺伝子は、複製と粒子形成を非常に効率的に行うのに必要である（ゴーラムＦ．Ｄ．（Goodrum, F.D.）、オーネルズＤ．Ａ．(Ornelles, D.A.）、「細胞周期非依存アデノウィルス複製におけるＥ４ｏｒｆ６、ｏｒｆ３及びＥ１Ｂ５５キロダルトンタンパクの役割（Roles for the E4orf6, orf3 and E1B 55-kilodalton proteins in cell cycle-independent adenovirus replication.）」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３、７４４７４〜７４８８（１９９９）；メジハルキＳ．（Medghalchi, S.）、パドマナブハンＲ．(Padmanabhan, R.)、ケトナーＧ．(Ketner, G.）、「遺伝子学的に分離可能な２種類のメカニズムにより初期領域４がアデノウィルスＤＮＡの複製を変調させる。（Early region 4 modulates adenovirus DNA replication by two genetically separable mechanisms.）」、ウィルス学（Virology）、２３６、８〜１７（１９９７））。また、Ｅ１Ａにコードされている２種のタンパク質（１２Ｓ及び１３Ｓタンパク)が、他のアデノウィルス遺伝子の発現を制御・誘導していることも知られている（ネビンスＪ．Ｒ．(Nevins,J.R.)、「アデノウィルスＥ１Ａ遺伝子産物による初期ウィルス転写の活性化メカニズム（Mechanism of activation of early viral transcription by the adenovirus E1A gene products．）」細胞（Cell）、２６、２１３〜２２０（１９８１）；ボウランジャーＰ（Boulange
r,P）ら（１９９１）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２７５、２８１〜２９９）。１３ＳタンパクのＣＲ３領域が、転写促進機能の主因であることが明らかになっている（ウォンＨＫ．(Wong HK）、ジフＥＢ．（Ziff EB.)、「Ｅ１ａ保存領域１の相補的な機能は保存領域３と共にアデノウィルス血清型５の初期プロモーターを活性化する。（Complementary functions of E1a conserved region 1 cooperate with conserved region 3 to activate adenovirusserotype 5 early promoters.）」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９４、６８（８）：４９１０〜２０）。１３ＳタンパクのＣＲ１及び／又はＣＲ２領域中において何らかの欠失を有するアデノウィルスは、複製することはできないが、ウィルス遺伝子やプロモーターの転写促進効果を有する。（ウォンＨＫ(Wong HK)、ジフＥＢ．(Ziff EB.)、「Ｅ１ａ保存領域１の相補的な機能は保存領域３と共にアデノウィルス血清型５の初期プロモーターを活性化する。（Complementary functions of E1a conserved region 1 cooperate with conserved region 3 to activate adenovirusserotype 5 early promoters.）」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９４、６９（８）：４９１０〜２０）。

このようなシステム（即ち、ウィルス遺伝子を活性化するがウィルスの複製はできないシステム）と導入遺伝子ＹＢ−１の腫瘍特異的又は組織特異的発現とを組み合わせれば、逆に、非常に効率良くウィルス複製や粒子生成をすることができ、よって腫瘍溶解をすることができる。本明細書中に記載されたどのプロモーターも、好適な腫瘍特異的又は組織特異的プロモーターとして用いることができる。

ＹＢ−１は、ＤＮＡのＹボックスの配列モチーフと結合するＹボックスタンパク質ファミリーの代表例である。該Ｙボックスモチーフは、細胞増殖を調整する役割をする多数の異なる遺伝子のプロモーター又はエンハンサー領域に見られる転写調節要素である（ラドメリーＭ．（Ladomery,M.）ら、１９９５；バイオアッセイ（Bioassays）、１７：９〜１１；ディディヤーＤ．Ｋ．（Didier,D.K.）ら、１９８８、ＰＮＡＳ、８５、７３２２〜７３２６）。

各種アデノウィルスが先行技術において知られている。また、それらはｄｓＤＮＡウィルスである（ボーランジャーＰ．（Boulanger,P.）ら（１９９１）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２７５、２８１〜２９９）。そのゲノム構成を図１に示す。アデノウィルスゲノムの全ヌクレオチド配列は知られており、それはクロボチェクＪ．（Chroboczek,J.）らにより記載されている（クロボチェクＪ．（Chroboczek,J.）ら、ウィルス学（Virology）、１９９２、１８６、２８０〜２８５）。ゲノムの内、アデノウィルスを利用するのに特に重要な部分は、いわゆる初期遺伝子とＥ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４と称されるその遺伝子産物である。Ｅ１は癌遺伝子である２種の遺伝子産物Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂから構成される。Ｅ２グループの合計３種の遺伝子産物が、遺伝子産物Ｅ３及びＥ４と共に複製に関与する。

先行技術において知られているＯｎｙｘ−０１５等の腫瘍溶解用アデノウィルスシステムは、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａタンパクが欠失したものである。この欠失は、完全な（intact）ｐ５３遺伝子がインビボでの効率良い複製を妨害するとの仮定の下、インビボでのアデノウィルス複製をｐ５３陰性／変異細胞中でのみ行わせることを確実にするためになされたものであったが、結果としては、複製が減少したため、野生型と比べて粒子数が２桁減少している。一方、これらの先行技術のアデノウィルスシステムは、Ｅ２前期プロモーターによって仲介されるインビボにおける複製を制御するためにＥ１Ａに依存するものである。

本明細書に記載したアデノウィルスシステムはＥ２後期プロモーターに基づくものであるため、本発明は上述の原理とは異なるものである。

本発明において、用語「アデノウィルス」と「アデノウィルスシステム」は、本質的に
同義である。アデノウィルスは、特に、カプシド及び核酸を含む完全ウィルス粒子として理解される。用語「アデノウィルスシステム」は、特に、核酸が野生型と比べて改変されることを表している。好ましくは、この改変は、アデノウィルスのゲノム構造の改変を包含するものである。例えば、プロモーター、調節配列及びコード配列（リーディングフレーム等）の欠失及び／又は付加及び／又は変異等が挙げられる。この用語「アデノウィルスシステム」は、好ましくはベクターに関して用いられる。

本明細書で言及するアデノウィルス核酸は、先行技術において知られているものである。アデノウィルス核酸配列を欠失あるいは変異させる方法は、当業者であれば知っているであろうし、本発明にとって重要ではない。このような欠失は、例えば、Ｅ３をコードする核酸に影響を与え得る。好ましい形態においては、これらのアデノウィルス核酸は、更にウィルスのカプシドに包含されて感染性の粒子を形成し得る。本発明の核酸についても同じことが当てはまる。一般に、アデノウィルスシステムは、１以上の発現産物に関して欠落していてもよいことにも留意すべきである。考慮すべきであるのは、これが、発現産物をコードする核酸が完全に変異又は欠失している、あるいは発現産物がほぼ形成されない程度に変異又は欠失しているために、あるいは、調節要素や発現調節要素（プロモーターや転写因子等）が、核酸レベル（プロモーターなし；シス活性化要素（cis-acting element））においても、翻訳・転写システムレベル（トランス活性化要素（trans-acting elements））においても存在しないために、起こり得るということである。特に、後者の様相は、各細胞のバックグラウンドによって異なり得る。

アデノウィルス核酸に加え更にＹＢ−１をコードする核酸配列を含む本発明核酸は、組換え核酸であることが好ましい。本発明において、ＹＢ−１をコードする核酸のリーディングフレームは、発現及び／又は翻訳を制御する要素の制御下にあることができる。これは、例えばアデノウィルスプロモーターや非アデノウィルスプロモーターとすることができる。非アデノウィルスプロモーターは、サイトメガロウィルスプロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウィルス)プロモーター、アデノウィルス系プロモーターＶａ Ｉ及び非ウィルスＹＢ−１プロモーターからなる群から選択することが好ましい。本明細書で開示した本発明の各様相と組み合わせて用いることのできる他のウィルスプロモーターの例としては、テロメラーゼプロモーター、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、癌胎児性抗原プロモーター（ＣＥＡ）（カオＧ．（Cao,G.）、クリヤマＳ．（Kuriyama,S.）、ガオＪ．（Gao,J.）、ミトロＡ．（Mitoro,A.）、キュイＬ．（Cui,L.）、ナカタニＴ．（Nakatani,T.）、チャンＸ．（Zhang,X.）、キクカワＭ．（Kikukawa,M.）、パンＸ．（Pan,X.）、フクイＨ．（Fukui,H.）、クイ（Qi,Z.）「強腫瘍選択性遺伝子の発現を誘導するためのヒト結腸直腸癌及び通常の近在粘膜から単離された癌胎児性抗原プロモーター領域の比較（Comparison of carcinoembryonic antigen promoter regions isolated
from human colorectal carcinoma and normal adjacent mucosa to induce strong tumour-selective gene expression.）」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７８、２４２〜２４７、１９９８）、Ｌ−プラスチンプロモーター（チャンＩ．（Chung,I.）、シュワルツＰＥ．（Schwartz,PE.）、クリスタルＲＣ．（Crystal,RC.）、ピツォルノＧ．（Pizzorno,G）、リヴィットＪ．（Leavitt,J.）、デイサロスＡＢ．（Deisseroth,AB.）「通常の中皮細胞でなく卵巣癌細胞において導入遺伝子を発現させるアデノウィルスシステム開発のためのＬ−プラスチンプロモーターの使用（Use of L-plastin promoter to develop an adenoviral system that confers transgene expression in ovarian cancer cells but not in normal mesothelial cells.）」、癌遺伝子治療（Cancer Gene Therapy）、６、９９〜１０６、１９９９）、アルギニン−バソプレッシンプロモーター（カールソンＪＭ（Coulson,JM）、ステーリーＪ．（Staley,J.）、ウォルＰＪ．（Woll,PJ.）「小細胞肺癌における腫瘍特異性アルギニンバソプレッシンプロモーターの活性化（Tumour-specific arginine vasopressin promoter activation in small cell lung cancer.）」、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８０、１９３５〜１９４４、１９９９）及びＰＳＡプロ
モーター（ハーレンベックＰＬ．（Hallenbeck PL）、チャンＹＮ（Chang,YN,）、ヘイＣ．（Hay,C.）、ゴライトリーＤ．（Golightly,D.）、スチュワートＤ．（Stewart,D.）、リンＪ．（Lin,J.）、フィップス（Phipps,S.）、チャンＹＬ．（Chiang,YL.）、「肝細胞癌の遺伝子治療用新規腫瘍特異性複製限定アデノウィルスベクター（A novel tumour-specific replication-restricted adenoviral vector for gene therapy of hepatocellular carcinoma.）」、ヒト遺伝子療法（Human Gene Therapy）、１０、１７２１〜１７３３、１９９９）が挙げられる。

テロメラーゼプロモーターは、ヒト細胞にとって非常に重要なものであることが知られている。テロメラーゼ活性の調節は、酵素の触媒サブユニットであるテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（ｈＴＥＲＴ）の転写制御によって達成される。テロメラーゼの発現は、ヒト腫瘍細胞の８５％において活発であるが、逆にほとんどの正常細胞においては活発でない。但し、生殖細胞と胚組織は例外である（ブラウンステインＩ．（Braunstein, I.）ら（２００１）、「正常細胞及び悪性ヒト卵巣上皮細胞におけるヒトテロメラーゼ逆転写プロモーター調節（Human telomerase reverse transcription promoter regulation in normal and malignant human ovarian epithelial cells.）」、癌研究（Cancer Research）、６１、５５２９〜５５３６；マジュンダーＡＳ（Majumdar AS）ら（２００１））、「テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより、構成プロモーターに対する肝細胞毒性を防ぎつつ有効な腫瘍自殺遺伝子療法を行う（The telomerase reverse transcriptase promoter drives efficacious tumour suicide gene therapy while preventing hepatotoxicity encountered with constitutive promoters.）」、遺伝子療法（Gene Therapy）、８、５６８〜５７８）。ｈＴＥＲＴプロモーターの詳細な調査により、開始コドンから２８３ｂｐ及び８２ｂｐ離れたプロモーターのフラグメントは、腫瘍細胞に特異的な発現を引き起こすのに十分であるということが明らかになっている。（ブラウンステインＩ．（Braunstein, I.）ら；マジュンダーＡＳ（Majumdar AS）ら、前出）。従って、このプロモーター及びその特異的なフラグメントは、導入遺伝子を腫瘍細胞においてのみ特異的に発現させるのに適している。このプロモーターは、導入遺伝子ＹＢ−１及び／又は未だ機能的に活性のあるトランケート形のもの（truncated form）を腫瘍細胞においてのみ発現できなければならない。アデノウィルスベクターにおける導入遺伝子の発現により、アデノウィルスベクターのウィルスを複製することができ、その結果、腫瘍溶解を達成することができる。また、ＹＢ−１のリーディングフレームが、１以上のアデノウィルスシステム遺伝子産物とインフレームの関係にある、ということも本発明の範囲内であるが、ＹＢ−１のリーディングフレームは、それと無関係であってもよい。ＹＢ−１をコードする核酸は、完全な配列であり得るが、核酸配列がトランケートされていても本発明の範囲内であり得る。このようなトランケート形の核酸配列や、トランケート形のＹＢ−１タンパクも、特に、このようなトランスケート形のＹＢ−１が未だ完全なＹＢ−１と同様の機能や特徴を有する限り本発明の範囲内である。このような機能や特徴とは、例えばＥ１Ｂ５５ｋＤａタンパクに結合してもしなくても核へ侵入する能力や、Ｅ２後期プロモーターへ結合する能力である。

本発明の核酸に含まれるアデノウィルス核酸は、それ自身が複製されるアデノウィルス核酸であることもできるし、別の核酸配列と結合して複製されるアデノウィルス核酸であることもできる。他の核酸配列の例としては、ＹＢ−１が挙げられる。以下に説明するように、本発明においては、複製に必要な配列及び／又は遺伝子産物は、ヘルパーウィルスにより提供することができる。このようなアデノウィルス核酸の一例としては、Ｅ１ＢでなくＥ１Ａを発現させるＯｎｙｘ−０１５の核酸が挙げられる。

本発明の核酸のこの形態、即ちＹＢ−１をコードする核酸配列を含む核酸においては、アデノウィルス核酸はＥ１−Ｂをコードする核酸配列を含んでもよい。本発明において、Ｅ１−Ｂをコードする核酸は存在するにもかかわらず、この核酸がコードするＥ１−Ｂを
発現させないことも可能である。例えば、Ｅ１−Ｂをコードする核酸に適切なプロモーターが欠けている場合、これを達成することができる。これは、例えば、Ｅ１Ａを発現させない場合である。しかしながら、例えば、Ｅ１−Ｂをコードする核酸が適切なプロモーターの制御下にある場合にＥ１−Ｂを発現させることも本発明の範囲内である。好適なプロモーターは、サイトメガロウィルスプロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウィルス）プロモーター、アデノウィルス系プロモーターＶａ Ｉ及び非ウィルスＹＢ−１プロモーターを含む群から選択される。更に、この場合、前述のプロモーター、即ち、テロメラーゼプロモーター、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、癌胎児性抗原プロモーター（ＣＥＡ）、Ｌ−プラスチンプロモーター、アルギニン−バソプレッシンプロモーター及びＰＳＡプロモーターも好適である。

本明細書に記載したように、Ｅ１−Ｂ−５５ｋは細胞核中へのＹＢ−１の分散及び輸送に関与している。一方、Ｅ４ｏｒｆ６はＥ１−Ｂ−５５ｋに結合してＥ１−Ｂ−５５の核中への輸送を担うため、Ｅ４ｏｒｆ６は、ＹＢ−１の細胞核中への分散及び輸送にも重要な役割を果たす。従って、Ｅ４領域の遺伝子、特にＥ４ｏｒｆ６が、上述の各種プロモーターの中の一種類の制御下にあることも本発明の範囲内である。本発明においては、アデノウィルスＥ４プロモーターがもはや機能しないという形態が好ましい。アデノウィルスＥ４プロモーターが欠失している場合が特に好ましい。

ＹＢ−１をコードする核酸配列を有する本発明の核酸の一形態においては、アデノウィルス核酸はＥ１−Ａをコードする核酸を含むが、Ｅ１−Ｂを発現させない。従って、このアデノウィルス核酸は、Ｏｎｙｘ−０１５のＤＮＡ構造に対応する。

一般に、本明細書においてＥ１−Ｂが言及される際は、特記しない限り、それは好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤａタンパクに当てはまる。

本明細書において、コードする核酸配列について言及し、これらが既知の核酸配列である場合は、既知のものと同一の配列だけでなく、それから派生する各種配列を使用することも本発明の範囲内である。本明細書において、各種派生配列とは、特に、非派生配列（non-derived sequence）の機能に相当する機能を有する遺伝子産物が得られる配列と理解される。これは、簡単な日常的試験により確認することができる。この派生核酸配列の一例としては、同じ遺伝子産物、特に同じアミノ酸配列をコードするが、遺伝コードの縮重のため、異なる塩基配列を有する核酸が挙げられる。

ＹＢ−１をコードする核酸及びＹＢ−１を核内へ輸送するのを仲介する核酸配列を有する本発明の核酸の他の様相は、ＹＢ−１が核に存在（特に、細胞周期とは関係なく）する場合、この細胞内（好ましくは腫瘍細胞内）でアデノウィルスの複製が起こる、という驚くべき知見に基づくものである。これに関連して、本発明の核酸、アデノウィルス及びアデノウィルスシステムは、それぞれ、単独であるいはＯｎｙｘ−０１５等の従来技術において知られているアデノウィルスと組み合わせて、アデノウィルス、アデノウィルスシステム、これらに相当する各種核酸として用いることができる。

核輸送を仲介する好適な核酸配列は当業者には知られており、各種文献（例えば、ウィタカーＧ．Ｒ．（Whittaker, G.R.）ら、「ウィルス学（Virology）」、２４６、１〜２３、１９９８；フリードバーグＥ．Ｃ．（Friedberg, E.C.）、ＴＩＢＳ、１７、３４７、１９９２；ジャンスＤ．Ａ．（Jans, D.A.）ら、「バイオアッセイ（Bioessays）」、２０００年６月；２２（６）：５３２〜４４；ヨネダＹ．（Yoneda, Y.）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（東京）１９９７年５月；１２１（５）：８１１〜７；ボーリカスＴ（Boulikas, T.）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．、１９９３；３（３）：１９３〜２２７）に記載されている。核輸送を仲介する核酸配列により異なる様々
な機構を用いることができる。これらのうちの一機構においては、ＹＢ−１とシグナルペプチドとの融合タンパクを生成し、このシグナルペプチドによりＹＢ−１を細胞核内へ輸送する。別の機構においては、ＹＢ−１に輸送配列を備えさせることによりＹＢ−１を細胞核内へ輸送する。この細胞核において、ＹＢ−１がウィルス複製を促進するが、ＹＢ−１が細胞質内で合成された後に促進するのが好ましい。核への輸送の仲介に特に効果的な核酸配列の一例は、ＨＩＶのＴＡＴ配列であるが、これは、このタイプの他の好適な核酸配列と共に、各種文献（例えば、エフシミアディスＡ．（Efthymiadis, A.）、ブリグスＬＪ（Briggs, LJ）、ジャンスＤＡ．（Jans, DA.）、「ＨＩＶ−１ ｔａｔ核存在配列は、新たな核移入特性を与える（The HIV-1 tat nuclear localisation sequence confers novel nuclear import properties.）」、ＪＢＣ、２７３、１６２３）に記載されている。

本発明の他の様相では、アデノウィルス核酸がＥ２後期プロモーターの代わりに腫瘍特異的プロモーターを含むアデノウィルス核酸を有する核酸を含む。この様相もまた、アデノウィルスの発現、更に複製、またこれによる腫瘍溶解は、本質的には、アデノウィルス遺伝子及び遺伝子産物を制御することによるものであり、この制御は特にＥ２後期プロモーターによりＥ２領域で、特にインビボにおいて行われる、という驚くべき知見に基づくものである。転写ユニットであるアデノウィルスのＥ２領域は、ウィルス複製にとって重要なタンパク（ｐＴＰ（末端タンパク前駆体）、ＤＮＡポリメラーゼ及び多機能性ＤＮＡ結合タンパクであるＤＢＰ）をコードするＥ２Ａ及びＥ２Ｂ遺伝子から構成される。本発明の範囲において、欠失（deleted）プロモーター、非機能的に活性のある（non-functionally active）プロモーター、機能的に不活性の（functionally non-active）プロモーター、非機能的（non-functional）プロモーターとは、もはや活性がない（即ち、もはや転写しない）プロモーターを意味する。このような非機能的（non-functional）プロモーターは、既知の方法で当業者により生成することができる。例えば、プロモーターの完全欠失、プロモーターの一部欠失、あるいは点変異により達成することができる。これらのプロモーターを変異する別の方法としては、例えば、プロモーターを構成する各要素間の空間的な関係を変更し機能的に不活性にする、という方法がある。

Ｅ２後期プロモーターを不活性化し、このＥ２後期プロモーターを腫瘍特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターへ置換し、かくして本発明の核酸のうちの一種を生成することにより、アデノウィルス複製にとって重要な遺伝子や遺伝子産物が、その腫瘍やそれに対応する組織の制御下にあること、そしてその結果アデノウィルスの複製がその腫瘍においてあるいは特定の組織において特異的に起こること、を確実にする。これは、特定のウィルス仲介細胞溶解のための必要条件を満たしており、システムの安全性を確実なものとする。ここで、Ｅ２後期プロモーターを完全に欠失させることにより、Ｅ２後期プロモーターを不活性化することができる。しかしながら、本発明においては、Ｅ２後期プロモーターがプロモーターとしてもはや機能的に活性を有さないように、Ｅ２後期プロモーターを改変することも可能である。これは、例えば、ＹＢ−１がプロモーターにもはや結合できないように、プロモーターのＹＢ−１結合部位を改変（変異、欠失等）させることにより実施できる。そのような欠失の一例として、プロモーターのＹボックスの欠失が挙げられる。ここで使用されている用語「本発明の核酸がＥ２プロモーターの代わりに組織特異的プロモーター又は腫瘍特異的プロモーターを含む」は上述の各方法を包含するものである。この点に関する限り、この用語は、機能面についてのことであると理解されるべきである。

腫瘍特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターによりＥ２遺伝子産物の発現を制御するシステムの安全性を更に高めるため、好ましい実施形態においては、Ｅ２後期プロモーターと同時にＥ２前期プロモーターを機能的に不活性にすべきである。例えば、欠失、または、プロモーターとしてもはや機能的に活性を有さないように改変することにより
不活性化する。このようにすることで、Ｅ２前期プロモーターのＥ２遺伝子発現に対する影響を確実に除くことができる。あるいは、好ましくはこれら２種類のプロモーター、即ち、Ｅ２後期プロモーター及びＥ２前期プロモーターを、本発明の組織特異的プロモーター又は腫瘍特異的プロモーターに置き換える。この場合においても、ＹＢ−１をコードする核酸配列に関して本明細書に記載した各種プロモーターを使用することができる。

アデノウィルス核酸やこれに対応する各種アデノウィルスは、好ましくはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２及びＥ３をコードする遺伝子を有する。好ましい実施形態においては、Ｅ３をコードする核酸を欠失させることができる。

上述の各種アデノウィルス構築物（特にこれらの核酸）を、部分的に、細胞（特に腫瘍細胞）に導入することもできる。この場合、様々な個々の成分の存在のため、それらの個々の成分が一個の核酸から由来しているように、それらは相互に作用する。本明細書においてアデノウィルス複製システムといわれるものの典型的な例としては、アデノウィルス核酸がＥ１Ａタンパクの発現に対して欠損しているものが挙げられる。好ましい細胞複製システムは、ヘルパーウィルスの核酸を含み、このヘルパーウィルスの核酸はＹＢ−１をコードする核酸配列を含む。ここで、アデノウィルス核酸又はヘルパーウィルスの核酸は、複製ベクターとして個々に又は別々に存在してもよい。

本発明の核酸はベクターとして存在することができ、好ましくはウィルスベクターである。本発明の核酸がアデノウィルス核酸を含む場合、ウィルス粒子はベクターである。しかしながら、本発明の核酸がプラスミドベクター内に存在することも本発明の範囲内である。このような場合、このベクターは被挿入核酸の増殖（複製）と、場合により被挿入核酸の発現とを引き起こすあるいは制御する要素を有する。適切なベクター（特に発現ベクター）や要素は、当業者には知られており、例えば、グランハウスＡ．（Grunhaus, A.）、ホルウィッツＭ．Ｓ．（Horwitz, M.S.）、１９９４「クローニングベクターとしてのアデノウィルス（Adenoviruses as cloning vectors.）」In ライスＣ．（Rice, C.）編、ウィルス学セミナー（Seminars in virology）、ロンドン：ソーンダース科学出版（Saunders Scientific Publications）、１９９２、２３７〜２５２に記載されている。

上述の実施形態では、本発明の核酸の各種要素は、必ずしも一個のベクターのみに含まれている必要はない。この実施形態は、ベクター群を含む本発明の様相を考慮したものである。対応して、１つのベクター群は少なくとも２つのベクターを含む。その他の点では、ベクターに関して本明細書中で一般的に述べたことと同様のことが、当該ベクターに当てはまる。

本発明のアデノウィルスは、本明細書に記載の各種核酸により特徴付けられる。その他の点では、当業者に知られている全ての要素を含み、これは野生型のアデノウィルスの場合も同様である（シェンクＴ．（Shenk, T.）、「アデノウィルス科：ウィルス及びその複製（Adenoviridae: The virus and their replication）」、フィールズのウィルス学（Fields Virology）、第３版、フィールズＢ．Ｎ．（Fields, B.N.）、ナイプＤ．Ｍ．（Knipe, D.M.）、ホーリーＰ．Ｍ．（Howley, P.M.）ら、リッピン・レーベン出版（Lippincott-Raven Publishers）、フィラデルフィア、１９９６、６７章)。

本発明の剤（即ち、核酸、ベクター、ベクター群、細胞、アデノウィルス、該核酸を含むアデノウィルス複製システム）は、医薬用組成物（以下、「医薬」と略記することもある）の製造に使用できる。本発明の剤は特定の活性を有するため、この医薬を腫瘍疾病の治療・予防薬として使用するのが好ましい。本発明の剤は基本的には全ての腫瘍疾病及び腫瘍に適しているが、特に、ｐ５３を含む腫瘍やｐ５３が存在しない腫瘍に適している。用語「腫瘍」は、悪性腫瘍と良性腫瘍の両方を含む。

この医薬は、様々な剤型、好ましくは液剤とすることができる。この医薬は、安定剤、緩衝剤、保存剤、その他ガレン派医学（galenics）分野の当業者には知られているもの等の副成分を更に含む。

特に、この医薬は、他の薬学的に活性な化合物も含むことができる。薬学的に活性な化合物のタイプや量は、当該医薬が使用される症状のタイプにより異なる。この医薬を腫瘍疾病の治療及び／又は予防に使用する場合、通常、シスプラチン、タキソール、ダウノブラスチン、アドリアマイシン、ミトキサントロン等の細胞分裂抑制剤を使用する。

Ｅ１Ｂ５５ｋＤａタンパクが欠損している弱毒化アデノィルス（Ｏｎｙｘ−０１５等）は、ウィルスによる腫瘍溶解に使用しても通常ほとんど成功しない。驚くべきことに本発明者は、細胞周期に関係なくＹＢ−１が細胞核に発生する腫瘍に対しては、これらの弱毒ウィルス（特にＯｎｙｘ−０１５）を用いる場合は成功率が特に高いことを見出した。ＹＢ−１は、通常は細胞質に、特に核周辺の細胞質に存在する。細胞周期Ｓ期において、ＹＢ−１は正常細胞と腫瘍細胞の細胞核に存在する。しかしながら、これだけでは、弱毒化アデノィルスによる腫瘍溶解を達成するのに十分ではない。先行技術において説明されるＯｎｙｘ−０１５等の弱毒化アデノィルスの有効性がかなり低いのは、その誤った使用によるものである。即ち、このようなシステム、特にＯｎｙｘ−０１５は、ウィルスを用いる腫瘍溶解のための分子生物学的必要条件が揃えば、極めて有効に使用できる。特にＯｎｙｘ−０１５の場合、細胞周期に関係なくＹＢ−１が核に存在している腫瘍疾病では、このような必要条件は揃っている。核存在のこの形態は腫瘍のタイプにより異なり得、又は、本明細書に記載の本発明の剤によって引き起こすことができる。従って、本発明は、本発明の剤、特に、先行技術において既に説明されている弱毒化アデノィルス、好ましくはＥ１Ｂ欠損（より好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤａ欠損）アデノウィルス、更に好ましくはＯｎｙｘ−０１５で、高い成功率で治療できる、腫瘍又は腫瘍疾病の新たなグループ、及び新たな患者群を特定する。

先行技術において説明されているアデノウィルス、特にＯＮＹＸ−０１５等のＥ１Ｂ欠損アデノウィルスを用いて治療できる別の患者群は、ある条件を設定することによりＹＢ−１が核に確実に移動する又は輸送される患者群である。この患者群にこのようなアデノウィルスを使用することは、ＹＢ−１の核存在の後、Ｅ２後期プロモーターと結合してウィルスの複製が誘導されるという知見に基づいている。ここに開示した知見は、Ｅ１Ｂ欠損のアデノウィルスＯＮＹＸ−０１５は、細胞のＹＢ−１の、核への輸送を仲介できないことを示している。これが、核内に既にＹＢ−１を有する腫瘍に対してはＯＮＹＸ−０１５の使用と成功が限定される理由である。しかしながら、これが当てはまる患者群は非常に僅かである。ＹＢ−１の核存在は、外部からのストレスや局所的なストレスにより誘導され得る。例えば、照射（特に、紫外線照射）、細胞分裂抑制剤（例えば、本明細書に記載した細胞分裂抑制剤）の投与、高温によりこのような誘導を達成し得る。高温については、このような誘導を極めて特異的に達成することができ、ＹＢ−１の核への輸送も特異的であり、その結果、アデノウィルスの複製、更には細胞や腫瘍の溶解に対する必要条件が満たされていることに注意すべきである（ステインＵ．（Stein U）、ジャコットＫ（Jurchott K）、ウォルサーＷ．（Walther W.）、バーグマンＳ．（Bergmann S.）、シュラグＰＭ（Schlag PM）、ロイヤーＨＤ（Royer HD）、「転写因子ＹＢ−１の高温誘導核転位が多剤耐性関連ＡＢＣトランスポーターの発現上昇を導く（Hyperthermia-induced nuclear translocation of transcription factor YB-1 leads to enhanced expression of multidrug resistance-related ABC transporters.）」、J. Biol. Chem.、２００１、２７６（３０）：２８５６２〜９；フーＺ．（Hu Z,）、ジンＳ．（Jin S,）、スコットＫＷ．（Scotto KW.）、「紫外線照射によるＭＤＲ１遺伝子の転写促進化 ＮＦ−Ｙ及びＳｐ１の役割（Transcriptional activation of the MDR1 gene by UV irradiation. Role
of NF-Y and Sp1.）」、」、J. Biol. Chem.、２０００年１月２８日；２７５（４）：２９７９〜８５；オーガＴ．（Ohga T,）、ウチウミＴ．（Uchiumi T,）、マキノＹ．（Makino Y,）、コイケＫ．（Koike K,）、ワダＭ．（Wada M,）、クワノＭ．（Kuwano M,）、コーノＫ．（Kohno K.）、「ヒト多剤耐性１遺伝子の遺伝毒性ストレス誘導活性化におけるＹボックス結合タンパクＹＢ−１の直接関与（Direct involvement of the Y box binding protein YB-1 in genotoxic stress-induced activation of the human multidrug resistance １ gene.）」、J. Biol. Chem.、１９９８、２７３（１１）：５９９７〜６０００）。

従って、本発明の医薬は、このような患者や患者群に投与することができ、ＹＢ−１の輸送、特に、腫瘍細胞へのＹＢ−１の輸送を適切な前処理により誘導し得る患者に適する。

従って、本発明の別の様相は、Ｏｎｙｘ−０１５等の弱毒化アデノィルス、一般にはＥ１Ｂ欠損（好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤａ欠損）アデノウィルスを用いて治療することができる患者のスクリーニング方法であって、次の各ステップ：
腫瘍組織のサンプルを調べるステップと、
細胞周期とは無関係にＹＢ−１が核内に存在するかどうかを決定するステップと
を含む方法に関する。

ここで、腫瘍組織のサンプルは、穿刺法又は外科手術により得ることができる。顕微鏡技法及び／又は通常抗体を用いる免疫組織分析を用いて、細胞周期に関係なく核内にＹＢ−１が存在するか否かを測定することが多い。ＹＢ−１は、各種抗ＹＢ−１抗体からなる群から選択される剤を用いて検出される。ＹＢ−１の核存在についての試験、特に細胞周期とは無関係に存在することについての試験は当業者には知られている。例えば、ＹＢ−１の核存在は、ＹＢ−１を染色した組織断面をスクリーニングすることにより容易に検出できる。この場合、ＹＢ−１の核内発生頻度により、細胞周期に無関係な核存在であるかがわかる。核内のＹＢ−１を細胞周期に関係なく検出する別の方法は、ＹＢ−１を染色し、ＹＢ−１が核内に存在するかを決定し、細胞の細胞周期におけるステージを決定することである。これは、適切な抗体を用いて実施することもできる（二重免疫組織分析）。

次に、本発明を図面と実施例を用いて更に説明する。これにより、本発明の特徴、実施形態、用途、利点が一層良く理解されるであろう。

図２は、本発明の各種核酸及び核酸の構築物を示す。即ち、図２．１Ａは、Ｅ１Ａ欠損及びＥ１Ｂ欠損であるがタンパクＹＢ−１を発現する本発明の組換えアデノウィルスベクターを示す。

図２．１Ｂは、ＹＢ−１を発現するがＥ１Ａ領域が欠損した本発明の組換えアデノウィルスベクターを示す。Ｅ１ＡはＥ１Ｂの発現に影響を与えるため、ベクターはこの遺伝子を含んでいるにもかかわらず、Ｅ１Ｂは全く、あるいはわずかな程度しか活性化されない。

図２．２は、ＹＢ−１を発現する本発明の組換えアデノウィルスベクターを示す。この場合、遺伝子Ｅ１Ｂ及びＥ１Ｂ５５ｋＤａは各々、外部のＥ１Ａ独立プロモーターにより制御されている。該プロモーターとしては、ＣＭＶ、ＲＳＶ、又はＹＢ−１プロモーターが挙げられる。

図２．３は、ＹＢ−１非依存Ｅ２後期プロモーターを有する本発明の別の組換えアデノウィルスベクターを示す。このベクターは、Ｅ２後期プロモーターを完全に除去するか、
あるいはＹＢ−１が結合する該プロモーター中の遺伝子配列（いわゆるＹボックス）を特異的に改変することにより得ることができる。

図２．４は、Ｅ２後期プロモーターだけでなくＥ２前期プロモーターも欠失したため、もはや機能的に活性がない本発明の別の組換えアデノウィルスベクターを示す。図式的に示した該ベクターにおいて、２個のプロモーターは、本明細書中で述べたような腫瘍特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターに置換されている。

実施例１: アデノウィルス複製におけるＹＢ−１の重要性
ＹＢ−１がＥ２後期プロモーターによるＥ２の発現を制御することを示すために、次の実験手法を実施した。

野生型のアデノウィルス、Ｅ１−マイナスアデノウィルス、又はＹＢ−１を発現するＥ１−マイナスアデノウィルス（ＡｄＹＢ−１）を、それぞれ腫瘍細胞（ＨｅＬａ細胞）に感染させた（ここにおいて、Ｋはコントロール（即ち非感染）を表す）。全ＲＮＡを２４時間後に単離した後、ノーザンブロット分析を行った。その後、ホルムアルデヒド−アガロースゲルにおけるゲル電気泳動により、単離したＲＮＡをサイズ別に分離し、それをナイロン膜にブロットし、紫外線で固定した。Ｅ２前期プロモーターとＥ２後期プロモーターの間に位置する配列に相補的なｃＤＮＡフラグメント（２５０ベース）を、放射性標識プローブとして用いた。該プローブは、アマシャム（Amersham）社製ランダムプライムラベリングシステム（random prime labeling system）を用いて標識した。フィルムの分析により、Ｅ２特異シグナルは、野生型のアデノウィルスに感染した細胞中にしか存在しないことが明らかになった（図３）。

実施例２: アデノウィルス複製におけるＹＢ−１の重要性
ＹＢ−１がＥ２後期プロモーターによるＥ２の発現を制御することを示すために、実施例１に記載のプロトコルに基づく次の実験手法を実施した。

実施例１の放射性プローブを水中で２分間煮沸して除去し、別のｃＤＮＡプローブと再びハイブリダイズした。このプローブは、Ｅ２後期プロモーターの上流に位置する。

上記の分析により、次の結果が得られた：ＡｄＹＢ−１に感染した細胞と同様、野生型のアデノウィルスに感染した細胞も、明確なシグナル及び特異的なＥ２バンドを有する。従って、ＹＢ−１はＥ２後期プロモーターによりＥ２領域を制御し、活性化する。

実施例３: ＹＢ−１のＥ２プロモーターへの特異的結合の証明
この実験は、転写因子であるＹＢ−１がＥ２後期プロモーター内のＹボックス（ＣＡＡＴ配列）に結合するはずである、という予想に基づいている。ＹＢ−１とこのプロモーターとの特異的な結合を検出するために、いわゆるＥＭＳＡ分析（electrophoretic mobility shift assay）を行う。即ち、野生型アデノウィルスを細胞に感染させた２４時間後に核タンパクを単離する。次いで、当該核タンパク（１〜１０μｇ）とＥ２後期プロモーター配列を含む短いＤＮＡフラグメント（長さ：３０〜８０ベース）とを共に３７℃で３０分間インキュベートする。このＤＮＡフラグメント（オリゴ）を、前もって５’末端においてキナーゼを用いて^３２Ｐで放射性標識する。その後、そのままの（native）ポリアクリルアミドゲルを用いて分離する。タンパクＹＢ−１が該オリゴの配列と結合する場合、５’末端において放射性標識された短いＤＮＡフラグメントは、ＹＢ−１がその短いＤＮＡフラグメントと結合しているために、未結合のオリゴよりもゆっくりとゲル内で移動するため、いわゆるシフトが見られる。このシフトは、１００倍過剰の未標識のオリゴを反応混合物に添加するとすぐに、再び消失させることができる。

その結果、ＹＢ−１がＥ２後期プロモーターに特異的に結合することが明らかになった。

競合実験をコントロールとして行った。過剰の未標識Ｅ２後期プロモーターフラグメントを反応混合物に添加したところ、上述の反応混合物中においてシフトはもはや見られなかった。

本明細書中、上の記載において先行技術を参照している場合は、それら自体あるいはそれらの内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。

本明細書、請求項、図面にて開示した本発明の各特徴は、個々に、またいかなる組み合わせにおいても、各種形態において本発明を実現する上で重要であろう。

アデノウィルスの基本的な分子−遺伝子構成を示す。 本発明の各種核酸及びアデノウィルスの構築物の概観を示す。 ノーザンブロット分析の結果を示す。

Claims (18)

1. ＹＢ−１をコードする核酸配列を含むアデノウィルス核酸を含むことを特徴とする、医薬用組成物。
2. ＹＢ−１をコードする核酸配列を含むアデノウィルス核酸は、アデノウィルス核酸におけるＥ１をコードするアデノウィルス核酸配列が欠損し又は不活性化されていることを特徴とする、請求項１に記載の医薬用組成物。
3. Ｅ１は、Ｅ１Ｂであることを特徴とする、請求項２に記載の医薬用組成物。
4. Ｅ１Ｂは、Ｅ５５ｋＤａタンパク質であることを特徴とする、請求項３に記載の医薬用組成物。
5. アデノウィルス核酸に感染した腫瘍細胞において、当該アデノウィルス核酸が増幅する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
6. 腫瘍細胞は、その細胞核内にＹＢ−１が存在することを特徴とする、請求項５に記載の医薬用組成物。
7. ＹＢ−１の腫瘍細胞核における存在は、外因性処置の影響下において達成されることを特徴とする、請求項６に記載の医薬用組成物。
8. 外因性処置は、照射、細胞分裂抑制剤及び高熱、からなる群から選択される１種以上の処置であることを特徴とする、請求項７に記載の医薬用組成物。
9. アデノウィルス核酸の増幅が、Ｅ２プロモーターの活性化により行われることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
10. Ｅ２プロモーターが、後期Ｅ２プロモーターであることを特徴とする、請求項９に記載の医薬用組成物。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬用組成物において含まれるアデノウィルス核酸、を有するアデノウィルスを含有することを特徴とする、医薬用組成物。
12. 腫瘍疾患の治療及び／又は予防に使用されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
13. 腫瘍疾患の基となる腫瘍は、ｐ５３陽性腫瘍、ｐ５３陰性腫瘍、悪性腫瘍、両性腫瘍並びにこれらの組み合わせの腫瘍、からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１２に記載の医薬用組成物。
14. 薬学的に腫瘍の治療及び／又は治療に有効な化合物を更に含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
15. 腫瘍の治療及び／又は治療に薬学的に有効な化合物は、細胞分裂抑制剤であることを特徴とする、請求項１４に記載の医薬用組成物。
16. 細胞分裂抑制剤は、シスプラチン、タキソール、ダウノブラスチン、アドリアマイシン及びミトキサントロンからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項１５に記載の医薬用組成物。
17. 請求項１〜１０及び請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の医薬用組成物に含まれるアデノウィルス核酸の、医薬用組成物の製造のための使用。
18. 請求項１１に記載の医薬用組成物に含まれるアデノウィルスの、医薬用組成物の製造のための使用。
    

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