ES2287181T3 - Sistemas adenovirales y sus aplicaciones. - Google Patents

Abstract

Ácido nucleico que comprende un ácido nucleico adenovírico, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica YB-1, siendo YB-1 un representante de la familia de proteínas Y-Box.

Description

Sistema adenovirales y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos que comprenden ácidos nucleicos adenovíricos, a adenovirus que los comprenden, y a su empleo.

En el tratamiento de tumores se siguen actualmente numerosos conceptos terapéuticos. Además del empleo de técnicas quirúrgicas, se hallan en el primer plano la quimioterapia y la terapia con radiaciones. Sin embargo, todas estas técnicas están asociadas a efectos secundarios no despreciables para el paciente.

Con el empleo de virus oncolíticos selectivos en su replicación se ha creado una nueva plataforma para el tratamiento de tumores. En este caso se provoca una replicación intratumoral selectiva de un agente vírico, que conduce sucesivamente a la replicación del virus, la lisis de la célula tumoral infectada y la propagación del virus a células tumorales vecinas. Como consecuencia de la limitación de la capacidad replicadora del virus a las células tumorales, el tejido normal no está expuesto a la infección y por tanto a la lisis por el virus. Son ejemplos de tales virus oncolíticos selectivos en su replicación los adenovirus y herpesvirus atenuados génicamente (Martuza, R. y otros, Science 252, 854-858 (1991); Fueyo, J. y otros, Oncogene 19, 2-12 (2000)).

Un ejemplo de uno de tales adenovirus es el dl 1520 (Onyx-015), que ya se ha utilizado con éxito en las fases clínicas I y II (Khuri, F. y otros, Nature Medicine 6, 879-885 (2000)). El Onyx-015 es un adenovirus en el cual se ha delecionado el gen E1B de 55 kDa. El producto génico E1B de 55 kDa participa en la inhibición de p53, en el transporte de mARN vírico, y en la desconexión de la síntesis proteica en la célula anfitrión. La inhibición de p53 se lleva a cabo en este caso mediante la formación de un complejo de p53 y la proteína E1B de 55 kDa codificada por el adenovirus. Del p53, codificado por TP53, se origina un complejo mecanismo regulatorio (Zambetti, G.P. y otros, FASEB J, 7, 855-865), que conduce también, entre otras cosas, a reprimir en la célula la replicación eficaz de virus tales como adenovirus. El gen TP 53 está delecionado o mutado en aproximadamente 50% de todos los tumores humanos, con la consecuencia de que no se llega a producir la deseada apoptosis como consecuencia de una quimioterapia o una terapia con radiaciones, y por tanto no se logra el éxito de estos tratamientos antitumorales como en un caso normal.

Los virus tumorales de ADN, tales como los adenovirus, llevan a las células infectadas a la fase S del ciclo celular, con el fin de facilitar la replicación del ADN vírico. El Onyx-015 no expresa la proteína E1B de 55 kDa, y se replica selectivamente en células tumorales frente a células normales. Existe además otra selectividad opuesta, ya que los tumores que son deficientes en p53 sufren, a consecuencia de la lisis vírica de las células tumorales, una necrosis comparativamente más intensa, que aquellos que presentan el tipo natural de p53 (Khuri y otros, en el artículo antes citado). A pesar de la eficacia básica de Onyx-015 en la oncólisis víricamente inducida, en el caso de tumores deficientes en p53, la tasa de éxito de 15% de los tumores tratados es muy pequeña.

Ries y otros (Ries, S.J. y otros, Nature Medicine 6, 1128 - 1132 (2000) han expuesto la posibilidad, en principio, de poder utilizar con éxito Onyx-015 también en el caso de tumores con tipo natural de p53. En este caso no se expresa la proteína supresora de tumores p14ARF. Como consecuencia de la falta de p14ARF, se detiene la reacción normal del sistema p53 frente a una infección vírica, y se posibilita así la replicación de Onyx-015 también en estos tumores. No obstante, la aplicación de este hecho presupone que existe en la célula tumoral una base genética adecuada o que se ha producido mediante medidas terapéuticas apropiadas. En el primer caso se reduciría ampliamente el número de tumores que pueden ser tratados con Onxy-015, y en el segundo caso sería necesaria una costosa modificación de la base genética de las células tumorales.

La presente invención tiene por misión mejorar los sistemas adenovíricos existentes para la oncólisis inducida víricamente. En especial, se debe mejorar con ella la tasa de éxito con que se puedan tratar tumores con éxito, en comparación con el estado de la técnica

Es otra misión de la presente invención poner a disposición sistemas adenovíricos para la oncólisis inducida víricamente, que sean también eficaces en aquellos tumores del tipo natural de p53.

De acuerdo con la invención, se han resuelto estas misiones mediante el objeto de las reivindicaciones principales. De las reivindicaciones subordinadas se desprenden formas de realización preferidas.

Con respecto a los ácidos nucleicos aquí descritos, el término se utiliza también en el sentido de "secuencias de ácidos nucleicos". En el caso de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, y también en el caso de los adenovirus de acuerdo con la invención, se trata preferiblemente de productos recombinantes, en particular cuando ha tenido lugar una modificación respecto al tipo natural. En la presente invención, los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención y los adenovirus de acuerdo con la invención presentan típicamente, una deleción E1, una deleción E1-E3 y/o una deleción E4, es decir, los ácidos nucleicos o los adenovirus correspondientes no tienen la capacidad de producir productos de expresión E1 y/o E3 y/o E4 funcionalmente activos, o bien no se pueden producir a partir de éstos los productos correspondientes. Típicamente, esto está causado por una deleción o una mutación correspondiente, inclusive una mutación puntual.

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En una forma de realización está previsto que una o más de las proteínas de la región E1A actúen de manera transactivante sobre la expresión génica adenovírica, pero no de manera activante sobre la replicación de un adenovirus.

La invención se basa en el sorprendente hallazgo de que, tras la infección con adenovirus de una célula, típicamente una célula tumoral, tiene lugar en el núcleo la formación de complejo entre YB-1 y el producto génico adenovírico E1B de 55 kDa, y como consecuencia de esta formación de complejo el transporte de YB-1 al interior del núcleo, lo que permite una replicación eficaz del virus en el núcleo celular in vivo. Así se ha comprobado, además, que también E4orf6 se une a E1B-55 K (Weigel, S., Dobbelstein, M. J., Virology, 74, 764-772, 2000, "The nuclear export signal within the E4orf6 protein of adenovirus type 5 supports virus replication and cytoplasmic accumulation of viral mRNA"; Keith N. Leppard, Seminars in Virology, 8, 301-307, 1998, "Regulated RNA processing and RNA transport during adenovirus infection") e interviene por tanto en el transporte o la distribución de E1B-55 K en el núcleo. Así, mediante la acción conjunta de E1B-55 K e YB-1, o bien E1B-55 K, YB-1 y E4orf6, se efectúa una replicación eficaz del virus, lo que a su vez conduce a la lisis de la célula, a la liberación del virus, y a la infección y lisis de células vecinas, de manera que en el caso de la infección de una célula tumoral o de un tumor se produce finalmente la lisis del tumor, esto es, la oncólisis.

Otro hallazgo básico para la invención consiste en que YB-1 se une como factor de transcripción al promotor E2 tardío (en inglés "E2 late Promotor") del adenovirus, y activa la replicación del adenovirus a través de éste. De esta manera se posibilitan para la oncólisis nuevos adenovirus y sistemas adenovíricos.

Sirve además de base a la presente invención el hallazgo sorprendente de que la expresión del transgen YB-1 en un vector adenovírico conduce a la replicación vírica. De esta manera no se ponen en marcha los genes víricos E1B, E3 y E4, lo cual está causado esencialmente porque el vector adenovírico ha sido delecionado con respecto a E1 y/o E3. Sin embargo, estos genes son necesarios para una replicación o formación de partículas muy eficientes (Goodrum, F. D., Ornelles, D. A., "Roles for the E4 orf6, orf3, and E1B 55-kilodalton proteins in cell cycle independent adenovirus replication", J. Virol., 73, 74474-7488 (1999); Medghalchi, S., Padmanabhan, R., Ketner, G., "Early region 4 modulates adenovirus DNA replication by two genetically separable mechanisms", Virology, 236, 8-17 (1997). Se sabe además que dos proteínas (la proteína 12S y la proteína 13S), que son codificadas por E1A, regulan o inducen la expresión de los otros genes adenovíricos (Nevins, J. R., "Mechanism of activation of early viral transcription by the adenovirus E1A gene products", Cell 26, 213-220 (1981); Boulanger, P., y otros, (1991); Biochem. J. 275, 281-299). Se ha demostrado, además, que principalmente la región CR3 de la proteína 13S ejerce la función transactivante (Wong HK, Ziff EB, "Complementary functions of Ela conserved region 1 cooperate with conserved region 3 to activate adenovirus serotype 5 early promoters", J. Virol. 1994, 68(8):4910-20). Los adenovirus que presentan determinadas deleciones en la región CR1 y/o en la región CR2 de la proteína 13S no se pueden replicar, pero todavía actúan de manera transactivante sobre los genes o promotores víricos (Wong HK, Ziff EB, "Complementary functions of Ela conserved region 1 cooperate with conserved region 3 to activate adenovirus serotype 5 early promoters", J. Virol. 1994, 68(8):4910-20).

La combinación de un sistema semejante, es decir, un sistema que pone en marcha los genes víricos pero que no es apto para la replicación vírica, con una expresión del transgen YB-1 con especificidad respecto al tumor o al tejido, ha permitido por el contrario la replicación vírica o formación de partículas víricas muy eficaz, y con ello la oncólisis. Como promotores con especificidad respecto al tumor o al tejido se pueden utilizar cualesquiera de los que se describen en el conjunto de la presente memoria.

YB-1 es un representante de la familia de proteínas Y-Box, que se une al motivo de secuencia de ADN Y-Box. El motivo Y-Box representa un elemento regulador transcripcional que se encuentra en las regiones de promotor o de intensificador de distintos genes, que desempeñan un papel en la regulación de la proliferación celular (Ladomery, M. y otros, 1995; Bioassays 17: 9-11; Didier, D.K. y otros, 1988, PNAS, 85, 7322-7326).

Los adenovirus son conocidos en la técnica. Se trata en este caso de virus de dsADN (Boulanger, P. y otros (1991); Biochem. J. 275, 281-299). En la Figura 1 se representa la organización del genoma. La secuencia nucleotídica completa del genoma adenovírico es conocida, y está descrita en (Chroboczek, J. y otros, Virology 1992, 186, 280-285). Una parte del genoma especialmente importante para el empleo de adenovirus está constituida por los denominados genes tempranos ("early" en inglés), y sus productos génicos, que se han denominado E1, E2, E3 y E4. Entre ellos, E1 comprende dos productos génicos, E1A y E1B, que constituyen oncogenes. Los productos génicos del grupo E2, que son tres en total, junto con los productos génicos E3 y E4, particpan en la replicación.

Los sistemas adenovíricos conocidos en el estado de la técnica para la oncólisis, por ejemplo Onyx-015, presentan una deleción para la proteína E1B de 55 kDa. Esta deleción se ha realizado bajo el supuesto de que un gen p53 intacto impide in vivo una replicación eficaz, y para asegurar la replicación adenovírica in vivo sólo en células mutadas negativamente respecto a p53, pero conduce a un número de partículas disminuido en dos órdenes de magnitud en comparación con el tipo natural, a causa de la replicación perturbada. Por otra parte, estos sistemas adenovíricos según el estado de la técnica recurren al E1A, para regular por medio del promotor E2 temprano ("E2 early promotor" en inglés) la replicación in vivo.

La presente invención se aparta de este principio por cuanto que los sistemas adenovíricos descritos en la presente memoria recurren al promotor E2 tardío.

En el marco de la presente invención se deben entender aquí los términos "adenovirus" y "sistemas adenovíricos" con sustancialmente el mismo significado. En especial, se debe entender en la presente memoria por "adenovirus", la partícula vírica completa, que comprende el cápside y el ácido nucleico. La expresión "sistema adenovírico" indica en especial que el ácido nucleico está modificado con respecto al tipo natural. Preferiblemente, tales modificaciones comprenden variaciones en la estructura del genoma del adenovirus tales como deleciones y/o adiciones y/o mutaciones de promotores, secuencias reguladoras y secuencias codificadoras (por ejemplo marcos de lectura). La expresión "sistemas adenovíricos" se utiliza de manera especialmente preferente en el contexto en que se trata de un vector.

Los ácidos nucleicos adenovíricos a los cuales se hace referencia en la presente memoria son conocidos en el estado de la técnica. Está dentro del marco de los conocimientos de los especialistas en este sector el delecionar o mutar secuencias de ácido nucleico adenovíricas no esenciales para la invención. Tales deleciones pueden afectar, por ejemplo, al ácido nucleico que codifica para E3. En formas de realización preferidas, estos ácidos nucleicos adenovíricos pueden estar todavía empaquetados en el cápside vírico, y formar por lo tanto partículas infecciosas. Lo mismo vale para los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. En general se ha de hacer hincapié también en que los sistemas adenovíricos pueden ser deficientes en cuanto a uno o más productos de expresión. Se ha de considerar aquí que, por una parte, esto puede afectar a que el ácido nucleico que codifica el producto de expresión esté mutado o delecionado, por completo o en un grado tal que esencialmente ya no se forme más producto de expresión, y por otra parte, a que falten elementos reguladores o controladores de la expresión, tales como promotores o factores de transcripción, sea en el plano del ácido nucleico (ausencia de un promotor; elementos de actuación cis) o en el plano del sistema de traducción o transcripción (elementos de actuación trans). Precisamente este último aspecto puede depender en este caso de la base celular respectiva.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención que comprenden un ácido nucleico adenovírico y además una secuencia de ácido nucleico que codifica YB-1 son, preferiblemente, ácidos nucleicos recombinantes. El marco de lectura para el ácido nucleico que codifica YB-1 puede estar en este caso bajo el control de un elemento regulador de la expresión y/o de la traducción. Se puede tratar, por ejemplo, de un promotor adenovírico o de un promotor no adenovírico. Los promotores no adenovíricos adecuados pueden estar seleccionados del grupo de promotor de citomegalovirus, promotor de RSV (virus del sarcoma de Rous), promotor Va I basado en adenovirus, y el promotor YB-1 no vírico. Otros promotores víricos que se pueden utilizar en conexión con algún aspecto de la invención aquí presentada son el promotor de telomerasa, el promotor de alfa-fetoproteína (AFP), el promotor de antígeno carcinoembriogénico (CEA) (Cao, G., Kuriyama, S., Gao, J., Mitoro, A., Cui, L., Nakatani, T., Zhang, X., Kikukawa, M., Pan, X., Fukui, H., Qi, Z., "Comparison of carcinoembryonic antigen promoter regions isolated from human colorectal carcinoma and normal adjacent mucosa to induce strong tumour-selective gene expresión", Int. J. Cancer, 78, 242-247, 1998), el promotor de L-plastina (Chung, I., Schwartz, PE., Crystal, RC., Pizzorno, G, Leavitt, J., Deisseroth, AB, "Use of L-plastin promoter to develop an adenoviral system that confers transgene expression in ovarian cancer cells but not in normal mesothelial cells", Cancer Gene Therapy, 6, 99-106, 1999), el promotor de arginina-vasopresina (Coulson, JM, Staley, J., Woll, PJ., "Tumour-specific arginine vasopressin promoter activation in small-cell lung cancer", British J. Cancer, 80, 1935-1944, 1999) y el promotor PSA (Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C, Golightly, D., Stewart, D., Lin, J., Phipps, S., Chiang, YL., "A novel tumour-specific replication-restricted adenoviral vector for gene therapy of hepatocellular carcinoma", Human Gene Therapy, 10, 1721-1733, 1999).

Se sabe con respecto al promotor de telomerasa que este promotor tiene una importancia capital en las células humanas. La actividad de la telomerasa está regulada a través del control transcripcional del gen de la transcriptasa inversa de la telomerasa (hTERT), que regula la subunidad catalítica de la enzima. La expresión de la telomerasa es activa en 85% de las células tumorales humanas. Por el contrario, es inactiva en la mayoría de las células normales, excluyendo las células germinales y el tejido embrionario [Braunstein, I. y otros, (2001) "Human telomerase reverse transcription promoter regulation in normal and malignant human ovarian epithelial cells", Cancer Research, 61, 5529-5536; Majumdar AS y otros (2001) "The telomerase reverse transcriptase promoter drives effcacious tumor suicide gene therapy while preventing hepatotoxicity encountered with constitutive promoters", Gene Therapy, 8, 568-578]. Investigaciones precisas sobre el promotor hTERT han demostrado que fragmentos del promotor alejados 283 pares de bases o bien 82 pares de bases del codon de iniciación son suficientes para la expresión específica en células tumorales (Braunstein I. y otros; Majumdar AS y otros, artículos antes citados). Por tanto, este promotor, o los fragmentos específicos, son adecuados para conseguir la expresión específica de un transgen sólo en células tumorales. El promotor debe posibilitar la expresión del transgen YB-1 y/o una forma acortada que sea aún funcionalmente activa, sólo en células tumorales. La expresión del transgen en un vector adenovírico conduce después a la replicación vírica del vector adenovírico y, como consecuencia de ello, a la oncólisis. También entra dentro del marco de la presente invención que el marco de lectura de YB-1 esté en el mismo marco de lectura (lo que se denomina en inglés "in frame") con uno o varios de los productos génicos del sistema adenovírico. No obstante, el marco de lectura de YB-1 también puede ser independiente de éstos. El ácido nucleico que codifica YB-1 puede consistir en la secuencia completa. No obstante, también entra dentro del marco de la presente invención que la secuencia de ácido nucleico esté acortada. En particular, dicha secuencia de ácido nucleico acortada, y por tanto también una proteína YB-1 acortada, están aún dentro del marco de la presente invención si tal YB-1 acortada presenta alguna función o propiedad de la YB-1 completa. Dicha función o propiedad es, por ejemplo, la capacidad de llegar al núcleo, unirse con o sin una proteína E1b de 55 kDa, o unirse al promotor E2 tardío.

El ácido nucleico adenovírico que está comprendido en el ácido nucleico de la invención puede ser cualquier ácido nucleico adenovírico que conduzca a un suceso de replicación, por sí mismo o en combinación con otras secuencias de ácido nucleico. Las otras secuencias de ácido nucleico pueden ser, por ejemplo, YB-1. Es posible, por tanto, tal como se ha expuesto en la presente memoria, que por medio de virus auxiliares se produzcan las secuencias y/o los productos génicos requeridos para la replicación. Es un ejemplo de tal ácido nucleico adenovírico el ácido nucleico de Onyx-015, que permite la expresión de E1A pero no la de E1B.

En la forma de realización del ácido nucleico de acuerdo con la invención que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica YB-1, puede estar previsto que el ácido nucleico adenovírico comprenda una secuencia que codifique E1-B. Con ello es posible que el ácido nucleico que codifica E1-B esté ciertamente presente, pero que no se exprese el E1-B codificado. Esto se logra, por ejemplo, cuando falta un promotor adecuado para el ácido nucleico que codifica E1-B, lo que puede ocurrir, por ejemplo, si no se expresa E1A. No obstante, entra también dentro del marco de la presente invención que se produzca una expresión de E1-B, por ejemplo al estar el ácido nucleico que codifica E1-B bajo el control de un promotor adecuado. Un promotor adecuado está seleccionado, por ejemplo, del grupo de promotor de citomegalovirus, promotor de RSV (virus del sarcoma de Rous), promotor Va I basado en adenovirus, y el promotor YB-1 no vírico. Son también apropiados en este caso, además, los promotores antes mencionados, es decir, el promotor de telomerasa, el promotor de alfa-fetoproteína (AFP), el promotor de antígeno carcinoembriogénico (CEA), el promotor de L-plastina, el promotor de arginina-vasopresina, y el promotor PSA.

Tal como se ha descrito en la presente memoria, E1-B de 55k interviene en la distribución o el transporte de YB-1 hasta el núcleo celular. Puesto que E4orf6 se une a su vez a E1-B de 55k y es igualmente responsable del transporte de E1-B-55 hasta el núcleo, E4orf6 desempeña también un papel importante en la distribución o el transporte de YB-1 hasta el núcleo celular. Por tanto, entra también en el marco de la presente invención que los genes de la región 4, en especial E4orf6, se hallen también bajo el control de uno de los promotores antes mencionados. Así, en una forma de realización preferida está previsto que el promotor adenovírico E4 ya no sea funcional. En tal caso se prefiere de manera especial que el promotor adenovírico E4 esté delecionado.

En una forma de realización del ácido nucleico de acuerdo con la invención que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica YB-1, puede estar previsto que el ácido nucleico adenovírico comprenda una secuencia que codifique E1-A, y que permita la expresión del ácido nucleico adenovírico pero no permita la expresión de E1-B, y por tanto corresponda a la estructura de ADN de Onyx-015.

En general, en la presente memoria es válido que, cuando se hace referencia a E1-B, ello se aplica preferiblemente a la proteína E1B de 55 kDa, salvo indicación en contrario.

Cuando se hace referencia en la presente memoria a secuencias de ácido nucleico codificadoras, y tales secuencias de ácido nucleico codificadoras son conocidas, entra dentro el marco de la invención que no sólo se utilice la secuencia idéntica, sino también secuencias derivadas de la misma. Se deben entender aquí por "secuencias derivadas", aquellas secuencias que aún conducen a un producto génico que tiene una función que corresponde a una función de la secuencia no derivada. Esto se puede comprobar mediante sencillas pruebas rutinarias. Son un ejemplo de tales secuencias de ácido nucleico derivadas aquellas secuencias de ácido nucleico que codifican el mismo producto génico, en particular la misma secuencia de aminoácidos, pero que a consecuencia de la degeneración del código genético, presentan otra ordenación de bases.

Otro aspecto que consiste en el ácido nucleico de acuerdo con la invención que comprende un ácido nucleico que codifica YB-1 y una secuencia de ácido nucleico que interviene en el transporte nuclear de YB-1, se basa en el igualmente sorprendente hallazgo de que, estando presente YB-1 en el núcleo, y en particular estando presente con independencia del ciclo celular, tiene lugar una replicación de adenovirus en una célula, preferiblemente en una célula tumoral. Se pueden utilizar como adenovirus o sistemas adenovíricos y, en consecuencia, los ácidos nucleicos correspondientes pueden estar en relación con ellos y en combinación con los mencionados ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, los ácidos nucleicos, adenovirus y sistemas adenovíricos de acuerdo con la invención, así como los adenovirus conocidos en el estado de la técnica tales como, por ejemplo, Onyx-015. Los especialistas en la técnica conocen secuencias de ácido nucleico inductoras del transporte nuclear apropiadas, que además están descritas, por ejemplo, en (Whittaker, G.R. y otros, Virology, 246, 1-23, 1998; Friedberg, E.C., TIBS 17, 347, 1992; Jans, D.A. y otros, Bioessays 2000 Jun; 22(6): 532-44; Yoneda, Y., J. Biochem. (Tokio) mayo de 1997; 121(5): 811-7; Boulikas, T., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1993; 3(3): 193-227). En el caso de las secuencias de ácido nucleico inductoras del transporte nuclear pueden emplearse distintos principios. Uno de tales principios consiste en que YB-1 está estructurado como proteína de fusión con un péptido señal, y gracias al péptido señal se admite a YB-1 dentro el núcleo celular. Otro principio consiste en dotar a YB-1 de una secuencia de transporte que hace que YB-1, preferiblemente partiendo de una síntesis en el citoplasma, sea admitido en el núcleo celular e impulse allí la replicación vírica. Es un ejemplo de secuencia de ácido nucleico inductora del transporte nuclear especialmente eficaz, la secuencia TAT del VIH que, junto a otras secuencias de ácido nucleico semejantes adecuadas, está descrita por ejemplo en Efthymiadis, A., Briggs, LJ, Jans, DA, "The HIV-1 tat nuclear localisation sequence confers novel nuclear import properties" JBC, 273, 1623.

Otro aspecto de la invención que consiste en un ácido nucleico de acuerdo con la invención que comprende un ácido nucleico adenovírico, teniendo el ácido nucleico adenovírico en lugar del promotor E2 tardío (late, en inglés) un promotor con especificidad de tumor, se basa igualmente en el sorprendente hallazgo de que la expresión, y por tanto la replicación, del adenovirus, y con ellas la oncólisis, dependen esencialmente de la regulación, por parte del promotor E2 tardío, de los genes y productos génicos adenovíricos, en especial la región E2, en particular in vivo. La región E2 del adenovirus, que constituye una unidad de transcripción, se compone de los genes E2A y E2B, que codifican proteínas vitales para la replicación vírica: la pTP (proteína terminal precursora), la ADN-polimerasa, y la DBP, una proteína de unión de ADN multifuncional. En el marco de la presente invención los conceptos de "promotor delecionado", "promotor activo no funcional", "promotor no activo funcional" o "promotor no funcional" denotan que el promotor como tal ya no es activo, es decir, ya no se efectúa desde el mismo ninguna transcripción. Un promotor no funcional semejante se puede preparar por medios conocidos para los especialistas en este campo. Se puede conseguir, por ejemplo, mediante una deleción completa del promotor, mediante una deleción parcial del promotor, o también mediante una mutación puntual. Otras posibilidades de las mutaciones de tales promotores pueden consistir en que se modifica la relación espacial de los elementos que constituyen el promotor, y así queda éste funcionalmente inactivo.

Con la inactivación del promotor E2 tardío y su reemplazo por un promotor con especificidad respecto al tumor o al tejido, y por tanto la obtención de uno de las ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, se garantiza que los genes o productos génicos importantes para la replicación vírica se encuentren bajo el control del tumor o del tejido correspondiente, con la consecuencia de que la replicación del adenovirus tiene lugar de manera específica en el tumor o en un tejido determinado. Con ello se consigue la activación a través de la lisis de células específicamente mediada por virus, y de este modo se garantiza la seguridad del sistema. La inactivación del promotor E2 tardío se puede conseguir delecionándolo por completo. No obstante, también está dentro del marco de la invención que el promotor E2 tardío esté modificado de manera tal que ya no sea funcionalmente activo como promotor. Esto se puede conseguir, por ejemplo, modificando el lugar de unión para YB-1 del promotor, por ejemplo mutándolo o delecionándolo, de modo que ya no sea posible la unión de YB-1 al promotor. La deleción de la caja Y-Box del promotor puede constituir una de tales deleciones. El concepto que se utiliza en la presente memoria, el que un ácido nucleico de acuerdo con la invención presente en lugar del promotor E2 un promotor con especificidad respecto al tumor o al tejido, comprende las posibilidades antes descritas. Con esta amplitud se ha de entender la noción de "funcional".

Para mejorar aún más la seguridad del sistema que regula la expresión de los productos génicos de E2 a través de un promotor con especificidad respecto al tumor o al tejido, en una forma de realización preferida se debe hacer que el promotor E2 temprano sea funcionalmente inactivo al mismo tiempo que el promotor E2 tardío, por ejemplo sometiéndolo a deleción o modificándolo de modo que ya no sea funcionalmente activo. De esta manera se asegura que el promotor E2 temprano no pueda ejercer ninguna influencia sobre la expresión de los genes E2. En lugar de ello, de acuerdo con la invención preferiblemente se reemplazan ambos promotores, es decir el promotor E2 tardío y el promotor E2 temprano, por un promotor con especificidad respecto al tejido o al tumor. Aquí también se pueden utilizar los promotores descritos en la presente memoria en relación con la secuencia de ácido nucleico que codifica YB-1. El ácido nucleico adenovírico o los correspondientes adenovirus comprenden preferiblemente los genes para E1A, E1B, E2 y E3. En una forma de realización preferida puede estar delecionado el ácido nucleico que codifica E3.

Las construcciones antes descritas de adenovirus y especialmente sus ácidos nucleicos también pueden ser introducidas en partes dentro de una célula, en especial una célula tumoral, con lo cual, y como consecuencia de la presencia de los diferentes componentes individuales, éstos actúan conjuntamente como si los componentes individuales procediesen de un único ácido nucleico. Una expresión típica de este denominado en la presente memoria "sistema de replicación adenovírico" prevé que el ácido nucleico adenovírico sea deficiente para la expresión de la proteína E1A. El sistema de replicación celular preferido comprende un ácido nucleico de un virus auxiliar, comprendiendo el ácido nucleico del virus auxiliar una secuencia de ácido nucleico que codifica YB-1. En este caso puede estar previsto que el ácido nucleico adenovírico o el ácido nucleico del virus auxiliar se presenten individualmente o por separado como vectores replicables.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden presentarse como vectores. Son preferiblemente de vectores víricos. En el caso de los ácidos nucleicos adenovíricos que comprenden ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, la partícula vírica es entonces el vector. No obstante, también entra dentro del marco de la presente invención que los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención estén presentes en un vector plásmido. En cualquier caso el vector tiene elementos que procuran o regulan la multiplicación del ácido nucleico insertado (replicación) y eventualmente la expresión del ácido nucleico insertado. Los especialistas en la técnica del sector conocen vectores apropiados, y especialmente también vectores de expresión y elementos, que están descritos por ejemplo en Grunhaus, A., Horwitz, M.S., 1994, "Adenoviruses as cloning vectors" en la compilación de Rice, C., Seminars in virology, London: Saunders Scientific Publications, 1992; 237 - 252.

La forma de realización antes descrita en la cual los distintos elementos del ácido nucleico de acuerdo con la invención no tienen que estar necesariamente contenidos en un solo vector, tiene en cuenta el aspecto de la invención que comprende el grupo de vectores. Un grupo de vectores comprende, consecuentemente, al menos dos vectores. Para estos vectores rige por lo demás lo que se ha dicho en general en la presente memoria en cuanto a vectores.

Los adenovirus de acuerdo con la invención están caracterizados por los distintos ácidos nucleicos descritos en la presente memoria, y comprenden por lo demás todos los elementos conocidos para los especialistas en la técnica del sector, como ocurre también en el caso de adenovirus de tipo natural (Shenk, T., "Adenoviridae: The virus and their replication", en Fields Virology, 3ª edición, compilada por Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, P.M. y otros, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, capítulo 67).

Los agentes de acuerdo con la invención, es decir los ácidos nucleicos, y vectores y grupos de vectores, células y adenovirus y sistemas de replicación adenovíricos, que los contengan, pueden ser empleados para preparar un medicamento. Por las actividades específicas de los agentes de acuerdo con la invención, el medicamento es preferiblemente un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades tumorales. En principio estos agentes son adecuados para todas las enfermedades tumorales o tumores, y especialmente aquellos tumores que contienen p53 y aquellos que carecen de p53. Se deben entender por "tumores" tanto tumores malignos como tumores benignos.

El medicamento puede presentarse en distintas formulaciones, preferiblemente en forma líquida. El medicamento contendrá además sustancias auxiliares tales como estabilizantes, tampones, agentes conservantes y similares, que son conocidos para el especialista en el sector de la galénica.

En particular, el medicamento pueden contener también otros compuestos farmacéuticamente activos. El tipo y extensión de estos otros compuestos farmacéuticamente activos depende en este caso del tipo de indicación para la cual se emplee el medicamento. En caso de emplear el medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades tumorales, se utilizan típicamente citostáticos tales como por ejemplo cisplatino y taxol, daunoblastina, adriamicina y/o mitoxantrona.

El empleo de adenovirus atenuados tales como Onyx-015, que es deficiente en cuanto a la proteína E1B de 55 kDa, en la aplicación destinada a lograr la oncólisis vírica, está asociado a expectativas de éxito comparativamente pequeñas. El autor de la presente invención ha comprobado, sorprendentemente, que estos virus atenuados, y en especial también Onyx-015, pueden ser empleados con una tasa de éxito especialmente grande en aquellos tumores en donde esté presente en el núcleo YB-1 con independencia del ciclo celular. Normalmente YB-1 está presente en el citoplasma, y en especial en el plasma perinuclear. En la fase S del ciclo celular se encuentra YB-1 en el núcleo celular tanto de células normales como de células tumorales. Sin embargo, esto no es suficiente para conseguir una oncólisis vírica empleando adenovirus atenuados. La eficacia comparativamente pequeña descrita en el estado de la técnica de adenovirus atenuados tales como Onyx-015 se basa también en su mal empleo. En otras palabras, se pueden emplear estos sistemas, en especial también Onyx-015, con mayor eficacia allí donde se dan las condiciones previas de biología molecular para la oncólisis vírica. En especial, en el caso de Onyx-015 se dan estas condiciones previas en aquellas enfermedades tumorales cuyas células presentan una localización nuclear de YB-1 con independencia del ciclo celular. Esta forma de localización nuclear puede deberse al tipo mismo de tumor, pero también se puede producir mediante los agentes de acuerdo con la invención que se describen en la presente memoria. La presente invención define con ello un nuevo grupo de tumores o enfermedades tumorales, y por tanto de pacientes, que pueden ser tratados con una gran tasa de éxito con los agentes de acuerdo con la invención, pero especialmente también con el adenovirus atenuado ya descrito en el estado de la técnica, preferiblemente con adenovirus deficientes en E1B, más preferiblemente deficientes en E1B de 55 kDa, y muy preferiblemente con Onyx-015.

Otro grupo de pacientes que pueden ser tratados utilizando los adenovirus descritos en el estado de la técnica, en especial aquellos que son deficientes en E1B, tal como por ejemplo, el Onyx-015, son aquellos en los cuales al establecer determinadas condiciones se garantiza que YB-1 migre al núcleo o sea transportado al mismo. El empleo de tales adenovirus en este grupo de pacientes se basa en el hallazgo de que la inducción de la replicación vírica se basa en la localización nuclear de YB-1 con la posterior unión al promotor E2 tardío. Como consecuencia del hallazgo aquí descrito, el adenovirus Onyx-015, que es deficiente en E1B, no puede intervenir en el transporte nuclear del YB-1 celular. Esto motiva la aplicación y el éxito de Onyx-015 limitados a aquellos tumores que presentan ya YB-1 en el núcleo. No obstante, esto sólo ocurre en un grupo muy pequeño de pacientes. La localización nuclear de YB-1 se puede inducir mediante estrés externo o estrés aplicado localmente. Tal inducción se puede realizar, por ejemplo, mediante irradiación, en especial irradiación UV, mediante la administración de citostáticos, tal como se ha descrito también, entre otros sitios, en la presente memoria, y mediante hipertermia. En relación con la hipertermia se debe señalar que ésta se puede llevar a cabo a intervalos de tiempo de manera muy específica y por tanto se consigue del mismo modo específico el transporte nuclear de YB-1 hasta el núcleo celular y como consecuencia de ello se dan las condiciones previas para la replicación del adenovirus y con ella la lisis celular y tumoral (Stein U, Jurchott K, Walter W, Bergmann S, Schlag PM, Royer HD., "Hyperthermia-induced nuclear translocation of transcription factor YB-1 leads to enhanced expression of multidrug resistance-related ABC transporters", J. Biol. Chem. 2001, 276(30):28562-9; Hu Z, Jin S, Scotto KW, "Transcriptional activation of the MDR1 gene by UV irradiation. Role of NF-Y and Spl", J. Biol. Chem. 2000 Jan 28;275(4):2979-85; Ohga T, Uchiumi T, Makino Y, Koike K, Wada M, Kuwano M, Kohno K, "Direct involvement of the Y-box binding protein YB-1 in genotoxic stress-induced activation of the human multidrug resistance 1 gene", J. Biol. Chem. 1998, 273(11):5997-6000).

El medicamento de acuerdo con la invención sería administrado, por tanto, a aquellos pacientes y grupos de pacientes en los cuales, mediante tratamientos previos adecuados, se hubiera provocado el transporte de YB-1, en especial en las correspondientes células tumorales.

Así, la invención se refiere también, en otro aspecto, a un procedimiento para discriminar pacientes que pueden ser tratados con un adenovirus atenuado tal como Onyx-1 o en general con adenovirus deficientes en E1B, preferiblemente deficientes en E1B de 55 kDa, caracterizado por los pasos siguientes:

-

analizar una muestra del tejido tumoral y

-

comprobar si YB-1 está localizado en el núcleo con independencia del ciclo celular.

La muestra del tejido tumoral se puede obtener mediante punción o mediante una intervención quirúrgica. La comprobación de si YB-1 está localizado en el núcleo con independencia del ciclo celular se efectúa en este caso frecuentemente utilizando técnicas microscópicas y/o por medio de inmunohistoanálisis, típicamente con empleo de anticuerpos. Así, la detección de YB-1 se realiza empleando un agente que está seleccionado del grupo que comprende anticuerpos contra YB-1. La detección de si además YB-1 está localizado en el núcleo y en particular si está allí con independencia del ciclo celular, es conocida para el especialista. Por ejemplo, se puede reconocer fácilmente la localización de YB-1 al examinar los cortes de tejido teñidos en busca de YB-1. De aquí se deduce ya, en función de la frecuencia de aparición de YB-1 en el núcleo, si se trata de una localización en el núcleo con independencia del ciclo celular. Otra posible detección de YB-1 en el núcleo con independencia del ciclo celular consiste en realizar una tinción en busca de YB-1, comprobar si YB-1 está localizado en el núcleo, y determinar el estadio celular de las células. Esto se puede conseguir también por medio de anticuerpos adecuados (doble inmunohistoanálisis).

A continuación se explicará con más detalle la invención por medio de las Figuras y los Ejemplos, de los cuales se deducen otras características, formas de realización, aplicaciones y ventajas. Así,

la Figura 1 muestra la organización genético-molecular básica del adenovirus;

la Figura 2 muestra una panorámica de distintas construcciones de ácido nucleico o de adenovirus de acuerdo con la invención; y

la Figura 3 muestra el resultado de un análisis de tinción tipo Northern.

En la Figura 2 están representadas algunas de las construcciones de ácido nucleico o de adenovirus de acuerdo con la invención. Así, la Figura 2.1A representa un vector adenovírico recombinante de acuerdo con la invención que es deficiente en E1A y deficiente en E1B, pero que expresa la proteína YB-1.

La Figura 2.1B representa un vector adenovírico recombinante de acuerdo con la invención que expresa igualmente la proteína YB-1, pero en el cual está delecionada la región E1A. Puesto que E1A es responsable de la expresión de E1B, se produce una activación nula o muy escasa de E1B, aunque el vector contiene el gen.

La Figura 2.2 representa un vector adenovírico recombinante de acuerdo con la invención que expresa igualmente YB-1. Aquí el gen E1B o E1B-55kDa son regulados a través de un promotor externo independiente de E1A. Tal promotor puede ser el promotor CMV, el promotor RSV, o el promotor YB-1.

La Figura 2.3 representa otro vector adenovírico recombinante de acuerdo con la invención que presenta un promotor E2 tardío independiente de YB-1. Esto se consigue eliminando el promotor E2 tardío completo, o bien llevando a cabo una modificación deliberada de la secuencia génica dentro del promotor a la cual se une YB-1 (la denominada Y-Box).

La Figura 2.4 representa otro vector adenovírico recombinante de acuerdo con la invención en el cual están delecionados tanto el promotor E2 tardío como el promotor E2 temprano, y que por tanto ya no es funcionalmente activo. En el vector esquemáticamente representado, los dos promotores han sido reemplazados por un promotor con especificidad respecto al tumor o al tejido, tal como se describe en la presente memoria.

Ejemplo 1 Importancia de YB-1 para la replicación adenovírica

Para demostrar que YB-1 regula la expresión de E2 a través del promotor E2 tardío, se eligió la siguiente disposición experimental:

Se infectaron células tumorales (células HeLa) con adenovirus de tipo natural, con un adenovirus E1-menos, o con un adenovirus E1-menos que expresaba YB-1 (K significa aquí el testigo no infectado). Al cabo de 24 horas se aisló el ARN total. A continuación se realizó un análisis mediante tinción tipo Northern. Después se separó por tamaño mediante electroforesis en gel, en un gel de formaldehído-agarosa, el ARN aislado, se transfirió a una membrana de Nylon, y se fijó bajo UV. Se utilizó como sonda radiactivamente marcada un fragmento de cADN de 250 bases que era complementario de una secuencia situada entre el promotor E2 temprano y el promotor E2 tardío. El marcado de la sonda se realizó con ayuda del sistema de marcado Random Prime Labelling System de la razón social Amersham. El análisis de las películas indicó que sólo en el caso de células infectadas con adenovirus de tipo natural estaba presente una señal específica de E2.

Ejemplo 2 Importancia de YB-1 para la replicación adenovírica

Para demostrar que YB-1 regula la expresión de E2 a través del promotor E2 tardío, se eligió la siguiente disposición experimental, que se basa en la disposición descrita en el Ejemplo 1.

Se eliminó la sonda radiactiva del Ejemplo 1 mediante ebullición en agua durante 2 minutos, y se hibridó de nuevo con otra sonda de cADN. Esta sonda estaba situada aguas arriba del promotor E2 tardío.

El análisis proporcionó el siguiente resultado: tanto las células infectadas con adenovirus de tipo natural como las células infectadas con AdYB-1 presentaban una clara señal o una banda específica de E2. De ello se deduce que YB-1 regula o activa la región E2 a través del promotor E2 tardío.

Ejemplo 3 Detección de la unión específica de YB-1 al promotor E2

El experimento se basó en la consideración de que YB-1, como factor de transcripción, se debía unir a la Y-Box (secuencia CAAT) dentro del promotor E2 tardío. Para detectar tal unión específica de YB-1 a este promotor se llevó a cabo el denominado análisis EMSA (siglas inglesas de ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética). Para ello se aisló, 24 horas después de la infección con adenovirus de tipo natural, la proteína nuclear. Después se incubaron a 37ºC, durante 30 minutos, 1 - 10 \mug de proteína y un corto fragmento de ADN con una longitud de 30 a 80 bases, que contenía la secuencia del promotor E2 tardío. Este oligofragmento de ADN había sido previamente marcado radiactivamente con ^{32}P en el extremo 5' mediante una cinasa. A continuación se efectuó la separación en un gel de poliacrilamida nativo. Si la proteína YB-1 se une a una secuencia del oligofragmento, se produce el denominado desplazamiento, ya que a causa de la unión de YB-1 al corto fragmento de ADN que está marcado radiactivamente en el extremo 5', migra más lentamente en el gel que un oligofragmento al cual no se ha fijado. Este desplazamiento se puede compensar si se añade un exceso de cien veces de oligofragmento no marcado al preparado de reacción.

Se obtuvo como resultado que YB-1 se une específicamente al promotor E2 tardío.

Se llevó a cabo como testigo un experimento de competición. En éste se añadió al preparado de reacción un exceso de fragmento de promotor E2 tardío. Después de ello ya no se observa en el anterior preparado de reacción ningún desplazamiento.

Claims (38)

1. \global\parskip0.950000\baselineskip

   1. Ácido nucleico que comprende un ácido nucleico adenovírico, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica YB-1, siendo YB-1 un representante de la familia de proteínas Y-Box.
2. 2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico adenovírico comprende un ácido nucleico que codifica E1-B.
3. 3. Ácido nucleico según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el ácido nucleico adenovírico comprende un ácido nucleico que codifica E4orf6.
4. 4. Ácido nucleico según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque se prevé un promotor que regula la expresión de E1-B.
5. 5. Ácido nucleico según una de las reivindicaciones 3 o 4, caracterizado porque se prevé un promotor que regula la expresión de E4orf6.
6. 6. Ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque E1B es la proteína E1B de 55 kDa.
7. 7. Ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el ácido nucleico codifica productos génicos funcionalmente inactivos E1B y/o E1 y/o E3 y/o E4.
8. 8. Sistema de replicación adenovírico que comprende un ácido nucleico adenovírico, siendo el ácido nucleico adenovírico deficiente para la expresión de la proteína E1A, y que comprende un ácido nucleico de un virus auxiliar, comprendiendo el ácido nucleico del virus auxiliar una secuencia de ácido nucleico que codifica YB-1, siendo YB-1 un representante de la familia de proteínas Y-Box.
9. 9. Sistema de replicación adenovírico según la reivindicación 8, caracterizado porque el ácido nucleico adenovírico y/o el ácido nucleico del virus auxiliar se presentan como vectores replicables.
10. 10. Vector, preferiblemente un vector de expresión, que comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 7.
11. 11. Grupo de vectores que comprende al menos dos vectores, en donde el grupo de vectores comprende en conjunto un sistema de replicación adenovírico según la reivindicación 8 o 9.
12. 12. Grupo de vectores según la reivindicación 11, caracterizado porque cada componente del sistema de replicación adenovírico está dispuesto sobre un vector propio, preferiblemente un vector de expresión.
13. 13. Grupo de vectores según la reivindicación 11, caracterizado porque al menos dos componentes del sistema de replicación adenovírico están dispuestos sobre un vector del grupo de vectores.
14. 14. Adenovirus que comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 7.
15. 15. Adenovirus según la reivindicación 14, que comprende un cápside.
16. 16. Célula que comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones1 a 7 y/o un sistema de replicación adenovírico según la reivindicación 8 o 9 y/o un vector según la reivindicación 10 y/o un grupo de vectores según una de las reivindicaciones 11 a 13 y/o un adenovirus según la reivindicación 14 o 15.
17. 17. Empleo de un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 7 y/o un sistema de replicación adenovírico según la reivindicación 8 o 9 y/o un vector según la reivindicación 10 y/o un grupo de vectores según una de las reivindicaciones 11 a 13 y/o un adenovirus según la reivindicación 14 o 15 y/o una célula según la reivindicación 16 para preparar un medicamento.
18. 18. Empleo según la reivindicación 17, caracterizado porque el medicamento está destinado al tratamiento y/o profilaxis de enfermedades tumorales.
19. 19. Empleo según la reivindicación 17 o 18, caracterizado porque el medicamento contiene además un compuesto farmacéuticamente activo.
20. 20. Empleo según la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto farmacéutico está seleccionado del grupo que comprende citostáticos que están seleccionados preferiblemente del grupo que comprende cisplatino, taxol, daunoblastina, adriamicina y mitoxantrona.

    \global\parskip1.000000\baselineskip

21. 21. Empleo de un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 7 y/o un sistema de replicación adenovírico según la reivindicación 8 o 9 y/o un vector según la reivindicación 10 y/o un grupo de vectores según una de las reivindicaciones 11 a 13 y/o un adenovirus según la reivindicación 14 o 15 y/o una célula según la reivindicación 16 para preparar un medicamento destinado al tratamiento y/o profilaxis de enfermedades tumorales, en donde las células tumorales presentan una localización nuclear de YB-1 con independencia del ciclo celular.
22. 22. Empleo según la reivindicación 21, caracterizado porque el ácido nucleico codifica un ácido nucleico adenovírico, y el ácido nucleico adenovírico es deficiente en E1B, en particular deficiente en E1B de 55 kDa.
23. 23. Empleo según la reivindicación 21, caracterizado porque el adenovirus es deficiente en E1B, en particular deficiente en E1B de 55 kDa.
24. 24. Empleo según la reivindicación 21, caracterizado porque el ácido nucleico codifica un ácido nucleico adenovírico, y el ácido nucleico adenovírico codifica E1B, en particular E1B de 55 kDa.
25. 25. Empleo según la reivindicación 21, caracterizado porque el adenovirus expresa E1B, en particular E1B de 55 kDa.
26. 26. Empleo según la reivindicación 21, 22 o 23, caracterizado porque el ácido nucleico adenovírico codifica E1A.
27. 27. Empleo según la reivindicación 21, 22 o 23, caracterizado porque el adenovirus expresa E1A.
28. 28. Empleo según una de las reivindicaciones 21 a 27, caracterizado porque el tumor y/o la enfermedad tumoral están seleccionados del grupo que comprende tumores p53-positivos, tumores p53-negativos, tumores malignos, tumores benignos, y combinaciones de los mismos.
29. 29. Procedimiento para discriminar pacientes que pueden ser tratados con un adenovirus deficiente en E1B, preferiblemente deficiente en E1B de 55 kDa, caracterizado por los pasos siguientes:

    -

    analizar una muestra del tejido tumoral y

    -

    comprobar si YB-1 está localizado en el núcleo con independencia del ciclo celular, siendo YB-1 un representante de la familia de proteínas Y-Box.

30. 30. Procedimiento según la reivindicación 29, caracterizado porque el análisis del tejido tumoral se realiza empleando un agente que está seleccionado del grupo que comprende anticuerpos contra YB-1.
31. 31. Empleo de un anticuerpo contra YB-1 para determinar los pacientes, en especial pacientes con tumores, que son tratables con un adenovirus deficiente en E1B, preferiblemente deficiente en E1B de 55 kDa, siendo YB-1 un representante de la familia de proteínas Y-Box.
32. 32. Complejo que comprende al menos una molécula YB-1 y al menos una proteína E1B de 55 kDa, siendo YB-1 un representante de la familia de proteínas Y-Box.
33. 33. Complejo según la reivindicación 32, caracterizado porque la molécula YB-1 es una molécula YB-1 transgénica.
34. 34. Complejo según la reivindicación 32 o 33, caracterizado porque YB-1 es YB-1 expresado nuclearmente.
35. 35. Empleo de un adenovirus deficiente en E1B para preparar un medicamente para el tratamiento de tumores que presentan YB-1 en el núcleo, siendo YB-1 un representante de la familia de proteínas Y-Box.
36. 36. Empleo según la reivindicación 35, caracterizado porque la localización nuclear de YB-1 se realiza mediante la influencia de medidas exógenas.
37. 37. Empleo según la reivindicación 36, caracterizado porque las medidas exógenas son aquellas medidas que están seleccionadas del grupo que comprende irradiación, citostáticos e hipertermia.
38. 38. Empleo según la reivindicación 36 o 37, caracterizado porque la medida exógena se aplica al organismo para el cual está destinado el medicamento.