KR101123510B1 - 신규한 아데노바이러스, 이를 암호화하는 핵산 및 이들의 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 E1B 단백질 및 E4 단백질을 포함하는 군으로부터 선택된 제1 단백질을, E1A 단백질을 포함하는 군으로부터 선택된 제2 단백질 이전에 발현하는 아데노바이러스에 관한 것이다.

아데노바이러스, E1B 단백질, E4 단백질, 종양 세포 파괴, YB-1

Description

신규한 아데노바이러스, 이를 암호화하는 핵산 및 이들의 조성물{Novel adenoviruses, nucleic acids coding therefor, and use thereof}

본 발명은 아데노바이러스, 이를 암호화하는 핵산 및 특히 종양 치료용 의약 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.

다수의 치료방법이 종양 치료에 현재 이용되고 있다. 수술을 이용한 방법 이외에, 화학요법 및 방사선요법이 주된 방법이다. 그러나 이들 모든 수법은 상당한 부작용과 관련된다. 복제 선택적 종양세포 파괴 바이러스의 사용은 종양 치료의 전기를 제공한다. 이와 관련하여 바이러스제의 선택적 종양내 복제가 개시되고, 바이러스 복제, 감염된 종양 세포용해 및 바이러스의 인접 종양 세포로 유포를 유발한다. 바이러스의 복제능은 종양세포에 한정되기 때문에, 정상 조직은 복제되지 않으므로 바이러스에 의한 용해도 없다.

얼마동안, 몇개의 바이러스 계가 종양 붕괴를 위해 임상시험처리되고 있다. 이러한 아데노바이러스의 일례는 dl1520 (Onyx-015)이며, 이들은 임상 I상 및 II상에서 성공적으로 이용되었다(Khuri, F. et al. Nature Medicine 6, 879-885, 2000). Onyx-015는 E1B-55kDa 유전자가 완전히 결실된 아데노바이러스이다. 아데노바이러스의 E1B55kDa 단백질의 완전한 결실은 복제 및 그에 따른 세포 용해가 p53 결핍을 갖는 아데노바이러스 벡터에 의해 가능하다는 발견에 기초로 하며(Kirn, D. et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17, 391a, 1998), 정상세포는 그에 의해 해를 입지 않는다. 보다 자세하게는, E1B-55kDa 유전자 산물은 p53의 억제, 바이러스 mRNA의 수송 및 숙주 세포의 단백질 합성의 중지에 관여한다. p53의 억제는 p53 및 아데노바이러스 암호화된 E1B-55kDa 단백질로 구성된 복합체 및/또는 E1B-55kDa 및 E4orf6으로 구성된 복합체의 형성을 통하여 생긴다. TP53에 의해 암호화된 p53은 복합체 조절 메카니즘의 출발지점(Zambetti, G.P. et al., FASEB J. 7, 855-865, 1993)이며, 아데노바이러스와 같은 바이러스의 세포 복제의 효과적인 억제를 초래한다. 유전자 TP53은 모든 인간 종양의 약 50%에서 결실되거나 돌연변이되며, 그에 의해 화학요법이나 방사선요법에 의한 소망하는 세포자살(apoptosis)의 부재를 초래하게 되어 흔히 종양 치료의 실패를 유발한다.

종양분해성 아데노바이러스의 다른 개념은 E1A 단백질이 특정의 결실 형태로 존재하거나 또는 Rb/E2F 및/또는 p107/E2F 및/또는 p130/E2F의 결합에 영향을 주지 않는 1 또는 몇개의 돌연변이를 포함하면, 이러한 아데노바이러스는 감염된 세포가 S상으로 들어가는 것을 유도하지 않을 것이고 또 작용성 Rb 단백질을 갖지 않는 종양 세포에서 복제할 수 있을 것이라는 발견에 기초로 한다. 부가적으로, E1A 단백질은 N-말단에서 결실될 수 있으며 또 E1A가 p300에 결합되는 것을 억제시켜 종양 세포에서 보다 선택적 복제를 제공하기 위하여, E1A 단백질의 아미노산 위치 1 내지 76의 영역에서 1 또는 몇개의 돌연변이를 포함한다. 이들 방법은 예컨대 유럽특허 EP 0 931 830호에 예시적으로 기재되어 있다. 이러한 바이러스의 예는 AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07 및 CB016이다 (Howe, J. A. et al., Molecular Therapy 2, 485-495, 2000; Fueyo, J. et al., Oncogene 19, 2-12, 2000; Heise, C. et al., Nature Medicine 6, 11341139, 2001; Balague, C. et al., J. Virol. 75, 7602-7611, 2001). 종래 기술에서 공지된 종양세포 붕괴용의 이들 아데노바이러스 계는 E1A 단백질에서 분명한 결실을 포함하며, 따라서 이들 결실은 생체내에서 Rb-음성적/돌연변이된 세포에서만 아데노바이러스 복제를 제공하기 위하여 작용성 Rb 단백질 및 불활성 Rb 단백질과 E2F로 구성된 복합체가 생체내 복제를 효과적으로 차단시킬 것이라는 가정하에서 실시되었다. 종래 기술에 따른 이들 아데노바이러스 계는 초기 E2 프로모터(E2 초기 프로모터) 및 유리 E2F에 의해 생체내 복제를 제어하기 위하여 E1A을 기초로 한다(Dyson, N. Genes & Development, 12, 2245-2262, 1998).

다른 형태의 종양분해성 아데노바이러스 계는 종양 세포에서 선택적 복제를 제공하는 바이러스성 암유전자 E1A를 특이적으로 발현하는 선택적 프로모터의 사용을 기본으로 한다(Rodriguez, R. et al., Cancer Res. 57, 2559-2563, 1997).

상술한 바와 같이, 작용 모드의 기초가 되는 각 개념에 적합한 세포 배경의 선택은 다양한 개념의 아데노바이러스 종양세포분해 바이러스에 중요하다. 즉, 현재 공지된 다양한 아데노바이러스 계는 분명한 분자 생물학적 요건이 실현될 때에만 이용될 수 있다. 이는 이러한 계의 사용은 특정 환자 그룹에 한정시킨다.

종양 질환의 치료에서 특정 문제는 일단 환자가 세포항상성에 대한 잘 연구된 형태의 종양 내성을 나타내는 다약제 내성(MDR)을 나타내면 유발된다(Gottesman and Pastan, Annu. Rev. Biochem. 62, 385-427, 1993). 이것은 소위 ABC 트랜스포터에 속하는 막-결합 이동 단백질 P-당단백질의 과발현을 기본으로 한다(Stein, U. et al., JBC 276, 28562-69, 2001, J. Wijnholds, Novartis Found Symp., 243, 69-79, 2002). Bargou, R. C. 등 및 Oda, Y. 등(Bargou, R.C. et al., Nature Medicine 3, 447-450, 1997; Clin. Cancer Res. 4, 2273-2277, 1998)은 인간의 전사인자 YB-1의 핵내 이동이 P-당단백질의 발현의 활성화에 직접적으로 관련된다는 것을 나타낼 수 있었다. 다른 연구는 YB-1이 UV 조사, 세포증식 억제제의 투여(Koike, K. et al., FEBS Lett 17, 390-394, 1997) 및 온열요법과 같은 다양한 스트레스 조건에 의해 핵으로 이동됨을 확인하였다. 다른 연구는 YB-1의 핵내이동이 1개의 다른 ABC 트랜스포터에 영향을 갖는 것도 확인하였다. 이러한 ABC 트랜스포터를 MRP(다약제 내성 관련 단백질)로 칭하며 이것은 소위 비정형 비-P-당단백질 의존형 다약제 내성의 형성에 관여한다(Stein, U. et al., JBC 276, 28562-69, 2001).

본 발명의 기본이 되는 문제는 특이적으로 종양분해적 활성제를 사용하여 생물, 보다 자세하게는 인간의 기관 및 환자 그룹을 치료하기 위한 기술적 방법 및 수단을 제공하는 것이다. 본 발명의 기본이 되는 다른 문제는 세포증식억제제에 대하여 내성인 종양 질환에 걸린 환자, 특히 다약제 내성을 갖는 환자에서 종양분해를 유발하기에 적합한 수단을 제공하는 것이다. 마지막으로, 본 발명의 기본이 되는 문제는 세포 분해에 적합한 아데노바이러스를 제공하는 것이다.

제1 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 E1B 단백질 및 E4 단백질을 포함하는 군으로부터 선택되는 제1 단백질을, E1A-단백질을 포함하는 군으로부터 선택된 제2 단백질 이전에 발현하는 아데노바이러스에 의해 해결된다.

구체예로서, 상기 제1 단백질은 E1B 단백질, 바람직하게는 E1B55kd 단백질이다.

다른 구체예로서, 상기 제1 단백질은 E4 단백질, 바람직하게는 E4orf6 단백질이다.

바람직한 구체예로서, 상기 제1 단백질은 E1B 단백질과 E4 단백질의 조합물, 바람직하게는 E1B55kD 단백질 및 E4orf6 단백질의 조합물이다.

바람직한 구체예로서, 상기 E1A 단백질은 E1A12S 단백질이다.

제2 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 아데노바이러스에 의해 해결되며, 상기 아데노바이러스는 E1B 단백질, E4 단백질 및 E1A 단백질을 포함하는 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 1 이상의 핵산을 포함하며, 따라서 상기 1 이상의 단백질은 야생형 아데노바이러스에서 단백질의 발현을 제어하는 프로모터와는 상이한 프로모터의 제어하에 있다.

제2 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 본 발명의 제1 요지에 따른 아데노바이러스이다.

제2 요지의 구체예로서, 상기 1 이상의 단백질은 E1B 단백질, 바람직하게는 E1B55kD 단백질이다.

제2 요지의 구체예로서, 상기 1 이상의 단백질은 E4 단백질, 바람직하게는 E4orf6 단백질이다.

제2 요지의 구체예로서, 상기 1 이상의 단백질은 E1A 단백질, 바람직하게는 E1A12S 단백질이다.

제2 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 1 이상의 단백질은 E1B 단백질, E4 단백질 및 E1A 단백질의 조합물, 바람직하게는 E1B55kD 단백질, E4orf6 단백질 및 E1A12S 단백질의 조합물이다.

제2 요지의 바람직한 구체예로서, E1B 단백질의 발현은 프로모터에 의해 제어되며, 상기 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 상기 아데노바이러스 프로모터는 E1B 프로모터와 상이하다.

제2 요지의 구체예로서, E4 단백질의 발현은 프로모터에 의해 제어되며, 상기 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 상기 아데노바이러스 프로모터는 E4 프로모터와 상이하다.

제2 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 아데노바이러스 프로모터는 E1A 프로모터이다.

제2 요지의 구체예로서, E1A 단백질의 발현은 프로모터에 의해 제어되며, 상기 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 상기 아데노바이러스 프로모터는 E1A 프로모터와 상이하다.

제2 요지의 구체예로서, E1A 단백질의 발현을 제어하는 프로모터는 YB-1 제어되거나 또는 YB-1에 의해 조절될 수 있다.

제2 요지의 바람직한 구체예로서, E1A 단백질의 발현을 제어하는 프로모터는 아데노바이러스 E2 후기 프로모터이다.

제1 및 제2 요지의 구체예로서, E4 단백질, 바람직하게는 E4orf6 단백질 및 E1B 단백질, 바람직하게는 E1B55kd 단백질은 동일하거나 공통되는 프로모터의 제어하에 있다.

제3 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 아데노바이러스에 의해 해결되며, 상기 아데노바이러스는 1 이상의 아데노바이러스 단백질을 통하여 핵에서 YB-1을 제공하거나 또는 핵에서 YB-1의 제공은 1 이상의 아데노바이러스 단백질을 통하여 매개되며, 바람직하게는 상기 아데노바이러스 단백질은 E1A와 상이하다.

제3 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 본 발명의 제1 요지 및/또는 제2 요지에 따른 아데노바이러스이다.

제4 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 아데노바이러스에 의해 해결되며, 상기 아데노바이러스는 1 이상의 아데노바이러스 단백질을 통한 아데노바이러스 복제를 위한 YB-1을 제공하거나 1 이상의 아데노바이러스 단백질을 통한 아데노바이러스 복제를 위한 YB-1의 제공을 매개하며, 바람직하게는 상기 아데노바이러스 단백질은 E1A와 상이하다.

제4 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 본 발명의 제1 요지 및/또는 제2 요지 및/또는 제3 요지에 따른 아데노바이러스이다.

제3 및 제4 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스 단백질은 E4orf6 및 E1B55kd의 복합체이다.

제5 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 아데노바이러스에 의해 해결되며, 상기 아데노바이러스의 핵산은 1 이상의 기능적으로 불활성 아데노바이러스 영역을 포함하며, 상기 영역은 E1 영역, E3 영역, E4 영역 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제5 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 본 발명의 제1 요지 및/또는 제2 요지 및/또는 제3 요지 및/또는 제4 요지에 따른 아데노바이러스이다.

제5 요지의 구체예로서, 상기 영역은 E1 영역이다.

제5 요지의 구체예로서, 상기 영역은 E3 영역이다.

제5 요지의 구체예로서, 상기 영역은 E4 영역이다.

제5 요지의 구체예로서, 상기 영역은 E1 영역, E3 영역 및 E4 영역을 포함한다.

제6 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 아데노바이러스에 의해 해결되며, 상기 아데노바이러스는 1 이상의 발현 카세트를 포함하며, 상기 발현 카세트는 1 이상의 프로모터 및 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 아데노바이러스 단백질은 E1B 단백질, 바람직하게는 E1B55kD 단백질이다.

제6 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 본 발명의 제1 요지 및/또는 제2 요지 및/또는 제3 요지 및/또는 제4 요지 및/또는 제5 요지에 따른 아데노바이러스이다.

제6 요지의 구체예로서, 상기 프로모터는 E1B 프로모터와 상이하다.

제6 요지의 구체예로서, 상기 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 상기 프로모터는 E1B 프로모터와 상이하다.

제7 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 아데노바이러스에 의해 해결되며, 상기 아데노바이러스는 1 이상의 발현 카세트를 포함하며, 상기 발현 카세트는 1 이상의 프로모터 및 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 아데노바이러스 단백질은 E4 단백질, 바람직하게는 E4orf6 단백질이다.
제7 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 본 발명의 제1 요지 및/또는 제2 요지 및/또는 제3 요지 및/또는 제4 요지 및/또는 제5 요지 및/또는 제6 요지에 따른 아데노바이러스이다.

제7 요지의 구체예로서, 상기 프로모터는 E4 프로모터와 상이하다.

제7 요지의 구체예로서, 상기 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 상기 아데노바이러스 프로모터는 E4 프로모터와 상이하다.

제7 요지의 구체예로서, 상기 프로모터는 E1A 프로모터와 이다.

제8 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 아데노바이러스에 의해 해결되며, 상기 아데노바이러스는 1 이상의 발현 카세트를 포함하며, 상기 발현 카세트는 1 이상의 프로모터 및 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 아데노바이러스 단백질은 E1A 단백질, 바람직하게는 E1A12S 단백질이다.

제8 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 본 발명의 제1 요지 및/또는 제2 요지 및/또는 제3 요지 및/또는 제4 요지 및/또는 제5 요지 및/또는 제6 요지 및/또는 제7 요지에 따른 아데노바이러스이다.

제8 요지의 구체예로서, 상기 프로모터는 E1A 프로모터와 상이하다.

제8 요지의 구체예로서, 상기 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된다.

제1 요지 및/또는 제2 요지 및/또는 제3 요지 및/또는 제4 요지 및/또는 제5 요지 및/또는 제6 요지 및/또는 제7 요지 및/또는 제8 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 YB-1을 암호화하는 핵산을 포함한다.

제8 요지의 바람직한 구체예로서, YB-1을 암호화하는 핵산은 바람직하게는 E2 후기 프로모터의 제어하에 있다.

제8 요지의 구체예로서, YB-1을 암호화하는 핵산은 프로모터의 제어하에 있으며, 상기 프로모터는 YB-1 의존적 및 YB-1 제어되는 프로모터이다.

제8 요지의 구체예로서, YB-1을 암호화하는 핵산은 E1A 단백질을 암호화하는 핵산, 바람직하게는 E1A12S 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 카세트의 일부이다.

제8 요지의 구체예로서, E1A 단백질을 암호화하는 핵산은 IRES 서열을 통하여 YB-1을 암호화하는 핵산과 분리된다.

제6 및/또는 제7 및/또는 제8 요지의 구체예로서, E4 단백질, 바람직하게는 E4orf6 단백질을 암호화하는 핵산 및 E1B 단백질, 바람직하게는 E1B55kD 단백질을 암호화하는 핵산이 발현 카세트에 함유되며, 바람직하게는 상기 2개의 코딩 서열은 IRES 서열에 통하여 분리된다.

제8 요지의 바람직한 구체예로서, 발현 카세트의 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 상기 아데노바이러스 프로모터는 E4 프로모터와 상이하고 또 E1B 프로모터와 상이하며, 바람직하게는 야생형 E4 프로모터와 상이하고 또 야생형 E1B 프로모터와 상이하다.

제1 및/또는 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 및/또는 제6 및/또는 제7 및/또는 제8 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 프로모터 및 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 상기 핵산 서열은 아프타머, 리보자임, 아프타자임, 안티센스 분자 및 siRNA를 포함하는 군으로부터 선택된다.

제1 및/또는 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 및/또는 제6 및/또는 제7 및/또는 제8 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 프로모터 및 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 상기 핵산 서열은 코딩 핵산이며, 상기 핵산은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 안티칼린, 항체 및 항체 단편을 포함하는 군으로부터 선택되는 분자를 암호화한다.

제1 및/또는 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 및/또는 제6 및/또는 제7 및/또는 제8 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 발현 카세트를 포함하고, 상기 발현 카세트는 프로모터 및 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은 세포자살 유도 유전자, 프로드럭 유전자, 프로테아제 억제제, 종양 서프레서 유전자, 사이토카인 및 신생혈관형성 억제제를 포함하는 군으로부터 선택된다.

제1 및/또는 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 및/또는 제6 및/또는 제7 및/또는 제8 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 재조합 아데노바이러스이다.

제1 및/또는 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 및/또는 제6 및/또는 제7 및/또는 제8 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 아데노바이러스 돌연변이체이다.

제1 및/또는 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 및/또는 제6 및/또는 제7 및/또는 제8 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 복제 결핍이다.

제1 및/또는 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 및/또는 제6 및/또는 제7 및/또는 제8 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 탈조절된 YB-1을 포함하거나 핵내에 YB-1을 갖는 세포에서 복제할 수 있다.

제1 및/또는 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 및/또는 제6 및/또는 제7 및/또는 제8 요지의 구체예로서, 상기 세포는 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 함유한다.

제1 및/또는 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 및/또는 제5 및/또는 제6 및/또는 제7 및/또는 제8 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 E1A13S 단백질을 포함하지 않고 및/또는 상기 아데노바이러스는 E1A13S 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하지 않는다.

제9 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 제1 내지 제8 요지중 어느 하나에 따른 아데노바이러스를 암호화하는 핵산에 의해 해결된다.

제10 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 제9 요지에 따른 핵산 및 헬퍼 바이러스의 핵산을 포함하는 복제 계에 의해 해결되며, 상기 헬퍼 바이러스의 핵산은 제1 내지 제8 요지에 따른 1 이상의 아데노바이러스의 발현 카세트를 포함한다.

제10 요지의 구체예로서, 상기 아데노바이러스 또는 이러한 아데노바이러스를 암호화하는 핵산은 헬퍼 바이러스에 의해 포함되는 발현 카세트를 갖고 있지 않다.

제11 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 제9 요지에 따른 핵산 및/또는 제10 요지에 따른 복제 계를 포함하는 벡터에 의해 해결된다.

제11 요지의 구체예로서, 상기 벡터는 발현 벡터이다.

제12 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 제1 내지 제8 요지에 따른 아데노바이러스 및/또는 제9 요지에 따른 핵산 및/또는 제10 요지에 따른 복제 계 및/또는 제11 요지에 따른 벡터를 포함하는 아데노바이러스 세포에 의해 해결된다.

제12 요지의 구체예로서, 상기 세포는 진핵세포, 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 포유류 세포이다.

제12 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 포유류 세포는 마우스, 래트, 기니아 피그, 돼지, 양, 염소, 소, 말, 개, 고양이 및 인간의 세포를 포함하는 군으로부터 선택된다.

제13 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 제1 내지 제8 요지에 따른 아데노바이러스, 제9 요지에 따른 핵산, 제10 요지에 따른 복제 계, 제11 요지에 따른 벡터 또는 제12 요지에 따른 세포를 포함하는 생물, 바람직하게는 포유류 생물에 의해 해결되며, 상기 생물은 마우스, 래트, 기니아 피그, 돼지, 양, 염소, 소, 말, 개 및 고양이를 포함하는 군으로부터 선택된다.

제14 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 제1 내지 제8 요지에 따른 아데노바이러스, 제9 요지에 따른 핵산, 제10 요지에 따른 복제계, 제 11 요지에 따른 벡터 또는 제12 요지에 따른 세포의 아데노바이러스의 복제, 바람직하게는 아데노바이러스의 시험관내 복제를 위한 용도에 의해 해결된다.

제15 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 제1 내지 제8 요지에 따른 아데노바이러스, 제9 요지에 따른 핵산, 제10 요지에 따른 복제계, 제 11 요지에 따른 벡터 또는 제12 요지에 따른 세포의 아데노바이러스의 제조를 위한, 바람직하게는 아데노바이러스의 시험관내 제조를 위한 용도에 의해 해결된다.

제16 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 제1 내지 제8 요지에 따른 아데노바이러스, 제9 요지에 따른 핵산, 제10 요지에 따른 복제계, 제 11 요지에 따른 벡터 또는 제12 요지에 따른 세포의 유전자의 발현, 바람직하게는 세포 용해, 바람직하게는 아데노바이러스 복제중의 세포 용해를 촉진시키고 및/또는 아데노바이스 매개된 세포 용해를 촉진시키는 유전자의 발현을 위한 용도에 의해 해결된다.

제16 요지의 구체예로서, 상기 발현된 유전자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 전이유전자이다.

제17 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 제1 내지 제8 요지에 따른 아데노바이러스, 제9 요지에 따른 핵산, 제10 요지에 따른 복제계, 제 11 요지에 따른 벡터 또는 제12 요지에 따른 세포의 의약제조를 위한 용도에 의해 해결된다.

제14 내지 제17 요지의 구체예로서, 아데노바이러스가 복제되는 세포는 핵내에 YB-1을 갖고, 바람직하게는 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는다.

제14 내지 제17 요지의 구체예로서, 아데노바이러스가 복제되는 세포는 탈조절된 YB-1을 포함한다.

제17 요지의 구체예로서, 상기 의약은 종양 질환을 치료하기 위한 것이다.

제17 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 종양 질환은 악성 질환, 암, 암 질환 및 종양을 포함하는 군으로부터 선택된다.

제17 요지의 구체예로서, 상기 종양은 고형, 비-고형, 악성 및 양성 종양을 포함하는 군으로부터 선택된다.

제17 요지의 구체예로서, 종양 형성 세포의 적어도 일부는 핵내에 YB-1을 갖고, 바람직하게는 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는다.

제17 요지의 구체예로서, 종양을 형성하는 세포의 일부는 탈조절된 YB-1을 포함한다.

제17 요지의 구체예로서, 종양 형성 세포의 적어도 일부는 Rb 양성 또는 Rb 음성이다.

제17 요지의 구체예로서, 종양 형성세포의 적어도 일부는 내성, 바람직하게는 약학적 활성제에 대한 다약제 내성을 갖는다.

제17 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 내성은 다중 내성이다.

제17 요지의 구체예로서, 상기 내성은 항-종양제, 바람직하게는 세포증식억제제에 대한 내성이고 및/또는 상기 내성은 조사(irradiation)에 의해 유발된다.

제17 요지의 구체예로서, 의약이 목적으로 하는 환자는 복수의 세포를 포함하며, 상기 세포는 본 발명의 제17 요지에 따른 용도의 다양한 구체예에 기재된 바와 같은 세포이다.

제17 요지의 구체예로서, 상기 의약은 1 이상의 추가의 약제학적 활성제를 포함한다.

제17 요지의 구체예로서, 상기 의약은 약제학적 활성제와 함께 투여되거나 그를 위하여 의도된다.

제17 요지의 구체예로서, 추가의 약제학적 활성제는 사이토카인, 메탈로프로테이나제 억제제, 신생혈관생성 억제제, 세포증식 억제제, 티로신 키나제 억제제 및 세포 주기 억제제를 포함한느 군으로부터 선택된다.

제17 요지의 구체예로서, 상기 의약은 조사 이전, 도중 또는 이후에 투여된다.

제17 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 조사는 종양을 치료하기 위해 투여된다.

제17 요지의 구체예로서, 상기 치료할 세포 또는 생물은 조사, 세포증식억제제의 투여 및 온열요법을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법에 처리된다.

제17 요지의 구체예로서, 상기 방법은 국소적으로 또는 전신적으로 투여된다.

제17 요지의 구체예로서, 조사는 고에너지 방사선을 이용하며, 바람직하게는 종양 질환 치료에 사용되는 임의 조사를 이용한다.

제18 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 제1 내지 제8 요지에 따른 아데노바이러스, 제9 요지에 따른 핵산, 제10 요지에 따른 복제계, 제 11 요지에 따른 벡터 또는 제12 요지에 따른 세포의 종양 질환 치료를 위한 의약제조 용도에 의해 해결되며, 상기 종양 질환은 유방암, 골종양, 위암, 장암, 담낭암, 췌장암, 간암, 신장암, 뇌암, 난소암, 피부암, 피부 부속기 종양, 두경부암, 자궁암, 활막 종양, 후두암, 식도암, 설암, 전립선암을 포함하는 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 전술한 내용에 기재된 바와 같은 특징을 갖는 종양 질환 중의 하나이다.

제19요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 제1 내지 제8 요지에 따른 아데노바이러스, 제9 요지에 따른 핵산, 제10 요지에 따른 복제계, 제 11 요지에 따른 벡터 또는 제12 요지에 따른 세포의 종양 질환의 치료를 위한 의약제조 용도에 의해 해결되며, 상기 종양 특이적 프로모터는 의약이 사용되는 종양에 대해 특이적인 프로모터이다.

제20 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 제1 내지 제8 요지에 따른 아데노바이러스, 제9 요지에 따른 핵산, 제10 요지에 따른 복제계, 제 11 요지에 따른 벡터 또는 제12 요지에 따른 세포 및 경우에 따라 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 의해 해결된다.
제21 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 의약제조를 위한 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스의 용도에 의해 해결되며, 상기 바이러스는 핵내에서 YB-1을 함유하지 않는 정상세포, 세포주기와 독립적으로 핵내에서 YB-1을 함유하지 않는 세포 및 탈조절된 YB-1을 함유하지 않는 세포에서 복제 결핍이며, 상기 바이러스는 종양 유전자 또는 종양 유전자 산물, 특히 YB-1 핵 양성 세포에서 1 이상의 바이러스 유전자, 바람직하게는 아데노바이러스 유전자를 트랜스액티베이트하는 종양유전자 단백질을 암호화하며, 상기 유전자는 E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP를 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 바이러스는 본원에서 E1B55kDa 및 E4orf6로도 불리는 바이러스 단백질 E1B55kDa를 발현한다.
제22 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 YB-1을 함유하는 세포에서 복제를 위한 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스의 용도에 의해 해결되며, 상기 바이러스는 핵내에서 YB-1을 함유하지 않는 세포 또는 세포주기와 독립적으로 핵내에서 YB-1을 함유하지 않는 세포 또는 임의의 탈조절된 YB-1을 함유하지 않는 세포에서 복제 결핍이며, 상기 바이러스는 종양 유전자 또는 종양 유전자 산물, 특히 1 이상의 바이러스 유전자, 바람직하게는 아데노바이러스 유전자를 트랜스액티베이트하는 종양유전자 단백질을 암호화하며, 상기 유전자는 E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 구체예로서, 상기 바이러스, 특히 아데노바이러스는 핵내에서 YB-1을 함유하는 세포 또는 세포주기와 독립적으로 핵내에서 YB-1을 함유하지 않는 세포 또는 임의의 탈조절된 YB-1을 함유하지 않는 세포에서 복제된다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 다른 구체예로서, 상기 바이러스 종양 유전자 단백질은 E1A이며 및/또는 상기 종양 유전자는 E1A을 암호화하는 유전자 및/또는 상기 종양 유전자 단백질은 E1A이다.
바람직한 구체예로서, 상기 바이러스 종양 유전자 단백질 E1A은 기능적 Rb 종양 억제제 유전자 산물에 결합할 수 있다.
다른 구체예로서, 상기 바이러스 종양 유전자 단백질 E1A은 기능적 Rb 종양 억제제 유전자 산물에 결합할 수 없다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 다른 구체예로서, 상기 바이러스 종양 유전자 단백질 E1A은 YB-1의 핵 편재를 유도하지 않는다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 다른 구체예로서, 상기 의약은 Rb 양성 또는 Rb 음성인 환자의 세포용이다.
바람직한 구체예로서, 상기 세포는 의약에 의해 영향을 받는 상태를 형성하는데 관여하는 세포들이다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 다른 구체예로서, 상기 세포는 핵내에서 Rb-음성 및 YB-1-양성, 특히 세포주기와는 독립적으로 핵내에서 YB-1-양성이다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 또 다른 구체예로서, 상기 의약은 종양 치료용이다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 또 다른 구체예로서, 상기 세포, 특히 종양 또는 그 일부를 형성하는 세포는 내성, 특히 의약 바람직하게는 항-종양제 및 더 바람직하게는 세포증식억제제에 대해 다중 내성이다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 바람직한 구체예로서, 상기 세포는 발현, 바람직하게는 막-결합 운반 단백질 P-당단백질 및/또는 MRP를 과잉-발현한다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 다른 구체예로서, 상기 세포는 p53-양성 또는 p53-음성이다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 구체예로서, 상기 종양 유전자 단백질은 야생형 종양 유전자 단백질 E1A와 비교할 때, 하나 또는 수개의 돌연변이 또는 결실을 포함하며, 상기 결실은 바람직하게는 CR3 영역의 결실 및 N-말단의 결실 및 C-말단의 결실을 포함하는 그룹으로부터 선택된 결실이다. E1A 종양 유전자 단백질은 Rb에 결합할 수 있음은 고려되어야 한다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 다른 구체예로서, 상기 종양 유전자 단백질은 야생형 종양 유전자 단백질과 비교할 때, 하나 또는 수개의 돌연변이 또는 결실을 포함하며, 상기 결실은 바람직하게는 CR1 영역 및/또는 CR2 영역에서 결실이다. E1A 종양 유전자 단백질은 Rb에 결합할 수 없음은 고려되어야 한다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 구체예로서, 상기 바이러스 종양 유전자 단백질, 특히 E1A는 조직-특이적 및/또는 종양 특이적 프로모터의 제어하에 있다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 다른 구체예로서, 상기 바이러스, 특히 아데노바이러스는 YB-1을 암호화한다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 또 다른 구체예로서, YB-1은 조직-특이적 및/또는 종양 특이적 프로모터의 제어하에 있다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 바람직한 구체예로서, 상기 바이러스, 특히 아데노바이러스는 E4orf6, E4orf3, E1B55k 및 아데노바이러스E3ADP 단백질을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 단백질을 암호화한다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 다른 구체예로서, 상기 세포는 핵내에서 YB-1을 함유, 특히 종양 또는 그 일부를 형성하는 상기 세포는 핵내에서 YB-1을 함유한다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 다른 구체예로서, 상기 종양은 핵내로 YB-1의 운반을 유도한 후 핵내에서 YB-1을 함유한다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 바람직한 구체예로서, 핵내로 YB-1의 운반은 1 이상의 방법에 의해 유발되며, 상기 방법은 조사, 세포증식억제제의 투여 및 온열요법을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 특히 바람직한 구체예로서, 상기 방법은 세포, 기관 또는 생물에 적용된다.
본 발명의 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도의 바람직한 구체예로서, 상기 바이러스, 특히 아데노바이러스는 기능적 Rb 종양 억제제 유전자 산물에 결합할 수 있는 발현된 바이러스 E1A 종양 유전자가 없는 Ad△24, dl922-947, E1Ad/01/07, dl1119/1131, CB 016, dl520 및 바이러스를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제23 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 의약 제조를 위한 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스의 용도에 의해 해결되며, 상기 바이러스, 특히 아데노바이러스는 상기 복제가 E2-후기 프로모터의 YB-1 매개 활성화를 통해 또는 의해 제어되도록, 바람직하게는 E2-후기 프로모터의 활성화에 의해 압도적으로 제어되도록 적응(adapted)된다.
제24 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 핵내에서 YB-1을 함유하는 세포에서 복제를 위한 바이러스, 특히 아데노바이러스의 용도에 의해 해결되며, 상기 바이러스, 특히 아데노바이러스는 상기 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 통해 YB-1에 의해 제어되도록, 바람직하게는 E2-후기 프로모터의 활성화에 의해 압도적으로 제어되도록 적응된다. 구체예로서, 상기 YB-1은 트랜스제닉 YB-1 또는 세포 YB-1, 특히 세포 탈조절된 또는 탈조절된 YB-1이다. 트랜스제닉 YB-1은 바람직하게는 벡터, 특히 아데노바이러스에 의해 세포에서 발현되는 YB-1이다. 상기 E2-후기 프로모터는, 바람직하게는 야생형 아데노바이러스로 존재하는 아데노바이러스 E2-후기 프로모터이거나 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 전이유전자의 발현과 관련하여 사용되는 E2-후기 프로모터이다.
본 발명의 제23 요지 및 제24 요지에 따른 용도의 바람직한 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 본 명세서에 기재된 바와 같은 특히, 본 발명에 따라 사용될 수 있도록 적응된다.
제25 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 바이러스 종양 유전자 단백질, 특히 분리된 바이러스 종양 유전자 단백질에 의해 해결되며, 상기 바이러스 종양 유전자 단백질은 하기의 특징을 갖는다:
a) E1B55k, E3ADP 및 E4orf6 및 E4orf4를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 YB-1 핵 양성 세포내에서 1 이상의 바이러스 유전자를 트랜스액티베이팅시키며; 및
b) 세포핵내에서, 특히 상기 바이러스 종양 유전자 단백질이 존재하는 세포핵내에서 YB-1의 유도가 없음.
구체예로서, 상기 바이러스 종양 유전자 단백질은 E1A이다.
다른 구체예로서, 상기 바이러스 종양 유전자 단백질은 야생형 종양 유전자 단백질과 비교할 때, 하나 또는 수개의 돌연변이 또는 결실을 포함하며, 상기 결실은 바람직하게는 CR3 영역의 결실, N-말단의 결실 및 C-말단의 결실을 포함하는 그룹으로부터 선택된 결실이다.
구체예로서, 상기 바이러스 종양 유전자 단백질을 통한 YB-1의 유도는 E4orf6 및/또는 E1B55kDa가 상기 핵을 포함하는 세포내에 존재하지 않는다는 조건하에서 발생하지 않는다.
상기 바이러스 종양 유전자 단백질이 Rb에 결합할 수 있다는 것은 고려되어야 한다.
다른 구체예로서, 상기 바이러스 종양 유전자 단백질은 하나 또는 수개의 돌연변이 또는 결실을 포함하며, 상기 결실은 바람직하게는 E1A 종양 유전자 단백질의 CR1 영역 및/또는 CR2 영역에서 결실이다. 상기 바이러스 종양 유전자 단백질이 Rb에 결합할 수 없다는 것은 고려되어야 한다.
제26 요지로서, 본 발명은 바이러스 복제계, 특히 본 발명에 따라 사용된 바이러스, 특히 아데노바이러스를 암호화하는 핵산 및 헬퍼 바이러스의 핵산을 포함하는 아데노바이러스 복제계의 용도와 관련되어 있으며, 상기 헬퍼 바이러스의 핵산은 YB-1을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
구체예로서, 상기 바이러스 핵산, 특히 아데노바이러스 핵산 및/또는 헬퍼 바이러스의 핵산은 복제가능한 벡터로서 존재한다.
제27 요지로서, 본 발명은 의약 제조를 위한 특히, 종양 치료용 의약 제조를 위한 바이러스, 특히 아데노바이러스를 암호화하는 핵산의 용도와 관련되어 있다.
바람직한 구체예로서, 상기 세포 특히, 종양 또는 그 일부를 형성하는 세포는 내성, 특히 약물, 항-종양제 및 세포증식억제제에 대해 다중 내성을 나타낸다.
제28 요지로서, 본 발명은 핵내에서 YB-1을 함유하는 세포에서 복제를 위한 바이러스, 특히 아데노바이러스를 암호화하는 핵산의 용도에 관한 것이며, 상기 바이러스는 핵내에서 YB-1을 함유하지 않는 세포 또는 세포주기와 독립적으로 핵내에서 YB-1을 함유하지 않는 세포 또는 임의의 탈조절된 YB-1을 함유하지 않는 세포에서 복제결핍이며, 상기 바이러스는 YB-1 핵 양성 세포내에서 1 이상의 바이러스 유전자, 바람직하게는 아데노바이러스 유전자를 트랜스액티베이트하는 종양 유전자 또는 종양 유전자 단백질을 암호화하며, 상기 유전자는 E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제29 요지로서, 본 발명의 기본이 되는 문제는 의약 제조를 위한 바이러스, 특히 아데노바이러스를 암호화하는 핵산의 용도에 의해 해결되며, 상기 바이러스는 상기 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 통해 YB-1에 의해 제어되도록, 바람직하게는 E2-후기 프로모터의 활성화에 의해 압도적으로 제어되도록 적응된다. 구체예로서, 상기 YB-1은 트랜스제닉 YB-1 또는 세포 YB-1, 특히 세포 탈조절된 또는 탈조절된 YB-1이다. 트랜스제닉 YB-1은 바람직하게는 벡터, 특히 아데노바이러스에 의해 세포에서 발현되는 YB-1이다. 상기 E2-후기 프로모터는, 바람직하게는 야생형 아데노바이러스에 함유된 아데노바이러스 E2-후기 프로모터이거나 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 전이유전자의 발현과 관련하여 사용되는 E2-후기 프로모터이다.
제30 요지로서, 본 발명은 세포에서 복제를 위한 바이러스, 특히 아데노바이러스를 암호화하는 핵산의 용도에 의해 해결되며, 상기 바이러스는 상기 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 통해 YB-1에 의해 제어되도록, 바람직하게는 E2-후기 프로모터의 활성화에 의해 압도적으로 제어되도록 적응된다. 구체예로서, 상기 YB-1은 트랜스제닉 YB-1 또는 세포 YB-1, 특히 세포 탈조절된 또는 탈조절된 YB-1이다. 트랜스제닉 YB-1은 바람직하게는 벡터, 특히 아데노바이러스에 의해 세포에서 발현되는 YB-1이다. 상기 E2-후기 프로모터는, 바람직하게는 야생형 아데노바이러스에 존재하는 아데노바이러스 E2-후기 프로모터이거나 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 전이유전자의 발현과 관련하여 사용되는 E2-후기 프로모터이다.
제31 요지로서, 본 발명은 제21 요지 또는 제22 요지에 따른 용도에 있어서 상술한 핵산중의 하나를 포함하는 벡터의 용도에 의해 해결된다.
제32 요지로서, 본 발명은 세포가 바이러스, 특히 아데노바이러스에 의해 접촉 및/또는 처리되는지 여부를 결정하기 위해 세포의 특징, 종양 조직의 세포 특징 또는 환자의 특징에 있어서 YB-1과 상호작용하는 물질의 용도와 관련되어 있다.
구체예로서, 상기 물질은 항생제, 안티칼린, 아프타머, 아프타짐 및 스피에겔머를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제33 요지로서, 본 발명은 제21 요지 및 제22 요지에 따른 용도와 관련하여 사용된 바와 같은 바이러스, 특히 아데노바이러스를 제조하기 위한 바이러스 종양 유전자 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산의 용도에 의해 해결된다.
구체예로서, 상기 바이러스는 전이유전자를 암호화하는 핵산을 포함한다.
다른 구체예로서, 상기 바이러스는 전이유전자의 번역 산물 및/또는 전사 산물을 포함한다.
바람직한 구체예로서, 아데노바이러스 복제계의 핵산 및/또는 헬퍼 바이러스의 핵산은 전이유전자 또는 전이유전자를 암호화하는 핵산을 포함한다.
또 다른 구체예로서, 상기 핵산은 전이유전자 또는 전이유전자를 암호화하는 핵산을 포함한다.
다른 구체예로서, 상기 전이유전자는 프러드럭, 사이토카인, 세포자살-유도 유전자, 종양 서프레서 유전자, 금속단백질 가수분해효소 억제제에 대한 유전자 및 신생혈관형성 억제제 및 티로신 키나아제 억제제에 대한 유전자를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
구체예로서, 상기 전이유전자는 siRNA에 대한 핵산, 아프타머에 대한 핵산, 안티센스 분자에 대한 핵산 및 리보자임에 대한 핵산을 포함하는 그룹으로부터 선택되며, 상기 아프타머, 안티센스 분자 및/또는 리보자임은 표적분자에 대해 유도된다.
다른 구체예로서, 상기 표적분자는 내성 관련 인자, 항-세포자살 인자, 종양유전자, 신생혈관형성 인자, DNA 합성효소, DNA 수복효소, 성장인자 및 이들의 수용체, 전사인자, 금속단백질 가수분해효소 특히 매트릭스 금속단백질 가수분해효소 및 유로키나아제 유형의 플라스미노젠 활성제를 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 구체예로서, 상기 내성 관련 인자는 바람직하게는 P-당단백질, MRP 및 GST를 포함하는 그룹으로부터 선택되며 이를 암호화하는 핵산을 또한 포함한다. 구체예로서, 상기 항-세포자살 인자는 BCL2를 포함하는 그룹으로부터 선택되며 이를 암호화하는 핵산을 또한 포함한다. 구체예로서, 상기 종양유전자는 Ras, 특히 돌연변이된 Ras, Rb 및 MYC를 포함하는 그룹으로부터 선택되며 이를 암호화하는 핵산을 또한 포함한다. 구체예로서, 상기 신생혈관형성 인자는 VEGF 및 HMG 단백질을 포함하는 그룹으로부터 선택되며 이를 암호화하는 핵산을 또한 포함한다. 구체예로서, 상기 DNA 합성효소는 텔로머라아제를 포함하는 그룹으로부터 선택되며 이를 암호화하는 핵산을 또한 포함한다. 구체예로서, 상기 DNA 수복효소는 Ku-80을 포함하는 그룹으로부터 선택되며 이를 암호화하는 핵산을 또한 포함한다. 구체예로서, 상기 성장인자는 PDGF, EGF 및 M-CSF를 포함하는 그룹으로부터 선택되며 이를 암호화하는 핵산을 또한 포함한다. 다른 구체예로서, 상기 수용체는 바람직하게는 성장인자에 대한 수용체이며, 상기 성장인자는 PDGF, EGF 및 M-CSF를 포함하는 그룹으로부터 선택되며 이를 암호화하는 핵산을 또한 포함한다. 구체예로서, 상기 전사인자는 YB-1을 포함하는 그룹으로부터 선택되며 이를 암호화하는 핵산을 또한 포함한다. 구체예로서, 상기 금속단백질가수분해효소는 특히 매트릭스 금속단백질가수분해효소이다. 바람직한 구체예로서, 상기 금속단백질가수분해효소는 MMP-1 및 MMP-2를 포함하는 그룹으로부터 선택되며 이를 암호화하는 핵산을 또한 포함한다. 구체예로서, 상기 유로키나아제 유형의 플라스미노젠 활성제는 uPa-R을 포함하는 그룹으로부터 선택되며 이를 암호화하는 핵산을 또한 포함한다.
또 다른 구체예로서, 상기 의약은 1 이상의 약제학적으로 활성인 화합물을 더 포함한다.
본 발명의 임의의 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 약제학적으로 활성인 화합물은 사이토카인, 금속단백질가수분해효소 억제제, 신생혈관형성 억제제, 세포증식억제제 및 세포주기 억제제 및 티로신 키나아제 억제제를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 상기 기재된 아데노바이러스, 특히 본 발명의 제1 내지 제8 요지에 기재된 바와 같은 아데노바이러스를 이후 그룹 I 아데노바이러스라 칭하며, 또 E1A 와 같은 트랜스액티베이팅(transactivating) 종양유전자 단백질을 갖는 아데노바이러스 및/또는 본 발명에 따라 사용되는 것으로 본 명세서에 기재된 아데노바이러스를 그룹 II 아데노바이러스라 칭한다. 그룹 I 아데노바이러스 및 그룹 II 아데노바이러스는 모두 합쳐서 이후 본 발명에 따른 아데노바이러스 또는 바이러스라 칭한다.

본 발명은 아데노바이러스 유전자의 발현 서열의 역전이 효과적인 복제와 경우에 따라 아데노바이러스에 의해 감염된 세포의 용해를 초래한다는 놀라운 발견을 기초로 하고 있다. 아데노바이러스 유전자의 연대순으로 변경된 발현에 관하여, 본 명세서에서 개별적으로 또는 집합적으로 제2 단백질 이전에 발현되는 제1 단백질로 불리는 E1B 단백질 및 E4 단백질이 특히 중요하다. 제2 단백질은 E1A 단백질을 포함하는 군으로부터 선택된다. 먼저 E1A 단백질이, 이어 E1B 단백질과 E4 단백질이 발현되는 야생형 아데노바이러스와 비교하여 역전된 이러한 발현 서열은 전사인자가 활성화, 예컨대 감염된 세포의 핵으로 이동시키게하며 추가의 복제 활성에 영향을 주거나 그를 제어한다. 야생형 아데노바이러스에서 아데노바이러스 전사물의 동력학은 예컨대 Glenn G. M 및 Ricciardi R. P. Virus Research 1988, 9, 73-91에 기재되어 있으며, 야생형에서 E1A 전사물, 즉 E1A12S 전사물 및 E1A13S 전사물은 전사물 및 번역산물, 각각 E4orf6 및 E1B55k 이전에 통상 검출될 수 있다고 보고하고 있다. 본 발명의 경우, E1B 단백질은 일반적으로 상이하게 표시되지 않는한 바람직하게는 E1B-55kD 단백질이다. 본 발명의 경우, E4 단백질은 일반적으로 상이하게 표시하지 않는 한 바람직하게는 E4orf6 단백질이다. 본 발명의 경우, E1A 단백질은 일반적으로 상이하게 표시하지 않는 한 바람직하게는 E1A12S 단백질이거나 E1A-변성 아데노바이러스와 관련하여 상기 기재된 바와 같은 E1A 단백질이다.

본 발명의 범위에서 E1A 단백질, 특히 E1A12S 단백질은 원칙적으로 치환될 수 있다. 이러한 치환된 E1A 단백질 및 E1A12S 단백질은 여기서 E1A 단백질 및 E1A12S 단백질로 칭하거나, 또는 다르게 나타내지 않는 한 상기 용어에 포함되는 것으로 한다. E1A12S 단백질 대신 E1A 단백질이 Dickopp A, Esche H, Swart G, Seeber S, Kirch HC, Opalka B. Cancer Gene Ther. 2000, Jul; 7(7): 1043-50에 의 기재된 바와 같이 종양 서프레서 기능을 갖는 것으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되고 및/또는 언급된 E1A 단백질, 특히 E1A12S 단백질의 다른 유도체는 일반적으로 Rb/E2F 복합체로 부터 인자 E2F를 방출할 수 있는 단백질이다. 이들 중에서 Chellappan S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 4549-4533에 의해 기재된 바와 같은 시미안 바이러스(Simian virus) 40 종양 항원(SV40 대형 T 항원), 파필로마바이러스(papillomavirus) E7 단백질(HPV E7)이 있다.

본 발명의 범위내에서 E4orf6 및 E1B55k의 유도체가 사용될 수 있으며, 사용되는 용어 E4orf6 및 E1B55k는 그러한 유도체를 포함한다. 이들 유도체는 예컨대 Shen Y et al., J. of Virology 2001, 75, 4297-4307; Querido E. et al., J. of Virology 2001, 75, 699-709에 기재되어 있다.

본 발명의 범위내에서, E1B 단백질은 E1A 단백질 이전에 발현되거나, 또는 E4 단백질은 E1A 단백질 이전에 발현되거나, 또는 양쪽 E1B 단백질 및 E4 단백질은 상기 각기 기재한 바와 같이 E1A 단백질 이전에 발현된다.

그러한 방식으로 디자인된 아데노바이러스는 핵내에서 YB-1을 발현하는 세포, 바람직하게는 세포 주기와는 독립적으로 핵내에서 YB-1을 발현하는 세포 또는 바람직하게는 세포질에 탈조절된 YB-1을 포함하는 세포의 감염시 특히 고비율로 복제할 수 있다. 이하에 한정되는 것은 아니나, 본 발명자들은 E1B 단백질 및/또는 E4 단백질로 구성된 복합체 및 상기 2개 단백질의 개별적인 하나는 각각 탈조절된 YB-1을 세포 핵으로 이동시킬 수 있거나 또는 E1A 단백질 이전에 발현되는 E1B 단백질 및/또는 E4 단백질의 영향하에서 아데노바이러스 복제를 개시할 수 있는 것으로 생각한다. 활성화된 형태로 세포 핵에 존재하면, YB-1은 본 명세서에 기재된 바와 같이 특히 E2 후기 프로모터를 사용하여 효과적으로 복제된다. E1B 단백질 및/또는 E4 단백질의 연대기적으로 초기 발현은 E1A 단백질의 초기 발현과 함께 생기는 야생형에서 캐스케이드를 피한다. 바람직한 구체예로서, E1A 단백질은 더 이상 트랜스액티베이팅시키지 않거나 또는 아주 제한된 정도로만 E1B 단백질 및/또는 E4 단백질을 트랜스액티베이팅시킬 수 있는 E1A 단백질이다. 바람직하게는, 상기 트랜스액티베이팅은 효과적인 복제를 보증하기에 충분하지 않고 핵내에 YB-1을 갖지 않는 세포에서 복제를 보증하기에 충분하지도 않다. 상기 트랜스액티베이팅은 세포주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖지 않는 세포 또는 탈조절된 YB-1을 갖지 않는 세포에서는 생기지 않는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 아데노바이러스가 E1B 단백질, E4 단백질 및 E1A 단백질을 포함하는 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 1 이상의 핵산을 포함하고 상기 1 이상의 단백질이 야생형 아데노바이러스에서 각 단백질의 발현을 제어하는 프로모터와는 상이한 프로모터의 제어하에 있으면 특히 효과적인 방식으로 복제될 수 있다는 놀라운 발견을 기초로 하고 있다. 이러한 복제는 특히 세포가 핵내에 YB-1을 갖고, 특히 세포주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는 경우, 또는 세포가 탈조절된 YB-1을 포함, 특히 세포질내에 탈조절된 YB-1을 포함하는 경우에 특히 효과적이며 흔히 종양 붕괴를 초래한다. E1B 단백질, E4 단백질 및 E1A 단백질에 대하여 상기 언급한 내용은 여기서도 동일하게 적용된다. 야생형 아데노바이러스에서, E1B 단백질은 E1B 프로모터에 의해 제어되며, E4 단백질은 E4 프로모터에 의해 제어되며 또 E1A 단백질은 E1A 프로모터에 의해 제어된다. 야생형 아데노바이러스에서 상술한 단백질의 발현을 제어하는 프로모터와는 상이한 프로모터를 선택함으로써, 상술한 단백질의 발현 및 그에 따른 개별 아데노바이러스 핵산 및 단백질의 조절성 상호작용이 변경된다. 프로모터를 선택함으로써 연대기적으로 상이한 발현 패턴이 창제될 수 있으며, 이하에 한정되는 것은 아니나, 세포에서 관찰된 복제를 초래하며, 그 메카니즘은 아데노바이러스 단백질 E1B, E4 및 E1A의 연대기적으로 상이한 발현에 대하여 앞서 기재한 바와 같은 메카니즘일 수 있다. 야생형 아데노바이러스에서 각 단백질의 발현을 제어하는 프로모터와는 상이한 프로모터를 통하여 상기 단백질을 제어하기 위한 특별한 디자인의 예는 특허청구범위 및 실시예 부분으로 부터 취할 수 있으며, 특히 XVirPSJL1 및 XVirPSJL2로 지칭되는 바이러스가 대표적이다. 바람직하게는, E1B 단백질은 E1B55kD 단백질이며, E4 단백질은 E4orf6 단백질이고 또 E1A 단백질은 E1A12S 단백질이다.

E1B 단백질 뿐만 아니라 E4 단백질을 바람직하게 제어하는 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 단 아데노바이러스 프로모터가 사용될 때 이들은 E1B 단백질의 발현 제어의 경우에는 E1B 프로모터와 상이하고, 또 E4 단백질의 발현 제어의 경우에는 E4 프로모터와 상이하다. E1B 단백질 및/또는 E4 단백질의 발현 제어를 위한 E1A 프로모터의 사용이 특히 바람직하다. E1A 프로모터는 예컨대 Boulanger P. A. 및 Blair, G.E. Biochem. J. 1991, 275, 281-299에 의해 기재된 바와 같다. 부가적으로, 각각의 이질 프로모터 및 기타 이질 프로모터, 즉 야생형 아데노바이러스에서 각 단백질의 발현을 제어하는 프로모터와는 상이한 프로모터를 사용할 수 있다. 대표적인 예는 CMV 프로모터이며, 기타 프로모터는 당업자에게 잘 알려져 있다.

E1A 단백질의 제어에 사용되는 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으며, 단 아데노바이러스 프로모터는 E1A 프로모터와 상이하다. 본 발명의 범위내에서 상술한 단백질의 1개 또는 몇개, 즉 E1B 단백질, E4 단백질 또는 E1A 단백질은 동일한 프로모터의 제어하에 있으며, 특히 E1B 단백질 및 E4 단백질은 동일한 프로모터의 제어하에 있는 것이 바람직하다. E1A 단백질의 발현이 YB-1-제어되는 프로모터 또는 YB-1에 의해 조절될 수 있는 프로모터에 의해 제어되는 것이 특히 바람직하다. 이러한 프로모터는 본 발명의 다른 요지와 관련하여 개시되어 있다. 아데노바이러스 E2-후기 프로모터의 사용은 이것이 첫째 YB-1에 의해 조절될 수 있고 또 둘째 YB-1의 부재하에서 실질적으로 무시될 수 있을 정도의 아주 적은 전사만을 나타내어 E2-후기 프로모터의 제어하에 있는 핵산의 아주 양호한 발현제어를 가능하게 하는 점에서 E1A 프로모터의 발현제어에 특히 바람직하다. 이것은 특히 의약분야에서 이용될 때 생물학적 안전성을 현저히 증가시킨다.

또한 본 발명자들은 YB-1이 복제를 위해 세포 핵내에 직접적으로 또는 간접적으로 제공되거나 또는 YB-1의 제공이 아데노바이러스 단백질을 통하여 직접적으로 또는 간접적으로 매개되어서 이러한 아데노바이러스 단백질이 E1A과 상이한 경우, 아데노바이러스가 핵내에 YB-1을 갖는 세포, 특히 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는 세포 및/또는 탈조절된 YB-1을 갖는 세포, 바람직하게는 세포질내에 탈조절된 YB-1을 갖는 세포에서 특히 잘 복제될 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 본 발명의 요지는 트랜스액티베이팅된 E1A-변성 아데노바이러스, 바람직하게는 그룹 II 아데노바이러스를 사용하는 요지와는 상이하며, E1A 단백질, 특히 E1A13S 단백질의 트랜스액티베이팅 특징이 여기서 이용되지 않는 한, 즉 그룹 I 아데노바이러스와 관련되지만 바람직한 구체예로서 E1A13S 단백질이 기능적으로 불활성이어서 YB-1의 이동 및 제공에 직접적으로 또는 간접적으로 이동 및 제공하는데 관여되는 E4orf6 및 E1B55k를 트랜스액티베이팅시킬 수 없으면, YB-1 핵-양성 종양 세포, 특히 세포 주기와 독립적으로 YB-1 양성인 YB-1 핵-양성 세포, 및 탈조절된 YB-1을 갖는 세포, 특히 세포질에서 YB-1을 포함하는 세포에서 상기 바이러스의 복제를 허용한다. 따라서, 아데노바이러스의 효과적인 복제는 본 발명의 상기 요지에 따라서는 가능하지 않다. 핵내의 YB-1의 제공 및 아데노바이러스 복제에 대한 YB-1의 제공은 E1A 단백질의 직접적 또는 간접적 관여의 제어하에 더 이상 있지 않지만 E1B 단백질, 특히 E1B55kD 단백질 및/또는 E4 단백질, 특히 E1A에 의해 제어되지 않는 E4orf6 단백질의 발현을 통하여 생긴다.

이러한 아데노바이러스의 실시예는 상술한 방법중의 하나, 예컨대 E1A 단백질의 발현과 비교한 E1B 단백질 및/또는 E4 단백질의 연대기적 발현에 의해, 또는 야생형 아데노바이러스에서 각 단백질의 발현을 제어하는 프로모터와는 상이한 프로모터의 제어하에 1 또는 몇개의 E1B 단백질, E4 단백질 및 E1A 단백질을 두는 것에 의해 제공될 수 있다.

마지막으로, 본 발명은 핵내에 YB-1을 갖는 세포, 보다 특히 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는 세포, 또는 바람직하게는 세포질내에 탈조절된 YB-1을 갖는 세포에서 효과적인 아데노바이러스 복제가 생길 수 있고, E1B 단백질, E4 단백질 및 E1A 단백질중의 1 이상, 특히 그의 바람직한 형태가 프로모터의 제어하에서 발현 카세트로 발현된다는 놀라운 발견으로 부터 시작된다. 본 발명의 제1 구체예로서, 상기 단백질 각각을 포함하는 기본적으로 3개의 발현 카세트가 제공된다. 다른 구체예로서, 발현 카세트는 특히 E1A12S의 경우에, 단백질 E1B, E4 및 E1A의 2 이상 및 이들의 유도체와 가능한 치환체를 포함할 수 있다. 아데노바이러스가 단백질 E1B, E4 및 E1A와 관련된 핵산을 포함하는 요지와 관련하여 앞서 말한 것은 다양한 단백질의 디자인 및 각각 사용된 프로모터에도 마찬가지로 적용된다. 이러한 발현 카세트를 사용할 때, 발현 카세트의 각 단백질에 상응하는 야생형 아데노바이러스의 게놈에서 단백질 및 그를 암호화하는 핵산은 바이러스가 안정하고 재조합을 상당한 정도로 피할 수 있도록 완전히 결실되거나 또는 부분적으로 결실되는 것이 바람직하다.

원칙적으로, 상기 발현 카세트는 아데노바이러스의 각 영역 및 각 부위에 각각 클로닝될 수 있으며, 그에 의해 바람직하게는 카세트의 1 또는 몇개가 개별적으로 또는 서로 조합되어 바이러스의 E1 영역, E3 영역 및/또는 E4 영역에 삽입된다. E1, E3 및 E4 영역의 핵산은 완전히 결실되거나, 부분적으로 결실되거나 또는 전혀 결실되지 않을 수 있으며, 그에 의해 본 발명에 따른 아데노바이러스와 관련하여 E1A13S 유전자를 암호화하는 핵산은 불활성화되거나 결실되어서 바이러스에 의한 트랜스액티베이팅 E1A 단백질을 제공할 수 없는 것이 바람직하다. 영역 E1, E3 및 E4의 1 또는 몇개에서 이러한 결실의 정도는 사용된 발현 카세트 및 경우에 따라 도입된 외래 유전자 또는 전이유전자 또는 이들을 포함하는 다른 발현 카세트, 즉 아데노바이러스 유전자와 상이한 유전자, 즉 야생형 아데노바이러스에서 우세한 아데노바이러스 핵산의 조절 배경에서 제공되지 않거나 또는 그러한 부위에서 야생형 아데노바이러스의 아데노바이러스 핵산의 서열에서 제공되지 않는 의미에서 적어도 상이한 유전자에 의해 결정된다. 본 발명의 범위내에서, E1B 단백질, E4 단백질 및/또는 E1A 단백질을 암호화하는 발현 카세트의 1개 또는 몇개에 함유되는 핵산은 아데노바이러스 게놈에서 부분적으로 또는 완전히 결실된다. 구체예로서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 XvirPSJL1 또는 2에서와 같이, E4orf6을 암호화하는 아데노바이러스 핵산은 부분적으로 결실되지만, 그를 암호화하는 완전한 핵산은 발현 카세트에 함유되어 있다. 바람직하게는, 이러한 것은 E1B55k(E1 55Kd로도 칭함) 단백질 및/또는 E1A12S 단백질에 대해서도 실현될 수 있다. 바람직한 구체예에서 결실의 정도는 야생형 아데노바이러스의 최대 팩케이지 크기의 약 103%의 최대 팩케이지 크기에 도달하지만 이러한 제한은 바람직한 제한일 뿐이다. 아데노바이러스 게놈에서 행해질 가능한 결실은 감염성이고 팩케이징된 입자가 제조될 수 있도록하는 바람직한 구체예에서 바람직한 제한이다. 정확한 결실 정도는 표준 시험과 함께 본 명세서에 제공된 기초로 부터 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본 명세서에 기재된 아데노바이러스의 작성을 위한 출발 지점으로서, 야생형 아데노바이러스가 사용될 수 있지만, 본 발명의 기술적 특징에 따라 작성될 수 있다면 기타 아데노바이러스도 사용될 수 있다. 서브그룹 C의 아데노바이러스 및 그중에서도 아데노바이러스 2 및 아데노바이러스 5가 특히 바람직하다.

특별히 다르게 지시하지 않는 한 용어 E1B 단백질 및 E1B 단백질, E4 단백질 및 E4 단백질 뿐만 아니라 E1A 단백질 및 E1 단백질은 동의적으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "탈조절된" YB-1은 세포내, 바람직하게는 비-종양 세포에서 정상적으로 존재하는 YB-1과는 양적으로 및/또는 질적으로 상이한 형태로 존재하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 YB-1 분자 또는 YB-1 단백질을 의미한다. 탈조절된 YB-1은 탈조절된 YB-1의 존재하의 이러한 탈조절된 YB-1을 포함하는 세포 배경에서 복제할 수 있는 특정 바이러스에 의해 특징화되고 확인될 수 있다. 그와 관련한 특정 바이러스는 그의 E1A 단백질이 돌연변이되고 트랜스액티베이팅 작용을 나타내는 바이러스이다. 이들 특정 바이러스의 예는 AD 델타 24, dl 922-947, E1 Ad/01/07 및 CB 016 및/또는 Howe, J. A. et al., Molecular Therapy 2, 485-495, 2000; Fueyo J. et al., Oncogene 19, 2-12, 2000; Heise C. et al., Nature Medicine 6, 1134-1139, 2001; Balague, C. et al., J. Virol. 75, 7602-7611, 2001; Bautista, D. S. et al., Virology 1991, 182, 578-596; Jelsma T. N. et al., Virology 1988, 163, 494-502; Wong, H. K 및 Ziff E. B., J. of Virology 1994, 68, 4910-4920에 의해 기재된 바이러스이다. 이러한 세포 및 그러한 배경을 갖는 세포는 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스의 복제에 사용될 수 있다. 부가적으로, 이러한 세포를 포함하는 종양은 본 발명에 따른 아데노바이러스에 의해 용해될 수 있다.

또한 본 발명은 YB-1 핵-양성 종양 세포에서 E1A-변성 아데노바이러스의 DNA 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 기본으로 한다는 놀라운 발견을 기초로 하고 있다. E1A-변성 아데노바이러스는 (a) YB-1 핵-음성 세포에서 야생형에 비교하여 복제가 감소되거나 전혀 복제되지 않고, (b) 1 이상의 바이러스 유전자상에서 트랜스액티베이팅 활성을 가지며, 상기 유전자는 E1B-55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP를 포함하는 군으로부터 특히 선택되며, 및/또는 (c) 아데노바이러스에 의해 세포성 YB-1을 핵으로 전위시키지 않는 아데노바이러스로 이해된다. 경우에 따라, 본 발명에 사용되는 아데노바이러스는 아데노바이러스에 의해 암호화된 E1A 단백질의 결합이 E2F 내지 RB의 결합을 방해하고 또 E2F 및 Rb로 구성된 각 복합체를 용해시킬 수 있는 추가의 특징을 갖는다. 상술한 특징 a) 내지 c)중의 1개 또는 몇 개를 갖거나, 바람직하게는 상술한 특징 a) 내지 c) 모두를 갖는 아데노바이러스는 핵내에 YB-1을 갖지 않는 세포에서 복제 결핍이다.

구체예로서, 본 명세서에서 강하게 감소된 복제는 야생형과 비교하여 인자 2, 바람직하게는 인자 5, 보다 바람직하게는 인자 10, 가장 바람직하게는 인자 100 정도 감소된 복제를 의미한다. 바람직한 구체예로서, 복제의 대조는 동일하거나 유사한 세포주, 동일하거나 유사한 감염을 위한 바이러스 역가(감염의 중복성, MOI 또는 플라크 형성 유닛, pfu) 및/또는 동일하거나 상이한 일반적 실험 조건을 이용하여 실시된다. 복제는 특히 입자의 형성을 의미한다. 다른 구체예로서, 복제 측량은 바이러스 핵산 합성의 정도일 수 있다. 바이러스 핵산 합성의 정도를 측정하는 방법 및 입자 형성을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

상기 발견, 방법, 용도 또는 핵산, 단백질, 복제 계 등은 아데노바이러스에 한정되지 않는다. 기본적으로, 이러한 계는 본 명세서에 포함되는 다른 바이러스에도 존재한다.

본 발명에 따른 바이러스의 사용 또는 본 발명에 따라 본 명세서에 기재된 바이러스의 사용은 종래 기술에 따른 10 내지 100 pfu/세포와 비교하여 1 내지 10 pfu/세포의 감염비율을 이용할 때 야생형에 필적하는 복제를 유발할 수 있다.

세포성 YB-1은 세포에 의해 암호화되고 발현되는 임의의 YB-1을 의미하며, 상기 YB-1은 아데노바이러스, 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 아데노바이러스 및/또는 헬퍼 바이러스에 의해 특히 각 세포의 감염 이전에 세포에 존재한다. 그러나, 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스와의 감염과 같은 외인성 수단이 적용될 때에만 세포성 YB-1이 세포에 도입되거나 또는 세포에 의해 생성되는 YB-1인 것도 본 발명의 범위에 든다.

다음에 제한하고자 하는 것은 아니나, 본 발명자들은 E2-초기 프로모터, 즉 초기 E2 프로모터가 본 발명에 사용된 바이러스의 복제와 관련하여 또 본 발명의 아데노바이러스의 본 발명에 따른 용도와 관련하여 인간의 세포성 E2F 전사 인자에 의해 스위치-온 되지 않는다고 가정한다. 이러한 상황하에서 복제의 개시는 세포의 Rb 상태와 독립적이며, 즉 본 명세서에 기재된 바이러스를 사용하여 감염된 다음 바람직하게는 용해되는 종양 세포는 기능적 뿐만아니라 불활성 Rb 단백질을 함유할 수 있다. 또한 본 명세서에 기재된 아데노바이러스를 사용하거나 또는 본 명세서에 기재된 조건을 이용한 아데노바이러스 복제는 임의의 기능적 p53 단백질을 필요로 하지 않지만, 그의 존재에 의해 음성적으로 영향을 받지도 않는다. 완전 작용적 Rb 단백질이 생체내 복제에서 효과적으로 방해하므로 Rb-음성적 및 Rb-돌연변이된 세포에서 생체내 아데노바이러스 복제를 제공한다는 가정하에서, 상기 기술적 가르침은 E1A 단백질에 1개 및/또는 몇개의 돌연변이가 실시된 AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB016 또는 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 바와 같은 아데노바이러스 유형의 종양파괴성 또는 종양용해성 아데노바이러스의 사용을 기본으로 하는 원리로부터 벗어난다. 종래 기술의 아데노바이러스 계는 초기 E2 프로모터(E2 초기 프로모터) 및 "자유 E2F"에 의하여 아데노바이러스의 생체내 복제를 제어하기 위하여 E1A를 기본으로 한다. 그럼에도 불구하고, 이들 공지된 종래 기술의 바이러스는 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 함유하는 세포에서, 또는 탈조절된 YB-1을 포함하는 세포에서 복제를 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

바이러스, 러스 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스는 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 보다 자세하게는, 상기 특허에 기재된 바이러스는 복제 결핍이고 작용성 Rb 종양 서프레서 유전자 산물을 결합할 수 있는 발현된 바이러스 종양단백질이 결핍된 바이러스이다. 아데노바이러스는 특히 작용성 종양 서프레서 유전자 산물, 보다 자세하게는 Rbㄹ르 결합시킬 수 있는 발현된 바이러스성 E1A 종양단백질이 결핍된 아데노바이러스일 수 있다. 바이러스성 E1A 종양단백질은 아데노바이러스 Ad5(이후 Ad5, Ad 5로도 지칭됨)중의 아미노산 위치 30 내지 85에서 예컨대 CR1 도메인, p105 Rb 단백질, p130 및 p107 단백질의 결합에 관여하는 뉴클레오티드 위치 920 내지 967에서 불활성화 돌연변이를 나타낼 수 있다. 그러나, 아데노바이러스가 2 dl 312 유형 또는 5 NT dl 1010 유형의 아데노바이러스인 것도 본 발명의 범위에 속한다.

의약 제조, 특히 종양 질환 및 본 명세서에 기재된 다른 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 아데노바이러스의 사용과 관련하여 또 본 발명에 따른 아데노바이러스의 사용 뿐만 아니라 핵내에 YB-1을 갖는 세포, 바람직하게는 세포주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는 세포 또는 바람직하게는 세포질에서 탈조절된 YB-1을 포함하는 세포에서 복제시키기 위한 본 발명에 따른 아데노바이러스의 사용과 고나련하여, 복제는 최종적으로 바람직하게는 세포주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는, 즉 YB-1 핵-양성인 세포에서, 또는 탈조절된 YB-1을 포함하는 세포에서 생긴다. 그러한 아데노바이러스는 핵내에 YB-1을 갖지 않지만, 세포질내에 YB-1을 함유하는 세포 또는 탈조절된 YB-1을 함유하지 않는 세포에서는 복제되지 않거나 현저히 감소된 수준으로만 복제할 수 있음은 인정되어야한다. 이들 바이러스의 성공적인 복제를 위해서는 YB-1은 바람직하게는 세포주기와 독립적으로 핵내에 존재하거나, 또는 탈조절된 YB-1이 존재하는 것이 필요하다. 이하에 자세히 설명한 바와 같이, 이것은 예컨대 세포에 바람직하게는 세포 주기와 독립적으로 YB-1, 또는 핵내의 탈조절된 YB-1의 발현 또는 존재를 초래하거나 또는 탈조절된 YB-1의 발현을 초래하는 조건을 적용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 각자의 방법은 본 발명에 따라 사용되거나 또는 본 발명에 따라 처리되는 아데노바이러스에 의한 YB-1의 암호화 및 발현일 수 있으며, 이 밖에 아데노바이러스 유전자는 또한 YB-1을 암호화하고 또 그의 발현을 특히 암호화하는 유전자 정보를 갖고 있다. 세포의 핵에서 YB-1의 전달, 도입 또는 발현을 초래하는 다른 방법은 세포 및 그러한 세포를 포함하는 생물에 세포증식억제제, 조사, 온열요법 등과 같은 스트레스를 적용하는 것이다. 바람직한 구체예로서, 조사는 종양 질환 치료에 사용되는 임의 방사선이다.

본 발명에 따라 특히 종양 분해를 위해 사용되는 아데노바이러스 뿐만 아니라 본 발명에 따른 아데노바이러스는 바람직한 구체예로서 세포주기와 무관하게 YB-1을 갖지 않으며 따라서 YB-1 핵-음성 또는 탈조절된 YB-1을 포함하지 않는 세포에서 복제되지 않는 사실을 특징으로 한다.

본 발명의 아데노바이러스와 상이한 본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스의 일부의 다른 특징은 암유전자 단백질로도 불리는 바이러스 암유전자를 암호화하며, 상기 암유전자 단백질은 바람직하게는 E1A 이고 또 상기 암유전자 단백질은 바이러스의 복제 및/또는 상기 바이러스에 의해 감염된 세포의 세포 용해에 영향을 갖는 1 이상의 바이러스 유전자를 활성화시킬 수 있다. 바람직하게는, 복제에 대한 영향은 각 바이러스의 암유전자 단백질이 부재할 경우의 시나리오와 비교하여 암유전자 단백질의 존재에서 바이러스가 더 잘 복제되게 한다. 이러한 방법은 본 명세서에서 트랜스액티베이팅이라 칭하며, 특히 그러한 상호작용화가 E1A에 의해 매개되는 경우 E1A 트랜스액티베이팅이라 칭한다. 용어 "트랜스액티베이팅한다" 또는 "트랜스액티베이팅"은 바람직하게는 각 바이러스 암단백질이 바이러스 암유전자 단백질 그 자체를 암호화하는 유전자와는 상이한 1 또는 몇개의 다른 유전자의 발현 및/또는 전사에 영향을 갖는, 즉 이들의 발현 및/또는 번역을 제어하고 특히 이들을 활성화시키는 과정을 기재한다. 이러한 바이러스 유전자는 바람직하게는 E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP 뿐만 아니라 상술한 유전자 및 유전자 산물의 조합물이다.

본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스 뿐만 아니라 본 발명의 아데노바이러스의 추가의 임의 특징은 이들의 결합 특징, 특히 이들에 의해 암호화되는 단백질중의 하나의 종양 서프레서 Rb에 대한 결합 특징이다. 기본적으로, 본 발명에 따라 사용되는 아데노바이러스는 Rb에 결합되거나 결합되지 않을 수 있다는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 아데노바이러스의 2개의 대안적 구체예의 사용은 처리될 세포의 Rb 상태 또는 처리될 세포와 무관하다.

Rb에 결합되지 않는 능력을 E1A에 부여하기 위하여, E1A 암단백질에 대하여 다음과 같은 결실을 실시할 수 있다: CR1 영역(Ad5중의 아미노산 위치 30-85)에서 결실 및 CR2 영역(Ad5중의 아미노산 위치 120-139)의 결실. 이렇게함으로써, CR3 영역은 보존되며 기타 초기 바이러스 유전자상에 트랜스액티베이팅 작용을 발휘할 수 있다.

Rb에 결합되는 능력을 E1A에 부여하기 위하여, E1A 암단백질에 대하여 이하와 같은 결실이 기본적으로 가능하다: CR3 영역(아미노산 위치 140-185)의 결실; N-말단(아미노산 위치 1-29)의 결실; 아미노산 위치 85-119의 결실; 및 C-말단(아미노산 위치 186-289)의 결실. 상기 수록된 영역은 E2F가 Rb에 결합되는 것을 방해하지 않는다. 트랜스액티베이팅 작용은 그대로 유지되지만, 야생형 Ad5에 비하여 감소된다.

구체예로서 Rb에 결합할 수 있고 또 상이한 구체예로서 Rb에 결합될 수 없도록 E1A 단백질, 특히 E1A12S 단백질이 고안되며, 이러한 E1A12S 단백질이 E1A 단백질, 특히 종래 기술에서 때때로 변성 E1A12S로도 불리는 본 발명의 의미에서 E1A12S 단백질인 것이 본 발명의 아데노바이러스와 관련하여 본 발명의 범위에 속한다. E1A12S 단백질의 각 디자인은 특히 E1A로 지칭되는 E1A 단백질의 상술한 결실에 관한 당해 분야의 기술의 범위에 속한다.

종래기술에서 기본적으로 이미 공지되어 있고 또 어떠한 트랜스액티베이팅을 나타내지 않는 아데노바이러스는 일반적으로 복제 결핍으로 간주된다. 그러나, 본 발명자들은 이들이 그럼에도 불구하고 적합한 배경, 특히 세포 배경에서 복제될 수 있는 것을 확인한 것은 본 발명의 이점이다. 이러한 적합한 세포 배경은 핵내에 YB-1의 존재, 핵내에 세포 주기 독립적으로 YB-1의 존재 또는 탈조절된 YB-1의 존재에 의해 유발되거나 제공된다. 용어 세포 또는 세포 계는 본 발명의 각각의 요지 및 기타 다른 요지와 관련하여 본 명세서에 사용되며, 세포 추출물의 단편 또는 분획 뿐만 아니라 시험관내, 생체내 또는 그자리에 존재하는 세포를 포함한다. 지금까지, 용어 세포 계 또는 세포는 세포 배양액, 조직 배양액, 기관 배양액 또는 생체내 및 그자리에서 조직, 기관 또는 생물의 그룹 또는 일부로 분리된 임의의 조직 또는 기관에 존재하지만, 바람직하게는 살아있는 생물에 그대로 존재하는 것일 수 도 있는 세포를 포함한다. 상기 생물은 바람직하게는 척추생물이며, 보다 바람직하게는 포유류이다. 보다 바람직하게는 상기 생물은 인간일 수 있다. 기타 바람직한 생물은 본 발명의 다양한 요지와 관련하여 개시된 바와 같다.

부가적으로, 본 명세서에 개시된 기술적 가르침을 기본으로 하여, 본 명세서에 기재된 아데노바이러스의 복제 특징을 나타내며 YB-1 핵-양성, 바람직하게는 세포 주기와 독립적으로 YB-1 핵-양성, 또는 탈조절된 YB-1을 포함하는 세포에서 종래기술의 복제 특성을 나타내는 신규 바이러스가 생성되는 것도 본 발명의 범위에 속한다. 즉, 이미 공지된 아데노바이러스로 부터 특이적으로 출발하여, 본 발명에 따른 용도와 관련된 상기 정의된 특징을 나타내는 다른 바이러스가 작성될 수 있다.

본 발명과 관련하여, 본 발명에 따라 사용될 다양한 아데노바이러스의 변성된 E1A 암단백질은 본 발명의 바이러스와는 대조적으로, YB-1 핵-양성 세포 또는 탈조절된 YB-1을 포함하는 세포에서 E1B55K, E4orf3, E4orf6, E3ADP와 같은 초기 바이러스 유전자를 트랜스액티베이팅시킬 수 있다. 바이러스 게놈에 대해서는 다른 변동이 존재하지 않으며 각 아데노바이러스는 야생형 아데노바이러스 또는 그의 유도체에 상응할 수 있다.

본 발명의 의미에서 트랜스액티베이팅 암유전자 단백질을 암호화하거나 포함하는 본 명세서에 기재된 바이러스는 야생형의 아데노바이러스, 특히 야생형 Ad5와 필적하는 E1B, E2, E3 및/또는 E4와 같은 초기 유전자를 트랜스액티베이팅시킬 수 있는 예컨대 아데노바이러스 AdΔ24, dl922-947, E1AAd/01/07, CB106 및/또는 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스를 포함한다. 이들 경우에서, E1A 단백질의 분명한 영역이 트랜스액티베이팅에 관여한다. 다양한 아데노바이러스 혈청형중에서, E1A 단백질에는 3개의 고도로 보존되는 영역이 존재한다. 아미노산 위치 41-80의 영역 CR1, 아미노산 위치 120-139의 CR2 및 아미노산 위치 140-188의 CR3. 트랜스액티베이팅 작용은 E1A 단백질내에서 CR3 영역의 존재를 주로 기본으로 한다. CR3의 아미노산 서열은 상술한 아데노바이러스에서 변경되지 않은 방식으로 존재한다. 이것은 YB-1이 핵내에 존재하는지 또는 세포질에 존재하는지에 관계없이 초기 유전자 E1B, E2, E3 및 E4의 트랜스액티베이팅을 초래한다.

이와 대조적으로, CR3 영역은 재조합 아데노바이러스 dl520에서 결실되었다. 따라서, dl520은 CR3 영역의 아미노산 서열을 포함하지 않는 소위 E1A12S 단백질을 발현한다. 따라서, dl520은 특히 E2 영역에 대하여 아주 약한 트랜스액티베이팅 작용만을 나타내며, YB-1 핵-음성 세포에서 복제되지 않는다. YB-1 핵-양성 세포에서, YB-1은 E2 영역의 트랜스액티베이팅에 관여하므로 dl520의 효과적인 복제를 허용한다. dl520과 같은 계 또는 본 명세서에 기재된 목적을 위해 그로 부터 기인한 계의 사용을 기본으로 한다. 예컨대 델타 24 (이후 AdΔ24로도 지칭) 및 dl520과 같은 앞서 기재한 2개 그룹의 아데노바이러스 사이의 중요한 차이는 초기 유전자 E1B, E3 및 E4가 YB-1 핵-음성 세포 또는 탈조절된 YB-1을 포함하지 않는 세포와 비교하여, 세포 주기와 독립적인 YB-1 핵-양성 세포에서 또는 탈조절된 YB-1을 함유하는 세포에서 더욱 광범위하게 트랜스액티베이팅될 수 있다는 사실에 존재한다. 이와 대조적으로, 델타 24에서는 차이가 없거나 오직 미소한 차이만 존재한다. 그러나 dl520, 보다 자세하게는 E1A12S 단백질의 트랜스액티베이팅은 야생형 아데노바이러스에 비하여 현저하게 감소된다. 그러나 이 트랜스액티베이팅은 실시에 10에 나타낸 바와 같이 YB-1 핵-양성 세포에서 효과적인 복제를 제공할 만큼 충분한 것이다. 특히 바람직하게 dl520 또는 AdΔ24, dl922 내지 947, E1Ad/01/07, CB106 및/또는 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스와 관련하여 기재된 바와 같은 E1A 단백질의 디자인을 비롯하여, E1A 단백질이 야생형 암유전자 단백질 E1A와 비교하여 1 또는 몇개의 결실 및/또는 돌연변이를 갖도록하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 E1A 단백질 및 특히 그와 관련하여 그를 암호화하는 핵산의 디자인이 바이러스, 특히 아데노바이러스의 구체예이며, 그의 복제는 제어되며, 바람직하게는 E2-후기 프로모터의 활성화에 의해 주로 제어된다. 바람직하게는, 상기 결실은 CR3 영역의 결실 및 N-말단의 결실 및 C-말단의 결실을 포함하는 군으로부터 선택된다. 상기 유형의 아데노바이러스 복제를 허용하는 E1A 단백질의 구체예는 본 명세서에 기재된 바를 기초로 하여 당업자에 의해 생성될 수 있다. 앞서 기재된 바와 같은 E1A 단백질의 구체예는 본 발명의 아데노바이러스 또는 그룹 I 아데노바이러스로 지칭되는 본 발명의 아데노바이러스와 관련하여 이용될 수 있는 구체예이다.

유도체로도 지칭되며 또 본 발명에 따라 사용될 수 있는 본 발명의 아데노바이러스, 특히 그룹 I 아데노바이러스는 전형적으로 E1 결실, E1/E3 결실 및/또는 E4 결실을 포함하며, 즉 상응하는 아데노바이러스는 기능적 활성 E1 및/또는 E3 및/또는 E4 발현 산물 및 상응하는 산물을 생성할 수 있다. 즉, 이들 아데노바이러스는 기능적 불활성 E1, E3 및/또는 E4 발현 산물만을 생성할 수 있으며, 기능적 불활성 E1, E3 및/또는 E4 발현산물은 전사 수준 및/또는 번역 수준에서는 전혀 발현 산물로 존재하지 않거나 또는 야생형 아데노바이러스에 기인한 작용중의 하나를 적어도 갖지 않는 형태로 존재하는 발현 산물이다. 야생형 아데노바이러스에서 발현산물에 고유한 이러한 기능은 당업자에게 공지되어 있으며, 예컨대 Russell, W. C., Journal of Virology, 81, 2573-2604, 2000에 기재되어 있다. 러셀(상기 참조)은 아데노바이러스와 아데노바이러스 벡터의 디자인 원리를 개시하고 있으며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 변성된 E1A 암단백질, 즉 더 이상 트랜스액티베이팅하지 않는 E1A 단백질 및 E1A12S, E1B-55K, E4orf6 및/또는 E3ADP(아데노바이러스 치사 단백질(ADP))(Tollefson, A. et al., J. Virology, 70, 2296-2306, 1996)과 같은 기타 단백질은 단독으로 또는 조합되어 그러한 벡터에서 발현된다. 상술한 개별 유전자 뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 전이유전자는 서로 독립적이며 E1 및/또는 E3 및/또는 E4 영역에 클로닝되며 또 적합한 프로모터를 사용하여 또는 적합한 프로모터의 제어하에서 발현된다. 기본적으로, E1, E3 및 E4 영역 각각은 아데노바이러스 핵산내의 클로닝 부위로서 적합하다. 일부 구체예로서, 적합한 프로모터는 E1A의 제어 및 발현과 관련하여, 바람직하게는 변성 E1A의 제어와 발현과 관련하여 상기 기재된 바와 같은 프로모터이다.

마지막으로, 구체예로서, 본 발명에 따라 사용된 그룹 II 아데노바이러스는 E1B 결핍, 특히 E1B 19 kDa 결핍이다. 여기서 사용된 용어 결핍은 E1B가 야생형 E1B의 모든 특징을 나타내지 않고 이들 특징중의 1 이상이 부족한 상태를 지칭한다.

본 명세서에 기재된 발명에 따라 사용되는 그룹 II 아데노바이러스의 적어도 일부 구체예는 당분야에 공지된 것이다. 본 발명에 따라 사용된 아데노바이러스는 바람직하게는 재조합 아데노바이러스이며, 특히 야생형과 비교하면, 본 명세서에 기재된 기술적 가르침의 의미에서 변화가 있었다. 본 발명과 상관없이 아데노바이러스 핵산 서열을 결실시키거나 돌연변이시키는 것은 당해 분야의 기술에 속하는 것이다. 이러한 결실은 예컨대 본 명세서에 기재된 바와 같은 E3 및 E4 코딩 핵산의 일부와 관련될 수 있다. 이러한 결실이 단백질 E4orf6에 연장되지 않는, 즉 본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스가 E4orf6을 암호화하는 한 E4의 결실이 특히 바람직하다. 바람직한 구체예로서, 이들 아데노바이러스 핵산은 바이러스 캡시드에 팩케이징될 수 있으므로 감염성 입자를 형성한다. 이것은 본 발명에 따른 핵산을 사용한 경우에도 사실이다. 일반적으로, 아데노바이러스 계는 단일 또는 몇개의 발현 산물에 관하여 결핍일 수 있다는 것이 알려져 있다. 이와 관련하여, 이는 그룹 I 아데노바이러스 및 그룹 II 아데노바이러스 모두에 관하여, 발현 산물을 암호화하는 핵산의 돌연변이 또는 결실에 의해 유발될 수 있거나, 이러한 각각의 돌연변이 및 결실은 완전한 것이거나 또는 어떠한 발현 산물도 더 이상 형성되지 않을 정도로 실시될 수 있거나, 또는 조절요소 및 발현을 제어하는 요소에 의해 유발될 수 있어 프로모터 및 전사인자는 핵산 수준(프로모터의 결핍; cis 작용 요소) 또는 번역 및 전사 계 수준(상호작용 요소)에서 야생형과는 상이한 방식으로 없어지거나 또는 활성일 수 있다. 특히 후술한 요지는 세포 배경에 좌우될 수 있다.

이미 공지된 아데노바이러스를 사용하는 것과는 달리, 본 발명에 따르면 그룹 II 아데노바이러스와 같은 신규한 아데노바이러스가 본 명세서에 기재된 기타 아데노바이러스에 대해 이미 기재된 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 신규 아데노바이러스는 본 명세서에 개시된 기술적 요지로 부터 기인한 것이다. 특히 바람직한 대표예는 예컨대 도 16 및 도 17에 도시된 바이러스 Xvir03 및 Xvir03/01이며, 그 원리는 실시예 11 및 12에 자세하게 예시되어 있다.

벡터 Xvir03의 경우, IRES 서열에 의해 분리된 E1B 55k 및 E4orf6에 대한 핵산을 제어하는 E1 영역에 CMV 프로모터를 클로닝하였다. 이들 2개 유전자를 바이러스에 클로닝하는 것에 의해 또 그로부터 생성한 유전자 산물로 인하여, 복제 효율 결과는 실제적으로 야생형 바이러스중의 하나에 상응하며, 세포내에서, 바람직하게는 종양 세포에서 선택적 복제는, YB-1 핵-양성 세포에서, 보다 특히 본 명세서에 기재된 의미에서 탈조절된 YB-1을 포함하는 세포에서 복제가 일어나는 한 유지된다. 탈조절된 YB-1이 존재하는 세포는, 구체예로서, 정상 세포 또는 비-종양 세포와 비교하여 YB-1의 발현증가, 바람직하게는 부분 독립적 YB-1 발현을 나타내는 세포이다.

바이러스 Xvir03의 추가의 발달은 바람직한 구체예로서 치료 유전자 또는 전이유전자가 특정 프로모터, 특히 종양 특이적 또는 조직 특이적 프로모터의 제어하에서 클로닝되는 바이러스 Xvir03/01이다. 이러한 바이러스와 관련하여, E4 영역은 기능적으로 불활성이며 바람직하게는 결실된다. 여기서 기재된 전이유전자는 E4 영역에 클로닝될 수 있으며, 이것은 전이유전자를 E3 영역에 클로닝하는 것의 대안으로 또는 부가적으로 실시될 수 있다.

여기서 기재되고 특히 이하에 기재된 전이유전자는 본 발명의 아데노바이러스와 관련하거나 또는 아데노바이러스에 의해, 즉 그룹 I 아데노바이러스 및 이들의 핵산에 의하거나 또는 본 발명의 복제 계에 의해 발현될 수 있으며, 따라서 프로모터 및 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트와 관련하여 포함되며, 상기 핵산서열은 상기 전이유전자의 1 또는 몇개를 암호화한다. E1, E3 및/또는 E4 영역은 아데노바이러스 게놈에서 특히 적합한 클로닝 부위이지만, 상기 클로닝 부위는 이들에 한정되지 않는다.

이러한 치료 유전자는 프로드럭 유전자, 사이토카인 유전자, 세포자살 유도 유전자, 종양 서프레서 유전자, 메탈로프로테이나제 억제제 유전자 및/또는 신생혈관생성 억제제 유전자 및 티로신 키나제 억제제 유전자일 수 있다. 부가적으로, siRNA, 아프타머, 안티센스 분자 및 리보자임은 암-관련 표적 분자에 대하여 발현될 수 있다. 바람직하게는, 개별 또는 몇개의 표적 분자는 내성 관련 인자, 항-세포자살 인자, 암유전자, 신생혈관생성 인자, DNA 합성 효소, DNA 수선 효소, 생장인자 및 이들의 리셉터, 전사인자, 메탈로프로테이나제, 특히 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 유로키나제 유형의 플라스미노겐 애티베이터를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예는 본 발명의 다른 요지와 관련하여 이미 본 명세서에 기재된 바와 같다.

사용될 수 있는 가능한 프로드럭 유전자는 바람직한 구체예로서 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제, 카르복시펩티다제, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제; 또는 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(PNP)이다; [Kirn 등, Trends in Molecular Medicine, 제8권, 4호(보충), 2002; Wybranietz W.A.등, Gene Therapy, 8, 1654-1664, 2001; Niculescu-Duvaz 등, Curr. Opin. Mol. Therapy, 1, 480.486, 1999; Koyama 등, Cancer Gene Therapy, 7, 1015-1022, 2000; Rogers 등, Human Gene Therapy, 7, 2235-2245, 1996; Lockett 등, Clinical Cancer Res., 3, 2075-2080, 1997; Vijayakrishna 등, J. Pharmacol. And Exp. Therapeutics, 304, 1280-1284, 2003].

바람직한 구체예로서 사용될 수 있는 가능한 사이토카인은 예컨대 GM-CSF, TNF-알파, Il-12, Il-2, Il-6, CSF 또는 인터페론-감마이다; [Gene Therapy, Advances in Pharmacology, Volume 40, editor: J. Thomas August, Academic Press; Zhang and Degroot, Endocrinology, 144, 1393-1398, 2003; Descamps et al., J. Mol. Med., 74, 183-189, 1996; Majumdar et al., Cancer Gene Therapy, 7, 1086-1099, 2000].

바람직한 구체예로서 사용될 수 있는 세포자살-유도 유전자는 예컨대 데코린[Tralhao et al., FASEB J, 17, 464-466, 2003]; 레티노블라스토마 94 [Zhang et al., Cancer Res., 63, 760-765, 2003]; Bax 및 Bad [Zhang et al., Hum. Gene Ther., 20, 2051-2064, 2002]; 아포프틴 [Noteborn 및 Pietersent, Adv.Exp.Med.Biol., 465, 153-161, 2000]; ADP [Toth et al., Cancer Gene Therapy, 10, 193-2000, 2003] bcl-xs [Sumantran et al., Cancer Res, 55, 2507-2512, 1995] E4orf4 [Braithwaite 및 Russell, Apoptosis, 6, 359-370, 2001]; FasL, Apo-1 및 Trail [Boehringer Manheim, Guide to Apoptotic Pathways, Arai et al., PNAC, 94, 13862-13867, 1997]; Bims [Yamaguchi et al., Gene Therapy, 10, 375-385, 2003; GNR163: Oncology News, 17 June, 2000]이다.

바람직한 구체예로서 사용될 수 있는 종양 서프레서 유전자는 예컨대 E1A, p53, p16, p21, p27 또는 MDA-7 이다 [Opalka et al., Cell Tissue Organs, 172, 126-132, 2002, Ji et al., Cancer Res., 59, 3333-3339, 1999, Su et al., Oncogene, 22, 1164-1180, 2003].

바람직한 구체예로서 사용될 수 있는 신생혈관형성 억제제는 예컨대 엔도스타틴 또는 안기오스타틴 [Hajitou et al., FASEB J., 16, 1802-1804, 2002] 및 VEGF에 대한 항체 [Ferrara, N., Semin Oncol 2002 Dec; 29 (6 suppl 16): 10-4] 이다.

바람직한 구체예로서 사용될 수 있는 메탈로프로테이나제 억제제는 예컨대 Timp-3 [Ahonen et al., Mol Therapy, 5, 705-715, 2002]; PAI-1 [Soff et al., J. Clin. Invest., 96, 2593-2600, 1995]; Timp-1 [Brandt K. Curr. Gene Therapy, 2, 255-271, 2002] 이다.

그룹 I 아데노바이러스 및 그룹 II 아데노바이러스에 의해 발현될 수 있는 본 발명의 의미에서 다른 전이유전자는 또한 티로신 키나제 억제제이다. 티로신 키나제의 예는 EGFR(표피 생장 인자 수용체) [Onkologie, Entstehung und Progression maligner Tumoren; author: Christoph Wagner, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1999]이다. 바람직한 티로신 키나제 억제제는 헤르셉틴 [Zhang H et al., Cancer Biol Ther. 2003, Jul-Aug; 2(4 suppl 1): S122-6] 이다.

SiRNA (짧은 간섭성 RNA)는 2개, 바람직하게는 염기 상보성으로 인하여 서로 혼성화되는 별개의 RNA 가닥으로 구성되며, 이는 이들이 기본적으로 염기 쌍을 이루며 바람직하게는 50개 이하의 뉴클레오티드, 바람직하게는 18 내지 30개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 25개 미만의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 21, 22 또는 23개 뉴클레오티드 길이를 가지며, 이들 특징은 siRNA의 단일 가닥, 특히 혼성화되거나 또는 염기 쌍을 이루는 단일 가닥의 스트레치 길이, 보다 자세하게는 제2 단일 가닥을 지칭한다. siRNA는 mRNA의 분해를 특이적으로 유도하거나 매개한다. 그러므로 필요한 특이성은 siRNA의 서열 및 그의 결합 부위에 의해 매개된다. 분해될 표적 서열은 기본적으로 siRNA 형성 가닥의 제1 또는 제2 가닥에 대하여 상보적이다. 작용의 자세한 모드는 분명하지 않지만, siRNA는 발생중 분명한 대립유전자를 억제하고 또 자신을 바이러스로 부터 보호하기 위한 세포에 대한 생물학적 전략으로 보여진다. siRNA 매개된 RNA 간섭은 유전자 특이적 이중가닥 RNA를 도입하는 것에 의해 단백질의 발현을 특이적으로 억제 또는 완전히 제거하는 방법으로 이용된다. 고등 생물의 경우, 19 내지 23개 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA는 지금까지 인터루킨 반응과 같은 비-특이적 방어 반응의 활성화를 초래하지 않기 때문에 특히 적합하다. 대칭적 2-nt 3' 오버헹을 갖는 21개 뉴클레오티드의 이중가닥 RNA의 직접적 형질감염은 포유류 세포에서 RNA 간섭을 매개하기에 적합하며 리보자임 및 안티센스 분자와 같은 기타 기술과 비교하여 아주 효과적이다(Elbashir, S. Harborth J. Lendeckel W. Yalvcin, A. Weber K, Tuschl T: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001, 411: 494-498). 아주 소형의 siRNA 분자가 표적 유전자의 발현을 억제하는데 충분하다. siRNA 분자의 간섭 현상 및 특이적 전달의 일시적 특성에 존재하는 외생적으로 부가된 siRNA의 제한을 피하기 이하여, 내생적 siRNA 발현을 허용하는 벡터가 종래 기술에서 사용되었다. 이러한 목적을 위해, 예컨대 64개 뉴클레오티드 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드를, 센스 방향 및 안티센스 방향 모두에서 19개 뉴클레오티드 길이의 표적 서열 및 그와 별도로 예컨대 9개 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함하는 벡터에 도입하였다. 생성한 전사물은 예컨대 19개 염기 쌍의 줄기 구조를 갖는 헤어핀 구조로 접힌다. 상기 루프는 세포에서 즉시 분해되어 기능적 siRNA 분자가 생성된다 (Brummelkamp et al., Science, 296, 550-553, 2002).

본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스의 구체예로서 아데노바이러스, 특히 그룹 I 아데노바이러스의 일부일 수 있지만 본 발명에 따른 아데노바이러스, 즉 그룹 I 아데노바이러스의 일부일 수 있는 YB-1을 암호화하는 핵산은 YB-1을 핵으로 이동시키는 것을 매개하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산, 아데노바이러스 및 아데노바이러스 계 뿐만 아니라 종래 기술에 공지된 아데노바이러스, 예컨대 Onyx-15, AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB016, dl520 및 유럽 특허 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스가 아데노바이러스 및 아데노바이러스 계로 또 본 발명에 따른 이들 핵산과 조합된 상응하는 핵산으로 사용될 수 있다. 핵 이동을 매개하는 적합한 핵산 서열은 당업자에게 공지되어 있으며, 예컨대 Whittaker, G.R. et al., Virology, 246, 1-23, 1998; Friedberg, E.C., TIBS 17, 347, 1992; Jans, D.A. et al., Bioassays 2000 Jun; 22(6): 532-44; Yoneda, Y., J. Biochem. (Tokyo) 1997 May; 121(5): 811-7; Boulikas, T., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1993; 3(3): 193-227; Lyons RH, Mol. Cell Biol., 7 2451-2456, 1987)에 기재되어 있다. 핵 이동을 매개하는 핵산 서열은 상이한 원리를 실현할 수 있다. 그러한 한가지 원리는 YB-1이 시그널 펩티드를 갖거나 또는 그러한 시그널 펩티드를 갖고 있어서 본 발명에 따른 아데노바이러스의 복제가 생길 때 그 시그널 펩티드로 인하여 세포 핵으로 전달되는 융합 단백질을 형성한다.

본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스, 특히 그룹 II 아데노바이러스 뿐만 아니라 본 발명에 따른 아데노바이러스, 즉 그룹 I 아데노바이러스의 디자인에 사용될 수 있는 다른 원리는 이동 서열을 갖는 YB-1을 제공하는 것이며, 그에 의해 YB-1을 세포 핵으로 이동 또는 전좌를 유발하는 이동 서열을 갖는 YB-1을 제공하여서 바람직하게는 세포질에서의 합성으로부터 시작해서 그곳에서 바이러스 복제를 촉진시키는 것이다. 핵으로의 이동을 매개하는 특히 효과적인 핵산서열의 일례는 HIV의 TAT 서열이며, 예컨대 이것은 이러한 종류의 다른 적합한 핵산 서열과 함께 Efthymiadis, A., Briggs, LJ, Jans, DA., JBC 273, 1623-1628, 1998에 기재되어 있다. 본 발명에 따라 사용되는 아데노바이러스, 특히 그룹 II 아데노바이러스 뿐만 아니라 본 발명에 따른 아데노바이러스, 특히 그룹 I 아데노바이러스가 핵 이동을 매개하는 펩티드를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 것은 본 발명의 범위내에 속한다.

YB-1이 전체 길이, 특히 야생형 YB-1에 상응하는 형태로 존재하는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 또한, YB-1이 예컨대 짧은 형태 또는 절단된 형태의 유도체로 사용되거나 존재하는 것도 본 발명의 범위에 속한다. 본 발명에 사용될 수 있거나 본 발명과 관련하여 존재할 수 있는 YB-1 유도체는 E2 후기 프로모터에 결합될 수 있어서 아데노바이러스 E2 영역의 유전자 발현을 활성화하는 YB-1 이다. 이러한 유도체는 특히 본 명세서에 기재된 YB-1 유도체를 포함한다. 다른 유도체는 N-말단, C-말단 또는 아미노산 서열 내부에 있는 단일 또는 몇개의 아미노산을 결실시키는 것에 의해 생성할 수 있다. YB-1 단편은 본 발명의 의미에서 YB-1 단백질로 사용될 수 있는 것도 본 발명의 범위에 속한다. Jurchott K et al. [JBC 2003, 278, 27988-27996]의 논문에는 C-말단 및 N-말단에서 결실을 특징으로 하는 다양한 YB-1 단편이 기재되어 있다. 다양한 YB-1 단편의 보급은 냉각 쇼크 도메인(CSD) 뿐만 아니라 C-말단이 세포 주기 조절된 YB-1의 세포 핵으로의 이동과 관련됨을 보여준다. 본 발명의 E1B55k 및 E4orf6의 발현과 관련된 짧아진 YB-1 (이후 YB-1 단백질로 지칭)는 핵으로 더 잘 이동하므로 천연 YB-1과 비교하여 E2-후기 프로모터에 반드시 더 잘 결합될 필요없이도 더 강한 CPE를 유발하는 것은 본 발명의 범위에 속하며, 짧아진 YB-1이 핵으로 더 잘 이동하여서 CPE를 유도하고 E2-후기 프로모터에 결합되는 양쪽 효과를 얻는 것도 제외되어서는 안된다. 마지막으로, 이러한 짧아진 YB-1 단편은 핵으로 더 잘 이동할 수 있고 또 더 우수한 CPE를 유발함없이 보다 효과적으로 E2-후기 프로모터에 결합될 수 있다. 짧아진 YB-1 단백질 및 단편은 전체 길이 YB-1과 관련하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 추가의 서열, 특히 세포내 이동 시그널 서열(NLS) 등을 더 포함하는 것도 본 발명의 범위내에 속한다.

아데노바이러스에 의해 암호화되고 발현된 상술한 다양한 유전자 및 유전자 산물에 관하여, 원칙적으로 이들은 어떠한 조합으로도 암호화되고 발현될 수 있다.

본 발명에서, 용어 아데노바이러스 및 아데노바이러스 계는 실질적으로 동일한 의미를 갖는 것으로 이해된다. 용어 아데노바이러스는 캡시드와 핵산을 포함하는 완전한 바이러스 입자와 관련된 것으로 이해되어야 한다. 용어 아데노바이러스 계는 핵산이 야생형과 비교하여 변경된 사실에 초점을 두고 있다. 바람직하게는 이러한 변경은 프로모터, 조절 서열 및/또는 리딩 프레임과 같은 코딩 서열의 결실 및/또는 부가 및/또는 돌연변이로 부터 기인할 수 있는 아데노바이러스의 게놈의 셋업에서 변경을 포함한다. 용어 아데노바이러스 계는 유전자 요법에 사용될 수 있는 벡터로서 바람직하게 사용될 수 있다.

아데노바이러스 및 아데노바이러스 계의 용도 및 디자인을 비롯한 상술한 내용은 그를 암호화하는 핵산에 대해서도 적용될 수 있으며 그 역도 마찬가지다.

본 발명과 관련하여, 본 발명에 따라 사용된 아데노바이러스, 특히 그룹 II 아데노바이러스 뿐만 아니라 그룹 I 아데노바이러스 및 그를 암호화하는 핵산은 그자체 또는 다른 핵산 서열과 조합되어 복제를 유발하는 아데노바이러스 핵산일 수 있다. 본 명세서에서 설명한 바와 같이, 복제에 필요한 서열 및/또는 유전자 산물은 헬퍼 바이러스에 의해 제공될 수 있다. 코딩 핵산서열에 관련되고 또 상기 핵산이 공지된 핵산 서열인한, 본 발명에서는 동일한 서열이 사용될 뿐만 아니라 그로부터 유도된 서열도 사용된다. 여기서, 유도된 서열은 유전사 산물을 여전히 초래할 수 있는 임의 서열, 즉 비-유도 서열의 기능에 상응하는 기능 또는 그 기능을 갖는 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다. 이것은 당업자에게 공지된 통상의 시험에 의해 시험될 수 있다. 이러한 유도된 핵산 서열의 일례는 동일한 유전자 산물, 특히 동일한 아미노산 서열을 암호화하지만, 유전자 코드의 축퇴로 인하여 상이한 염기 서열을 갖는 핵산서열이다.

그룹 II의 본 발명에 따른 아데노바이러스 및/또는 본 발명에 따른 상응하는 아데노바이러스 복제 계 및 본 발명에 따른 이들의 용도에 관하여, 구체예로서, 상기 아데노바이러스 핵산은 암유전자 단백질의 발현에 대해 결핍이고, 특히 E1A 단백질 결핍이며, 즉 12S E1A 단백질(이후 E1A12S 단백질로 칭함) 또는 13S E1A 단백질 (이후 E1A13S 단백질이라 칭함)을 암호화하지 않거나 또는 12S E1A 단백질 및 13S E1A 단백질을 모두 암호화하지 않거나, 또는 다르게 정의하지 않는 한, 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형되며, 또 아데노바이러스 복제 계는 헬퍼 바이러스의 핵산을 더 포함하며 상기 헬퍼 바이러스의 핵산은 암유전자 단백질, 특히 E1A 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 이하의 특징을 갖고 아데노바이러스에게 이하의 특징을 부여한다: YB-1 핵-음성 세포에서 복제되지 않는 것이 바람직하지만 세포주기와 독립적으로 YB-1 핵-양성인 세포 또는 탈조절된 YB-1을 나타내는 세포에서는 복제될 수 있으며, YB-1 핵-양성 세포에서 1 이상의 바이러스 유전자, 특히 E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및/또는 E3ADP를 트랜스액티베이팅할 수 있고 및/또는 세포 YB-1을 핵으로 이동시키지 않는다. 본 발명에서는 본 명세서에 기재된 전이유전자는 헬퍼 바이러스에 의해 개별적으로 또는 집합적으로 암호화하고 및/또는 발현된다. 이러한 것은 그룹 I 아데노바이러스 및 그룹 II 아데노바이러스 모두에 있어서 헬퍼 바이러스에 적용된다.

또한, 본 발명에 따른 아데노바이러스 복제 계의 구체예로서, 아데노바이러스 핵산 및/또는 헬퍼 바이러스의 핵산은 복제가능한 벡터로 존재한다.

본 발명에서, 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스를 암호화하는 핵산은 발현벡터내에 존재하며 상기 발현 벡터는 본 발명에 따라 사용된다.

다른 요지로서 본 발명은 2 이상의 벡터를 포함하는 벡터 그룹에 관한 것으로, 상기 벡터 그룹은 본 명세서에 기재된 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스에 대해 전체적인 아데노바이러스 복제계를 포함하며, 또 상기 벡터 그룹은 본 발명에 따라 사용된다. 구체예로서, 아데노바이러스 복제 계의 각 성분은 개별 벡터, 바람직하게는 발현 벡터상에 배열된다.

결국, 본 발명은 다른 요지로서 본 발명에 따라 바람직하게 사용되는 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스를 암호화하는 1 또는 몇개의 핵산을 함유하며 또 본 발명에 따라 사용될 세포 및/또는 다양한 아데노바이러스에 대해 상기 기재된 바와 같은 동일한 목적을 위한 상응하는 아데노바이러스 복제 계 및/또는 상응하는 벡터 및/또는 본 발명에 따른 벡터 그룹의 용도에 관한 것이다.

아데노바이러스, 특히 이들의 핵산 및 이들을 암호화하는 핵산의 상기 기재한 구조물은 여러부분으로 나뉜 형태로 세포, 바람직하게는 종양 세포에 도입될 수 있으며, 다양한 개별 성분의 존재로 인하여 이들은 개별 성분이 단일 핵산 및 단일 또는 몇개의 아데노바이러스로 부터 유래한 것 처럼 함께 작용한다.

본 발명에 따라 사용되며 아데노바이러스 계 또는 그의 부분에 상응하는 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스를 암호화하는 핵산은 벡터로 존재할 수 있다. 바람직하게는 이들 벡터는 바이러스 벡터이다. 핵산이 아데노바이러스 핵산인 경우, 바람직하게는 바이러스 입자가 벡터이다. 그러나 본 발명에서는 상기 핵산이 플라스미드 벡터에 존재한다. 각 경우 벡터는 삽입된 핵산의 증식, 즉 삽입된 핵산의 복제 및 경우에 따라 발현을 허용하고 제어하는 요소를 포함한다. 적합한 벡터, 바람직하게는 발현 벡터 및 각 요소는 당업자에게 공지되어 있으며, 예컨대 Grunhaus, A., Horwitz, M.S., 1994, Adenoviruses as cloning vectors. In Rice, C. editor, Seminars in Virology, London: Saunders Scientific Publications에 기재되어 있다.

벡터 그룹에 관련된 요지는 상술한 구체예를 고려하며 상기 핵산의 다양한 요소는 단일 벡터에만 반드시 함유될 필요는 없다. 따라서 벡터 그룹은 2개 이상의 벡터로 구성된다. 별도로, 벡터에 관한 진술은 또한 벡터 및 벡터 그룹에 대해 적용가능하다.

그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스는 본 명세서에 기재된 다양한 핵산 및 유전자 산물을 특징으로 하며 당업자에게 공지되고 야생형 아데노바이러스에 고유한 모든 요소를 포함할 수 있다(Shenk, T.: Adenoviridae: The virus and their replication. Fields Virology, vol. 3, editors Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, P.M. et al., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, chapter 67).

설명을 위한 것이지만 본 발명을 제한하기 위한 것이 아닌 아데노바이러스이 복제는 이하에 간단히 논의할 것이다.

아데노바이러스의 복제는 매우 복잡한 과정이며 통상 인간의 전사인자 E2F를 기본으로 한다. 바이러스 감염 중에, 먼저 "초기 유전자" E1, E2, E3 및 E4가 발현된다. "후기 유전자"의 그룹은 바이러스의 구조 단백질의 합성에 관여한다. 상이한 E1A 및 E1B 단백질을 암호화하는 2개의 전사 단위체 E1A 및 E1B로 구성된 E1 영역은 이들이 E2, E3 및 E4 유전자의 전사를 유도하기 때문에 초기 및 후기 유전자 모두의 활성화에 중요한 역할을 한다 (Nevins, J. R., Cell 26, 213-220, 1981). 부가적으로, E1A 단백질은 휴지 세포에서 DNA 합성을 개시시킬 수 있으므로 이들이 S상으로 들어가도록 유발한다(Boulanger and Blair, 1991 참조). 부가적으로, 이들은 Rb류의 종양 서프레서와 상호작용한다(Whyte, P. et al., Nature 334, 124-127, 1988). 이렇게함으로써, 세포성 전사인자 E2F가 방출된다. E2F 인자는 세포성 및 바이러스성 유전자 모두의 상응하는 프로모터 영역(특히 아데노바이러스 E2 후기 프로모터)에 결합될 수 있고 또 전사 및 복제를 개시시킨다(Nevins, J. R., Science 258, 424-429, 1992). pRb 및 E2F의 활성은 포스포릴화에 의해 조절된다. pRb의 하이포포스포릴화된 형태는 G1 및 M 상으로 존재한다. 대조적으로, 하이퍼포스포릴화된 형태의 pRb는 S 및 G2 상으로 존재한다. pRb의 포스포릴화에 의해 E2F는 E2F 및 하이포포스포릴화된 pRb로 구성된 복합체로 부터 방출된다. E2F 및 하이포포스포릴화된 pRb의 복합체로 부터 E2F의 방출은 E2F 의존적 유전자의 전사를 초래한다. E1A 단백질은 하이포포스포릴화된 형태의 pRb에만 결합되며, E1A가 pRb에 결합하는 것은 주로 E1A 단백질의 CR2 영역을 통하여 생긴다. 부가적으로, 이것은 낮은 친화성으로 CR1 영역에 결합된다 (Ben-Israel and Kleiberger, Frontiers in Bioscience, 7, 1369-1395, 2002; Helt and Galloway, Carcinogenesis, 24, 159-169, 2003).

E2 영역의 유전사 산물은 이들이 3개의 필수적인 단백질을 암호화하기 때문에 복제의 개시 및 완료에 특히 필요하다. E2 단백질의 전사는 2개의 프로모터, "E2 초기 E2F 의존적" 프로모터(이후, E2-초기 프로모터 또는 초기 E2 프로모터라 칭함) 및 "E2-후기" 프로모터 (Swaminathan and Thimmapaya, The Molecular Repertoire of Adenoviruses III: Current Topics in Microbiology and Immunology, vol 199, 177-194, Springer Verlag 1995)에 의해 제어된다. 부가적으로 E4 영역과 E1A 및 E1B-55kDa 단백질의 산물은 E2F의 활성 및 p53의 안정성에 중요한 역할을 한다. 예컨대, E2 프로모터는 E2F 및 DP1으로 구성된 헤테로다이머를 갖는 E4 영역에 의해 암호화되는 E4orf6/7 단백질의 직접적 상호작용에 의해 더욱 더 트랜스액티베이팅된다 (Swaminathan and Thimmapaya, JBC 258, 736-746, 1996). 또한, E1B-55kDa 및 E4orf6으로 구성된 복합체는 성공적인 감염성 용해 주기를 완성하도록 p53에 의해 불활성화된다 (Steegenga, W. T. et al., Oncogene 16, 349-357, 1998). 부가적으로, E1B-55kDa는 E4orf6 단백질과 상호작용하면 핵으로부터 바이러스 RNA의 이동을 촉진시키는 한 중요한 기능을 가지지만, 세포성 RNA는 핵에 함유된다(Bridge and Ketner, Virology 174, 345-353, 1990). 더욱 중요한 관찰은 E1B-55kDa/E4orf6으로 구성된 단백질 복합체가 소위 "바이러스 봉입체"로 이동하는 점이다. 이들 구조는 복제 및 전사 부위로 추정된다(Ornelles and Shenk, J. Virology 65, 424-429, 1991).

E3 영역은 복제, 특히 아데노바이러스의 방출에 중요한 영역이다. E3 영역은 보다 자세하게는 시험관내, 즉 세포 배양액에서 아데노바이러스의 감염주기에 필수적이지 않은 다양한 비교적 소형 단백질의 유전자 정보를 함유한다. 그러나, 이들은 그중에서도 면역 조절 및 세포자살 기능을 가지고 있기 때문에 생체내에서 급성 및/또는 잠재적 감염 동안 바이러스의 생존에 중요한 역할을 한다(Marshall S. Horwitz, Virologie, 279, 1-8, 2001; Russell, 상동). 약 11.6 kDa 크기를 갖는 단백질이 세포 치사를 유도하는 것으로 볼 수 있었다. 이러한 단백질은 그의 기능으로 인하여 영어 용어 아데노바이러스 치사 단백질의 의미인 ADP로 불렸다(Tollefson, J. Virology, 70, 2296-2306, 1996). 이 단백질은 감염 주기의 후기 상에서 주로 형성된다. 또한, 이 단백질의 과발현은 감염 세포를 더 잘 용해시킨다(Doronin et all, J. Virology, 74, 6147-6155, 2000).

또한 E1A-결실 바이러스, 즉 특히 12S E1A 단백질과 13S E1A 단백질을 모두 발현하지 않는 바이러스는 높은 MOI에서 아주 효과적으로 복제될 수 있다는 것은 본 발명자에게 공지(Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981)되어 있지만, 임상적 용도에서 적용될 수 없다. 이러한 현상을 문헌에서는 "E1A-유사 활성"이라 칭한다. 또한 E1A에 의해 암호화된 5개 단백질중 2개 단백질, 즉 12S 및 13S 단백질은 다른 아데노바이러스 유전자의 발현을 제어하고 유도한다는 것이 공지되어 있다(Nevins, J. R., Cell 26, 213-220, 1981; Boulanger, P. and Blair, E.; Biochem. J. 275, 281-299, 1991). 특히 13S 단백질의 CR3 영역이 트랜스액티베이팅 작용을 나타내는 것도 분명하게 되었다(Wong HK and Ziff EB., J. Virol., 68, 4910-20, 1994). 13S 단백질의 CR1 및/또는 CR2 영역 및/또는 CR3 영역에서 분명한 결실을 갖는 아데노바이러스는 실질적으로 복제 결핍이지만, 다른 세포주에서 바이러스 유전자 및 프로모터, 특히 E2 영역을 트랜스액티베이팅시킨다(Wong HK, Ziff EB., J Virol. 68, 4910-20, 1994; Mymryk, J. S. and Bayley, S. T., Virus Research 33, 89-97, 1994).

세포, 전형적으로 종양 세포를 야생형 아데노바이러스에 의해 감염시킨 후, YB-1은 E1A, E1B-55K 및 E4orf6에 의해 핵으로 유도되며 핵내의 바이러스 봉입체에서 E1B-55K에 의해 공동이동하며, 이는 시험관내 및 생체내에서 모두 세포 핵중의 바이러스의 효과적인 복제를 허용한다. 이미 앞서서 발견된 바와 같이 E4orf6는 E1B-55K에 결합되며(Weigel, s. and Dobbelstein, M. J. Virology, 74, 764-772, 2000; Keith N. Leppard, Seminars in Virology, 8, 301-307, 1998) 따라서 E1B-55K가 핵으로 이동하여 분포되는 것을 매개하며 이는 최적 바이러스 생산 및 아데노바이러스 복제를 확실하게 한다. E1A, E1B-55K 및 YB-1의 공동 작업에 의해 및 E1B-55K/E4orf6 및 YB-1으로 구성된 복합체 및 소위 바이러스 봉입체중의 핵내에 YB-1 및 E1B-55K가 함께 존재하는 것에 의해, 본 발명에 따른 바이러스의 효과적인 복제가 가능하며 따라서 YB-1 핵-양성인 세포, 바람직하게는 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 함유하는 세포 및/또는 탈조절된 YB-1을 포함하거나 또는 나타내는 세포에서 복제를 위하여, 의약 제조를 위해, YB-1 핵-양성 세포, 바람직하게는 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 함유하는 세포 및/또는 탈조절된 YB-1를 포함하거나 나타내는 세포에서 질병을 치료하기 위해 상기 기재된 바이러스의 용도가 포함된다. 따라서 상기 세포 배경에서 가능한 복제는 세포의 용해, 바이러스의 방출 및 인근 세포의 감염과 용해를 초래하므로 종양 세포 및 종양 감염의 경우에 결국 종양의 용해, 즉 암세포 붕괴가 생긴다.

YB-1는 Y-박스라고도 불리는 반전된 CAAT 서열에 결합되는 고도로 보존된 인자 그룹에 속한다. 이들은 전사 및 번역 수준에서 조절되는 방식으로 작용할 수 있다(Wolffe, A. P. Trends in Cell Biology 8, 318-323, 1998). 활성화 뿐만 아니라 생장 억제 및 세포자살과 관련된 유전자에서 발견된 더 많은 Y-박스 의존적 조절 경로가 존재한다(Swamynathan, S. K. et al., FASEB J. 12, 515-522, 1998). 예컨대, YB-1는 직접적으로 p53과 상호작용하며(Okamoto, T. et al., Oncogene 19, 6194-6202, 2000) 또 Fas 유전자의 발현(Lasham, A. et al., Gene 252, 1-13, 2000), MDR 및 MRP의 유전자 발현(Stein, U. et al., JBC 276, 28562-69, 2001; Bargou, R. C. et al., Nature Medicine 3, 447-450, 1997) 및 토포아이소머라제 및 메탈로프로테이나제의 활성화(Mertens, P. R. et al., JBC 272, 22905-22912, 1997; Shibao, K. et al., Int. J. Cancer 83, 732-737, 1999)에 중요한 역할을 한다. 또한 YB-1는 mRNA 안정성의 조절(Chen, C-Y. et al., Genes & Development 14, 1236-1248, 2000) 및 수선 공정(Ohag, T. et al., Cancer Res. 56, 4224-4228, 1996; Izumi H. et al., Nucleic Acid Research 2001, 29, 1200-1207; Ise T. et al., Cancer Res., 1999, 59, 342-346)에 관여한다.

세포주기와 독립적으로 핵에 존재하는 YB-1에 의해 또는 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스에 의해 핵으로 전좌된 세포질내에 존재하는 탈조절된 YB-1에 의해 종양 세포중의 YB-1이 핵내 이동하는 것은 특히 12S E1A 단백질과 13S E1A 단백질이 발현되거나 사용되지 않는 E1A-독립적 바이러스성 복제를 초래(Holm, P.S. et al., JBC 277, 10427-10434, 2002)하고 또 단백질 YB-1의 과발현의 경우에 다약제 내성을 초래한다. 부가적으로, E4orf6 및 E1B-55K와 같은 아데노바이러스 단백질이 바이러스 복제(Goodrum, F. D. 및 Ornelles, D. A., J. Virology 73, 7474-7488, 1999)에 대하여 양성의 영향을 가지고 있으며, 따라서 기능적 E1A 단백질이 다른 바이러스 유전자 산물(E4orf6, E3ADP 및 E1B-55K)의 활성화에 관여한다는 것은 알려져 있다(Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981). 그러나, 이것은 13S E1A가 존재하지 않는 당분야에 공지된 E1A-마이너스 아데노바이러스에 의해서는 생기지 않는다. 핵내에 YB-1를 갖는 다약제 내성 세포에서 YB-1의 핵내 이동은 그러한 E1A-마이너스 바이러스의 복제와 입자 형성을 허용한다. 그러나 이와 관련하여, 바이러스 복제 및 입자 형성의 효율은 야생형 Ad5에 비교하여 몇배 정도 감소된다. 이것과 비교하여, YB-1의 조합은 YB-1에 의해 매개된 매우 효과적인 바이러스 복제와 입자 형성, 즉 종양세포붕괴를 허용하므로, YB-1는 세포 주기와 독립적으로 방식으로 핵내에 존재하는 YB-1로 부터 기인할 수 있는 종양세포의 핵내에 이미 함유되거나 또는 세포질내에 존재하는 탈조절된 YB-1는 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스에 의해 핵으로 전좌되거나 외인성 인자(예컨대 세포증식억제제 또는 조사 또는 온열요법의 적용)에 의해 세포 핵내로 유발, 즉 바람직하게는 세포 주기와 독립적으로 핵내에 존재하도록 유발되거나, 또는 YB-1는 아데노바이러스 유전자를 스위치-온시키지만 바이러스 복제는 나타내지 않는 계, 바람직하게는 아데노바이러스 계에 벡터에 의해 전이유전자로서 도입된다. 이러한 것은 특정 디자인으로 인하여 효과적으로 복제될 수 있고 또 E1B 단백질, 바람직하게는 E1B55K 단백질 및/또는 E4 단백질, 바람직하게는 E4orf6 단백질이 YB-1의 효과적인 핵내 존재를 제공하는 효과를 이용할 수 있는 본 발명에 따른 아데노바이러스, 즉 그룹 I 아데노바이러스에도 적용된다. 본 발명의 다양한 요지와 관련하여 기재된 아데노바이러스와 함께 사용될 수 있는 적합한 세포증식억제제는 예컨대 다음 군에 속하는 것이다: 예컨대 다우노마이신 및 아드리아마이신과 같은 안트라사이클린; 예컨대 시클로포스파미드와 같은 알킬화제; 에토포시드와 같은 알칼로이드; 예컨대 빈크리스틴 및 빈블라스틴과 같은 빈-알칼로이드; 예컨대 5-플루오로우라실 및 메토트렉세이트와 같은 항대사물질; 예컨대 시스-플라틴과 같은 플라틴-유도체; 예컨대 캄포테신, CPT-11과 같은 토포아이소머라제 억제제; 예컨대 탁솔, 파클리탁셀과 같은 탁산; 예컨대 FR901228, MS-27-275, 트리코스타틴 A와 같은 히스톤-데아세틸라제 억제제; 예컨대 MS-209, VX-710과 같은 MDR 조절제; 예컨대 17-AAG와 같은 겔다나마이신 유도체. YB-1 핵-양성인 세포 및 바람직하게는 세포질내에 조절된 YB-1를 함유하는 세포에서만 복제될 수 있는 여기서 기재된 아데노바이러스, 특히 재조합 아데노바이러스는 야생형 아데노바이러스, 특히 야생형 Ad5의 트랜스액티베이팅 능력과 비교하여 바이러스 유전자 E1B-55K, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP를 트랜스액티베이팅시키는 능력에 한정된다. 본 발명자는 놀랍게도 이러한 제한된 트랜스액티베이팅 능력은 YB-1의 핵내 이동과 조합하여 상응하는 유전자, 특히 E1B-55K 및 E4orf6을 발현하는 것에 의해 극복될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 본 발명의 실시예에 기재한 바와 같이, 바이러스 복제 및 입자 형성은 야생형 아데노바이러스의 복제 활성 및 입자 형성에 필적하는 수준으로 상기 조건하에서 증가된다.

본 명세서에 기재된 아데노바이러스가 본 발명에 따라 사용되는 제법에 의한 의약은 전신적 방법으로 흔히 도포되는 것이지만, 국소적으로 도포하거나 전달하는 것도 본 발명에 속한다. 이러한 적용은 상기와 같은 세포를 아데노바이러스로 감염시키기 위한 것이고 그곳에서 아데노바이러스 복제가 생겨서 전형적으로 질환 상태를 본 발명에 따른 의약을 사용하여 진단 및/또는 예방 및/또는 치료하는데 관여한다.

이러한 의약은 바람직하게는 악성 질환, 종양 질환, 암 질환, 암 및 종양의 치료를 위한 것이고, 상기 용어는 본 명세서에서 다르게 지시하지 않는 한 동일한 의미로 이용된다. 종양 질환은 종양 질환의 기본이 되는 메카니즘으로 인하여, 특히 기본이 되는 병인학적 메카니즘으로 인하여 YB-1이 세포 주기와 독립적으로 핵내에 존재하는 경우의 질환, 또는 세포핵에서 YB-1의 존재는 외인성 수단에 의해 유발되고 그러한 외인성 수단은 YB-1을 세포 핵으로 전달하거나 그곳에서 발현을 유도하기에 적합한 질환이다. 용어 종양 또는 종양 질환은 악성 뿐만아니라 양성 종양을 포함하는 것이며, 각각 고형이며 종양 및 질환을 확산시킨다. 구체예로서, 상기 의약은 1 이상의 약제학적 활성 화합물을 포함한다. 이러한 약제학적 활성 화합물의 성질 및 양은 상기 의약이 사용되기 위한 효과의 유형에 좌우될 것이다. 상기 의약을 종양 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 사용하는 경우, 전형적으로 시스-플라틴 및 탁솔, 다우노블라스틴, 다우노루비신, 아드리아마이신 및/또는 미토크산트론과 같은 세포증식억제제 또는 본 명세서에 기재된 다른 세포증식억제제 또는 그 그룹이 사용되며, 바람직하게는 세포증식억제제 매개된 YB-1의 핵내 이동과 관련하여 기재된 것이 사용된다.

본 발명에 따른 의약은 다양한 제형, 바람직하게는 액체 형태로 존재할 수 있다. 또한 상기 의약은 제형 분야에서 당업자에게 공지된 안정화제, 완충액, 보존제 등과 같은 보조제를 함유할 것이다.

본 발명자는 놀랍게도 본 명세서에 기재된 바이러스의 사용도, 바람직하게는 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스의 사용은 이러한 종양과 관련하여 아주 높은 성공율로 실시될 수 있고 또 이들은 세포주기와 독립적으로 세포 핵내에 YB-1을 갖는 그러한 종양을 치료하기 위한 의약 제조를 위해 사용될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 정상적으로, YB-1은 세포질, 특히 핵주위 세포질(perinuclear plasm)에 위치한다. 세포주기의 G1/S 상에서, YB-1은 정상세포 및 종양 세포 모두에서 핵에서 발견되지만, YB-1의 일부는 세포질내에 잔류한다[Juerchott K et al., JBC 2003, 278, 27988-27996]. 그러나, 이것은 그러한 변형된 아데노바이러스를 사용한 바이러스 종양세포 붕괴를 제공하기에는 충분하지 않다. 종래기술에 기재된 바와 같은 이러한 약화된 아데노바이러스의 비교적 낮은 효율은 궁극적으로 이들의 잘못한 적용을 기본으로 하고 있다. 즉, 이러한 아데노바이러스 계는 바이러스 종양세포붕괴를 위한 분자 생물학적 요건이 본 명세서에 기재한 바와 같은 약화되거나 변형된 아데노바이러스를 사용하여, 바람직하게는 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스를 사용하여 주어질 경우 특히 고효율로 사용될 수 있다. AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB016, dl520 및 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 재조합 아데노바이러스와 같은 본 발명에 따라 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 아데노바이러스의 경우, 상기 요건은 그 세포가 세포 주기 독립적 YB-1의 핵내이동을 나타내는 종양에 의해 주어진다. 이러한 종류의 핵내 이동은 종양 그자체의 성질에 의해 유발될 수 있거나 또는 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 수단이나 본 발명의 시약에 의해 달성될 수 있다. 따라서 본 발명은 새로운 그룹의 종양 및 종양 질환을 규정하며 그 환자는 본 발명에 따른 바이러스, 바람직하게는 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스를 사용하는 것에 의해서 뿐만 아니라 종래 기술에 기재된 약화되거나 변형된 아데노바이러스를 사용하여 효과적으로 치료될 수 있다.

그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스 또는 종래 기술에 이미 공지된 본 발명에 따라 사용되는 아데노바이러스를 사용하여 또는 최초로 본 명세서에 기재된 아데노바이러스를 사용, 바람직하게는 Rb/E2f의 결합을 방해하지 않거나 또는 YB-1 핵-음성 세포에서 복제할 수 없거나 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 강하게 감소된 복제를 나타내고 및/또는 예컨대 바이러스 AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB016, dl520 및 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스의 경우, 결실된 암단백질, 특히 E1A를 갖거나 및/또는 나타내는 E1A 단백질에서 돌연변이 및 결실을 갖는 아데노바이러스를 사용하여 본 발명에 따라 치료될 수 있는 환자 그룹은 YB-1이 핵으로 이동하거나 그곳으로 유도 또는 이동되거나 또는 탈조절된 YB-1이 존재하는 특수한 조건을 적용하거나 실현하는 것에 의해 확실하게 되는 환자이다. 상기 그룹의 환자와 관련하여 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스의 사용은 바이러스 복제의 유도가 YB-1의 핵내 존재에 이어 YB-1의 E2-후기 프로모터로의 결합을 기본으로 한다는 발견을 기초로 하고 있다. 본 발명에 기재된 상기와 같은 발견으로 인하여, AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB016과 같은 아데노바이러스 및 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스는 YB-1 핵-양성인 세포 및/또는 본 발명의 의미내에서 탈조절된 방식으로 YB-1가 존재하는 세포에서 복제될 수 있다. 이들 아데노바이러스는 특히 세포가 치료할 각 질병의 생성에 관여되는 경우, 상기 특징을 갖는 세포를 포함하는 본 발명에 따른 질환 및 환자 그룹의 치료를 위해 사용될 수 있다. 이것은 세포주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 함유하거나 또는 본 발명의 의미에서 탈조절된 YB-1을 함유하는 종양의 본 발명에 따른 치료에서 AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB016 및 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스 및 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스의 성공의 기본이 된다. 본 발명에 따라 사용되는 것으로 기재된 바이러스를 사용하고 또 본 명세서에서 최초로 기재된 바이러스, 특히 아데노바이러스 및 그룹 I 및/또는 그룹 II 아데노바이러스를 사용하여 본 발명에 따라 치료될 수 있는 환자 그룹은 이하에 기재된 치료의 결과로 YB-1 핵-양성 및/또는 YB-1 핵-음성인 환자 및/또는 아데노바이러스를 투여하기 전에 각 바이러스를 동시에 적용하거나 아데노바이러스를 투여한 후에 치료의 의미에서 이하의 조치를 거치는 환자를 의미한다. 본 발명에서, YB-1 핵-양성 환자는 특히 세포 주기와 독립적인 다수의 종양 형성 세포에서 YB-1을 갖고 및/또는 그러한 세포에서 탈조절된 YB-1을 갖는 환자이다. 상기 조치의 하나는 본 명세서에 기재한 바와 같고 및/또는 종양 요법에서 이용되는 것과 같은 세포증식억제제를 투여하는 것이다. 조사는 특히 고에너지 방사선, 바람직하게는 방사활성 방사선, 바람직하게는 종양 요법에 사용되는 것을 이용한 조사를 의미한다. 다른 조치는 온열요법 및 온열요법의 적용이며, 바람직하게는 종양 요법에서 사용된 것과 같은 온열요법이다. 특히 바람직한 구체예로서, 온열요법은 국소적으로 적용된다. 결국, 다른 조치는 호르몬 치료, 특히 종양 요법에서 적용된 것과 같은 호르몬 치료이다. 호르몬 요법의 과정중, 항-에스테로겐 및/또는 항-안드로겐이 사용된다. 그와 관련하여, 타목시펜과 같은 항-에스테로겐은 특히 유방암의 치료에 사용되며 또 예컨대 플루타미드 또는 사이프로테론아세테이트와 같은 항-안드로겐은 특히 전립선암의 치료에 사용된다.

여기서 기재된 아데노바이러스는 종야의 치료에 사용될 수 있으며, 상기 종양은 일차 종양, 이차 종양, 삼차 종양 및 전이 종양을 포함하는 군으로부터 선택된다. 이와 관련하여, 종양은 하기 특징중의 하나를 나타내며, 즉 이들은 그 이유에 상관없이 세포주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 가지며, 및/또는 탈조절된 YB-1을 함유한다.

본 발명에서, 본 발명에 따른 아데노바이러스가 복제되거나 복제될 수 있는 세포를 포함하는 세포 및 종양은 본 명세서에 기재된 특징, 특히 세포 주기와 독립적으로 그 이유에 상관없이 핵내에 YB-1을 갖는 특징, 및/또는 탈조절된 YB-1을 갖는 특징 및 이들 세포 및 종양이 본 발명에 따른 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스를 사용하여 처리될 수 있는 특징 및 아데노바이러스가 이들을 치료하기 위한 의약제조를 위해 사용될 수 있는 특징중의 하나 또는 몇개를 갖고 있음으로써 아데노바이러스가 YB-1 코딩 핵산을 발현하는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 그룹 I 아데노바이러스 및 그룹 II 아데노바이러스가 복제될 수 있고 이들 아데노바이러스를 사용하여 치료되고 바람직하게는 용해될 수 있는 세포 및 종양에는 3가지 종류가 존재한다:

그룹 A: 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는 세포;

그룹 B: 핵내에 YB-1을 갖지 않고, 세포 주기와 독립적이지 않지만 탈조절된 YB-1을 포함하는 세포; 및

그룹 C: 핵내에 YB-1을 갖지 않고, 세포 주기와 독립적이지 않으며 탈조절된 YB-1을 포함하지 않는 세포.

그룹 A의 세포의 경우, 본 발명에 따른 아데노바이러스, 특히 부가적 YB-1을 발현하지 않는 그룹 I 아데노바이러스가 복제 또는 용해에 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 이러한 아데노바이러스, 특히 부가적 YB-1을 발현하는 그룹 I 아데노바이러스가 복제 및 용해에 사용될 수도 있다. 이것은 그룹 B에도 적용된다. 이들에 한정되는 것은 아니나, 그 이유는 E1B 단백질, 특히 E1B55K 단백질 및/또는 E4 단백질, 특히 E4orf6 단백질의 효과로 인하여, 핵내에서 YB-1의 존재 및 이들의 핵으로의 전이에 의해 효과적인 복제가 확실하게 된다. 아데노바이러스에 의해 부가적으로 발현된 YB-1은 상기 과정을 지지한다.

그룹 C의 경우, 바람직하게는 본 발명에 따른 아데노바이러스, 특히 그룹 I 아데노바이러스는 복제 또는 용균에 이용되어서 부가적으로 YB-1을 발현한다. 그 이유는 상기에 한정시키고자 하는 것은 아니나 상기 바이러스 복제 과정이 특정 세포 배경에서 활성이 아니어서 효과적인 복제가 생길 수 있는 것에 기인한 것으로 보인다. YB-1을 제공하거나 YB-1을 발현하는 것에 의해서, 효과적인 복제가 생길 수 있으며, 그에 의해 기본이 되는 메카니즘은 YB-1의 과발현이 Bargout [Bargout R.C. et al., Nature Medicine 1997, 3, 447-450] 및 Juerchott [Juerchott K. et al., JBC 2003, 278, 27988-27966]에 의해 기재된 바와 같이 YB-1의 핵내이동을 초래하는 것으로 보인다.

종양 형성 세포의 일부가 핵내에 YB-1을 본질적으로 함유하거나 핵으로의 유도 및 활성 도입 이후에 YB-1을 함유하거나 또는 본 발명의 의미내에서 탈조절된 YB-1을 포함하는 것은 본 발명에 속한다. 바람직하게는 약 5% 이상, 즉 6%, 7%, 8%의 종양 형성 세포는 YB-1 핵-양성 세포 또는 탈조절된 YB-1가 존재하는 세포이다. 유방암, 골육종, 난소암, 활액암 또는 폐암과 같은 다른 종양의 경우, 탈조절된 YB-1을 포함하거나 세포 주기와 독립적으로 YB-1의 핵내 이동을 나타내는 종양 세포의 비율은 약 30 내지 50% 일 수 있다 [Kohno K. et al., BioEssays 2003, 25, 691-698]. 이러한 종양은 바람직하게는 본 발명에 따른 아데노바이러스를 사용하여 치료할 수 있다. YB-1의 핵내 존재는 외부 스트레스 및 국소적으로 가해진 스트레스에 의해 유도될 수 있다. 이러한 유도는 조사, 특히 UV-조사, 본 명세서에 기재된 것 중에서 세포증식억제제의 적용, 및 온열요법을 통하여 생길 수 있다. 온열요법과 관련하여, 아주 특이적인 방식으로, 특히 국소적 방식으로 실시되며, 또한 YB-1의 특이적 핵으로의 이동이 유발될 수 있고 이 때문에 바람직하게는 국소적으로 한정되만 아데노바이러스의 복제 및 세포와 종양의 붕괴의 필요조건이 이루어지는 것이 중요하다(Stein U, Jurchott K, Walther W, Bergmann, S, Schlag PM, Royer HD. J Biol Chem. 2001, 276(30): 28562-9; Hu Z, Jin S, Scotto KW. J Biol. Chem. 2000 Jan 28; 275(4): 2979-85; Ohga T, Uchiumi T, Makino Y, Koike K, Wada M, Kuwano M, Kohno K. J Biol Chem. 1998, 273(11): 5997-6000).

본 발명의 의약은 환자들 및 환자 그룹에 투여되거나 또는 적합한 치료 전 또는 치료 후 또는 동시처리시 바람직하게는 각 종양 세포에서 YB-1의 이동이 유발되거나 또는 탈조절된 YB-1이 세포에서 생성되도록 디자인될 수 있다.

본 명세서에 개시된 기술적 특징을 기본으로 하여, 특별히 E1A를 적합하게 변형하는 것도 당분야의 기술에 속하며, 이러한 변형은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 아데노바이러스의 상이한 구체예를 생성하기 위하여 결실 또는 점 돌연변이의 발생을 포함할 수 있다.

상술한 바와 같이, 그룹 I 및/또는 그룹 II 아데노바이러스는 핵내에 YB-1을 갖는 세포 및 세포 계에서 복제될 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 상기 아데노바이러스가 복제될 수 있는지 또 그에 따라 종양 붕괴시킬 수 있는지에 대한 질문에 대해서는, Rb의 존재 또는 부재에 관한 세포의 상태, 즉 망막모세포종 서프레서 산물은 관련이 없다. 또한, 본 밤령에 따른 상기 아데노바이러스를 사용하기 위하여, 감염된 세포, 감염될 세포 또는 치료될 세포의 p53 상태를 고려할 필요는 없으며, 이는 본 명세서에 기재된 아데노바이러스 계를 YB-1 핵-양성 세포에서 사용하면, 즉 세포 상태와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는 세포, p53 상태 뿐만 아니라 Rb 상태는 본 명세서에 기재된 기술적 특징을 실시하기 위해 아데노바이러스의 복제에 아무런 영향을 주지 않기 때문이다.

트랜스액티베이팅 암유전자 및 암유전자 단백질, 특히 바람직하게는 그룹 II 아데노바이러스의 E1A는 독점적인 천연 아데노바이러스 프로모터의 제어하에 있거나 및/또는 종양 특이적 또는 조직 특이적 프로모터를 통하여 제어될 수 있다. 적합한 비-아데노바이러스 프로모터는 사이토메갈로바이러스 프로모터, RSV (육종 바이러스) 프로모터, 아데노바이러스-기제 프로모터 Va I 및 비-바이러스 YB-1 프로모털르 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다(Makino Y. et al., Nucleic Acids Res. 1996, 15, 1873-1878). 본 명세서의 요지와 관련하여 사용될 수 있는 프로모터는 텔로머라제 프로모터, 알파-페토단백질(AFP) 프로모터, 태아성암항원 프로모터 (CEA) (Cao, G., Kuriyama, S., Gao, J., Mitoro, A., Cui, L., Nakatani, T., Zhang, X., Kikukawa, M., Pan, X., Fuki, H., Qi, Z. Int. J. Cancer, 78, 242-247, 1998), L-플라스틴 프로모터 (Chung, I., Schwartz, PE., Crystal, RC., Pizzorno, G, Leavitt, J., Deisseroth, AB. Cancer Gene Therapy, 6, 99-106, 1999), 아르제닌 바소프레신 프로모터 (Coulson, JM, Staley, J., Woll, PJ. British J. Cancer, 80, 1935-1944, 1999), E2f 프로모터 (Tsukada et al., Cancer Res., 62, 3428-3477, 2002), 우로플라킨 II 프로모터 (Zhang et al., Cancer Res., 62, 3743-3750, 2002) 및 PSA 프로모터 (Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C. Goligthtly, D., Stewart, D., Lin, J., Philpps, S., Chiang, YL. Human Gene Therapy, 10, 1721-1733, 1999), 티로시나제 프로모터 (Nettelbeck, DM. Anti-Cancer Drugs, 14, 577-584, 2003), 시클로옥시게나제 2 프로모터 (Nettelbeck, DM., Rivera, AA, Davydova, J., Dieckmann, D., Yamamoto, M., Curiel, DT. Melanoma Res., 13, 287-292, 2003) 및 테트라사이클린과 같은 유도 계(Xu, XL., Mizuguchi, H., Mayumi, T., Hayakawa, T. Gene, 309, 145-151, 2003) 이다. 또한 독일 특허 출원 DE 101 50 984.7에 기재된 바와 같은 아데노바이러스의 YB-1 의존적 E2 후기 프로모터는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 프로모터이다.

텔로머라제 프로모터에 관해서는 그것이 인간 세포에서 아주 중요하다고 알려져 있다. 따라서, 텔로머라제 활성은 이 효소의 촉매적 서브유닛인 텔로머라제 역전사효소 유전자(hTERT)의 전사 제어를 통하여 조절된다. 텔로머라제의 발현은 인간 종양 세포의 85%에서 활성이다. 이와 대조적으로, 대부분의 정상 세포에서는 불활성이다. 그 예외가 병균 및 배아 조직이다(Braunstein, I. et al., Cancer Research, 61, 5529-5536, 2001; Majumdar, A. S. et al., Gene Therapy 8, 568-578, 2001). hTERT 프로모터의 자세한 연구에 의해 개시코돈 283 bp 및 82 bp로 부터 분리된 프로모터의 단편이 종양 세포에서 특수 발현에 충분함이 밝혀졌다(Braunstein I. et al.; Majumdar AS et al., 상동). 따라서, 상기 프로모터 및 그의 특정 단편은 유전자 및 전이유전자, 바람직하게는 본 명세서에 기재된 전이유전자중의 하나의 종양 세포에서 특수 발현에 적합하다. 이 프로모터는 변형된 암유전자, 바람직하게는 E1A 암유전자 단백질이 종양 세포에서만 발현되게 한다. 또한, 구체예로서, 이들 프로모터의 제어하의 아데노바이러스 벡터에서 전이유전자, 바람직하게는 E4orf6, E1B55kD, ADP 및 YB-1을 포함하는 군으로부터 선택되는 전이유전자의 발현도 고려할 수 있다. 트랜스액티베이팅 암유전자 단백질, 특히 E1A 단백질의 리딩 프레임은 상기 아데노바이러스 계의 1개 또는 몇개의 유전자 산물을 갖는 프레임인 것은 본 발명의 범위에 속한다. 그러나 트랜스액티베이팅 E1A 단백질의 리딩 프레임은 그로부터 독립적일 수 있다.

본 발명의 범위내에서, 특히 야생형 아데노바이러스에서 각 단백질의 발현 또는 발현 산물을 제어하는 프로모터와는 상이한 프로모터가 사용되는 경우, 상술한 바와 같은 다양한 프로모터가 본 발명에 따른 다양한 구체예의 아데노바이러스, 바람직하게는 그룹 I 아데노바이러스와 관련하여 사용될 수 있다. 상술한 프로모터는 본 발명의 의미에서 적합한 이종성 프로모터이다. 본 발명에 따른 아데노바이러스, 특히 그룹 I 아데노바이러스의 바람직한 구체예로서, 상기 정의된 바와 같은 그룹 A 및 B의 세포에 대하여 상기 아데노바이러스를 적용하면, E1B 단백질 및/또는 E4 단백질의 발현은 그러한 이종성 프로모터로 부터 개시되어 생기며, 바람직하지만 배타적이지 않게, E1A 단백질의 발현은 YB-1에 의해 제어되는 것을 고려할 수 있다. E1A 단백질의 발현은 상기 구체예 및 다른 구체예에서 아데노바이러스 E2-후기 프로모터와 같은 YB-1 제어성 프로모터의 제어하에 있다. 이것은 E1B 단백질 및/또는 E4 단백질이 발현 카세트에서 발현될 때에도 사실이다.

본 발명에 따른 아데노바이러스, 특히 그룹 I 아데노바이러스의 바람직한 구체예로서, 그룹 C의 세포와 관련하여 아데노바이러스를 적용할 때 상기 프로모터는 각기 독립적으로 종양 특이적, 기관-특이적 또는 조직 특이적 프로모터인 것으로 고려할 수 있다. 이와 관련하여, E1B 단백질, E4 단백질 및/또는 E1A 단백질의 발현을 제어하는 프로모터중의 적어도 하나가 특정 프로모터이면 충분하다. 이러한 종양, 기관 및 조직 특이성에 의하여, 본 발명에 따른 아데노바이러스의 복제는 각 종양, 기관 또는 조직의 세포에서만 생기고 또 그와 별도로 더 이상의 다른 조직이 아데노바이러스의 복제에 의해 예컨대 용해되는 것과 같은 손상을 받지 않게된다. 바람직하게는, 제2 및 보다 바람직하게는 모든 3개의 단백질은 종양 특이적, 기관 특이적 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 제어된다. 이러한 아데노바이러스를 사용하여 종양을 형성하지 않거나 종양으로 발전될 수 없지만, 바람직하지 않은 인자를 생성하거나 이러한 인자를 다량 생산하기 때문에, 의약적 이유와 같은 다른 이유로 인하여 파괴되거나 또는 생물, 바람직하게는 포유류 및 보다 바람직하게는 인간으로 부터 제거될 세포를 용해시킬 수 있다.

구체예로서, 용해를 위해 본 발명에 따라 개시된 아데노바이러스가 사용되는 세포는 내성이며, 바람직하게는 다약제 내성을 나타내는 것을 알 수 있다.

본 명세서에서 언급되고 치료할 종양과 환자에 대한 특징인 내성은 이하의 유전자에 의해 매개되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: MDR, MRP, 토포아이소머라제, BCL2, 글루타치온-2-트랜스퍼라제(GST), 프로테인 키나제 C (PKC). 세포증식억제제의 효과는 다른 것중에서 세포자살 유도를 기본으로 하고 있기 때문에, 세포자살-관련 유전자의 발현은 내성 생성에 중요한 역할을 하며 이하의 인자, 즉 Fas, BCL2 패밀리, HSP 70 및 EGFR 이 그와 관련된다 [Kim et al., Cancer Chemther. Pharmacol. 2002, 50, 343-352].

Levenson 등 [Levenson, V.V. et al., Cancer Res., 2000, 60, 5027-5030]은 YB-1의 발현은 비-내성 종양 세포에 비교하여 내성 종양 세포에서 현저하게 증가된다고 기재하였다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 내성은 바람직하게는 여기서 기재한 세포증식억제제에 대한 내성을 지칭한다. 다약제 내성은 바람직하게는 각 세포를 결정하는 마커로 사용될 수 있는 막 결합 트랜스포터 단백질 P 당단백질 및 이러한 마커 및 개별 환자 그룹을 나타내는 종양의 발현, 바람직하게는 과발현에 부수된다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어 내성은 P 당단백질을 통하여 매개된 전통적인 내성 뿐만 아니라 MRP에 의해 매개된 비전형적 내성 또는 기타 비-P-당단백질 매개된 내성으로 불리는 내성을 포함한다. YB-1의 발현과 상관있는 다른 마커는 토포아이소머라제 II 알파이다. 환자가 성공의 기대로 아데노바이러스를 사용하여 본 발명에 따라 치료될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 핵내에 있는 YB-1를 측정하는 대신 또는 측정하는 이외에 토포아이소머라제 II 알파가 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 원칙적으로 P 당단백질로 유사하게 사용될 수 있는 마커는 MRP이다. 결장암 세포 또는 결장암에 걸린 환자가 관련되는 한 다른 마커는 예컨대 시아보 케이. 등 (Shiabo K et al., Int. Cancer, 83, 732-737, 1999)에 의해 기재된 바와 같은 PCNA(증식성 세포 핵 항원) 이다. 마지막으로, 적어도 유방암 및 골육종 세포 분야에서, MDR(다약제 내성)의 발현은 상술한 의미에서 마커이다(Oda Y et al., Clin. Cancer Res., 4, 2273-2277, 1998). 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 가능성 있는 마커는 p73 이다 (Kamiya, M., Nakazatp, Y., J Neuroncology 59, 143-149 (2002); Stiewe et al., J. Biol. Chem., 278, 14230-14236, 2003).

YB-1을 본 발명에 사용될 수 있는 유방암의 진단 마커라 할 수 있다. 일차 종양에서 YB-1의 발현이 증가된 환자에서만, 외과수술 및 화학요법후에도 재발이 생긴다[Janz M. et al., Int. J. Cancer 2002, 97, 278-282].

의학적-임상적 의미에서 더 이상 치료가 불가능하고 종래 기술의 방법을 이용한 종양 질환의 치료가 더 이상 성공 가능성이 없을 때, 특히 세포증식억제제 및 조사의 이용이 더 이상 이성적으로 가능하지 않고 종양에 영향을 주거나 종양을 감소시키는 의미에서 더 이상 성공적으로 실시될 수 없는 경우에, 상기 환자들을 본 발명에 따라 본 명세서에 기재된 아데노바이러스를 사용하여 치료할 수 있는 것은 본 발명의 특별한 이점이다. 여기서 용어 종양은 일반적으로 세포핵내에, 바람직하게는 세포주기와 독립적으로 고유하게 YB-1을 함유하거나, 또는 본 명세서에 기재된 외인성 수단을 적용하는 것에 의해 YB-1을 함유하거나 및/또는 탈조절된 YB-1을 함유하는 종양 또는 암 질환을 의미한다.

또한, 본 명세서에 기재된 바이러스는 원칙적으로 종양의 치료에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이들 종양은 유방암, 난소암, 전립선암, 골육종, 교모세포종, 흑색종, 폐 및 결장암의 작은 세포암을 포함하는 군으로부터 선택된다. 다른 종양은 본 명세서에 기재된 바와 같이 내성인 종양, 바람직하게는 다약제내성인 종양, 특히 상술한 그룹의 종양이다. 특히 바람직한 종양은 유방암, 골암, 위암, 장암, 담낭암, 췌장암, 간암, 신장암, 뇌암, 난소암, 피부암, 피부 부속기 종양, 두경부암, 자궁암, 활막 종양, 후두암, 침샘암, 식도암, 설암 및 전립선암을 포함하는 군으로부터 선택된다. 이와 관련하여, 이들 종양은 본 명세서에 기재된 바와 같이 전체적으로 명백히 나타난 것이 바람직하다.

본 발명의 아데노바이러스, 바람직하게는 그룹 I 아데노바이러스 및 본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스, 바람직하게는 그룹 II 아데노바이러스.

본 명세서에 기재된 아데노바이러스, 특히 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스를 특히 전신투여용의 의약으로 사용하는 것은 아데노바이러스를 적절히 표적으로 하는 것에 의해 향상될 수 있다. 아데노바이러스에 의한 종양 세포의 감염은 다른 것 중에서도 콕사키바이러스(Coxackievirus)-아데노바이러스 수용체 CAR 및 분명한 인테그린의 존재에 어느 정도 좌우된다. 종양 세포에서 강하게 발현되자마자, 감염은 아주 낮은 역가(pfu/세포)로 가능하다. 소위 재조합 아데노바이러스의 리-타게팅에 도달하기 위하여 예컨대 섬유 마디 영역에 이질 서열을 삽입하는 것에 의해, 바이-특이적 항체를 사용하고, 아데노바이러스를 중합체로 코팅하며, 리간드를 Ad 섬유에 도입하고, 혈청형 5 마디 및 혈청형5 섬유 샤프트 및 마디를 혈청형 3 마디 및 Ad35 섬유 샤프트 및 마디로 치환하는 것에 의해 및 펜톤 염기의 변형에 의해 지금까지 다양한 전략을 시험하여 왔다 (Nicklin S.A. et al., Molecular Therapy 2001, 4, 534-542; Magnusson, M. K. et al., J. of Virology 2001, 75, 7280-7289; Barnett B. G. et al., Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1575, 1-14). 다른 구체예 및 특징의 본 발명의 다양한 요지와 관련하여본 발명에 다른 아데노바이러스 및 본 발명에 사용되는 아데노바이러스, 특히 그룹 I 아데노바이러스 및 그룹 II 아데노바이러스는 본 발명에 속한다.

다른 요지로서 본 발명은,

- 종양 조직의 샘플을 분석하는 단계, 및

- 세포주기와 독립적으로 핵내에 YB-1이 존재하는지 또는 세포가 탈조절된 YB-1을 함유하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는,

변형된 아데노바이러스, 즉 예컨대 AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB016와 같은 본 발명에 따라 사용되는 아데노바이러스 또는 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 바이러스 및/또는 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스를 사용하여 치료될 수 있는 환자를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

YB-1 대신 또는 YB-1 이외에, 상술한 마커의 존재도 평가될 수 있다.

종양 조직 또는 그의 일부가 핵내에, 바람직하게는 세포 주기와 독립적으로 YB-1을 포함하거나, 또는 탈조절된 YB-1을 포함하는 경우, 본 명세서에 기재된 아데노바이러스, 특히 그룹 I 아데노바이러스 및/또는 그룹 II 아데노바이러스는 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 구체예로서, 종양조직의 분석은 YB-1에 대한 항체, YB-1에 대한 아프타머, YB-1에 대한 스피겔머(spiegelmer) 뿐만 아니라 YB-1에 대한 안티칼린을 포함하는 군으로부터 선택되는 물질에 의하여 생긴다는 것을 예상할 수 있다. 원칙적으로, 동일 종류의 물질을 제조하여 각 마커 대신 사용할 수 있다. 항체, 특히 모노클로날 항체의 제조는 당업자에게 공지되어 있다. YB-1의 특정 검출을 위한 다른 물질 또는 마커는 표적 구조, 지금의 경우 YB-1 또는 상기 마커에 대하여 고 친화성으로 결합되는 펩티드이다. 종래 기술에서는 이러한 펩티드를 생성하기 위해 예컨대 파아지-디스플레이와 같은 방법이 공지되어 있다. 이러한 목적을 위하여, 개별 펩티드가 약 8 내지 20개 아미노산 길이를 갖는 펩티드 라이브러리로 부터 시작할 수 있으며 상기 라이브러리의 크기는 약 10² 내지 10¹⁸, 바람직하게는 10⁸ 내지 10¹⁵ 상이한 펩티드이다. 표적분자 결합 폴리펩티드의 특정 형태는 예컨대 독일 특허출원 DE 197 42 706에 기재된 바와 같은 소위 안티칼린이다.

YB-1 또는 본 명세서에 기재된 상응하는 마커에 특이적으로 결합될 수 있고 또 세포 핵내에 세포주기 독립적으로 YB-1이 존재하는 것을 검출하기 위한 다른 물질은 소위 아프타머, 즉 D-핵산이며, 이것은 RNA 또는 DNA를 기본으로 하고, 단일 가닥 또는 이중가닥으로 존재하며 또 표적 분자에 특이적으로 결합된다. 아프타머의 생성은 예컨대 유럽 특허 EP 0 533 838호에 기재되어 있다. 아프타머의 특정 구체예는 소위 아프타자임(aptazyme)이며, 이것은 예컨대 Piganeau, N. et al. (2000)에 의해 Angew. Chem. Int. Ed., 39, no. 29, 4369-4373 페이지에 기재되어 있다. 이들은 이들이 아프타머 잔기와는 별도로 리보자임 잔기를 포함하고 또 아프타머 잔기에 대한 표적 분자의 결합 또는 표적분자 결합의 방출시에 상기 리보자임 잔기가 촉매적으로 활성으로 되어 시그널 생성과 함께 핵산 기질을 분해하는 한 아프타머의 특정 구체예이다.

아프타머의 다른 형태는 소위 스피겔머, 즉 L-핵산으로 구성된 표적분자 결합 핵산이다. 이러한 스피겔머를 생성하는 방법은 예컨대 WO 98/08856에 기재되어 있다.

종양조직의 샘플은 천자(punctuation) 또는 수술에 의해 얻을 수 있다. YB-1이 세포 주기와 독립적으로 핵내에 존재하는지 여부를 평가하는 것은 현미경 수법 및/또는 면역조직분석법, 전형적으로 상술한 바와 같은 항체 또는 임의 물질을 사용하여 실시한다. YB-1이 핵내에 존재하는지 또 그 존재가 세포 주기와 독립적인지 검출하기 위한 다른 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대 YB-1의 존재는 YB-1에 대하여 염색된 조직 슬라이스를 주사할 때 용이하게 검출할 수 있다. 핵내에서 YB-1의 빈도는 핵내 이동이 세포 주기와 독립적인지를 나타내는 표시이다. 핵내에서 YB-1의 세포 주기 독립적 검출방법은 YB-1에 대하여 염색을 시키고 핵내에 YB-1이 존재하는지 여부를 평가하고 또 세포의 상을 결정한다. 그러나 이러한 YB-1의 검출은 YB-1에 대하여 상술한 물질을 사용하여도 실시될 수 있다. 상기 물질의 검출은 당업자에게 공지된 과정에 의해 실시될 수 있다. 이러한 물질은 YB-1에 대하여 특이적으로 만들어지고 또 분석될 샘플내의 다른 구조, 특히 다른 구조의 세포에는 결합하지 않기 때문에, 물질의 적합한 라벨링에 의해 및 YB-1에 대한 특이적 결합에 기인한 상기 물질의 존재 뿐만아니라 YB-1의 존재가 검출될 수 있고 평가될 수 있다. 상기 물질을 라벨링하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 샘플의 세포가 탈조절된 YB-1을 함유하는지 여부 및 그렇다면 샘플의 얼마나 많은 세포가 탈조절된 YB-1을 함유하는지를 결저하기 위해 동일한 수법이 이용될 수 있다. 탈조절된 YB-1은 비-탈조절된 YB-1과 비교하여 과발현을 나타내기 때문에, 참조용 샘플과 비교한 YB-1의 상대적 발현이 YB-1이 분석된 세포에서 조절제거되는지 여부를 결정하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명을 도면과 실시예를 이용하여 더욱 자세하게 설명하며, 본 발명의 신규 특징, 구체예 및 이점은 그로부터 알 수 있다.

도 1은 E1/E3-결실 아데노바이러스, 야생형 아데노바이러스 및 아데노바이러스 dl520인 AdE1/E3-마이너스 아데노바이러스 벡터로 지칭되는 아데노바이러스 벡터의 구조 디자인을 도시한다.

도 2는 p300, p107 및 p105의 결합에 대한 E1A 단백질의 결합 도메인을 도시한다.

도 3은 E1/E3-마이너스 Ad5로 칭하는 E1/E3-결실 아데노바이러스 Ad5, 및 dl520에 의해 감염된 후, 핵내에서 YB-1을 갖지 않는 U2OS 세포를 도시한다.

도 4는 E1/E3-마이너스 Ad5로 칭하는 E1/E3-결실 아데노바이러스 Ad5, 및 아데노바이러스 dl520에 의해 감염된 후, 핵내에서 YB-1을 함유하는 257RDB 세포를 도시한다.

도 5는 아데노바이러스 dl1119/1131에 의해 감염된 후의 257RDB 세포 및 U2OS 세포를 도시한다.

도 6은 YB-1이 다내성 세포 및 세포주 257RDB, 181 RDB, MCF-7Ad에서 세포 핵내에 존재하는 반면, YB-1이 US20S 및 HeLa 세포의 핵에는 존재하지 않는 것을 확인시켜 주는 EMSA 분석의 결과를 도시한다.

도 7은 야생형 아데노바이러스, 아데노바이러스 dl520 및 아데노바이러스 dl1119/1131의 E1A 단백질의 구조 디자인을 도시한다.

도 8은 부가적으로 발현된 바이러스 단백질의 존재하에서 아데노바이러스의 복제효율을 절대치로 표시한 막대 그래프를 도시한다.

도 9는 부가적으로 발현된 바이러스 단백질의 존재하에서 아데노바이러스의 복제효율의 증가를 나타내는 막대 그래프를 도시한다.

도 10은 다우노루비신을 투여하지 않고 또 40ng 다우노루비신/ml을 투여하여 크리스탈 바이올렛 염색 및 dl520을 사용하여 10 및 30 pfu/세포 및 대조용(K)으로 감염시킨 후 그곳에서 생장한 U2OS 세포를 갖는 웰을 도시한다.

도 11은 다우노루비신을 투여하지 않고 또 40ng 다우노루비신/ml을 투여하여 크리스탈 바이올렛 염색 및 dl520을 사용하여 10 및 30 pfu/세포 및 대조용(K)으로 감염시킨 후 그곳에서 생장한 HeLa 세포를 갖는 웰을 도시한다.

도 12는 PBS 및 dl520으로 각각 치료한 후 상이한 기원의 종양(RDB257 및 HeLa)의 시간함수에 대한 종양 부피의 다이아그램을 도시한다.

도 13은 PBS 및 5 x 10⁸ pfu dl520으로 각각 치료한 후의 RDB257 세포를 기본한 종양을 나타낸 희생된 마우스의 사진을 도시한다.

도 14는 dl520으로 감염된 후 RDB257 세포 및 HeLa 세포의 세포 추출액(피하적으로 생장한 종양의)의 서던 블럿 분석 결과를 도시한다.

도 15는 YB-1 핵-양성 종양 세포(257RDB 및 181RDB) 및 YB-1 핵-음성 종양 세포(HeLa, U2OS)에서 dl520 및 야생형 아데노바이러스의 복제 효율 및 입자 형성을 나타내는 막대 그래프를 도시한다.

도 16은 야생형 아데노바이러스 및 아데노바이러스 벡터 AdXVir03의 구조 디자인을 도시한다.

도 17은 아데노바이러스 벡터 AdXVir03/01의 구조 디자인을 도시한다.

도 18A 및 도 18B는 크리스탈 바이올렛 염색 및 Ad312 (20 pfu/세포), Xvir03 (5 pfu/세포) 및 대조용 (비-감염)으로 감염시킨 후 생장한 18RDB 세포(도 18A) 및 272RDB (도 18B)를 갖는 웰을 도시하며, 상기 크리스탈 바이올렛 염색은 감염된지 5일 후에 실시하였다.

도 19는 야생형 아데노바이러스 Ad5 및 아데노바이러스 Ad312에 의해 감염된 후 A549 세포 및 U2OS 세포에서 E2 유전자의 발현을 노던 블럿 분석한 결과를 도시한다.

도 20은 야생형 아데노바이러스 Ad5 및 아데노바이러스 델타24에 의해 감염된지 12 시간 및 24시간 후에 U2OS 세포에서 E2 유전자의 발현을 노던 블럿 분석한 결과를 도시한다.

도 21은 아데노바이러스 벡터 XvirPSJL1의 구조 디자인을 도시한다.

도 22는 아데노바이러스 벡터 XvirPSJL2의 구조 디자인을 도시한다.

도 23은 크리스탈 바이올렛 염색 및 상이한 pfu/세포를 이용하여 아데노바이러스 dl520으로 감염된 후 생장한 HeLa 세포를 갖는 웰을 도시한다.

도 24는 아데노바이러스 E2-후기 프로모터의 상이한 프로모터 단편의 사용시 U2OS 세포, HeLa 세포 및 257RDB 세포에서 루시페라제의 활성을 나타내는 막대 그래프를 도시한다.

도 25는 YB-1 발현 아데노바이러스 및 바이러스 Ad312를 사용하여 U2OS 세포를 감염시킨지 2일 및 5일후에 바이러스 입자의 갯수를 나타내는 막대 그래프를 도시하며, 그에 의해 세포내에 잔류하는 바이러스 입자(흑색으로 표시)와 방출된 세포외 바이러스 입자(수평적으로 줄무늬 표시됨) 사이의 구별이 행해진다.

실시예 1: 본 발명에 따라 사용되는 아데노바이러스에 의해 포함될 수 있는 E1A 변형의 유형

도 1은 아데노바이러스 벡터 AdE1/E3-마이너스, 즉 E1/E3-결실 아데노바이러스, 야생형 아데노바이러스 및 아데노바이러스 dl520의 구조 디자인을 도시한다.

아데노바이러스 AdE1/E3-마이너스는 기능적 E1A 또는 기능적 E1B 또는 E3을 암호화하는 영역을 갖지 않거나 또는 독성 대조용으로서 본 실험에 사용된다.

야생형 E1A 유전자는 E1A RNA의 스플라이싱을 통하여 생성된 총 5개 단백질 을 암호화한다. 다른 것 중에서, 2개의 상이한 단백질, 즉 289 아미노산 단백질 및 243 아미노산 단백질이 생성된다. dl520은 E1A 유전자의 CR3 스트레치에서 결실을 갖기 때문에 289 아미노산 단백질을 암호화하지 않으며, 13S 유전자 산물의 결핍을 초래한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 아데노바이러스 dl520을 당업자들에 의해 12S-E1A 바이러스라 칭한다. 종래기술에 공지된 아데노바이러스 dl347(Wong und Ziff, J. Virol., 68, 4910-4920, 1994)는 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있는 12S-E1A 바이러스이다.

13S-E1A mRNA에 의해 암호화되는 289 아미노산 단백질내에는 다양한 아데노바이러스 서브타입중에 보존되는 3개 영역이 존재한다. 이들을 CR1, CR2 및 CR3이라 칭한다. CR1 및 CR2는 모두 E1A 단백질(E1A 12S 및 E1A 13S)에, 즉 289 아미노산 및 243 아미노산 단백질에 존재하며, CR3 영역은 2개의 상술한 단백질중의 더 큰 것에만 존재한다.

CR3 영역은 바이러스 유전자, 특히 E1B, E2, E3 및 E4의 활성화에 요구된다. 더 작은, 즉 243 아미노산 단백질만을 포함하는 바이러스는 아주 약하게 바이러스 유전자를 트랜스액티베이팅시키며 핵내에 YB-1을 갖지 않는 세포에서는 아데노바이러스 복제를 촉진시키지 않는다. YB-1이 종양세포중에서만 핵에 존재하고 또 그곳에서만 검출될 수 있기 때문에, 상기 벡터는 종양 특이적 복제를 유도하기에 적합하다.

dl520에서 CR3의 결실로 인하여, 상기 아데노바이러스는 세포성 YB-1을 세포의 핵으로 이동(전좌라도고 함)시킬 수 없고 따라서 YB-1 핵-음성인 세포에서 복제 될 위치에 존재하지 않으며 또 본 발명에 따라 사용될 수 있는 바이러스이며, 이 바이러스는 본 발명에 따라 필요한 트랜스액티베이션을 포함한다.

실시예 2: 세포의 Rb 상태에 의존적인 아데노바이러스의 작용 모드

도 2는 p300, p107 및 p105의 결합에 대한 E1A 단백질의 결합 도메인을 도시한다. p300분만 아니라 p107은 세포성 결합 단백질이다. 종양 서프레서 단백질인 망막모세포종 단백질(pRb)의 결합은 CR1 및 CR2를 통하여 매개된다. 본 연구는 pRb 및 p107/p300이 전사 조절에 효과적인 세포 전사 인자 E2F와 조합됨을 나타낸다. 야생형 E1A 단백질은 E2F를 Rb에 결합시키는 것을 방해한다. 이렇게하여 방출된 E2F는 E2 후기 프로모터에 결합되고 그에 의해 아데노바이러스 복제를 유발한다.

E1A 암단백질에서 특정 결실은 이하에 나타낸 바와 같이 Rb-음성 세포에서 주로 복제될 수 있고 본 발명에 따라 사용될 수 있는 재조합 아데노바이러스 벡터를 초래할 수 있다는 것은 종래기술로 부터 공지되어 있다. 예컨대, 아데노바이러스 벡터 dl922-947은 CR2 영역(아미노산 위치 122-129)에서 결실을 포함하며 또 벡터 CB016은 CR1 영역(아미노산 위치 27-80) 및 CR2 영역(아미노산 위치 122-129)에서 결실을 갖는다. 벡터 E1Adl01/07은 CR2 영역(아미노산 위치 111-123)에서 결실을 포함한다. 부가적으로, N-말단(아미노산 위치 4-25)에서 부가적 결실로 인하여, 단백질 p300에 결합되지 않는다. 아데노바이러스 벡터 AdΔ24는 CR2 영역(아미노산 위치 120-127)에서 결실을 포함한다. 특허 EP 0 931 830에 기재된 아데노바이 러스 벡터는 CR1 영역 및 CR2 영역에서 결실을 포함한다.

E2F/RB의 결합 메카니즘 및 E1A를 통하여 매개된 E2F의 방출은 본 발명의 기초가 되는 메카니즘과는 기본적으로 상이하다. 종래기술에서 추정될 수 있는 것과는 다르게, Rb 단백질로 부터 E2F가 방출되는 것이 필수적인 것이 아니라, 바이러스 복제에 중요한 것은 인간 전사인자 YB-1의 핵내 이동이다. 이러한 전사인자는 보통 세포에서는 대부분의 세포 주기 동안 세포질에 존재한다. 아데노바이러스에 의해 감염된 후, 특정 환경하에서 핵으로 도입되거나 또는 유방암, 난소암, 전립선암, 골육종, 교모세포종, 흑색종, 작은 세포 폐암 및 결장암을 비롯한 분명한 종양 질환과 같은 분명한 세포 계내의 핵에 존재한다.

실시예 3: U2OS 세포의 감염

웰당 100,000개 U2OS 세포를 플레이팅하였다. 그 다음 날, 세포를 도 3에 도시된 바와 같은 다양한 아데노바이러스에 의해 감염시켰다. 이 감염은 37℃의 500 μl 무혈청 DMEM 배지에서 1시간 동안 실시하였다. 이어, 감염 배지를 제거하고 2 ml 완전 배지(10% FCS/DMEM)로 치환시켰다. 크리스탈 바이올렛 염색을 이용하여 3일 후 분석을 실시하였다.

도 3으로부터 알 수 있듯이, 핵내에 YB-1을 갖지 않는 U2OS 세포는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 2개의 상이한 아데노바이러스, 즉 E1/E3-결실 아데노바이러스(이후 E1/E3-마이너스로 칭함) 및 아데노바이러스 dl520에 의해 감염된 후 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 도시한 바와 같이 용해를 나타내지 않는다. 이와 관 련하여, 첫째 배지를 제거한다. 이어, 세포에 크리스탈 바이올렛(50% ETOH, 3% 포름알데히드, 5% 아세트산, 1% 크리스탈 바이올렛)을 겹치게 덮고 실온에서 5 내지 10분간 배양하였다. 이어, 6개 웰을 갖는 플레이트는 물을 사용하여 완전히 헹구고 실온에서 건조시켰다.

이것은 본 발명에 따라 사용되는 바이러스를 유발하고 감염된 세포를 용해시키기 위해 YB-1의 존재가 필요하다는 본 발명의 발견을 확인시켜 준다.

실시예 4: 257RDB 세포의 감염

웰당 100,000개 257RDB 세포를 플레이팅하였다. 그 다음 날, 세포를 도 4에 도시한 바와 같은 다양한 아데노바이러스에 의해 감염시켰다. 이 감염은 37℃의 500 μl 무혈청 DMEM 배지에서 1시간 동안 실시하였다. 이어, 감염 배지를 제거하고 2 ml 완전 배지(10% FCS/DMEM)로 치환시켰다. 크리스탈 바이올렛 염색을 이용하여 3일 후 분석을 실시하였다.

상기 실험의 결과는 도 4에 도시한다. E1/E3-마이너스 Ad5로도 지칭되는 E1/E3-결핍된 아데노바이러스는 핵내에 YB-1을 갖는 257RDB 세포의 감염시 낮은 MOI(pfu/세포)에서도 용해를 나타내지 않았다. 이와 대조적으로, 실시예 3에 도시한 바와 같은 dl520은 YB-1 핵-음성 세포에서 복제되지 않으며 그와 동시에 본 발명에 따른 암유전자 단백질을 트랜스액티베이팅하기 위한 E1A를 암호화하여 세포당 40 pfu의 MOI(감염중복도)에서 실질적으로 완전한 용해를 초래하고 세포당 10 pfu의 MOI에서 여전히 우세한 용해를 초래한다. dl520 및 dl1119/1131 또는 AdXvir03 으로 기재된 그와 유사한 바이러스는 이들의 임상적 용도를 정당화하는 E1-결실 또는 E1/E3-결실 아데노바이러스와 비교하여 약 1 매그니튜드(팩터 10) 정도 감소된 MOI를 필요로 한다.

도 7에 도시한 바와 같이, dl520의 단백질 E1A는 그의 CR3 영역이 결실되어 본 발명에 따른 용도에 필요한 트랜스액티베이션과 YB-1 핵-양성 세포에서 복제를 초래한다.

실시예 5: dl1119/1131을 사용한 257RDB 및 U2OS 세포의 감염

도 5에 도시된 바와 같이, E1A 단백질의 아미노산 4-138 및 그를 암호화하는 핵산이 결실되고, 아미노산 218 이후에 중지코돈을 더 포함하는 아데노바이러스 dl1119/1131을 사용하여 YB-1 핵-음성 U2OS 세포를 감염시키면, 세포당 20 pfu의 MOI에서는 용해가 전혀 없으며, 따라서 발현된 절단 E1A 단백질은 완전한 E1A 단백질의 CR3 영역을 포함한다. 음성 대조용으로서, 비-감염 세포층을 사용하였다.

이와 대조적으로, 핵내에 YB-1을 함유하는, 즉 YB-1 핵-양성인 257RDB와 같은 세포 계중 아데노바이러스 dl1119/1131의 영향하에서 세포당 20 pfu의 MOI에서 세포층의 완전한 용해가 있었다. 그러므로 이 실시예는 도 7에 도시된 바와 같이 CR3 영역만을 포함하고 또 CR1 영역 및 CR2 영역을 갖지 않는 변형된 E1A 암유전자 단백질이 본 발명에 따른 아데노바이러스의 복제에 요구되는 YB-1 핵-양성 세포에서 필요한 트랜스액티베이션을 제공하며, 그에 의해 바이러스 복제가 초래됨을 보여주는 또 다른 증거이다. 아데노바이러스 dl1119/1131은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 아데노바이러스이다. 본 발명에서, CR3 영역에 관해서는 dl1119/1131과 유사하게 디자인되지만 CR1 영역 및/또는 CR2 영역을 갖는 바이러스가 사용될 수 있다.

실시예 6: 다약제 내성 세포에서 핵 YB-1의 검출

본 실시예는 핵 YB-1이 mdrl 프로모터(영어. 다약제 내성 프로모터)내의 Y-박스(CAAT 서열)에 대하여 전사인자로서 결합되어야하는 것을 기본적으로 고려한 것이다. 이를 검출하기 위하여, 소위 EMSA 분석(전기영동적 이동성 시프트 에세이)을 실시하였다. 이와 관련하여, 핵 단백질을 분리한 다음 1-10 ㎍ 단백질을 짧은 DNA 단편(올리고)와 함께 37℃에서 배양하였다. 핵내 YB-1을 결정하기 위하여, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드가 사용되었다: U2O3 (위치 -86 내지 -67)에 대조적인 mdrl 프로모터: TGAGGCTGATTGGCTGGGCA (X-박스는 밑줄로 표시됨).

상기 DNA 단편은 그 전에 ³²P에 의해 5' 말단에서 방사능으로 라벨링되었다. 이어, 천연 폴리아크릴 아미드 겔에서 분리를 실시하였다. 단백질 YB-1이 상기 올리고뉴클레오티드중의 서열에 결합되는 경우, 이것은 비-결합 올리고뉴클레오티드가 겔에서는 결합된 올리고뉴클레오티드에 비하여 더 빠르게 이동하기 때문에 검출될 수 있다(Holm, P.S. et al., JBC 277, 10427-10434, 2002; Bargou, R. C. et al., Nature Medicine 3, 447-450, 1997).

도 6에 도시한 바와 같이, YB-1은 세포주 U2OS 및 HeLa 세포와 대조적으로 다약제 내성 세포 257RDB, 181RDB 및 MCF-7Ad 세포의 핵에 존재한다는 것을 EMSA 분석에 의해 알 수 있었다.

실시예 4 및 5에 나타낸 결과는 아데노바이러스 dl520 및 dl1119/1131이 U205와 대조적으로 257RDB와 같은 YB-1 핵-양성 세포에서 복제되어 그의 용해를 유도한다는 것을 확인시켜준다. 이것은 또한 본 발명에 따른 아데노바이러스의 사용에 관한 발견도 확인시켜 준다. 부가적으로, 상기 결과는 야생형 아데노바이러스와 비교하여, 변형되거나 결실된 E1A 유전자 산물을 통하여 YB-1 핵-양성 세포에서 바이러스 유전자를 약하게 트랜스액티베이트시키면 핵내에 YB-1의 존재하에서 성공적인 복제 및 그러한 세포, 예컨대 다약제 내성 세포의 용해를 초래하며, 따라서 이러한 종양의 용해에 사용될 수 있음을 확인시켜 준다.

실시예 7: E1-마이너스 아데노바이러스의 복제 효율의 증가

이 실시예는 초기 바이러스 유전자 E1B-55K 및 E4orf6이 플라스미드 pE4orf6과의 형질감염 및 E1/E3-결실된 아데노바이러스 Ad-55K에 의한 감염을 통하여 치환될 수 있음을 보여준다. Ad-55K는 E1/E3 결실된 바이러스이며, 그에 의해 E1B-55K는 E1에 클로닝되며 CMV의 제어하에 있다. AdYB-1, 즉 YB-1을 발현하는 아데노바이러스가 상기 초기 유전자를 발현하지 않고 또 본 발명자는 핵내에 YB-1을 함유하는 복제 계에서 상기 초기 유전자의 치환이 복제 효율과 입자 형성 효율을 Ad5형의 야생형 아데노바이러스중의 하나에 필적할 정도로 증가시킬 수 있다는 것을 인식한 사실에 관련하여 상기 치환은 필요하다.

다음을 실시하였다:

각 10⁵ U2OS 세포를 리포펙타민을 사용하여 플라스미드 pE4orf6으로 형질감염시켰다. 상기 플라스미드 pE4orf6은 CMV 제어하에서 초기 바이러스 유전자 E4orf6을 암호화하는 DNA 서열을 갖는다.

플라스미드 pE4orf6을 사용하여 24시간 동안 형질감염시킨 후 세포를 YB-1 발현 E1/E3-결실된 아데노바이러스 AdYB-1 (50 pfu/세포) 및 E1/E3-결실된 E1B-55K 아데노바이러스 Ad-55K (50 pfu/세포)와 형질감염시켰다. Ad-55K는 CMV 제어하에서 바이러스 유전자 E1B-55K를 전이유전자로서 갖는 E1/E3-결실된 바이러스이다.

이어, 감염된지 5일 후(=감염후) 배지(2ml)로 부터 세포를 제거하였다. 분리된 세포로 부터 바이러스 입자의 방출은 3회의 냉동과 해동을 교대하여 (해동/냉동) 실시하였다. 이어, 생성된 감염성 입자(ml당 플라크 형성 유닛 (pfu/ml))를 측정하기 위하여 293개 세포상에서 플라크 에세이를 실시하였다. 그 결과를 도 8 및 도 9에 도시하였다. 도 8은 절대치로 나타낸 플라크 에세이의 결과를 도시한다. AdYB-1만에 의한 감염과 비교하여 가장 중요한 차이는 플라스미드 pE4orf6에 의한 형질감염과 2개의 바이러스 AdYB-1 및 Ad-55K에 의한 공동감염에 의해 나타난 것이다. 도 9는 도 8의 결과를 도시하며, 복제효율의 증가는 AdYB-1에 대해 측정된 복제의 배수로서 표시된다. 플라스미드 pE4orf6에 의해 감염된 다음 AdYB-1 및 E1B-55K (Ad-55K)에 의해 감염된 세포는 25배 이상 pfu/ml까지 생산하였다.

이들 결과를 기초로 하여, E1B-55K 및 E4orf6의 치환은 E1/E3-결실 아데노바 이러스 AdYB-1에 의해 감염된 후 형성된 바이러스 개수(pfu/ml)를 25배 까지의 팩터로 증가시킨다고 결론지을 수 있다. 플라크 형성 유닛(pfu)의 생산에 대한 E1B-55K 및 E4orf6의 첨가제 효과는 2개의 유전자 산물 각각의 효과와 비교하여 훨씬 더 높다.

EGFP를 발현하는 1개 플라스미드를 사용한 대조 실험은 선택된 실험 방법에서 세포의 10%만이 성공적으로 플라스미드 pE4orf6에 의해 형질감염되었다는 것을 분명히 나타내었다. E1B-55K 및 E4orf6을 발현하는 세포에서 형성된 입자의 수는 인간의 아데노바이러스 유형 5(야생형)중의 하나에 필적한다. 이것은 E4orf6 및 E1B-55K의 발현이 YB-1의 핵내 존재와 조합되어 특히 E1A-결실된 아데노바이러스의 아데노바이러스 복제 및 입자 형성을 제공하며, 이는 야생형 Ad5중의 하나에 필적한다는 본 발명의 발견을 확인시켜 준다.

실시예 8: YB-1 핵-음성 세포에서 복제될 수 없고, 세포증식억제제 투여시 YB-1 핵-양성 세포에서 복제될 수 없는 아데노바이러스의 복제 증가

상이한 세포증식억제제의 부가가 인간의 전사인자 YB-1의 핵내 이동을 유발한다는 것은 종래 기술에 공지되어 있다. 본 발명자에 의해 밝혀진 바와 같이, 핵내에 존재하는 YB-1은 아데노바이러스 E2-후기 프로모터의 활성화를 통하여 아데노바이러스 복제를 제어한다. 양쪽 효과의 조합은 특정 종양 붕괴를 제공하기 위해 이용될 수 있다.

종양세포 붕괴 에세이의 실시에 있어서, 이하의 과정을 실시하였다: 200,000 개 세포(HeLa 및 U2OS)를 6개 웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 그 다음날 40 ng/ml (최종 농도)의 다우노루비신을 부가하였다. 배양한지 3시간 후 세포를 10 및 30 pfu dl520/세포으로 감염시켰다. 이어, 상기 세포를 세포증식억제제를 갖지 않는 배지에서 배양하였다. 3 내지 5일 후, 크리스탈 바이올렛을 사용하여 세포를 염색시켰다.

도 10 및 도 11로 부터 알 수 있듯이, 다우노루비신의 부가는 YB-1의 핵내 이동을 통하여 dl520의 복제를 유발한다. 따라서, dl520은 다우노루비신 단독을 사용한 경우와 비교하여 세포증식억제제 다우노루비신과의 조합시 더 큰 종양붕괴 효과를 낸다.

실시예 9: dl520에 의한 생체내에서 종양 붕괴

본 생체내 연구에서 사용되는 HeLa (YB-1 핵-음성) 및 257RDB (YB-1 핵-양성) 세포를 멸균 세포 배양 조건하에서 팽창시켰다. 피하 종양을 생성하기 위하여 상기 세포를 마우스(CD1NuNu 균주)에 주입하기 전에, 상기 세포는 트립신처리에 의해 수집하여 DMEM 배지(10% FCS)에 용해시키고 계수하고 PBS를 사용하여 1회 세척하였다. 이어, 세포를 원심분리하고, PBS 처리하고 상기 세포를 소망하는 세포수를 갖도록 신선한 PBS에 분배시킨다. 본 연구에서 피하 주입될 세포수는 양쪽 세포주에 대하여 5 x 10⁶ 세포이었다. 동물의 한 측면에 피하 주사하고, 그에 의해 HeLa 세포는 우측에 주사되고 257DBR 세포는 분명한 대조를 위하여 좌측에 주사되었다. 종양의 생장은 1주에 두번씩 제어하며 종양의 길이와 폭을 버니어 캘리퍼스를 이용하여 측정하였다. 이를 기본으로 하여 이하의 수학식을 따라 종양 부피를 산출하였다:

3/4Π * a/2^* (b/2)²

a = 길이, b = 폭

종양이 부피 200 내지 520 mm³에 도달하면, 바이러스 및 음성 대조용인 PBS를 각각 종양내에 투여하였다. 주입된 부피는 동일하고 각각 50 ㎕ 이었다. 이것을 3일 연속하여 반복하였다. 사용된 바이러스의 전체 투여량은 5 x 10⁸ pfu 이었다. 이어, 종양 생장을 1주에 2회 계속 기록하고 부피를 산출하였다. 이 연구의 마지막에 마우스를 죽이고 추가의 분석을 위해 종양을 제거하였다.

그 결과를 도 12 및 도 13에 도시한다.

도 12는 시간과 다양한 치료 방법의 함수로 종양 부피를 나타낸 다이아그램을 도시한다. 종양이 RDB257에 의해 형성된 경우, PBS 주사시 약 438 mm³ 내지 1466 mm³의 현저한 종양 생장이 있었다. 본 발명에 따라 사용된 벡터 dl520의 영향하에서, 종양 생장은 현저히 감소되었다. 평균 종양 크기 344 mm³으로 부터 출발해서, 종양 크기는 21% 정도로 증가해서 전체 543 mm³ 로 되었다.

본 실시예에서, HeLa 세포로 구성된 종양은 대조용으로 사용되며 이것은 PBS 투여시, PBS 투여시의 RDB257 기제 종양과 유사하게 나타내었다. 그러나 HeLa 세포를 기본으로 하며 dl520으로 처리된 종양은 311 mm³에서 1954 mm³ 까지 급격한 종양 생장 증가를 나타내었다.

도 13은 RDB257을 사용하여 생장한 종양을 갖는 희생된 누드 마우스의 사진을 도시한다. 본 발명에 따라 아데노바이러스 dl520을 투여한 후 현저한 종양 감소가 생긴다는 것을 분명히 알 수 있다. 이 경우, 종양 부피의 감소도 있었다(바이러스 dl520을 투여한 지 하루 후: 515 mm³; 바이러스 dl520을 투여한 지 30일 후: 350 mm³).

실시예 10: 종양 DNA의 서던 블럿

실시예 9에서 생긴 종양의 중앙부로 부터 취한 종양 샘플로 부터 DNA를 추출하였다. 분리를 위하여 Qiagen의 Dneasy Tissue Kit를 사용하였다. 제조자의 지시에 따라서 DNA 분리를 실시하였다. 그에 따라서, DNA를 알칼리성 용해를 통하여 세포로 부터 방출시켰다. 이어, 분리된 DNA는 칼럼상에서 정제시켰다. 이어, 분리된 DNA의 농도는 260 nm에서 광도측정법으로 측정하였다. 10 유닛의 제한효소 Kpn I에 의해 분해된 2㎍의 DNA 샘플을 사용하여 분석을 실시하였다. 이어, 0.8% 아가로오스 겔에서 샘플의 전기영동 분리를 실시하였다. 이어, DNA를 나일론 막상에 블러팅하였다(Schleicher & Schuell의 계에 따라 실시). 막에 블러팅된 DNA를 특정의 1501 bp DNA 프로브와 혼성화시켰다. 이 1501 bp DNA 프로브는 E2A 암호화 Ad5 서 열내에서 3369 bp Kpn I 단편과 특이적으로 결합한다. 이 프로브는 그 전에 PCR에 의해 제조(프라이머: 5'-GTC GGA GAT CAG ATC CGC GT (서열 2), 5'-GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT (서열 3))하였고 ³²P를 사용하여 방사능으로 라벨링하였다. 이어, 상기 막을 세척하고 필름에 노출시켰다.

종양 DNA의 서던 블럿의 결과를 도 14에 나타낸다. 이 분석은 레인 3, 4 및 5에 나타낸 바와 같이, dl520만이 시험관중의 내성 세포 RDB257에서 복제됨을 확인시켜 준다. 레인 1은 양성 대조용 Ad-5d로 나타나고, 레인 6, 7 및 8은 dl520으로 감염된 HeLa 세포로 부터의 DNA를 나타낸다. HeLa 세포는 YB-1 핵 양성이 아니기 때문에, 바이러스 dl520은 복제되지 않으며 그에 따라서 E2A 서열은 검출될 수 없었다.

dl520으로 얻은 다른 결과는 도 15에 도시되어 있다. 플라크 에세이를 기본으로 하여, dl520 및 야생형 아데노바이러스에 의해 감염시킨 후 플라크 형성(pfu/ml)을 조사하였다.

다양한 YB-1 핵-양성 (257RDB 및 181RDB) 종양 세포 및 YB-1 핵-음성 종양 세포를 dl520 및 야생형 아데노바이러스에 의해 감염시켰다.

이하의 과정을 실시하였다.

L15 배지(내성 세포) 및 10% FCS를 갖는 DMEM(비-내성 세포)중의 100,000 내지 200,000개 세포를 6개 웰을 갖는 플레이트(6웰 플레이트)에 플레이팅하였다. 24시간 후 dl520 및 야생형 아데노바이러스(10 pfu/세포)에 의한 감염을 실시하였다. 감염된지 3일 후(후 감염), 냉동 및 해동이 교대되는 과정을 3회 반복하여 세포 현탁액(3ml)으로 부터 바이러스 입자를 방출시켰다. 이어, 형성된 감염성 입자(ml당 플라크 형성 유닛 (pfu/ml))를 측정하기 위하여 293개 세포상에서 플라크 에세이를 실시하였다. 그 결과를 도 15에 도시한다. 플라크 에세이의 결과는 dl520이 야생형 아데노바이러스와 유사하게 YB-1 핵-양성 세포(257RDB 및 181RDB)에서 복제됨을 보여준다. 본 발명에 따라 본 명세서에 기재된 아데노바이러스를 사용하면 야생형 아데노바이러스중의 하나와 유사한 복제 효율이 관측될 수 있다.

실시예 11: 아데노바이러스 벡터 Xvir03의 구조 디자인

도 16은 아데노바이러스 벡터 Xvir03의 구조 디자인을 도시한다. 아데노바이러스 Xvir03은 소위 E1/E3-결실 아데노바이러스이다. 이것은 아데노바이러스 복제에 작용하는 E1A, E1B 및 E3 단백질이 제조되지 않는 것을 의미한다. E1 영역의 결실은 342-3528에 걸쳐있고; E3 영역의 결실은 아미노산 위치 27865-30995에 걸쳐 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "E1-결실 바이러스"는 E1이 더 이상 기능적으로 활성이 아닌 바이러스를 의미한다. 이것은 대부분 완전한 핵산 및 아미노산 서열에 의한 불활성화에 의해 달성될 수 있지만, 다양한 크기를 갖는 E1 영역 암호화 단백질의 결실을 의미할 수도 있다. E1A 및 E1B 단백질 및 그를 암호화하는 핵산의 결핍으로 인하여, E4orf6과 같은 E4 영역은 아주 약하게 발현되거나(야생형 아데노바이러스에 비하여 약 1-5%) 또는 전혀 발현되지 않는다. 바이러스 유전자 E1B55k 및 E4orf6은 Xvir03에 도입된 이종성 CMV 프로모터(클론테크 제조: 플라스미드 pShuttle)에 의하여 E1 영역에서 발현된다. CMV 프로모터 대신, 본 명세서에 기재된 바와 같이 프로모터 각각이 E1A의 발현과 관련하여 사용될 수 있다. 유전자의 오픈 리딩 프레임은 소위 IRES 서열(영어. 내부 리보솜 입장 부위)에 의해 서로 연결된다(Pelletier, J. and Sonenberg, N. Nature, 1988, 334, 320-325). 이 요소(Novagen; pCITE)는 1개의 mRNA로 부터 2개 단백질의 발현을 제공한다.

벡터는 다음과 같이 제조하였다:

플라스미드 E1B55k-pShuttle은 엠. 더블슈타인(마르부그크 대학)으로 부터 얻은 pCGNE1B로 부터의 E1B55k의 오픈 리딩 프레임을 XbaI 및 BrfI와 함께 클론테크사로 부터 얻은 pShuttle 벡터에 클로닝하는 것에 의해 창제하였다. 이어, pShuttle중의 E1B55k를 ApaI에 의해 선형화시키고 말단을 무딘말단으로 만들고 NheI으로 절단하였다.

두번째 벡터로서, PCR 산물로서 IRES 요소 뒤에 pcDNA3.1(+)(인비트로겐 제조)를 TA 클로닝에 의해 주형으로서 노바겐 캄패니의 pCITE-4a(+)와 함께 EcoRV 분해 부위에 클로닝하고, 플라스미드 pCMV-E4orf6(엠. 더블슈타인, 마르부르크 대학)으로부터의 E4orf6은 BamHI = IRES-E4orf6-pcDN3.1(+)에 의해 클로닝하였다. pcDNA3.1(+)중의 IRES-E4orf6은 NotI에 의해 선형화시키고, 말단을 무딘 말단으로 만든 다음 단편 IREs-E4orf6을 NheI으로 절단하였다. 단편 IRES-E4orf6을 오픈 벡터 E1B55k-pShuttle (무딘, NheI)에 연결시켰다. 상기 카세트는 E1B55k-IREs-E4orf6-pShuttle로 부터, I-Ceu I 및 PI-SceI를 갖는 ΔE1, ΔE3 아데노-X-플라스미드(클론테크 제조)에 CMV 프로모터 및 소 생장 호르몬(BGH)-폴리A와 함께 클로 닝하고 이를 AdcmvE1B/IRES/E4orf6이라 칭하였다. 이어, 제조자의 지시(클론테크)에 따라서 아데노바이러스를 제조하였다. PacI에 의해 선형화되었고 발현요소 CMV-E1B55k-IRES-E4orf6-BGH 폴리 A를 갖는 아데노바이러스를 HEK293 세포에 형질전환시키고 형질감염된지 11일 후 반복되는 냉동-해동 주기를 통하여 아데노바이러스를 방출시키기 위하여 제거할 세포를 배지와 함께 제거하였다.

상기 기재한 벡터는 원칙적으로 본 발명에 따라 사용되는 것으로 기재된 다른 바이러스로도 적합하다. 특히 상술한 벡터는 YB-1 핵-양성 세포에서 뿐만 아니라 YB-1이 탈조절된 세포, 즉 정상 세포 및 비-종양 세포와 비교하여 과발현되는 세포에서 복제 및 용해 유도에 적합하다. 상기 벡터의 용도는 본 발명에 따라 사용되는 것으로 기재된 다른 아데노바이러스 및 본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 아데노바이러스와 관련하여 기재된 질환 및 환자 그룹 또는 환자 집단에 특히 적용된다.

실시예 12: 아데노바이러스 벡터 Xvir03/01의 구조 디자인

도 17로 부터 알 수 있듯이, Xvir03/01은 Xvir03의 더 발전된 형태이다. 본 명세서에 기재된 유전자 및 전이유전자와 같은 치료적 유전자는 E3 영역에 클로닝할 수 있다. 또한, Xvir03의 발현 카세트로 부터 E4orf6과 상동 재조합되는 것을 방지하기 위하여 E4 영역에 결실을 도입하였다. 이것은 더 큰 전이유전자가 상기 구조물에 클로닝될 수 있도록 한다. 결실된 E3 영역은 카세트를 도입하기 위한 SacI, NdeI 및 NheI 제한 부위를 함유하며, 여기에 예컨대 치료적 전이유전자가 클 로닝될 수 있다.

치료적 유전자를 E3 영역에 클로닝하고 또 E4 영역에 결실을 제조하기 위한 플라스미드의 제조

클론테크가 제조한 pAdenoX-Plasmid는 야생형 아데노바이러스에는 존재하지 않는 3' ITR 영역 뒤에 SfuI에 대한 제한부위를 갖는다. E3-E4 영역은 SpeI (위치 23644) 및 SfuI을 이용하여 pAdenoX (클론테크)로 부터 얻었고 pcDNA3.1(+) (Invitrogen) = pcDNA3.1-E3Δ27865-30995-E4에 전달하였다. E4ORF6의 대부분, 즉 33241-33875를 PstI에 의해 제거하였다 = pcDNA3.1-E3Δ27865-30995, E4Δ33241-33875. Xvir03을 더 개발하기 위하여, pcDNA3.1-E3Δ27865-30995, E4Δ33241-33875로 부터 얻은 결실 E3/E4 영역을 SfuI 및 SpeI에 의해 플라스미드 pAdenoX = pAdenoX E3Δ27865-30995, E4Δ33241-33875에 클로닝하였다.

Xvir03에서 기재한 바와 같이 발현 카세트를 I-Ceu I 및 PI-SceI를 이용하여 E1B55k-IRES-E4orf6-pShuttle로 부터 CMV 프로모터 및 소 생장 호르몬(BGH)-폴리 A와 함께 pAdenoX E3Δ27865-30995, E4Δ33241-33875에 클로닝하고 이것을 AdcmvE1B/IRES/E4orf6-ΔE4로 지칭하였다. 이어, 제조자의 지시(클론테크)에 따라서 아데노바이러스를 제조하였다.

상술한 벡터는 원칙적으로 본 발명에 따라 사용될 것으로 기재된 다른 바이러스로도 유용하다. 특히 상술한 벡터는 YB-1 핵-양성 세포에서 뿐만 아니라 YB-1이 탈조절된 세포, 즉 정상 세포 및 비-종양 세포와 비교하여 과발현되는 세포에서 복제 및 용해 유도에 적합하다. 상기 벡터는 또한 본 발명에 따라 사용되는 것으로 기재된 다른 아데노바이러스 및 본 명세서에 기재된 본 발명의 다른 아데노바이러스와 관련하여 기재된 질환 및 환자 그룹 또는 환자 집단에 이용될 수 있다.

실시예 13: 257RDB 및 181 RDB 세포에서 Xvir03의 종양세포 붕괴 효과

6개 웰을 갖는 플레이트(영어. 6웰 플레이트)의 각 웰당 100,000개 세포(257RDB 및 181RDB)를 플레팅하였다. 그 다음날 도 18에 도시한 바와 같이 세포를 Ad312 (20 pfu/세포) 및 Xvir03 (5 pfu/세포)로 감염시켰다. 감염은 500㎕ 무혈청 DMEM 배지중, 37℃에서 1시간 동안 실시하였다. 이어, 감염 배지를 제거하고 2 ml 완전 배지(10% FCS/DMEM)으로 교체하였다. 5일 후 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 18A 및 도 18B에 도시한다.

도 18A 및 도 18B로 부터 알 수 있듯이, 핵내에 YB-1을 갖는 다약제 내성 세포는, 세포의 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 표시한 바와 같이 Xvir03의 경우에서만 Ad312 및 Xvir03에 의한 감염 후 용해를 나타낸다. 이와 관련하여, 제1 배지를 제거한다. 이어 세포를 크리스탈 바이올렛(50% ETOH, 3% 포름알데히드, 5% 아세트산, 1% 크리스탈 바이올렛)으로 덮고 실온에서 5-10분간 배양하였다. 이어, 세포 웰 플레이트를 물에 의해 완전히 헹구고 실온에서 건조시켰다.

본 발명의 의미에서 아데노바이러스를 트랜스액티베이팅하지 않는 E1A-결실 바이러스(예컨대 Ad312)는 높은 MOI에서 아주 효과적으로 복제될 수 있지만(Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981), 임상 적용에서 실현되지 못한다. 이 현상을 문헌에서 "E1A-유사 활성"이라 칭한다. 본 명세서에서 사용된 아데노바이러스 Ad312는 E1A-결실 바이러스이다. 임상적으로 바람직한 역가 보다는 이상이지만 사용된 역가(20 pfu/세포)에서, E1B55k 및 E4orf6과 같은 초기 아데노바이러스 유전자는 발현되지 않거나 또는 아주 적은 정도로만 발현된다(Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981). 본 명세서에 이미 기재한 바와 같이, 이들 유전자 및 단백질은 바이러스 복제에 중요한 역할을 한다. 그와 대조적으로, 이들 유전자 및 단백질은 아데노바이러스 Xvir03에 의해 발현된다(도 16). 도 18A 및 도 18B로 부터 알 수 있듯이, 유전자 E1B55k 및 E4orf6의 발현은 동시에 생기는 낮은 감염 역가에서 효과적인 바이러스 복제와 세포 용해를 초래한다(pfu/세포로 표시). 이것은 본 발명의 기초가 되는 발견, 즉 E4orf6 및 E1B-55k (및 E1A의 부재하)의 발현이 YB-1의 핵내 존재와 조합되어 아주 효과적인 아데노바이러스 복제를 유도할 수 있다는 것을 확인시켜 준다. 필요한 역가는 1 내지 5 pfu/세포이며, 이것은 임상적용을 가능하게 한다.

상기 내용은 본 발명의 기본이 되는 발견, 즉 본 발명에 따라 사용되고 감염된 세포를 용해시키기 위한 바이러스를 제조하기 위해 YB-1의 핵내 존재, 특히 세포 주기와 독립적인 존재가 필요하다는 것을 확인시켜 준다.

실시예 14: 아데노바이러스 Ad312의 E2 유전자 발현의 노던 블럿 분석

각 경우 10cm 페트리 접시에서 백만개의 A549 및 U2OS 세포를 플레이팅하였다. 그 다음 날 Ad312 (50 pfu/세포) 및 Adwt (대조용으로 사용, 5 pfu/세포)에 의해 세포를 감염시켰다. 사용된 고 바이러스 역가의 Ad312는 종양 세포에서 E1-독립적 복제를 초래하였다. 감염은 1-2 ml 무혈청 DMEM 배지중, 37℃에서 1시간 동 안 실시하였다. 이어, 감염 배지를 제거하고 10 ml 완전 배지(10% FCS/DMEM)에 의해 치환하였다. 3일 후, RNA를 분리하였다. 이어, 분리된 RNA의 농도를 광도측정기를 이용하여 260 nm에서 측정하였다. RNA 샘플은 0.8% 포름알데히드 아가로오스 겔에서 전기영동적으로 분리하였다. 이어, RNA를 나일론 막상에 블러팅하였다(슐라이허 및 슈엘의 계에 따라 작성). 막상에 블러팅된 RNA를 "초기 프로브" E2 및 "후기 프로브" E2 에 대해 블러팅하였다. 1501 bp "후기 프로브"는 E2 후기 프로모터에 특이적으로 결합된다. 이 프로브는 상기 전에 PCR에 의해 제조(프라이머: 5'-GTC GGA GAT CAG ATC CGC GT (서열 4), 5'-GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT (서열 5)하고 ³²P를 사용하여 방사능으로 라벨링시켰다. 이와 대조적으로, 초기 프로브는 E2-초기 프로모터와 E2-후기 프로모터 사이(위치: 226791-227002)에 결합되며 PCR에 의해서도 생성된다(프라이머: 5'-AGCTGATCTTCGCTTTTG (서열 6), 5'-GGATAGCAAGACTCTGAC AAAG (서열 7)). 이어 막을 세척하고 필름에 노출시켰다.

결과를 도 19에 도시한다. 초기 프로브 뿐만 아니라 후기 프로브는 야생형 아데노바이러스와의 대조감염에서 특정 시그널을 제공하는 반면에 Ad312에 의해 감염된 종양 세포는 후기 프로브가 사용될 때에만 특정 시그널을 제공하였다. 이것은 본 발명의 기본이 되는 발견, 즉 E4orf6 및 E1B55K의 발현 및 E1A의 부재가 과발현되고 탈조절된 YB-1을 핵으로 이동시켜서 효과적인 아데노바이러스 복제의 전제조건인 E2 유전자 발현을 유도한다는 것을 확인시켜 준다.

실시예 15: E2 아데노바이러스 Ad델타 24의 E2 유전자 발현의 노던 블럿 분석

각각 백만개의 U2OS 세포를 10cm 페트리 접시에 플레이팅하였다. 그 다음 날 세포들을 아데노바이러스 델타 24 (Addelta24)(10 pfu/세포) 및 야생형 아데노바이러스(Adwt)(대조용으로 사용, 10 pfu/세포)에 의해 감염시켰다. 사용된 재조합 아데노바이러스 Addelta24 (Fueyo, J. et al., Oncogene 19, 2-12, 2000)은 E1A 단백질의 CR2 영역에서 특정 결실을 가지므로 Rb-음성 종양에서 복제될 수 있다. 부가적으로, 이 바이러스는 야생형 아데노바이러스에 필적하게 유전자 E1B55k 및 E4orf6을 발현한다. 감염은 1-2 ml 무혈청 DMEM 배지중 37℃에서 1시간 동안 생겼다. 이어, 감염 배지를 제거하고 10 ml 완전 배지(10% FCS/DMEM)으로 교체하였다. RNA는 12시간 및 24시간 후에 분리하였다. 이어, 분리된 RNA의 농도는 광도측정기로 260 nm에서 측정하였다. 이어 RNA 샘플을 0.8% 포름알데히드 아가로오스 겔에서 전기영동적으로 분리시켰다. 이어 RNA를 나일론 막상에 블러팅하였다(Schleicher & Schuell의 계에 따라 실시함). 막에 블러팅된 RNA를 "초기 프로브" 및 "후기 프로브"에 대하여 혼성화시켰다. 1501bp를 포함하는 "후기 프로브"는 E2-후기 프로모터에 특이적으로 결합된다. 이 프로브는 그 전에 PCR에 의해 제조(프라이머: 5'-GTC GGA GAT CAG ATC CGC GT (서열 4), 5'-GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT (서열 5))하였고 또 ³² P를 사용하여 방사능으로 라벨링시켰다. 그러나 초기 프로브는 E2-초기 프로모터 및 E2-후기 프로모터 사이에 결합되며 PCR에 의해 제조되었다(프라이 머: 5'-AGCTGATCTTCGCTTTTG (서열 6), 5'-GGATAGCAAGACTCTGACAAAG (서열 7)). 이어, 막을 세척하고 필름에 노출시켰다.

결과를 도 20에 도시한다.

12시간 후, 오직 후기 프로브만이 특정 시그널을 제공하였다. 24시간 후 초기 프로브도 Addelta24에 의해 감염된 세포에서 시그널을 제공하였다. 아생형 아데노바이러스와 비교하여, 상기 시그널은 현저히 약하다. 또한 이러한 결과는 본 발명의 기초가 되는 발견으로 E4orf6 및 E1B-55K의 발현이 과발현되고 탈조절된 YB-1을 핵으로 이동시켜서 E2-후기 프로모터에 결합되어 E2 유전자 발현을 유도함을 확인시켜 준다.

실시예 16: 아데노바이러스 벡터 XvirPSJL1 및 XvirPSJL2의 구조 디자인

벡터의 설명: 본 명세서에서 그룹 I 아데노바이러스로 지칭되고 벡터 및 아데노바이러스의 예로 XvirPSJL1 및 XvirPSJL2로 예시된 바이러스의 구체예인 XvirPSJL 그룹의 벡터는 아데노바이러스 dl520 처럼 YB-1 핵-양성 세포, 특히 조양 세포에서 복제될 수 있을 뿐만 아니라 YB-1이 과발현되고 탈조절된 종양 세포에서 복제될 수 있다. 바이러스 유전자 E1B55k 및 E4orf6은 E1B 프로모터 및 E4 프로모터의 영향하에서 dl520 감염된 YB-1 핵-양성 세포에서 발현되지만, XvirPSJL에서의 E1B55k 및 E4orf6의 발현은 사이토메갈로바이러스(cmw) 프로모터에 의해 생긴다. 그러나, cmw 프로모터 대신 다른 프로모터, 특히 종양 특이적, 조직 특이적 및 기관 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. E1B55k 및 E4orf6의 발현으로 인하여, 과발현된 YB-1 및 탈조절된 YB-1은 핵으로 이동되고 아데노바이러스의 복제가 개시된다. 본 명세서에 기재된 XvirPSJL 그룹의 아데노바이러스 벡터는 다양한 요소와 결합하므로 단일 벡터내에서 아데노바이러스 벡터 dl520, Xvir03 및 AdYB-1의 기능을 한다. 벡터 dl520과 유사하게, XvirPSJL 바이러스는 E1A12S 유전자를 함유한다. 상기 유전자 및 상응하는 유전자 산물은 감염된 세포의 S상의 유도에 관여하며 바이러스 복제와 화학요법과 조사의 효과를 증진시킨다. Xvir03과 마찬가지로 XvirPSJL 바이러스는 효과적인 복제에 필요한 발현 카세트 CMV-E1B55k/IRES/E4orf6을 함유하며 또 탈조절된 YB-1을 간접적으로 또는 직접적으로 종양 세포에 함유되어 있는 핵으로 이동시킨다. 따라서 복제는 세포, 특히 종양 세포에서만 가능하며, YB-1은 과발현되거나 탈조절된다. 부가적으로, P53은 E1B55k/E4orf6 복합체의 분해에 의해 제조된다. 인간의 전사 인자 YB-1을 암호화하는 서열은 바이러스 AdYb-1으로 부터 취한다. 내생성, 즉 YB-1이 세포에 이미 존재하는 것은 바이러스 복제를 증폭시킨다. E1A12S 및 YB-1의 발현은 YB-1 의존적 아데노바이러스 E2-후기 프로모터에 의해 제어된다. 또한 이와 관련하여 특정 프로모터, 특히 종양 특이적, 조직 특이적 또는 기관 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 이들 바이러스의 다른 특징은 E4 영역이 결실되어 있는 것이다. 이 벡터는 그 곳에서 제한 부위를 함유하며, 아데노바이러스 벡터 XvirPSJL1 및 XvirPSJL2의 경우, 리보자임, 안티센스 분자, siRNA, 세포자살-유발 유전자, 사이토카인 및 프로드럭 유전자와 같은 본 명세서에 기재된 바와 같은 다양한 전이유전자가 발현될 수 있다. 이들의 발현은 본 명세서에 기재된 종양 특이적, 조직 특이적 또는 기관 특이적 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 발현 카세트의 위치는 고정되지 않으며, 특히 이와 관련하여 E1, E3 및 E4 영역내에 있지만, 다르게 배열될 수 있다. 이 벡터는 종양 세포의 p53 또는 Rb 상태와 독립적으로 복제된다.

재조합 아데노바이러스 XvirPSJL1 및 XvirPSJL2의 구조 디자인은 도 21 및 도 22에 도시되어 있다.

카세트 E2-후기-YB11RES/12S의 생성:

출발 물질로 사용되는 클론테크/BD 바이오사이언스의 pAdenoX 플라스미드는 아데노바이러스 Ad5의 게놈 핵산을 포함하고 또 야생형 아데노바이러스에는 존재하지 않는 3'ITR 영역 뒤에 SfuI 제한 부위를 갖는다. E3-E4 영역은 pAdenoX (클론테크 제조)으로 부터 SpeI (위치 23644) 및 SfuI에 의해 pcDNA3.1(+)(인비트로겐 제조)로 이동되며 이를 pcDNA3.1-E3Δ27865-30995-E4로 칭한다. E4ORF6의 대다수, 즉 염기 33241-33875가 PstI에 의해 제거되었다. 이렇게하여 수득한 단편을 pcDNA3.1-E3Δ27865-30995, E4Δ33241-33875로 칭하였다.

E2-후기 프로모터를 pGL3-EGFP(Holm et al., JBC 2002, 277, 10427-10434)로 부터 SacI 및 NheI에 의해 절단해내고 pcDNA3.1-E3Δ27865-30995, E4Δ33241-33875에 클로닝하였다. 이렇게하여, E3 영역은 염기 Δ27593-31509 영역에서 더욱 결실되었다. 이렇게하여 얻은 단편을 E2-후기-pcDNA3.1-E3Δ27593-31509, E4Δ33241-33875로 칭하였다.

E1A-243AA 산물에 대한 cDNA를 RT-PCR에 의해 생성하고 분리하여 그 서열을 확인하고 BamHI 및 EcoRI을 이용하여 pcDNA3.1(+) 벡터(인비트로겐 제조)에 클로닝 하였다. E1A-12S-pcDNA3.1+는 NheI 및 BamHI에 의해 선형화시키고, T4 폴리머라제를 사용하여 무딘 말단으로 만든 다음 Taq 폴리머라제 및 dTTP에 의해 T 오버헹을 제공하였다. IRES 요소는 PCR 산물(주형 = pCITE, 노바겐 제조)로서 E1A-12S-pcDNA3.1(+) 벡터(TA 클로닝 strategy)에 클로닝하였다.

YB-1-EcoRI 단편을 벡터 pHVad2c (Holm et al., JBC 2002, 277, 10427-10434)로 부터 분리하고 무딘 말단으로 만들었다. 벡터 pShuttle (BD 바이오사언스가 시판하고 있음)를 XbaI으로 선형화시키고, 그 말단을 무딘 말단으로 만든 다음 탈포스포릴화시키고 앞서 제조된 YB-1 암호화 핵산과 결찰시켰다. 이렇게하여 얻은 벡터를 YB-1-pShuttle이라 칭한다. pShuttle 벡터에 클로닝하는 것은 YB-1 단편을 암호화하는 핵산에 인-프레임 중지 코돈을 제공한다. YB-1 암호화 핵산은 NheI 및 BfrI에 의해 YB-1-pShuttle로 부터 pcDNA3.1(+)중의 벡터 IRES-E1A-12S 에 클로닝하였다. 이렇게하여 얻은 단편을 YB-1(중지코돈을 갖는 EcoRI-EcoRI)-IRES-E1A-12S-pcDNA3.1(+)이라 칭하였다.

이어, 카세트 YB-1-IRES-E1A12S를 PmeI에 의해 절취해내어 NheI 선형화되고, 무딘말단화되고 탈포스포릴화된 벡터 E2후기-pcDNA3.1 E3Δ27593-31509, E4Δ33241-33875에 클로닝하였다. 따라서 이 두번째 카세트는 E3 영역의 결실 영역에 존재한다.

핵산 구조물 E2후기-YB-1-IRES-E1A12S를 포함하는 전이유전자 카세트를 잔류 아데노바이러스 서열 E3Δ27593-31509, E4Δ33241-33875와 함께 SfuI 및 SpeI에 의해 클론테크가 제조한 벡터 pAdenoX에 클로닝하였다(= AdenoX/E2후기-YB-1-IRES- E1A12S/E3Δ27593-31509, E4Δ33241-33875).

상기 카세트 CMV-E1B55k/IRES/E4orf6을 I-CeuI 및 PI-SceI에 의해 Xvir-3 과 관련하여 상기 기재된 pShuttle로 부터 절취해내고 벡터 pAdenoX/E2후기-YB-1-IRES-E1A12S/E3Δ27593-31509, E4Δ33241-33875에 클로닝하였다.

이어, 상기 벡터를 Pac I에 의해 선형화시키고, 293세포 및 재조합 아데노바이러스 XvirPSJL1 및 XvirPSJL 2에 의해 형질감염시키고 제조자의 지시에 따라서 도면에 지시된 전이유전자없이 분리하였다.

실시예 17: 아데노바이러스 dl520을 사용한 HeLa 세포의 감염

100,000개 HeLa 세포를 접시에 플레이팅하였다. 그 다음 날 세포를 다양한 역가(pfu/ml)의 아네노바이러스 dl520에 의해 감염시켰다. 감염은 500㎕ 무혈청 DMEM 배지중, 37℃에서 1시간 동안 실시하였다. 이어, 감염 배지를 제거하고 2 ml 완전 배지(10% FCS/DMEM)로 교체하였다. 3-5일 후 크리스탈 바이올렛 염색을 이용하여 분석을 실시하였다.

상기 실험의 결과를 도 23에 도시한다. 아데노바이러스 dl520은 낮은 MOI(5-10 pfu/세포)로 핵에 YB-1을 갖지 않는 HeLa 세포와 감염시 용해를 나타내지 않는다. 이와 대조적으로, dl520은 세포당 100-200 pfu의 MOI(감염의 중복도)에서 실질적으로 완전한 용해를 나타내며 세포당 50 pfu의 MOI에서도 우세한 용해를 나타내었다. 그로 부터 dl520 및 아데노바이러스 유전자 E1B55k 및 E4orf6을 스위칭-온할 수 있는 유사한 바이러스는 직접적으로 또는 간접적으로 과발현되거나 탈조절된 YB-1을 핵으로 이동시켜서 세포 용해를 유발하기에 적합하다고 결론지을 수 있다.

실시예 18: E2-후기 프로모터 활성을 결정하기 위한 루시페라제 에세이

YB-1은 핵내의 아데노바이러스 E2-후기 프로모터와 결합한다(Holm et al., JBC 2002, 277, 10427-20434)는 것과 상기 프로모터가 핵산의 발현에 아주 적합하다는 것은 공지되어 있다. 아데노바이러스 E2-후기 프로모터의 사용은 이것이 YB-1에 의해 조절될 수 있으며, YB-1이 양성 이팩터로 작용하여, 즉 상기 프로모터가 핵내에 YB-1이 존재할 경우에만 활성이라는 사실에 의해 특히 동기를 부여받는다. 상기 아데노바이러스 E2-후기 프로모터가 아주 선택적 방식으로 조절될 수 있어서 YB-1이 핵에 존재하는 계에 사용될 수 있고 또 YB-1이 이펙터 및 레귤레이터로서 핵에 존재하지 않을 경우, 실질적으로 아데노바이러스 E2 후기 프로모터의 제어하에 있는 핵산의 발현을 피할 수 있다. E2-후기 프로모터는 E2 유전자의 활성화에 관련되는 3Y-박스(CCAAT)를 포함한다. 상이한 E2-후기 프로모터 구조를 작성하고 이들의 특이성과 활성에 대해 시험하였다. 그 분석은 다음과 같이 실시하였다.

핵내에 YB-1을 갖는 세포주 EPG-257 RDB (상피세포 위암), HeLa (상피세포성 자궁경부암) 및 U2OS (골육종)을 3개의 상이한 세포 농도를 이용하여 6개 웰 플레이트에 심었다. 그 다음 날 70%의 콘플루언스를 나타낸 웰을 형질감염에 사용하였다. 각 웰에 대하여 루시페라제 벡터중의 E2-후기 프로모터 구조물의 500ng SpinMiniprep (Qiagen 제조) 정제된 플라스미드 DNA를 1.5 ml 로킹캡 반응 용기중 의 500 ㎕ OptiMEM에 부가하고 다른 로킹캡 반응 용기중의 500㎕에 5 ㎕ DOTAP를 부가하였다. 양쪽 용액을 합쳐서 혼합하였다. 그 혼합물을 실온에서 30분간 복합체가 형성되도록 배양하였다. 세포를 PBS를 사용하여 3회 헹구고 형질감염 혼합물층으로 덮었다. 플레이트를 37℃에서 5시간 동안 배양한 다음 PBS를 사용하여 3회 헹구고 완전 배지를 제공하였다.

상기 세포를 감염시킨 지 48시간 후 루시페라제 에세이 계 키트(프로메가 제조, Cat. No. E1500)를 이용하여 세포를 처리하였다: 각 웰에 500 ㎕ 용해 완충액을 제공하고, 세포를 실온에서 10분 후 1 ml 피펫을 사용하여 웰 플레이트로 부터 헹구고 1.5 ml 로킹캡 반응 용기로 옮겼다. 세포 용해물을 4℃에서 15분간 14,000 rpm으로 원심분리시켰다. 각 50 ㎕의 상층액에 100 ㎕의 루시페라제 기질을 부가하고 TopCount (칸베라-팩커드 GmbH 제조, 63303 드라이아이히 소재) 마이크로플레이트 신틸레이션 & 루미네센스 카운터를 이용하여 96개 웰을 갖는 블랙 플레이트, 파장 945 nm에서 측정하였다.

단백질은 BCA 단백질 에세이 시약 키트, 카탈로그 번호 23227 (PIERCE, 미국 일리노이 록포드 소재)를 이용하여 바이오루미노미터(Biolumin^TM 960) 키네틱 형광/몰리큘라 다이나믹스의 흡광 플레이트 리더중 570 nm에서 측정하였다. 샘플의 상대적 광 신호는 단백질 양(RLU/㎍ 단백질)으로 번역되었다.

이하의 플라스미드를 사용하였다: 인헨서가 BamHI (2250bp) 및 BsaBI (2003 bp)에 의해 제거된 pGL3-인헨서(프로메가 제조)를 블랭크 리딩(blank reading)으로 이용하였다. 다양한 E2 프로모터 구조를 제한부위 ApaI 및 Sac I에 의해 인헨서-결핍 pGL3 벡터에 MCS로 클로닝되었다. Bgl II 및 Hind III에 의하여 hCMV 프로모터를 pGL3 인헨서에 클로닝하여 양성 대조용으로 사용하였다. 이 양성 대조용은 추정 형질감염 효율을 나타내며 이것은 루시페라제 활성에 대한 참조값으로 작용한다. 각 세포주에 대하여 CMV 대조용은 100%로 설정되며 그와 곤련하여 E2 프로모터 구조물에 의해 효소활성이 생기며 이를 도 24에 막대 그래프로 도시한다.

이하에 나타낸 바와 같은 다양한 구조물이 이용될 수 있다:

1. 염기 25932-26179 bp에 상응하는 Y-박스 I, II 및 III을 포함(야생형 아데노바이러스 서열로 지칭, 이하에 제공된 아데노바이러스 E2 영역의 일부 참조)

2. 염기 25932-26127 bp에 상응하는 Y-박스 II 및 III을 포함(야생형 아데노바이러스 서열로 지칭, 이하에 제공된 아데노바이러스 E2 영역의 일부 참조)

3. 염기 25932-26004 bp에 상응하는 Y-박스 III을 포함(야생형 아데노바이러스 서열로 지칭, 이하에 제공된 아데노바이러스 E2 영역의 일부 참조)

4. 블랭크 리딩으로서 Y-박스를 포함하지 않음.

아데노바이러스 E2 영역의 일부 (Virology 1992, 186, 280-285로 부터 취함)

(YB-1 결합 부위는 진한 글씨체로 표시됨):

도 24에 도시된 결과는 상이한 E2-후기/Y-박스를 함유하는 개별 프로모터 단 편이 YB-1 핵-양성 종양 세포에서 치료적 전잉전자의 발현에 적합하며 본 발명의의미에서 프로모터로 사용될 수 있음을 인상적인 방식으로 확인시켜 준다.

실시예 19: 입자 방출에 대한 아데노바이러스에 의해 발현된 YB-1의 효과

인간의 골육종 세포(U2OS)를 E1/E3-결실 아데노바이러스 벡터 AdYB-1 및 E1A-결실만을 갖는 Ad312를 사용하여 50 pfu/세포의 MOI로 감염시켰다. AdYB-1은 게놈중에 세포성 전사인자 YB-1을 암호화하는 서열을 함유하며 또 Y-박스 결합 단백질 1(YB-1)을 발현한다. 감염 후 "플라크 형성 유닛"(pfu)으로서 바이러스 입자의 방출을 평가하기 위하여, 배양 배지 또는 나머지 세포 층의 상청액을 감염후 2일 및 5일 후에 분리하였다. 세포내 입자는 해동/냉동 주기를 3회 실시하여 방출시켰다. 입자 개수는 293 세포에서 플라크 에세이를 이용하여 분석하였다.

그 결과를 도 25에 도시하며, 진한 막대는 세포내 잔류하는 바이러스 입자를 나타내고, 교차줄무늬의 막대는 방출된 세포외의 바이러스 입자를 나타낸다.

도 25에 도시된 결과는 AdYB-1이 대체로 Ad312보다 더 많은 pfu를 나타내고 더 많은 입자를 방출함을 확인시켜 준다. 5일 후 AdYB-1 감염 세포는 Ad312-감염 세포와 대조적으로 세포변성효과(CPE: cytopathic effect)를 분명하게 나타낸다.

본 명세서, 특허청구범위 뿐만 아니라 도면에 기재된 본 발명의 특징은 다양한 구체예로서 개별적으로 또 조합되어 본 발명을 실시하는데 중요하다.

SEQUENCE LISTING <110> Holm, Per Sonne <120> Novel adenoviruses, nucleic acid coding therefor, and use thereof <130> H 10013 PCT <140> PCT/EP 03/11427 <141> 2003-10-15 <160> 8 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Probe for binding to YB-1 <400> 1 tgaggctgat tggctgggca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Probe for the manufacture of the detection probe for the KpnI fragment within the E2A coding Ad 5 sequence <400> 2 gtcggagatc agatccgcgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Probe for the manufacture of the detection probe for the KpnI fragment within the E2A coding Ad 5 sequence <400> 3 gatcctcgtc gtcttcgctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Probe for the manufacture of the detection probe for the KpnI fragment within the E2A coding Ad 5 sequence <400> 4 gtcggagatc agatccgcgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Probe for the manufacture of the detection probe for the KpnI fragment within the E2A coding Ad 5 sequence <400> 5 gatcctcgtc gtcttcgctt 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Probe for the manufacture of the probe binding between the E2 early and the E2 late promoter <400> 6 agctgatctt cgcttttg 18 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Probe for the manufacture of the probe binding between the E2 early and the E2 late promoter <400> 7 ggatagcaag actctgacaa ag 22 <210> 8 <211> 1260 <212> DNA <213> Adenovirus type 37 <220> <221> misc_feature <223> Part of the adenoviral E2 region with the YB-1 binding sites <400> 8 aggaacttta tcctagagcg ctcaggaatc ttgcccgcca cctgctgtgc acttcctagc 60 gactttgtgc ccattaagta ccgcgaatgc cctccgccgc tttggggcca ctgctacctt 120 ctgcagctag ccaactacct tgcctaccac tctgacataa tggaagacgt gagcggtgac 180 ggtctactgg agtgtcactg tcgctgcaac ctatgcaccc cgcaccgctc cctggtttgc 240 aattcgcagc tgcttaacga aagtcaaatt atcggtacct ttgagctgca gggtccctcg 300 cctgacgaaa agtccgcggc tccggggttg aaactcactc cggggctgtg gacgtcggct 360 taccttcgca aatttgtacc tgaggactac cacgcccacg agattaggtt ctacgaagac 420 caatcccgcc cgccaaatgc ggagcttacc gcctgcgtca ttacccaggg ccacattctt 480 ggccaattgc aagccatcaa caaagcccgc caagagtttc tgctacgaaa gggacggggg 540 gtttacttgg acccccagtc cggcgaggag ctcaacccaa tccccccgcc gccgcagccc 600 tatcagcagc agccgcgggc ccttgcttcc caggatggca cccaaaaaga agctgcagct 660 gccgccgcca cccacggacg aggaggaata ctgggacagt caggcagagg aggttttgga 720 cgaggaggag gaggacatga tggaagactg ggagagccta gacgaggaag cttccgaggt 780 cgaagaggtg tcagacgaaa caccgtcacc ctcggtcgca ttcccctcgc cggcgcccca 840 gaaatcggca accggttcca gcatggctac aacctccgct cctcaggcgc cgccggcact 900 gcccgttcgc cgacccaacc gtagatggga caccactgga accagggccg gtaagtccaa 960 gcagccgccg ccgttagccc aagagcaaca acagcgccaa ggctaccgct catggcgcgg 1020 gcacaagaac gccatagttg cttgcttgca agactgtggg ggcaacatct ccttcgcccg 1080 ccgctttctt ctctaccatc acggcgtggc cttcccccgt aacatcctgc attactaccg 1140 tcatctctac agcccatact gcaccggcgg cagcggcagc ggcagcaaca gcagcggcca 1200 cacagaagca aaggcgaccg gatagcaaga ctctgacaaa gcccaagaaa tccacagcgg 1260

Claims (110)

1. E1B 단백질 및 E4 단백질을 포함하는 군으로부터 선택되는 제1 단백질을, E1A-단백질을 포함하는 군으로부터 선택된 제2 단백질 이전에 발현하는 재조합 아데노바이러스.
2. 제 1항에 있어서, 상기 제1 단백질은 E1B 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
3. 제 2항에 있어서, 상기 제1 단백질은 E1B55kd 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
4. 제 1항에 있어서, 상기 제1 단백질은 E4 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
5. 제 4항에 있어서, 상기 E4 단백질은 E4orf6 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
6. 제 1항에 있어서, 상기 제1 단백질은 E1B 단백질과 E4 단백질의 조합물인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
7. 제 1항에 있어서, 상기 제1 단백질은 E1B55kD 단백질 및 E4orf6 단백질의 조합물인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
8. 제 6항에 있어서, 상기 제1 단백질은 E1B55kD 단백질 및 E4orf6 단백질의 조합물인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
9. 제 1항에 있어서, 상기 E1A 단백질은 E1A12S 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
10. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 E1B 단백질, E4 단백질 및 E1A 단백질을 포함하는 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 1 이상의 핵산을 포함하며, 상기 1 이상의 단백질은 야생형 아데노바이러스에서 단백질의 발현을 제어하는 프로모터와는 상이한 프로모터의 제어하에 있는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
11. 제 10항에 있어서, 상기 1 이상의 단백질은 E1B 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
12. 제 11항에 있어서, 상기 E1B 단백질은 E1B55kD 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
13. 제 10항에 있어서, 상기 1 이상의 단백질은 E4 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
14. 제 13항에 있어서, 상기 E4 단백질은 E4orf6 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
15. 제 10항에 있어서, 상기 1 이상의 단백질은 E1A 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
16. 제 15항에 있어서, 상기 E1A 단백질은 E1A12S 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
17. 제 10항에 있어서, 상기 1 이상의 단백질은 E1B 단백질과 E4 단백질의 조합물인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
18. 제 10항에 있어서, 상기 1 이상의 단백질은 E1B55kD 단백질 및 E4orf6 단백질의 조합물인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
19. 제 10항에 있어서, 상기 1 이상의 단백질은 E1B 단백질과 E1A 단백질의 조합물인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
20. 제 19항에 있어서, 상기 1 이상의 단백질은 E1B55kD 단백질 및 E1A12S 단백질의 조합물인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
21. 제 10항에 있어서, 상기 1 이상의 단백질은 E4 단백질과 E1A 단백질의 조합물인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
22. 제 10항에 있어서, 상기 1 이상의 단백질은 E4orf6 단백질 및 E1A12S 단백질의 조합물인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
23. 제 10항에 있어서, 상기 1 이상의 단백질이 E1B 단백질, E4 단백질 및 E1A 단백질의 조합물인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
24. 제 23항에 있어서, 상기 1 이상의 단백질이 E1B55kD 단백질, E4orf6 단백질 및 E1A12S 단백질의 조합물인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
25. 제 10항에 있어서, E1B 단백질의 발현은 프로모터에 의해 제어되며, 상기 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 상기 아데노바이러스 프로모터는 E1B 프로모터와 상이한 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
26. 제 10항에 있어서, E4 단백질의 발현은 프로모터에 의해 제어되며, 상기 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 상기 아데노바이러스 프로모터는 E4 프로모터와 상이한 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
27. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 상기 아데노바이러스 프로모터는 E1A 프로모터인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
28. 제 10항에 있어서, E1A 단백질의 발현은 프로모터에 의해 제어되며, 상기 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 상기 아데노바이러스 프로모터는 E1A 프로모터와 상이한 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
29. 제 25항에 있어서, E1A 단백질의 발현을 제어하는 프로모터는 YB-1 제어되거나 또는 YB-1에 의해 조절될 수 있는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
30. 제 29항에 있어서, E1A 단백질의 발현을 제어하는 프로모터는 아데노바이러스 E2 후기 프로모터인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
31. 제 26항에 있어서, E1A 단백질의 발현을 제어하는 프로모터는 YB-1 제어되거나 또는 YB-1에 의해 조절될 수 있는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
32. 제 31항에 있어서, E1A 단백질의 발현을 제어하는 프로모터는 아데노바이러스 E2 후기 프로모터인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
33. 제 27항에 있어서, E1A 단백질의 발현을 제어하는 프로모터는 YB-1 제어되거나 또는 YB-1에 의해 조절될 수 있는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
34. 제 33항에 있어서, E1A 단백질의 발현을 제어하는 프로모터는 아데노바이러스 E2 후기 프로모터인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
35. 제 28항에 있어서, E1A 단백질의 발현을 제어하는 프로모터는 YB-1 제어되거나 또는 YB-1에 의해 조절될 수 있는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
36. 제 35항에 있어서, E1A 단백질의 발현을 제어하는 프로모터는 아데노바이러스 E2 후기 프로모터인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
37. 제 1항에 있어서, E4 단백질 및 E1B 단백질은 동일하거나 공통되는 프로모터의 제어하에 있는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
38. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 1 이상의 아데노바이러스 단백질을 통하여 핵에서 YB-1을 제공하거나 또는 핵에서 YB-1의 제공은 1 이상의 아데노바이러스 단백질을 통하여 매개되며, 상기 아데노바이러스 단백질은 E1A와 상이한 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
39. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 1 이상의 아데노바이러스 단백질을 통한 아데노바이러스 복제를 위한 YB-1을 제공하거나 1 이상의 아데노바이러스 단백질을 통한 아데노바이러스 복제를 위한 YB-1의 제공을 매개하며, 상기 아데노바이러스 단백질은 E1A와 상이한 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
40. 제 38항에 있어서, 상기 아데노바이러스 단백질은 E4orf6 및 E1B55kD의 복합체인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
41. 제 39항에 있어서, 상기 아데노바이러스 단백질은 E4orf6 및 E1B55kD의 복합체인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
42. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스의 핵산은 1 이상의 기능적으로 불활성 아데노바이러스 영역을 포함하며, 상기 영역은 E1 영역, E3 영역, E4 영역 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
43. 제 42항에 있어서, 상기 영역은 E1 영역인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
44. 제 42항에 있어서, 상기 영역은 E3 영역인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
45. 제 42항에 있어서, 상기 영역은 E4 영역인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
46. 제 42항에 있어서, 상기 영역은 E1 영역, E3 영역 및 E4 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
47. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 1 이상의 발현 카세트를 포함하며, 상기 발현 카세트는 1 이상의 프로모터 및 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 아데노바이러스 단백질은 E1B 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
48. 제 47항에 있어서, 상기 아데노바이러스 단백질은 E1B55kD 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
49. 제 48항에 있어서, 상기 프로모터는 E1B 프로모터와 상이한 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
50. 제 49항에 있어서, 상기 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 상기 프로모터는 E1B 프로모터와 상이한 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
51. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 1 이상의 발현 카세트를 포함하며, 상기 발현 카세트는 1 이상의 프로모터 및 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 아데노바이러스 단백질은 E4orf6 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
52. 제 51항에 있어서, 상기 프로모터는 E4 프로모터와 상이한 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
53. 제 52항에 있어서, 상기 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 상기 아데노바이러스 프로모터는 E4 프로모터와 상이한 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
54. 제 47항에 있어서, 상기 프로모터는 E1A 프로모터인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
55. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 1 이상의 발현 카세트를 포함하며, 상기 발현 카세트는 1 이상의 프로모터 및 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 아데노바이러스 단백질은 E1A12S 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
56. 제 55항에 있어서, 상기 프로모터는 E1A 프로모터와 상이한 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
57. 제 56항에 있어서, 상기 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
58. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 YB-1을 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
59. 제 58항에 있어서, 상기 YB-1을 암호화하는 핵산은 프로모터의 제어하에 있으며, 상기 프로모터는 E2 후기 프로모터인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
60. 제 58항에 있어서, YB-1을 암호화하는 핵산은 프로모터의 제어하에 있으며, 상기 프로모터는 YB-1 의존적 및 YB-1 제어되는 프로모터인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
61. 제 58항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 YB-1를 암호화하고 YB-1을 암호화하는 핵산은 E1A 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 카세트의 일부인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
62. 제 61항에 있어서, 상기 E1A 단백질은 E1A12S 단백질인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
63. 제 61항에 있어서, E1A 단백질을 암호화하는 핵산은 IRES 서열을 통하여 YB-1을 암호화하는 핵산과 분리되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
64. 제 47항에 있어서, 상기 발현 카세트는 E4orf6 단백질을 암호화하는 핵산 및 E1B55kD 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
65. 제 64항에 있어서, 상기 E4orf6 단백질을 암호화하는 핵산 및 E1B55kD 단백질을 암호화하는 핵산은 IRES 서열에 통하여 분리되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
66. 제 64항에 있어서, 상기 발현 카세트의 프로모터는 종양 특이적 프로모터, 기관 특이적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 이종성 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 상기 아데노바이러스 프로모터는 E4 프로모터와 상이하고, E1B 프로모터와 상이하며, 야생형 E4 프로모터와 상이하고, 야생형 E1B 프로모터와 상이한 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
67. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 프로모터 및 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 상기 핵산 서열은 아프타머, 리보자임, 아프타자임, 안티센스 분자 및 siRNA를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
68. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 프로모터 및 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 상기 핵산 서열은 코딩 핵산이며, 상기 핵산은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 안티칼린, 항체 및 항체 단편을 포함하는 군으로부터 선택되는 분자를 암호화하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
69. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 발현 카세트를 포함하고, 상기 발현 카세트는 프로모터 및 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은 세포자살 유도 유전자, 프로드럭 유전자, 프로테아제 억제제, 종양 서프레서 유전자, 사이토카인 및 신생혈관형성 억제제를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
70. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 재조합 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
71. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 복제 결핍이지만, 상기 아데노바이러스는 탈조절된 YB-1을 포함하거나 핵내에 YB-1을 갖는 세포에서 복제할 수 있는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
72. 제 71항에 있어서, 상기 세포는 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 함유하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스.
73. 제 1항에 따른 아데노바이러스를 암호화하는 핵산.
74. 삭제
75. 삭제
76. 제 73항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
77. 제 76항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
78. 제 1항에 따른 아데노바이러스 또는 제 73항에 따른 핵산 또는 제 76항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
79. 제 78항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
80. 제 79항에 있어서, 상기 포유류 세포는 마우스, 래트, 기니아 피그, 돼지, 양, 염소, 소, 말, 개, 고양이 및 인간의 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
81. 제 1항에 따른 아데노바이러스, 제 73항에 따른 핵산, 제 76항에 따른 벡터 또는 제 78항에 따른 세포를 포함하는, 아데노바이러스의 시험관내 복제를 위한 조성물.
82. 제 1항에 따른 아데노바이러스, 제 73항에 따른 핵산, 제 76항에 따른 벡터 또는 제 78항에 따른 세포를 포함하는, 아데노바이러스의 시험관내 제조를 위한 조성물.
83. 제 1항에 따른 아데노바이러스, 제 73항에 따른 핵산, 제 76항에 따른 벡터 또는 제 78항에 따른 세포를 포함하는, 유전자 발현을 위한 조성물.
84. 제 1항에 따른 아데노바이러스, 제 73항에 따른 핵산, 제 76항에 따른 벡터 또는 제 78항에 따른 세포 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 종양 질환 치료용 의약을 제조하기 위한 조성물.
85. 제 81항에 있어서, 아데노바이러스가 복제되는 세포는 핵내에 YB-1을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
86. 제 85항에 있어서, 상기 세포는 세포 주기에 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
87. 제 84항에 있어서, 아데노바이러스가 복제되는 세포는 핵내에 YB-1을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
88. 제 87항에 있어서, 상기 세포는 세포 주기에 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
89. 제 81항에 있어서, 아데노바이러스가 복제되는 세포는 탈조절된 YB-1을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
90. 제 84항에 있어서, 아데노바이러스가 복제되는 세포는 탈조절된 YB-1을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
91. 제 84항에 있어서, 상기 종양 질환은 악성 질환, 암, 암 질환 및 종양을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
92. 제 91항에 있어서, 상기 종양은 고형, 비-고형, 악성 및 양성 종양을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
93. 제 84항에 있어서, 종양 형성 세포의 적어도 일부는 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
94. 제 84항에 있어서, 종양 형성 세포의 적어도 일부는 탈조절된 YB-1을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
95. 제 84항에 있어서, 종양 형성 세포의 적어도 일부는 Rb 양성 또는 Rb 음성인 것을 특징으로 하는 조성물.
96. 제 84항에 있어서, 종양 형성세포의 적어도 일부는 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
97. 제 96항에 있어서, 상기 내성은 다중 내성인 것을 특징으로 하는 조성물.
98. 제 96항에 있어서, 상기 내성은 항-종양제에 대한 것임을 특징으로 하는 조성물.
99. 제 96항에 있어서, 상기 내성은 조사에 의해 초래되는 것을 특징으로 하는 조성물.
100. 제 84항에 있어서, 상기 의약은 1 이상의 추가의 약제학적 활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
101. 제 84항에 있어서, 상기 의약은 약제학적 활성제와 함께 투여되거나 이를 위하여 의도되는 것을 특징으로 하는 조성물.
102. 제 100항에 있어서, 추가의 약제학적 활성제는 사이토카인, 메탈로프로테이나제 억제제, 신생혈관생성 억제제, 세포증식 억제제, 티로신 키나제 억제제 및 세포 주기 억제제를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
103. 제 101항에 있어서, 추가의 약제학적 활성제는 사이토카인, 메탈로프로테이나제 억제제, 신생혈관생성 억제제, 세포증식 억제제, 티로신 키나제 억제제 및 세포 주기 억제제를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
104. 제 84항에 있어서, 상기 의약은 조사(irradiation) 이전, 도중 또는 이후에 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
105. 제 104에 있어서, 상기 조사는 종양 치료 목적으로 가해지는 것을 특징으로 하는 조성물.
106. 제 84항에 있어서, 상기 치료할 세포 또는 유기체는 조사, 세포증식억제제의 투여 및 온열요법을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법에 처리되는 것을 특징으로 하는 조성물.
107. 제 106항에 있어서, 상기 방법은 국소적으로 또는 전신적으로 가해지는 것을 특징으로 하는 조성물.
108. 삭제
109. 제 104항에 있어서, 상기 조사는 종량 질환의 치료에 이용된 조사를 이용하는 것을 특징으로 하는 조성물.
110. 제 84항에 있어서, 상기 종양 질환은 유방암, 골종양, 위암, 장암, 담낭암, 췌장암, 간암, 신장암, 뇌암, 난소암, 피부암, 피부 부속기 종양 (tumors of cutaneous appendages), 두경부암 (head and neck cancer), 자궁암, 활막 종양 (synovial tumor), 후두암, 식도암, 설암, 전립선암을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.

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