CN1110553C - 基因工程腺病毒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明构建了两种基因工程腺病毒，它们能选择性地在p53功能缺失的人肿瘤细胞中大量复制，并最终杀死肿瘤细胞。同时，它们并不能在正常细胞中复制。其抗肿瘤的疗效是通过检测小鼠身上的人肿瘤移植模型进行确证。试验数据表明，此工程腺病毒可用于治疗特定的肿瘤模型。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程腺病毒，它们能选择性地在p53功能缺失的肿瘤细胞中大量复制并最终杀死肿瘤细胞，但它们并不能在正常细胞中复制。此外，本发明还涉及含有该基因工程腺病毒的药物组合物以及该基因工程腺病毒在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
背景技术
癌症是一种异源性疾病的总称，其特征为非正常细胞的无限生长和增殖。通常认为，正常细胞的增殖受两种相互拮抗的基因的调节，即原癌基因和肿瘤抑制基因。原癌基因能促进细胞的生长，而肿瘤抑制基因则抑制细胞的生长。当基因发生突变，即原癌基因被激活或肿瘤抑制基因失活，均可加速肿瘤细胞的生长。通常肿瘤抑制基因(包括p53，RB基因)的失活和原癌基因的激活同时发生，其结果是产生无限增殖的肿瘤细胞。
尽管不同类型的基因变化都有可能导致细胞生长调节基因的功能发生变化，并产生非正常的细胞增殖。通常认为需要多种因素同时作用才能将正常细胞转化成为肿瘤细胞。其精确的分子途径和随之发生的细胞变化导致细胞恶性增殖的机理尚未明了。但已有许多报道表明，细胞内的一些蛋白在细胞增殖周期的调控中起着重要作用，当它们的功能发生变化时，往往会导致细胞的恶性转化，例如当p53基因产物失活时，会使细胞的生长失去控制。
尽管已经有了许多发现，但目前癌症的治疗绝大部分仍用常规的治疗方法，如放疗和化疗。这些方法的治疗指数很低，而且副作用很大，常给病人带来很多痛苦，甚至生命受到威胁，如骨髓的抑制等。
近年来，已经有科学家应用基因治疗的方法来修正或补充人等位基因的缺陷，用于治疗一些遗传性疾病，但目前为止成功率较小。其主要采用的方法是将一段寡核苷酸序列转导入人细胞中，以期表达正常的功能蛋白，纠正等位基因的缺陷或补偿细胞的某种功能。应用的载体是复制缺陷型重组腺病毒。如将肿瘤坏死因子(TNF)和白介素II(IL-2)导入细胞内进行肿瘤治疗。在美国专利7769623、WO9514101等中记载了用复制缺陷型腺病毒将特定基因传递到癌症患者的病灶，在所述病灶表达由所述基因编码的特定抑制肿瘤的蛋白质以达到治疗癌症的目的。在体外的试验中，这种方法是成功的，但在体内，有效率大大降低。
这种基因治疗的方法到目前为止，还不能有效地修复缺陷的原癌基因或肿瘤抑制基因。肿瘤自身的细胞生物学特性使得现今还没有一种有效的方法能治疗癌症，而且所有基因治疗的方法都太昂贵，这也限制了它的应用。
腺病毒可以感染呼吸道、眼、胃肠道和膀胱，已经鉴定出47个血清型。根据其血凝作用特征、致瘤性、对培养细胞的转化和G+C百分比，将人腺病毒分成7个亚型。
腺病毒的复制循环分为早期和晚期两个阶段，晚期是从病毒DNA复制开始的。感染后，腺病毒迅速关闭细胞中DNA和蛋白质的合成。其关闭机制尚不清楚，但细胞中的蛋白质合成迅速受到抑制，而细胞DNA合成则稍晚。在32-36小时的一个病毒循环中，每细胞产生104个病毒颗粒。
腺病毒基因组中有11个基因，其中E1A区在早期基因合成中是非常重要的。研究表明，E1A蛋白质可结合肿瘤抑制基因RB105(成视网膜细胞瘤105kd)，而E1B蛋白可结合P53肿瘤抑制蛋白。E1B本身不能转化细胞，但与E1A一起可稳定地转化细胞。E3区含有调节与宿主对感染反应有关的基因。
正常情况下，腺病毒主要在细胞内有效地复制，它的核酸序列的E1B区基因编码合成P55蛋白，此蛋白能同宿主细胞中的P53蛋白结合，并使其失活从而阻止了细胞凋亡的发生，使病毒得以复制，这样缺失了P53蛋白功能的细胞可任病毒大量复制。通过这种方式，野生型腺病毒可在具有功能性P53蛋白的正常细胞中大量复制。
美国专利5677178中公开了用重组腺病毒治疗肿瘤的方法，方法所使用的是由腺病毒II型(Ad2)和腺病毒V型(Ad5)构建的重组嵌合病毒d11520，由于这种重组病毒不是天然存在于哺乳动物中的腺病毒，因此，这种病毒在人体中的生存状态以及潜在的可能突变和所引起的危害尚难以确定。此外，该方法所用的病毒还保留了1/9的E3区，而E3区有抑制人体免疫系统的作用，该区的部分保留已证明可使该病毒产生抗性，因而有可能在人体中长期存在。这样由于病毒的返祖现象，或由于其它因素的影响，该重组腺病毒会回复成可在正常人体细胞中表达的野生型病毒，从而对人体产生不利影响。
由于复制缺陷型腺病毒的增殖是以特定的宿主，即肿瘤细胞为靶，因此当特定的靶组织消失后，要求破坏特定靶组织的所述复制缺陷型腺病毒也应随之从受体内消失，以免使所述复制缺陷型腺病毒在体内产生不需要的突变并保留在体内，而对宿主产生不利影响。因此，这就要求用于破坏特定靶组织的复制缺陷型腺病毒有尽可能高的靶特异性，从而使其只能在特定的靶组织中生活。
为此，本发明人经过研究和试验构建了一种新型的重组腺病毒，它来源于Ad5。由于Ad5型腺病毒是天然存在于哺乳动物中的，它同人类的相互关系已经研究的非常明确，而且将E3区基因全部去除。这样，当此病毒在体内发挥药效后，人体自身的免疫系统可将之清除，从而避免了存留于体内可能产生的危害。因此，此新型的重组腺病毒的安全性优于现有技术改进的重组复制缺陷型腺病毒。
本发明的目的是提供一种改进的重组复制缺陷型腺病毒，以及含有该病毒的药物组合物，此外，本发明还提供选择性杀死肿瘤细胞的方法。
本发明的另一目的是提供选择性杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括，在感染的条件下，将杀死肿瘤细胞有效量的E1B区P55缺陷的重组缺陷腺病毒与含有肿瘤细胞的细胞种群接触，由此产生感染的细胞种群，所述病毒为E1B/E1a双突变得病毒，并可进一步包含有一个与病毒启动子相连的阴性选择基因。
另一方面，本发明提供含有重组复制缺陷型腺病毒及可药用载体的药用组合物。
此外，本发明还提供了重组缺陷腺病毒在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的用途。
附图说明图1.S98基因工程腺病毒图谱。图2.在正常细胞中，S98基因工程腺病毒的复制。图3.S98-001的药效学试验。
发明内容
本发明的复制缺陷型腺病毒为经过改造的Ad5。Ad5的基因组含有35935个核苷酸。Ad5与人类的关系十分清楚，有明显的自愈性。在已将Ad5全序列用于人的临床实验中，从未发生过转化人正常细胞的特性。
本发明构建的重组复制缺陷型腺病毒如图1中所示的S98-001和S98-002。在S98-001中，在E1B区的2025核苷酸处加入了TGA终止密码子，同时缺失了核苷酸2501-3328，同时缺失了包括核苷酸27865-30995的整个E3区。由于E1B编码P55蛋白，所以上述缺失使得复制缺陷型腺病毒只能生产出缺陷型P55蛋白质，而所述缺陷型P55蛋白同p53基因产物的结合能力大大降低或与之不能结合。因此，所述缺陷型Ad5不能在含有正常p53基因产物的正常细胞中复制，而只能选择性地在p53功能缺陷的肿瘤细胞中大量复制，最终通过所述腺病毒的大量复制而杀死肿瘤细胞。由于该腺病毒是E1b-55KD缺陷型的，因此，当体内肿瘤细胞被基本上全部杀死后，这些腺病毒因不能在正常细胞中复制最终也会死亡。因此，这些复制缺陷型病毒对于正常细胞来讲是安全的。E3区是与宿主免疫系统有关的区域，该区的存在有可能使腺病毒抵御宿主免疫系统，因此在本发明中，完全缺失了E3。此外，由于本发明的重组腺病毒完全缺失了E3区，从而进一步降低了该病毒进入人体后会给人体带来危害的可能性。本发明的复制缺陷型腺病毒的特异性为每杀死100-1000个肿瘤细胞才会杀死一个正常细胞。
除以上55KD区的突变外，所述突变腺病毒也可能有P19蛋白功能的缺失，它能增强细胞的病变效应，其相应的基因是P19cyt突变基因。但是，也有很多的突变保持了功能性P19基因，这是为了保持病毒DNA在感染细胞的过程中的完整性。
本发明所用的另一重组复制缺陷型腺病毒是S98-002，该病毒缺失了55kD内的核苷酸2501-3328以及包括核苷酸27865-30995的整个E3区。其目的也是为了提高所述复制缺陷型腺病毒的特异性和杀伤力，使所述病毒通过常规的给药途径和给药形式，到达特定的靶区，选择性地杀死肿瘤细胞，在肿瘤细胞被全部杀死后，所述病毒也因失去赖以复制地环境而随之死亡。
本发明的重组复制缺陷型腺病毒可通过常规给药途径，如静脉内给药。给药剂量为109PFU-1012PFU/患者，优选109PFU-1012PFU/个体。
具体实施方式
实施例1 质粒的构建
pXC-1和pBHG11购于Microbix Biosystems，PXC-1含有人腺病毒5型(Ad5)基因序列，从bp22到5790。pBHG11含有Ad5基因序列，上有两处缺失：E1区的缺失，从bp188到1339，即用于形成病毒DNA壳蛋白的包装信号，和E3区的缺失，从bp27865到30995。pBHG11的DNA不具有感染性，但pXC-1和pBHG11的共转染能通过同源重组产生具有感染性的病毒。
为了构建pXC-1上Ad5从bp1338到bp2501 DNA片断的亚克隆，应用以下二个合成的寡核苷酸片断，从pXC-1上扩增出PCR产物，引物如下：HZ1(5’-CTATCCTGAGACGCCCGAC-3’)HZ2(5’-GATCGGATCC
AGGTCTCCAGTAAGTGGTAGCTGC-3’)(下标线处为Bg1II位点)并将它克隆到pGEM-T载体上(Promega)，产生HZ102。为了构建HZ103，以Xba1和Bg1II消化HZ102，将得到的片断和以同样的方法进行切割的pXC-1进行连接。
为了在pXC-1 bp2025处构建一个终止位点，两个寡核苷酸链HZ3(5’-AAAGGATAAATGGAGTAAAGAAACC-3’)HZ4(5’CAGATGGGTTTCTTCACTCCATTTATCC-3’)被用于基因突变的过程，采用QuickChange(Strategene)，并产生质粒HZ104，以测序的方法检测改变的序列。为了构建HZ105，用Bg1II和Xba1消化HZ104，释放的片断，同以相同的方法切割的pXC-1连接。
S98病毒的产生是通过二个重叠的质粒DNA，以同源重组的方法得到。挑选得到的噬斑，并在HYH细胞中扩增。病毒DNA从Qiagen血液试剂盒得到，用PCR和Southern-Blot法分析。
S98-001的产生是HZ105DNA同pBHG11DNA共转染得到的。S98-001属于人腺病毒5型，保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：武汉大学)保藏号：CCTCC NO：V98003。同样，S98-002和S98-100是以pBHG11和HZ103DNA或pXC-1DNA共转染得到的。
S98-100是S98野生型腺病毒，它含有E3区的缺失，从图距77.5mu到86.2mu(见图1)。它可用做阳性对照，来检测S98病毒的特异性和杀伤力。
S98-001是腺病毒在E1B区发生一突变，此突变是缺失了一段合成495R蛋白(55KD)的核酸序列，以及同495R相关的合成mRNA-13s，14s和14.5s的序列，但并未影响其175R(19KD)蛋白的结构。
S98-002是另一个Ad突变株，同S98-001类似，除了它仍具有合成mRNA-13s，14s和14.5s的序列。无论是S98-001还是S98-002，都能产生具有功能性的E1B19KD蛋白，即仍可抑制细胞的凋亡。
S98病毒的结构是通过PCR，测序和Southern法进行确证。我们假设：基因工程S98腺病毒，当它不表达E1B55KD蛋白，它应该在正常细胞内无法复制，但可以在p53缺陷型细胞中大量复制。
实施例2 用噬斑法进行体外检测
首先采用噬斑法在p53缺陷型细胞中检测这类病毒的生长能力，即定量检测特定病毒感染某一细胞株的能力。噬斑法应用以下的细胞株：卵巢癌细胞株(OVCAR-3，p53突变株)，肝癌细胞株(Hep3B，p53突变株)神经胶质瘤细胞株(U373，p53突变株)，结肠癌细胞株(SW620，p53突变株和RKO，p53正常株)，乳腺正常细胞(HBL-100，p53正常株)。因为HYH细胞表达E1A和E1B蛋白，S98病毒能对这些细胞株有效的形成噬斑。
表1显示了被测病毒的复制样本的平均百分比。对于所有的细胞系，将一个特定的病毒的滴度同它对HYH细胞的滴度进行标准化，这样病毒和相应细胞系之间具有可比性。当某一细胞系的滴度同HYH细胞系的滴度均为标准化时，重组病毒的数量即可同S98-100，即野生型腺病毒具有可比性。S98基因工程病毒同野生型腺病毒的比率可用来评估病毒复制的有效性，以及对肿瘤细胞的特异性。例如，当比率小于100，表明被测病毒形成噬斑的能力小于野生型腺病毒。相反，当比率大于100时，则表明此病毒形成噬斑的能力比野生型腺病毒形成噬斑的能力更强。
从此噬斑检测中，可观察到：首先，S98-001和S98-002在p53缺陷的细胞中有明显的复制优势。例如：S98-001和S98-002同S98-100相比，能更有效的诱导p53缺陷细胞发生病变，Hep3B，卵巢癌细胞，结肠癌细胞。其次，S98-001和S98-002在p53功能正常的癌细胞和正常的人细胞中，发生病毒复制并导致细胞裂解的数目很少，其形成噬斑的数量呈数量级的减少。例如，在p53功能正常的结肠癌细胞RKO中，S98-001和S98-002比S98-100产生的噬斑数量，分别少470倍和250倍。在人正常的乳腺癌细胞中也取得了类似的结果。而S98-100在HBL-100细胞中形成噬斑的能力比S98-001和S98-002分别超出3000倍和1000倍。因此，基因工程腺病毒介导的细胞裂解，相对野生型腺病毒而言，在p53功能正常的细胞中呈数量级的减少。
该实验表明，S98-001和S98-002在p53功能正常的细胞中(即HBL-100和RKO)形成的噬斑数明显少于在p53功能缺陷的癌细胞中(即OVCAR-3，Hep3B，U373，SW620)形成的噬斑数。表1 噬斑法表示S98基因工程腺病毒在p53缺陷的人肿瘤细胞中的选择性复制注：
1.OVCAR-3是p53缺陷型的卵巢癌细胞系
2.Hep3B是p53缺陷型的肝癌细胞系
3.U373是p53缺陷型的神经胶质瘤细胞系
4.SW620是p53缺陷型的结肠癌细胞系
5.RKO是p53功能正常的结肠癌细胞系
6.HBL-100是p53功能正常的正常乳腺细胞
实施例3体外细胞试验
第2个实验是观察不同病毒复制的特点和细胞产生的病变。其实验过程如下所述。以逐渐递增的病毒感染量来感染细胞，并监测细胞发生的病变。当观察到MOI为0.01时，野生型腺病毒可使培养的单层细胞完全裂解，此即为实验的终点。选择人微管内皮细胞(hMVEC，来源于人肺)，一种原代不可再生的细胞，在体外检测它对S98基因工程病毒和野生型腺病毒的敏感性。
结果表明，当S98-100在MOI为0.01时，10天内可使培养的单层细胞完全裂解。相反，S98-002感染的正常单层细胞，在相同的时间点，MOI分别为10，1.0，0.1，和0.01时，没有呈现明显的细胞病变。只有当MOI比野生型腺病毒大100倍和1000倍时，才能观察到相应的细胞病变的现象。因此，S98基因工程腺病毒同野生型腺病毒相比，对人正常细胞造成的细胞病变大大减少。
实施例4病毒滴定实验为了确定病毒的复制是否同S98基因工程腺病毒在p53缺陷的细胞和正常细胞中产生的细胞病变相关，我们在p53缺陷的细胞和正常细胞中以不同的病毒滴度进行实验，所选细胞为hMVEC。当细胞生长至70％-90％融合时，分别以野生型腺病毒、S98-001和S98-002感染90分钟，MOI为10。感染48小时后，将细胞三次冻融，释放出病毒，上清用HYH细胞滴定。将S98-001和S98-002在48小时感染细胞后产生的病毒数，同野生型腺病毒在同样的细胞株和同样的细胞周期内产生的病毒数进行标准化计算。
试验表明，对正常细胞，S98基因工程病毒同野生型相比，病毒的滴度小于100倍。而对OVCAR-3细胞系，S98-001和S98-002是S98-100的病毒滴度的30％。这再一次证明，S98基因工程腺病毒在人正常细胞中的复制量很少。
实施例5.动物实验
首先将C33A细胞(人宫颈癌，p53缺陷型)、A549细胞(人肺癌，p53正常型)皮下注射到雌性无胸腺的裸鼠体内，当肿瘤体积大于200ul时，直接将S98-001/S98-002注射到肿瘤组织中，以S98-100为阳性对照，10％甘油的PBS溶液作为阴性对照。每种病毒分别接种各10个C33A和A549肿瘤。病毒的注射剂量分别为108PFU/mm3，107PFU/mm3，106PFU/mm3，105PFU/mm3，连续注射，共注射6天。每周记录一次肿瘤的生长情况，连续记录6周，结果列于表2。并见图3。
表二S98-001动物药效学试验数据(n＝10)
| 天数 | 第1组 | 第2组 | 第3组 | 第4组 | 对照组 |
| 0天 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 7 | 85.87 | 142.55 | 160.35 | 242.85 | 245.19 |
| 14 | 84.78 | 139.08 | 189.80 | 235.94 | 354.16 |
| 21 | 75.02 | 161.66 | 244.28 | 274.31 | 424.55 |
| 28 | 63.51 | 216.88 | 276.37 | 300.03 | 545.92 |
注：
1.表中1-4组所用的病毒的注射剂量分别为109颗粒数/mm3，
108颗粒数/mm3，107颗粒数/mm3，106颗粒数/mm3。
2.*以给药后当天的瘤体积为100。
结果表明，S98-001接种到C33A裸鼠身上以后，1周后即观察到肿瘤体积减小，这种趋势一直得到保持，5周后愈加明显，到第六周后，肿瘤体积已缩减到原体积的1/3，即缩小了近70％，其中有一个肿瘤完全消失。在停止给药后，肿瘤体积仍在不断缩小。而在阴性对照组中，在给药后，肿瘤体积持续增大，6周后，是原肿瘤体积的近4倍。因此，同阴性对照组相比，S98-001给药组的肿瘤体积缩小了10倍以上。对于A549裸鼠，在6周后，S98-001给药组同对照组的肿瘤体积差别很小，均持续增大，最后直至溃破。对于S98-001，在同样的剂量下，无论何种肿瘤模型均可使肿瘤体积明显缩小，其程度大于S98-001(94％)。从而证实了S98-001可选择性地杀死p53缺陷型肿瘤细胞。
本发明的基因工程腺病毒可经本领域的常规技术进行纯化，纯化后的基因工程腺病毒可用本领域常用的可药用载体(如缓冲液等)制成常规的制剂形式如冻干制剂、混悬液等进行使用。
本发明的方法也试用于准备其它重组病毒，如人乳头瘤病毒，SV40，它们都缺少能同P53蛋白相结合并使之失活的相应的病毒蛋白。如人乳头瘤病毒突变株不能编码正常的E6蛋白，此蛋白即能同P53蛋白结合，因此它能在p53缺陷的肿瘤细胞中大量复制，并最终杀死肿瘤细胞。相应的，在正常细胞中，它不能进行复制。
本发明还包括给肿瘤病人用药的一系列步骤，即以此重组病毒给特定类型的p53缺陷的肿瘤病人用药。
尽管上文以实施例详细描述了本发明，但本领域专业人员应当理解，可对本发明进行任何改变而不偏离本发明的范围。
Claims (5)
1.一种重组腺病毒，其特征在于该病毒不能表达可与细胞内功能性p53肿瘤抑制基因产物结合的E1B-55KD多肽，并缺失了E3区。
2.权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述病毒可在p53缺陷的肿瘤细胞中大量复制，形成感染性病毒颗粒。
3.权利要求2所述的重组腺病毒是S98-001，保藏号为CCTCC NO：V98003。
4.一种药物组合物，该组合物含有杀死肿瘤细胞有效量的权利要求1-3中任一项所述的重组腺病毒及可药用载体。
5.一种根据权利要求1-3中任一项所述的重组腺病毒在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108338994A (zh) * | 2017-01-25 | 2018-07-31 | 杭州康万达医药科技有限公司 | 溶瘤病毒作为用于治疗肿瘤和/或癌症的免疫刺激剂的应用 |
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Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1655827B (zh) * | 2002-05-27 | 2010-06-23 | 佩尔·松内·霍尔姆 | 腺病毒和编码其的核酸的新应用 |
| CN1528887A (zh) * | 2003-10-15 | 2004-09-15 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 肿瘤靶向双基因-病毒的构建方法 |
| KR101169109B1 (ko) | 2004-05-26 | 2012-07-26 | 싸이오서스 테라퓨틱스 엘티디. | 암 치료에 사용하기 위한 키메릭 아데노바이러스 |
| CN103501824A (zh) * | 2011-02-18 | 2014-01-08 | Uab研究基金会 | 与嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的前体药物的改进的治疗用途相关的应用 |
| ES2661132T3 (es) | 2013-10-25 | 2018-03-27 | Psioxus Therapeutics Limited | Adenovirus oncolíticos armados con genes heterólogos |
| DK3288573T3 (da) | 2015-04-30 | 2020-03-16 | Psioxus Therapeutics Ltd | Onkolytisk adenovirus, der koder for et b7-protein |
| MY193281A (en) | 2015-12-17 | 2022-09-30 | Psioxus Therapeutics Ltd | Group b adenovirus encoding an anti-tcr-complex antibody or fragment |
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| WO2018041838A1 (en) | 2016-08-29 | 2018-03-08 | Psioxus Therapeutics Limited | Adenovirus armed with bispecific t cell engager (bite) |
-
1998
- 1998-07-15 CN CN98103219A patent/CN1110553C/zh not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SCIENCE274(5268) 1996-10-18 Bischoff JR An adenovirus mutant that repIicates seIectiveIY inp53-deficient human tumor ceIIs * |
| SCIENCE274(5268) 1996-10-18 Bischoff JR An adenovirus mutant that repIicates seIectiveIY inp53-deficient human tumor ceIIs;中国地方病学杂志17(2) 1998-03-01 介导野生型P53基因转移的重组腺病毒的构建研究基因工程腺病毒及其用途 * |
| 中国地方病学杂志17(2) 1998-03-01 介导野生型P53基因转移的重组腺病毒的构建研究基因工程腺病毒及其用途 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10980859B2 (en) | 2013-09-02 | 2021-04-20 | Hangzhou Converd Co., Ltd. | In vivo individualized systemic immunotherapeutic method and device |
| CN108338994A (zh) * | 2017-01-25 | 2018-07-31 | 杭州康万达医药科技有限公司 | 溶瘤病毒作为用于治疗肿瘤和/或癌症的免疫刺激剂的应用 |
| US11357804B2 (en) | 2017-01-25 | 2022-06-14 | Hangzhou Converd Co., Ltd. | Application of oncolytic viruses as immunostimulants for treatment of tumors and/or cancers |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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