KR101083450B1 - 아데노바이러스 및 그를 코딩하는 핵산의 신규 용도 - Google Patents

아데노바이러스 및 그를 코딩하는 핵산의 신규 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101083450B1
KR101083450B1 KR1020047019231A KR20047019231A KR101083450B1 KR 101083450 B1 KR101083450 B1 KR 101083450B1 KR 1020047019231 A KR1020047019231 A KR 1020047019231A KR 20047019231 A KR20047019231 A KR 20047019231A KR 101083450 B1 KR101083450 B1 KR 101083450B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
cells
adenovirus
pharmaceutical composition
nucleic acid
Prior art date
Application number
KR1020047019231A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20050008744A (ko
Inventor
페르 손네 홀름
Original Assignee
페르 손네 홀름
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE2002123534 external-priority patent/DE10223534A1/de
Application filed by 페르 손네 홀름 filed Critical 페르 손네 홀름
Publication of KR20050008744A publication Critical patent/KR20050008744A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101083450B1 publication Critical patent/KR101083450B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/763—Herpes virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 의약을 제조하기 위한 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스의 용도에 관한 것이다. 상기 바이러스는 코어에 YB-1을 함유하지 않는 세포에서 복제 결핍이고 적어도 1개의 바이러스 유전자, 바람직하게는 아데노바이러스 유전자를 트랜스활성화시키는 암유전자 또는 암유전자 산물, 특히 암유전자 단백질을 코딩하며 상기 유전자는 E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP를 포함하는 군으로부터 선택된다.

Description

아데노바이러스 및 그를 코딩하는 핵산의 신규 용도{Novel use of adenoviruses and nucleic acids coding therefor}
본 발명은 아데노바이러스 및 그를 코딩하는 핵산의 용도 및 재조합 바이러스 암단백질에 관한 것이다.
종양 치료에는 현재 많은 치료 수법이 이용되고 있다. 수술을 이용하는 것과는 별도로, 화학요법 및 방사선요법이 우세하다. 그러나 이들 수법 모두는 상당한 부작용과 관련되어 있다. 복제 선택적 암분해 바이러스의 사용은 종양 치료의 새로운 전기를 제공한다. 이와 관련하여 바이러스제의 선택적 종양내 복제가 개시되며, 이것은 바이러스 복제, 감염된 종양세포의 분해 및 인접 종양 세포로 바이러스의 확산을 초래한다. 바이러스의 복제능이 종양 세포에만 한정되기 때문에, 정상 조직은 복제되지 않으므로 바이러스에 의해 분해되지 않는다.
현재로서는 몇 개의 바이러스 계가 종양 분해를 목적으로 하여 임상 시험처리되고 있다. 이러한 아데노바이러스의 일례는 임상 제I상 및 제II상에 성공적으로 이용되고 있는 d11520 (Onyx-015)이다(Khuri, F. 등, Nature Medicine 6,879-885, 2000). Onyx-015는 E1B-55kDa 유전자가 완전히 결실된 아데노바이러스이다. 아데노바이러스의 E1B55kDa 단백질의 완전한 결실은 세포의 복제 및 분해가 p53 결 핍 아데노바이러스 벡터 (Kirn, D. 등, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17, 391a, 1998)에 의해서 가능하게되고 정상 세포는 손상되지 않는다는 사실을 기초로 한다. 보다 특히, E1B-55kDa 유전자 산물은 p53의 억제, 바이러스 mRNA의 전달 및 숙주 세포의 단백질 합성의 중지에 관련된다. p53의 억제는 E1B-55kDa 단백질에 의해 코딩된 아데노바이러스 및 p53으로 구성된 복합체의 형성을 통하여 생기거나 및/또는 TP53에 의해 코딩된 E4orf6.p53 및 E1B-55kDa 으로 구성된 복합체는 복합체 조절 메카니즘 (Zambetti, G. P. 등, FASEB J. 7, 855-865, 1993)에 대한 출발점이며, 그 결과 아데노바이러스와 같은 바이러스 세포에서 복제를 효과적으로 억제한다. 유전자 TP53은 모든 인간 종양의 약 50%에서 결실되거나 돌연변이되고, 그에 따라 화학요법이나 방사선요법으로 인하여 소망하는 세포자살의 부재를 초래하며, 그 결과 통상 종양 치료가 성공적으로 되지 못하게 된다.
종양분해성 아데노바이러스의 다른 개념은 E1A 단백질이 Rb/E2F 및/또는 p107/E2F 및/또는 p130/E2F의 결합에 영향을 주지 않는 특정의 결실 형태로 존재하거나 또는 1개 또는 몇 개의 돌연변이를 포함한다면, 그러한 아데노바이러스는 감염 세포의 S상으로의 진입을 유발하지 않을 것이며 기능적 Rb 단백질을 갖지 않는 종양 세포에서 복제될 수 있다는 발견을 기초로 한다. 부가적으로, E1A 단백질은 E1A가 p300에 결합되는 것을 억제시키고 또 종양세포에서 선택적 복제를 제공하기 위하여 N-말단에서 결실될 수 있고 또 E1A 단백질의 아미노산 위치 1 내지 76 영역에서 1개 또는 몇 개의 돌연변이를 포함한다. 이들 방법은 유럽특허 EP 0 931 830호에 예시적 방식으로 기재되어 있다. 그러한 바이러스의 예는 AdΔ24, d1922 - 947, E1Ad/01/07 및 CB016 이다(Howe, J. A. 등, Molecular Therapy 2, 485-495, 2000; Fueyo, J. 등, Oncogene 19, 2-12, 2000; Heise, C. 등, Nature Medicine 6, 11341139, 2001; Balague, C. 등, J. Virol. 75, 7602-7611, 2001). 종래 기술에 공지된 암분해를 위한 이들 아데노바이러스 계는 E1A 단백질에 분명한 결실부위를 포함하며, 그러한 결실은, 불활성 Rb 단백질 및 E2F로 구성된 복합체 및 기능적 Rb 단백질 각각은 생체내 아데노바이러스 복제를 Rb-음성/돌연변이된 세포에서만 제공하기 위하여 효과적인 생체내 복제를 방지할 것이라는 가정하에서 실시되었다. 종래 기술에 따른 이들 아데노바이러스 계는 초기 E2 프로모터 (E2-초기 프로모터) 및 유리 E2F를 사용하여 생체내 복제를 제어하기 위하여 E1A를 기초로 한다(Dyson N. Genes & Development, 12, 2245-2262, 1998).
다른 형태의 종양분해 아데노바이러스 계는 종양세포에서 선택적 복제를 제공하는 바이러스 암유전자 E1A를 특이적으로 발현하기 위한 선택적 프로모터의 사용을 기초로 한다(Rodriguez, R. 등, Cancer Res. 57, 2559-2563, 1997).
상기 기재한 바와 같이, 작용 모드의 기초가 되는 각 개념에 적합한 세포 배경의 선택은 아데노바이러스 종양분해 바이러스의 다양한 개념에 중요하다. 즉, 현재 공지된 다양한 아데노바이러스 계는 분명한 분자 생물학적 요건이 실현될 때에만 사용될 수 있을 것이다. 이것은 이러한 계의 사용을 분명한 환자 그룹에 사용되게 제한한다.
종양질병 치료에서의 특정 문제는 환자가 소위 다약제 내성(multidrug resistance(MDR))을 나타내는 경우에 생기며, 세포증식억제성 약물(cytostatics)에 대한 종양의 특히 잘 연구된 내성 형태를 제공한다 (Gottesman and Pastan, Annu. Rev. Biochem. 62, 385-427, 1993). 이것은 소위 ABC 전달체(transporter)에 속하는 막-결합형 전달 단백질 P-당단백질의 과발현을 기초로 한다 (Stein, U. 등, JBC 276, 28562-69, 2001, J. Wijnholds, Novartis Found Symp., 243, 69-79, 2002). Bargou, R.C.등 및 Oda, Y. 등 (Bargou, R. C. 등, Nature Medicine 3, 447-450, 1997; Clin. Cancer Res. 4, 2273-2277, 1998)은 인간 전사인자 YB-1의 핵 존재화는 P-당단백질 발현의 활성화에 직접적으로 관련되어 있음을 나타낼 수 있었다. 다른 연구는 YB-1이 UV 조사, 세포증식억제성 약물의 투여 (Koike, K. 등, FEBS Lett 17, 390-394, 1997) 및 온열요법(hyperthermia)(Stein, U. 등, JBC 276, 28562-69, 2001)과 같은 다양한 스트레스 조건에 의해 핵으로 전달된다는 것을 확인하였다. 또한 다른 연구는 YB-1의 핵 존재화는 다른 ABC 전달체에도 영향을 줄 수 있음을 확인하였다. 이러한 ABC 전달체를 MRP(multidrug resistance-related protein)이라 칭하며 이것은 소위 비정형 비-P-당단백질 의존형 다약제 내성 형성에 관여한다(Stein, U. 등, JBC 276, 28562-69, 2001).
본 발명의 기초가 되는 문제는 생물체, 보다 특히 인간 및 환자들을 종양분해적 활성제로써 치료하도록 하는 기술적 가르침 및 특히 수단을 제공하는 것이다. 본 발명의 기초가 되는 다른 문제는 세포증식억제성 약물에 내성인 종양질병, 특히 다약제 내성을 갖는 종양질병에 걸린 환자에서 종양분해를 유발하기에 적합한 수단을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 제1 요지로서, 상기 문제는 의약제조를 위해 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스를 사용하는 것에 의해 해결되며, 상기 바이러스는 핵에서 YB-1을 갖지 않는 세포에서 복제 결핍이며, 상기 바이러스는 YB-1 핵 양성 세포에서 적어도 1개의 바이러스 유전자, 바람직하게는 아데노바이러스 유전자를 트랜스활성화(transactivate)시키는 암유전자 또는 암유전자 산물, 바람직하게는 암유전자 단백질을 코딩하며, 상기 유전자는 E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 요지로서, 상술한 문제는 핵에서 YB-1를 갖는 세포에서 복제하기 위해 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스를 사용하는 것에 의해 해결되며, 상기 바이러스는 핵에서 YB-1를 갖지 않는 세포에서 복제 결핍이며 또 상기 바이러스는 적어도 1개의 바이러스 유전자, 바람직하게는 아데노바이러스 유전자를 트랜스활성화시키는 암유전자 또는 암유전자 산물, 바람직하게는 암유전자 단백질을 코딩하며, 상기 유전자는 E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 상기 2 용도의 구체예로서, 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스는 핵내에서 YB-1을 갖는 세포에서 복제된다.
본 발명에 따른 상기 2 용도의 구체예로서, 바이러스 암유전자 단백질은 E1A이고 및/또는 암유전자는 E1A를 코딩하는 유전자이며 및/또는 암유전자 단백질은 E1A 이다.
바람직한 구체예로서, 바이러스 암유전자 단백질 E1A는 기능적 Rb 종양 억제제 유전자 산물에 결합할 수 있다.
다른 구체예로서, 바이러스 암유전자 단백질 E1A는 기능적 Rb 종양 억제제 유전자 산물에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, 바이러스 암유전자 단백질 E1A는 YB-1의 핵 존재화를 유도하지 않는다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, 상기 의약은 Rb-양성 또는 Rb-음성인 세포를 갖는 환자에 사용하기 위한 것이다.
바람직한 구체예로서, 상기 세포는 의약에 의해 영향을 받을 조건의 형성에 관여하는 세포이다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, 상기 세포는 Rb-음성이고 핵에서 YB-1 양성이며, 바람직하게는 세포 주기로부터 독립적으로 핵에서 YB-1 양성이다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, 상기 의약은 종양 치료용이다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, 상기 세포, 특히 종양 또는 그의 일부를 형성하는 세포는 약물 내성이며, 특히 다약제 내성이고, 바람직하게는 항-종양제 내성이고, 더욱 바람직하게는 세포증식억제성 약물에 대하여 내성이다.
본 발명에 따른 2 용도의 바람직한 구체예로서, 상기 세포는 막-결합형 전달 단백질 P-당단백질 및/또는 MRP를 발현, 바람직하게는 과발현한다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, 상기 세포는 p53-양성 또는 p53-음성이다.
본 발명에 따른 2 용도의 구체예로서, 암유전자 단백질은, 야생형 암유전자 단백질 E1A와 비교하여, 1개 또는 몇 개의 돌연변이 또는 결실을 가지며, 상기 결 실은 CR3 영역의 결실, N-말단의 결실 및 C-말단의 결실을 포함하는 군으로부터 선택된다. 이와 관련하여, E1A 암유전자 단백질은 Rb에 결합될 수 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, 상기 암유전자 단백질은, 야생형 암유전자 단백질과 비교하여, 1개 또는 몇 개의 돌연변이 또는 결실을 가지며, 상기 결실은 CR1 영역 및/또는 CR2 영역에 존재한다. 본 발명의 범위내에서 암유전자 단백질 E1A는 Rb에 결합될 수 없다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, 상기 바이러스 암유전자 단백질, 특히 E1A는 조직 특이적 및/또는 종양 특이적 프로모터의 제어하에 있다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, 상기 바이러스, 특히 아데노바이러스는 YB-1을 암호화한다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, YB-1은 조직 특이적 및/또는 종양 특이적 프로모터의 제어하에 있다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, 상기 바이러스, 특히 아데노바이러스는 E4orf6, E4orf3, E1B55K 및 아데노바이러스 E3ADP 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 단백질을 암호화한다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, 상기 세포는 핵내에 YB-1을 가지며, 특히 종양 또는 그의 일부를 형성하는 세포는 핵내에 YB-1을 갖는다.
본 발명에 따른 2 용도의 다른 구체예로서, 종양은 YB-1의 핵내 전달을 유도하면 핵에 YB-1을 갖는다.
본 발명에 따른 2 용도의 바람직한 구체예로서, YB-1을 핵으로 전달하는 것은 방사선, 세포증식억제성 약물 및 온열요법을 포함하는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 수단을 통하여 유발된다.
본 발명에 따른 2 용도의 특히 바람직한 구체예로서, 상기 수단을 세포, 기관 또는 생물체에 적용한다.
본 발명에 따른 2 용도의 바람직한 구체예로서, 바이러스, 특히 아데노바이러스는 AdΔ24, d1922-947, E1Ad/01/07, d11119/1131, CB 016, dl520 및 기능적 Rb 종양 억제인자 유전자 산물을 결합할 수 있는 발현된 바이러스 E1A 암유전자가 결합된 바이러스를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제3 요지로서, 상기 문제는 의약제조를 위해 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스를 사용하는 것에 의해 해결되며, 상기 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스는 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 통하여 또는 E2-후기 프로모터의 활성화를 통한 YB-1에 의해, 바람직하게는 주로 E2-후기 프로모터의 활성화를 통하여 제어되도록 고안된다. 일개 구체예로서, YB-1은 트랜스제닉 YB-1 또는 세포성, 특히 세포성 통제가 제거된 YB-1이다. 트랜스제닉 YB-1은 세포에서 벡터에 의해, 바람직하게는 아데노바이러스에 의해 발현되는 YB-1을 의미한다. E2-후기 프로모터는 야생형 아데노바이러스에 존재하는 것과 같은 아데노바이러스 E2-후기 프로모터이거나, 또는 형질전환 유전자의 발현과 관련하여 기재된 것과 같은 E2-후기 프로모터이다.
제4 요지로서, 상기 문제는 핵에 YB-1을 갖는 세포에서 복제시키기 위해 바 이러스 및 특히 아데노바이러스를 사용하는 것에 의해 해결되며, 상기 바이러스, 특히 아데노바이러스는 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 통한 YB-1에 의해, 바람직하게는 주로 E2-후기 프로모터의 활성화를 통하여 제어되도록 고안된다. 일개 구체예로서, YB-1은 트랜스제닉 YB-1 또는 세포성, 특히 세포성 통제가 제거된 YB-1이다. 트랜스제닉 YB-1은 세포에서 벡터에 의해, 바람직하게는 아데노바이러스에 의해 발현되는 YB-1을 의미한다. E2-후기 프로모터는 야생형 아데노바이러스에 존재하는 것과 같은 아데노바이러스 E2-후기 프로모터이거나, 또는 형질전환 유전자의 발현과 관련하여 기재된 것과 같은 E2-후기 프로모터이다.
본 발명의 제3 및/또는 제4 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 아데노바이러스는 본 발명에 따라서 사용되도록 고안되는 바와 같이 본 명세서에 기재된 바와 같이 고안된다.
제5 요지로서, 상기 문제는 바이러스 암유전자 단백질, 특히 다음 특징을 갖는 단리된 바이러스 암유전자 단백질에 의해 해결된다:
a) E1B-55K, E3ADP 및 E4orf6 및 E4orf3으로 구성된 군으로부터 선택된, YB-1 핵-양성 세포에서 적어도 1개의 바이러스 유전자의 트랜스활성화; 및
b) 핵, 특히 바이러스 암유전자 단백질이 존재하는 세포의 핵에서 YB-1의 도입 결핍.
구체예로서, 바이러스 암단백질은 E1A이다.
다른 구체예로서, 상기 바이러스 암유전자 단백질은, 야생형 암유전자 단백질과 비교하여, 1개 또는 몇 개의 돌연변이 또는 결실을 갖고 있으며, 상기 결실은 CR3 영역의 결실, N-말단의 결실 및 C-말단의 결실을 포함하는 군으로부터 선택된다.
구체예로서, 핵을 나타내는 세포에 E4orf6 및/또는 E1B 55 kD가 존재하지 않으면, 바이러스 암유전자 단백질을 통한 YB-1의 도입은 존재하지 않는다.
상기와 관련하여, 바이러스 암유전자 단백질은 Rb에 결합될 수 있다.
다른 구체예로서, 바이러스 암유전자 단백질은 1개 또는 몇 개의 돌연변이 또는 결실을 포함하며, 상기 결실은 E1A 암유전자 단백질의 CR1 영역 및/또는 CR2 영역에 존재한다. 이와 관련하여, 바이러스 암유전자 단백질은 Rb에 결합될 수 없다.
제6 요지로서, 본 발명은 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 바이러스, 특히 아데노바이러스를 코딩하는 핵산, 및 헬퍼 바이러스의 1개 핵산을 포함하며 상기 헬퍼 바이러스의 핵산은 YB-1을 코딩하는 핵산을 포함하는, 바이러스 복제 계, 바람직하게는 아데노바이러스 복제 계의 용도에 관한 것이다.
구체예로서, 바이러스 핵산, 특히 아데노바이러스 핵산 및/또는 헬퍼 바이러스의 핵산은 복제될 수 있는 벡터로서 존재한다.
제7 요지로서, 본 발명은 의약을 제조하기 위한, 특히 종양 치료용 의약을 제조하기 위한 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 바이러스, 특히 아데노바이러스를 코딩하는 핵산의 용도에 관한 것이다.
구체예로서, 세포, 특히 종양 또는 그의 일부를 형성하는 세포는 약물, 바람직하게는 항종양제 및 더욱 바람직하게는 세포증식억제성 약물에 대하여 내성이고, 특히 다약제 내성을 갖는다.
제8 요지로서, 본 발명은 핵내에 YB-1을 갖는 세포에서 복제하기 위한 본 발명에 따라 사용되는 것과 같은 바이러스, 특히 아데노바이러스를 코딩하는 핵산의 용도에 관한 것이고, 상기 바이러스는 핵내에 YB-1을 갖지 않는 세포에서 복제 결핍이며, 또 상기 바이러스는 YB-1 핵-양성 세포에서 적어도 1개 바이러스 유전자, 바람직하게는 아데노바이러스 유전자를 트랜스활성화시키는 암유전자 또는 암유전자 산물을 코딩하며, 상기 유전자는 E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP로 구성된 군으로부터 선택된다.
제9 요지로서, 상기 문제는 의약 제조를 위해 본 발명에 따라 사용되는 것과 같은 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스를 코딩하는 핵산을 사용하는 것에 의해 해결되며, 상기 바이러스는 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 통한 YB-1에 의해, 바람직하게는 주로 E2-후기 프로모터의 활성화를 통하여 제어되도록 고안된다. 구체예로서 YB-1은 트랜스제닉 YB-1이거나 세포성, 특히 세포성 통제를 벗어난 YB-1이다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 트랜스제닉 YB-1은 벡터에 의해, 바람직하게는 아데노바이러스에 의해 세포에서 발현되는 YB-1이다. E2-후기 프로모터는 바람직하게는 야생형 아데노바이러스에 존재하는 것과 같은 아데노바이러스 E2-후기 프로모터이거나, 또는 형질전환 유전자의 발현 이용과 관련하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 E2-후기 프로모터이다.
제10 요지로서, 상기 문제는 의약 제조를 위해 본 발명에 따라 사용되는 것과 같은 바이러스, 바람직하게는 아데노바이러스를 코딩하는 핵산을 사용하는 것에 의해 해결되며, 상기 바이러스는 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 통한 YB-1에 의해, 바람직하게는 주로 E2-후기 프로모터의 활성화를 통하여 제어되도록 고안된다. 구체예로서, YB-1은 트랜스제닉 YB-1이거나 세포성, 특히 세포성 통제가 제거된 YB-1이다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, 트랜스제닉 YB-1은 벡터에 의해, 바람직하게는 아데노바이러스에 의해 세포에서 발현되는 YB-1이다. E2-후기 프로모터는 바람직하게는 야생형 아데노바이러스에 존재하는 것과 같은 아데노바이러스 E2-후기 프로모터이거나, 또는 형질전환 유전자의 발현 이용과 관련하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 E2-후기 프로모터이다.
제11 요지로서, 상기 문제는 본 발명의 제1 요지 또는 제2 요지에 따라 사용하기 위한 상기 기재된 핵산 중의 하나를 포함하는 벡터를 사용하는 것에 의해 해결된다.
제12 요지로서, 본 발명은 세포, 종양조직 세포 또는 환자가 본 발명에 따라 사용되는 바이러스, 특히 아데노바이러스와 접촉 및/또는 치료받을 지 여부를 결정하도록 세포, 종양조직 세포 또는 환자를 특징화하기 위한 YB-1과 상호작용하는 물질의 용도에 관한 것이다.
구체예로서, 상기 물질은 항체, 안티칼린, 앱타머, 앱타자임 및 스피겔머를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제13 요지로서, 상기 문제는 본 발명의 제1 및 제2 요지에 따라 사용되는, 바이러스, 특히 아데노바이러스의 제조를 위해 본 발명에 따른 바이러스 암유전자 단백질 또는 그를 코딩하는 핵산을 사용하는 것에 의해 해결된다.
구체예로서, 바이러스는 형질전환 유전자를 코딩하는 핵산을 포함한다.
다른 구체예로서, 바이러스는 번역 산물 및/또는 형질전환 유전자의 전사 산물을 포함한다.
바람직한 구체예로서, 아데노바이러스 복제 계의 핵산 및/또는 헬퍼 바이러스의 핵산은 형질전환 유전자 또는 형질전환 유전자를 코딩하는 핵산을 포함한다.
다른 구체예로서, 핵산은 형질전환 유전자 또는 형질전환 유전자를 코딩하는 핵산을 포함한다.
다른 구체예로서, 형질전환 유전자는 프로드럭 유전자, 사이토카인, 세포자살-유도 유전자, 종양 억제인자 유전자, 메탈로프로테이나제 억제제 유전자 및 신생혈관 억제제 유전자로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 구체예로서, 표적 분자는 내성 관련 인자, 항-세포자살 인자, 암유전자, 혈관신생 인자, DNA 합성 효소, DNA 수선효소, 성장인자 및 이들의 수용체, 전사인자, 메탈로프로테이나제, 특히 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 우로키나제 유형의 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 군으로부터 선택된다. 구체예로서 내성 관련 인자는 바람직하게는 P-당단백질, MRP 및 GST를 포함하는 군으로부터 선택되며, 또한 그를 코딩하는 핵산도 포함한다. 구체예로서, 항-세포자살 인자는 BCL2를 포함하는 군으로부터 선택되며 또 그를 코딩하는 핵산도 포함한다. 구체예로서, 암유전자는 Ras, 특히 돌연변이된 Ras, Rb 및 Myc를 포함하는 군으로부터 선택되며 또 그를 코딩하는 핵산도 포함한다. 구체예로서 혈관신생 인자는 VEGF 및 HMG 단백질을 포함하는 군으로부터 선택되며 또 그를 코딩하는 핵산도 포함한다. 구체예 로서 DNA 합성 효소는 텔로머라제를 포함하는 군으로부터 선택되며 또 그를 코딩하는 핵산도 포함하다. 구체예로서 DNA 수선 효소는 Ku-80을 포함하는 군으로부터 선택되며 또 그를 코딩하는 핵산도 포함한다. 구체예로서 성장인자는 PDGF, EGF 및 M-CSF를 포함하는 군으로부터 선택되며 또 그를 코딩하는 핵산도 포함한다. 구체예로서 수용체는 특히 성장인자 수용체이며 또 그를 코딩하는 핵산도 포함하며, 상기 성장인자는 PDGF, EGF 및 M-CSF를 포함하는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 구체예로서 전사인자는 YB-1을 포함하는 군으로부터 선택되며, 또 그를 코딩하는 핵산도 포함한다. 구체예로서 메탈로프로테이나제는 바람직하게는 매트릭스 메탈로프로테이나제이다. 바람직한 구체예로서 매트릭스 메탈로프로테이나제는 MMP-1 및 MMP-2를 포함하는 군으로부터 선택되며 또 그를 코딩하는 핵산도 포함한다. 구체예로서 우로키나제 유형의 플라스미노겐 활성인자는 uPa-R를 포함하는 군으로부터 선택되며 또 그를 코딩하는 핵산도 포함한다.
다른 구체예로서, 의약은 적어도 1개의 약제학적 활성 화합물을 부가적으로 포함한다.
바람직한 구체예로서, 약제학적 활성 화합물은 사이토카인, 메탈로프로테이나제 억제제, 혈관신생 억제제, 세포증식억제성 약물 및 세포 주기 억제제를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 YB-1 핵-양성 종양세포에서 E1A-변성 아데노바이러스의 DNA 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 기본으로 한다는 놀라운 발견을 기초로 한다. 여기서 사용된 E1A-변성 아데노바이러스는 (a) YB-1 핵-음성 세포에서 복제되지 않거 나 또는 YB-1 핵-음성 세포에서 그의 상응하는 야생형과 비교하여 감소된, 바람직하게는 상당히 감소된 복제를 나타내고, (b) 적어도 1개의 바이러스 유전자를 트랜스활성화하며, 상기 유전자는 특히 E1B-55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP를 포함하는 군으로부터 선택되며, 및/또는 (c) 세포성 YB-1을 아데노바이러스를 통하여 핵으로 전위시키지 않는 아데노바이러스이다. 경우에 따라 본 발명에 따라 사용된 아데노바이러스는 E1A 단백질에 의해 암호화된 아데노바이러스의 결합이, E2F가 Rb에 결합되는 것을 방해하며 또 E2F 및 Rb로 구성된 복합체를 용해시킬 수 있는 다른 특징들도 갖는다. 상술한 특징 a) 내지 c)중의 적어도 1개 또는 몇 개를 갖는 아데노바이러스, 바람직하게는 특징 a) 내지 c) 모두를 갖는 아데노바이러스는 YB-1을 핵에 갖지 않는 세포에서 복제 결핍이다.
구체예로서, 본 명세서에 나타낸 바와 같은 강하게 감소된 복제는 야생형에 비하여 복제가 2배, 바람직하게는 5배, 더욱 바람직하게는 10배, 가장 바람직하게는 100배 정도 감소됨을 의미한다. 바람직한 구체예로서, 이러한 복제의 비교는 동일하거나 유사한 세포주, 동일하거나 유사한 바이러스 감염 역가 (감염의 중복도, MOI, 또는 플라크 형성 유닛, pfu) 및/또는 동일하거나 유사한 일반적 실험 조건을 이용하여 실시한다. 본 명세서에서의 복제는 특히 입자의 형성을 의미한다. 다른 구체예로서 복제 정도는 바이러스 핵산 합성의 정도일 수 있다. 바이러스 핵산 합성의 정도를 측정하는 방법 및 입자 형성을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본 명세서에 기재된 발견, 방법, 용도 또는 핵산, 단백질, 복제 계 등은 아 데노바이러스에 한정되는 것은 아니다. 원칙상, 이러한 계는 다른 바이러스에도 존재할 수 있으며, 이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따른 바이러스를 사용하면 또는 본 발명에 따라 기재된 바이러스를 사용하면, 종래 기술에 따른 10 내지 100 pfu/세포와 비교하여, 1 내지 10 pfu/세포의 감염율로도 야생형 복제에 필적하는 복제를 달성할 수 있다.
본 명세서에 사용된 세포성 YB-1은 세포에 의해 코딩되고 바람직하게는 세포에 의해 발현되는 YB-1를 의미하며, 이러한 YB-1은 각 세포를 아데노바이러스, 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 아데노바이러스 및/또는 헬퍼바이러스와 감염시키기 전에 세포에 존재한다. 그러나 본 발명의 범위내에서 세포성 YB-1은 바이러스, 특히 아데노바이러스에 의한 감염과 같은 외인성 수단을 적용할 때 세포에 도입되거나 세포에 의해 생산되는 YB-1 이다.
이하에서 상기 내용에 한정시키려 하는 것은 아니며, 본 발명은 E2-초기 프로모터, 즉 초기 E2 프로모터가 본 발명에 따라 사용된 바이러스의 복제와 관련하여 인간 세포성 E2F 전사인자를 통하여 스위치온되지 않는다고 가정한다. 복제의 스위칭온은 세포의 Rb 상태와는 독립적이며, 즉 이는 본 명세서에 기재된 바이러스를 사용하여 감염되고 바람직하게는 이후에 분해되는 종양세포는 기능적 및 비활성 Rb 단백질을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 아데노바이러스 복제는 본 명세서에 기재된 아데노바이러스를 사용하거나 또는 본 명세서에 기재된 조건하에 있다면 기능적 p53 단백질을 필요로 하지 않으며 그 존재에 의해서 영향을 받지도 않는다. 지금까지의 기술내용은 AdΔ24, d1922-947, E1Ad/01/07, CB016 유형의 암 분해성 또는 종양분해성 아데노바이러스 또는 EP 0 931 830호에 기재된 것으로 완전한 기능적 Rb 단백질이 생체내의 효과적인 복제에 장애 요인이어서 Rb-음성 및 Rb-돌연변이된 세포에서만 생체내 아데노바이러스 복제를 제공한다는 가정하에서 1개 또는 몇 개의 결실이 E1A 단백질에 도입된 아데노바이러스의 사용을 기초로 하는 원리와는 벗어나 있다. 종래 기술에 따른 이들 아데노바이러스 계는 초기 E2 프로모터(E2-초기 프로모터) 및 "자유 E2F"에 의해 아데노바이러스의 생체내 복제를 제어하기 위하여 E1A를 기본으로 한다. 그럼에도 불구하고, 종래 기술에 따른 이들 바이러스는 본 발명에 따라 세포 주기와는 독립적으로 핵내에 YB-1을 함유하는 세포에서 복제하기 위해 사용될 수 있다.
유럽특허 EP 0 931 830호에 개시된 바이러스, 특히 아데노바이러스가 본 발명에 사용될 수 있다. 보다 특히, 상기 특허에 기재된 바이러스는 복제 결핍이어서 기능적 Rb 종양 억제인자 유전자 산물을 결합시킬 수 있는 발현된 바이러스 암단백질이 부족하다. 아데노바이러스는 특히 기능적 종양 억제인자 유전자 산물, 특히 Rb를 결합시킬 수 있는 발현된 바이러스 E1A 암단백질이 결핍된 아데노바이러스일 수 있다. 바이러스 E1A 암단백질은 불활성화 돌연변이를 포함할 수 있으며, 예컨대 CR1 도메인의 경우 Ad5중의 아미노산 위치 30 내지 85, Ad 5중의 뉴클레오타이드 위치 697 내지 790에서 및/또는 CR2 도메인의 경우 Ad5중의 아미노산 위치 120 내지 139, p105Rb 단백질, p130 및 p107 단백질의 결합에 관여하는 뉴클레오타이드 위치 920 내지 967에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 아데노바이러스는 2 dl 312 유형이거나 또는 아데노바이러스는 5 NT d1 1010 유형일 수 있다.
세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 포함하여서 YB-1 핵-양성인 세포에서, 의약 제조를 위해, 특히 종양 질병의 치료용 의약을 제조하기 위해 본 발명에 따라 아데노바이러스를 사용하고 또 핵에 YB-1을 갖는 세포에서 복제시키기 위해 본 발명에 따라 아데노바이러스를 사용하면, 복제가 궁극적으로 생긴다. 이와 같은 아데노바이러스는 핵내에 YB-1을 갖지 않고 세포질에서만 YB-1을 갖는 세포에서는 복제되지 않거나 또는 현저히 감소된 정도로 복제된다는 것은 아주 주목할만 하다. 이것은 이후에 더 자세하게 개략적으로 설명되며, 이것은 핵내에 YB-1의 발현 또는 핵내에 YB-1의 존재를 초래하도록 세포에 조처를 취하는 것에 의해 실현된다. 각 조치는 예컨대 본 발명에 따라 사용된 아데노바이러스를 통한 YB-1의 코딩 및 발현이며, 이는 아데노바이러스 이외에 YB-1을 코딩하는 유전자 정보, 특히 YB-1의 발현에 대한 유전자 정보를 포함할 수 있다. 세포의 핵에서 YB-1의 전달, 도입 또는 발현을 초래하는 다른 수단은 세포증식억제성 약물, 조사, 온열요법 등을 그러한 세포를 함유하는 생물체에 투여하는 것과 같은 스트레스 조건이다.
본 발명에 따라 종양 분해를 위해 사용되는 아데노바이러스는 이들이 핵에서 YB-1를 갖지 않는 세포, 즉 YB-1 핵-음성인 세포에서 복제되지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스의 다른 특징은 이들이 암유전자 단백질로도 불리는 바이러스 암단백질을 코딩하며, 암유전자 단백질은 바람직하게는 E1A이고, 암유전자 단백질은 바이러스의 복제 및/또는 바이러스에 의해 감염된 세포의 세포 분해에 영향을 줄 수 있는 적어도 1개의 바이러스 유전자를 활성화할 수 있다는 것입니다. 복제에 대한 영향은, 상응하는 바이러스의 암유전자 단백질이 부족한 상황과 비교하여, 암유전자 단백질의 존재하에서 바이러스가 더 잘 복제되게 하는 것이 바람직하다. 이러한 과정을 트랜스활성화(transactivation), 특히 E1A 트랜스활성화라 칭하며, 상기 트랜스활성화는 E1A를 통하여 매개된다. 용어 "트랜스활성화"는 각 바이러스 암단백질이 바이러스 암단백질 코딩 서열 자체와는 상이한 1개 또는 몇 개의 다른 유전자의 발현 및/또는 전사에 대하여 영향을 나타내며, 즉 바람직하게는 그의 발현 및/또는 번역을 제어하고, 특히 상기 발현 및/또는 번역을 활성화하는 방법을 나타낸다. 이러한 바이러스 유전자는 바람직하게는 E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP 뿐만 아니라 상술한 유전자의 임의 조합물 및 유전자 산물이다.
본 발명에 따라 사용되는 아데노바이러스의 다른 바람직한 특징은 종양 억제인자 Rb에 결합하는 것이다. 원칙상, 본 발명의 범위내에서 본 발명에 따라 사용된 아데노바이러스는 Rb에 결합되거나 또는 Rb에 결합되지 않는다. 처리될 세포의 Rb 상태와 독립적으로, 아데노바이러스의 다른 구체예도 사용가능하다.
Rb에 결합되지 않는 능력을 부여하기 위하여, E1A 암단백질의 다음과 같은 결실도 가능하다: CR1 영역(Ad5중의 아미노산 위치 30-85)의 결실 및 CR2 영역(AD5중의 아미노산 위치 120-139)의 결실. 이렇게함으로써, CR3 영역이 유지되며 다른 초기 바이러스 유전자에 대한 트랜스활성화 기능을 가질 수 있다.
지금까지 내용과 대조적으로, Rb에 대한 결합능을 E1A에게 부여하기 위하여 E1A 암단백질에 대한 이하의 결실도 가능하다: CR3 영역(아미노산 위치 140-185)의 결실; N-말단(아미노산 위치 1-29)의 결실; 아미노산 위치 85-119의 결실 및 C-말단(아미노산 위치 186-289)의 결실. 여기서 언급된 영역은 E2F가 Rb에 결합되는 것을 방해하지 않는다. 트랜스활성화 기능은 잔존하지만, 야생형 Ad5에 비해서는 감소된다.
종래 기술에 공지된 이러한 바이러스는 일반적으로 복제 결핍성으로 간주된다. 그러나, 본 발명자들이 인식한 본 발명의 이점은 바이러스가 적합한 배경에서, 특히 세포 배경에서 복제될 수 있는 것이다. 이러한 적합한 세포성 배경은 핵내에 YB-1의 존재에 의해, 바람직하게는 핵내에 YB-1가 세포 주기 독립적으로 존재하는 것에 의해 유발되거나 제공된다. 본 발명에서 사용된 용어 세포 또는 세포 계는 시험관내, 생체내 또는 원래 자리에 존재하는 세포 뿐만 아니라 세포 단편 또는 세포 분해물의 분획을 포함한다. 지금까지, 용어 세포 계 또는 세포는 세포 배양액, 조직 배양액, 기관 배양액 또는 조직, 기관 또는 생물체의 단리된, 그룹 또는 일부로서 생체내 또는 원래 자리에 있는 기타 조직 또는 기관으로 존재하거나 또는 바람직하게는 살아있는 생물체내에 그 자체로 존재하는 세포를 포함한다. 생물체는 바람직하게는 척추 생물체, 보다 바람직하게는 포유동물이다. 생물체가 인간인 것이 특히 바람직하다.
또한, 본 명세서에 제시된 기술내용을 기초로하는 본 발명의 범위내에서 YB-1 핵-양성인 세포에서 종래 기술의 아데노바이러스 중의 하나 뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 아데노바이러스의 복제 특징을 갖는 신규 바이러스가 생긴다. 즉, 이미 공지된 아데노바이러스로부터 출발해서 본 발명에 따라 사용하는데 필요한 것 으로 정의된 특징을 갖는 다른 바이러스가 고안될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 본 발명에 따라 사용될 다양한 아데노바이러스의 변형된 E1A 암단백질은 YB-1 핵-양성 세포에서 E1B55K, E4orf3, E4orf6, E3ADP와 같은 초기 바이러스 유전자를 트랜스활성화할 수 있다. 이와 관련하여, 바이러스 게놈에는 더 이상의 변화가 없는 것이 바람직하고 또 각각의 아데노바이러스는 야생형의 아데노바이러스 또는 그의 유도체에 대응될 수 있다.
본 발명에서 암유전자 단백질을 트랜스활성화를 코딩하거나 또는 그러한 암유전자 단백질을 포함하는 바이러스는 예컨대 아데노바이러스 AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB106 및/또는 유럽특허 EP 0 931 380호에 기재된 아데노바이러스를 포함하며, E1B, E2, E3 및/또는 E4와 같은 초기 유전자를 트랜스활성화할 수 있고 또 야생형의 아데노바이러스, 특히 야생형 Ad5에 필적한다. E1A 단백질의 특정 영역은 상기 경우에서 트랜스활성화에 필요하다. 다양한 아데노바이러스 혈청형내에서 E1A 단백질에 3개의 고도 보존 영역이 있다. 아미노산 위치 41-80의 CR1 영역, 아미노산 위치 120-139의 CR2 영역 및 아미노산 위치 140-188의 CR3 영역. 트랜스활성화 기능은 주로 E1A 단백질에 CR3 영역의 존재를 기본으로 한다. CR3의 아미노산 서열은 상술한 아데노바이러스에서 변경되지 않는다. 이것은 핵내에서 또는 세포질에서 YB-1의 존재와는 독립적으로 초기 유전자 E1B, E2, E3 및 E4의 트랜스활성화를 초래한다.
그러나 재조합 아데노바이러스 dl520에서, CR3 영역이 결실되어 있다. 따라서 dl520은 CR3 영역의 아미노산 서열을 포함하지 않는 소위 E1A12S를 발현한다. 그 결과, dl520은 특히 E2 영역에서만 아주 약한 트랜스활성화 기능을 나타낼 수 있고 따라서 YB-1 핵-음성 세포에서 복제되지 않는다. YB-1 핵-양성 세포에서, YB-1은 E2 영역을 트랜스활성화하며 dl520의 효과적인 복제를 허용한다. 이것은 dl520과 같은 계의 사용에 대한 기본이며 상기 목적을 위한 dl520에 기초한 계는 본 명세서에 기재되어 있다. 앞에서 기재한 그룹의 아데노바이러스, 즉 델타 24 (여기서 AdΔ24로 칭함) 및 dl520 사이의 중요한 차이는 dl520을 사용함으로써 초기 유전자 E1B, E3 및 E4가 YB-1 핵-음성 세포에 비교하여 YB-1 양성 세포에서 더욱 강하게 트랜스활성화된다는 사실에 존재한다. 대조적으로, 델타 24와는 차이가 거의 없거나 근소한 차이가 있을 뿐이다. dl520, 특히 E1A12S 단백질의 트랜스활성화 효과는 야생형 아데노바이러스와 비교해서는 현저하게 감소된다. 그러나 이러한 트랜스활성화는 실시예 10에서 나타낸 바와 같이 YB-1 핵-양성 세포에서 효과적인 복제를 허용하도록 충분해야한다. 상기와 관련하여 본 명세서에 기재된 E1A 단백질 및 그를 코딩하는 핵산은 E1A 단백질이 야생형 암유전자 단백질과 비교하여 1개 또는 몇 개의 결실 및/또는 돌연변이를 갖도록 고안되어야하며, 상기 결실은 CR3 영역의 결실, N-말단의 결실 및 C-말단의 결실을 포함하는 군으로부터 선택되는 결실이며, dl520 또는 AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB106 및/또는 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스와 관련하여 기재된 E1A 단백질의 바람직한 구체예는 바이러스의 구체예, 특히 아데노바이러스이며, 그의 복제는 E2-후기 프로모터의 활성화를 통한 YB-1에 의해, 바람직하게는 주로 E2-후기 프로모터의 활성화를 통하여 제어된다. 이러한 형태의 아데노바이러스 복제를 허용하는 E1A의 구 체예는 본 명세서에 제공된 기재내용을 기본하여 당업자들이 생성할 수 있다.
또한, 유도체로도 불리며 본 발명에 따라 사용될 수 있는 새로 작성할 다른 아데노바이러스는 전형적으로 E1 결실, E1/E3 결실 및/또는 E4 결실을 가지며, 즉 상응하는 아데노바이러스는 기능적으로 활성인 E1 및/또는 E3 및/또는 E4 발현산물 및 개별 산물을 생성할 수 없으며, 다시말해 이들 아데노바이러스는 기능적으로 불활성 E1, E3 및/또는 E4 발현산물 만을 생성할 수 있고, 기능적으로 불활성 E1, E3 및/또는 E4 발현산물 그자체는 발현산물로 존재하지 않거나, 전사레벨 및/또는 번역레벨에 있을 수 있거나, 야생형 아데노바이러스에 존재하는 기능중의 하나가 결핍된 형태로 존재할 수 있다. 야생형 아데노바이러스의 발현산물의 기능은 당업자에게 공지되어 있으며, 예컨대 Russell, W. C., Journal of Virology, 81, 2573-2604, 2000에 기재되어 있다. Russell (상기 참조)은 아데노바이러스 및 아데노바이러스 벡터의 작성 원리를 기재하고 있으며, 이는 본 발명에 참고문헌으로 포함된다. 본 발명의 범위내에서 변형된 E1A 암단백질, E1B-55K, E4orf6 및/또는 E3ADP (아데노바이러스성 치사 단백질(ADP))(Tollefson, A. 등, J. Virology, 70, 2296-2306, 1996)은 벡터에서 개별적으로 또는 조합되어 발현된다. 그와 관련하여, 개별적으로 명명된 유전자 뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 형질전환 유전자는 E1 및/또는 E3 및/또는 E4 영역에 클로닝될 수 있고 또 적합한 프로모터에 의하여 독립적으로 또는 적합한 프로모터의 제어하에서 발현될 수 있다. 기본적으로, 영역 E1, E3 및 E4는 아데노바이러스 핵산내에서 클로닝 부위로서 유사하게 적합하다. 적합한 프로모터는 그중에서도 E1A, 특히 변형된 E1A의 제어 및 발현과 관련하여 기재된 프로모터이다.
마지막으로, 일 구체예로서, 본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스는 E1B, 특히 E1B 19 kDa가 결핍되어 있다.
본 명세서에 이용된 바와 같이, 용어 결핍은 일반적으로 E1B가 야생형 고유의 특징을 모두 갖는 것은 아니지만 이들 특징의 적어도 하나가 존재하지 않는 조건을 의미한다.
본 발명에 따라 사용되는 아데노바이러스는 기본적으로 일부 구체예에서 종래 기술로 공지되어 있다. 본 발명에 따라 사용되는 아데노바이러스는 특히 야생형에 비하여 본 발명에 개시된 수법에 따라 일개의 변화가 실시되면 바람직하게는 재조합 아데노바이러스이다. 이들 아데노바이러스 핵산 서열을 결실 또는 돌연변이하는 것은 당업자 기술에 속하며, 본 발명에 고유한 것은 아니다. 이러한 결실은 예컨대 본 명세서에 기재된 E3 및 E4를 코딩하는 핵산의 일부와 관련될 수 있다. E4의 결실은 그러한 결실이 단백질 E4orf6에 미치지 않을 경우 특히 바람직하며, 다르게 말해, 본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스는 E4orf6을 코딩한다. 바람직한 구체예로서, 이들 아데노바이러스 핵산은 바이러스 캡시드에 팩킹될 수 있고, 따라서 감염성 입자를 형성할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산을 사용한 경우에도 상기한 내용이 적용된다. 일반적으로 아데노바이러스 계는 단일 또는 몇 개 발현 산물이 결핍될 수 있음을 주목해야 한다. 이와 관련하여, 그러한 발현 산물을 코딩하는 핵산은 완전히 돌연변이되거나 결실되거나 또는 실질적으로 아무런 발현 산물이 생성되지 않을 정도로 돌연변이되거나 결실된다는 사실을 기본으로 할 수 있 거나 또는 발현을 제어하거나 핵산 수준(프로모터의 부족; 시스-작용 요소) 또는 번역 계 및 전사 계에서 야생형과는 상이한 방식으로 활성인 프로모터 또는 전사 인자의 부족을 기본으로 한다. 특히 후자의 특징은 세포성 배경에 따라 달라질 수 있다.
이미 공지된 본 발명에 따른 아데노바이러스를 사용하는 것과는 달리, 본 명세서에 기재된 다른 아데노바이러스에 대해 이미 기재된 바와 같은 정도의 신규 아데노바이러스가 사용될 수 있다. 특히 바람직한 대표예는 예컨대 도 16 및 도 17에 도시된 바이러스 Xvir03 및 Xvir03/01이며, 그의 디자인 원리는 실시예 11 및 12에 설명되어 있다.
벡터 Xvir03의 경우, CMV 프로모터를 IRES 서열에 의해 분리되어 있는 E1B 55K 및 E4orf6에 대한 핵산을 코딩하는 E1 영역에 클로닝한다. 이들 2개 유전자 및 그로부터 생산된 유전자 산물을 도입함으로 인하여, 야생형 바이러스중의 하나에 상응하는 복제 효율이 얻어지며, 복제의 선택성은, 복제가 YB-1 핵-양성 세포에서, 보다 특히 YB-1가 통제제거된 세포에서 생기는 한, 세포, 특히 종양 세포에 대해 유지된다. YB-1가 통제제거된 세포는 정상 또는 비-종양 세포와 비교하여 바람직하게는 구획 독립적으로 YB-1의 발현 증가를 나타내는 세포이다.
바람직한 구체예로서, 바이러스 Xvir03의 다른 개발은 특정한 프로모터 제어하에, 특히 종양-특이적 또는 조직 특이적 프로모터의 제어하에서 치료적 유전자 또는 형질전환 유전자가 클로닝되어 있는 바이러스 Xvir03/01 이다. 이러한 바이러스 범위내에서 E4 영역은 기능적으로 비활성, 바람직하게는 결실되어 있다. 여 기서 기재된 형질전환 유전자는 E4 영역에 클로닝될 수 있으며, 이러한 것은 형질전환 유전자를 E3 영역에 클로닝하는 것에 부가적으로 또는 교대적으로 실시할 수 있다.
이러한 치료적 유전자는 프로드럭 유전자, 사이토카인 유전자, 세포자살 유전자, 종양 억제제 유전자, 메탈로프로테이나제 억제제 및/또는 혈관신생 억제제일 수 있다. 바람직하게는, 내성 관련 인자, 항-세포자살 인자, 암유전자, 혈관신생 인자, DNA 합성 효소, DNA 수선 효소, 성장인자 및 이들의 수용체, 전사 인자, 메탈로프로테이나제, 특히 매트릭스 메탈로프로테아니제 및 우로키나제 형의 플라스미노겐 활성인자로 구성된 군으로부터 1개 또는 다수개의 표적 분자가 선택된다. 바람직한 구체예는 본 명세서에 기재되어 있다.
바람직한 구체예로 사용될 수 있는 가능한 프로드럭 유전자는 예컨대 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제, 카르복시펩티다제, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(PNP) 이다; Kirn 등, Trends in Molecular Medicine, Volume 8, No.4(Suppl), 2002; Wybranietz W.A. 등, Gene Therapy, 8, 1654-1664, 2001; Niculescu-Duvaz 등, Curr. Opin. Mol. Therapy, 1, 480.486, 1999; Koyama 등, Cancer Gene Therapy, 7, 1015-1022, 2000; Rogers 등, Human Gene Therapy, 7, 2235-2245, 1996; Lockett 등, Clinical Cancer Res., 3, 2075-2080, 1997; Vijayakrishna 등, J. Pharmacol. And Exp. Therapeutics, 304, 1280-1284, 2003.
바람직한 구체예로 사용될 수 있는 가능한 사이토카인은 예컨대 GM-CSF, TNF-알파, Il-12, Il-2, Il-6, CSF, 인터페론-감마이다; Gene Therapy, Advances in Pharmacology, Volume 40, Editor: J. Thomas August, Academic Press; Zhang und Degroot, Endocrinology, 144, 1393-1398, 2003; Descamps 등, J. Mol. Med., 74, 183-189, 1996; Majumdar 등, Cancer Gene Therapy, 7, 1086-1099, 2000.
바람직한 구체예로서 사용될 수 있는 세포자살 유발 유전자는 예컨대 다음과 같다: 데코린: Tralhao 등, FASEB J, 17, 464-466, 2003; 망막모세포종 94: Zhang 등, Cancer Res., 63, 760-765, 2003; Bax 및 Bad: Zhang 등, Hum. Gene Ther., 20, 2051-2064, 2002; 아포프틴: Noteborn and Pietersen, Adv. Exp. Med. Biol., 465, 153-161, 2000); ADP: Toth 등, Cancer Gene Therapy, 10, 193-200, 2003; bcl-xs: Sumantran 등, Cancer Res, 55, 2507-2512, 1995; E4orf4: Braithwaite and Russell, Apoptosis, 6, 359-370, 2001; FasL, Apo-1 및 Trail: Boehringer Manheim, Guide to Apoptotic Pathways, Arai 등, PNAC, 94, 13862-13867, 1997; Bims; Yamaguchi 등, Gene Therapy, 10, 375-385, 2003; GNR163: Oncology News, 17 Juni, 2000.
바람직한 구체예로 사용될 수 있는 종양 억제인자 유전자는 예컨대 E1A, p53, p16, p21, p27, MDA-7 이다: Opalka 등, Cell Tissues Organs, 172, 126-132, 2002, Ji 등, Cancer Res., 59, 3333-3339, 1999, Su 등, Oncogene, 22, 1164-1180, 2003.
바람직한 구체예로 사용될 수 있는 혈관신생 억제제는 예컨대 엔도스타틴, 안기오스타틴: Hajitou 등, FASEB J., 16, 1802-1804, 2002, 및 VEGF에 대한 항체 (Ferrara, N., Semin Oncol 2002; 29 (6 Suppl 16): 10-4) 이다.
바람직한 구체예로 사용될 수 있는 메탈로프로테이나제 억제제는 예컨대 다음과 같다: Timp3: Ahonen 등, Mol Therapy, 5, 705-715, 2002; PAI-1; Soff 등, J. Clin. Invest., 96, 2593-2600, 1995; 및 Timp-1, Brandt K. Curr. Gene Therapy, 2, 255-271, 2002.
siRNA (짧은 간섭 RNA)는 2개, 바람직하게는 2개의 별도의 RNA 가닥으로 구성되며, 염기 상보성으로 인하여 서로에 대해 혼성화되며, 즉 염기 쌍을 이루며 또 바람직하게는 50개 이하의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 18 내지 30개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 25개 미만의 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 21, 22 또는 23개 뉴클레오타이드를 가질 수 있으며, 상기 숫자는 단일 가닥의 siRNA, 특히 하나의 단일가닥, 보다 특히 제2 단일 가닥과 혼성화되는 단일 가닥의 스트레치 길이를 지칭하며, 각각 서로에 대해 염기쌍을 이룬다. siRNA는 특히 mRNA의 퇴화를 유도하거나 매개한다. 이를 위해 필요한 특이성은 siRNA의 서열 및 그의 결합 부위에 의해 제공된다. 퇴화될 표적 서열은 siRNA 형성 가닥의 제1 또는 제2 가닥과 주로 상보적이다. 정확한 작용 모드는 여전히 분명하지 않지만, siRNA는 발생중 세포가 특정 대립유전자를 억제하고 또 그자체를 바이러스로부터 보호하는 생물학적 전략을 나타낸다. siRNA 매개된 RNA 간섭은 유전자 특이적 이중가닥의 RNA를 도입하는 것에 의해 단백질의 발현을 특이적으로 억제하거나 완전히 차단시키기 위해 이용된다. 고등 생물의 경우 19 내지 23개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 siRNA가 특히 바람직한데, 이는 비특이적 방어 반응, 소위 인터루킨 반응의 활성화를 유 발하지 않는다. 3' 말단에 대칭적 2-nt 오버헹(overhangs)을 갖는 21개 뉴클레오타이드로 구성된 이중가닥 RNA의 즉각적 형질감염은 포유동물 세포에서 RNA 간섭을 매개할 수 있었고 또 리보자임 및 안티센스 분자와 같은 다른 기술과 비교하여 훨씬 더 효과적이었다(Elbashir, S. Harborth J. Lendeckel W. Yalvcin, A. Weber K Tuschl T: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001, 411: 494-498). 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해서는 아주 소량의 siRNA 분자가 필요하였다. 간섭 현상의 일시적 성질 및 siRNA 분자의 특이적 전달에 각별하게 존재하는 외래 투여된 siRNA의 제한을 피하기 위하여, 종래 기술은 외인성 siRNA 발현을 허용하는 벡터를 사용한다. 예컨대 벡터내에 도입된 예컨대 9개 뉴클레오타이드 길이의 스페이서 서열을 통하여 분리된, 19개의 뉴클레오타이드 길이의 표적 서열을 센스 및 안티센스 방향으로 함유하는 64개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 제공된다. 생성한 전사물은 줄기 구조, 예컨대 19개 염기쌍을 갖는 헤어핀 구조로 접혀진다. 상기 세포에서는 루프가 급격히 퇴화되어 기능적 siRNA가 생성된다(Brummelkamp 등, Science, 296, 550-553, 2002).
pRb 및 E2F 각각의 활성은 인산화를 통하여 조절된다. pRb의 하이포인산화된 형태가 G1 및 M상에서 주로 존재한다. 대조적으로, pRb의 하이퍼인산화된 형태는 S 및 G2 상에 존재한다. E2F는 E2F 및 하이포인산화된 pRb로 구성된 복합체로부터 pRb의 인산화에 의해 방출된다. E2F 및 하이포인산화된 pRb로 구성된 복합체로부터 E2F의 방출은 E2F 의존적 유전자의 전사를 초래한다. E1A 단백질은 pRb의 하이포인산화된 형태에 결합되지 않으며, E1A가 pRb에 결합하는 것은 E1A 단백질의 CR2 영역을 통하여 주로 생긴다. 부가적으로, 이것은 또한 낮은 친화력이긴 하지만 CR1 영역에 결합된다 (Ben-Israel and Kleiberger, Frontiers in Bioscience, 7, 1369-1395, 2002; Helt and Galloway, Carcinogenesis, 24, 159-169, 2003).
본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스의 구체예로서 아데노바이러스의 일부인 YB-1을 코딩하는 핵산은 YB-1을 핵으로 전달하는 것을 매개하는 핵산서열을 또한 포함한다. Onyx-015, AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB016, dl520 및 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스와 같은 종래 기술에 공지된 아데노바이러스 뿐만 아니라 본 발명에 따른 핵산, 아데노바이러스 및 아데노바이러스 계는 그대로 사용되거나 또는 아데노바이러스 및 아데노바이러스 계 및 상응하는 핵산과 관련하여 본 발명에 따른 상기 핵산과 조합되어 사용된다. 핵산 전달을 매개하는 적합한 핵산 서열은 당업자에게 공지되어 있으며 또 예컨대 이하에 기재되어 있다: Whittaker, G.R. 등, Virology, 246, 1-23, 1998; Friedberg, E.C., TIBS 17, 347, 1992; Jans, D.A. 등, Bioessays 2000 Jun; 22(6): 532-44; Yoneda, Y., J. Biochem. (Tokyo) 1997 May; 121 (5): 811-7; Boulikas, T., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1993; 3(3): 193-227; Lyons RH, Mol. Cell Biol., 7, 2451-2456, 1987). 핵 전달 매개 핵산서열과 관련하여, 상이한 원리가 이용될 수 있다. 1가지 가능한 원리는 예컨대 YB-1이 단일 펩티드와 하메 융합 단백질로 형성되어 핵으로 도입되고, 그에 따라 본 발명에 따른 아데노바이러스의 복제가 생기는 것이다.
본 발명에 따라 사용된 아데노바이러스의 디자인으로 실현될 수 있는 다른 원리는, 세포질에서 합성으로 개시된 전달체 서열이 YB-1에 제공되어, YB-1가 세포 핵으로 도입되거나 YB-1을 세포 핵으로 전위하며 바이러스 복제를 증대시키는 것이다. 특히 효과적인 핵산 서열 매개 핵산 전달의 예는 Efthymiadis, A., Briggs, LJ, Jans, DA., JBC 273, 1623-1628에 기재된 유형중 다른 적합한 핵산 서열인 HIV의 TAT 서열이다. 본 발명의 범위내에서 본 발명에 따라 사용된 아데노바이러스는 핵 전달을 코딩하는 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 범위내에서 YB-1은 전체 길이로, 특히 야생형 YB-1에 상응하는 형태로 존재한다. 본 발명의 범위내에서 YB-1은 짧은 형태 또는 절단된 형태와 같은 유도체로서 사용되거나 유도체로서 제공된다. 본 발명에 사용되거나 제공되는 YB-1 유도체는 E2-후기 프로모터에 결합될 수 있고 아데노바이러스 E2 영역의 유전자 발현을 활성화시키는 YB-1 이다. 이러한 유도체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 YB-1 유도체를 포함한다. 이러한 유도체는 N-말단, C-말단에서 또는 아미노산 서열 내에서 단일 또는 몇 개의 아미노산을 결실시키는 것에 의해 생길 수 있다.
아데노바이러스에 의해 코딩된 앞서 다양한 유전자 및 유전자 산물을 제공하며, 재조합되어 코딩되거나 조합되어 발현된다.
용어 아데노바이러스 및 아데노바이러스 계는 본 발명의 범위내에서 동일한 의미를 갖는다. 아데노바이러스는 캡시드 및 핵산을 포함하는 완전한 바이러스 입자를 지칭한다. 용어 아데노바이러스 계는 핵산이 야생형과 비교하여 변경될 것이라는 사실을 기본으로 한다. 이러한 변화는 프로모터, 조절 서열 및/또는 오픈 리딩 프레임과 같은 코딩 서열을 결실 및/또는 부가 및/또는 돌연변이시키는 것에 의 해 유발되는 아데노바이러스의 게놈 구조의 변화를 포함한다. 부가적으로, 용어 아데노바이러스 계는 유전자 요법에 사용되는 벡터와의 조합으로 사용된다.
아데노바이러스 및 아데노바이러스 계의 고안뿐만 아니라 용도를 포함하여 앞서 언급한 사항은 각각 코딩 핵산에도 적용되며, 그 역도 마찬가지다.
본 발명과 관련하여, 본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스 및 그를 코딩하는 핵산은 각각 그 자체 또는 다른 핵산 서열과 조합하여 복제를 유발하는 아데노바이러스 핵산일 수 있다 여기서 설명한 바와 같이, 헬퍼 바이러스에 의해 복제에 필요한 서열 및/또는 유전자 산물이 제공된다. 코딩 핵산 서열을 참조한 정도 및 그러한 핵산 서열이 공지되어 있는 정도에 따라서, 사용된 동일한 서열 뿐만 아니라 그로부터 유도된 서열도 본 발명의 범위내에 속한다. 유도된 서열이라는 용어는 본 명세서에서는 유전자 산물을 초래하는 서열로서 비-유도 서열의 기능 중의 하나 또는 그 이상에 상응하는 기능을 나타내는 핵산 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이것은 당업자에게 공지된 간단한 통상의 시험에 의해 결정될 수 있다. 이러한 유도된 핵산 서열의 예는 동일한 유전자 산물을 코딩하는, 특히 동일한 아미노산 서열을 코딩하지만 유전자 암호의 축퇴로 인하여 염기서열에 차이가 있는 핵산 서열이다.
바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 및 본 발명에 따른 아데노바이러스 복제 계 및 본 발명에 따른 상기의 용도에 관하여, 암유전자 단백질, 특히 E1A 단백질의 발현용으로 아데노바이러스 핵산은 불충분하며, 이는 이것이 12S E1A 단백질 또는 13S E1A 단백질을 코딩하지 않거나 변형되어 있음을 의미하고 또 아데노바이러스 복제계는 또한 헬퍼 바이러스의 핵산을 더 포함하며, 헬퍼 바이러스의 핵산은 암유전자 단백질, 특히 E1A 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 이하의 특징을 갖고 또 아데노바이러스에 대하여 이하의 특징을 부여하는 것을 의미하며, 즉 YB-1 핵-음성 세포에서 복제되지 않고 세포 주기 YB-1 핵-양성과 독립적인 세포에서 복제되며, 적어도 1개의 바이러스 유전자, 특히 E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및/또는 E3ADP를 YB-1 핵-양성 세포에서 트랜스활성화하며 및/또는 세포성 YB-1을 핵으로 전위시키지 않음을 의미한다. 본 발명에서 본 명세서에 기재된 형질전환 유전자는 개별적으로 또는 헬퍼 바이러스와 함께 코딩되며 및/또는 그로부터 발현된다.
본 발명에 따른 아데노바이러스 복제 계의 구체예로서, 아데노바이러스 핵산 및/또는 헬퍼 바이러스의 핵산은 복제할 수 있는 벡터로서 제공된다.
본 발명에서 본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스를 코딩하는 코딩 핵산은 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 존재하며 상기 발현 벡터는 본 발명에 따라 사용된다.
본 발명의 다른 특징은 적어도 2개의 벡터를 포함하는 벡터 그룹에 관련되며, 상기 벡터 그룹은 본 명세서에 기재된 아데노바이러스 복제 계를 포함하고 또 상기 벡터 그룹은 본 발명에 따라 사용된다. 아데노바이러스 복제 계의 성분 각각은 개별 벡터상에, 바람직하게는 발현 벡터상에 배열하는 것이 좋다.
마지막으로, 본 발명은 아데노바이러스에 대해 기재된 동일한 목적에 대한 세포의 용도에 관련되며, 상기 세포는 본 발명에 따라 사용될 상기 기재된 아데노 바이러스를 코딩하는 1개 또는 몇 개 핵산 및/또는 각 아데노바이러스 복제계 및/또는 각 벡터 및/또는 본 발명에 따른 벡터 그룹을 포함한다.
앞서 기재한 아데노바이러스 구조물, 특히 이들의 핵산 및 그를 코딩하는 핵산은 세포에 부분적으로, 특히 종양 세포에 도입될 수 있고, 이때 다양한 개별 성분의 존재로 인하여, 개별 성분들이 단일 핵산 및 단일 또는 몇 개의 아데노바이러스로부터 기인한 것이면, 함께 작용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 아데노바이러스, 아데노바이러스 계 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산은 벡터로서 존재할 수 있다. 바람직하게는, 이들은 바이러스 벡터로 존재한다. 아데노바이러스 핵산을 포함하는 핵산의 경우 바이러스 입자는 바람직하게는 벡터이다. 그러나, 본 발명에서 상기 핵산은 플라스미드 벡터로 존재한다. 어떤 경우든 벡터는 삽입된 핵산의 증식을 제공하기 위한, 즉 삽입된 핵산의 복제 및 경우에 따라 발현 및 이들의 제어를 제공하는 요소를 포함한다. 적합한 벡터, 특히 발현 벡터 및 상응하는 요소는 당업자에게 공지되어 있으며 예컨대 Grunhaus, A., Horwitz, M.S., 1994, Adenoviruses as cloning vectors. In Rice, C., edit, Seminars in Virology, London: Saunders Scientific Publications 에 기재되어 있다.
벡터 그룹에 관련된 본 발명의 특징은 상술한 구체예를 설명하며, 핵산의 다양한 요소는 1개 벡터에만 함유되는 것은 아니다. 따라서, 벡터 그룹은 2개 이상의 벡터를 포함한다. 다르게는, 벡터에 관하여 언급한 사항은 벡터 및 벡터 그룹에도 또한 적용된다.
본 발명에 따라 사용되는 아데노바이러스는 본 명세서에 기재한 바와 같은 다양한 핵산 및 유전자 산물을 특징으로 하며 또 당업자에게 공지된 모든 요소를 더 포함할 수 있으며, 이는 야생형의 아데노바이러스에 대해서도 마찬가지이다 (Shenk, T.: Adenoviridae: The virus and their replication. Fields Virology, 3rd edition, edit. Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, P.M. 등, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, chapter 67).
아데노바이러스의 복제는 매우 복잡한 과정이고 통상 인간 전사 인자 E2F를 사용한다. 바이러스 감염중, 먼저 "초기 유전자" E1, E2, E3 및 E4가 발현된다. "후기 유전자" 그룹은 바이러스 구조 단백질의 합성에 관여한다. 초기 및 후기 유전자 모두를 활성화하기 위하여, 상이한 E1A 및 E1B 단백질을 코딩하는 2개 전사 단위 E1A 및 E1B로 구성된 E1 영역은, E2, E3 및 E4의 전사가 이들에 의해 유발되기 때문에 중요하다(Nevins, J. R., Cell 26, 213-220, 1981). 또한, E1A 단백질은 휴지기 세포에서 DNA 합성을 유발할 수 있으므로 S상으로의 진입을 개시한다(c.f. Boulanger and Blair, 1991). 또한, 이들은 Rb 종류의 종양 억제인자와 상호작용한다(Whyte, P. 등, Nature 334, 124-127, 1988). 이렇게 함으로써, 세포 전사 인자 E2F가 방출된다. E2F 인자는 세포의 상응하는 프로모터 영역 뿐만 아니라 바이러스 유전자(특히 아데노바이러스 E2-초기 프로모터)에 결합될 수 있고 따라서 전사 및 복제를 개시한다(Nevins, J.R., Science 258, 424-429, 1992).
E2 영역의 유전자 산물은 3개의 필수단백질을 코딩하기 때문에 복제의 개시 및 실시에 특히 필요하다. E2 단백질의 전사는 2개의 프로모터, 이후 E2-초기 프로모터 또는 초기 E2 프로모터라 불리는 "E2-초기 E2F-의존" 프로모터 및 "E2-후기" 프로모터에 의해 제어된다 (Swaminathan and Thimmapaya, The Molecular Repertoire of Adenoviruses III: Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol 199, 177-194, Springer Verlag 1995). 또한, E1A 및 E1B-55kDa 단백질과 합쳐진 E4 영역의 산물은 E2F의 활성 및 p53의 안정성에 중요한 역할을 한다. 예컨대, 상기 프로모터는 E4 영역에 의해 코딩된 E4orf6/7 단백질이 E2F 및 DP1으로 구성된 헤테로다이머와 직접 상호작용하는 것에 의해 더욱 더 활성화된다 (Swaminathan and Thimmapaya, JBC 258, 736-746, 1996). 또한 p53은 분해 감염 주기를 성공적으로 완성하기 위하여 E1B-55kDa 및 E4orf6으로 구성된 복합체에 의해 불활성화된다 (Steegena, W. T. 등, Oncogene 16, 349-357, 1998). 또한, E1B-55kDa 단백질은 E4orf6 단백질과의 상호작용에 의하여 핵으로부터 바이러스 RNA의 전달을 증진시키기 때문에 지금까지 중요한 기능을 나타내는 반면에, 세포 고유의 RNA는 핵내에 유지된다 (Bridge and Ketner, Virology 174, 345-353, 1990). 더욱 중요한 발견은 E1B-55kDa/E4orf6으로 구성된 단백질 복합체가 소위 "바이러스 봉입체"에 위치하는 것이다. 이들 구조는 복제 및 전사 부위로 추정된다 (Ornelles and Shenk, J. Virology 65, 424-429, 1991).
복제 및 특히 아데노바이러스의 방출에 중요한 다른 영역은 E3 영역이다. E3 영역은 보다 특히 시험관에서 아데노바이러스 감염 주기에 필수적이지 않은 비교적 소형인 다수의 단백질에 대한 유전자 정보를 포함하므로, 세포 배양에 필수적 인 것은 아니다. 그러나, 이들은 면역 조절 및 세포자살 기능을 갖기 때문에 생체내에서 급성 및/또는 잠재적 감염동안 바이러스의 생존에 중요한 역할을 한다 (Marshall S. Horwitz, Virologie, 279, 1-8, 2001; Russell, 상동). 약 11.6 kDa 크기를 갖는 단백질은 세포 치사를 유발한다. 단백질은 그의 작용으로 인하여 ADP - 아데노바이러스 치사 단백질-이라 칭한다(Tollefson, J. Virology, 70, 2296-2306, 1996). 단백질은 감염 주기의 후기 상에서 주로 형성된다. 또한 단백질의 과발현은 감염 세포의 분해를 더 잘 유발한다(Doronin 등, J. Virology, 74, 6147-6155, 2000).
또한, E1 결실 바이러스, 즉 12S E1A 단백질을 갖지 않고 13S E1A 단백질을 발현하지 않는 바이러스는 더 높은 MOI(Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981)에서 효과적으로 복제할 수 있지만, 임상적 적용에 사용될 수 없다는 것은 본 발명자에게 공지되어 있다. 이러한 현상을 문헌에는 "E1A-유사 활성"이라 칭한다. E1A에 의해 코딩된 5개 단백질로부터, 2개 단백질, 즉 12S 및 13S 단백질은 다른 아데노바이러스 유전자의 발현을 제어하고 또 유발한다 (Nevins, J. R., Cell 26, 213-220, 1981; Boulanger, P. and Blair, E.; Biochem. J. 275, 281-299, 1991). 이와 관련하여, 13S 단백질의 CR3 영역에 의해 트랜스활성화 작용이 주로 제공된다는 것이 알려졌다 (Wong HK und Ziff EB., J Virol., 68, 4910-20, 1994). 13S 단백질의 CR1 및/또는 CR2 영역 및/또는 CR3 영역에서의 특정 결실을 갖는 아데노바이러스는 가장 복제 결핍적이지만, 일부 세포주에서는 바이러스 유전자 및 프로모터, 특히 E2 영역을 트랜스활성화한다 (Wong HK, Ziff EB., J Virol. 68, 4910-20, 1994; Mymryk, J. S. and Bayley, S. T., Virus Research 33, 89-97, 1994).
야생형 아데노바이러스를 사용하여 세포, 전형적으로 종양 세포를 감염시킨 후, 핵에 YB-1을 유발하며, 이는 E1A, E1B-55K 및 E4orf6에 의해 매개되고 바이러스 봉입체내의 핵에 있는 E1B-55K와 함께 공동 배치되어 시험관내 및 생체내에서 세포 핵에서 바이러스의 효과적인 복제를 허용한다. 이와 관련하여, E4orf6은 E1B-55K에 결합(Weigel, S and Dobbelstein, M. J. Virology, 74, 764-772, 2000; Keith N. Leppard, Seminars in Virology, 8, 301-307, 1998)하며 그렇게하여 E1B-55K의 핵으로의 전달과 분포를 매개하며, 최적 바이러스 생산과 아데노바이러스 복제를 제공한다는 것은 일찍이 밝혀져 있었다. E1A, E1B-55K 및 YB-1의 상호작용으로 인하여 본 발명에 따른 바이러스의 효과적인 복제가 가능해졌고 또 E1B-55K/E4orf6 및 YB-1으로 구성된 복합체 및 소위 바이러스 봉입체내의 핵에서 YB-1 및 E1B-55K의 공동 존재에 의해 및 YB-1 핵-양성인 세포에서 복제를 위해 및 질병의 치료용 의약의 제조를 위해 상기 기재된 바이러스를 사용하는 것에 의해, YB-1 핵-양성 세포가 관여한다. 이러한 세포 배경에 의해 가능한 복제는 세포의 분해, 바이러스의 방출 및 인접 세포의 감염 및 분해를 초래하므로, 종양 세포 및 종양 감염의 경우, 마침내 종양의 분해, 즉 암분해가 생긴다.
YB-1은 인버트된 CAAT 서열, 소위 Y-박스에 결합되는 고도로 보존되는 인자 그룹에 속한다. 이들은 전사레벨 뿐만 아니라 번역 레벨에서 조절되는 방식으로 활성일 수 있다(Wolffe, A. P. Trends in Cell Biology 8, 318-323, 1998). 점점 증가하는 수의 Y-박스 의존적 조절 경로가 활성화에서 뿐만 아니라 성장 억제 및 세포자살 관련 유전자에서 밝혀지고 있다 (Swamynathan, S. K. 등, FASEB J. 12, 515-522, 1998). 따라서, YB-1은 직접적으로 p53과 상호작용(Okamoto, T. 등, Oncogene 19, 6194-6202, 2000)하고, Fas의 유전자 발현 (Lasham, A. 등, Gene 252, 1-13, 2000), MDR 및 MRP 유전자 발현(Stein, U. 등, JBC 276, 28562-69, 2001; Bargou, R. C. 등, Nature Medicine 3, 447-450, 1997) 및 토포아이소머라제 및 메탈로프로테이나제의 활성화(Mertens. P.R. 등, JBC 272, 22905-22912, 1997; Shibao, K. 등, Int. J. Cancer 83, 732-737, 1999)에 중요한 역할을 한다. 또한, YB-1은 mRNA 안정성의 조절(Chen, C-Y 등, Genes & Development 14, 1236-1248,2000) 및 수선 과정(Ohga, T. 등, Cancer Res. 56, 4224-4228, 1996)에도 관여한다.
종양 세포에서 YB-1의 핵내 존재는 E1A 독립적 바이러스 복제를 유발하고, 12S E1A 단백질 및 13S E1A 단백질 모두 발현 형태로 존재하지 않으므로 다약제 내성(복수 내성)에서 단백질 YB-1의 발현의 경우에 각각 사용된다(Holm, P.S. 등, JBC 277, 10427-10434, 2002). 또한, E4orf6 및 E1B-55K와 같은 아데노바이러스 단백질은 바이러스 복제에 대하여 양성 효과를 갖고 기능적 E1A 단백질이 다른 바이러스 유전자 산물(E4orf6, E3ADP 및 E1B-55K)상에서 스위칭하는데 관여한다(Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981)는 것은 공지되어 있다. 그러나, 이러한 것은 13S E1A 단백질이 존재하지 않는 종래 기술의 E1A-마이너스 아데노바이러스를 사용해서는 생기지 않는다. 핵내에 YB-1을 갖는 다약제 내성 세포에서 YB-1의 핵내 존재는 E1A-마이너스 바이러스의 복제 및 입자 형성을 각각 제공한다. 그러나, 이 경우, 바이러스 복제 및 입자 형성의 효율은 야생형 Ad5와 비교하여 몇 배 정도 감소된다. 종양 세포의 핵에 이미 존재하거나, 또는 외부 인자에 의해 종양 세포에 도입된(예컨대 세포증식억제성 약물의 투여 또는 조사 또는 온열요법) YB-1의 조합은 세포 주기와는 독립적으로 핵내에 존재하게 되거나, 벡터를 통하여 형질전환 유전자로서 계, 바람직하게는 아데노바이러스 계에 도입되어 아데노바이러스 유전자상에 스위칭하지만 바이러스 복제는 허용하지 않으며, 아주 효과적인 바이러스 복제 및 입자 형성을 YB-1를 통하여 매개해서 암분해를 제공하는 계인 것으로 놀랍게도 밝혀졌다. 적합한 세포증식억제성 약물은 다음 군에 속하는 것들이다: 다우노마이신 및 아드리아마이신과 같은 안트라시클린; 시클로포스파미드와 같은 알킬화제; 에토포시드와 같은 알칼로이드; 빈크리스틴 및 빈블라스틴과 같은 빈-알칼로이드; 예컨대 5-플루오로우라실 및 메토트렉세이트와 같은 항대사물질; 예컨대 시스-플라틴과 같은 플라틴 유도체; 캄포테신과 같은 토포아이소머라제; 및 예컨대 탁솔과 같은 탁산이다. YB-1 핵-양성 세포에서만 복제할 수 있는 본 명세서에 기재된 아데노바이러스, 특히 재조합 아데노바이러스는 상응하는 야생형 아데노바이러스, 특히 야생형 Ad5의 트랜스활성화 능력과 비교하여, 바이러스 유전자 E1B-55K, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP를 트랜스활성화하는 능력에 있어서 제한된다. 본 발명자들은 놀랍게도 이들 제한된 트랜스활성화 능력이, YB-1의 핵내 존재와 조합하여 발현되는 상응하는 유전자, 특히 E1B-55K 및 E4orf6에 의해, 보상될 수 있음을 밝혀내었다. 이하의 실시예에 나타낸 바와 같이, 바이러스 복제 및 입자 형성은 그러한 조건하에서 야생형 아데노바이러스의 복제 및 입자 형성 특성에 필적하는 수준 으로 증가된다.
본 발명에 기재된 아데노바이러스가 본 발명에 따라 사용되어 제조된 의약은 전신적으로 투여되지만 그러한 의약을 국소적으로 도포하거나 투약하는 것도 본 발명에 속한다. 이러한 도포는 상기 세포가 아데노바이러스에 감염되고, 특히 이들 세포에서 복제가 생길 때 통상의 방식으로 조건의 형성, 특히 질병의 진단 및/또는 예방 및/또는 치료에 본 발명에 따른 의약이 사용되게 하는 의도에 따라 도포한다.
이러한 의약은 종양 질병의 치료에 바람직하다. 종양 질병 중에서 종양 질병에 기초한 메카니즘으로 인하여, 특히 병인학적 메카니즘에 의해, 핵에 YB-1가 이미 존재하거나 또는 핵내에서 YB-1의 존재가 외인성 수단에 의해 유발되는 질병이 바람직하며, 상기 수단은 YB-1을 핵으로 전달하여 그곳에서 YB-1을 유도하여 YB-1을 발현시키기에 적합하다. 본 발명에서 사용된 용어 종양 또는 종양질병은 악성 뿐만 아니라 양성 종양 및 그에 따른 질병을 포함한다. 본 발명의 의약은 적어도 1개의 약제학적 활성 화합물을 더 포함할 수 있다. 이러한 추가의 약제학적 활성 화합물의 종류 및 양은 의약을 사용할 목적에 따라 다를 것이다. 종양 질병의 치료 및/또는 예방을 위해 상기 의약을 사용하는 경우, 시스-플라틴 및 탁솔, 다우노블라스틴, 다우노루비신, 아드리아마이신 및/또는 미토크산트론 또는 다른 종류의 세포증식억제성 약물 또는 본 명세서에 제시된 세포증식억제성 약물이 사용된다.
본 발명에 따른 의약은 다양한 조제로 존재할 수 있고, 바람직하게는 액체 형태이다. 또한 본 발명의 의약은 안정화제, 완충제, 방부제 및 약제학적 제제 분야의 당업자에게 공지된 다른 물질을 함유할 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따라서 여기서 기재된 바이러스는 세포 주기로부터 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는 종양에 높은 성공률로 도포될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 보통, YB-1은 세포질, 특히 핵주위 형질에 존재한다. 세포 주기의 S-상 동안, YB-1은 보통 세포 뿐만 아니라 종양 세포의 세포 핵에서 찾아 볼 수 있다. 그러나, 이것은 변형된 아데노바이러스를 사용한 바이러스 암분해를 제공하기에 충분하지 않다. 종래 기술에 기재된 약화된 아데노바이러스의 비교적 적은 효율은 자신의 잘못된 출원을 기초로 하고 있다. 다시말해, 이러한 아데노바이러스 계는 증가된 효율로 사용될 수 있고, 바이러스 암 분해에 대한 분자 생물학적 요건은 여기서 기재된 바와 같은 약화되거나 변형된 바이러스를 투여할 때 제공된다. AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB016, dl520 및 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 재조합 아데노바이러스와 같은 본 발명에 따라서 사용될 상술한 아데노바이러스의 경우, 세포가 세포 주기와 독립적으로 YB-1의 핵내 존재를 나타내는 종양 질병의 경우에 필요조건이 주어진다. 이러한 핵내 존재 형태는 종양 자체의 종류에 의해 유발되거나 또는 여기서 기재한 본 발명에 따른 수단 또는 물질에 의해 유발될 수 있다. 따라서 본 발명은 종양 및 종양 질병의 새로운 그룹, 및 본 발명에 따른 바이러스에 의해 성공적으로 치료될 수 있는 환자, 특히 종래 기술에 기재된 약화되거나 변형된 아데노바이러스로도 치료될 수 있는 환자의 새로운 그룹을 정의한다.
일부가 공지되어 있고 본 발명에 따라 사용될 수 있는 아데노바이러스를 사용하거나, 또는 본 명세서에 처음으로 기재된 아데노바이러스, 특히 E1A 단백질에 서 돌연변이 및 결실을 갖고, Rb/E2f의 결합을 방해하지 않지만 YB-1 핵-음성 세포에서 복제되지 않거나 또는 여기서 정의된 바와 같이 각기 강하게 감소된 복제를 나타내거나 및/또는 결실된 암단백질, 특히 E1A인 아데노바이러스, 예컨대 바이러스 AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB106 및 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스를 사용하여 본 발명에 따라 치료될 수 있는 환자 그룹은 분명한 조건을 가하거나 실현함으로써 YB-1이 핵으로 이동해가거나 또는 유발되거나 또는 전달되게하는 환자이다. 환자 그룹과 관련하여 이러한 아데노바이러스를 사용하는 것은 바이러스 복제의 유도가 YB-1의 핵내 존재에 이어 YB-1가 E2-후기 프로모터에 결합하는 것에 기초로 한다. 여기서 기재된 발견으로 인하여, AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB106와 같은 아데노바이러스 및 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스는 YB-1 핵-양성인 세포 및/또는 YB-1이 본 발명에서 정의된 바와 같은 통제를 벗어난 세포에서 복제될 수 있다. 지금까지, 본 발명에 따른 이들 아데노바이러스는 이들 특징을 갖는 세포를 포함하고, 특히 상기 세포가 치료될 각 질병의 형성에 관여하는 환자 그룹 및 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖거나 또는 본 발명의 기재 내용에서 YB-1이 통제를 벗어난 본 발명에 종양의 치료를 위해 AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB106 및 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스의 성공의 기초이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 것으로 기재된 아데노바이러스를 사용하고 또 본 명세서에 처음으로 기재된 바이러스, 특히 아데노바이러스를 사용하여 본 발명에 따라 치료될 수 있는 환자의 그룹은 YB-1 핵-양성인 환자 및/또는 이하 에 기재된 치료, 바람직하게는 의과적 치료의 결과로서 YB-1 핵-양성인 환자 및/또는 각 바이러스를 연속적으로 투여하는 치료를 받은 환자이다. 본 발명에서 YB-1 핵-양성 환자는 종양을 형성하는 다수의 세포에서 세포 주기와 독립적으로 핵내에 YB-1을 갖는 환자이다. 이들 중에서 치료는 종양 요법에 사용되는 것으로 기재된 세포증식 억제성 약물을 투여하는 것이다. 또한, 방사선, 바람직하게는 종양 요법에서 이용되는 방사선은 상기 치료 그룹에 속한다. 방사선은 고에너지 방사선, 바람직하게는 방사활성 방사선, 바람직하게는 종양 요법에 사용되는 것과 같은 방사선을 의미한다. 온열요법 및 온열요법의 적용, 바람직하게는 종양 요법에 이용되는 것과 같은 온열요법 또한 다른 치료법이다. 특히 바람직한 구체예로서, 온열요법은 국소적으로 도포된다. 마지막으로, 호르몬 치료, 특히 종양 요법에 이용되는 것과 같은 호르몬 치료도 다른 치료법이다. 이러한 호르몬 치료와 관련하여, 항-에스테로겐 및/또는 항-안드로겐이 사용된다. 타목시펜과 같은 항에스트로겐은 유방암의 치료에 사용되고 또 플루타미드 또는 시프로테론 아세테이트와 같은 항-안드로겐은 전립선암 치료에 사용된다.
본 발명에서 종양을 형성하는 일부 세포는 본래 또는 핵으로의 유도 및 활성 도입후에 YB-1을 포함하거나, 본 명세서에 기재된 의미로 통제를 벗어난 YB-1을 포함한다. 바람직하게는 종양 형성 세포의 약 5% 또는 그 이상, 즉 6%, 7%, 8%는 YB-1 핵-양성 세포이거나 또는 YB-1이 통제를 벗어난 방식으로 존재하는 세포이다. YB-1의 핵내 존재는 외부로부터 인가된 스트레스에 의해 또는 국소적으로 도포된 스트레스에 의해 유도될 수 있다. 이러한 유도는 예컨대 방사선에 의해, 특히 UV 방사선, 세포증식억제성 약물의 투여 및 본 명세서에 이미 기재한 바와 같이 온열요법의 적용에 의해 생길 수 있다. 이와 관련하여, 온열요법은 아주 특이적 방식으로, 보다 특히 국소적으로 아주 특이한 방식으로 실현될 수 있으며 세포 핵에서 YB-1의 특정 핵내 존재를 제공할 수 있으며, 그에 의해 아데노바이러스의 복제 및 세포 및 종양 분해의 필수요건을 제공하며, 바람직하게는 국소적으로 제한된다 (Stein U, Jurchott K, Walther W, Bergmann S, Schlag PM, Royer HD. J Biol Chem. 2001, 276 (30): 28562-9; Hu Z, Jin S, Scotto KW. J Biol Chem. 2000 Jan 28; 275(4): 2979-85; Ohga T, Uchiumi T, Makino Y, Koike K, Wada M, Kuwano M, Kohno K. J Biol Chem. 1998, 273(11): 5997-6000).
본 발명에 따른 의약은 또한 환자 또는 환자 그룹에 투여될 수 있거나 또는 바람직하게는 각 종양 세포에서 적합한 예비치료 또는 동시 치료를 통하여 YB-1의 전달이 영향을 받는 환자에게 투여될 수 있다.
상기 기술내용을 기초로, 당업자들은 자신의 기술범위내에서 E1A에 대해 적합한 변형을 실시할 수 있으며, 예컨대 본 발명에 따라 사용될 수 있는 아데노바이러스의 다양한 구체예를 생성하기 위하여 결실 또는 점 돌연변이를 포함할 수 있다.
상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 사용되는 아데노바이러스는 핵내에 YB-1를 갖는 세포 및 세포 계에서 복제될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 아데노바이러스가 복제될 수 있고 종양을 분해시킬 수 있는지에 대한 의문에 답하기 위하여, Rb, 즉 망막모세포종 종양 억제제 산물의 존재 또는 부재에 대한 세포의 상태 는 무관하다. 상기 아데노바이러스의 본 발명에 따른 용도와 관련하여 감염 세포, 감염될 세포 또는 치료될 세포의 p53 상태를 고려하는 것은 필수적인 것은 아니며, YB-1 핵-양성 세포, 즉 세포 주기와 무관하게 핵에서 YB-1를 갖는 세포와 관련하여 본 명세서에 기재된 아데노바이러스를 사용함으로써, 상기 p53 상태 뿐만 아니라 Rb 상태는 본 명세서에 기재된 기술 작용에 영향을 갖지 않는다.
암유전자 및 암유전자 단백질, 특히 E1A는 고유한 천연 아데노바이러스 프로모터의 제어하에 있을 수 있거나 및/또는 종양 또는 조직특이적 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 적합한 비-아데노바이러스 프로모터는 사이토메갈로바이러스 프로모터, RSV (라우스 육종 바이러스) 프로모터, 아데노바이러스-기제 프로모터 Va I 및 비-바이러스 YB-1 프로모터(Makino Y. 등, Nucleic Acids Res. 1996, 15, 1873-1878)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 프로모터는 텔로머라제 프로모터, 알파-페토프로테인 (AFP) 프로모터, 암배아 항원 (CEA) 프로모터 (Cao, G., Kuriyama, S., Gao, J., Mitoro, A., Cui, L, Nakatani, T., Zhang, X., Kikukawa, M., Pan, X., Fukui, H., Qi, Z. Int. J. Cancer, 78, 242-247, 1998), L-플라스틴 프로모터 (Chung, I., Schwartz, PE., Crystal, RC., Pizzorno, G, Leavitt, J., Deisseroth, AB. Cancer Gene Therapy, 6, 99-106, 1999), 아르기닌 바소프레신 프로모터 (Coulson, JM, Staley, J., Woll, PJ. British J. Cancer, 80, 1935-1944, 1999), E2f 프로모터 (Tsukada 등, Cancer Res., 62, 3428-3477), 우로플라킨 II 프로모터 (Zhang 등, Cancer Res., 62, 3743-3750, 2002) 및 PSA 프로모터 (Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C, Golightly, D., Stewart, D., Lin, J., Phipps, S., Chiang, YL. Human Gene Therapy, 10, 1721-1733, 1999)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한 독일 특허출원 DE 101 50 984.7에 기재된 바와 같은 아데노바이러스의 YB-1 의존적 E2-후기 프로모터는 본 발명에 사용될 수 있는 프로모터이다.
텔로머라제 프로모터는 인간 세포에서 아주 중요하다는 것은 공지되어 있다. 따라서, 텔로머라제 활성은 효소의 촉매적 서브유닛인 테로머라제 역전사효소 유전자(hTERT)의 전사적 제어를 통하여 조절된다. 텔로머라제의 발현은 인간 종양 세포의 85%에서 활성이다. 이와 대조적으로, 이것은 대부분의 정상 세포에서 불활성이다. 그 예외가 병균 세포 및 배아 조직이다(Braunstein, I. 등, Cancer Research, 61, 5529-5536, 2001; Majumdar, A.S. 등, Gene Therapy 8, 568-578, 2001). hTERT 프로모터에 대한 더욱 자세한 연구는 개시 코돈으로부터 떨어져 있는 프모모터 283 bp 내지 82 bp의 단편이 종양 세포에서 특정 발현에 충분하다는 것을 밝혀내었다 (Braunstein I. 등; Majumdar AS 등, 상동). 따라서, 상기 프로모터 및 상기 특정 단편은 각각 유전자, 특히 형질전환 유전자, 바람직하게는 본 명세서에 기재된 형질전환 유전자중의 하나를 종양세포에서만 발현하기에 적합하다. 프로모터는 변형된 암유전자, 바람직하게는 E1A 암유전자 단백질이 종양 세포에서만 발현되게 한다. 바람직한 구체예로서, 형질전환 유전자, 특히 E4orf6, E1B55kDa, ADP 및 YB-1를 포함하는 군으로부터 선택된 하나의 아데노바이러스 벡터에서의 발현은 이들 프로모터의 제어하에 있다. 본 발명에서 암유전자 단백질, 특히 E1A 단백질의 트랜스활성화의 오픈 리딩 프레임은 아데노바이러스 계의 유전자 산물의 1개 또는 몇 개를 갖는 프레임에 존재한다. E1A 단백질을 트랜스활성화하는 오픈 리딩 프레임은 서로 독립적일 수 있다.
분해를 위해 본 명세서에 기재된 아데노바이러스가 본 발명에 따라 사용되는 세포의 특징은 내성, 바람직하게는 다약제 내성 또는 복수 내성이다. 본 명세서에 서 이용된 것과 같은 내성은 본 명세서에 기재된 세포증식억제성 약물에 대한 내성을 지칭한다. 다약제 내성은 바람직하게는 각 세포를 결정하는 마커로서 사용될 수 있고 또 그러한 다약제 내성을 갖는 환자 그룹 및 종양에 대해 사용될 수 있는 막-결합형 전달 단백질 P-당단백질의 발현, 바람직하게는 과발현과 관련이 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 내성은 전통적인 내성으로 불리는 P-당단백질 매개 내성 뿐만 아니라 MRP를 통하여 매개된 내성을 포함하는 비전형적 내성, 또는 비-P-당단백질 매개 내성을 포함한다. YB-1의 발현과 상관관계가 있는 다른 마커는 토포아이소머라제 II 알파이다. 지금까지, 환자가 본 발명에 따른 아데노바이러스를 사용하여 성공적으로 치료될 수 있을지 여부를 결정하기 위한 스크리닝에서, 토포아이소머라제 II 알파의 발현은 핵에서 YB-1의 결정 대신 또는 그와 더불어 사용될 수 있다. 동일한 방식으로 P-당단백질로서 사용될 수 있는 마커는 MRP 이다. 적어도 결장직장암 세포 또는 결장직장암 환자에 관한 한 마커는 PCNA (증식 세포 핵 항원) 이다 (Hasan S. 등, Nature, 15, 387-391, 2001). 마지막으로, MDR(다약제 내성)의 발현은 적어도 유방암 세포 및 골육종 세포에 대한 상술한 의미(Oda Y 등, Clin. Cancer Res., 4, 2273-2277, 1998)의 마커이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 가능한 마커는 p73 (Kamiya, M., Nakazatp, Y., J Neuroncology 59, 143-149 (2002); Stiewe 등, J. Biol. Chem., 278, 14230-14236, 2003) 이다.
본 발명에 기재된 바와 같이 임상적 의미로 더 이상 치료가 불가능하게 보이는 경우, 종래 기술의 방법에 따른 종양 질병의 다른 치료는 성공을 기대할 수 없는 경우, 특히 세포증식억제성 약물의 사용이 더 이상 가능하지 않고 종양에 영향을 주거나 종양을 감소시키는 의미에서 더 이상 성공적으로 실시될 수 없는 경우, 본 발명에 따른 아데노바이러스를 사용하여 환자를 치료할 수 있다는 것은 본 발명의 특히 유리한 특징이다. 본 명세서에서 용어 종양은 일반적으로 핵내에 고유하게 YB-1을 함유하거나 본 명세서에 기재된 외인성 수단을 가한 결과로서 세포 주기와는 독립적으로 핵내에 YB-1을 함유하는 종양 또는 암 질환을 지칭한다.
또한, 본 명세서에 기재된 바이러스는 일반적으로 종양 치료에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 종양은 유방암, 난소육종, 전립선암, 골육종, 교모세포종, 흑색종, 소형 세포 폐암 및 결장직장암을 포함하는 군으로부터 선택된다. 다른 종양은 본 명세서에 기재된 바와 같은 내성을 갖는 종양, 바람직하게는 복수 내성을 갖는 종양, 특히 상술한 그룹의 종양이다.
본 발명은 다른 요지로서 변형된 아데노바이러스중의 하나, 즉 AdΔ24, dl922-947, E1Ad/01/07, CB106 및 유럽특허 EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스와 같은 본 발명에 따라 사용되는 것과 같은 아데노바이러스를 사용하여 치료될 수 있는 환자의 스크리닝 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음 단계
- 종양 조직의 샘플을 조사하는 단계, 및
- YB-1이 세포 주기와 독립적으로 핵내에 존재하는지 여부를 측정하는 단계.
상술한 마커의 존재는 YB-1 대신 또는 YB-1와 더불어 검출될 수 있다.
종양 조직 또는 그의 일부가 세포 주기와는 독립적으로 핵내에 YB-1을 포함하는 경우, 본 명세서에 기재된 아데노바이러스는 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 구체예로서, 종양 조직의 검사는 YB-1에 대한 항체, YB-1에 대한 앱타머 및 YB-1에 대한 스피겔머 및 YB-1에 대한 안티칼린을 포함하는 군으로부터 선택된 물질을 사용함으로써 실시된다. 기본적으로, 상응하는 마커에 대해 동일한 수단을 이용하여 사용한다. 항체, 특히 모노클로날 항체의 제조는 당업자에게 공지되어 있다. YB-1 또는 마커의 특정 검출을 위한 수단은 표적 구조에 높은 친화력으로 결합되는 펩티드로서, 이 경우 YB-1 또는 상기 마커이다. 종래 기술에는 그러한 펩티드를 생성하기 위해 상-표시와 같은 방법이 공지되어 있다. 전형적으로, 펩티드 라이브러리는 출발점이 되고 있으며, 개별 펩티드는 8 내지 20개 아미노산 길이를 갖고 또 라이브러리의 크기는 약 102 내지 1018, 바람직하게는 10 8 내지 1015 의 상이한 펩티드이다. 폴리펩티드에 결합되는 표적 분자의 특수 형태는 독일 특허출원 DE 197 42 706호에 기재된 소위 안티칼린이다.
YB-1 또는 본 명세서에 기재된 상응하는 마커의 특정 결합을 위한 수단 및 세포핵에서 YB-1의 세포 주기 독립적 위치의 검출을 위한 수단은 소위 앱타머, 즉 단일 가닥 또는 이중가닥의 RNA 또는 DNA로 존재하는 D-핵산이고 이것은 표적 분자에 특이적으로 결합한다. 앱타머의 생산은 유럽 특허 EP 0 533 838호에 기재되어 있다. 특정 형태의 앱타머는 소위 앱타자임이며, Piganeau, N. 등 (2000), Angew. Chem. Int. Ed., 39, 29, page 4369-4373에 의해 기재되어 있다. 이들은 지금까지 앱타머의 특수한 구체예이며, 이는 이들이 앱타머 부분과는 별도로 리보자임 부분의 일부를 포함하며 앱타머 부분에 결합되는 표적 분자의 결합 또는 방출시 촉매적 활성을 얻을 수 있고 또 신호의 생성과 함께 핵산 기질을 절단할 수 있기 때문이다.
앱타머의 다른 형태는 소위 스피겔머, 즉 L-핵산으로 제조된 표적 분자 결합 핵산이다. 이러한 스피겔머의 제조방법은 예컨대 WO 98/08856호에 기재되어 있다.
종양 조직의 샘플은 구멍을 내거나 수술을 통하여 얻을 수 있다. YB-1이 세포 주기와 독립적으로 핵내에 존재하는지 여부의 평가는 현미경 수법 및/또는 이뮤노 조직분석을 이용하여, 바람직하게는 항체를 사용하거나 또는 상술한 다른 수단을 이용하여 흔히 실시된다. 핵내 YB-1을 검출하거나 YB-1이 세포 주기와는 독립적으로 존재하는지를 검출하기 위한 수단은 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, YB-1의 존재화는 이들을 스크리닝할 때 염색된 조직 부분에서 용이하게 검출될 수 있다. 핵내 YB-1의 존재 빈도는 상기 존재가 세포 주기와는 독립적이라는 것을 이미 보여준다. 핵내의 YB-1을 세포 주기 독립적으로 검출하기 위한 다른 선택은 YB-1에 대한 염색에 존재하며 YB-1이 핵내에 존재하는지 여부를 검출하고 상기 세포의 상으로부터 결정화 및 세포의 상을 결정하는데 존재한다. YB-1을 검출하는 것은 YB-1에 대한 상술한 수단을 이용하는 것에 의해 실시될 수 있다. 검출 수단은 당업자에게 공지된 방법에 의해 실시한다. YB-1에 특이적으로 결합되고 분석될 샘플내 의 다른 구조, 특히 세포와는 결합하지 않는 상기 물질에 의하여, 이들의 존재 및 이들의 YB-1에 대한 특이적 결합으로 인하여 YB-1의 존재가 적합한 라벨링 수단에 의해 검출되고 확인될 수 있다. 상기 라벨링 수단의 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
이하에서 본 발명을 도면과 샘플을 참조하여 더욱 자세하게 설명하며, 그로부터 새로운 특징, 구체예 및 이점을 취할 수 있다.
도 1은 야생형 아데노바이러스 및 아데노바이러스 dl520 의 야생형 아데노바이러스의 E1/E3-결실 아데노바이러스인 AdE1/E3-마이너스로 불리는 아데노바이러스 벡터의 구조를 도시한다.
도 2는 p300, p107 및 p105의 결합에 관하여 E1A 단백질의 결합 도메인을 도시한다.
도 3은 E1/E3-마이너스 Ad5 으로 불리는 El/E3-결실 아데노바이러스 Ad5 및 dl520을 사용하여 감염시킨 후 핵내에서 YB-1을 갖지 않는 U20S 세포를 도시한다.
도 4는 E1/E3-마이너스 Ad5 으로 불리는 El/E3-결실 아데노바이러스 Ad5 및 dl520을 사용하여 감염시킨 후 핵내에서 YB-1을 갖는 257RDB 세포를 도시한다.
도 5는 아데노바이러스 dl1119/1131을 사용하여 감염시킨 후 257RDB 세포 및 U2OS 세포를 도시한다.
도 6은 YB-1이 다약제 내성 세포 및 세포주 257RDB, 181 RDB, MCF-7Ad에 각각 존재하는 반면에 YB-1은 U2OS 및 HeLa 세포의 핵에서는 존재하지 않음을 확인시 켜 주는 EMSA 분석의 결과를 도시한다.
도 7은 야생형 아데노바이러스, 아데노바이러스 dl520 및 아데노바이러스 dl1119/1131의 E1A 단백질의 구조를 도시한다.
도 8은 부가적으로 발현된 바이러스 단백질의 존재하에서 아데노바이러스의 복제 효율을 절대치로 나타내는 칼럼 다이아그램이다.
도 9는 부가적으로 발현된 바이러스 단백질의 존재하에서 아데노바이러스의 복제 효율의 증가를 도시하는 칼럼 다이아그램이다.
도 10은 크리스탈 바이올렛 염색하고 dl520을 사용하여 10 및 30 pfu/세포로 감염시킨 후 다우노루비신이 투여되지 않은 대조용(K)과 ml당 40 ng의 다우노루비신이 투여된 U2OS 세포가 생장한 웰을 도시한다.
도 11은 크리스탈 바이올렛 염색하고 dl520을 사용하여 10 및 30 pfu/세포로 감염시킨 후 다우노루비신이 투여되지 않은 대조용(K)과 ml당 40 ng의 다우노루비신이 투여된 HeLa 세포가 생장한 웰을 도시한다.
도 12는 PBS 및 dl520으로 처리한 후 시간 함수로 상이한 기원(RDB257 및 HeLa)의 종양의 종양 부피를 도시하는 다이아그램이다.
도 13은 PBS 및 dl520으로 처리한 후 RDB257 세포를 기본하여 종양을 형성한 시간 함수로 상이한 기원(RDB257 및 HeLa)의 종양의 종양 부피를 도시하는 다이아그램이다.
도 14는 dl520으로 감염된 후 RDB257 세포 및 HeLa 세포의 세포 추출액(피하적으로 생장한 종양의)을 서던 블럿 분석한 결과를 도시한다.
도 15는 YB-1 핵-양성 종양 세포 (257RDB 및 181RDB) 및 YB-1 핵-음성 종양 세포(HeLa, U2OS)에서 dl520 및 야생형 아데노바이러스의 복제 효율 및 입자 형성을 각각 도시하는 칼럼 다이아그램이다.
도 16은 야생형 아데노바이러스 및 아데노바이러스 벡터 AdXvir03의 구조를 도시한다.
도 17은 아데노바이러스 벡터 AdXvir03/01의 구조를 도시한다.
도 18A 및 도 18B는 바이올렛 염색하고 Ad312 (20 pfu/세포), Xvir03 (5 pfu/세포)을 감염시키고 대조용(비-감염)을 사용하고, 감염된 지 5일 후에 크리스탈 바이올렛 염색을 실시하여 181RDB 세포 (도18A) 및 272RDB 세포(도18B)와 생장한 웰을 도시한다.
실시예 1: 본 발명에 따라 사용되는 아데노바이러스에 포함될 수 있는 E1A 변형 유형
도 1은 아데노바이러스 벡터 AdE1/E3-마이너스, 즉 E1/E3-결실 아데노바이러스, 야생형 아데노바이러스 및 아데노바이러스 dl520의 구조를 도시한다.
아데노바이러스 AdE1/E3-마이너스는 E1A의 기능 또는 기능적 E1B 또는 E3을 코딩하는 영역을 갖지 않아 독성 대조용으로 본 실험에 사용된다.
야생형 E1A 유전자는 E1A RNA의 선택적 스플라이싱을 통하여 생성된 총 5개의 단백질을 코딩한다. 그 중에서, 2개의 상이한 단백질, 즉 289 아미노산 단백질 및 243 아미노산 단백질이 생성된다. dl520은 E1A 유전자의 CR3 스트레치에서 결 실을 갖기 때문에 289 아미노산 단백질을 코딩하지 않으며, 따라서 13S 유전자 산물이 결핍되게 된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 아데노바이러스 dl520을 당업자들은 12S-E1A 바이러스로 칭한다. 종래기술에 공지된 아데노바이러스 dl347 (Wong und Ziff, J. Virol., 68, 4910-4920, 1994)은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 12S-E1A 바이러스이다.
13S-E1A mRNA에 의해 암호화된 289 아미노산 단백질에는 다양한 아데노바이러스 서브타입으로 보존되는 3개 영역이 존재한다. 이들을 CR1, CR2 및 CR3이라 칭한다. CR1 및 CR2는 E1A 단백질(E1A 12S 및 E1A 13S), 즉 289 아미노산 단백질 및 243 아미노산 단백질에 존재하는 반면에, CR3 영역은 상술한 2개 단백질중의 더 큰 쪽에만 존재한다.
CR3 영역은 바이러스 유전자, 특히 E1B, E2, E3 및 E4의 활성화에 필요하다. 작은 단백질, 즉 243 아미노산 단백질만을 포함하는 바이러스는 바이러스 유전자를아주 약하게만 트랜스활성화하고 핵내에 YB-1을 갖지 않는 세포에서 아데노바이러스 복제를 촉진하지 않는다. YB-1은 종양 세포내의 핵에만 존재하고 그 곳에서만 검출될 수 있기 때문에, 상기 벡터는 종양-특이적 복제를 유도하기에 적합하다.
dl520 내의 CR3의 결실로 인하여, 상기 아데노바이러스는 세포성 YB-1을 세포핵으로 전위시킬 수 없고, 따라서 YB-1 핵-음성인 세포에서 복제되는 위치에 있지 않아 본 발명에 따라 사용될 수 있는 바이러스이며, 상기 바이러스는 본 발명에 따라 필요한 트랜스활성화를 포함한다.
실시예 2: 세포의 Rb 상태에 따른 아데노바이러스의 활성화 모드
도 2는 p300, p107 및 p105의 결합에 관련된 E1A 단백질의 결합 도메인을 도시한다. p300 뿐만 아니라 p107은 세포 결합 단백질이다. 망막모세포종 단백질(pRb)-종양억제제 단백질-의 결합은 CR1 및 CR2를 통하여 매개된다. 연구에 따르면, pRb 및 p107/p300은 전사 조절에 효과적인 세포성 전사인자 E2F와 조합됨이 밝혀졌다. 야생형 E1A 단백질은 E2F가 Rb에 결합되는 것을 방해한다. 따라서 방출된 E2F는 E2-초기 프로모터에 결합되며 아데노바이러스 복제를 유발한다.
E1A 암단백질에서 특정 결실은, Rb-음성 세포에서 주로 복제될 수 있고 본 발명에 사용될 수 있는 이하에 기재된 것과 같은 재조합 아데노바이러스 벡터를 초래할 수 있음은 종래기술로부터 공지되어 있다. 예컨대, 아데노바이러스 벡터 dl922-947은 CR2 영역에서의 결실(아미노산 위치 122-129)을 포함하고 또 벡터 CB016은 CR1 영역에서의 결실(아미노산 위치 27-80) 및 CR2 영역에서의 결실(아미노산 위치 122-129)을 포함한다. 벡터 E1Adl/01/07은 CR2 영역에서의 결실(아미노산 위치 111-123)을 포함한다. 또한 N-말단에서의 부가적 결실(아미노산 위치 4-25)로 인하여, 단백질 p300에 대한 결합이 존재하지 않는다. 아데노바이러스벡터 AdΔ24는 CR2 영역에서의 결실(아미노산 위치 120-127)을 포함한다. EP 0 931 830호에 기재된 아데노바이러스 벡터는 CR1 영역 및 CR2 영역에서의 결실을 포함한다.
E2F/RB의 결합 메카니즘 및 E1A를 통하여 매개된 E2F의 방출은 본 발명의 기초가 되는 메카니즘과는 기본적으로 상이하다. 종래 기술에서 예상한 것과는 달리, 바이러스 복제에 있어서 필수적인, 아주 중요한 것은 Rb 단백질로부터 E2F의 방출이 아니라, 인간 전사 인자 YB-1의 핵내 존재이다. 이러한 전사인자는 정상 세포에서 대부분의 세포 주기에 걸쳐 세포질에만 존재한다. 아데노바이러스와 감염된 후, 특정 조건하에서 핵으로 유도되거나, 분명한 세포 계내에서 핵내에 존재한다. 아데노바이러스에 의해 감염된 후 특정 조건하에서 핵내로 도입되거나 또는 분명한 세포 계, 예컨대 비제한적인 예로서 유방암, 난소암, 전립선압, 골육종, 교모세포종, 흑색종, 소형 세포 폐암 및 결장직장암을 포함하는 분명한 종양 질환에서 핵내에 이미 존재한다.
실시예 3: U2OS 세포의 감염
웰당 100,000개의 U2OS 세포를 플레이팅하였다. 다음 날 세포를 도 3에 도시된 바와 같은 다양한 아데노바이러스로 감염시켰다. 이러한 감염은 500 ㎕ 무혈청 DMEM 배지중, 37℃에서 1시간 동안 실시하였다. 이어, 감염 배지를 제거하고 2 ml 완전 배지(10% FCS/DMEM)로 교체하였다. 3일 후 크리스탈 바이올렛 염색을 이용하여 분석을 실시하였다.
도 3으로부터 알 수 있듯이, 핵내에 YB-1을 갖지 않는 U2OS 세포는, 2개의 상이한 아데노바이러스, 즉 E1/E3-마이너스로도 불리는 E1/E3-결실 아데노바이러스 및 본 발명에 따라 사용될 수 있는 아데노바이러스 dl520에 의해 감염된 후 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 드러나듯이 분해를 나타내지 않는다. 이와 관련하여, 첫째 배지를 제거한다. 이어 세포위에 크리스탈 바이올렛(50% ETOH, 3% 포름알데히드, 5% 아세트산, 1% 크리스탈 바이올렛)을 놓고 실온에서 5 내지 10분간 배양하였 다. 이어, 6개 웰을 갖는 플레이트를 물로 완전히 세정하고 실온에서 건조시켰다.
상기에 의하여 YB-1은 본 발명에 따라 사용되는 바이러스를 유발하기 위해 감염 세포를 분해시키는데 필요하다는 본 발명의 기초를 이루는 발견이 확인되었다.
실시예 4: 257RDB 세포의 감염
웰당 100,000개의 257RDB 세포를 플레이팅하였다. 다음 날 세포를 도 4에 도시된 바와 같은 다양한 아데노바이러스로 감염시켰다. 이러한 감염은 500 ㎕ 무혈청 DMEM 배지중, 37℃에서 1시간 동안 실시하였다. 이어, 감염 배지를 제거하고 2 ml 완전 배지(10% FCS/DMEM)로 교체하였다. 3일 후 크리스탈 바이올렛 염색을 이용하여 분석을 실시하였다.
도 4로부터 알 수 있듯이, E1/E3-결핍된 E1/E3-마이너스로도 불리는 아데노바이러스는 핵내에 YB-1을 갖는 257RDB 세포의 감염시 낮은 감염중복도(MOI)(pfu/세포)에서 분해를 전혀 나타내지 않았다. 대조적으로, 실시예 3에 나타낸 바와 같은 dl520은 YB-1 핵-음성 세포에서 복제되지 않으며 또 동시에 본 발명에 따른 트랜스활성화 암유전자 단백질을 E1A와 함께 코딩하여, 세포당 40 pfu의 MOI(감염 중복도)에서 완전한 분해를 초래하며 또 세포당 10 pfu의 MOI에서도 우세한 분해를 나타낸다. 상기로부터 dl520 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 d11119/1131 또는 AdXvir03과 같은 유사한 바이러스는 임상적 용도를 보증하는 E1-결실된 또는 E1/E3-결실된 아데노바이러스와 비교하여 약 1 등급 정도(10의 인자) 감소된 MOI를 필요로한다고 결론지을 수 있다.
도 7에 도시된 바와 같이, dl520의 E1A 단백질은 그의 CR3 영역이 결실되어 있어 본 발명에 따른 용도에 필요한 트랜스활성화 및 YB-1 핵-양성 세포에서의 복제를 초래한다.
실시예 5: d11119/1131에 의한 257RDB 및 U2OS 세포의 감염
도 5에 도시한 바와 같이, 세포당 20 pfu의 MOI에서 YB-1 핵-음성 U2OS 세포를 E1A 단백질의 아미노산 4-138 및 그를 코딩하는 핵산이 결핍되고 아미노산 218 이후에 중지코돈을 포함하는 아데노바이러스 dl1119/1131에 의한 감염시 분해가 존재하지 않으며, 따라서 발현된 절단 E1A 단백질은 완전한 E1A 단백질의 CR3 영역을 포함한다. 음성 대조용으로서 비감염 세포층을 사용하였다.
대조적으로, 핵내에 YB-1을 함유하는, 즉 YB-1 핵-양성인 257RDB와 같은 세포 계에서 아데노바이러스 dl1119/1131의 영향하에서, 세포당 20 pfu의 MOI인 세포층의 완전한 분해가 관찰되었다. 지금까지 이러한 실시예는 도 7에 도시된 바와 같이 CR3 영역만을 포함하고 또 CR1 영역 및 CR2 영역이 부족한 변형된 E1A 암유전자 단백질은 본 발명에 따른 아데노바이러스의 복제에 필요한 YB-1 핵-양성 세포에서 필요한 트랜스활성화를 제공하여 바이러스 복제를 초래함을 보여주는 다른 증거이다. 아데노바이러스 dl1119/1131은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 아데노바이러스이다. 본 발명에서 바이러스는 CR3 영역에 관하여 dl1119/1131과 유사하게 고안되어 사용될 수 있지만, 대조적으로, CR1 영역 및/또는 CR2 영역을 가질 수 도 있다.
실시예 6: 다약제 내성 세포에서 핵내 YB-1의 검출
본 실시예는 핵내 YB-1은 mdr1 프로모터(다약제 내성 프로모터)내의 Y-박스(CAAT 서열)에 전사인자로서 결합해야한다는 사실을 기초로 하고 있다. 이를 검출하기 위하여, 소위 EMSA 분석(전기영동 이동도 시프트 에세이)을 실시하였다. 이와 관련하여, 핵 단백질을 분리한 다음 1-10 ㎍ 단백질을 짧은 DNA 단편(올리고)과 함께 37℃에서 배양하였다. 핵 YB-1을 결정하기 위하여, 이하의 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다: U2O3에 대조적인 mdr1 프로모터(위치 -86 내지 -67): TGAGGCTGATTGGCTGGGCA (X-박스는 밑줄친다)
상기 DNA 단편은 처리하기 전에 5' 말단에서 32P로 방사능활성으로 라벨링하였다. 이어, 천연 폴리아크릴 아미드 겔에서 분리를 실시하였다. 단백질 YB-1이 올리고뉴클레오타이드 중의 서열에 결합되면, 이것은 검출될 수 있는데 이는 비-결합 올리고뉴클레오타이드는 결합된 올리고뉴클레오타이드에 비하여 겔에서 더 빨리 이동하기 때문이다 (Holm, P.S. 등, JBC 277, 10427-10434, 2002; Bargou, R.C. 등, Nature Medicine 3, 447-450, 1997).
도 6에 도시한 바와 같이, YB-1은 세포주 U2OS 및 HeLa 세포와는 대조적으로, 다약제 내성 세포 257RDB, 181RDB 및 MCF-7Ad 세포의 핵에 존재함을 EMSA 분석으로 나타낼 수 있었다.
실시예 4 및 5에 나타낸 결과는 아데노바이러스 dl520 및 dl1119/1131은 U205와 대조적으로 257RDB와 같은 YB-1 핵-양성 세포에서 복제될 수 있고 그의 분해를 유도함을 확실히 보여준다. 이것은 또한 본 발명에 따른 아데노바이러스의 용도도 또한 확인시켜 준다. 또한, 상기 결과는 야생형 아데노바이러스와 대조적으로, 변형되거나 결실된 E1A 유전자 산물을 통하여 YB-1 핵-양성 세포에서 바이러스 유전자의 약한 트랜스활성화가 핵내에 YB-1가 존재하는 세포내, 예컨대 다약제 내성 세포에서 성공적인 복제와 분해를 유발하며 또 본 명세서에 기재된 아데노바이러스는 이러한 종양의 분해에 사용될 수 있음도 확실히 보여준다.
실시예 7: E1-마이너스 아데노바이러스의 복제 효율의 증가
본 실시예는 초기 바이러스 유전자 E1B-55K 및 E4orf6은 플라스미드 pE4orf6과의 형질감염 및 E1/E3-결실된 아데노바이러스 Ad-55K와의 감염을 통하여 치환될 수 있음을 보여준다. Ad-55K는 E1/E3 결실된 바이러스이므로, E1B-55K는 E1에 클로닝될 수 있고 또 CMV의 제어하에 있다. AdYB-1, 즉 YB-1을 발현하는 아데노바이러스가 이들 초기 유전자를 발현하지 않는 것과 YB-1을 핵내에 함유하는 복제 계에서의 이들 초기 유전자의 치환이 Ad5 유형의 야생형 아데노바이러스에 필적하는 정도로 복제 효율과 입자 형성 효율을 증가시킬 수 있다는 본 발명자들이 인식한 사실을 기초로 할 때 상기와 같은 치환은 필수적인 것이다.
이하와 같이 실시하였다:
리포펙타민을 사용하여 105 U2OS 세포를 플라스미드 pE4orf6에 의해 형질감염시킨다. 플라스미드 pE4orf6은 CMV의 제어하에서 초기 바이러스 유전자 E4orf6을 코딩하는 DNA 서열을 갖는다.
플라스미드 pE4orf6을 사용하여 형질감염시킨 지 24시간 후, 세포를 YB-1 발현성 E1/E3-결실 아데노바이러스 AdYB-1 (50 pfu/세포) 및 E1/E3-결실 E1B-55K 아데노바이러스 Ad-55K (50 pfu/세포)로 감염시켰다. Ad-55K는 CMV 제어하에서 형질전환 유전자인 바이러스 유전자 E1-55K를 갖는 E1/E3-결실 바이러스이다.
이어, 감염된 지 5일 후 (감염후) 배지(2 ml)로부터 세포를 제거하였다. 분리된 세포로부터 바이러스 입자의 방출은 냉동 및 해동을 3회 (해동/냉동)하여 실시하였다. 이어, 생성된 감염성 입자(ml당 플라크 형성 유닛(pfu/ml))를 결정하기 위해 293개 세포상에서 플라크 에세이를 실시하였다. 결과를 도 8 및 9에 도시한다. 도 8은 절대치로 표시한 플라크 에세이의 결과를 도시한다. AdYB-1만으로 감염시킨 것과 비교하여 가장 현저한 차이는 플라스미드 pErorf6과 형질감염시킨 다음 2개의 바이러스 AdYB-1 및 Ad-55K으로 공감염시킨 것에 의해 분명하게 나타난다. 도 9는 도 8의 결과를 도시하며, 복제 효율의 증가는 AdYB-1에 대해 측정된 복제의 다중도로서 나타낸다. 플라스미드 pErorf6으로 감염된 다음 AdYB-1 및 E1B-55K (Ad-55K)으로 감염된 세포는 25배 이상 까지의 pfu/ml을 생성하였다.
이들 결과를 기본으로 하여, E1B-55K 및 E4orf6의 치환은 E1/E3-결실 아데노바이러스 AdYB-1으로 감염된 후 형성된 바이러스의 수(pfu/ml)를 25배 정도까지 증 가시킨다. 플라크 형성 유닛(pfu)의 생산에 대한 E1B-55K 및 E4orf6의 부가적 영향은 2개 유전자 산물의 효과에 비교하여 현저하게 높다.
EGFP를 발현하는 1개 플라스미드를 사용한 대조용 실험은, 선택된 실험 방법에서 오직 10%의 세포가 플라스미드 pE4orf6에 의해 성공적으로 형질감염됨을 보여 주었다. E1B-55K 및 E4orf6 모두를 발현하는 세포에서 형성된 입자의 개수는 인간 아데노바이러스 유형 5의 하나(야생형)에 필적한다. 이것은 E4orf6 및 E1B-55K의 발현이 YB-1의 핵내 존재와 조합되어 아데노바이러스 복제 및 입자 형성, 특히 야생형 Ad5중의 하나에 필적하는 E1A-결실 아데노바이러스를 제공할 수 있다는 본 발명의 기초를 이루는 발견을 확증시켜 준다.
실시예 8: 세포증식억제성 약물의 투여시 YB-1 핵-음성 세포에서 복제될 수 없는 아데노바이러스의 복제 증가 및 YB-1 핵-양성 세포에서 아데노바이러스의 복제 증가
상이한 세포증식억제성 약물의 부가가 인간 전사인자 YB-1의 핵내 존재를 유발한다는 것은 종래 기술에 공지되어 있다. 본 발명자에 의해 발견된 바와 같이, 핵내에 존재하는 YB-1은 아데노바이러스 E2-후기 프로모터의 활성화를 통하여 아데노바이러스 복제를 제어한다. 양쪽 효과를 조합하는 것은 특정 종양 분해를 제공하기 위해 이용될 수 있다.
암분해성 에세이를 실시함에 있어서, 하기 과정을 실시하였다: 200,000개 세포(HeLa 및 U2OS)를 6개 웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 그 다음 날 다우 노루비신 40 ng/ml(최종 농도)를 부가하였다. 3시간의 배양 후, 세포를 10 및 30 pfu dl520/세포로 감염시켰다. 이어, 세포를 세포증식억제성 약물이 존재하지 않는 배지에서 배양하였다. 3-5일 후, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.
도 10 및 11로부터 알 수 있듯이, 다우노루비신의 부가는 YB-1의 핵내 존재를 통하여 dl520의 복제를 유발한다. 따라서, dl520은 다우노루비신 단독으로 처리한 것에 비하여 세포증식억제성 약물과 조합한 다우노루비신을 사용하면 더 큰 종양분해 효과를 생성한다.
실시예 9: dl520에 의한 생체내 종양 분해
생체내 연구에 사용된 HeLa (YB-1 핵-음성) 및 257RDB(YB-1 핵-양성)을 멸균 세포 배양 조건하에서 팽창시켰다. 피하 종양을 생성하기 위하여 세포를 마우스(CD1NUNu 균주)에 주사하기 전에, 세포를 트립신처리에 의해 수집하고, DMEM 배지(10% FCS)에 용해시키고 계수한 다음 PBS로 1회 세척하였다. 이어, 세포를 원심분리시키고, PBS를 제거하고 세포를 신선한 PBS에 소망하는 세포 수로 넣었다. 본 연구에서 피하 주사된 세포 수는 세포 주당 각각 5 x 106 세포였다. 주사는 1 플랭크의 동물에 피하주사로 실시하였고, HeLa 세포는 우측에 주사되었고 또 257RDB 세포는 분명한 구별을 위해 좌측에 주사하였다. 종양의 생장은 2주에 한번씩 제어하고 베르니어 캘리퍼스를 이용하여 종양의 길이 및 폭을 측정하였다. 이를 기초로 하여, 하기 수학식을 기초로 종양 부피를 산출하였다:
3/4π*a/2* (b/2)2 a = 길이, b = 폭
종양이 200 내지 520 mm3 부피에 도달하면, 바이러스 및 음성 대조용으로서 PBS를 종양 하부에 도포하였다. 주입된 부피는 동일하였고 각 회당 50 ㎕ 이었다. 이것을 3일 연속 반복하였다. 사용된 바이러스의 전체 투여량은 5 x 108 pfu 이었다. 이어, 종양 생장은 1주에 2회씩 계속하여 기록하고 부피를 산출하였다. 연구의 마지막에 마우스를 죽이고 추가의 분석을 위해 종양을 제거하였다.
결과를 도 12 및 도 13에 도시한다.
도 12는 시간 및 다양한 처리 계획의 함수로 종양 부피를 나타내는 다이아그램을 도시한다. 종양이 RDB257에 의해 형성된 경우, PBS 주사시에 약 438 mm3 내지 1466 mm3의 현저한 종양 성장이 있었다. 본 발명에 따라 사용된 벡터 dl520의 영향하에서, 종양 생장은 현저하게 감소되었다. 평균 종양 크기 344 mm3으로 시작해서, 종양 크기는 21% 정도인 전체 543 mm3로 증가하였다.
본 실시예에서 HeLa 세포로 구성된 종양은 대조용으로 사용되었으며, 이것은 PBS 투여시 PBS를 투여한 RDB257 기제 종양과 유사하게 작용하였다. HeLa 세포를 기본하고 dl520으로 처리된 종양은 여전히 311 mm3에서 시작해서 1954 mm3 까지 현저한 종양 생장 증가를 나타내었다.
도 13은 RDB257을 사용하여 생장한 종양을 갖는 치사된 누드 마우스의 사진 을 도시한다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 dl520을 적용한 후 종양의 현저한 감소가 관찰됨을 분명히 알 수 있다. 이 경우에서 종양 부피의 감소도 있었다(바이러스 dl520을 투여한 지 1일 후: 515 mm3; 바이러스 dl520을 투여한 지 30일 후: 350 mm3).
실시예 10: 종양 DNA의 서던 블럿
실시예 9에서 형성된 종양의 중앙으로부터 취한 종양 샘플로부터 DNA를 추출하였다. 분리를 위하여 Dneasy Tissue Kit (Qiagen 제조)를 사용하였다. DNA 분리는 제조자의 지시에 따라 실시하였다. 그에 따라 세포를 알칼리성 분해시켜 DNA를 방출시켰다. 이어, 분리된 DNA를 칼럼상에서 정제시켰다. 이어, 분리된 DNA의 농도를 260 nm에서 광도계로 측정하였다. 2 ㎍의 DNA 샘플을 10 유닛의 제한효소 KpnI으로 분해시켜서 분석을 실시하였다. 이어, 0.8% 아가로오스겔상에서 샘플을 전기영동 분해시켰다. 이어, DNA를 나일론 막(Schleicher & Schuell의 계에 따라 실시)상에 블러팅하였다. 막상에 블러팅된 DNA를 특정의 1501 bp DNA 프로브와 혼성시켰다. 1501 bp DNA 프로브는 특이적으로 Ad5 서열을 코딩하는 E2A내의 3369 bp Kpn I 단편에만 결합한다. 상기 프로브는 PCR에 의해 제조하였고(프라이머: 5'-GTC GGA GAT CAG ATC CGC GT, 5'-GAT CCT CGT CGT CTT CGC TT) 또 32P를 사용하여 방사능활성으로 라벨링하였다. 이어, 막을 세척하고 필름에 노출시켰다.
종양 DNA의 서던 블럿의 결과를 도 14에 도시한다. 이 분석은 레인 3, 4 및 5에 도시된 바와 같이 dl520 만이 시험관중의 내성 세포 RDB257에서 복제됨을 확인시켜 준다. 레인 1은 포지티브 대조용 Ad-5d를 나타내고, 레인 6, 7 및 8은 dl520으로 감염된 HeLa 세포로부터 얻은 DNA를 나타낸다. HeLa 세포는 YB-1 핵 양성이 아니기 때문에, 바이러스 dl520은 복제되지 않았고 그에 따라 E2A 서열은 검출될 수 없었다.
dl520을 사용한 다른 결과를 도 15에 도시한다. 플라크 에세이를 기본으로 하여, dl520 및 야생형 아데노바이러스에 의해 감염시킨 후 입자 형성(pfu/ml)을 조사하였다. 다양한 YB-1 핵-양성 (257RDB 및 181RDB) 종양 세포 및 YB-1 핵-음성 종양 세포는 dl520 및 야생형 아데노바이러스에 의해 감염되었다.
이하 과정을 실시하였다.
L15 배지 (내성 세포) 및 10% FCS를 갖는 DMEM (비내성 세포)가 든 6개 웰을 갖는 소위 플레이트 (6웰 플레이트)에 100,000 내지 200,000개 세포를 플레이팅하였다. 24시간 후, dl520 및 야생형 아데노바이러스(10 pfu/세포)를 사용하여 감염을 실시하였다. 감염한지 3일 후(감염 후) 바이러스 입자는 냉동 및 해동 과정을 3회 실시하는 것에 의해 세포 상층액(3 ml)로부터 방출되었다. 이어, 형성된 감염 입자(ml당 플라크 형성 유닛(pfu/ml))를 측정하기 위하여 293개 웰상에서 플라크 에세이를 실시하였다. 결과를 도 15에 도시한다. 플라크 에세이의 결과는 dl520은 야생형 아데노바이러스와 유사하게 YB-1 핵-양성 세포(257RDB 및 181RDB)에서 복제된다는 것을 보여준다. 본 발명에 따라 본 명세서에 기재된 아데노바이러스를 사용하는 한, 야생형 아데노바이러스중의 하나에 유사한 복제 효율이 관찰될 수 있 다.
실시예 11: 아데노바이러스 벡터 Xvir03의 구조 고안
도 16은 아데노바이러스 벡터 Xvir03의 구조도를 도시한다. 아데노바이러스 Xvir03은 소위 E1/E3-결실 아데노바이러스이다. 이것은 아데노바이러스 복제에 작용하는 E1A, E1B 및 E3 단백질이 제조되지 않음을 의미한다. E1 영역의 결실은 342-3528에 이르며, E3 영역의 결실은 아미노산 위치 27865-30995에 이른다. 여기서,용어 "E1-결실 바이러스"는 E1이 더 이상 기능적으로 활성이 아닌 바이러스를 의미한다. 이것은 주로 완전한 핵산 및 아미노산 서열에 의해 불활성화에 의해 달성될 수 있지만, 다양한 크기를 갖는 단백질을 코딩하는 E1 영역의 결실을 의미할 수도 있다. E1A 및 E1B 단백질 및 그를 코딩하는 핵산의 부족으로 인하여, E4orf6과 같은 E4 영역은 약하게 발현(야생형 아데노바이러스의 약 1 내지 5%)되거나 또는 전혀 발현되지 않는다. 바이러스 유전자 E1B55k 및 E4orf6은 Xvir03에 도입된 이질성 CMV 프로모터(Clontech: Plasmid pShuttle)에 의해 E1 영역에서 발현된다. CMV 프로모터 대신, E1A의 발현과 관련하여 본 명세서에 기재된 임의의 프로모터가 사용된다. 양쪽 유전자의 오픈 리딩 프레임은 소위 IRES 서열(내부 리보소말 진입 부위)(Pelletier, J. and Sonenberg, N. Nature, 1988, 334, 320-325)에 의하여 서로 연결된다. 이러한 요소(Novagen: pCITE)는 1개 mRNA로부터 2개 단백질의 발현을 제공한다.
벡터는 다음과 같이 제조하였다:
플라스미드 E1B55k-pShuttle은 M.Dobelstein(마르부르크 대학)으로부터 구입한 pCGNE1B로부터의 E1B55k의 오픈 리딩 프레임을 XbaI 및 Bfr1를 이용하여 클론테크사 제조의 pShuttle 벡터에 클로닝함으로써 만들었다. 이어 pShuttle중의 E1B55k를 ApaI으로 선형화시키고 양 말단을 무딘 말단으로 만들고 NheI으로 절단하였다.
2번째 벡터인 pcDNA3.1(+)(Invitrogen 제조)에서, PCR 산물인 IRES 요소가 주형인 Novagen사의 pCITE-4a(+)와 함께 T 클로닝에 의해 EcoRV 절단부위에 클로닝되었고, 또 플라스미드 pCMV-E4orf6(M. Dobelstein, 마르그부르크 대학)로부터 얻은 E4orf6을 BamHI = IRES-E4orf6-pcDNA3.1(+)에 의해 클로닝하였다. pcDNA3.1(+)중의 IRES-E4orf6을 NotI을 사용하여 선형화시키고, 양쪽 말단을 무딘 말단으로 만든 다음 단편 IRES-E4orf6을 NheI에 의해 절단하였다. 단편 IRES-E4orf6을 개방 벡터 E1B55k-pShuttle (무딘 말단, NheI)과 함께 연결시켰다. 이 카세트를 CMV 프로모터 및 소 생장 호르몬(BGH)-폴리 A와 함께 E1B55k-IRES-E4orf6-pShuttle 로부터 I-Ceu I 및 PI-SceI을 갖는 ΔE1, ΔE3 아데노-X-플라스미드 (Clontech 제조)에 클로닝하고 이를 AdcmvE1B/IRES/E4orf6으로 명명하였다. 이어, 제조자(Clontech 사)의 지시에 따라서 아데노바이러스를 만들었다. PacI으로 선형화되고 발현 요소 CMV-E1B55k-IRES-E4orf6-BGH 폴리 A를 갖는 아데노바이러스를 HEK293 세포에 형질감염시키고 형질감염한지 11일 후에 반복된 냉동-해동 주기를 거쳐 아데노바이러스를 방출시키기 위하여 배지와 함께 세포를 제거하였다.
상기 기재된 벡터는 원칙상 본 발명에 따라 사용하기 위한 다른 바이러스에도 적합하다. 특히 상술한 벡터는 YB-1 핵-양성 세포인 세포 뿐만 아니라 YB-1가 통제를 벗어난 세포에서 복제하기에 적합하고 분해를 유발하며, 즉 정상 세포 및 비-종양 세포에 비교하여 과발현된다. 이러한 벡터의 사용은 본 발명과 관련하여 사용될 다른 바이러스 및 본 발명의 다른 아데노바이러스와 관련하여 기재된 질환 및 환자 그룹 및 환자의 집합에 대해서도 적용된다.
실시예 12: 아데노바이러스 벡터 Xvir03/01의 구조 고안
도 17로부터 알 수 있듯이, Xvir03/01은 Xvir03을 더욱 개발시킨 것이다. 본 명세서에 기재된 유전자 및 형질전환 유전자와 같은 치료 유전자를 E3 영역에 클로닝할 수 있다. 부가적으로, Xvir03의 발현 카세트로부터 E4orf6과의 동종 재조합을 피하기 위하여 E4 영역에 결실을 도입하였다. 이것은 더 큰 형질전환 유전자가 상기 구조물에 클로닝될 수 있게 한다. 결실된 E3 영역은 예컨대 치료 형질전환 유전자가 클로닝되는 카세트를 도입하기 위해 SacI, NdeI 및 NheI 제한 부위를 함유한다.
치료적 유전자를 E3 영역에 클로닝하고 또 E4 영역에서 결실을 만들기 위한 플라스미드의 제조:
Clontech사의 pAdenoX-플라스미드는 야생형 아데노바이러스에는 존재하지 않는 3' ITR 영역 뒤에 SfuI에 대한 제한 부위를 갖는다. E3-E4 영역은 SpeI(위치 23644) 및 SfuI를 사용하여 pAdenoX(Clontech 제조)로부터 얻었고 pcDNA3.1(+)(Invitrogen 제조) = pcDNA3.1-E3Δ27865-30995-E4에 전달하였다. 대다수의 E4ORF6, 즉 33241-33875를 PstI = pcDNA3.1-E3Δ27865-30995, E4Δ33241- 33875에 의해 제거하였다. Xvir03을 더욱 개발하기 위하여, pcDNA3.1-E3Δ27865-30995, E4Δ33241-33875로부터 결실된 E3/E4 영역을 SfuI 및 SpeI에 의해 플라스미드 pAdenoX = pAdenoX E3Δ27865-30995, E4Δ33241-33875에 클로닝하였다.
Xvir03에서 기재한 바와 같이 상기 발현 카세트를 E1B55k-IRES-E4orf6-pShuttle로부터 I-Ceu I 및 PI-SceI를 이용하여 CMV 프로모터 및 소 생장 호르몬(BGH)-폴리 A와 함께 pAdenoX E3Δ27865-30995, E4Δ33241-33875에 클로닝하였고 이를 AdemvE1B/IRES/E4orf6-ΔE4라 칭한다. 이어, 제조자(Clontech 사)의 지시에 따라서 아데노바이러스를 만들었다.
상기 기재된 벡터는 원칙상 본 발명에 따라 사용하기 위한 다른 바이러스에도 적합하다. 특히 상술한 벡터는 YB-1 핵-양성 세포인 세포 뿐만 아니라 YB-1가 통제를 벗어난 세포에서 복제하기에 적합하고 분해를 유발한다. 상기 벡터는 또한 본 발명과 관련하여 사용될 다른 바이러스 및 본 발명의 다른 아데노바이러스와 관련하여 기재된 질환 및 환자 그룹 및 환자의 집합에 대해서도 적용된다.
실시예 13: 257RDB 및 181RDB 세포에서 Xvir03의 암분해 효과
6개 웰을 갖는 플레이트(6웰 플레이트)에 각 웰당 100,000 세포(257RDB 및 181RDB)를 플레이팅하였다. 다음날, 도 18에 도시된 바와 같이 세포를 Ad312 (20pfu/세포) 및 Xvir03 (5pfu/세포)로 감염시켰다. 감염은 500 ㎕ 무혈청 DMEM 배지중, 37℃에서 1시간 동안 실시하였다. 이어, 감염 배지를 제거하고 2ml 완전 배지(10% FCS/DMEM)로 교체하였다. 5일 후 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 분석하 였다. 그 결과를 도 18A 및 도 18B 에 도시한다.
도 18A 및 도 18B로부터 알 수 있듯이, 핵내에 YB-1을 갖는 다약제 내성 세포는 세포의 크리스탈 바이올렛 염색으로 나타낸 바와 같이 Ad312 및 Xvir03에 의한 감염 후 Xvir03의 경우에서는 분해를 나타낸다. 이와 관련하여, 제1 배지를 제거한다. 이어 세포에 크리스탈 바이올렛(50% ETOH, 3% 포름알데히드, 5% 아세트산, 1% 크리스탈 바이올렛)을 덮고 실온에서 5 내지 10분간 배양하였다. 이어, 6개 웰 플레이트를 물로 완전히 세척하고 실온에서 건조시켰다.
그러나 본 발명의 의미대로 아데노바이러스를 트랜스활성화시키지 않는 E1A-결실 바이러스(예컨대 Ad312)는 더 높은 MOI에서 아주 효과적으로 복제될 수 있지만(Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981), 임상 적용에서는 실현될 수 없음이 본 발명자에게 공지되어 있다. 이러한 현상을 문헌에는 "E1A-유사 활성"이라 칭한다. 여기서 사용된 아데노바이러스 Ad312는 E1A-결실 바이러스이다. 임상적으로 바람직한 역가를 여전히 상회하는 사용된 역가(20 pfu/세포)에서 E1B55k 및 E4orf6과 같은 초기 아데노바이러스 유전자는 발현되지 않거나 극히 적게 발현되었다(Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981). 앞서 기재한 바와 같이, 이들 유전자 및 단백질은 바이러스 복제에 중요한 역할을 한다. 이와 대조적으로, 상기 유전자 및 단백질은 아데노바이러스 Xvir03에 의해서는 발현된다(도 16). 도 18A 및 도18B로부터 분명하듯이, 유전자 E1B55K 및 E4orf6의 발현은 필료로 하는 낮은 감염 역가(pfu/세포로 표시됨)에서 효과적인 바이러스 복제 및 세포 분해를 나타낸다. 이는 E4orf6 및 E1B-55K (및 E1A의 부재하)의 발현과 YB-1의 핵내 존재가 합쳐져서 아주 효과적인 아데노바이러스 복제를 유발할 수 있다는 본 발명의 기초를 이루는 발견을 확증시켜 준다. 1 내지 5 pfu/세포의 필요 역가는 임상 적용도 허용한다.
이것은 또한 본 발명에 따라 사용되어 감염 세포를 분해시킬 바이러스를 제조하기 위해서 YB-1의 핵내 존재, 바람직하게는 세포 주기와는 독립적인 존재가 필요하다는 본 발명의 기초가 되는 발견을 확인시켜 준다.
상술한 명세서, 특허청구범위 및 도면에 기재된 본원 발명의 특징은 개별적으로 뿐만 아니라 조합되어도 다양한 구체예로 본원 발명을 실현하는데 중요하다.

Claims (74)

  1. 핵에서 YB-1을 갖지 않는 세포에서 복제 결핍이며, E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP를 포함하는 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 바이러스 유전자를 트랜스활성화(transactivating)시키는 암유전자 단백질을 코딩하는 바이러스를 포함함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  2. 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 통하여 YB-1에 의해 제어되도록 고안된 바이러스를 포함함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스가 아데노바이러스임을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스가 핵에서 YB-1을 지니는 세포 내에서 복제됨을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스 암유전자 단백질이 E1A이고 암유전자가 E1A를 코딩하는 유전자임을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 바이러스 암유전자 단백질 E1A가 YB-1의 핵내 편재화를 유도하지 않음을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 Rb-음성이고 또 YB-1 핵 양성임을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 세포가 세포 주기로부터 독립적으로 YB-1 핵 양성임을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 종양 또는 이의 일부를 형성하는 세포가 세포증식 억제성 약물에 대하여 내성임을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 세포가 막-결합형 전달 단백질 P-당단백질의 과발현을 나타냄을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  11. 삭제
  12. 제11항에 있어서, 바이러스 암유전자 단백질이 E1A임을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스가 YB-1을 코딩함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  14. 삭제
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스가, E4orf6, E4orf3, E1B55K 및 아데노바이러스 E3ADP 단백질을 포함하는 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 단백질을 코딩함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 종양 또는 이의 일부를 형성하는 세포가 핵 내에 YB-1을 지님을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵내로 YB-1의 전달을 유도한 후, 종양이 핵 내에 YB-1을 포함함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스가 AdΔ24, d1922-947, E1Ad/01/07, d11119/1131, CB 016, dl520 및 기능적 Rb 종양 억제인자 유전자 산물을 결합할 수 있는 발현된 바이러스 암유전자가 결핍된 바이러스를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  19. 제2항에 있어서, 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 통해 주로 YB-1에 의해 제어됨을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  20. 제1항 또는 제2항에서 정의된 바이러스를 코딩하는 핵산을 포함하고, 헬퍼 바이러스의 핵산도 포함하며, 상기 헬퍼 바이러스의 핵산이 YB-1을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 복제 계를 포함함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 바이러스 복제 계가 아데노바이러스 복제 계임을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  22. 종양 치료용 의약을 제조하기 위한, 제1항 또는 제2항에서 정의된 바이러스를 코딩하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 종양 또는 이의 일부를 형성하는 세포가 세포증식 억제성 약물에 대하여 내성임을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 내성이 복수 내성임을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 종양 치료용 의약을 제조하기 위한, 제22항에서 정의된 핵산을 포함하는 벡터를 포함함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  28. 제1항, 제2항, 제20항, 제22항 및 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 형질전환 유전자를 코딩하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  29. 제1항, 제2항, 제20항, 제22항 및 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 형질 전환 유전자의 번역 산물, 형질전환 유전자의 전사 산물, 또는 형질 전환 유전자의 번역 산물과 형질전환 유전자의 전사 산물 둘 다를 포함함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  30. 제20항에 있어서, 아데노바이러스 복제계의 핵산, 헬퍼 바이러스의 핵산, 또는 아데노바이러스 복제계의 핵산과 헬퍼 바이러스의 핵산 둘 다가 형질전환 유전자 또는 형질전환 유전자를 코딩하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  31. 제22항 및 제28항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 핵산이 형질전환 유전자 또는 형질전환 유전자를 코딩하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 형질전환 유전자가 프로드럭 유전자, 사이토카인, 세포자살-유도 유전자, 종양 억제인자 유전자, 메탈로프로테이나제 억제제 유전자 및 신생혈관 억제제 유전자를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  33. 제31항에 있어서, 형질전환 유전자가 SiRNA용 핵산, 앱타머용 핵산, 안티센스 분자용 핵산 및 리보자임용 핵산을 포함하는 군으로부터 선택되며, 또 상기 SiRNA, 앱타머, 안티센스 분자 및 리보자임이 표적 분자를 표적으로 함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 표적 분자가 내성 관련 인자, 항-세포자살 인자, 암유전자, 혈관신생 인자, DNA 합성 효소, DNA 수선효소, 성장인자 및 이의 수용체, 전사인자, 메탈로프로테이나제 및 우로키나제 유형의 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  35. 제1항, 제2항, 제20항, 제22항 및 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 약제학적 활성 화합물을 추가로 포함함을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 약제학적 활성 화합물이 사이토카인, 메탈로프로테이나제 억제제, 혈관신생 억제제, 세포증식억제성 약물 및 세포 주기 억제제를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  37. 핵에서 YB-1를 지니지 않는 세포 내에서 복제 결핍이며 E1B55kDa, E4orf6, E4orf3 및 E3ADP를 포함하는 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 바이러스 유전자를 트랜스활성화시키는 암유전자 단백질을 코딩함을 특징으로 하는 바이러스를 핵에서 YB-1를 발현시키는 세포 내에서 복제시키는 방법.
  38. 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 통해 YB-1에 의해 제어되도록 고안됨을 특징으로 하는 바이러스를 핵에서 YB-1를 지니는 세포 내에서 복제시키는 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 바이러스가 아데노바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  40. 제37항 또는 제38항에 있어서, 바이러스가 핵에서 YB-1을 지니는 세포 내에서 복제됨을 특징으로 하는 방법.
  41. 제37항 또는 제38항에 있어서, 바이러스 암유전자 단백질이 E1A이고 암유전자가 E1A를 코딩하는 유전자임을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 바이러스 암유전자 단백질 E1A가 YB-1의 핵내 편재화를 유도하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  43. 제37항 또는 제38항에 있어서, 세포가 Rb-음성이고 또 YB-1 핵 양성임을 특징으로 하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 세포가 세포 주기로부터 독립적으로 YB-1 핵 양성임을 특징으로 하는 방법.
  45. 삭제
  46. 제45항에 있어서, 바이러스 암유전자 단백질이 E1A임을 특징으로 하는 방법.
  47. 제37항 또는 제38항에 있어서, 바이러스가 YB-1을 코딩함을 특징으로 하는 방법.
  48. 삭제
  49. 제37항 또는 제38항에 있어서, 바이러스가, E4orf6, E4orf3, E1B55K 및 아데노바이러스 E3ADP 단백질을 포함하는 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 단백질을 코딩함을 특징으로 하는 방법.
  50. 제37항 또는 제38항에 있어서, 바이러스가 AdΔ24, d1922-947, E1Ad/01/07, d11119/1131, CB 016, dl520 및 기능적 Rb 종양 억제인자 유전자 산물을 결합할 수 있는 발현된 바이러스 암유전자가 결핍된 바이러스를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  51. 제38항에 있어서, 복제가 E2-후기 프로모터의 활성화를 통해 주로 YB-1에 의해 제어됨을 특징으로 하는 방법.
  52. 제22항에서 정의된 핵산을 포함하는 벡터를 사용함을 특징으로 하여, 바이러스를 핵에서 YB-1을 지니는 세포 내에서 복제하는 방법.
  53. 제37항 또는 제38항에 있어서, 바이러스가 형질전환 유전자를 코딩하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  54. 제37항 또는 제38항에 있어서, 바이러스가 형질 전환 유전자의 번역 산물, 형질전환 유전자의 전사 산물, 또는 형질 전환 유전자의 번역 산물과 형질전환 유전자의 전사 산물 둘 다를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  55. 제53항에 있어서, 형질전환 유전자가 프로드럭 유전자, 사이토카인, 세포자살-유도 유전자, 종양 억제인자 유전자, 메탈로프로테이나제 억제제 유전자 및 신생혈관 억제제 유전자를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  56. 제53항에 있어서, 형질전환 유전자가 SiRNA용 핵산, 앱타머용 핵산, 안티센스 분자용 핵산 및 리보자임용 핵산을 포함하는 군으로부터 선택되며, 또 상기 SiRNA, 앱타머, 안티센스 분자 및 리보자임이 표적 분자를 표적으로 함을 특징으로 하는 방법.
  57. 제53항에 있어서, 표적 분자가 내성 관련 인자, 항-세포자살 인자, 암유전자, 혈관신생 인자, DNA 합성 효소, DNA 수선효소, 성장인자 및 이의 수용체, 전사인자, 메탈로프로테이나제 및 우로키나제 유형의 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  58. E1B-55K, E3ADP, E4orf6 및 E4orf3을 포함하는 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 바이러스 유전자의 트랜스활성화 특성(a) 및
    바이러스 암유전자 단백질이 존재하는 핵에서 YB-1의 도입 결핍 특성(b)을 지님을 특징으로 하는, 바이러스 암유전자 단백질.
  59. 제58항에 있어서, 바이러스 암단백질이 E1A임을 특징으로 하는, 바이러스 암유전자 단백질.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 야생형 암유전자 단백질과 대비하여 돌연변이 또는 결실 부위를 지님을 특징으로 하는, 바이러스 암유전자 단백질.
  61. 제60항에 있어서, 결실이 CR3 영역의 결실, N-말단의 결실 및 C-말단의 결실을 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 바이러스 암유전자 단백질.
  62. 제1항, 제2항, 제20항, 제22항 및 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 바이러스 또는 이를 코딩하는 핵산이 제58항에 따르는 바이러스 암유전자 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  63. 제37항 또는 제38항에 있어서, 바이러스 또는 이를 코딩하는 핵산이 제58항에 따르는 바이러스 암유전자 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  64. 삭제
  65. 제34항에 있어서, 메탈로프로테이나제가 매트릭스 메탈로프로테이나제임을 특징으로 하는, 종양 치료용 약제학적 조성물.
  66. 제58항에 있어서, 핵이 세포핵임을 특징으로 하는, 바이러스 암유전자 단백질.
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
KR1020047019231A 2002-05-27 2003-05-27 아데노바이러스 및 그를 코딩하는 핵산의 신규 용도 KR101083450B1 (ko)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10223534.1 2002-05-27
DE2002123534 DE10223534A1 (de) 2002-05-27 2002-05-27 Verwendung von Adenoviren und dafür codierenden Nukleinsäuren
DE10225400 2002-06-07
DE10225400.1 2002-06-07
DE10248039.7 2002-10-15
DE10248039 2002-10-15
DE10322530 2003-05-19
DE10322530.7 2003-05-19
PCT/EP2003/005583 WO2003099859A2 (de) 2002-05-27 2003-05-27 Neue verwendung von adenoviren und dafür codierenden nukleinsäuren

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20050008744A KR20050008744A (ko) 2005-01-21
KR101083450B1 true KR101083450B1 (ko) 2011-11-16

Family

ID=29587746

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020047019231A KR101083450B1 (ko) 2002-05-27 2003-05-27 아데노바이러스 및 그를 코딩하는 핵산의 신규 용도

Country Status (9)

Country Link
US (5) US20060099178A1 (ko)
EP (1) EP1506021B1 (ko)
JP (3) JP5213298B2 (ko)
KR (1) KR101083450B1 (ko)
CN (2) CN101843641B (ko)
AU (2) AU2003242585A1 (ko)
CA (1) CA2487811A1 (ko)
WO (1) WO2003099859A2 (ko)
ZA (1) ZA200409361B (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101843641B (zh) 2002-05-27 2014-09-17 佩尔·松内·霍尔姆 腺病毒和编码其的核酸的新应用
CA2546178A1 (en) * 2003-11-14 2005-06-09 Per Sonne Holm New use of adenovirus and nucleic acids coding therefor
WO2005052143A2 (de) * 2003-11-14 2005-06-09 Per Sonne Holm Neue adenoviren, dafür codierende nukleinsäuren und deren verwendung
US8361976B2 (en) 2004-07-09 2013-01-29 University Of Massachusetts Therapeutic alteration of transplantable tissues through in situ or ex vivo exposure to RNA interference molecules
CA2610360A1 (en) * 2004-12-31 2006-07-06 Per Sonne Holm E1-minus adenoviruses and use thereof
CN101128593B (zh) * 2004-12-31 2014-09-03 佩尔·松内·霍尔姆 逆转动物细胞中多种抗性的方法
WO2012022496A2 (en) 2010-08-19 2012-02-23 Per Sonne Holm Method for killing tumor stem cells
KR102089121B1 (ko) * 2013-03-14 2020-03-13 더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 종양살상형 아데노바이러스 조성물
CA3013637A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
EP3390645B1 (en) 2016-02-23 2022-09-14 Salk Institute for Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
EP3532082A4 (en) 2016-12-12 2020-08-26 Salk Institute for Biological Studies SYNTHETIC ADENOVIRUS TUMOR TARGETING AND THEIR USES
CN112533620A (zh) 2018-03-05 2021-03-19 慕尼黑工业大学临床教学中心 通过溶瘤腺病毒和cdk4/6抑制剂的组合治疗肿瘤
AU2019294294A1 (en) * 2018-06-25 2021-02-11 Fondazione Telethon Ets Gene therapy
EP4025229A1 (en) * 2019-09-05 2022-07-13 Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München Treatment of tumors by a combination of an oncolytic adenovirus, a cdk4/6 inhibitor and a further therapeutically active agent
CN115335513A (zh) * 2020-03-23 2022-11-11 株式会社库利金 包含双特异性核酸分子的溶瘤病毒的结构
CN114540349A (zh) * 2020-11-27 2022-05-27 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 结合yb-1蛋白的核酸分子

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US931830A (en) * 1907-09-17 1909-08-24 Harry Zimmerman Material-cutter.
US4947842A (en) 1988-09-22 1990-08-14 Medical Engineering And Development Institute, Inc. Method and apparatus for treating tissue with first and second modalities
DK0533838T3 (da) 1990-06-11 1998-02-23 Nexstar Pharmaceuticals Inc Nukleinsyreligander
US5846945A (en) 1993-02-16 1998-12-08 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
AU682854B2 (en) * 1993-02-16 1997-10-23 Onyx Pharmaceuticals Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
US5698443A (en) 1995-06-27 1997-12-16 Calydon, Inc. Tissue specific viral vectors
JP3816518B2 (ja) 1994-06-10 2006-08-30 ジェンベク、インコーポレイティッド 相補的なアデノウイルスベクター系と細胞系
US5998205A (en) 1994-11-28 1999-12-07 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
US6326356B1 (en) * 1996-10-18 2001-12-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Suppression of neu overexpression using a mini-E1A gene
ATE386130T1 (de) 1995-03-24 2008-03-15 Genzyme Corp Adenovirale vektoren für die gentherapie
US5707618A (en) 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
US6676935B2 (en) 1995-06-27 2004-01-13 Cell Genesys, Inc. Tissue specific adenoviral vectors
WO1997016547A1 (en) 1995-10-31 1997-05-09 The Board Of Regents, The University Of Texas System ADENOVIRUS-ANTISENSE K-ras EXPRESSION VECTORS AND THEIR APPLICATION IN CANCER THERAPY
US6022863A (en) 1996-05-21 2000-02-08 Yale University Regulation of gene expression
PT951553E (pt) 1996-07-05 2004-02-27 Philip E Branton Proteinas de e4 de adenovirus para unducao de morte celular
US6730662B1 (en) * 1996-07-05 2004-05-04 Mcgill University Adenovirus E4 proteins for inducing cell death
ES2188985T3 (es) 1996-08-30 2003-07-01 Jens Peter Furste Seleccion enantiomerica y evolucion enantiomerica de acidos nucleicos.
US5994132A (en) 1996-10-23 1999-11-30 University Of Michigan Adenovirus vectors
AU5253998A (en) 1996-11-13 1998-06-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Diminishing viral gene expression by promoter replacement
US6080578A (en) 1996-12-31 2000-06-27 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic adenoviral E1B mutated viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
US6100086A (en) 1997-04-14 2000-08-08 Genzyme Corporation Transgene expression systems
DE69838584T2 (de) 1997-08-04 2008-06-26 Cell Genesys, Inc., Foster City Enhancer des menschlichen glandulären kallikreingens, vektoren die ihn enthalten und methoden für seine verwendung
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
EP1032269B1 (en) 1997-10-09 2007-08-29 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with interferon-sensitive, clonal viruses
CN1110553C (zh) * 1998-07-15 2003-06-04 杭州赛狮生物技术开发有限公司 基因工程腺病毒及其用途
AU1092500A (en) 1998-10-15 2000-05-01 Canji, Inc. Recombinant e1a deleted adenoviral vectors
US6649158B1 (en) 1998-10-15 2003-11-18 Canji, Inc. Methods and compositions to induce antitumor response
DE19860602A1 (de) 1998-12-29 2000-07-06 Max Delbrueck Centrum Gentransfervektor für die Diagnostik und die Therapie von malignen Tumoren
US6428968B1 (en) 1999-03-15 2002-08-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combined therapy with a chemotherapeutic agent and an oncolytic virus for killing tumor cells in a subject
GB9906815D0 (en) 1999-03-24 1999-05-19 Isrec Anti-neoplastic viral agents
DE19929569A1 (de) 1999-06-21 2000-12-28 Holm Per Sonne Mittel zur Behandlung maligner Erkrankungen unter Verwendung des Proteins YB-1
AU6425800A (en) 1999-06-30 2001-01-22 Max-Delbruck-Centrum Fur Molekulare Medizin Agents for the diagnosis, prognosis and treatment of malignant diseases
US6955808B2 (en) 1999-09-24 2005-10-18 Uab Research Foundation Capsid-modified recombinant adenovirus and methods of use
EP1223947A4 (en) 1999-10-15 2004-12-08 Canji Inc TARGETED VECTORS
US6140126A (en) 1999-10-26 2000-10-31 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Y-box binding protein 1 expression
PT1230378E (pt) * 1999-11-15 2007-09-17 Onyx Pharma Inc ''adenovírus oncolítico''
DE10015413A1 (de) 2000-03-23 2001-09-27 Max Delbrueck Centrum Mittel zur Diagnose und Therapie viraler Erkrankungen
JP2003534806A (ja) 2000-05-31 2003-11-25 ジェンベク、インコーポレイティッド アデノウイルスベクターのターゲティングの方法および組成物
AU784975B2 (en) 2000-10-11 2006-08-10 Sumitomo Chemical Company, Limited DNA-binding protein YB-1-containing collagen accumulation inhibitors
AU2002235141A1 (en) 2000-11-27 2002-06-03 Geron Corporation Glycosyltransferase vectors for treating cancer
US20030095989A1 (en) 2000-12-18 2003-05-22 Irving John M. Chimeric cytolytic viruses for cancer treatment
DE10150945A1 (de) 2001-10-16 2003-04-17 Holm Per Sonne Adenovirale Systeme und deren Anwendungen
DE50112463D1 (de) 2000-12-28 2007-06-14 Per Sonne Holm Adenovirale systeme und deren anwendungen
US20030138405A1 (en) 2001-04-17 2003-07-24 Juan Fueyo Conditionally replicative adenovirus to target the Rb and Rb-related pathways
JP3974894B2 (ja) 2001-09-14 2007-09-12 財団法人新産業創造研究機構 腫瘍特異的プロモーターおよびその用途
DE10150984A1 (de) 2001-10-16 2003-04-17 Holm Per Sonne Verwendung des adenoviralen E2-late-Promotors
PL208588B1 (pl) 2002-04-25 2011-05-31 Crucell Holland Bv Rekombinowane adenowirusy, wyizolowane kwasy nukleinowe, komórki pakujące oraz sposoby zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa
CN101843641B (zh) * 2002-05-27 2014-09-17 佩尔·松内·霍尔姆 腺病毒和编码其的核酸的新应用
PL219321B1 (pl) * 2002-10-15 2015-04-30 Per Sonne Holm Adenowirus, kodujący go kwas nukleinowy, zawierający je układ replikacyjny, wektor, komórka i organizm, ich zastosowanie oraz środek farmaceutyczny
AU2003271730A1 (en) 2002-10-15 2004-05-04 Per Sonne Holm Novel adenoviruses, nucleic acids coding therefor, and use thereof
JP2006520604A (ja) 2003-03-19 2006-09-14 アイソジェニス・インコーポレイテッド ＣＤ８α鎖に基づき免疫原性が減少した遺伝子治療ベクター
CA2546178A1 (en) 2003-11-14 2005-06-09 Per Sonne Holm New use of adenovirus and nucleic acids coding therefor
WO2005052143A2 (de) * 2003-11-14 2005-06-09 Per Sonne Holm Neue adenoviren, dafür codierende nukleinsäuren und deren verwendung
ATE516343T1 (de) 2004-12-13 2011-07-15 Canji Inc Zellinien zur produktion von replikationsdefektem adenovirus
CA2610360A1 (en) 2004-12-31 2006-07-06 Per Sonne Holm E1-minus adenoviruses and use thereof
CN101128593B (zh) 2004-12-31 2014-09-03 佩尔·松内·霍尔姆 逆转动物细胞中多种抗性的方法
US20070292396A1 (en) 2006-03-02 2007-12-20 Juan Fueyo Combination therapy with oncolytic adenovirus

Also Published As

Publication number Publication date
CN1655827A (zh) 2005-08-17
EP1506021B1 (de) 2019-05-01
US10731136B2 (en) 2020-08-04
CN101843641B (zh) 2014-09-17
CA2487811A1 (en) 2003-12-04
EP1506021A2 (de) 2005-02-16
US20180002674A1 (en) 2018-01-04
AU2010219364B2 (en) 2011-06-09
JP2012179058A (ja) 2012-09-20
AU2003242585A1 (en) 2003-12-12
KR20050008744A (ko) 2005-01-21
JP5213298B2 (ja) 2013-06-19
WO2003099859A2 (de) 2003-12-04
US20200095560A1 (en) 2020-03-26
US10538744B2 (en) 2020-01-21
US20060099178A1 (en) 2006-05-11
WO2003099859A3 (de) 2004-04-15
ZA200409361B (en) 2005-08-31
AU2003242585A2 (en) 2003-12-12
JP2014224141A (ja) 2014-12-04
US11268073B2 (en) 2022-03-08
JP2006512284A (ja) 2006-04-13
US20110033424A1 (en) 2011-02-10
CN1655827B (zh) 2010-06-23
CN101843641A (zh) 2010-09-29
US10155930B2 (en) 2018-12-18
US20190055522A1 (en) 2019-02-21
AU2010219364A1 (en) 2010-09-30
JP5719800B2 (ja) 2015-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11268073B2 (en) Use of adenovirus and nucleic acids coding therefor
US10300096B2 (en) Use of adenoviruses and nucleic acids that code for said viruses
AU2010257327B2 (en) Adenovirus expressing genes in reverse order and use thereof
KR101123510B1 (ko) 신규한 아데노바이러스, 이를 암호화하는 핵산 및 이들의 조성물
AU2015201828B2 (en) Novel use of adenoviruses and nucleic acids coding therefor

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141022

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151022

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161011

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171027

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200304

Year of fee payment: 10