BR112016006564B1 - Polipeptídeo de fibra adb-2/3 recombinante e composição farmacêutica - Google Patents

Polipeptídeo de fibra adb-2/3 recombinante e composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

POLIPEPTÍDEO DE FIBRA ADB-2/3 RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO RELACIONADOS, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE E CÉLULA HOSPEDEIRA. A presente invenção provê métodos e composições de adenovírus recombinantes para a sua utilização no tratamento de distúrbios associados com tecidos epiteliais.

Description

Referência cruzada
[0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente PCT No. de série PCT/US13/61431 depositado em 24 de setembro de 2013, e para o Pedido de Patente Provisório No. de série U.S. 61/954822 depositado em 18 de março de 2014, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.
Declaração de Direitos do Governo
[0002] Esta invenção foi feita com o apoio do Governo dos EUA sob R01 CA080192 e RO1 HLA078836 concedidos pelo Institutos Nacionais da Saúde. O governo dos EUA tem certos direitos nesta invenção.
Fundamentos
[0003] Adenovírus humanos (Ads) foram classificados em seis espécies (A a F), contendo atualmente 51 sorótipos. A maioria dos sorótipos Ad utilizam o receptor de coxsackie e adenovírus (CAR) como um receptor de fixação primária (Bergelson et al., 1997). Isto, no entanto, não é o caso para sorótipos Ad de espécie B. Recentemente, sugerimos que um novo agrupamento de Ads de espécie B com base no uso de receptor (Tuve et al., 2006). Grupo 1 (Ad16, 21, 35, 50) utilizam quase exclusivamente CD46 como um receptor; Grupo 2 (Ad3, Ad7, 14) partilham um receptor/es comum(s) e não identificado(s), o que não é CD46 e que foi provisoriamente chamado receptor X; Grupo 3 (Ad11) interage preferencialmente com CD46, mas também utiliza o receptor X se CD46 está bloqueado.
[0004] Ads de espécie B são patógenos humanos comuns. Desde 2005, observou-se um surgimento simultâneo de sorótipos de diversas espécies B na maioria de instalações de treinamento militar dos EUA. Isto incluiu sorótipos Ad3, Ad7 e Ad14 (Metzgar et al., 2007). Em 2007, uma cepa nova e altamente patogênica e cepa possivelmente mais virulenta de Ad14, Ad14a, foi descoberta em vários locais nos Estados Unidos e na Ásia (Louie et al., 2008; Tate et al., 2009). Recentemente, demonstramos que Ad14a pertence a Ads do Grupo 2 de espécie B com relação ao seu uso do receptor (Wang et al., 2009). Coletivamente, todos os receptores X utilizando sorótipos (Ad3, Ad7, Ad14, Ad14a e Ad11) são referidos neste documento como AdB-2/3.
[0005] AdB-2/3 tem grande relevância como vetores de transferência do gene, particularmente no que diz respeito a tumores de origem epitelial, representando a maioria dos tumores sólidos (Yamamoto e Curiel, 2010). Células epiteliais mantêm várias junções intercelulares e uma polaridade apical-basal. Recursos-chave de células epiteliais são conservados em cancros epiteliais in situ e em linhas de células cancerígenas (Turley et al., 2008). Tanto CAR quanto CD46 são frequentemente presos em junções firmes e de aderência de células de câncer epitelial e são não acessíveis a Ads que usam estes receptores de fixação (Coyne e Bergelson, 2005; Strauss et al., 2009). Em contraste, AdB- 2/3 infecta eficientemente células epiteliais do câncer, o que é alcançado em parte através da indução de processos que são reminiscentes de transição epitélio-mesenquimal (EMT) (Strauss et al., 2009). Outro recurso distintivo de AdB-2/3 é sua capacidade de produzir partículas dodecaédricas sub-virais durante sua replicação, consistindo em fibra de Ad e base de penton (Norrby et al., 1967). Penton-dodecaedros (PtDd) não podem se juntar a partir de proteína à base de penton completa, mas exigem truncamento espontâneo do N-terminal por proteólise entre resíduos 37 e 38 (Fuschiotti et al., 2006). Este sítio clivado é conservado em Ad3, Ad7, Ad11 e Ad14, mas não está presente em Ad2 e Ad5. No caso de Ad3, os PtDds são formados em um enorme excesso de 5,5 x 106 ptDd por vírus infeccioso (Fender et al., 2005) e foi sugerido que os PtDds melhoram a infecciosidade por Ad3 ao mexer em junções intercelulares, favorecendo assim a propagação do vírus (Walters et al., 2002).
Resumo da Invenção
[0006] Em um aspecto, a presente invenção provê polipeptídeos isolados que compreendem a sequência de aminoácidos de qualquer um de SEQ ID NOS: 1-11. Em outro aspecto, a presente invenção provê polipeptídeos de fibra AdB-2/3 recombinantes, compreendendo: i. um ou mais domínios de eixo do polipeptídeo de fibra AdB-2/3, motifs de domínio de eixo ou seus equivalentes funcionais; ii. um domínio globular do polipeptídeo de fibra AdB-2/3 ligado operativamente a e localizado no C-terminal ao um ou mais motifs de domínio de eixo ou domínios de eixo do polipeptídeo de fibra AdB-2/3, em que o domínio globular do polipeptídeo de fibra AdB-2/3 compreende o peptídeo de qualquer um de SEQ ID NOS: 1-11; e iii. um ou mais domínios de dimerização não derivados de AdB-2/3 ligados operativamente a e localizado no N-terminal ao um ou mais motifs de domínio de eixo ou domínios de eixo do polipeptídeo de fibra AdB-2/3.
[0007] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fibra AdB-2/3 não inclui um domínio cauda do polipeptídeo de fibra AdB-2/3. Em outra modalidade, cada domínio de eixo ou motifs de domínio de eixo selecionado a partir do grupo que consiste em um motif de domínio de eixo ou domínio de eixo do polipeptídeo de fibra Ad3, um motif de domínio de eixo ou domínio de eixo do polipeptídeo de fibra Ad7, um motif de domínio de eixo ou domínio de eixo do polipeptídeo de fibra Ad11, um motif de domínio de eixo ou domínio de eixo do polipeptídeo de fibra Ad 14, um domínio de eixo de polipeptídeo de fibra Ad14a , ou combinações de motif de domínio de eixo dos mesmos e seus equivalentes funcionais. Em uma modalidade adicional, cada domínio de eixo ou motif de domínio de eixo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um de SEQ ID NOS: 12-18, SEQ ID NO: 43-48, ou suas combinações. Em outra modalidade, o domínio de dimerização compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO: 25. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de qualquer um de SEQ ID NO:28-34. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fibra AdB-2/3 é multimerizado, tal como dimerizado. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo de fibra AdB-2/3 compreende, adicionalmente, um ou mais compostos conjugados ao polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, tais como agentes terapêuticos, de diagnóstico e imageamento.
[0008] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê ácidos nucleicos isolados codificando o peptídeo isolado ou os polipeptídeos de fibra AdB-2/3 recombinantes da invenção, vetores de expressão recombinantes que compreendem os ácidos nucleicos isolados e células hospedeiras que compreendem os vetores de expressão recombinantes.
[0009] Em outro aspecto, a presente invenção provê composições farmacêuticas, compreendendo iv. o multímero da fibra AdB-2/3 de qualquer modalidade ou combinação de modalidades da invenção; e um portador farmaceuticamente aceitável.
[00010] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê métodos para melhorar o tratamento terapêutico ou diagnóstico de um distúrbio associado com tecido epitelial, e/ou imageamento de tecidos epiteliais, compreendendo a administração a um sujeito em necessidade do mesmo: v. uma quantidade de um ou mais terapêuticos suficientes para tratar o distúrbio, diagnóstico suficiente para diagnosticar o distúrbio, e/ou agente de imageamento suficiente para o imageamento do tecido epitelial; e vi. uma quantidade de um multímero de fibra AdB-2/3 ou composição farmacêutica de qualquer modalidade ou combinação de modalidades da invenção, suficiente para melhorar a eficácia do um ou mais agentes terapêuticos, de diagnóstico e/ou imageamento.
[00011] Tais distúrbios exemplares associados com o tecido epitelial incluem tumores sólidos, síndrome do intestino irritável, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, constipação, doença do refluxo gastroesofágico, esôfago de Barrett, doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, bronquite, enfisema pulmonar, fibrose cística, doença intersticial pulmonar, pneumonia, hipertensão pulmonar primária, embolia pulmonar, sarcoidose pulmonar, tuberculose, pancreatite, distúrbios do ducto pancreático, obstrução das vias biliares, colecistite, coledocolitíase, distúrbios cerebrais, psoríase, dermatite, glomerulonefrite, hepatite, diabetes, distúrbios da tireóide, celulite, infecção, pielonefrite e cálculos biliares.
[00012] Em outro aspecto, a presente invenção provê métodos para o tratamento de um distúrbio associado com tecido epitelial, compreendendo administrar a um sujeito que necessite deste uma quantidade de um multímero de fibra AdB-2/3 ou composição farmacêutica de qualquer modalidade ou combinação de modalidades da invenção, suficiente para tratar o distúrbio. Em modalidades exemplares, tal distúrbio pode ser uma infecção viral ou um tumor sólido.
[00013] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê métodos para melhorar a entrega de um composto a um tecido epitelial, compreendendo colocar em contato o tecido epitelial com um ou mais compostos a serem entregues ao tecido epitelial; e uma quantidade de um multímero de fibra AdB-2/3 ou composição farmacêutica de qualquer modalidade ou combinação de modalidades da invenção, suficiente para melhorar a entrega dos um ou mais compostos ao tecido epitelial. Em modalidades exemplares, os um ou mais compostos podem ser agentes de diagnóstico ou de imageamento.
[00014] Em um aspecto ainda adicional, a presente invenção provê métodos para aprimorar a entrega de uma substância a um tecido expressando desmogleína 2 (DSG2), compreendendo colocar em contato o tecido expressando DSG2 com vii. um ou mais compostos para serem entregues ao tecido; e viii. uma quantidade de um multímero de fibra AdB-2/3 ou composição farmacêutica de qualquer modalidade ou combinação de modalidades da invenção, suficiente para melhorar a entrega do um ou mais compostos ao tecido.
[00015] Em outro aspecto, a presente invenção provê métodos para induzir uma transição epitélio-mesenquimal (EMT) em um tecido, compreendendo colocar o tecido epitelial em contato com uma quantidade de um multímero de fibra AdB-2/3 ou composição farmacêutica de qualquer modalidade ou combinação de modalidades da invenção, suficiente para induzir EMT.
[00016] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê métodos para identificar compostos candidatos a um ou mais de tratamento de um distúrbio associado com tecido epitelial, aprimorar a entrega de uma substância a um tecido epitelial, para aprimorar a entrega de um tecido de substância que expressa DSG2, induzir um EMT em um tecido e/ou tratar uma infecção de AdB-2/3, compreendendo ix. colocar em contato um multímero de fibra AdB-2/3 de qualquer modalidade ou combinação de modalidades da invenção, a DSG2 em condições para promover a ligação de multímero a DSG2, em que o contato é realizado na presença de um ou mais compostos de teste; e x. identificar compostos de teste positivos que competem com o multímero de fibra AdB-2/3 para ligação a DSG2 em comparação ao controle;
[00017] em que os compostos de teste positivos são compostos candidatos a um ou mais de tratamento de um distúrbio associado com tecido epitelial, aprimoramento da entrega de uma substância a um tecido epitelial, para aprimoramento da entrega de um tecido de substância que expressa DSG2, indução de um EMT em um tecido e/ou tratamento de uma infecção de AdB-2/3.
Descrição das Figuras
[00018] Figura 1. Resíduos considerados por serem criticamente envolvidos na ligação a DSG2. A) São mostradas as sequências de aminoácidos da região globular da fibra Ad3 e Ad14p1. Folhas-beta presentes na região globular Ad3 (número de adesão PDB 1H7Z_A) e região globular Ad14 (PDB: 3F0Y_A) são indicadas por linhas. Setas pretas indicam resíduos dentro da região globular da fibra Ad3 que, ao sofrerem mutação individualmente, executam ablação ou redução da ligação a DSG2. Em comparação com a cepa parental Ad14(deWit), Ad14p1 tinha uma deleção de dois resíduos de aminoácidos dentro do ciclo de FG da região globular da proteína da fibra (24) indicada por um triângulo. B) Estrutura esquemática de mutantes de região globular da fibra Ad3 dimérica. O domínio da região globular da fibra e um motif de eixo foram fundidos através de um vinculador flexível para um domínio de espiral K de homodimerização (41). As proteínas são autodimerizantes e podem ser purificadas por cromatografia de afinidade de His-Ni-NTA. C-F) Análise de ligação de mutantes de região globular da fibra Ad3 dimérica para DSG2 solúvel. C e D) Coloração Coomassie. 10Dg de região globular da fibra Ad3 purificada, (não fervidos) foram carregados por faixa. Formas triméricas das regiões globulares de fibra são indicadas por uma seta. O gel continha SDS e o tampão de carregamento contendo DTT, que causou a desmontagem de dímeros de regiões globulares de fibra triméricas como relatado anteriormente (41). E e F): Western blot usando DSG2 recombinante solúvel como uma sonda, seguido por anti-DSG2-mAb e anti-mouse IgG- HRP. Para comparação, JO-1 (0,5 g /faixa) w mostrado. Os western blots foram examinados e sinais foram quantificados.
[00019] Figura 2. Modelo 3D da região globular da fibra Ad3. A estrutura é baseada no número de adesão PDB 1H7Z_A. Painel superior: Quatro áreas críticas envolvidas na ligação de DSG2. Os resíduos críticos são mostrados na isosuperfície da região globular da fibra trimérica. Vista de topo (lado apical) virada para o receptor. Painel inferior: Todos os resíduos críticos combinaram. Lado direito: Um alargamento do sulco após uma ligeira rotação lateral.
[00020] Figura 3. Competição de vírus Ad3 por mutantes de região globular Ad3 dimerizadas. A) Anexo relativo de vírus Ad3 rotulado 3H na presença de mutantes de região globular da fibra dimérica. Células 1,8 x 105 HeLa foram incubadas com mutantes de região globular Ad3 a uma concentração de 2,5 e 100Dg/ml no gelo por 1 hora. Em seguida, 400 pfu/célula de vírus Ad3 3H foi adicionado no gelo por mais uma hora. Partículas de vírus não ligadas foram lavadas. Fixação de partículas de vírus incubadas com PBS foi tomada como 100%. N=3. B) Concorrência de infecção por vírus Ad3-GFP em células HeLa. Células 1,5 x 105 HeLa foram cultivadas em 24 placas de poço. As células foram incubadas com os mutantes da região globular Ad3 a concentrações crescentes por uma hora em temperatura ambiente. 100 pfu/célula de vírus Ad3-GFP, em seguida, foram adicionados e expressão de GFP foi analisada 18 horas mais tarde por citometria de fluxo. Painel esquerdo: porcentagem de células positivas de GFP. Painel direito: intensidade de fluorescência média. N=3. O desvio padrão foi inferior a 10%. C) Anexo relativo de vírus Ad3 rotulado 3H na presença de mutantes de região globular da fibra dimérica com mutações múltiplas. O estudo foi realizado como descrito em B) O desvio padrão foi inferior a 10%. D) Concorrência de infecção por vírus Ad3-GFP em células HeLa. O estudo foi realizado como descrito em C) O desvio padrão foi inferior a 10%.
[00021] Figura 4. Análise de ligação de região globular da fibra Ad3 a CD46 solúvel. Regiões globulares de fibra Ad3 contendo números diferentes de motifs de eixo e a região globular da fibra do tipo selvagem Ad3 (faixa 1: Ad3-S6/Kn, faixa 2: Ad3-S5/Kn, faixa 3: Ad3-S4/Kn, faixa 4: Ad3-S3/Kn, faixa 5: Ad3-S2/Kn, faixa 6: Ad3-S/kN), JO-1 (faixa 7) e a região globular da fibra Ad35 ligando a CD46 (faixa 8) sofreram blotting e foram hibridizados com DSG2 solúvel (painel superior) ou CD46 solúvel (painel inferior). Ligação foi detectada por mAb anti-DSG2 ou mAb anti-CD46.
[00022] Figura 5. Correlação de ligação de DSG2 reduzida com a capacidade de abrir junções epiteliais. A) Resistência elétrica transepitelial (TEER) medida em células T84 de câncer de cólon polarizadas. As células foram cultivadas em câmaras transwell até que a TEER fosse constante, ou seja, junções firmes haviam se formado. Um total de 5Dg de regiões globulares de fibra Ad3 diméricas em PBS, em seguida, foi adicionado por 1 hora à câmara apical. TEER foi medida nos pontos de tempo indicados. N=6. Para pontos de tempo 1,5 e 4 horas, a diferença entre JO-1 vs D261N e N186D foi significativa (p < 0,01). As setas indicam a adição e a remoção das regiões globulares de fibra Ad3. B) Melhoria de terapia com irinotecano. Um total de células 4x106 A549 foi injetado por via subcutânea camundongos beges CB17-SCID. Uma vez que o tumor atingiu um volume de ~100 mm3 (dia 15 após a implantação), os camundongos foram injetados por via intravenosa com 2mg/kg de JO-1, E299V, N186D ou PBS, seguido por uma injeção intravenosa de irinotecano (37,5 mg/kg), uma hora mais tarde. O tratamento foi repetido no dia 25. N=5. As diferenças entre os grupos "irinotecano" vs "E299V + irinotecano" ou "irinotecano" vs "N186 + irinotecano" não foram significativas. A diferença entre "irinotecano" vs "JO- 1 + irinotecano" foi significativa (p < 0,01) do dia 20 em diante.
[00023] Figura 6. Substituições de aminoácidos que aumentam a ligação a DSG2. A) É mostrada a sequência de aminoácidos da região globular da fibra Ad3. Folhas-beta são indicadas por linhas. As setas indicam resíduos dentro da região globular da fibra Ad3 que, quando mutada rendeu sinais mais fortes em ensaios de colony blot, indicando ligação mais forte a DSG2. B) A isosuperfície dos três monômeros de região globular. Painel esquerdo: Vista superior; Painel direito: Vista lateral. V239 e Y250 não estão expostos na parte superior, sugerindo uma mudança estrutural na região globular em vez de um envolvimento em ligação direta a DSG2. C) Localização de todas as mutações que aumentam a ligação a DSG2. Resíduos são mostradas em magenta em dois monômeros de região globular. Isosuperfície de um monômero é mostrada em transparência cinza.
[00024] Figura 7. Análise de SPR de interações da região globular da fibra Ad3 não dimerizada com DSG2. A) DSG2 foi imobilizada em sensorchips, e plano de fundo foi subtraído automaticamente da célula de fluxo de controle. As regiões globulares de fibra Ad3 (sem o domínio de dimerização: "noDD") foram injetadas por 3 minutos em 2,5 Dg/ml, seguido de um período de dissociação de 2,5 minutos. B) Resumo dos dados de SPR. Um intervalo de concentração de 2,5 a 10 Dg/ml das regiões globulares foi injetado e parâmetros de cinética e afinidade foram avaliados utilizando o software BIAeval. Os dados extraídos são retomados na tabela. Wt=Região globular da fibra Ad3 sem mutações
[00025] Figura 8. Microscopia eletrônica e estrutura 3D de mutante da região globular da fibra Ad3 JO-2. A-C) Coloração negativa de JO-2 com SST. Formas diméricas podem ser vistas, mas organizações superiores também são visíveis, um complexo heterogêneo de cerca de 50nm representado por setas finas e uma partícula "que se assemelha à dodecaédrica" menor regular representada por setas grossas. Vistas de perto são apresentadas em B e C. D-G) Estrutura cristalográfica de forma não dimerizada de (mutante K217E/F224S). D) cristais de proteína. E) A região globular Ad3 do tipo selvagem é tingida em cinza com o ciclo EF 217-224 separadamente tingido. Este é o ciclo que se torna desordenado no mutante. Não há nenhuma densidade para estes resíduos na estrutura mutante. F) O mutante é exibido como um esboço. G) Sobreposição destas duas estruturas mostra que o ciclo EG é completamente desordenado no mutante K217E/F224S. Os painéis de fundo mostram vistas de perto de um monômero. K217 e F224 aparecem como varas.
[00026] Figura 9. Análise de mutantes de região globular da fibra Ad3 diméricos com maior afinidade a DSG2. A) Concorrência de infecção por vírus Ad3-GFP em células HeLa com mutante aprimorado de afinidade dimérica Y250F e JO-1 (região globular da fibra Ad3 wt dimérica). A configuração experimental é conforme descrito para Fig.3C. painel esquerdo: porcentagem de células positivas de GFP. Painel direito: intensidade de fluorescência média. N=3. O desvio padrão foi inferior a 10%. B) Concorrência de infecção por vírus Ad3-GFP em células HeLa por mutantes de região globular Ad3 com ligação de DSG2 aprimorada, mas sem domínio de dimerização. Células 1,5 x 105 HeLa foram cultivadas em 24 placas de poço. As células foram incubadas com os mutantes da região globular Ad3 às concentrações crescentes por uma hora em temperatura ambiente. 100 pfu/célula de vírus Ad3GFP, em seguida, foram adicionados e expressão de GFP foi analisada 18 horas mais tarde. C) TEER em células de câncer do cólon T84. A configuração experimental foi a mesma para Fig. 5A. A TEER a 4 horas é mostrada. N=3.
[00027] Figura 10. Combinação de versões de JO-1 aprimorada por afinidade com quimioterapia. A) Melhoria de terapia com irinotecano (I). A configuração experimental foi a mesma que na Fig. 5B. As diferenças nos grupos "JO-1 + I" vs "JO-2+irinotecano" e "JO-2 + I" vs "JO-4+I foram significativas do dia 20 em diante. N=5. B) JO-4 aprimora terapia por PLD em um modelo de câncer de ovário em dose mais baixa do que JO-1. Tumores da gordura mamária foram estabelecidos a partir de células de câncer de ovário primário ovc316. Tratamento foi iniciado quando tumores atingiram um volume de 100mm3. Camundongos foram injetados por via intravenosa com 2 mg/kg de JO-1 ou com 0,5 mg/kg de JO-4, seguido por uma injeção intravenosa de doxorrubicina lipossomal peguilada (PLD) (1mg/kg), uma hora mais tarde. Tratamento foi repetido semanalmente. C) JO-4 aumenta a terapia no câncer de mama negativo triplo (TNBC) de prognóstico pouco favorável. Um total de células 4 x 106 TNBC MDA-MB- 231 foram injetadas na gordura mamária de camundongos beges CB17 SCID. JO-4 (2mg/kg) foi injetado por via intravenosa 1 hora antes da aplicação do cetuximab (C) (10mg/kg, i.p.) e nab-paclitaxel (nab-P) (5mg/kg, i.v.). Tratamento foi dado semanalmente. N=10 P<0,01 no dia 25 para nab-P+C vs JO-4+nab-P+C.
[00028] Figura 11. Farmacocinética, toxicidade e imunogenicidade de JO-4. A) Depuração de soro de JO-1 e JO-4. camundongos transgênicos hDSG2 com tumores subcutâneos de TC1- hDSG2 (~600mm3) foram injetados por via intravenosa com JO-1 ou JO-4 (2mg/kg) e amostras de soro foram analisadas por ELISA. N=3. Observe que o eixo y tem uma escala logarítmica. B) Contagem de linfócitos e plaquetas em camundongos transgênicos hDSG2/TC1-hDSG2 após a injeção de JO-1 ou JO-4. N=3. C) Estudos de terapia em camundongos transgênicos hDSG2 imunocompetentes com tumores TC1-hDSG2. Quando tumores atingiram um volume de ~80mm3, JO-1 ou JO-4 (2mg/kg) ou PBS foi injetado por via intravenosa seguido uma hora mais tarde de PLD/Doxil (i.v. 1,5 mg/kg). Tratamento foi repetido como indicado por setas. Tumores em seguida foram autorizados a voltar a crescer novamente por cerca de duas semanas. Do dia 15 em diante anticorpos anti-JO-1/J)-4 do soro foram detectáveis por ELISA. Mais dois ciclos de tratamento foram realizadas no dia 28 e dia 35. JO-1 e JO-4 continuaram a ser eficazes após múltiplos ciclos de tratamento, mesmo na presença de anticorpos detectáveis. A diferença entre JO-1/PLD vs JO-4/PLD é significativa do dia 31 em diante. N=10.
[00029] Figura 12. Alinhamento de sequências de região globular da fibra. Os resíduos que realizam ablação/reduzem a ligação da região globular Ad3 para DSG2 são indicados.
[00030] Figura 13. Os soros de humanos e camundongos hipervacinados não inibem a atividade de JO-4. A) Análise de soro humano para ligação com JO-4 por ELISA. Anticorpos policlonais de coelho contra a região globular da fibra Ad3 foram utilizados para captura, seguida de proteína de JO-1 recombinante, soro humano (diluições 1:20 a 1:1000) e IgG-HRP anti-humano. Soro Ab humano comercial empobrecido de IgG foi usado como um controle negativo (linha horizontal). Soro de um cientista que trabalha rotineiramente com vírus Ad3 foi usado como controle positivo. P1 a P38 são amostras de soro para pacientes com câncer de ovário, obtidas do Pacific Ovarian Cancer Research Consortium.
Descrição Detalhada da Invenção
[00031] Todas as referências citadas são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade. Dentro deste pedido, salvo indicação em contrário, as técnicas utilizadas podem ser encontradas em qualquer uma das várias referências conhecidas, tais como: Clonagem molecular: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory prima), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification" em Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, Ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2a Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. Nova, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, Nova Jersey) e o catálogo Ambion 1998 (Ambion, Austin, TX).
[00032] Como usado neste documento, as formas singulares "um", "uma" e "a/o" incluem referentes plurais, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. "E" como usado neste documento é usado permutavelmente com "ou", a menos que expressamente indicado o contrário.
[00033] Como usado neste documento, os resíduos de aminoácidos são abreviados da seguinte maneira: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutâmico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) e valina (Val; V).
[00034] Como usado neste documento, a abreviação "Ad" refere- se a um adenovírus e é normalmente seguida de um número indicando o sorótipo do adenovírus. Por exemplo, "Ad3" refere-se a adenovírus de sorótipo 3.
[00035] Todas as modalidades de qualquer aspecto da invenção também podem ser usadas em conbinação, a menos que o contexto claramente dite o contrário.
[00036] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê polipeptídeos isolados que compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: TLWTG(V/P)(N/K)P( /T)(E/R)ANC(Q/I)(M/I)(M/E)(Y/A/N/D) (S/G)(S/K)(E/Q)(S/N) (N/P)D(C/S)KL(I/T)L(I/T)LVK(T/N)G(A/G)(L/I)V(T/N)(A/G)(F/Y)V(Y/T)(V/L )(I/M)G(V/A) S(N/D)(N/D/Y)(F/V)N(M/T)L(T/F)(T/K)(Y/H/N)(R/K)N(I/V)(N/S)(F/I)(T/N)(A /V)EL(F/Y)FD (S/A)(A/T)G(N/H)(L/I)L(T/P)(S/R/D)(L/S)SSLKT(P/D)L(N/E) X2 X3(S/Y)(G/K)Q(N/T)(M/--)(A/--)(T/--)(G/--)A(I/L/D) X4 (N/S)A(K/R)(S/G)FMPSTTAYPF X5 (--/L)(N/P)(N/D/V) (N/A)(S/G)(R/T)(E/H)(N/K/--) X6 N X7 I(Y/F)G(T/Q)C(H/Y)Y X8 ASD(H/G/R)(T/A)(A/L)FP (I/L)(D/E)(I/V)(S/T)VMLN(Q/R/K)R(A/L)(I/L/P)(R/N/D)(A/D/N/S)(D/E/R)TS Y(C/V)(I/M) (R/T)(I/V/F)(T/L)WS(W/L) X9 (T/A)G(D/L/V)APE(G/V/--)(Q/-- )T(S/T)(A/Q)(T/A)TL(V/I) TSPFTF(Y/S)YIREDD (SEQ ID NO: 1); em que X2 é H, L ou P; X3 é K ou E; X4 é T, F, S ou L; X5 é V, D, ou está ausente; X6 é E, G), ou está ausente X7 é Y ou F; X8 é T, K ou E; e X9 é N ou S; em que pelo menos um dos seguintes é verdadeiro: X2 é P; X3 é E; X4 é S ou L; X5 é D; X6 é G); X7 é F; X8 é E; ou X9 é S.
[00037] Polipeptídeos isolados de acordo com este aspecto da invenção compreendem domínios de região globular AdB-2/3 mutante, os quais podem ser usados, por exemplo, para produzir polipeptídeos de fibra AdB-2/3 recombinantes que proveem afinidade significativamente aprimorada para desmogleína 2 (DSG2) em comparação com os polipeptídeos de ligação DSG2 anteriormente conhecidos. Como mostrado nos exemplos que se seguem, polipeptídeos da fibra AdB-2/3 recombinantes da invenção que incorporam os domínios da região globular mutantes deste primeiro aspecto da invenção são adicionalmente mostrados por serem terapeuticamente mais potentes do que os polipeptídeos de ligação DSG2 anteriormente conhecidos por tratar distúrbio associado ao epitelial, exemplificado pela eficácia melhorada em uma série de modelos de câncer. Os peptídeos isolados da invenção também podem ser usados, por exemplo, como antígenos contra vírus AdB-2/3.
[00038] Em uma modalidade, os polipeptídeos isolados do primeiro aspecto da invenção compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos TLWTG(V/P)(N/K)P(E/R)ANC(Q/I)(M/I)(M/E)(Y/A/N/D)(S/G)(S/K)(E/Q)(S/ N)(N/P)D (C/S)KL(I/T)L(I/T)LVK(T/N)G(A/G) (L/I)V(T/N)(A/G)(F/Y)V(Y/T)(V/L)(I/M)G(V/A)S(N/D) (N/D/Y)(F/V)N(M/T)L(T/F)(T/K)(Y/H/N)(R/K)N(I/V)(N/S)(F/I)(T/N)(A/V)EL( F/Y)FD(S/A) (A/T)G(N/H)(L/I)L(T/P)(S/R/D)(L/S)SSLKT(P/D)L(N/E) X2 X3(S/Y)(G/K)Q(N/T)A(I/L/D) X4 (N/S)A(K/R)(S/G)FMPSTTAYPF X5 (-- /L)(N/P)(N/D/V)(N/A)(S/G)(R/T)(E/H)(N/K/--) X6 N X7 I(Y/F)G(T/Q)C(H/Y)Y X8 ASD(H/G/R)(T/A)(A/L)FP(I/L)(D/E)(I/V)(S/T)VMLN (Q/R/K)R(A/L)(I/L/P)(R/N/D)(A/D/N/S)(D/E/R)TSY(C/V)(I/M)(R/T)(I/V/F)(T /L)WS (W/L) X9 (T/A)G(D/L/V)APET(S/T)(A/Q)(T/A)TL(V/I)TSPFTF(Y/S)YIREDD (SEQ ID NO: 2).
[00039] Em outra modalidade, os polipeptídeos isolados do primeiro aspecto da invenção compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos TLWTG(V/P)(N/K)P(E/R)ANC(Q/I)(M/I)(M/E)(Y/A/N/D)(S/G)(S/K)(E/Q)(S/ N)(N/P)D (C/S)KL(I/T)L(I/T)LVK(T/N)G(A/G) (L/I)V(T/N)(A/G)(F/Y)V(Y/T)(V/L)(I/M)G(V/A)S(N/D) (N/D/Y)(F/V)N(M/T)L(T/F)(T/K)(Y/H/N)(R/K)N(I/V)(N/S)(F/I)(T/N)(A/V)EL( F/Y)FD(S/A) (A/T)G(N/H)(L/I)L(T/P)(S/R/D)(L/S)SSLKT(P/D)L(N/E) X2 X3(S/Y)(G/K)Q(N/T)A(I/L/D) X4 (N/S)A(K/R)(S/G)FMPSTTAYPF X5 L(N/P)(N/D/V)(N/A)(S/G)(R/T)(E/H)(N/K/) X6 N X7 I(Y/F)G(T/Q)C(H/Y)Y X8 ASD(H/G/R)(T/A)(A/L)FP(I/L)(D/E)(I/V)(S/T)VMLN (Q/R/K)R(A/L)(I/L/P)(R/N/D)(A/D/N/S)(D/E/R)TSY(C/V)(I/M)(R/T)(I/V/F)(T /L)WS (W/L) X9 (T/A)G(D/L/V)APET(S/T)(A/Q)(T/A)TL(V/I)TSPFTF(Y/S)YIREDD (SEQ ID NO: 3).
[00040] Em uma modalidade adicional, os polipeptídeos isolados do primeiro aspecto da invenção compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos
[00041] TLWTGPKPEA NCIIEYGKQN PDSKLTLILV KNGG(I/L)VNGYV TLMGASDYVN TLFKNKNVSI NVELYFDATG HILPDSSSLK TDLEX2 X3YKQT AD X4 SARGFMP STTAYPFX5LP NAGTHNX6NX7 I FGQCYY X8 ASD GALFPLEVTV MLNKRLPDSR TSYVMTFLWS LX9AGLAPETT QATLITSPFT FSYIREDD (SEQ ID NO: 4). Em todas estas modalidades, pelo menos uma das seguintes opções é verdadeira: X2 é P; X3 é E; X4 é S ou L; X5 é D; X6 é G); X7 é F; X8 é E; ou X9 é S.
[00042] Em diversas modalidades, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todas as 8 destas declarações são verdadeiras. Em uma modalidade exemplar, pelo menos X7 é F. Em outra modalidade, pelo menos X3 é E e X4 é S. Em outra modalidade, pelo menos X9 é S. Em uma modalidade adicional, pelo menos X5 é D. Em outra modalidade, pelo menos X4 é L. Em outra modalidade, pelo menos X2 é P e X8 é E. Em outra modalidade, pelo menos X6 é G e X8 é E.
[00043] Em diversas modalidades adicionais, o polipeptídeo isolado compreende ou consiste em um dos seguintes peptídeos: XI. TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLM GASDYVNTL
[00044] FKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTA DFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENFIFGQCYYKASDGALFPLEVTVM LNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 5);
[00045] (b) TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVN
[00046] TLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELEYKQT ADSSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTV MLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 6);
[00047] (c) TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNT L
[00048] FKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTA DFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVM LNKRLPDSRTSYVMTFLWSLSAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 7);
[00049] (d) TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNT L
[00050] FKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTA DFSARGFMPSTTAYPFDLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVM LNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 8);
[00051] (e) TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGLVNGYVTLMGASDYVN
[00052] TLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLEPKYKQT ADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYEASDGALFPLEVTV MLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 9);
[00053] (f) TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDY V
[00054] NTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQ TADLSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVT VMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 10); e
[00055] (g) TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASD YV
[00056] NTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQ TADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNGNYIFGQCYYEASDGALFPLEVT VMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 11).
[00057] Em um segundo aspecto, a presente invenção provê polipeptídeos de fibra AdB-2/3 recombinantes, compreendendo: xii. um ou mais domínios de eixo do polipeptídeo de fibra AdB-2/3, motifs de domínio de eixo ou seus equivalentes funcionais; xiii. um domínio globular do polipeptídeo de fibra AdB-2/3 ligado operativamente a e localizado no C-terminal ao um ou mais motifs de domínio de eixo ou domínios de eixo do polipeptídeo de fibra AdB-2/3, em que o domínio globular do polipeptídeo de fibra AdB-2/3 compreende o peptídeo de qualquer modalidade ou combinação de modalidades do primeiro aspecto da invenção; e xiv. um ou mais domínios de dimerização não derivados de AdB- 2/3 ligados operativamente a e localizado no N-terminal ao um ou mais motifs de domínio de eixo ou domínios de eixo do polipeptídeo de fibra AdB-2/3.
[00058] Como usado neste documento, "AdB-2/3" é qualquer sorótipo de adenovírus que usa DSG2 como um receptor de células epiteliais para ligação viral. Até hoje, foram identificados sorótipos Ad3, Ad7, Ad11, Ad14 e Ad14a. Como outros sorótipos Ad são identificados, aqueles versados na técnica podem facilmente identificar aqueles que pertencem à família de AbD-2/3 com base em ensaios de ligação a DSG2, como divulgado neste documento. Por exemplo, estudos de ressonância de plasmon de superfície (SPR) usando sensores contendo DSG2 recombinante imobilizado podem ser usados para determinar se novos sorótipos Ad ligam a DSG2, juntamente com os estudos de concorrência de DSG2. Exemplares estudos adicionais, tais como análises de perda e ganho de função, são descritos em detalhe em WO 2011/156761.
[00059] O adenovírus vírion é um icosaedro caracterizado por uma fibra localizada na base de cada um dos 12 vértices do capsídeo. A fibra no vírion é uma estrutura homotrimérica que consiste em 3 polipeptídeos de fibra individuais. Cada polipeptídeo de fibra de adenovírus é uma estrutura assimétrica que consiste em uma cauda de N-terminal, que interage com a proteína de penton base do capsídeo e contém os sinais necessários para o transporte da proteína para o núcleo da célula; um eixo, que contém um número de unidades de repetição de 15 resíduos; e um domínio de região globular de C-terminal que contém os determinantes para a ligação do receptor (J.S. Hong e J.A. Engler, Journal of Virology 70: 7071-7078 (1996)). Todos os adenovírus anexam aos seus receptores através da estrutura da região globular na extremidade da fibra. Assim, como usado neste documento, o termo "polipeptídeo de fibra" AdB-2/3 refere-se a um polipeptídeo de fibra de comprimento total que compreende um domínio cauda de N-terminal, um domínio de eixo ou motif de domínio de eixo e um domínio de região globular do C-terminal. Os polipeptídeos de fibra reúnem-se espontaneamente em homotrímeros, referidos como "fibras", os quais estão localizados na parte externa do adenovírus vírion na base de cada um dos doze vértices do capsídeo.
[00060] Em uma modalidade preferencial, os polipeptídeos recombinantes não incluem um domínio cauda de um polipeptídeo de fibra Ad. Como é divulgado em detalhes abaixo, os inventores identificaram resíduos críticos, mutação dos quais resultam em polipeptídeos de fibra com afinidade significativamente aprimorada para DSG2 e com potência terapêutica significativamente aprimorada. Os polipeptídeos deste aspecto da invenção podem ser, assim, usados, por exemplo, para formar multímeros de fibra AdB-2/3 para uso nos diversos métodos da invenção discutidos acima. Neste aspecto, os polipeptídeos recombinantes podem incluir domínios de eixo ou motifs de domínio de eixo a partir de qualquer vírus AdB-2/3, ou quaisquer mutantes (substituições, adições, exclusões, quimeras, etc.) para tais domínios de eixo ou motifs de domínio do eixo que mantêm ou aprimoram a afinidade de ligação a DSG2 e são capazes de formar multímeros (tais como dímeros) através do domínio de dimerização (equivalentes funcionais). Por exemplo, estudos de ressonância de plasmon de superfície (SPR) usando sensores contendo DSG2 recombinante imobilizado podem ser usados para determinar se polipeptídeos recombinantes sendo avaliados se ligam a DSG2, juntamente com os estudos de concorrência de DSG2.
[00061] Como usado em todo o presente pedido, o termo "polipeptídeo" é usado em seu sentido mais amplo para se referir a uma sequência de aminoácidos da subunidade. Os polipeptídeos da invenção podem compreender L-aminoácidos, D-aminoácidos (que são resistentes às proteases específicas de L-aminoácido in vivo) ou uma combinação de D- e L-aminoácidos. Os polipeptídeos descritos neste documento podem ser sintetizados quimicamente ou expressos de forma recombinante. Os polipeptídeos podem estar ligados a outros compostos para promover uma maior meia-vida in vivo, tal como por peguilação, HESilação, PASilação, glicosilação, ou podem ser produzidos como uma fusão de Fc ou em variantes não imunizadas. Tal ligação pode ser covalente ou não covalente como é entendido por aqueles versados na técnica.
[00062] Como usado neste documento, o termo "ligado operativamente" refere-se a um arranjo de elementos em que os domínios são configurados de forma que eles funcionem como uma unidade para a sua finalidade pretendida. O termo não exige que os domínios sejam imediatamente adjacentes no polipeptídeo, uma vez que sequências de espaçador/vinculador podem estar presentes entre os domínios, os comprimentos dos quais podem ser bastante variáveis. Em uma modalidade não limitante, o comprimento do espaçador entre quaisquer dois domínios dos polipeptídeos de fibra AdB-2/3 recombinantes pode ser entre cerca de 0 aminoácidos e cerca de 20 aminoácidos. Em diversas outras modalidades não limitantes, o comprimento do espaçador pode ser de 0-20, 0-19, 0-18, 0-17, 0-16, 0-15, 0-14, 0-13, 0-12, 0-11, 0-10, 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4, 0-3, 0-2, 0-1, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 113, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-20, 2-19, 2-18, 2-17, 2-16, 2-15, 2-14, 2-13, 2-12, 2-11, 2-10, 2-9 , 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 23, 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-20, 4-19, 4-18, 4-17, 4-16, 4-15, 4-14, 4-13, 4-12, 4-11, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-20, 5-19, 5-18, 5-17, 5-16, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-20, 6-19, 6-18, 6-17, 6-16, 6-15, 6-14 , 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-20, 7-19, 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 714, 7-13, 7-12, 7-11, 7-10, 7-9, 7-8, 8-20, 8-19, 8-18, 8-17, 8-16, 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 9-20, 9-19, 9-18, 9-17, 9-16, 9-15, 9-14, 9-13, 912, 9-11, 9-10, 10-20, 10-19, 10-18, 10-17, 10-16, 10-15, 10-14, 10-13, 1012, 10-11, 11-20, 11-19, 11-18, 11-17, 11-16, 11-15, 11-14, 11-13 , 11-12, 12-20, 12-19, 12-18, 12-17, 12-16, 12-15, 12-14, 12-13, 13-20, 13-19, 13 18, 13-17, 13-16, 13-15, 13-14, 14-20, 14-19, 14-18, 14-17, 14-16, 14-15, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 15-16, 16-20, 16-19, 16-18, 16-17, 17-20, 17 19, 17-18, 18-20, 18-19, 19-20, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, ou 0 aminoácidos em comprimento.
[00063] Como usado neste documento, "polipeptídeo recombinante" significa um produto de proteína de ocorrência não natural, em que os domínios do polipeptídeo recombinante são derivados de uma ou mais outras proteínas ou sequências derivadas artificialmente, tais como os polipeptídeos de domínio de região globular mutante da invenção. Por exemplo, cada domínio de eixo ou motif de domínio de eixo pode ser derivado de uma proteína diferente de ocorrência natural. O polipeptídeo recombinante pode ser construído por uma variedade de mecanismos, incluindo, mas não se limitando a, técnicas de manipulação de DNA padrão e montagem química através de partes de subunidade do polipeptídeo recombinante. A montagem química pode levar a uma forma equivalente como a forma genética molecular ou associações alternativas com função equivalente. Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo recombinante é produzido por técnicas padrão de DNA recombinante. Técnicas para tal produção recombinante e isolamento dos polipeptídeos recombinantes da invenção estão dentro do nível de habilidade na técnica com base nos ensinamentos neste documento.
[00064] Em uma modalidade, cada domínio de eixo ou motifs de domínio de eixo selecionados a partir do grupo que consiste em um motif de domínio de eixo ou domínio de eixo Ad3, um motif de domínio de eixo Ad5, um motif de domínio de eixo ou domínio de eixo Ad7, um motif de domínio de eixo ou domínio de eixo Ad11, um motif de domínio de eixo ou domínio de eixo Ad 14, um domínio de eixo Ad14a, ou motif de domínio de eixo, suas combinações e seus equivalentes funcionais. O domínio do eixo ou motifs de domínio de eixo necessários para dimerização da região globular da fibra, que é necessário para ligação a DSG2 e abertura transitória resultante de junções intercelulares. Como usado neste documento, um "motif de domínio de eixo" é qualquer porção de um domínio de eixo que permite dimerização de região globular da fibra dos polipeptídeos de fibra AdB-2/3 recombinantesda invenção. Tais motifs de domínio de eixo podem ser facilmente determinados por aqueles versados na técnica, com base nos exemplos providos abaixo. Por exemplo, estudos de ressonância de plasmon de superfície (SPR) usando sensores contendo DSG2 recombinante imobilizado podem ser usados para determinar se polipeptídeos recombinantes sendo avaliados se ligam a DSG2, juntamente com os estudos de concorrência de DSG2. Exemplares estudos adicionais, tais como análises de perda e ganho de função, são descritos em detalhe no Exemplo 1.
[00065] Os polipeptídeos recombinantes podem compreender entre 1 e 22 motifs de domínio do eixo ou domínios de eixo do polipeptídeo de fibra AdB-2/3. Assim, em diversas modalidades para polipeptídeos, compreendem 1-22, 1-21, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 112, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-22, 2-21, 2-20, 2-19, 2-18, 2-17, 2-16, 2-15, 2-14, 2-13, 2-12, 2-11, 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-22, 3-21, 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 311, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-22, 4-21, 4-20, 4-19, 4-18, 4-17, 416, 4-15, 4-14, 4-13, 4-12, 4-11, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-22, 5-21, 520, 5-19, 5-18, 5-17, 5-16, 5-15, 5-14, 5-13, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-22, 6-21, 6-20, 6-19, 6-18, 6-17, 6-16, 6-15, 6-14, 6-13, 6-12, 6-11, 610, 6-9, 6-8, 6-7, 7-22, 7-21, 7-20, 7-19, 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 7-14, 7-13, 7-12, 7-11, 7-10, 7-9, 7-8, 8-22, 8-21, 8-20, 8-19, 8-18, 8-17, 8-16, 8-15, 814, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 9-22, 9-21, 9-20, 9-19, 9-18, 9-17, 9-16, 915, 9-14, 9-13, 9-12, 9-11, 9-10, 10-22, 10-21, 10-20, 10-19, 10-18, 10-17, 10-16, 10-15, 10-14, 10-13, 10-12, 10-11, 11-22, 11-21, 11-20, 11-19, 1118, 11-17, 11-16, 11-15, 11-14, 11-13, 11-12, 12-22, 12-21, 12-20, 12-19, 12-18, 12-17, 12-16, 12-15, 12-14, 12-13, 13-22, 13-21, 13-20, 13-19, 1318, 13-17, 13-16, 13-15, 13-14, 14-22, 14-21, 14-20, 14-19, 14-18, 14-17, 14-16, 14-15, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 15-16, 16-22, 1621, 16-20, 16-19, 16-18, 16-17, 17-22, 17-21, 17-20, 17-19, 17-18, 18-22, 18-21, 18-20, 18-19, 19-22, 19-21, 19-20, 20-22, 20-21, 21-22, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 motifs de domínio de eixo ou domínios de eixo da proteína de fibra AdB-2/3. Onde mais de 1 motif de domínio de eixo ou domínio de eixo da proteína de fibra AdB-2/3 está presente, cada motif de domínio do eixo ou domínio de eixo pode ser idêntico, ou uma ou mais cópias do domínio do eixo ou motif de domínio do eixo podem ser diferentes em um único polipeptídeo recombinante. Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante tem um único motif de domínio do eixo ou domínio de eixo.
[00066] Em outra modalidade, um ou mais (ou todos) os domínios de eixo ou motifs de domínio do eixo no polipeptídeo recombinante compreendem ou consistem em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO 12:
[00067] GVL(T/S)LKC(L/V)(T/N)PLTT(T/A)(G/S)GSLQLKVG(G/S) GLTVD(D/T)T(D/N)G(T/F/S)L(Q/K/E)ENI(G/S/K)(A/V)(T/N)TPL(V/T)K(T/S)( G/N)HSI(G/N)L(S/P)(L/I)G(A/P/N)GL(G/Q)(T/I)(D/E)(E/Q)NKLC(T/S/A)KLG( E/Q/N)GLTF(N/D)S(N/S)N(I/S)(C/I)(I/A)(D/N/L)(D/K)N(I/--)NTL;
[00068] ou SEQ ID NOS:43-48:
[00069] Motif de domínio de eixo Ad3: NSIALKNNTL SEQ ID NO:43
[00070] Motif de domínio de eixo Ad7: NSNNICINDNINTL SEQ ID NO:44
[00071] Motif de domínio de eixo Ad5: GAITVGNKNNDKLTL SEQ ID NO:45
[00072] Motif de domínio de eixo Ad11: NSNNICIDDNINTL SEQ ID NO:46
[00073] Motif de domínio de eixo Ad14: NSNNICIDDNINTL SEQ ID NO:47
[00074] Motif de domínio de eixo Ad35: GDICIKDSINTL SEQ ID NO:48
[00075] Nessa sequência e outras sequências variáveis mostradas neste documento, os resíduos variáveis são notados entre parênteses e um "-" indica que o resíduo pode estar ausente.
[00076] Em outra modalidade, um ou mais (ou todos) os domínios de eixo ou motifs de domínio do eixo no polipeptídeo recombinante compreendem ou consistem em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO 13:
[00077] GVLTLKCLTPLTTTGGSLQLKVGGGLT(V/I)DDTDG(T/F) L(Q/K)ENI(G/S)ATTPLVKTGHSIGL(S/P)LG(A/P)GLGT(D/N)ENKLC(T/A)KL G(E/Q)GLTFNSNNICI(D/N) DNINTL
[00078] ou SEQ ID NOS: SEQ ID NOS:43-48
[00079] Em uma modalidade ainda adicional, um ou mais (ou todos) os domínios de eixo ou motifs de domínio do eixo no polipeptídeo recombinante compreendem ou consistem em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO:14 (Ad3), SEQ ID NO: 15 (Ad7), SEQ ID NO: 16 (Ad11), SEQ ID NO: 17 (Ad14), SEQ ID NO:18 (Ad14a) e SEQ ID NOS:43-48.
[00080] O domínio de região globular do polipeptídeo de fibra AdB-2/3 compreende ou consiste em qualquer modalidade ou combinação de modalidades do primeiro aspecto da invenção (ou seja: qualquer um dos SEQ ID NOS: 1-11); estes domínios de polipeptídeo são descritos em detalhes no primeiro aspecto da invenção.
[00081] Como usado neste documento um "domínio de dimerização" é uma sequência de peptídeo que promove a dimerização no polipeptídeo recombinante que o contém. Qualquer domínio de dimerização não derivado de AdB-2/3 pode ser usado no polipeptídeo recombinante da invenção, contanto que permita dimerização do polipeptídeo recombinante e, assim, ligação a DSG2. O domínio de dimerização é não derivado de AdB-2/3, no sentido de que não é um domínio de ocorrência natural em um polipeptídeo de fibra AdB-2/3. Exemplos não limitantes dos numerosos domínios de dimerização conhecidos àqueles versados na técnica e adequados para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a hélices de peptídeo contendo pelo menos uma hélice, ou uma estrutura formada por uma hélice, uma bobina e outra hélice, etc., estruturas de hélice superenrolada, domínios de dimerização dentro, por exemplo, de muitos receptores de sinalização de superfície de célula, regiões de Fc ou regiões de dobradiça de um anticorpo, zíperes de leucina, o domínio de N-terminal da proteína STAT, proteína de ligação FK506, do domínio de C-terminal da proteína LexA, receptores nucleares, o domínio de N-terminal do FkpA, proteína carotenóide laranja de A. maxima, proteína de matriz M1 da gripe, neuraminidase do vírus da gripe, e. coli fuculose aldolase; e similares. (vide, por exemplo, O'Shea, Science. 254: 539 (1991), Barahmand-Pour et al, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211: 121-128 (1996); Klemm et al, Annu. Rev. Immunol. 16: 569-592 (1998); Klemm et al, Annu. Rev. Immunol. 16: 569-592 (1998); Ho et al., Nature. 382: 822-826 (1996); e Pomeranz et al., Biochem. 37: 965 (1998)). Outros exemplos incluem resíduos 325 a 410 na proteína E2 do papilomavírus bovino, (Dostatni, N., et al., EMBO J 7 (1988) 3807-3816; Haugen, T., et al. EMBO J 7 (1988) 4245-4253; McBride, A., et al., EMBO J 7 (1988) 533-539; McBride, A., et al., Proc Natl Acad Sci USA 86 (1989) 510-514), desiodase Tipo I (D1): DFLVIYIEEAHASDGW (SEQ ID NO: 19) ou ADFL--YI-EAH—DGW (SEQ ID NO: 20); Proteína de capsídeo do HIV-1: QGPKEPFRDYVDRFYKTLRA (SEQ ID NO: 21); motif de dimerização do zíper de leucina de GCN4 de levedura: HMKQL D VEEL S NYHL N VARL K VGER (SEQ ID NO: 22); zíper de leucina na proteína de Escherichia coli transcriptional antiterminator; e BglG: GVTQLMREMLQLIKFQFSLNYQEESLSYQRLVT (SEQ ID NO: 23). Em modalidades preferenciais, o domínio de dimerização compreende uma ou mais cópias de EVSALEK (SEQ ID NO: 24) e/ou KVSALKE (SEQ ID NO: 25).
[00082] Está dentro do nível de habilidade na técnica identificar sequências de peptídeo apropriadas que podem servir como domínios de dimerização e seus mutantes, nos polipeptídeos recombinantes da presente invenção. Por exemplo, dimerização dos polipeptídeos de fibra AdB-2/3 recombinantes pode ser avaliada por critérios incluindo sedimentação em gradientes de sacarose, resistência à proteólise de tripsina e mobilidade eletroforética em géis de poliacrilamida (Hong e Engler, Journal of Virology 70: 7071-7078 (1996)).
[00083] Os polipeptídeos recombinantes podem compreender um ou mais domínios de dimerização não derivados de AdB-2/3. Assim, em diversas modalidades, o polipeptídeo recombinante compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais domínios de dimerização não derivados de AdB- 2/3. Onde múltiplos domínios estão presentes em um polipeptídeo, é preferencial que cada domínio de dimerização seja o mesmo.
[00084] Em uma modalidade preferencial, um peptídeo espaçador situa-se entre o domínio de dimerização e os um ou mais domínios de eixo ou motifs de domínio do eixo. Em uma modalidade adicionalmente preferencial, o peptídeo espaçador é um peptídeo com flexibilidade estrutural. Virtualmente qualquer peptídeo com flexibilidade estrutural pode ser usado. Como exemplo, o peptídeo flexível pode compreender repetições de resíduos de aminoácidos, tais como Gly-Gly- Gly-Ser (SEQ ID NO: 26), ou qualquer outra repetição adequada de resíduos de aminoácidos. Em outra modalidade, a região de dobradiça de um anticorpo pode ser usada. O espaçador pode ser qualquer comprimento adequado que mantenha a capacidade do polipeptídeo recombinante de dimerizar e manter a ligação do polipeptídeo recombinante a DSG2.
[00085] Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo AdB-2/3 recombinante compreende um ou mais domínios de eixo que compreendem ou consistem, cada um, em um domínio de eixo Ad3 de (SEQ ID NO:14)
[00086] Esta modalidade preferencial pode ser usada com qualquer modalidade ou combinação de modalidades descritas neste documento. Por exemplo, qualquer domínio globular adequado pode ser usado, e qualquer domínio de dimerização adequado pode ser usado, incluindo, mas não se limitando a uma ou mais cópias de EVSALEK (SEQ ID NO:24) e/ou KVSALKE (SEQ ID NO: 25). De forma similar, quaisquer peptídeos espaçadores adequados podem ser usados entre o domínio de dimerização e o domínio do eixo ou motif de domínio de eixo e/ou entre o domínio de eixo ou motif de domínio do eixo e o domínio globular. Em uma modalidade mais preferencial, o polipeptídeo AdB-2/3 recombinante compreende ou consiste em JO-1 (SEQ ID NO :27), ou um multímero deste (tal como um dímero).
[00087] Os polipeptídeos recombinantes podem compreender domínios adicionais, tais como um domínio para isolamento do polipeptídeo e/ou um domínio de detecção. Um domínio de isolamento pode ser adicionado para facilitar purificação/isolamento do polipeptídeo seguindo, por exemplo, produção de polipeptídeo recombinante. Qualquer domínio de isolamento adequado pode ser usado, incluindo, mas não se limitando a HIS, CBP, CYD (peptídeo NorpD covalente, porém dissociável), Strep II, FLAG, HPC (cadeia pesada de proteína C) marcações de peptídeo, marcações de afinidade GST e MBP. Como usado neste documento, "domínio de detecção" significa uma ou mais sequência de aminoácidos que pode ser detectada. Qualquer domínio de detecção adequado pode ser usado, incluindo, mas não se limitando a, proteínas inerentemente fluorescentes (por exemplo, proteínas fluorescentes verdes e proteínas fluorescentes de espécie de Anthozoa não bioluminescente), proteínas fluorescentes ou luminescentes que requerem cofator (por exemplo, ficobiliproteínas ou luciferases), e epitopos reconhecidos por anticorpos específicos ou outras sondas de ligação natural ou artificial específica, incluindo, mas não se limitando a, corantes, cofatores de enzimas e moléculas de ligação modificadas, que são rotuladas de forma fluorescente ou luminescente.
[00088] Em modalidades adicionais preferenciais, o polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de um dos seguintes XV. (M/-)
[00089] GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEG SGGGSGGGSGGGSNSIALKNN
[00090] TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGY VTLMGASDYVNTL
[00091] FKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTA DFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENFIFGQCYYKASDGALFPLEVTVM LNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 28);
[00092] (b) (M/-) GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGG GSNSIALKNN
[00093] TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGY VTLMGASDYVN
[00094] TLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELEYKQT ADSSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTV MLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD(SEQ ID NO: 29);
[00095] (c) (M/-) GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGG GSNSIALKNN
[00096] TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGY VTLMGASDYVNTL
[00097] FKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTA DFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVM LNKRLPDSRTSYVMTFLWSLSAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 30);
[00098] (d) (M/-) GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGG GSNSIALKNN
[00099] TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGY VTLMGASDYVNTL
[000100] FKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTA DFSARGFMPSTTAYPFDLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVM LNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 31);
[000101] (e) (M/-) GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGG GSNSIALKNN
[000102] TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGLVNGY VTLMGASDYVN
[000103] TLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLEPKYKQT ADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYEASDGALFPLEVTV MLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 32);
[000104] (f) (M/-) GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGG GSNSIALKNN
[000105] TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGY VTLMGASDYV
[000106] NTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQ TADLSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVT VMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 33); e
[000107] (g) (M/-) GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGG GSNSIALKNN
[000108] TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGY VTLMGASDYV
[000109] NTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQ TADFSARGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNGNYIFGQCYYEASDGALFPLEVT VMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 34).
[000110] Em outra modalidade, os polipeptídeos recombinantes estão em uma forma multimérica, tal como um dímero, trímero, etc. Em uma modalidade preferencial, um multímero compreende um dímero formado por dimerização através dos domínios de dimerização em cada homotrímero (ou seja: um polipeptídeo é um homotrímero através de trimerização do domínio globular) em forma multimérica (tal como um dímero), os polipeptídeos recombinantes compreendem multímeros de fibra AdB-2/3, e podem ser usados nos diversos métodos da invenção discutidos acima. Como será entendido por aqueles versados na técnica, tais multímeros podem compreender multímeros de polipeptídeo recombinante idêntico da invenção, ou podem compreender multímeros de diferentes polipeptídeos recombinantes da invenção. Em uma modalidade, os domínios de dimerização são os mesmos em cada polipeptídeo recombinante que forma parte do multímero. Em outra modalidade, os domínios de dimerização são diferentes em cada polipeptídeo recombinante que forma parte do multímero. Em outra modalidade, os domínios globulares e/ou de eixo são os mesmos em cada polipeptídeo recombinante que forma parte do multímero. Em outra modalidade, os domínios globulares e/ou de eixo são diferentes em cada polipeptídeo recombinante que forma parte do multímero.
[000111] Multimerização de fibra AdB-2/3 pode ser determinada de acordo com os métodos conhecidos aos praticantes da técnica. Por exemplo, multimerização dos construtos de fibra AdB-2/3 recombinantes pode ser avaliada por critérios incluindo sedimentação em gradientes de sacarose, resistência à proteólise de tripsina e mobilidade eletroforética em géis de poliacrilamida (Hong e Engler, Journal of Virology 70: 7071-7078 (1996)). Em matéria de mobilidade eletroforética, o multímero de fibra é um complexo muito estável e será executado em um peso molecular consistente com aquele de um multímero quando a amostra não é fervida antes de SDS-PAGE. Mediante ebulição, no entanto, a estrutura multimérica é interrompida e a proteína subsequentemente é executada em um tamanho consistente com o monômero de proteína.
[000112] Os polipeptídeos recombinantes, ou suas versões multiméricas, podem ser armazenados em solução ou congelados.
[000113] Em outra modalidade, os polipeptídeos recombinantes da invenção são combinados com (tais como conjugados a) um ou mais terapêuticos para um distúrbio associado com tecido epitelial. Tais conjugados podem ser usados, por exemplo, nos métodos terapêuticos da invenção. Métodos para conjugar os polipeptídeos da invenção a uma terapêutica de interesse, tais como por ligação covalente ou reticulação química, são conhecidos àqueles versados na técnica. Qualquer terapêutico adequado pode ser usado para formar um conjugado de acordo com esta modalidade da invenção, incluindo, mas não se limitando a compostos de degradação do tumor estromal (tais como a relaxina), agentes de alquilação, inibidores de angiogênese, anticorpos, antimetabólitos, antimitóticos, antiproliferativos, inibidores da quinase de aurora, inibidores de promotores da apoptose (por exemplo, Bcl-xL, Bcl-w e Bfl-1), ativadores da via de morte receptora, inibidores da quinase do Bcr- Abl, anticorpos BiTE (Bi-Specific T cell Engager), modificadores de resposta biológica, inibidores da quinase dependente de ciclina, inibidores do ciclo celular, inibidores da ciclo-oxigenase-2, inibidores do fator de crescimento, inibidores de chaperonas (heat shock protein) HSP90, agentes desmetilantes, inibidores de histona deacetilase (HDAC), terapias hormonais, medicamentos imunológicos, inibidores de proteínas de apoptose (IAPs) antibioticos intercambiáveis, inibidores da quinase, alvo mamífero de inibidores de rapamicina, inibidores de quinase regulados por sinal extracelular ativado por mitógeno do microRNA, proteínas de ligação multivalentes, drogas anti-inflamatórias não esteróides (AINEs), inibidores de poli ADP (adenosina difosfato)-ribose polimerase (PARP), quimioterápicos de platina, inibidores da quinase tipo pólo (Plk), inibidores do proteassoma, análogos de purina, análogos de pirimidina, inibidores do receptor de tirosina quinase, alcalóides de plantas retinóides/deltóides, pequenos ácidos ribonucléicos inibitórios (siRNAs), inibidores da topoisomerase e similares.
[000114] Terapêuticos exemplares abrangendo estas várias classes incluem,mas não estão limitados a: docetaxel, doxorrubicina, irinotecano, paclitaxel (Taxol®), partículas paclitaxel ligadas à albumina (Abraxane®), lipossomas HCL de doxorrubicina (Doxil®), anticorpos BiTE, tais como adecatumumab (Micromet MT201), blinatumomab (Micromet MT103) e similares, terapêuticos à base de siRNA, agentes de alquilação incluindo altretamina, AMD-473, AP-5280, apaziquona, bendamustina, brostallicina, bussulfano, carboquona, carmustina (BCNU), clorambucila, CLORETAZINE.® (laromustina, VNP 40101M), ciclofosfamida, dacarbazina,decitabina, 5'-azacitidina, estramustina, fotemustina, glufosfamida, ifosfamida, KW-2170, lomustina (CCNU), mafosfamida, melfalano, mitobronitol, mitolactol, nimustina, N-óxido de mostarda nitrogenada, ranimustina, temozolomida, tiotepa, TREANDA® (bendamustina), treossulfano, rofosfamida e similares; inibidores de angiogênese incluindo inibidores de tirosina quinase de receptor específico endotelial (Tie-2), inibidores de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), inibidores de receptor do fator de crescimento 2 de insulina (IGFR- 2), inibidores de metaloproteinase-2 de matriz (MMP-2), inibidores de metaloproteinase-9 de matriz (MMP-9), inibidores de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), análogos de trombospondina, inibidores de tirosina quinase de receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR) e similares; antimetabólitos, incluindo ALIMTA® (pemetrexede dissódico, LY231514, MTA), 5-azacitidina, XELODA® (capecitabina), carmofur, LEUSTAT® (cladribina), clofarabina, citarabina, ocfosfato de citarabina, arabinosida de citosina, decitabina, deferoxamina, doxifluridina, eflornitina, EICAR (5-etinil-1-.beta.-D-ribofuranosilimidazol-4-carboxamida), enocitabina, etnilcitidina, fludarabina, 5-fluorouracil sozinho ou em combinação com leucovorina, GEMZAR® (gemcitabina), hidroxiureia, ALKERAN® (melfalano), mercaptopurina, 6-mercaptopurina ribosídica, metotrexato, análogos de metotrexato (tais como trimetrexato e pralatraxato), ácido micofenólico, nelarabina, nolatrexede, ocfosfato, pelitrexol, pentostatina, raltitrexede, ribavirina, triapina, trimetrexato, S-1, tiazofurina, tegafur, TS-1, vidarabina e similares; inibidores de proteína Bcl- 2 incluindo AT-101 (gossipol (-)), GENASENSE® (G3139 ou oblimersen (nucleotídeos antisense visando Bcl-2)), IPI-194, IPI-565, N-(4-(4-((4'- cloro(1,1'-bifenil)-2-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4--(((1R)-3-(dimetilamino)- 1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-nitrobenzenosulfonamida) (ABT-737), N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetil-1-ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1- il)benzoil)-4-(((1R)-3-(morfolin-4-il)-1-((fenilsulfanil)metil-)propil)amino)-3- ((trifluorometil) sulfonil)benzenosulfonamida (ABT-263), GX-070 (obatoclax) e similares; Inibidores da quinase Bcr-Abl incluem DASATINIB® (BMS- 354825), GLEEVEC® (imatinib) e similares; inibidores CDK incluindo AZD- 5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT-2584, flavopiridol, GPC-286199, MCS-5A, PD0332991, PHA-690509, seliciclib (CYC-202, R-roscovitina), ZK- 304709 e similares; inibidores EGFR incluindo ABX-EGF, imunolipossomas anti-EGFR, vacina EGF, EMD-7200, ERBITUX® (cetuximab), HR3, anticorpos IgA, IRESSA® (gefitinib), TARCEVA® (erlotinib ou OSI-774), TP- 38, proteína de fusão EGFR, TYKERB® (lapatinib) e similares; inibidores de receptor ErbB2 incluem CP-724-714, CI-1033 (canertinib), HERCEPTIN® (trastuzumab), TYKERB® (lapatinib), OMNITARG® (2C4, petuzumab), TAK-165, GW-572016 (ionafarnib), GW-282974, EKB-569, PI-166, dHER2 (vacina HER2), APC-8024 (vacina HER-2), anticorpo biespecífico anti- HER/2neu, B7.her2IgG3, anticorpos biespecíficos trifuncionais AS HER2, mAb AR-209, mAb 2B-1 e similares; inibidores de histona deacetilase incluem romidepsina, LAQ-824, MS-275, trapoxina, ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA), TSA, ácido valproico e similares; inibidores HSP-90 incluindo 17-AAG-nab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17- DMAG, geldanamicina, IPI-504, KOS-953, MYCOGRAB® (anticorpo recombinante humano para HSP-90), NCS-683664, PU24FC1, PU-3, radicicol, SNX-2112, STA-9090 VER49009 e similares; ativadores de vias de receptor de morte incluindo TRIAL, anticorpos e outros agentes que visam TRIAL ou receptores de morte (por exemplo, DR4 e DR5), tais como Apomab, conatumumab, ETR2-ST01, GDC0145, (lexatumumab), HGS- 1029, LBY-135, PRO-1762 e trastuzumab; quimioterápicos de platina incluem cisplatina, ELOXATIN® (oxaliplatina) eptaplatina, lobaplatina, nedaplatina, PARAPLATIN® (carboplatina), satraplatina, picoplatina e similares; inibidores VEGFR incluindo AVASTIN® (bevacizumab), ABT-869, AEE-788, axitinib (AG-13736), AZD-2171, CP-547,632, IM-862, MACUGEN (pegaptamib), NEXAVAR® (sorafenib, BAY43-9006), pazopanib (GW- 786034), vatalanib (PTK-787, ZK-222584), SUTENT® (sunitinib, SU- 11248), VEGF trap, ZACTIMAThi (vandetanib, ZD-6474) e similares; terapia celular dendrítica (sipuleucel-T, Provenge®); inibidores de topoisomerase incluindo aclarubicina, 9-aminocamptotecina, amonafida, amsacrina, becatecarina, belotecano, BN-80915, CAMPTOSAR® (hidrocloreto de irinotecano), camptotecina, dexrazoxina, diflomotecano, edotecarina, ELLENCE® ou PHARMORUBICIN® (epirubicina), etoposida, exatecano, abraxano, irenotecano, 10-hidroxicamptotecina, gimatecano, lurtotecano, mitoxantrona, oratecina, pirarbucina, pixantrona, rubitecano, sobuzoxano, SN-38, tafluposida, topotecano e similares; anticorpos incluindo AVASTIN® (bevacizumab), anticorpos CD40 específicos, chTNT-1/B, denosumab, ERBITUX® (cetuximab), HUMAX-CD4® (zanolimumab), anticorpos IGF I R específicos, lintuzumab, PANOREX® (edrecolomab), RENCAREX® (WX G250), RITUXAN® (rituximab), ticilimumab, trastuzimab e similares; terapias hormonais incluindo ARIMIDEX® (anastrozol), AROMASIN® (exemestano), arzoxifeno, CASODEX® (bicalutamida), CETROTIDE® (cetrorelix), degarelix, deslorelina, DESOPAN® (trilostano), dexametasona, DROGENIL® (flutamida), EVISTA® (raloxifeno), AFEMA® (fadrozol), FARESTON® (toremifeno), FASLODEX® (fulvestrant), FEMARA® (letrozol), formestano, glicocorticoides, HECTOROL® (doxercalciferol), RENAGEL® (carbonato de sevelamer), lasofoxifeno, acetato de leuprolida, MEGACE® (megesterol), MIFEPREX® (mifepristona), NILANDRON® (nilutamida), NOLVADEX® (citrato de tamoxifeno), PLENAXIS® (abarelix), prednisona, PROPECIA® (finasterida), rilostano, SUPREFACT® (buserelina), TRELSTAR® (hormônio de liberação de hormônio luteinizante (LHRH)), VANTAS® (implante de histrelina), VETORYL® (trilostano ou modrastano), ZOLADEX® (fosrelina, goserelina) e similares; imunológicos incluindo interferon alfa, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon beta, interferon gama-1a, ACTIMMUNE® (interferon gama-1b) ou interferon gama-n1, combinações destes e similares. Outros agentes incluem ALFAFERONE® (IFN-alfa), BAM-002 (glutationa oxidada), BEROMUN® (tasonermina), BEXXAR® (tositumomab), CAMPATH® (alemtuzumab), CTLA4 (antígeno de linfócitos citotóxicos 4), decarbazina, denileukin, epratuzumab, GRANOCYTE® (lenograstim), lentinano, interferon-alfa de leucócito, imiquimod, MDX-010 (anti-CTLA-4), vacina contra melanoma, mitumomab, molgramostim, MYLOTARG.TM. (gentuzumab ozogamicina), NEUPOGEN® (filgrastim), OncoVAC-CL, OVAREX® (oregovomab), pemtumomab (Y-muHMFG1), PROVENGE® (sipuleucel-T), sargaramostim, sizofilano, teceleukin, THERACYS® (Bacillus Calmette-Guerin), ubenimex, VIRULIZIN® (imunoterápico, Lorus Pharmaceuticals), Z-100 (Substância Específica de Maruyama (SSM)), WF-10 (Tetraclorodecaóxido (TCDO)), PROLEUKIN® (aldesleucina), ZADAXIN® (timalfasina), ZENAPAX® (daclizumab), ZEVALIN®. (90Y-Ibritumomab tiuxetano) e similares; ofatumumab; agentes modificadores de resposta biológica incluindo krestin, sizofurano, picibanil PF-3512676 (CpG-8954), ubenimex e similares; análogos de pirimidina incluem citarabina (ara-C ou arabinosida C) citosina arabinosida, doxifluridina, FLUDARA® (fludarabina), 5-FU (5-fluorouracil), floxuridina, GEMZAR® (gemcitabina), TOMUDEX® (ratitrexed), TROXATYL® (triacetiluridina troxacitabina) e similares; análogos de purina incluindo LANVIS® (tioguanina) e PURI-NETHOL® (mercaptopurina); agentes antimitóticos incluindo batabulina, epotilona D (KOS-862), N-(2-((4- hidroxifenil)amino)piridin-3-il)-4-metoxibenzenosulfonamida, ixabepilona (BMS-247550), paclitaxel, TAXOTERE® (docetaxel), PNU100940 (109881), patupilona, XRP-9881 (larotaxel), vinflunina, ZK-EPO (epotilona sintética) e similares; e outros agentes quimioterápicos, tais como ABRAXANE® (ABI- 007), ABT-100 (inibidor de farnesil transferase), ADVEXIN® (vacina Ad5CMV-p53), ALTOCOR® ou MEVACOR® (lovastatina), AMPLIGE®. (poli I: poli C12U, um RNA sintético), APTOSYN® (exisulind), AREDIA® (ácido pamidrônico), arglabina, L-asparaginase, atamestano (1-metil-3,17- diona-androsta-1,4-dieno), AVAGE® (tazaroteno), AVE-8062 (derivado de combreastatina) BEC2 (mitumomab), cachectina ou cachexina (fator de necrose tumoral), canvaxina (vacina), CEAVAC® (vacina contra câncer), CELEUK® (celmoleucina), CEPLENE® (dicloridrato de histamina), CERVARIX® (vacina contra o papilomavírus humano), CHOP® (C: CYTOXAN® (ciclofosfamida); H: ADRIAMICINA® (hydroxydoxorubicin); O: Vincristina (ONCOVIN®); P: prednisona), CYPAT® (acetato de ciproterona), combrestatina A4P, DAB (389)EGF (domínios catalítico e de translocação de toxina da difteria fundida por meio de um vinculador His-Ala para fator de crescimento epidérmico humano) ou TransMID-107R® (toxinas de difteria), dacarbazina, dactinomicina, ácido 5,6- dimetilxantenona-4-acético (DMXAA), eniluracil, EVIZON. TM. (lactato de esqualamina), DIMERICINE® (loção de lipossomas T4N5), discodermolida, DX-8951f (mesilato de exatecano), enzastaurina, EPO906 (epitilona B), GARDASIL® (vacina recombinante contra papilomavírus humano quadrivalente (tipos 6, 11, 16, 18)), GASTRIMMUNE®, GENASENSE®, GMK (vacina conjugada de gangliosídeo), GVAX® (vacina contra o câncer de próstata), halofuginona, histerelina, hidroxicarbamida, ácido ibandrônico, IGN-101, IL-13-PE38, IL-13-PE38QQR (cintredekin besudotox), exotoxina de pseudomonas IL-13, interferon-.alfa., interferon-.gama., JUNOVAN® ou MEPACT® (mifamurtida) , lonafarnib, 5,10-metilenotetrahidrofolato, miltefosina (hexadecilfosfocolina), NEOVASTAT® (AE-941), NEUTREXIN® (trimetrexato glucuronato), NIPENT® (pentostatina), ONCONASE® (uma enzima de ribonuclease), ONCOPHAGE® (tratamento de vacina contra melanoma), ONCOVAX® (vacina Il-2), ORATHECIN® (rubitecano), OSIDEM® (droga celular à base de anticorpo), OVAREX®® MAb (anticorpo monoclonal murino), paclitaxel, PANDIMEX® (saponinas de aglicona de ginseng compreendendo 20(S)protopanaxadiol (aPPD) e 20(S)protopanaxatriol (aPPT)) , panitumumab, PANVAC®-VF (vacina contra o câncer experimental), pegaspargase, PEG-Interferon A, fenoxodiol, procarbazina, rebimastat, REMOVAB® (catumaxomab), REVLIMID® (lenalidomida), RSR13 (efaproxiral), SOMATULINE® (lanreotida), SORIATANE® (acitretina), estaurosporina (Streptomyces staurospores), talabostat (PT100), TARGRETIN® (Bexaroteno), TAXOPREXIN® (DHA- paclitaxel), TELCYTA® (canfosfamida, TLK286), temilifeno, TEMODAR® (temozolomida), tesmilifeno, talidomida, THERATOPE® (STn-KLH) , thymitaq (dicloridrato de 2-amino-3,4-dihidro-6-metil-4-oxo-5-(4- piridiltio)quinazolina), TNFERADE® (vetor adenoviral: Transportador de DNA contendo o gene para fator de necrose tumoral-.alfa.), TRACLEER® ou ZAVESCA® (bosentano), tretinoína (Retin-A), tetrandrina, TRISENOX®. (trióxido de arsênio), VIRULIZIN®, ukrain (derivado de alcaloides da planta quelidônia-maior), vitaxina (anticorpo anti-alfavbeta3), XCYTRIN® (gadolínio de motexafina), XINLAY® (atrasentano), XYOTAX® (paclitaxel poliglumex), YONDELIS® (trabectedina), ZD-6126, ZINECARD® (dexrazoxano), ZOMETA® (ácido zolendrônico), crizotinib, zorubicina e similares.
[000115] Em outra modalidade preferencial, o terapêutico compreende um composto que se liga a desmogleína-2; preferencialmente um composto que liga a DSG2 e abre as junções apertadas.
[000116] Em outras modalidades, o terapêutico compreende terapias de partículas radioativas/radiação. Qualquer terapia ou partícula radioativa adequada pode ser considerada apropriada por um médico, incluindo, mas não limitado a, cobalto-60, iodo-131, irídio-192, estrôncio-89, samário-153, rênio-186 e chumbo-212.
[000117] Em uma modalidade preferencial, o terapêutico é um terapêutico anti-tumor e compreende um anticorpo quimioterápico ou anti- tumoral monoclonal conforme descrito neste documento. Em uma modalidade preferencial adicional, o terapêutico anti-tumor compreende um anticorpo selecionado do grupo consistindo em trastuzumab, cetumiximab, petuzumab, apomab, conatumumab, lexatumumab, bevacizumab, bevacizumab, denosumab, zanolimumab, lintuzumab, edrecolomab, rituximab, ticilimumab, tositumomab, alemtuzumab, epratuzumab, mitumomab, gentuzumab ozogamicina, oregovomab, pemtumomab daclizumab, panitumumab, catumaxomab, ofatumumab e ibritumomab. Exemplos não limitantes de mAb anti-tumor útil e seus usos específicos são listados na Tabela 1 e, como adicionalmente descrito em Campoli, M., et al., Principles & Practice of Oncology 23(1&2):1-19 (2009), incorporado neste documento por referência. Tabela 1: mAbs de antígeno específico de tumor para tratamento do cancer
[000118] Em outra modalidade, os polipeptídeos recombinantes da invenção são combinados com (tais como conjugados a) um ou mais agentes de diagnóstico ou de imageamento. Os polipeptídeos recombinantes da invenção e seus multímeros, têm ampla aplicação para a entrega de qualquer diagnóstico, agente de imageamento ou outro composto para tecido epitelial compreendendo junções intercelulares onde o acesso a um alvo de interesse pode ser limitado. Em várias modalidades não limitantes, os agentes de imagem podem incluir qualquer composto químico que pode produzir um sinal detectável, direta ou indiretamente. Muitos de tais agentes de imagem são conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos de agentes de imagem adequados para uso nos métodos e composições divulgados são isótopos radioativos, moléculas fluorescentes, partículas magnéticas (incluindo nanopartículas), partículas metálicas (incluindo nanopartículas), moléculas fosforescentes, enzimas, anticorpos, ligantes e combinações destes, enquanto agentes de diagnóstico podem compreender um composto que é um marcador de diagnóstico para um distúrbio epitelial particular ligado ao tal agente de imageamento. Métodos para detectar e medir sinais gerados por agentes de imagem também são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, isótopos radioativos podem ser detectados pela contagem de cintilação ou visualização direta; moléculas fluorescentes podem ser detectadas com espectrofotômetros fluorescentes; moléculas fosforescentes podem ser detectadas com um espectrofotômetro ou visualizadas diretamente com uma câmera; enzimas podem ser detectadas por detecção ou visualização do produto de uma reação catalisada pela enzima; anticorpos podem ser detectados ao detectar um rótulo de detecção secundário acoplado ao anticorpo. Em uma modalidade preferencial, o agente de imageamento e/ou diagnóstico é aquele que pode ser usado para detectar um tumor, seja por ligação de tumor direta ou por acoplamento do agente de imageamento ou de diagnóstico com um composto que pode ligar o tumor.
[000119] Em diversas modalidades, o agente de imageamento pode ser um agente de imageamento fluorescente, enquanto agentes de diagnóstico podem compreender um composto que é um marcador de diagnóstico para um distúrbio epitelial particular ligado ao agente de imageamento fluorescente. Um agente de imageamento fluorescente é qualquer fração química que tem um sinal de fluorescência detectável. Este agente de imageamento pode ser usado sozinho ou em combinação com outros agentes de imagem. Exemplos de agentes fluorescentes adequados que podem ser usados nas composições e métodos divulgados neste documento incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína (FITC), éster 5-carboxifluorescein-N-hidroxisuccinimida, 5,6-carboximetil fluoresceína, nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il (NBD), fluorescamina, OPA, NDA, corante verde de indocianina, os corantes de cianina (por exemplo, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 e Cy7), ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno- 2,2'disulfônico, acridina, isotiocianato de acridina, ácido 5-(2'- aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfônico (EDANS) , 4-amino-N- [3- vinilsulfonil)fenilnaftalimida-3,5 dissulfonato, N-(4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, BODIPY, Amarelo Brilhante, cumarina, 7-amino-4- metilcumarina (AMC, Cumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcoumarina (Coumaran 151), cianosina, 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5',5''- dibromopirogalol-sulfonaftaleína (Vermelho de Bromopirogalol), pentaacetato de 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina dietilenotriamina, ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'- dissulfônico, ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-dissulfônico, cloreto de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonil (DNS, cloreto de dansila), ácido 4-(4'- dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), 4-dimetilaminofenilazofenil-4'- isotiocianato (DABITC), eosina, isotiocianato de eosina, eritrosina B, eritrosina, isotiocianato, brometo de etídio, etídio, 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2',7'-dimetoxi- 4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), isotiocianato de fluoresceína, IR144, IR1446, isotiocianato de verde malaquita, 4-metilumbeliferona, orto- cresolftaleína, nitrotirosina, pararosanilina, Vermelho de Fenol, B- ficoeritrina, o-ftaldialdeído, pireno, butirato de pireno, butirato de succinimidil 1-pireno, Vermelho Reativo 4 (Cibacron [R] Vermelho Brilhante 3B-A), 6- carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), lisamina rodamina B cloreto de sulfonil rodamina (Rhod), 5,6-tetrametil rodamina, rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloreto de sulfonil de sulforodamina 101 (Vermelho Texas), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC), riboflavina, ácido rosólico, cumarina-6 e similares, incluindo combinações destes. Estas frações de imagem fluorescentes podem ser obtidas de uma variedade de fontes comerciais, incluindo sondas moleculares, Eugene, Oreg. and Research Organics, Cleveland, Ohio, ou podem ser sintetizadas por aqueles ordinariamente versados na técnica.
[000120] Em outro exemplo, os agentes de imagem podem compreender um agente de imageamento de ressonância magnética (MRI), enquanto agentes de diagnóstico podem compreender um composto que é um marcador de diagnóstico para um distúrbio epitelial particular ligado ao agente de imageamento MRI. Um agente MRI é qualquer fração química que tem um sinal de ressonância magnética detectável ou que pode influenciar (por exemplo, aumentar ou alterar) o sinal de ressonância magnética de outro agente. Este tipo de agente de imageamento pode ser usado sozinho ou em combinação com outros agentes de imagem. Ainda em outro exemplo, um agente de MRI à base de gadolínio pode servir como um agente da imagem latente. Um exemplo de um agente MRI adequado que pode ser incorporado nos agentes de imagem divulgados é ácido paraamino-benzil dietilenotriaminapentaacético (p-NH2-Bz-DTPA, Composto 7), uma forma conjugável a partir de ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA), que é conhecido para fortemente ligar gadolínio e é aprovado para uso clínico como um agente de contraste da ressonância magnética. Incorporação de um agente MRI em uma macromolécula grande, tal como um substrato dendrimérico, conforme divulgado neste documento pode permitir grande relaxamento T1 (alto contraste) e múltiplas cópias de agente em uma única molécula, que pode aumentar o sinal. Ao combinar um agente de imageamento MRI e, por exemplo, um agente de imageamento fluorescente, o agente resultante pode ser detectado, representado por imagem e seguido em tempo real por meio do MR I. Outros agentes de imagem incluem agentes PET que podem ser preparados ao incorporar um 18F ou um quelante para 64Cu ou 68Ga. Além disso, a adição de um radionuclídeo pode ser usada para facilitar o imagemento SPECT ou entrega de uma dose de radiação, enquanto agentes de diagnóstico podem compreender um composto que é um marcador de diagnóstico para um distúrbio epitelial ligado ao agente PET.
[000121] Em algumas modalidades, o agente de diagnóstico é um agente de imagem de diagnóstico, incluindo, mas não limitado a, agentes de tomografia de emissão de posição (PET), agentes da tomografia computadorizada (CT), agentes de imagem de ressonância magnética (MRI), agentes da imagem magnética nuclear (NMI), agentes de fluoroscopia e agentes de contraste de ultrassom. Tais agentes de diagnóstico incluem radioisótopos de tais elementos como iodo (I), incluindo 123I, 125I, 131I etc., bário (Ba), gadolínio (Gd), tecnécio (Tc), incluindo 99Tc, fósforo (P), incluindo 31P, ferro (Fe), manganês (Mn), tálio (Tl), cromo (Cr), incluindo 51Cr, carbono (C), incluindo 14C ou similares, compostos rotulados de forma fluorescente ou seus complexos, quelantes, adutos e conjugados. Agentes PET adequados podem ser usados, incluindo, mas não limitados a, carbono-11, nitrogênio-13, oxigênio-15, flúor-18, 11C-metomidato e análogos de glicose destes, incluindo, mas não limitado a fludesoxiglicose (um análogo de glicose rotulado com flúor-18.
[000122] Em outras modalidades, o agente de diagnóstico é um marcador genético que codifica proteínas que são prontamente detectáveis quando expressas em uma célula (incluindo, mas não limitadas a, betagalactosidase, proteína verde fluorescente, luciferase e similares) e sondas de ácido nucleico rotulado (por exemplo, radiomarcado ou sondas marcadas de forma fluorescente). Em algumas modalidades, conjugação covalente de agentes de diagnóstico ou de imageamento para os multímeros AdB-2/3 providos neste documento é alcançada de acordo com uma variedade de processos de conjugação. Em outras modalidades, o agente de diagnóstico está associado de forma não covalente com multímeros AdB-2/3 providos.
[000123] Em outro aspecto, a presente invenção provê ácidos nucléicos codificando o polipeptídeo ou qualquer modalidade da invenção. Os ácidos nucleicos podem compreender RNA ou DNA e podem ser preparados e isolados usando técnicas biológicas moleculares padrão, baseadas nos ensinamentos neste documento. Os ácidos nucleicos podem compreender domínios adicionais úteis para promover a expressão e/ou purificação da proteína codificada, incluindo, mas não se limitando a sequências poliA, sequências de Kozak modificadas e sequências que codificam marcações de epítopo, sinais de exportação e sinais de secreção, sinais de localização nuclear, e sinais de localização da membrana plasmática.
[000124] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê vetores de expressão recombinantes compreendendo o ácido nucleico de qualquer aspecto da invenção ligado operativamente a um promotor. "Vetor de expressão recombinante" inclui vetores que ligam operativamente uma região ou gene de codificação de ácido nucleico a qualquer promotor capaz de efetuar a expressão do produto de gene. A sequência do promotor usada para conduzir expressão dos ácidos nucleicos divulgados em um sistema de mamíferos pode ser constitutiva (conduzida por qualquer um de uma variedade de promotores, incluindo, mas não se limitando a, CMV, SV40, RSV, actina, EF) ou induzível (conduzido por qualquer um de um número de promotores induzíveis, incluindo, mas não se limitando a, tetraciclina, ecdisona, responsiva a esteróide). A construção de vetores de expressão para uso na transfecção de células procarióticas também é bem conhecida na técnica e, assim, pode ser realizada através de técnicas padrão. (Vide, por exemplo, Sapeka, Fritsch e Maniatis, em: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, Nova Jersey) e o catálogo Ambion 1998 (Ambion, Austin, TX). O vetor de expressão deve ser replicável nos organismos hospedeiros como um epissoma ou pela integração no DNA cromossômico do hospedeiro e pode compreender quaisquer outros componentes que forem considerados apropriados para um dado uso, incluindo, mas não se limitando a marcadores de seleção tais como um gene de resistência a antibióticos.
[000125] Em um aspecto ainda adicional, a presente invenção provê células hospedeiras compreendendo os vetores de expressão recombinantes divulgados neste documento e sua descendência, em que as células hospedeiras podem ser procarióticas ou eucarióticas. As células podem ser transfectadas de forma transitória ou estável. Tal transfecção de vetores de expressão em células procarióticas e eucarióticas pode ser alcançada através de qualquer técnica conhecida na técnica, incluindo, mas não se limitando a transformações bacterianas padrão, co-precipitação de fosfato de cálcio, eletroporação ou transfecção mediada viral, mediada por policatiônico, mediada por DEAE-dextrano ou mediada por lipossoma. (Vide, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2a Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. Nova York, NY). Técnicas utilizando culturas de células transfectadas com vetores de expressão para produzir quantidades de polipeptídeos são bem conhecidas na técnica.
[000126] Em outro aspecto, a presente invenção provê composições farmacêuticas, compreendendo
[000127] um multímero de fibra AdB-2/3 da presente invenção; e
[000128] um transportador farmaceuticamente aceitável.
[000129] O multímero de fibra AdB-2/3 pode ser qualquer tal multímero como descrito neste documento de acordo com qualquer aspecto, modalidades ou combinação de modalidades da invenção que incorpora um polipeptídeo de domínio globular mutante de qualquer modalidade do primeiro aspecto da invenção (ou seja: SEQ ID NOS:1-11).
[000130] A composição farmacêutica pode compreender, adicionalmente, um ou mais terapêuticos para o tratamento de um distúrbio associado com tecido epitelial, incluindo, mas não se limitando àquelas divulgadas acima. Em uma modalidade preferencial, o terapêutico é um terapêutico anti-tumor e compreende um anticorpo quimioterápico ou anti- tumoral monoclonal conforme descrito neste documento. Em uma modalidade preferencial adicional, o terapêutico anti-tumor compreende um anticorpo selecionado a partir do grupo consistindo em trastuzumab, cetumiximab, petuzumab, apomab, conatumumab, lexatumumab, bevacizumab, bevacizumab, denosumab, zanolimumab, lintuzumab, edrecolomab, rituximab, ticilimumab, tositumomab, alemtuzumab, epratuzumab, mitumomab, gentuzumab ozogamicina, oregovomab, pemtumomab daclizumab, panitumumab, catumaxomab, ofatumumab e ibritumomab.
[000131] O transportador farmaceuticamente aceitável é não tóxico, biocompatível e é selecionado de forma a não afetar prejudicialmente a atividade biológica dos multímeros (e quaisquer outros agentes terapêuticos combinados com o mesmo). Exemplares transportadores farmaceuticamente aceitáveis para peptídeos são descritos em Patente U.S. No. 5.211.657 para Yamada. As composições podem ser formuladas em preparações em formas sólidas, semi-sólidas, em gel, líquidas ou gasosas, tais como comprimidos, cápsulas, pós, granulados, pomadas, soluções, supositórios, inalantes e injeções, permitindo a administração oral, parenteral ou cirúrgica. Transportadores adequados para administração parenteral via entrega injetável, por infusão ou irrigação e tópica incluem água destilada, solução salina tamponada com fosfato fisiológica, normal ou de Ringer-lactato, solução de dextrose, solução de Hank ou propanodiol. Além disso, óleos fixos e estéreis podem ser empregados como um meio solvente ou de suspensão. Para esta finalidade, qualquer óleo biocompatível pode ser empregado, incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos, tais como ácido oléico, encontram utilidade na preparação de injetáveis. O transportador e o agente podem ser combinados como um gel, uma pasta ou um bálsamo líquido, em suspensão, polimerizável ou não polimerizável. O transportador também pode compreender um veículo de entrega para sustentar (ou seja, estender, atrasar ou regular) a entrega do(s) agente(s) ou para melhorar a entrega, absorção, estabilidade ou farmacocinética do(s) agente(s) terapêutico(s). Tal veículo de entrega pode incluir, a título de exemplo não limitante, micropartículas, microesferas, nanoesferas ou nanopartículas compostas por proteínas, lipossomas, hidratos de carbono, compostos orgânicos sintéticos, compostos inorgânicos, hidrogéis poliméricos ou copoliméricos e micelas poliméricas. Sistemas de entrega de hidrogel e micela adequados incluem os complexos de copolímeros de PEO:PHB:PEO e copolímero/ciclodextrina divulgados na Publicação Internacional No. WO 2004/009664 A2 e os complexos de PEO e PEO/ciclodextrina divulgados em Publicação U.S. No. 2002/0019369 A1. Tais hidrogéis podem ser injetados localmente no sítio de ação pretendido, ou por via subcutânea ou intramuscular para formar um depósito de liberação prolongada.
[000132] Para entrega intratecal (IT) ou entrega intracerebroventricular (ICV), sistemas de entrega devidamente esterilizados (por exemplo, líquidos, géis, suspensões, etc.) podem ser usados para administrar as composições. Para a administração oral de agentes não peptidérgicos, as composições podem ser transportadas em um preenchedor ou diluente inerte, tal como sacarose, amido de milho ou celulose.
[000133] As composições da presente invenção também podem incluir excipientes biocompatíveis, tais como agentes de dispersão ou umectantes, agentes de suspensão, diluentes, tampões, potenciadores de penetração, emulsionantes, ligantes, espessantes, agentes flavorizantes (para administração oral). Formulações exemplares podem ser administradas por via parentérica como doses injetáveis de uma solução ou suspensão do multímero em um diluente fisiologicamente aceitável com um transportador farmacêutico que pode ser um líquido estéril, tal como água, óleos, solução salina, glicerol ou etanol. Além disso, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsionantes, surfactantes, substâncias de tamponamento de pH e similares podem estar presentes em composições compreendendo polipeptídeos modificados. Componentes adicionais de composições farmacêuticas incluem petróleo (tal como de origem animal, vegetal ou sintética), por exemplo, óleo de soja e óleo mineral. Em geral, glicóis tais como propileno glicol ou polietileno glicol são portadores de líquido preferenciais para soluções injetáveis.
[000134] A composição farmacêutica também pode ser administrada sob a forma de uma injeção de depósito ou preparação de implante que pode ser formulada de maneira a permitir uma liberação prolongada ou pulsátil dos multímeros e outros terapêuticos (se presente).
[000135] A composição farmacêutica pode compreender, além do polipeptídeo da invenção, (a) um lioprotetor; (b) um surfactante; (c) um agente de volume; (d) um agente de regulação de tonicidade; (e) um estabilizador; (f) um conservante e/ou (g) um tampão. Em algumas modalidades, o tampão na composição farmacêutica é um tampão Tris, um tampão de histidina, um tampão de fosfato, um tampão de citrato ou um tampão de acetato. A composição farmacêutica também pode incluir um lioprotetor, por exemplo, sacarose, sorbitol ou trealose. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica inclui um conservante, por exemplo, cloreto de benzalcônio, benzetônio, clorohexidina, fenol, m-cresol, álcool benzílico, metilparabeno, propilparabeno, clorobutanol, o-cresol, p- cresol, clorocresol, nitrato fenilmercúrico, timerosal, ácido benzóico e suas diversas misturas. Em outras modalidades, a composição farmacêutica inclui um agente de volume, como a glicina. Em ainda outras modalidades, a composição farmacêutica inclui um surfactante, por exemplo, polissorbato-20, polissorbato-40, polissorbato-60, polissorbato-65, polissorbato-80, polissorbato-85, poloxâmero-188, monolaurato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano, monoestearato de sorbitano, monooleato de sorbitano, trilaurato de sorbitano, triestearato de sorbitano, trioleato de sorbitano ou uma combinação desses. A composição farmacêutica também pode incluir um agente de regulação de tonicidade, por exemplo, um composto que processa a formulação substancialmente isotônica ou isoosmótica com sangue humano. Agentes de regulação de tonicidade exemplares incluem sacarose, sorbitol, glicina, metionina, manitol, dextrose, inositol, cloreto de sódio, arginina e cloridrato de arginina. Em outras modalidades, a composição farmacêutica inclui, adicionalmente, um estabilizador, por exemplo, uma molécula que, quando combinada com uma proteína de interesse impede ou reduz substancialmente a instabilidade química e/ou física da proteína de interesse em forma liofilizada ou líquida. Estabilizadores exemplares incluem sacarose, sorbitol, glicina, inositol, cloreto de sódio, metionina, arginina e cloridrato de arginina.
[000136] A composição farmacêutica pode ser empacotada de qualquer maneira adequada. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é empacotada como um kit contendo um recipiente (tal como um tubo de ensaio) de multímero de fibra AdB-2/3. Em uma modalidade preferencial, o kit compreende, adicionalmente, no mesmo ou em um recipiente separado (tal como um tubo de ensaio), um agente terapêutico, de diagnóstico ou imageamento a ser administrado a um sujeito, juntamente com o multímero de fibra AdB-2/3.
[000137] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê kits compreendendo (a) um ou mais polipeptídeos recombinantes / multímeros de fibra AdB-2/3, ácidos nucleicos isolados, vetores de expressão recombinantes e/ou células hospedeiras da invenção; e (b) instruções para sua utilização no tratamento de um distúrbio associado com o tecido epitelial. Os kits podem compreender, adicionalmente, um terapêutico para o uso nos métodos da presente invenção.
[000138] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê métodos para melhorar o tratamento terapêutico ou diagnóstico de um distúrbio associado com tecido epitelial, e/ou imageamento de tecidos epiteliais, compreendendo a administração a um sujeito em necessidade do mesmo: xvi. uma quantidade de um ou mais terapêuticos suficientes para tratar o distúrbio, diagnóstico suficiente para diagnosticar o distúrbio, e/ou agente de imageamento suficiente para o imageamento do tecido epitelial; e xvii. uma quantidade do multímero de fibra AdB-2/3 da invenção ou uma composição farmacêutica da invenção, suficiente para melhorar a eficácia do um ou mais agentes terapêuticos, de diagnóstico e/ou imageamento.
[000139] Os métodos deste aspecto da invenção podem ser usados para melhorar o tratamento terapêutico, diagnóstico, ou imageamento de um distúrbio associado com tecido epitelial, ao aprimorar o acesso ao agente terapêutico, de diagnóstico e/ou de imageamento ao seu alvo e disseminação no tecido epitelial. Embora não seja ligado por qualquer mecanismo, os inventores acreditam que isto ocorre através de mecanismos complementares: movimento do receptor de alvo a partir do basolateral à superfície da célula apical, permitindo, assim, melhor acesso ao alvo de tecido epitelial por agentes terapêuticos, de diagnóstico, e/ou imageamento que visam o receptor, tais como anticorpos monoclonais) e melhor penetração do terapêutico através de rompimento de junções intercelulares. DSG2 é o receptor de alta afinidade primário para AdB-2/3. DSG2 é uma glicoproteína transmembrana de ligação de cálcio, pertencente à família de proteínas caderina. Nas células epiteliais, DSG2 é um componente da estrutura de aderência célula-célula. Sua cauda citoplasmática interage com uma série de proteínas que estão em contato direto com os reguladores de aderência de célula e junções intercelulares / morfologia de célula. Tem sido demonstrado que DSG2 é superexpressa em uma série de malignidades epiteliais, incluindo câncer gástrico, carcinomas de células escamosas, melanoma, câncer de próstata metastático e câncer de bexiga.
[000140] Embora não seja ligado por um mecanismo específico de ação, os inventores acreditam que a ligação de multímero de fibra AdB-2/3 a DSG2 serve para acionar a abertura mediada por DSG2 transitória de junções intercelulares, que serve para aprimorar o acesso de agentes terapêuticos, de diagnósticos, de imageamento, ou qualquer outro composto de interesse que se liga a um alvo em células epiteliais que estivesse caso contrário preso até pelo menos certo ponto em junções intercelulares. Exemplos detalhados de tal atividade são providos neste documento. Os métodos da invenção podem, assim, ser realizados utilizando qualquer multímero de fibra AdB-2/3 da presente invenção para acionar abertura mediada por DSG2 transitória de junções intercelulares. Multímeros exemplares compreendendo um ou mais multímeros de fibra AdB-2/3 da invenção que podem ser usados nestes métodos incluem, mas não estão limitados a, virions AdB-2/3, capsídeos AdB-2/3, partículas dodecaédricas AdB-2/3 (PtDd) (partículas sub-virais dodecaédricas produzidas por AdB-2/3 durante sua replicação) e multímeros de fibra AdB- 2/3 recombinantes.
[000141] Os métodos da invenção têm aplicação ampla para a entrega de qualquer agente terapêutico, diagnóstico, de imageamento ou outro composto a tecido epitelial compreendendo junções intercelulares onde o acesso a um alvo de interesse pode ser limitado, uma vez que DSG2 é amplamente expresso em células epiteliais. Como usado neste documento, um "distúrbio associado com tecido epitelial" é qualquer transtorno no qual agente terapêutico, de diagnóstico ou de imageamento administrado para/através de células epiteliais/tecido epitelial provê um benefício clínico a um paciente, seja no aprimoramento da eficácia terapêutica, diagnóstica e/ou de imageamento. Tais distúrbios incluem, mas não se limitam a tumores sólidos (ou seja: qualquer tumor com junções de célula epitelial), distúrbios gastrintestinais (incluindo, mas não se limitando a síndrome do intestino irritável, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, constipação, doença do refluxo gastresofágico, esôfago de Barrett, etc.), doenças da pele (incluindo, mas não se limitando a psoríase e dermatite), doenças pulmonares (incluindo, mas não se limitando a doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, bronquite, enfisema pulmonar, fibrose cística, doença intersticial pulmonar, pneumonia, distúrbios do ducto pancreático, distúrbios cerebrais (ou seja: qualquer distúrbio cerebral que poderia beneficiar de transporte aprimorado de drogas através da barreira hemato-encefálica), hipertensão pulmonar primária, embolia pulmonar, sarcoidose pulmonar, tuberculose, etc.), distúrbios renais, (incluindo, mas não se limitando a glomerulonefrite), doenças hepáticas (incluindo, mas não se limitando a hepatite), distúrbios endócrinos (incluindo, mas não se limitando a diabetes e distúrbios de tireóide), distúrbios do ducto pancreático (incluindo, mas não se limitando a pancreatite) e distúrbios do ducto biliar (incluindo, mas não se limitando a obstrução das vias biliares, colecistite, coledocolitíase, cálculos biliares, etc.) e infecções de tecidos epiteliais (incluindo, mas não se limitando a celulite, pneumonia, hepatite e pielonefrite). Em uma modalidade preferencial, o distúrbio associado com tecido epitelial compreende um tumor sólido, incluindo, mas não se limitando a tumores de mama, tumores de pulmão, tumores de cólon, tumores retais, tumores de pele, tumores endócrinos, tumores de estômago, tumores de próstata, tumores ovarianos, tumores uterinos, tumores do colo do útero, tumores renais, melanomas, tumores pancreáticos, tumores no fígado, tumores cerebrais, tumores de cabeça e pescoço, tumores de nasofaringe, tumores gástricos, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, tumores de bexiga e tumores de esôfago. Como será compreendido por aqueles versados na técnica, tais tumores incluem tumores primários, tumores que são localmente invasivos, bem como tumores que sofreram metástase.
[000142] Como usado neste documento, "melhorar a eficácia" significa qualquer aumento na eficácia terapêutica, diagnóstica e/ou de imageamento sobre o que seria visto usando o agente terapêutico, de diagnóstico e/ou imageamento sozinho. Por exemplo, medidas de eficácia terapêutica irão variar de acordo com o distúrbio a ser tratado, mas são facilmente identificadas por um médico. Por exemplo, tais aumentos na eficácia incluem, mas não estão limitados a aumentar um ou mais dos seguintes em relação ao tratamento com o terapêutico sozinho: (a) redução da gravidade do distúrbio; (b) limitação ou impedimento do desenvolvimento de sintomas característicos do(s) distúrbio(s) a ser(em) tratado(s); (c) inibição da piora de sintomas característicos do(s) distúrbio(s) a ser(em) tratado(s); (d) limitação ou prevenção da recorrência do(s) distúrbio(s) em pacientes que já tiveram o(s) distúrbio(s); e (e) limitação ou prevenção da recorrência dos sintomas em pacientes que foram previamente sintomáticos para o(s) distúrbio(s). Em um exemplo não limitante, tratar um tumor sólido provê uma capacidade de induzir a saída dos receptores do tumor a partir do lado basolateral de células epiteliais para permitir o acesso aprimorado e a matança do tumor.
[000143] Para câncer, há normas de definição de resposta do tumor e métodos padrão de medir a resposta. Estes incluem a resposta do tumor, que é determinada pelo monitoramento da alteração no tamanho do tumor ou um marcador de soro da doença. Uma resposta parcial é mais de 50% de redução no tumor, enquanto uma resposta completa é definida como o completo desaparecimento do tumor. Métodos utilizados para medir os tumores são bem conhecidos aos médicos e incluem exame físico, teste radiológico tal como tomografias computadorizadas, MRI, PET tomografias por emissão de pósitrons, raios-x, bem como marcadores séricos tais como antígeno prostático específico, que é usado para monitorar o câncer de próstata. Outras medidas de efeito terapêutico do tratamento do câncer incluem medições de tempo para progressão, sobrevivência livre de progressão e sobrevida global.
[000144] Eficácia diagnóstica aprimorada inclui qualquer melhoria na eficácia em relação à administração do diagnóstico sozinho, incluindo mas não limitado a, aumento da especificidade e/ou sensibilidade do teste diagnóstico. Eficácia de imageamento aprimorada inclui qualquer melhoria na eficácia em comparação com a administração do agente de imageamento sozinho, incluindo, mas não limitado a especificidade, sensibilidade, reprodutibilidade, realce de contraste, detecção de sítios menores da doença, delimitação mais precisa da doença, tais como o tamanho e o formato de doenças, tais como tumores, abscessos, etc.
[000145] Em diversas modalidades, o aumento na eficácia é um benefício de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 100%, ou maior em comparação à eficácia com o agente terapêutico, de diagnóstico e/ou imageamento sozinho, através de uma população de pacientes.
[000146] Qualquer sujeito adequado pode ser tratado usando os métodos da invenção, preferencialmente sujeitos humanos.
[000147] Qualquer agente terapêutico, de diagnóstico, imageamento ou outro composto que pode visar o tecido epitelial e cuja entrega ao tecido epitelial pode ser aprimorada através da abertura transitória de junções intercelulares pode ser usado nos métodos da invenção. Em uma modalidade, o terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos, imunoconjugados, nanopartículas, terapêutica do ácido nucleico e combinações destes, quimioterápicos, vacinas, terapia de radiação/partículas radioativas ("radiação"), imunoterapia celular incluindo terapia de células T adotiva e terapia com células dendríticas (exemplo: penetração intratumoral de células T administradas), terapêuticos inalados, construtos de terapia gênica (incluindo, mas não limitado a vírus AdB-2/3 como um vetor de terapia gênica e a coadministração com um vetor de terapia gênica à base de Ad5), outros terapêuticos do ácido nucleico e suas combinações.
[000148] Em diversas modalidades, o terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em anticorpos, antimetabólitos, antimitóticos, antiproliferativos, inibidores da quinase de aurora, inibidores de promotores da apoptose (por exemplo, Bcl-xL, Bcl-w e Bfl-1), ativadores da via de morte receptora, inibidores da quinase do Bcr-Abl, anticorpos BiTE (Bi-Specific T cell Engager), modificadores de resposta biológica, inibidores da quinase dependente de ciclina, inibidores do ciclo celular, inibidores da ciclo- oxigenase-2, inibidores do fator de crescimento, inibidores de chaperonas (heat shock protein) HSP90, agentes desmetilantes, inibidores de histona deacetilase (HDAC), terapias hormonais, medicamentos imunológicos, inibidores de proteínas de apoptose (IAPs) antibioticos intercambiáveis, inibidores da quinase, alvo mamífero de inibidores de rapamicina, inibidores de quinase regulados por sinal extracelular ativado por mitógeno do microRNA, proteínas de ligação multivalentes, drogas anti-inflamatórias não esteróides (AINEs), inibidores de poli ADP (adenosina difosfato)-ribose polimerase (PARP), quimioterápicos de platina, inibidores da quinase tipo pólo (Plk), inibidores do proteassoma, análogos de purina, análogos de pirimidina, inibidores do receptor de tirosina quinase, alcalóides de plantas retinóides/deltóides, pequenos ácidos ribonucléicos inibitórios (siRNAs), inibidores da topoisomerase e similares.
[000149] Terapêuticos exemplares abrangendo estas várias classes incluem, mas não estão limitados a: docetaxel, doxorrubicina, irinotecano, paclitaxel (Taxol®), partículas paclitaxel ligadas à albumina (Abraxane®), lipossomas HCL de doxorrubicina (Doxil®), anticorpos BiTE, tais como adecatumumab (Micromet MT201), blinatumomab (Micromet MT103) e similares, terapêuticos à base de siRNA, agentes de alquilação incluindo altretamina, AMD-473, AP-5280, apaziquona, bendamustina, brostalicina, bussulfano, carboquona, carmustina (BCNU), clorambucila, CLORETAZINE.® (laromustina, VNP 40101M), ciclofosfamida, dacarbazina, decitabina, 5'-azacitidina, estramustina, fotemustina, glufosfamida, ifosfamida, KW-2170, lomustina (CCNU), mafosfamida, melfalano, mitobronitol, mitolactol, nimustina, N-óxido de mostarda nitrogenada, ranimustina, temozolomida, tiotepa, TREANDA® (bendamustina), treossulfano, rofosfamida e similares; inibidores de angiogênese incluindo inibidores de tirosina quinase de receptor específico endotelial (Tie-2), inibidores de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), inibidores de receptor do fator de crescimento 2 de insulina (IGFR- 2), inibidores de metaloproteinase-2 de matriz (MMP-2), inibidores de metaloproteinase-9 de matriz (MMP-9), inibidores de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), análogos de trombospondina, inibidores de tirosina quinase de receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR) e similares; antimetabólitos, incluindo ALIMTA® (pemetrexede dissódico, LY231514, MTA), 5-azacitidina, XELODA® (capecitabina), carmofur, LEUSTAT® (cladribina), clofarabina, citarabina, ocfosfato de citarabina, arabinosida de citosina, decitabina, deferoxamina, doxifluridina, eflornitina, EICAR (5-etinil-1-.beta.-D-ribofuranosilimidazol-4-carboxamida), enocitabina, etnilcitidina, fludarabina, 5-fluorouracil sozinho ou em combinação com leucovorina, GEMZAR® (gemcitabina), hidroxiureia, ALKERAN® (melfalano), mercaptopurina, 6-mercaptopurina ribosídica, metotrexato, análogos de metotrexato (tais como trimetrexato e pralatraxato), ácido micofenólico, nelarabina, nolatrexede, ocfosfato, pelitrexol, pentostatina, raltitrexede, ribavirina, triapina, trimetrexato, S-1, tiazofurina, tegafur, TS-1, vidarabina e similares; inibidores de proteína Bcl- 2 incluindo AT-101 (gossipol (-)), GENASENSE® (G3139 ou oblimersen (nucleotídeos antisense visando Bcl-2)), IPI-194, IPI-565, N-(4-(4-((4'- cloro(1,1'-bifenil)-2-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4--(((1R)-3-(dimetilamino)- 1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-nitrobenzenosulfonamida) (ABT-737), N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetil-1-ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1- il)benzoil)-4-(((1R)-3-(morfolin-4-il)-1-((fenilsulfanil)metil-)propil)amino)-3- ((trifluorometil) sulfonil)benzenosulfonamida (ABT-263), GX-070 (obatoclax) e similares; Inibidores da quinase Bcr-Abl incluem DASATINIB® (BMS- 354825), GLEEVEC® (imatinib) e similares; inibidores CDK incluindo AZD- 5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT-2584, flavopiridol, GPC-286199, MCS-5A, PD0332991, PHA-690509, seliciclib (CYC-202, R-roscovitina), ZK- 304709 e similares; inibidores EGFR incluindo ABX-EGF, imunolipossomas anti-EGFR, vacina EGF, EMD-7200, ERBITUX® (cetuximab), HR3, anticorpos IgA, IRESSA® (gefitinib), TARCEVA® (erlotinib ou OSI-774), TP- 38, proteína de fusão EGFR, TYKERB® (lapatinib) e similares; inibidores de receptor ErbB2 incluem CP-724-714, CI-1033 (canertinib), HERCEPTIN® (trastuzumab), TYKERB® (lapatinib), OMNITARG® (2C4, petuzumab), TAK-165, GW-572016 (ionafarnib), GW-282974, EKB-569, PI-166, dHER2 (vacina HER2), APC-8024 (vacina HER-2), anticorpo biespecífico anti- HER/2neu, B7.her2IgG3, anticorpos biespecíficos trifuncionais AS HER2, mAb AR-209, mAb 2B-1 e similares; inibidores de histona deacetilase incluem romidepsina, LAQ-824, MS-275, trapoxina, ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA), TSA, ácido valproico e similares; inibidores HSP-90 incluindo 17-AAG-nab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17- DMAG, geldanamicina, IPI-504, KOS-953, MYCOGRAB® (anticorpo recombinante humano para HSP-90), NCS-683664, PU24FC1, PU-3, radicicol, SNX-2112, STA-9090 VER49009 e similares; ativadores de vias de receptor de morte incluindo TRIAL, anticorpos e outros agentes que visam TRIAL ou receptores de morte (por exemplo, DR4 e DR5), tais como Apomab, conatumumab, ETR2-ST01, GDC0145, (lexatumumab), HGS- 1029, LBY-135, PRO-1762 e trastuzumab; quimioterápicos de platina incluem cisplatina, ELOXATIN® (oxaliplatina) eptaplatina, lobaplatina, nedaplatina, PARAPLATIN® (carboplatina), satraplatina, picoplatina e similares; inibidores VEGFR incluindo AVASTIN® (bevacizumab), ABT-869, AEE-788, axitinib (AG-13736), AZD-2171, CP-547,632, IM-862, MACUGEN (pegaptamib), NEXAVAR® (sorafenib, BAY43-9006), pazopanib (GW- 786034), vatalanib (PTK-787, ZK-222584), SUTENT® (sunitinib, SU- 11248), VEGF trap, ZACTIMAThi (vandetanib, ZD-6474) e similares; terapia celular dendrítica (sipuleucel-T, Provenge®); inibidores de topoisomerase incluindo aclarubicina, 9-aminocamptotecina, amonafida, amsacrina, becatecarina, belotecano, BN-80915, CAMPTOSAR® (hidrocloreto de irinotecano), camptotecina, dexrazoxina, diflomotecano, edotecarina, ELLENCE® ou PHARMORUBICIN® (epirubicina), etoposida, exatecano, abraxano, irenotecano, 10-hidroxicamptotecina, gimatecano, lurtotecano, mitoxantrona, oratecina, pirarbucina, pixantrona, rubitecano, sobuzoxano, SN-38, tafluposida, topotecano e similares; anticorpos incluindo AVASTIN® (bevacizumab), anticorpos CD40 específicos, chTNT-1/B, denosumab, ERBITUX® (cetuximab), HUMAX-CD4® (zanolimumab), anticorpos IGF I R específicos, lintuzumab, PANOREX® (edrecolomab), RENCAREX® (WX G250), RITUXAN® (rituximab), ticilimumab, trastuzimab e similares; terapias hormonais incluindo ARIMIDEX® (anastrozol), AROMASIN® (exemestano), arzoxifeno, CASODEX® (bicalutamida), CETROTIDE® (cetrorelix), degarelix, deslorelina, DESOPAN® (trilostano), dexametasona, DROGENIL® (flutamida), EVISTA® (raloxifeno), AFEMA® (fadrozol), FARESTON® (toremifeno), FASLODEX® (fulvestrant), FEMARA® (letrozol), formestano, glicocorticoides, HECTOROL® (doxercalciferol), RENAGEL® (carbonato de sevelamer), lasofoxifeno, acetato de leuprolida, MEGACE® (megesterol), MIFEPREX® (mifepristona), NILANDRON® (nilutamida), NOLVADEX® (citrato de tamoxifeno), PLENAXIS® (abarelix), prednisona, PROPECIA® (finasterida), rilostano, SUPREFACT® (buserelina), TRELSTAR® (hormônio de liberação de hormônio luteinizante (LHRH)), VANTAS® (implante de histrelina), VETORYL® (trilostano ou modrastano), ZOLADEX® (fosrelina, goserelina) e similares; imunológicos incluindo interferon alfa, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon beta, interferon gama-1a, ACTIMMUNE® (interferon gama-1b) ou interferon gama-n1, combinações destes e similares. Outros agentes incluem ALFAFERONE® (IFN-alfa), BAM-002 (glutationa oxidada), BEROMUN® (tasonermina), BEXXAR® (tositumomab), CAMPATH® (alemtuzumab), CTLA4 (antígeno de linfócitos citotóxicos 4), decarbazina, denileukin, epratuzumab, GRANOCYTE® (lenograstim), lentinano, interferon-alfa de leucócito, imiquimod, MDX-010 (anti-CTLA-4), vacina contra melanoma, mitumomab, molgramostim, MYLOTARG.TM. (gentuzumab ozogamicina), NEUPOGEN® (filgrastim), OncoVAC-CL, OVAREX® (oregovomab), pemtumomab (Y-muHMFG1), PROVENGE® (sipuleucel-T), sargaramostim, sizofilano, teceleukin, THERACYS® (Bacillus Calmette-Guerin), ubenimex, VIRULIZIN® (imunoterápico, Lorus Pharmaceuticals), Z-100 (Substância Específica de Maruyama (SSM)), WF-10 (Tetraclorodecaóxido (TCDO)), PROLEUKIN® (aldesleucina), ZADAXIN® (timalfasina), ZENAPAX® (daclizumab), ZEVALIN®. (90Y-Ibritumomab tiuxetano) e similares; ofatumumab; agentes modificadores de resposta biológica incluindo krestin, sizofurano, picibanil PF-3512676 (CpG-8954), ubenimex e similares; análogos de pirimidina incluem citarabina (ara-C ou arabinosida C) citosina arabinosida, doxifluridina, FLUDARA® (fludarabina), 5-FU (5-fluorouracil), floxuridina, GEMZAR® (gemcitabina), TOMUDEX® (ratitrexed), TROXATYL® (triacetiluridina troxacitabina) e similares; análogos de purina incluindo LANVIS® (tioguanina) e PURI-NETHOL® (mercaptopurina); agentes antimitóticos incluindo batabulina, epotilona D (KOS-862), N-(2-((4- hidroxifenil)amino)piridin-3-il)-4-metoxibenzenosulfonamida, ixabepilona (BMS-247550), paclitaxel, TAXOTERE® (docetaxel), PNU100940 (109881), patupilona, XRP-9881 (larotaxel), vinflunina, ZK-EPO (epotilona sintética) e similares; e outros agentes quimioterápicos, tais como ABRAXANE® (ABI- 007), ABT-100 (inibidor de farnesil transferase), ADVEXIN® (vacina Ad5CMV-p53), ALTOCOR® ou MEVACOR® (lovastatina), AMPLIGE®. (poli I: poli C12U, um RNA sintético), APTOSYN® (exisulind), AREDIA® (ácido pamidrônico), arglabina, L-asparaginase, atamestano (1-metil-3,17- diona-androsta-1,4-dieno), AVAGE® (tazaroteno), AVE-8062 (derivado de combreastatina) BEC2 (mitumomab), cachectina ou cachexina (fator de necrose tumoral), canvaxina (vacina), CEAVAC® (vacina contra câncer), CELEUK® (celmoleucina), CEPLENE® (dicloridrato de histamina), CERVARIX® (vacina contra o papilomavírus humano), CHOP® (C: CYTOXAN® (ciclofosfamida); H: ADRIAMICINA® (hidroxidoxorubicina); O: vincristina (ONCOVIN®); P: prednisona), CYPAT® (acetato de ciproterona), combrestatina A4P, DAB (389)EGF (domínios catalítico e de translocação de toxina da difteria fundida por meio de um vinculador His-Ala para fator de crescimento epidérmico humano) ou TransMID-107R® (toxinas de difteria), dacarbazina, dactinomicina, ácido 5,6-dimetilxantenona-4-acético (DMXAA), eniluracil, EVIZON. TM. (lactato de esqualamina), DIMERICINE® (loção de lipossomas T4N5), discodermolida, DX-8951f (mesilato de exatecano), enzastaurina, EPO906 (epitilona B), GARDASIL® (vacina recombinante contra papilomavírus humano quadrivalente (tipos 6, 11, 16, 18)), GASTRIMMUNE®, GENASENSE®, GMK (vacina conjugada de gangliosídeo), GVAX® (vacina contra o câncer de próstata), halofuginona, histerelina, hidroxicarbamida, ácido ibandrônico, IGN-101, IL-13-PE38, IL- 13-PE38QQR (cintredekin besudotox), exotoxina de pseudomonas IL-13, interferon-.alfa., interferon-.gama., JUNOVAN® ou MEPACT® (mifamurtida) , lonafarnib, 5,10-metilenotetrahidrofolato, miltefosina (hexadecilfosfocolina), NEOVASTAT® (AE-941), NEUTREXIN® (trimetrexato glucuronato), NIPENT® (pentostatina), ONCONASE® (uma enzima de ribonuclease), ONCOPHAGE® (tratamento de vacina contra melanoma), ONCOVAX® (vacina Il-2), ORATHECIN® (rubitecano), OSIDEM® (droga celular à base de anticorpo), OVAREX®® MAb (anticorpo monoclonal murino), paclitaxel, PANDIMEX® (saponinas de aglicona de ginseng compreendendo 20(S)protopanaxadiol (aPPD) e 20(S)protopanaxatriol (aPPT)) , panitumumab, PANVAC®-VF (vacina contra o câncer experimental), pegaspargase, PEG-Interferon A, fenoxodiol, procarbazina, rebimastat, REMOVAB® (catumaxomab), REVLIMID® (lenalidomida), RSR13 (efaproxiral), SOMATULINE® (lanreotida), SORIATANE® (acitretina), estaurosporina (Streptomyces staurospores), talabostat (PT100), TARGRETIN® (Bexaroteno), TAXOPREXIN® (DHA-paclitaxel), TELCYTA® (canfosfamida, TLK286), temilifeno, TEMODAR® (temozolomida), tesmilifeno, talidomida, THERATOPE® (STn-KLH) , thymitaq (dicloridrato de 2-amino-3,4-dihidro-6-metil-4-oxo-5-(4-piridiltio)quinazolina), TNFERADE® (vetor adenoviral: Transportador de DNA contendo o gene para fator de necrose tumoral-.alfa.), TRACLEER® ou ZAVESCA® (bosentano), tretinoína (Retin-A), tetrandrina, TRISENOX®. (trióxido de arsênio), VIRULIZIN®, ukrain (derivado de alcaloides da planta quelidônia- maior), vitaxina (anticorpo anti-alfavbeta3), XCYTRIN® (gadolínio de motexafina), XINLAY® (atrasentano), XYOTAX® (paclitaxel poliglumex), YONDELIS® (trabectedina), ZD-6126, ZINECARD® (dexrazoxano), ZOMETA® (ácido zolendrônico), crizotinib, zorubicina e similares.
[000150] Em outra modalidade preferencial, o terapêutico compreende um composto que se liga a desmogleína-2; preferencialmente um composto que liga a DSG2 e abre as junções apertadas.
[000151] Em outras modalidades, o terapêutico compreende terapias de partículas radioativas/radiação. Qualquer terapia ou partícula radioativa adequada pode ser considerada apropriada por um médico, incluindo, mas não limitado a, cobalto-60, iodo-131, irídio-192, estrôncio-89, samário-153, rênio-186 e chumbo-212.
[000152] Em uma modalidade preferencial, o terapêutico é um terapêutico anti-tumor e compreende um anticorpo quimioterápico ou anti- tumoral monoclonal conforme descrito neste documento. Em uma modalidade preferencial adicional, o terapêutico anti-tumor compreende um anticorpo selecionado do grupo consistindo em trastuzumab, cetumiximab, petuzumab, apomab, conatumumab, lexatumumab, bevacizumab, bevacizumab, denosumab, zanolimumab, lintuzumab, edrecolomab, rituximab, ticilimumab, tositumomab, alemtuzumab, epratuzumab, mitumomab, gentuzumab ozogamicina, oregovomab, pemtumomab daclizumab, panitumumab, catumaxomab, ofatumumab e ibritumomab. Exemplos não limitantes de anti-tumor mAb útil e seus usos específicos são listados na Tabela 1 acima e como adicionalmente descritos em Campoli, M., et al., Principles & Practice of Oncology 23(1&2):1-19 (2009), incorporado neste documento por referência.
[000153] Os terapêuticos de anticorpo monoclonal podem ser de qualquer tipo de anticorpo monoclonal, incluindo, mas não limitado a, anticorpos monoclonais padrão, monoclonais humanizados, anticorpos plenamente humanos gerados a partir de camundongos ou outras fontes, monoclonais quiméricos e fragmentos destes. "Anticorpos monoclonais humanizados" referem-se aos anticorpos monoclonais derivados de um anticorpo monoclonal não humano, tal como um anticorpo monoclonal de camundongo. Alternativamente, os anticorpos monoclonais humanizados podem ser derivados de anticorpos quiméricos que retém, ou substancialmente retém, as propriedades de ligação de antígeno dos anticorpos monoclonais não humanos precursores, mas que exibem imunogenicidade reduzida em comparação ao anticorpo monoclonal precursor quando administrado aos seres humanos. Por exemplo, anticorpos monoclonais quiméricos podem compreender fragmentos de anticorpo humano e murino, geralmente regiões variáveis de humano constante e camundongo. Os anticorpos monoclonais humanizados podem ser preparados usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado a, (1) complementaridade de enxerto determinando as regiões de um anticorpo monoclonal não humano sobre uma região de armação e constante ("humanizando") e (2) transplantar os domínios variáveis de anticorpo monoclonal não humano, mas "camuflando- os" com uma superfície do tipo humano pela substituição de resíduos de superfície ("embutindo"). Estes métodos são divulgados, por exemplo, em, por exemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., E. U. A., 81:6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169-217 (1994); e Kettleborough, C. A. et al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991). Anticorpos monoclonais podem ser fragmentados usando técnicas convencionais e os fragmentos examinados para utilidade da mesma forma quanto aos anticorpos completos. Por exemplo, fragmentos F(ab')2 podem ser gerados ao tratar o anticorpo com pepsina. O fragmento F(ab')2 resultante pode ser tratado para reduzir pontes de dissulfeto para produzir fragmentos Fab'. Fragmentos Fab podem ser obtidos ao tratar um anticorpo IgG com papaína; fragmentos F(ab') podem ser obtidos com a digestão de pepsina de anticorpo IgG. Um fragmento F(ab') também pode ser produzido ao ligar Fab' descrito abaixo por meio de uma ligação de tioéter ou uma ligação de dissulfeto. Um fragmento Fab' é um fragmento de anticorpo obtido ao cortar uma ligação de dissulfeto da região de dobradiça do F(ab')2. Um fragmento Fab' pode ser obtido ao tratar um fragmento F(ab')2 com um agente redutor, tal como ditiotreitol. Peptídeos de fragmento de anticorpo também podem ser gerados pela expressão de ácidos nucleicos codificando tais peptídeos em células recombinantes (ver, por exemplo, Evans et al., J. Immunol. Meth. 184: 123-38 (1995)). Por exemplo, um gene quimérico codificando uma porção de um fragmento F(ab')2 pode incluir sequências de DNA codificando a região de domínio e dobradiça CH1 da cadeia H, seguido por um códon de parada de tradução para produzir tal molécula de fragmento de anticorpo truncado. Exemplos não limitantes de fragmentos de anticorpos monoclonais incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo essencialmente em domínios VL, VH, CL e CH I; (ii) fragmentos F(ab)2 e F(ab')2, fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo essencialmente nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo essencialmente nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste essencialmente em um domínio VH; e (vi) um ou mais CDRs isolados ou um parátopo funcional.
[000154] Em uma modalidade preferencial que pode ser combinada com qualquer modalidade ou combinação de modalidades da invenção, a desordem compreende um tumor positivo Her-2 e o método compreende coadministrar o multímero de fibra AdB-2/3 da invenção juntamente com a terapia de anticorpo monoclonal adequada, sozinha ou em combinação com um quimioterápico, radiação ou combinações destes. Em uma modalidade preferencial adicional, o anticorpo monoclonal é trastuzumab. Em uma modalidade preferencial adicional que pode ser combinada com qualquer uma destas modalidades, o tumor positivo Her-2 é selecionado a partir do grupo consistindo em um tumor de mama, um tumor gástrico, tumor de cólon e tumor de ovário. Em uma modalidade preferencial adicional, o método é realizado em pacientes que não responderam adequadamente a trastuzumab, tal como falta de remissão de tumor, por reincidência de tumor, ou pelo desenvolvimento de resistência a trastuzumab. Os métodos destas modalidades também podem ser usados para ajudar a reduzir a dosagem de trastuzumab exigida para obter a eficácia terapêutica e podem, portanto, servir para limitar os efeitos colaterais (tais como cardiotoxicidade associada a trastuzumab).
[000155] Em uma modalidade preferencial que pode ser combinada com qualquer modalidade ou combinação de modalidades da invenção, a desordem compreende um tumor positivo EGFR e o método compreende coadministrar o multímero de fibra AdB-2/3 da invenção juntamente com a terapia de anticorpo monoclonal adequada, sozinha ou em combinação com um quimioterápico, radiação ou combinações destes. Em uma modalidade preferencial adicional, o anticorpo monoclonal é cetuximab. Em uma modalidade preferencial adicional que pode ser combinada com qualquer uma destas modalidades, o tumor positivo EGFR é selecionado a partir do grupo consistindo em um tumor de pulmão, um tumor de mama, um tumor retal, um tumor de cabeça e pescoço e um tumor pancreático. Em uma modalidade preferencial adicional, o método é realizado em pacientes que não responderam adequadamente a cetuximab, tal como falta de remissão de tumor, por reincidência de tumor, ou pelo desenvolvimento de resistência a cetuximab. Os métodos destas modalidades também podem ser usados para ajudar a reduzir a dosagem de cetuximab exigida para obter a eficácia terapêutica e pode, portanto, servir para limitar os efeitos colaterais (tais como erupções de tipo acne que frequentemente ocorrem durante a terapia de cetuximab).
[000156] Em uma modalidade preferencial que pode ser combinada com qualquer modalidade ou combinação de modalidades da invenção, a desordem compreende um tumor epitelial e o método compreende coadministrar o multímero de fibra AdB-2/3 com um inibidor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), sozinho ou em combinação com outro quimioterápico, radiação ou combinações destes. Qualquer inibidor VEGF adequado pode ser usado, incluindo, mas não limitado a, bevacizumab.
[000157] Em uma modalidade adicional que pode ser combinada com qualquer modalidade ou combinação de modalidades neste documento, os métodos envolvendo tumores sólidos compreendem, adicionalmente, administrar um composto capaz de degradar proteínas de estroma tumoral. Qualquer composto adequado pode ser usado para degradar proteínas de estroma tumoral, incluindo, mas não limitado a, relaxina, colagenase, tripsina, dispase, MMP(metaloproteinase)-1 e MMP8. Entrega de tais compostos pode ser por qualquer mecanismo adequado, incluindo terapia genética, administração separada como o multímero de fibra AdB-2/3 ou o terapêutico ou administração como um conjugado com a fibra AdB-2/3 ou o terapêutico.
[000158] Em uma modalidade adicional que pode ser combinada com qualquer modalidade ou combinação de modalidades neste documento, os métodos adicionalmente compreendem administrar o multímero AdB-2/3, em combinação com outros abridores de junção. Como usado neste documento, um "abridor de junção" é um composto capaz de transitoriamente abrir junções intercelulares. Quaisquer abridores de junção adequados podem ser usados. Em uma modalidade não limitante, o abridor de junção compreende toxina de Zona occludens (Zot), uma toxina produzida de Vibrio cholerae (V. cholerae) que possui a habilidade de alterar de forma reversível junções epiteliais intestinais, permitindo a passagem de macromoléculas através das barreiras de mucosa (Fasano et al. (1991) Proc Natl Acad Sci E U A 88: 5242-5246)]. Um hexapeptídeo derivado de Zot (AT-1001) foi desenvolvido. Em outra modalidade, enterotoxina de Clostridium perfringens remove claudinas-3 e -4 das junções apertadas para facilitar a invasão bacteriana (Sonoda N, et al. (1999) J Cell Biol 147: 195-204]. Em uma modalidade adicional, oncoproteínas codificadas pelo Ad, HPV, HTLV-1 humano pode abrir transitoriamente junções epiteliais ao localizar de forma errada a junção de proteína ZO-1 (Latorre IJ, et al. (2005) J Cell Sci 118: 4283-4293). Em outras modalidades, diversos vírus humanos ligam a junção apertada ou outras moléculas de junção celular para atingir a entrada em células epiteliais. Entre estes vírus estão vírus da hepatite C (Evans MJ, et al. (2007) Nature 446: 801-805), reovírus (Barton ES, et al. (2001) Cell 104: 441-451) e vírus de herpes simples (Geraghty RJ, et al. (1998) Science 280: 1618-1620).
[000159] Em outra modalidade, o terapêutico é um terapêutico inalado. Qualquer terapêutico inalado adequado pode ser usado nos métodos da invenção. Em várias modalidades não limitantes, o terapêutico inalado é selecionado a partir do grupo consistindo em corticosteroides, broncodilatadores, agonistas beta, anticolinérgicos, albuterol (PROVENTIL®; VENOLIN®; ACCUNEB®; PROAIR®), levalbuterol (XOPENEX®), pirbutrol (MAXAIR®), brometo de ipratrópio (ATROVENT®), beclometasona, budesonida, flunisolida (AEROBID®), fluticasona, triancinolona acetonida, fluticasona (um corticosteroide) e salmeterol (ADVAIR®), formotorol (um broncodilatador de beta-agonista de ação prolongada,) e budesonida (um corticosteroide) (SYMICORT®), albuterol (um agonista beta) e ipratrópio (COMBIVENT®; um anticolinérgico) (budesonida (PULMICORT RESPULES®) e tioprópio (SPIRIVA®; um broncodilatador anticolinérgico).
[000160] Em outra modalidade, o composto compreende um agente de diagnóstico ou de imagem. Os métodos da invenção tem aplicação ampla para a entrega de qualquer diagnóstico, agente de imagem ou outro composto para tecido epitelial compreendendo junções intercelulares onde o acesso a um alvo de interesse pode ser limitado. Em várias modalidades não limitantes, os agentes de imagem podem incluir qualquer composto químico que pode produzir um sinal detectável, direta ou indiretamente. Muitos de tais agentes de imagem são conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos de agentes de imagem adequados para uso nos métodos e composições divulgados são isótopos radioativos, moléculas fluorescentes, partículas magnéticas (incluindo nanopartículas), partículas metálicas (incluindo nanopartículas), moléculas fosforescentes, enzimas, anticorpos, ligantes e combinações destes, enquanto agentes de diagnóstico podem compreender um composto que é um marcador de diagnóstico para um distúrbio epitelial particular ligado ao tal agente de imagem. Métodos para detectar e medir sinais gerados por agentes de imagem também são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, isótopos radioativos podem ser detectados pela contagem de cintilação ou visualização direta; moléculas fluorescentes podem ser detectadas com espectrofotômetros fluorescentes; moléculas fosforescentes podem ser detectadas com um espectrofotômetro ou visualizadas diretamente com uma câmera; enzimas podem ser detectadas por detecção ou visualização do produto de uma reação catalisada pela enzima; anticorpos podem ser detectados ao detectar um marca de detecção secundário acoplado ao anticorpo. Em uma modalidade preferencial, o agente de imagem e/ou diagnóstico é aquele que pode ser usado para detectar um tumor, seja por ligação de tumor direta ou por acoplamento do agente de imagem ou de diagnóstico com um composto que pode ligar o tumor.
[000161] Em um exemplo, os agentes de imagem podem compreender um agente de imagem fluorescente, enquanto agentes de diagnóstico podem compreender um composto que é um marcador de diagnóstico para um distúrbio epitelial particular ligado ao agente de imagem fluorescente. Um agente de imagem fluorescente é qualquer fração química que tem um sinal de fluorescência detectável. Este agente de imagem pode ser usado sozinho ou em combinação com outros agentes de imagem. Exemplos de agentes fluorescentes adequados que podem ser usados nas composições e métodos divulgados neste documento incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína (FITC), éster 5-carboxifluorescein- N-hidroxisuccinimida, 5,6-carboximetil fluoresceína, nitrobenz-2-oxa-1,3- diazol-4-il (NBD), fluorescamina, OPA, NDA, corante verde de indocianina, os corantes de cianina (por exemplo, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 e Cy7), ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno-2,2'disulfônico, acridina, isotiocianato de acridina, ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfônico (EDANS) , 4- amino-N-[3-vinilsulfonil)fenilnaftalimida-3,5 dissulfonato, N-(4-anilino-1- naftil)maleimida, antranilamida, BODIPY, Amarelo Brilhante, cumarina, 7- amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120), 7-amino-4- trifluorometilcoumarina (Coumaran 151), cianosina, 4',6-diaminidino-2- fenilindol (DAPI), 5',5''-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (Vermelho de Bromopirogalol), pentaacetato de 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4- metilcumarina dietilenotriamina, ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno- 2,2'-dissulfônico, ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-dissulfônico, cloreto de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonil (DNS, cloreto de dansila), ácido 4- (4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), 4-dimetilaminofenilazofenil-4'- isotiocianato (DABITC), eosina, isotiocianato de eosina, eritrosina B, eritrosina, isotiocianato, brometo de etídio, etídio, 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2',7'-dimetoxi- 4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), isotiocianato de fluoresceína, IR144, IR1446, isotiocianato de verde malaquita, 4-metilumbeliferona, orto- cresolftaleína, nitrotirosina, pararosanilina, Vermelho de Fenol, B- ficoeritrina, o-ftaldialdeído, pireno, butirato de pireno, butirato de succinimidil 1-pireno, Vermelho Reativo 4 (Cibacron [R] Vermelho Brilhante 3B-A), 6- carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), lisamina rodamina B cloreto de sulfonil rodamina (Rhod), 5,6-tetrametil rodamina, rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloreto de sulfonil de sulforodamina 101 (Vermelho Texas), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC), riboflavina, ácido rosólico, cumarina-6 e similares, incluindo combinações destes. Estas frações de imagem fluorescentes podem ser obtidas de uma variedade de fontes comerciais, incluindo sondas moleculares, Eugene, Oreg. and Research Organics, Cleveland, Ohio, ou podem ser sintetizadas por aqueles ordinariamente versados na técnica.
[000162] Em outro exemplo, os agentes de imagem podem compreender um agente de imagem de ressonância magnética (MRI), enquanto agentes de diagnóstico podem compreender um composto que é um marcador de diagnóstico para um distúrbio epitelial particular ligado ao agente de imagem MRI. Um agente MRI é qualquer fração química que tem um sinal de ressonância magnética detectável ou que pode influenciar (por exemplo, aumentar ou alterar) o sinal de ressonância magnética de outro agente. Este tipo de agente de imagem pode ser usado sozinho ou em combinação com outros agentes de imagem. Ainda em outro exemplo, um agente de MRI à base de gadolínio pode servir como um agente da imagem latente. Um exemplo de um agente MRI adequado que pode ser incorporado nos agentes de imagem divulgados é ácido para-amino-benzil dietilenotriaminapentaacético (p-NH2-Bz-DTPA, Composto 7), uma forma conjugável a partir de ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA), que é conhecido para fortemente ligar gadolínio e é aprovado para uso clínico como um agente de contraste da ressonância magnética. Incorporação de um agente MRI em uma macromolécula grande, tal como um substrato dendrimérico, conforme divulgado neste documento pode permitir grande relaxamento T1 (alto contraste) e múltiplas cópias de agente em uma única molécula, que pode aumentar o sinal. Ao combinar um agente de imagem MRI e, por exemplo, um agente de imagem fluorescente, o agente resultante pode ser detectado, representado por imagem e seguido em tempo real por meio do MR I. Outros agentes de imagem incluem agentes PET que podem ser preparados ao incorporar um 18F ou um quelante para 64Cu ou 68Ga. Além disso, a adição de um radionuclídeo pode ser usada para facilitar o imageamento SPECT ou entrega de uma dose de radiação, enquanto agentes de diagnóstico podem compreender um composto que é um marcador de diagnóstico para um distúrbio epitelial ligado ao agente PET.
[000163] Em algumas modalidades, o agente de diagnóstico é um agente de imagem de diagnóstico, incluindo, mas não limitado a, agentes de tomografia de emissão de posição (PET), agentes da tomografia computadorizada (CT), agentes de imagem de ressonância magnética (MRI), agentes da imagem magnética nuclear (NMI), agentes de fluoroscopia e agentes de contraste de ultrassom. Tais agentes de diagnóstico incluem radioisótopos de tais elementos como iodo (I), incluindo 123I, 125I, 131I etc., bário (Ba), gadolínio (Gd), tecnécio (Tc), incluindo 99Tc, fósforo (P), incluindo 31P, ferro (Fe), manganês (Mn), tálio (Tl), cromo (Cr), incluindo 51Cr, carbono (C), incluindo 14C ou similares, compostos marcados de forma fluorescente ou seus complexos, quelantes, adutos e conjugados. Agentes PET adequados podem ser usados, incluindo, mas não limitados a, carbono-11, nitrogênio-13, oxigênio-15, flúor-18, 11C-metomidato e análogos de glicose destes, incluindo, mas não limitado a fludesoxiglicose (um análogo de glicose marcado com flúor-18.
[000164] Em outras modalidades, o agente de diagnóstico é um marcador genético que codifica proteínas que são prontamente detectáveis quando expressas em uma célula (incluindo, mas não limitadas a, betagalactosidase, proteína verde fluorescente, luciferase e similares) e sondas de ácido nucleico marcado (por exemplo, radiomarcado ou sondas marcadas de forma fluorescente). Em algumas modalidades, conjugação covalente de agentes de diagnóstico para multímeros AdB-2/3 providos neste documento é atingida de acordo com uma variedade de processos de conjugação. Em outras modalidades, o agente de diagnóstico está associado de forma não covalente com multímeros AdB-2/3 providos.
[000165] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê métodos para melhorar a entrega de uma substância de um tecido epitelial, compreendendo fazer tecido epitelial entrar em contato com (a) um ou mais compostos a serem entregues ao tecido epitelial; e (b) uma quantia de um multímero de fibra AdB-2/3 da invenção suficiente para intensificar a entrega do um ou mais compostos ao tecido epitelial. Neste aspecto, os compostos podem ser qualquer composto adequado, tais como aqueles descritos em detalhes acima. Em uma modalidade preferencial, o um ou mais compostos compreendem um agente de imagem. Em uma modalidade preferencial adicional, o tecido epitelial compreende um tumor sólido, incluindo quaisquer daqueles divulgados no presente pedido. Em várias modalidades não limitantes, o tumor sólido é selecionado a partir do grupo consistindo em tumores de mama, tumores de pulmão, tumores do cólon, tumores retais, tumores de estômago, tumores da próstata, tumores ovarianos, tumores uterinos, tumores de pele, tumores endócrinos, tumores do colo do útero, tumores renais, melanomas, tumores pancreáticos, tumores no fígado, tumores cerebrais, tumores de cabeça e pescoço, tumores de nasofaringe, tumores gástricos, carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas, tumores de bexiga e tumores esofágicos. Multímeros exemplares compreendendo um ou mais multímeros de fibra AdB-2/3 da invenção que podem ser usados nestes métodos incluem, mas não estão limitados a, virions AdB-2/3, capsídeos AdB-2/3, partículas dodecaédricas AdB-2/3 (PtDd) (partículas sub-virais dodecaédricas produzidas por AdB-2/3 durante sua replicação) e multímeros de fibra AdB- 2/3 recombinantes.
[000166] Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção provê métodos para melhorar a entrega de uma desmogleína de expressão de substância celular ou de tecido 2 (DSG2), compreendendo fazer a DSG2 de expressão celular ou de tecido entrar em contato com (a) um ou mais compostos a serem entregues à célula ou ao tecido; e (b) uma quantia de um multímero de fibra AdB-2/3 da invenção suficiente para intensificar a entrega do um ou mais compostos ao tecido. Tipos de tecido exemplares expressando DSG2 incluem, mas não estão limitados a, células/tecido epitelial (tais como aqueles divulgados neste documento), plaquetas e granulócitos humanos. Como mostrado nos exemplos que se seguem, DSG2 também atua como receptor em células não polarizadas. Deste modo, estes métodos encontram aplicação não apenas nas células e tecido epiteliais, mas também são relevantes, por exemplo, na patogênese de AdB-2/3 e a aplicação intravascular de vetores AdB-2/3 para fins de terapia genética. Multímeros exemplares compreendendo um ou mais multímeros de fibra AdB-2/3 da invenção que podem ser usados nestes métodos incluem, mas não estão limitados a, virions AdB-2/3, capsídeos AdB-2/3, partículas dodecaédricas AdB-2/3 (PtDd) (partículas sub-virais dodecaédricas produzidas por AdB-2/3 durante sua replicação) e multímeros de fibra AdB-2/3 recombinantes.
[000167] Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção provê métodos para induzir um epitélio de transição mesenquimal (EMT) em um tecido compreendendo fazer o tecido epitelial entrar em contato com uma quantia de um multímero de fibra AdB-2/3 da invenção suficiente para induzir EMT. EMT é um programa de transdiferenciação celular onde as células epiteliais perdem características, tais como junções intercelulares e ganham propriedades das células mesenquimais. EMT é caracterizado por aumentada expressão de marcadores mesenquimais, aumentada expressão de compostos de matriz extracelular, diminuída expressão de marcadores epiteliais, alterada localização de fatores de transcrição e ativação de quinases e dissociação de junções intercelulares. Multímeros exemplares compreendendo um ou mais multímeros de fibra AdB-2/3 da invenção que podem ser usados nestes métodos incluem, mas não estão limitados a, virions AdB-2/3, capsídeos AdB-2/3, partículas dodecaédricas AdB-2/3 (PtDd) (partículas sub-virais dodecaédricas produzidas por AdB- 2/3 durante sua replicação) e multímeros de fibra AdB-2/3 recombinantes.
[000168] Em todos os aspectos e modalidades dos métodos da invenção, o agente terapêutico, de diagnóstico e/ou de imagem pode ser administrado juntamente com o multímero AdB-2/3 (tal como por meio das composições da invenção divulgada acima) ou pode ser administrado separadamente. Em uma modalidade, o terapêutico e o multímero AdB-2/3 estão ligados, por meio de qualquer ligação covalente ou não covalente adequada. Em uma modalidade não limitante, um multímero AbB-2/3 pode, ligado a uma toxina ou outra droga, matar células de tumor sólido.
[000169] O multímero de fibra AdB-2/3 e/ou terapêutico pode ser administrado de qualquer forma considerada adequada por um médico, dependendo de se um modo local ou sistêmico de administração é mais apropriado para a condição sendo tratada. Como usado neste documento, os termos "entrega sistêmica" e "administração sistêmica" destinam-se a incluir, mas não são limitados a, vias orais e parenterais incluindo intramuscular (IM), subcutânea, intravenosa (IV), intra-arterial, inalatória, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, nasal, retal, vaginal e outras vias de administração que efetivamente resultam na dispersão do agente entregue a um único ou vários sítios de ação terapêutica pretendida. Vias preferenciais de entrega sistêmica para as presentes composições incluem intravenosa, intramuscular, subcutânea e inalatória. Em uma modalidade preferencial, administração intravenosa é usada, tal como para o tratamento de tumores disseminados (e para a entrega de anticorpo monoclonal). Em outra modalidade, entrega oral pode ser preferencial, por exemplo, para tratar distúrbios epiteliais gastrointestinais (GI). Em outra modalidade, entrega nasal ou por aerossol pode ser preferencial para entrega aos pulmões, tal como para distúrbios epiteliais do pulmão.
[000170] O multímero de fibra AdB-2/3 pode ser introduzido em associação com outra molécula, tal como um lipídio ou um lipossoma para proteger os polipeptídeos a partir de degradação enzimática. Por exemplo, a ligação covalente de polímeros, especialmente o polietilenoglicol (PEG), foi usada para proteger certas proteínas a partir de hidrólise enzimática no corpo e, deste modo, prolongar a meia vida.
[000171] O multímero de fibra AdB-2/3 e/ou terapêutico pode ser administrado de forma sistêmica em uma base periódica em intervalos determinados para manter um nível desejado de efeito terapêutico. Por exemplo, a administração por injeção intravenosa pode ser uma vez por dia, uma vez por semana, a cada duas a quatro semanas ou em intervalos menos frequentes. O regime de dosagem será determinado pelo médico considerando vários fatores que podem influenciar a ação da combinação de agentes. Estes fatores irão incluir a extensão do progresso da condição sendo tratada, a idade do paciente, sexo e peso e outros fatores clínicos. A dosagem para o multímero de fibra AdB-2/3 e/ou terapêuticos varia como uma função do multímero e/ou terapêutico sendo administrado, assim como a presença e natureza de qualquer veículo de entrega de droga (por exemplo, um veículo de entrega de liberação prolongada). Além disso, a quantidade de dosagem pode ser ajustada para ser responsável pela variação na frequência de administração e o comportamento farmacocinético do(s) agente(s) entregue(s). Intervalos de dosagem de multímeros de fibra AdB-2/3, em geral, irão variar entre 0,01 e 250 mg/kg, preferencialmente entre 0,1 e 10 mg/kg e mais preferencialmente entre 0,10 a 0,5 mg/kg. Dosagens de terapêuticos aprovados são facilmente identificáveis pelos médicos. O terapêutico também pode ser capaz de ser administrado em uma dose reduzida devido à penetração intensificada em tecidos epiteliais, tais como cânceres.
[000172] O multímero de fibra AdB-2/3 pode ser administrado ao sujeito antes, simultaneamente ou após a administração do terapêutico. Em uma modalidade preferencial, administração do terapêutico e o multímero de fibra AdB-2/3 são realizados ao mesmo tempo. O sincronismo de administrações do terapêutico em relação ao multímero de fibra AdB-2/3 pode ser variado para atingir o maior efeito terapêutico. Preferencialmente, o terapêutico é administrado ao mesmo tempo para garantir o seu contato com a abertura transitória da junção intercelular causada pela ligação de multímero de fibra AdB-2/3 à DSG2. Por exemplo, o terapêutico pode ser administrado antes, simultaneamente, após cada administração do multímero de fibra AdB-2/3. Em outras modalidades preferenciais, o terapêutico pode ser administrado após a administração do multímero de fibra AdB-2/3, por exemplo, até 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas, 42 horas, 48 horas, 54 horas, 60 horas, 66 horas, 72 horas, 78 horas, 84 horas, 90 horas ou mesmo até 96 horas após a administração do multímero de fibra AdB-2/3.
[000173] Em outro aspecto, a presente invenção provê métodos para o tratamento de um distúrbio associado com tecido epitelial, compreendendo administrar a um sujeito que necessite deste uma quantia de um multímero de fibra AdB-2/3 da invenção suficiente para tratar o distúrbio. Nesta modalidade, nenhum outro terapêutico é entregue. Em modalidades não limitantes, a monoterapia é usada para tratar um distúrbio selecionado a partir do grupo consistindo em uma infecção viral AdB-2/3, um tumor sólido ou um distúrbio que pode ser tratado usando um vetor de entrega genética à base de AdB-2/3. Por exemplo, no tratamento de tumores sólidos, o método compreende melhorar o acesso de células do sistema imunológico ao sítio da desordem, tal como pela penetração (tal como penetração intratumoral de células exterminadoras naturais pré- existente, células T ou células dendríticas). O método também pode ser usado para tratar qualquer um dos distúrbios associados com células epiteliais discutidas acima que podem se beneficiar do acesso melhorado de células do sistema imunológico para as células epiteliais alvo. Em uma modalidade preferencial, o distúrbio é um tumor sólido e o método compreende melhorar o ataque de sistema imunológico do tumor. O método pode ser usado com qualquer um dos tumores sólidos discutidos acima. Todas as modalidades e combinações de modalidades do primeiro aspecto da invenção também podem ser usadas neste segundo aspecto, a menos que o contexto claramente dite o contrário. Multímeros exemplares compreendendo um ou mais multímeros de fibra AdB-2/3 da invenção que podem ser usados nestes métodos incluem, mas não estão limitados a, virions AdB-2/3, capsídeos AdB-2/3, partículas dodecaédricas AdB-2/3 (PtDd) (partículas sub-virais dodecaédricas produzidas por AdB-2/3 durante sua replicação) e multímeros de fibra AdB-2/3 recombinantes.
[000174] Em outro aspecto, a presente invenção provê o método para identificar compostos candidatos para um ou mais dentre tratar um distúrbio associado com tecido epitelial, melhorar a entrega de uma substância a um tecido epitelial, melhorar a entrega de uma substância ao tecido expressando DSG2, induzir um EMT em um tecido e/ou tratar uma infecção AdB-2/3 compreendendo (a) fazer um multímero de fibra AdB-2/3 da invenção entrar em contato com DSG2 sob condições para promover ligação de multímero a DSG2, em que o contato é realizado na presença de um ou mais compostos de teste; e (b) identificar compostos de teste positivo que competem com o multímero de fibra AdB-2/3 para ligação a DSG2 em comparação ao controle; em que os compostos de teste positivo são compostos de candidatos para um ou mais dentre tratar um distúrbio associado com tecido epitelial, melhorar a entrega de uma substância a um tecido epitelial, melhorar a entrega de uma substância ao tecido expressando DSG2, induzir um EMT em um tecido e/ou tratar uma infecção AdB-2/3.
[000175] Compostos de teste positivo que competem com o multímero de fibra AdB-2/3 para ligar a DSG2 são compostos candidatos para de forma transitória abrir junções intracelulares através da sua interação com DSG2. Ensaios de acompanhamento para verificar a capacidade dos compostos de abrirem de forma transitória junções intracelulares através de sua interação com a DSG2 podem ser realizados por quaisquer métodos adequados, incluindo, mas não limitados a, estudos divulgados nos exemplos que a seguir. Compostos tão identificados para tratar um distúrbio associado com tecido epitelial, melhorar a entrega de uma substância a um tecido epitelial, melhorar a entrega de uma substância ao tecido expressando DSG2 ou induzir um EMT em um tecido, podem ser usados como substitutos para o multímero AdB-2/3 em qualquer um dos métodos da presente invenção. Além disso, AdB-2/3 representa importantes patógenos humanos causando infecções do trato respiratório (algumas severas) e febre faringoconjuntival. Deste modo, compostos que podem tratar a infecção AdB-2/3 seria útil. Como divulgado neste documento, DSG2 como o principal receptor de alta afinidade usado pelo AdB-2/3 e, deste modo, compostos que podem diminuir a ligação AdB-2/3 de DSG2 são compostos candidatos para tratar ou limitar o desenvolvimento de infecção AdB-2/3.
[000176] Multímeros exemplares compreendendo um ou mais multímeros de fibra AdB-2/3 da invenção que podem ser usados nestes métodos incluem, mas não estão limitados a, virions AdB-2/3, capsídeos AdB-2/3, partículas dodecaédricas AdB-2/3 (PtDd) (partículas sub-virais dodecaédricas produzidas por AdB-2/3 durante sua replicação) e multímeros de fibra AdB-2/3 recombinantes. Qualquer controle adequado pode ser usado, incluindo, mas não limitado a, uma ligação de multímero AdB-2/3 à DSG2 na ausência de compostos de teste.
[000177] Em uma modalidade, a DSG compreende DSG2 recombinante. Em outra modalidade, os métodos de usam células expressando DSG2 (de forma endógena ou recombinante) na superfície celular.
[000178] Em uma modalidade não limitante, estudos de ressonância de plasmon de superfície (SPR) usando sensores contendo recombinantes imobilizados DSG2 podem ser usados para identificar compostos candidatos que ligação de multímero de fibra AdB-2/3 à DSG2, combinado com os estudos de concorrência de DSG2. Em outra modalidade, a identificação compreende estudos de transdução, onde a capacidade de compostos de teste para diminuir a ligação é detectada como uma diminuição na capacidade de virions AdB-2/3 funcionais para transduzir células epiteliais expressando DSG2. Em outra modalidade, extrato celular expressando DSG2 é separado de forma eletroforética e por Western blot e multímero de fibra AdB-2/3 marcado é usado para sondar o Western blot na presença dos compostos de teste. Em uma modalidade adicional, ensaios de dot-blot podem ser usados, tais como aqueles descritos em Wang et al., J. Virology (2007) 81:12785-12792; e Wang et al. (2008) 82:10567-10579.
[000179] Quando os compostos de teste compreendem sequências de polipeptídeo, tais polipeptídeos podem ser quimicamente sintetizados ou expresso de forma recombinante. Expressão recombinante pode ser conseguida usando métodos padrão na técnica, conforme divulgado acima. Tais vetores de expressão podem compreender os vetores de expressão bacteriana ou viral, e tais células hospedeiras podem ser procarióticas ou eucarióticas. Polipeptídeos sintéticos, preparados usando as técnicas bem conhecidas de fase sólida, fase líquida ou técnicas de condensação do peptídeo ou qualquer combinação destas, podem incluir aminoácidos naturais e artificiais. Aminoácidos usados para a síntese do peptídeo podem ser resina de aminoácido padrão Boc (Nα-t- butiloxicarbonil protegido com Nα-amino) com protocolos de desproteção, neutralização, acoplamento e lavagem padrão ou aminoácidos 9- fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) protegido com Nα-amino de base lábil padrão. Tanto aminoácidos protegidos com Nα-amino Fmoc quanto Boc podem ser obtidos a partir de Sigma, Cambridge Research Biochemical ou outras empresas químicas familiares para aqueles versados na técnica. Além disso, os polipeptídeos podem ser sintetizados com outros grupos de proteção Nα que são familiares para aqueles versados nesta técnica. Síntese do peptídeo de fase sólida pode ser conseguido por técnicas familiares para aqueles versados na técnica e provido, tais como, ao usar sintetizadores automatizados.
[000180] Quando os compostos de teste compreendem anticorpos, tais anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais. Os anticorpos podem ser de formas humanizadas, plenamente humanas ou murinas dos anticorpos. Tais anticorpos podem ser feitos por métodos bem conhecidos, tais como descritos em Harlow e Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, (1988).
[000181] Quando os compostos de teste compreendem sequências de ácido nucleico, tais ácidos nucleicos podem ser quimicamente sintetizados ou também expressos de forma recombinante. Técnicas de expressão recombinante são bem conhecidas por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook, et al., 1989, supra). Os ácidos nucleicos podem ser DNA ou RNA e podem ser de filamento único ou duplo. De forma similar, tais ácidos nucleicos podem ser sintetizados de forma química ou enzimática por reações manuais ou automatizadas, usando técnicas padrão na técnica. Se sintetizado de forma química ou por síntese enzimática in vitro, o ácido nucleico pode ser purificado antes da introdução na célula. Por exemplo, os ácidos nucleicos pode ser purificados a partir de uma mistura por extração com um solvente ou uma resina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou uma combinação destes. Alternativamente, os ácidos nucleicos pode ser usados sem nenhum ou um mínimo de purificação para evitar perdas devido ao processamento de amostra.
[000182] Quando os compostos de teste compreendem compostos que não sejam polipeptídeos, anticorpos ou ácidos nucleicos, tais compostos podem ser feitos por qualquer um dentre a variedade de métodos na técnica para conduzir a síntese química orgânica. Exemplos. Estudos estruturais e funcionais na interação de domínios de região globular da fibra de adenovírus e desmogleína 2.
Resumo
[000183] Sorótipos de adenovírus humano (Ad) Ad3, Ad7, Ad11, Ad14 e uma nova cepa que surgiu recentemente de Ad14 (Ad14p1) usam a desmogleína 2 de proteína de junção epitelial (DSG2) como um receptor para a infecção. Ao contrário de interação Ad com CAR e CD46, detalhes estruturais para a ligação Ad à DSG2 ainda são elusiva. Usando uma abordagem à base de bibliotecas de expressão de E. coli de Ad3 aleatórias região globular da fibra Ad14p1 mutantes identificamos resíduos de aminoácidos que, quando mutados de forma individual, retirados ou ligação de região globular Ad reduzida à DSG2. Estes resíduos formaram três conjuntos no interior de um sulco na extremidade distal extrema da região globular da fibra. A biblioteca mutante de região globular da fibra Ad3 também foi usada para identificar variantes com afinidade aumentada à DSG2. Encontramos um número de mutações dentro ou perto do ciclo EF da região globular Ad3 que resultou em diversas ordens de afinidades superiores de magnitude à DSG2 em comparação com a região globular Ad3 de tipo selvagem. Análise de estrutura de cristal de um dos mutantes mostrou que as mutações introduzidas fazem o ciclo EF mais flexível, o que pode facilitar a interação com DSG2. Nossos descobertas têm relevância prática para a terapia de câncer. Recentemente relatamos que uma região globular da fibra Ad3 contendo proteína recombinante (JO-1) é capaz de acionar abertura de junções entre as células de câncer epitelial que, por sua vez, melhoraram muito a penetração intratumoral e a eficácia de agentes terapêuticos. Aqui, mostramos que versões de afinidade intensificada de JO-1 são terapeuticamente mais potentes do que a proteína parental em uma série de modelos de câncer.
Introdução
[000184] Recentemente identificamos DSG2 como a principal receptora para um grupo de espécies de adenovírus B, incluindo sorótipo de adenovírus 3 (Ad3), um sorótipo que é amplamente distribuído na população humana(42). Descobrimos que o(s) domínio(s) de interação DSG2 dentro de Ad3 é(são) formado(s) por diversas regiões globulares da fibra (41). Este modo específico de interação de região globular de fibra Ad3-DSG2 provê uma alta avidez e é funcionalmente relevante para abrir junções epiteliais (41, 42). Este último envolve formar conjuntos de DSG2 e ativação de vias que são reminiscentes de uma transição epitelial para mesenquimal, incluindo a fosforilação da quinase MAP e a diminuição de expressão de junção de proteína (6, 40, 42). A capacidade de abrir junções epiteliais parece ser importante para penetração de Ad3 e se espalhou dentro de células epiteliais das vias respiratórias (40-42). Em um estudo recente, procurou-se encontrar a fração mínima dentro do capsídeo Ad3 que confere uma ligação eficiente à DSG2 (41). Geramos uma pequena proteína recombinante que contém a região globular da fibra Ad3 e um domínio que permite para a auto-dimerização de regiões globulares da fibra Ad3 triméricas (JO-1) (41). JO-1 pode ser prontamente produzida em E. coli e purificada por cromatografia de afinidade. Em culturas de célula epitelial polarizadas JO-1 acionou-se a abertura de junções intercelulares enquanto permitiu-se a injeção intravenosa de JO-1 em camundongos com tumores epiteliais para melhor penetração de drogas anti-câncer (5, 6).
[000185] O primeiro objetivo do presente estudo foi adicionalmente delinear recursos estruturais da interação de região globular de Ad3-DSG2. Isto incluiu identificar os resíduos de aminoácidos dentro da região globular da fibra Ad3 que estão envolvidos na ligação à DSG2 e criar mutantes JO-1 com ligação à DSG2 reduzida e retirada. O segundo objetivo deste estudo, que tem relevância de tradução, era adicionalmente melhorar JO-1 ao intensificar a sua afinidade à DSG2 aumentando, desse modo, seu efeito terapêutico. Isto foi feito ao identificar de mutantes com ligação melhorada à DSG2.
[000186] Ambos os objetivos foram atingidos usando uma biblioteca de expressão E. coli de mutantes de região globular da fibra Ad3. Identificamos resíduos em três conjuntos diferentes dentro da região globular da fibra Ad3 que são criticamente envolvidos na ligação à DSG2. Todos os resíduos são localizados dentro de um sulco na extremidade distal da região globular da fibra voltada para o receptor. Então, avaliamos o efeito destas mutações na capacidade da região globular da fibra abrir junções epiteliais ao medir da resistência elétrica transepitelial em células epiteliais polarizadas in vitro e a capacidade de intensificar a eficácia de uma droga de quimioterapia em camundongos com tumores epiteliais de xenoenxertos. Como esperado, quando mutações com afinidade reduzida à DSG2 foram introduzidas em JO-1, as proteínas resultantes foram menos capazes de abrir junções epiteliais. Por outro lado, um número de mutações que aumentou a afinidade de JO-1 à DSG2 exibiu uma atividade mais forte na abertura de junções epiteliais. Em geral, estes estudos indicam uma correlação entre a afinidade de regiões globulares da fibra Ad3-DSG2 e efeitos subsequentes em junções epiteliais.
[000187] O terceiro objetivo deste estudo foi delinear a DSG2 interagindo com resíduos de região globular da fibra de outro sorótipo Ad visando DSG2; a nova cepa Ad14p1 (44), que é considerado mais patogênico/virulento do que a cepa parental (Ad14-deWit) (10, 16, 22). A distribuição de folha beta de Ad14p1 difere daquela de Ad3, que potencialmente poderia resultar em diferenças no modo de ligação de DSG2. Portanto, geramos uma biblioteca de expressão de E. coli de mutantes de região globular da fibra Ad14p1 para identificar os resíduos de interação de DSG2 de Ad14p1.
Materiais e Métodos
[000188] Proteínas. Proteína DSG2 humana recombinante era a partir de Leinco Technologies, Inc. (St. Louis, MO). A região globular da fibra Ad3 derivou-se de vírus Ad3, cepa GB, obtidos a partir de ATCC. A região globular da fibra Ad14p1 é derivada de vírus Ad14p1, cepa Portland 2971/2007, providas pelo Centro de Controle e Prevenção de Doenças (Center for Disease Control and Prevention) (Atlanta, GA) (44). As regiões globulares da fibra foram produzidas em E. coli com marcações 6-His de N- terminal, usando o vetor de expressão pQE30 (Qiagen, Valência, CA) e purificadas por cromatografia de agarose Ni-NTA conforme descrito em outro lugar (43).
[000189] Linhas celulares. Células 293, HeLa e A549 foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina (P/S), 2 mM de glutamina (Glu) e 1x MEM de solução de não essencial de aminoácido (Invitrogen, Carlsbad, CA). Células T84 de câncer de cólon (ATCC CCL-248) foram cultivadas em uma mistura 1:1 de meio F12 de Ham e DMEM, 10% de FBS, Glu e P/S. Células Ovc316 são células de tumor epitelial positivo Her2/neu derivadas de uma biópsia de câncer de ovário (32). Células Ovc316 foram cultivadas em MEGM (Lonza, Mapleton, IL), contendo 3μg/l de hEGF, 5μg/l de insulina, 5 mg/l de hidrocortisona, 26 mg/l de extrato pituitário bovino, 25 mg/l de anfotericina B) (Lonza), suplementado com 1% de FBS, 100 I.U. de penicilina, 100μg/l de estreptomicina, 10 mg/l de ciprofloxacina. Células MDA-MB-231, uma linha celular de câncer de mama triplo-negativo (ATCC- HTB-26) foram cultivadas em meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% de FBS, 100 I.U. de penicilina, 100μg/l de estreptomicina. TC1-DSG2 foram derivadas de células TC1, uma linha celular de câncer do pulmão C57Bl/6 que expressa HPV16 E6 e E7 (36). Células TC1 foram transduzidas com um vetor de lentivírus de pseudotipo de VSVG expressando DSG2 humana (42). Um clone que expressa a DSG2 humana a um nível visto em tumores humanos foi selecionado para estudos in vivo.
[000190] Adenovirus. Propagação, marcação de metil-3H timidina, purificação e titulação de Ad3 de tipo selvagem foi executada conforme descrito em outro lugar (37). Ad3-GFP é um vetor à base de Ad3 de tipo selvagem contendo um cassete de expressão CMV-GFP inserido na região E3 (42). As concentrações de partículas virais (VP) foram determinadas por espectrometria ao medir a densidade óptica em 260 nm (OD260). Titulações de placas formando unidades (pfu) foram executadas usando células 293 conforme descrito em outro lugar (29). A razão de VP para pfu era de 20:1 para todas as preparações de vírus.
[000191] Biblioteca de região globular Ad3. A sequência de codificação da região globular Ad3 (aa 108-319) contendo as últimas duas repetições de eixo foi obtida por PCR a partir de DNA Ad3 usando primers P1: 5' ATCACGGATCCGGTGGCGGTTCTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGGTTCT AACAAACTTTGCAGTAAACTC 3' (SEQ ID NO: 35) e P2: 5'CTCAGCTAATTAAGCTTAGTCATCTTCTCTAATATAG GA 3' (SEQ ID N°: 36) e clonada em pQE30 (Qiagen, Valência, CA) por expressão em E. coli. O plasmídeo resultante foi chamado de região globular pQE-Ad3. PCR mutagênica aleatória foi realizada com base em um protocolo publicado em outro lugar (7, 8). Brevemente, 20 fmoles de modelo de DNA de região modular pQE-Ad3, 30 pmoles (cada) de primers de PCR (Pmut1: 5'- CCAATTCTATTGCACTTAAGAATAACACTTTATGGACAGGT -3' (SEQ ID N°: 37) e Pmut2: 5'- GTCCAAGCTCAGCTAATTAAGCTTAGTCATCTTC -3' (SEQ ID N°: 38), 2,5 μl, 3,5 μl, 5 μl ou 10 μl de 10x de tampão mutagênico (70 mM de MgCl2, 500 mM de KCl, 100 mM de Tris (pH 8,3 a 25°C) e 0,1% de gelatina (p/v)), 10 μl de 5mM de MnCl2, 10 μl de mistura de dNTP (2 mM de dGTP, 2 mM de dATP, 10 mM de dCTP, 10 mM de dTTP) e 5 unidades de Taq polimerase (Promega Madison, WI) foram misturados em um volume final de 100 μl. Condições de PCR estavam a 94°C por 1 min, 45°C por 1 min e 72°C por 1 min (30 ciclos). Os produtos de PCR mutantes (615bp de comprimento contendo mutações apenas na armação de leitura de cabeça de região globular da fibra) foram purificados, digeridos com enzimas apropriadas e clonados no plasmídeo de região modular pQE-Ad3. Para controle de qualidade da biblioteca mutagênica aleatória, o produto de ligação foi transformado em E. coli M15 (Qiagen, Valência, CA), transferidas para placas em placas de canamicina e ampicilina e 50 colônias foram aleatoriamente escolhidas para sequenciamento.
[000192] Biblioteca Ad14: A sequência de codificação da região globular Ad14p1 (aa 108-323) contendo as últimas duas repetições de eixo foi obtida por PCR a partir de DNA Ad14p1 usando primers P1: 5' CATCACGGATCCGGTGGCGGTTCTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGGTTC TAATAAACTTTGTACCAAATTGGGAGAAGG 3' (SEQ ID N°: 39) e P2: 5' GCTAATTAAGCTTAGTCGTCTTCTCTGATGTAGTAAAAGG 3'(SEQ ID N°: 40), e clonada em pQE30 (Qiagen, Valência, CA) por expressão em E. coli. O plasmídeo resultante foi chamado região globular pQE-Ad14p1. PCR mutagênica aleatória foi executada ao usar primers PCR (Pmut1: 5'- AACACCCTGTGGACAGGAGTTAACCC -3' (SEQ ID N°: 41) e Pmut2: 5'- CTCAGCTAATTAAGCTTAGTCGTC -3' (SEQ ID N°: 42)). Os produtos de PCR mutantes (594bp de comprimento contendo mutações apenas na armação de leitura de cabeça de região globular da fibra) foram purificados, digeridos com enzimas apropriadas e clonados no plasmídeo de região globular pQE-Ad14p1. Para controle de qualidade da biblioteca mutagênica aleatória, o produto de ligação foi transformado em E. coli M15 (Qiagen, Valência, CA), transferidas para placas em placas de canamicina e ampicilina e 50 colônias foram aleatoriamente escolhidas para sequenciamento.
[000193] Ensaios de colônia. Biblioteca de plasmídeo mutante de região globular Ad3 ou Ad14p1 foi transformada em cepas hospedeiras de E. coli XL1 Azul ou M15 e transferidas para placas em placas LB com antibióticos apropriados, ou seja, Amp ou Amp+Kan, respectivamente. Após o crescimento durante a noite, uma membrana de filtro Durapore de 0,45 μm (Millipore, Billerica, MA) foi colocado no topo das colônias. A membrana foi descascada e colocada cuidadosamente, com as colônias voltadas para cima, em duas folhas de papel de 3mm embebidas em meio LB suplementado com antibióticos e 1mM de IPTG. Expressão da proteína das colônias foi induzida por 6 horas a 30°C, depois do qual o filtro com as colônias foi colocado sobre um filtro de nitrocelulose e um papel Whatman 3MM embebido em tampão de lise nativo {20 mM de Tris-Cl (pH8), 300 mM de NaCl, 50mm de MgCl2, 0,1 mg/ml de lisozima, 0,75 mg/ml de DNAse I, ^ comprimido de coquetel inibidor de protease livre de EDTA completa/10 ml (Roche, Palo Alto, CA)}. O "sanduíche de filtro" foi incubado em temperatura ambiente por 10 minutos e depois congelado-descongelado 4 vezes por 10 minutos a -80°C e 10 minutos a 30°C. A membrana de nitrocelulose foi removida do sanduíche e bloqueada com 3% de BSA em TBST a 4°C durante a noite. O blot foi então incubado com 0,1 ng/ml de proteína DSG2 recombinante (Leinco, St. Louis, MO) em TBST/BSA, seguido por anticorpos anti-DSG2 monoclonais de camundongo (Clone 6D8; SeroTec Ltd., Oxford, UK) e conjugado de peroxidase de rábano IgG anti-camundongo. Colônias sem ligação de DSG2 foram escolhidas e cultivadas em 3 ml de meio LB durante a noite. Expressão da proteína foi induzida com 1 mM de IPTG por 5 horas, as bactérias foram então peletizadas, ressuspensas em tampão de carga SDS e congelado/descongelado 3 vezes. Após a eletroforese, proteínas foram transferidas para nitrocelulose e incubadas com anticorpos anti-His (MCA1396, Sertec) para avaliar trimerização de região globular Ad. Para pesquisar por mutantes com forte ligação à DSG2, biblioteca mutante de região globular Ad3 foi transformada em cepa hospedeira de E. coli M15. Expressão de proteína das colônias foi induzida por apenas 20 minutos à temperatura ambiente. As colônias que mostraram o sinal de ligação de DSG2 mais intenso foram escolhidas.
[000194] Western Blot: Géis pré-moldados Mini-PROTEAN (BIORAD, Hércules, CA) com 4%-15% de poliacrilamida gradiente foram usados. Um total de 1 μg de proteína misturado com 2x tampão de carga (10 mM de Tris-HCl, ppH6,8, 200 mM de DTT, 4% de SDS, 20% de glicerol, 0,2% de bromofenol) foi carregado por faixa. Amostras foram cozidas (B) por 5 minutos ou carregadas sem cozimento (UB). O seguinte tampão de execução foi usado: 25mM de Tris, pH8,3, 0,192 M de glicina, 0,1% de SDS. Após a eletroforese, proteínas foram transferidas para nitrocelulose e incubadas com proteína DSG2 humana recombinante e anticorpos anti- DSG2, conforme descrito anteriormente (42). Os Western blots foram examinados e quantificados usando o software ImageJ 1.32 (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Intensidade de banda de JO-1 foi definida como 100%. Para a análise da atividade de quinase MAP, culturas T84 polarizadas foram lisadas em 20 mM de Hepes (pH 7,5), 2mM de EGTA, 10% de glicerol, 1% de TritonX100, 1mM de PMSF, 200μM de Na3VO4 e inibidores de protease) no gelo. Depois sonicação, amostras foram peletizadas e proteína contendo sobrenadante armazenado a -80°C. 15 μg de proteína total foram usados para realizar Western blot com mAb contra fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Danvers, MA) ou mAb contra anti-Erk1/2 de camundongo (Cell Signaling).
[000195] Ensaios de competição. Células HeLa foram separadas de pratos de cultura pela incubação com Versene e lavadas com PBS. Um total de 105 células por tubo foram ressuspensos em 50 μl de tampão de adesão gelada (DMEM suplementado com 2 mM de MgCl2, 1% de FBS e 20 mM de HEPES) contendo diferentes concentrações de proteína de região globular da fibra Ad3 e incubados em gelo por 1 hora. Então, vírus Ad3 de tipo selvagem marcado com 3H foi adicionado no tampão de adesão em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 8.000 partículas virais (vp) por célula até um volume final de 100 μl. Após 1h de incubação no gelo, as células foram peletizadas e lavadas duas vezes com 0,5 ml de PBS gelado. Após a última lavagem, o sobrenadante foi removido e a radioatividade associada à célula foi determinada por um contador de cintilação. O número de VP ligado por célula foi calculado ao usar a radioatividade específica de virion e o número de células.
[000196] Ressonância de Plasmon de Superfície: Aquisições foram feitas em um instrumento BIAcore 3000. HBS-N (GE-Healthcare, Pittsburgh, PA) suplementado com 2 mM de CaCl2 foram usados como tampão de execução em todos os experimentos a uma taxa de fluxo de 5 μl/min. Imobilização no chip sensorial CM4 (BIAcore) foi realizada usando DSG2 a 10 μg/ml diluído em 10 mM de tampão de acetato de pH 4,5 injetado por 10 minutos na célula de fluxo ativado com etil(dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)/N-Hidroxisuccinimida (NHS). Uma célula de fluxo de controle foi ativada por (EDC/NHS) e inativada por etanolamina. Diferentes concentrações de proteínas de região globular da fibra Ad3 foram injetadas para associação de 3 minutos, seguida por tempo de dissociação de 2,5 minutos, e o sinal foi automaticamente subtraído do plano de fundo da célula de fluxo EDC-NHS desativada de etanolamina. Constantes de cinética e afinidade foram calculadas usando o software BIAeval.
[000197] Cristalografia: Condições de cristalização para wtAd3 e mutantes de região globular K217E/F224S estavam usando o serviço do High Throughput Screening Lab em Hauptman Woodward Medical Research Institute. Para estudos de difração, wtAd3 e mutante de região globular K217E/F224S foram cristalizados usando o método de gotejamento suspenso. Cristais foram cultivados usando uma solução de reservatório de 1,65M de MgSO4(7H20) em 0,1M de tampão TAPS de pH 9,0 e uma solução de proteína de 15mg/ml. Cristais foram congelados usando um crioprotetor composto por 85% de reservatório e 15% de glicerol (v/v). Coleta de dados foi executada a 100K no ID14-4 da ESRF usando a tubulação EDNA (19). Dados foram indexados e dimensionados usando XDS/XSCALE (20, 21) e a estrutura resolvido por substituição molecular (PDB 1H7Z) com o programa PHASER (25). O modelo foi construído e refinado usando COOT (14) e PHENIX (2), respectivamente (Tabela 1). A entrada "Estrutura do mutante K217E e F224S de domínio de região globular 3 de adenovírus" foi atribuída o código de identificação RCSB rcsb080687 e código de identificação PDB 4LIY.Tabela 1. Coleta de dados e estatísticas de refinamento.
[000198] Estatísticas para o cobertura de maior resolução são mostradas entre parênteses.
[000199] Estrutura 3D: Software Pymol foi usado para analisar a estrutura. Mutações no domínio de região globular Ad3 (pdb 1H7Z) foram coradas usando diferentes cores sobre a isosuperfície roxa. Monômeros de mutante de região globular Ad3 K217E/F224S foram desenhados em desenhos coloridos com mutações em bastões e sobrepostos sobre a vista de desenho cinza da região globular da fibra Ad3 de tipo selvagem.
[000200] Microscopia eletrônica de mancha negativa: Proteína JO- 2 recombinante foi visualizada pela mancha negativa EM para avaliar seu status de montagem. A preparação de mica-carbono padrão foi usada com proteína em 0,1 mg/ml. Amostra foi manchada usando 1% (p/vol) de silicotungstato de sódio (pH 7,0) e visualizada em um microscópio eletrônico JEOL-1200 a 100 kV.
[000201] Ensaio de permeabilidade. Um total de 5x105 células T84 foram cultivadas em inserções transwell de 12mm (membrana PET, com tamanho de poro 0,4 μm (Corning, NY) e cultivadas por > 14 dias até que resistência elétrica transepitelial (TEER) fosse estável. Meio de cultura foi mudado a cada 2-3 dias. As células foram expostas a ligantes DSG2 (20 de μg/ml) em meio de adesão (DMEM, 1% de FBS, 2 mM de MgCl2, 20 mM de HEPES) por 15 min em temperatura ambiente e TEER foi medido e calculado conforme descrito em outro lugar (39).
[000202] Estudos em animais: Todos os experimentos envolvendo animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes institucionais estabelecidas pela Universidade de Washington. Camundongos foram alojados em instalações livres de patógenos específicos. Camundongos imunodeficientes (CB17) ratos [nome da cepa: NOD.CB17-Prkdcscid/J] foram obtidos a partir do Jackson Laboratory. Camundongos transgênicos de DSG2 humana contêm 90kb do locus de DSG2 humana e expressam hDSG2 em um nível e em um padrão similar para os seres humanos (40).
[000203] Tumores de xenoenxerto A549, MDA-MB-231 e ovc316 foram estabelecidos por injeção das células de tumor correspondentes no coxim de gordura mamária (1:1 com Matrigel) de camundongos CB17. Tumores TC1-DSG2 foram estabelecidos por injeção subcutânea de células TC1-DSG2 em camundongos transgênicos DSG2. JO-0, JO-1, JO-2 ou JO- 4 foram injetadas por via intravenosa uma hora antes da aplicação de drogas quimioterápicas: Irinotecano/CamptosarTM (Pfizer Inc., Groton, CT), doxorrubicina lipossomal peguilada/LipodoxTM (Sun Pharmaceuticals IN, Índia), cetuximab/ErbituxTM (ImClone, Somerville, NJ), nanopartículas de albumina conjugadas com paclitaxel/AbraxaneTM (Abraxis Biosciences, Summit, NJ). Volumes de tumor foram medidos 3 vezes por semana. Cada grupo de tratamento consistiu em um mínimo de 5 camundongos. Os animais foram sacrificados e o experimento finalizado quando os tumores em um dos grupos atingiu um volume de 800 mm3 ou tumores exibiram ulceração.
[000204] Anticorpos anti-JO4: concentrações de anticorpos anti- JO-4 em amostras de soro humano foram medidas por ELISA. Placas serão revestidas com anticorpos de fibra anti-Ad3 policlonal de coelho (42), seguido por JO-4 recombinante, amostras de soro humano (diluição de 1:2 a 1:1000) e IgG-HRP anti-humano. Amostras de soro de pacientes com câncer de ovário foram providas pelo Pacific Ovarian Cancer Research Consortium.
[000205] Estrutura 3D: Software PyMOL foi usado para visualizar a estrutura 3D da região globular da fibra Ad3 (Identificação MMDB: 16945, Identificação PDB: 1H7Z (13))
[000206] Análise estatística: Todos os resultados são expressos como média +/- SD 2-way ANOVA para múltiplos testes foi aplicado. Número animais e valores P são indicados nas legendas da figura.
Resultados
[000207] Resíduos críticos para ligação de DSG2. Primeiramente, focamos nosso trabalho em Ad3. Ligação de alta afinidade para DSG2 e posterior abertura de junção epitelial exige diversas regiões globulares da fibra triméricas em uma constelação espacial presente no virion, PtDd ou regiões globulares da fibra Ad3 dimerizadas (triméricas) (por exemplo, JO- 1) (41). Região globular da fibra recombinante (trimérica) com dois motifs de eixo, mas sem ligações de domínio de dimerização ("monômero de região globular Ad3") para DSG2 com uma afinidade que é ordens de magnitude menor do que JO-1, não é capaz de bloquear a infecção Ad3 e não aciona a abertura de junção (37, 41, 42). Entretanto, a afinidade de "monômero de região globular Ad3" é alta o suficiente para detectar a ligação em Western blots em que DSG2 solúvel é usada como uma sonda. Usamos, portanto, uma biblioteca de expressão de E. coli de mutantes de "monômero de região globular Ad3" de His marcado para identificar os resíduos de aminoácido dentro da região globular da fibra Ad3 que são críticos para a ligação de DSG2. Para gerar esta biblioteca empregamos PCR mutagênica (7, 8) em um protocolo que, em média, gerou de uma a duas substituições de aminoácido por região globular. A biblioteca de região globular da fibra Ad3 em E. coli XL-1 azul foi transferida para placas em placas de ágar, expressão de região globular foi induzida por IPTG e colônias foram examinadas para ligação de DSG2 usando anticorpos DSG2 e anti-DSG2 recombinantes. Uma primeira rodada de exame de ~10.000 colônias para variantes que não se ligaram à DSG2 revelou 240 colônias candidatas. Quando analisadas por Western blot para a marcação 6xHis, 40 das 240 colônias mostraram expressão de região globular da fibra trimérica, indicando a ausência de grandes mudanças conformacionais. As variantes restantes tinham truncado regiões globulares da fibra ou não formaram trímeros. Os 40 plasmídeos correspondentes foram sequenciados. A grande maioria das colônias tinha substituições de aminoácido únicas dentro da região globular da fibra. Se múltiplas substituições de aminoácido por região globular foram encontradas, novos genomas de região globular Ad3 contendo as mutações correspondentes individualmente foram sintetizados. Rodadas adicionais de exame de colônia não descobriram outras regiões, indicando que todos os resíduos de interação de DSG2 tinham sido encontrados. Um total de 8 mutantes independentes foram então usados para estudos posteriores (Fig. 1A). Em todos os estudos posteriores, geramos forma de auto-dimerização dos mutantes de fibra Ad3 (Fig. 1B) e os purificamos por cromatografia de afinidade usando colunas NTA-Ni. Os mutantes de região globular dimerizada purificada foram analisados para ligação de DSG2 por Western blot (Fig. 1C-F). Todos os mutantes foram severamente reduzidos na ligação quando comparados a JO-1 (ou seja, a forma dimerizada contendo a região globular da fibra wtAd3). Mutantes D261N e F265L foram quase completamente retirados para ligação de DSG2, enquanto os outros mutantes tinham diferentes níveis de ligação de DSG2 residual (3,6% - 20% em peso de região globular Ad3) (Tabela 2, "Western blot"). Os resíduos identificados, críticos para a ligação de região globular Ad3 à DSG2, estavam em três áreas diferentes da região globular Ad3 dentro do ciclo CD/folha beta D (N186D, V189G, S190P), o ciclo FG/folhas beta G (D261N, F265L) e a folha beta H/ciclo HI (L292A, L296R, E299V) (Fig. 1A). Em um modelo 3D da região globular da fibra Ad3 (número de acesso PDB 1H7Z_A), todos os resíduos identificados foram localizados no lado apical da região globular da fibra e seguiram um sulco específico na região globular (Fig. 2). É importante salientar, que, exceto F265L, todas as outras substituições resultaram em uma mudança de carga no resíduo correspondente. Diferenças nos padrões de migrações em géis de poliacrilamida (por exemplo, para D261N) indicam que as substituições causaram mudanças conformacionais. Atualmente estamos tentando cristalizar estes mutantes para analisar sua estrutura 3D.
[000208] Para criar uma região globular da fibra Ad3 e eventualmente um vírus Ad3 com ablação máxima de ligação de DSG2, introduzimos múltiplas mutações nas três áreas identificadas, especificamente uma combinação de N186D e D261N, uma combinação de D261N e L296R e uma combinação de todos os três N186D, D261N e L296R. Como esperado a combinação de mutações em todas as três regiões críticas conferiu o maior nível de ablação (Tabela 2, "Western Blot), Fig.1F).Tabela 2: Análise de mutantes de fibra Ad3. A segunda coluna mostra a análise quantitativa de bandas de Western blot correspondentes a trímeros de região globular Ad3. A intensidade da região globular da fibra wt Ad3 foi tomada como 100%. Os dados na terceira coluna refletem a capacidade de mutantes de região globular da fibra Ad3 dimérica de inibir a infecção Ad3-GFP (ver Fig.3B). Quanto maior a porcentagem, mais forte a inibição. Inibição por JO-1 (região globular wtAd3 dimérica) é tomada como 100%. A quarta coluna mostra dados correspondentes para ligação de vírus Ad3. N=3. As médias são mostradas. O desvio padrão foi inferior a 10%.
[000209] Em função de sua relevância como um patógeno que surgiu recentemente, também geramos uma biblioteca de mutantes de região globular da fibra de Ad14p1 ("monoméricos"). Um primeiro exame revelou ~300 colônias candidatas para variantes que não se ligaram à DSG2. Quando analisadas por Western blot para a marcação 6xHis, 45 das 300 colônias mostraram expressão de região globular da fibra trimérica. Sequenciamento destas variantes revelou 15 mutantes independentes com ligação reduzida à DSG2 (Fig. 1A). Curiosamente, apesar de uma distribuição de folha beta diferente, os resíduos de aminoácido que foram fundamentais para a ligação de região globular de Ad14p1 estavam nas mesmas três regiões que foram identificadas para a região globular da fibra Ad3. Em função destas semelhanças, executamos os estudos adicionais apenas com mutantes de região globular da fibra Ad3 selecionados.
[000210] Validação funcional. Estudos de competição foram executados em células HeLa, que expressam DSG2 (42). Primeiramente, estudamos a ligação de vírus Ad3 marcado com 3H após pré-incubação de células com regiões globulares da fibra Ad3 dimérica (Fig.3A). Redução na ligação de vírus Ad3 foi comparada à pré-incubação com JO-1, ou seja, a proteína dimérica que continha a região globular da fibra Ad3 de tipo selvagem. A inibição da ligação por JO-1 foi tomada como 100%. Os mutantes L296R, D261N e F265L bloquearam vírus Ad3 ligando o mínimo (5,1%, 5,3% e 17,6%), seguido por mutantes S190P, N186D e E299V (30,9%, 32,7% e 50,7% de ligação reduzida, respectivamente) (Tabela 2, "Ligação"). Uma configuração de ensaio similar foi usada para medir a capacidade de mutantes de região globular Ad3 dimérica para bloquear a transdução de células HeLa por um vetor Ad3-GFP. Transdução foi medida com base na expressão de GFP (Fig.3B). Similar ao que observamos no estudo de ligação, infecção Ad3-GFP foi menos reduzida pela pré- incubação com mutantes D261N e F265L, seguido por mutantes N186D, S190P, L296R e V189G. Considerando a ligação de DSG2 (Western blot), ligação e dados de competição de infecção juntos, concluímos que a área contendo resíduos 261 a 265 é a área mais crítica na ligação de DSG2. A região em torno de resíduos 186-190 também contribui para ligação, enquanto a região contendo resíduo 299 parece ser apenas marginalmente envolvida na ligação. Mutantes de região globular Ad3 dimérica com mutações combinadas também foram analisados por sua capacidade de competir com vírus Ad3 para a ligação (Fig. 3C) e infecção (Fig. 3D). O mutante com mutações em todas as três áreas (N185, D261, L296) não bloqueou ligação ou infecção Ad3 mesmo em concentrações de 200 ug/ml, indicando que quase é retirada para ligação de DSG2. De forma notável, ao usar sCD46 como uma sonda no Western blot de fibras Ad3 de tipo selvagem, nenhuma ligação específica foi observada (Fig. 4). Isto indica que Ad3 apenas se liga ineficientemente a CD46.
[000211] Correlação de ligação de DSG2 reduzida e capacidade mais fraca de abrir junções epiteliais. Um ensaio simples para a função de abertura de junção de mutantes de região globular Ad3 dimérica baseia-se na medição da resistência elétrica transepitelial (TEER) em culturas de células transwell. Células epiteliais cancerosas são cultivadas até a TEER ser constante, quando as principais junções intercelulares são formadas. Adição de JO-1 por 1 hora ao lado apical das culturas transwell resultou em uma rápida diminuição na TEER indicando abertura de junções (Fig. 5A). Incubação com mutante D261N não teve nenhum efeito sobre a TEER. N186D e E299V tinham efeitos intermediários que correlacionaram com a ligação residual das regiões globulares da fibra correspondentes à DSG2. Em estudos anteriores, também estabelecemos que JO-1 acionou mudanças em junções epiteliais de tumores de xenoenxerto e aumentou a eficácia antitumoral de quimioterápicos com alto peso molecular, por exemplo, irinotecano. (Irinotecano tem um peso molecular de 586,7 Da e é usado para tratar câncer de cólon e de pulmão). Usamos este efeito para avaliar a função de mutantes de região globular Ad3 dimérica in vivo (Fig. 5B). De forma similar ao que observamos in vitro, JO-1 intensificou terapia de irinotecano enquanto mutantes com ligação de DSG2 reduzida não tinham nenhum efeito significativo na eficácia de irinotecano.
[000212] Regiões globulares da fibra Ad3 dimérica de afinidade intensificada. Conforme descrito acima, JO-1 é relevante para a terapia de câncer. Portanto, é importante para melhor entender os detalhes estruturais de sua interação com DSG2 e criar mutantes JO-1 com afinidade aumentada para DSG2. Intensificação de afinidade de produtos biológicos é usada para: i) diminuir sua dose efetiva, ii) aumentar suas meia vidas, iii) potencialmente aumentar seus efeitos terapêuticos e iv) evitar os efeitos adversos de anticorpos gerados pelos pacientes contra o biológico (por exemplo, neutralização ou mudanças para os farmacocinéticos). Para fazer análogos de JO-1 com afinidade aumentada, nós examinamos a biblioteca de expressão de E. coli com mutações aleatórias dentro de JO-1 para variantes com ligação à DSG2 aumentada. Dentre as 10.000 colônias transferidas para placas, vinte colônias com sinais de DSG2 mais intensos foram escolhidas e DNA de plasmídeo foi sequenciado. Sete diferentes mutantes com uma ou duas substituições de aminoácido foram identificados: Y250F, K217E+F224S, N293S, V239D, F224L, E248G+K258E e L277R+N293D. A localização dos resíduos nas estruturas primárias e 3D da região globular da fibra Ad3 são mostrados na Fig. 6. De forma notável, a maioria das mutações foram localizadas dentro do ciclo EF, indicando que este ciclo está envolvido na estabilização da interação entre Ad3 e DSG2. V239 e Y250 não estão expostos na superfície de região globular, sugerindo uma mudança estrutural na região globular em vez de um envolvimento em ligação direta à DSG2 (Fig. 6B, painel direito). Proteínas de região globular Ad3 dimérica mutante recombinante foram então purificadas. Para medir a afinidade dos mutantes para DSG2, executamos estudos de ressonância de plasmon de superfície. O resultado de estudos com regiões globulares contendo o domínio de dimerização era complexo, mais provavelmente devido ao fato de que estes mutantes formaram complexos multiméricos. Portanto, executamos estudos com proteínas de região globular faltando o domínio de dimerização ("noDD"). A taxa de associação constante (ka ou kligado) e a taxa de dissociação constante (kd ou kdesligado), assim como o KD de região globular wt Ad3 e todos os mutantes de região globular são mostrados na Fig. 7. De acordo com estudos anteriores (41), descobrimos que a região globular wt Ad3 sem o domínio de dimerização ligado à DSG2 apenas com afinidade relativamente baixa (KD= 10μM). Com a exceção de mutantes L227R/noDD+N293D/noDD, todos os mutantes identificados no exame de blot de colônia tinham maiores afinidades para DSG2. De forma notável, as afinidades de mutante Y250F/noDD ou V239D/noDD foram 885 ou 405 vezes maior do que aquela de região globular wt Ad3k/noDD. A alta afinidade dos mutantes diferentes deveu-se principalmente a uma associação mais rápida à DSG2 ao invés de uma mudança na taxa de dissociação. A única exceção para esta tendência foi mutante N293S/noDD, para o qual a taxa de associação foi menor quando comparado com outros mutantes. Entretanto, isto foi parcialmente compensado por uma taxa de dissociação mais lenta. Juntos, estes resultados indicam que ligação de região globular wt Ad3 (noDD) à DSG2 é limitada principalmente por uma taxa de associação lenta que pode ser melhorada por um painel de mutações. Estas mutações não parecem modificar a estabilidade desta interação, mas o equilíbrio de associação versus dissociação, resultando em maiores afinidades de ligantes ao receptor.
[000213] Para melhor entender os elementos estruturais que intensificam a ligação à DSG2, executamos uma análise mais detalhada com mutante K217E/F224S. Microscopia eletrônica de transmissão com acetato de uranil manchou regiões globulares da fibra K217E/F224S contendo o domínio de dimerização mostrou partículas com 6 regiões globulares representando fibras triméricas dimerizadas (Fig. 8A, setas grossas e Fig. 8B). Curiosamente, nestas condições regiões globulares da fibra também formaram arrogados regularmente formatados (com ~30nm de diâmetro) assemelhando-se a PtDd colapsado (Fig. 8A, setas finas e Fig. 8C). Então, executamos estudos de cristalografia de raios x para resolver a estrutura do mutante K217E/F224S ao nível atômico (Figs. 8D- H). Como esperado, o mutante K217E/F224S formou um monotrímero de regiões globulares da fibra (Fig. 8E). A estrutura 3D do mutante foi revestida com aquela da região globular da fibra Ad3 de tipo selvagem (Fig. 8F-H). Isto revelou que o ciclo EF no mutante K217E/F224S foi completamente desordenado. Este ciclo está na base do domínio de região globular na junção com o eixo de fibra. As mutações K217E/F224S podem, portanto, permitir a ligação mais fácil ao aumentar a flexibilidade desta região de ciclo.
[000214] Correlação de afinidade aumentada com capacidade de abrir junções epiteliais mais forte. Para os seguintes estudos foi usado formas de região globular da fibra Ad3 contendo o domínio de dimerização. Para analisar os mutantes de alta afinidade selecionados, executamos estudos de infecção de competição com células Ad3-GFP em HeLa e as formas diméricas dos mutantes de fibra Ad3 de afinidade intensificada (Fig. 9a). Com base na expressão de GFP, todos os mutantes diméricos, exceto mutante L277R+N293D, inibiam infecção Ad3-GFP significativamente mais do que JO-1. De forma notável, as formas não dimerizadas de regiões globulares da fibra Ad3 com afinidade aumentada para DSG2 foram incapazes de atuar como concorrentes em estudos de transdução (Fig. 9B). Maior afinidade para DSG2 resultou em uma capacidade aumentada para abrir junções epiteliais em culturas transwell (Fig. 9C). Em comparação a JO-1, a TEER em culturas incubadas com os mutantes 250F, V239D e K217E+F224S foi significativamente maior.
[000215] Dois dentre a versão de afinidade intensificada de JO-1, Y293D e V250F foram analisados em ensaio in vivo. Chamamos estes mutantes JO-2 e JO-4, respectivamente. O primeiro estudo foi executado em um modelo de xenoenxerto derivado a partir de células A549 similares ao estudo descrito por Fig. 5B. A Figura 10A mostra que os mutantes de afinidade intensificada JO-2 e JO-4 aumentaram terapia de irinotecano significativamente mais do que JO-1 (p < 0,05 a partir do dia 27). Além disso, JO-4 (Kd=11,4nM) foi significativamente mais eficiente do que JO-2 (Kd-24,9nM), indicando uma correlação entre a afinidade para DSG2 e efeito terapêutico. Estudos adicionais foram executados em tumores de xenoenxerto derivados de células ovc316 (30, 32). Células ovc316 são células de tumor epitelial positivo Her2/neu derivadas de uma biópsia de câncer de ovário. Estas células podem se submeter a EMT e o processo inverso, transição de mesenquimal para epitelial (MET), em condições específicas in vitro e in vivo. Uma subfração de células ovc316 que é positiva para Nanog, CD133 e E-caderina é enriquecida para células-tronco cancerosas, ou seja, células de auto-renovação com potencial pluripotente e capacidade de formação de tumor (30). Células ovc316, portanto, estreitamente modela a heterogeneidade e plasticidade vistas em tumores in situ. Injeção intravenosa de JO-1 em uma dose de 2mg/kg uma hora antes da injeção do doxorrubicina lipossomal peguilada (PLD), uma droga que é amplamente usada para quimioterapia de câncer de ovário, aumentou significativamente a eficiência de tratamento (Fig. 10B). Consideravelmente, em uma dose de 0,5 mg/kg de JO-4 tinha um efeito de estimulação ainda maior na terapia PLD. Finalmente, testamos JO-4 em um modelo para câncer de mama triplo-negativo (TNBC). TNBC é caracterizado por uma falta de ou mínima expressão do receptor de estrógeno (ER), receptores de progesterona (PR) e a ausência de superexpressão de Her2/neu. TNBC é responsável por 15% de todos os cânceres de mama. Sobrevivência global é pobre comparado com a aquela em pacientes que têm outros fenótipos. Um recurso característico de TNBC é altos níveis de DSG2 e junções epiteliais. Resultados clínicos promissores no tratamento de TNBS foram atingidos com nanopartículas, paclitaxel conjugado com albumina (nab-paclitaxel/AbraxaneTM) sozinho ou em combinação com o cetuximab mAb visando EGFR/ErbituxTM (38). Nosso estudo mostrou que o JO-4 aumentou significativamente a terapia de nab- paclitaxel/cetuximab em um modelo do camundongo com tumores TNBC ortotópicos (Fig. 10C). Em função de sua relevância terapêutica, estudamos, adicionalmente, JO-4 em um modelo de tumor de camundongo adequado. Em função de vírus Ad3 e derivados de região globular da fibra Ad3 não se ligarem a tecidos e células de camundongo, usamos camundongos transgênicos humanos que expressaram a DSG2 humana em um padrão e a um nível semelhante ao de seres humanos (40). Estes camundongos foram implantados por via subcutânea com tumores TC1- hDSG singênico. Quando tumores alcançaram um volume de ~600mm3, JO-1 ou JO-4 foi injetado por via intravenosa para estudos de segurança e eficácia. Tanto concentrações de soro JO-1 quanto JO-4 diminuiu mais de uma ordem de magnitude dentro de uma hora após a injeção, por meio do qual o declínio foi significativamente maior para JO-4 (p<0,01 por 1 hora após injeção) (Fig. 11A). Depois de uma hora após injeção, concentração de JO-1 e JO-4 atingiu um patamar com ~100ng/ml. Também analisamos parâmetros hematológicos após injeção i.v. de JO-1 e JO-4. Química sanguínea não mostrou mudanças anormais. Contagem de células sanguíneas estavam normais, exceto o número de linfócitos e plaquetas, o que diminuiu no início após a injeção (Fig. 11B). Contagens de linfócitos e plaquetas atingiu um ponto mais baixo em 24 horas p.i. com números significativamente inferiores para JO-4 (p<0,01). Curiosamente, contagens de linfócitos e plaquetas retornadas aos níveis normais mais rápidos em camundongos injetados com JO-4 do que em animais tratados com JO-1.
[000216] JO-1 e JO-4 são proteínas derivadas de vírus e imunogênica. Em camundongos imunocompetentes, anticorpos IgG de soro contra estas proteínas podem ser detectados por ELISA duas semanas após injeção (5). Uma das premissas teóricas para intensificação de afinidade de proteínas terapêuticas é que evita anticorpos de neutralização de soro. Para testar isso, realizamos injeções repetidas de JO-1 e JO-4 em um modelo de tumor de camundongo hDSG2 imunocompetentes com tumores TC1-hDSG2 (Fig. 11C). Após dois ciclos de tratamento de JO-1 e PLD, o tratamento foi interrompido e permitiu-se que tumores voltassem a crescer. O 3° e o 4° ciclos de tratamento foram iniciados nos dia 28 e dia 35, respectivamente. No momento dos 3° ciclo, anticorpos anti-JO-1 de soro foram detectados por ELISA. Consideravelmente, em ambos, o 3° e o 4° ciclos de tratamento de JO-1 e JO-4 tinham um efeito de intensificação na terapia de PLD, por meio da qual o efeito de intensificação foi significativamente mais forte para JO-4.
[000217] Em geral, nossos estudos funcionais com mutantes de fibra Ad3 dimérica de afinidade intensificada demonstram uma correlação entre a afinidade de DSG2 e efeitos de abertura de junção epitelial/terapêuticos.
Discussão
[000218] Resíduos envolvidos na ligação de região globular Ad3 à DSG2. Ao contrário de interação Ad com CAR e CD46 (4, 28), detalhes estruturais na interação Ad com interação DSG2 são ainda elusivos. Embora a estrutura de cristal da região globular da fibra Ad3 foi resolvida, para DSG2, a estrutura 3D apenas do mais distal dos quatro domínios extracelulares (ECD) está disponível (Identificação MMDB: 59843). Entretanto, nossos estudos de competição anteriores com anticorpos monoclonais contra diferentes domínios DSG2 indicaram que ECDs 3 e 4 estão envolvidos na ligação à Ad3 (42). Neste estudo usamos análises à base de mutagênese para identificar os resíduos de aminoácido dentro da região globular da fibra Ad3 que são críticos para a ligação à DSG2. Análise mutagênica de DSG2 não foi possível em função de, quando expressa em E. coli, a proteína não se ligou à Ad3, indicando que o processamento após à tradução é necessário para criar sítios de ligação Ad3 ativos dentro de DSG2 (dados não mostrados). Os resíduos identificados, críticos para a ligação de região globular Ad3 para DSG2, estavam em três áreas diferentes da região globular da fibra Ad3 e formaram uma bolsa de ligação potencial localizada em um sulco na extremidade distal da região globular da fibra, voltada para o receptor. De forma notável, ligação de outros sorótipos Ad a CAR ou CD46 primariamente envolve regiões no lado lateral ou basal das regiões globulares da fibra correspondentes (27, 43). Nossos dados indicam que Ad3 usa uma estratégia de ligação diferentes. Estamos atualmente executando estudos de cristalografia com regiões globulares da fibra diméricas Ad3 à DSG2. Considerando que regiões globulares da fibra multiméricas Ad3 agrupam diversas moléculas de DSG2 (41), espera-se que a estrutura 3D deste complexo será complicada. Ela continua a ser estudada se os resíduos críticos para a ligação de região globular da fibra Ad3 à DSG2 também estarão envolvidos na ligação de outras espécies B Ads para DSG2. De forma notável, enquanto D261, F265 e E299 são conservados em todos os quatro Ads interagindo com DSG2 (Ad3, 7, 11, 14), outros resíduos críticos (N186, V189, L296) diferem entre estes sorótipos (Fig. 12).
[000219] Ad14 é um importante objeto de pesquisa em função do recente aparecimento de uma nova cepa (Ad14p1). Nunca anteriormente documentado nos Estados Unidos, o Ad14p1 foi primeiramente relatado em março e abril de 2006, durante a vigilância de rotina em diversos centros de treinamento de recrutas militares dos Estados Unidos (26). Durante março - junho do ano seguinte, um total de 140 casos adicionais de doença respiratória HAdV-B14p1 confirmados foram relatados em pacientes em Oregon, Washington e Texas (3). Trinta e oito por cento destes pacientes foram hospitalizados, incluindo 17% que foram internados em unidades de terapia intensiva; 5% dos pacientes morreram. Surtos de HAdV-B14p1 foram posteriormente detectados nas outras 5 bases e em populações civis em Washington (1), Oregon (23), Alasca (15), Wisconsin e Pensilvânia (10, 22), assim como no Canadá (16), China (33) e Coreia do Sul (34). Neste ponto, a base molecular para a alta patogenicidade e/ou virulência de Ad14p1 não é clara. Tentamos delinear os componentes estruturais para ligação de Ad14p1 à DSG2. A distribuição de folha beta de Ad14p1 difere daquela de Ad3 (Fig. 1A). Portanto, similar aos sorótipos interagindo com CD46 (11, 12), é possível que Ads interagindo com DSG2 variam em sua estratégia de ligação à DSG2, que poderia resultar em diferentes áreas de ligação de DSG2. Entretanto, o exame de uma biblioteca mutante de região globular da fibra Ad14p1 não apoiaram esta hipótese. As áreas envolvidas na ligação de DSG2 eram essencialmente as mesmas para regiões globulares da fibra Ad3 e Ad14p1. No entanto, nossas descobertas são relevantes para o tratamento de viremia Ad14p1, especificamente para a produção de inibidores de Ad14p1 ou chamarizes de alta afinidade que podem acionar a opsonização de vírus presentes na circulação sanguínea ou vias respiratórias.
[000220] Relatou-se que, além de DSG2, Ad3 pode usar CD46 como um receptor para infectar células se DSG2 estiver ausente (35). Anteriormente, descobrimos que em células epiteliais normais polarizadas DSG2 é presa em junções apertadas e não acessíveis a partir do lado apical, enquanto CD46 está presente em ambos os lados da membrana (42). Portanto, especulamos que CD46 pode servir como um receptor de entrada relativamente ineficiente para Ad3, enquanto, de novo, produziu Ad3 e Ad3 pentadodecaedro interagirem com DSG2, abrir junções epiteliais e permitir a propagação lateral eficiente de Ad3 ou penetração em camadas de tecido mais profundas e a circulação sanguínea. A capacidade de individualmente retirar os resíduos de região globular Ad3 que são críticos para a ligação de DSG2 e CD46, respectivamente, deveria tornar possível provar esta hipótese.
[000221] Regiões globulares da fibra de afinidade intensificada. A maioria das mutações que aumentaram a afinidade à DGS2 foram localizadas dentro do ciclo EF, indicando que este ciclo está envolvido na estabilização da interação entre Ad3 e DSG2. Curiosamente, ao contrário de Ad7, 11 e 14, a região globular da fibra Ad3 tem, nesta área, dois resíduos adicionais (VL) seguidos por uma prolina. Este ciclo, portanto, poderia ser adicionalmente estendido ainda mais e a prolina poderia orientá-lo de forma que pudesse permitir a melhor interação com o receptor. A análise da estrutura 3D de um destes mutantes ao nível atômico apoia esta conclusão. Estes estudos indicam que as mutações introduzidas fazem o ciclo mais flexível, o que pode facilitar a interação com DSG2.
[000222] A identificação de regiões globulares Ad3 com maior afinidade do que a região globular wt Ad3 tem implicações para terapia genética mediada por Ad3. Recentemente, vetores de transferência genética com base em Ad3 se mostraram promissores para a terapia de câncer em ensaios clínicos (18). Teoricamente, vetores Ad3 de afinidade intensificada poderiam ser usados em doses inferiores e superam anticorpos de neutralização. Recentemente, as tentativas foram realizadas para incorporar ligantes de alta afinidade em vírus de sarampo (17) e vetores de base Ad5 (3, 9, 45) a fim de aumentar a eficácia e especificidade de infecção celular alvo in vivo. Com base em nossas descobertas neste estudo, uma estratégia similar pode agora ser prosseguida para vetores Ad3.
[000223] Além de melhorar vetores Ad3, versões de afinidade intensificada de JO-1 têm relevância de tradução. Tumores mais sólidos são de origem epitelial e, embora células malignas sejam desdiferenciadas, mantêm junções intercelulares, um recurso principal de células epiteliais, tanto no tumor primário, assim como em lesões metastáticas (5, 31). Estas junções intercelulares representam um mecanismo de proteção contra ataques pelo sistema imunológico hospedeiro e representam barreiras físicas que impedem a penetração de intratumoral e disseminação de terapêuticos de câncer, incluindo anticorpos monoclonais e drogas quimioterápicas (5, 31). Quando injetado por via intravenosa em camundongos com xenoenxerto ou tumores transgênicos DSG2 singênicos, efeitos terapêuticos acentuadamente intensificados de JO-1 com uma variedade de drogas quimioterápicas, assim como anticorpos monoclonais (5, 6). Neste estudo, mostramos que novas versões de afinidade intensificada de JO-1 (por exemplo, JO-4) aumentaram a eficácia de terapêuticos de câncer significativamente mais do que JO-1 (irinotecano, nab-paclitaxel, doxorrubicina lipossomal peguilada, cetuximab) em quatro modelos de tumor (A549, ovc316, MDA-MB231 e TC1-DSG2). Estudos em camundongos transgênicos DSG2 com tumores singênicos mostraram que níveis de JO-4 de soro rapidamente diminui muito provavelmente devido à ligação de DSG2 em tecidos. Estudos anteriores mostraram que, além de tumores, linfócitos e plaquetas de transgênicos hDSG2 expressam hDSG2 (similar a humanos e macacos) (40, 42). Ao longo desta linha, descobrimos que injeção de JO-4 resultou em uma redução transitória de contagem de linfócito e plaqueta.
[000224] Apesar do fato de que aproximadamente um terço dos seres humanos têm anticorpos de neutralização contra Ad3 (42), em um estudo recente com soro de pacientes com câncer de ovário descobrimos anticorpos detectáveis (de ligação) contra JO-4 em apenas 10% dos pacientes (N=38) (Fig. 13). Entretanto, é certo que respostas imunes adaptativas contra JO-4 administrado por via intravenosa irá desenvolver em seres humanos, particularmente após a injeção repetida. Neste contexto, entretanto, é de forma notável anticorpos anti-JO-4 gerados após injeção em camundongos imunocompetentes pareceu não inibir criticamente a função de JO-4. Os dados mostrados na Fig. 11C demonstram que JO-1 e JO-4 continuam a ser eficazes após múltiplos ciclos de tratamento, mesmo na presença de anticorpos detectáveis. Em função disso, o efeito terapêutico após a injeção repetida foi significativamente maior para JO-4, especulamos que JO-4 é mais potente, não apenas na abertura de junção, mas também em interromper complexos entre o abridor de junção e os anticorpos de soro.
[000225] Em resumo, nossos estudos descobriram detalhes estruturais importantes de ligação de região globular da fibra Ad3 e Ad14p1 à DSG2. Além disso, mostra uma correlação entre a afinidade de regiões globulares de fibra Ad3 para DSG2 e efeitos subsequentes em junções epiteliais. Finalmente, a geração de regiões globulares da fibra Ad3 dimérica recombinante de afinidade intensificada tem implicações para a terapia de câncer. Referências 1. 2007. Acute respiratory disease associated with adenovirus serotype 14--four states, 2006-2007. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 56:1181-1184. 2. Adams, P. D., P. V. Afonine, G. Bunkoczi, V. B. Chen, I. W. Davis, N. Echols, J. J. Headd, L. W. Hung, G. J. Kapral, R. W. Grosse- Kunstleve, A. J. McCoy, N. W. Moriarty, R. Oeffner, R. J. Read, D. C. Richardson, J. S. Richardson, T. C. Terwilliger e H. P. Zwart. 2010. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66:213-221. 3. 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Claims (12)

1. Polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um ou mais motifs de domínio de eixo do polipeptídeo de fibra AdB- 2/3, em que cada motif de domínio de eixo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 12-18 e 4348; (b) um domínio knob do polipeptídeo de fibra AdB-2/3 ligado operativamente a, e localizado no C-terminal ao um ou mais motifs de domínio de eixo do polipeptídeo de fibra AdB-2/3, em que o domínio knob do polipeptídeo de fibra AdB-2/3 compreende o peptídeo de qualquer uma de SEQ ID NOS: 111, em que, quando o domínio knob do polipeptídeo de fibra AdB-2/3 compreende o peptídeo de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-4, X2 é H, L ou P; X3 é K ou E; X4 é T, F, S ou L; X5 é V ou D; X6 é E ou G; X7 é Y ou F; X8 é T, K ou E; e X9 é N ou S; e pelo menos um dos seguintes é verdadeiro: X2 é P; X3 é E; X4 é S ou L; X5 é D; X6 é G; X7 é F; X8 é E; ou X9 é S; e (c) um ou mais domínios de dimerização não derivados de AdB-2/3 ligados operativamente a, e localizados no N-terminal ao um ou mais motifs de domínio de eixo do polipeptídeo de fibra AdB-2/3.
2. Polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fibra AdB-2/3 não inclui um domínio cauda do polipeptídeo de fibra AdB-2/3, e/ou em que cada motif de domínio do eixo é selecionado a partir do grupo que consiste em um motif de domínio de eixo do polipeptídeo de fibra Ad3, um motif de domínio de eixo do polipeptídeo de fibra Ad7, um motif de domínio de eixo do polipeptídeo de fibra Ad11, um motif de domínio de eixo do polipeptídeo de fibra Ad14, um motif de domínio de eixo do polipeptídeo de fibra Ad14a, e suas combinações, e/ou em que o um ou mais motifs de domínio do eixo compreendem motifs de domínio do eixo 1-22.
3. Polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que cada motif de domínio de eixo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 43-48.
4. Polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) (M/)GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGG GSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMG ASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSARGF MPSTTAYPFVLPNAGTHNENFIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDSR TSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 28); (b) (M/)GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGSGG GSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMG ASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELEYKQTADSSARG FMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPDS RTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 29); (c) (M/-)GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGS GGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTL MGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSA RGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLP DSRTSYVMTFLWSLSAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 30); (d) (M/-)GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGS GGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTL MGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSA RGFMPSTTAYPFDLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLP DSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 31); (e) (M/-)GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGS GGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGLVNGYVTL MGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLEPKYKQTADFSA RGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYEASDGALFPLEVTVMLNKRLP DSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 32); (f) (M/-)GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGS GGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTL MGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADLSA RGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLP DSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 33); e (g) (M/-)GSKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEGSGGGSGGGS GGGSNSIALKNNTLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTL MGASDYVNTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDSSSLKTDLELKYKQTADFSA RGFMPSTTAYPFVLPNAGTHNGNYIFGQCYYEASDGALFPLEVTVMLNKRLP DSRTSYVMTFLWSLNAGLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEQ ID NO: 34).
5. Polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fibra AdB-2/3 contém um único motif de domínio de eixo do polipeptídeo de fibra AdB-2/3.
6. Polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fibra AdB-2/3 é multimerizado como um homotrímero.
7. Polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fibra AdB-2/3 é um dímero do homotrímero.
8. Polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, um ou mais compostos conjugados ao polipeptídeo de fibra AdB-2/3 selecionado a partir do grupo consistindo em agentes terapêuticos, de diagnóstico e de imageamento.
9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 6 a 8, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
10. Polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 8, ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, caracterizados por serem para uso no aumento da eficácia de um ou mais agentes terapêuticos no tratamento, ou diagnóstico no diagnóstico de um distúrbio associado ao tecido epitelial, e/ou um ou mais agentes de imageamento no imageamento de tecidos epiteliais.
11. Polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado com o tecido epitelial é selecionado a partir do grupo que consiste em tumores sólidos, síndrome do intestino irritável, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, constipação, doença do refluxo gastresofágico, esôfago de Barrett, doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, bronquite, enfisema pulmonar, fibrose cística, doença intersticial pulmonar, pneumonia, hipertensão pulmonar primária, embolia pulmonar, sarcoidose pulmonar, tuberculose, pancreatite, distúrbios do ducto pancreático, obstrução das vias biliares, colecistite, coledocolitíase, distúrbios cerebrais, psoríase, dermatite, glomerulonefrite, hepatite, diabetes, distúrbios da tireoide, celulite, infecção, pielonefrite e cálculos biliares.
12. Polipeptídeo de fibra AdB-2/3 recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 8, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizados por serem para uso no tratamento de um distúrbio associado ao tecido epitelial.
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