JP2019532621A - 二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）で武装したアデノウイルス - Google Patents

二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）で武装したアデノウイルス Download PDF

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Abstract

少なくとも２つの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）で武装した修飾アデノウイルス、特にエナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）（ＥｎＡｄ）であって、それぞれが少なくとも２つの結合ドメインを含み、そのドメインのうちの少なくとも１つが、対象のＴ細胞などの対象の免疫細胞上の表面抗原に特異的である、修飾アデノウイルス。ウイルスを含む医薬製剤などの組成物、ウイルスの使用、及び癌の治療などにおける治療のためのウイルス製剤も提供される。本開示はまた、ウイルスを調製するための方法にも及ぶ。【選択図】図３１

Description

本開示は、少なくとも１つのドメインが、対象のＴ細胞上の表面抗原に特異的である、少なくとも２つの結合ドメインを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）で武装した修飾アデノウイルス、特にエナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）（ＥｎＡｄ）に関する。本開示はさらに、特に治療、それも癌の治療における、ウイルス、ウイルスの使用、及びウイルス製剤を含む医薬製剤などの組成物に関する。本開示はまた、ウイルス及びそれをコードするＤＮＡを調製するための方法にも及ぶ。
患者とその愛する人たちの困難と苦しみ、そしてまた患者の治療、介護及び支援にかかる高い経済的費用という点でも、癌はいまだに社会にとって大きな社会的負担である。
化学療法剤、放射線療法及びごく最近では抗体などの生物製剤を含む、多種多様な療法が癌の治療のために開発されてきた。癌に対する抗体ベースの治療法は過去１５年間にわたって確立されてきており、現在は血液悪性腫瘍及び固形腫瘍を有する患者を治療するための最も成功した重要な戦略の１つである。現在臨床的に使用されているモノクローナル抗体ベースの抗癌療法の例には、ＣＤ２０を標的とするリツキシマブ、ＶＥＧＦを標的とするベバシズマブ、ＥＧＦＲを標的とするセツキシマブ、及びＣＥＡを標的とするラベツズマブが含まれる。
開発された様々な抗体フォーマットの中で、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は多くの見込みを示している。これらは、Ｔ細胞のＴＣＲ複合体のＣＤ３εサブユニットに特異的であり、そしてまた癌抗原のような対象の抗原を標的とする比較的単純な二重特異性分子である。ＢｉＴＥはＴＣＲ複合体に特異的であるので、これは、それらの細胞表面上に特定の標的抗原を発現する細胞、例えば癌細胞を死滅させるためにＢｉＴＥが常在Ｔ細胞を活性化することを可能にする。ＢｉＴＥの重要な特性は、ＣＤ４＋及び非活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞に、癌細胞を標的にさせる能力である。言い換えれば、ＢｉＴＥＳによって活性化されたＴ細胞は、細胞表面上のＭＨＣ発現とは無関係に細胞を死滅させるようにすることができる。いくつかの腫瘍細胞はＭＨＣを下方制御し、それによってそれらがＣＡＲ−Ｔ細胞及びｉｍｍＴＡＣなどの薬剤に対して耐性になるので、これは重要である。
残念なことに、ＢｉＴＥは完全長抗体と比較して乏しい循環動態を有する。これは、患者に投与したときに、大部分のＢｉＴＥがそれらの標的細胞に到達しないことを意味する。さらに、ＢｉＴＥの一部としての高親和性抗ＣＤ３ ＳｃＦｖの使用は、血中のＴ細胞への強い結合をもたらし得、これはまた、腫瘍への送達をも妨害する。結果として、ＢｉＴＥは、それらが腫瘍細胞に効果的に送達され得ないので、抗癌治療としてのそれらの最大の可能性に達することができない。
固形腫瘍が、例えば腫瘍の周りに間質を発達させることにより、多くの方法でインビボでそれら自身を保護することがより明らかになっているので、腫瘍細胞へのＢｉＴＥのような治療薬の効果的送達の必要性はますます重要になっている。癌腫への進行は、活性化腫瘍間質の発生と共に上皮細胞（有糸分裂細胞）の増殖と関連している。この場合、ターンオーバーが増加するため、コラーゲンバンドルなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分が分解される。炎症細胞の数が増加し、線維芽細胞が筋線維芽細胞に分化し、その結果、増殖因子、マトリックス成分及び分解プロテアーゼが発現する。血管新生は維持され、その結果多数の漏出性腫瘍血管が生じる。持続的な血管新生を伴う腫瘍間質の活性化に続いて、腫瘍細胞による浸潤が、分解した基底膜を通して始まり、そして血管が腫瘍組織に浸潤する。
この間質は、それが腫瘍と戦うために送られる免疫細胞を捕捉する機能を有し得るという点で物理的保護である。さらに間質は、腫瘍の低酸素状態の微小環境を遮蔽し、これは許容され、腫瘍の増殖に最適化される。間質内の細胞が腫瘍内のエネルギー源であるという理論がいくつかある。
腫瘍間質の大部分は線維芽細胞であり、これは癌の目的を果たすために破損している。間質に浸潤する他の細胞は腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）であり、これは免疫応答を抑制するＩＬ−１０などのサイトカイン及びケモカインを分泌することによって腫瘍増殖を促進することができる２型（Ｍ２）マクロファージである。
環境を形成する細胞は、体全体に見られる「天然の」免疫組織細胞又は結合組織細胞であるため、腫瘍間質を標的にすることは特に困難である。従って、これらの細胞を治療薬で標的化することは、深刻な標的外効果をもたらし得る。
それ故に、それが最大の治療上の利益、特に間質性線維芽細胞に囲まれた腫瘍細胞への送達を提供することができる腫瘍細胞へ直接ＢｉＴＥを送達する改良された方法が必要とされている。
本発明者らは、治療薬を腫瘍に直接送達するための最も効果的な方法の１つは、例えば間質におけるようなＴ細胞を活性化し抗原を標的とする薬剤を発現するように操作された腫瘍溶解性アデノウイルスを用いることである。
従って、本開示は、式（Ｉ）：
５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−Ｂ２−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ（Ｉ）
式中、
Ｂ１は結合であるか、又はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はＥ１Ａ−Ｅ１Ｂを含み、
ＢＡは、−Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含み、
Ｂ２は結合であるか、又はＥ３を含み、
ＢＸは結合であるか、又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子、又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、
ＢＢはＬ５を含み、
ＢＹは結合であるか、又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子、又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、
Ｂ３は結合であるか、又はＥ４を含み、
アデノウイルスは、少なくとも２つの結合ドメインを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）をコードし、前記ドメインのうちの少なくとも１つは、対象のＴ細胞などの目的の免疫細胞上の表面抗原に特異的であり、前記アデノウイルスはさらに第２のＢｉＴＥをコードし、
アデノウイルスはＥｎＡｄ又はＡｄ１１である、式（Ｉ）の配列を含むアデノウイルスを提供する。
本開示による１つ又は複数のＢｉＴＥは、膜貫通ドメインを含まず、従って癌細胞表面上に発現されず、むしろ癌細胞からのＢｉＴＥ分子の放出を促進するためのシグナル配列を含む。
以下の段落は、本開示の概要である。
１．式（Ｉ）：
５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−Ｂ２−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ（Ｉ）
式中、
Ｂ１は結合であるか、又はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はＥ１Ａ−Ｅ１Ｂを含み、
ＢＡは、−Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含み、
Ｂ２は結合であるか、又はＥ３を含み、
ＢＸは結合であるか、又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子、又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、
ＢＢはＬ５を含み、
ＢＹは結合であるか、又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子、又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、
Ｂ３は結合であるか、又はＥ４を含み、
アデノウイルスは、少なくとも２つの結合ドメイン、Ｂｄ１及びＢｄ２を含む第１の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）をコードし、Ｂｄ１などの前記ドメインの少なくとも１つは、Ｔ細胞及び少なくとも２つの結合ドメイン、Ｂｄ３及びＢｄ４を含む第２のＢｉＴＥなどの免疫細胞上の表面抗原に特異的であり、ならびに少なくとも１つの前記結合ドメイン、例えばＢｄ３は、Ｔ細胞などの免疫細胞上の表面抗原に特異的であり、
アデノウイルスはＥｎＡｄ又はＡｄ１１である、式（Ｉ）の配列を含むアデノウイルスを提供する。
２．アデノウイルスはＥｎＡｄである、段落１に記載のアデノウイルス。
３．表面抗原がＣＤ３、ＴＣＲ−α及びＴＣＲ−βなどのＴ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）の成分である、段落１又は２に記載のアデノウイルス。
４．表面抗原がＣＤ３−ε、ＣＤ３−γ、及びＣＤ３−δ、特にＣＤ３−εのようなＣＤ３である、段落３に記載のアデノウイルス。
５．ＢｉＴＥ中の結合ドメインの１つがＣＤ３１、ＣＤ２及びＣＤ２７７のような非ＴＣＲ活性化タンパク質に特異的である、請求項１又は２に記載のアデノウイルス。
６．第１のＢｉＴＥ中の結合ドメイン（例えばＢｄ１）及び第２のＢｉＴＥ中の結合ドメイン（例えばＢｄ３）が、Ｔ細胞などの免疫細胞上の同じ表面抗原に特異的である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
７．第１のＢｉＴＥ中の結合ドメイン（例えばＢｄ１）及び第２のＢｉＴＥ中の結合ドメイン（例えばＢｄ２）が、例えば同一の又は異なる免疫細胞上で、異なる表面抗原に特異的である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
８．前記第１のＢｉＴＥ中のＢｄ２及び前記第２のＢｉＴＥ中のＢｄ４が同じ対象の抗原に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
９．前記第１のＢｉＴＥ中のＢｄ２及び前記第２のＢｉＴＥ中のＢｄ４が異なる対象の抗原に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
１０．結合ドメインの１つが、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ受容体ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＥＭ、Ａ３３、Ｇ２５０、炭水化物抗原Ｌｅｙ、ＬｅＸ、Ｌｅｂ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｅ−カドヘリン、ＳＰＡＲＣ、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３などの腫瘍抗原に特異的である、段落１〜９のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
１１．結合ドメインの１つ、例えばＢｄ２及び／又はＢｄ４が、ＥｐＣＡＭ、例えば配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含むＥｐＣＡＭに特異的である、段落１０に記載のアデノウイルス。
１２．結合ドメインのうちの１つが腫瘍間質抗原、例えば線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＴＲＥＭ１、ＩＧＦＢＰ７、ＦＳＰ−１、血小板由来成長因子−α受容体（ＰＤＧＦＲ−α）、血小板由来成長因子−β受容体（ＰＤＧＦＲ−β）及びビメンチンに特異的である、段落１〜４のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
１３．結合ドメインのうちの１つ、例えばＢｄ２及び／又はＢｄ４が、ＦＡＰ、例えば配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含むＦＡＰに特異的である、段落１２に記載のアデノウイルス。
１４．間質抗原が抗原であり、骨髄由来サプレッサー細胞抗原、腫瘍関連マクロファージ、及びそれらの組み合わせから選択される、段落１２又は１３に記載のアデノウイルス。
１５．抗原がＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＳＦ１受容体、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＤ６６ｂ及びそれらの２つ以上の組み合わせから選択される、段落１４に記載のアデノウイルス。
１６．ＢＸ又はＢＹの少なくとも一方が結合ではない、段落１〜１５のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
１７．アデノウイルスがキメラである、段落１〜１６のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
１８．アデノウイルスが腫瘍溶解性である、段落１〜１７のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
１９．アデノウイルスの複製が可能である、段落１〜１８のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
２０．アデノウイルスに複製能力がある、段落１９に記載のアデノウイルス。
２１．アデノウイルスが複製能欠損型である、段落１〜１８のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
２２．ＢＸが、１つ又は複数の導入遺伝子又は導入遺伝子カセットを含む、段落１〜１２１のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
２３．ＢＹが１つ又は複数の導入遺伝子又は導入遺伝子カセットを含む、段落１〜２２のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
２４．１つ又は複数の導入遺伝子又は導入遺伝子カセットが、内因性プロモーターなどの内因性又は外因性プロモーターの制御下にある、段落１〜２３のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
２５．導入遺伝子又は導入遺伝子カセットがＥ４プロモーター及び主要後期プロモーター、特に主要後期プロモーターからなる群から選択される内因性プロモーターの制御下にある、段落２４に記載のアデノウイルス。
２６．導入遺伝子又は導入遺伝子カセットが、ＣＭＶなどの外因性プロモーターの制御下にある、段落２４に記載のアデノウイルス。
２７．導入遺伝子カセットが、
ａ．スプライスアクセプター配列、
ｂ．内部リボソーム進入配列又は高い自己切断効率のＡペプチド、
ｃ．Ｋｏｚａｋ配列、及び
ｄ．それらの組み合わせから独立して選択される調節エレメントをさらに含む、段落１〜２６のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
２８．導入遺伝子カセットがタンパク質コード配列の開始点にあるコザック配列を含む、段落２７に記載のアデノウイルス。
２９．導入遺伝子カセットが高い自己切断効率のＡペプチドをコードする、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
３０．導入遺伝子カセットがポリアデニル化配列をさらに含む、段落１〜２９のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
３１．導入遺伝子カセットが、ＤＮＡ配列の「末端」及び／又はＤＮＡ配列の「末端」に制限部位をさらに含む、段落１〜３０のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
３２．少なくとも１つの導入遺伝子カセットがモノシストロニックｍＲＮＡをコードする、段落１〜３１のいずれかに記載のアデノウイルス。
３３．ＢｉＴＥが短い半減期、例えば４８時間以下を有する、段落１〜３２のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
３４．ＢｉＴＥが、Ｅ１、Ｅ３、ＢＸ、ＢＹ及びそれらの組み合わせから選択される領域にコードされている、段落１〜３３のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
３５．ＢｉＴＥが、例えば主要後期プロモーターの制御下で、少なくともＢＸ位にコードされている、段落３４に記載のアデノウイルス。
３６．第１のＢｉＴＥ分子が腫瘍抗原、例えば腫瘍抗原（例えば本明細書に記載のもの）に特異的であり、第２のＢｉＴＥ分子が腫瘍間質抗原、例えば間質抗原（例えば本明細書に記載のもの）に特異的である、段落１〜３５のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
３７．アデノウイルスがサイトカイン又はケモカイン又は免疫調節剤（サイトカイン又はケモカインなど）をさらに含む、段落１〜３６のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
３８．サイトカイン又はケモカインは、ＭＩＰ１α、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、リンホトキシンα（ＬＴＡ）、Ｆｌｔ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ）−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、リンホトキシンα（ＬＴＡ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１）、例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５など、ＩＬ−２１、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、リンホトキシンα（ＬＴＡ）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１から選択される、段落３７に記載のアデノウイルス。
３９．アデノウイルスが、抗体もしくは抗体フラグメントなどの免疫調節剤、又はＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−３、ＩＬＴ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ又はＣＤ１６０、例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に対する、又はＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＩＣＯＳ、Ｂ７Ｈ２、ＴＬ１Ａ及び４−１ＢＢなどの共刺激分子に対する、チェックポイントタンパク質に特異的な、タンパク質もしくはペプチドリガンドをさらに含む、段落１〜３８のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
４０．ＢｉＴＥが、配列番号８、１３もしくは１８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、又はこれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、段落１〜３９のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
４１．ＢｉＴＥが、配列番号９、１２、もしくは１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又はこれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、段落１〜４０のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
４２．ＢｉＴＥが、配列番号７、１１もしくは１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ、又はこれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、段落１〜４１のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
４３．ＢｉＴＥが、配列番号２もしくは４に記載のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、例えば配列番号７３もしくは７５に記載のアミノ酸配列を含む、段落１〜４２のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
４４．アデノウイルスが配列番号１２０に記載のＤＮＡ配列を含む、段落１〜４３のいずれか一段落に記載のアデノウイルス。
４５．段落１〜４１のいずれか一段落に記載のアデノウイルス及び希釈剤又は担体を含む組成物。
４６．製剤が第２の腫瘍溶解性ウイルス、例えばＡｄ１１又はその誘導体、例えばＥｎＡｄを含み、特に追加のウイルスが本開示によるものである、請求項４５に記載の組成物。
４７．患者を治療する方法であって、段落１〜４４のいずれか一段落に記載のアデノウイルス又は段落４６の組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
４８．癌、特に固形腫瘍の治療のための、段落４７に記載の方法。
一実施形態では、本開示によるアデノウイルスは、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子、例えば１、２、３又は４つのさらなる導入遺伝子をコードする。
一実施形態では、異なる切断ペプチドが各遺伝子間でコードされている。
一実施形態では、すべての導入遺伝子がウイルス内の１箇所にあり、例えばＢＹに位置している。
有利には、本発明者らは、アデノウイルスにＢｉＴＥ分子で武装することにより、二重特異性抗体フラグメント分子に癌細胞に選択的に感染するアデノウイルスの能力に「便乗」させ、それによって腫瘍細胞へのＢｉＴＥの標的送達を可能にすることを発見した。
有利には、ＢｉＴＥは小さく、哺乳動物細胞中で生成することができる。従って、本開示のアデノウイルスに感染すると、ＢｉＴＥ分子は腫瘍細胞によって合成され、分泌され、局所的に作用してウイルスの直接のフットプリントを超えて広がることがある。従って、これはＢｉＴＥが感染の直接の部位を超えて広がることを可能にするが、同時に感染した腫瘍細胞の巣を過度に超えるウイルスの広がりを制限する。これにより、望ましくないオフターゲット効果のリスクが最小限に抑えられる。
一実施形態では、アデノウイルスはＥｎＡｄである。ＥｎＡｄは、先行技術のアデノウイルスと比較して腫瘍溶解活性が増強されていることが示されている。ＥｎＡｄは、結腸癌細胞、肺癌細胞、膀胱癌細胞及び腎臓癌細胞などのヒト上皮由来癌細胞に対して高い選択性を有することも示されている。Ｔ細胞はＢｉＴＥ分子によって活性化されて標的細胞を攻撃する一方、ＥｎＡｄは同時に癌細胞に感染し溶解することができるので、これはＢｉＴＥ分子にとって理想的な送達媒体となる。これは、相乗的な腫瘍溶解効果を有する、腫瘍に対する二面攻撃をもたらす。
一実施形態では、表面抗原は、ＣＤ３、ＴＣＲ−α及びＴＣＲ−βなどのＴ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）の構成要素である。
一実施形態では、表面抗原は、特定のＣＤ３ε、例えばＣＤ３ε、ＣＤ３γ、及びＣＤ３δなどのＣＤ３である。
一実施形態では、結合ドメインの一方は、例えば、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ受容体（例えばＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４など）、ＰＥＭ、Ａ３３、Ｇ２５０、炭水化物抗原ＬｅＹ、Ｌｅｘ、Ｌｅｂ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｅ−カドヘリン、ＳＰＡＲＣ、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３、特にＥｐＣＡＭなどの腫瘍抗原に特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つは、例えば配列番号２８に記載のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含むＥｐＣＡＭなどのＥｐＣＡＭに特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つは、例えば、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＴＲＥＭ１、ＩＧＦＢＰ７、ＦＳＰ−１、血小板由来成長因子−α受容体（ＰＤＧＦＲ−α）、血小板由来成長因子β受容体（ＰＤＧＦＲ−β）及びビメンチンなどの腫瘍間質抗原に特異的である。有利には、これらの抗原を発現する間質細胞（非形質転換細胞）は、形質転換細胞と同じレベルの変異耐性選択プロセスを受けない。従って、これらの細胞は「動く標的」ではないため、癌治療の標的にするのがより簡単である。さらに、間質細胞に見出される受容体の種類は、異なる種類の癌にわたって一般的であることが多い。従って、上記の抗原のうちの１つを標的とすることは、複数の癌の種類に有効である可能性が高い。
一実施形態では、結合ドメインの１つは、例えば配列番号３０に記載のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含むＦＡＰなどのＦＡＰに特異的である。有利には、ＦＡＰは腫瘍関連線維芽細胞において上方制御される。線維芽細胞は、成長、浸潤、及び介入からの回復を支持する固形癌の重要な構成要素である。それらは典型的には進行癌における細胞の４０〜６０％を占める。有利には、線維芽細胞は癌細胞より治療を免れる可能性が低い遺伝的に安定な細胞である。活性化線維芽細胞はまた、様々な種類の腫瘍にわたって比較的類似している。従って、Ｔ細胞を活性化してＦＡＰを発現する腫瘍関連線維芽細胞を標的化し死滅させることによって、本開示のアデノウイルスは、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、及びＩＤＯによって媒介されるものなどの免疫抑制経路のスペクトルを減少させるのに役立ち得る。
他の間質標的としては、腫瘍関連マクロファージ及び骨髄由来サプレッサー細胞抗原、例えばＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＳＦ１受容体、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＤ６６ｂ及びそれらの２つ以上の組み合わせが挙げられる。
一実施形態では、ＢｉＴＥ内の結合ドメインの１つは、ＣＤ３１、ＣＤ２、及びＣＤ２７７などの非ＴＣＲ活性化タンパク質に特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つは、ＣＤ３（ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ガンマなど）、ＴＣＲ−α鎖及びＴＣＲ−β鎖から選択されるような、対象のＴ細胞上の表面抗原に特異的であり、１つの結合ドメインは腫瘍抗原に特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つはＣＤ３に特異的であり、別の結合ドメインは、例えばＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ受容体ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＥＭ、Ａ３３、Ｇ２５０、炭水化物抗原ＬｅＹ、ＬｅＸ、Ｌｅｂ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｅ−カドヘリン、ＳＰＡＲＣ、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３からなる群から選択される、腫瘍抗原に特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つはＣＤ３（ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ガンマなど）に特異的であり、別の結合ドメインはＥｐＣＡＭに特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つはＣＤ３εに特異的であり、別の結合ドメインはＥｐＣＡＭに特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つは、ＣＤ３（ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ガンマなど）、ＴＣＲ−α及びＴＣＲ−βから選択されるような、対象のＴ細胞上の表面抗原に特異的であり、別の結合ドメインは腫瘍間質抗原に特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つは、ＣＤ３（ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ガンマなど）に特異的であり、別の結合ドメインは、例えば、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＴＲＥＭ１、ＩＧＦＢＰ７、ＦＳＰ−１、血小板由来成長因子−α受容体（ＰＤＧＦＲ−α）、血小板由来成長因子−β受容体（ＰＤＧＦＲ−β）及びビメンチンからなる群から選択される、腫瘍間質抗原に特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つはＣＤ３（ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ガンマなど）に特異的であり、別の結合ドメインはＦＡＰに特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つはＣＤ３εに特異的であり、別の結合ドメインはＦＡＰに特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つは、ＣＤ３、ＴＣＲ−α及びＴＣＲ−βなどの対象のＴ細胞上の表面抗原に特異的であり、別の結合ドメインは非ＴＣＲ活性化タンパク質に特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つはＣＤ３（ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン又はＣＤ３ガンマなど）に特異的であり、別の結合ドメインはＣＤ３１、ＣＤ２及びＣＤ２７７からなる群から選択される非ＴＣＲ活性化タンパク質に特異的である。
一実施形態では、結合ドメインの１つはＣＤ３εに特異的であり、別の結合ドメインはＣＤ３１、ＣＤ２及びＣＤ２７７からなる群から選択される非ＴＣＲ活性化タンパク質に特異的である。
一実施形態では、ＢＸ又はＢＹの少なくとも一方は結合ではない。
一実施形態では、ＢＸは結合ではない。
一実施形態では、ＢＹは結合ではない。
一実施形態では、ＢＸとＢＹの両方が結合ではない。
一実施形態では、アデノウイルスはキメラである。
一実施形態では、アデノウイルスは腫瘍溶解性である。
一実施形態では、アデノウイルスはキメラ及び腫瘍溶解性である。
一実施形態では、アデノウイルスは複製可能である。
一実施形態では、アデノウイルスはキメラ、腫瘍溶解性及び複製可能である。
一実施形態では、アデノウイルスは複製能力がある。
別の実施形態では、アデノウイルスはキメラ、腫瘍溶解性であり、及び複製能力がある。
一実施形態では、アデノウイルスは複製能欠損型であり、すなわちベクターである。
一実施形態では、ＢＸは導入遺伝子又は導入遺伝子カセット、特に本開示によるＢｉＴＥをコードする導入遺伝子カセットを含む。
一実施形態では、ＢＹは導入遺伝子又は導入遺伝子カセット、特に本開示によるＢｉＴＥをコードする導入遺伝子カセットを含む。
一実施形態では、ＢＹは導入遺伝子又は導入遺伝子カセット、特に本開示によるＢｉＴＥをコードする導入遺伝子カセットを含み、ＢＸは結合を表す。
一実施形態では、ＢＸとＢＹの両方が導入遺伝子又は導入遺伝子カセットを含む。
一実施形態では、１つ又は複数の導入遺伝子又は導入遺伝子カセットは、内因性プロモーターなどの内因性又は外因性プロモーターの制御下にある。有利には、これらのプロモーターの制御下にあるとき、ウイルスは複製能力を維持し、またＢｉＴＥ及び／又は他のタンパク質を発現することができる。従って、選択したＢｉＴＥは癌細胞によって発現される。外因性プロモーターを使用することは、それが抗体又はフラグメントを強くかつ構成的に発現することができるので、いくつかの実施形態において有利であり得、それはいくつかの状況において、例えば患者が非常に広汎な癌を有する場合に特に有用であり得る。内因性プロモーターを使用することは、それがＢｉＴＥを発現するために取り込まれる必要がある導入遺伝子カセットのサイズを減少させるので有利であり得、すなわち外因性プロモーターを含ませる必要がないので、カセットはより小さくなり得る。
従って、一実施形態では、導入遺伝子又は導入遺伝子カセットは、Ｅ４及び主要後期プロモーターからなる群、特に主要後期プロモーターから選択される内因性プロモーターの制御下にある。継続的に導入遺伝子を転写し、抗体又はフラグメントの不適切な濃度につながる可能性がある構成的外因性プロモーターとは対照的に、導入遺伝子はウイルスが癌細胞内で複製しているときにのみ発現されるので、内因性プロモーターをウイルス内で使用することも、治療文脈においては有利であり得る。
一実施形態では、導入遺伝子又は導入遺伝子カセット（例えば、ＢｉＴＥをコードする）は、ＣＭＶなどの外因性プロモーターの制御下にある。有利には、構成的外因性プロモーターの使用は、導入遺伝子の連続転写をもたらし、これはある場合には望ましい可能性がある。
一実施形態では、１つの導入遺伝子又は導入遺伝子カセット（例えばＢｉＴＥをコードする）は、内因性プロモーターの制御下にあり、別の導入遺伝子又は導入遺伝子カセット（例えばＢｉＴＥをコードする）は、外因性プロモーターの制御下にある。
一実施形態では、ウイルス中の導入遺伝子又は導入遺伝子カセット（例えばＢｉＴＥをコードする）の全てが、内因性プロモーターの制御下にある。
別の実施形態では、ウイルス中の導入遺伝子又は導入遺伝子カセット（例えば、ＢｉＴＥをコードする）の全てが、外因性プロモーターの制御下にある。
一実施形態では、導入遺伝子又は導入遺伝子カセットは、
ｉ）スプライスアクセプター配列、
ｉｉ）内部リボソーム進入配列又は高い自己切断効率の２Ａペプチド、
ｉｉｉ）Ｋｏｚａｋ配列、及び
ｉｖ）それらの組み合わせから独立して選択される調節エレメントをさらに含む。
従って、一実施形態では、導入遺伝子カセットは、ｉ）又はｉｉ）又はｉｉｉ）又はｉｖ）を含む。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは、ｉ）及びｉｉ）、又はｉ）及びｉｉｉ）、又はｉ）及びｉｖ）、又はｉｉ）及びｉｉｉ）、又はｉｉ）及びｉｖ）、又はｉｉｉ）及びｉｖ）を含む。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは、ｉ）及びｉｉ）及びｉｉｉ）、又はｉ）及びｉｉ）及びｉｖ）、又はｉ）及びｉｉｉ）及びｉｖ）、又はｉｉ）及びｉｉｉ）及びｉｖ）を含む。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは、ｉ）及びｉｉ）ならびにｉｉｉ）及びｉｖ）を含む。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは、タンパク質（例えばＢｉＴＥ）コード配列の開始点にＫｏｚａｋ配列を含み、これはｍＲＮＡの翻訳を補助する。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは、高い自己切断効率の２Ａペプチドをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子カセットはポリアデニル化配列をさらに含む。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは、ＤＮＡ配列の３’末端及び／又はＤＮＡ配列の５’末端に制限部位をさらに含む。
一実施形態では、少なくとも１つの導入遺伝子カセットがモノシストロニックｍＲＮＡをコードする。
一実施形態では、ＢｉＴＥ分子は、例えば４８時間以下の短い半減期を有する。
一実施形態では、ＢｉＴＥ分子は、Ｅ１、Ｅ３、ＢＸ、ＢＹ及びそれらの組み合わせから選択される領域にコードされている。有利には、本発明者らは、ウイルスのライフサイクル又はベクターの安定性に悪影響を及ぼすことなく、外因性又は内因性プロモーターの制御下で、様々な導入遺伝子をＢＸ及び／又はＢＹに挿入できることを確立した。
一実施形態では、ＢｉＴＥ分子は、例えば主要後期プロモーターの制御下で、少なくとも位置ＢＸでコードされている。有利には、導入遺伝子又は導入遺伝子カセットは、ＢｉＴＥ又は任意のさらなる分子をアデノウイルス自体と一緒に発現させることを可能にする。重要なことに、本発明者らは、ＢｉＴＥの発現がＥｎＡｄの複製能力に有意な影響を及ぼさず、その腫瘍溶解活性に悪影響を及ぼさないことを首尾よく実証した。
一実施形態では、ＢｉＴＥ分子は、例えば主要後期プロモーターの制御下で、少なくともＢＹ位置にコードされている。有利には、導入遺伝子又は導入遺伝子カセットは、ＢｉＴＥ又は任意のさらなる分子をアデノウイルス自体と一緒に発現させることを可能にする。重要なことに、本発明者らは、ＢｉＴＥの発現がＥｎＡｄの複製能力に有意な影響を及ぼさず、その腫瘍溶解活性に悪影響を及ぼさないことを首尾よく実証した。
一実施形態では、アデノウイルスはさらに第２のＢｉＴＥをコードする。
一実施形態では、第１のＢｉＴＥ分子は腫瘍抗原、例えば上記のような腫瘍抗原に特異的であり、第２のＢｉＴＥ分子は腫瘍間質抗原、例えば上記のような間質抗原に特異的である。
一実施形態では、第１のＢｉＴＥ分子は、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ受容体ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＥＭ、Ａ３３、Ｇ２５０、炭水化物抗原Ｌｅｙ、Ｌｅｘ、Ｌｅｂ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｅ−カドヘリン、ＳＰＡＲＣ、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３からなる群から選択される腫瘍抗原に特異的であり、第２のＢｉＴＥ分子は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＴＲＥＭ１、ＩＧＦＢＰ７、ＦＳＰ−１、血小板由来成長因子−α受容体（ＰＤＧＦＲ−α）、血小板由来成長因子−β受容体（ＰＤＧＦＲ−β）及びビメンチンからなる群から選択される腫瘍間質抗原に特異的である。
一実施形態では、第１のＢｉＴＥ分子はＥｐＣＡＭに特異的であり、第２のＢｉＴＥ分子は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＴＲＥＭ１、ＩＧＦＢＰ７、ＦＳＰ−１、血小板由来成長因子−α受容体（ＰＤＧＦＲ−α）、血小板由来成長因子−β受容体（ＰＤＧＦＲ−β）及びビメンチンからなる群から選択される腫瘍間質抗原に特異的である。
一実施形態では、第１のＢｉＴＥ分子は、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ受容体ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＥＭ、Ａ３３、Ｇ２５０、炭水化物抗原Ｌｅｙ、Ｌｅｘ、Ｌｅｂ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｅ−カドヘリン、ＳＰＡＲＣ、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３からなる群から選択される腫瘍抗原に特異的であり、第２のＢｉＴＥはＦＡＰに特異的である。
一実施形態では、第１のＢｉＴＥ分子はＥｐＣＡＭに特異的であり、第２のＢｉＴＥ分子はＦＡＰに特異的である。
別の実施形態では、第１のＢｉＴＥ分子は腫瘍抗原に特異的であり、第２のＢｉＴＥ分子は非ＴＣＲ活性化タンパク質に特異的である。
一実施形態では、第１のＢｉＴＥ分子は、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ受容体ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＥＭ、Ａ３３、Ｇ２５０、炭水化物抗原Ｌｅｙ、Ｌｅｘ、Ｌｅｂ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｅ−カドヘリン、ＳＰＡＲＣ、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３からなる群から選択される腫瘍抗原に特異的である。
一実施形態では、第１のＢｉＴＥ分子はＥｐＣＡＭに特異的であり、第２のＢｉＴＥ分子はＣＤ３１、ＣＤ２及びＣＤ２７７からなる群から選択される非ＴＣＲ活性化タンパク質に特異的である。
一実施形態では、第１のＢｉＴＥ分子は腫瘍間質抗原に特異的であり、第２のＢｉＴＥ分子は非ＴＣＲ活性化タンパク質に特異的である。
一実施形態では、第１のＢｉＴＥ分子は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＴＲＥＭ１、ＩＧＦＢＰ７、ＦＳＰ−１、血小板由来成長因子−α受容体（ＰＤＧＦＲ−α）、血小板由来成長因子−β受容体（ＰＤＧＦＲ−β）及びビメンチンからなる群から選択される腫瘍間質抗原に特異的であり、第２のＢｉＴｅ分子は、ＣＤ３１、ＣＤ２及びＣＤ２７７からなる群から選択される非ＴＣＲ活性化タンパク質に特異的である。
一実施形態では、第１のＢｉＴＥ分子はＦＡＰに特異的であり、第２のＢｉＴＥ分子はＣＤ３１、ＣＤ２及びＣＤ２７７からなる群から選択される非ＴＣＲ活性化タンパク質に特異的である。
一実施形態では、アデノウイルスは１つのＢｉＴＥのみを含む。
別の実施形態では、アデノウイルスは２つのＢｉＴＥを含む。
別の実施形態では、アデノウイルスは３つのＢｉＴＥを含む。
１つ、２つ又は３つのＢｉＴＥをコードすることに加えて、ウイルスは１、２、３又は４個のさらなる導入遺伝子をコードすることもできる。
一実施形態では、アデノウイルスはさらにサイトカイン又はケモカインをコードする。
一実施形態では、アデノウイルスはさらにサイトカインをコードする。
一実施形態では、アデノウイルスはケモカインをさらにコードする。
別の実施形態では、アデノウイルスはさらにサイトカイン及びケモカインをコードする。
一実施形態では、アデノウイルスは、１つのＢｉＴＥ、及び少なくとも１つのサイトカイン又はケモカイン、例えば１、２又は３個のサイトカイン、１、２又は３個のケモカイン、又はそれぞれの遺伝子がケモカインのサイトカインを独立にコードする、２個又は３個の遺伝子の組み合わせを含む。
別の実施形態では、アデノウイルスは、２つのＢＩＴＥ及び少なくとも１つのサイトカインもしくはケモカイン、例えば１もしくは２個のサイトカイン、１もしくは２個のケモカイン、又はサイトカインとケモカインとの組み合わせを含む。
別の実施形態では、アデノウイルスは３つのＢｉＴＥ及び少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインを含む。
一実施形態では、サイトカイン又はケモカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、リンホトキシンα（ＬＴＡ）及びＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、リンホトキシンα（ＬＴＡ）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、及びＣＣＬ２１から選択される。
一実施形態では、コードされるサイトカインは、ＴＮＦアルファスーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦは、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１５４、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＧＩＴＲリガンド、ＥＤＡ−Ａ、ＥＤＡ−Ａ２を含む）、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリー、ＩＬ−１ファミリー（すなわちＩＬ−１及びＩＬ−８）、ＩＬ−２ファミリー、ＩＬ−１０ファミリー、ＩＬ−１７ファミリー、インターフェロンファミリーから選択される。
一実施形態では、ケモカインは、ＭＩＰ−１アルファ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１を含む群から選択される。
一実施形態では、アデノウイルスは、チェックポイントタンパク質もしくは共刺激分子に特異的な抗体もしくは抗体フラグメント、又はタンパク質もしくはペプチドリガンドなどの免疫調節剤、又はそのような分子に対する特異的結合リガンドをさらに含む。
一実施形態では、免疫調節剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−３、ＩＬＴ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ又はＣＤ１６０、例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２などのチェックポイントタンパク質に特異的な抗体もしくは抗体フラグメント、又はタンパク質もしくはペプチドリガンドである。
一実施形態では、免疫調節剤は阻害剤、例えばチェックポイント阻害剤である。
一実施形態では、免疫調節剤はアゴニストである。
別の実施形態では、免疫調節剤は、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＩＣＯＳ、Ｂ７Ｈ２、ＴＬ１Ａ及び４−１ＢＢなどの共刺激分子に特異的な抗体もしくは抗体フラグメント、又はタンパク質もしくはペプチドリガンドである。
一実施形態では、アデノウイルスは、チェックポイントタンパク質に特異的な第１の抗体、抗体フラグメント、タンパク質又はペプチドリガンド、及び共刺激分子に特異的な第２の抗体、抗体フラグメント、タンパク質又はペプチドリガンドを含む。
一実施形態では、ＢｉＴＥは、配列番号８、１３又は１８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。
一実施形態では、ＢｉＴＥは、配列番号９、１２又は１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
一実施形態では、ＢｉＴＥは、配列番号７、１１、又は１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。
一実施形態では、本開示で使用するＢｉＴＥ（すなわち、アデノウイルスによってコードされる）は、配列番号８に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号９に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＬドメインを有する結合ドメインを含む。
一実施形態では、本開示で使用するＢｉＴＥ（すなわち、アデノウイルスによってコードされる）は、配列番号１３に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号１２に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＬドメインを有する結合ドメインを含む。
一実施形態では、本開示で使用するＢｉＴＥ（すなわち、アデノウイルスによってコードされる）は、配列番号１８に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号１７に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＬドメインを有する結合ドメインを含む。
一実施形態では、本開示で使用するＢｉＴＥ（すなわち、アデノウイルスによってコードされる）は、配列番号８に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号９に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＬドメインを有する結合ドメイン、ならびに配列番号１３に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号１２に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＬドメインを有する結合ドメインを含む。
一実施形態では、本開示で使用するＢｉＴＥ（すなわち、アデノウイルスによってコードされる）は、配列番号８に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号９に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＬドメインを有する結合ドメイン、ならびに配列番号１８に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＨドメイン、及び配列番号１７に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を有するＶＬドメインを有する結合ドメインを含む。
一実施形態では、本開示で使用するＢｉＴＥ（すなわち、アデノウイルスによってコードされる）は、配列番号７、１１、１６に示す配列又はそのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む。
一実施形態では、本開示で使用するＢｉＴＥ（すなわち、アデノウイルスによってコードされる）は、配列番号７に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む。
一実施形態では、本開示で使用するＢｉＴＥ（すなわち、アデノウイルスによってコードされる）は、配列番号１１に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む。
一実施形態では、本開示で使用するＢｉＴＥ（すなわち、アデノウイルスによってコードされる）は、配列番号１６に示す配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む。
一実施形態では、ＢｉＴＥは、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、例えば配列番号７３又は７５に記載のアミノ酸を含む。
一実施形態では、本開示によるアデノウイルスは、配列番号３４〜３７のいずれか１つに記載のＤＮＡ配列、又はそれにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ酸配列を含む。
一実施形態では、本開示によるアデノウイルスは、配列番号７９〜８２のいずれか１つに記載のＤＮＡ配列を含む。
一実施形態では、本開示によるアデノウイルスは、配列番号３４、３５、３６、３７、７９、８０、８２、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１２０、２９８のいずれか１つに示されるＤＮＡ配列、又は同じウイルスをコードする配列、又はストリンジェントな条件下でそのいずれか１つにハイブリダイズする配列を含む。
一実施形態では、本開示によるアデノウイルスは、配列番号３４、３５、３６、３７、７９、８０、８２、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１２０又は２９８のいずれか１つに示されるＤＮＡ配列を含む。
当業者は、ＤＮＡコードに機能不全があることを認識しており、従って本開示は、本明細書に開示されたアミノ酸を有するＢｉＴＥをコードするＥｎＡｄ又はＡｄ１１に及ぶ。
Ｃ末端デカ−Ｈｉｓ（ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ、配列番号２４）親和性タグは、ＢｉＴＥ又はアデノウイルスの精製に有用である。ただし、これはオプションであり、たとえば最終製品では除外される可能性がある。当業者はまた、デカ−Ｈｉｓ以外の他の親和性タグを使用することができ、同様にＢｉＴＥ又はアデノウイルスの生物学的機能に影響を及ぼすことなく除外することができることを認識しているだろう。従って、一実施形態では、ＢｉＴＥは配列番号２又は４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むが、例えば配列番号７３又は７５に記載の配列のＣ末端にデカ−Ｈｉｓ親和性タグを除外する。別の実施形態では、アデノウイルスは、配列番号３４〜３７のいずれか１つに記載のＤＮＡ配列を含むが、例えば、配列番号７９〜８２のいずれか１つに記載のＤＮＡ配列などのデカ−Ｈｉｓ親和性タグは除外する。
デカ−Ｈｉｓ親和性タグの除外は、デカ−Ｈｉｓ親和性タグを含む本明細書に開示された他のすべての配列にさらに及び、すなわち本開示は、Ｃ末端デカ−Ｈｉｓタグを欠く同じアミノ酸又はＤＮＡ配列（ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ又はＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴ）を含み、例えば配列番号７２〜８２のいずれか１つに記載の通りである。
一実施形態では、本開示のウイルスによってコードされるＢｉＴＥは、外因性プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターの制御下にある。外因性は、導入遺伝子がＬ５領域とＥ４領域との間にある場合、ＭＰＬとコードされた導入遺伝子との間に配置され得る。
外因性は、導入遺伝子がＬ５領域とＥ３領域との間にある場合、コードされた導入遺伝子とＬ５との間に配置され得る。
一態様では、本明細書に記載のアデノウイルスと希釈剤又は担体とを含む組成物が提供される。
一態様では、本明細書に記載のアデノウイルス又は組成物の治療有効量を投与することを含む、患者を治療する方法が提供される。
一実施形態では、この方法は、癌、例えば上皮癌、特に固形腫瘍の治療のためのものである。
一実施形態では、本開示によるウイルスをチェックポイント阻害剤（例えばＰＤ−１又はＰＤＬ１阻害剤）と組み合わせて投与することを含む、特にチェックポイント阻害剤がウイルスをコードしている治療方法が提供される。
一実施形態では、チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１又はＰＤＬ１阻害剤などの本明細書の他の箇所に記載のもの）と組み合わせていない本開示によるウイルスを投与することを含む治療方法が提供され、特にここではチェックポイント阻害剤はウイルスをコードしていない。
本開示に従ってウイルスによってコードされるＢｉＴＥは、ウイルスの細胞傷害性を増強する能力を有する。
驚くべきことに、本開示に従ってウイルスによってコードされるＢｉＴｅｓは、ＣＤ４＋細胞及び／又はＣＤ８＋細胞、例えば腫瘍の腹水などの流体環境中のＴ細胞を含む、腫瘍の抑制的環境における細胞さえも活性化することができる。
有利には、本開示に従ってウイルスによってコードされるＢｉＴｅｓは、細胞傷害性Ｔ細胞、例えば腫瘍の腹水などの流動環境中のＴ細胞を含む、腫瘍の抑制的環境におけるＴ細胞さえも活性化することができる。
さらに驚くべきことに、本開示に従ってウイルスによってコードされるＢｉＴＥは、Ｔ細胞増殖を刺激（活性化）することができる。
本開示によるＢｉＴＥをコードするウイルスは、腫瘍の免疫抑制性微小環境を回避、克服、又は逆転させることができるように思われる。
一実施形態では、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞マーカー、例えばＣＤ２５の上方制御をもたらす。
一実施形態では、本開示によるウイルス中のＢｉＴＥの結合は、新生抗原に特異的である。
本開示はまた、本明細書に開示されている新規な配列にも及ぶ。
本明細書で使用される第１のＢｉＴＥは、本開示によるアデノウイルスによってコードされる２つのＢｉＴＥのうちの一方に与えられる標識である。これは、第２のＢｉＴＥに対する、ＢｉＴＥの位置又はＢｉＴＥの相対位置に関する参照又は制限ではない。
本明細書で使用される第２のＢｉＴＥは、本開示によるアデノウイルスによってコードされる２つのＢｉＴＥのうちの一方に与えられる標識である。これは、第１のＢｉＴＥに対する、ＢｉＴＥの位置又はＢｉＴＥの相対位置に関する参照又は制限ではない。
本明細書で使用されるＢｄ１及びＢｄ２は、第１のＢｉＴＥ中の結合ドメインの名目上の標識である。これは、前記第１のＢｉＴＥ内の結合ドメインの配向の位置に関する参照又は限定ではない。
本明細書で使用されるＢｄ３及びＢｄ４は、第２のＢｉＴＥ中の結合ドメインの名目上の標識である。これは、前記第２のＢｉＴＥ内の結合ドメインの配向の位置に関する参照又は制限ではない。
本明細書で使用する抗体という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも１つの抗原認識部位（本明細書では結合部位とも呼ばれる）を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、ペプチドなどの標的抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。別段の記載がない限り、この用語は全長抗体及び全長抗体を含む多重特異性抗体分子にまで及ぶ。
本明細書で使用される「抗体分子」は、抗体及びその結合フラグメント、ならびにそのいずれか１つの多重特異性フォーマットを含む。
本明細書で使用される抗原結合部位は、一対の可変領域、特に標的抗原と特異的に相互作用する同族対を含む、分子の一部を指す。
具体的には、本明細書で使用される場合、それが特異的である抗原のみを認識する結合部位、又はそれが非特異的である抗原に対する親和性と比較して、特異的である抗原に対して著しく高い結合親和性、例えば５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性を有する結合部位を指すことを意図する。
本明細書で使用される結合フラグメント又は抗体結合フラグメントは、抗体結合フラグメント、ならびにこれらに限定されないが、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントを含む、抗体結合フラグメントを含む、多重特異性抗体分子を指す（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６〜１１３６；Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ ２（３）、２０９〜２１７参照のこと）。これらの抗体フラグメントを作製及び産生するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６：１６５〜１８１を参照のこと）。本開示における使用のための他の抗体フラグメントは、国際特許出願ＷＯ０５／００３１６９、ＷＯ０５／００３１７０及びＷＯ０５／００３１７１に記載されるＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントを含む。多価抗体は、多重特異性、例えば二重特異性を含み得るか、又は単一特異性であり得る（例えば、ＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照のこと）。
一実施形態では、アデノウイルスは多重特異性抗体分子を含む。
本明細書で使用される多重特異性抗体分子は、２つ以上の抗原結合ドメイン、例えば２つ（二重特異性）又は３つ（三重特異性）又は４つ（四重特異性）結合ドメインを有する抗体分子を指す。
本開示の多重特異性抗体分子は、上記のものなどの様々な抗体フラグメントから構築することができる。例えば、ダイアボディは、ＳｃＦｖフラグメントの非共有二量体からなる二重特異性抗体分子であり、一方Ｆ（ａｂ’）２は、ヒンジ領域によって連結された２つのＦａｂフラグメントからなる二重特異性抗体分子である。従って、当業者は、二重又は多重特異性抗体分子を産生させるために、異なる抗体フラグメントを様々な組み合わせで配置することができることを認識するであろう。
三特異的又は四特異的抗体フォーマットの例には、Ｆａｂ３、トリアボディ、テトラボディ、トライボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、ＳｃＦｖ２−Ｆｃ、ｔａｎｄＡｂ及びＤＮＬ−Ｆａｂ３が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される二重特異性抗体分子は、同じ又は異なる抗原に結合し得る２つの抗原結合ドメインを有する分子を指す。ＢｉＴＥは二重特異性抗体分子のサブクラスである。
ドメインは異なる抗原に結合してもよい。
あるいは、ドメインは、抗原上の同じエピトープに結合すること、又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合することを含め、すべて同じ抗原に結合することができる。
二重特異性抗体フォーマットの例としては、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）−ＳｃＦｖ２、ｄｉ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ＳｃＤｉａｂｏｄｙ、ＳｃＤｉａｂｏｄｙ−ＣＨ３、Ｄｉａｂｏｄｙ−ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ＳｃＦｖ−ＣＨ３ ＫＩＨ（ｋｎｏｂｓ ｉｎ ｈｏｌｅｓ）、Ｆａｂ−ＳｃＦｖ、ＳＣＦｖ−ＣＨ−ＣＬ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＫＩＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ−Ｆｃ、Ｄｉａｂｏｄｙ−Ｆｃ、イントラボディ、ドック・アンド・ロック抗体、ＩｍｍＴＡＣ、ＨＳＡｂｏｄｙ、ＳｃＤｉａｂｏｄｙ−ＨＡＳ、ヒューマボディ及びタンデムＳｃＦｖ毒性が挙げられるが、これらに限定されない（例えばＣｈｒｉｓｔｏｐｈ Ｓｐｉｅｓｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２０１５）９５〜１０６ページ参照のこと）。
本開示のアデノウイルスは、対象のＴ細胞上の少なくとも表面抗原に特異的なＢｉＴＥを含む。Ｔ細胞表面抗原の例には、ＣＤ３、ＣＤ２、ＶＬＡ−１、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ５、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１９７、ＣＤ１２７、ＣＤ３８、ＣＤ２７、ＣＤ１９６、ＣＤ２７７及びＣＸＣＲ３、特にＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３１及びＣＤ２７７が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、約５５ＫＤａの単一ペプチド鎖上の２ｓｃＦｖの異なる抗体又は４つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列を含む人工二重特異性モノクローナル抗体のクラスを指す。ｓｃＦｖの１つは、Ｔ細胞の表面に発現されるＣＤ３受容体のようなＴ細胞抗原のような免疫細胞に特異的である。他のｓｃＦｖは典型的には腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合する。従って、ＢｉＴＥは、Ｔ細胞上の抗原及び腫瘍細胞上の抗原に対するそれらの特異性のおかげで、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間のリンクを形成することができる。これは、Ｔ細胞の活性化を導き、ＭＨＣ Ｉ又は共刺激分子とは無関係に、Ｔ細胞がそれらの細胞傷害作用を腫瘍細胞に及ぼすように誘発する。現在承認されているか又は臨床試験を受けているＢＩＴＥベースの療法の例には、例えばＣＤ１９を標的とし非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病を治療するブリナツモマブ（Ｂｌｙｎｃｙｔｏ（商標））及びＥｐＣＡＭを標的とし胃腸及び肺癌を治療するソリトマブが含まれる。
一実施形態では、免疫細胞エンゲージャー（Ｔ細胞エンゲージャーなど）は、例えばＶＬ１−リンカー１−ＶＨ１−リンカー２−ＶＨ２−リンカー３−ＶＬ２のフォーマットで配置され、例えば、本明細書に開示のリンカー配列から独立して選択されるリンカーを使用する。
一実施形態では、本開示によるＢｉＴＥ中のリンカーは、配列番号１０、１４、２３、１２４〜１６２及び１６６〜２９７から独立して選択される。
一実施形態では、リンカー１及びリンカー３は、例えば、配列番号１０、１４、２３、１２４〜１６２及び１６６〜２９６、特に１０、１４及び２３のいずれか１つに示される配列と同じ配列を有する。
一実施形態では、リンカー１及びリンカー３は、例えば、配列番号１０、１４、２３、１２４〜１６２及び１６６〜２９６、特に１０、１４及び２３から独立して選択される異なるアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、リンカー１は配列番号１０である。
一実施形態では、リンカー１は配列番号１４である。
一実施形態では、リンカー３は配列番号１０である。
一実施形態では、リンカー３は配列番号１４である。
一実施形態では、リンカー１及びリンカー３は配列番号１０である。
一実施形態では、リンカー１及びリンカー３は配列番号１４である。
一実施形態では、リンカー１は配列番号１０であり、リンカー３は配列番号１４である。
一実施形態では、リンカー１は配列番号１４であり、リンカー３は配列番号１０である。
一実施形態では、リンカー２はリンカー１及びリンカー３の両方とは異なる。
一実施形態では、リンカー２は、配列番号２９７などの、配列番号１０、１４、２３、１２４〜１６２及び１６６〜２９７のいずれか１つから選択される。
一実施形態では、リンカー１は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０など、１０〜３０アミノ酸長の範囲内である。
一実施形態では、リンカー３は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０など、１０〜３０アミノ酸長の範囲内である。
一実施形態では、リンカー２は、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０など、２〜１０アミノ酸長の範囲内である。
一実施形態では、ＶＨ１及びＶＬ１は本開示によるＴ細胞抗原、例えばＣＤ３に特異的である。
一実施形態では、ＶＨ２及びＶＬ２は、本開示によれば、ＣＤ３などのＴ細胞抗原などの免疫細胞抗原に特異的である。
一実施形態では、ＶＨ１及びＶＬ１は、癌抗原又は間質抗原などのような抗原又は対象に特異的である。
一実施形態では、ＶＨ２及びＶＬ２は、癌抗原又は間質抗原などのような抗原又は対象に特異的である。
本明細書で使用される間質又は間質抗原は、間質マトリックスの分子構造、例えば、線維芽細胞、腫瘍関連マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞及び／又は間質に浸潤したＴ細胞上に発現される、結合組織分子又はこのマトリックスに関連する分子又は間質の細胞成分に関連する抗原などの間質マトリックスの分子構造で発現されるものを含む、間質内の抗原治療標的を指す。間質抗原の例としては、ＦＡＰ、ＴＧＦβ、ＴＲＥＭ１、ＩＧＦＢＰ７、ＦＳＰ−１、線維芽細胞関連抗原、ＮＧ２、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、血小板由来成長因子−α受容体（ＰＤＧＦＲ−α）、血小板由来成長因子−β受容体（ＰＤＧＦＲ−β）及びビメンチンが挙げられるが、これらに限定されない。
線維芽細胞は、抗原線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、特にＣＤ２６に結合しないＦＡＰに特異的な抗体を使用することによって標的とされ得る（参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／０２５８１１９を参照のこと）。
ＦＡＰは当初、反応性間質線維芽細胞上のセリンプロテアーゼとして同定された。その後の分子クローニングは、ＦＡＰが、メラノーマ細胞系によって発現される１７０ｋＤａの膜結合ゼラチナーゼであるセプラーゼと同一であることを明らかにした。全長ｃＤＮＡは、全配列にわたって５２％のアミノ酸同一性及び触媒ドメインにおいてほぼ７０％の同一性を有する、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）に高度に相同な７６０アミノ酸（ａａ）のＨ型膜貫通プロテアーゼをコードしていた。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５８７，２９９号は、ＦＡＰをコードする核酸分子及びその用途を記載している。
ＦＡＰ及びＤＰＰＩＶは同様の遺伝子サイズを有し、２ｑ２４で互いに染色体的に隣接しており、これは遺伝子重複事象を示唆している（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号Ｕ０９２７８）。両タンパク質はプロリルペプチダーゼファミリーのメンバーである。このクラスの酵素は誘導性であり、細胞表面上又は細胞外液中で活性であり、そして最後から２番目の位置にプロリン又はアラニンを有するポリペプチドからＮ末端ジペプチドを独自に切断することができる。ＣＤ２６とも呼ばれるＤＰＰＩＶは、線維芽細胞、内皮細胞及び上皮細胞、ＮＫ細胞のような白血球サブセット、Ｔリンパ球及びマクロファージを含むいくつかの細胞型によって構成的に発現される。少量のＤＰＰＩＶが血中で可溶性タンパク質として循環する。ＤＰＰＩＶとは対照的に、ＦＡＰは通常、正常な成人組織では発現されず、そのタンパク質分解的に活性な可溶型はａ２−抗プラスミン切断酵素（ＡＰＣＥ）と呼ばれる。著しいＦＡＰ発現は、創傷治癒、上皮癌、変形性関節症、慢性関節リウマチ、肝硬変及び肺線維症を含む、活性化間質に関連した状態で起こる。
ＦＡＰ構造は解明され（ＰＤＢ ＩＤ １Ｚ６８）、ＤＰＰＩＶの構造と非常によく似ている。ＦＡＰは、約２０アミノ酸の切断されていないシグナル配列によって原形質膜に固定されており、６アミノ酸の短いアミノ末端の細胞質ドメインを有する。触媒ドメインを含むタンパク質の大部分は細胞外環境にさらされている。ＦＡＰ糖タンパク質は、２つの同一の９７ｋＤａサブユニットからなるホモ二量体である。各ＦＡＰモノマーサブユニットは、２つのドメイン、すなわちαβヒドロラーゼドメイン（アミノ酸２７〜５３及び４９３〜７６０）及び８個のブレードを有するβプロペラドメイン（アミノ酸５４〜４９２）からなり、これらは大きな空洞を囲んでいる。両方のドメインの界面にあるこの空洞内の小さなポケットは触媒トライアド（Ｓｅｒ６２４、Ａｓｐ７０２及びＨｉｓ７３４）を含む。ＦＡＰは、サブユニットのホモ二量体化の際にその酵素活性を獲得し、そしてそのジペプチジルペプチダーゼ活性の他に、ＦＡＰは、Ｉ型コラーゲン特異的ゼラチナーゼ及びエンドペプチダーゼ活性も有する。βプロペラは、タンパク質−タンパク質相互作用の足場として作用し、基質及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の結合を決定する。さらに、βプロペラは、他のプロリルペプチダーゼ又は他の膜結合分子とＦＡＰの超分子複合体を形成することに関与している。ＦＡＰ及びＤＰＰＩＶのヘテロマー又はテトラマー複合体の形成は、コラーゲン基質上の遊走細胞の浸潤突起と関連することが見出された。Ｉ型コラーゲンは、ＦＡＰとβ１インテグリンとの密接な会合を誘導し、それによって、浸潤突起の形成及び接着において主要な組織的役割を果たす。関与するメカニズムは詳細には理解されていないが、細胞浸潤前面におけるそのようなプロテイナーゼに富む膜ドメインの形成は、指向性細胞周囲ＥＣＭ分解に寄与する。これは、ＦＡＰとＥＣＭの相互作用が、インテグリン経路を介した細胞接着、遊走、増殖及びアポトーシスに影響を与えることによって侵襲性細胞の行動と密接に関連している可能性、ならびに発病及び進行におけるＦＡＰの役割を支持し得ることを示している。要約すると、ＦＡＰは、そのプロテアーゼ活性と他の細胞表面分子と複合体を形成する能力との組み合わせにより細胞依存的にその生物学的機能を実行する多機能タンパク質として認識されている。上皮細胞株及び線維芽細胞株におけるＦＡＰの過剰発現は、悪性行動を促進し、ＦＡＰの細胞発現レベルがより悪い臨床転帰と相関するという臨床状況を示している。
パラクリンシグナル伝達分子を介して、癌細胞は間質性線維芽細胞を活性化し、そしてＦＡＰの発現を誘導し、それが今度は癌細胞の増殖、浸潤及び遊走に影響を及ぼす。最近の研究は、ＴＧＦ−βがＦＡＰタンパク質発現を促進することにおける主要な因子であることを証明した（Ｃｈｅｎ、Ｈら（２００９）Ｅｘｐ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｅｘｍｐ．２００９．０９．００１）。ＦＡＰは、乳房、肺、結腸直腸及び卵巣のものを含む、ヒト上皮癌の９０％において反応性間質性線維芽細胞上で高度に発現される（Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ、Ｐら（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ８７：７２３６〜７２３９）。チェンらは、最近、そのＦＡＰαが、ＨＯ−８９１０ＰＭ卵巣癌細胞の浸潤、増殖及び遊走に影響を与えることを示している（Ｃｈｅｎ、Ｈら（２００９）Ｅｘｐ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｅｘｍｐ．２００９．０９．００１）。
ＦＡＰは、前記抗原と結合し、その生物学的に関連のある分子との相互作用を立体的に遮断することによって標的とされ得る。あるいは、又はさらにＦＡＰ分子を別のＦＡＰ分子又は異なる分子、例えば癌細胞の表面上の抗原と架橋することは、二重特異性抗体分子などの多重特異性を用いて達成することができる。この架橋は、免疫系に対して抗原を保有する細胞の視認性を高め、それは次に免疫系を活性化して中性にするか又はそれを破壊することができる。
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、ＴＲＥＭ１、ＣＤ２０４、ＣＤ６８を（単独で又はＣＤ１６３もしくはＣＤ２０６と組み合わせて）発現すると考えられている。これらのマーカーを使用して、ＴＡＭを標的にすることができる。
本開示のアデノウイルスは腫瘍細胞に感染する能力を有し、特に腫瘍細胞に優先的に感染するように選択される。腫瘍溶解性ウイルス感染は、新たに生成されたウイルス粒子の放出を伴う癌細胞の死滅及び溶解を引き起こす。抗体、ＢｉＴＥ及び他の「ペイロード」をコードする組み込まれた導入遺伝子は、それらが死ぬ前に腫瘍細胞によって新たに合成され、活発に分泌され、そしていくつかの分子もまた細胞溶解の際に放出される。
短い半減期を有する抗体分子は、全身的に利用可能になった場合に身体が分子を急速にクリアにし、これが標的外効果を最小にするので、本開示における使用に特に適している可能性がある。
ＮＫＴ細胞は腫瘍関連マクロファージを標的とし破壊する能力を有する。しかしながら、それらの活性は腫瘍の低酸素環境によって阻害されるように思われる。この活性は、例えば本開示のウイルスにコードされているＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５をＮＫＴ細胞に提供することによって回復することができる。
従って、一実施形態では、本開示によるウイルスは、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１５及びそれらの組み合わせから選択される、活性化するサイトカイン及びＮＫＴ細胞をさらにコードする。サイトカインをコードする遺伝子は、例えば、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、ＢＸ及びＢＹから独立して選択される、抗体分子をコードする遺伝子と同じ位置にあっても異なる位置にあってもよい。
従って、本開示によるアデノウイルスは、腫瘍間質を損なう間接的なメカニズムを含む、腫瘍を傷つけるための少なくとも２つ又は３つのメカニズムを有する。
本明細書で用いられる導入遺伝子は、ゲノム配列に挿入されている遺伝子を指し、これはウイルスにとって不自然な（外因性の）遺伝子、又はウイルス中のその特定の位置に通常見られない遺伝子である。導入遺伝子の例を以下に示す。本明細書で用いられる導入遺伝子はまた、挿入されたときに全長遺伝子の機能又は機能の大部分を果たすのに適している遺伝子の一部である遺伝子の機能的フラグメントを含む。
導入遺伝子及びコード配列は、別段の記載がない限り、ウイルスゲノムへの挿入という文脈において本明細書で互換的に使用される。本明細書中で使用されるコード配列は、例えば機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列を意味する。典型的には、コード配列は目的の機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする導入遺伝子のｃＤＮＡである。対象の機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を以下に記載する。
明らかにウイルスゲノムはＤＮＡのコード配列を含む。ウイルスのゲノム配列中の内因性（天然に存在する遺伝子）は、それらが非天然の位置にあるか又は非天然の環境にあるような組換え技術によって改変されていない限り、本明細書の文脈内で導入遺伝子とみなされない。
一実施形態では、導入遺伝子は、本明細書で使用される場合、１つの生物から単離され、異なる生物、すなわち本開示のウイルスに導入された、遺伝子又はｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡのセグメントを指す。一実施形態では、このＤＮＡの非天然セグメントは、機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を産生する能力を保持し得る。
従って、一実施形態では、挿入された導入遺伝子は、ヒト又はヒト化タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする。
一実施形態では、挿入された導入遺伝子は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ又は同様のものに由来する、非ヒトタンパク質、ポリペプチド又はペプチド（非ヒト哺乳動物タンパク質、ポリペプチド又はペプチドなど）又はＲＮＡ分子をコードする。有利には、本開示のウイルスは、導入遺伝子が癌性細胞内に輸送されることを可能にする。従って、ヒト患者によって生成される非ヒト配列（タンパク質など）に対する応答は、この細胞内送達によって最小限に抑えることができる。
ＤＮＡ配列は、２つ以上の導入遺伝子、例えば１又は２などの１、２、３又は４つの導入遺伝子を含み得る。
導入遺伝子カセットは、２つ以上の導入遺伝子、例えば１又は２などの１、２、３又は４つの導入遺伝子を含み得る。
１つ又は複数の実施形態では、カセットは、１つ又は複数の図面又は実施例に示されるように配置されている。
本明細書で使用される導入遺伝子カセットは、１つ又は複数のコード配列及び１つ又は複数の調節要素の形態の１つ又は複数の導入遺伝子をコードするＤＮＡ配列を指す。
導入遺伝子カセットは、１つ又は複数のモノシストロニック及び／又はポリシストロニックｍＲＮＡ配列をコードし得る。
一実施形態では、導入遺伝子又は導入遺伝子カセットは、モノシストロニック又はポリシストロニックｍＲＮＡをコードし、例えば、カセットは、内因性プロモーター又は外因性プロモーター又はそれらの組み合わせの制御下の位置でアデノウイルスゲノムへの挿入に適している。
本明細書中で使用されるモノシストロニックｍＲＮＡは、単一の機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を指す。
一実施形態では、導入遺伝子カセットはモノシストロニックｍＲＮＡをコードする。
一実施形態では、モノシストロニックｍＲＮＡをコードするカセットの文脈における導入遺伝子カセットとは、外因性プロモーター（導入遺伝子がどこでいつ活性化するかを決定する調節配列である）又はスプライス部位（ｍＲＮＡ分子がいつスプライセオソームによって切断されるかを決定する調節配列である）、コード配列（すなわち、導入遺伝子）を任意に含むＤＮＡセグメントであって、通常、対象のタンパク質のｃＤＮＡに由来し、ポリＡシグナル配列及びターミネーター配列を任意に含むＤＮＡセグメントを意味する。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは、１つ又は複数のポリシストロニックｍＲＮＡ配列をコードし得る。
本明細書で使用されるポリシストロニックｍＲＮＡは、２つ以上の機能的ＲＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質又はそれらの組み合わせをコードするｍＲＮＡ分子を指す。一実施形態では、導入遺伝子カセットはポリシストロニックｍＲＮＡをコードする。
一実施形態では、ポリシストロニックｍＲＮＡをコードするカセットの文脈における導入遺伝子カセットは、外因性プロモーター（導入遺伝子がどこでいつ活性であるかを決定する調節配列である）又はスプライス部位（ｍＲＮＡ分子がいつスプライセオソームによって切断されるかを決定する調節配列である）、２つ以上のコード配列（すなわち、導入遺伝子）を任意に含むＤＮＡセグメントであって、通常、対象のタンパク質又はペプチドのｃＤＮＡに由来し、例えば、各コード配列はＩＲＥＳ又は２Ａペプチドのいずれかによって分離されている、ＤＮＡセグメントを含む。転写される最後のコード配列に続いて、カセットは場合によりポリＡ配列及びターミネーター配列を含み得る。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは、モノシストロニックｍＲＮＡ、続いてポリシストロニックｍＲＮＡをコードする。別の実施形態では、導入遺伝子カセットは、ポリシストロニックｍＲＮＡ、続いてモノシストロニックｍＲＮＡをコードする。
一実施形態では、アデノウイルスはヒトアデノウイルスである。本明細書で使用される「アデノウイルス」、「血清型」又は「アデノウイルス血清型」は、サブグループＡ〜Ｆに分類され、さらに未だ同定されていないか、又は未分類のものにまでさらに及ぶ、５０以上の現在公知のアデノウイルス血清型のいくつかに属することができる任意のアデノウイルスを指す。例えば、表１に示すとおり、Ｓｔｒａｕｓｓ、’’Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ’’ｉｎ Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、ｅａ．、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ｐｐ．４５１〜５９６（１９８４）及びＳｈｅｎｋ、’’Ａｄｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ’’ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２、Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｋｎｉｐｅ、３５ｅａ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、ｐｐ．２２６５〜２２６７（２００１）を参照のこと。
表１
本開示のアデノウイルスは、サブグループＢのウイルス、すなわちＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐ（Ｓｌｏｂｉｔｓｋｉ株）、及びその誘導体、例えばＥｎＡｄである。
アデノウイルスは、ヘキソン及び／又はファイバーなどのキャプシドに基づいてそれらのグループ／血清型に指定される。
本開示のアデノウイルスは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＦ群のウイルスではない。本開示のウイルスはアデノウイルス死タンパク質を含まない。
一実施形態では、本開示のアデノウイルスはキメラである。アデノウイルスがキメラである場合、外側のキャプシドの特徴は血清型を決定するために使用されるだろう。本明細書で用いられるキメラとは、同じ群内の異なる血清型を含む少なくとも２つの異なるウイルス血清型由来のＤＮＡを含むウイルスを指す。
一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、同じ血清型、例えばＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐ由来で、例えば後者ゲノム配列の３０８１２〜３１７８９、１８２５４〜２１１００及び１３６８２〜１５３６７の位置で見られる、ファイバー、ヘキソン及びペントンタンパク質を有し、後者ゲノム配列において、ヌクレオチド位置はジェンバンクＩＤ ２１７３０７３９９（登録番号：ＧＣ６８９２０８）に相対的である。
一実施形態では、アデノウイルスは、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）（別名ＥｎＡｄ及び旧称ＥｎＡｄ）である。本明細書で使用されるエナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）は、配列番号３８のキメラアデノウイルスを指す。それは、野生型アデノウイルスと比較して増強された治療特性を有する複製能力のある腫瘍溶解性キメラアデノウイルスである（ＷＯ２００５／１１８８２５参照）。ＥｎＡｄは、Ａｄ１１ｐ及びＡｄ３由来のＤＮＡ、ならびにＥ３／Ｅ４における欠失を特徴とするキメラＥ２Ｂ領域を有する。エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）の構造変化は、Ａｄ１１ｐよりも約３．５ｋｂ小さいゲノムをもたらし、それによって導入遺伝子の挿入のためのさらなる「スペース」を提供する。
エナデノチュシレブ（Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）（ＥｎＡｄ）は、Ａｄ１１ｐ由来のファイバー、ペントン及びヘキソンを有する、以前はＥｎＡｄ（ＷＯ２００５／１１８８２５）として公知のキメラ腫瘍溶解性アデノウイルスであり、従ってそれはサブグループＢウイルスである。それは、Ａｄ１１ｐ及びＡｄ３由来のＤＮＡを含むキメラＥ２Ｂ領域を有する。ＥｎＡｄでは、Ｅ３領域のほとんどすべてとＥ４領域の一部が削除される。それ故、それは生存可能なままである間に追加の遺伝物質を収容するためにゲノム中にかなりの空間を有する。さらに、ＥｎＡｄはサブグループＢアデノウイルスであるため、ヒトにおける既存の免疫は、例えばＡｄ５よりも一般的ではない。Ａｄ１１ファイバー、ペントン及びヘキソンを有するキメラ腫瘍溶解性ウイルスの他の例には、ＯｖＡｄ１及びＯｖＡｄ２が含まれる（ＷＯ２００６／０６０３１４参照）。
ＥｎＡｄは腫瘍細胞に優先的に感染し、これらの細胞内で急速に複製し、細胞溶解を引き起こすようである。これは、順番に、炎症性免疫応答を生成することができ、それによって身体も癌と闘うように刺激する。ＥｎＡｄの成功の一部は、インビボでのウイルスの迅速な複製に関連していると仮定されている 。
ＥｎＡｄは腫瘍細胞を選択的に溶解するが、例えばウイルスの治療活性を高める、又は細胞シグナリングタンパク質もしくは抗体をコードする導入遺伝子、又は細胞シグナリングタンパク質を刺激する実体をコードする導入遺伝子などの導入遺伝子でそれを武装することによってウイルスの副作用を減らすなどのさらなる有益な特性を導入することができる。
癌細胞内で発現され得るＢｉＴＥなどの特定のタンパク質をコードするＤＮＡを有するウイルスを有利に武装することは、例えば、免疫系に細胞をより可視化することによって、又は治療用遺伝子／タンパク質を標的腫瘍細胞に優先的に送達することによって、身体自身の防御を用いてより効果的に腫瘍細胞と戦うことを可能にし得る。
さらに、レポーターである導入遺伝子をゲノムに挿入する能力は、臨床試験又は前臨床試験に役立ち得る。
導入遺伝子の発現がウイルスの複製又は他の有利な特性に悪影響を及ぼさないことが重要である。従って、１つ又は複数の遺伝子は、複製能力及びウイルスの他の有利な特性を損なわない場所に挿入されなければならない。さらに、アデノウイルスのゲノムは密集しているため、導入遺伝子を挿入するのに適した位置を見つけることは困難であり得る。これはまた、収容され得る導入遺伝子のサイズを制限する。
ＯｖＡｄ１及びＯｖＡｄ２もまた、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）と同様のキメラアデノウイルスであり、それらもゲノム中にさらなる「スペース」を有する（ＷＯ２００８／０８０００３参照）。従って、一実施形態では、アデノウイルスはＯｖＡｄ１又はＯｖＡｄ２である。
一実施形態では、アデノウイルスは腫瘍溶解性である。本明細書で使用される腫瘍溶解性アデノウイルスは、非癌細胞と比較して癌細胞を優先的に死滅させるアデノウイルスを意味する。
一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスはアポトーシス性である。すなわち、それはプログラム細胞死を促進する。
一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは細胞溶解性である。本開示の腫瘍溶解性アデノウイルスの細胞溶解活性は、代表的な腫瘍細胞株において決定され得、そして例えばＡｄ５のようなサブグループＣに属するアデノウイルスが標準（すなわち、１の効力）として使用される場合、データは効力の測定に変換され得る。細胞溶解活性を決定するための適切な方法は、ＭＴＳアッセイである（参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００５／１１８８２５の実施例４、図２を参照のこと）。
一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは壊死性である。すなわち、それは細胞壊死又は免疫原性細胞死を引き起こすか又は早める。一実施形態では、壊死性細胞死は、それが患者（宿主）の免疫応答を誘発し、誘導するので有利である。
別段の記載がない限り、本明細書中で使用されるアデノウイルスは、複製可能なウイルス（例えば複製能力のあるウイルス）及び複製能欠損型ウイルスベクターも指す。
本明細書中で使用される場合、複製可能とは、複製能力のあるウイルス、又はその複製が癌細胞内の因子、例えばｐ５３などの上方制御因子に依存するウイルスを指す。
一実施形態では、ウイルスは複製能力がある。本明細書の文脈における複製能力があるとは、インビトロ及びインビボで、すなわちパッケージング細胞株の助けを借りずに、細胞内で複製するために必要な機構をすべて保有するウイルスを指す。相補的パッケージング細胞株において複製することができる、例えばＥ１領域において削除されるウイルスベクターは、本文脈において複製能力のあるウイルスではない。
ウイルスベクターは複製能欠損型であり、複製を可能にするための相補的遺伝子を提供するためにパッケージング細胞を必要とする。
本明細書で使用されるアデノウイルスゲノムは、アデノウイルスの機能／生活環に関連する構造タンパク質及び要素をコードするＤＮＡ配列を意味する。
今日までに調べられたすべてのヒトアデノウイルスゲノムは同じ一般的な構成を有する、すなわち特定の機能をコードする遺伝子はウイルスゲノム中の同じ位置に位置する（本明細書では構造要素と呼ぶ）。ウイルスゲノムの各末端は、ウイルス複製に必要とされる末端逆位配列（又はＩＴＲ）として知られる短い配列を有する。ウイルスゲノムは、５つの初期転写単位（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４）、３つの遅延初期単位（ＩＸ、ＩＶａ２及びＥ２後期）、及び後期ｍＲＮＡ（Ｌ１〜Ｌ５）の５つのファミリーを生成するよう処理される１つの後期単位（主要後期）を含む。初期遺伝子によってコードされるタンパク質は、感染に対する宿主細胞応答の複製及び調節に主に関与しているが、後期遺伝子はウイルス構造タンパク質をコードする。初期の遺伝子はＥという文字が前に置かれ、後期の遺伝子はＬという文字が前に置かれる。
アデノウイルスのゲノムは密集している、すなわち、非コード配列がほとんどないため、導入遺伝子を挿入するのに適した位置を見つけることは困難であり得る。本発明者らは、導入遺伝子が許容される２つのＤＮＡ領域を同定し、特に同定された部位は、抗体をコードするものなどの複雑な導入遺伝子を収容するのに適している。すなわち、導入遺伝子は、ウイルスの生存能力、腫瘍溶解特性又は複製などの天然の特性に悪影響を及ぼすことなく発現される。
一実施形態では、本開示による腫瘍溶解性又は部分腫瘍溶解性ウイルスは、Ｅ４及び／又はＥ３領域の欠失、例えばＥ４領域の一部の欠失、又はＥ３領域の完全欠失、あるいは例えば本明細書に開示される配列に例示されるように、Ｅ４領域の一部（Ｅ４ｏｒｆ４など）の欠失、及びＥ３領域の完全欠失の結果であり得る。
一実施形態では、本開示の腫瘍溶解性ウイルスはキメラである。本明細書で用いられるキメラとは、２つ以上の異なる血清型由来のＤＮＡを含み、腫瘍溶解性ウイルス特性を有するウイルスを指す。
一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスの本質的な有益な特性を保持しているＥｎＡｄ又はその活性誘導体である。ＥｎＡｄは、ＷＯ２００５／１１８８２５（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されており、ウイルスの全配列は本明細書に配列番号３８で提供されている。キメラＥ２Ｂ領域は、本明細書に配列番号７１として開示されている。
代替の腫瘍溶解性ウイルスには、ＯｖＡｄ１及びＯｖＡｄ２が含まれ、これらはそれぞれＷＯ２００８／０８０００３に配列番号２及び３として開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
有利には、本開示のアデノウイルスは、インビトロでの様々な異なる結腸癌細胞株の感染後に、ＥｎＡｄと同様のウイルス活性、例えば複製及び／又は感染性、プロファイルを示す。
アデノウイルスの構造要素
本開示はまた、本明細書に開示されているプラスミドなどのウイルス又はウイルス成分／構築物の新規配列に関する。
一実施形態では、アデノウイルスは、式（Ｉ）：
５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−Ｂ２−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ（Ｉ）
式中、Ｂ１はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はＥ１Ａ−Ｅ１Ｂを含み、ＢＡはＥ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含み、Ｂ２は結合であるか又はＥ３を含み、ＢＸは結合であるか又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子（特に、例えば外因性プロモーターの制御下にある本開示による少なくとも１つのＢｉＴＥをコードする導入遺伝子）又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、ＢＢはＬ５を含み、ＢＹは結合であるか又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子（特に、例えばＭＰＬのような内因性プロモーターの制御下又はＣＭＶプロモーターなどの外因性プロモータの制御下にある本開示による少なくとも１つのＢｉＴＥをコードする導入遺伝子）又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、Ｂ３は結合であるか又はＥ４を含み、ここで、ＢＸ及びＢＹの少なくとも一方は結合ではなく、導入遺伝子又は制限部位又はその両方を含み、少なくとも２つの結合ドメインを含む多重特異性抗原分子をコードし、前記ドメインの少なくとも１つは対象のＴ細胞上の表面抗原に対して特異的である、式（Ｉ）の配列を含むゲノムを含む。一実施形態では、アデノウイルスは、Ｂ１ ＢＸが結合である式（Ｉ）の配列を含むゲノムを含む。
一実施形態では、アデノウイルスは式（Ｉ）の配列を含むゲノムを含み、式中、ＢＹは結合である。
一実施形態では、アデノウイルスは、式（Ｉａ）：
５’ＩＴＲ−ＢＡ−Ｂ２−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ（Ｉａ）
式中、ＢＡはＥ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含み、Ｂ２は結合であるか又はＥ３を含み、ＢＸは結合であるか又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子（特に、例えば外因性プロモーターの制御下にある本開示による少なくとも１つのＢｉＴＥをコードする導入遺伝子）又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、ＢＢはＬ５を含み、ＢＹは結合であるか又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子（特に、例えばＭＰＬのような内因性プロモーターの制御下又はＣＭＶプロモーターなどの外因性プロモータの制御下にある本開示による少なくとも１つのＢｉＴＥをコードする導入遺伝子、）又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、Ｂ３は結合であるか又はＥ４を含み、ここで、ＢＸ及びＢＹの少なくとも一方は結合ではなく、少なくとも１つは導入遺伝子などの導入遺伝子又は制限部位を含む、式（Ｉａ）の配列を含むゲノムを含む。
一実施形態では、アデノウイルスは、式（Ｉａ）の配列を含むゲノムを含み、式中、ＢＸは結合である。
一実施形態では、アデノウイルスは、式（Ｉａ）の配列を含むゲノムを含み、式中、ＢＹは結合である。
一実施形態では、アデノウイルスは、式（Ｉｂ）：
５’ＩＴＲ−ＢＡ−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ Ｉｂ（Ｉｂ）
式中、ＢＡはＥ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含み、ＢＸは結合であるか又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子（特に、例えば外因性プロモーターの制御下にある本開示による少なくとも１つのＢｉＴＥをコードする導入遺伝子）又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、ＢＢはＬ５を含み、ＢＹは結合であるか又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子（特に、例えばＭＰＬのような内因性プロモーターの制御下又はＣＭＶプロモーターなどの外因性プロモータの制御下にある本開示による少なくとも１つのＢｉＴＥをコードする導入遺伝子）又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、Ｂ３は結合であるか又はＥ４を含み、ここで、ＢＸ及びＢＹの少なくとも一方は結合ではなく、導入遺伝子などの導入遺伝子又は制限部位又はその両方を含む、式（Ｉｂ）の配列を含むゲノムを含む。
一実施形態では、アデノウイルスは、式（Ｉｂ）の配列を含むゲノムを含み、式中、ＢＸは結合である。
一実施形態では、アデノウイルスは、式（Ｉｂ）の配列を含むゲノムを含み、式中、ＢＹは結合である。
一実施形態では、アデノウイルスは、式（Ｉｃ）：
５’ＩＴＲ−ＢＡ−Ｂ２−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−３’ＩＴＲ（Ｉｃ）
式中、ＢＡはＥ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含み、Ｂ２はＥ３であり、ＢＸは結合であるか又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子（特に、例えば外因性プロモーターの制御下にある本開示による少なくとも１つのＢｉＴＥをコードする導入遺伝子）又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、ＢＢはＬ５を含み、ＢＹは結合であるか又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子（特に、例えばＭＰＬのような内因性プロモーターの制御下又はＣＭＶプロモーターなどの外因性プロモータの制御下にある本開示による少なくとも１つのＢｉＴＥをコードする導入遺伝子）又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、ここで、ＢＸ及びＢＹの少なくとも一方は結合ではなく、導入遺伝子などの導入遺伝子又は制限部位又はその両方を含む、式（Ｉｃ）の配列を含むゲノムを含む。
一実施形態では、アデノウイルスは、式（Ｉｃ）の配列を含むゲノムを含み、式中ＢＸは結合である。
一実施形態では、アデノウイルスは、式（Ｉｃ）の配列を含むゲノムを含み、式中ＢＹは結合である。
一実施形態では、アデノウイルスは、式（Ｉｄ）：
５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ（Ｉｄ）
式中、Ｂ１はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、又はＥ１Ａ−Ｅ１Ｂを含み、ＢＡはＥ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含み、ＢＸは結合であるか又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子（特に、例えば外因性プロモーターの制御下にある本開示による少なくとも１つのＢｉＴＥをコードする導入遺伝子）又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、ＢＢはＬ５を含み、ＢＹは結合であるか又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子（特に、例えばＭＰＬのような内因性プロモーターの制御下又はＣＭＶプロモーターなどの外因性プロモータの制御下にある本開示による少なくとも１つのＢｉＴＥをコードする導入遺伝子）又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、Ｂ３は結合であるか又はＥ４を含み、ここで、ＢＸ及びＢＹの少なくとも一方は結合ではなく、導入遺伝子、制限部位、又はその両方を含む、式（Ｉｄ）の配列を含むゲノムを含む。
一実施形態では、アデノウイルスは、ＢＸが結合である式（Ｉｄ）の配列を含むゲノムを含む。
一実施形態では、アデノウイルスは、ＢＹが結合である式（Ｉｄ）の配列を含むゲノムを含む。
一実施形態では、アデノウイルスは、式（Ｉｅ）：
５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−Ｂ２−ＢＢ−ＢＹ−３’ＩＴＲ（Ｉｅ）
式中、Ｂ１はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、又はＥ１Ａ−Ｅ１Ｂを含み、ＢＡはＥ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含み、Ｂ２はＥ３を含み、ＢＢはＬ５を含み、ＢＹは結合であるか又は（例えばＭＰＬのような内因性プロモーターの制御下又はＣＭＶプロモーターなどの外因性プロモータの制御下にある）本開示による少なくとも１つのＢｉＴＥをコードする１つ又は複数の導入遺伝子を含むＤＮＡ配列であり、ここで、ＢＸ及びＢＹの少なくとも一方は結合ではなく、導入遺伝子、制限部位、又はその両方を含む、式（Ｉｅ）の配列を含むゲノムを含む。
一実施形態では、ＢＸ及びＢＹが結合ではなく、ＢＸ及びＢＹの両方が導入遺伝子であるような、導入遺伝子、制限部位、又はその両方を含む、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）又は（Ｉｅ）の化合物を提供する。
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）又は（Ｉｄ）の一実施形態では、ＢＸのみが１つ又は２つのＢｉＴＥ、例えば１つのＢｉＴＥ（ＢＹはＢｉＴＥをコードしない）をコードし、特に該１つ又は複数のＢｉＴＥは、ＣＭＶプロモーターなどの外因性プロモーターの制御下にある。式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）又は（Ｉｄ）の一実施形態では、ＢＹのみが１つ又は２つのＢｉＴＥ、例えば１つのＢｉＴＥ（ＢＸはＢｉＴＥをコードしない）をコードし、特に該１つまたは複数のＢｉＴＥは、ＭＰＬなどの内因性プロモーターの制御下にあるか、又はＣＭＶプロモーターなどの外因性プロモーターの制御下にある。式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）又は（Ｉｄ）の一実施形態では、ＢＸはＢｉＴＥ（例えばＣＭＶプロモーターなどの外因性プロモーターの制御下にある）をコードし、ＢＹはＢｉＴＥ（例えば、ＭＰＬなどの内因性プロモーターの制御下、又はＣＭＶプロモーターなどの外因性プロモーターの制御下にある）をコードする。
結合とは、１つのＤＮＡ配列を別のＤＮＡ配列に接続する、例えばウイルスゲノムのある部分を別の部分に接続する、共有結合を指す。従って、本明細書中の式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）又は（Ｉｅ）における変数が結合を表す場合、その結合によって表される特徴又は要素は存在しない、すなわち削除される。
アデノウイルスの構造は一般に類似しているので、当業者に知られている構造要素及びそれを参照する一般的に使用されている用語に関して以下の要素を論じる。本明細書において要素が言及される場合、我々はその要素をコードするＤＮＡ配列又はアデノウイルス中の要素の同じ構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列を指す。後者はＤＮＡコードの冗長性のために適切である。最適化された結果を得るためには、コドン使用に対するウイルスの好みを考慮する必要がある。
本開示のウイルスに使用されるアデノウイルス由来の任意の構造要素は、天然配列を含むかもしくはそれからなるか、又は所与の長さにわたって少なくとも９５％、例えば９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の類似性を有し得る。元の配列は、遺伝物質の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％を省くように改変することができる。当業者は、構造タンパク質の発現が破壊されるように、変化を加えるときにウイルスの読み枠が破壊されてはならないことを認識している。
一実施形態では、所与の要素は全長配列、すなわち全長遺伝子である。
一実施形態では、所与の要素は全長より短く、全長配列と同じ又は対応する機能を保持している。
本開示の構築物において任意選択である所与の要素に関する一実施形態では、ＤＮＡ配列は全長より短く、機能性を有さないことがある。
アデノウイルスの構造タンパク質又は機能タンパク質をコードする構造遺伝子は、一般にＤＮＡの非コード領域によって連結されている。従って、本開示のウイルスに導入遺伝子を挿入する目的で、対象の構造要素（特にその非コード領域）のゲノム配列をどこで「切断」するかについてはある程度の柔軟性がある。従って、本明細書の目的のために、その要素は、それが目的のために適合し、無関係な材料をコードしない限りにおいて、参照の構造要素と見なされるであろう。従って、適切であれば、例えばウイルスの天然構造に見られるように、遺伝子は適切な非コード領域と関連するであろう。
従って、一実施形態では、制限部位及び／又は導入遺伝子をコードするＤＮＡなどの挿入物を、イントロン又は遺伝子間配列などのゲノムウイルスＤＮＡの非コード領域に挿入する。アデノウイルスのこのいくつかの非コード領域は、例えばオルタナティブスプライシング、転写調節又は翻訳調節において機能を有する可能性があると述べたので、これを考慮に入れる必要があり得る。
Ｌ５領域（例えば、Ｌ５とＥ４領域の間）に関連する、本明細書中に同定される部位は、ＲＮＡｉ、サイトカイン、単鎖又は、ＢｉＴＥなどの抗体のような多量体タンパク質などの複雑な実体をコードする様々なＤＮＡ配列を収容するのに適する。
本明細書中で使用される遺伝子は、それに関連するコード及び任意の非コード配列、例えばイントロン及び関連エクソンを指す。一実施形態では、遺伝子は、必須の構造的構成要素のみ、例えばコード領域を含むか又はそれからなる。
以下は、アデノウイルスの特定の構造要素に関する考察に続く。
末端逆位配列（ＩＴＲ）は全ての公知のアデノウイルスに共通であり、それらの対称性のためにそのように命名され、そしてウイルス染色体複製起点である。これらの配列の他の特性は、ヘアピン構造を形成するそれらの能力である。
本明細書で用いられる５’ＩＴＲは、アデノウイルスの適切な位置に組み込まれたときにＩＴＲの機能を保持する、アデノウイルスの５’末端からのＩＴＲの一部又は全部を指す。一実施態様では、５’ＩＴＲは、配列番号３８の約１ｂｐ〜１３８ｂｐの配列、又は全長に沿ってそれと９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一の配列、特に配列番号３８の約１ｂｐ〜１３８ｂｐからなる配列を含むか又はそれからなる。
本明細書で用いられる３’ＩＴＲは、アデノウイルスの適切な位置に組み込まれたときにＩＴＲの機能を保持する、アデノウイルスの３’末端からのＩＴＲの一部又は全部を指す。一実施態様では、３’ＩＴＲは、配列番号３８の約３２１８９ｂｐ〜３２３２６ｂｐの配列、又は全長に沿ってそれと９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一の配列、特に配列番号３８の約３２１８９ｂｐ〜３２３２６ｂｐからなる配列を含むか又はそれからなる。
本明細書で用いられるＢ１は、アデノウイルス由来のＥ１Ａの一部又は全部、アデノウイルスのＥ１Ｂ領域の一部又は全部、ならびに独立してアデノウイルスのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ領域の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列を指す。
Ｂ１が結合である場合には、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ配列はウイルスから除外されるだろう。一実施形態では、Ｂ１は結合であり、従ってウイルスはベクターである。
一実施形態では、Ｂ１はさらに導入遺伝子を含む。Ｅ１領域が、破壊的な方法でＥ１領域に挿入することができる（すなわち配列の「中央」に）導入遺伝子を収容することができること、又はＥ１領域の一部もしくは全部を、遺伝物質を収容するためのより多くのスペースを提供するために、欠失させることができることは当業界で公知である。
本明細書で使用されるＥ１Ａは、アデノウイルスＥ１Ａ領域の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列を指す。後者はここではポリペプチド／タンパク質Ｅ１Ａを指す。Ｅ１Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質が、例えば、野生型と同じ機能を有する（すなわち対応する非変異タンパク質）、野生型タンパク質と比較して機能向上、野生型タンパク質と比較して機能がないなどの機能低下、あるいは、野生型タンパク質又は必要に応じてそれらの組み合わせと比較して新しい機能を有する、などの保存的又は非保存的アミノ酸変化を有するように変異されてもよい。
本明細書で用いるＥ１Ｂは、アデノウイルスＥ１Ｂ領域（すなわち、ポリペプチド又はタンパク質）の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列を指し、Ｅ１Ｂ遺伝子／領域によってコードされるタンパク質が、例えば、野生型と同じ機能を有する（すなわち対応する非変異タンパク質）、野生型タンパク質と比較して機能向上、野生型タンパク質と比較して機能がないなどの機能低下、あるいは、野生型タンパク質又は必要に応じてそれらの組み合わせと比較して新しい機能を有する、などの保存的又は非保存的アミノ酸変化を有するように変異されてもよい。
従って、Ｂ１は、野生型Ｅ１Ａ及び／又はＥ１Ｂなどの野生型Ｅ１領域に対して修飾されていてもいなくてもよい。当業者は、Ｅ１Ａ及び／又はＥ１Ｂが存在するのか、又は（一部）欠失もしくは変異しているのかを容易に識別することができる。
本明細書で用いられる野生型は、公知のアデノウイルスを指す。公知のアデノウイルスは、配列が利用可能であるかどうかにかかわらず、同定されそして命名されたものである。
一実施態様では、Ｂ１は配列番号３８の１３９ｂｐ〜３９３２ｂｐの配列を有する。
本明細書で使用されるＢＡは、適宜、任意の非コード配列を含むＥ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４領域をコードするＤＮＡ配列を指す。一般にこの配列は導入遺伝子を含まないであろう。一実施形態では、配列は、公知のアデノウイルス、例えば表１に示す血清型、特にグループＢウイルス、例えばＡｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１、又はそれらの組み合わせ、例えばＡｄ３、Ａｄ１１又はそれらの組み合わせからの連続配列と実質的に類似又は同一である。一実施形態では、Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４は、これらの要素及びその領域に関連する他の構造要素を含むことを意味し、例えばＢＡは一般に、例えば以下の：ＩＶ２Ａ ＩＶ２ａ−Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４などのタンパク質ＩＶ２ａをコードする配列を含む。
一実施形態では、Ｅ２Ｂ領域はキメラである。すなわち、２つ以上の異なるアデノウイルス血清型、例えばＡｄ３及びＡｄ１１、例えばＡｄ１１ｐからのＤＮＡ配列を含む。一実施形態では、Ｅ２Ｂ領域は、全長にわたって配列番号３８の５０６８ｂｐ〜１０３５５ｂｐの配列、又はそれと９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一の配列を有する。
一実施形態では、成分ＢＡ中のＥ２Ｂは、配列番号７１に示される配列（ＷＯ２００５／１１８８２５に開示された配列番号３に対応する）を含む。
一実施形態では、ＢＡは、配列番号３８の３９３３ｂｐ〜２７１８４ｂｐの配列を有する。
本明細書で使用されるＥ３は、アデノウイルスＥ３領域の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列（すなわち、タンパク質／ポリペプチド）を指し、Ｅ３遺伝子によってコードされるタンパク質が、例えば、野生型と同じ機能を有する（対応する未変異タンパク質）、野生型タンパク質と比較して機能向上、野生型タンパク質と比較して機能がないなどの機能低下、あるいは、野生型タンパク質又は必要に応じてそれらの組み合わせと比較して新しい機能を有する、などの保存的又は非保存的アミノ酸変化を有するように変異されてもよい。
一実施形態では、Ｅ３領域は、表１に示すアデノウイルス血清型、又はその組み合わせ、特にグループＢ血清型、例えばＡｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１（特にＡｄ１１ｐ）、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１又はそれらの組み合わせ、例えばＡｄ３、Ａｄ１１（特にＡｄ１１ｐ）又はそれらの組み合わせの形態である。
一実施形態では、Ｅ３領域は部分的に欠失しており、例えば９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％が欠失している。
一実施形態では、Ｂ２は結合であり、Ｅ３領域をコードするＤＮＡは存在しない。
一実施形態では、Ｅ３領域をコードするＤＮＡを、導入遺伝子によって置換又は中断することができる。本明細書で使用される「本明細書で使用されるように導入遺伝子によって置き換えられるＥ３領域は、Ｅ３領域の一部又は全部が導入遺伝子で置き換えられることを含む。
一実施形態では、Ｂ２領域は、配列番号３８の２７１８５ｂｐ〜２８１６５ｂｐの配列を含む。
一実施形態では、Ｂ２は、配列番号３８の２７１８５ｂｐ〜２８１６５ｂｐの配列からなる。
本明細書で使用されるＢＸは、ＢＢ中のＬ５遺伝子の５’末端付近のＤＮＡ配列を指す。本明細書中で使用される場合、Ｌ５遺伝子の５’末端付近又はその近位とは、Ｌ５遺伝子の５’末端に隣接（近接）又は本質的にこれに関連する非コード領域、すなわちＬ５遺伝子の最末端に隣接もしくは近接、又はそれと本質的に関連する非コード領域を指す。あるいは、Ｌ５遺伝子付近又は近位とは、ＢＸ領域とＬ５遺伝子の５’末端との間にコード配列が存在しないように、Ｌ５遺伝子に近いことを指すことがある。
従って、一実施形態では、ＢＸは、例えばＬ５遺伝子のコード配列の開始を表すＬ５の塩基に直接結合している。
従って、一実施形態では、ＢＸは、例えば非コード配列の始まりを表すＬ５の塩基に直接結合するか、又はＬ５と自然に関連する非コード領域に直接結合する。本明細書で使用される自然に関連した非コード領域Ｌ５は、Ｌ５遺伝子の一部又はそれと連続しているが他の遺伝子の一部ではないすべての非コード領域の一部を指す。
一実施形態では、ＢＸは配列番号３９の配列を含む。この配列は人工の非コード配列であり、例えば導入遺伝子（又は導入遺伝子カセット）、制限部位又はそれらの組み合わせを含むＤＮＡ配列がその中に挿入されていてもよい。この配列は、それが導入遺伝子の正確な位置に対するある程度の柔軟性を可能にしながら、ウイルスの安定性及び生存能力に対する破壊的な影響を最小限に抑えることができるという点で緩衝液として作用するので有利である。
挿入は、配列番号３９内の５’末端から、３’末端、又はｂｐ１〜２０１の間の任意の点、例えば塩基対１／２、２／３、３／４、４／５、５／６、６／７、７／８、８／９、９／１０、１０／１１、１１／１２、１２／１３、１３／１４、１４／１５、１５／１６、１６／１７、１７／１８、１８／１９、１９／２０、２０／２１、２１／２２、２２／２３、２３／２４、２４／２５、２５／２６、２６／２７、２７／２８、２８／２９、２９／３０、３０／３１、３１／３２、３２／３３、３３／３４、３４／３５、３５／３６、３６／３７、３７／３８、３８／３９、３９／４０、４０／４１、４１／４２、４２／４３、４３／４４、４４／４５、４５／４６、４６／４７、４７／４８、４８／４９、４９／５０、５０／５１、５１／５２、５２／５３、５３／５４、５４／５５、５５／５６、５６／５７、５７／５８、５８／５９、５９／６０、６０／６１、６１／６２、６２／６３、６３／６４、６４／６５、６５／６６、６６／６７、６７／６８、６８／６９、６９／７０、７０／７１、７１／７２、７２／７３、７３／７４、７４／７５、７５／７６、７６／７７、７７／７８、７８／７９、７９／８０、８０／８１、８１／８２、８２／８３、８３／８４、８４／８５、８５／８６、８６／８７、８７／８８、８８／８９、８９／９０、９０／９１、９１／９２、９２／９３、９３／９４、９４／９５、９５／９６、９６／９７、９７／９８、９８／９９、９９／１００、１００／１０１、１０１／１０２、１０２／１０３、１０３／１０４、１０４／１０５、１０５／１０６、１０６／１０７、１０７／１０８、１０８／１０９、１０９／１１０、１１０／１１１、１１１／１１２、１１２／１１３、１１３／１１４、１１４／１１５、１１５／１１６、１１６／１１７、１１７／１１８、１１８／１１９、１１９／１２０、１２０／１２１、１２１／１２２、１２２／１２３、１２３／１２４、１２４／１２５、１２５／１２６、１２６／１２７、１２７／１２８、１２８／１２９、１２９／１３０、１３０／１３１、１３１／１３２、１３２／１３３、１３３／１３４、１３４／１３５、１３５／１３６、１３６／１３７、１３７／１３８、１３８／１３９、１３９／１４０、１４０／１４１、１４１／１４２、１４２／１４３、１４３／１４４、１４４／１４５、１４５／１４６、１４６／１４７、１４７／１４８、１４８／１４９、１５０／１５１、１５１／１５２、１５２／１５３、１５３／１５４、１５４／１５５、１５５／１５６、１５６／１５７、１５７／１５８、１５８／１５９、１５９／１６０、１６０／１６１、１６１／１６２、１６２／１６３、１６３／１６４、１６４／１６５、１６５／１６６、１６６／１６７、１６７／１６８、１６８／１６９、１６９／１７０、１７０／１７１、１７１／１７２、１７２／１７４、１７４／１７５、１７５／１７６、１７６／１７７、１７７／１７８、１７８／１７９、１７９／１８０、１８０／１８１、１８１／１８２、１８２／１８３、１８３／１８４、１８４／１８５、１８５／１８６、１８６／１８７、１８７／１８８、１８９／１９０、１９０／１９１、１９１／１９２、１９２／１９３、１９３／１９４、１９４／１９５、１９５／１９６、１９６／１９７、１９７／１９８、１９８／１９９、１９９／２００、又は２００／２０１の間のどこにでも起こり得る。
一実施態様では、ＢＸは配列番号３９を含み、ＤＮＡ配列は、塩基対２７と塩基対２８の間又は配列番号３８の２８１９２ｂｐ〜２８１９３ｂｐに対応する位置に挿入される。
一実施形態では、挿入物は制限部位挿入物である。一実施形態では、制限部位挿入物は１つ又は２つの制限部位を含む。一実施形態では、制限部位は、２つの制限部位を含む１９ｂｐ制限部位挿入物である。一実施形態では、制限部位挿入物は、１つの制限部位を含む９ｂｐ制限部位挿入物である。一実施形態では、制限部位挿入物は、１つ又は２つの制限部位及び少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１つ又は２つの導入遺伝子を含む。一実施形態では、制限部位は、２つの制限部位及び少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１つ又は２つの導入遺伝子を含む、１９ｂｐ制限部位挿入物である。一実施形態では、制限部位挿入物は、１つの制限部位及び少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１つ又は２つなどの１つ、２つ又は３つの導入遺伝子を含む９ｂｐ制限部位挿入物である。一実施形態では、２つの制限部位が１つ又は複数の、例えば２つの導入遺伝子（例えば導入遺伝子カセット内）を挟む。一実施形態では、ＢＸが２つの制限部位を含むとき、該制限部位は互いに異なる。一実施形態では、ＢＸ中の該１つ又は複数の制限部位は、それらが挿入されている特定のアデノウイルスゲノム中に天然に存在しない。一実施形態では、ＢＸ中の該１つ又は複数の制限部位は、アデノウイルスゲノムの他の場所に位置する他の制限部位とは異なり、例えば、天然に存在する制限部位及び／又はＢＹに導入された制限部位などのゲノムの他の部分に導入された制限部位とは異なる。従って、一実施形態では、１つ又は複数の制限部位によって、その部分のＤＮＡを特異的に切断することが可能になる。
有利なことに、「ユニーク」な制限部位の使用は、選択性及びウイルスゲノムが単に適当な制限酵素を用いて切断された場合の制御を提供する。
本明細書中で使用される場合、特異的に切断するとは、制限部位に特異的な酵素の使用が、通常は１つの位置、しかし時には２つの位置になり得る所望の位置のみで、ウイルスを切断する場合を指す。本明細書で使用される一対の位置は、同じ酵素によって切断されるように設計されている（すなわち、互いに区別することができない）、２つの互いに近接する制限部位を指す。
一実施形態では、制限部位挿入物は配列番号５０である。
一実施態様では、ＢＸは配列番号３８の２８１６６ｂｐ〜２８３６６ｂｐの配列を有する。
一実施形態では、ＢＸは結合である。
一実施形態では、ＢＸは制限部位、例えば１又は２などの１、２、３又は４つの制限部位を含む。一実施形態では、ＢＸは少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１又は２つの導入遺伝子を含む。一実施形態では、特に制限部位が、遺伝子又はそれらがゲノムから特異的に切除及び／又は置換されることを可能にする遺伝子を含むＤＮＡ配列を挟む場合、ＢＸは少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１又は２つの導入遺伝子、及び１つ又は複数の制限部位、例えば２又は３つの制限部位を含む。あるいは、例えば２つの導入遺伝子がある場合、制限部位は各遺伝子を挟むことができ、３つの異なる制限部位が遺伝子が選択的に切除及び／又は置換されることを確実にするために必要とされる。一実施形態では、１つ又は複数の、例えば全ての導入遺伝子が導入遺伝子カセットの形態である。一実施形態では、ＢＸは配列番号３９を含む。一実施形態では、配列番号３９は、例えば導入遺伝子によって中断される。実施形態では、配列番号３９は中断されない。一実施形態では、ＢＸは制限部位を含まない。一実施形態では、ＢＸは結合である。一実施形態では、Ｂｘは１つ又は複数の導入遺伝子を含むか又はそれからなる。
一実施形態では、ＢＹは制限部位、例えば１又は２などの１、２、３又は４つの制限部位を含む。一実施態様では、ＢＹは少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１又は２つの導入遺伝子を含む。一実施形態では、特に制限部位が、遺伝子又はそれらがゲノムから特異的に切除及び／又は置換されることを可能にする遺伝子を含むＤＮＡ配列を挟む場合、ＢＹは少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１又は２つの導入遺伝子、及び１つ又は複数の制限部位、例えば２又は３つの制限部位を含む。あるいは、例えば２つの導入遺伝子がある場合、制限部位は各遺伝子を挟むことができ、３つの異なる制限部位が遺伝子が選択的に切除及び／又は置換されることを確実にするために必要とされる。一実施形態では、１つ又は複数の、例えば全ての導入遺伝子が導入遺伝子カセットの形態である。一実施形態では、ＢＹは配列番号４０を含む。一実施形態では、配列番号４０は、例えば導入遺伝子によって中断される。実施形態では、配列番号４０は中断されない。一実施形態では、ＢＹは制限部位を含まない。一実施形態では、ＢＹは結合である。一実施形態では、ＢＹは１つ又は複数の導入遺伝子を含むか又はそれからなる。
一実施形態では、ＢＸ及びＢＹはそれぞれ制限部位、例えば１又は２などの１、２、３又は４つの制限部位を含む。一実施形態では、ＢＸ及びＢＹはそれぞれ少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１又は２つの導入遺伝子を含む。一実施形態では、特に制限部位が、遺伝子又はそれがゲノムから特異的に切除及び／又は置換されることを可能にする遺伝子を含むＤＮＡ配列を挟む場合、ＢＸ及びＢＹはそれぞれ少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１又は２つの導入遺伝子、及び１つ又は複数の制限部位、例えば２又は３つの制限部位を含む。あるいは、例えば２つの導入遺伝子がある場合、制限部位は各遺伝子を挟むことができ、３つの異なる制限部位が遺伝子が選択的に切除及び／又は置換されることを確実にするために必要とされる。一実施形態では、１つ又は複数の、例えば全ての導入遺伝子が導入遺伝子カセットの形態である。一実施形態では、ＢＸ及びＢＹはそれぞれ、配列番号３９及び配列番号４０を含む。一実施形態では、ＢＸ及びＢＹは制限部位を含まない。一実施形態では、ＢＸは結合であり、ＢＹは結合ではない。一実施形態では、ＢＹは結合であり、ＢＸは結合ではない。
本明細書で使用されるＢＢは、Ｌ５領域をコードするＤＮＡ配列を指す。本明細書中で使用される場合、Ｌ５領域は、文脈において適切であるように、ファイバーポリペプチド／タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を指す。ファイバー遺伝子／領域は、アデノウイルスの主要キャプシド成分であるファイバータンパク質をコードする。ファイバーは受容体認識において機能し、細胞に選択的に結合して感染するアデノウイルスの能力に寄与する。
本開示のウイルスにおいて、ファイバーは、Ａｄ１１ｐなどの血清型１１の任意のアデノウイルス株由来であり得る。
一実施形態では、ＢＢは、配列番号３８の２８３６７ｂｐ〜２９３４４ｂｐの配列を有する。
本明細書で使用されるＢＹに関するＤＮＡ配列は、ＢＢのＬ５遺伝子の３’末端付近のＤＮＡ配列を指す。本明細書中で使用される場合、Ｌ５遺伝子の３’末端付近又はその近位とは、Ｌ５遺伝子の３’末端に隣接（近接）又は本質的にそれに関連する非コード領域、すなわちＬ５遺伝子の３’最末端に隣接もしくは近接、又はそれと本質的に関連する非コード領域（すなわち、Ｌ５に内在する非コード配列の全部又は一部）を指す。あるいは、Ｌ５遺伝子付近又は近位とは、ＢＹ領域とＬ５遺伝子の３’末端との間にコード配列が存在しないように、Ｌ５遺伝子に近いことを指すことがある。
従って、一実施形態では、ＢＹは、コード配列の「末端」を表すＬ５の塩基に直接結合する。
従って、一実施形態では、ＢＹは、非コード配列の「末端」を表すＬ５の塩基に直接結合するか、又はＬ５に自然に関連する非コード領域に直接結合する。
本明細書では本質的にかつ自然に互換的に使用される。一実施形態では、ＢＹは配列番号４０の配列を含む。この配列は非コード配列であり、例えば導入遺伝子（又は導入遺伝子カセット）、制限部位又はそれらの組み合わせを含むＤＮＡ配列が挿入されていてもよい。この配列は、それが導入遺伝子の正確な位置に対するある程度の柔軟性を可能にしながら、ウイルスの安定性及び生存能力に対する破壊的な影響を最小限に抑えることができるという点で緩衝液のように作用するので有利である。
挿入は、配列番号４０内の５’末端から、３’末端、又はｂｐ１〜３５の間の任意の点、例えば塩基対１／２、２／３、３／４、４／５、５／６、６／７、７／８、８／９、９／１０、１０／１１、１１／１２、１２／１３、１３／１４、１４／１５、１５／１６、１６／１７、１７／１８、１８／１９、１９／２０、２０／２１、２１／２２、２２／２３、２３／２４、２４／２５、２５／２６、２６／２７、２７／２８、２８／２９、２９／３０、３０／３１、３１／３２、３２／３３、３３／３４、又は３４／３５の間のどこにでも起こり得る。
一実施形態では、ＢＹは配列番号４０を含み、ＤＮＡ配列は、塩基対１２と塩基対１３の間又は配列番号３８の２９３５６ｂｐ〜２９３５７ｂｐに対応する位置に挿入される。一実施形態では、挿入物は制限部位挿入物である。一実施形態では、制限部位挿入物は１つ又は２つの制限部位を含む。一実施形態では、制限部位は、２つの制限部位を含む１９ｂｐ制限部位挿入物である。一実施形態では、制限部位挿入物は、１つの制限部位を含む９ｂｐ制限部位挿入物である。一実施形態では、制限部位挿入物は、１つ又は２つの制限部位、及び少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１つ又は２つ又は３つの導入遺伝子、例えば１つ又は２つの導入遺伝子を含む。一実施形態では、制限部位は、２つの制限部位及び少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１つ又は２つの導入遺伝子を含む、１９ｂｐ制限部位挿入物である。一実施形態では、制限部位挿入物は、１つの制限部位と少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１つ又は２つの導入遺伝子を含む、９ｂｐ制限部位挿入物である。一実施形態では、２つの制限部位が１つ又は複数の、例えば２つの導入遺伝子（例えば導入遺伝子カセット内）を挟む。一実施形態では、ＢＹが２つの制限部位を含むとき、該制限部位は互いに異なる。一実施形態では、ＢＹ中の該１つ又は複数の制限部位は、それらが挿入されている特定のアデノウイルスゲノム中に天然に存在しない（例えば、固有のもの）。一実施形態では、ＢＹ中の該１つ又は複数の制限部位は、アデノウイルスゲノムの他の場所に位置する他の制限部位とは異なり、例えば、天然に存在する制限部位又はＢＸなどのゲノムの他の部分に導入された制限部位とは異なる。従って、一実施形態では、１つ又は複数の制限部位によって、その部分のＤＮＡを特異的に切断することが可能になる。
一実施形態では、制限部位挿入物は配列番号５１である。
一実施形態では、ＢＹは、配列番号３８の２９３４５ｂｐ〜２９３７９ｂｐの配列を有する。
一実施形態では、ＢＹは結合である。
一実施形態では、挿入物は、配列番号４０のｂｐ １２の後にある。
一実施形態では、挿入物は、配列番号３８のおよそ２９３５６ｂｐの位置にある。
一実施形態では、挿入物は、１つ又は複数の導入遺伝子、例えば１又は２などの１、２又は３つの導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットである。
本明細書で使用されるＥ４は、アデノウイルスＥ４領域の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列（すなわち、ポリペプチド／タンパク質領域）を指し、これはＥ４遺伝子によってコードされるタンパク質が保存的又は非保存的アミノ酸変化を有し、野生型と同じ機能を有する（対応する非変異タンパク質）、野生型タンパク質と比較して機能向上、野生型タンパク質と比較して機能がないなどの機能低下、あるいは、野生型タンパク質又は必要に応じてそれらの組み合わせと比較して新しい機能を有するように変異されてもよい。一実施形態では、Ｅ４領域はＥ４ｏｒｆ４を欠失している。
一実施形態では、Ｅ４領域は部分的に欠失しており、例えば９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％が欠失している。一実施形態では、Ｅ４領域は、配列番号３８の３２１８８ｂｐ〜２９３８０ｂｐの配列を有する。
一実施形態では、Ｂ３は結合であり、すなわちＥ４が存在しない。
一実施形態では、Ｂ３は、配列番号３８の３２１８８ｂｐ〜２９３８０ｂｐからなる配列を有する。
本明細書中で使用される場合、数の範囲は終点を含む。
当業者は、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）及び（Ｉｅ）のような本明細書の式中の要素が隣接しており、本明細書に記載の非コードＤＮＡ配列ならびに遺伝子及びコードＤＮＡ配列（構造的特徴）を具体化し得ることを理解するだろう。１つ又は複数の実施形態では、本開示の式は、アデノウイルスゲノム中に天然に存在する配列を記載しようとしている。これに関連して、式はゲノムの関連部分を特徴付ける主要な要素を指すものであり、ＤＮＡのゲノムストレッチの網羅的な説明であることを意図していないことは当業者に明らかであろう。
本明細書で使用されるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ３及びＥ４はそれぞれ独立して、本明細書に記載の各領域の野生型及びその均等物、変異型又は部分欠失型、特に公知のアデノウイルス由来の野生型配列を指す。
本明細書で使用される「挿入物」は、それが参照配列を中断するように、５’末端、３’末端又は所与のＤＮＡ配列参照セグメント内のいずれかに組み込まれるＤＮＡ配列を指す。後者は、挿入物が位置する基準点として用いられる基準配列である。本開示の文脈において、挿入物は一般に、配列番号１０又は配列番号１１のいずれかの中に存在する。挿入物は、制限部位挿入物、導入遺伝子カセットのいずれか、又は両方であり得る。配列が中断されても、ウイルスは依然として元の配列を含むであろうが、一般的にはそれは挿入物を挟む２つのフラグメントとしてであろう。
一実施形態では、導入遺伝子又は導入遺伝子カセットは、ＴＮ７トランスポゾン又はその一部などの偏りのない挿入トランスポゾンを含まない。本明細書で使用されるＴｎ７トランスポゾンは、ＷＯ２００８／０８０００３に記載されているような偏りのない挿入トランスポゾンを指す。
一実施形態ではＢＸ及びＢＹ中の１つ又は複数の制限部位は、例えばＮｏｔＩ、ＦｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＳｇｆＩ及びＳｂｆＩなどの本明細書に記載の酵素に特異的な制限部位から独立して選択され、特にＢＸに位置するＮｏｔＩに特異的な部位及びＦｓｅＩに特異的な部位、ならびにＢＹに位置するＳｇｆＩ及びＳｂｆＩのように、挿入された制限部位は全て異なる。
一実施形態では上述したように、領域ＢＸ及び／又はＢＹは制限部位を含まない。有利には、本開示のウイルス及び構築物は、制限部位なしで、例えば合成技術を用いて調製することができる。これらの技術はウイルスと構築物の作成において大きな柔軟性を可能にする。さらに、本発明者らは、ウイルス及び構築物の特性が、それらが合成技術によって調製されるときに低下しないことを確立した。
プロモーター
本明細書で使用されるプロモーターは、特定の１つ又は複数の遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を意味する。プロモーターは一般に、それらが転写する遺伝子に近接して、ＤＮＡ上の同じ鎖上及び上流（すなわち５’）に位置する。これに関連して用いられる近位とは、プロモーターとして機能するのに十分近いことを意味する。一実施形態では、プロモーターは転写開始部位の１００ｂｐ以内にある。従って、本明細書中で使用される内因性プロモーターは、導入遺伝子が挿入されているアデノウイルス（又は構築物）中に天然に存在する（すなわち原産の）プロモーターを指す。１つ又は複数の実施形態において、使用される内因性プロモーターは、ウイルスゲノム中のその元の位置にあるウイルス中の天然に存在するプロモーターであり、特にこれは、導入遺伝子又は導入遺伝子の発現に使用される一次又は唯一のプロモーターである。一実施形態では、導入遺伝子の翻訳及び任意選択で転写を促進するために使用される内因性プロモーターは、１つの常在するものであり、すなわちアデノウイルスのゲノムに組み込まれたものであって、組換え技術によって以前に導入されたものではない。
本明細書で用いられる内因性プロモーターの制御下にあるとは、導入遺伝子／導入遺伝子カセットが該内因性プロモーターの制御下にあるように適切な向きに挿入される場所を指す。すなわち、プロモーターが一般にアンチセンス鎖上にある場合、カセットは例えばアンチセンス方向に挿入される。
それでもやはり、遺伝子は２つの方向のうちの１つで発現することができる。しかしながら、一般に、ある所与の（特定の）導入遺伝子について、一方の方向が他方の方向よりも高いレベルの発現をもたらす。
一実施形態では、カセットはセンス方向にある。すなわち、５’から３’方向に転写される。一実施形態では、カセットはアンチセンス配向にある。すなわち、３’から５’方向に転写される。
ウイルス中の内因性プロモーターは、例えば、導入遺伝子及びスプライスアクセプター配列をコードする遺伝子を用いることによって利用することができる。従って、一実施形態では、カセットは、内因性プロモーターの制御下にあるときにスプライスアクセプター配列を含む。従って、一実施形態では、コード配列、例えば抗体又は抗体結合フラグメントをコードする配列は、スプライスアクセプター配列をさらに含む。
一実施形態では、１つもしくは複数の導入遺伝子、又は導入遺伝子カセットは、例えば主要後期プロモーター（ＭＬプロモーター）などのＥ４プロモーター又は主要後期プロモーターの制御下にある。
本明細書で使用される「制御下」とは、特定のプロモーターが指示するときに導入遺伝子が活性化される、すなわち転写されることを意味する。
本明細書中で使用される主要後期プロモーター（ＭＬプロモーター又はＭＬＰ）は、Ｌ５遺伝子のような「後期発現」遺伝子の発現を制御するアデノウイルスプロモーターを指す。ＭＬＰは「センス鎖」プロモーターである。すなわち、プロモーターは５’−３’方向においてプロモーターの下流にある遺伝子に影響を与える。本明細書中で使用される主要後期プロモーターは、ウイルスゲノムに位置する元の主要後期プロモーターを指す。
本明細書で使用されるＥ４プロモーターは、Ｅ４領域のアデノウイルスプロモーターを指す。Ｅ４領域はアンチセンス領域であるため、プロモーターはアンチセンスプロモーターである。すなわち、プロモーターは、３’−５’方向においてＥ４領域の上流にある。従って、Ｅ４プロモーターの制御下にある任意の導入遺伝子カセットは、適切に配向される必要があり得る。一実施形態では、Ｅ４プロモーターの制御下にあるカセットはアンチセンス方向にある。一実施形態では、カセットは、センス配向でＥ４プロモーターの制御下にある。本明細書で使用されるＥ４プロモーターは、ウイルスゲノムに位置する元のＥ４プロモーターを指す。
従って、一実施形態では、ファイバー、ヘキソン及びキャプシドが血清型１１（Ａｄ１１ｐなど）であり、ウイルスゲノムが治療用抗体又は抗体結合フラグメント（ＢｉＴＥなど）をコードするＤＮＡ配列を含み、導入遺伝子がウイルス複製を中断しないように、Ｅ４及び主要後期プロモーター（すなわちＥ４プロモーター又は主要後期プロモーター）からなる群から選択される、アデノウイルスに内因性のプロモーターの制御下にある該ＤＮＡ配列が、例えば特にＬ５とＥ４領域との間に位置するウイルスゲノム中のＬ５の後に位置するような、Ｌ５領域に関連する（すなわち該領域の前又は後）、複製能力のある腫瘍溶解性アデノウイルス血清型１１（Ａｄ１１ｐなど）又はそのウイルス誘導体が提供される。
一実施形態では、内因性プロモーターは、組換え技術によってウイルスゲノムの所望の位置に導入され、例えば導入遺伝子カセットに導入される。しかしながら、本明細書の文脈において、この配置は一般に外因性プロモーターと呼ばれるであろう。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは外因性プロモーターを含む。本明細書で使用される外因性プロモーターは、導入遺伝子が挿入されているアデノウイルス中に天然には存在しないプロモーターを指す。典型的には、外因性プロモーターは他のウイルス由来であるか又は哺乳類プロモーターである。本明細書中で使用される外因性プロモーターは、遺伝子の転写を調節する、通常、対象の遺伝子の上流に位置するＤＮＡ要素を意味する。
一実施形態では、遺伝子発現の調節因子は、ＣＭＶプロモーターなどの、例えばＣＭＶ（サイトメガロウイルスプロモーター）、ＣＢＡ（ニワトリベータアクチンプロモーター）又はＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター）などの、外因性プロモーターである。
一実施形態では、使用されるＣＭＶ外因性プロモーターは、配列番号５２のヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、使用されるＰＧＫ外因性プロモーターは、配列番号５３のヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、使用されるＣＢＡ外因性プロモーターは、配列番号５４のヌクレオチド配列を有する。
一実施形態では、ファイバー、ヘキソン及びキャプシドが血清型１１（Ａｄ１１ｐなど）であり、ウイルスゲノムが治療用抗体又は抗体結合フラグメント（本開示によるＢｉＴＥなど）をコードするＤＮＡ配列を含み、導入遺伝子がウイルス複製を中断しないように、ウイルス複製周期の後期に発現するウイルスゲノムの一部に位置し、該ＤＮＡ配列がアデノウイルスに対して外因性プロモーターの制御下にある（例えば、ＣＭＶプロモーター）、複製能力のある腫瘍溶解性アデノウイルス血清型１１（Ａｄ１１ｐなど）又はそのウイルス誘導体が提供される。一実施形態では、抗体又はフラグメント（本開示によるＢｉＴＥなど）をコードするＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所に記載されるように、特にＬ５領域とＥ４領域との間に位置するＬ５領域と関連する。
一実施形態では、外因性プロモーターは抗原提示細胞プロモーターである。本明細書で使用される抗原提示細胞プロモーターは、樹状細胞又はマクロファージなどの抗原提示細胞によって選択的に発現される遺伝子のプロモーターを指す。そのような遺伝子としては、ＦＬＴ−３、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＬＲ、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ２０９、ＣＤ２７３、ＣＤ２８１、ＣＤ２８３、ＣＤ２８６、ＣＤ２８９、ＣＤ２８７、ＣＸＣＲ４、ＧＩＴＲリガンド、ＩＦＮ−α２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬＴ１、ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ７、ＴＳＬＰ受容体、ＣＤ１４１、ＣＤ３０３、ＣＡＤＭ１、ＣＬＥＣ９ａ、ＸＣＲ１、又はＣＤ３０４；ＣＴＩＩＡ又はＧＩＬＴなどの抗原処理及び提示メディエータが挙げられるが、これらに限定されない。従って、一実施形態では、外因性プロモーターは、該抗原提示細胞における導入遺伝子の選択的発現に適している。
他の調節配列
本明細書で使用される「遺伝子発現の調節因子」（又は調節因子／調節エレメント）は、典型的には転写又は翻訳を開始又は増強することによって遺伝子発現において役割を果たすプロモーター、エンハンサー又はスプライスアクセプター配列などの遺伝的特徴を指す。
本明細書で使用される「スプライスアクセプター配列」、「スプライスアクセプター」又は「スプライス部位」は、ｍＲＮＡ分子がいつスプライセオソーム複合体の小核リボ核タンパク質によって認識されるかを決定する調節配列を指す。一旦組み立てられると、スプライセオソームは、ｍＲＮＡ分子のスプライスアクセプター部位と上流のスプライスドナー部位との間のスプライシングを触媒して、翻訳されて単一のポリペプチド又はタンパク質を生成することができる成熟ｍＲＮＡ分子を生成する。
本発明では異なるサイズのスプライスアクセプター配列を使用することができ、これらは短いスプライスアクセプター（小）、スプライスアクセプター（中）及び分岐スプライスアクセプター（大）として記載することができる。
本明細書で使用されるＳＳＡは、典型的にはちょうど４つの塩基対などのスプライス部位のみを含む短いスプライスアクセプターを意味する。本明細書で使用されるＳＡは、典型的には短いスプライスアクセプター及びポリピリミジントラクトを含むスプライスアクセプター、例えば１６塩基対を意味する。本明細書で使用されるｂＳＡは、典型的には短いスプライスアクセプター、ポリピリミジントラクト及び分岐点、例えば２６塩基対を含む分岐スプライスアクセプターを意味する。
一実施形態では、本開示の構築物に使用されるスプライスアクセプターは、配列番号５５〜５７に示される。一実施形態では、ＳＳＡは、配列番号５５のヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、ＳＡは、配列番号５６のヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、ｂＳＡは配列番号５７のヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、スプライスアクセプター配列は、ＴＧＣＴＡＡＴＣＴＴ ＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣ ＴＴＣＡＧＧ（配列番号５７）、ＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴ ＣＡＧＧ（配列番号５６）、及びＣＡＧＧ（配列番号５５）からなる群から独立して選択される。
一実施形態では、スプライス部位は、ＣＣＡＣＣを含むコンセンサスコザック配列によって直ちに進められる（すなわち、５’から３’方向に進む）。一実施形態では、スプライス部位及びコザック配列には、最大１００個以下の塩基対が点在している。一実施形態では、コザック配列は、配列番号５８のヌクレオチド配列を有する。
典型的には、内因性又は外因性プロモーター（内因性プロモーターなど）の制御下にある場合、コード配列のすぐ前にコザック配列がある。コード領域の開始は、開始コドン（ＡＵＧ）で示され、例えば配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧｇ［配列番号５９］の文脈内にあり、コード配列の「開始」の開始は、太字の塩基によって示される。小文字はこの位置に共通の塩基を表し（それでも変化することができる）、大文字は高度に保存された塩基を示し、すなわち「ＡＵＧＧ」配列は一定であるか又はもしあるとすればまれに変化する。「Ｒ」は、プリン（アデニン又はグアニン）が通常この位置に観察されることを示し、括弧内の配列（ｇｃｃ）は意義不明である。従って、一実施形態では、開始コドンＡＵＧはコザック配列に組み込まれる。
本明細書中で使用される内部リボソーム進入ＤＮＡ配列は、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）をコードするＤＮＡ配列を指す。本明細書で用いられるＩＲＥＳは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列内での開始を含む、ｍＲＮＡ配列の翻訳の開始を可能にするヌクレオチド配列を意味する。カセットがポリシストロニックｍＲＮＡをコードするとき、これは特に有用である。ＩＲＥＳを使用すると、複数の個々のタンパク質又はペプチドに翻訳されるポリシストロニックｍＲＮＡが得られる。一実施形態では、内部リボソーム進入ＤＮＡ配列は、配列番号６０のヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、特定のＩＲＥＳはゲノム内で一度だけ使用される。これは、ゲノムの安定性に関して利益をもたらし得る。
本明細書で使用される「高い自己切断効率の２Ａペプチド」又は「２Ａペプチド」は、翻訳後に効率的に切断されるペプチドを指す。適切な２ＡペプチドはＰ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ及びＴ２Ａを含む。本発明者らは、所与の２Ａペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列が一度使用されると、同じ特定のＤＮＡ配列が二度目に使用されない可能性があることに注目した。しかしながら、ＤＮＡコードの重複性を利用して、同じ２Ａペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列を生成することができる。２Ａペプチドを使用することは、カセットがポリシストロニックｍＲＮＡをコードする場合に特に有用である。２Ａペプチドを使用すると、翻訳後に修飾されて複数の個々のタンパク質又はペプチドを生成する単一のポリペプチド鎖が翻訳される。
一実施形態では、使用されるコードされたＰ２Ａペプチドは、配列番号６１のアミノ酸配列を有する。一実施態様では、使用されるコードされたＦ２Ａペプチドは、配列番号６２のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、使用されるコードされたＥ２Ａペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、使用されるコードされたＴ２Ａペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、導入遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ又は各ｍＲＮＡは、例えば配列番号６５に示されるように、典型的にはｍＲＮＡ配列の最後にポリアデニル化シグナル配列を含む。従って、一実施形態では、導入遺伝子又は導入遺伝子カセットは、ポリアデニル化シグナル配列をコードする少なくとも１つの配列を含む。
本明細書で使用される「ポリＡ」、「ポリアデニル化シグナル」又は「ポリアデニル化配列」は、転写されると新生ｍＲＮＡ分子を切断及びポリアデニル化する多タンパク質複合体によって認識され得るＡＡＴＡＡＡ部位を通常含むＤＮＡ配列を意味する。
一実施形態ではポリアデニル化配列は、配列番号６５のヌクレオチド配列を有する。
一実施形態では、構築物はポリアデニル化配列を含まない。一実施形態では、遺伝子発現の調節因子はスプライスアクセプター配列である。
一実施形態では、抗体又は抗体フラグメント（本開示によるＢｉＴＥなど）などのタンパク質／ポリペプチド／ペプチドをコードする配列は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
導入遺伝子によってコードされる分子
本明細書中に記載されるように、ウイルス中の少なくとも１つの導入遺伝子はＢｉＴＥをコードし、ここで１つの結合ドメインはＴ細胞表面抗原に特異的である。第２の結合ドメインは、適切な抗原、例えば病原体抗原、癌抗原、間質抗原を標的とし得る。
癌抗原（また、腫瘍抗原と称される）は、特定の関心の１つのカテゴリーであり、例えば以下から選ばれるものが含まれる：ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ受容体ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＥＭ、Ａ３３、Ｇ２５０、炭水化物抗原ＬｅＹ、ＬｅＸ、Ｌｅｂ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｅ−カドヘリン、ＳＰＡＲＣ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、イディオタイプ、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３非変異性、ｐ５３変異体、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＰＳＭＡ、ＰＣＳＡ、ＰＳＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、特にＷＴ１、ＭＵＣ１、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン及びｈＴＥＲＴ。
間質抗原には、例えばＦＡＰ、腫瘍関連マクロファージ抗原、及び骨髄由来サプレッサー細胞抗原、例えばＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＳＦ１受容体、ＣＤ１５、ＣＤ３３及びＣＤ６６ｂなどの本明細書に記載の線維芽細胞抗原が含まれる。
以下の標的リストは、適切であれば、本開示に従ってＢｉＴＥでコードされてもよく、あるいはさらなる治療用導入遺伝子として提供されてもよく、又はその両方であってもよい。
一実施形態では、１つ又は複数の導入遺伝子は、ＲＮＡ分子などのタンパク質、ペプチド、ＲＮＡ分子を独立してコードする。有利には、導入遺伝子は細胞内に送達され得、続いて転写され得、適切ならば翻訳され得る。導入遺伝子によってコードされる遺伝物質の例には、例えば抗体又はその結合フラグメント、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節剤、酵素（例えば活性薬剤中でプロドラッグを変換することができる）及びＲＮＡｉ分子が含まれる。
本明細書で使用されるペプチドは、２〜５０残基、例えば５〜２０残基のアミノ酸配列を指す。本明細書で使用されるポリペプチドは、三次構造を含まない、特に二次構造及び三次構造を含まない、５０残基を超えるアミノ酸配列を指す。タンパク質とは、二次及び／又は三次構造、特に二次及び三次構造を有する、５０残基を超えるアミノ酸配列を指す。
一実施形態では、コード配列は治療用ＲＮＡ、治療用ペプチド、治療用ポリペプチド又は治療用タンパク質をコードする（すなわち治療用遺伝子である）。
本明細書で使用される免疫調節遺伝子又は導入遺伝子は、免疫系の細胞の１つ又は複数の活性を、定性的又は定量的に修飾することができるペプチド又はタンパク質分子をコードする遺伝子を意味する。
本明細書で用いる治療用遺伝子は、疾患の治療、改善又は予防に有用であり得る実体をコードする遺伝子を意味し、例えば、その遺伝子は、癌などの疾患の進行を少なくとも減速、停止又は逆転する治療用タンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はＲＮＡを発現する。
一実施形態では、癌細胞などの細胞内で転写又は翻訳されるときに導入遺伝子によってコードされる実体は、細胞による危険信号の生成を増加させる。本明細書で用いられる「危険信号」とは、例えば先天性免疫系の細胞を刺激して直接的に応答するだけでなく、適応免疫系の細胞の活性化を増強するように働くことによって、警告信号として作用する、損傷、ストレス又は非アポトーシス死を受けている細胞によって生じる様々な分子を指す。
腫瘍の微小環境は、天然のヒト免疫応答が下方制御されるようにしばしば変化することが知られている。従って、腫瘍内から免疫応答を再開する能力は、癌の治療において潜在的に非常に興味深い。
一実施形態では、コードされた治療用ペプチド又はタンパク質は、細胞外環境に分泌されるように設計されている。一実施形態では、抗体などの機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、細胞外の微小環境、例えば培養上清、又はインビボ：組織、間質、循環、血液及び／又はリンパ系で放出される。
一実施形態では、導入遺伝子によってコードされるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（本開示によるＢｉＴＥを含む）はシグナル配列を含む。本明細書で使用されるシグナルペプチドは、分泌又は膜発現のための分泌経路へのタンパク質の侵入を補助する、タンパク質のＮ末端に位置する短い１３〜３６残基のペプチド配列を指す。一実施形態では、リーダー配列（シグナルペプチド）は、配列番号６６又は６７のアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、抗体などのコードされた治療用ペプチド又はタンパク質は、例えばタンパク質又は脂質膜アンカーの結合部位に膜貫通ドメインをコードすることを含むことによって、細胞の表面膜に膜固定形態として発現するように設計されている。一般に、本開示の１つ又は複数のＢｉＴＥは、細胞表面アンカーフォーマットとして発現されていない。
一実施形態では、抗体などの機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、アデノウイルスに感染した細胞から、例えば能動的分泌によって、又は細胞溶解の結果として放出される。従って、一実施形態では、アデノウイルスは細胞を溶解し、それによって抗体などの機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を放出する。
別の実施形態では、抗体などのコードされたさらなる治療用ペプチド又はタンパク質は、インタクトな細胞内に保持されるように設計されている。
有利には、本開示のアデノウイルスによって発現される抗体のような機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、インビボで組織中でｍＲＮＡ及び抗体タンパク質の両方として検出され得る。さらに、抗体などの発現された機能的ＲＮＡ、ペプチド又はタンパク質は、ＥＬＩＳＡにおいてそのリガンドに結合することができる。なおさらに、抗体のような機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、早期に検出可能であり（例えば感染の３日以内）、発現は数週間にわたって持続する。
一実施形態では、本開示のアデノウイルスは、感染の約３日以内又はそれ以上、例えば約３６、４８、６０もしくは７２時間以内、又は２、３、４、５もしくは６日などの抗体のような機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を発現する。
一実施形態では、本開示のアデノウイルスは、約１、２、３、４、５又は６週間などの数週間の抗体などの機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を発現する。例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１又は４２日である。
有利には、抗体発現などの機能的ＲＮＡ、ペプチド又はタンパク質の発現は、血中の抗体などの機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を検出することができるのに十分に高い。
一実施形態では、本開示のアデノウイルスによって発現される抗体などの機能的ＲＮＡ、ペプチド又はタンパク質は、血流及び／又はリンパ系に入る。
一実施形態では、本開示のアデノウイルスは、癌細胞に対して増強された治療指数を有する腫瘍溶解性ウイルスである。
一実施形態では、コード配列はさらに機能的ＲＮＡ、例えば治療用ＲＮＡをコードする。
本明細書で使用される機能的ＲＮＡは、タンパク質又はペプチドをコードする以外の機能を有するＲＮＡを指し、例えば、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡなどのＲＮＡｉを含む、遺伝子活性を阻害又は低減するのに適したＲＮＡ構築物を含む。本明細書で使用されるｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現を沈黙させるために使用することができるタイトなヘアピンターンを形成するＲＮＡの配列である短鎖ヘアピンＲＮＡを指す。本明細書で使用されるｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）は、ｍＲＮＡ分子中の相補的配列と塩基対形成を介して機能する、小非コードＲＮＡ分子（約２２ヌクレオチドを含む）を指し、転写レベル又は転写後レベルで遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡにより拘束されたｍＲＮＡ鎖が沈黙するのは、それらがもはやリボソームによってタンパク質に翻訳されることはできないからであり、このような複合体は、多くの場合、積極的に、細胞によって解体されている。
一実施形態では、導入遺伝子はタンパク質をコードする。本明細書で使用されるタンパク質は、タンパク質リガンド、タンパク質受容体、又は抗体分子を含む。
本明細書で使用されるタンパク質リガンドは、例えば細胞内シグナル伝達を刺激し、細胞内の遺伝子転写を調節することによって細胞受容体に結合するか、そうでなければ関与して細胞機能に影響を及ぼす、細胞表面膜又はその分泌タンパク質結合フラグメントを指す。一実施形態では、発現されるタンパク質は、細胞の表面に発現されるように及び／又は細胞から分泌されるように操作される。
一実施形態では、コードされるタンパク質は、ＢｉＴＥなどの二重特異性抗体である。
一実施形態では、導入遺伝子は、酵素、例えば腫瘍の細胞外マトリックスの分解を助ける酵素、例えばＤＮＡｓｅ、コラゲナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ２又は１４など）などをさらにコードする。
適切な抗体及び抗体フラグメントは、アゴニスト性又はアンタゴニスト性であり得、抗癌活性を有するもの及び癌に対する宿主細胞応答を改変するものを含み、例えば：アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体フラグメントは、血管新生を減少させ又は腫瘍の血管新生を正常化し得る。一実施形態では、アゴニスト抗体又は他のコードされたタンパク質は、例えば抗原、危険シグナル、サイトカインもしくはケモカインを発現させてそれらを引きつけ活性化することによって、又は共刺激分子もしくはチェックポイント経路分子と結合して適応免疫応答を高めることによって、宿主細胞を宿主の生得的で適応性のある免疫応答についてより可視化し得る。
本明細書で使用される治療用抗体又は抗体結合フラグメントは、腫瘍溶解性ウイルスに挿入されたときに患者の病状、例えば治療される癌に有益な影響を与える抗体又は抗体結合フラグメントを指す。
本明細書で使用される有益な影響は、インビボで発現している抗体の望ましい及び／又は有利な効果を指す。
治療用抗体及び抗体結合フラグメントのクラスには、抗ＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰＤＧＦ抗体、抗ＣＴＬＡ抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体及び抗ＦＧＦ抗体が含まれる。
本開示のウイルスへの組み込みに適した登録治療用抗体には、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ（ｃｅｒｔｏｌｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ（ｅｃｕｌｚｕｍａｂ）、エファリズマブ（ｅｆａｌｉｘｕｍａｂ）、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、オフツムマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ及びトラスツズマブが挙げられる。
一実施形態では、使用される抗体又は抗体フラグメントの抗体可変領域配列は、９６、９７、９８又は９９％類似又は同一など、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）としても知られる）の可変領域と９５〜１００％類似又は同一である。
本開示のウイルスへの組み込みにも適しているのは、癌の適応症に対して承認されているそれらの抗体及びその結合フラグメント、例えばトラスツズマブ、トシツマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、オファツマブ、イピリムマブ、イブリツマブチウキセタン、ゲムツズマブ、デノスマブ、セツキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、アバスチン及びアダリムマブのためのコード配列である。
一実施形態では、使用される抗体又は抗体フラグメントの抗体可変領域配列は、公知の抗体又は本明細書に開示される抗体の可変領域と９５〜１００％類似又は同一である。
本明細書で使用される「抗体分子」は、抗体及びその結合フラグメントを含む。
本明細書で使用される抗体は、一般に、全長抗体、及びそれを含む二重特異性又は多重特異性フォーマットを指す。
抗体結合フラグメントは、それが由来する元の「抗体」と同じ、類似の、又はより良好な特異性で抗原を標的化することができる抗体フラグメントを含む。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二、三又は四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６〜１１３６；Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ ２（３）、２０９〜２１７を参照のこと）。これらの抗体フラグメントを生成及び産生するための方法は当技術分野において周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１を参照のこと）。本発明における使用のための他の抗体フラグメントは、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されているＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントを含む。多価抗体は、多重特異性、例えば二重特異性を含み得るか、又は単一特異性であり得る（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２及びＷＯ２０１０／０３５０１２を参照のこと）。
本明細書中で使用される場合、特異的とは、それが特異的である抗原のみを認識する抗体もしくはフラグメント、又は特異的でない抗原に対するその結合親和性と比較して特異的な抗原に対して、例えば５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性などの著しく高い結合親和性を有する抗体又はフラグメントを指すことを意図する。
公知の抗体又は抗体結合フラグメントを使用して、同じＣＤＲ又は同じ可変領域を有する別の抗体フォーマットを生成することができ、例えば全長抗体をＦａｂ、Ｆａｂ’又はｓｃＦｖフラグメントに容易に変換することができる。
非ヒト動物由来の抗体分子、ヒト抗体分子、ヒト化抗体分子及びキメラ抗体分子を含む、広範囲の異なる形態の抗体を本開示の構築物において使用することができる。
一実施形態では、抗体又は結合フラグメントはモノクローナルである。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、ｐｐ７７〜９６、Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５）などの当該分野に公知のいかなる方法によって調製されてもよい。
一実施形態では、抗体又は結合フラグメントは非ヒト、すなわち完全に非ヒト由来のものである。これは、抗体及びフラグメントがウイルスによって癌細胞内に送達され得るので可能である。
一実施形態では、抗体はキメラであり、例えばヒト定常領域及び非ヒト可変領域を有する。
一実施形態では、抗体又は結合フラグメントはヒト、すなわち完全にヒト由来のものである。
一実施形態では、抗体又は結合フラグメントはヒト化されている。ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体を含む）は、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；ＷＯ９１／０９９６７を参照のこと）。ＣＤＲ全体ではなくＣＤＲの特異性決定残基を転移することのみが必要であり得ることが理解されよう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４を参照のこと）。ヒト化抗体は、例えばＣＤＲが由来した、非ヒト種に由来する１つ又は複数のフレームワーク残基を場合によりさらに含み得る。
一実施形態では、コード配列は抗体重鎖、抗体軽鎖又は抗体フラグメントをコードする。本明細書で使用される重鎖（ＨＣ）は、抗体の大きなポリペプチドサブユニットを指す。本明細書で使用される軽鎖（ＬＣ）は、抗体の小さなポリペプチドサブユニットを指す。一実施形態では、抗体軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかのＣＬドメインを含む。
本開示における使用のための抗体は、当該分野において公知の任意の適切な方法を使用して得られ得る。ポリペプチド（活性化Ｔ細胞など）を発現する細胞（組換え型又は天然型）を含む、融合タンパク質を含む抗原ポリペプチド／タンパク質は、抗原を特異的に認識する抗体を産生するために使用することができる。ポリペプチドは、「成熟」ポリペプチド又はその生物学的に活性なフラグメントもしくは誘導体であり得る。
抗体のスクリーニングは、抗原への結合を測定するためのアッセイ及び／又は受容体に拮抗する能力を測定するためのアッセイを使用して実施することができる。結合アッセイの例は、特に、プレート上に固定化されている融合タンパク質（場合によりレポーターを含む）を用い、融合タンパク質に結合した抗抗原抗体を検出するためにコンジュゲートした二次抗体を用いるＥＬＩＳＡである。
存在する場合、本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、抗体分子の提案された機能、特に必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであり得る。特に、抗体分子が治療的使用を目的とし、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプを使用することができる。あるいは、抗体分子が治療目的に意図され、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、例えば単純な活性化作用又は標的の中和のために、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用してもよい。これらの定常領域ドメインの配列改変体もまた使用され得ることが理解されよう。例えば、Ａｎｇａｌ ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、３０（１）、１０５〜１０８に記載されているように、２４１位のセリンがプロリンに変更されている、ＩｇＧ４分子を使用することができる。
例えば免疫系の細胞のような抗体の標的分子を担持する細胞に活性化シグナルを送達するための特定の抗体機能については、抗体が発現細胞の表面に発現されるように抗体の膜アンカー型を使用することが有利であり得る。このような細胞表面発現結合分子は、標的分子からレシピエント細胞への活性化シグナルの送達を増強する別の細胞の表面上の標的シグナル伝達分子間の効率的な多量体相互作用を可能にする。
有利には、本開示のアデノウイルスは、全長抗体、ｓｃＦｖなどの抗体フラグメント、多重特異性抗体、特に本明細書に記載のＢｉＴＥなどの二重特異性抗体を発現することができる。
一実施形態では、抗体又は抗体フラグメント（本開示によるＢｉＴＥなど）をコードする配列は、内部リボソーム進入配列を含むか、又はさらに含む。本明細書中で使用される内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の中央での翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列を意味する。
一実施形態では、コードされた治療用タンパク質又はペプチドは標的特異的タンパク質、ポリペプチド又はペプチドである。
本明細書で使用される標的特異的タンパク質又はペプチドは、標的タンパク質自体、又は標的タンパク質もしくはペプチドのレベルに直接結合するか（例えば標的に特異的な）、そうでなければ修飾する、異なるタンパク質もしくはペプチドのいずれかを指す。前者の例はサイトカインであり、一方後者の例はそのサイトカインに対する抗体である。
対象の標的は一般的に、特定の細胞、細胞生成物、抗原、又は疾患、特に癌に関連するシグナル伝達経路に関する。文脈に応じて、標的は、タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又は同様のものにも関し、これは例えばＲＮＡｉ型技術によって阻害することができる。従って、ＲＮＡｉ技術などのＲＮＡの文脈において、標的は標的の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡである。
対象の標的の例としては、刺激性Ｔ細胞コレセプター及びそのリガンド、チェックポイント阻害性Ｔ細胞コレセプター分子及びそのリガンド、調節性Ｔ細胞によって発現される受容体及びそのリガンド、骨髄由来サプレッサー細胞及び免疫抑制免疫細胞、樹状細胞及び抗原提示細胞受容体及びそれらのリガンド、抗原プロセシング及び提示メディエーター、サイトカイン及びサイトカイン受容体、ケモカイン及びケモカイン受容体、転写因子及び転写調節因子、細胞内輸送分子及び細胞機能調節因子、腫瘍細胞及び腫瘍微小環境受容体及び生成物、ＩＤＯなどの細胞内腫瘍細胞酵素、免疫細胞による認識のための抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
従って、一実施形態では、本明細書で使用される標的は、例えば抗体又はその中の結合フラグメントによって、必要に応じて、例えば阻害、中和又は活性化することができるタンパク質又はポリペプチドを指す。サイトカインの文脈における標的とは、サイトカイン自体、又はサイトカインに特異的な抗体もしくはその結合フラグメントを指す。従って、その放出が「宿主」免疫応答を刺激する可能性があるので、ウイルスはサイトカイン自体をコードし、発現する可能性がある。リガンドの文脈において、リガンドの変異型は、受容体に結合するために天然のリガンドと競合するウイルスによってコードされ得る。変異リガンドは、例えばそれが遅い解離速度を有し、それにより受容体を占有し、それからのシグナル伝達を増加又は減少させるように、受容体に対する増加した結合親和性を有し得る。あるいは、変異リガンドの活性は、野生型リガンドと比較して低下し得、それによって、天然リガンドから受容体を介した結合及び全体的な活性が低下する。
一実施形態では、本開示によるウイルス又は構築物は、プロドラッグ、免疫調節剤及び／又は酵素をコードする。
本明細書中で使用されるプロドラッグは、不活性な（又は完全に活性ではない）誘導体として投与され、その後しばしば通常の代謝過程を経て体内で活性な薬剤に変換される分子を意味する。プロドラッグは、意図した薬物の一種の前駆体として機能する。プロドラッグ変換酵素は、プロドラッグをその薬理学的に活性な形態に変換する酵素として機能する。
本明細書で使用される免疫調節剤は、免疫応答の調節剤を意味する。免疫調節剤は、免疫増強、免疫抑制、又は免疫寛容の誘導におけるように、所望のレベルへの免疫応答の調整において機能する。
Ｔ細胞が完全に活性化するためには２つのシグナルが必要である。抗原特異的である第１のシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の膜上のペプチド−ＭＨＣ分子と相互作用するＴ細胞受容体を介して提供される。第２のシグナル、すなわち共刺激シグナルは、抗原非特異的であり、ＡＰＣの膜上に発現される共刺激分子とＴ細胞との間の相互作用によって提供される。従って、本明細書で使用される共刺激分子は、活性化、増殖及び生存のためにＴ細胞によって必要とされる抗原特異的シグナルに相補的シグナルを提供する分子を意味する。共刺激分子の例には、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３及び４−１ＢＢが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される酵素は、生物において触媒として作用し、化学反応がそれ自体プロセスにおいて変化することなく進行する速度を調節する物質を意味する。
以下は、例示的な標的ペプチド／ポリペプチド及びタンパク質の非網羅的考察である。
一実施形態では、標的は免疫チェックポイント又は細胞周期チェックポイントタンパク質などのチェックポイントタンパク質である。チェックポイントタンパク質の例には、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−３、ＩＬＴ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ又はＣＤ１６０、例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、そのうちの１つに特異的な抗体又はその結合フラグメントが提供される。従って、一実施形態では、導入遺伝子又は導入遺伝子カセットは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする。一実施形態では、アデノウイルスは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２に特異的な抗体又は抗体フラグメントを発現する。
一実施態様では、抗体は、例えば抗ＰＤ−Ｌ１などのチェックポイント阻害剤抗体である。一実施形態では、アデノウイルスは全長抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体を発現する。一実施形態では、全長抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体の発現は、特にＢＹ位置における主要後期プロモーター（ＭＬＰ）などの内因性プロモーターの制御下にある。一実施形態では、アデノウイルスはｓｃＦｖ形態の抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体を発現する。一実施形態では、ｓｃＦｖ形態の抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体の発現は、特にＢＹ位置における主要後期プロモーターなどの内因性プロモーターの制御下にある。
一実施形態では、例えば本明細書に例示されるように、完全長抗体又はＣＴＬＡ−４に特異的なｓｃＦｖに対する抗体又はその結合フラグメントをコードする本開示によるウイルス又は構築物が提供される。
一実施形態では、標的は、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３３２、ＣＤ１２７、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ１６２、ＣＤ３０１ａ、ＣＤ３０１ｂ及びガレクチン−３からなる群から独立して選択される１つ又は複数である。一実施形態では、それに対して特異的な抗体又はその結合フラグメント、例えば全長抗体又はｓｃＦｖが提供される。
一実施形態では、例えば抗体又は結合フラグメントによって標的化され得る標的は、ＦＬＴ−３、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＬＲ、ＴＬＲリガンド、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、ＣＤ２０９、ＣＤ２７３、ＣＤ２８１、ＣＤ２８３、ＣＤ２８６、ＣＤ２８９、ＣＤ２８７、ＣＸＣＲ４、ＧＩＴＲリガンド、ＩＦＮ−α２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬＴ１、ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ７、ＴＳＬＰ受容体、ＣＤ１４１、ＣＤ３０３、ＣＡＤＭ１、ＣＬＥＣ９ａ、ＸＣＲ１及びＣＤ３０４からなる群から独立して選択される１つ又は複数である。
一実施形態では、本開示で使用されるＢｉＴＥの標的は、腫瘍細胞抗原である。
一実施形態では、標的は、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ受容体ＨＥＲ １、ＨＥＲ ２、ＨＥＲ ３、ＨＥＲ ４、ＰＥＭ、Ａ３３、Ｇ２５０、炭水化物抗原Ｌｅｙ、Ｌｅｘ、Ｌｅｂ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｅ−カドヘリン、ＳＰＡＲＣ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３からなる群から独立して選択される１つ又は複数である。
一実施形態では、本開示において使用されるＢｉＴＥの標的は、腫瘍間質抗原である。
一実施形態では、本開示において使用されるＢｉＴＥの標的は、ＦＡＰ、ＴＲＥＭ１、ＩＧＦＢＰ７、ＦＳＰ−１、血小板由来成長因子−α受容体（ＰＤＧＦＲ−α）、血小板由来成長因子β受容体（ＰＤＧＦＲ−β）及びビメンチンからなる群から独立して選択される１つ又は複数である。
一実施形態では、例えば抗体又は結合フラグメント（ＢｉＴＥなど）によって標的とされ得る標的は、癌標的である。
一実施形態では、標的は、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＴＬ１Ａ、ＣＤ７０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ又はＩＣＯＳリガンド、例えばＣＤ４０及びＣＤ４０リガンドからなる群から独立して選択される１つ又は複数である。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは、ＣＤ４０もしくはＣＤ４０リガンドを含むリガンド、又はＣＤ４０もしくはＣＤ４０リガンドを標的とする抗体、抗体フラグメントもしくはｓｈＲＮＡをコードする。一実施形態では、アデノウイルスは、ＣＤ４０もしくはＣＤ４０リガンドを含むリガンド、又はＣＤ４０もしくはＣＤ４０リガンド（に特異的な）を標的とする抗体、抗体フラグメントもしくはｓｈＲＮＡを発現する。
一実施形態では、標的は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５からなる群から独立して選択される１つ又は複数のサイトカインである。インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、リンホトキシンα（ＬＴＡ）及びＧＭ−ＣＳＦ。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ又はリンホトキシンα（ＬＴＡ）に特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする。一実施形態では、アデノウイルスは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ又はリンホトキシンα（ＬＴＡ）を発現する。
一実施形態では、ＩＦＮγのアミノ酸配列は、配列番号６８である。一実施形態では、ＩＦＮαのアミノ酸配列は、配列番号６９である。一実施形態では、ＴＮＦαのアミノ酸配列は、配列番号７０である。
一実施形態では、標的はケモカイン、例えば、ＩＬ−８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５及びＣＲＴＨ２からなる群から選択される１つ又は複数である。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４又はＣＸＣＲ４に特異的な抗体又は抗体フラグメントをコードする。ケモカインの文脈において、標的は、例えば癌に対する宿主免疫応答を誘導又は増強するために、ウイルスがケモカインをコードし発現する場所を含む。
一実施形態では、アデノウイルスは、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４又はＣＸＣＲ４に特異的な抗体又は抗体フラグメントを発現する。
一実施形態では、標的は、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ＣＴＩＩＡ、ＭｙＤ８８、及びＮＦκＢファミリーメンバーからなる群から独立して選択される１つ又は複数であり、例えばタンパク質は阻害剤、例えば抗体もしくはその結合フラグメントで標的化されるか、又は関連遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、ＲＮＡｉなどのメカニズムによって阻害される。
一実施形態では、標的はＨＳｐ７０又はサバイビンなどの細胞生存及び死の調節因子であり、例えばタンパク質は阻害剤、例えば抗体又はその結合フラグメントで標的化されるか、又は関連遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、ＲＮＡｉなどのメカニズムによって阻害される。
一実施形態では、標的は、アンフィレグリン、ＢＴＣ、ＮＲＧ１ａ、ＮＲＧ１ｂ、ＮＲＧ３、ＴＧＦα、ＬＲＩＧ１、ＬＲＩＧ３、ＥＧＦ、ＥＧＦ−Ｌ６、Ｅｐｉｇｅｎ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３及びＨｅｒ４からなる群から独立して選択される１つ又は複数であり、例えばタンパク質は阻害剤、例えば抗体又はその結合フラグメントで標的化されるか、又は関連遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、ＲＮＡｉのようなメカニズムによって阻害される。
一実施形態では、標的は、ヘッジホッグ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ及びＮｏｔｃｈからなる群から独立して選択される１つ又は複数に対するリガンド又は受容体である。
一実施形態では、アデノウイルスは、ＶＥＧＦに特異的な抗体又は抗体フラグメントを発現する。一実施形態では、抗体は抗ＶＥＧＦ抗体である。例えば、抗体ベバシズマブのアミノ酸配列を有する抗体、又はそれと同等のものなど。一実施形態では、アデノウイルスは全長抗ヒトＶＥＧＦ抗体を発現する。一実施形態では、全長抗ヒトＶＥＧＦ抗体の発現は、特にＢＹ位置における主要後期プロモーター（ＭＬＰ）などの内因性プロモーターの制御下にある。一実施形態では、アデノウイルスはｓｃＦｖ形態の抗ヒトＶＥＧＦ抗体を発現する。一実施形態では、ｓｃＦｖ形態の抗ヒトＶＥＧＦ抗体の発現は、特にＢＹ位置における主要後期プロモーターなどの内因性プロモーターの制御下にある。
一実施形態では、標的はＩＤＯである。
一実施形態では、標的は、免疫細胞による認識のための抗原（ＢｉＴＥが関与するＴ細胞など）であり、サイトメガロウイルス抗原、インフルエンザ抗原、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原及びコア抗原、ジフテリアトキソイド、Ｃｒｍ１９７、破傷風トキソイドなどの感染性生物由来の免疫原性タンパク質；公知のＴ細胞もしくは抗体エピトープであるそのような抗原に由来するペプチド、又はそのような抗原の遺伝子操作された複合体もしくは多量体；抗原としての腫瘍由来タンパク質Ｔ細胞又は抗体のエピトープとして公知のそのような抗原に由来するペプチド；及び遺伝子操作された複合体又はそのような抗原、例えばＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、イディオタイプ、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３非変異、ｐ５３変異体、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＰＳＭＡ、ＰＣＳＡ、ＰＳＡ、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、特にＷＴ１、ＭＵＣ１、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン又はｈＴＥＲＴの多量体からなる群から独立して選択される１つ又は複数のタンパク質又はペプチドである。
当業者は、コドンの冗長性のために所与のアミノ酸配列をコードする核酸配列について多くの可能性が存在すること、サイレント核酸塩基対変異が許容されること、及び任意の配列番号に定義される所与のアミノ酸配列をコードするすべての核酸配列は本開示によって想定されることを理解するであろう。
一実施形態では、導入遺伝子によってコードされるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質はミモトープである。本明細書で使用されるミモトープは、エピトープの構造を模倣する分子、しばしばペプチドである。後者の特性は、エピトープによって誘発されるものと同様の抗体反応を引き起こす。所与のエピトープ抗原に対する抗体は、そのエピトープを模倣するミモトープを認識するであろう。ミモトープは、通常、バイオパニングによってファージディスプレイライブラリーから得られる。ミモトープを利用するワクチンが開発されている。従って、公知の特異性の抗体を用いてライブラリー（例えばファージディスプレイ中のペプチドライブラリー、例えばＡｂ配列ライブラリー又は非抗体ペプチドライブラリー、特により安定な３Ｄ立体配座を有するペプチドを産生するために最適化したもの）をスクリーニングすることができる。ミモトープの産生は、当該分野に十分に記載されている（Ｔｒｉｂｂｉｃｋ Ｇ、Ｒｏｄｄａ Ｓ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｗｈｉｃｈ ｂｉｎｄ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００２ １５（５）：３０６〜１０；Ｍａｓｕｋｏ Ｔ、Ｏｈｎｏ Ｙ、Ｍａｓｕｋｏ Ｋ、Ｙａｇｉ Ｈ、Ｕｅｊｉｍａ Ｓ、Ｔａｋｅｃｈｉ Ｍ、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｙ．Ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ａ ｒｏｂｕｓｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｕｓｉｎｇ ｒａｔｓ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．２０１１ １０２（１）：２５〜３５を参照のこと）。
一実施形態では、ミモトープ又は他の設計されたワクチン抗原は、導入遺伝子によってコードされ、レシピエント患者において抗体応答を誘導するために発現し、ここで誘導された抗体は所望の治療効果を有する。一実施形態では、所望のヒトリガンド由来のペプチド配列を有するＧＦＰ−ペプチド融合タンパク質を用いて、抗自己標的抗体応答誘導する。例えば、標的分子ＰＤ−１への結合に重要であることが知られているＰＤ−Ｌ１のペプチド領域は、ペプチドに対する免疫抗体応答が、天然のＰＤＬ１分子と交差反応する抗体を含み、従って、ＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−１相互作用をブロックするのに役立つように、直接抗ＰＤＬ１抗体をコードするのと同じ方法で、ＧＦＰ又は他の免疫原性の高い外来担体タンパク質と遺伝的に連結され得る。抗自己治療的抗体応答を誘導するワクチンの概念は、当該分野において十分に記載されている（Ｓｐｏｈｎ Ｇ、Ｂａｃｈｍａｎｎ ＭＦ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｌｏｃｋ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３ ３（３）：４６９〜７６；Ｌｉｎｋ Ａ、Ｂａｃｈｍａｎｎ ＭＦ．Ｉｍｍｕｎｏｄｒｕｇｓ： ｂｒｅａｋｉｎｇ Ｂ− ｂｕｔ ｎｏｔ Ｔ−ｃｅｌｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｃｙｔｏｋｉｎｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１０ ２（４）：５６１〜７４；Ｄｅｌａｖａｌｌeｅ Ｌ、Ａｓｓｉｅｒ Ｅ、Ｓｅｍｅｒａｎｏ Ｌ、Ｂｅｓｓｉｓ Ｎ、Ｂｏｉｓｓｉｅｒ ＭＣ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｎｔｉｃｙｔｏｋｉｎｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００８ ７（１０）：１５０７〜１７を参照のこと）。
１つ又は複数の実施形態において、使用される導入遺伝子は、配列番号２、４、７、１１又は１６のいずれか１つに示される配列をコードする。
別の実施形態では、使用される導入遺伝子は、例えば、配列番号７２〜７８のいずれか１つに記載のウイルスに示されるように、Ｃ末端のデカ−Ｈｉｓ親和性タグを除外する配列をコードする。
有利には、本開示のアデノウイルスは、抗体形態（ＢｉＴＥなど）及びその中の導入遺伝子によってコードされるサイトカインなどの他のタンパク質を発現し、インビトロで培養上清中に、又はインビボで腫瘍組織間質中に放出する。リーダー配列は、コードされたタンパク質／ポリペプチド又は癌細胞を出るペプチドを助け得る。従って、一実施形態では、コードされた「タンパク質」はリーダー配列を含む。本明細書で使用されるリーダー配列は、プロモーター配列と転写又は翻訳のレベルで遺伝子発現を調節することができるコード領域との間に位置するポリヌクレオチド配列を指す。
一実施形態では、コード配列はペプチドをコードする。本明細書で使用されるペプチドは、完全な機能的タンパク質ではないアミノ酸鎖を指す。典型的には、それが免疫系のフラグメントであるか又は免疫系によって認識され得るタンパク質の機能の一部又は全部を保持するフラグメント、例えば、Ｔ細胞によって認識され得る８個以上のアミノ酸のペプチド。
一実施形態では、導入遺伝子は、例えばルシフェラーゼ、ＧＦＰ又はｅＧＦＰ又は赤色蛍光タンパク質などの生物発光蛍光イメージング剤（活性化可能蛍光イメージング剤を含む）を含むイメージング剤をコードするレポーター遺伝子である。
本明細書で使用されるレポーター遺伝子又はレポーター配列は、真核細胞において容易に検出される産物を産生する遺伝子又はＤＮＡ配列を意味し、そのＤＮＡが密接に連結又は結合している他の遺伝子の活性を決定するためのマーカーとして使用され得る。レポーター遺伝子は、それらを発現する細胞又は生物上で、容易に同定及び測定されるか、又は選択マーカーである特徴を付与する。レポーター遺伝子は、特定の遺伝子が細胞又は生物集団によって取り込まれたか、又はその中で発現されたかどうかの指標としてしばしば使用される。一般的なレポーター遺伝子の例としては、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ニトロレダクターゼ（例えばＮｆｓＡ、ＮｆｓＢ）細胞内メタロタンパク質、ＨＳＶ１−ｔｋ又はエストロゲン受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、遺伝物質（特に導入遺伝子）は、造影剤、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ又はｅＧＦＰなどのレポーター遺伝子をコード又は発現しない。
本開示によるウイルスは、腫瘍細胞のパネルにおけるその溶解能力の試験によって特定の腫瘍タイプに対するそれらの優先性について調べることができる。例えば、結腸腫瘍細胞株には、ＨＴ−２９、ＤＬＤ−１、ＬＳ１７４Ｔ、ＬＳ１０３４、ＳＷ４０３、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８、及びＣｏｌｏ３２０ＤＭが含まれる。任意の利用可能な結腸腫瘍細胞株がそのような評価に同様に有用であろう。
前立腺細胞株には、ＤＵ１４５及びＰＣ−３細胞が含まれる。膵臓細胞株には、Ｐａｎｃ−１細胞が含まれる。乳房腫瘍細胞株にはＭＤＡ２３１細胞株が含まれ、卵巣細胞株にはＯＶＣＡＲ−３細胞株が含まれる。造血細胞株には、Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ Ｂリンパ球、Ｋ５６２赤芽球様細胞、Ｕ９３７骨髄様細胞、及びＨＳＢ ２ Ｔリンパ球が含まれるが、これらに限定されない。他の利用可能な腫瘍細胞株も同様に有用である。
本開示はまた、本明細書に開示されている新規な配列にも及ぶ。一実施形態では、ウイルスは、本明細書に開示されたいずれか１つの配列、例えば配列番号３４〜３７のいずれか１つ、又は、それと少なくとも９５％同一の配列、例えば配列番号７９〜８２のいずれか１つに記載の配列に示される。
製剤
本開示はまた、本明細書中に記載されるようなウイルスの医薬製剤にも関する。
一実施形態では、例えば注入又は注射のための、本開示による複製可能な腫瘍溶解性の液体非経口製剤が提供され、ここで製剤は、用量の体積あたり１×１０１０〜１×１０１４ウイルス粒子の範囲の用量を提供する。
非経口製剤は、消化管を通して送達されないように設計された製剤を意味する。典型的な非経口送達経路は注射、移植又は注入を含む。一実施形態では、製剤はボーラス送達用の形態で提供される。
一実施形態では、非経口製剤は注射剤の形態である。注射としては、静脈内、皮下、腫瘍内又は筋肉内注射が挙げられる。本明細書で使用される注射は、注射器を介して体内に液体を挿入することを意味する。一実施形態では、本開示の方法は腫瘍内注射を含まない。
一実施形態では、非経口製剤は注入剤の形態である。
本明細書で使用される注入は、点滴、注入ポンプ、シリンジドライバー又は同等の装置によるより遅い速度での流体の投与を意味する。一実施形態では、注入は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、６５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０又は１１５分など、１．５分から１２０分の範囲の期間にわたって投与される。
一実施形態では、シリンジドライバによって投与される場合など、製剤の１用量は１００ｍｌ未満、例えば３０ｍｌである。一実施形態では、製剤の１用量は１０ｍｌ未満、例えば９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｍｌである。一実施形態では、製剤の１用量は１ｍｌ未満、例えば０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２又は０．１ｍｌである。
一実施形態では、注射は、例えば１．５〜３０分かけて緩徐注射として投与される。
一実施形態では、製剤は静脈内（ｉ．ｖ．）投与用である。この経路は、大多数の臓器及び組織への迅速なアクセスを可能にし、例えば確立された転移、特に肝臓及び肺のような高度に血管新生化された領域にある転移の治療に特に有用であるため、腫瘍溶解性ウイルスの送達に特に有効である。
治療用製剤は典型的に、製造及び保存条件下で無菌かつ安定であろう。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又はヒトへの投与に適した他の非経口製剤として製剤化することができ、シリンジ又はバイアルなどの予め充填された装置として、特に単回投与として製剤化することができる。
製剤は一般に、薬学的に許容される希釈剤又は担体、例えば、ウイルスと適合性であり、ウイルスが必要な期間安定である無毒性の等張性担体を含む。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの分散剤もしくは界面活性剤、又はポリソルベート８０もしくは４０などの非イオン性界面活性剤の使用によって維持することができる。分散液において、必要な粒径の維持は、界面活性剤の存在によって補助され得る。等張化剤の例には、組成物中の糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、又は塩化ナトリウムが含まれる。
一実施形態では、使用される非経口製剤は、以下の緩衝液のうちの１つ又は複数を含み得る。例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、リン酸緩衝液及び／又はトリス緩衝液、例えばデキストロース、マンノース、スクロースなどの糖、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム又は塩化カリウムなどの塩、ブリジ、ＰＳ−８０、ＰＳ−４０などの非イオン性界面活性剤などの洗剤など。製剤はまた、可能な分解の１つ又は複数の経路を妨げると考えられている、ＥＤＴＡもしくはエタノール又はＥＤＴＡとエタノールとの組み合わせなどの防腐剤を含み得る。
一実施形態では、製剤は、用量当たり１×１０１０〜１×１０１２のウイルス粒子などの、例えば用量当たり１×１０１０〜１×１０１４のウイルス粒子などの、本開示による精製された腫瘍溶解性ウイルスを含むであろう。一実施形態では、製剤中のウイルスの濃度は、２ｘ１０１２ｖｐ／ｍｌなど、２ｘ１０８〜２ｘ１０１４ｖｐ／ｍＬの範囲である。
一実施形態では、非経口製剤はグリセロールを含む。
一実施形態では、製剤は、本明細書に記載の腫瘍溶解性アデノウイルス、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、グリセロール及び緩衝液を含む。
一実施形態では、非経口製剤は、本開示のウイルス、例えば５ｍＭのＨＥＰＥＳ、例えば５〜２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、例えばｐＨを７〜８の範囲に調整するための塩酸、及び注射のための水からなる。
一実施形態では、２ｘ１０１２ｖｐ／ｍＬの濃度の本開示のウイルス０．７ｍＬを、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０％のグリセロール中に最終ｐＨ７．８で配合する。
薬学的に許容される担体の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。
一実施形態では、製剤は吸入を含む局所投与用の製剤として提供される。
適切な吸入用製剤には、吸入用粉末、噴射剤ガスを含有する計量エアロゾル、又は噴射剤ガスを含まない吸入用溶液が含まれる。本開示による吸入用粉末は、一般に、生理学的に許容される賦形剤と共に、本明細書に記載のウイルスを含有するであろう。
これらの吸入用粉末は、単糖類（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖類（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖類及び多糖類（例えばデキストラン）、ポリアルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩類（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらの互いの混合物を含み得る。単糖類又は二糖類、特にラクトース又はグルコースの使用が適切に用いられるが、それらの水和物の形態で使用されることはない。
肺に沈着させるための粒子は、１０ミクロン未満、例えば１〜９ミクロン、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍの粒径を必要とする。ウイルスを担持する粒径は最も重要であり、従って一実施形態では、本開示によるウイルスは、所与のサイズのラクトース粒子などの粒子上に吸着又は吸収され得る。
吸入可能なエアロゾルを調製するために使用され得る噴射剤ガスは当該分野で公知である。適切な噴射剤ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンなどの炭化水素、ならびにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体などのハロ炭化水素の中から選択される。上記の噴射剤ガスは、それ自体で又はそれらの混合物で使用することができる。
特に適切な噴射剤ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）及びそれらの混合物が特に適している。
噴射剤ガス含有吸入用エアロゾルはまた、共溶媒、安定剤、界面活性剤（界面活性物質）、酸化防止剤、潤滑剤及びｐＨを調整するための手段などの他の成分を含有し得る。これら全ての成分は当該分野において公知である。
本発明による噴射剤ガス含有吸入用エアロゾルは、５重量％までの活性物質を含有することができる。本発明によるエアロゾルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％、又は０．５〜１重量％の有効成分を含有する。
あるいは、肺への局所投与は、例えばネブライザー、例えばコンプレッサーに接続されたネブライザー（例えば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．によって製造されたＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）コンプレッサーに接続されたｔｈｅ Ｐａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）ネブライザー）のような装置を用いて、溶液又は懸濁液製剤の投与によることもできる。
本発明のウイルスは、例えば非経口製剤について既に上述したように、例えば溶液又は懸濁液の形態で溶媒中に分散して送達することができる。それは適切な生理学的溶液、例えば食塩水又は他の薬理学的に許容される溶媒又は緩衝溶液に懸濁することができる。当該分野で公知の緩衝溶液は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するように、１ｍｌの水あたり０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有し得る。
治療用懸濁液又は溶液製剤はまた、１つ又は複数の賦形剤を含有し得る。賦形剤は当該分野において周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸塩緩衝液及び重炭酸塩緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールを含む。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェアに封入することができる。製剤は一般に、無菌製造方法を用いて実質的に無菌の形態で提供されるであろう。
これは、製剤に使用される緩衝溶媒／溶液の濾過による製造及び滅菌、無菌緩衝溶媒溶液中の抗体の無菌懸濁液、及び当業者によく知られた方法による製剤の無菌容器への分配を含み得る。
本開示による噴霧可能製剤は、例えば、ホイルエンベロープに詰められた単回投与単位（例えば、密封プラスチック容器又はバイアル）として提供されてもよい。各バイアルは、例えば２ｍＬ容量の溶媒／溶液緩衝液中に単位用量を含む。
治療
さらなる態様において、本開示は、治療、特に癌の治療に使用するための本明細書に記載のウイルス又はその製剤に及ぶ。
一実施形態では、治療方法は、腫瘍、特に固形腫瘍の治療に使用するためのものである。
本明細書で用いられる腫瘍は、新生物とも呼ばれる、制御されずかつ進行性である過剰な細胞分裂から生じる異常な組織塊を指すことを意図している。腫瘍は良性（癌性ではない）又は悪性のいずれかであり得る。腫瘍はあらゆる形態の癌及び転移を包含する。
一実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。固形腫瘍は局在性又は転移性であり得る。
一実施形態では、腫瘍は上皮起源のものである。
一実施形態では、腫瘍は、結腸直腸癌、肝癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頸部癌又は肺癌などの悪性腫瘍である。
一実施形態では、腫瘍は結腸直腸悪性腫瘍である。
本明細書で使用される悪性腫瘍は癌性細胞を意味する。
一実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスは転移の治療又は予防に使用される。
一実施形態では、本明細書の方法又は製剤は薬剤耐性癌の治療に用いられる。
一実施形態では、ウイルスは、さらなる癌治療又は療法の投薬と組み合わせて投与される。
一実施形態では、癌、例えば上記の癌の治療用の医薬の製造に使用するための本開示によるウイルス又は製剤が提供される。
さらなる態様では、それを必要とする患者、例えばヒト患者に、本開示による治療有効量のウイルス又は製剤を投与することを含む、癌を治療する方法が提供される。
一実施形態では、本明細書の腫瘍溶解性ウイルス又は製剤は、別の療法と組み合わせて投与される。
本明細書で使用される「組み合わせて」は、腫瘍溶解性ウイルスが癌治療又は療法の前、同時及び／又は後に投与される場合を包含することを意図している。
癌療法は、外科手術、放射線療法、標的療法及び／又は化学療法を含む。
本明細書で用いられる癌治療は、治療用化合物又は生物学的薬剤、例えば癌を治療することを意図した抗体及び／又はその維持療法を用いた治療を指す。
一実施形態では、癌治療は、化学療法剤、標的抗癌剤、放射線療法、放射性同位体療法、又はそれらの任意の組み合わせを含む任意の他の抗癌療法から選択される。
一実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスなどの本開示のウイルスは、腫瘍を縮小するため、転移を治療するため、及び／又は転移もしくはさらなる転移を予防するために、外科手術（ネオアジュバント療法）などの療法に対する前処置として使用することができる。腫瘍溶解性アデノウイルスは、外科手術（アジュバント療法）などの療法後に、転移を治療するために及び／又は転移もしくはさらなる転移を予防するために使用され得る。
本明細書で同時に使用されるのは、腫瘍溶解性アデノウイルス製剤と同時に又はほぼ同時に、追加の癌治療を投薬することである。治療は、同じ製剤内に含まれてもよく、又は別々の製剤として投与されてもよい。
一実施形態では、ウイルスは化学療法剤の投薬と組み合わせて投与される。
本明細書で使用される化学療法剤は、悪性細胞及び組織に対して選択的に破壊的である特定の抗新生物化学剤又は薬物を指すことを意図している。例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、及び他の抗腫瘍剤。化学療法の他の例には、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、パクリタキセル、カペシタビン、イリノテカン、及びシスプラチン及びオキサリプラチンなどのプラチンが含まれる。好ましい用量は、治療されている癌の性質に基づいて、施術者によって選択されてもよい。
一実施形態では、治療薬はガンシクロビルであり、これは免疫応答及び／又は腫瘍血管新生の制御を補助し得る。
一実施形態では、本明細書の方法で使用される１つ又は複数の療法はメトロノーム療法、すなわち低用量の抗癌薬による連続的又は頻繁な治療であり、他の治療法と同時に行われることが多い。
サブグループＢの腫瘍溶解性アデノウイルス、特にＡｄ１１及びＥｎＡｄなどそれに由来するものは、アポトーシスとはほとんど無関係の作用機序を有し、主に表皮壊死症の機序によって癌細胞を死滅させるため、化学療法薬と特に相乗的であり得る。さらに、化学療法中に起こる免疫抑制は、腫瘍溶解性ウイルスがより高い効率で機能することを可能にし得る。
本明細書で使用される治療用量は、適切な治療計画で使用されるときに意図された治療効果を達成するのに適した、例えば疾患の症状又は状態を改善する、腫瘍溶解性アデノウイルスなどのウイルスの量を指す。ウイルス粒子の数が以下の結果をもたらすのに十分であり得る場合、用量は癌又は転移の治療における治療用量と見なされ得る：腫瘍もしくは転移増殖が減速又は停止する、又は腫瘍もしくは転移がサイズが縮小することが見出される及び／又は患者の寿命が延びる。適切な治療用量は、一般に、治療効果と許容される毒性との間のバランスであり、例えば、副作用及び毒性が治療によって達成される利益を考えると許容される場合である。
一実施形態では、本開示によるウイルス又は治療用構築物（それを含む製剤を含む）は毎週投与され、例えば最初の１週間は、１、３、５日目に用量が投与され、その後毎週１回投与される。
一実施形態では、本開示によるウイルス又は治療用構築物（それを含む製剤を含む）は、週２回又は週３回投与され、例えば１週目は１、３及び５日目に１回投与され、２週目又は３週目もその１、３及び５日目に投与される。この投与計画は、必要に応じて何度でも繰り返すことができる。
一実施形態では、本開示によるウイルス又は治療用構築物（それを含む製剤を含む）は毎月投与される。
一実施形態では、本開示のウイルス及び構築物は、組換え技術によって調製される。当業者は、武装アデノウイルスゲノムが、ゲノム又は全ゲノムの一部を含むプラスミドを完全に合成することを含む他の技術的手段によって製造され得ることを理解するであろう。当業者は、ゲノムを合成する場合、後者はクローニング法を用いた遺伝子の挿入後の人工物であるので、挿入領域は制限部位ヌクレオチドを含まなくてもよいことを理解するであろう。
一実施形態では、武装アデノウイルスゲノムは、例えば配列番号３４〜３７によるように、完全に合成的に製造されている。
本明細書中の開示はさらに、導入遺伝子又は導入遺伝子カセットを挿入することから得られるか又は入手可能な、式（Ｉ）のアデノウイルス又はその部分式に及ぶ。
本明細書で使用される「である（Ｉｓ）」は、含むことを意味する。
本明細書の文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈されるべきである。
特定の特徴／要素を含む本発明の実施形態は、関連する要素／特徴の「からなる」又は「から本質的になる」代替の実施形態にも及ぶことを意図している。
技術的に適切な場合には、本発明の実施形態を組み合わせることができる。
特許及び出願などの技術的参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に具体的かつ明示的に列挙された任意の実施形態は、単独で、又は１つもしくは複数のさらなる実施形態と組み合わせて、免責事項の基礎を形成し得る。
本出願は、参照により本明細書に組み込まれるＧＢ１６１４６０７．８、ＧＢ１７００６６３．６、ＧＢ１７０６２１９．１及びＧＢ１７１３７６５．４からの優先権を主張する。これらの文書は、本明細書中の誤り、特に配列表中の誤りを訂正するために使用され得る。
本発明は、添付の図面を参照する以下の実施例において例示としてのみさらに説明される。
（Ａ）任意のデカヒスチジン（ｄｅｃａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）親和性タグを含むか又は欠く、本開示のＢｉＴＥ抗体の概略図。Ｉｇ ＳＰ：シグナルペプチド。１０Ｈｉｓ：デカヒスチジン親和性タグ。Ｌ：ＧＳリンカー。ＶＬ：可変光ドメイン。ＶＨ可変重鎖ドメイン。（Ｂ）ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥのプラスミドマップ。（Ｃ）ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥのプラスミドマップ。（Ｄ）ｐＳＦ−ＣＭＶ−コントロールＢｉＴＥのプラスミドマップ。 同上。 同上。 同上。 （Ａ）組換えＢｉＴＥの定量化を示すドットブロット。（Ｂ）は、ＦＡＰについてのＥＬＩＳＡ結果を示すグラフ。（Ｃ）ＥｐＣＡＭについてのＥＬＩＳＡ結果を示すグラフ。 同上。 単独で、又はフローサイトメトリーを用いて測定されたＦＡＰ ＢｉＴＥ及びコントロールＢｉＴＥの存在下で、ＮＨＤＦ細胞と共培養された、Ｔ細胞についてのＣＤ６９（Ａ）及びＣＤ２５（Ｂ）の発現レベルを示すグラフ。 同上。 （Ａ）細胞内サイトカイン染色によって測定した、単独で、又はＦＡＰ ＢｉＴＥ及びコントロールＢｉＴＥの存在下で、ＮＨＤＦ細胞と共培養された、Ｔ細胞についてのＩＦＮ γの発現レベルを示すグラフ。（Ｂ）及び（Ｃ）フローサイトメトリーを用いて測定された、単独で又はＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ及びコントロールＢｉＴＥの存在下でＤＬＤ細胞と共培養されたＴ細胞についてのＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルを示すグラフ。 同上。 （Ａ）細胞内サイトカイン染色によって測定したＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ及びコントロールＢｉＴＥの存在下で、ＤＬＤ細胞と共培養したＴ細胞についてのＩＦＮ γの発現レベルを示すグラフ。（Ｂ）及び（Ｃ）フローサイトメトリーによって測定された、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ及びコントロールＢｉＴＥの存在下で、ＤＬＤ細胞と共培養されたＰＢＭＣについてのＣＤ６９及びＣＤ２５のレベルを示すグラフ。 同上。 （Ａ）Ｔ細胞及びＦＡＰ ＢｉＴＥ又はコントロールＢｉＴＥと共培養されたＮＨＤＦ細胞の細胞傷害性を示すＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。（Ｂ）Ｔ細胞及びＦＡＰ ＢｉＴＥ又はコントロールＢｉＴＥと共培養したＢＴＣ１００細胞の細胞傷害性を示すＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。（Ｃ）Ｔ細胞及びＦＡＰ ＢｉＴＥ対コントロールＢｉＴＥの共培養後のＮＨＤＦ細胞の画像。 （Ａ）複数の患者由来細胞におけるＦＡＰ発現を示す散布図。（Ｂ）複数の細胞及び細胞株にわたってＥｐＣＡＭ及びＦＡＰを発現する細胞の％を示すグラフ。 同上。 同上。 （Ａ）増加するＢｉＴＥ濃度のＦＡＰ ＢｉＴＥについてのＮＨＤＦ用量応答を示すグラフ。（Ｂ）及び（Ｃ）Ｔ細胞及びＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ又はコントロールＢｉＴＥと共培養したＤＬＤ細胞の細胞傷害性を示すＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。 同上。 （Ａ）Ｔ細胞及びＥｐＣＡＭのＢｉＴＥ又はコントロールＢｉＴＥと共培養したＳＫＯＶ細胞の細胞傷害性を示すＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。（Ｂ）Ｔ細胞及びＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ又はコントロールＢｉＴＥと共培養したＭＣＦ７細胞の細胞傷害性を示すＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。 同上。 増加するＢｉＴＥ濃度のＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥについてのＮＨＤＦ用量応答を示すグラフ。 （Ａ）ＦＡＰ又は同位体対照抗体によって決定され、フローサイトメトリーによって分析されるＣＨＯ細胞におけるＦＡＰ発現を示すグラフ。（Ｂ）Ｔ細胞及びＦＡＰ ＢｉＴＥ又はコントロールＢｉＴＥと共培養したＣＨＯ又はＣＨＯ−ＦＡＰ細胞の細胞傷害性を示すＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。 フローサイトメトリーを用いて分析された、ＣＨＯ対ＣＨＯ−ＦＡＰ細胞によるＴ細胞活性化（ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルに基づいて）を示すグラフ。 （Ａ）ＥｐＣＡＭ又は同位体対照抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いて分析することによって決定され、親細胞株対安定なトランスフェクトされた変異体のＥｐＣＡＭ発現を示すグラフ。（Ｂ）Ｔ細胞及びＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ又はコントロールＢｉＴＥと共培養したＣＨＯ又はＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞の細胞傷害性を示すＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。 同上。 フローサイトメトリーを用いて分析された、ＣＨＯ対ＣＨＯ−ＥｐＣＡＭの細胞によるＴ細胞活性化（ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルに基づいて）を示すグラフ。 （Ａ）フローサイトメトリーを用いて分析された、（ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルに基づいて）ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するＦＡＰ ＢｉＴＥの能力を示すグラフ。（Ｂ）ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞及びＦＡＰ ＢｉＴＥ又はコントロールＢｉＴＥと共培養した、ＮＨＤＦ細胞の細胞傷害性を示すＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。 （Ａ）フローサイトメトリーを用いて分析された、ＥｐＣＡＭ又はコントロールＢｉＴＥの存在下で、ＤＬＤ細胞によるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化（ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルに基づいて）を示すグラフ。（Ｂ）ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞及びＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ又はコントロールＢｉＴＥと共培養したＤＬＤ細胞の細胞傷害性を示すＬＤＨアッセイの結果を示すグラフ。 （Ａ）コントロール又はＦＡＰ ＢｉＴＥで培養した、腹水由来のＣＤ３＋Ｔ細胞の数を示すグラフ。（Ｂ）コントロール又はＦＡＰ ＢｉＴＥで培養した、腹水由来のＴ細胞のＣＤ２５発現レベルを示すグラフ。（Ｃ）コントロール又はＦＡＰ ＢｉＴＥで培養した腹水由来のＦＡＰ＋細胞の数を示すグラフ。 （Ａ）本開示のアデノウイルスのゲノムの概略図。（Ｂ）ＣＭＶ対ＳＡプロモーター駆動発現の動態を比較するグラフ。 （Ａ）ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６及びＥｎＡｄについて、細胞当たりの検出されたウイルスゲノムの数の定量化を示すグラフ。（Ｂ）Ａ５４９細胞の感染によって評価されたＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６又はＥｎＡｄの腫瘍溶解活性を示すグラフ。 （Ａ）フローサイトメトリーを用いて分析したＣＨＯ−ＦＡＰで共培養した場合の、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６による（ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルに基づいて）Ｔ細胞活性化を示すグラフ。（Ｂ）フローサイトメトリーを用いて分析した、ＣＨＯ−ＥｐＣＡＭで共培養した場合の、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６による（ＣＤ６９及びＣＤ２５発現レベルに基づく）Ｔ細胞活性化を示すグラフ。 同上。 ＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６から産生されたＦＡＰ ＢｉＴＥの量を決定するための実験の結果を示すグラフ。 ＮＧ−６０１及びＮＧ−６０２から産生されたＥｐＣＡＭＢｉＴＥの量を決定するための実験の結果を示すグラフ。 ＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９及びＮＧ−６１０に感染したＡｄ２９３細胞の顕微鏡画像。 （Ａ）ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用して分析された、ＥｎＡｄに感染したＤＬＤ細胞の細胞傷害性を示すグラフ。（Ｂ）ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用して分析した、ＥｎＡｄに感染したＳＫＯＶ細胞の細胞傷害性を示すグラフ。（Ｃ）ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用して分析した、ＥｎＡｄに感染したＮＨＤＦ細胞の細胞傷害性を示すグラフ。 （Ａ）ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用して分析した、ＮＨＤＦ細胞を死滅させるＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６及びＥｎＡｄの能力を示すグラフ。（Ｂ）ＬＤＨアッセイを使用して分析した、ＮＨＤＦ細胞を死滅させるＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６及びＥｎＡｄの能力を示すグラフ。 フローサイトメトリーを用いて分析した、ＮＨＤＦ細胞、ＳＫＯＶ及びＴ細胞と共培養したＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６による（ＣＤ６９及びＣＤ２５発現レベルに基づいて）Ｔ細胞活性化を示すグラフ。 （Ａ）フローサイトメトリーを用いて分析した、ＮＨＤＦ及びＳＫＯＶ細胞対ＳＫＯＶのみで共培養したＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６による（ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルに基づいて）Ｔ細胞活性化を示すグラフ。（Ｂ）ＬＤＨアッセイを用いて分析した、ＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６に感染したＮＨＤＦ細胞の細胞傷害性を示すグラフ。 組換えＦＡＰ ＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ、ＮＧ−６０３又はＮＧ−６０５によるＮＨＤＦ細胞の溶解のタイムラプスビデオからの静止画フレーム。 ＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９又はＮＧ−６１０によるＮＨＤＦ細胞の溶解のタイムラプスビデオからの静止画フレーム。 ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いて分析示した、Ｔ細胞の存在下又はＴ細胞の非存在下でのＥｎＡｄ、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４に感染したＤＬＤ細胞の細胞傷害性を示すグラフ。 ＬＤＨアッセイを使用して分析示した、Ｔ細胞の存在下又はＴ細胞の非存在下でのＥｎＡｄ、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４に感染したＤＬＤ細胞の細胞傷害性を示すグラフ。 フローサイトメトリーにより分析した、ＥｎＡｄ、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４による（ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルに基づいて）Ｔ細胞活性化を示すグラフ。 ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用して評価した、ＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下又は非存在下で、感染（ＭＯＩ）の多重度を変化させることで、ＤＬＤ腫瘍細胞を死滅させるＮＧ−６０１の能力を決定するための実験の結果。 同上。 同上。 ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用して評価した、ＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下又は非存在下で、ＳＫＯＶ腫瘍細胞を死滅させるＥｎＡｄ及びＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４の能力を示すグラフ。 ＬＤＨアッセイを用いて評価した、ＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下又は非存在下で、ＳＫＯＶ腫瘍細胞を死滅させるＥｎＡｄ及びＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４の能力を示すグラフ。 フローサイトメトリーを用いて分析した、ＳＫＯＶ腫瘍細胞で共培養したＥｎＡｄ、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４による（ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルに基づいて）Ｔ細胞活性化を示すグラフ。 フローサイトメトリーを用いて分析した、腹水細胞で共培養したＥｎＡｄ、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４による（ＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルに基づいて）Ｔ細胞活性化を示すグラフ。 ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ、ＮＧ−６０１又はＮＧ−６０３によるＮＨＤＦ細胞の溶解のタイムラプスビデオからの静止画フレーム。 本開示のウイルスに感染させ、感染及び後期ウイルス遺伝子発現を決定するためのレポーターとしてＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ及びＥｎＡｄ−ＳＡ−ＧＦＰで染色した患者から得た腹水細胞の顕微鏡画像。 （Ａ）本開示のウイルスに感染した腹水サンプル中のＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現レベルを示すグラフ。（Ｂ）本開示のウイルスに感染した腹水サンプル中のＦＡＰ＋細胞の数を示すグラフ。 本開示のウイルスに感染させ、感染及び後期ウイルス遺伝子発現を決定するためのレポーターとしてＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ及びＥｎＡｄ−ＳＡ−ＧＦＰで染色した癌患者から得た腹水細胞の顕微鏡画像。 本開示のウイルスに感染した癌患者から得た腹水サンプル中のＣＤ３＋Ｔ細胞の数を示すグラフ。 本開示のウイルスに感染した癌患者から得た腹水サンプル中のＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現レベルを示すグラフ。 本開示のウイルスに感染した癌患者から得た腹水サンプル中のＦＡＰ＋細胞の数を示すグラフ。 ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ及びＰＢＭＣ由来Ｔ細胞へのその影響の特徴付け（Ａ）ＥｐＣＡＭを標的としたＢｉＴＥ及び非特異的コントロールＢｉＴＥの構造の概略図。ＶＬ及びＶＨドメインは、柔軟性及び溶解性のためにセリン及びグリシンに富む柔軟なペプチドリンカー（Ｌ）と結合している。Ｉｇ ＳＰ、軽鎖免疫グロブリンシグナルペプチド。１０Ｈｉｓ、デカヒスチジン親和性タグ。（Ｂ）ＢｉＴＥ含有上清の存在下で単独又はＤＬＤ細胞（５：１）と培養したＣＤ３精製ＰＢＭＣ上での活性化マーカーＣＤ６９及び（Ｃ）ＣＤ２５の誘導。共培養２４時間後にＣＤ６９及びＣＤ２５をフローサイトメトリーで測定した。ＩｇＧアイソタイプと比較して有意性を評価した。（Ｄ）ＤＬＤ細胞（５：１）及びＢｉＴＥ含有上清との共培養における６時間後のＩＦＮγ陽性Ｔ細胞の割合。（Ｅ）ＤＬＤ細胞（５：１）及びＢｉＴＥ含有上清と共培養したＣＦＳＥ染色Ｔ細胞の分裂指数及び増殖に入る親Ｔ細胞集団の割合で表される増殖。共培養の５日後にフローサイトメトリーによって蛍光を測定した。分裂指数はＦｌｏｗＪｏ増殖ツールを用いてモデル化した。（Ｆ）ＤＬＤ細胞（５：１）及びＢｉＴＥ含有上清と共培養した、ＣＤ１０７ａの表出化によって測定したＴ細胞の脱顆粒。ＣＤ１０７ａ特異的抗体との６時間の共培養とそれに続くフローサイトメトリー分析によって、表出化を評価した。（Ｇ）Ｔ細胞とＤＬＤ細胞（５：１）の共培養からの上清を、ＢｉＴＥ含有上清の存在下で４８時間使用して、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘヒトＴｈサイトカインパネルによりサイトカインレベルを測定した。各条件は、生物学的三重測定で測定され、データは平均±ＳＤとして表された。有意性は、特に明記されていない限り、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析を用いた一元配置分散分析検定を用いて、未処置と比較して評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 同上。 同上。 同上。 同上。 組換えＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの特徴付け（Ａ）トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ａ細胞によって産生されたＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの量を推定するためのドットブロット。（Ｂ）コントロール又は組換えＥｐＣＡＭ又は非特異的ＢｉＴＥによるＥｐＣＡＭ結合のレベルを測定するＥＬＩＳＡ。有意性は、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析を用いた一元配置分散分析検定を用いて、空のベクター対照サンプルと比較することによって評価した。＊＊＊ｐ＜０．００１ ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを介したＴ細胞の細胞傷害性の抗原特異性の評価（Ａ）２４時間の共培養後にＦＡＣＳ分析により測定した、ＣＨＯ又はＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞（５：１）及びＢｉＴＥ含有上清と共培養したＣＤ３＋Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ２５の誘導。（Ｂ）ＢｉＴＥ含有上清のみ、又はＴ細胞との共培養で培養したＣＨＯ又はＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞の細胞傷害性。細胞傷害性は、インキュベーションの２４時間後の培養上清中へのＬＤＨの放出によって評価した。（Ｃ）Ｔ細胞（１：５）及びＢｉＴＥ含有上清と共培養した２４時間後の複数のＥｐＣＡＭ陽性癌細胞の細胞傷害性。共培養２４時間後にＭＴＳアッセイにより生存率を測定した。（Ｄ）アイソタイプコントロール抗体を使用して測定されたバックグラウンド蛍光と比較した、（Ｃ）のＥｐＣＡＭ陽性細胞株のＦＡＣＳ分析により評価されたＥｐＣＡＭ発現レベル（Ｎ＝１）。（ＡＣ）各条件を生物学的三重測定で測定し、平均±ＳＤとして表した。有意性は、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析を用いた一元配置分散分析検定を用いて、未処置又はＴ細胞のみの対照と比較して評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 同上。 ＳＫＯＶ３細胞におけるＥｎＡｄ発現ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの細胞傷害性ＳＫＯＶ３細胞を、Ｔ細胞の非存在下（Ａ）又は存在下（Ｂ）でＥｎＡｄ又は組換えウイルスとインキュベートし、細胞傷害性を特定の時点でのＬＤＨ放出によって測定した。有意性は、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析を用いた一元配置分散分析検定を用いて、感染していない対照ウェルと比較することによって評価した。＊＊＊ ｐ ＜０．００１ どのＴ細胞がＢｉＴＥを介した細胞傷害性に関与しているかの同定（Ａ）ＣＤ３ Ｔ細胞とＤＬＤ細胞（５：１）及びＢｉＴＥ含有上清との共培養２４時間後の、ＣＤ４及びＣＤ８細胞のＢｉＴＥを介したＴ細胞活性化。活性化はＣＤ６９及びＣＤ２５の表面発現によって評価し、フローサイトメトリーによって測定した。（Ｂ）ＣＦＳＥ染色したＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞のＤＬＤ細胞との共培養及びＢｉＴＥ含有上清とのインキュベーションにおける増殖応答。５日間インキュベートした後、蛍光をＦＡＣＳ分析によって測定した。（Ｃ）ＤＬＤ細胞及びＢｉＴＥ含有上清と６時間共培養した後のＣＤ４及びＣＤ８細胞の脱顆粒。共培養の間、ＣＤ１０７ａ特異的抗体を培地に添加し、脱顆粒をフローサイトメトリーで評価する。（Ｄ）ＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞サブセットによる細胞傷害性は、ＤＬＤ細胞をＣＤ４又はＣＤ８精製Ｔ細胞（１：５）及びＢｉＴＥ含有上清と２４時間インキュベートした後の、上清へのＬＤＨ放出によって評価される。各条件は、生物学的三重測定で測定され、平均±ＳＤとして表された。有意性は、特に明記されていない限り、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ処理をコントロールＢｉＴＥと比較し、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析による一元配置分散分析検定を使用して評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 同上。 同上。 ＤＬＤ細胞におけるＥｎＡｄ発現ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥによる細胞傷害性及びＴ細胞活性化感染したＤＬＤ細胞に対するＴ細胞の非存在下（Ａ）又は存在下（Ｂ）の細胞傷害性ＤＬＤ細胞を感染させ、Ｔ細胞と共培養し、細胞傷害性を特定の時点でのＬＤＨ放出によって測定した。（Ｃ〜Ｄ）Ｔ細胞を（Ｂ）から採取し、活性化マーカーＣＤ６９（Ｃ）又はＣＤ２５（Ｄ）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。（Ｅ〜Ｆ）組換えウイルスに感染したＤＬＤ細胞から産生されたＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの定量化。ＣＤ３＋細胞及び様々な公知量の組換えＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥとの共培養におけるＤＬＤのＬＤＨ放出（Ａｂ）の標準曲線（Ｅ）。並行して、共培養物を３日間感染したＤＬＤ細胞からの希釈上清（１０，０００倍）と共にインキュベートした（Ｆ）。標準曲線により、ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ及びＥｎＡｄ−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥについて、それぞれ１００万個あたり１６５μｇ及び５０μｇのＤＬＤ細胞で産生されるＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥのおおよその測定が可能になった。有意性は、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析を用いた一元配置分散分析検定を用いて、感染していない対照ウェルと比較することによって評価した。＊＊＊ｐ＜０．００１ 同上。 同上。 同上。 細胞株とＰＢＭＣ由来Ｔ細胞を用いたＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを発現する腫瘍溶解性ウイルスＥｎＡｄの特徴付け（Ａ）ＤＬＤ細胞を親ＥｎＡｄ又は組換えウイルス（１００ｖｐ／細胞）で感染させ、２４又は７２時間でウェルを回収した。ウイルスヘキソンに対するｑＰＣＲを用いてゲノムを測定することによって複製を評価した。（Ｂ）漸増濃度のウイルスでＥｎＡｄ又は組換えウイルスに感染したＤＬＤ細胞の細胞傷害性。細胞傷害性は、感染５日後にＭＴＳアッセイにより測定した。（Ｃ）３日目の未感染又はウイルス感染ＨＥＫ２９３Ａ細胞からの上清を、免疫ブロット分析により導入遺伝子発現について評価し、抗Ｈｉｓ抗体でプローブした。（Ｄ）ＣＨＯ又はＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ（Ｅ：Ｔ ５：１）及び（Ｄ）の希釈ＨＥＫ２９３Ａ上清と培養した、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の活性化マーカーＣＤ２５の誘導。活性化はフローサイトメトリーによるＣＤ２５の表面発現により測定した。（Ｅ）単独又はＣＤ３精製ＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ ５：１）との共培養による（Ｄ）のＨＥＫ２９３Ａ上清とインキュベーションされたＣＨＯ又はＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞の細胞傷害性。ＨＥＫ２９３Ａ上清を３００倍希釈した。細胞傷害性は、２４時間のインキュベーション後に上清に放出されたＬＤＨによって評価した。各条件は、生物学的三重測定で測定され、平均±ＳＤとして表された。有意性は、未処置のものと比較した各条件で、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析を用いた一元配置分散分析検定を用いて評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 同上。 同上。 同上。 悪性滲出液の細胞内組成（Ａ）フローサイトメトリーによって評価されるように、それらの細胞組成について腹水及び滲出液のスクリーニングを示す代表的な画像（胸水サンプル、図５７の患者３）。（Ｂ）各細胞型の絶対数（１０，０００個の細胞サンプルサイズ中）が表に記載されている。 同上。 部分的にＥｎＡｄ耐性の癌細胞株における、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄの優れた効力（Ａ〜Ｂ）ＳＫＯＶ３細胞の生存率を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅベースの細胞傷害性アッセイにより１６０時間にわたってリアルタイムでモニターした。ＳＫＯＶ３細胞に、０時間でＥｎＡｄ又はＢｉＴＥで武装したＥｎＡｄウイルスを播種して感染させ、感染していない細胞をネガティブコントロールとして使用した。（Ｂ）ＣＤ２で精製したＰＢＭＣ（５：１）を感染２時間後に添加し、インピーダンスを１５分間隔で測定した。（Ｃ〜Ｄ）ＣＤ３精製ＰＢＭＣを、親ＥｎＡｄ又は組換え武装ウイルスに感染させたＳＫＯＶ３細胞（５：１）と培養した。各時点で、Ｔ細胞を採取し、フローサイトメトリーによりＣＤ６９（Ｃ）又はＣＤ２５（Ｄ）の表面発現について分析した。（Ｅ）ＥｎＡｄ、ＥｎＡｄ−ＣＭＶＥｐＣＡＭＢｉＴＥに感染した、又は感染していない、ＳＫＯＶ３癌細胞（染色されていない）、ＮＨＤＦ線維芽細胞（赤）、及びＣＤ３で精製されたＰＢＭＣ（青）の共培養を示すタイムラプスシーケンス。ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ Ｃａｓｐａｓｅ ３／７検出試薬（緑色）を用いてアポトーシスを可視化した。画像をＮｉｋｏｎ ＴＥ ２０００−Ｅ Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立顕微鏡で１５分間隔で９６時間撮影した。代表的な画像は表示された時間に記録された。元の倍率×１０。スケールバー１００μｍ。（Ａ〜Ｄ）各条件は、生物学的三重測定で測定され、平均±ＳＤとして表された。有意性は、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析を用いた一元配置分散分析検定を用いて、感染していない対照との比較によって評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 同上。 同上。 ＰＤ１の発現及びＢｉＴＥを介したＴ細胞活性化に対するＰＤ１抗体の効果（Ａ）胸水からの初期単離後の内因性Ｔ細胞によるＰＤ１の発現をフローサイトメトリーによって評価した。（Ｂ〜Ｄ）胸水からの未精製の全細胞（３人の異なる患者由来）を、遊離のＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ、又は組換えウイルスの存在下で、同じ胸水からの１００％液体中でインキュベートした。５日後、総細胞集団を採取し、（Ｂ）ＣＤ３＋Ｔ細胞及び（Ｃ）ＣＤ２５＋であるものの数を定量化した。（Ｄ）フローサイトメトリーを用いてＥｐＣＡＭ＋細胞数を測定した。有意性は、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析を用いた一元配置分散分析検定を用いて、未処置の対照ウェルと比較することによって評価した。＊＊＊ｐ＜０．００１ 同上。 ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄは、化学療法前治療を受けた患者の原発性ヒト腫瘍細胞を選択的に死滅させることができる最初に３人の患者の腹水から単離し、エクスビボで増殖させ、次いで組換えＢｉＴＥとインキュベートするか、又はＥｎＡｄもしくは組換えウイルスに感染させた、（Ａ）ＥｐＣＡＭ＋細胞の細胞傷害性、又は（Ｂ）ＦＡＰ＋線維芽細胞。細胞傷害性は５日後にフローサイトメトリーにより測定した。（Ｃ）（Ａ＋Ｂ）の腹水由来のＥｐＣＡＭ＋及びＦＡＰ＋細胞と共に培養したＣＤ３陽性Ｔ細胞に対する活性化マーカーＣＤ２５の誘導。各条件は、生物学的三重測定で測定され、平均±ＳＤとして表された。有意性は、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析を用いた一元配置分散分析検定を用いて、未処置との比較により評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 同上。 ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥは腹水の免疫抑制効果を克服し、内因性Ｔ細胞を活性化する（Ａ〜Ｂ）ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞を、ＲＰＭＩ培地で又は５人の卵巣癌患者由来の１００％腹膜腹水の存在下で、抗ＣＤ３抗体とインキュベートした。（Ａ）２４時間目にＴ細胞活性化マーカーの誘導ＣＤ６９及びＣＤ２５を分析し、（Ｂ）Ｔ細胞の脱顆粒をフローサイトメトリーを用いてＣＤ１０７ａの表出化により測定した。（Ｃ）ＭＣＦ７細胞の生存率をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅベースの細胞傷害性アッセイにより、６０時間にわたってリアルタイムでモニターした。ＭＣＦ７細胞を播種し、ＲＰＭＩ培地又は１００％腹水＃１もしくは＃２の存在下で、２５時間、コントロール又はＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥと共にインキュベートした。未処置細胞をネガティブコントロールとして用いた。ＣＤ３精製ＰＢＭＣ（５：１）を同時に添加し、インピーダンスを１５分間隔で測定した。（Ｄ）腹膜腹水由来の内因性の未精製の総細胞を、遊離ＥｐＣＡＭ又はコントロールＢｉＴＥの存在下で、１００％腹水中でインキュベートした。２４時間後、総細胞集団を回収し、ＣＤ３＋／ＣＤ６９＋及びＣＤ３＋／ＣＤ２５＋細胞数をフローサイトメトリーにより測定した。各条件は、生物学的三重測定で測定され、平均±ＳＤとして表された。有意性は、ＲＰＭＩ（Ａ＋Ｂ）、未処置（Ｄ）又はコントロールＢｉＴＥ（Ｅ）との比較により、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析を用いた一元配置分散分析検定を用いて評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 同上。 同上。 同上。 ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄは、内因性Ｔ細胞を活性化して、悪性胸水中の内因性腫瘍細胞を死滅させることができる（４人の異なる患者由来の）胸水からの未精製の全細胞を、遊離のＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ又は組換えウイルスの存在下で、同じ胸水からの１００％の液体中でインキュベートした。５日後、総細胞集団を採取し、（Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞及び（Ｂ）ＣＤ２５＋であるものの数を定量化した。（Ｃ）フローサイトメトリーを用いてＥｐＣＡＭ＋細胞数を測定した。（Ｄ）ＥｎＡｄ又はＥｎＡｄ−ＣＭＶＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥによる治療後の患者３の胸水細胞（癌細胞及びリンパ球）の代表的な画像（倍率×１０、スケールバー１００μｍ）及びフローサイトメトリー分析（Ｅ）５日目に、遊離組換えＢｉＴＥとのインキュベーション又はＥｎＡｄもしくは組換えウイルスによる感染の後に、胸水培養物を使用して、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘヒトＴｈサイトカインパネルによってサイトカインレベルを測定した。各条件は、生物学的三重測定で測定され、平均±ＳＤとして表された。有意性は、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析を用いた一元配置分散分析検定を用いて、未処置対照サンプルと比較することによって評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 同上。 同上。 同上。 ヒトＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４３０６０４）を用いて、正常血清（ＮＳ）又は患者の悪性滲出液（Ａ：腹膜腹水、Ｐ：胸水）で測定されたＩＬ−１０の量。 フローサイトメトリーにより測定された、患者の体液中の（ＣＤ６９／ＣＤ２５のレベルに基づいて）ＣＤ３／２８ビーズ媒介ＰＢＭＣ Ｔ細胞活性化対正常血清。Ａ：患者の滲出液、Ｐ：胸水。 患者の体液中の（ＣＤ１０７ａの発現に基づいて）ＣＤ３／２８ビーズ媒介ＰＢＭＣ Ｔ細胞の脱顆粒。Ａ：腹水、Ｐ：胸水。 患者の体液中及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ媒介Ｔ細胞脱顆粒中のＩＬ−１０レベルの間の相関。 患者の体液中の（ＣＤ６９／ＣＤ２５の発現に基づいて）ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥビーズ媒介ＰＢＭＣ Ｔ細胞活性化。Ａ：腹水、Ｐ：胸水。 患者の体液中の（ＣＤ１０７ａの発現に基づいて）ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥビーズ媒介ＰＢＭＣ Ｔ細胞の脱顆粒。Ａ：腹水、Ｐ：胸水。 患者の体液中のＳＫＯＶ３のＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥビーズ媒介細胞傷害性。Ａ：腹水、Ｐ：胸水。 ＲＰＭＩ培地対腹水での（ＣＤ２５／ＣＤ６９の発現に基づいて）ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ媒介Ｔ細胞活性化。 ＲＰＭＩ培地対腹水でのＴ細胞媒介の標的細胞の溶解を誘導するＥｎＡｄ−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥとＥｎＡｄ−ＳＡ−ＣｏｎｔｒｏｌＢｉＴＥの能力。（（Ａ）ＣＤ３＋の数。（Ｂ）Ｔ細胞のＣＤ２５発現。（Ｃ）フローサイトメトリーによって決定されたＥｐＣＡＭ＋細胞の数。 同上。 同上。 腹水（７つの患者サンプル）におけるＴ細胞媒介の標的細胞の溶解を誘導するＥｎＡｄ−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥとＥｎＡｄ−ＳＡ−ＣｏｎｔｒｏｌＢｉＴＥの能力。（Ａ）ＣＤ３＋の数。（Ｂ）Ｔ細胞のＣＤ２５発現。（Ｃ）フローサイトメトリーによって決定されたＥｐＣＡＭ＋細胞の数。説明については、図６７Ａを参照のこと。 同上。 同上。 ヒト線維芽細胞の存在下で、及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでポリクローナル活性化によって、組換えＦＡＰ ＢｉＴＥタンパク質によるＴ細胞のサイトカイン産生の活性化の比較。（Ａ）ＥＬＩＳＡによって測定されたＩＦＮγレベル。（Ｂ）サイトカインビーズアレイによって測定されたサイトカインレベル。 ＦＡＰを標的としたＢｉＴＥはＴ細胞の脱顆粒及びＦＡＰ＋細胞の特異的な細胞傷害性を誘導する（Ａ）ＮＨＤＦ細胞（５：１）と培養中のＴ細胞の脱顆粒、及び（Ｂ）ＢｉＴＥ含有上清。脱顆粒は、ＣＤ１０７ａ特異的抗体と共に６時間培養した後のＣＤ１０７ａの表出化によって評価し、フローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズをポジティブコントロールとして使用した。（Ｃ）Ｔ細胞（１：５）及び１０倍連続希釈のＢｉＴＥ含有上清との共培養における２４時間後のＮＨＤＦ細胞の細胞傷害性。細胞傷害性は、培養上清中へのＬＤＨの放出によって評価した。（Ｄ）ＬＤＨ放出によるＮＨＤＦの溶解（左）及びＴ細胞上のＣＤ２５誘導（右）を、６人の健康なドナー及びＢｉＴＥ含有上清からのＰＢＭＣ由来のＴ細胞（１：５）との２４時間の共培養後に評価した。 同上。 ＦＡＰ ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄが、選択的にＦＡＰ＋線維芽細胞を死滅させ、腹膜腹水サンプル中のＴＧＦｂを減少させる（Ａ、Ｂ）ＰＢＭＣ由来のＴ細胞及びＥｎＡｄ又は組換えウイルスとの７２時間の培養後のＦＡＰ＋線維芽細胞（Ａ）及びＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞（Ｂ）の数。腹水細胞は、最初に３人の患者の腹水から単離され、エクスビボで拡大された。細胞数はフローサイトメトリーによって感染後７２時間で測定された。（Ｃ）（Ａ）からのＰＢＭＣ由来ＣＤ３細胞上の活性化マーカーＣＤ２５の誘導を感染後７２時間で測定した。（Ｄ）（Ａ）から回収した上清を用いてＥＬＩＳＡによりＴＧＦｂのレベルを測定した。 同上。 ＦＡＰ ＢｉＴＥタンパク質とＥｎＡｄ−ＦＡＰＢｉＴＥウイルスによる患者の悪性腹水生検サンプルにおける、内因性腫瘍関連Ｔ細胞の活性化及び関連するＦＡＰ＋細胞の死滅。（Ａ）ＣＤ２５発現によって測定されたＴ細胞活性化。（Ｂ）フローサイトメトリーによって測定されたＦＡＰ＋細胞の残存数。 患者サンプル中のＢｉＴＥ媒介Ｔ細胞活性化に対する抗体を遮断するＰＤ−Ｌ１の効果（Ａ）腹膜腹水からのそれらの初期単離後の内因性Ｔ細胞及びＦＡＰ＋細胞上のＰＤ−Ｌ１によるＰＤ１の発現を、フローサイトメトリーによって評価した。（Ｂ）腹膜腹水由来の未精製の全細胞を、抗ＰＤ−Ｌ１遮断抗体を用いて、又は用いずに、遊離ＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ又は組換えウイルスの存在下で同じ滲出液からの５０％液中でインキュベートした。２日後、総細胞集団を採取し、ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーによって定量化した。（Ｃ）（Ｂ、Ｄ）からの培養上清中のインターフェロンガンマの量をＥＬＩＳＡによって測定した。（Ｄ）（Ｂ）中の残存ＦＡＰ＋細胞の数をフローサイトメトリーを用いて測定した。 同上。 ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄは、患者生検サンプル由来のＴ細胞を活性化し、方向転換してＮＨＤＦ線維芽細胞を溶解する（Ａ）健康なドナー又は悪性滲出液癌生検サンプル由来の単離後の内因性Ｔ細胞によるＰＤ−１の発現。ＰＤ−１発現はフローサイトメトリーによって測定した。（Ｂ）フローサイトメトリーによって測定された、未精製のＰＢＭＣ細胞集団及び癌生検サンプル中のＣＤ３＋細胞の割合。（Ｃ）処理後１２０時間で（Ｂ）から回収した培養上清中のＥＬＩＳＡにより測定されたインターフェロンガンマのレベル。（Ｄ）ＮＨＤＦ線維芽細胞の生存率を、ＰＢＭＣ又は全癌生検細胞（１：５）及びＢｉＴＥ含有上清との共培養におけるｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイによって１３０時間にわたってリアルタイムでモニターした。 同上。 ＰＢＭＣ Ｔ細胞のＦＡＰ ＢｉＴＥ及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ媒介活性に対する免疫抑制腹水サンプルの効果。（Ａ）抗ＣＤ３／Ｃｄ２８ダイナビーズで活性化されたＰＢＭＣ Ｔ細胞。（Ｂ）ＮＨＤＦ細胞の存在下でコントロール又はＦＡＰ ＢＩＴＥで活性化したＰＢＭＣ Ｔ細胞ＮＳ：正常血清、Ａ：腹膜腹水。 ＥｎＡｄを発現するＦＡＰ ＢｉＴＥは、患者のＣＤ１１ｂ＋マクロファージをより炎症性の表現型へと分極させる（Ａ）腹水サンプル由来の未精製総細胞を、遊離ＢｉＴＥ又はウイルスを発現するＢｉＴＥの存在下で５０％腹水中でインキュベートした。インターフェロンガンマ処理をポジティブコントロールとして使用した。３日後、総細胞集団を採取し、ＣＤ３＋細胞上の活性化マーカーＣＤ２５の誘導をフローサイトメトリーにより測定した。（Ｂ）（Ａ）からの培養上清中のインターフェロンガンマのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。（Ｃ）３日目に、（Ａ）からのＣＤ１１ｂ＋細胞上のＣＤ６８、ＣＤ８６、ＣＤ２０６及びＣＤ１６３の発現レベルをフローサイトメトリーによって測定した。３通りからの代表的なフローサイトメトリースペクトルは、完全なデータセットと一緒に示されている。 同上。 前立腺固形腫瘍の構造及び細胞組成の特徴付け（Ａ）ＥｐＣＡＭ染色、（Ｂ）ＣＤ８染色、（Ｃ）ＦＡＰ染色。（Ｄ）ウイルスを発現するＢｉＴＥによる治療後の前立腺腫瘍切片内のＣＤ２５誘導の代表的な免疫組織化学画像。腫瘍コアをＬｅｉｃａビブラトームで３００μＭの厚さにスライスし、培養し、挿入物に感染させ、７日間の処理後に回収した。（Ｅ）ＥＬＩＳＡによって測定された組織切片培養培地中のＩＦＮｇのレベル。特定の時点で悪性及び良性組織のスライス培養物から上清を採取した。（Ｆ）ＥＬＩＳＡによって測定された悪性及び良性組織の組織培養培地中のＩＬ−２のレベル。 同上。 同上。 図７７Ａ−Ｃは、実施例３３で使用された導入遺伝子カセットの概略図。図７７Ｄは、ＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２及びＮＧ−６１７で処置した腫瘍細胞において、細胞あたり検出されるウイルスゲノムの数を示すグラフ。 同上。 ＳＫＯＶ細胞を発現するＥｐＣＡＭで共培養し、ＮＧ−６１１ウイルス粒子での処理後２４、４８又は７２時間でＡ５４９細胞から上清を回収した後、ＣＤ６９（ａ）、ＣＤ２５（ｂ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ｃ）、ＣＤ４０Ｌ（ｄ）又は細胞表面のＣＤ１０７ａ（ｅ）を発現するＴ細胞と、ＮＧ−６１２、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処置対照上清とを比較した割合。 ＭＲＣ−５細胞を発現するＦＡＰで共培養し、ＮＧ−６１２ウイルス粒子での処理後２４、４８又は７２時間でＡ５４９細胞から上清を回収した後、ＣＤ６９（ａ）、ＣＤ２５（ｂ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ｃ）、ＣＤ４０Ｌ（ｄ）又は細胞表面のＣＤ１０７ａ（ｅ）を発現するＴ細胞と、ＮＧ−６１１、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処理対照上清とを比較した割合。 ＥｐＣＡＭ及びＦＡＰを発現するＭＲＣ−５細胞の割合 ＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２もしくはエナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）ウイルス粒子、又は未処置対照上清での処置後２４、４８又は７２時間で、Ａ５４９細胞から回収した上清でインキュベートしたＳＫＯＶ細胞（Ａ）又はＭＲＣ−５細胞（Ｂ）とのＴ細胞共培養物の上清中のＩＦＮγ発現。 抗腫瘍効力及びインビボでウイルスを発現するＢｉＴＥの免疫活性化。（ａ）生理食塩水、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又はＮＧ−６１１で処置したマウスにおける腫瘍体積。（ｂ）エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）処置又は未処置対照と比較した、ＮＧ−６１１処置腫瘍におけるＣＤ４ Ｔ細胞に対するＣＤ８の比率。 導入遺伝子カセットの概略図。（ａ）ＮＧ−６１５、（ｂ）ＮＧ−６４０、（ｃ）ＮＧ−６４１。 ＮＧ−６１２及びＮＧ−６１５で処置した腫瘍細胞において細胞あたり検出されるウイルスゲノムの数を示すグラフ ＮＧ−６１５の細胞上清対エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）及び未処置の対照の腫瘍細胞の上清におけるＩＦＮα、ＭＩＰ１α及びＦｌｔ３ Ｌの発現。 ＭＲＣ−５細胞を発現するＦＡＰで共培養し、ＮＧ−６１５ウイルス粒子での処理後２４、４８又は７２時間でＡ５４９細胞から上清を回収した後、ＣＤ６９（ａ）、ＣＤ２５（ｂ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ｃ）、ＣＤ４０Ｌ（ｄ）又は細胞表面のＣＤ１０７ａ（ｅ）を発現するＴ細胞と、ＮＧ−６１２、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処理対照上清とを比較した数。 ＮＧ−６１２、ＮＧ−６１５もしくはエナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）ウイルス粒子、又は未処置対照上清での処理後２４、４８又は７２時間で、Ａ５４９細胞から回収した上清でインキュベートしたＭＲＣ−５細胞とのＴ細胞共培養物の上清中のＩＦＮγ発現。 ＮＧ−６１８導入遺伝子カセットの概略図 ＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２、ＮＧ−６１５又はエナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）ウイルス粒子での処理後７２時間で、Ａ５４９細胞から回収した上清でインキュベーション後のＭＲＣ−５細胞上の表面ＦＡＰ発現（ａ）又はＳＫＯＶ細胞上のＥｐＣＡＭ発現の（ｂ）検出。 ＭＲＣ−５細胞を発現するＦＡＰで共培養し、ＮＧ−６１８ウイルス粒子で処理後７２時間でＡ５４９細胞から上清を回収した後、ＣＤ２４（ａ）、ＣＤ４０Ｌ（ｂ）、又は細胞表面のＣＤ１０７ａ（ｃ）を発現するＴ細胞と、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処置対照とを比較した割合。 ＳＫＯＶ細胞を発現するＥｐＣａｍで共培養し、ＮＧ−６１８ウイルス粒子での処理後７２時間でＡ５４９細胞から上清を回収した後、ＣＤ２４（ａ）、ＣＤ４０（ｂ）、又は細胞表面のＣＤ１０７ａ（ｃ）を発現するＴ細胞と、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処置対照とを比較した割合。 Ｔ細胞とＡ５４９細胞から回収した上清とを、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処置対照と比較して、ＮＧ−６１８ウイルス粒子での処理後７２時間で共培養した後、デッドＭＲＣ−５（ａ）又はＳＫＯＶ （ｂ）細胞の割合。
配列
配列番号１ Ｎ末端シグナル配列及びＣ末端デカＨｉｓ親和性タグを有する、抗ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ ＤＮＡコード配列
配列番号２ Ｎ末端シグナル配列及びＣ末端デカＨｉｓ親和性タグを有する、抗ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ タンパク質配列
配列番号３ Ｎ末端シグナル配列及びＣ末端デカＨｉｓ親和性タグを有する、抗ＦＡＰ ＢｉＴＥ ＤＮＡコード配列
配列番号４ Ｎ末端シグナル配列及びＣ末端デカＨｉｓ親和性タグを有する、抗ＦＡＰ ＢｉＴＥ アミノ酸配列
配列番号５ Ｎ末端シグナル配列及びＣ末端デカＨｉｓ親和性タグを有する、コントロール（抗ＦＨＡ）ＢｉＴＥ ＤＮＡコード配列
配列番号６ Ｎ末端シグナル配列及びＣ末端デカＨｉｓ親和性タグを有する、コントロール（抗ＦＨＡ）ＢｉＴＥ アミノ酸配列
配列番号７ 抗ＣＤ３ ＳｃＦｖ のアミノ酸配列
配列番号８ 抗ＣＤ３ ＶＨ
配列番号９ 抗ＣＤ３ ＶＬ
配列番号１０ 抗ＣＤ３ ＳｃＦｖリンカー配列
配列番号１１ 抗ＦＡＰ ＳｃＦｖ
配列番号１２ 抗ＦＡＰ ＶＬドメイン
配列番号１３ 抗ＦＡＰ ＶＨドメイン
配列番号１４ 抗ＦＡＰ及び抗ＥｐＣＡＭリンカー配列
配列番号１５ ＢｉＴＥリーダー配列
配列番号１６ 抗ＥｐＣＡＭ ＳｃＦｖ
配列番号１７ 抗ＥｐＣＡＭ ＶＬ
配列番号１８ 抗ＥｐＣＡＭ ＶＨ
配列番号１９ コントロールＢｉＴＥ（抗ＦＨＡ）
配列番号２０ コントロール（抗ＦＨＡ）のＳｃＦｖ
配列番号２１ コントロール（抗ＦＨＡ）ＶＬ
配列番号２２ コントロール（抗ＦＨＡ）ＶＨ
配列番号２３ コントロール（抗ＦＨＡ）ＳｃＦｖリンカー配列
配列番号２４ デカ−Ｈｉｓタグ配列
配列番号２５ ＦＡＰ ＢｉＴＥ−Ｐ２Ａ−ＲＦＰ（斜字体＝リーダー、太字＝フリン切断部位、下線＝Ｐ２Ａ配列、小文字＝ＲＦＰ）
配列番号２６ コントロール（抗ＦＨＡ）ＢｉＴＥ−Ｐ２Ａ−ＲＦＰ（斜字体＝リーダー、太字＝フリン切断部位、下線＝Ｐ２Ａ配列、小文字＝ＲＦＰ）
配列番号２７ ヒトＥｐＣＡＭのＤＮＡコード配列
配列番号２８ ヒトＥｐＣＡＭのアミノ酸配列
配列番号２９ ヒトＦＡＰのＤＮＡコード配列
配列番号３０ ヒトＦＡＰのアミノ酸配列
配列番号３１ ＣＭＶプロモーター配列
配列番号３２ ＳＶ４０後期ポリアデニル化配列
配列番号３３ Ｎｕｌｌ配列
配列番号３４ Ｎｕｌｌ配列
配列番号３５ Ｎｕｌｌ配列
配列番号３６ Ｎｕｌｌ配列
配列番号３７ Ｎｕｌｌ配列
配列番号３８ ＥｎＡｄゲノム
配列番号３９ ＥｎＡｄゲノムの塩基対２８１６６〜２８３６６に対応しかつこれを含むＢＸ ＤＮＡ配列
配列番号４０ ＥｎＡｄゲノムの塩基対２９３４５〜２９３７９に対応し、かつこれを含むＢＹ ＤＮＡ配列
配列番号４１ ＨＩＳタグ
配列番号４２ スプライスアクセプター配列
配列番号４３ ＳＶ４０ポリアデニル化配列
配列番号４４ ＥｐＣａｍ ＢｉＴＥ核酸配列（ＯＫＴ３）
配列番号４５ ＦＡＰ ＢｉＴＥ核酸配列（ＯＫＴ３）
配列番号４６ ＦＡＰ ＢｉＴＥ核酸配列（ａＣＤ３）
配列番号４７ ＮＧ−６１１導入遺伝子カセット
配列番号４８ ＮＧ−６１２導入遺伝子カセット
配列番号４９ ＮＧ−６１３ 導入遺伝子カセット
配列番号５０ 制限部位挿入物（ＢＸ）
配列番号５１ 制限部位挿入物（ＢＹ）
配列番号５２ ＣＭＶプロモーター配列
配列番号５３ ＰＧＫプロモーター配列
配列番号５４ ＣＢＡプロモーター配列
配列番号５５ 短いスプライスアクセプター（ＳＳＡ）ＤＮＡ配列
配列番号５６ スプライスアクセプター（ＳＡ）ＤＮＡ配列
配列番号５７ 分岐スプライスアクセプター（ｂＳＡ）ＤＮＡ配列
配列番号５８ コザック配列（ｎｕｌｌ配列）
配列番号５９ 開始コドンの例
配列番号６０ 内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）
配列番号６１ Ｐ２Ａペプチド
配列番号６２ Ｆ２Ａペプチド
配列番号６３ Ｅ２Ａペプチド
配列番号６４ Ｔ２Ａペプチド
配列番号６５ ポリアデニル化（ポリＡ）配列
配列番号６６ リーダー配列
配列番号６７ リーダー配列
配列番号６８ ＩＦＮΓアミノ酸配列
配列番号６９ ＩＦＮαアミノ酸配列
配列番号７０ ＴＮＦαアミノ酸配列
配列番号７１ ＥｎＡｄゲノム（塩基対１０３５５〜５０６８）のＥ２Ｂ領域に対応するＤＮＡ配列
配列番号７２ Ｎ末端シグナル配列及びＣ末端デカＨｉｓ親和性タグを有する、抗ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ ＤＮＡコード配列
配列番号７３ Ｎ末端シグナル配列を有するが、Ｃ末端デカＨｉｓ親和性タグを有さない、抗ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥタンパク質配列
配列番号７４ Ｎ末端シグナル配列を有するが、Ｃ末端デカＨｉｓ親和性タグを有さない、抗ＦＡＰ ＢｉＴＥ ＤＮＡコード配列
配列番号７５ Ｎ末端シグナル配列を有するが、Ｃ末端デカＨｉｓ親和性タグを有さない、抗ＦＡＰ ＢｉＴＥアミノ酸配列
配列番号７６ Ｎ末端シグナル配列を有するが、Ｃ末端デカＨｉｓの親和性タグを有さない、コントロール（抗ＦＨＡ）のＢｉＴＥ ＤＮＡコード配列
配列番号７７ Ｎ末端シグナル配列を有するが、Ｃ末端デカＨｉｓ親和性タグを有さないコントロール（抗ＦＨＡ）ＢｉＴＥアミノ酸配列
配列番号７８ Ｃ末端デカＨｉｓ親和性タグを有さない、コントロールＢＩＴＥ（抗ＦＨＡ）
配列番号７９ Ｎｕｌｌ配列
配列番号８０ Ｎｕｌｌ配列
配列番号８１ Ｎｕｌｌ配列
配列番号８２ Ｎｕｌｌ配列
配列番号８３ ＥｐＣａｍ ＢｉＴＥ核酸配列（ＯＫＴ３）
配列番号８４ Ｎｕｌｌ配列
配列番号８５ ＦＡＰ ＢｉＴＥ核酸配列（ＯＫＴ３）
配列番号８６ Ｎｕｌｌ配列
配列番号８７ ＦＡＰ ＢｉＴＥ核酸配列（ａＣＤ３）
配列番号８８ ＮＧ−６１１導入遺伝子カセット
配列番号８９ ＮＧ−６１２導入遺伝子カセット
配列番号９０ ＮＧ−６１３導入遺伝子カセット
配列番号９１ ＮＧ−６１４導入遺伝子カセット
配列番号９２ ＮＧ−６１７導入遺伝子カセット
配列番号９３ ＥｐＣａｍ ＢｉＴＥアミノ酸配列（ＯＫＴ３）
配列番号９４ ＦＡＰ ＢｉＴＥアミノ酸配列（ＯＫＴ３）
配列番号９５ ＦＡＰ ＢｉＴＥアミノ酸配列（ａＣＤ３）
配列番号９６ Ｎｕｌｌ配列
配列番号９７ Ｎｕｌｌ配列
配列番号９８ Ｎｕｌｌ配列
配列番号９９ Ｎｕｌｌ配列
配列番号１００ Ｎｕｌｌ配列
配列番号１０１ Ｎｕｌｌ配列
配列番号１０２ Ｎｕｌｌ配列
配列番号１０３ Ｎｕｌｌ配列
配列番号１０４ Ｎｕｌｌ配列
配列番号１０５ Ｆｌｔ３Ｌ核酸配列
配列番号１０６ Ｎｕｌｌ配列
配列番号１０７ ＭＩＰ１α核酸配列
配列番号１０８ フレキシブルリンカー配列
配列番号１０９ ＩＦＮα核酸配列
配列番号１１０ ＣＸＣＬ１０核酸配列
配列番号１１１ ＣＸＣＬ９核酸配列
配列番号１１２ ＮＧ−６１５導入遺伝子カセット
配列番号１１３ ＮＧ−６４０導入遺伝子カセット
配列番号１１４ ＮＧ−６４１導入遺伝子カセット
配列番号１１５ ＦＬＴ３Ｌアミノ酸配列
配列番号１１６ ＭＩＰ１αアミノ酸配列
配列番号１１７ ＩＦＮαアミノ酸配列
配列番号１１８ ＣＸＣＬ９アミノ酸配列
配列番号１１９ ＣＸＣＬ１０アミノ酸配列
配列番号１２０ ＮＧ−６１８ゲノム
配列番号１２１ ＮＧ−６１８ ＥｐＣａｍ ＢｉＴＥ核酸配列
配列番号１２２ ＮＧ−６１８ ＦＡＰ ＢｉＴＥ核酸配列
配列番号１２３ ＮＧ−６１８導入遺伝子カセット
配列番号１２４〜２９７ リンカー配列
ＮＧ−６０１ ＣＭＶプロモーターの制御下でＢＹ位にＥｐＣａｍ ＢｉＴＥをコードするアデノウイルス
ＮＧ−６０２ ＢＹ位にＥｐＣａｍ ＢｉＴＥ及びスプライスアクセプターをコードするアデノウイルス
ＮＧ−６０５ ＣＭＶプロモーターの制御下でＢＹ位置にＦＡＰ ＢｉＴＥをコードするアデノウイルス
ＮＧ−６０６ ＢＹ位にＦＡＰ ＢｉＴＥ及びスプライスアクセプターをコードするアデノウイルス
ＮＧ−６１１ ＢＹ位にＥｐＣａｍ ＢｉＴＥ及びＳＳＡをコードする アデノウイルス
ＮＧ−６１２ ＢＹ位にＦＡＰ ＢｉＴＥ及びＳＳＡをコードするアデノウイルス
ＮＧ−６１３ ＢＹ位にＦＡＰ ＢｉＴＥ及びＳＡをコードするアデノウイルス
ＮＧ−６１４ ＢＹ位にＦＡＰ ＢｉＴＥ及びＳＡをコードするアデノウイルス（ＮＧ−６１３とはＣＤ３の特異性が異なる）
ＮＧ−６１５ ＢＹ位にＦＡＰ ＢｉＴＥ、ＦＬＴ３リガンド、インターフェロンアルファ、ＭＩＰアルファ、ａｎｓ ＳＳＡをコードするアデノウイルス
ＮＧ−６１６ ＢＹ位にＦＡＰ ＢｉＴＥ、ＦＬｔ３リガンド、インターフェロンアルファ、ＭＩＰアルファ、ａｎｓ ＳＡをコードするアデノウイルス
ＮＧ−６１７ ＢＹ位にＦＡＰ ＢｉＴＥ及びＳＳＡをコードするアデノウイルス
ＮＧ−６４０ ＢＹ位にＦＡＰ ＢｉＴＥ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９及びＳＳＡをコードするアデノウイルス
ＮＧ−６４１ ＢＹ位にＦＡＰ ＢｉＴＥ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９及びインターフェロンアルファをコードする−アデノウイルス
実施例１
この実施例に記載したように、組換えＢｉＴＥを設計し、タンパク質を産生した。
ＢｉＴＥエンジニアリング
ＢｉＴＥは、特異性の異なる２本の一本鎖抗体フラグメント（ＳｃＦｖ）を、柔軟なＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーと連結することによって生成される。ＳｃＦｖは、親モノクローナル抗体からのＶＨ及びＶＬドメインをリンカーによって連結することによって生成される。各ＢｉＴＥは、哺乳動物分泌のためのＮ末端シグナル配列及び検出及び精製のためのＣ末端デカヒスチジン親和性タグを用いて設計された。ＢｉＴＥは標準的なＤＮＡクローニング技術によって操作され、タンパク質発現ベクターに挿入された（図１）。抗ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥは、特許ＷＯ２００５０４０２２０（その中の配列番号６３）からのものであり、シグナル配列及び親和性タグが付加されている。抗ＦＡＰ ＢｉＴＥは、シグナル配列及び親和性タグを付加して、特許ＷＯ２０１００３７８３５Ａ２からの抗ＦＡＰ ＳｃＦｖ及び特許ＷＯ２００５０４０２２０（その中の配列番号６３）からの抗ＣＤ３ ＳｃＦｖを用いて新たに作成された。コントロールＢｉＴＥは、Ｈｕｓｓｅｉｎら、２００７年からの抗ＦＨＡ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の糸状赤血球凝集素）ＳｃＦｖ（Ｈｕｓｓｅｉｎ ＡＨら、（２００７）“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｓｕｒｆａｃｅ ａｄｈｅｓｉｎｓ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ａｎｄ ｐｅｒｔａｃｔｉｎ”．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７５、５４７６〜５４８２）及び特許ＷＯ２００５０４０２２０（その中の配列番号６３）からの抗ＣＤ３ ＳｃＦｖを、シグナル配列及び親和性タグを加えて使用した。これらのＢｉＴＥのＤＮＡコード配列及びアミノ酸配列は、配列番号１〜６である。
組換えＢｉＴＥ生産
タンパク質発現を駆動するためにＣＭＶプロモーター（配列番号３１）を使用して、それぞれの配列をｐＳＦ−ＣＭＶベクターにクローニングすることによって、組換えＢｉＴＥタンパク質を産生した（図１）。プラスミド、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥ及びｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣｏｎｔｒｏｌＢｉＴＥ（表２）のプラスミドＤＮＡの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐにより測定した。空のｐＳＦ−ＣＭＶベクターはネガティブコントロールとして含む。それぞれ５４．７μｇを４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭで希釈した。１０９．２μｇのＰＥＩ（線状、ＭＷ２５０００、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地で希釈し、４ｍｌの希釈ＤＮＡと混合してＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を生成した（ＤＮＡ：ＰＥＩ比１：２（ｗ／ｗ））。室温で２０分間インキュベートした後、混合物をＯｐｔｉＭＥＭで１８ｍＬまで補充し、このトランスフェクション混合物を９０％の集密度でＡｄ２９３細胞を含むＴ１７５フラスコに加えた。細胞をトランスフェクション混合物と共に３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、３０ｍＬの細胞培地（グルタミン補充ＤＭＥＭ高グルコース、フェノールレッド不含）を細胞に加え、フラスコを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。効率的なトランスフェクション効率を確保するために、別の細胞のフラスコにｐＳＦ−ＣＭＶ−ＧＦＰを並行してトランスフェクトした。分泌タンパク質を回収するために、トランスフェクトした細胞の上清を回収し、細胞成分を除去するために４℃で５分間３５０ｇで遠心分離した（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−１５Ｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。上清を１０ｋ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。４７５０ｒｐｍ及び４℃で回転させた後、５０倍高い濃度を得るためにフロースルーを用いて保持液の体積を調整した。濃縮タンパク質のアリコートを−８０℃で保存した。
表２
命名構築物において接頭辞として使用される「ｐ」は、構築物がプラスミドであることを示す。
組換えＢｉＴＥ検出
ＢｉＴＥを検出するために、Ｃ末端デカヒスチジン親和性タグを、ウエスタンブロッティングの技術を用いて抗Ｈｉｓ抗体でプローブすることができる。タンパク質サンプルを溶解緩衝液で、β−メルカプトエタノール及びＳＤＳを含む２．５μＬの６×Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳサンプル緩衝液を含む１５μＬの最終容量に調整した。サンプルを９５℃で５分間インキュベートしてタンパク質を変性させ、１５ウェルの１０％プレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌｓ、ＢｉｏＲａｄ、英国）にロードした。Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ Ｔｅｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ、ＵＫ）内の１×ランニングバッファー中でゲルを１８０ Ｖで４５分間泳動した。ＳＤＳゲルからのタンパク質を、Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ、英国）内の１×転写緩衝液中、３００ｍＡ及び４℃で９０分間の湿式エレクトロブロッティングによってニトロセルロース膜上に転写した。熱を制限するためにアイスパックの存在下で移動を行った。次いでニトロセルロース膜を室温で１時間シェーカー上でＰＢＳ−Ｔ中の５％ミルクでブロッキングし、抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体（マウスα− ６ｘＨｉｓ、クローン３Ｄ５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ、＃４６〜０６９３））でプローブし、ＰＢＳ／５％ミルクで１：５０００に希釈した。振盪機上で一晩４℃でインキュベートした後、膜を洗浄し、ＨＲＰ標識ポリクローナル二次α−マウス−免疫グロブリン−抗体（ＰＢＳ／５％ミルク中１：１０．０００、Ｄａｋｏ、＃Ｐ０１６１）で１時間室温でプローブした。視覚化のために、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国）を製造元の指示に従って適用し、Ｘ線フィルムに露光し、自動フィルムプロセッサーで現像した。結果は、ＢｉＴＥ発現プラスミドをトランスフェクトしたが、親ベクターはトランスフェクトしていないＡｄ２９３細胞からのＢｉＴＥタンパク質の発現及び分泌を示した。
組換えＢｉＴＥの定量化
組換えＢｉＴＥタンパク質の量を測定するために、ドットブロットの技術を用いてＢｉＴＥシグナルをＨｉｓタグ付き（Ｃ末端１０Ｈｉｓ）タンパク質標準物質（１０×Ｈｉｓタグ付きヒトカテプシンＤ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃５５６７０４）と比較した。ＢｉＴＥサンプル及びタンパク質標準物質の２倍段階希釈物を調製し、それぞれ１．５μＬをニトロセルロース膜に直接塗布し、２０分間風乾した。次いで、ウエスタンブロッティングについて上述したブロッキング及び染色プロトコルを実施した。タンパク質標準物質のモル濃度は、２５０μｇ／ ｍＬのＢｉＴＥ濃度を表すように調整した。結果（図２Ａ）は、ＢｉＴＥ発現プラスミドをトランスフェクトしたＡｄ２９３細胞からのＢｉＴＥタンパク質の発現及び分泌を実証した。
ＦＡＰ結合ＥＬＩＳＡ
ＦＡＰ ＢｉＴＥのＦＡＰ結合活性及びｐＳＦ−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥ又はｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣｏｎｔｒｏｌＢｉＴＥでトランスフェクトした細胞から分泌されたコントロール（抗ＦＨＡ）ＢｉＴＥ（配列番号４及び６）は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。空のｐＳＦ−ＣＭＶベクター上清をネガティブコントロールとして含めた。ＰＢＳ緩衝液中のヒトＦＡＰ／セプラーゼタンパク質（１００ｎｇ／ウェル、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ、１０４６４−Ｈ０７Ｈ−１０）で４℃で一晩コーティングすることによって、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート）を調製した。その後の全ての結合工程の間に、プレートをＰＢＳ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。プレートを、ＰＢＳ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０中５％ＢＳＡで、室温で１時間ブロッキングした。一定量のＢｉＴＥタンパク質、又は空のｐＳＦ−ＣＭＶベクターをトランスフェクトしたウェルから採取したタンパク質を、ＰＢＳ／５％ ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で１０倍希釈した。全てのサンプルをＦＡＰコートプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。検出抗体である抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体（マウス抗６ｘＨｉｓ、クローン３Ｄ５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国、＃４６〜０６９３）を１：１０００に希釈し、室温で１時間適用した。次いで、ＨＲＰ結合抗マウスＦｃ（ＰＢＳ／５％ミルク中１：１０００、Ｄａｋｏ）を室温で１時間適用した後、ＨＲＰ基質溶液３．３．５．５’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＢ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＨＲＰ検出を実施した。停止溶液を使用して反応を停止させ、発色をプレートリーダーで４５０ｎｍで測定した。４５０ｎｍでの吸光度をＦＡＰ ＢｉＴＥ、コントロールＢｉＴＥ及び空のベクター上清についてプロットしたところ、ＦＡＰ ＢｉＴＥのＦＡＰタンパク質への特異的結合が示された。結果（図２Ｂ）は、組換えＦＡＰタンパク質へのコントロールＢｉＴＥではなく、ＦＡＰ ＢｉＴＥの特異的結合を示す。
ＥｐＣＡＭ結合ＥＬＩＳＡ
ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥのＥｐＣＡＭ結合活性及びｐＳＦ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ又はｐＳＦ−ＣＭＶ−ＣｏｎｔｒｏｌＢｉＴＥでトランスフェクトした細胞から分泌されたコントロールＢｉＴＥ（配列番号２及び６）は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。空のｐＳＦ−ＣＭＶベクター上清をネガティブコントロールとして含める。ＰＢＳ緩衝液中のヒトＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ−１タンパク質（５０ｎｇ／ウェル、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ、＃１０６９４−Ｈ０２Ｈ−５０）で４℃で一晩コーティングすることによって、ＥＬＩＳＡプレート（Ａ Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルマイクロプレート）を調製した。その後の全ての結合工程の間に、プレートをＰＢＳ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。プレートを、ＰＢＳ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０中５％ＢＳＡで、室温で１時間ブロッキングした。一定量のＢｉＴＥタンパク質、又は空のｐＳＦ−ＣＭＶベクターをトランスフェクトしたウェルから採取したタンパク質を、ＰＢＳ／５％ ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で１０倍希釈した。全てのサンプルをＥｐＣＡＭ被覆プレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。検出抗体である抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体（マウス抗６ｘＨｉｓ、クローン３Ｄ５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国、＃４６〜０６９３）を１：５０００に希釈し、室温で１時間適用した。次いで、ＨＲＰ結合抗マウスＦｃ（ＰＢＳ／５％ミルク中１：１０００、Ｄａｋｏ）を室温で１時間適用した後、ＨＲＰ基質溶液３．３．５．５’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＢ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＨＲＰ検出を実施した。停止溶液を使用して反応を停止させ、発色をプレートリーダーで４５０ｎｍで測定した。４５０ｎｍでの吸光度をＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ、コントロールＢｉＴＥ及び空のベクター上清についてプロットしたところ、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの組換えＥｐＣＡＭへの特異的結合が実証された。結果（図２Ｃ）は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの特異的結合を示し、コントロールＢｉＴＥの組換えＥｐＣＡＭタンパク質への特異的結合は示さない。
実施例２
ＢｉＴＥ導入遺伝子保有ＥｎＡｄウイルスを構築する前に、組換えＢｉＴＥタンパク質の機能活性をいくつかの異なるアッセイで評価した。
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離
健康なドナーの新鮮なヒト血液サンプルから、又はオックスフォードのＮＨＳ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ＵＫから入手した全血白血球コーンからのいずれかからの、ヒトＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって単離した。いずれの場合も、サンプルをＰＢＳで１：２に希釈し、この混合物２５ｍＬを５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中の１３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ（１．０７９ｇ／ｍＬ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に重層した。相分離を維持するために最低の減速設定でサンプルを２２℃で３０分間１６００ｒｐｍで遠心分離した（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−１５Ｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。遠心分離後、４層は、上部に血漿層を、続いてＰＢＭＣ含有界面、フィコール層、及び底部に赤血球及び顆粒球の層を含むことが観察できた。パスツールピペットを用いてＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳ（室温で１０分間１２００ｒｐｍ）で２回洗浄し、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地に再懸濁した。
ＣＤ３陽性Ｔ細胞の単離
製造元のプロトコルに従って、Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０−０９６−５３５）を使用して、非ＣＤ３細胞を枯渇させることにより、ＰＢＭＣからＣＤ３陽性（ＣＤ３＋）Ｔ細胞を抽出した。
一次腹水サンプルの処理
チャーチル病院（オックスフォード大学病院）腫瘍病棟の卵巣癌、膵臓癌、乳癌及び胃癌を含むがこれらに限定されない複数の適応症を有する患者から、一次ヒト腹水サンプルを受け取った。受け取ると、保存と将来の分析のために、細胞及び液体画分を、−２０℃で凍結した流体のアリコートで、分離した。製造元の指示に従って、細胞画分を赤血球溶解緩衝液（Ｒｏｃｈｅ、＃１１８１４３８９００１）で処理して赤血球を除去した。各サンプル中に存在する細胞型を、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ１及びＣＴＬＡ４について染色することによって決定し、フローサイトメトリーによって分析した。次いで細胞をエクスビボ Ｔ細胞活性化及び標的細胞溶解実験のために新鮮に使用した。場合によっては、後の実験で使用するために、細胞を１０％ ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ中で継代した。
細胞株の維持
表３で特定されるように、別段の記載がない限り、すべての細胞株は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ、ギブコ（商標））及び１％、（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、英国）で補充し、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、英国）又はＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、英国）で、加湿インキュベーター（ＭＣＯ−１７ＡＩＣ、三洋）内で、３７℃で及び５％ ＣＯ２で維持した。トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％トリプシン、０．０２％ ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）による酵素的解離によって密集度に達する前に、細胞を２〜３日毎に分割した。このプロセスでは、培地を吸引し、細胞を１５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、続いて細胞を２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡで２〜１０分間３７℃で処理した。トリプシンを１０％ ＦＢＳを含む１０ｍＬのＤＭＥＭで中和し、細胞の一部を新しい培地を含む新しいフラスコに移した。日常的な細胞培養のために、２％ ＦＢＳを含む感染及びウイルスプラスミドトランスフェクションのため、ならびにＦＢＳを含まない組換えＢｉＴＥプラスミドトランスフェクションのために、培地に１０％ ＦＢＳを補った。
表３
統計
２つの条件が比較されている場合は、ｔ検定を使用して統計分析が行われた。他の全ての場合において、統計分析は一元配置分散分析を用いて行った。
組換えＦＡＰ ＢｉＴＥによるヒトＴ細胞活性化の特徴付け
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の存在下又は非存在下でＦＡＰ ＢｉＴＥがＴ細胞活性化を誘導する能力を比較した。ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（９６ウェルＵ底プレート中、１ウェルあたり７０，０００細胞）を培地単独又は３００ｎｇ／ｍＬのＦＡＰ又はコントロールＢｉＴＥの存在下で、単独で又はＮＨＤＦ細胞（１０：１ Ｔ：ＮＨＤＦ）と共培養した。細胞を３７℃で２４時間共培養し、続いて無酵素細胞解離緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ、＃１３１５１０１４）で採取した。次いで、ＣＤ４５＋Ｔ細胞上のＣＤ６９（図３Ａ）及びＣＤ２５（図３Ｂ）の発現レベルを、抗体染色及びフローサイトメトリーによって分析し、幾何平均蛍光（ｇＭＦＩ）値として表した。プレート固定化抗ＣＤ３抗体（７．５μｇ／ｍＬ）をＴ細胞活性化のためのポジティブコントロールとして使用した。ＦＡＰ ＢｉＴＥは、Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の発現を選択的に誘導し、それがＴ細胞を活性化することができたことを示している。
第２の同様の実験において、Ｔ細胞を、ＮＨＤＦ細胞（９６ウェルプレートのウェル中の２００，０００ ＣＤ３＋細胞＋４０，０００ ＮＨＤＦ）及び３００ｎｇ／ｍＬ ＦＡＰ又はコントロールＢｉＴＥとの共培養の６時間後の細胞内サイトカイン染色によって評価した。採取の５時間前に培地にブレフェルジンＡを添加して、ＣＤ４５＋Ｔ細胞をＩＦＮγ発現について細胞内染色した。ポジティブコントロールとして、Ｔ細胞を可溶性ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。図４Ａに示す結果は、ＮＨＤＦの存在下でのＦＡＰ ＢｉＴＥが、コントロールＢｉＴＥと比較して、Ｔ細胞を発現する有意に多数のＩＦＮγをもたらしたことを示している。
実施例３
実施例２の実験と同様の一連の実験を行って、組換えＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥタンパク質を特徴付けた。
組換えＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥによるヒトＴ細胞活性化の特徴付け
ＥｐＣＡＭ陽性ＤＬＤ細胞株の存在下又は非存在下でＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥがＴ細胞活性化を誘導する能力を比較した。ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（９６ウェルＵ底プレート中、１ウェルあたり７０，０００細胞）を培地単独又は６００ｎｇ／ｍＬのＥｐＣＡＭ又はコントロールＢｉＴＥの存在下で、単独又はＤＬＤ細胞（１０：１ Ｔ：ＤＬＤ）と共培養した。細胞を３７℃で２４時間共培養し、続いて無酵素細胞解離緩衝液を用いて採取した。次いで、ＣＤ４５＋Ｔ細胞上のＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルを、抗体染色及びフローサイトメトリーによって分析し、データを幾何平均蛍光（ｇＭＦＩ）値として表した。プレート固定化抗ＣＤ３抗体（７．５μｇ／ｍＬ）をＴ細胞活性化のポジティブコントロールとして使用した。ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥはＴ細胞上の活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の発現を選択的に誘導し、それがＴ細胞を活性化することができたことを示している（図４Ｂ及びＣ）。
同様の実験において、Ｔ細胞を、ＤＬＤ細胞（９６ウェルプレートのウェルあたり２００，０００ＣＤ３＋Ｔ細胞＋４０，０００ ＤＬＤ細胞）及び３００ｎｇ／ｍＬのＥｐＣＡＭ又はコントロールＢｉＴＥとの共培養の６時間後に細胞内サイトカイン染色によって評価した。採取の５時間前に培地にブレフェルジンＡを添加して、ＣＤ４５＋Ｔ細胞をＩＦＮγ発現について細胞内染色した。ポジティブコントロールとして、Ｔ細胞を可溶性ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。結果は、ＤＬＤの存在下でのＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥが、コントロールＢｉＴＥと比較して、Ｔ細胞を発現する有意に多数のＩＦＮγをもたらしたことを示した（図５Ａ）。
別の同様の実験では、８人の異なる献血者からのＰＢＭＣを使用して、ＢｉＴＥ媒介Ｔ細胞活性化におけるドナー依存的変動を評価した。ＤＬＤ（７，０００細胞）を、培地単独又は３００ｎｇ／ｍＬのコントロールもしくはＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下で、Ｕ底９６ウェルプレート中で１００，０００個のＰＢＭＣと共培養した。細胞を３７℃で２４時間共培養し、続いて採取した。次いで、ＣＤ４５＋Ｔ細胞上のＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルを、抗体染色及びフローサイトメトリーによって分析し、データを幾何平均蛍光（ｇＭＦＩ）値として表した。結果は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥが８人すべてのドナーからのＣＤ３＋Ｔ細胞において活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の発現を誘導することを示した（図５Ｂ及びＣ）。
実施例４
この実施例では、組換えＦＡＰ ＢｉＴＥ活性化Ｔ細胞が、線維芽細胞標的細胞の死滅を誘導する能力を評価した。
ＦＡＰ ＢｉＴＥはＦＡＰ陽性細胞株及び初代細胞のＴ細胞媒介溶解性を誘導する
ＮＨＤＦ（７，０００細胞）を、培地単独又は３００ｎｇ／ｍＬのコントロールもしくはＦＡＰ ＢｉＴＥの存在下で、Ｕ底９６ウェルプレートのウェル中で７０，０００個のＴ細胞と共培養した。２４時間の共培養の後、上清を回収し、製造元の指示に従ってＬＤＨアッセイにより細胞傷害性を決定した。結果は図６Ａにあり、ＦＡＰ ＢｉＴＥがＮＨＤＦ細胞の溶解を有意に増加させたことを示す。
同様の実験において、７，０００個の初代肺線維芽細胞（ＢＴＣ１００）を、３００ｎｇ／ｍＬのコントロール又はＦＡＰ ＢｉＴＥを、含む又は含まない７０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養した。２４時間の共培養の後、上清を回収し、細胞傷害性をＬＤＨアッセイにより測定した。図６Ｂ及びＣの結果は、ＦＡＰ ＢｉＴＥが原発性ヒト癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の溶解を有意に増加させたことを示している。これら及び他の患者由来細胞株によるＦＡＰの発現を図７に示す。
ＦＡＰ ＢｉＴＥ媒介細胞溶解の用量反応関係を、８，０００個のＮＨＤＦ細胞を４０，０００個のＴ細胞と共に２×１０３〜２×１０−２ｎｇ／ｍＬの範囲のＢｉＴＥ濃度で共培養することによって評価した。３７℃で２４時間共培養した後、ＬＤＨアッセイを上清に対して行い、標的細胞の細胞傷害性を決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍに統合された４パラメーター非線形フィットモデルを用いて用量反応曲線をフィットさせ、３．２ｎｇ／ｍＬのＦＡＰ ＢｉＴＥに対するＥＣ ５０値を生成した。結果（図８Ａ）は、ＬＤＨアッセイによって測定されるように、ＦＡＰ ＢｉＴＥ濃度と細胞傷害性との間の用量依存的関係を示す（Ａｂｓ４９０として示す）。
実施例５
実施例４と同様の研究を用いて、標的腫瘍細胞の死滅を誘導する組換えＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ活性化Ｔ細胞の能力を評価した。
ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥはＥｐＣＡＭ陽性細胞株のＴ細胞媒介溶解を誘導する
ＤＬＤ腫瘍細胞（７，０００細胞）を、培地単独又は３００ｎｇ／ｍＬのコントロールもしくはＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下で、Ｕ底９６ウェルプレートのウェル中で７０，０００個のＴ細胞と共培養した。２４時間の共培養の後、上清を回収し、細胞傷害性をＬＤＨアッセイにより測定した。図８Ｂの結果は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥがＤＬＤ細胞の溶解を有意に増加させたことを示す（ＤＬＤ細胞上のＥｐＣＡＭ発現を図８Ｃに示す）。
同様の実験において、４，０００個のＳＫＯＶ細胞を、３００ ｎｇ／ｍＬのコントロール又はＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの有無にかかわらず、４０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養した。２４時間の共培養の後、上清を回収し、細胞傷害性をＬＤＨアッセイにより測定した。図９Ａの結果は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥがＳＫＯＶ細胞の溶解を有意に増加させたことを示す。
別の同様の実験では、５０００個のＭＣＦ７細胞を、３００ｎｇ／ｍＬのコントロール又はＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの有無にかかわらず、５０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養した。２４時間の共培養の後、上清を回収し、細胞傷害性をＬＤＨアッセイにより測定した。図９Ｂの結果は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥもＭＣＦ７細胞の溶解を有意に増加させたことを示している。
ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ媒介細胞溶解の用量反応関係は、８，０００個のＤＬＤを４０，０００個のＴ細胞と共に、２×１０３〜２×１０−２ ｎｇ／ ｍＬの範囲のＥｐＣＡＭ又はコントロールＢｉＴＥ濃度で共培養することによって評価した。３７℃で２４時間共培養した後、ＬＤＨアッセイを上清に対して行い、標的細胞の細胞傷害性を決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍに統合された４パラメータ非線形フィットモデルを使用して、用量反応曲線をフィットさせ、７．４ ｎｇ／ｍＬのＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥに対するＥＣ ５０値を生成した。図１０の結果は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ濃度と細胞傷害性との間の用量依存的関係を示す。
結論として、この実施例の結果は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥが複数のＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞株のＴ細胞媒介溶解性を誘導することができたことを実証している。
実施例６
ＦＡＰを発現する安定なＣＨＯ及びＡｄ２９３細胞株を、親非トランスフェクト細胞と比較することによってＦＡＰ ＢｉＴＥのＦＡＰ抗原特異性を実証するための手段として生成した。
ＦＡＰ発現安定トランスフェクト細胞株の生成
ＦＡＰ遺伝子のタンパク質配列は、ＮＣＢＩデータベース（配列番号３０）から得られ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｔｄ（オックスフォード、英国）によって合成されたＤＮＡコード配列を生成するために逆転写された。ＦＡＰ遺伝子を、ｐＳＦ−Ｌｅｎｔｉ−ＦＡＰベクターを産生する標準的なクローニング技術によってｐＳＦ−Ｌｅｎｔｉベクターにクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＨＩＶ−Ｇａｇ−Ｐｏｌ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＨＩＶ−Ｒｅｖと共にレンチウイルスＦＡＰ発現ベクターでトランスフェクトした。リポフェクタミン２０００を、トランスフェクション試薬として使用し、１：２のＤＮＡ：リポフェクタミン比でベクターＤＮＡに添加し、３７℃で細胞と共にインキュベートした。レンチウイルスを含む上清を４８時間後に回収し、ポリブレンと混合した（最終濃度、８μｇ／ｍＬ）。レンチウイルス／ポリブレン混合物を、播種したＡｄ２９３又はＣＨＯ細胞に添加し、３７℃でインキュベートした。４日目に、上清をピューロマイシン（Ａｄ２９３について２μｇ／ｍＬ及びＣＨＯについて７．５μｇ／ｍＬ）を含有する培地と交換した。次に安定な変異体をクローン選択し、親細胞株又は安定にトランスフェクトした変異体のＦＡＰ発現を、ＦＡＰ又は同位体対照抗体で染色することによって決定し、フローサイトメトリーによって分析した（図１１Ａ）。
ＦＡＰ ＢｉＴＥ媒介標的細胞溶解はＦＡＰ発現細胞に特異的である
ＣＨＯ又はＣＨＯ−ＦＡＰ細胞（７，０００細胞）を、培地単独又は２μｇ／ｍＬコントロールもしくはＦＡＰ ＢｉＴＥの存在下で、Ｕ底９６ウェルプレートのウェル中で、単独で又はヒトＴ細胞（７０，０００個）と共培養した。２４時間のインキュベーション後、上清を回収し、標的細胞の細胞傷害性を、実施例４に記載のようにＬＤＨ細胞傷害性アッセイによって測定した（図１１Ｂ）。Ｔ細胞活性化はまた、フローサイトメトリーによってＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルを分析することによっても決定された（図１２）。細胞傷害性は、ＣＨＯ−ＦＡＰ細胞をＴ細胞及びＦＡＰ ＢｉＴＥと共に培養した場合にのみ観察された。これは、ＦＡＰ ＢｉＴＥが媒介するＴ細胞活性化及び標的細胞溶解が非常に特異的であり、ＦＡＰ発現細胞に限定され、ＦＡＰ陰性親細胞株ではないことを示している。
実施例７
ＥｐＣＡＭを発現する安定なＣＨＯ及びＡｄ２９３細胞株は、親非トランスフェクト細胞と比較することによって、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥのＥｐＣＡＭ抗原特異性を実証するための手段として生成した。
ＥｐＣＡＭ発現安定トランスフェクト細胞株の生成
ＥｐＣＡＭ遺伝子のタンパク質配列は、ＮＣＢＩデータベース（配列番号２８）から得られ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｔｄ（オックスフォード、英国）によって合成されたＤＮＡコード配列を生成するために逆転写された。ＥｐＣＡＭ遺伝子を、ｐＳＦ−Ｌｅｎｔｉ−ＥｐＣＡＭベクターを産生する標準的なクローニング技術によってｐＳＦ−Ｌｅｎｔｉベクターにクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＨＩＶ−Ｇａｇ−Ｐｏｌ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＨＩＶ−Ｒｅｖと共にレンチウイルスＥｐＣＡＭ発現ベクターでトランスフェクトした。リポフェクタミン２０００をトランスフェクション試薬として使用し、１：２のＤＮＡ：リポフェクタミン比でベクターＤＮＡに添加し、３７℃で細胞と共にインキュベートした。レンチウイルスを含む上清を４８時間後に回収し、ポリブレンと混合した（最終濃度、８μｇ／ｍＬ）。レンチウイルス／ポリブレン混合物を、播種したＡｄ２９３又はＣＨＯ細胞に添加し、３７℃でインキュベートした。４日目に、上清をピューロマイシン（Ａｄ２９３について２μｇ／ｍＬ及びＣＨＯについて７．５μｇ／ｍＬ）を含有する培地と交換した。次に安定な変異体をクローン選択し、親細胞株又は安定にトランスフェクトした変異体のＥｐＣＡＭ発現を、ＥｐＣＡＭ又は同位体対照抗体で染色することによって決定し、フローサイトメトリーによって分析した（図１３Ａ）。
ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ媒介標的細胞溶解はＥｐＣＡＭ発現細胞に特異的である
ＣＨＯ又はＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞（７，０００細胞）を、培地単独又は２μｇ／ｍＬコントロールもしくはＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下で、Ｕ底９６ウェルプレートのウェル中で、単独で又はヒトＴ細胞（７０，０００個）と共培養した。２４時間のインキュベーション後、上清を回収し、標的細胞の細胞傷害性をＬＤＨ細胞傷害性アッセイによって測定した（図１３Ｂ）。Ｔ細胞活性化はまた、フローサイトメトリーによってＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルを分析することによっても決定された（図１４）。細胞傷害性は、ＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞をＴ細胞及びＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥと共に培養した場合にのみ観察された。これは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ媒介Ｔ細胞活性化及び標的細胞溶解が非常に特異的であり、ＥｐＣＡＭ発現細胞に限定され、ＥｐＣＡＭ陰性の親細胞株ではないことを示している。
実施例８
さらなる実験において、組換えＦＡＰ ＢｉＴＥタンパク質がＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞を活性化する能力及びこれらのＴ細胞サブセットのそれぞれがＮＨＤＦ細胞を溶解する能力を評価した。ＣＤ３＋Ｔ細胞（３５，０００個）を、Ｕ底９６ウェルプレートのウェル中で３００ｎｇ／ｍＬのコントロール又はＦＡＰ ＢｉＴＥの存在下で、７，０００個のＮＨＤＦ細胞と共培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を採取し、ＣＤ４又はＣＤ８ならびにＣＤ６９及びＣＤ２５について抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。結果（図１５Ａ）は、ＦＡＰ ＢｉＴＥがＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方において活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の増加を誘導することを実証した。
同様の実験において、各Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４及びＣＤ８）が標的細胞を死滅させる能力を評価した。製造元のプロトコルに従って、ＣＤ４Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０−０４５−１０１）を使用して、非単離フロースルー内のＣＤ８細胞と共に、ポジティブ選択によりＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ３精製細胞から抽出した。Ｕ底９６ウェルプレートのウェル中で、７，０００個のＮＨＤＦを、３００ｎｇ／ｍＬのコントロール又はＦＡＰ ＢｉＴＥと共に、３５，０００個のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養し、３７℃でインキュベートした。２４時間後、上清を回収し、標的細胞の細胞傷害性をＬＤＨ細胞傷害性アッセイによって測定した。結果（図１５Ｂ）は、ＦＡＰ ＢｉＴＥがＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を誘導してＮＨＤＦ細胞を死滅させることを示す。
実施例９
ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥがＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する能力及び各サブセットのＤＬＤ腫瘍細胞を溶解する能力を評価した。ＣＤ３＋Ｔ細胞（３５，０００個）を、Ｕ底９６ウェルプレートのウェル中で３００ｎｇ／ｍＬのコントロール又はＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下で、７，０００個のＤＬＤ細胞と共培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を採取し、ＣＤ４又はＣＤ８ならびにＣＤ６９及びＣＤ２５について抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。結果（図１６Ａ）は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥがＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方において活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の増加を誘導したことを実証した。
同様の実験において、各Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４及びＣＤ８）が標的細胞を死滅させる能力を評価した。製造元のプロトコルに従って、ＣＤ４Ｔ細胞単離キットを使用して、選択されていないフロースルー内のＣＤ８細胞と共に、ポジティブ選択によりＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ３精製細胞から抽出した。Ｕ底９６ウェルプレートのウェルにおいて、７，０００個のＤＬＤを、３００ｎｇ／ｍＬのコントロール又はＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥと共に、３５，０００個のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養し、３７℃でインキュベートした。２４時間後、上清を回収し、標的細胞の細胞傷害性をＬＤＨ細胞傷害性アッセイによって測定した（図１６Ｂ）。結果は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥがＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を誘導してＤＬＤ細胞を死滅させることを示す。
実施例１０
原発性悪性腹水からの自己腫瘍関連リンパ球のＦＡＰ ＢｉＴＥ媒介活性化の特徴付け
癌患者由来の細胞を用いてＢｉＴＥタンパク質の活性を評価するために、ＣＤ３＋Ｔ細胞とＦＡＰ＋細胞の両方を含む一次悪性腹水のサンプルを試験のために得た。未精製腹水細胞（従って、受け取ったときから変わらない）を、１００％腹水又は５００ｎｇ／ｍＬコントロール又はＦＡＰ ＢｉＴＥの存在下で、１％ヒト血清を補充した培地のいずれかに、Ｕ底９６ウェルプレートのウェル当たり２５０，０００細胞で播種した。未処置ウェルをネガティブコントロールとして用いた。３７℃で５日間インキュベートした後、総細胞集団を採取し、ＣＤ３＋Ｔ細胞の数（図１７Ａ）及びＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現レベルを決定した（図１７Ｂ）。１ウェルあたりの総細胞数は精密計数ビーズを用いて決定した。結果は、ＦＡＰ ＢｉＴＥが癌患者由来の腫瘍関連Ｔ細胞のＴ細胞活性化の有意な増加をもたらしたことを実証している。
上記実験の延長として、複製ウェルを回収し、フローサイトメトリーによりＦＡＰ＋細胞の数を決定した（図１７Ｃ）。１ウェルあたりの総細胞数は精密計数ビーズを用いて決定した。結果は、ＦＡＰ ＢｉＴＥが腹水サンプル中の自己ＦＡＰ発現細胞数の有意な減少をもたらしたことを示す。
実施例１１
以下に記載する方法を用いて、組換えＢｉＴＥ発現ＥｎＡｄウイルスを操作し、産生し、そして精製した。
ＢｉＴＥ発現エナデノチュシレブ（Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）の生成
ＥｎＡｄは、Ｅ２Ｂ領域におけるＡｄ１１ｐに対するＡｄ３の頻繁な非相同的ヌクレオチド置換、ほぼ完全なＥ３欠失、及びＥ４ｏｒｆ４にマッピングされたより小さなＥ４欠失を含む、複製能力のあるキメラグループＢアデノウイルスである（Ｋｕｈｎら、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２００８年６月１８日； ３（６）：ｅ２４０９）。この研究で使用したアデノウイルスのゲノムの略図を図１８Ａに示す。
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を使用して、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ（配列番号１）、ＦＡＰ ＢｉＴＥ（配列番号３）又はコントロールＢｉＴＥ（配列番号５）をコードするカセットの直接挿入により、プラスミドｐＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−コントロールＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−コントロールＢｉＴＥ（表４）を生成した。導入遺伝子カセットは、５ ’に短いスプライスアクセプター配列（配列番号３３）もしくは外因性ＣＭＶプロモーター（配列番号３１）、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ又はコントロールＢｉＴＥ ｃＤＮＡ配列、及び３’にポリアデニル化配列（配列番号３２）を含んでいた。プラスミドの構築はＤＮＡ配列決定により確認した。外因性ＣＭＶプロモーターは構成的に活性であり、従って導入遺伝子の早期発現をもたらす。スプライスアクセプター配列は、ウイルスの主要後期プロモーターの制御下で発現を駆動し、ウイルスゲノム複製の開始後にその後の導入遺伝子発現をもたらす。このプロモーター駆動発現の動態は図１８Ｂで観察することができ、そこではＧＦＰが導入遺伝子として使用された。
表４
ウイルス産生と特徴付け
プラスミドＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−コントロールＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−コントロールＢｉＴＥは、ライナーウイルスゲノムを生成するために、酵素ＡｓｃＩでの制限消化によって線状化された。消化したＤＮＡをイソプロパノール抽出により精製し、３００μｌ＞９５％分子生物学グレードのエタノール及び１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム中で、−２０℃で１６時間沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレット化し、５００μｌの７０％エタノールで洗浄した後、再び１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。きれいなＤＮＡペレットを風乾し、１００μＬの水に再懸濁した。６．２５μｇのＤＮＡを、ＯｐｔｉＭＥＭ中でリポフェクタミントランスフェクション試薬１５．６μＬと混合し、２０分間室温でインキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物を、８０％の密集度まで増殖させたＡｄ２９３細胞を含むＴ−２５フラスコに加えた。細胞をトランスフェクション混合物と共に３７℃で４時間インキュベートした後、５％ＣＯ２ ４ｍｌの細胞培地（１０％ ＦＢＳを補充したグルタミンを含むＤＭＥＭ高グルコース）を細胞に加え、フラスコを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクトしたＡｄ２９３細胞を２４時間ごとにモニターし、４８〜７２時間ごとに追加の培地を補充した。細胞単層における有意な細胞変性効果（ＣＰＥ）の観察によってウイルスの産生をモニターした。広範囲のＣＰＥが観察されたら、３回の凍結融解サイクルによってＡｄ２９３細胞からウイルスを採取した。収集した溶解物を段階希釈し、Ａｄ２９３細胞を再感染させ、単一のプラークを含むウェルを収集することによって、単一のウイルスクローンを選択した。ウイルスストックを増幅するために、感染が完全ＣＰＥに達したら、Ａｄ２９３細胞の連続感染を行った。増幅中の生存ウイルス産生は、細胞単層中の有意なＣＰＥの観察によって確認された。
ウイルス精製
強力なウイルスストックを増幅したら、二重塩化セシウム密度勾配遠心分離（バンディング）によってウイルスを精製して、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６ウイルスストックを生成した。製造元の指示に従って、これらのストックをｍｉｃｏＢＣＡアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって力価測定した（表５）。
表5
実施例１２
ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６ウイルスの活性は、下記の方法を用いて特徴付けられた。
癌細胞株におけるＥｎＡｄと比較したＥｎＡｄ活性をコードするＢｉＴＥの特徴付け
ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６又はＥｎＡｄが複製する能力を、Ａ５４９肺癌細胞の感染によって分析し、ｑＰＣＲによって評価した。Ａ５４９細胞を２４ウェルプレートのウェルに、２×１０５細胞／ウェルの細胞密度で播種した。細胞を細胞当たり１００ウイルス粒子（ｐｐｃ）で感染させるか又は未感染のままにする前に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。感染の２４、４８又は７２時間後にウェルを採取し、製造元のプロトコルに従ってＰｕｒｅＬｉｎｋゲノムＤＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡを精製した。全ウイルスゲノムを、表６に詳述した反応混合物中のＥｎＡｄヘキソン遺伝子特異的プライマー−プローブセットを用いて、各抽出サンプル又は標準物質を用いてｑＰＣＲにより定量化した。ｑＰＣＲは表７のプログラムに従って実施した。
表６

表７

細胞当たりの検出されたウイルスゲノムの数の定量化は、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６及びＥｎＡｄウイルス複製がＡ５４９細胞株において同程度であることを実証した（図１９Ａ）。
ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６又はＥｎＡｄの腫瘍溶解活性をＡ５４９の感染によって評価した（図１９Ｂ）。Ａ５４９細胞を９６ウェルプレートに１．５×１０４細胞／ウェルの細胞密度で播種した。細胞は、ウイルスの増加ｐｐｃ（５倍連続希釈、４．１ｘ１０−７〜５０００ウイルスｐｐｃ）に感染させた又は非感染のままにする前に、プレートを、１８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。５日目に、Ａ５４９細胞傷害性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（ＭＴＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ３５８２）によって測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍに統合された４パラメータ非線形フィットモデルを用いて用量反応曲線をフィットさせた。各ウイルスについて生成されたＩＣ５０値は、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６及びＥｎＡｄの腫瘍溶解活性が各ウイルスについて同程度であることを実証した。
ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６からの機能的ＢｉＴＥ導入遺伝子発現の確認
ウイルスＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６が機能的ＢｉＴＥを産生するかどうかを決定するために、標的細胞としてＣＨＯ、ＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ及びＣＨＯ−ＦＡＰ細胞株を使用する、Ｔ細胞活性化アッセイを実施した。培養液中で１００倍希釈したＡｄ２９３ウイルス上清を含むＵ底９６ウェルプレートのウェル中で、１０，０００個の標的細胞を５０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。Ｔ細胞を採取し、ＣＤ２５及びＣＤ６９に特異的な抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。結果（図２０Ａ及び２０Ｂ）は、ウイルスＮＧ−６０１及びＮＧ−６０２が、ＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞と共培養するとＴ細胞を活性化する機能的ＢｉＴＥ導入遺伝子を発現し、ＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６が、ＣＨＯ−ＦＡＰ細胞と共培養するとＴ細胞を活性化したが、ＣＨＯ細胞と共培養すると活性化しなかった機能的ＢｉＴＥ導入遺伝子を発現することを示した。
結腸癌細胞株におけるＢｉＴＥ発現の定量化
ヒト結腸癌細胞株ＤＬＤのＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６感染によるＢｉＴＥ発現量を評価した。ＤＬＤ細胞を、１ウェルあたり１．２×１０６細胞の密度で６ウェル培養プレートに播種した。播種１８時間後、ＤＬＤ細胞を１００ｐｐｃでＥｎＡｄ、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６に感染させた。上清をウェルから回収する前に細胞を７２時間培養し、細胞破片を除去するために１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、清澄化した上清を、公知濃度の組み換えＢｉＴＥを用いて作成した標準曲線と比較して細胞傷害性を用いて殺傷アッセイに使用し、ウイルス上清中のＢｉＴＥの量を決定した。
ＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６から産生したＦＡＰ ＢｉＴＥの量を決定するために、８，０００個のＮＨＤＦを、４０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞及び１０３に１、１０４に１、及び１０５に１の割合で希釈されたＤＬＤウイルス上清と共培養して、細胞傷害性アッセイを行った。標準曲線は、３３３３から３．３３×１０−４ｎｇ／μＬの１０倍連続希釈で、ＮＨＤＦ及びＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＦＡＰ又はコントロールＢｉＴＥと共にインキュベートすることによって生成した。上清を処理の２４時間後に回収し、細胞傷害性をＬＤＨアッセイにより測定した。発現されたＢｉＴＥの量は、ウイルス上清の細胞傷害性を組換えＢｉＴＥ標準曲線のそれと比較することによって決定された。結果（図２１）は、ウイルスＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６が、１００万個のＤＬＤ細胞あたりそれぞれ９．８及び４９．２μｇのＦＡＰ ＢｉＴＥを産生することを示した。
ＮＧ−６０１及びＮＧ−６０２から産生されたＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの量を決定するために、８，０００個のＤＬＤ細胞を、４０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞及び１０３に１、１０４に１、及び１０５に１の割合で希釈されたＤＬＤウイルス上清と共培養して、細胞傷害性アッセイを行った。標準曲線は、３３３３から３．３３×１０−４ ｎｇ／μＬまでの１０倍段階希釈で、ＤＬＤ及びＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＥｐＣＡＭ又はコントロールＢｉＴＥと共にインキュベートすることによって作成した。上清を処理の２４時間後に回収し、細胞傷害性をＬＤＨアッセイにより測定した（図２２）。発現されたＢｉＴＥの量は、ウイルス上清の細胞傷害性を組換えＢｉＴＥ標準曲線のそれと比較することによって決定された。結果は、ウイルスＮＧ−６０１及びＮＧ−６０２が、１００万個のＤＬＤ細胞あたりそれぞれ１６５及び５０．３μｇのＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを産生することを示した。
実施例１３
ＦＡＰ又はコントロールＢｉＴＥをコードすることに加えて、ＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９、ＮＧ−６１０ウイルスはまた、蛍光顕微鏡法（配列番号２５及び２６、表４）を用いた感染細胞の視覚化のために、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）導入遺伝子を担持する。これらのウイルスの機能活性は、下記の方法を用いて特徴付けられた。
ＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９、ＮＧ−６１０からの導入遺伝子発現の確認
ウイルスＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９及びＮＧ−６１０がそれらのＢｉＴＥ導入遺伝子を産生する能力をＡｄ２９３細胞の感染によって評価した。Ａｄ２９３細胞を１×１０６細胞／ウェルで６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を１００ｐｐｃでウイルスに感染させる前、又は未感染のままにする前に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。感染後４８時間で、プラークを蛍光水銀灯で照射し、写真撮影した（図２３）。結果は、ウイルスＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９及びＮＧ−６１０がＲＦＰ導入遺伝子を発現することを示唆した。
実施例１４
次の一連の実験では、ＥｎＡｄ及びＦＡＰ、又はコントロールＢｉＴＥウイルスＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６、ＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９、ＮＧ−６１０が、腫瘍細胞及び線維芽細胞を含む標的細胞を死滅させる能力評価した。
最初の試験では、ＥｎＡｄがＤＬＤ細胞を死滅させる能力を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ技術を用いて評価した。ＤＬＤ細胞を４８ウェルＥプレートに１．２×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、細胞を１００ ＥｎＡｄ ｐｐｃで感染させるか又は未感染のままにする前に、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用して、８日間のインキュベーション期間にわたって１５分ごとに標的細胞の細胞傷害性を測定した。結果（図２４Ａ）は、ＥｎＡｄがその期間にわたってＤＬＤ細胞を効果的に死滅させることができたことを示唆する。
同様の実験で、ＥｎＡｄがＳＫＯＶ細胞を死滅させる能力を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ技術を用いて評価した。ＳＫＯＶ細胞を１×１０４細胞／ウェルで４８ウェルＥプレートにプレーティングし、細胞を１００ ＥｎＡｄ ｐｐｃで感染させるか、又は未感染のままにする前に、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用して、１５分ごとに８日間、標的細胞の細胞傷害性を測定した。結果（図２４Ｂ）は、この期間にわたってＳＫＯＶ細胞がＥｎＡｄ媒介細胞傷害性に対して耐性であることを示唆する。
同様の実験で、ＥｎＡｄがＮＨＤＦ細胞を死滅させる能力も、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ技術を用いて評価した。ＮＨＤＦ細胞を４８ウェルＥプレートに４×１０３細胞／ウェルでプレーティングし、細胞を１００ ＥｎＡｄ ｐｐｃで感染させるか又は未感染のままにする前に、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用して、Ａ５４９及びＳＫＯＶ細胞と同じ期間にわたって、１５分ごとに標的細胞の細胞傷害性を測定した。結果（図２４Ｃ）は、観察された期間内にＥｎＡｄがＮＨＤＦ細胞を死滅させることができないことを示唆している。
同様の実験において、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６及びＥｎＡｄがＮＨＤＦ細胞を死滅させる能力を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いてＳＫＯＶ腫瘍細胞及びＣＤ３＋Ｔ細胞との共培養において評価した。ＮＨＤＦ細胞及びＳＫＯＶ細胞は、それぞれ４×１０３、１×１０３細胞／ウェルで、４８ウェルＥ−プレートに播種した。細胞を１００ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５又はＮＧ−６０６に感染させるか、又は未感染のままにする前に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。２時間インキュベートした後、３７，５００個のＣＤ３＋Ｔ細胞を各ウェルに加えた。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いて１５分ごとに標的細胞の細胞傷害性を測定した。結果（図２５Ａ）は、ＥｎＡｄ又はコントロールＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４ではなく、ＦＡＰ ＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０５及びＮＧ６０６が、ＢｉＴＥ発現に使用されるプロモーター（ＣＭＶプロモーターの方が速い）依存の動態で、ＮＨＤＦ細胞の溶解を誘導できたことを実証している。
同様の実験において、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５、ＮＧ−６０６及びＥｎＡｄのＮＨＤＦ細胞を死滅させる能力を、ＬＤＨ細胞傷害性アッセイを用いてＳＫＯＶ及びＣＤ３＋Ｔ細胞との共培養において評価した。ＮＨＤＦ細胞及びＳＫＯＶ細胞を９６ウェルＵ底プレートにそれぞれ８×１０３及び２×１０３細胞／ウェルで播種し、１００ ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５又はＮＧ−６０６のいずれかで感染させるか、又は未感染のままにした。２時間インキュベートした後、７５，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞を各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。上清を、処理後０、２４、４８及び９６時間に採取し、細胞傷害性をＬＤＨ細胞傷害性アッセイにより測定した。結果（図２５Ｂ）は、ＥｎＡｄ又はコントロールＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４ではなく、ＦＡＰ ＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０５及びＮＧ６０６が、ＢｉＴＥ発現に使用されるプロモーター依存の動態で、ＮＨＤＦ細胞の溶解を誘導できたことを実証している。
上記のＬＤＨ実験の延長として、処理後０、２４、４８及び９６時間に細胞も収集し、ＣＤ４５、ＣＤ６９及びＣＤ２５について抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。結果（図２６）は、ＥｎＡｄ又はコントロールＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４ではなく、ＦＡＰ ＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６が、ＢｉＴＥ発現に使用されるプロモーターに依存の動態で、Ｔ細胞活性化を誘導できたことを実証する。
同様の実験において、ＦＡＰ ＢｉＴＥ媒介Ｔ細胞活性化を誘導するためのＦＡＰへの依存性を評価した。９６ウェルＵ底プレートにおいて、ＳＫＯＶ細胞を２×１０３細胞／ウェルに単独で、又は８×１０３細胞／ウェルにＮＨＤＦ細胞と組み合わせて播種した。ウイルス粒子を１００ｐｐｃで各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２時間後、７５，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞を加え、プレートをさらにインキュベートした。感染の９６時間後に細胞を採取し、ＣＤ４５及びＣＤ２５について染色し、フローサイトメトリーにより分析した（図２７Ａ）。結果は、ＦＡＰ ＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６が、ＦＡＰ陽性ＮＨＤＦ細胞の存在下でのみＴ細胞活性化を誘導したことを実証している。
同様の実験において、ＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６におけるプロモーター（ＣＭＶ又はウイルスＭＬＰ／ＳＡ）駆動のＢｉＴＥ発現の特異性をさらに調べた。９６ウェルＵ底プレートに、ＮＨＤＦ細胞を４ ×１０３細胞／ウェルで播種した。細胞当たり１００個のウイルス粒子を各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２時間後、４０，０００個のＣＤ３細胞を添加し、プレートをさらにインキュベートした。感染の７２時間後に、上清を回収し、細胞傷害性をＬＤＨ細胞傷害性アッセイにより測定した。結果（図２７Ｂ）は、ＣＭＶ駆動ウイルスＮＧ−６０５が、ＮＨＤＦ細胞単独の感染時に、ＮＨＤＦ細胞の殺傷を媒介することができたが、ＳＡ駆動のＮＧ−６０６は媒介することができなかったことを示す。
結果は、ＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６はどちらもＴ細胞活性化及び標的細胞溶解を誘導することができたが、動態プロファイルは使用したプロモーターに応じてわずかに異なることを示している。
タイムラプスビデオを得て、組換えＦＡＰ ＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ、ＮＧ−６０３又はＮＧ−６０５による、標的細胞のウイルス性又はＴ細胞媒介溶解性を観察した。ＮＨＤＦ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ、＃Ｃ２９２７）で染色し、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ、＃Ｃ３４５５７）で製造元のプロトコルに従って染色した。染色したＮＨＤＦを、１．３５×１０４ ＤＬＤ又はＳＫＯＶ腫瘍細胞と共培養して、７．５×１０３細胞／ウェルで２４ウェルプレートにプレーティングした。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。次に、細胞を３００ ｎｇ／ｍＬのＦＡＰ ＢｉＴＥで処理するか、１００ ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ−６０３、及びＮＧ−６０５で感染させるか、又は未処置のままにした。２時間のインキュベーションの後、１．５μＭのＣｅｌｌＥｖｅｎｔ Ｃａｓｐａｓｅ ３−７試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ、＃Ｃ１０４２３）に加えて、１００，０００個の染色されたＣＤ３＋Ｔ細胞を必要なウェルに添加した。ビデオは、Ｎｉｋｏｎ ＴＥ ２０００−Ｅ Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立顕微鏡で撮影し、１５分ごとに９６時間撮影した。ビデオのフレームを図２８に示す。結果は、ＥｎＡｄ又はＮＧ−６０３ではなく、組み換えＦＡＰ ＢｉＴＥ及びＮＧ−６０５が、ＮＨＤＦ細胞の急速溶解を誘導することができたことを示す。
同様の実験において、ＮＨＤＦ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ、＃Ｃ２９２５）で染色し、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ、＃Ｃ３４５５７）で製造元のプロトコルに従って染色した。染色したＮＨＤＦを、１．３５×１０４ ＤＬＤ又はＳＫＯＶ腫瘍細胞と共培養して、７．５×１０３細胞／ウェルで２４ウェルプレートにプレーティングした。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。次いで細胞を１００ｐｐｃのＮＧ−６０７、ＮＧ−６０８、ＮＧ−６０９又はＮＧ−６１０で感染させるか、又は未感染のままにした。２時間インキュベートした後、１００，０００個の染色されたＣＤ３＋Ｔ細胞を必要なウェルに加えた。ビデオは、Ｎｉｋｏｎ ＴＥ ２０００−Ｅ Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立顕微鏡で撮影し、１５分ごとに９６時間撮影した。ビデオのフレームを図２９に示す。結果は、全てのウイルスが腫瘍細胞感染（ＲＦＰ、赤色蛍光、陽性）をもたらすが、ＮＧ−６０９及びＮＧ−６１０のみが共培養ＮＨＤＦ細胞の急速溶解を誘導することができたことを示す。
実施例１５
この一連の実験では、ＥｎＡｄ及びＥｐＣＡＭ又はコントロールＢｉＴＥウイルスＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４が腫瘍細胞及び線維芽細胞を含む標的細胞を死滅させる能力を評価した。
ＥｎＡｄ、ＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４によるヒトＴ細胞活性化及びＥｐＣＡＭ陽性標的細胞溶解の特徴付け
ＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下又は非存在下で、ＥｎＡｄ及びＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４が、ＤＬＤ腫瘍細胞を死滅させる能力をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ技術を用いて評価した。ＤＬＤ細胞を１．２×１０４細胞／ウェルで４８ウェルＥプレートにプレーティングした。細胞を１００ｐｐｃでＥｎＡｄに感染させるか、又は未感染のままにする前に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。感染の２時間後、７５，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞を必要なウェルに加えた。ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いて、１５分ごとに標的細胞の細胞傷害性を測定した。結果（図３０）は、ＮＧ−６０１及びＮＧ−６０２が、Ｔ細胞依存的に、有意により迅速なＤＬＤ細胞傷害性をもたらすことを示す。
同様の実験において、ＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下又は非存在下で、ＥｎＡｄ及びＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４がＤＬＤ腫瘍細胞を死滅させる能力を、ＬＤＨ細胞傷害性アッセイを用いて評価した。ＤＬＤ細胞を９６ウェルＵ底プレートに２×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、１００ ｐｐｃ ＥｎＡｄで感染させるか、又は未感染のままにした。感染の２時間後、１５０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞を必要なウェルに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、上清を採取し、感染後０、２４、４８及び７２時間にＬＤＨ細胞傷害性アッセイによって分析した。結果（図３１）は、ＮＧ−６０１及びＮＧ−６０２が、Ｔ細胞依存的に、より急速なＤＬＤ細胞傷害性をもたらすことを示す。
上記のＬＤＨ実験の延長として、細胞を処理後０、２４、４８及び９６時間にも収集し、ＣＤ４５、ＣＤ６９及びＣＤ２５について抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析して、ＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化状態を決定した。結果（図３２）は、ＥｎＡｄ又はコントロールＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４ではなく、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０１及びＮＧ−６０２が、ＢｉＴＥ発現に使用されるプロモーターに依存の動態で、Ｔ細胞活性化を誘導することができたことを示す。
別の実験では、ＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下又は非存在下で、様々な感染多重度（ＭＯＩ）でＤＬＤ腫瘍細胞を死滅させるＮＧ−６０１の能力を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ技術を用いて評価した。ＤＬＤ細胞を２×１０４細胞／ウェルで４８ウェルＥプレートにプレーティングした。細胞を、０．００１から１０まで変動するＭＯＩ（ｐｐｃ）でＮＧ−６０１に感染させるか、又は未感染のままにする前に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。感染の２時間後、１５０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞を必要なウェルに加えた。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いて１５分ごとに標的細胞の細胞傷害性を測定した。結果（図３３）は、ＮＧ−６０１が、０．００１という低いＭＯＩで、Ｔ細胞依存的に、より急速なＤＬＤ細胞傷害性をもたらすことを示す。
同様の実験において、ＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下又は非存在下で、ＥｎＡｄ及びＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４がＳＫＯＶ腫瘍細胞を死滅させる能力を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ技術を用いて評価した。ＳＫＯＶ細胞を１×１０４細胞／ウェルで４８ウェルＥプレートにプレーティングした。細胞をＥｎＡｄ（１００ｐｐｃ）に感染させるか又は未感染のままにする前に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。感染の２時間後、５０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞を必要なウェルに加えた。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いて１５分ごとに標的細胞の細胞傷害性を測定した。結果（図３４）は、この研究の期間にわたってＳＫＯＶ細胞が、ＥｎＡｄ媒介細胞傷害性に対して耐性であることを示唆しているが、ＮＧ−６０１及びＮＧ−６０２はＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下で、ＳＫＯＶ細胞の急速溶解を誘導することができた。
同様の実験において、ＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下又は非存在下で、ＥｎＡｄ及びＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４がＳＫＯＶ細胞を死滅させる能力をＬＤＨ細胞傷害性アッセイを用いて評価した。ＳＫＯＶ細胞を９６ウェルＵ底プレートに２×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、ＥｎＡｄ（１００ ｐｐｃ）で感染させるか、又は未感染のままにした。感染の２時間後、１５０，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞を必要なウェルに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、上清を採取し、感染後０、２４、４８及び７２時間にＬＤＨ細胞傷害性アッセイによって分析した。結果（図３５）は以前のデータと一致し、この時間枠にわたってＳＫＯＶ細胞が、ＥｎＡｄ媒介細胞傷害性に対して耐性であることを示唆しているが、ＮＧ−６０１及びＮＧ−６０２はＣＤ３＋Ｔ細胞の存在下で、ＳＫＯＶ細胞の急速溶解を誘導することができた。
上記のＬＤＨ実験の延長として、細胞を処理後０、２４、４８及び９６時間にも収集し、ＣＤ４５、ＣＤ６９及びＣＤ２５について抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析して、ＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化状態を決定した（図３６）。結果は、ＥｎＡｄ又はコントロールＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４ではなく、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０１及びＮＧ−６０２が、ＢｉＴＥ発現に使用されるプロモーターに依存の動態で、Ｔ細胞活性化を誘導することができたことを示す。
同様の実験で、ＥｎＡｄ及びＮＧ−６０１、ＮＧ−６０２、ＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４が、ＣＤ３＋ＥｐＣＡＭ陰性の一次腹水サンプルからの癌患者由来のＣＤ３＋Ｔ細胞を活性化する能力を評価した。ＥｐＣＡＭ陽性ＤＬＤ細胞を、９６ウェルＵ底プレートに１ウェルあたり１×１０４細胞でプレーティングし、１００，０００個の腹水細胞と共培養した（受け取ったときと変わらず）。細胞を１００ｐｐｃでウイルス粒子に感染させるか、又は未感染のままにした。３７℃で４８時間インキュベートした後、総細胞集団を採取し、ＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現レベルをフローサイトメトリーによって決定した。結果（図３７）は、ＥｎＡｄ又はコントロールＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０３及びＮＧ−６０４ではなく、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ発現ウイルスＮＧ−６０１及びＮＧ−６０２が、患者由来のＣＤ３＋Ｔ細胞のＴ細胞活性化を誘導することができたことを示す。
結果は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥウイルスＮＧ−６０１及びＮＧ−６０２の両方が、Ｔ細胞活性化及び標的細胞溶解を誘導することができたが、使用したプロモーターに応じて動態プロファイルはわずかに異なることを示した。
タイムラプスビデオを得て、組換え型ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ、ＮＧ−６０１又はＮＧ−６０３による標的細胞のウイルス性又はＴ細胞媒介溶解性を観察した。ＮＨＤＦ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ、＃Ｃ２９２７）で染色し、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ、＃Ｃ３４５５７）で製造元のプロトコルに従って染色した。染色したＮＨＤＦを、１．３５×１０４ ＤＬＤ又はＳＫＯＶ腫瘍細胞と共培養して、７．５×１０３細胞／ウェルで２４ウェルプレートにプレーティングした。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。次に細胞を３００ｎｇ／ｍＬのＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥで処理するか、１００ｐｐｃでＥｎＡｄ、ＮＧ−６０１又はＮＧ−６０３に感染させるか、又は未処置のままにした。２時間のインキュベーション後、１．５μＭのＣｅｌｌＥｖｅｎｔ Ｃａｓｐａｓｅ ３−７試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ、＃Ｃ１０４２３）に加えて、１００，０００個の染色されたＣＤ３＋Ｔ細胞を必要なウェルに加えた。ビデオはＮｉｋｏｎ ＴＥ ２０００−Ｅ Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立顕微鏡で撮影し、１５分ごとに９６時間撮影した。ビデオのフレームを図３８に示す。結果は、組換えＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ及びＮＧ−６０５が、ＤＬＤ及びＳＫＯＶ標的細胞の両方の迅速な溶解をもたらすが、ＮＨＤＦは影響を受けないままであることを示す。
実施例１６
この実施例では、ＥｎＡｄ、ＮＧ−６０３、ＮＧ−６０４、ＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６による癌患者からのＦＡＰ＋原発性悪性腹水由来の自己由来腫瘍関連リンパ球の活性化を評価した。さらなる分析に適していると考えられる患者サンプルは、ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＦＡＰ＋細胞を含むものであった。
最初の実験では、患者から得た未精製の（従って、受け取ったときと変わらない）腹水細胞を、１００％腹水中に、Ｕ底９６ウェルプレートの１ウェルあたり２５０，０００細胞で播種した。細胞を１００ｐｐｃでウイルスに感染させ、未処置ウェルをネガティブコントロールとして用いた。ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ及びＥｎＡｄ−ＳＡ−ＧＦＰもまた、感染及び後期ウイルス遺伝子発現をそれぞれ決定するためのレポーターとして実験に含め、顕微鏡写真を図３９に示す。３７℃で５日間インキュベートした後、総細胞集団を採取し、ＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現レベル（図４０Ａ）を決定した。１ウェルあたりの総細胞数は精密計数ビーズを用いて決定した。結果は、ＦＡＰ ＢｉＴＥウイルスＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６が腫瘍関連リンパ球のＴ細胞活性化の有意な増加をもたらしたことを実証している。
上記実験の延長として、複製ウェルを回収し、フローサイトメトリーにより内因性ＦＡＰ＋細胞の数を決定した。１ウェルあたりの総細胞数は精密計数ビーズを用いて決定した。結果（図４０Ｂ）は、腹水サンプル中のＮＧ−６０５及びＮＧ−６０６が自己ＦＡＰ発現細胞数の有意な減少をもたらしたことを示し、これはいくつかのＦＡＰ＋細胞が活性化Ｔ細胞によって死滅させられたことを示唆する。
第２の実験では、癌患者からの未精製の（従って受けとったときと変わらない）腹水細胞を、１００％腹水中、又は１％ヒト血清を補充した培地のいずれかに、Ｕ底９６穴プレートの１ウェルあたり２５０，０００細胞で播種した。細胞を１００ｐｐｃでウイルスに感染させ、未処置ウェルをネガティブコントロールとして用いた。ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ及びＥｎＡｄ−ＳＡ−ＧＦＰもまた、感染及び後期ウイルス遺伝子発現をそれぞれ決定するためのレポーターとして含め、顕微鏡写真を図４１に示す。３７℃で５日間インキュベートした後、総細胞集団を採取し、ＣＤ３＋Ｔ細胞の数（図４２）及びＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の発現レベル（図４３）を決定した。１ウェルあたりの総細胞数は精密計数ビーズを用いて決定した。結果は、この患者について、ＮＧ−６０６ではなく、組換えＦＡＰ ＢｉＴＥ及びＮＧ−６０５が、培地中の腫瘍関連リンパ球のＴ細胞活性化の有意な増加をもたらしたことを実証している。どちらのウイルスも腹水中で活性化を引き起こさなかった。
上記実験の延長として、複製ウェルを回収し、フローサイトメトリーによりＦＡＰ＋細胞の数を決定した（図４４）。１ウェルあたりの総細胞数は精密計数ビーズを用いて決定した。結果は、ＮＧ−６０６ではなく、組換えＦＡＰ ＢｉＴＥ及びＮＧ−６０５が、培地中の自己ＦＡＰ発現細胞数の有意な減少をもたらしたことを示す。どちらのウイルスも腹水中でＦＡＰ＋細胞の減少をもたらさなかった。
実施例１７−材料及び方法
細胞株
ＨＥＫ２９３Ａ、ＤＬＤ、ＳＫＯＶ３、ＭＣＦ７、Ａ４３１、Ａ５４９、及びＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ）は、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ−１６４０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）及びＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）で培養した。増殖培地には、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、英国）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（１０ ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充し、細胞を加湿雰囲気中で３７℃、５％ ＣＯ２で維持した。ウイルス感染及びウイルスプラスミドトランスフェクションのために、細胞を２％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で維持した。組換えＢｉＴＥプラスミドトランスフェクションのために、細胞をＦＢＳなしでＤＭＥＭ中に維持した。標的細胞株のＥｐＣＡＭ発現をフローサイトメトリーによって決定した。
ＥｐＣＡＭ発現安定細胞株の生成
ＥｐＣＡＭ遺伝子のタンパク質配列（配列番号４０７２）は、ＮＣＢＩデータベース及びＯｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｔｄ（Ｏｘｆｏｒｄ、英国）によって合成されたＤＮＡから得た。ＥｐＣＡＭ遺伝子は、ｐＳＦ−Ｌｅｎｔｉ−ＥｐＣＡＭベクターを生成する標準的なクローニング技術によって、ｐＳＦ−Ｌｅｎｔｉベクターにクローニングされた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐＳＦ−ＣＭＶＨＩＶ−Ｇａｇ−Ｐｏｌ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＨＩＶ−Ｒｅｖ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｔｄ）と共に、レンチウイルスＥｐＣＡＭ発現ベクターを伴うＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いてトランスフェクトした。レンチウイルスを含む上清を、４８時間後に回収し、ポリブレン（８μｇ／ｍＬ）と混合した。レンチウイルス／ポリブレン混合物を、ＣＨＯ細胞に添加し、３７℃でインキュベートした。４日目に、上清を７．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含有する培地と交換した。次に安定な変異体をクローン選択し、親細胞株又は安定にトランスフェクトした変異体のＥｐＣＡＭ発現を、ＥｐＣＡＭ又は同位体対照抗体での抗体染色によって決定し、フローサイトメトリーによって分析した。陽性クローンを拡大し、さらなる実験に使用した。
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の調製及びＴ細胞の単離
ＰＢＭＣを、ＮＨＳ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ＵＫ（Ｏｘｆｏｒｄ、英国）から入手した全血白血球円錐体から密度勾配遠心分離（Ｂｏｙｕｍ、１９６８）によって単離した。血液をＰＢＳで１：２に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ（１，０７９ ｇ／ｍＬ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に重層した後、４００ ｇで３０分間、２２℃で低減速で遠心分離した。遠心分離後、ＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳで２回洗浄し（３００ ｇ、室温で１０分間）、１０％ ＦＢＳで補充したＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁した。ＰＢＭＣからＣＤ３陽性Ｔ細胞を抽出するために、非ＣＤ３細胞を、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０−０９６−５３５）を、製造元のプロトコルに従って使用し、除去した。ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞をさらに単離するために、ＣＤ３ Ｔ細胞をＣＤ４＋Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０−０４５−１０１）を使用して、さらにもう１回精製した。
一次腹水及び胸水の処理
卵巣癌、膵臓癌、乳癌及び肺癌を含むがこれらに限定されない進行癌の複数の適応症を有する患者からのインフォームド・コンセントの後、原発性ヒト悪性腹水及び胸水サンプルを、オックスフォード大学病院のチャーチル病院（Ｏｘｆｏｒｄ、英国）から受け取った。この研究は、オックスフォード病理組織学研究センターの研究倫理委員会によって承認された。受け取り次第、細胞画分と液体画分を分離し、液体を直ちに使用するか、又はアリコートを将来の分析のために−２０℃で保存した。細胞画分を、製造元の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（Ｒｏｃｈｅ、英国）で処理した。細胞数及び生存率は、トリパンブルー染色によって決定した。各サンプル中に存在する細胞型を、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ１及びＣＴＬＡ４に対する抗体染色によって決定し、フローサイトメトリーによって分析した。エクスビボでのＴ細胞活性化及び標的細胞溶解実験には、新鮮な細胞と液体を使用した。場合によっては、接着細胞を１０％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で継代し、後で使用するために増殖させた。
ＢｉＴＥのエンジニアリングと産生
ＢｉＴＥは、異なる特異性の２つのｓｃＦｖを柔軟なＧＳリンカーで連結することによって生成された。各ｓｃＦｖは、親モノクローナル抗体由来のＶＨドメイン及びＶＬドメインをリンカーによって連結することによって生成される。各ＢｉＴＥは、哺乳動物の分泌のための免疫グロブリン軽鎖（Ｉｇ）Ｎ末端シグナル配列と、検出と精製のためのＣ末端デカヒスチジン親和性タグを保有した。ＢｉＴＥは、標準的なＤＮＡクローニング技術によって操作され、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター駆動の構成的タンパク質発現及び分泌のためのタンパク質発現ベクター（ｐＳＦＣＭＶ−Ａｍｐ）に挿入された。ｐＳＦ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ又はｐＳＦ−ＣＭＶ−コントロールＢｉＴＥプラスミドＤＮＡを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、リニア、ＭＷ ２５０００、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて以下の条件下でＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした：５５μｇのプラスミドＤＮＡ：１１０μｇ ＰＥＩ（ＤＮＡ：ＰＥＩ比は１：２（ｗ／ｗ））を細胞に加え、３７℃で４時間インキュベートした後、新鮮な無血清ＤＭＥＭと交換し、さらに３７℃、５％ ＣＯ２で４８時間インキュベートした。トランスフェクション効率を確実にするために、細胞をｐＳＦ−ＣＭＶ−ＧＦＰと並行してトランスフェクトした。分泌タンパク質を回収するために、トランスフェクトされた細胞の上清を集め、細胞成分を除去するために、３５０ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上清を１０，０００ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。４７５０ ｇ、４℃で遠心した後、５０倍高い濃度を得るためにフロースルーを用いて保持液の体積を調整した。濃縮タンパク質のアリコートを−８０℃で保存した。
ＢｉＴＥ発現エナデノチュシレブ（ＥｎＡｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）の生成
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−コントロールＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−コントロールＢｉＴＥは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ又はコントロールＢｉＴＥをコードする導入遺伝子カセットを、ギブソンアセンブリ技術を用いた基本的なＥｎＡｄプラスミドｐＥｎＡｄ２．４に直接挿入することによって生成した。導入遺伝子カセットは、５ ’短いスプライスアクセプター配列又は外因性ＣＭＶプロモーターを含み、その後下流にＥｐＣＡＭ又はコントロールＢｉＴＥ ｃＤＮＡ配列及び３’ポリアデニル化配列が続く。挿入された導入遺伝子カセットの概略図を図１８に示す。プラスミドの正しい構築はＤＮＡ配列決定により確認された。プラスミドＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ｐＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−コントロールＢｉＴＥ及びｐＥｎＡｄ２．４−ＳＡ−コントロールＢｉＴＥは、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へのトランスフェクションの前に、酵素ＡｓｃＩによる制限消化によって線状化された。細胞単層における細胞変性効果（ＣＰＥ）の観察によってウイルスの産生をモニターした。広範囲のＣＰＥが観察されたら、３回の凍結融解サイクルでＨＥＫ２９３Ａ細胞からウイルスを回収した。収集した溶解物を段階希釈し、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を再感染させ、単一のプラークを含むウェルを収集することによって、単一のウイルスクローンを選択した。ウイルスストックを増幅するために、感染が完全ＣＰＥに達したら、ＨＥＫ２９３Ａ細胞の連続感染を行った。強力なウイルスストックが増幅されたら、二重塩化セシウムバンディングによってウイルスを精製し、ＥｎＡｄ−ＣＭＶＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−コントロールＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ−ＳＡ−コントロールＢｉＴＥウイルスストックを生成した。製造元の指示に従って、これらのストックをＴＣＩＤ ５０及びピコグリーンアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって力価測定した。
上清の調製
ＢｉＴＥを介したサイトカインの放出を評価するために、ＤＬＤ細胞（２０，０００個）を、９６ウェル平底プレート中で単独で、又は２ｎｇ／μＬのＥｐＣＡＭ又はコントロールＢｉＴＥと共に、１００，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞とプレーティングした。３７℃、５％ ＣＯ２で４８時間インキュベートした後、上清を回収し、細胞成分を遠心分離で除去し、アリコートを−２０℃で保存した。組換えウイルスからのＢｉＴＥ導入遺伝子発現を評価するために、ＨＥＫ２９３Ａ（１ｅ６）又はＤＬＤ細胞（１．２ｅ６）を、ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ−ＣＭＶコントロールＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ−ＳＡ−コントロールＢｉＴＥ又は１００ｖｐ／細胞のＥｎＡｄで感染させた。細胞を７２時間培養し、その時点で細胞変性効果（ＣＰＥ）が進行した。上清を回収し、３００ ｇで５分間遠心して細胞片を除去し、将来の分析のために−２０℃で保存した。
イムノブロッティング
ドットブロットを用いて、プラスミドトランスフェクションから産生された組換えＢｉＴＥの濃度を測定した。各ＢｉＴＥ及びタンパク質標準（１０×Ｈｉｓタグ付き（Ｃ末端）ヒトカテプシンＤ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃５５６７０４）の２倍段階希釈物を調製した。タンパク質標準のモル濃度は、１００μｇ／ ｍＬのＢｉＴＥ濃度を表すように調整した。各サンプル及びタンパク質標準物質２μＬを、ニトロセルロース膜に直接塗布した。膜を風乾し、Ｃ末端Ｈｉｓタグタンパク質を検出するために、α−６ｘＨｉｓ（Ｃ末端）抗体（１：５０００、クローン３Ｄ５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国、＃４６−０６９３）でブロッキング及びプローブし、続いて洗浄して抗マウス二次抗体（１：１００００、Ｄａｋｏ、＃Ｐ０１６１）とインキュベートし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃３４０７５）を製造元の指示に従って、適用することによって検出した。ウイルス感染ＨＥＫ２９３Ａ細胞の上清を、ＢｉＴＥ発現についてウエスタンブロッティングによって分析した。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、製造元のプロトコル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に従って、ニトロセルロース膜に転写した。膜をさらに上記のドットブロットプロトコルと同様に処理した。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＥｐＣＡＭ結合を評価するために、ヒトＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ−１タンパク質（５０ ｎｇ／ウェル、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ、＃１０６９４−Ｈ０２Ｈ−５０）で、４℃で一晩コーティングすることによって、ＥＬＩＳＡプレートを調製した。プレートを５％ ＢＳＡで周囲温度で１時間ブロッキングした後、希釈したＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ−、コントロールＢｉＴＥ−及び空のｐＳＦ−ＣＭＶベクタートランスフェクトＨＥＫ２９３Ａ上清とインキュベートした（２時間、室温）。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、その後に起こる結合ステップの後毎に洗浄した。プレートを抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体（１：５０００、クローン３Ｄ５、＃４６−０６９３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国）と共に室温で１時間、続いてＨＲＰ結合抗マウスＦｃ（１：１０００、ＰＢＳ／５％ミルク、Ｄａｋｏ）と共に室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ検出は３．３．５．５’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＢ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して行い、反応を停止させるために停止溶液を使用した。４５０ｎｍでの吸光度をＷａｌｌａｃ １４２０プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、データをＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．０．７ｒ２ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ Ｉｎｃ．、米国）で処理した。異なる細胞集団の分類のために、ＣＤ４５（ＨＩ３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｂ（ＩＣＲＦ４４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＥｐＣＡＭ（９Ｃ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＦＡＰ（４２７８１９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に特異的な抗体を用いた。Ｔ細胞集団の分析には、異なる蛍光色素分子に結合した以下の抗体クローンを使用した：ＣＤ６９（ＦＮ５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５（ＢＣ９６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＦＮγ（４Ｓ．Ｂ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、αＣＤ１０７ａ抗体（Ｈ４Ａ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３（ＨＩＴ３ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４（ＯＫＴ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８ａ（ＨＩＴ８ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＤ１（Ｈ４Ａ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。各場合において、適切なアイソタイプ対照抗体を使用した。
ヒトＴ細胞活性化の特徴付け
ＣＤ６９及びＣＤ２５発現レベル
組み換えＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ又はＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥウイルスがＴ細胞活性化を誘導する能力は、ＣＤ６９及びＣＤ２５の表面発現によって評価された。ＰＢＭＣ又は腹水サンプル由来のヒトＣＤ３細胞（９６ウェル平底プレートで７５，０００細胞／ウェル）を、培地のみ、ＥｐＣＡＭもしくはコントロールＢｉＴＥタンパク質（２ｎｇ／μＬ）又は組換えウイルス（１００ｖｐ／細胞）の存在下で、単独で又はＤＬＤ、ＳＫＯＶ、ＣＨＯ、ＣＨＯＥｐＣＡＭもしくは腹水標的細胞（１５，０００個）と共に培養した。場合によっては、抗ＰＤ１（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、＃ｈｐｄ１ｎｉ−ｍａｂ７）抗体を終濃度２．５μｇ／ ｍＬで添加した。Ｔ細胞活性化のポジティブコントロールとして、ＣＤ３細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃１１１３１Ｄ）と共にインキュベートした。特に明記しない限り、細胞を３７℃で２４時間培地で培養し、続いて無酵素細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、＃１３１５１０１４）を用いて回収した。全細胞をＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ３、ＣＤ４又はＣＤ８の表面発現について抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。Ｔ細胞活性化（ＣＤ６９、ＣＤ２５）に対する腹水の影響を、ＲＰＭＩ−１６４０又は悪性腹水サンプルから分離された液体中で、プレート固定化ＣＤ３抗体（７．５μｇ／ ｍＬ、ＨＩＴ３ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３００３１３）とインキュベートすることによって、ＣＤ３精製ＰＢＭＣ（１００，０００個）をポリクローナル活性化することによって調査した。
ＩＦＮγの発現
ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥがＴ細胞活性を誘導する能力は、Ｔ細胞をＤＬＤ細胞（平底９６ウェルプレートで、２００，０００個のＣＤ３細胞／ウェル、４０，０００個のＤＬＤ細胞／ウェル）及び２ｎｇ／μＬの組換えＥｐＣＡＭ又はコントロールＢｉＴＥと、６時間共培養することによる、ＩＦＮγ発現によって評価された。ポジティブコントロールとして、Ｔ細胞を可溶性ＰＭＡ／イオノマイシン細胞活性化カクテル（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃４２３３０１）で刺激した。Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を回収の５時間前に培地に添加し、その時点でＣＤ３＋Ｔ細胞を回収し、細胞内でＩＦＮγ発現について染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
Ｔ細胞増殖
Ｔ細胞増殖を研究するために、１００，０００個のＣＦＳＥ標識（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｃ３４５５４）ＣＤ３＋Ｔ細胞を、２ｎｇ／μＬのＥｐＣＡＭ又はコントロールＢｉＴＥと共に、９６ウェルプレートフォーマットで、２０，０００個のＤＬＤ細胞とインキュベートした。
共培養５日後、細胞をＣＤ３、ＣＤ４、又はＣＤ８で染色し、生存細胞ＣＤ３＋Ｔ細胞のＣＦＳＥ蛍光をフローサイトメトリーで測定し、総細胞数を精密計数ビーズを用いて正規化した（５０００／ｗｅｌｌ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃４２４９０２）。ＦｌｏｗＪｏ ｖ７．６．５ソフトウェアの増殖機能を用いて、蛍光データを分析しモデル化した。データは、増殖周期に入った元の細胞の割合（％除算）又は元の集団の細胞が受けた細胞分裂の平均数（分裂指数）として表される。
ＣＤ１０７ａ脱顆粒
培地単独又は２ ｎｇ／μＬのコントロールもしくはＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下、平底９６ウェルプレートでＤＬＤ細胞（１５，０００細胞／ウェル）を７５，０００個のＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養した。αＣＤ１０７ａ又はアイソタイプ対照抗体を、培地に直接添加した。モネンシン（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、３７℃及び５％ ＣＯ２で１時間インキュベートした後、その後さらに５時間インキュベートした後に添加した。続いて細胞を採取し、ＣＤ３、ＣＤ４又はＣＤ８について染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
サイトカイン放出
ＤＬＤ／ＰＢＭＣ又は胸水細胞の培養物から採取した上清中のサイトカインを、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘヒトＴヘルパーサイトカインパネル（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃７４０００１）及び製造元の指示に従ってフローサイトメトリーを用いて定量化した。解析に含まれるサイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮγ及びＴＮＦαがある。
インビトロ標的細胞細胞傷害性アッセイ
組換えＢｉＴＥ又はウイルスによって媒介される標的細胞の細胞傷害性は、ＬＤＨ放出又はＭＴＳアッセイによって評価された。標的細胞（ＤＬＤ、ＳＫＯＶ、ＨＴ−２９、Ａ４３１、Ａ５４９、ＰＣ３、ＣＨＯ、ＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ）を、培地単独、希釈上清又はウイルス（１００ｖｐ／細胞）の存在下で、平底９６ウェルプレートでＣＤ３、ＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ ５：１）と共培養した。２４時間共培養した後（特に明記しない限り）、上清と細胞を回収し、細胞傷害性を、ＬＤＨアッセイ（ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞傷害性アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ１７８０）又はＭＴＳ生存アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ３５８０）により、製造元の指示に従って決定した。ウイルス感染ＤＬＤ細胞から産生されたＢｉＴＥの量は、希釈されたウイルス上清によって誘導された細胞傷害性を、組換えＢｉＴＥを用いて生成された標準曲線のそれと比較することによって決定された。
ウイルスの腫瘍溶解活性を評価するために、増加するｖｐ／細胞（５倍連続希釈、１００〜５．１２ｅ−５ｖｐ／細胞まで）で感染させるか、又は感染していないままにしておく前に、ＤＬＤ細胞を、９６ウェルプレート（２５，０００細胞／ウェル）に３７℃及び５％ ＣＯ２で１８時間播種した。５日目にＭＴＳ生存率アッセイによりＤＬＤ細胞傷害性を測定した。Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）に統合された４パラメーター非線形適合モデルを用いて、用量応答曲線をフィットさせ、ＩＣ５０を決定した。細胞生存率は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＤＰテクノロジー（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてリアルタイムでモニターした。ＤＬＤ、ＳＫＯＶ３又はＭＣＦ７細胞を、４８ウェルＥプレートに１２，０００細胞／ウェルでプレーティングした。細胞をＢｉＴＥ（２ｎｇ／μＬ）で処理するか又はウイルス（１００ｖｐ／細胞）で感染させるか又は未処置のままにする前に、プレートを、３７℃、５％ ＣＯ２で１８時間インキュベートした。感染の２時間後、７５，０００個のＣＤ３＋細胞を必要なウェルに加えた。細胞インピーダンスは、１６０時間までの間１５分毎に測定された。エクスビボでの細胞傷害性アッセイでは、腹水又は胸水サンプルからの未精製細胞を腹水に再懸濁し、平底９６ウェルプレートにプレーティングした（１．５ｅ５／ウェル）。３７℃、５％ ＣＯ２で記載された期間インキュベートした後、上清をＬＤＨアッセイで分析するか、全細胞を細胞解離緩衝液で回収し、ＣＤ３、ＣＤ２５、及びＥｐＣＡＭで染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＰＤ１ブロッキング実験には、抗ＰＤ１抗体（２．５μｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、＃ｈｐｄ１ｎｉ−ｍａｂ７）抗体を含めた。
ウイルスゲノム複製及びｑＰＣＲ
ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−コントロールＢｉＴＥ、ＥｎＡｄ−ＳＡコントロールＢｉＴＥ又はＥｎＡｄがそれぞれのゲノムを複製する能力を、１００ｖｐ／細胞で感染する前に、ＤＬＤ細胞を２４ウェルプレート（１５０，０００細胞／ウェル）に１８時間、３７℃、５％ ＣＯ２で播種することによって分析した。感染の２４及び７２時間後にウェルを採取し、ＰｕｒｅＬｉｎｋゲノムＤＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｋ１８２００１）を製造元のプロトコルに従って使用し、ＤＮＡを精製した。全ウイルスゲノムを、特異的プライマー−プローブセット（プライマー：ＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＧＧＡ／ＣＧＧＧＣＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＡ、プローブ：ＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡＡＧＣＡＴＣＣＴ）を用いてＥｎＡｄヘキソンに対するｑＰＣＲにより定量化した。
顕微鏡検査
明視野及び蛍光画像をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２５顕微鏡で捕捉した。タイムラプスビデオを得て、ＥｎＡｄ又はＥｎＡｄ−ＣＭＶＥｐＣＡＭＢｉＴＥによる標的細胞のウイルス性又はＴ細胞媒介溶解性を観察した。感染していない細胞をネガティブコントロールとして使用した。ＮＨＤＦ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ｃ２９２７）で染色し、ＣＤ３＋細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ｃ３４５５７）で製造元のプロトコルに従って染色した。染色したＮＨＤＦを２４ウェルプレートに７，５００細胞／ウェルで、ＳＫＯＶ３と共培養して１３，５００細胞／ウェルで、プレーティングした。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で１８時間インキュベートした。次に、細胞を３００ｎｇ／ｍＬのＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥで処理するか、１００ ｖｐ／細胞のＥｎＡｄ又はＥｎＡｄ２．４−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥで感染させるか、未処置のままにした。２時間のインキュベーション後、１．５μＭのＣｅｌｌＥｖｅｎｔ Ｃａｓｐａｓｅ ３−７試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ｃ１０４２３）に加えて、１００，０００個の染色ＣＤ３＋を必要なウェルに加えた。画像をＮｉｋｏｎ ＴＥ ２０００−Ｅ Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立顕微鏡（１０倍光学対物レンズ）で、１５分間隔で９６時間撮影した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、タイムラプスビデオ（１２フレーム／秒）を生成した。
統計
比較されている２つ以上の実験条件のすべての場合において、統計分析はＴｕｋｅｙ’ｓ Ｐｏｓｔ Ｈｏｃ分析を用いた一元配置分散分析検定を用いて行われた。全てのデータは平均±ＳＤとして提示されている。使用した有意水準はＰ＝０．０１〜０．０５（＊）、０．００１〜０．０１（＊＊）、０．０００１〜０．００１（＊＊＊）であった。明記しない限り、全てのインビトロ実験は３回行った。
実施例１８−ＥｐＣＡＭを標的とするＢｉＴＥの生成及び産生
ＥｐＣＡＭを標的とするＢｉＴＥは、ＣＤ３ε及びＥｐＣＡＭに特異的な２つのｓｃＦｖを柔軟なグリシン−セリン（ＧＳ）リンカーと連結することによって操作された。ＣＤ３ε及び無関係の抗原（百日咳菌の線維状赤血球凝集素アドヘシン（ＦＨＡ））を認識するコントロールＢｉＴＥもまた産生した。両方のＢｉＴＥは、哺乳動物分泌のためのＮ末端シグナル配列及び検出及び精製のためのＣ末端デカヒスチジン親和性タグを含むように操作された（図４５Ａ）。組み換えＢｉＴＥの機能を特徴付けるために、それらをＣＭＶ最初期プロモーター（それぞれｐＳＦ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ及びｐＳＦ−ＣＭＶ−コントロールＢｉＴＥ）の転写制御下で、発現ベクターにクローニングした。
接着性ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３Ａ）に発現ベクターをトランスフェクトし、上清を回収し、さらなる分析のために５０倍に濃縮した。産生されたＢｉＴＥの量を見積もるために、サンプルを段階希釈し、抗Ｈｉｓを用いて、標準としてデカヒスチジンタグ付きカテプシンＤを用いるドットブロットで評価した。このようにして、上清中に産生されたＢｉＴＥのレベルを、（１．８ｅ７ ＨＥＫ２９３Ａ細胞の）トランスフェクションの４８時間後に、約２０μｇ／ｍＬであると推定することができた。
（図４６Ａ）。コントロールＢｉＴＥではなく、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの組換えＥｐＣＡＭタンパク質への特異的結合が、ＥＬＩＳＡによって示された（図４６Ｂ）。
実施例１９−組換えＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥによるヒトＴ細胞活性化の特徴付け
ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞を活性化するための組換えＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥタンパク質の能力は、表面にＥｐＣＡＭを発現することが知られているヒトＤＬＤ結腸直腸癌細胞の培養物に未刺激ヒト初代ＣＤ３＋細胞を添加することによって評価した（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、２００８）。２．５ｎｇ／ｍｌのＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ（形質導入ＨＥＫ２９３Ａ細胞からの上清として）の添加は、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の有意な増加をもたらした（図４５Ｂ及びＣ）が、コントロールＢｉＴＥは効果がなかった。
腫瘍細胞の非存在下でのＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥへのＣＤ３細胞の曝露は、ＣＤ６９及びＣＤ２５の非常に適度な増加を与え、これはＣＤ３の抗体媒介クラスタリングが、この抗ＣＤ３結合による完全な活性化に不可欠であることを示す。腫瘍細胞の存在下でのＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥによって刺激されたＴ細胞もまた、ガンマインターフェロンの産生（図４５Ｄ）及び細胞増殖（図４５Ｅ）の有意な増加を示したが、コントロールＢｉＴＥは効果がなかった。Ｔ細胞活性化の目的は、脱顆粒媒介細胞傷害性を引き起こすことであり、表面ＣＤ１０７ａ／ＬＡＭＰ１（脱顆粒を示す、Ａｋｔａｓら）の発現は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥによって強く上方制御されたが、コントロールによっては上方制御されなかった（図４５Ｆ）。
ＤＬＤ細胞の存在下でのＰＢＭＣ由来Ｔ細胞のＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ媒介活性化後のサイトカインの放出は、サイトカインビーズアレイを用いたフローサイトメトリーによって特徴付けられた。以前のように、コントロールＢｉＴＥはほとんど活性を示さなかったが、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥは高レベルのＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ガンマインターフェロン及びＴＮＦを含むいくつかのサイトカインの放出を引き起こした（図４５Ｇ）。ＩＬ−２、ガンマインターフェロン、及びＴＮＦの産生は一般に、Ｔｈ１反応に関連しているが、ＩＬ−６及びＩＬ−１０はＴｈ２反応に関連していることがより多い（Ｍｏｓｍａｎｎ＆Ｓａｄ、１９９６）。
実施例２０−組換えＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの特異性
ほとんどのヒト上皮細胞はＥｐＣＡＭを発現するため、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの効果が
抗原特異的であるかどうか評価するために、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）をレンチウイルスベクターを用いて操作し、その表面にヒトＥｐＣＡＭを発現させた。ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ及びＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞の存在下では、外因的に添加されたＰＢＭＣ由来Ｔ細胞は、強い活性化（ＣＤ２５発現による評価、図４７Ａ参照）及び親ＣＨＯ対象細胞及びコントロールＢｉＴＥには見られない、関連する細胞傷害性（図４７Ｂ）を示した。これは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの細胞傷害性が抗原特異的であることを示している。
次に、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥが様々な腫瘍細胞を死滅させるかどうか、及び観察されたＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを介した細胞傷害性のレベルがＥｐＣＡＭ発現の密度に依存するかどうかを評価した。ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの存在下でのＴ細胞の細胞傷害性を６つの異なる癌細胞株において測定し、最大の細胞傷害性がＤＬＤ及びＡ４３１において、最小の細胞障害性がＡ５４９及びＰＣ３において観察された（図４７Ｃ）。これは、Ａ５４９細胞及びＰＣ３細胞が最も低いレベルを示し、ＤＬＤが最も高いレベルを示し、（フローサイトメトリーによって決定される）ＥｐＣＡＭの表面レベルとの緩やかな関連を示した（図４７Ｄ）。これは、ＥｐＣＡＭ発現の存在及びレベルが、細胞傷害性の程度に影響を与えることを示唆しているが、他の要因（おそらくグランザイム媒介アポトーシスに対する細胞の固有の耐性）も全体的な細胞殺傷レベルの決定において役割を果たす。
実施例２１−ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのＢｉＴＥ媒介活性化
どのＴ細胞型がＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥによって活性化されるかを決定するために、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞をＤＬＤ細胞とインキュベートし、フロー解析の前にＢｉＴＥを用いて活性化した。活性化ＣＤ４細胞の割合は一般的にわずかに高かったが、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方がＣＤ６９及びＣＤ２５の高レベルの発現を示した（図４９Ａ）。ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ媒介Ｔ細胞増殖をＣＦＳＥ染色を用いて評価し（図４９Ｂ）、ＣＤ１９７ａ／ＬＡＭＰ１の発現による脱顆粒（図４９Ｃ）、そして再び同様のレベルの活性化がＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方で見られた。最後に、達成された腫瘍細胞の細胞傷害性のレベルを、精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットを活性化するためにＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを用いて比較した。すべてのＴ細胞調製物は同様の細胞傷害性を示し（図４９Ｄ）、これはＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方が観察されたＢｉＴＥ媒介細胞傷害性に寄与し得ることを示した。
実施例２２−腫瘍溶解性アデノウイルスであるエナデノチュシレブ（ＥｎＡｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）からのＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの発現
エナデノチュシレブ（ＥｎＡｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）（ＥｎＡｄ）は、腫瘍溶解性アデノウイルスであり、モザイクＥ２Ｂ領域、ほぼ完全なＥ３欠失及びＥ４ｏｒｆ４にマッピングされたより小さなＥ４欠失を有するグループＢタイプ１１及びタイプ３アデノウイルスのキメラである（Ｋｕｈｎ ２００８）。現在癌治療のためにいくつかの初期段階臨床試験を受けているこのウイルスは、優れた全身薬物動態及び有望な臨床活性を、導入遺伝子のコード化及び発現の可能性と組み合わせている（Ｃａｌｖｏ ２０１４、Ｂｏｎｉ ２０１４）。ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥは、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリによってウイルス骨格に挿入されたシャトルベクターを使用して、ファイバー遺伝子のすぐ下流のＥｎＡｄ内にコードされた（図１８）。ＢｉＴＥは、ＣＭＶ最初期プロモーター（ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭ ＢＩＴＥ）の転写制御下に置くか、アデノウイルス主要後期プロモーターのスプライスアクセプター部位（ＭＬＰ；ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ）の下流に置いた。前者の構成では、ウイルスが首尾よく細胞に感染するときはいつでもＢｉＴＥが発現されるべきであるのに対して、ＭＬＰスプライスアクセプター部位からの発現は、ウイルス複製を許容する細胞においてＭＬＰが活性化されるときにのみ起こる。２つの対応する対照ウイルスを生成するために（ＣＤ３及びＦＨＡを認識する）コントロールＢｉＴＥも導入した。
ウイルスをクローン化し、ＨＥＫ２９３Ａ細胞中で救済し、各々の大バッチをハイパーフラスコ中で調製して、塩化セシウムバンディングにより２回精製した。親ＥｎＡｄ及び組換えＢｉＴＥウイルスを用いたＤＬＤの感染は、試験したすべての時点で同量のウイルスゲノム（ｑＰＣＲにより測定）を生じ、ＢｉＴＥ導入遺伝子がウイルス複製動態を妨害しないことを示した（図５１Ａ）。次に、ヒトＴ細胞が存在しない場合のウイルスの複製と腫瘍溶解特性を調査した。ＤＬＤ細胞を、増加するウイルス粒子（ｖｐ）／細胞でウイルスバッチに感染させ、５日目に細胞傷害性をＭＴＳアッセイによって測定した。ＣＭＶプロモーター又はスプライスアクセプターによって調節されるＥｐＣＡＭ及びコントロールＢｉＴＥを有するものを含むすべての組換えウイルスは、親ウイルスと区別できない細胞傷害活性を示し、遺伝子改変がウイルスの固有の腫瘍溶解活性を変化させなかったことを示す（図５１Ｂ）。
ＢｉＴＥ発現及び分泌を評価するために、ＢｉＴＥ発現ＥｎＡｄウイルスを用いて、ＨＥＫ２９３Ａ細胞に感染させ、７２時間上清を抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより調べた。図５１Ｃに示すように、４つ全てのウイルス（２つはコントロールＢｉＴＥを発現し、２つはＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを発現する）は、上清中に分泌された類似レベルのＢｉＴＥを示した。
実施例２３−ウイルス産生されたＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥによるＥｐＣＡＭ陽性細胞の選択的殺傷
ＥｎＡｄ−ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ感染ＨＥＫ２９３Ａ細胞の上清を、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の有無にかかわらず、ＣＨＯ及びＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞の培養液に加え、Ｔ細胞活性化及びＣＨＯ／ＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞に対する細胞傷害性を２４時間後に測定した。ＣＨＯ細胞の場合、ＣＤ２５のＴ細胞発現の増加は見られず（図５１Ｄ）、いかなる処理でも細胞傷害性は観察されなかった（図５１Ｅ）。しかしながら、ＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞と共にインキュベートしたＴ細胞は、ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ又はＥｎＡｄ−ＳＡ−ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥウイルスのいずれかに感染したＨＥＫ２９３Ａ細胞からの上清を用いてＣＤ２５発現の実質的な増加を示した（図５１Ｄ）。予想通り、これは、ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ又はＥｎＡｄ−ＳＡ−ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥウイルスのいずれかに感染した２９３Ａ細胞からの上清の存在下で、Ｔ細胞を添加した場合にのみ、ＣＨＯ−ＥｐＣＡＭ細胞に対する選択的細胞傷害性に変換された（図５１Ｅ）。決定的には、Ｔ細胞の非存在下で、又はその細胞がコントロールＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄに感染していたＨＥＫ２９３Ａからの上清を使用する場合、細胞傷害性はなかった。
実施例２４−ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄの優れた細胞傷害性
一部の細胞、特にＳＫＯＶ３卵巣癌細胞は部分的に耐性があり、よりゆっくりと死滅するが、ＥｎＡｄはほとんどの癌細胞を直接腫瘍溶解によって迅速に死滅させる（Ｋｕｈｎ ２００８）。従って、Ｔ細胞の細胞傷害性活性化をもたらすＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを分泌するためにＥｎｄを武装させることの結果は、ＳＫＯＶ３細胞において特に明白であり得ると推論した。それゆえ、細胞は播種の２４時間後にウイルス（１００ ｖｐ／細胞）にさらされ、細胞死はｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムによってモニターされた。ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞を２時間後にＳＫＯＶ３細胞培養液に添加した（又は添加しない）。Ｔ細胞の非存在下では、腫瘍細胞は約７２時間増殖したが（図５３Ａの増加するＣｅｌｌ Ｉｎｄｅｘシグナルにより明白）、その後細胞増殖はプラトーに達し、ウイルス感染とは無関係に、少なくとも１６０時間まで安定していた。親ＥｎＡｄを含む試験したウイルスはすべて、測定した時間中に観察可能な標的細胞の細胞傷害性を誘導しなかった。しかし、ＰＢＭＣ由来のＴ細胞と共培養すると、ＣＭＶとＳＡの両方のＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ武装ウイルスは、Ｔ細胞の添加後ＣＭＶ駆動の誘導溶解は１６時間以内、ＳＡは４４時間以内など、迅速なＳＫＯＶ３溶解を誘導する（図５３Ｂ）。重要なことに、親ＥｎＡｄ又は非特異的ＢｉＴＥ対照ウイルスは、Ｔ細胞を添加したとしても、この期間内に標的細胞溶解を示さなかった。この結果は、感染後２４、４８及び９６時間に細胞傷害性を測定し、上記と同一の共培養を設定したＬＤＨアッセイによって確認された（図４８）。これらの結果は、ウイルスを発現するＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥが、コントロールＢｉＴＥウイルスよりも有意に速い速度で細胞傷害性を誘導した、ＤＬＤ細胞における同様の知見によってさらに支持される（図５０Ａ＋Ｂ）。
標的細胞の細胞傷害性が、Ｔ細胞活性化を介して媒介されることを確認するために、ＣＤ３細胞を各時点で採取し、活性化状態を、細胞障害性に対して観察された同様の発現動態を示す、ＣＤ６９及びＣＤ２５発現によって決定した（図５３Ｃ及びＤ、図５０Ｃ及びＤ）。感染ＤＬＤ細胞から産生されたＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥのおおよその量は、感染ＤＬＤ上清によって誘導された細胞傷害性（Ａｂｓ４９０）を、公知量の組換えＢｉＴＥによって誘導された細胞傷害性と比較することによって決定した（すなわち標準曲線（Ａｂｓ４９０）の作成）。ＣＤ３精製ＰＢＭＣ（１：５）と共培養したＤＬＤを、組換えＢｉＴＥ（図５０Ｅ）又は感染したＤＬＤ上清（図５０Ｆ）とインキュベートし、２４時間でＬＤＨ放出を測定した。これは、ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ及びＥｎＡｄ−ＳＡＥｐＣＡＭＢｉＴＥのそれぞれについて、１００万個あたり１６５μｇ及び５０μｇのＤＬＤで、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥが産生されたことを決定することを可能にする。ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥのＥＣ５０は、７．４ｎｇ／ｍｌであり（図５０Ｅ及びＦ）、従ってＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥは治療用量に達すると思われるレベルで組換えウイルスによって産生される。
ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ発現ＥｎＡｄの細胞傷害性は、タイムラプスビデオ顕微鏡により可視化された。ＳＫＯＶ３腫瘍細胞（非標識）を、カスパーゼ染色剤（ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ Ｃａｓｐａｓｅ カスパーゼが活性化されると、３−７試薬は緑色の染色を生じる）の存在下で、正常ヒト線維芽細胞（ＥｐＣＡＭ陰性、赤色標識、非標的対照細胞として機能）及びＰＢＭＣ由来のＴ細胞（青色標識）と共インキュベートした。また、外因性Ｔ細胞と組み合わせたＥｐＣＡＭ ＢＩＴＥ発現ＥｎＡｄの組み合わせは、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞に劇的な細胞傷害性を与え、これはＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥに感染するとアポトーシスの強い誘導を示したが、親ＥｎＡｄの場合は示さなかった。重要なことに、共培養におけるＥｐＣＡＭ陰性のＮＨＤＦは終始生存可能であった。ＳＫＯＶ３ビデオからの異なる時点での代表的な蛍光画像を図５３Ｅに示す。ＮＨＤＦと共培養したＤＬＤ細胞（これは本質的にウイルスに対してより敏感である）を示す同等のタイムラプスビデオもまた示されている。
実施例２５−ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥは、免疫抑制を克服し、内因性Ｔ細胞を活性化し、悪性腹膜腹水中の内因性腫瘍細胞を死滅させることができる
ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞と原発性線維芽細胞（コントロールとして、非ＥｐＣＡＭ発現細胞）を含む３つの悪性腹膜腹水サンプルの臨床サンプルをエクスビボで増殖させ、混合した初代細胞集団をＰＢＭＣ由来Ｔ細胞とインキュベートし、培養液中の遊離ＢｉＴＥ又は１００ ｖｐ／細胞のＥｎＡｄ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥで処理した。７２時間後、ＥｐＣＡＭ陽性標的細胞（図５５Ａ）又は非標的線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）陽性線維芽細胞（図５５Ｂ）のレベルをフローサイトメトリーで測定した。Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ２５発現を測定することによって分析した（図５５Ｃ）。遊離ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ及びＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ発現ウイルスは、Ｔ細胞活性化を誘導し、ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞の枯渇を引き起こし、初代ＦＡＰ陽性（ＥｐＣＡＭ陰性）線維芽細胞は数に変化を示さなかった。これはすべての患者のサンプルで観察され、他の治療法はいずれも有意な効果を示さなかった。これは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ（又はそれをコードする腫瘍溶解性ウイルス）が、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞によるヒト卵巣腹水腫瘍細胞に対する活性化及び選択的細胞傷害性を媒介することができることを示す。
悪性滲出液は、後期転移性癌患者に一般的に見られる免疫反応が抑制された潜在的な免疫寛容の環境を表している可能性が高い。この仮説を検証するために、我々は、培養液中の抗ＣＤ３抗体又は腹膜悪性腫瘍を有する５人の患者からの１００％腹水の存在で、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞をポリクローナルに刺激した。ＲＰＭＩ培地中で抗ＣＤ３抗体はＣＤ２５とＣＤ６９の両方に約５０％のＴ細胞陽性を与えたが、抗体の減少により決定されたＴ細胞の活性化を弱めるように見える腹水の存在は、ＣＤ６９／ＣＤ２５発現の抗体上昇を媒介し、これは患者の体液＃２について特に顕著であった（図５６Ａ）。これは、腹水の成分が免疫抑制又は寛容効果を発揮し得るという我々の考えを支持する。しかしながら、この活性化マーカーの増加における減弱は、Ｔ細胞脱顆粒の抑制とは相関せず、腹水中のＣＤ１０７ａの表出化は培養液中のそれと類似していた（図５６Ｂ）。その結果、ＢｉＴＥはＴ細胞免疫抑制の腫瘍微小環境関連メカニズムを回避することが可能である（Ｎａｋａｍｕｒａ＆Ｓｍｙｔｈ、２０１６）。
そこで、免疫抑制性腹水の存在下で、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞及びＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥが、標的細胞の細胞傷害性を媒介する能力を調査した。細胞傷害性は患者の腹水＃２の存在下で、約８時間の遅れを示したが、腹水１及び２とインキュベートしたＴ細胞は、ＲＰＭＩ培地中での場合と同様に、ヒト乳腺癌ＭＣＦ７細胞株の溶解を誘導した（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを用いて測定）（図５６Ｃ）。存在する免疫抑制液及び腫瘍細胞に加えて、腹水は腫瘍関連リンパ球及び腫瘍間質の支持細胞を含み、内因性患者由来Ｔ細胞のＢｉＴＥ媒介活性化を試験するためのユニークな腫瘍様モデルシステムを提供する。全内因性細胞及び腹水を遊離組換えＢｉＴＥと共に２４時間インキュベートした後、患者のＴ細胞の活性化を評価した（図５６Ｄ）。臨床的に非常に関連性の高いこの設定では、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ（コントロール対照物ではない）は、単純培地中よりも１００％腹水中で実験を行った場合、ＣＤ２５は低レベルではあるが、ＣＤ６９及びＣＤ２５発現を誘導した。これらのデータは、内因性Ｔ細胞を活性化するために、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥが腹膜腹水の少なくともいくつかの免疫抑制効果を克服することができることを示唆している。細胞傷害性は、ＬＤＨの放出を測定することによって評価され、実験が培地中でも１００％腹水中でも行われたときの両方で、ＢｉＴＥは有意な上昇を引き起こした。これは、いくつかの腹水細胞がＢｉＴＥを介した細胞傷害性によって死滅したことを示すが、一次腹水中に複数の細胞タイプが存在する中で、腫瘍細胞のどの部分が死滅したかを画定するのは不可能である。
実施例２６−ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄは、内因性Ｔ細胞を活性化して悪性胸水中の内因性腫瘍細胞を死滅させることができる
臨床的に関連性のある別の状況で、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ発現ウイルスの影響を調べるために、様々な悪性腫瘍患者から胸水のサンプルをいくつか入手した。初回スクリーニング時（例を図５２に示す）には、さらなる分析に適していると考えられるサンプルは、ＣＤ３及びＥｐＣＡＭ陽性細胞を含むものであった。最初の単離後に内因性Ｔ細胞によるＰＤ１の発現も評価したところ、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の１０％のみがＰＤ１を発現するのに対して、悪性滲出液サンプルＴ細胞はすべてＰＤ１に対して少なくとも４０％陽性であり、時に１００％にまで高く達することもあった（図５４）。未精製の全細胞（遠心分離によって単離し、再懸濁した）を、５００ｎｇ／ｍＬの遊離ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ又は１００ｖｐ／細胞ウイルスをコードするＢｉＴＥの存在下で、１００％胸水中で一定濃度でインキュベートした。５日後、総細胞集団を採取し、ＣＤ３＋細胞の総数（図５７Ａ）を測定した。
未処置対照と比較して、遊離のＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ又はＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥをコードするＥｎＡｄを受けたサンプルのみがＴ細胞増殖を示した。これは、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥがＥｐＣＡＭ標的に結合し、ＣＤ３を架橋して内因性Ｔ細胞を刺激したことを裏付けている。ＣＤ３細胞上のＣＤ２５の発現レベルもまた決定された（図５７Ｂ）。遊離ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥは、胸水の免疫寛容の可能性が高い環境内であっても、すべての患者のサンプルにおいて腫瘍関連リンパ球の有意なＴ細胞活性化（ＣＤ２５発現により評価）を誘導した。この設定では、抗ＰＤ１遮断抗体を添加しても、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥが媒介するＴ細胞の活性化に影響はなかった（図５４Ｂ及びＣ）。患者間で顕著な変動があったが（同じ患者からのサンプル間ではわずかであったが）、活性化はドナーに応じて５０％から９０％の範囲であった。同様に、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄで処理したサンプルは、一部の患者で高い活性化を示した（ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭ ＢＩＴＥ及びＥｎＡｄ−ＳＡ−ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの両方に対して１０〜２０％から最大８０％の範囲）。
興味深いことに、最も低いＢｉＴＥ媒介活性化を示した患者は、最低レベルのバックグラウンドＴ細胞活性化も示した。親ＥｎＡｄ、又はコントロールＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄ、又は遊離コントロールＢｉＴＥは、バックグラウンドを超える刺激を引き起こさなかった。
５日間のインキュベーションの最後に、フローサイトメトリーでＥｐＣＡＭ陽性細胞の残存レベルを測定することにより、ＢｉＴＥ発現ウイルスのＥｐＣＡＭ標的細胞傷害性を媒介する能力を評価した（図５７Ｃ）。遊離ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ、及びＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥをコードする２つのウイルスは、すべての場合において自己ＥｐＣＡＭ発現細胞の著しい枯渇を引き起こしたが、他の処理はＥｐＣＡＭ陽性細胞のレベルにほとんど又は全く影響を及ぼさなかった。サンプル＃１の場合、未処置の対照と比較して、全てのＥｎＡｄベースのウイルスの生存率がわずかに低下しており、これは直接のウイルスによる腫瘍溶解の影響を表すと思われる。Ｔ細胞活性化に対するＰＤ１遮断抗体の影響の欠如と関連して、それは標的細胞のＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ媒介殺傷に対して効果がなく、ＰＤ１ブロッカーの非存在下でのＥｐＣＡＭ＋細胞（患者２、３及び４）の細胞傷害性はほぼ完全であった。（図５４Ｄ）。
親ＥｎＡｄ及びＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥの異なる効果を図５７Ｄに顕微鏡で示し、ここでＢｉＴＥの発現は腫瘍細胞の存在を減少させ、Ｔ細胞集団を拡大させる。関連するフローサイトメトリープロットにより、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ発現ウイルスで処理した後のＴ細胞の実質的な拡大と活性化が確認される。
最後に、様々な処理の効果を、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘタンパク質アレイを用いて産生された重要なサイトカインのレベルを測定することによって特徴付けた（図５７Ｅ）。これまでのところ、最大の倍増はガンマインターフェロンであり、遊離のＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ又はＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥをコードするＥｎＡｄで処理した後、これは約１０００倍に上昇した。これら２つの処理はまた、活性化Ｔ細胞に特徴的なＩＬ−５、ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆの発現を約１０倍増加させた。ＥｎＡｄ単独（又はコントロールＢｉＴＥの発現）もまた、ガンマインターフェロンの１０倍の上昇を引き起こしたが、それ以外の処理は、サイトカイン発現のいかなる顕著な変化も引き起こさない。
実施例２７−考察
腫瘍溶解性ウイルスは、単一の標的化自己増幅剤内にいくつかの治療法を組み合わせるための興味深い新しい戦略を提供する（Ｋｅｌｌｅｒ＆Ｂｅｌｌ、２０１６； Ｓｅｙｍｏｕｒ＆Ｆｉｓｈｅｒ、２０１６）。それらは癌細胞内で選択的に増殖し、細胞から細胞へと広がるため、一部の腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルス粒子が死にかけている細胞から逃げるのを許容するプロセスの一部として、非アポトーシス死経路（Ｉｎｇｅｍａｒｓｄｏｔｔｅｒら、２０１０； Ｌｉ ら、２０１３）による細胞死を媒介すると考えられている。特にＥｎＡｄは、壊死症又は虚血性細胞死として知られる炎症誘発プロセスによって細胞を死滅させる（Ｄｙｅｒ、２０１７）。この非アポトーシス死のメカニズムは、ＡＴＰ、ＨＭＧＢ１、カルレティキュリン（損傷関連分子パターンとして知られる、
ＤＡＭＰｓ）（Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ＆Ｂｕｊａ、２０１２）の曝露など、いくつかの炎症誘発性細胞成分の放出を引き起こし、ウイルスが有効な抗癌免疫反応を促進する能力にとって極めて重要であると考えられる。しかしながら、直接溶解の結果に加えて、ウイルスは、送達の課題を回避し、生物製剤が腫瘍微小環境内でその最高濃度を達成するのを確実にしながら、他の抗癌生物製剤をコード化及び発現する可能性を提供する。ＩｍｌｙｇｉｃはＧＭ−ＣＳＦをコードするが、ウイルスを武装させる可能性は事実上無限であり、相加的又は相乗的な抗癌効果を持つマルチモーダルな治療戦略を設計するための多くのエキサイティングな機会を提供する（ｄｅ Ｇｒｕｉｊｌら、２０１５；Ｈｅｒｍｉｓｔｏｎ＆Ｋｕｈｎ、２００２）。
腫瘍溶解性ウイルス内にＢｉＴＥをコードすることは、腫瘍浸潤リンパ球を活性化して細胞傷害性にし、抗原陽性標的細胞を溶解させる強力な手段を提供し、直接ウイルス溶解の効果とは全く別の治療法を提供する。この研究で我々は、
ＢｉＴＥを標的とした細胞傷害性は完全に抗原特異的であり、ＣＤ４とＣＤ８の両方のＴ細胞によって媒介され得、（Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎら、２００６）、腫瘍溶解性アデノウイルスに組み込まれ得、そしてウイルス複製を可能にする細胞においてのみ発現され得ることを示した。さらに、今回の研究は、液体癌生検材料内の内因性Ｔ細胞が、ＢｉＴＥ及びウイルスコード化ＢｉＴＥによって活性化され、追加の刺激や免疫抑制の逆転なしに内因性腫瘍細胞を死滅させることができることを初めて示した。重要なことに、これは、固形腫瘍の免疫抑制性微小環境の代用として、腹膜腹水又は胸水の微小環境を含む一次体液においても起こり得る。
ＢｉＴＥを発現させるための武装腫瘍溶解性ウイルスは、２つの全く異なる治療メカニズムを組み合わせ、前者はウイルス感染を許容する腫瘍細胞の溶解死を提供し、後者は特定の選択された抗原を介してＴ細胞の細胞傷害性を標的とする。これは、おそらくウイルスによる直接殺傷に対して比較的耐性のある腫瘍関連細胞に細胞傷害性を送達するために、ＢｉＴＥを使用することにより、治療アプローチの設計においてかなりの柔軟性を提供する。例えば、ここでは癌関連抗原を認識するＢｉＴＥ（ＥｐＣＡＭ）を使用した技術を例示したが、腫瘍関連線維芽細胞又は他の間質細胞に対する細胞傷害性を標的とするためにＢｉＴＥアプローチを使用することも可能である。実際、ＢｉＴＥ認識の標的が腫瘍の微小環境での発現に限定されていない場合でも、ＢｉＴＥの産生をウイルスの複製に結び付けることで、ＢｉＴＥの発現を腫瘍に空間的に限定して、全身毒性を最小限に抑えることが可能である。静脈内投与されたＢｉＴＥは比較的短い循環動態を示し（Ｋｌｉｎｇｅｒら、２０１２）、標的上だが腫瘍外のかなりの毒性と関連していることが多いため（Ｔｅａｃｈｅｙら、２０１３）、これは重要である。
腫瘍溶解性ウイルス内にＢｉＴＥをコードする可能性は、以前に腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとＥｐｈｒｉｎ Ａ２標的ＢｉＴＥを用いて検討されてきた。この薬剤は、Ｅｐｈｒｉｎ ＢｉＴＥがインビトロ及びインビボの両方で ＰＢＭＣの活性化及び腫瘍細胞の抗原標的死滅を媒介し得ることを示した。興味深いことに、ＢｉＴＥはＴ細胞を活性化することができたが、外因性のＩＬ−２を添加しなければＴ細胞の増殖にはつながらなかったのに対し、本試験で用いたＢｉＴＥは、インビトロでのＰＢＭＣ及びエクスビボでの臨床生検サンプルを用いた腫瘍関連リンパ球の両方に広範囲の増殖をもたらした。
観察された差異は、異なるＢｉＴＥデザイン、使用された異なる腫瘍溶解性ウイルスを反映するか、又はおそらくＴ細胞上にＣＤ３の十分な架橋を与える抗原密度に依存すると考えられる。
腫瘍溶解性ウイルス療法の１つの中心的目的は、患者に特異的な新抗原及び「公の」腫瘍関連抗原を認識する抗癌Ｔ細胞応答を作り出すことである。溶解性ウイルスは、ウイルス関連病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と並んでＤＡＭＰとの関連で腫瘍細胞を溶解することによって改善された抗原提示を刺激することによってこれを行うことができる。ＥｎＡｄの静脈内送達後の切除された結腸腫瘍の免疫組織化学的染色は、ウイルスが腫瘍組織へのＣＤ８＋Ｔ細胞の強い流入を促進することを示唆している（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｂｏｎｅｒｏ、２０１７）。しかしながら、これは潜在的に非常に強力なアプローチであるが、適応的Ｔ細胞応答は、最終的には腫瘍細胞によるＭＨＣクラスＩ抗原の発現に依存しており、標的化された殺傷を可能にする。ＭＨＣ発現の喪失は、腫瘍に対する十分に実証された免疫回避戦略である（Ｇａｒｒｉｄｏら、２０１６）。
注目すべきは、ＢｉＴＥで武装した腫瘍溶解性ウイルスが直ちに関与する両方の細胞傷害性戦略が、腫瘍細胞によってＭＨＣクラスＩとは無関係に作用するため、腫瘍細胞がＭＨＣ発現を喪失した場合でも癌細胞を死滅させるために採用できることである。
このように本研究は、ＥｎＡｄ内でＢｉＴＥをコードすることが、公知の血液安定性及びウイルスの全身バイオアベイラビリティーを利用して、播種性腫瘍における標的発現を達成するための特に有望な戦略を提供することを示しており、これはいくつかの初期相の臨床治験で研究されている。特に、原発性結腸癌の切除の数日前にウイルスが静脈内投与された研究では、その後の腫瘍切片の免疫組織学的評価は、ウイルスが腫瘍を通して領域に達し、強力な核内ヘキソンシグナルを与えたことを示し、感染の成功及び腫瘍細胞における選択的ウイルス複製を示している。これは前臨床データを裏付けるものであり（Ｄｉら、２０１４；Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ、２０１７）、このウイルスは１００％のヒト血液中で安定であり、ヒト患者における播種性及び転移性悪性腫瘍の腫瘍標的感染の可能性がある。
ウイルスのかなりの導入遺伝子パッケージング能力を反映して、ＢｉＴＥは、腫瘍溶解性ビルレンスを全く喪失することなくＥｎＡｄによってコードされ得る（図５１Ｂ）。導入遺伝子の存在は、ウイルス粒子の物理化学的特性に影響を及ぼさず、それ故修飾ウイルスは親物質と全く同じ臨床薬物動態を示すべきであり、コードされたＢｉＴＥを全身の腫瘍内で選択的に発現できるべきである。これは、現在臨床評価のために優先されるべきである、体系的に標的化された癌免疫療法へのエキサイティングで潜在的に非常に効果的な新しいアプローチを提供する。
実施例２８
患者の悪性滲出液によるヒトＴ細胞活性化及び標的細胞の細胞傷害性の免疫抑制
悪性滲出液は、後期転移性癌患者で一般的に観察される免疫応答が抑制された潜在的免疫寛容の環境を表す。抗炎症性サイトカインと考えられるＩＬ−１０の量を、ヒトＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４３０６０４）を用いて、正常血清又は患者の悪性滲出液（Ａ、腹膜腹水、Ｐ、胸水）中で測定した。滲出液中のＩＬ−１０レベル（８８．１〜６３３．４ｐｇ／ｍＬ）は、正常血清（７．２〜１０ｐｇ／ｍＬ）で測定された値をはるかに超えていた。図５８を参照のこと。
正常な血清、腹水又は胸水の存在下で、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｇｉｂｃｏ、１１１６１Ｄ）がＰＢＭＣ Ｔ細胞を活性化する能力を調査した。ヒトＰＢＭＣ Ｔ細胞（９６ウェルプレート中の１ウェルあたり１００，０００細胞）を、通常の血清又は患者の滲出液（５０％）中のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（製造元の指示に従って）で処理した。Ｔ細胞は、ネガティブコントロールとして各液体中で未処置のままにした。培養２４時間後、細胞を回収し、ＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルを抗体染色及びフローサイトメトリーによって分析し、二重陽性（ＣＤ６９＋ＣＤ２５＋細胞）の割合として表した（図５９）。正常な血清では、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズはＣＤ２５とＣＤ６９の両方に対して二重陽性のＴ細胞の約６０％を与えたが、腹水の存在は６／１２の液体中のＴ細胞活性化を弱めた。
同様の実験において、正常血清、腹水又は胸水（５０％）の存在下で、１００，０００個のＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで処理した。抗ＣＤ１０７ａ又はアイソタイプ対照抗体を培地に直接添加した。１時間後、モネンシンを製造元の指示に従って添加した（ＢＤ Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。さらに５時間後、細胞を採取し、フローサイトメトリーによって分析して脱顆粒を決定した（図６０）。正常な血清では、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズは脱顆粒したＴ細胞の約２２．５％を与えたが、腹水の存在は１０／１２の液体中のＴ細胞活性化を減弱させた。脱顆粒のレベルは、各液体中のＩＬ−１０の量と有意に相関していた（Ｐｅａｒｓｏｎ係数、ｒ＝−０．７６４５；ｐ＝０．００３８）（図６１）。
同様の実験において、７５，０００個のＴ細胞を、正常な血清、腹水又は胸水（５０％）の存在下で、１５，０００個のＳＫＯＶ３及びＥｐＣＡＭと共培養した。Ｔ細胞を、ネガティブコントロールとして各液体中のコントロールＢｉＴＥで処理した。培養２４時間後、細胞を回収し、ＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ６９及びＣＤ２５の発現レベルを抗体染色及びフローサイトメトリーにより分析し、二重陽性（ＣＤ６９＋ＣＤ２５＋細胞）の割合として表した（図６２）。正常な血清では、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥはＣＤ２５とＣＤ６９の両方に対して二重陽性のＴ細胞の約６７．６％を与えたが、腹水の存在は、０／１２液中のＴ細胞活性化を弱め、４／１０液中でわずかに活性化を誘導した。
同様の実験において、７５，０００個のＴ細胞を、正常な血清、腹水又は胸水（５０％）の存在下で、１５，０００個のＳＫＯＶ３及びＥｐＣＡＭと共培養した。Ｔ細胞を、ネガティブコントロールとして各液体中のコントロールＢｉＴＥで処理した。抗ＣＤ１０７ａ又はアイソタイプ対照抗体を培地に直接添加した。１時間後、モネンシンを製造元の指示に従って添加した（ＢＤ Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。さらに５時間後、細胞を採取し、フローサイトメトリーにより分析して脱顆粒を決定した（図６３）。正常な血清中では、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥビーズは、脱顆粒したＴ細胞の約４１．４％を与えたが、腹水の存在は、２／１２の液体中のＴ細胞活性化を弱めた。
ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＥｐＣＡＭＢｉＴＥ及びＥｎＡｄ−ＳＡ−コントロールＢｉＴＥが悪性滲出液中のＴ細胞媒介標的細胞溶解を誘導する能力を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ技術を用いて評価した。ＳＫＯＶ細胞を４８ウェルＥプレートにそれぞれ１ｅ４細胞／ウェルでプレーティングした。細胞を細胞当たり１００ウイルス粒子（ｐｐｃ）で感染させるか又は未感染のままにする前に、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で１８時間インキュベートした。２時間後、正常血清中のＰＢＭＣ Ｔ細胞（５：１）又は患者の滲出液（最終、５０％）を加えた。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅを使用して１０分ごとに標的細胞の細胞傷害性を測定した（図６４）。結果は、Ｔ細胞によるＢｉＴＥ媒介ＳＫＯＶ３溶解は、使用した液体とは無関係であることを示唆している。
未精製腹水細胞（従って、受け取ったときと変わらない）を、ＲＰＭＩ培地又は腹水中、平底９６ウェルプレートの１ウェルあたり１００，０００細胞で播種する。細胞をＥｐＣＡＭ又はコントロールＢｉＴＥで処理し、未処置ウェルをネガティブコントロールとして用いた。３７℃で２４時間インキュベートした後、細胞を回収し、ＣＤ３細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９の発現レベルを決定した（図６５）。結果は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥが腫瘍関連リンパ球のＴ細胞活性化（ＣＤ６９／ＣＤ２５二重陽性）の有意な増加をもたらし、腹水によってわずかに増加することを証明している。
同様の実験において、未精製腹水細胞（従って、受け取ったときから変わらない）を、ＲＰＭＩ培地又は腹水中、平底９６ウェルプレートの１ウェルあたり１００，０００細胞で播種する。細胞をＥｐＣＡＭ、コントロールＢｉＴＥ又は組換えＢｉＴＥウイルス（１００ｖｐ／細胞）で処理し、未処置ウェルをネガティブコントロールとして用いた（図６６）。３７℃で５日間インキュベートした後、総細胞集団を採取し、ＣＤ３＋細胞の数（図６６Ａ）及びＣＤ３細胞上のＣＤ２５の発現レベルを決定し（図６６Ｂ）、フローサイトメトリーにより内因性ＥｐＣａＭ＋細胞の数を決定した。（図６６Ｃ）。１ウェルあたりの総細胞数は精密計数ビーズを用いて決定した。結果は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ及びＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄが、ＲＰＭＩ培地及び腹水の両方において、腫瘍関連リンパ球のＴ細胞活性化（ＣＤ３数、ＣＤ２５）及びＥｐＣＡＭ＋細胞の細胞傷害性の有意な増加をもたらしたことを実証する。
上記実験の延長として、さらに６つの患者滲出液サンプル（合計７つ）を腹水（図６７）中で、フローサイトメトリーによって決定されたＣＤ３＋の数（図６７Ａ）、Ｔ細胞のＣＤ２５発現（図６７Ｂ）、及びＥｐＣＡＭ＋細胞の数（図６７Ｃ）で同様に処理した。結果は、ＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥ及びＥｐＣＡＭ ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄが、腫瘍関連リンパ球のＴ細胞活性化（ＣＤ３数、ＣＤ２５）及びＥｐＣＡＭ＋細胞の細胞傷害性の有意な増加を、再現性よく滲出性生検サンプルの範囲においてもたらしたことを示す。
実施例２９
ＦＡＰ ＢｉＴＥは異なるドナーＴ細胞によるＴ細胞の活性化とＦＡＰ＋細胞の死滅を媒介する
他の実験では、実施例２に記載の方法を用いて、ＮＨＤＦ及びＴ細胞の共培養物中で試験した組換えＦＡＰ ＢｉＴＥタンパク質のＴ細胞活性化特性を、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを用いたコントロールＢｉＴＥ及びポリクローナルＴ細胞活性化と比較して、さらに評価した。
培養の２４時間後に採取した上清を、ＩＦＮγ（図６８Ａ）のためのＥＬＩＳＡ、及びサイトカイン（図６８Ｂ）のパネルのためのサイトカインビーズアレイ（ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘヒトＴヘルパーサイトカインパネル、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃７４００１）でにより試験した。コントロールＢｉＴＥは任意のサイトカインにおいて有意な変化を誘導しなかったが、ＦＡＰ−ＢｉＴＥはガンマインターフェロン、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−１７及びＩＬ−１０における強い増加をもたらし、刺激されたＴ細胞の異なるサブセットと一致し、ＩＦＮγの産生は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８によってトリガーされたものよりもはるかに大きかった。
ＮＨＤＦ細胞の存在下での、コントロールＢｉＴＥではなくＦＡＰ ＢｉＴＥによる刺激は、Ｔ細胞表面（フローサイトメトリーにより評価）上のＣＤ１０７ａ／ＬＡＭＰ１の表出化によって決定されるように、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方のＴ細胞の急速な脱顆粒（６時間以内）も誘導し、これは標的細胞を死滅させるそれらの能力と強く相関している（図６９Ａ及びＢ）。ＦＡＰ ＢｉＴＥによる脱顆粒のこの誘導は、誘導されたＴ細胞活性化及び６／６ドナーＴ細胞を用いて観察された細胞傷害性（図６９Ｄ）を伴う、ＰＢＭＣ Ｔ細胞（約２．５ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０）との２４時間の共培養後のＬＤＨ放出によって測定されたように、強力な線維芽細胞溶解に変換された（図６９Ｃ）。不活性化状態で残っているＴ細胞と一致して、細胞傷害性はコントロールＢｉＴＥによって誘導されなかった。
実施例３０
異なる潰瘍患者由来の原発性悪性腹水サンプル中の細胞に対するＦＡＰ ＢｉＴＥ及びＥｎＡｄ−ＦＡＰ ＢｉＴＥウイルスの影響
実施例１６に記載した研究の後継として、さらなる癌患者からの新鮮な原発性悪性腹膜腹水をＥｎＡｄ ＦＡＰ ＢｉＴＥウイルス活性の研究のために得た。ＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞とＦＡＰ＋線維芽細胞の両方を含む３人の患者サンプルを、エクスビボで増殖させ、混合（付着）細胞集団をＰＢＭＣ由来Ｔ細胞及び未修飾又はＥｎＡｄウイルスを発現するＢｉＴＥと共に培養した。７２時間後、全細胞を採取し、フローサイトメトリーによってＦＡＰ＋（図７０Ａ）及びＥｐＣＡＭ＋細胞（図７０Ｂ）の数を決定した。さらに、Ｔ細胞の活性化状態（ＣＤ２５発現による）を測定した（図７０Ｃ）。ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥ及びＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥの両方による感染は、すべての患者サンプルにおいてＴ細胞活性化及びＦＡＰ＋細胞枯渇を誘導し、ＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞のレベルに有意な変化はなかった。親ＥｎＡｄ又は対照ウイルスは、観察可能なＴ細胞活性化を誘導せず、ＦＡＰ＋細胞数は未感染対照と同じままであった。
重要なことに、ＦＡＰ＋線維芽細胞のこの枯渇は、上清中に検出された免疫抑制性サイトカインＴＧＦβのレベルの一貫した強い減少をもたらした（図７０Ｄ）。
第２の一連の実験では、５つの患者生検サンプルからの全（及び未精製）細胞を評価して、サンプル中の内因性腫瘍関連Ｔ細胞の活性を評価した。細胞を５０％腹水中にプレーティングし、組換え対照タンパク質もしくはＦＡＰ ＢｉＴＥタンパク質、又は１００ ｖｐ／細胞のＥｎＡｄもしくはＥｎＡｄ−ＢｉＴＥウイルスで処理した。５日間のインキュベーション後、Ｔ細胞活性化（ＣＤ２５発現による）及びＦＡＰ＋細胞の残存数をフローサイトメトリーにより測定した（図７１Ａ及びＢ）。３人の患者サンプルすべてにおいて、組換えＦＡＰ−ＢｉＴＥ及びＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＦＡＰ ＢｉＴＥは強力なＴ細胞活性化を誘導し、最大約８０％の患者由来Ｔ細胞が活性化され、これはＦＡＰ＋線維芽細胞の顕著な枯渇を引き起こした。興味深いことに、ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰ−ＢｉＴＥは２／３サンプルでＣＤ２５発現を誘導し、患者１では観察可能な活性化もＦＡＰ＋細胞枯渇も見られなかった。これはおそらく、ウイルスによる感染及びＢｉＴＥタンパク質の産生のための不十分な腫瘍細胞が存在するからであり（フローサイトメトリーによってこのサンプル中にＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞は検出されなかった）、ＭＬＰ（ＳＡ）駆動の導入遺伝子発現のための腫瘍細胞の要件と一致する（これはまた、図４２〜４４に示される患者腹水サンプルでのＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰ−ＢｉＴＥウイルスによるＴ細胞活性化及びＦＡＰ＋細胞枯渇の欠如をも説明する）。まとめると、データは、ＦＡＰ−ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄが、腫瘍細胞の感染後に、内因性線維芽細胞を死滅させるために腫瘍関連Ｔ細胞の活性化を再現可能にもたらし得ることを示す。
別の実験では、Ｔ細胞が７３．６％ ＰＤ−１陽性でＦＡＰ＋細胞が６２．９％ ＰＤＬ１陽性である患者生検サンプルを用いて、ＰＤ−１チェックポイントをブロックすることによってＦＡＰ−ＢｉＴＥ活性を改善できるかどうか調査した（図７２Ａ）。上記と同様の共培養は、ヒトＰＤＬ１に対する精製ブロッキングマウスＩｇＧ２ｂの抗体の存在下又は非存在下で（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン２９Ｅ．２Ａ３）、２．５μｇ／ｍＬの最終濃度に設定した。２日間の培養後、全細胞を採取し、残存ＦＡＰ＋細胞及びＴ細胞活性化を測定した。ブロッキング抗ＰＤＬ１抗体を含めることにより、ＦＡＰ＋細胞の枯渇を変えることなく（図７２Ｄ）、どちらの設定でも２日目にはほぼ完全な溶解があり、ＣＤ２５誘導（図７２Ｂ）及び２倍高いＩＦＮγ産生（図７２Ｃ）において中程度の増加がもたらされた。
卵巣癌患者の腹水から単離された腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）は、ＰＤ−１の発現が豊富であり、細胞傷害性及びＩＦＮｇ産生を含むエフェクター機能が損なわれていると報告されている。これと一致して、ＰＤ−１発現は、６人の癌患者腹水症生検からのＣＤ３＋細胞上では、３人の健康なドナーからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中のそれらより２倍高かった（図７３Ａ）。これらの癌生検サンプル内のＴ細胞の機能性を評価するために、ＮＨＤＦ細胞及び未精製のＰＢＭＣ又は腹水細胞（各サンプルについての％ ＣＤ３＋細胞を図７３Ｂに示す）をコントロール又はＦＡＰ ＢｉＴＥ含有上清と共培養し、上清を５日後に回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮγについて試験した（図７３Ｃ）。コントロールＢｉＴＥによってＩＦＮγは誘導されなかった。腹水細胞サンプルのうちの３つは、ＰＢＭＣサンプルのレベルと同様のレベルでＩＦＮγを産生したが、他の３つは、ＦＡＰ ＢｉＴＥに対する反応が減弱していた。我々は次にこれらのＴ細胞がＮＨＤＦ細胞のＢｉＴＥ媒介溶解を誘導する能力を調査する。ＮＨＤＦをプレーティングし、ＰＢＭＣ又は腹水細胞をＢｉＴＥ含有上清と一緒に添加し、培養物中の細胞の生存率をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイシステムを用いてリアルタイムでモニターした。ＩＦＮγ産生の変動性にもかかわらず、全ての腹水サンプルは、ＦＡＰ ＢｉＴＥを添加したときにＮＨＤＦ細胞の完全な細胞傷害性を誘導し、ＰＢＭＣによって影響を受けたときに見られるものと全体的に同様のＢｉＴＥ媒介ＮＨＤＦ溶解を示した（図７３Ｄ）。
ＦＡＰ ＢｉＴＥが患者の悪性滲出液サンプル（すべて５０％）の存在下で、Ｔ細胞活性化を媒介できるかどうかを調べるために、ＰＢＭＣ Ｔ細胞を、ＮＨＤＦ細胞の存在下で、５０％正常ヒト血清（ＮＳ）又は異なる（無細胞）悪性滲出液サンプルのいずれかにおいて、コントロール又はＦＡＰ ＢｉＴＥで活性化するか、又は抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズで活性化した。正常血清中では、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる刺激の２４時間後に７４％のＴ細胞が活性化された（ＣＤ２５及びＣＤ６９の両方に対して二重陽性）のに対して、３／５の試験腹水は、ＮＳにおける反応に比較して、Ｔ細胞活性化を著しく低下させた（図７４Ａ）。しかしながら、ＰＢＭＣをＮＨＤＦと共に培養し、ＦＡＰ ＢｉＴＥで刺激した場合、いかなる滲出液の存在下でも観察可能なＴ細胞活性化の抑制は見られず（図７４Ｂ）、ＦＡＰ ＢｉＴＥが免疫抑制メカニズムを克服してＴ細胞を活性化することを実証した。
実施例３１
ＥｎＡｄ‐ＦＡＰＢｉＴＥ媒介腫瘍溶解及びＴ細胞刺激は、患者の腹水症におけるＣＤ１１ｂ＋ＴＡＭをより活性化した表現型に偏らせる
Ｔ細胞のＦＡＰ ＢｉＴＥ媒介活性化によるＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ−２を含むＴｈ１サイトカインの産生、及びその後のＦＡＰ＋線維芽細胞の除去（及びそれに伴うＴＧＦβ１の減少）が、免疫抑制及び発がん性から抗腫瘍活性に向けての腫瘍微小環境における他のシフトと関連しているかどうかを調べるために、分離されていない腹水細胞サンプルにおける腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）に対する効果を評価した。未精製の患者の腹水細胞全体を５０％腹水にプレーティングし、遊離コントロール又はＦＡＰ ＢｉＴＥで処理するか、又はＥｎＡｄ−ＳＡコントロールＢｉＴＥ又はＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥウイルスに感染させた（１００ ｖｐ／細胞）。並行して、いくつかの細胞をＩＦＮγで処理して活性化ＣＤ１１ｂ骨髄性細胞表現型を誘導した。３日間インキュベートした後、Ｔ細胞の活性化状態を最初に測定した。ＣＤ２５＋細胞をフローサイトメトリーにより測定し、ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。
ＦＡＰ ＢｉＴＥ及びＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥで処理すると、およそ６０％のＣＤ３＋Ｔ細胞がＣＤ２５＋になり（図７５Ａ）、培養上清中に大量のＩＦＮγが生じた（図７５Ｂ）。ＣＤ２５発現又はＩＦＮγについて、コントロールＢｉＴＥ又は対照ウイルスによるバックグラウンドを超える増加は観察されなかった。ＴＡＭ分極を評価するために、ＣＤ６４及びＣＤ８６（Ｍ１又は「活性化」マクロファージマーカー）ならびにＣＤ２０６及びＣＤ１６３（Ｍ２又はＴＡＭマーカー）の発現レベルをフローサイトメトリーによってＣＤ１１ｂ＋細胞上で測定した（図７５Ｃ）。遊離ＦＡＰ ＢｉＴＥ又はＦＡＰ ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄによる処理は、ＣＤ６４発現の有意な増加、及びＣＤ２０６及びＣＤ１６３の強力な減少によって明示される、より活性化された表現型を誘導し、ＩＦＮγを培養物に添加した場合に観察されたものと同様である。
この実験では、遊離ＦＡＰ ＢｉＴＥ又は対照ウイルスで処理しても、バックグラウンドを超えるＣＤ８６の明らかな変化は誘導されなかったが、ＦＡＰ ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄは、ＣＤ８６発現の大幅な増加を誘導し、ＥｎＡｄウイルス感染及びＦＡＰ ＢｉＴＥ活性は相乗作用して、ここでテストされた悪性腹水サンプルのような抑制性腫瘍微小環境内で、一次骨髄細胞を活性化し得ることを示している。この研究では、ＩＦＮγ処理はＣＤ８６の適度な減少を誘導し、これはＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥによって観察されたＣＤ８６の強い増加が、ＩＦＮγ非依存性機序によるものであり得ることを示している。
実施例３２
ＥｎＡｄ ‐ ＦＡＰＢｉＴＥは、腫瘍浸潤リンパ球を活性化し、固形前立腺腫瘍生検においてエクスビボで細胞傷害性を誘導する
組織切片培養は、多様な組織、器官及び腫瘍の最も現実的な前臨床モデルの１つを提供する。この臨床的に極めて関連性の高い状況におけるウイルスを発現するＦＡＰ ＢｉＴＥの活性を評価するために、切除されたヒト前立腺由来の悪性及び良性前立腺組織が、いくつかの対でパンチ生検によって研究された。最初のスクリーニングで、前立腺組織は、散在したＣＤ８ Ｔ細胞を含む間質の広い領域の間に散在したＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞の円環（図７６Ａ）を有することが再現可能に示された（図７６Ｂ）。ＦＡＰ染色は、腫瘍領域に隣接する線維芽細胞で見られた（図７６Ｃ）。
コアをビブラトームで３００μｍの厚さにスライスし、スライス培養物をウイルスの存在下（１．５ｅ９ ｖｐ／スライス）で確立するか、又は感染させないでおいた。７日後、スライスを固定し、パラフィン包埋し、切片にし、Ｔ細胞活性化状態をＣＤ２５発現について染色することにより免疫組織化学（ＩＨＣ）により評価した（図７６Ｄ）。ＥｎＡｄ−ＣＭＶ−ＦＡＰＢｉＴＥ又はＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥを受けたサンプルのみが、強力なＣＤ２５染色によって明らかにされる腫瘍浸潤Ｔ細胞の活性化を示した。未処置も対照ウイルス処理も、検出可能なＣＤ２５陽性細胞を有さなかった。感染後４及び７日目に採取したこれらのスライス培養物からの上清を、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮγ及びＩＬ−２について試験し、ＦＡＰ ＢｉＴＥウイルス（図７６Ｅ）及びＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥウイルス（図７６Ｆ）を含む培養物中で検出されたＩＬ−２のどちらかに感染した、良性ではなく悪性の前立腺スライス培養物から検出したＩＦＮγで増加した。ＥｎＡｄ−ＳＡ−ＦＡＰＢｉＴＥは、ＣＭＶ駆動ＦＡＰＢｉＴＥウイルスよりも早期に検出可能であった大量のＩＦＮγを誘導した。
実施例３３−ＥｐＣＡＭ又はＦＡＰ ＢｉＴＥを発現するＥｎＡｄウイルス
単一のＢｉＴＥをコードする５つのウイルス（ＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２、ＮＧ−６１３、ＮＧ−６１４、ＮＧ−６１７）が生成された（表８）。
表８
１配列番号55; ２配列番号83; ３配列番号84; ４配列番号65; ５配列番号85; ６配列番号86; ７配列番号87;
各導入遺伝子カセットにおいて、ＢｉＴＥをコードするｃＤＮＡの５’末端に短いスプライスアクセプター配列（ＳＳＡ、配列番号５５）又はより長いスプライスアクセプター配列（ＳＡ、配列番号８６）のいずれかが隣接していた。ＢｉＴＥの３’末端では、ヒスチジンタグ（ＨＩＳ、配列番号４１）又はタグなしのいずれかの前に、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列（ＰＡ、配列番号６５）がコードされた。ウイルスＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２、ＮＧ−６１３及びＮＧ−６１７において、ＢｉＴＥ分子の抗ＣＤ３部分は、マウス抗ヒトＣＤ３εモノクローナル抗体ＯＫＴ３の一本鎖変異体を使用した。
ウイルス産生
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を、合成導入遺伝子カセット（それぞれ配列番号８８〜９２）の直接挿入によりプラスミドｐＮＧ−６１１、ｐＮＧ−６１２、ｐＮＧ−６１３、ｐＮＧ−６１４及びｐＮＧ−６１７を生成するために使用した。ｐＮＧ−６１１導入遺伝子カセットは、ＢｉＴＥ（配列番号９３）を標的とするＥｐＣａｍをコードし、ｐＮＧ−６１２、ｐＮＧ−６１３及びｐＮＧ−６１７導入遺伝子カセットは、配列番号９４のＢｉＴＥを標的とするＦＡＰをコードし、ｐＮＧ−６１４導入遺伝子カセットは、配列番号９５のＢｉＴＥを標的とするＦＡＰをコードする。導入遺伝子カセットの概略図を図７７Ａ〜Ｃに示す。プラスミドＤＮＡの構築は制限分析及びＤＮＡ配列決定により確認した。
プラスミドｐＮＧ−６１１、ｐＮＧ−６１２、ｐＮＧ−６１３、ｐＮＧ−６１４及びｐＮＧ−６１７を、酵素ＡｓｃＩでの制限消化によって線状化してウイルスゲノムを産生した。ウイルスを下記の方法に従って増幅及び精製した。
消化されたＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により精製し、３００μｌの＞９５％分子生物学等級のエタノール及び１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム中で−２０℃で１６時間沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレット化し、５００μｌの７０％エタノールで洗浄した後、再び１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。きれいなＤＮＡペレットを風乾し、１５μｌのリポフェクタミントランスフェクション試薬を含む５００μｌのＯｐｔｉＭＥＭに再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物を、集密度７０％まで増殖した２９３細胞を含むＴ−２５フラスコに滴下した。細胞をトランスフェクション混合物と共に３７℃で２時間インキュベートした後、５％ ＣＯ２ ４ｍｌの細胞培地（２％ ＦＢＳを補充したグルタミンを含むＤＭＥＭ高グルコース）を細胞に加え、フラスコを３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。
トランスフェクトした２９３細胞を２４時間ごとにモニターし、４８〜７２時間ごとに追加の培地を補充した。細胞単層における有意な細胞変性効果（ＣＰＥ）の観察によってウイルスの産生をモニターした。広範囲のＣＰＥが観察されたら、３回の凍結融解サイクルによって２９３細胞からウイルスを採取した。ウイルスストックを増幅するために、採取したウイルスを用いて２９３細胞を再感染させた。増幅中の生存ウイルス産生は、細胞単層中の有意なＣＰＥの観察によって確認された。ＣＰＥが観察されたら、３回の凍結融解サイクルによって２９３細胞からウイルスを採取した。ウイルスを二重塩化セシウムバンディングによって精製して、精製ウイルスストックを産生する前に、増幅されたウイルスストックをさらなる増幅に使用した。
ｑＰＣＲによって評価されたウイルス活性
１ｐｐｃのＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２、ＮＧ−６１７、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）で７２時間感染させた、又は未感染のままにしたＡ５４９細胞を、ｑＰＣＲによるウイルスＤＮＡの定量化に使用した。細胞上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって清澄化した。製造元のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙキットを用いて４５μＬの上清からＤＮＡを抽出した。エナデノチュシレブ（Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）ウイルス粒子（２．５ｅ１０−２．５ｅ５ｖｐ）を用いた標準曲線もまた作成し、ＤＮｅａｓｙキットを用いて抽出した。抽出された各サンプル又は標準物質は、初期遺伝子Ｅ３に設定されたウイルス遺伝子特異的プライマー−プローブを用いてｑＰＣＲにより分析された。
細胞あたりの検出されたウイルスゲノムの数の定量化は、ＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２、及びＮＧ−６１７がＡ５４９細胞株において有意なゲノム複製を示すことを実証した（図７７Ｄ）。これは親ウイルスエナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）を含む試験したすべてのウイルスについて同様であり、ＢｉＴＥ導入遺伝子の包含がウイルス複製活性に影響を及ぼさないことを示している。未感染細胞ではウイルスゲノムは検出されなかった（データ示さず）。
ウイルスを発現するＢｉＴＥにより媒介されるＴ細胞活性化及び脱顆粒
癌細胞感染
Ａ５４９細胞を２４ウェルプレートに２．５ｅ５細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を１ｐｐｃのＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）に感染させるか、又は未感染のままにする前に、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で４時間インキュベートした。感染後２４、４８又は７２時間に細胞から上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより清澄化し、瞬間凍結した。
Ｔ細胞アッセイ
ＦＡＰを発現する肺線維芽細胞株ＭＲＣ−５、又はＥｐＣａｍを発現する卵巣癌細胞、ＳＫＯＶ３を、それぞれ４８ウェルプレートに５．７ｅ４細胞／ウェル及び１．２ｅ５細胞／ウェルの密度で播種した。プレートを、３７℃、５％ ＣＯ２で４時間インキュベートした後、培地をＡ５４９プレートから回収した１５０μＬ／ウェルの解凍上清と交換した。次いで、ヒトＰＢＭＣドナーから単離した精製ＣＤ３ Ｔ細胞もプレートに添加して、２：１のＴ細胞対ＭＲＣ−５又はＳＫＯＶ３の比を得た。共培養物を３７℃、５％ ＣＯ２で１６時間インキュベートした後、細胞上清をＥＬＩＳＡ分析のために収集し、Ｔ細胞をフローサイトメトリー分析のために収集した。非接着細胞を含む培地を共培養ウェルから取り出し、遠心分離した（３００×ｇ）。上清を注意深く除去し、ＰＢＳ ５％ ＢＳＡで１／２に希釈し、ＥＬＩＳＡ分析のために保存した。接着細胞単層をＰＢＳで１回洗浄した後、トリプシンを用いて剥離した。トリプシンを１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ培地を用いて不活性化し、細胞を培養上清から集めた細胞ペレットに添加した。細胞を遠心分離し（３００×ｇ）、上清を捨て、細胞ペレットを２００μＬのＰＢＳ中で洗浄した。細胞を再度遠心分離し、次いでＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ）を含む５０μＬのＰＢＳに室温で１５分間再懸濁した。直接結合抗体のパネルで染色する前に、細胞をＦＡＣ緩衝液中で１回洗浄した：ＡＦ７００にコンジュゲートした抗ＣＤ３；ＢＶ４２１にコンジュゲートした抗ＣＤ２５；ＰＥ／ＣＹ５にコンジュゲートした抗ＨＬＡ−ＤＲ；ＢＶ６０５にコンジュゲートした抗ＣＤ４０Ｌ；ＰＥにコンジュゲートした抗ＣＤ６９及びＦＩＴＣにコンジュゲートした抗ＣＤ１０７ａ。各共培養条件からの細胞のサンプルもまた、関連するアイソタイプ対照抗体で染色された。全ての染色は、ＦＡＣ緩衝液中、全容量５０μＬ／ウェルで１５分間、４℃で行った。次に、細胞をＦＡＣ緩衝液（２００μＬ）で２回洗浄した後、２００μＬのＦＡＣ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ）で分析した。
Ｔ細胞活性化マーカーの上方制御
Ｔ細胞活性化のフローサイトメトリー分析は、生きた単一細胞上のＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ４０Ｌ又はＴ細胞脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現によって評価した。これらのデータは、ＥｐＣａｍ＋ＳＫＯＶ３細胞と共培養したとき、ＮＧ−６１１上清を細胞に添加すると、ＮＧ−６１２、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処置対照上清と比較して、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０Ｌ又は細胞表面ＣＤ１０７ａを発現するＴ細胞の数が有意に増加することを示した（図７８）。これらすべてのマーカーについて、２４時間感染させたＡ５４９細胞からの上清によってはほとんどＴ細胞活性化が刺激されなかったが、感染後４８時間までに、上清はすべてのマーカーにわたって有意なＴ細胞活性化を刺激した。これは感染後７２時間の時点でも同様であった。
ＦＡＰ＋ＭＲＣ−５細胞と共培養した場合、ＮＧ−６１２上清を細胞に添加すると、ＮＧ−６１１、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処置のコントロール上清と比較して、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０Ｌ又は細胞表面ＣＤ１０７ａを発現するＴ細胞の数が有意に増加した（図７９）。ＮＧ−６１１ウイルスによって発現されたＥｐＣａｍ ＢｉＴＥを結合するＭＲＣ−５細胞株上のＥｐＣａｍの低いが検出可能な発現（約５％）によると思われる、Ｔ細胞活性化もいくらかＮＧ−６１１ウイルスと共に観察された（図８０）。これらすべてのマーカーについて、２４時間感染させたＡ５４９細胞からの上清によってはほとんどＴ細胞活性化が刺激されなかったが、感染後４８時間までに、上清はすべてのマーカーにわたって有意なＴ細胞活性化を刺激した。感染から７２時間後に回収した上清とのインキュベーション後に、ＣＤ２５及びＣＤ６９マーカーも上方制御されたが、感染後７２時間に回収した上清では活性化マーカー、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ１０７ａは感染後４８時間よりも低レベルで検出された。これは、感染のこの後期段階に存在する高レベルのＢｉＴＥが原因であり、迅速かつ強力なＴ細胞活性化をもたらし、上清とのインキュベーション後１６時間より早い時点でエフェクター機能を測定する必要があることを意味する。
ＩＦＮγ発現の検出のために、共培養上清を５％ ＢＳＡ／ＰＢＳアッセイ緩衝液（１：１０〜１：１０００の範囲内）に希釈し、ＥＬＩＳＡをヒトＩＦＮガンマＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造元のプロトコルに従って実施した。標準曲線から内挿することによって、分泌されたＩＦＮγの濃度を決定した。ＩＦＮγの発現は、ＳＫＯＶ３細胞上のＮＧ−６１１（図８１Ａ）又はＭＲＣ−５細胞上のＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２（図８１Ｂ）を用いた共培養の上清中でのみ検出することができた。
実施例３４：インビボでウイルスを発現するＢｉＴＥの免疫活性化及び抗腫瘍効果
ＮＳＧマウスヒト化ＣＤ３４＋造血幹細胞（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから）を、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞と共に、生着後１８週目に、両脇腹の皮下に移植した。腫瘍が８０〜４００ｍｍ３に達したら、各処置群が同等の腫瘍体積分布を有するようにマウスをグループ分けし、１グループ当たり７匹のマウスにした。マウスに生理食塩水、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又はＮＧ−６１１のいずれかを、注射当たり５×１０９粒子、腫瘍当たり２回注射で腫瘍内注射した。両脇腹の腫瘍を治療した。腫瘍体積を週に３〜４回測定し、ＮＧ−６１１処置が投与後２０日までの間、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処置の対照と比較して、有意な抗腫瘍応答をもたらすことを実証した（図８２ａ）。投与２０日後、各群の４匹のマウスからの１つの腫瘍をフローサイトメトリーのために処理し、一方残りの腫瘍はドライアイス上で凍結した。
フローサイトメトリー
腫瘍サンプルは切除直後に少量のＲＰＭＩ培地中で機械的に分離した。次いで、分離した腫瘍を７０μｍセルストレーナーに通し、３００ｇで１０分間遠心した。細胞ペレットをＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ）を含む１００μＬのＰＢＳに氷上で１５分間再懸濁した。直接結合抗体のパネルで染色する前に、細胞をＦＡＣｓ緩衝液（５％ ＢＳＡ ＰＢＳ）で１回洗浄した：抗ＣＤ８（ＲＰＡ−Ｔ８、ＡＦ７００）；抗ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４、ＰＥ）；抗ＣＤ４５（２Ｄ１、ＡＰＣ−Ｆｉｒｅ ７５０）；抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）；抗ＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５１、ＰＥ−Ｄａｚｚｌｅ ５９４）；抗ＣＤ６９（ＦＮ５０、ＡＰＣ）；抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３、ＢＶ６０５）；抗ＣＤ１０７ａ（Ｈ４Ａ３、ＦＩＴＣ）。腫瘍細胞懸濁液のプールも、関連アイソタイプ対照抗体で染色した。全ての染色は、４℃で２０分間、５０μＬ／ウェルの総容量でＦＡＣ緩衝液中で実施した。細胞をＦＡＣ緩衝液（２００μＬ）で３回洗浄した後、２００μＬのＦＡＣ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ）で分析した。ＦＡＣ分析は、腫瘍中のＣＤ４ Ｔ細胞に対するＣＤ８ Ｔ細胞の比が、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）処置又は未処置対照と比較して、ＮＧ−６１１処置腫瘍において有意に増加したことを示した（図８２ｂ）。
実施例３５−ＦＡＰ ＢｉＴＥならびに免疫調節サイトカイン及びケモカインを共発現するＥｎＡｄウィルス
ＦＡＰ ＢｉＴＥ及び免疫調節タンパク質をコードする３つのウイルス（ＮＧ−６１５、ＮＧ−６４０及びＮＧ−６４１）が生成された（表９）。
表9
１配列番号55; ２配列番号87; ３配列番号63; ４配列番号１０５； ５配列番号61; ６配列番号１０７； ７配列番号64; ８配列番号 109; ９配列番号 65; １０ 配列番号110; 11配列番号111; １２ 配列番号86
ウイルス産生
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を使用して、合成導入遺伝子カセット（それぞれ配列番号１１２〜１１４）の直接挿入により、プラスミドｐＮＧ−６１５、ｐＮＧ−６１６、ｐＮＧ−６４０及びｐＮＧ−６４１を生成した。ＮＧ−６１５及びＮＧ−６１６は、ＦＡＰ標的ＢｉＴＥ（配列番号９４）、Ｆｌｔ３Ｌ（配列番号１１５）、ＭＩＰ１α（配列番号１１６）及びＩＦＮα（配列番号１１７）をコードする４つの導入遺伝子を含む。ＮＧ−６４０及びＮＧ−６４１は、ＦＡＰ標的ＢｉＴｅ（配列番号９４）、ＣＸＣＬ９（配列番号１１８）及びＣＸＣＬ１０（配列番号１１９）をコードし、ＮＧ−６４１はまた、ＩＦＮα（配列番号１１７）をコードする第４の導入遺伝子を含む。導入遺伝子カセットの概略図を図８３Ａ〜Ｃに示す。プラスミドＤＮＡの構築は制限分析及びＤＮＡ配列決定により確認した。
プラスミドｐＮＧ−６１５、ｐＮＧ−６１６、ｐＮＧ−６４０及びｐＮＧ−６４１を、酵素ＡｓｃＩでの制限消化によって線状化してウイルスゲノムを生成した。実施例３３に詳述した方法に従ってウイルスを増幅し精製した。
ｑＰＣＲ及び導入遺伝子ＥＬＩＳＡによって評価されたウイルス活性
癌細胞感染
１ｐｐｃのＮＧ−６１５、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）で７２時間感染させた、又は未感染のままにしたＡ５４９細胞を、ｑＰＣＲによるウイルスＤＮＡの定量化及びＥＬＩＳＡによる導入遺伝子発現の分析に使用した。細胞上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって清澄化した。４５μＬの上清をＤＮＡ分析に使用し、残りの上清をＥＬＩＳＡに使用した。
ｑＰＣＲ
製造元のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙキットを使用して上清サンプルからＤＮＡを抽出した。エナデノチュシレブ（Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）ウイルス粒子（２．５ｅ１０−２．５ｅ５ｖｐ）を用いた標準曲線もまた作成し、ＤＮｅａｓｙキットを用いて抽出した。抽出された各サンプル又は標準物質は、初期遺伝子Ｅ３に設定されたウイルス遺伝子特異的プライマー−プローブを用いてｑＰＣＲにより分析された。細胞あたりの検出されたウイルスゲノムの数の定量化は、ＮＧ−６１５がＡ５４９細胞株において親ウイルスのエナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）と同等のレベルで有意なゲノム複製を示したことを実証した（図８４）。これらのデータは、ＢｉＴＥ及び３つの免疫調節導入遺伝子の包含がウイルス複製活性に有意な影響を及ぼさないことを示した。未感染細胞ではウイルスゲノムは検出されなかった。
ＥＬＩＳＡ
ＩＦＮα ＥＬＩＳＡは、Ｖｅｒｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ ａｌｐｈａ キット（Ｐｂｌ ａｓｓａｙ ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して実施し、ＭＩＰ１α ＥＬＩＳＡは、ヒトＣＣＬ３ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施し、Ｆｌｔ３Ｌ ＥＬＩＳＡは、Ｆｌｔ３ＬヒトＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）を使用して実施した。全てのアッセイは製造元のプロトコルに従って実施した。
標準曲線から内挿することによって、分泌されたＩＦＮα、ＭＩＰα又はＦＬｔ３Ｌの濃度を決定した。ＩＦＮα、ＭＩＰ１α及びＦｌｔ３Ｌの発現は、ＮＧ−６１５の細胞上清中に検出されたが、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処置対照細胞には検出されなかった（図８５）。
ウイルスを発現するＢｉＴＥにより媒介されるＴ細胞活性化及び脱顆粒
癌細胞感染
Ａ５４９細胞を２４ウェルプレートに２．５ｅ５細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を１ｐｐｃのＮＧ−６１２、ＮＧ−６１５、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）に感染させるか、又は未感染のままにする前に、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で４時間インキュベートした。感染後２４、４８又は７２時間に細胞から上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより清澄化し、瞬間凍結した。
Ｔ細胞アッセイ
ＦＡＰを発現する肺線維芽細胞株ＭＲＣ−５を、４８ウェルプレートに５．７ｅ４細胞／ウェルの密度で播種した。プレートを、３７℃、５％ ＣＯ２で４時間インキュベートした後、培地をＡ５４９プレートから回収した１５０μＬ／ウェルの解凍上清と交換した。次いで、ヒトＰＢＭＣドナーから単離された精製ＣＤ３ Ｔ細胞もプレートに添加して、２：１のＴ細胞対ＭＲＣ−５の比を得た。細胞上清をＥＬＩＳＡ分析のために収集し、Ｔ細胞を実施例２９に詳述した方法に従ってフローサイトメトリー分析のために回収する前に、共培養物を３７℃、５％ ＣＯ２で１６時間インキュベートした。
Ｔ細胞活性化マーカーの上方制御
Ｔ細胞活性化のフローサイトメトリー分析は、生きたＣＤ３＋単一細胞上のＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ４０Ｌ、又はＴ細胞脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現によって評価した。これらのデータは、ＦＡＰ＋ＭＲＣ−５細胞と共培養したとき、ＮＧ−６１５又は６１２上清を添加すると、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処置対照上清と比較して、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ１０７ａを発現するＴ細胞の数が、有意に増加したことを示した（図８６）。
刺激性サイトカインＩＦＮγの分泌
ＩＦＮγ発現の検出のために、共培養上清を５％ ＢＳＡ／ＰＢＳアッセイ緩衝液（１：１０〜１：１０００の範囲内）に希釈し、ＥＬＩＳＡをヒトＩＦＮガンマＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ キット（ＲａｎｄＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造元のプロトコルに従って行った。標準曲線から内挿することによって、分泌されたＩＦＮγの濃度を決定した。ＩＦＮγの発現は、ＮＧ−６１２又はＮＧ−６１５に感染したＡ５４９上清を用いた共培養の上清中でのみ検出することができた（図８７）。
実施例３６−ＦＡＰを標的とするＢｉＴＥ及びＥｐＣａｍを標的とするＢｉＴＥを共発現するＥｎＡｄウイルス
一方がＥｐＣａｍを標的とし（ＥｐＣａｍ ＢｉＴＥ）、他方がＦＡＰを標的とする（ＦＡＰ ＢｉＴＥ）２つのＢｉＴＥ分子をコードするウイルスＮＧ−６１８が生成された（表１０）。
表10
１配列番号55; ２配列番号121; ３配列番号106; ４配列番号122; ５配列番号65;
ウイルス産生
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を使用して、合成導入遺伝子カセット（配列番号１２３）の直接挿入により、プラスミドｐＮＧ−６１８を生成した。ＮＧ−６１８ウイルスは、ＥｐＣａｍ標的ＢｉＴＥ（配列番号９３）及びＦＡＰ標的ＢｉＴＥ（配列番号９５）をコードする２つの導入遺伝子を含む。導入遺伝子カセットの概略図を図８８に示す。プラスミドＤＮＡの構築は制限分析及びＤＮＡ配列決定により確認した。
プラスミドｐＮＧ−６１８を、酵素ＡｓｃＩでの制限消化によって線状化してウイルスゲノムを産生した。実施例３３に詳述した方法に従ってウイルスを増幅し精製した。
ウイルスを発現するＢｉＴＥにより媒介されるＴ細胞活性化及び脱顆粒
癌細胞感染
Ａ５４９細胞を１．２ｅ６細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。細胞をＮＧ−６１１、ＮＧ−６１２、ＮＧ−６１８、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）に感染させるか、又は未感染のままにする前に、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で４時間インキュベートした。感染後７２時間で、細胞から上清を回収し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって清澄化した。
Ｔ細胞アッセイ
ＦＡＰを発現する肺線維芽細胞系ＭＲＣ−５及びＥｐＣａｍを発現するＡ５４９細胞を、２４ウェルプレートに１．５ｅ５細胞／ウェルの密度で播種した。ＭＲＣ−５及びＡ５４９細胞もまた１：１の比率で混合し、１．５ｅ５細胞／ウェルの総細胞密度で２４プレートに播種した。培地をＡ５４９プレートから回収した３００μＬ／ウェルの解凍上清と交換する前に、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で４時間インキュベートした。次いで、ヒトＰＢＭＣドナーから単離された精製ＣＤ３ Ｔ細胞もプレートに添加して、２：１のＴ細胞対ＭＲＣ−５又はＳＫＯＶ３細胞の比を得た。細胞上清をＥＬＩＳＡ分析用に収集し、Ｔ細胞、ＭＲＣ−５細胞及びＡ５４９細胞をフローサイトメトリー分析用に収集する前に、共培養物を３７℃、５％ ＣＯ２で１６時間インキュベートした。
ＭＲＣ−５又はＳＫＯＶ細胞でのＦＡＰ及びＥｐＣａｍの検出
ＭＲＣ−５又はＳＫＯＶ細胞の表面上のそれぞれ検出可能なＦＡＰ又はＥｐＣａｍのフローサイトメトリー分析は、直接結合抗体のパネルで染色する前に、細胞をＦＡＣ緩衝液中で１回洗浄することによって評価した：ＡＦ６４７とコンジュゲートした抗ＦＡＰ； ＰＥとコンジュゲートした抗ＥｐＣａｍ。分析は、ウイルスを発現するＦＡＰ−ＢｉＴＥ、ＮＧ−６１８に感染した細胞からの上清とインキュベートしたＭＲＣ−５細胞ではＦＡＰ発現がもはや検出できないが、ＥｎＡｄで処置した細胞又は未処置細胞からの上清でインキュベートした＞８０％の細胞上では検出されたことを示した。（図８９Ａ）。これらのデータは、ＮＧ−６１８ウイルスによって産生されたＦＡＰ−ＢｉＴＥが、抗ＦＡＰ抗体の結合を妨げるＭＲＣ−５細胞上のそのＦＡＰ標的に結合することを示す。生きた大きな単一細胞のＳＫＯＶ細胞を、検出可能なＥｐＣａｍの発現について評価した。ウイルスを発現するＥｐＣａｍ−ＢｉＴＥ、ＮＧ−６１８に感染した細胞からの上清（１７％の細胞）とインキュベートしたＳＫＯＶ細胞では、ＥｐＣａｍ発現は低レベルでしか検出できなかったが、ＥｎＡｄで処置した細胞又は未処置細胞からの上清でインキュベートした＞４０％の細胞上では検出された（図８９Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＮＧ−６１８がＥｐＣａｍ及びＦＡＰ標的タンパク質に結合するＢＩＴＥ分子を産生することを示す。
Ｔ細胞活性化マーカーの上方制御
Ｔ細胞活性化のフローサイトメトリー分析は、生きたＣＤ３＋単一細胞上のＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ４０Ｌ、又はＴ細胞脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現によって評価した。これらのデータは、ＦＡＰ＋ＭＲＣ−５細胞と共培養したとき、ＮＧ−６１８上清を細胞に添加しすると、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処置対応上清と比較して、ＣＤ２５、ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ１０７ａを発現するＴ細胞数が有意に増加したことを示した（図９０）。ＮＧ−６１８上清をＥｐＣａｍ＋ＳＫＯＶ３細胞に添加した場合、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処置の対照上清と比較して、ＣＤ２５、ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ１０７ａを発現するＴ細胞の数もまた有意に増加した（図９１）。これらのデータは、ＮＧ−６１８ウイルスによって発現された両方のＢｉＴＥ分子が、Ｔ細胞活性化の誘導に関して機能的であることを実証している。
Ｔ細胞媒介標的（ＭＲＣ−５及びＳＫＯＶ）細胞殺傷の分析
ＭＲＣ−５及びＳＫＯＶ細胞生存率のフローサイトメトリー分析は、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ）を含む５０μＬのＰＢＳ中で、室温で１５分間細胞を染色することによって評価した。直接結合抗体のパネルで染色する前に、細胞をＦＡＣ緩衝液中で１回洗浄した：ＡＦ６４７にコンジュゲートした抗ＦＡＰ；ＰＥとコンジュゲートした抗ＥｐＣａｍ。ＭＲＣ−５及びＳＫＯＶ細胞生存率は、ＮＧ−６１８上清サンプルとのインキュベーション後に有意に減少したが、有意な細胞死は、エナデノチュシレブ（ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）又は未処置の対照上清において検出されなかった（図９２）。これらのデータは、標的細胞のＴ細胞媒介細胞死滅を誘導するための、ＦＡＰ及びＥｐＣａｍ標的ＢｉＴＥを同時発現したＮＧ−６１８の機能的能力を実証する。
配列
配列番号２５：ＦＡＰ ＢｉＴＥ−Ｐ２Ａ−ＲＦＰ（斜字体＝リーダー、太字＝フリン切断部位、下線＝Ｐ２Ａ配列、小文字＝ＲＦＰ）
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＦＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＦＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＦＳＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＲＹＴＦＴＥＹＴＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＧＩＮＰＮＮＧＩＰＮＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＶＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＲＩＡＹＧＹＤＥＧＨＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＤＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＴＴＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＥＧＴＳＴＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＡＤＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＲＲＫＲＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰｍｓｅｌｉｋｅｎｍｈｍｋｌｙｍｅｇｔｖｎｎｈｈｆｋｃｔｓｅｇｅｇｋｐｙｅｇｔｑｔｍｋｉｋｖｖｅｇｇｐｌｐｆａｆｄｉｌａｔｓｆｍｙｇｓｋａｆｉｎｈｔｑｇｉｐｄｆｆｋｑｓｆｐｅｇｆｔｗｅｒｉｔｔｙｅｄｇｇｖｌｔａｔｑｄｔｓｆｑｎｇｃｉｉｙｎｖｋｉｎｇｖｎｆｐｓｎｇｐｖｍｑｋｋｔｒｇｗｅａｎｔｅｍｌｙｐａｄｇｇｌｒｇｈｓｑｍａｌｋｌｖｇｇｇｙｌｈｃｓｆｋｔｔｙｒｓｋｋｐａｋｎｌｋｍｐｇｆｈｆｖｄｈｒｌｅｒｉｋｅａｄｋｅｔｙｖｅｑｈｅｍａｖａｋｙｃｄｌｐｓｋｌｇｈｒ
配列番号２６：コントロール（抗ＦＨＡ）ＢｉＴＥ−Ｐ２Ａ−ＲＦＰ （斜字体 ＝リーダー、太字 ＝フリン切断部位、下線＝Ｐ２Ａ配列、小文字＝ＲＦＰ）
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＬＤＩＶＭＴＱＡＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＫＳＶＳＳＳＧＹＮＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＬＡＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＥＥＤＡＡＴＹＹＣＱＨＳＲＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＧＳＳＲＳＳＬＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＧＹＴＭＨＷＶＲＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＧＩＮＰＫＮＧＧＩＩＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＳＭＥＬＲＳＬＴＳＤＤＳＡＶＹＹＣＡＲＲＶＹＤＤＹＰＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＴＳＧＧＧＧＳＤＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＴＴＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＥＧＴＳＴＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＡＤＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＲＲＫＲＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰｍｓｅｌｉｋｅｎｍｈｍｋｌｙｍｅｇｔｖｎｎｈｈｆｋｃｔｓｅｇｅｇｋｐｙｅｇｔｑｔｍｋｉｋｖｖｅｇｇｐｌｐｆａｆｄｉｌａｔｓｆｍｙｇｓｋａｆｉｎｈｔｑｇｉｐｄｆｆｋｑｓｆｐｅｇｆｔｗｅｒｉｔｔｙｅｄｇｇｖｌｔａｔｑｄｔｓｆｑｎｇｃｉｉｙｎｖｋｉｎｇｖｎｆｐｓｎｇｐｖｍｑｋｋｔｒｇｗｅａｎｔｅｍｌｙｐａｄｇｇｌｒｇｈｓｑｍａｌｋｌｖｇｇｇｙｌｈｃｓｆｋｔｔｙｒｓｋｋｐａｋｎｌｋｍｐｇｆｈｆｖｄｈｒｌｅｒｉｋｅａｄｋｅｔｙｖｅｑｈｅｍａｖａｋｙｃｄｌｐｓｋｌｇｈｒ
配列番号３３：スプライスアクセプター配列
ＣＡＧＧ
配列番号５５：短いスプライスアクセプター（ＳＳＡ）ＤＮＡ配列（ｎｕｌｌ配列）
ＣＡＧＧ
配列番号５８：コザック配列（ｎｕｌｌ配列）
ＣＣＡＣＣ

Claims (47)

  1. 式（Ｉ）：
    ５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−Ｂ２−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ（Ｉ）
    式中、
    Ｂ１は結合であるか、又はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はＥ１Ａ−Ｅ１Ｂを含み、
    ＢＡは、−Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含み、
    Ｂ２は結合であるか、又はＥ３を含み、
    ＢＸは結合であるか、又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子、又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、
    ＢＢはＬ５を含み、
    ＢＹは結合であるか、又は制限部位、１つ又は複数の導入遺伝子、又はその両方を含むＤＮＡ配列であり、
    Ｂ３は結合であるか、又はＥ４を含み、
    ここで、アデノウイルスは、少なくとも２つの結合ドメイン、Ｂｄ１及びＢｄ２を含む第１の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）をコードし、ここでＢｄ１などの前記ドメインの少なくとも１つは、Ｔ細胞などの免疫細胞上の表面抗原に特異的であり、少なくとも２つの結合ドメイン、Ｂｄ３及びＢｄ４を含む第２のＢｉＴＥ、ならびにＢｄ３などの少なくとも１つの前記結合ドメインは、Ｔ細胞などの免疫細胞上の表面抗原に特異的であり、
    前記アデノウイルスはＥｎＡｄ又はＡｄ１１である、式（Ｉ）の配列を含むアデノウイルス。
  2. 前記アデノウイルスがＥｎＡｄである、請求項１に記載のアデノウイルス。
  3. 前記表面抗原が、ＣＤ３、ＴＣＲ−α及びＴＣＲ−βから選択されるものなどのＴ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）の成分である、請求項１又は２に記載のアデノウイルス。
  4. 前記表面抗原は、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ及びＣＤ３δなどのＣＤ３、特にＣＤ３εである、請求項３に記載のアデノウイルス。
  5. 前記ＢｉＴＥ中の前記結合ドメインの１つがＣＤ３１、ＣＤ２及びＣＤ２７７のような非ＴＣＲ活性化タンパク質に特異的である、請求項１又は２に記載のアデノウイルス。
  6. 第１のＢｉＴＥ中の結合ドメイン（例えばＢｄ１）及び第２のＢｉＴＥ中の結合ドメイン（例えばＢｄ３）が、Ｔ細胞などの免疫細胞上の同じ表面抗原に特異的である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  7. 第１のＢｉＴＥ中の結合ドメイン（例えばＢｄ１）及び第２のＢｉＴＥ中の結合ドメイン（例えばＢｄ２）が、例えば同一の又は異なる免疫細胞上で、異なる表面抗原に特異的である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  8. 前記第１のＢｉＴＥ中のＢｄ２及び前記第２のＢｉＴＥ中のＢｄ４が同じ対象の抗原に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  9. 前記第１のＢｉＴＥ中のＢｄ２及び前記第２のＢｉＴＥ中のＢｄ４が異なる対象の抗原に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  10. 前記結合ドメインのうちの１つが、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ受容体ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＥＭ、Ａ３３、Ｇ２５０、炭水化物抗原Ｌｅｙ、ＬｅＸ、Ｌｅｂ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｅ−カドヘリン、ＳＰＡＲＣ、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３などの腫瘍抗原に特異的である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  11. 前記結合ドメインの１つ、例えばＢｄ２及び／又はＢｄ４が、ＥｐＣＡＭに特異的である、請求項１０に記載のアデノウイルス。
  12. 前記結合ドメインの１つが腫瘍間質抗原、例えば線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＴＲＥＭ１、ＩＧＦＢＰ７、ＦＳＰ−１、血小板由来成長因子−α受容体（ＰＤＧＦＲ−α）、血小板由来成長因子−β受容体（ＰＤＧＦＲ−β）及びビメンチンに特異的である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  13. 前記結合ドメインの１つ、例えばＢｄ２及び／又はＢｄ４が、ＦＡＰに特異的である、請求項１２に記載のアデノウイルス。
  14. 前記間質抗原が、骨髄由来サプレッサー細胞抗原、腫瘍関連マクロファージ、及びそれらの組み合わせから選択される抗原である、請求項１２又は１３に記載のアデノウイルス。
  15. 前記抗原がＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＳＦ１受容体、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＤ６６ｂ及びそれらの２つ以上の組み合わせから選択される、請求項１４に記載のアデノウイルス。
  16. ＢＸ又はＢＹの少なくとも一方が結合ではない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  17. 前記アデノウイルスがキメラである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  18. 前記アデノウイルスが腫瘍溶解性である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  19. 前記アデノウイルスの複製が可能である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  20. 前記アデノウイルスに複製能力がある、請求項１９に記載のアデノウイルス。
  21. 前記アデノウイルスが複製能欠損型である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  22. 第１のＢｉＴＥ及び第２のＢｉＴＥが、前記アデノウイルスの同じ位置にコードされている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  23. 第１のＢｉＴＥ及び第２のＢｉＴＥが、前記アデノウイルス内の異なる位置にコードされている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  24. 少なくとも１つのＢｉＴＥが、Ｅ１、Ｅ３、ＢＸ、ＢＹ及びそれらの組み合わせから選択される領域にコードされている、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  25. ＢｉＴＥが、例えばＣＭＶプロモーターなどの外因性プロモーターの制御下で、少なくともＢＸ位にコードされている、請求項２４に記載のアデノウイルス。
  26. ＢｉＴＥが、例えば主要後期プロモーターなどの内因性プロモーターの制御下、又はＣＭＶプロモーターなどの外因性プロモーターの制御下で少なくともＢＹ位にコードされている、請求項２４又は２５に記載のアデノウイルス。
  27. 例えば、両方のＢｉＴＥがＢＹ位にコードされている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  28. 導入遺伝子又は導入遺伝子カセットが内因性プロモーターである主要後期プロモーターの制御下にある、請求項２６又は２に記載のアデノウイルス。
  29. 前記ＢｉＴＥが短い半減期、例えば４８時間以下を有する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  30. 第１のＢｉＴＥ中の結合ドメイン（例えばＢｄ２）が腫瘍抗原、例えば本明細書中に開示される腫瘍抗原に特異的であり、第２のＢｉＴＥ中の結合ドメイン（例えばＢｄ４）が腫瘍間質抗原、例えば本明細書に記載のように、例えば線維芽細胞上の間質抗原又は腫瘍関連マクロファージ又は骨髄由来サプレッサー細胞に特異的である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  31. コードされたＢｉＴＥが、配列番号８に記載のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号９に記載のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一である配列を含むＶＬを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  32. 前記コードされたＢｉＴＥが、配列番号７に記載のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含むｓｃＦｖを含む、請求項３１に記載のアデノウイルス。
  33. 前記コードされたＢｉＴＥが、配列番号８に記載のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７に記載のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一である配列を含むＶＬを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  34. 前記コードされたＢｉＴＥが、配列番号７に記載のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一である配列を含むｓｃＦｖを含む、請求項３２に記載のアデノウイルス。
  35. 前記コードされたＢｉＴＥが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１２に記載のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一である配列を含むＶＬを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  36. 前記コードされたＢｉＴＥが、配列番号１１、７４、７５に記載のアミノ酸配列又はそれらのいずれか１つと少なくとも９５％同一である配列を含むｓｃＦｖを含む、請求項３４に記載のアデノウイルス。
  37. 前記コードされたＢｉＴＥが、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号１７に記載のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一である配列を含むＶＬを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  38. 前記コードされたＢｉＴＥが、配列番号１６、７２、７３に記載のアミノ酸配列又はそのいずれか１つと少なくとも９５％同一である配列を含むｓｃＦｖを含む、請求項３６に記載のアデノウイルス。
  39. 前記アデノウイルスが配列番号１２０に示される配列を含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  40. 前記アデノウイルスが少なくとも１つのさらなる導入遺伝子、例えば１、２、３又は４のさらなる導入遺伝子をコードする、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  41. 前記さらなる導入遺伝子が、サイトカイン、ケモカイン及び／又は免疫調節剤をコードし、例えばＢＹ位にコードされる、請求項３９に記載のアデノウイルス。
  42. 少なくとも１つのさらなる導入遺伝子が、例えばＭＩＰ１α、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、リンホトキシンα（ＬＴＡ）、Ｆｌｔ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−８から選択される、サイトカインをコードする、請求項３９又は４０に記載のアデノウイルス。
  43. 少なくとも１つのさらなる導入遺伝子が、例えばＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１から選択されるケモカインをコードする、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  44. 請求項１〜４２のいずれか一項に記載のアデノウイルス、及び希釈剤又は担体を含む、組成物。
  45. 前記製剤が第２の腫瘍溶解性ウイルス、例えばＡｄ１１又はその誘導体、例えばＥｎＡｄを含み、特に追加のウイルスが本開示によるものである、請求項４３に記載の組成物。
  46. 請求項１〜４３のいずれか一項に記載のアデノウイルス又は請求項４４もしくは４５に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、患者を治療する方法。
  47. 癌、特に固形腫瘍の治療のための請求項４５に記載の方法。
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