ES2638320T3 - Proteínas de unión a desmogleina 2 (DSG2) y sus usos - Google Patents

Proteínas de unión a desmogleina 2 (DSG2) y sus usos Download PDF

Info

Publication number
ES2638320T3
ES2638320T3 ES14783729.8T ES14783729T ES2638320T3 ES 2638320 T3 ES2638320 T3 ES 2638320T3 ES 14783729 T ES14783729 T ES 14783729T ES 2638320 T3 ES2638320 T3 ES 2638320T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
adb
dsg2
fiber
inhibitors
agents
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14783729.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Andre Lieber
Hongjie Wang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Washington Center for Commercialization
Original Assignee
University of Washington Center for Commercialization
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2013/061431 external-priority patent/WO2014052322A1/en
Application filed by University of Washington Center for Commercialization filed Critical University of Washington Center for Commercialization
Application granted granted Critical
Publication of ES2638320T3 publication Critical patent/ES2638320T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/04—X-ray contrast preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/10—Laxatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10033—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10333—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)

Abstract

Un polipéptido de fibra AdB-2/3 recombinante, que comprende: (a) uno o más motivos de dominio de eje de un polipéptido de fibra AdB-2/3; (b) un dominio de protuberancia de un polipéptido de fibra AdB-2/3 unido operativamente a y localizado en C- terminal con relación a uno o más motivos de dominio de eje de un polipéptido de fibra AdB-2/3, en donde el dominio de protuberancia del polipéptido de fibra AdB-2/3 comprende el péptido de una cualquiera de SEC ID NOS: 1-11, en donde cuando el dominio de protuberancia del polipéptido de fibra AdB-2/3 comprende el péptido de uno cualquiera de SEC ID NOS:1-4, al menos uno de los siguientes sucesos es cierto: X2 es P; X3 es E; X4 es S, o L; X5 es D; X6 es G; X7 es F; X8 es E; o X9 es S; y (c) uno o más de los dominios de dimerización no derivados de AdB-2/3 unidos operativamente y localizados en N-terminal con relación a uno o más motivos del dominio de eje del polipéptido de fibra AdB-2/3.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
X5 es V, D, o está ausente; X6 es E, G, o esta ausente; X7 es Y o F; X8 es T, K, o E; y
5 X9 es N o S; en donde al menos uno de los siguientes es cierto: X2 es P; X3 es E; X4 es S, o L;
10 X5 es D; X6 es G; X7 es F; X8 es E; o X9 es S.
15 Los polipéptidos aislados de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden dominios de protuberancias de AdB-2/3 mutante, que se pueden utilizar, por ejemplo, para producir polipéptidos de fibra AdB-2/3 recombinantes que proporcionan afinidad significativamente mejorada para desmogleina 2 (DSG2) en comparación con polipéptidos anteriormente conocidos de unión a DSG2. Como se muestra en los ejemplos que siguen, los polipéptidos de fibra AdB-2/3 recombinantes de la invención que incorporan los dominios de protuberancia mutantes de este primer
20 aspecto de la invención se muestra además que son terapéuticamente más potentes que los polipéptidos anteriormente conocidos de unión a DSG2 para el tratamiento de trastornos asociados al epitelio, ejemplificado por una eficacia mejorada en unas series de modelos de cáncer. Los péptidos aislados de la invención se pueden utilizar también, por ejemplo, como antígenos frente a virus AdB-2/3.
En una realización, los polipéptidos aislados del primer aspecto de la invención comprenden o consisten en la 25 secuencia de aminoácidos
imagen6
En otra realización, los polipéptidos aislados del primer aspecto de la invención comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos
imagen7
En una realización adicional, los polipéptidos aislados del primer aspecto de la invención comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos
imagen8
En todas estas realizaciones, al menos uno de los siguientes es cierto: X2 es P; X3 es E; X4 es S, o L;
10 X5 es D; X6 es G); X7 es F; X8 es E; o X9 es S.
15 En varias realizaciones, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, o todas las 8 de estos enunciados son ciertos. En una realización ejemplar, al menos X7 es F. En otra realización, al menos X3 es E y X4 es S. En otra realización, al menos X9 es S. En una realización adicional, al menos X5 es D. En otra realización, al menos X4 es L. En otra realización, al menos X2 es P y X8 es E. En otra realización, al menos X6 es G y X8 es E.
En varias realizaciones adicionales, el polipéptido aislado comprende o consiste en uno de los siguientes péptidos:
20 (a) TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYV NTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDS-SSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLP NAGTHNENFIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPSRT-SYVMTFLWSLNAGLA PETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEC ID NO: 5);
(b) TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVN TLFKNKNVSINVELYFDATGHILP-
DSSSLKTDLELEYKQTADSSARGFMPSTTAYPFV LPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPD25 SRTSYVMTFLWSLNAG LAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEC ID NO: 6);
(c) TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTL FKNKNVSINVELYFDATGHILPD-SSSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVLP NAGTHNENYIFGQCYYKASDGALF-PLEVTVMLNKRLPD-SRTSYVMTFLWSLSAGLA PETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEC ID NO: 7);
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(d)
TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYVNTL FKNKNVSINVELYFDATGHILPDS-SSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFDLP NAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPD-SRTSYVMTFLWSLNAGLA PETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEC ID NO: 8);
(e)
TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGLVNGYVTLMGASDYVN TLFKNKNVSINVELYFDAT-GHILPDS-SSLKTDLEPKYKQTADFSARGFMPSTTAYPFVL PNAGTHNENYIFGQCYYEASDGALF-PLEVTVMLNKRLPDSRTSYVMTFLWSLNAGL APETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEC ID NO: 9);
(f)
TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYV NTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDS-SSLKTDLELKYKQTADLSARGFMPSTTAYPF VLPNAGTHNENYIFGQCYYKASDGALFPLEVTVMLNKRLPD-SRTSYVMTFLWSLNA GLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEC ID NO: 10); y
(g)
TLWTGPKPEANCIIEYGKQNPDSKLTLILVKNGGIVNGYVTLMGASDYV NTLFKNKNVSINVELYFDATGHILPDS-SSLKTDLELKYKQTADFSARGFMPSTTAYPF VLPNAGTHNGNYIFGQCYYEASDGALFPLEVTVMLNKRLPD-SRTSYVMTFLWSLNA GLAPETTQATLITSPFTFSYIREDD (SEC ID NO: 11).
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido de fibra AdB-2/3 recombinante, que comprende:
uno o más dominios de eje de polipéptido de fibra AdB-2/3, motivos de dominio de eje o equivalentes funcionales de los mismos;
un dominio de protuberancia de polipéptido de fibra AdB-2/3, unido operativamente a un C-terminal localizado al uno
o más dominios de eje del polipéptido de fibra AdB-2/3 o motivos del dominio de eje, en donde el dominio de protuberancia de polipéptido de fibra AdB-2/3 comprende el polipéptido de cualquier realización o combinación de realizaciones del primer aspecto de la invención; y
uno o más dominios de dimerización no derivados de AdB-2/3 unidos operativamente a N-terminal y localizados a uno o más dominios de eje del polipéptido de fibra AdB-2/3 o motivos de dominio del eje.
Como se utiliza aquí, “AdB-2/3” es cualquier serotipo del adenovirus que utiliza DSG2 como un receptor de celulas epiteliales para unión viral. Hasta la fecha, se han identificado los serotipos Ad3, Ad7, Ad11, Ad14 y Ad14a. A medida que se identifican otros serotipos de Ad, aquellos expertos en la técnica pueden identificar rápidamente aquellos que pertenecen a la familia AbD-2/3 en base a los ensayos de unión a DSG2 como se describe aquí. Por ejemplo, los estudios de resonancia de plasmón superficial (SPR) que utilizan sensores que contienen DSG2 recombinante inmovilizado se pueden utilizar para determinar si los nuevos serotipos de Ad se unen a DSG2, combinado con los estudios de competición de DSG2. Estudios adicionales ejemplares, tales como análisis de la pérdida o ganancia de función, se describen en detalle en el documento de Patente WO 2011/156761.
El virión del adenovirus es un icosaedro caracterizado por una fibra situada en la base de cada uno de los 12 vértices de la cápside. La fibra en el virión es una estructura homotrimérica que consiste en 3 polipéptidos de fibra individuales. Cada polipéptido de fibra del adenovirus es una estructura asimétrica que consiste en una cola Nterminal, que interacciona con la proteína base del pentón de la cápside y contiene las señales necesarias para el transporte de la proteína al núcleo de la célula; un eje, que contiene un número de unidades de repetición de 15 restos; y un dominio de protuberancia C-terminal que contiene los determinantes para la unión al receptor (J.S. Hong y J.A. Engler, Journal of Virology 70:7071-7078 (1996)). Todos los adenovirus se unen a sus receptores a través de la estructura de protuberancia en el extremo de la fibra. Por lo tanto, tal como se usa aquí, el término “polipéptido de fibra” AdB-2/3 se refiere a un polipéptido de fibra de longitud completa que comprende un dominio de cola Nterminal, un dominio de eje o un motivo de dominio de eje, un dominio de protuberancia C-terminal. Los polipéptidos de fibra se unen espontáneamente en homotrímeros, denominados “fibras”, que se sitúan en el exterior del virión del adenovirus en la base de cada uno de los doce vértices de la cápside.
En una realización preferida, los polipéptidos recombinantes no incluyen un dominio de cola de un polipéptido de fibra Ad. Como se describe en detalle a continuación, los inventores identificaron restos críticos, cuya mutación dio como resultado polipéptidos de fibra con afinidad para DSG2 significativamente mejorada, y con potencia terapéutica significativamente mejorada. Los polipéptidos de este aspecto de la invención se pueden utilizar por tanto, por ejemplo, para formar multímeros de fibras AdB-2/3 para uso en los diferentes métodos de la invención descritos anteriormente. En este aspecto, los polipéptidos recombinantes pueden incluir dominios de eje o motivos de dominio de eje de cualquier virus AdB-2/3, o cualquier mutante (sustituciones, adiciones, deleciones, quimeras, etc,) a tales dominios de eje o motivos de dominio de eje que retienen o mejoran la afinidad de unión a DSG2, y son capaces de formar multímeros (tales como dímeros) vía el dominio de dimerización (equivalentes funcionales). Por ejemplo, pueden utilizarse estudios de resonancia de plasmón superficial (SPR) usando sensores que contienen DSG2 recombinante inmovilizado para determinar si los polipéptidos recombinantes que se están evaluando se unen a DSG2, combinado con estudios de competición de DSG2.
Como se usa en toda la presente solicitud, el término “polipéptido” se utiliza en su sentido más amplio para referirse a una secuencia de subunidades de aminoácidos. Los polipéptidos de la invención pueden comprender Laminoácidos, D-aminoácidos (que son resistentes a proteasas específicas de L-aminoácidos in vivo), o una
imagen9
imagen10
imagen11
imagen12
y
En otra realización, los polipéptidos recombinantes están en una forma multimérica, tal como un dímero, trímero, etc. En una realización preferida, un multímero comprende un dímero formado por dimerización a través de los dominios 10 de dimerización en cada homotrímero (es decir, un polipéptido es un homotrímero mediante la trimerización del domino de protuberancia). En forma multimérica (tal como un dímero), los polipéptidos recombinantes comprenden multímeros de fibra AdB-2/3, y se pueden utilizar en los diversos métodos de la invención descritos anteriormente. Como comprenderán los expertos en la técnica, tales multímeros pueden comprender multímeros de polipéptidos recombinantes idénticos de la invención, o pueden comprender multímeros de diferentes polipéptidos recombinantes15 de la invención. En una realización, los dominios de dimerización son los mismos en cada polipéptido recombinante que forma parte del multímero. En otra realización, los dominios de dimerización son diferentes en cada polipéptido recombinante que forma parte del multímero. En otra realización, los dominios de eje y/o protuberancia son los
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
mismos en cada polipéptido recombinante que forma parte del multímero. En otra realización, los dominios de eje y/o de protuberancia son diferentes en cada polipéptido recombinante que forma parte del multímero.
La multimerización de fibras AdB-2/3 se puede determinar de acuerdo con los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la multimerización de las construcciones de fibras AdB-2/3 recombinantes se puede evaluar mediante criterios que incluyen sedimentación en gradientes de sacarosa, resistencia a la proteolísis de tripsina, y movilidad electroforética en geles de poliacrilamida (Hong y Engler, Journal of Virology 70:7071-7078 (1996)). Con respecto a la movilidad electroforética, el multímero fibroso es un complejo muy estable y funcionará con un peso molecular consistente con el de un multímero cuando la muestra no se hierva antes del SDS-PAGE. Después de hervir, sin embargo, la estructura multimérica se rompe y la proteína pasa posteriormente a un tamaño consistente con el monómero de proteína.
Los polipéptidos recombinantes, o versiones multiméricas de los mismos, pueden almacenarse en disolución o congelarse.
En otra realización, los polipéptidos recombinantes de la invención se combinan con (tal como conjugado con) uno o más agentes terapéuticos para un trastorno asociado con el tejido epitelial. Tales conjugados se pueden utilizar, por ejemplo, en los métodos terapéuticos de la invención. Los métodos para conjugar los polipéptidos de la invención con un agente terapéutico de interés, tales como por unión covalente o reticulación química, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Cualquier agente terapéutico adecuado se puede utilizar para formar un conjugado de acuerdo con esta realización de la invención, incluyendo pero no limitado a compuestos degradantes de estroma tumoral (tal como relaxina), agentes alquilantes, inhibidores de angiogénesis, anticuerpos, antimetabolitos, antimitóticos, antiproliferativos, inhibidores de aurora quinasa, inhibidores de promotores de apoptosis (por ejemplo, Bc1-xL, Bc1-w y Bfl-1), activadores de la vía del receptor de la muerte, inhibidores Bcr-Ab1 quinasa, anticuerpos BiTE(Bi-Specific Tcell Engager), modificadores de la respuesta biológica, inhibidores de quinasa dependiente de ciclina, inhibidores del ciclo celular, inhibidores de ciclooxigenasa 2, inhibidores del factor del crecimiento, inhibidores de la proteína de choque térmico (HSP)-90, agentes de desmetilación, inhibidores de histona desacetilasa (HDAC), terapias hormonales, inmunológicas, inhibidores de proteínas de apoptosis (IAPs) que intercalan antibióticos, inhibidores de quinasa, objetivos mamíferos de los inhibidores de rapamicina, inhibidores de la quinasa regulada por señal extracelular activada por mitógenos de microRNA, proteínas de unión multivalentes, fármacos anti inflamatorios no esteroideos (NSAIDs), inhibidores de poli ADP (adenosina difosfato)-ribosa polimerasa (PARP), agentes quimioterapéuticos de platino, inhibidores de quinasa de tipo polo (plk), inhibidores de proteasoma, análogos de purina, análogos de pirimidina, inhibidores del receptor de tirosina quinasa, alcaloides de plantas retinoides/deltoides, ácidos nucleicos inhibidores pequeños (siRNAs), inhibidores de topoisomerasa y similares.
Ejemplos de agentes terapéuticos que entran dentro de estas diversas clases incluyen, pero no se limitan a: docetaxel, doxorubicina, irinotecan, paclitaxel (Taxol®), partículas ligadas a la albumina del paclitaxel (Abraxane®), doxorubicina HCl liposoma (Doxil®), anticuerpos BITE tales como adecatumumab (Micromet MT201), blinatumomab (Micromet MT103) y similares, agentes terapéuticos basados en siRNA, agentes alquilantes que incluyen altretamina, AMD-473, AP-5280, apaziquona, bendamustina, brostalicina, busulfan, carboquone, carmustina (BCNU), clorambucil, CLORETAZINE® (laromustina, VNP 40101M), ciclofosfamida, dacarbacina, decitabina, 5’azacitidina, estramustina, fotemustina, glufosfamida, ifosfamida, KW-2170, lomustina (CCNU), mafosfamida, melfalan, mitobronitol, mitolactol, nimustina, N-óxido de mostaza de nitrógeno, ranimustina, temozolomida, tiotepa, TREANDA® (bendamustina), treosulfan, rofosfamida y similares; inhibidores de angiogénesis que incluyen inhibidores del receptor específico endotelial de tirosina quinasa (Tie-2), inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR), inhibidores del receptor del factor de crecimiento de la insulina 2 (IGFR-2), inhibidores de la matriz de la metaloproteinasa 2 (MMP-2), inhibidores de la matriz de la metaloproteinasa-9 (MMP9), inhibidores del receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGFR), análogos de trombospondina, inhibidores del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de la tirosina quinasa (VEGFR) y similares; antimetabolitos que incluyen ALIMTA® (pemetrexed disódico, LY231514, MTA), 5-azacitidina, XELODA® (capecitabina), carmofur, LEUSTAT® (cladribina), clofarabina, citarabina, ocfosfato de citarabina, citosina arabinosida, decitabina, deferoxamina, doxifluridina, eflornitina, EICAR (5-etinil-1-beta-D-ribofuranosilimidazol-4carboxamida), enocitabina, etnilcitidina, fluradabina, 5-fluorouracilo solo o en combinación con leucovorina, GEMZAR® (gemcitabina), hidroxiurea, ALKERAN® (melfalan), mercaptopurina, 6-mercaptopurina ribosida, metotrexato, análogos de metotrexato (tales como trimetrexato y pralatraxato), ácido micofenólico, nelarabina, nolatrexed, ocfosfato, pelitrexol, pentostatina, raltitrexed, ribavirina, triapina, trimetrexato, S-1, tiazofurina, tegafur, TS-1, vidarabina, y similares; inhibidores de la proteína Bcl-2 que incluyen AT-101 ((-)gosipol), GENASENSE® (G3139 u oblimersen (oligonucleótido antisentido dirigido a Bcl-2), IPI-194, IPI-565, N-(4-(4-((4’-cloro(1,1’-bifenil)-2il)metil)piperazin-1-il)benzoílo)-4-(((1R)-3-(dimetilamino)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3nitrobencenosulfonamida) (ABT-737, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetil-1-ciclohex-1-en-1-il)metil)piperazin-1il)benzoílo)-4-(((1R)-3-(morfolin-4-il)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)bencenosulfonamida (ABT-263), GX-070 (obatoclax) y similares; inhibidores de Ber-Abl quinasa incluyen DASATINIB® (BMS-354825), GLEEVEC® (imatinib) y similares; inhibidores CDK que incluyen AZD-5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT2584, flavopiridol, GPC-286199, MCS-5a, PD0332991, PHA-690509, seliciclib (CYC-202, R-roscovitina), ZK-304709 y similares; inhibidores EGFR que incluyen ABX-EGF, inmunoliposomas anti-EGFR, vacuna EGF, EMD-7200, ERBITUX® (cetuximab), HR3, anticuerpos IgA, IRESSA® (gefitinib), TARCEVA® (erlotinib o OSI-774), TP-38, proteína de fusión EGFR, TYKERB® (lapatinib) y similares; inhibidores del receptor ErbB2 incluyen CP-724-714, CI
5
15
25
35
45
55
65
1033 (canertinib), HERCEPTIN® (trastuzumab), TYKERB® (lapatinib) OMNITARG® (2C4, petuzumab), TAK-165, GW-572016 (ionafarnib), GW-282974, EKB-569, PI-166, dHER2 (vacuna HER2), APC-8024 (vacuna HER-2), anticuerpo bisespecífico anti-HER/2neu, B7.her2IgG3, anticuerpos bisespecíficos trifuncionales AS HER2, mAb Ar209, mAb 2B-1 y similares; inhibidores de histona desacetilasa incluyen romidepsin, LAQ-824, MS-275, trapoxina, ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA), TSA, ácido valproico y similares; inhibidores HSP-90 que incluyen 17AAG-nab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17-DMAG, geldanamicina, IPI-504, KOS-953, MYCOGRAB® anticuerpo recombinante humano a HSP-90), NCS-683664, PU24FCI, PU-3, radicicol, SNX-2112, STA-9090, VER49009 y similares; activadores de la vía del receptor de la muerte que incluyen TRAIL, anticuerpos u otros agentes que dirigen a TRAIL o a los receptores de la muerte (por ejemplo, DR4 y DR5) tales como Apomab, conatumumab, ETR2-ST01, GDC0145, (lexatumumab), HGS-1029, LBY-135, PRO-1762 y trastuzumab; agentes quimioterapéuticos de platino incluyen cisplatino, ELOXATIN® (oxaliplatino) eptaplatino, lobaplatino, nedaplatino, PARAPLATIN® (carboplatino), satraplatino, picoplatino y similares; inhibidores VEGFR que incluyen AVASTIN® (bevacizumab), ABT-869, AEE-788, axitinib (AG-13736), AZD-2171, CP-547,632, IM-862, MACUGEN (pegaptamib), NEXAVAR® (sorafenib, BAY43-9006), pazopanib (GW-786034), vatalanib (PTK-787, ZK-222584), SUTENT® (sunitinib, SU-11248), trampa de VEGF, ZACTIMAThi (vandetanib, ZD-6474) y similares; terapia celular dendrítica (sipuleucel-T, Provenge®); inhibidores de topoisomerasa que incluyen aclarubicina, 9-aminocamptotecina, amonafida, amsacrina, becatecarina, belotecan, BN-80915, CAMPTOSAR® (clorhidrato de irinotecan), campotecina, dexrazoxina, diflomotecan, edotecarina, ELLENCE® o PHARMORUBICIN® (epirubicina), etopoxide, exatecan, abraxane, irenotecan, 10-hidroxicamtotecina, gimatecan, lurtotecan, mitoxantrone, oratecina, pirarbucina, pixantrona, rubitecan, sobuzoxano, SN-38, Tafluposide, topotecan y similares; anticuerpos que incluyen AVASTIN® (bevacizumab), anticuerpos específicos de CD40, ehTNT-1/B, denosumab, ERBITUX® (cetuximab), HUMAX-CD4® (zanolimumab), anticuerpos específicos de IGF I R, lintuzumab, PANOREX® (edrecolomab), RENCAREX® (WX G250), RITUXAN® (rituximab), ticilimumab, trastuzimab y similares; terapias hormonales que incluyen ARIMIDEX® (anastrozol), AROMASIN® (exemestano), arzoxifeno, CASODEX® (bicalutamida), CETROTIDE® (cetrorelix), degarelix, deslorelina, DESOPAN® (trilostano), dexametasona, DROGENIL® (flutamida), EVISTA® (raloxifeno), AFEMA® (fadrozol), FARESTON® (toremifeno), FASLODEX® (fulvestrant), FEMARA® (letrozol), formestano, glucocorticoides, HECTOROL® (doxercalciferol), RENAGEL® (carbonato de sevelamer), lasofoxifeno, acetato de leuprolida, MEGACE® (megestrol), MIFEPREX® (mifepristona), NILANDRON® (nilutamida), NOLVADEX® (citrato de tamoxifeno), PLENAXIS® (abarelix), prednisona, PROPECIA® (finasteride), rilostano, SUPREFACT® (buserelin), TRELSTAR® (hormonas liberadoras de hormonas luteinizantes (LHRH)), VANTAS® (implante de histrelina), VETORYL® (trilostano o modrastano), ZOLADEX® (fosrelina, goserelina) y similares; inmunológicos que incluyen interferón alfa, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón beta, interferón gamma-1a, ACTIMMUNE® (interferón gamma-1b) o interferón gamma-n1, combinaciones de las mismas y similares. Otros agentes incluyen ALFAFERONE® (IFN-alfa), BAM-002 (glutationa oxidada), BEROMUN® (tasonermina), BEXXAR® (tositumomab), CAMPATH® (alemtuzumab), CTLA4 (antígeno 4 del linfocito T citotóxico), decarbacina, denileucina, epratuzumab, GRANOCYTE® (lenograstim), lentinan, interferón alfa de leucocitos, imiquimod, MDX-010 (anti CTLA-4), vacuna de melanoma, mitumomab, molgramostim, MYLOTARG.TM. (gemtuzumab ozogamicina), NEUPOGEN® (filgrastim), Onco VAC-CL, OVAREX® (oregovomab), pemtumomab (Y-muHMFGI), PROVENGE® (sipuleucel-T), sargaramostim, sizofilan, teceleucina, THERACYS® (Bacillus Camette-Guerin), ubenimex, VIRULIZIN® (inmunoterapéutico, Lorus Pharmaceuticals), Z-100 (Sustancia específica de Maruyama (SSM)), WF-10 (Tetraclorodecaóxido (TCDO)), PROLEUKIN® (aldesleucina), ZADAXIN® (timalfasina), ZENAPAX® (daclizumab), ZEVALIN® (90Y-Ibritumomab tiuxetan) y similares; ofatumumab; agentes modificadores de la respuesta biológica que incluyen krestina, lentinan, sizofurano, picibanil PF-3512676 (CpG-8954), ubenimex y similares; análogos de pirimidina incluyen citarabina (ara C o Arabinósido C), citoxina arabinósido, doxifluridina, FLUDARA® (fludarabina), 5-FU (5-fluorouracilo), floxuridina, GEMZAR® (gemcitabina), TOMUDEX® (ratitrexed), TROXATYL® (triacetiluridina troxacitabina) y similares; análogos de purina que incluyen LANVIS® (tioguanina) y PURI-NETHOL® (mercaptopurina); agentes antimitóticos que incluyen batabulina, epotilona D (KOS-862), N-(2-((4hidroxifenil)amino)piridin-3-il)-4-metoxibencenosulfonamida, ixabepilona (BMS 247550), paclitaxel, TAXOTERE® (docetaxel), PNU100940 (109881), patupilona, XRP-9881 (larotaxel), vinflunina, ZK-EPO (eptilona sintética) y similares; y otros agentes quimioterapéuticos tales como ABRAXANE® (ABI-007), ABT-100 (inhibidor de farnesil transferasa), ADVEXIN® (vacuna Ad5CMV-p53), ALTOCOR® o MEVACOR® (lovastatina), AMPLIGE® (poli I, poli C12U, un RNA sintético), APTOSYN® (exisulind), AREDIA® (ácido pamidrónico), arglabina, L-asparaginasa, atamestano (1-metil-3,17-diona-androsta-1,4-dieno), AVAGE® (tazaroteno), AVE-8062 (derivado de combreastatina), BEC2 (mitumomab), cachectina o cachesina (factor de necrosis tumoral), canvaxina (vacuna), CEAVAC® (vacuna contra el cáncer), CELEUK® (celmoleucina), CEPLENE® (diclorhidrato de histamina), CERVARIX® (vacuna del papilomavirus humano), CHOP® (C; CYTOXAN®) (ciclofosfamida); H: ADRIAMYCIN® (hidroxidoxorubicina): O: Vincristina (ONCOVIN®); P: prednisona, CYPAT® (acetato de ciproterona), combrestatina A4P, DAB(389)EGF (dominios catalíticos y de translocación de la toxina diftérica fusionada mediante un ligador His-Ala al factor de crecimiento epidérmico humano) o TransMID-107R® (toxinas diftéricas), dacarbacina, dactinomicina, ácido 5,6-dimetilxantenona-4-acético (DMXAA), eniluracilo, EVIZON.TM. (lactato de escualamina), DIMERICINE® (loción de liposomas T4N5), discodermolida, DX-8951f (mesilato de extecan), enzastaurina, EPO906 (epitilona B), GARDASIL® (vacuna recombinante cuadrivalente del papilomavirus humano (Tipos 6, 11, 16, 18)), GASTRIMMUNE®, GENASENSE®, GMK (vacuna conjugada con gangliósidos), GVAX® (vacuna contra el cáncer de próstata), halofuginona, histerelina, hidroxicarbamida, ácido ibandrónico, IGN-101, IL-13-PE38, IL-13-PE38QQR (cintredekina besudotox), IL-13-pseudomonas exotoxina, interferón-.alfa., interferón-.gamma., JUNOVAN® o MEPACT® (mifamurtida), lonafarnib, 5,10-metilentetrahidrofolato, miltefosina (hexadecilfosfocolina), NEOVASTAT®
5
10
15
20
25
30
(AE-941), NEUTREXIN® (trimetrexato glucuronato), NIPENT® (pentostatina), ONCONASE® (una enzima ribonucleasa), ONCOPHAGE® (tratamiento con vacuna de melanoma), ONCOVAX® (vacuna IL-2), ORATHECIN® (rubitecan), OSIDEM® (fármaco celular basado en anticuerpos), OVAREX® MAb (anticuerpo monoclonal murino), paclitaxel, PANDIMEX® (saponinas de aglicona de ginseng que comprenden 20(S)protopanaxadiol (aPPD) y 20(S)protopanaxatriol (aPPT), panitumumab, PANVAC®-VF (vacuna de investigación contra el cáncer), pegaspargasa, PEG interferón A, fenoxodiol, procarbacina, rebimstat, REMOVAB® (catumaxomab), REVLIMID® (lenalidomida), RSR13 (efaproxiral), SOMATULINE®LA (lanreotida), SORIATANE® (acitretina), estaurosporina (Estreptomices estaurosporas), talabostat (PT100), TARGRETIN® (bexaroteno), TAXOPREXIN® (DHA-paclitaxel), TELCYTA® (canfosfamida, TLK-286), temilifeno, TEMODAR® (temozolomida), tesmilifeno, talidomida, THERATOPE® (STn-KLH), timitaq (diclorhidrato de (2-amino-3,4-dihidro-6-metil-4-oxo-5-(4-piridiltio)quinazolina), TNFERADE® (adenovector: portador de DNA que contiene el gen para el factor.-alfa. de la necrosis tumoral), TRACLEER® o ZAVESCA® (bosentan), tretinoina (Retina-A), tetrandrina, TRISENOX® (trióxido de arsénico), VIRULIZIN®, ukraina (derivado de alcaloides de la planta de celandina mayor), vitaxina (anticuerpo anti-alfavbeta3), XCYTRIN® (motexafina gadolinio), XINLAY® (atrasentan), XYOTAX® (paclitaxel poliglumex), YONDELIS® (trabectedina), ZD-6126, ZINECARD® (dexrazoxano), ZOMETA® (ácido zolendrónico), crizotinib, zorubicina y similares.
En otra realización preferida, el agente terapéutico comprende un compuesto que se une a la desmogleina-2; preferiblemente un compuesto que se une a DSG2 y abre las uniones estrechas.
En otras realizaciones, el agente terapéutico comprende partículas radiactivas/terapia de radiación. Cualquier terapia
o partícula radiactiva adecuada se puede utilizar según se considere apropiado por un médico asistente, incluyendo pero sin estar limitado a cobalto-60, yodo-131, iridio-192, estroncio-89, samario 153, renio-186 y plomo-212.
En una realización preferida, el agente terapéutico es un agente terapéutico anti tumoral y comprende un agente quimioterapéutico o anticuerpo monoclonal anti tumoral como se describe aquí. En una realización preferida adicional, el agente terapéutico anti tumoral comprende un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en trastuzumab, cetumiximab, petuzumab, apomab, conatumumab, lexatumumab, bevacizumab, bevacizumad, denosumab, zanolimumab, lintuzumab, edrecolomab, rituximab, ticilimumab, tositumomab, alemtuzumab, epratuzumab, mitumomab, gemtuzumab ozogamicina, oregovomab, pemtumomab daclizumab, panitumumab, catumaxomab, ofatumumab, y ibritumomab. Ejemplos no limitantes de mAb anti tumoral útiles y sus usos específicos se listan en la Tabla 1, y se describen adicionalmente en Campoli, M. y colaboradores, Principles & Practice of Oncology 23(1&2):1-19 (2009).
Tabla 1: mAbs específicos de antígeno tumoral para el tratamiento del cáncer
Anticuerpo
Isotipo Diana Indicación de la enfermedad
SGN-75
IgG1 Humanizado CD70 Tumores sólidos, incluyendo cáncer de células renales, CD70 + tumores malignos hematológicos
Trastuzumab
IgG1 Humanizado HER2/neu Cáncer de mama HER2/neu(+)*
Cetuximab
IgG1 quimérico EGFR Cáncer de colon EGFR(+)*
Panitumumab
IgG2 totalmente humanizado EGFR Cáncer de colon EGFR(+)*
Matuzumab
IgG1 Humanizado EGFR Cáncer de pulmón de células no escamosas no pequeñas (NSCLC), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), cáncer de mama y de páncreas, cáncer de colon (CC)
Pertuzumab
IgG1 Humanizado EGFR NSCLC, HNSCC, CC, cáncer de mama y de ovario
Ipilimumab (MDX-010)
IgG1 Humanizado CTLA-4 NSCLC, RCC, melanoma metastásico
Tremelimumab (CP-675, 206)
IgG1 Humanizado CTLA-4 NSCLC, RCC, melanoma metastásico
Sibrotuzumab
IgG1 Humanizado FAP** NSCLC, CC
imagen13
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
tetrametilrodamime, isotiocianato de tetrametilrodamine (TRITC), riboflavina, ácido rosólico, cumarina-6, y similares, incluyendo combinaciones de los mismos. Estos restos de imágenes fluorescentes pueden obtenerse de una variedad de fuentes comerciales, incluyendo Molecular Probes, Eugene, Oreg. And Research Organics, Cleveland, Ohio, o pueden sintetizarse por los expertos en la técnica.
En otro ejemplo, los agentes de formación de imágenes pueden comprender un agente de formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), mientras que los agentes de diagnóstico pueden comprender un compuesto que es un marcador de diagnóstico para un trastorno epitelial particular unido al agente MRI. Un agente MRI es cualquier resto químico que tiene una señal de resonancia magnética detectable o que puede influir (por ejemplo, aumentar o cambiar) la señal de resonancia magnética de otro agente. Este tipo de agente de formación de imagen puede utilizarse solo o en combinación con otro agente de imagen. En otro ejemplo más, un agente MRI basado en gadolinio puede servir como un agente de formación de imagen. Un ejemplo de agente MRI adecuado que puede incorporarse en los agentes de formación de imágenes descritos es el ácido para-amino-bencil dietilentriaminopentaacético (p-NH2-Bz-DTPA, Compuesto 7), una forma conjugable del ácido dietilentriaminopentaacetico (DTPA), que es conocido por su fuerte adhesión al gadolinio y está aprobado para su uso clínico como un agente de contraste de resonancia magnética. La incorporación de un agente de MRI en una macromolécula grande tal como un sustrato dendrimérico como se describe aquí puede permitir una relajación de T1 grande (alto contraste) y múltiples copias de un agente en una sola molécula, lo que puede aumentar la señal. Por combinación de una agente de formación de imagen MRI y, por ejemplo, un agente de formación de imagen fluorescente, el agente resultante se puede detectar, visualizar y seguir en tiempo real mediante MRI. Otros agentes de formación de imágenes incluyen agentes PET que pueden prepararse incorporando un 18F o un quelante para 64Cu o 68Ga. También, la adición de un radionúclido puede utilizarse para facilitar la formación de imágenes SPECT o la administración de una dosis de radiación, mientras los agentes de diagnóstico pueden comprender un compuesto que es un marcador de diagnóstico para un trastorno epitelial particular unido al agente PET.
En algunas realizaciones, el agente de diagnóstico es un agente de formación de imagen de diagnóstico, incluyendo pero no limitado a agentes de tomografía de emisión de posición (PET), agentes de tomografía computarizada (CT), agentes de formación de imagen por resonancia magnética (MRI), agentes de formación de imagen magnética nuclear (NMI), agentes de fluoroscopía y agentes de contraste de ultrasonido. Tales agentes de diagnóstico incluyen radioisótopos de dichos elementos como yodo (I), incluyendo 123I, 125I, 131I, etc., Bario (Ba), gadolinio (Gd), Tecnecio (Tc), incluyendo 99Tc, fósforo (P), incluyendo 31P, hierro (fe), manganeso (Mn), talio (Tl), cromo (Cr), incluyendo 51Cr, carbono (C), incluyendo 14C, o similares, compuestos marcados fluorescentemente, o sus complejos, quelatos, aductos y conjugados. Cualquier agente PET adecuado puede utilizarse, incluyendo pero no limitado a carbono-11, nitrógeno-13, oxígeno-15, fluor-18, 11C-metomidato, y análogos de glucosa de los mismos, incluyendo pero no limitado a fludeoxiglucosa (un análogo de glucosa marcado con fluor-18).
En otras realizaciones, el agente de diagnóstico es un gen marcador que codifica proteínas que son fácilmente detectables cuando se expresan en una célula (incluyendo, pero no limitado a, betagalactosidasa, proteína fluorescente verde, luciferasa, y similares) y sondas de ácidos nucleicos marcados (por ejemplo, sondas radiomarcadas o marcadas fluorescentemente). En algunas realizaciones, la conjugación covalente de agentes de diagnóstico y de formación de imágenes a los multímeros de AdB-2/3 proporcionados aquí se consigue de acuerdo con una variedad de procesos de conjugación. En otras realizaciones el agente de diagnóstico no está asociado covalentemente con los multímeros de AdB-2/3 proporcionados.
En otro aspecto, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican el polipéptido o cualquier realización de la invención. Los ácidos nucleicos pueden comprender RNA o DNA, y pueden prepararse y aislarse utilizando técnicas de biología molecular estándar, basándose en las enseñanzas de aquí. Los ácidos nucleicos pueden comprender dominios adicionales útiles para promover la expresión y/o purificación de la proteína codificada, incluyendo pero no limitado a secuencias poliA, secuencias Kozak modificadas, y secuencias que codifican etiquetas de epítopo, señales de exportación, y señales secretoras, señales de localización nuclear, y señales de localización de membranas plásmáticas.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden el ácido nucleico de cualquier aspecto de la invención operativamente unido a un promotor. El “vector de expresión recombinante” incluye vectores que unen operativamente una región o gen codificante de ácido nucleico a cualquier promotor capaz de efectuar la expresión del producto génico. La secuencia del promotor utilizada para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos descritos en un sistema de mamífero puede ser constitutiva (dirigida por cualquiera de una variedad de promotores, incluyendo pero no limitado a, CMV, SV40, RSV, actina, EF) o inducible (dirigida por cualquiera de un número de promotores inducibles incluyendo, pero no limitada a, tetraciclina, ecdisona, sensible a los esteroides). La construcción de los vectores de expresión para su uso en la transfección de células procarióticas es también bien conocida en la técnica, y por lo tanto puede realizarse mediante técnicas estándar. (Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch, y Maniatis, en: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratry Press, 1989; Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press, Inc., Clifton, N.J.), y el catálog Ambion 1998 (Ambion, Austin, TX). El vector de expresión puede ser replicable en los organismos huésped o como un episoma o por integración en el DNA cromosómico del huésped, y puede comprender cualquier otro componente que se considere apropiado para un uso dado, incluyendo pero no limitado a marcadores de selección tales como un gen de resistencia a antibióticos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona células huésped que comprenden los vectores de expresión recombinantes descritos aquí, y descendientes de los mismos, en donde las células huésped pueden ser procarióticas o eucarióticas, Las células pueden estar transitoriamente o establemente transfectadas. Dicha transfección de los vectores de expresión en células procarióticas o eucarióticas puede llevarse a cabo mediante cualquier técnica conocida en la técnica, incluyendo pero no limitado a transformaciones bacterianas estándar, coprecipitación de fosfato cálcico, electroporación, o mediado por liposoma, mediado por dextran DEAD, mediado policatiónico, o transfección mediada por virus. (Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Culture of Animal Cells: A Manual of basic Technique, 2nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY). Las técnicas que utilizan células cultivadas transfectadas con vectores de expresión para producir cantidades de polipéptidos son bien conocidas en la técnica.
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas, que comprenden
un multímero de fibra AdB-2/3 de la presente invención; y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El multímero de fibra AdB-2/3 puede ser cualquier multímero tal como se describe aquí de acuerdo con cualquier aspecto, realización, o combinación de realizaciones de la invención que incorpora un polipéptido de dominio de protuberancia mutante de cualquier realización del primer aspecto de la invención (es decir, SEC ID NO: 1-11).
La composición farmacéutica puede además comprender uno o más agentes terapéuticos para tratar un trastorno asociado al tejido epitelial, incluyendo pero no limitado a aquellos descritos anteriormente. En una realización preferida, el agente terapéutico es un agente terapéutico anti tumoral y comprende un agente quimioterapéutico o un anticuerpo monoclonal anti tumoral como se describe aquí. En una realización preferida adicional, el agente terapéutico anti tumoral comprende un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en trastuzumab, cetumiximab, petuzumab, Apomab, conatumumab, lexatumumab, bevacizumab, bevacizumab, denosumab, zanolimumab, lintuzumab, edrecolomab, rituximab, ticilimumab, tositumomab, alemtuzumab, epratuzumab, mitumomab, gemtuzumab ozogamicina, oregovomab, pemtumomab daclizumab, panitumumab, catumaxomab, ofatumumab, y ibritumomab.
El vehículo farmacéuticamente aceptable es no tóxico, biocompatible y se selecciona de manera que no afecte perjudicialmente a la actividad biológica de los multímeros (y cualquier otro agente terapéutico combinado con los mismos). Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables para péptidos se describen en el documento de Patente U.S. No. 5,211,657 de Yamada. Las composiciones pueden formularse en preparaciones en formas sólida, semi-sólida, gel, líquido o gaseosa tales como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, inhalantes, e inyecciones, que permiten la administración oral, parenteral, o quirúrgica. Vehículos adecuados para administración parenteral mediante inyección, infusión, o irrigación y administración tópica incluyen agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer normales o lactadas, solución de dextrosa, solución de Hank, o propanodiol. Además, pueden emplearse aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este propósito puede emplearse cualquier aceite biocompatible incluyendo mono-o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos, tales como ácido oleico, encuentran uso en la preparación de inyectables. El vehículo y agente pueden estar compuestos como un líquido, suspensión, gel polimerizable o no polimerizable, pasta o pomada. El vehículo puede comprender también un vehículo de suministro para sostener (es decir, extender, retrasar o regular) el suministro del agente (s) o para mejora la administración, absorción, estabilidad, o farmacocinética del agente (s) terapéutico. Dicho vehículo de suministro puede incluir, a modo de ejemplo no limitante, micropartículas, microesferas, nonoesferas, o nanopartículas compuestas de proteínas, liposomas, carbohidratos, compuestos orgánicos sintéticos, compuestos inorgánicos, hidrogeles poliméricos o copoliméricos, y micelas poliméricas. Los sistemas de suministro de hidrogeles y micelas adecuados incluyen los copolímeros PEO:PHB:PEO y complejos copolímero/ciclodextrina descritos en el documento de Publicación Internacional No. WO 2004/009664 A2, y el PEO y complejos PEO/ciclodextrina descritos en el documento de Patente U.S. No. 2002/0019369 A1. Tales hidrogeles se pueden inyectar localmente en el sitio de la acción deseada, o de forma subcutánea o intramuscular para formar un depósito de liberación sostenida.
Para administración intratecal (IT) o intracerebroventricular (ICV), se pueden utilizar sistemas de administración adecuadamente estériles (por ejemplo, liquidos; geles, suspensiones, etc.) para administrar las composiciones. Para administración oral de agentes no peptidérgicos, las composiciones pueden llevar un relleno o diluyente inerte tal como sacarosa, almidón de maíz, o celulosa.
Las composiciones de la presente invención pueden incluir también excipientes biocompatibles, tales como agentes de dispersión o humectantes, agentes de suspensión, diluyentes, tampones, potenciadores de penetración, emulsionantes, aglutinantes, espesantes y agentes aromatizantes (para administración oral). Las formulaciones ejemplares pueden administrarse parenteralmente como dosis inyectables de una solución o suspensión del multímero en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como agua, aceites, solución salina, glicerol, o etanol.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Además, sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponadoras de pH y similares pueden estar presentes en composiciones que comprenden polipéptidos modificados. Componentes adicionales de composiciones farmacéuticas incluyen petróleo (tales como de animal, vegetal, o de origen sintético), por ejemplo, aceite de soja y aceite mineral. En general, glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son vehículos líquidos preferidos para las soluciones inyectables.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse también en forma de inyección de depósito o preparación de implante que se pueden formular de tal manera que permitan una liberación sostenida o pulsátil de los multímeros y otros agentes terapéuticos (si están presentes).
La composición farmacéutica puede comprender además del polipéptido de la invención (a) un lioprotector; (b) un tensoactivo; (c) un agente espesante; (d) un agente de ajuste de la tonicidad; (e) un estabilizante; (f) un conservante y/o (g) un tampón. En algunas realizaciones, el tampón en la composición farmacéutica es un tampón Tris, un tampón histidina, un tampón fosfato, un tampón citrato o un tampón acetato. La composición farmacéutica puede incluir también un lioprotector, por ejemplo, sacarosa, sorbitol o trehalosa. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica incluye un conservante por ejemplo cloruro de benzalconio, bencetonio, clorohexidina, fenol, m-cresol, alcohol bencílico, metilparaben, propilparaben, clorobutanol, o-cresol, p-cresol, clorocresol, nitrato fenilmercúrico, timerosal, ácido benzoico, y varias mezclas de los mismos. En otras realizaciones, la composición farmacéutica incluye un agente espesante, como glicina. En otras realizaciones, la composición farmacéutica incluye un tensoactivo por ejemplo, polisorbato-20, polisorbato-40, polisorbato-60, polisorbato-65, polisorbato-80, polisorbato85, poloxamer-188, monolaurato de sorbitan, monopalmitato de sorbitan, monoestearato de sorbitan, monooleato de sorbitan, trilaurato de sorbitan, triestearato de sorbitan, trioleasto de sorbitan, o combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica puede incluir también un agente de ajuste de la tonicidad, por ejemplo, un compuesto que hace que la formulación sea sustancialmente isotónica o isoosmótica con la sangre humana. Ejemplos de agentes de ajuste de la tonicidad incluyen sacarosa, sorbitol, glicina, metionina, manitol, destrosa, inositol, cloruro de sodio, arginina y clorhidrato de arginina. En otras realizaciones, la composición farmacéutica incluye adicionalmente un estabilizante, por ejemplo, una molécula que, cuando se combina con una proteína de interés previene o reduce sustancialmente la inestabilidad química y/o física de la proteína de interés en forma liofilizada o líquida. Estabilizantes ejemplares incluyen sacarosa, sorbitol, glicina, inositol, cloruro de sodio, metionina, arginina, y clorhidrato de arginina.
La composición farmacéutica puede envasarse en cualquier manera adecuada. En una realización, la composición farmacéutica se envasa como un kit que contiene un recipiente (tal como un vial) del multímero de fibra AdB-2/3. En una realización preferida, el kit comprende además, en el mismo recipiente o un recipiente separado (tal como un vial), un agente terapéutico, un agente de diagnóstico, o un agente de formación de imagen para administrar a un sujeto, junto con el multímero de fibra AdB-2/3.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona kits que comprenden (a) uno o más polipéptidos recombinantes/múltimeros de fibra AdB-2/3, ácidos nucleicos aislados, vectores de expresión recombinantes, y/o células huésped de la invención; y (b) instrucciones para su/sus usos para tratar un trastorno asociado con el tejido epitelial. Los kits pueden comprender además un agente terapéutico para utilizar en los métodos de la presente invención.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para mejorar el tratamiento terapéutico, o el diagnóstico de un trastorno asociado con el tejido epitelial, y/o formación de imágenes de tejidos epiteliales, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite:
una cantidad de uno o más agentes terapéuticos suficiente para tratar el trastorno, de diagnóstico suficiente para diagnosticar el trastorno, y/o agente de formación de imágenes suficiente para formar imágenes del tejido epitelial; y
una cantidad del multímero de fibra AdB-2/3 de la invención, o una composición farmacéutica de la invención, suficiente para mejorar la eficacia de uno o más agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico, y/o agentes de formación de imágenes.
Los métodos de este aspecto de la invención se pueden utilizar para mejorar el tratamiento terapéutico, el diagnóstico, o la formación de imágenes de un trastorno asociado con el tejido epitelial mejorando el acceso para el agente terapéutico, de diagnóstico, y/o de formación de imagen a su diana y diseminación en el tejido epitelial. Aunque no están limitados por ningún mecanismo, los inventores creen que esto ocurre a través mecanismos complementarios: movimiento del receptor de la diana desde la superficie celular basolateral a la apical permitiendo así un mejor acceso a del tejido epitelial diana por los agentes terapéuticos, de diagnóstico, y/o de formación de imágenes que se dirigen al receptor, (tales como anticuerpos monoclonales), y una mejor penetración del agente terapéutico mediante la ruptura de las uniones intercelulares. DSG2 es el principal receptor de alta afinidad para AdB-2/3. DSG2 es una glicoproteína de transmembrana de unión al calcio perteneciente a la familia de proteínas de cadherina. En células epiteliales, DSG2 es un componente de la estructura de adhesión célula-célula. Su cola citoplásmática interacciona con una serie de proteínas que están en contacto directo con los reguladores de la adhesión celular y las uniones intercelulares/morfología celular. Se ha demostrado que DSG2 está sobreexpresado
imagen14
imagen15
5
15
25
35
45
55
65
(ABT-263), GX-070 (obatoclax) y similares; inhibidores de quinasa Bcr-Abl incluyen DASATINIB® (BMS-354825), GLEEVEC® (imatinib) y similares; inhibidores de CDK incluyendo AZD-5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT2584, flavopiridol, GPC-286199, MCS-5A, PD-0332991, PHA-690509, seliciclib (CYC-202, R-roscovitina), ZK304709 y similares; inhibidores de EGFR incluyendo ABX-EGF, inmunoliposomas anti-EGFR, vacuna EGF, EMD7200, ERBITUX® (cetuximab), HR3, anticuerpos IgA, IRESSA® (gefitinib), TARCEVA® (erlotinib o OSI-774), TP-38, proteína de fusión EGFR, TYKERB® (lapatinib) y similares; inhibidores del receptor ErbB2 incluyen CP-724-714, CI1033 (canertinib), HERCEPTIN® (trastuzumab), TYKERB® (lapatinib), OMNITARG® (2C4, petuzumab), TAK-165, GW-572016 (ionafarnib), GW-282974, EKB-569, PI-166, dHER2 (vacuna HER2), APC-8024 (vacuna HER-2), anticuerpo bisespecífico anti-HER/2neu, B7.her2IgG3, anticuerpos bisespecífico trifuncional AS HER2, mAb AR-209, mAb 2B-1, y similares; inhibidores de histona desacetilasa incluyen romidepsina, LAQ-824, MS-275, trapoxina, ácido suberoilanilida hidroxámico (SAHA), TSA, ácido valproico y similares; inhibidores de HSP-90 incluyendo 17-AAGnab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17-DMAG, geldanamicina, IPI-504, KOS-953, MYCOGRAB® (anticuerpo humano recombinante a HSP-90), NCS-683664, PU24FC1, PU-3, radicicol, SNX-2112, STA-9090 VER49009 y similares; activadores de la vía del receptor de la muerte incluyendo TRAIL, anticuerpos y otros agentes que se dirigen a TRAIL o receptores de la muerte (por ejemplo, DR4 y DR5) tales como Apomab, conatumumab, ETR2-ST01, GDC0145, (lexatumumab), HGS-1029, LBY-135, PRO-1762 y trastuzumab; agentes quimioterapéuticos de platino incluyen cisplatino, ELOXATIN® (oxaliplatino) eptaplatino, lobaplatino, nedaplatino, PARAPLATIN® (carboplatino), satraplatino, picoplatino y similares; inhibidores de VEGFR incluyendo AVASTIN® (bevacizumab), ABT-869, AEE-788, axitinib (AG-13736), AZD-2171, CP-547,632, IM-862, MACUGEN (pegaptamib), NEXAVAR® (sorafenib, BAY43-9006), pazopanib (GW-786034), vatalanib (PTK-787, ZK-222584), SUTENT® (sunitinib, SU-11248), trampa de VEGF, ZACTIMAThi (vandetanib, ZD-6474) y similares; terapia celular dendrítica (sipulecel-T, Provenge®); inhibidores de topoisomerasa incluyendo aclarubicina, 9-aminocamptotecina, amonafide, amsacrina, becatecarina, belotecan, BN-80915, CAMPTOSAR® (clorhidrato de irinotecan), captotecina, dexrazoxina, diflomotecan, edotecarina, ELLENCE® o PHARMORUBICIN® (epirubicina), etoposide, exatecan, abraxane, irenotecan, 10-hidroxicamptotecina, gimatecan, lurtotecan, mitoxantrona, oratecina, pirarbucina, pixantrona, rubitecan, sobuzoxane, SN-38, tafluposida, topotecan y similares; anticuerpos incluyendo AVASTIN® (bevacizumab), anticuerpos específicos de CD40, chTNT-1/B, denosumab, ERBITUX® (cetuximab), HUMAX-CD4® (zanolimumab), anticuerpos específicos de IGF I R, lintuzumab, PANOREX® (edrecolomab), RENCAREX® (WX G250), RITUXAN (rituximab), ticilimumab, Trastuzimab y similares; terapia hormonal incluyendo ARIMIDEX® (anastrazol), AROMASIN® (exemestano), arzoxifeno, CASODEX® (bicalutamida), CETROTIDE® (cetrorelix), degarelix, deslorelina, DESOPAN® (trilostano), dexametasona, DROGENIL® (flutamida), EVISTA® (raloxifeno), AFEMA® (fadrozol), FARESTON® (toremifeno), FASLODEX® (fulvestrant), FEMARA® (letrozol), formestano, glucocorticoides, HECTOROL® (doxercalciferol), RENAGEL® (carbonato de sevelamer), lasofoxifeno, acetato de leuprolida, MEGACE® (megesterol), MIFEPREX® (mifepristona), NILANDRON® (nilutamida), NOLVADEX® (citrato de tamoxifeno), PLENAXIS® (abarelix), prednisona, PROPECIA® (finasterida), rilostano, SUPREFACT® (buserelina), TRELSTAR® (hormonas liberadoras de hormonas luteinizantes (LHRH)), VANTAS® (implante de histrelina), VETORYL® (trilostano o modrastano), ZOLADEX® (fosrelina, goserelina) y similares; inmunológicos incluyendo interferón alfa, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón beta, interferón gamma-1a, ACTIMMUNE® (interferón gamma-1b) o interferón gamma-n1, combinaciones de los mismos y similares. Otros agentes incluyen ALFAFERONE® (1FN-alfa), BAM-002 (glutationa oxidada), BEROMUN® (tasonermina), BEXXAR® (tositumomab), CAMPATH® (alemtuzumab), CTLA4 (antígeno linfocítico citotóxico 4), decarbazina, denileucina, epratuzumab, GRANOCYTE® (lenograstim), lentinan, interferón alfa de leucocitos, imiquimod, MDX-010 (anti-CTLA-4), vacuna de melanoma, mitumomab, molgramostim, MYLOTARG.TM. (gemtuzumab ozogamicina), NEUPOGEN® (filgrastim), Onco VAC-CL, OVAREX® (oregovomab), pemtumomab (Y-muHMFG1), PROVENGE® (sipileucel-T), sargaramostim, sizofilan, teceleucina, THERACYS® (Bacillus Calmette-Guerin), ubenimex, VIRULIZIN® (agente inmunoterapéutico, Lorus Pharmaceuticals), Z-100 (Sustancia específica de Maruyama (SSM)), WF-10 (detraclorodecaoxido (TCDO)), PROLEUKIN® (aldesleucina), ZADAXIN® (timalfasin), ZENAPAX® (daclizumab), ZEVALIN®. (90Y-Ibritumomab tiuxetan) y similares; ofatumumab; agentes modificadores de respuesta biológica incluyendo krestina, lentinan, sizofurano, picibanil PF-3512676 (CpG-8954), ubenimex y similares; análogos de pirimidina incluyen citarabina (ara C o Arabinosido C), citosina arabinosido, doxifluridina, FLUDARA® (fludarabina), 5-FU (5-fluorouracilo), floxuridina, GEMZAR® (gemcitabina), TOMUDEX® (ratitrexed), TROXATYL® (triacetiluridina troxacitabina) y similares; análogos de purina incluyendo LANVIS® (tioguanina) y PURI-NETHOL® (mercaptopurina); agentes antimitóticos incluyendo batabulina, epotilona D (KOS-862), N-(2-((4hidroxifenil)amino)piridin-3-il)-4-metoxibencenosulfonamida, ixabepilona (BMS 247550), paclitaxel, TAXOTERE® (docetaxel), PNU100940 (109881), patupilona, XRP-9881 (larotaxel), vinflunina, ZK-EPO (epotilona sintética) y similares; y otros agentes quimioterapéuticos tales como ABRAXANE® (ABI-007), ABT-100 (inhibidor de farnesil tranferasa), ADVEXIN® (vacuna Ad5CMV-p53), ALTOCOR® o MEVACOR® (lovastatina), AMPLIGE®. (poli I:poli C12U, un RNA sintético), APTOSYN® (exisulind), AREDIA® (ácido pamidrónico), arglabina, L-asparaginasa, atamestrane (1-metil-3,17-diona-androsta-1,4-dieno), AVAGE® (tazaroteno), AVE-8062 (derivado de combreastatina) BEC2 (mitumomab), cachectina o cachexina (factor de necrosis tumoral), canvaxina (vacuna), CEAVAC® (vacuna contra el cáncer), CELEUK® (celmoleucina), CEPLENE® (diclorhidrato de histamina), CERVARIX® (vacuna contra el papilovirus humano), CHOP® (C: CYTOXAN® (ciclofosfamida); H: ADRIAMYCIN® (hidroxidoxorubicina); O: Vincristina (ONCOVIN®); P: prednisona), CYPAT® (acetato de ciporterona), combrestatina A4P, DAB(389)EGF (dominios catalíticos y de translocación de la toxina difteria fusionada mediante un ligador His-Ala al factor de crecimiento epidérmico humano) o TransMID-107R® (toxinas diftéricas), dacarbazina, dactinomicina, ácido 5,6-dimetilxantenona-4-acético (DMXAA), eniluracilo, EVIZON.TM. (lactato de escualamina), DIMERICINE®
imagen16
imagen17
imagen18
imagen19
imagen20
5
15
25
35
45
55
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar un trastorno asociado con el tejido epitelial, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad de un multímero de fibra AdB-2/3 de la invención suficiente para tratar el trastorno. En esta realización, no se suministra ningún otro agente terapéutico. En realizaciones no limitantes, la monoterapia se utiliza para tratar un trastorno seleccionado del grupo que consiste en una infección virial AdB-2/3, un tumor sólido, o un trastorno que se puede tratar utilizando un vector génico de suministro basado en AdB-2/3. Por ejemplo, en el tratamiento de tumores sólidos, el método comprende mejorar el acceso de células del sistema inmune al sitio del trastorno, tal como por penetración (tal como penetración intratumoral de células asesinas naturales preexistentes, células T o células dendríticas). El método puede utilizarse también para tratar cualquiera de los trastornos asociados con las células epiteliales discutidas anteriormente que pueden beneficiarse del mejor acceso de células del sistema inmune a las células epiteliales diana. En una realización preferida, el trastorno es un tumor sólido, y el método comprende mejorar el ataque del sistema inmune del tumor. El método puede utilizarse con cualquiera de los tumores sólidos discutidos anteriormente. Todas las realizaciones y combinaciones de realizaciones del primer aspecto de la invención pueden utilizarse también en este segundo aspecto, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Ejemplos de multímeros que comprenden uno o más multímeros de fibra AdB-2/3 de la invención que pueden utilizarse en estos métodos incluyen, pero no se limitan a, viriones AdB-2/3, cápsides AdB-2/3, partículas dodecaédricas AdB-2/3 (PtDd) (partículas dodecaédricas subvirales producidas por AdB-2/3 durante su replicación), y multímeros de fibra AdB-2/3 recombinantes.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar compuestos candidato para uno o más de los tratamientos de un trastorno asociado con el tejido epitelial, mejorar el suministro de una sustancia al tejido epitelial, mejorar la administración de una sustancia al tejido que expresa DSG2, inducir un EMT en un tejido, y/o tratar una infección AdB-2/3 que comprende (a) poner en contacto un multímero de fibra AdB-2/3 de la invención con DSG2 bajo condiciones para promover la unión del multímero a DSG2, en donde el contacto se lleva a cabo en presencia de uno o más compuestos de ensayo; y (b) identificar compuestos de ensayo positivo que compitan con el multímero de fibra AdB-2/3 para la unión a DSG2 comparado con el control; en donde los compuestos de ensayo positivo son compuestos candidatos para uno o más de los tratamientos de un trastorno asociado con el tejido epitelial, mejorando la administración de una sustancia a un tejido epitelial, para mejorar el suministro de una sustancia que expresa DSG2, inducir un EMT en un tejido, y/o tratar una infección AdB-2/3.
Los compuestos de ensayo positivo que compiten con el multímero de fibra AdB-2/3 para la unión a DSG2 son compuestos candidato para abrir transitoriamente las uniones intracelulares mediante su interacción con DSG2. Los ensayos de seguimiento para verificar la capacidad de los compuestos para abrir transitoriamente las uniones intracelulares mediante su interacción con DSG2 se puede llevar a cabo por cualquier método adecuado, incluyendo pero no limitado a los estudios descritos en los siguientes ejemplos. Los compuestos así identificados para tratar un trastorno asociado con el tejido epitelial, mejorar el suministro de una sustancia al tejido epitelial, mejorar el suministro de una sustancia que expresa DSG2, o inducir un EMT en un tejido, pueden utilizarse como sustitutos para el multímero de AdB-2/3 en cualquiera de los métodos de la presente invención. Además, los AdB-2/3 representan patógenos humanos importantes que causan infecciones del tracto respiratorio (algunas severas) y fiebre faringoconjuntival. Por lo tanto los compuestos que pueden tratar infección por AdB-2/3 serían útiles. Como se describe aquí, DSG2 como receptor primario de alta afinidad utilizado por AdB-2/3, y por lo tanto los compuestos que pueden disminuir la unión de AdB-2/3 a DSG2 son compuestos candidatos para tratar o limitar el desarrollo de la infección AdB-2/3.
Ejemplos de multímeros que comprenden uno o más multímeros de fibra AdB-2/3 de la invención que se pueden utilizar en estos métodos incluyen, pero no se limitan a viriones AdB-2/3, cápsides AdB-2/3, partículas dodecaédricas AdB-2/3 (PtDd) (partículas dodecaédricas subvirales producidas por AdB-2/3 durante su replicación), y multímeros de fibra AdB-2/3 recombinantes. Se puede utilizar cualquier control adecuado, incluyendo pero no limitado a un multímero AdB-2/3 unido a DSG2 en ausencia de compuestos de ensayo.
En una realización, el DSG comprende DSG2 recombinante. En otra realización, los métodos utilizan células que expresan DSG2 (endógena o recombinantemente) en la superficie celular.
En una realización no limitante, pueden utilizarse estudios de resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando sensores que contienen DSG2 recombinante inmovilizado para identificar compuestos candidato que unen el multímero de fibra AdB-2/3 a DSG2, combinado con estudios de competición DSG2. En otra realización, la identificación comprende estudios de trasducción, en los que la capacidad de los compuestos de ensayo para disminuir la unión se detecta como una disminución en la capacidad de viriones AdB-2/3 funcionales para transducir las células epiteliales que expresan DSG2. En otra realización, el extracto celular que expresa DSG2 se separa electroforéticamente y se transfiere por Western, y el multímero de fibra AdB-2/3 marcado se utiliza como sonda en la trasferencia de Western en presencia de los compuestos de ensayo. En una realización adicional, se puede utilizar ensayos de transferencia de puntos, tales como los descritos en Wang y colaboradores, J. Virology (2007) 81:12785-12792; y Wang y colaboradores, (2008) 82:10567-10579.
Cuando los compuestos de ensayo comprenden secuencias polipeptídicas, tales polipéptidos pueden ser sintetizados químicamente o recombinantemente expresados. La expresión recombinante se puede lograr utilizando métodos estándar en la técnica, como se describió anteriormente. Tales vectores de expresión pueden comprender
imagen21
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
que contiene la protuberancia de fibra Ad3 y un dominio que permite la autodimerización de protuberancias de fibra Ad3 trimérico (JO-1) (41). JO-1 puede producirse fácilmente en E. coli y purificarse por cromatografía de afinidad. En cultivos de células epiteliales polarizadas JO-1 desencadenaron la apertura de uniones intercelulares mientras la inyección intravenosa de JO-1 en ratones con tumores epiteliales permitió una mejor penetración de los fármacos anticancerosos (5,6).
El primer objetivo del presente estudio fue el de delinear más las características estructurales de la interacción protuberancia de fibra Ad3-DSG2. Esto incluye identificar los restos de aminoácidos dentro de la protuberancia de fibra Ad3 que están involucrados en la unión a DSG2 y crear mutantes JO-1 con unión reducida y escindida a DSG2. El segundo objetivo de este estudio, que tiene relevancia translacional, fue mejorar aún más el JO-1 mejorando su afinidad a DSG2 aumentando así su efecto terapéutico. Esto se hizo mediante la identificación de mutantes con un aumento de la unión a DSG2.
Ambos objetivos se lograron utilizando la genoteca de expresión de E.coli de los mutantes de protuberancia de fibra Ad3. Hemos identificado restos en tres agrupaciones diferentes dentro de la protuberancia de fibra Ad3 que están críticamente involucradoas en la unión a DSG2. Todos los restos están localizados dentro de una ranura en la terminación distal de la protuberancia de fibra frente al receptor. Después se evaluó el efecto de estas mutaciones sobre la capacidad de la protuberancia de fibra para abrir las uniones epiteliales mediante la medición de la resistencia eléctrica transepitelial en células epiteliales polarizadas in vitro, y la capacidad para mejorar la eficacia de un fármaco de quimioterapia en ratones con tumores de xenoinjertos epiteliales. Como era de esperar, cuando las mutaciones con afinidad reducida para DSG2 se introdujeron en JO-1, las proteínas resultantes fueron menos capaces de abrir las uniones epiteliales. Por otro lado, un número de mutaciones que incrementaban la afinidad de JO-1 a DSG2 mostraron una actividad más fuerte en la apertura de las uniones epiteliales. En general, estos estudios indican una correlación entre la afinidad de las protuberancias de fibra Ad3 a DSG2 y los efectos posteriores sobre las uniones epiteliales.
El tercer objetivo de este estudio fue delimitar la interacción de los restos de protuberancia de fibras con DSG2 de otro serotipo de Ad diana con DSG2; la cepa surgida recientemente Ad14p1 (44), que se considera más patogénica/virulenta que la cepa parental (Ad14-de Wit) (10, 16, 22). La distribución de la hoja beta de Ad14p1 difiere de la de Ad3, lo que podría dar lugar potencialmente a diferencias en el modo de unión a DSG2. Hemos generado por lo tanto una genoteca de expresión de E. coli de los mutantes de la protuberancia de fibra Ad14p1 para identificar los restos de Ad14p1 que interaccionan con DSG2.
Materiales y métodos
Proteínas. La proteína DSG2 recombinante humana fue de Leinco Technoligies, Inc. (St. Louis, MO). La protuberancia de fibra Ad3 se derivó del virus Ad3, cepa GB, obtenida de la ATCC. La protuberancia de fibra Ad14p1 se deriva del virus Ad14p1, cepa Portland 2971/2007, proporcionado por Centro para el Control y Prevención de las Enfermedades (Atlanta, GA) (44). Las protuberancias de fibra se produjeron en E. coli con etiquetas 6-His Nterminales, utilizando el vector de expresión pQE30 (Qiagen, Valencia, CA) y se purificaron por cromatografía de agarosa Ni-NTA como se describe en otra parte (43).
Líneas celulares. Células 293, HeLa y A549 se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estrptomicina (P/S), glutamina (Glu) 2 mM y una solución de aminoácido no esencial 1x MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA). Células T84 de cáncer de colon (ATCC CCL-248) se cultivaron en una mezcla 1:1 de medio F12 de Ham y DMEM, 10% de FBS, Glu y P/S. Las células Ove316 son células tumorales epiteliales positivas Her2/neu derivadas de una biopsia de cáncer de ovario (32). Las células Ove316 se cultivaron en MEGM (Lonza, Mapleton, IL), que contiene 3 µg/L de hEGF, 5 µg/L de insulina, 5 mg/L de hidrocortisona, 26 mg/L de extracto de pituitaria bovina, 25 mg/L de anfotericina B (Lonza), suplementado con 1% de FBS, 100 I.U. de penicilina, 100 µg/L de estreptomicina, 10 mg/L de ciprofloxacino. Células MDA-MB-231, línea celular triple negativa del cáncer de mama (ATCC-HTB-26) se cultivaron en medio L-15 de Leibovitz suplementado con 10% de FBS, 100
I.U. de penicilina, 100 µg/L de estreptomicina. TCI-DSG2 se derivaron de células TCI, una línea celular C57B1/6 de cáncer de pulmón que expresa HPV16 E6 y E7 (36). Las células TCI se transdujeron con un vector de lentivirus pseudotipado VSVG que expresa DSG2 humano (42). Un clon que expresa DSG2 humano a un nivel visto en tumores humanos se seleccionó para estudios in vivo.
Los adenovirus. Propagación, marcación de metil-3H timidina, purificación y titulación de Ad3 de tipo nativo se llevó a cabo como se describe en otra parte (37). Ad3-GFP es un vector basado en Ad3 de tipo nativo que contiene un casete de expresión CMV-GFP insertado en la región E3 (42). Las concentraciones de las partículas virales (VP) se determinaron espectrofotométricamente midiendo la densidad óptica a 260 nm (OD260). Los títulos de las unidades de formación de plaquetas (pfu) se llevaron a cabo utilizando células 293 como se describe en otra parte (29). La relación VP a pfu fue 20:1 para todas las preparaciones de virus.
genoteca de protuberancias Ad3. La secuencia de codificación de la protuberancia de Ad3 (aa 108-319) que contiene las dos últimas repetciones de eje se obtuvo por PCR a partir de DNA de Ad3 utilizando los cebadores P1: 5’
imagen22
imagen23
imagen24
imagen25
5
10
15
20
25
30
35
Transferencia de Western Unión al resto de DSG2 (protuberancia wtAd3 = 100%)*
Inhibición de la infección en presencia de protuberancia dimérica (JO-1 = 100%) Inhibición de la fijación en presencia de protuberancia dimérica (JO-1 = 100%)
N186D
5,3% 32,7 56,5
V189G
14 54 81
S190P
7,1 30,9 73,4
D261N
0 5,3 45
F265L
0 17,6 55,6
L296R
3,6 5,1 73,7
E299V
20 50,7 97,3
N186D, D261N
7,0 5,2 23,5
D261, L296R
7,0 1,5 20,1
N186D, D261N, L296R
0 0 18,5
Tabla 2: Análisis de los mutantes de fibra Ad3. La segunda columna muestra el análisis cuantitativo de las bandas de la transferencia de Western que corresponden a los trímeros de protuberancias de Ad3. La intensidad de la protuberancia de fibra wt Ad3 se tomó como el 100%. Los datos en la tercera columna reflejan la capacidad de los mutantes de protuberancia de fibra Ad3 diméricos para inhibir la infección Ad3-GFP (véase Fig. 3B). Cuanto más alto es el porcentaje, más fuerte es la inhibición. La inhibición por JO-1 (protuberancia wtAd3 dimérica) se toma como 100%. La cuarta columna muestra los datos correspondientes a la fijación del virus Ad3. N = 3. Se muestran promedios. La desviación estándar fue menor del 10%.
Debido a su relevancia como un patógeno recientemente aparecido, generamos también una genoteca de mutantes de protuberancia de fibra Ad14p1 (“monomérico”). Un primer cribado reveló ̴ 300 colonias candidato para variantes que no se unen a DSG2. Cuando se analizaron por la transferencia de Western para las 6xHis marcadas, 45 de las 300 colonias mostraron expresión de la protuberancia de fibra trimérica. La secuenciación de estas variantes reveló 15 mutantes independientes que redujeron su unión a DSG2 (Fig. 1A). Curiosamente, a pesar de una distribución de hoja beta diferente, los restos de aminoácidos que eran críticos para la unión a la protuberancia Ad14p1 estaban en las mismas tres regiones que fueron identificadas para la protuberancia de fibra Ad3. Debido a estas similitudes, llevamos a cabo estudios adicionales sólo con los mutantes de protuberancia de fibra Ad3 seleccionados.
Validación funcional. Los estudios de competición se llevaron a cabo en células HeLa, que expresan DSG2 (42). Primero estudiamos la fijación del virus Ad3 marcado en 3H después de la preincubación de las células con las protuberancias de fibras Ad3 diméricas (Fig. 3A). La reducción en la unión del virus Ad3 se comparó con la preincubación con JO-1, es decir, la proteína dimérica que contenía la protuberancia de fibra Ad3 de tipo nativo. La inhibición de la unión por JO-1 se tomó como el 100%. Los mutantes L296R, D261N, y F265L bloquearon la unión del virus Ad3 al menos (5,1, 5,3, y 17,6%), seguido por los mutantes S190P, N186D, y E299V (unión reducida un 30,9, 32,7, y 50,7%, respectivamente) (Tabla 2, “fijación”). Una configuración de ensayo similar se utilizó para medir la capacidad de los mutantes de protuberancia de Ad3 para bloquear la transducción de las células HeLa por un vector Ad3-GFP. La transducción se midió en base a la expresión de GFP (Fig. 3B). Similar a lo que observamos en el estudio adjunto, la infección Ad3-GFP se redujo menos por la preincubación con los mutantes D261N y F265L, seguido de los mutantes N186D, S190P, L296R, y V189G. Tomando la unión a DSG2 (transferencia de Western), fijación, y datos de la competencia de la infección juntos, concluimos que el área que contiene los restos 261 a 265 es el área más crítica en la unión a DSG2. La región alrededor de los restos 186-190 también contribuyen a la unión, mientras que la región que contiene el resto 299 parece estar solo marginalmente implicado en la unión. Los mutantes de protuberancia Ad3 dimérica con mutaciones combinadas se analizaron también para su capacitad para competir con el virus Ad3 para su fijación (Fig. 3C) e infección (Fig. 3D). El mutante con mutaciones en las tres áreas (N185, D261, L296) no bloquearon la unión o infección Ad3 incluso a concentraciones de 200 µg/ml lo que indica que está casi ablatida para la unión DSG2. Cabe destacar que, cuando se utilizó sCD46 como una sonda en la transferencia de Western de las fibras Ad3 de tipo nativo, no se observó uniones específicas (Fig. 4). Esto indica que Ad3 solo se une ineficazmente a CD46.
Correlación de la unión reducida a DSG2 y la capacidad más débil para abrir las uniones epiteliales. Un ensayo sencillo para la función de apertura de la unión de mutantes de protuberancia Ad3 dimérica se basa en la medida de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en cultivos celulares transwell. Las células cancerígenas epiteliales se
imagen26
imagen27
imagen28
imagen29
imagen30
imagen31

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
    imagen3
ES14783729.8T 2013-09-24 2014-09-24 Proteínas de unión a desmogleina 2 (DSG2) y sus usos Active ES2638320T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
WOPCT/US2013/061431 2013-09-24
PCT/US2013/061431 WO2014052322A1 (en) 2012-09-25 2013-09-24 Desmoglein 2 (dsg2) binding proteins and uses therefor
US201461954822P 2014-03-18 2014-03-18
US201461954822P 2014-03-18
PCT/US2014/057139 WO2015048081A1 (en) 2013-09-24 2014-09-24 Desmoglein 2 (dsg2) binding proteins and uses therefor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2638320T3 true ES2638320T3 (es) 2017-10-19

Family

ID=52744402

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14783729.8T Active ES2638320T3 (es) 2013-09-24 2014-09-24 Proteínas de unión a desmogleina 2 (DSG2) y sus usos

Country Status (16)

Country Link
US (6) US9688727B2 (es)
EP (1) EP3049520B1 (es)
JP (1) JP2016538327A (es)
KR (2) KR20160056938A (es)
CN (1) CN107041146A (es)
AU (1) AU2014326972B2 (es)
BR (1) BR112016006564B1 (es)
CA (1) CA2925487C (es)
DK (1) DK3049520T3 (es)
ES (1) ES2638320T3 (es)
HK (1) HK1221262A1 (es)
IL (1) IL244685B (es)
MX (1) MX2016003942A (es)
RU (1) RU2685876C2 (es)
TW (1) TWI647307B (es)
WO (1) WO2015048081A1 (es)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2971008B1 (en) 2013-03-14 2018-07-25 Salk Institute for Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
IL274151B (en) 2015-05-21 2022-07-01 Harpoon Therapeutics Inc Trispecific binding proteins and methods of use
JP7015551B2 (ja) 2016-02-23 2022-02-15 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ ウイルス動態への影響を最小限にするための治療用アデノウイルスにおける外因性遺伝子発現
JP7054527B2 (ja) 2016-02-23 2022-04-14 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ アデノウイルスの複製動態を測定するための高スループットアッセイ
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
JP7101621B2 (ja) 2016-05-20 2022-07-15 ハープーン セラピューティクス，インク． 単一ドメイン血清アルブミン結合タンパク質
EA201991168A1 (ru) 2016-11-23 2019-12-30 Харпун Терапьютикс, Инк. Белок, связывающий простатический специфический мембранный антиген
KR20190087539A (ko) 2016-11-23 2019-07-24 하푼 테라퓨틱스, 인크. Psma 표적화 삼중특이성 단백질 및 사용 방법
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
US11535668B2 (en) 2017-02-28 2022-12-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
CN115028727A (zh) 2017-05-12 2022-09-09 哈普恩治疗公司 靶向msln的三特异性蛋白质及使用方法
BR112019023855B1 (pt) 2017-05-12 2021-11-30 Harpoon Therapeutics, Inc Proteínas de ligação à mesotelina
CN107459562B (zh) * 2017-08-30 2020-10-27 广州医科大学附属第一医院 重组表达的腺病毒纤毛蛋白肽、腺病毒亚单位疫苗及其制备方法
CN111630070A (zh) 2017-10-13 2020-09-04 哈普恩治疗公司 三特异性蛋白质及使用方法
AU2018346955A1 (en) 2017-10-13 2020-04-30 Harpoon Therapeutics, Inc. B cell maturation antigen binding proteins
EP3743090A4 (en) * 2018-01-25 2022-02-09 Pai Life Sciences, Inc. CONJUGABLE DESMOGLEIN 2 (DSG2)-BINDING PROTEINS AND USES THEREOF
CA3114038A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
CA3170833A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Harpoon Therapeutics, Inc. Flt3 binding proteins and methods of use
WO2023167413A1 (ko) * 2022-03-04 2023-09-07 주식회사 케이피에스 Dsg2를 이용한 순환종양세포 검출 방법

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0494175A4 (en) 1989-09-27 1993-05-05 Athena Neurosciences, Inc. Compositions for cell adhesion inhibition and methods of use
IL96808A (en) 1990-04-18 1996-03-31 Rambus Inc Introductory / Origin Circuit Agreed Using High-Performance Brokerage
US5527773A (en) 1993-08-25 1996-06-18 United States Of America Use of synthetic peptides to disrupt the cytoskeleton
GB9423372D0 (en) 1994-11-18 1995-01-11 Eisai London Res Lab Ltd Proteins and their uses
US6169071B1 (en) 1996-07-12 2001-01-02 Mcgill University Compounds and methods for modulating cell adhesion
GB9620390D0 (en) 1996-09-30 1996-11-13 Eisai London Res Lab Ltd Substances and their uses
US6638911B1 (en) 1998-05-05 2003-10-28 Adherex Technologies Inc. Compounds and methods for modulating desmosomal cadherin-mediated functions
AU767975B2 (en) 1998-09-11 2003-11-27 Genvec, Inc. Alternatively targeted adenovirus
US6669951B2 (en) 1999-08-24 2003-12-30 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
US6635466B2 (en) * 2001-01-09 2003-10-21 University Of Iowa Research Foundation Adenovirus serotype 30 (Ad30)
AU2003271730A1 (en) * 2002-10-15 2004-05-04 Per Sonne Holm Novel adenoviruses, nucleic acids coding therefor, and use thereof
WO2004063355A2 (en) 2003-01-10 2004-07-29 Protein Design Labs, Inc. Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of matastatic cancer
KR101003817B1 (ko) 2003-01-10 2010-12-28 센트로 데 인베스티가시온 와이 데 에스튜디오스 아반자도스 델 인스티튜토 폴리테크니코 나시오날 조직 투과성의 조절을 위한 로타바이러스 단백질, 유도단백질 및 펩티드의 용도
US8529889B2 (en) 2004-06-29 2013-09-10 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions related to the modulation of intercellular junctions
US20060006792A1 (en) 2004-07-09 2006-01-12 Eastman Kodak Company Flat panel light emitting devices with two sided
US7383021B2 (en) 2004-07-28 2008-06-03 Motorola, Inc. Method and apparatus for transmitting in a communication device
CN101068933A (zh) 2004-08-25 2007-11-07 细胞基因系统有限公司 用于肿瘤细胞增强转导的纤维修饰的腺病毒载体
JP2008525496A (ja) 2004-12-28 2008-07-17 エモリー・ユニバーシティ 上皮性癌を治療するための方法及び組成
WO2011156761A1 (en) * 2010-06-10 2011-12-15 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods and systems for adenovirus interaction with desmoglein 2 (dsg2)

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015048081A1 (en) 2015-04-02
MX2016003942A (es) 2016-10-03
AU2014326972B2 (en) 2020-10-29
EP3049520A1 (en) 2016-08-03
US20220127308A1 (en) 2022-04-28
US10611803B2 (en) 2020-04-07
CA2925487C (en) 2023-11-07
US20200277336A1 (en) 2020-09-03
CA2925487A1 (en) 2015-04-02
BR112016006564B1 (pt) 2023-11-21
BR112016006564A2 (pt) 2017-09-12
CN107041146A (zh) 2017-08-11
KR20210129274A (ko) 2021-10-27
IL244685A0 (en) 2016-04-21
US20160257721A1 (en) 2016-09-08
RU2016110826A (ru) 2017-10-26
DK3049520T3 (en) 2017-08-14
KR20160056938A (ko) 2016-05-20
TWI647307B (zh) 2019-01-11
EP3049520B1 (en) 2017-07-05
TW201610150A (zh) 2016-03-16
AU2014326972A1 (en) 2016-04-07
JP2016538327A (ja) 2016-12-08
US11248028B2 (en) 2022-02-15
US10150798B2 (en) 2018-12-11
US20170247419A1 (en) 2017-08-31
IL244685B (en) 2021-01-31
US20240083953A1 (en) 2024-03-14
US11820795B2 (en) 2023-11-21
US9688727B2 (en) 2017-06-27
HK1221262A1 (zh) 2017-05-26
RU2685876C2 (ru) 2019-04-23
US20190092819A1 (en) 2019-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2638320T3 (es) Proteínas de unión a desmogleina 2 (DSG2) y sus usos
US9200041B2 (en) Methods and systems for adenovirus interaction with desmoglein 2 (DSG2)
EP2900818B1 (en) Desmoglein 2 (dsg2) binding proteins and uses therefor
WO2022166849A1 (en) Multi-valent oligonucleotide agent and methods of use thereof