KR102491752B1 - 이중특이성 T 세포 세포 관여자(BiTE)가 보강된 아데노바이러스 - Google Patents

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조슈아 데이비드 프리드맨
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레너드 윌리엄 시모어
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Abstract

변형된 아데노바이러스, 특히 적어도 2개의 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 T 세포 관여자(BiTE)가 보강된 에나데노툭시레브(EnAd)로서, 도메인 중 적어도 하나는 관심 대상의 T-세포 상의 표면 항원에 특이적인, 아데노바이러스. 또한 조성물, 예컨대, 바이러스를 포함하는 약제학적 제형, 암의 치료에서와 같은 치료를 위한 바이러스 및 바이러스 제형의 용도가 제공된다. 본 개시내용은 또한 바이러스를 제조하는 방법으로 확장된다.

Description

이중특이성 T 세포 세포 관여자(BiTE)가 보강된 아데노바이러스 {Adenovirus armed with bispecific T cell engagner(BITE)}
본 개시내용은 적어도 2개의 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 T 세포 관여자(Bispecific T cell Engager: BiTE)가 보강된(armed) 변형된 아데노바이러스, 특히 에나데노툭시레브(Enadenotucirev: EnAd)에 관한 것이되, 도메인 중 적어도 하나는 관심 대상의 T-세포 상의 표면 항원에 특이적이다. 본 개시내용은 추가로, 특히 치료에서, 특히 암 치료에서의 조성물, 예컨대, 바이러스를 포함하는 약제학적 제형, 바이러스의 용도 및 바이러스 제형에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 바이러스 및 이를 암호화하는 DNA를 제조하는 방법으로 확장된다.
암은 환자 및 그들의 가족의 어려움 및 고통에 관해, 그리고 또한 환자를 치료하고, 관리하며 지원하는 높은 재정적 비용에 관해, 사회에 대한 여전히 거대한 사회적 부담이다.
화학치료제, 방사선요법 및 더 최근에는 생물학, 예컨대, 항체를 포함하는 암 치료에 대해 매우 다양한 요법이 개발되었다. 암에 대한 항체-기반 요법은 과거 15년에 걸쳐 확립되었고, 현재 혈액학적 악성종양 및 고형종양을 갖는 환자를 치료하기 위한 가장 성공적이고 중요한 전략 중 하나이다. 현재 임상에서 단클론성 항체 기반 항암 요법의 예는 CD20을 표적화하는 리툭시맙, VEGF를 표적화하는 베바시주맙, EGFR을 표적화하는 세툭시맙 및 CEA를 표적화하는 라베투주맙을 포함한다.
개발된 다양한 항체 형식 중에서도, 이중특이성 T-세포 관여자(BiTE)는 큰 유망함을 나타낸다. 이들은 T-세포의 TCR 복합체의 CD3ε 서브유닛에 특이적이고 또한 암 항원과 같은 관심 대상의 항원을 표적화하는 상대적으로 단순한 이중특이성 분자이다. BiTE는 TCR 복합체에 특이적이기 때문에, 이는 BiTE가 세포 표면 상에서 특정 표적 항원을 발현시키는 세포, 예를 들어, 암 세포를 사멸시키도록 체류 T-세포를 활성화시키는 것을 가능하게 한다. BiTE의 중요한 특성은 CD4+ 및 비활성화된 CD8+ T-세포가 암 세포를 표적화하도록 하는 그들의 능력이다. 다시 말해서, BiTES에 의해 활성화된 T-세포는 세포 표면 상에서 MHC 발현과 독립적으로 세포를 사멸시키도록 이루어질 수 있다. 이는 일부 종양 세포가 그들을 CAR-T 세포 및 immTAC와 같은 제제에 대해 내성을 만들도록 MHC를 하향조절하기 때문에 중요하다.
불행하게도, BiTE는 전장 항체에 대해 불량한 순환 역학을 가진다. 이는 환자에게 투여될 때, 큰 비율의 BiTE가 그들의 표적 세포에 도달하지 않는다는 것을 의미한다. 추가로, BiTE의 부분으로서 고친화도 항-CD3 ScFv의 사용은 혈액에서 T-세포에 대한 강한 결합을 야기할 수 있는데, 이는 또한 종양에 대한 전달을 방해한다. 그 결과, BiTE는 그들이 종양 세포에 효과적으로 전달될 수 없기 때문에 항암 요법으로서 그들의 전체 가능성에 도달할 수 없게 한다.
종양 세포에 대한 BiTE와 같은 치료제의 효과적인 전달의 필요는 점점 더 중요하게 되었는데, 다수의 방법으로, 예를 들어, 종양 주변에서 기질이 발생함으로써 고형 종양이 생체내에서 그 자신을 보호한다는 것이 점점 더 분명해지고 있기 때문이다. 암종으로의 진행은 활성화된 종양 기질의 발생과 함께 상피 세포(유사분열 세포)의 증식과 관련된다. 이 경우에, 세포외 기질(extracellular-matrix: ECM) 성분, 예컨대, 콜라겐 다발은 증가된 전환(turnover) 때문에 분해된다. 염증 세포의 수는 증가하며, 섬유아세포는 근섬유아세포로 분화하여, 성장 인자, 기질 성분 및 분해 프로테아제의 그들의 발현을 초래한다. 매우 다수의 누수(leaky) 종양 혈관을 초래하는 혈관신생이 유지된다. 지속적 혈관신생을 갖는 종양 기질의 활성화 후에, 종양 세포에 의한 침해는 분해된 기저막을 통해 시작되며, 혈관은 종양 조직을 침윤한다.
이 기질은 종양과 싸우도록 보내지는 트랩핑 면역 세포의 기능을 가질 수 있다는 점에서 물리적 보호이다. 추가로 기질은 종양의 저산소 미세환경을 가리는데, 이는 종양 성장을 위해 허용되며 최적화된다. 기질 내 세포는 종양 에너지의 공급원이라는 일부 이론이 있다.
종양 기질의 다수 성분은 암의 목적의 역할을 하도록 변질된 섬유아세포이다. 기질에 침투하는 다른 세포는 사이토카인 및 케모카인, 예컨대, 면역 반응을 억제하는 IL-10을 분비함으로써 종양 성장을 촉진시킬 수 있는 2형(M2) 대식세포인 종양 관련 대식세포이다.
환경을 만드는 세포는 신체 전체적으로 발견되는 "천연" 면역 또는 결합 조직 세포이기 때문에, 종양 기질을 표적화하는 것은 특히 어렵다. 따라서, 치료제를 이용하여 이들 세포를 표적화하는 것은 심각한 표적을 벗어난 효과를 야기할 수 있다.
이런 이유로, BiTE를 종양 세포에 직접 전달하는 개선된 방법에 대한 필요가 있으며, 이는 최대의 치료적 이점, 특히 기질 섬유아세포에 의해 둘러싸인 종양 세포의 전달을 제공할 수 있다.
본 발명자들은 치료제가 종양에 직접 전달되는 가장 효과적인 방법 중 하나는, 예를 들어, 기질에서와 같이 T 세포를 활성화시키고 항원을 표적화하는 제제를 발현시키도록 조작된 종양 용해성(oncolytic) 아데노바이러스를 이용하는 것으로 여긴다.
따라서, 본 개시내용은 하기 식 (I)의 순서를 포함하는 아데노바이러스를 제공하되:
5'ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR (I)
(식 중:
B1은 결합이거나 또는 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하고;
BA는 -E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하며;
B2는 결합이거나 또는 E3을 포함하고;
BX는 결합이거나, 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이며;
BB는 L5를 포함하고;
BY는 결합이거나, 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이며;
B3은 결합이거나 또는 E4를 포함한다);
상기 아데노바이러스는 적어도 2개의 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 T 세포 관여자(BiTE)를 암호화하고, 상기 도메인 중 적어도 하나는 관심 대상의 면역 세포, 예컨대, 관심 대상의 T 세포 상의 표면 항원에 특이적이고; 그리고
상기 아데노바이러스는 EnAd 또는 Ad11이다.
본 개시내용에 따른 BiTE 또는 BiTE는 막관통 도메인을 포함하지 않으며, 따라서 암 세포 표면 상에서 발현되지 않고, 오히려 암 세포로부터 BiTE 분자의 방출을 용이하게 하도록 신호 서열을 포함한다.
다음의 단락은 본 개시내용의 요약이다:
1. 하기 식 (I)의 순서를 포함하는 아데노바이러스로서,
상기 아데노바이러스는 적어도 2개의 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 T 세포 관여자(BiTE)를 암호화하되, 상기 도메인 중 적어도 하나는 관심 대상의 면역 세포, 예컨대, 관심 대상의 T 세포 상의 표면 항원에 특이적이고; 그리고
상기 아데노바이러스는 EnAd 또는 Ad11인, 아데노바이러스:
5'ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR (I)
식 중:
B1은 결합이거나 또는 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하고;
BA는 -E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하며;
B2는 결합이거나 또는 E3을 포함하고;
BX는 결합이거나, 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이며;
BB는 L5를 포함하고;
BY는 결합이거나, 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이며;
B3은 결합이거나 또는 E4를 포함한다.
2. 단락 1에 있어서, 아데노바이러스는 EnAd인, 아데노바이러스.
3. 단락 1 또는 2에 있어서, 상기 표면 항원은 T-세포 수용체 복합체(TCR)의 성분, 예컨대, CD3, TCR-α 및 TCR-β인, 아데노바이러스.
4. 단락 3에 있어서, 표면 항원은 CD3, 예컨대, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ, 특히 CD3ε인, 아데노바이러스.
5. 단락 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 결합 도메인 중 하나는 종양 항원, 예컨대, CEA, MUC-1, EpCAM, HER 수용체 HER1, HER2, HER3, HER4, PEM, A33, G250, 탄수화물 항원 Ley, Lex, Leb, PSMA, TAG-72, STEAP1, CD166, CD24, CD44, E-카데린, SPARC, ErbB2 및 ErbB3에 특이적인, 아데노바이러스.
6. 단락 5에 있어서, 결합 도메인 중 하나는 EpCAM, 예를 들어, 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 EpCAM에 특이적인, 아데노바이러스.
7. 단락 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 결합 도메인 중 하나는 종양 기질 항원, 예를 들어, 섬유아세포 활성화 단백질(fibroblast activation protein: FAP), TREM1, IGFBP7, FSP-1, 혈소판-유래 성장 인자-α 수용체(PDGFR-α), 혈소판-유래 성장 인자-β 수용체(PDGFR-β) 및 비멘틴에 특이적인, 아데노바이러스.
8. 단락 7에 있어서, 결합 도메인 중 하나는 FAP, 예를 들어, 서열번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 FAP에 특이적인, 아데노바이러스.
9. 단락 7 또는 8에 있어서, 기질 항원은 골수 유래 억제 세포 항원, 종양 연관 대식세포, 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 아데노바이러스.
10. 단락 9에 있어서, 상기 항원은 CD163, CD206, CD68, CD11c, CD11b, CD14, CSF1 수용체, CD15, CD33, CD66b 및 이들 중 둘 이상의 조합으로부터 선택되는, 아데노바이러스.
11. 단락 1 내지 3 및 5 내지 10 중 어느 하나에 있어서, BiTE에서 결합 도메인 중 하나는 비-TCR 활성화 단백질, 예컨대, CD31, CD2 및 CD277에 특이적인, 아데노바이러스.
12. 단락 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, BX 또는 BY 중 적어도 하나는 결합이 아닌, 아데노바이러스.
13. 단락 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스는 키메라인, 아데노바이러스.
14. 단락 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스는 종양 용해성인, 아데노바이러스.
15. 단락 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스는 복제 가능한, 아데노바이러스.
16. 단락 13에 있어서, 아데노바이러스는 복제 적격인, 아데노바이러스.
17. 단락 1 내지 14에 있어서, 아데노바이러스는 복제 결함인, 아데노바이러스.
18. 단락 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, BX는 하나 이상의 이식 유전자 또는 이식유전자 카세트를 포함하는, 아데노바이러스.
19. 단락 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, BY는 하나 이상의 이식 유전자 또는 이식유전자 카세트를 포함하는, 아데노바이러스.
20. 단락 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 이식 유전자 또는 이식유전자 카세트는 내인성 또는 외인성 프로모터, 예컨대, 내인성 프로모터의 제어 하에 있는, 아데노바이러스.
21. 단락 20에 있어서, 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 E4 프로모터 및 주요 후기 프로모터, 특히 주요 후기 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 내인성 프로모터의 제어 하에 있는, 아데노바이러스.
22. 단락 19에 있어서, 상기 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 외인성 프로모터, 예컨대, CMV의 제어 하에 있는, 아데노바이러스.
23. 단락 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자 카세트는 하기로부터 독립적으로 선택되는 조절 요소를 더 포함하는, 아데노바이러스:
a. 스플라이스 수용자 서열,
b. 내부 리보솜 유입 서열 또는 고 자기-절단 효율 A 펩타이드,
c. 코작(Kozak) 서열 및
d. 이들의 조합.
24. 단락 23에 있어서, 상기 이식유전자 카세트는 단백질 암호 서열의 시작에서 코작 서열을 포함하는, 아데노바이러스.
25. 제1항 내지 제24항 중 언으 한 항에 있어서, 상기 이식유전자 카세트는 높은 자기-절단 효율 A 펩타이드를 암호화하는, 아데노바이러스.
26. 단락 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자 카세트는 폴리아데닐화 서열을 더 포함하는, 아데노바이러스.
27. 단락 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 이식유전자 카세트는 DNA 서열의 말단에서 그리고/또는 DNA 서열의 말단에서 제한 부위를 더 포함하는, 아데노바이러스.
28. 단락 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 이식유전자 카세트는 모노시트론성 mRNA를 암호화하는, 아데노바이러스.
29. 단락 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 BiTE는 짧은 반감기, 예를 들어, 48시간 이하를 갖는, 아데노바이러스.
30. 단락 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, BiTE는 E1, E3, BX, BY 및 이들의 조합으로부터 선택되는 영역에서 암호화되는, 아데노바이러스.
31. 단락 30에 있어서, BiTE는 적어도 위치 BX에서, 예를 들어, 주요 후기 프로모터의 제어 하에 암호화되는, 아데노바이러스.
32. 단락 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스는 제2 BiTE를 더 암호화하는, 아데노바이러스.
33. 단락 32에 있어서, 제1 BiTE 분자는 종양 항원, 예를 들어, 종양 항원(예를 들어, 본 명세서에 열거됨)에 특이적이고, 제2 BiTE 분자는 종양 기질 항원, 예를 들어, 기질 항원(예를 들어, 본 명세서에 열거됨)에 특이적인, 아데노바이러스.
34. 단락 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스는 사이토카인 또는 케모카인 또는 면역조절자(예컨대, 사이토카인 또는 케모카인)를 더 포함하는, 아데노바이러스.
35. 단락 34에 있어서, 상기 사이토카인 또는 케모카인은 MIP1α, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-33, IL-35, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, 림포톡신 α(LTA), Flt3L, GM-CSF, IL-8, CCL2, CCL3, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, (예를 들어, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-33, IL-35, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, 림포톡신 α(LTA), GM-CSF, IL-8, CCL2, CCL3, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21), 예컨대, IL-12, IL-18, IL-22, IL-7, IL-15, IL-21, IFNγ, TNFα, 림포톡신 α(LTA), CCL3, CCL5, CXCL9, CXCL10, CXCL12, CCL2, CCL19 및 CCL21로부터 선택되는, 아데노바이러스.
36. 단락 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스는 관문 단백질, 예컨대, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT 또는 CD160, 예를 들어, CTLA-4, PD-1, PD-L1 및 PD-L2에, 또는 공자극 분자, 예컨대, CD28, CD80, CD86, CD83, ICOS, B7H2, TL1A 및 4-1BB에 특이적인 면역조절제, 예컨대, 항체 또는 항체 단편 또는 단백질 또는 펩타이드 리간드를 더 포함하는, 아데노바이러스.
37. 단락 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, BiTE는 서열번호 8, 13 또는 18 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 아데노바이러스.
38. 단락 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, BiTE는 서열번호 9, 12 또는 17 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 아데노바이러스.
39. 단락 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, BiTE는 서열번호 7, 11 또는 16 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는, 아데노바이러스.
40. 단락 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 BiTE는 서열번호 2 또는 4에 제시된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열, 예를 들어, 서열번호 73 또는 75에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 아데노바이러스.
41. 단락 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스는 서열번호 34 내지 37 중 임의의 하나에 제시된 DNA 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 DNA 산 서열, 예를 들어, 서열번호 79 내지 82 중 임의의 하나에 제시된 DNA 서열을 포함하는, 아데노바이러스.
42. 단락 1 내지 41 중 임의의 하나에 따른 아데노바이러스 및 희석제 또는 담체를 포함하는 조성물.
43. 치료적 유효량의 단락 1 내지 41 중 임의의 하나의 아데노바이러스 또는 단락 42의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 환자의 치료 방법.
44. 단락 43에 있어서, 암, 특히 고형 종양의 치료를 위한 방법.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 아데노바이러스는 적어도 하나의 추가적인 이식유전자, 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 추가적인 이식유전자를 암호화한다.
일 실시형태에서, 상이한 절단 펩타이드는 각각의 유전자 사이에서 암호화된다.
일 실시형태에서, 모든 이식유전자는 바이러스 내 하나의 위치에 있으며, 예를 들어, 위치 BY에 있다.
유리하게는, 본 발명자들은 BiTE 분자로 아데노바이러스를 보강하는 것이 암 세포를 선택적으로 감염시키는 아데노바이러스의 능력에 대해 이중특이성 항체 단편 분자가 '피기백(piggyback)'하도록 허용함으로써, 종양 세포에 대한 BiTE의 표적화된 전달을 가능하게 한다는 것을 발견하였다.
유리하게는, BiTE는 작으며 포유류 세포에서 만들어질 수 있다. 이런 이유로, 일단 본 개시내용의 아데노바이러스에 의해 감염된다면, BiTE 분자는 종양 세포에 의해 합성되고, 분비되며, 국소로 작용하여, 바이러스의 가장 가까운 풋프린트 뒤쪽으로 확산될 수 있다. 따라서 이는 BiTE가 감염의 가장 가까운 부위 뒤쪽으로 확산되도록 허용하지만, 동시에 감염된 종양 세포소 뒤쪽으로 훨씬 떨어져서 바이러스의 확산을 제한한다. 이는 원치않는 표적을 벗어난 효과의 위험을 최소화한다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 EnAd이다. EnAd는 선행 기술 아데노바이러스에 비해 향상된 종양세포 용해 활성을 갖는 것으로 나타났다. EnAd는 또한 인간 상피-유래 암종 세포, 예컨대, 결장, 폐, 방광 및 신장암 세포에 대해 높은 선택성을 갖는 것으로 나타났다. 이는 T-세포가 표적 세포를 공격하도록 BiTE 분자에 의해 활성화될 수 있는 한편, EnAd가 암세포를 동시에 감염시키고 용해시키기 때문에, BiTE 분자에 대한 이상적인 전달 비히클을 만들게 한다. 이는 상승적 종양세포 붕괴 효과를 갖는 종양에 대해 동시공격을 초래한다.
일 실시형태에서 표면 항원은 T-세포 수용체 복합체(TCR), 예컨대, CD3, TCR-α 및 TCR-β의 성분이다.
일 실시형태에서, 표면 항원은 CD3, 예컨대, CD3ε, CD3γ 및 CD3δ, 특히 CD3ε이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 종양 항원, 예컨대, CEA, MUC-1, EpCAM, HER 수용체(예컨대, HER1, HER2, HER3, HER4), PEM, A33, G250, 탄수화물 항원 Ley, Lex, Leb, PSMA, TAG-72, STEAP1, CD166, CD24, CD44, E-카데린, SPARC, ErbB2 및 ErbB3, 특히 EpCAM에 특이적이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 EpCAM, 예를 들어, 서열번호 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 EpCAM에 특이적이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 종양 기질 항원, 예를 들어, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), TREM1, IGFBP7, FSP-1, 혈소판-유래 성장 인자-α 수용체(PDGFR-α), 혈소판-유래 성장 인자-β 수용체(PDGFR-β) 및 비멘틴에 특이적이다. 유리하게는, 이들 항원을 발현시키는 기질 세포(비형질감염 세포)는 형질감염된 세포와 동일한 수준의 돌연변이-내성-선택 과정이 실시되지 않는다. 따라서, 이들 세포는 암 요법에 대한 표적에 대해 더 용이한데, 그들이 '움직이는 표적'이 아니기 때문이다. 더 나아가, 기질 세포에서 발견되는 수용체의 유형은 상이한 유형의 암에 걸쳐 종종 통상적이다. 이런 이유로, 상기 항원 중 하나의 표적화는 다중 암 유형에 대해 효과적일 가능성이 있다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 FAP, 예를 들어, 서열번호 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 FAP에 특이적이다. 유리하게는, FAP는 종양 연관 섬유아세포 상에서 상향조절된다. 섬유아세포는 간섭으로부터 성장, 침윤 및 회복을 뒷받침하는 고형 암종의 활력 성분이다. 그들은 전형적으로 진행된 암종에서 세포의 40 내지 60%를 포함한다. 유리하게는, 섬유아세포는 암 세포보다 요법을 벗어날 가능성이 더 적은 유전적으로 안정한 세포이다. 활성화된 섬유아세포는 또한 다양한 종양 유형에 걸쳐 상대적으로 유사하다. 따라서, 종양 연관 섬유아세포를 발현시키는 FAP를 표적화하고 사멸시키기 위해 T 세포를 활성화시킴으로써, 본 개시내용의 아데노바이러스는 면역 억제 경로의 범위, 예컨대, IL-10, TGFβ 및 IDO에 의해 매개되는 것을 감소시킬 수 있다.
다른 기질 표적은 종양 연관 대식세포 및 골수 유래 억제 세포 항원, 예를 들어, CD163, CD206, CD68, CD11c, CD11b, CD14, CSF1 수용체, CD15, CD33, CD66b 및 이들 중 2 이상의 조합을 포함한다.
일 실시형태에서, BiTE에서 결합 도메인 중 하나는 비-TCR 활성화 단백질, 예컨대, CD31, CD2 및 CD277에 특이적이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는, 예컨대, CD3(예컨대, CD3 델타, CD3 엡실론 또는 CD3 감마), TCR-α 쇄 및 TCR-β쇄로부터 선택되는 관심 대상의 T 세포 상의 표면 항원에 특이적이며, 하나의 결합 도메인은 종양 항원에 특이적이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 CD3에 특이적이며, 그리고 다른 결합 도메인은, 예를 들어, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양항원에 대해 특이적이다: CEA, MUC-1, EpCAM, HER 수용체 HER1, HER2, HER3, HER4, PEM, A33, G250, 탄수화물 항원 Ley, Lex, Leb, PSMA, TAG-72, STEAP1, CD166, CD24, CD44, E-카데린, SPARC, ErbB2 및 ErbB3.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 CD3(예컨대, CD3 델타, CD3 엡실론 또는 CD3 감마)에 특이적이며, 다른 결합 도메인은 EpCAM에 특이적이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 CD3ε에 특이적이고, 다른 결합 도메인은 EpCAM에 특이적이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 CD3(예컨대, CD3 델타, CD3 엡실론 또는 CD3 감마), TCR-α 및 TCR-β로부터 선택되는 관심 대상의 T 세포 상의 표면 항원에 특이적이고, 다른 결합 도메인은 종양 기질 항원에 특이적이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 CD3(예컨대, CD3 델타, CD3 엡실론 또는 CD3 감마)에 특이적이고, 다른 결합 도메인은, 예를 들어: 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), TREM1, IGFBP7, FSP-1, 혈소판-유래 성장 인자-α 수용체(PDGFR-α), 혈소판-유래 성장 인자-β 수용체(PDGFR-β) 및 비멘틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 종양 기질 항원에 특이적이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 CD3(예컨대, CD3 델타, CD3 엡실론 또는 CD3 감마)에 특이적이며, 다른 결합 도메인은 FAP에 특이적이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 CD3ε에 특이적이고, 다른 결합 도메인은 FAP에 특이적이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 관심 대상의 T 세포 상의 표면 항원, 예컨대, CD3, TCR-α 및 TCR-β에 특이적이고, 다른 결합 도메인은 비-TCR 활성화 단백질에 특이적이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 CD3(예컨대, CD3 델타, CD3 엡실론 또는 CD3 감마)에 특이적이고, 다른 결합 도메인은 CD31, CD2 및 CD277로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-TCR 활성화 단백질에 특이적이다.
일 실시형태에서, 결합 도메인 중 하나는 CD3ε에 특이적이고, 다른 결합 도메인은 CD31, CD2 및 CD277로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-TCR 활성화 단백질에 특이적이다.
일 실시형태에서, BX 또는 BY 중 적어도 하나는 결합이 아니다.
일 실시형태에서, BX는 결합이 아니다.
일 실시형태에서, BY는 결합이 아니다.
일 실시형태에서, BX와 BY는 둘 다 결합이 아니다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 키메라이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 종양 용해성이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 키메라 및 종양 용해성이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 복제 가능하다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 키메라, 종양 용해성 및 복제 가능하다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 복제 적격이다.
다른 실시형태에서, 아데노바이러스는 키메라, 종양 용해성 및 복제 적격이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 복제 결함이며, 즉, 벡터이다.
일 실시형태에서 BX는 이식유전자 또는 이식유전자 카세트, 특히 본 개시내용에 따른 BiTE를 암호화하는 이식유전자 카세트를 포함한다.
일 실시형태에서 BY는 이식유전자 또는 이식유전자 카세트, 특히 본 개시내용에 따른 BiTE를 암호화하는 이식유전자 카세트를 포함한다.
일 실시형태에서 BY는 이식유전자 또는 이식유전자 카세트, 특히 본 개시내용에 따른 BiTE를 암호화하는 이식유전자 카세트를 포함하고, BX는 결합을 나타낸다.
일 실시형태에서, BX와 BY는 둘 다 이식유전자 또는 이식유전자 카세트를 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 이식 유전자 또는 이식유전자 카세트는 내인성 또는 외인성 프로모터, 예컨대, 내인성 프로모터의 제어 하에 있다. 유리하게는, 이들 프로모터의 제어 하에 있을 때, 바이러스는 복제 적격으로 남아있으며 또한 BiTE 및/또는 다른 단백질을 발현시킬 수 있다. 따라서, 선택의 BiTE는 암세포에 의해 발현될 것이다. 외인성 프로모터를 사용하는 것은 일부 실시형태에서 유리할 수 있는데, 일부 상황에서, 예를 들어, 환자가 매우 만연한 암을 갖는 경우에, 특히 유용할 수 있는 항체 또는 단편을 강하게 그리고 구성적으로 발현시킬 수 있기 때문이다. 내인성 프로모터를 사용하는 것은 BiTE를 발현시키는 데 혼입될 필요가 있는 이식유전자 카세트 크기를 감소시키기 때문에 유리할 수 있고, 즉, 외인성 프로모터가 포함될 필요가 없기 때문에 카세트는 더 작을 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 E4 및 주요 후기 프로모터, 특히 주요 후기 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 내인성 프로모터의 제어 하에 있다. 바이러스가 이식유전자를 지속적으로 전사시키는 구성적 외인성 프로모터와 대조적으로 암 세포에서 복제성이고 항체 또는 단편의 부적절한 농도를 야기할 수 있을 때 이식유전자는 단지 발현되기 때문에, 바이러스에서 내인성 프로모터를 사용하는 것은 또한 치료 관련하여 유리할 수 있다.
일 실시형태에서, 이식유전자 또는 이식유전자 카세트(예를 들 BiTE를 암호화)는 외인성 프로모터, 예컨대, CMV의 제어 하에 있다. 유리하게는, 구성적 외인성 프로모터의 사용은 특정 예에서 바람직할 수 있는 이식유전자의 지속적 전사를 초래한다.
일 실시형태에서, 하나의 이식유전자 또는 이식유전자 카세트(예를 들어, BiTE를 암호화)는 내인성 프로모터의 제어 하에 있고, 다른 이식유전자 또는 이식유전자 카세트(예를 들어, BiTE를 암호화)는 외인성 프로모터의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서 바이러스에서 모든 이식유전자 또는 이식유전자 카세트(예를 들어, BiTE를 암호화)는 내인성 프로모터의 제어 하에 있다.
다른 실시형태에서 바이러스에서 모든 이식유전자 또는 이식유전자 카세트(예를 들어, BiTE를 암호화)는 외인성 프로모터의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서, 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 하기로부터 독립적으로 선택되는 조절 요소를 추가로 포함한다:
i) 스플라이스 수용자 서열,
ii) 내부 리보솜 유입 서열 또는 고 자기-절단 효율 2A 펩타이드,
iii) 코작(Kozak) 서열 및
iv) 이들의 조합.
따라서, 일 실시형태에서 이식유전자 카세트는 i) 또는 ii) 또는 iii) 또는 iv)를 포함한다.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 i)과 ii), 또는 i) 및 iii), 또는 i) 및 iv), 또는 ii) 및 iii), 또는 ii)와 iv), 또는 iii) 및 iv)를 포함한다.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 i) 및 ii) 및 iii), 또는 i) 및 ii) 및 iv), 또는 i) 및 iii) 및 iv), 또는 ii) 및 iii) 및 iv)를 포함한다.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 i) 및 ii) 및 iii) 및 iv)를 포함한다.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 mRNA의 번역을 보조하는 단백질(예를 들어, BiTE) 암호 서열의 시작에서 코작 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 높은 자기 절단 효율 2A 펩타이드를 암호화한다.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 DNA 서열의 3' 말단에서 그리고/또는 DNA 서열의 5' 말단에서 제한 부위를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서 적어도 하나의 이식유전자 카세트는 모노시트론성 mRNA를 암호화한다.
일 실시형태에서, BiTE 분자는 짧은 반감기, 예를 들어, 48시간 이하를 가진다.
일 실시형태에서, BiTE 분자는 E1, E3, BX, BY 및 이들의 조합으로부터 선택되는 영역에서 암호화된다. 유리하게는, 본 발명자들은 다양한 이식유전자가 바이러스의 생활사 또는 벡터의 안정성에 유해하게 영향을 미치는 일 없이 외인성 또는 내인성 프로모터의 제어 하에 BX 및/또는 BY 내로 삽입될 수 있다는 것을 확립하였다.
일 실시형태에서, BiTE 분자는 위치 BX에서, 예를 들어, 주요 후기 프로모터의 제어 하에서 적어도 암호화된다. 유리하게는, 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 BiTE 또는 임의의 추가적인 분자가 아데노바이러스 그 자체와 함께 발현되도록 허용한다. 중요하게는, 본 발명자들은 BiTE의 발현이 EnAd이 복제하는 능력에 상당하게 영향을 미치지도 또는 그의 종양세포 용해 활성에 부정적으로 영향을 미치지도 않는 다는 것을 성공적으로 입증하였다.
일 실시형태에서, BiTE 분자는 위치 BY에서, 예를 들어, 주요 후기 프로모터의 제어 하에서 적어도 암호화된다. 유리하게는, 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 BiTE 또는 임의의 추가적인 분자가 아데노바이러스 그 자체와 함께 발현되도록 허용한다. 중요하게는, 본 발명자들은 BiTE의 발현이 EnAd이 복제하는 능력에 상당하게 영향을 미치지도 또는 그의 종양세포 용해 활성에 부정적으로 영향을 미치지도 않는다는 것을 성공적으로 입증하였다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 제2 BiTE를 추가로 암호화한다.
일 실시형태에서, 제1 BiTE 분자는 종양 항원, 예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 종양 항원에 특이적이고, 제2 BiTE 분자는 종양 기질 항원, 예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 기질 항원에 특이적이다.
일 실시형태에서, 제1 BiTE 분자는 CEA, MUC-1, EpCAM, HER 수용체 HER1, HER2, HER3, HER4, PEM, A33, G250, 탄수화물 항원 Ley, Lex, Leb, PSMA, TAG-72, STEAP1, CD166, CD24, CD44, E-카데린, SPARC, ErbB2 및 ErbB3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 항원에 특이적이고, 제2 BiTE 분자는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), TREM1, IGFBP7, FSP-1, 혈소판-유래 성장 인자-α 수용체(PDGFR-α), 혈소판-유래 성장 인자-β 수용체(PDGFR-β) 및 비멘틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 기질 항원에 특이적이다.
일 실시형태에서, 제1 BiTE 분자는 EpCAM에 특이적이고, 제2 BiTE 분자는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), TREM1, IGFBP7, FSP-1, 혈소판-유래 성장 인자-α 수용체(PDGFR-α), 혈소판-유래 성장 인자-β 수용체(PDGFR-β) 및 비멘틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 기질 항원에 특이적이다.
일 실시형태에서, 제1 BiTE 분자는 CEA, MUC-1, EpCAM, HER 수용체 HER1, HER2, HER3, HER4, PEM, A33, G250, 탄수화물 항원 Ley, Lex, Leb, PSMA, TAG-72, STEAP1, CD166, CD24, CD44, E-카데린, SPARC, ErbB2 및 ErbB3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 항원에 특이적이고, 제2 BiTE는 FAP에 특이적이다.
일 실시형태에서, 제1 BiTE 분자는 EpCAM에 특이적이고, 제2 BiTE 분자는 FAP에 특이적이다.
다른 실시형태에서, 제1 BiTE 분자는 종양 항원에 특이적이고, 제2 BiTE 분자는 비-TCR 활성화 단백질에 특이적이다.
일 실시형태에서, 제1 BiTE 분자는 CEA, MUC-1, EpCAM, HER 수용체s HER1, HER2, HER3, HER4, PEM, A33, G250, 탄수화물 항원 Ley, Lex, Leb, PSMA, TAG-72, STEAP1, CD166, CD24, CD44, E-카데린, SPARC, ErbB2 및 ErbB3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 항원에 특이적이다.
일 실시형태에서, 제1 BiTE 분자는 EpCAM에 특이적이고, 제2 BiTE 분자는 CD31, CD2 및 CD277로 이루어진 군으로부터 선택되는 비TCR 활성화 단백질에 특이적이다.
일 실시형태에서, 제1 BiTE 분자는 종양 기질 항원에 특이적이고, 제2 BiTE 분자는 비-TCR 활성화 단백질에 특이적이다.
일 실시형태에서, 제1 BiTE 분자는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), TREM1, IGFBP7, FSP-1, 혈소판-유래 성장 인자-α 수용체(PDGFR-α), 혈소판-유래 성장 인자-β 수용체(PDGFR-β) 및 비멘틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 기질 항원에 특이적이고, 제2 BiTE 분자는 CD31, CD2 및 CD277로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-TCR 활성화 단백질에 특이적이다.
일 실시형태에서, 제1 BiTE 분자는 FAP에 특이적이고, 제2 BiTE 분자는 CD31, CD2 및 CD277로 이루어진 군으로부터 선택되는 비TCR 활성화 단백질에 특이적이다.
일 실시형태에서 아데노바이러스는 1개의 BiTE만을 포함한다.
다른 실시형태에서, 아데노바이러스는 2개의 BiTE를 포함한다.
다른 실시형태에서, 아데노바이러스는 3개의 BiTE를 포함한다.
1, 2 또는 3개의 BiTE를 암호화하는 것에 추가로, 바이러스는 또한 1, 2, 3 또는 4개의 추가적인 이식유전자를 암호화할 수 있다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 사이토카인 또는 케모카인을 추가로 암호화한다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 사이토카인을 추가로 암호화한다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 케모카인을 추가로 암호화한다.
다른 실시형태에서, 아데노바이러스는 사이토카인 및 케모카인을 추가로 암호화한다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 1개의 BiTE 및 적어도 1종의 사이토카인 또는 케모카인, 예를 들어, 1, 2 또는 3종의 사이토카인, 1, 2 또는 3종의 케모카인 또는 2 또는 3가지 유전자의 조합을 포함하며, 각각의 유전자는 케모카인의 사이토카인을 독립적으로 암호화한다.
다른 실시형태에서, 아데노바이러스는 2개의 BITE 및 적어도 1종의 사이토카인 또는 케모카인, 예를 들어, 1 또는 2종의 사이토카인, 1 또는 2종의 케모카인 또는 사이토카인과 케모카인의 조합을 포함한다.
다른 실시형태에서, 아데노바이러스는 3개의 BiTE 및 적어도 1종의 사이토카인 또는 케모카인을 포함한다.
일 실시형태에서, 사이토카인 또는 케모카인은 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-33, IL-35, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, 림포톡신 α(LTA) 및 GM-CSF, IL-8, CCL2, CCL3, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, 예를 들어, IL-12, IL-18, IL-22, IL-7, IL-15, IL-21, IFNγ, TNFα, 림포톡신 α(LTA), CCL3, CCL5, CXCL9, CXCL12, CCL2, CCL19 및 CCL21로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 암호화된 사이토카인은 TNF 알파 슈퍼 패밀리(TNFRSF는 TNF-알파, TNF-C, OX40L, CD154, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR 리간드, EDA-A, EDA-A2를 포함함), TGF-베타 슈퍼패밀리, IL-1 패밀리(즉, IL-1 및 IL-8), IL-2 패밀리, IL-10 패밀리, IL-17 패밀리, 인터페론 패밀리로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 케모카인은 MIP-1 알파, RANTES, IL-8, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 및 CCL21을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 관문 단백질 또는 공자극 분자에 특이적인 면역조절제, 예컨대, 항체 또는 항체 단편, 또는 단백질 또는 펩타이드 리간드, 또는 이러한 분자에 대한특이적 결합 리간드를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 면역조절제는 관문 단백질, 예컨대, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT 또는 CD160, 예를 들어, CTLA-4, PD-1, PD-L1 및 PD-L2에 특이적인 항체 또는 항체 단편, 또는 펩타이드 또는 펩타이드 리간드이다.
일 실시형태에서, 면역조절제는 저해제, 예를 들어, 면역관문 저해제이다.
일 실시형태에서, 면역조절제는 작용제이다.
다른 실시형태에서, 면역조절제는 공자극 분자, 예컨대, CD28, CD80, CD86, CD83, ICOS, B7H2, TL1A 및 4-1BB에 특이적인 항체 또는 항체 단편, 또는 단백질 또는 펩타이드 리간드이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 관문 단백질에 특이적인 제1 항체, 항체 단편, 단백질 또는 펩타이드 리간드 및 공자극 분자에 특이적인 제2 항체, 항체 단편, 단백질 또는 펩타이드 리간드를 포함한다.
일 실시형태에서, BiTE는 서열번호 8, 13 또는 18 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, BiTE는 서열번호 9, 12 또는 17 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, BiTE는 서열번호 7, 11 또는 16 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는(즉, 아데노바이러스에 의해 암호화된) BiTE는 서열번호 8에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열번호 9에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 VL 도메인을 갖는 결합 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는(즉, 아데노바이러스에 의해 암호화된) BiTE는 서열번호 13에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열번호 12에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 VL 도메인을 갖는 결합 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는(즉, 아데노바이러스에 의해 암호화된) BiTE는 서열번호 18에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열번호 17에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 VL 도메인을 갖는 결합 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는(즉, 아데노바이러스에 의해 암호화된) BiTE는 서열번호 8에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열번호 9에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 VL 도메인, 및 서열번호 13에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열번호 12에 나타낸 서열을 갖는 VL 도메인 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 결합 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는(즉, 아데노바이러스에 의해 암호화된) BiTE는 서열번호 8에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열번호 9에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 VL 도메인, 및 서열번호 18에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열번호 17에 나타낸 서열을 갖는 VL 도메인 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 결합 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는(즉, 아데노바이러스에 의해 암호화된) BiTE는 서열번호 7, 11, 16에 나타낸 서열 또는 이 중 임의의 하나에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는(즉, 아데노바이러스에 의해 암호화된) BiTE는 서열번호 7에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는(즉, 아데노바이러스에 의해 암호화된) BiTE는 서열번호 11에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는(즉, 아데노바이러스에 의해 암호화된) BiTE는 서열번호 16에 나타낸 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, BiTE는 서열번호 2 또는 4에 제시된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%인 아미노산 서열, 예를 들어, 서열번호 73 또는 75에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 아데노바이러스는 서열번호 34 내지 37 중 임의의 하나에 제시된 DNA 서열, 또는 엄격한 조건 하에 혼성화하는 DNA 산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 아데노바이러스는 서열번호 서열번호 79 내지 82 중 임의의 하나에 제시된 DNA 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 아데노바이러스는 서열번호 34, 35, 36, 37, 79, 80, 82, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 120, 298 중 임의의 하나에 나타낸 DNA 서열 또는 동일한 바이러스를 암호화하는 서열, 또는 엄격한 조건 하에 임의의 이들에 혼성화하는 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 아데노바이러스는 서열번호 34, 35, 36, 37, 79, 80, 82, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 120 또는 298 중 임의의 하나에 나타낸 DNA 서열을 포함한다.
당업자는 DNA 암호의 중복이 있으며, 따라서 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 아미노산을 갖는 BiTE를 암호화하는 EnAd 또는 Ad11로 확장된다는 것을 안다.
C-말단의 데카-His(HHHHHHHHHH 서열번호 24) 친화도 태그는 BiTE 또는 아데노바이러스의 정제에 유용하다. 그러나, 이는 선택적이며, 예를 들어, 최종 생성물에서 제외될 수 있다. 당업자는 또한 데카-His 이외의 다른 친화도 태그가 사용될 수 있고, 마찬가지로 BiTE 또는 아데노바이러스의 생물학적 기능에 영향을 미치는 일 없이 제외될 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 일 실시형태에서, BiTE는 서열번호 2 또는 4 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하지만, 서열의 C-말단에서, 예를 들어, 서열번호 73 또는 75에 제시된 바와 같은 데카-His 친화도 태그를 제외한다. 다른 실시형태에서, 아데노바이러스는 서열번호 34 내지 37 중 임의의 하나에 제시된 DNA 서열을 포함하지만, 데카-His 친화도 태그, 예를 들어, 서열번호 79 내지 82 중 임의의 하나에 제시된 DNA 서열을 제외한다.
데카-His 친화도 태그의 제외는 데카-His 친화도 태그를 포함하는 본 명세서에 개시된 모든 다른 서열로 추가로 확장되며, 즉, 본 개시내용은 동일한 아미노산 또는, 예를 들어, 서열번호 72 내지 82 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 C-말단의 데카-His 태그를 결여하는 DNA 서열(HHHHHHHHHH 또는 CATCACCATCACCATCACCACCATCACCAT)을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스에 의해 암호화된 BiTE는 외인성 프로모터, 예를 들어, CMV 프로모터의 제어 하에 있다. 이식유전자가 L5와 E4 영역 사이에 있을 때, 외인성은 MPL과 암호화된 이식유전자 사이에 위치될 수 있다.
이식유전자가 L5와 E3 영역 사이에 있을 때, 외인성은 암호화된 이식유전자와 L5 사이에 위치될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 아데노바이러스 및 희석제 또는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
일 양성에서, 치료적 유효량의 아데노바이러스 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 환자의 치료 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 암, 예를 들어, 상피암, 특히 고형 종양의 치료를 위한 것이다.
일 실시형태에서, 관문 저해제(예컨대, PD-1 또는 PDL1 저해제)와 조합하여 본 개시내용에 따른 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 제공되되, 특히 관문 저해제는 바이러스에서 암호화된다.
일 실시형태에서, 관문 저해제(예를 들어, 본 명세서에 다른 곳에 열거됨, 예컨대, PD-1 또는 PDL1 저해제)와 조합되지 않는 본 개시내용에 따른 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 제공되되, 특히 관문 저해제는 바이러스에서 암호화되지 않는다.
본 개시내용에 따른 바이러스에 의해 암호화된 BiTE는 바이러스의 세포독성을 강화시키는 능력을 가진다.
놀랍게도, 본 개시내용에 따라 바이러스에 의해 암호화된 BiTe는 CD4+ 세포 및/또는 CD8+ 세포, 예를 들어, 유체 환경, 예컨대, 종양의 복수에서 T 세포를 포함하는, 종양 억제 환경에서의 세포조차 활성화시킬 수 있다.
놀랍게도, 본 개시내용에 따라 바이러스에 의해 암호화된 BiTe는 세포독성 T 세포, 예를 들어, 유체 환경, 예컨대, 종양의 복수에서 T 세포를 포함하는, 종양 억제 환경에서의 T 세포조차 활성화시킬 수 있다.
훨씬 더 놀랍게는, 본 개시내용에 따른 바이러스에 의해 암호화된 BiTE는 T 세포 증식을 자극(활성화)시킬 수 있다.
본 개시내용에 따른 BiTE를 암호화하는 바이러스는 종양의 면역 억제성 미세환경을 우회하거나, 극복하거나 또는 반전시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
일 실시형태에서, T 세포의 활성화는 T 세포 마커, 예를 들어, CD25의 상향조절을 초래한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스에서 BiTE의 결합은 신생항원에 특이적이다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 신규한 서열로 확장된다.
상세한 설명
본 명세서에서 사용되는 면역 세포는 대식세포, 호중구, 수지상 세포, NK 세포, 림프구, 예컨대, T 림프구(특히 T 세포 및 NKT 세포)를 포함하는(그러나, 이들로 제한되지 않는) 면역계에서 기능성 역할을 하는 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 항체는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치된 적어도 하나의 항원 인식 부위(또한 본 명세서의 결합 부위로서 지칭됨)를 통해 표적 항원, 예컨대, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드, 펩타이드 등에 특이적인 결합을 할 수 있는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 상기 용어는 전장 항체 및 전장 항체를 포함하는 다중특이성 항체 분자로 확장된다.
본 명세서에서 사용되는 "항체 분자"는 항체 및 이의 결합 단편 및 이 중 임의의 하나의 다중 특이성 형태를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 항원 결합 부위는 가변 영역의 쌍, 특히 표적 항원과 특별하게 상호작용하는 동족쌍을 포함하는 분자의 일부를 지칭한다.
구체적으로는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 그것이 특이적인 항원만을 인식하는 결합 부위 또는 그것이 비특이적인, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 더 높은 결합 친화도인 항원에 대한 친화도에 비해 특이적인 항원에 대해 상당히 더 높은 결합 친화도를 갖는 결합 부위를 지칭하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 결합 단편 또는 항체 결합 단편은 Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체, scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, Bis-scFv, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디 및 상기 중 임의의 에피토프-결합 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 항체 결합 단편을 포함하는 항체 결합 단편 및 다중 특이성 항체 분자를 지칭한다(예를 들어, 문헌[Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참조). 이들 항체 단편을 생성하고 제조하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181] 참조). 본 개시내용에서 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 출원 WO05/003169, WO05/003170 및 WO05/003171에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성, 예를 들어, 이중특이성을 포함할 수 있거나 또는 단일특이성일 수 있다(예를 들어, WO92/22853 및 WO05/113605 참조).
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 다중 특이성 항체 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 다중-특이성 항체 분자는 2개 이상의 항원 결합 도메인, 예를 들어, 2개(이중 특이성) 또는 3개(삼중 특이성) 또는 4개(사중 특이성) 결합 도메인을 갖는 항체 분자를 지칭한다.
본 개시내용의 다중 특이성 항체 분자는 다양한 항체 단편, 예컨대, 상기 기재한 것으로부터 구성될 수 있다. 예를 들어, 다이어바디는 ScFv 단편의 비공유 이량체로 구성된 이중특이성 항체 분자인 반면, F(ab')2는 힌지 영역에 의해 연결된 2개의 Fab 단편으로 구성된 이중특이성 항체 분자이다. 당업자는 따라서 상이한 항체 단편이 이중- 또는 다중 특이성 항체 분자를 생성하기 위해 다양한 조합으로 배열될 수 있다는 것을 알 것이다.
삼중 특이성 또는 사중 특이성 항체 형태의 예는 Fab3, 트라이어바디, 테트라바디, 트라이바디, DVD-Ig, IgG-scFv, ScFv2-Fc, tandAb 및 DNL-Fab3을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 이중 특이성 항체 분자는 동일 또는 상이한 항원에 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 도메인을 갖는 분자를 지칭한다. BiTE는 이중특이성 항체 분자의 서브클래스이다.
도메인은 상이한 항원에 결합할 수 있다.
대안적으로, 도메인은 항원 상의 동일한 에피토프의 결합 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프의 결합을 포함하여, 동일한 항원에 모두 결합할 수 있다.
이중특이성 항체 형식의 예는 이중특이성 T 세포 관여자(BiTE), F(ab')2, F(ab')-ScFv2, 다이-scFv, 다이어바디, 미니바디, scFv-Fc, DART, TandAb, Sc다이어바디, Sc다이어바디-CH3, 다이어바디-CH3, 트리플 바디, 미니항체, 미니바디, 트라이바이 미니바디, ScFv-CH3 KIH (놉인홀(knobs in holes)), Fab-ScFv, SCFv-CH-CL-scFv, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, 4가 HCAb, sc다이어바디-Fc, 다이어바디-Fc, 인트라바디, 독앤락(dock and lock) 항체, ImmTAC, HSA바디, Sc다이어바디-HAS, 휴마바디 및 탠덤(Tandem) ScFv-독성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌[Christoph Spiess et al, Molecular Immunology 67 (2015) 페이지 95-106] 참조).
본 개시내용의 아데노바이러스는 관심 대상의 T 세포 상에서 적어도 표면 항원에 특이적인 BiTE를 포함한다. T 세포 표면 항원의 예는 CD3, CD2, VLA-1, CD8, CD4, CCR6, CXCR5, CD25, CD31, CD45RO, CD197, CD127, CD38, CD27, CD196, CD277 및 CXCR3, 특히 CD2, CD3, CD31 및 CD277을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 이중특이성 T 세포 관여자(BiTE)는 상이한 항체의 2개의 scFv 또는 약 55 KDa의 단일 펩타이드 쇄 상에서 4개의 상이한 유전자로부터의 아미노산 서열을 포함하는 인공 이중특이성 단클론성 항체의 부류를 지칭한다. scFv 중 하나는 T 세포 표면 상에서 발현되는 면역 세포, 예컨대, T 세포 항원, 예컨대, CD3 수용체에 특이적이다. 다른 scFv는 전형적으로 종양-특이적 분자를 통해 종양 세포에 결합한다. 따라서, BiTE는 T 세포 상의 항원 및 종양 세포 상의 항원에 대한 그들의 특이성에 의해 T 세포와 종양 세포 사이의 연결을 형성할 수 있다. 이는 T-세포의 활성화를 야기하며, MHC I 또는 공자극 분자와 독립적으로, T 세포가 종양 세포 상에서 그들의 세포독성 효과를 발휘하도록 촉발시킨다. 현재 승인된 요법 또는 근본적인 임상 시험에 기반한 BITE의 예는, 예를 들어, CD19를 표적화하고 비호지킨 림프종 및 급성 림프모구백혈병의 치료를 위한 블리나투모맙(블린사이토(Blyncyto)(등록상표)) 및 EpCAM을 표적화하고 위장 및 폐암을 치료하기 위한 솔리토맙을 포함한다.
일 실시형태에서, 면역 세포 관여자(예컨대, T 세포 관여자)가 배열되며, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 링커 서열로부터 독립적으로 선택되는 링커를 사용하는 형식 VL1-링커1-VH1-링커2-VH2-링커3-VL2이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 BiTE에서 링커는 서열번호 10, 14, 23, 124 내지 162 및 166 내지 297로부터 독립적으로 선택된다.
일 실시형태에서 링커1 및 링커3은 동일한 서열, 예를 들어, 서열번호 10, 14, 23, 124 내지 162 및 166 내지 296, 특히 10, 14 및 23 중 임의의 하나에 나타낸 서열을 가진다.
일 실시형태에서 링커1 및 링커3은, 예를 들어, 서열번호 10, 14, 23, 124 내지 162 및 166 내지 296, 특히 10, 14 및 23으로부터 독립적으로 선택되는 상이한 아미노산 서열을 가진다.
일 실시형태에서 링커1은 서열번호 10이다.
일 실시형태에서 링커1은 서열번호 14이다.
일 실시형태에서 링커3은 서열번호 10이다.
일 실시형태에서 링커3은 서열번호 14이다.
일 실시형태에서 링커1 및 링커3은 서열번호 10이다.
일 실시형태에서 링커1 및 링커3은 서열번호 14이다.
일 실시형태에서 링커1은 서열번호 10이고, 링커 3은 서열번호 14이다.
일 실시형태에서 링커1은 서열번호 14이고, 링커3은 서열번호 10이다.
일 실시형태에서 링커2는 링커 1과 링커3 둘 다와 상이하다.
일 실시형태에서, 링커2는 서열번호 10, 14, 23, 124 내지 162 및 166 내지 297 중 임의의 하나, 예컨대, 서열번호 297로부터 선택된다.
일 실시형태에서 링커1은 길이가 10 내지 30개 범위인 아미노산, 예컨대, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30이다.
일 실시형태에서 링커3은 길이가 10 내지 30개 범위인 아미노산, 예컨대, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30이다.
일 실시형태에서 링커2는 길이가 2 내지 10개 범위인 아미노산, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
일 실시형태에서 VH1 및 VL1은 본 개시내용에 따른 T 세포 항원, 예컨대, CD3에 특이적이다.
일 실시형태에서 VH2 및 VL2는 면역 세포 항원, 예컨대, 본 개시내용에 따른 T 세포 항원, 예컨대, CD3에 특이적이다.
일 실시형태에서 VH1 및 VL1은 관심 대상의 항원, 예컨대, 암 항원 또는 기질 항원 등에 특이적이다.
일 실시형태에서 VH2 및 VL2는 관심 대상의 항원, 예컨대, 암 항원 또는 기질 항원 등에 특이적이다.
본 명세서에서 사용되는 기질 또는 기질 항원은 기질 매트릭스의 분자 구조, 예컨대, 결합 조직 분자 또는 이 기질과 관련된 분자 또는 기질의 세포 성분과 관련된 항원에서 발현된, 예를 들어, 기질에 침윤된 섬유아세포, 종양 관련 대식세포, 수지상 세포, NK 세포 및/또는 T-세포 상에서 발현된 것을 포함하는, 기질 내 항원 치료적 표적을 지칭한다. 기질 항원의 예는 FAP, TGF, TREM1, IGFBP7, FSP-1, 섬유아세포 연관 항원, NG2, 엔도시알린(CD248), 혈소판-유래 성장 인자-α 수용체(PDGFR-α), 혈소판-유래 성장 인자-β 수용체(PDGFR-β) 및 비멘틴을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
섬유아세포는 항원 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 특히 CD26에 결합하지 않는 FAP에 특이적인 항체를 사용함으로써 표적화될 수 있다(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제2012/0258119호 참조).
FAP는 본래 반응성 기질 섬유아세포 상에서 세린 프로테아제로서 동정되었다. 후속적 분자 클로닝은 FAP가 흑색종 세포주에 의해 발현되는 170kDa 막 결합 젤라티나제인 세프라제와 동일하다는 것을 나타내었다. 전장 cDNA는 전체 서열에 대해 52% aa 동일성 및 특정 도메인에서 거의 70% 동일성을 갖는 다이펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV)에 대해 고도로 상동성인 760개의 아미노산(aa)의 H형 막관통 프로테아제를 암호화하였다. 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,587,299호는 FAP를 암호화하는 핵산 분자 및 이의 용도를 기재한다.
FAP 및 DPPIV는 유사한 유전자 크기를 가지며, 2q24에서 서로 염색체가 인접해있는데, 이는 유전자 중복 사건을 시사한다(젠뱅크 수탁 번호 U09278). 단백질은 둘 다 프롤릴 펩티다제 패밀리의 구성원이다. 이 부류의 효소는 유도성이며, 세포 표면 또는 세포외 유체에서 활성이고, 독특하게는 끝에서 두번째 위치에서 프롤릴 또는 알라닌을 갖는 폴리펩타이드로부터 N-말단의 다이펩타이드를 절단할 수 있다. CD26으로도 지칭되는 DPPIV는 섬유아세포, 내피 및 상피 세포, NK-세포, T-림프구 및 대식세포와 같은 백혈구 서브세트를 포함하는 몇몇 세포 유형에 의해 구성적으로 발현된다. 적은 비율의 DPPIV는 혈액 중에서 가용성 단백질로서 순환한다. DPPIV와 대조적으로, FAP는 전형적으로 정상 성인 조작에서 발현되지 않으며, 그의 단백질 분해 활성 가용성 형태는 a2-항플라스민 절단 효소(a2-Antiplasmin Cleaving Enzyme: APCE)로 지칭된다. 표시된 FAP 발현은 상처 치유, 상피암, 골관절염, 류마티스 관절염, 간경변 및 폐 섬유증을 포함하는 활성화된 기질과 관련된 병태에서 일어난다.
FAP 구조는 해결되며(PDB ID 1Z68) DPPIV의 구조와 매우 유사하다. FAP는 대략 20개 아미노산의 비절단 신호 서열에 의해 혈장막에서 고정되고, 6개 아미노산의 짧은, 아미노산 말단, 세포질 도메인을 가진다. 촉매 도메인을 포함하는 단백질의 주요 부분은 세포외 환경에 노출된다. FAP 당단백질은 2개의 동일한 97-kDa 서브유닛으로 이루어진 동종이량체이다. 각각의 FAP-단량체 서브유닛은 2개의 도메인, 즉, αβ 하이드롤라제 도메인(aa 27-53 및 493-760) 및 큰 구멍을 에워싸는 8-블레이드 β 프로펠러 도메인(aa 54-492)으로 이루어진다. 도메인 둘 다의 계면에서 이 구멍 내의 작은 주머니는 촉매적 트라이어드(triad)(Ser624, Asp702 및 His734)를 함유한다. FAP는 서브유닛의ㅡ 동종이량체에 대한 그리고 그의 다이펩티딜 펩티다제 활성 이외의 그의 효소 활성을 획득하며, FAP는 또한 젤라티나제에 특이적인 I형 콜라겐 및 엔도펩티다제 활성을 가진다. β 프로펠러는 단백질-단백질 상호작용을 위한 스캐폴딩으로서 작용하며, 기질 및 세포외 기질(extracellular matrix: ECM) 결합을 결정한다. 더 나아가, β 프로펠러는 다른 프롤릴 펩티다제와 또는 다른 막-결합 분자와 FAP의 초분자 복합체를 형성하는 데 연루된다. FAP 및 DPPIV의 헤테로머 또는 테트라머 복합체의 형성은 콜라겐 기질 상에서 이동 세포의 침투(invadopodia)와 관련되는 것으로 발견되었다. I형 콜라겐은 β1 인테그린과 FAP의 밀접한 결합을 유도함으로써, 침투의 형성 및 접착에서 주된 조직적 역할을 한다. 연루된 메커니즘은 상세하게 이해되지 않지만, 앞쪽의 세포 침범에서 이러한 프로테이나제-풍부막의 형성은 지시된 세포주위 ECM 분해에 기여한다. 이는 FAP 및 ECM 상호작용이 인테그린 경로를 통한 세포 접착, 이동, 증식 및 세포자멸사에 영향을 미침으로써 침습적 세포 거동과 밀접하게 관련될 수 있으며 질환 병리 및 진행에서 FAP의 역할을 뒷받침한다는 것을 나타낸다. 요약하면, FAP는 그의 프로테아제 활성과 다른 세포 표면 분자와 복합체를 형성하는 그의 능력의 조합을 통해 세포 의존적 방식으로 그의 생물학적 기능을 실행하는 다기능성 단백질로서 인식된다. 상피 및 섬유아세포 세포주에서 FAP의 과발현은 임상 상황을 암시하는 악성 거동을 촉진시키고, 여기서 FAP의 세포 발현 수준은 나쁜 임상 결과와 관련된다.
근거리분비 신호전달 분자를 통해, 암세포는 기질 섬유아세포를 활성화시키고, FAP의 발현을 유도하는데, 이는 결국 암세포의 증식, 침범 및 이동에 영향을 미친다. 최근의 연구는 TGF-β가 FAP 단백질 발현을 촉진시키는 데 우세한 인자라는 것을 입증하였다(Chen, H et al (2009) Exp and Molec Pathology, doi: 10.1016/j.yexmp. 2009.09.001). FAP는 유방, 폐, 결장직장 및 난소의 암종을 포함하는, 인간 상피 암종의 90%에서 반응성 기질 섬유아세포 상에서 크게 발현된다(Garin-Chesa, P et al (1990) PNAS USA 87: 7236-7239). Chen 등은 최근에 FAP가 HO-8910PM 난소암 세포의 침범, 증식 및 이동에 영향을 미친다는 것을 나타내었다(Chen, H et al (2009) Exp and Molec Pathology, doi: 10.1016/j.yexmp. 2009.09.001).
FAP는 상기 항원에 결합함으로써 그리고 생물학적으로 적절한 분자와 그의 상호작용을 입체적으로 차단시킴으로써 표적화될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로 FAP 분자를 다른 FAP 분자 또는 상이한 분자, 예를 들어, 암세포 표면 상의 항원과 가교시키는 것은 다중특이성, 예컨대, 이중특이성 항체 분자를 사용하여 달성될 수 있다. 이 가교는 면역계에 대해 항원을 보유하는 세포의 가시성을 상승시켰는데, 이는 이어서, 중성으로 활성화되거나 또는 이를 파괴할 수 있다.
종양 관련 대식세포(TAM)는 TREM1, CD204, CD68(단독 또는 CD163 또는 CD206과 조합)을 발현시키는 것으로 생각된다. 이들 마커는 TAM을 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용의 아데노바이러스는 종양 세포를 감염시키는 능력을 가지며, 특히, 종양 세포를 우선적으로 감염시키도록 선택된다. 종양 용해성 바이러스 감염은 새로 생성된 바이러스 입자의 방출에 의해 암 세포의 사멸 및 용해를 야기한다. 항체를 암호화하는 이식유전자가 혼입되면, BiTE 및 다른 "페이로드"는 새로 합성되고 그들의 사멸 전에 종양 세포에 의해 적극적으로 분비되며, 일부 분자는 또한 세포 용해 시 방출될 것이다.
짧은 반감기를 갖는 항체 분자는 본 개시내용에서 사용하기에 특히 적합할 수 있는데, 이는 그들이 전신으로 이용 가능하다면 신체가 빠르게 분자를 클리어런스하기 때문에 표적을 벗어난 효과를 최소화하기 때문이다.
NKT 세포는 종양 관련 대식세포를 표적화하고 파괴하는 능력을 가진다. 그러나, 그들의 활성은 종양의 저산소 환경에 의해 저해되는 것으로 여겨진다. 이 활성은, 예를 들어, 본 개시내용의 바이러스에서 암호화된 IL-2 및/또는 IL-15와 함께 NKT 세포를 제공함으로써 회복될 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스는, 예를 들어, IL-2, IL-15 및 이들의 조합으로부터 선택되는 NKT 세포를 활성화시키도록 사이토카인을 추가로 암호화한다. 사이토카인을 암호화하는 유전자는 E1, E3, E4, BX 및 BY로부터 독립적으로 선택되는, 항체 분자를 암호화하는 유전자에 대해 동일한 위치 또는 상이한 위치에 있을 수 있다.
따라서, 본 개시내용에 따른 아데노바이러스는 종양 기질을 약화시키는 간접 메커니즘을 포함하는, 종양을 공격하기 위한 적어도 2 또는 3개의 메커니즘을 가진다.
본 명세서에서 사용되는 이식유전자는 바이러스(외인성)에 대해 비천연이거나 또는 바이러스 내 특정 위치에서 정상적으로 발견되지 않는 유전자인, 게놈 서열 내로 삽입된 유전자를 지칭한다. 이식유전자의 예를 이하에 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 이식유전자는 또한 삽입될 때 전장 유전자의 기능 또는 대부분의 기능을 수행하기에 적합한 유전자의 일부인 유전자의 기능성 단편을 포함한다.
문맥에서 달리 표시되지 않는 한, 이식유전자 및 암호 서열은 바이러스 게놈 내로의 삽입과 관련하여 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 암호 서열은, 예를 들어, 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 의미한다. 전형적으로, 암호 서열은 관심 대상의 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 이식유전자에 대한 cDNA이다. 관심 대상의 기능성 RNA, 펩타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 이하에 기재한다.
분명하게, 바이러스 게놈은 DNA의 암호 서열을 함유한다. 바이러스의 게놈 서열에서 내인성(천연 유래 유전자)은, 그들이 비천연 위치에 또는 비천연 환경에 있을 때와 같이, 재조합 기법에 의해 변형되지 않는 한, 본 명세서의 내용 내에서, 이식유전자로 고려하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 이식유전자는 하나의 유기체로부터 단리된 유전자 또는 cDNA 서열을 함유하고 상이한 유기체, 즉, 본 개시내용의 바이러스 내로 도입되는 DNA의 세그먼트를 지칭한다. 일 실시형태에서, DNA의 이런 비-천연 세그먼트는 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 생성하는 능력을 보유할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 삽입된 이식유전자는 인간 또는 인간화된 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화한다.
일 실시형태에서, 삽입된 이식유전자는, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 낙타, 라마 또는 유사한 것으로부터의 비-인간 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드(예컨대, 비인간 포유류 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드) 또는 RNA 분자를 암호화한다. 유리하게는, 본 개시내용의 바이러스는 이식유전자가 암성 세포 내에 전달되도록 허용한다. 비인간 서열(예컨대, 단백질)에 대해 인간 환자에 의해 생성된 반응은 이런 세포내 전달에 의해 최소화될 수 있다.
DNA 서열은 1개 초과의 이식유전자, 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 이식유전자, 예컨대, 1 또는 2개를 포함할 수 있다.
이식유전자 카세트는 1개 초과의 이식유전자, 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 이식유전자, 예컨대, 1 또는 2개를 포함할 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 카세트는 도면 또는 실시예 중 하나 이상에 나타낸 바와 같이 배열된다.
본 명세서에서 사용되는 이식유전자 카세트는 하나 이상의 암호 서열 및 하나 이상의 조절 요소의 형태로 하나 이상의 이식 유전자를 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다.
이식유전자 카세트는 하나 이상의 모노시트론성 및/또는 다시트론성 mRNA 서열을 암호화할 수 있다.
일 실시형태에서, 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 모노시트론성 또는 다시트론성 mRNA를 암호화하며, 예를 들어, 카세트는 내인성 프로모터 또는 외인성 프로모터 또는 이들의 조합의 제어 하의 위치에서 아데노바이러스 게놈 내로의 삽입에 적합하다.
본 명세서에서 사용되는 모노시트론성 mRNA는 단일 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 mRNA 분자를 지칭한다.
일 실시형태에서 이식유전자 카세트는 모노시트론성 mRNA를 암호화한다.
일 실시형태에서, 모노시트론성 mRNA를 암호화하는 카세트와 관련하여 이식유전자 카세트는 외인성 프로모터(이식유전자가 활성인 경우와 활성인 때를 결정하는 조절 서열임) 또는 스플라이스 부위(mRNA 분자가 스플라이소솜에 의해 절단될 때를 결정하는 조절 서열임) 보통 관심 대상의 단백질에 대해 cDNA로부터 유래되고, 선택적으로 폴리A 신호 서열 및 종결자 서열을 함유하는 암호 서열(즉, 이식유전자)을 선택적으로 함유하는 DNA의 세그먼트를 의미한다.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 하나 이상의 다시트론성 mRNA 서열을 암호화할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 다시트론성 mRNA는 2개 이상의 기능성 RNA, 펩타이드 또는 단백질 또는 이들의 조합을 암호화하는 mRNA 분자를 지칭한다. 일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 다시트론성 mRNA를 암호화한다.
일 실시형태에서 다시트론성 mRNA를 암호화하는 카세트와 관련하여 이식유전자 카세트는 외인성 프로모터(이식유전자가 활성인 경우 및 활성인 때를 결정할 조절 서열임) 또는 스플라이스 부위(mRNA 분자가 스플라이소솜에 의래 절단될 때를 결정하는 조절 서열임) 관심 대상의 단백질 또는 펩타이드에 대해 cDNA로부터 보통 유래된 2 이상의 암호 서열(즉, 이식유전자)을 선택적으로 함유하는 DNA의 세그먼트를 포함하되, 예를 들어, 각각의 암호 서열은 IRES 또는 2A 펩타이드 중 하나에 의해 분리된다. 마지막 암호 서열이 전사된 후에, 카세트는 폴리A 서열 및 종결자 서열을 선택적으로 함유할 수 있다.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 모노시트론성 mRNA 다음에 다시트론성 mRNA를 암호화한다. 다른 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 다시트론성 mRNA 다음에 모노시트론성 mRNA를 암호화한다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스이다. 본 명세서에서 사용되는 "아데노바이러스", "혈청형" 또는 아데노바이러스 혈청형"은 하위그룹 A 내지 F로 분류되고, 추가로 임의의, 아직까지 동정되지 않은 또는 분류되지 않은 아데노바이러스 혈청형으로 추가로 확장되는 임의의 50가지 이상의 현재 공지된 아데노바이러스 혈청형에 부여될 수 있는 임의의 아데노바이러스를 지칭한다. 예를 들어, 표 1에 나타내는 바와 같이 문헌[Strauss, "Adenovirus infections in humans," in The Adenoviruses, Ginsberg, ea., Plenum Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984) 및 Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication," in Fields Virology, Vol.2, Fourth Edition, Knipe, 35ea., Lippincott Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001)] 참조.
하위그룹 아데노바이러스 혈청형
A 12, 18, 31
B 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35,51
C 1, 2, 5, 6
D 8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33,36-39,42-49, 50
E 4
F 40,41
본 개시내용의 아데노바이러스는 하위그룹 B 바이러스, 즉, Ad11, 특히 Ad11p(슬로비츠키(Slobitski) 균주) 및 이들의 유도체, 예컨대, EnAd이다. 아데노바이러스는 캡시드, 예컨대, 헥손 및/또는 섬유에 기반한 그들의 그룹/혈청형으로 표기된다.
본 개시내용의 아데노바이러스는 그룹 A, C, D, E 또는 F 바이러스가 아니다. 본 개시내용의 바이러스는 아데노바이러스 사멸 단백질을 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스는 키메라이다. 아데노바이러스가 키메라일 때, 외부 캡시드의 특징은 혈청형을 결정하는 데 사용될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 키메라는 적어도 2개의 상이한 바이러스 혈청형(동일한 그룹 내의 상이한 혈청형을 포함)으로부터의 DNA를 포함하는 바이러스를 지칭한다.
일 실시형태에서, 종양 용해성 바이러스는, 후자의 게놈 서열의 위치 30812-31789, 18254-21100 및 13682-15367에서 발견되는 동일한 혈청형, 예를 들어, Ad11, 특히 Ad11p로부터의 섬유, 헥손 및 펜톤 단백질을 갖되, 뉴클레오타이드 위치는 젠뱅크 ID 217307399(수탁 번호: GC689208)에 대한 것이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 에나데노툭시레브(또한 EnAd로서 그리고 형식적으로 EnAd로서 알려짐)이다. 본 명세서에서 사용되는 에나데노툭시레브는 서열번호 38의 키메라 아데노바이러스를 지칭한다. 이는 야생형 아데노바이러스에 비해 향상된 치료 특성을 갖는 복제 적격 종양 용해성 키메라 아데노바이러스이다(WO2005/118825 참조). EnAd는 Ad11p 및 Ad3로부터의 DNA, 및 E3/E4에서의 결실을 특징으로 하는 키메라 E2B를 가진다. 에나데노툭시레브에서 구조적 변화는 Ad11p보다 대략 3.5kb 더 작은 게놈을 초래함으로써, 이식유전자의 삽입을 위한 추가적인 "공간"을 제공한다.
에나데노툭시레브(EnAd)는 Ad11p로부터의 섬유, 펜톤 및 헥손을 갖는 앞서 EnAd로서 알려진(WO2005/118825) 키메라 종양 용해성 아데노바이러스이며, 따라서, 이는 하위그룹 B 바이러스이다. 이는 Ad11p 및 Ad3으로부터의 DNA를 포함하는 키메라 E2B 영역을 가진다. 거의 모든 E3 영역 및 E4 영역의 부분은 EnAd에서 결실된다. 따라서, 이는 추가적인 유전자 물질을 수용하는 한편 실행 가능하게 남아있는 게놈 내 상당한 공간을 가진다. 더 나아가, EnAd는 하위그룹 B 아데노바이러스이기 때문에, 인간에서 사전 존재하는 면역은, 예를 들어, Ad5보다 덜 통상적이다. Ad11 섬유, 펜톤 및 헥손을 갖는 키메라 종양 용해성 바이러스의 다른 예는 OvAd1 및 OvAd2를 포함한다(WO2006/060314 참조).
EnAd는 종양 세포를 우선적으로 감염시키는 것으로 여겨지며, 이들 세포에서 빠르게 복제하고, 세포 용해를 야기한다. 이는, 결국, 염증 면역 반응을 생성함으로써, 또한 암과 싸우도록 신체를 자극할 수 있다. EnAd 성공의 부분은 생체내 바이러스의 빠른 복제와 관련되는 것으로 가설을 세운다.
EnAd는 종양 세포를 선택적으로 용해시키지만, 이는 추가적인 유리한 특성, 예를 들어, 바이러스의 치료 활성의 증가 또는 그것에 이식유전자, 예컨대, 세포 신호전달 단백질 또는 항체를 암호화하는 이식유전자를 갖춤으로써 바이러스의 부작용 감소, 또는 세포 신호전달 단백질(들)을 자극하는 독립체를 암호화하는 이식유전자를 도입하는 것이 가능할 수 있다.
유리하게는 암 세포 내에서 발현될 수 있는 특정 단백질, 예컨대, BiTE를 암호화하는 DNA에 의한 바이러스의 보강은, 예를 들어, 세포를 면역계에 더 눈에 띄게 만듦으로써 또는 치료 유전자/단백질을 표적 종양 세포에 우선적으로 전달함으로써 신체 자신의 방어가 더 효과적으로 종양 세포와 싸우는데 사용될 수 있도록 가능하게 할 수 있다.
더 나아가, 리포터인 이식유전자를 게놈 내로 삽입하는 능력은 임상 또는 전임상 연구를 보조할 수 있다.
이식유전자의 발현이 바이러스의 복제 또는 다른 유리한 특성에 유해하게 영향을 미치지 않는다는 것은 중요하다. 따라서, 유전자 또는 유전자들은 바이러스의 복제 적격 및 다른 유리한 특성을 손상시키지 않는 위치에 삽입되어야 한다. 추가로, 아데노바이러스의 게놈은 단단하게 패킹되어 있고, 따라서 이식유전자를 삽입하기 위한 적합한 위치를 발견하는 것은 어렵다. 이는 또한 수용될 수 있는 이식유전자의 크기를 제한한다.
OvAd1 및 OvAd2는 또한 게노모 내 추가적인 "공간"을 갖는 에나데노툭시레브와 유사한 키메라 아데노바이러스이다(WO2008/080003 참조). 따라서, 일 실시형태에서 아데노바이러스는 OvAd1 또는 OvAd2이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 종양 용해성이다. 본 명세서에서 사용되는 종양 용해성 아데노바이러스는 비암 세포에 비해 암세포를 우선적으로 사멸시키는 아데노바이러스를 의미한다.
일 실시형태에서, 종양 용해성 바이러스는 세포자멸성이다. 즉, 이는 세포예정사를 재촉한다.
일 실시형태에서, 종양 용해성 바이러스는 세포용해성이다. 본 개시내용의 종양 용해성 아데노바이러스의 세포 용해 활성은 대표적인 종양 세포주에서 결정될 수 있고, 데이터는, 예를 들어, 표준으로서 사용되는(즉, 효능 1로 주어짐) 하위그룹 C에 속하는 아데노바이러스, 예컨대, Ad5에 의한 효능 측정으로 전환된다. 세포용해 활성을 결정하기 위한 적합한 방법은 MTS 분석이다(본 명세서에 참고로 포함되는 WO2005/118825의 실시예 4, 도 2 참조).
일 실시형태에서, 종양 용해성 바이러스는 괴사용해성이다. 즉, 이는 세포괴사 또는 면역원성 세포사를 야기하거나 또는 재촉한다. 일 실시형태에서 괴사용해성 세포사는 환자(숙주) 면역 반응을 촉발하고, 유도하기 때문에 유리하다.
달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 아데노바이러스는 복제 가능한 바이러스(예컨대, 복제 적격 바이러스) 및 또한 복제 결함 바이러스 벡터를 지칭한다.
본 명세서에서 사용될 수 있는 복제는 복제가 암세포 내 인자, 예를 들어, 상향조절 인자, 예컨대, p53 또는 유사한 것에 의존하는 복제 적격 바이러스 또는 바이러스를 지칭한다.
일 실시형태에서, 바이러스는 복제 적격이다. 본 명세서와 관련하여 복제 적격은 시험관내 및 생체내 세포에서, 즉, 패키징 세포주의 도움 없이, 복제하기 위한 모든 필요한 기작을 갖는 바이러스를 지칭한다. 상보성 패키징 세포주에서 복제할 수 있는, 예를 들어, E1 영역에서 결실된 바이러스 벡터는 본 내용에서 복제 적격 바이러스가 아니다.
바이러스 벡터는 복제 결함이고, 복제를 허용하기 위해 상보성 유전자를 제공하도록 패키징 세포를 필요로 한다.
본 명세서에서 사용되는 아데노바이러스 게놈은 아데노바이러스의 기능/생활사에 적절한 구조적 단백질 및 요소를 암호화하는 DNA 서열을 의미한다.
지금까지 시험한 모든 인간 아데노바이러스 게놈은 동일한 일반적 조직화를 가지며, 즉, 특정 기능을 암호화하는 유전자는 바이러스 게놈에서 동일한 위치에 위치된다(본 명세서에 구조적 요소로서 지칭됨). 바이러스 게놈의 각각의 말단은 바이러스 복제에 필요한 반전 말단 반복부((inverted terminal repeat) 또는 ITR)로서 알려진 짧은 서열을 가진다. 바이러스 게놈은 후기 mRNA의 5개 패밀리(L1-L5)를 생성하도록 가공된 5가지의 초기 전사 단위(E1A, E1B, E2, E3 및 E4), 3가지의 지연된 초기 단위(IX, IVa2 및 E2 후기) 및 하나의 후기 단위(주요 후기)를 함유한다. 초기 유전자에 의해 암호화된 단백질은 감염에 대한 숙주 세포 반응의 복제 및 조절에 주로 연루되는 반면, 후기 유전자는 바이러스 구조 단백질을 암호화한다. 초기 유전자는 E 글자가 접두사로 붙고, 후기 유전자는 L 글자가 접두사로 붙는다.
아데노바이러스의 게놈은 단단하게 패킹되며, 즉, 비-암호 서열이 거의 없고, 따라서 이식유전자를 삽입하기 위한 적합한 위치를 찾는 것이 어려울 수 있다. 본 발명자들은 이식유전자가 용인되는 2개의 DNA 영역을 동정하였으며, 특히 동정된 부위는 복잡한 이식유전자, 예컨대, 항체를 암호화하는 것을 수용하는 데 적합하다. 즉, 이식유전자는 바이러스의 생존도, 천연 특성, 예컨대, 종양 용해성 특성 또는 복제에 유해하게 영향을 미치는 일 없이 발현된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 종양 용해성 또는 부분적 종양 용해성 바이러스는, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 서열에서 예시된 바와 같이, 예를 들어, E4 영역의 부분에서 결실되거나 또는 E3 영역에서 완전히 결실되거나, 또는 대안적으로 E4 영역(예컨대, E4orf4)의 부분에서 결실되고 E3에서 완전히 결실된 E4 및/또는 E3 영역에서의 결실의 결과로서일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 종양 용해성 바이러스는 키메라이다. 본 명세서에서 사용되는 키메라는 2 이상의 상이한 혈청형으로부터의 DNA를 포함하고 종양 용해성 바이러스 특성을 갖는 바이러스를 지칭한다.
일 실시형태에서, 종양 용해성 바이러스는 바이러스의 필수적인 유리한 특성을 보유하는 EnAd 또는 이의 활성 유도체이다. EnAd는 WO2005/118825에 개시되어 있으며(본 명세서에 참고로 포함됨) 바이러스에 대한 전체 서열은 본 명세서에서 서열번호 38로 제공된다. 키메라 E2B 영역은 본 명세서에서 서열번호 71로서 개시된다.
대안의 종양 용해성 바이러스는 WO2008/080003에서 서열번호 2 및 3으로서 각각 개시되고 본 명세서에 참고로 포함된 OvAd1 및 OvAd2를 포함한다.
유리하게는, 본 개시내용의 아데노바이러스는 유사한 바이러스 활성, 예를 들어, 시험관내에서 다양한 상이한 결장암 세포주의 감염 후에 EnAd에 대한 복제 및/또는 감염 프로파일을 나타낸다.
아데노바이러스의 구조적 요소
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 바이러스 또는 바이러스 성분/작제물, 예컨대, 플라스미드의 신규한 서열에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 하기 식 (I)의 순서를 포함하는 게놈을 포함한다
5'ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR (I)
식 중: B1은 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하고; BA는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하며; B2는 결합이거나 또는 E3을 포함하고; BX는 결합이거나 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자(특히, 예를 들어, 외인성 프로모터의 제어 하에 본 개시내용에 따라 적어도 하나의 BiTE를 암호화하는 이식유전자) 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이고; BB는 L5를 포함하고; BY는 결합이거나 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자(특히, 예를 들어, 내인성 프로모터, 예컨대, MPL의 제어 하에 또는 외인성 프로모터, 예컨대, CMV 프로모터의 제어 하에 본 개시내용에 따라 적어도 하나의 BiTE를 암호화하는 이식유전자) 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이며; B3은 결합이거나 또는 E4를 포함하되; BX 및 BY 중 적어도 하나는 결합이 아니고, 이식유전자 또는 제한 부위 또는 둘 다를 포함하며; 그리고 적어도 2개의 결합 도메인을 포함하는 다중특이성 항체 분자를 암호화하고, 상기 도메인 중 적어도 하나는 관심 대상의 T 세포 상에서 표면 항원에 대해 특이적이다. 일 실시형태에서, 아데노바이러스는 식 (I)의 순서를 포함하는 게놈을 포함하되, B1 BX는 결합이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 식 (I)의 순서를 포함하는 게놈을 포함하되, 여기서: BY는 결합이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 하기 식 (Ia)의 순서를 포함하는 게놈을 포함한다
5'ITR-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR (Ia)
식 중: BA는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하고; B2는 결합이거나 또는 E3을 포함하고; BX는 결합이거나 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자(특히 예를 들어, 외인성 프로모터의 제어 하에 적어도 하나의 BiTE를 암호화하는 이식유전자) 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이고; BB는 L5를 포함하며; BY는 결합이거나 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자(특히, 예를 들어, 내인성 프로모터, 예컨대, MPL의 제어 하에 또는 외인성 프로모터, 예컨대, CMV 프로모터의 제어 하에 본 개시내용에 따른 적어도 하나의 BiTE를 암호화하는 이식유전자) 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이고; B3은 결합이거나 또는 E4를 포함하되; BX 및 BY 중 적어도 하나는 결합이 아니고, 적어도 하나는 이식유전자 또는 제한 부위, 예컨대, 이식유전자를 포함한다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 식 (Ia)의 순서를 포함하는 게놈을 포함하되, BX는 결합이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 식 (Ia)의 순서를 포함하는 게놈을 포함하되, BY는 결합이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 하기 식 (Ib)의 순서를 포함하는 게놈을 포함한다
5'ITR-BA-BX-BB-BY-B3-3'ITR (Ib)
식 중: BA는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하고; BX는 결합이거나 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자(특히 예를 들어, 외인성 프로모터의 제어 하에 적어도 하나의 BiTE를 암호화하는 이식유전자) 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이고; BB는 L5를 포함하며; BY는 결합이거나 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자(특히, 예를 들어, 내인성 프로모터, 예컨대, MPL의 제어 하에 또는 외인성 프로모터, 예컨대, CMV 프로모터의 제어 하에 본 개시내용에 따른 적어도 하나의 BiTE를 암호화하는 이식유전자) 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이고; B3은 결합이거나 또는 E4를 포함하되; BX 및 BY 중 적어도 하나는 결합이 아니고, 이식유전자 또는 제한 부위 또는 둘 다, 예컨대, 이식유전자를 포함한다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 식 (Ib)의 순서를 포함하는 게놈을 포함하되, BX는 결합이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 식 (Ib)의 순서를 포함하는 게놈을 포함하되, BY는 결합이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 하기 식 (Ic)의 순서를 포함하는 게놈을 포함한다
5'ITR-BA-B2-BX-BB-BY-3'ITR (Ic)
식 중: BA는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하고; B2는 E3이며; BX는 결합이거나 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자(특히 예를 들어, 외인성 프로모터의 제어 하에 적어도 하나의 BiTE를 암호화하는 이식유전자) 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이고; BB는 L5를 포함하며; BY는 결합이거나 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자(특히, 예를 들어, 내인성 프로모터, 예컨대, MPL의 제어 하에 또는 외인성 프로모터, 예컨대, CMV 프로모터의 제어 하에 본 개시내용에 따른 적어도 하나의 BiTE를 암호화하는 이식유전자) 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이되; BX 및 BY 중 적어도 하나는 결합이 아니고, 이식유전자 또는 제한 부위 또는 둘 다, 예컨대, 이식유전자를 포함한다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 하기 식 (Ic)의 순서를 포함하는 게놈을 포함하되, BX는 결합이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 하기 식 (Ic)의 순서를 포함하는 게놈을 포함하되, BY는 결합이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 하기 식 (Id)의 순서를 포함하는 게놈을 포함한다
5'ITR-B1-BA-BX-BB-BY-B3-3'ITR (Id)
식 중: B1은 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하며; BA는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하고; BX는 결합이거나 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자(특히 예를 들어, 외인성 프로모터의 제어 하에 적어도 하나의 BiTE를 암호화하는 이식유전자) 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이고; BB는 L5를 포함하며; BY는 결합이거나 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식 유전자(특히, 예를 들어, 내인성 프로모터, 예컨대, MPL의 제어 하에 또는 외인성 프로모터, 예컨대, CMV 프로모터의 제어 하에 본 개시내용에 따른 적어도 하나의 BiTE를 암호화하는 이식유전자) 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이고; B3은 결합이거나 또는 E4를 포함하되; BX 및 BY 중 적어도 하나는 결합이 아니고, 이식유전자 또는 제한 부위 또는 둘 다를 포함한다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 하기 식 (Id)의 순서를 포함하는 게놈을 포함하되, BX는 결합이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 하기 식 (Id)의 순서를 포함하는 게놈을 포함하되, BY는 결합이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 하기 식 (Ie)의 순서를 포함하는 게놈을 포함한다
5'ITR-B1-BA-B2-BB-BY-3'ITR (Ie)
식 중: B1은 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하고; BA는 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하며; B2는 E3을 포함하고; BB는 L5를 포함하며; BY는 결합이거나 또는 (예를 들어, 내인성 프로모터, 예컨대, MPL의 제어 하에서 또는 외인성 프로모터, 예컨대, CMV 프로모터의 제어 하에서) 본 개시내용에 따른 적어도 하나의 BiTE를 암호화하는 하나 이상의 이식 유전자를 포함하는 DNA 서열이되; BX 및 BY 중 적어도 하나는 결합이 아니고, 이식유전자 또는 제한 부위 또는 둘 다를 포함한다.
일 실시형태에서, 식 (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) 또는 (Ie)의 화합물이 제공되되, BX 및 BY는 결합이 아니고 이식유전자 또는 제한 부위 또는 둘 다를 포함하고, 예컨대, BX와 BY는 둘 다 이식유전자이다.
식 (I), (Ia), (Ib), (Ic) 또는 (Id)의 일 실시형태에서, BX만이 1 또는 2개의 BiTE, 예를 들어, 1개의 BiTE를 암호화하고(그리고 BY는 BiTE를 암호화하지 않음), 특히 상기 BiTE 또는 BiTE는 외인성 프로모터, 예컨대, CMV 프로모터의 제어 하에 있다. 식 (I), (Ia), (Ib), (Ic) 또는 (Id)의 일 실시형태에서, BY만이 1 또는 2개의 BiTE, 예를 들어, 1개의 BiTE를 암호화하고(그리고 BX는 BiTE를 암호화하지 않음), 특히 상기 BiTE 또는 BiTE는 내인성 프로모터, 예컨대, MPL의 제어 하에 또는 외인성 프로모터, 예컨대, CMV 프로모터의 제어 하에 있다. 식 (I), (Ia), (Ib), (Ic) 또는 (Id)의 일 실시형태에서, BX는 (예를 들어, 외인성 프로모터, 예컨대, CMV 프로모터의 제어 하에서) BiTE를 암호화하고, 그리고 BY는 (예를 들어, 내인성 프로모터, 예컨대, MPL의 제어 하에서 또는 외인성 프로모터, 예컨대, CMV 프로모터의 제어 하에서) BiTE를 암호화한다.
결합은 다른 DNA 서열에 하나의 DNA 서열을 연결하는, 예를 들어, 바이러스 게놈의 한 부문을 다른 것에 연결하는 공유 결합을 지칭한다. 따라서, 본 명세서에서 식 (I) (Ia), (Ib), (Ic), (Id) 또는 (Ie)의 변수가 결합을 나타낼 때, 결합으로 나타내는 특징 또는 요소는 없으며, 즉, 결실된다.
아데노바이러스의 구조는, 일반적으로 유사하기 때문에, 이하의 요소는 구조적 요소 및 당업자에게 공지된 그에 대해 통상적으로 사용되는 명명법에 관해 논의된다. 요소가 본 명세서에 대해 언급될 때, 본 발명자들은 아데노바이러스에서 요소를 암호화하는 DNA 서열 또는 요소의 동일한 구조적 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. DNA 암호의 중복성 때문에 후자가 적절하다. 코돈 사용 빈도에 대한 바이러스의 선호도는 최적화된 결과를 위해 고려될 필요가 있을 수 있다.
본 개시내용의 바이러스에서 사용되는 아데노바이러스로부터의 임의의 구조적 요소는 천연 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어질 수 있거나 또는 주어진 길이에 대해 적어도 95%, 예컨대, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 유사성을 가질 수 있다. 본래의 서열은 유전자 물질의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%를 생략하도록 변형될 수 있다. 당업자는 변화시킬 때, 구조적 단백질의 발현이 붕괴되도록 바이러스의 리딩 프레임은 붕괴되어서는 안 된다는 것을 안다.
일 실시형태에서, 주어진 요소는 전장 서열, 즉, 전장 유전자이다.
일 실시형태에서, 주어진 요소는 전장보다 적으며, 전장 서열과 동일하거나 저 또는 대응하는 기능을 보유한다.
본 개시내용의 작제물에서 선택적인 주어진 요소에 대한 일 실시형태에서, DNA 서열은 전장보다 적고, 기능성을 갖지 않을 수 있다.
아데노바이러스의 구조적 또는 기능성 단백질을 암호화하는 구조적 유전자는 일반적으로 DNA의 비암호 영역에 의해 연결된다. 따라서 본 개시내용의 바이러스 내로 이식유전자를 삽입할 목적을 위해 관심 대상의 구조적 요소(특히 이의 비암호 영역)의 게놈 서열을 "절단"하는 경우에 대해 일부 유연성이 있다. 따라서 본 명세서의 목적을 위해, 요소는 목적에 적합하고 관련 없는 물질을 암호화하지 않는 정도로 기준의 구조적 요소가 고려될 수 있다. 따라서, 적절하다면, 유전자는, 예를 들어, 바이러스의 천연 구조에서 발견되는 바와 같이 적합한 비-암호 영역과 관련된다.
따라서, 일 실시형태에서 삽입물, 예컨대, 제한 부위 및/또는 이식유전자를 암호화하는 DNA는 게놈 바이러스 DNA의 비암호 영역, 예컨대, 인트론 또는 유전자간 서열 내로 삽입된다. 이를 언급하면, 아데노바이러스의 일부 비암호 영역은, 예를 들어, 대안의 스플라이싱, 전사 조절 또는 번역 조절에서 기능을 가질 수 있고, 그리고 이는 고려할 필요가 있을 수 있다.
L5 영역과 관련된 본 명세서에서 동정된 부위(예를 들어, L5와 E4 영역 사이)는 복잡한 독립체, 예컨대, RNAi, 사이토카인, 단일쇄 또는 다량체 단백질, 예컨대, 항체, 예컨대, BiTE를 암호화하는 다양한 DNA 서열을 수용하기에 적합하다.
본 명세서에서 사용되는 유전자는 이와 관련된 암호 및 임의의 비암호 서열, 예를 들어, 인트론 및 관련된 엑손을 지칭한다. 일 실시형태에서, 유전자는 필수 구조 성분, 예를 들어, 암호 영역만을 포함하거나 또는 이들만으로 이루어진다.
이하는 아데노바이러스의 구체적 구조적 요소에 관한 논의에 따른다.
반전 말단 반복부(ITR) 서열은 모두 공지된 아데노바이러스에 대해 공통적이며, 그들의 대칭성 때문에 이렇게 명명되었고, 바이러스 염색체 복제기점이다. 이들 서열의 다른 특성은 헤어핀을 형성하는 그들의 능력이다.
본 명세서에서 사용되는 5'ITR은 아데노바이러스의 5' 말단으로부터의 ITR의 부분 또는 모두를 지칭하는데, 이는 적절한 위치에서 아데노바이러스 내로 혼입될 때 ITR의 기능을 보유한다. 일 실시형태에서, 5'ITR은 서열번호 38의 약 1bp 내지 138bp로부터의 서열 또는 전장을 따라 이에 대해 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열, 특히 서열번호 38의 약 1bp 내지 138bp로 이루어진 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
본 명세서에서 사용되는 3'ITR은 아데노바이러스의 3' 말단으로부터의 ITR의 부분 또는 모두를 지칭하는데, 이는 적절한 위치에서 아데노바이러스 내로 혼입될 때 ITR의 기능을 보유한다. 일 실시형태에서, 3'ITR은 서열번호 38의 약 32189bp 내지 32326bp로부터의 서열 또는 전장을 따라 이에 대해 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열, 특히 서열번호 38의 약 32189bp 내지 32326bp로 이루어진 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
본 명세서에서 사용되는 B1은 아데노바이러스로부터의 E1A의 부분 또는 모두, 아데노바이러스의 E1B 영역의 부분 또는 모두, 및 독립적으로 아데노바이러스의 E1A 및 E1B 영역의 부분 또는 모두를 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다.
B1이 결합일 때, E1A 및 E1B 서열은 바이러스로부터 생략될 것이다. 일 실시형태에서 B1은 결합이고, 따라서 바이러스는 벡터이다.
일 실시형태에서 B1은 추가로 이식유전자를 포함한다. E1 영역이 E1 영역 내로(즉, 서열의 "중간"에서) 파괴적 방법으로 삽입될 수 있는 이식유전자를 수용할 수 있거나 또는 E1 영역의 부분 또는 모두가 유전자 물질을 수용하기 위한 더 많은 방을 제공하도록 결실될 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 E1A는 아데노바이러스 E1A 영역의 부분 또는 모두를 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 후자는 폴리펩타이드/단백질 E1A을 지칭한다. E1A 유전자에 의해 암호화된 단백질이 보존적 또는 비보존적 아미노산 변화를 갖도록, 그것이 야생형과 동일한 기능(즉, 대응하는 비돌연변이 단백질); 야생형 단백질에 비해 증가된 기능; 감소된 기능, 예컨대, 야생형 단백질에 비해 기능 없음을 갖도록; 또는 적절하다면 야생형 단백질 또는 이의 조합물에 비해 새로운 기능을 갖도록 돌연변이될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 E1B는 아데노바이러스 E1B 영역(즉, 폴리펩타이드 또는 단백질)의 부분 또는 모두를 암호화하는 DNA 서열을 지칭하며, 이는 E1B 유전자에 의해 암호화된 단백질이 보존적 또는 비보존적 아미노산 변화를 갖도록, 그것이 야생형과 동일한 기능(즉, 대응하는 비돌연변이 단백질); 야생형 단백질에 비해 증가된 기능; 감소된 기능, 예컨대, 야생형 단백질에 비해 기능 없음을 갖도록; 또는 적절하다면 야생형 단백질 또는 이의 조합물에 비해 새로운 기능을 갖도록 돌연변이될 수 있다.
따라서 B1은 야생형 E1 영역, 예컨대, 야생형 E1A 및/또는 E1B에 비해 변형 또는 비변형될 수 있다. 당업자는 E1A 및/또는 E1B가 존재하거나 또는 (부분) 결실되거나 또는 돌연변이되는지 여부를 용이하게 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 야생형은 공지된 아데노바이러스를 지칭한다. 공지된 아데노바이러스는 서열이 이용 가능한지 여부와 상관 없이 동정되고 명명된 것이다.
일 실시형태에서 B1은 서열번호 38의 139bp 내지 3932bp의 서열을 가진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 BA는 적절하다면 임의의 비-암호 서열을 포함하는, E2B-L1-L2-L3-E2A-L4 영역을 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로 이 서열은 이식유전자를 포함하지 않을 것이다. 일 실시형태에서, 서열은 공지된 아데노바이러스, 예를 들어, 표 1에 나타낸 혈청형, 특히 그룹 B 바이러스, 예를 들어, Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 또는 이들의 조합, 예컨대, Ad3, Ad11 또는 이들의 조합으로부터의 인접한 서열과 실질적으로 유사하거나 또는 동일하다. 일 실시형태에서 E2B-L1-L2-L3-E2A-L4는 영역과 관련된 이들 요소 및 다른 구조적 요소를 포함하는 것을 지칭하며, 예를 들어, BA는 일반적으로, 예를 들어, 다음과 같이 단백질 IV2a를 암호화하는 서열을 포함할 것이다: IV2A IV2a-E2B-L1-L2-L3-E2A-L4
일 실시형태에서, E2B 영역은 키메라이다. 즉, 2 이상의 상이한 아데노바이러스 혈청형으로부터의, 예를 들어, Ad3 및 Ad11, 예컨대, Ad11p로부터의 DNA 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, E2B 영역은 서열번호 38의 5068bp 내지 10355bp로부터의 서열 또는 전체 길이에 대해 이에 대해 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 가진다.
일 실시형태에서, 성분 BA에서 E2B는 서열번호 71(WO2005/118825에 개시된 서열번호 3에 대응)에 나타낸 서열을 포함한다.
일 실시형태에서 BA는 서열번호 38의 3933bp 내지 27184bp의 서열을 가진다.
본 명세서에서 사용되는 E3은 아데노바이러스 E3 영역(즉, 단백질/폴리펩타이드)의 부분 또는 모두를 암호화하는 DNA 서열을 지칭하며, 이는 E3 유전자에 의해 암호화된 단백질이 보존적 또는 비보존적 아미노산 변화를 갖도록, 그것이 야생형과 동일한 기능(대응하는 비돌연변이 단백질); 야생형 단백질에 비해 증가된 기능; 감소된 기능, 예컨대, 야생형 단백질에 비해 기능 없음을 갖도록; 또는 적절하다면 야생형 단백질 또는 이의 조합물에 비해 새로운 기능을 갖도록 돌연변이될 수 있다.
일 실시형태에서, E3 영역은 표 1에 주어진 아데노바이러스 혈청형 또는 이의 조합물, 특히 그룹 B 혈청형, 예를 들어, Ad3, Ad7, Ad11(특히 Ad11p), Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 또는 이들의 조합, 예컨대, Ad3, Ad11(특히 Ad11p) 또는 이들의 조합으로부터 형성된다.
일 실시형태에서, E3 영역은 부분적으로 결실되고, 예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 결실된다.
일 실시형태에서 B2는 결합이되, E3 영역을 암호화하는 DNA는 없다.
일 실시형태에서, E3 영역을 암호화하는 DNA는 이식유전자에 의해 대체되거나 또는 가로막힌다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 본 명세서에서 사용되는 이식유전자로 대체되는 "E3 영역"은 이식유전자로 대체되는 E3 영역의 부분 또는 모두를 포함한다.
일 실시형태에서, B2 영역은 서열번호 38의 27185bp 내지 28165bp의 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, B2는 서열번호 38의 27185bp 내지 28165bp의 서열로 이루어진다.
본 명세서에서 사용되는 BX는 BB에서 L5 유전자의 5' 말단 근처의 DNA 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 L5 유전자의 5' 말단의 근처 또는 근위에서 L5 유전자 또는 이와 본래 결합된 비-암호 영역의 5' 말단에 인접한(근접한), 즉, L5 유전자 또는 이와 본래 결합된 비암호 영역의 5' 프라임 말단에 접하거나 또는 근접한 것을 지칭한다. 대안적으로, 근처 또는 근위는 유전자의 BX 영역과 L5 유전자의 5' 말단 사이에 암호 서열이 없도록, L5 유전자에 가까운 것을 지칭할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서 BX는, 예를 들어, L5 유전자의 암호 서열의 시작을 나타내는 L5 염기에 직접 결합된다.
따라서, 일 실시형태에서 BX는, 예를 들어, 비-암호 서열의 시작을 나타내는 L5의 염기에 직접 결합되거나, 또는 L5와 자연적으로 결합된 비암호 영역에 직접적으로 결합된다. 본 명세서에서 사용되는 L5와 자연적으로 결합된 비암호 영역은 L5 유전자의 부분이거나 또는 이에 인접하지만 다른 유전자의 부분이 아닌 비암호 영역의 부분 또는 모두를 지칭한다.
일 실시형태에서 BX는 서열번호 39의 서열을 포함한다. 이 서열은 인공 비암호 서열이되, 예를 들어, 이식유전자(또는 이식유전자 카세트), 제한 부위 또는 이들의 조합을 포함하는 DNA 서열은 그에 삽입될 수 있다. 이 서열은 이식유전자의 정확한 위치 상에서 일부 유연성을 허용하는 완충제로서 작용하는 한편, 바이러스 안정성 및 생존도에 대해 파괴적 효과를 최소화하기 때문에 유리하다.
이 삽입(들)은 5' 말단, 3' 말단으로부터 서열번호 39 내의 어느 곳에서 또는 bp 1 내지 201의 임의의 지점에서, 예를 들어, 염기쌍 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34, 34/35, 35/36, 36/37, 37/38, 38/39, 39/40, 40/41, 41/42, 42/43, 43/44, 44/45, 45/46, 46/47, 47/48, 48/49, 49/50, 50/51, 51/52, 52/53, 53/54, 54/55, 55/56, 56/57, 57/58, 58/59, 59/60, 60/61, 61/62, 62/63, 63/64, 64/65, 65/66, 66/67, 67/68, 68/69, 69/70, 70/71, 71/72, 72/73, 73/74, 74/75, 75/76, 76/77, 77/78, 78/79, 79/80, 80/81, 81/82, 82/83, 83/84, 84/85, 85/86, 86/87, 87/88, 88/89, 89/90, 90/91, 91/92, 92/93, 93/94, 94/95, 95/96, 96/97, 97/98, 98/99, 99/100, 100/101, 101/102, 102/103, 103/104, 104/105, 105/106, 106/107, 107/108, 108/109, 109/110, 110/111, 111/112, 112/113, 113/114, 114/115, 115/116, 116/117, 117/118, 118/119, 119/120, 120/121, 121/122, 122/123, 123/124, 124/125, 125/126, 126/127, 127/128, 128/129, 129/130, 130/131, 131/132, 132/133, 133/134, 134/135, 135/136, 136/137, 137/138, 138/139, 139/140, 140/141, 141/142, 142/143, 143/144, 144/145, 145/146, 146/147, 147/148, 148/149, 150/151, 151/152, 152/153, 153/154, 154/155, 155/156, 156/157, 157/158, 158/159, 159/160, 160/161, 161/162, 162/163, 163/164, 164/165, 165/166, 166/167, 167/168, 168/169, 169/170, 170/171, 171/172, 172/173, 173/174, 174/175, 175/176, 176/177, 177/178, 178/179, 179/180, 180/181, 181/182, 182/183, 183/184, 184/185, 185/186, 186/187, 187/188, 189/190, 190/191, 191/192, 192/193, 193/194, 194/195, 195/196, 196/197, 197/198, 198/199, 199/200 또는 200/201에서 생길 수 있다.
일 실시형태에서 BX는 bp 27과 bp 28 사이 또는 서열번호 38의 위치 28192bp 내지 28193bp에 대응하는 위치에 삽입된 DNA 서열을 갖는 서열번호 39를 포함한다.
일 실시형태에서, 삽입은 제한 부위 삽입이다. 일 실시형태에서, 제한 부위 삽입은 1 또는 2개의 제한 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 제한 부위는 2개의 제한 부위를 포함하는 19bp 제한 부위 삽입이다. 일 실시형태에서, 제한 부위 삽입은 1개의 제한 부위를 포함하는 9bp 제한 부위 삽입이다. 일 실시형태에서, 제한 부위 삽입은 1 또는 2개의 제한 부위 및 적어도 1개의 이식유전자, 예를 들어, 1 또는 2개의 이식유전자를 포함한다. 일 실시형태에서, 제한 부위는 2개의 제한 부위 및 적어도 1개의 이식유전자, 예를 들어, 1 또는 2개의 이식유전자를 포함하는 19bp 제한 부위 삽입이다. 일 실시형태에서, 제한 부위 삽입은 1 제한 부위 및 적어도 1개의 이식유전자, 예를 들어, 1, 2 또는 3개의 이식유전자, 예컨대, 1 또는 2개를 포함하는 9bp 제한 부위 삽입이다. 일 실시형태에서, 2개의 제한 부위는 (예를 들어, 이식유전자 카세트에서) 1개 이상, 예컨대, 2개의 이식유전자를 샌드위치한다. 일 실시형태에서, BX가 2개의 제한 부위를 포함할 때, 상기 제한 부위는 서로 상이하다. 일 실시형태에서, BX에서 상기 1개 이상의 제한 부위는 그들이 삽입되는 특정 아데노바이러스 게놈에서 비천연 유래된다. 일 실시형태에서, BX 내 상기 1개 이상의 제한 부위는 아데노바이러스 게놈 내 다른 곳에 위치된 다른 제한 부위와 상이하며, 예를 들어, 게놈의 다른 부분에 도입된 천연 유래 제한 부위 및/또는 제한 부위, 예컨대, BY 내에 도입된 제한 부위와 상이하다. 따라서, 일 실시형태에서 제한 부위 또는 부위들은 부문 내의 DNA가 특별하게 절단되도록 허용한다.
유리하게는, "독특한" 제한 부위의 사용은 단순히 적절한 제한 효소를 이용함으로써 바이러스 게놈이 절단되는 선택성 및 제어를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 특별하게 절단되는은 제한 부위에 특이적인 효소의 사용이 목적으로 하는 위치에서만, 보통 하나의 위치에서(그것이 위치의 쌍일 수 있지만) 바이러스를 절단하는 경우를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 위치의 쌍은 동일한 효소에 의해 절단되도록 설계된(즉, 서로로부터 분화될 수 없는) 서로에 대해 근위인 2개의 제한 부위를 지칭한다.
일 실시형태에서, 제한 부위 삽입은 서열번호 50이다.
일 실시형태에서, BX는 서열번호 38의 28166bp 내지 28366bp의 서열을 가진다.
일 실시형태에서, BX는 결합이다.
일 실시형태에서, BX는 제한 부위, 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 제한 부위, 예컨대, 1 또는 2개를 포함한다. 일 실시형태에서, BX는 적어도 1개의 이식유전자, 예를 들어, 1 또는 2개의 이식유전자를 포함한다. 일 실시형태에서, BX는 적어도 1개의 이식유전자, 예를 들어, 1 또는 2개의 이식유전자 및 1개 이상의 제한 부위, 예를 들어, 2 또는 3개의 제한 부위를 포함하며, 특히 제한 부위는 그/그들이 게놈으로부터 특별하게 절단되고/되거나 대체되도록 유전자 또는 유전자를 포함하는 DNA 서열을 샌드위치한다. 대안적으로, 제한 부위는 각각의 유전자를 샌드위치할 수 있으며, 예를 들어, 2개의 이식 유전자가 있을 때, 유전자가 선택적으로 절단되고/되거나 대체될 수 있다는 것을 보장하기 위해 3개의 상이한 제한 부위가 필요하다. 일 실시형태에서, 하나 이상, 예를 들어, 모든 이식유전자는 이식유전자 카세트의 형태이다. 일 실시형태에서, BX는 서열번호 39를 포함한다. 일 실시형태에서 서열번호 39는, 예를 들어, 이식유전자에 의해 가로막힌다. 실시형태에서, 서열번호 39는 가로막히지 않는다. 일 실시형태에서 BX는 제한 부위를 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, BX는 결합이다. 일 실시형태에서 BX는 하나 이상의 이식 유전자를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, BY는 제한 부위, 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 제한 부위, 예컨대, 1 또는 2개를 포함한다. 일 실시형태에서, BY는 적어도 1개의 이식유전자, 예를 들어, 1 또는 2개의 이식유전자를 포함한다. 일 실시형태에서, BY는 적어도 1개의 이식유전자, 예를 들어, 1 또는 2개의 이식유전자 및 1개 이상의 제한 부위, 예를 들어, 2 또는 3개의 제한 부위를 포함하며, 특히 제한 부위는 그/그들이 게놈으로부터 특별하게 절단되고/되거나 대체되도록 유전자 또는 유전자를 포함하는 DNA 서열을 샌드위치한다. 대안적으로, 제한 부위는 각각의 유전자를 샌드위치할 수 있으며, 예를 들어, 2개의 이식 유전자가 있을 때, 유전자가 선택적으로 절단되고/되거나 대체될 수 있다는 것을 보장하기 위해 3개의 상이한 제한 부위가 필요하다. 일 실시형태에서, 하나 이상, 예를 들어, 모든 이식유전자는 이식유전자 카세트의 형태이다. 일 실시형태에서, BY는 서열번호 40을 포함한다. 일 실시형태에서 서열번호 40은, 예를 들어, 이식유전자에 의해 가로막힌다. 실시형태에서, 서열번호 40은 가로막히지 않는다. 일 실시형태에서 BY는 제한 부위를 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, BY는 결합이다. 일 실시형태에서 BY는 하나 이상의 이식 유전자를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, BX 및 BY는 각각 제한 부위, 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 제한 부위, 예컨대, 1 또는 2개를 포함한다. 일 실시형태에서 BX 및 BY는 각각 적어도 하나의 이식유전자, 예를 들어, 1 또는 2개의 이식유전자를 포함한다. 일 실시형태에서 BX 및 BY는 각각 적어도 1개의 이식유전자, 예를 들어, 1 또는 2개의 이식유전자 및 1개 이상의 제한 부위, 예를 들어, 2 또는 3개의 제한 부위를 포함하며, 특히 제한 부위는 그것이 게놈으로부터 특별하게 절단되고/되거나 대체되도록 유전자 또는 유전자를 포함하는 DNA 서열을 샌드위치한다. 대안적으로, 제한 부위는 각각의 유전자를 샌드위치할 수 있으며, 예를 들어, 2개의 이식 유전자가 있을 때, 유전자가 선택적으로 절단되고/되거나 대체될 수 있다는 것을 보장하기 위해 3개의 상이한 제한 부위가 필요하다. 일 실시형태에서, 하나 이상, 예를 들어, 모든 이식유전자는 이식유전자 카세트의 형태이다. 일 실시형태에서 BX 및 BY는 각각 서열번호 39 및 서열번호 40을 포함한다. 일 실시형태에서, BX 및 BY는 제한 부위를 포함하지 않는다. 일 실시형태에서 BX는 결합이고, BY는 결합이 아니다. 일 실시형태에서, BY는 결합이고, BX는 결합이 아니다.
본 명세서에서 사용되는 BB는 L5를 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 L5 영역은 내용에서 적절하다면, 섬유 폴리펩타이드/단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 서열을 지칭한다. 섬유 유전자/영역은 아데노바이러스의 주요 캡시드 성분인 섬유 단백질을 암호화한다. 섬유는 수용체 인식에서 기능하고, 세포에 선택적으로 결합하고 감염시키는 아데노바이러스의 능력에 기여한다.
본 개시내용의 바이러스에서, 섬유는 혈청형 11, 예컨대, Ad11p의 임의의 아데노바이러스 균주로부터 유래될 수 있다.
일 실시형태에서 BB는 서열번호 38의 28367bp 내지 29344bp의 서열을 가진다.
본 명세서에서 사용되는 BY에 관한 DNA 서열은 BB의 L5 유전자의 3' 말단 근처의 DNA 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 L5 유전자의 3' 말단의 근처 또는 근위에서 L5 유전자 또는 이와 본래 결합된 비-암호 영역의 3' 말단에 인접한(근접한), 즉, L5 유전자 또는 이와 본래 결합된 비암호 영역(즉, L5에 내인성인 비암호 서열의 모두 또는 부분)의 3' 프라임 말단에 접하거나 또는 근접한 것을 지칭한다. 대안적으로, 근처 또는 근위는 유전자의 BY 영역과 L5 유전자의 3' 말단 사이에 암호 서열이 없도록, L5 유전자에 가까운 것을 지칭할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서 BY는 암호 서열의 "말단"을 나타내는 염기에 직접 결합된다.
따라서, 일 실시형태에서 BY는 비-암호 서열의 "말단"을 나타내는 L5의 염기에 직접 결합되거나, 또는 L5와 자연적으로 결합된 비암호 영역에 직접적으로 결합된다.
본래 그리고 자연적으로는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다. 일 실시형태에서 BY는 서열번호 40의 서열을 포함한다. 이 서열은 비암호 서열이되, 예를 들어, 이식유전자(또는 이식유전자 카세트), 제한 부위 또는 이들의 조합을 포함하는 DNA 서열이 삽입될 수 있다. 이 서열은 이식유전자의 정확한 위치 상에서 일부 유연성을 허용하는 완충제로서 작용하는 한편, 바이러스 안정성 및 생존도에 대해 파괴적 효과를 최소화하기 때문에 유리하다.
이 삽입(들)은 5' 말단, 3' 말단으로부터 서열번호 40 내의 어느 곳에서 또는 bp 1 내지 35의 임의의 지점에서, 예를 들어, 염기쌍 1/2, 2/3, 3/4, 4/5, 5/6, 6/7, 7/8, 8/9, 9/10, 10/11, 11/12, 12/13, 13/14, 14/15, 15/16, 16/17, 17/18, 18/19, 19/20, 20/21, 21/22, 22/23, 23/24, 24/25, 25/26, 26/27, 27/28, 28/29, 29/30, 30/31, 31/32, 32/33, 33/34 또는 34/35에서 생길 수 있다.
일 실시형태에서 BY는 위치 bp 12와 13 사이 또는 서열번호 38에서 29356bp 내지 29357bp에 대응하는 위치에 삽입된 DNA 서열을 갖는 서열번호 40을 포함한다. 일 실시형태에서, 삽입은 제한 부위 삽입이다. 일 실시형태에서, 제한 부위 삽입은 1 또는 2개의 제한 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 제한 부위는 2개의 제한 부위를 포함하는 19bp 제한 부위 삽입이다. 일 실시형태에서, 제한 부위 삽입은 1개의 제한 부위를 포함하는 9bp 제한 부위 삽입이다. 일 실시형태에서, 제한 부위 삽입은 1 또는 2개의 제한 부위 및 적어도 1개의 이식유전자, 예를 들어, 1 또는 2 또는 3개의 이식유전자, 예컨대, 1 또는 2개의 이식유전자를 포함한다. 일 실시형태에서, 제한 부위는 2개의 제한 부위 및 적어도 1개의 이식유전자, 예를 들어, 1 또는 2개의 이식유전자를 포함하는 19bp 제한 부위 삽입이다. 일 실시형태에서, 제한 부위 삽입은 1 제한 부위 및 적어도 1개의 이식유전자, 예를 들어, 1 또는 2개의 이식유전자를 포함하는 9bp 제한 부위 삽입이다. 일 실시형태에서, 2개의 제한 부위는 (예를 들어, 이식유전자 카세트에서) 1개 이상, 예컨대, 2개의 이식유전자를 샌드위치한다. 일 실시형태에서, BY가 2개의 제한 부위를 포함할 때, 상기 제한 부위는 서로 상이하다. 일 실시형태에서, BY에서 상기 1개 이상의 제한 부위는 그들이 삽입되는 특정 아데노바이러스 게놈에서 비천연 유래된다(예컨대, 독특함). 일 실시형태에서, BY 내 상기 1개 이상의 제한 부위는 아데노바이러스 게놈 내 다른 곳에 위치된 다른 제한 부위와 상이하며, 예를 들어, 게놈의 다른 부분에 도입된 천연 유래 제한 부위 또는 제한 부위, 예컨대, BX와 상이하다. 따라서, 일 실시형태에서 제한 부위 또는 부위들은 부문 내의 DNA가 특별하게 절단되도록 허용한다.
일 실시형태에서, 제한 부위 삽입은 서열번호 51이다.
일 실시형태에서 BY는 서열번호 38의 29345bp 내지 29379bp의 서열을 가진다.
일 실시형태에서, BY는 결합이다.
일 실시형태에서, 삽입은 서열번호 40에서 bp 12 다음이다.
일 실시형태에서, 삽입은 서열번호 38의 대략 위치 29356bp에서이다.
일 실시형태에서, 삽입은 하나 이상의 이식 유전자, 예를 들어, 1, 2 또는 3, 예컨대, 1 또는 2개를 포함하는 이식유전자 카세트이다.
본 명세서에서 사용되는 E4는 아데노바이러스 E4 영역(즉, 폴리펩타이드/단백질 영역)의 부분 또는 모두를 암호화하는 DNA 서열을 지칭하며, 이는 E4 유전자에 의해 암호화된 단백질이 보존적 또는 비보존적 아미노산 변화를 갖도록, 그것이 야생형과 동일한 기능(대응하는 비돌연변이 단백질); 야생형 단백질에 비해 증가된 기능; 감소된 기능, 예컨대, 야생형 단백질에 비해 기능 없음을 갖도록; 또는 적절하다면 야생형 단백질 또는 이의 조합물에 비해 새로운 기능을 갖도록 돌연변이될 수 있다. 일 실시형태에서, E4 영역은 E4orf4 결실된다.
일 실시형태에서, E4 영역은 부분적으로 결실되고, 예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 결실된다. 일 실시형태에서, E4 영역은 서열번호 38의 32188bp 내지 29380bp의 서열을 가진다.
일 실시형태에서, B3은 결합이며, 즉, E4는 없다.
일 실시형태에서 B3은 서열번호 38의 32188bp 내지 29380bp로 이루어진 서열을 가진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 숫자 범위는 종점을 포함한다.
당업자는 본 명세서의 식, 예컨대, 식 (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id) 및 (Ie)의 요소가 인접해 있고, 비암호 DNA 서열뿐만 아니라 본 명세서에 언급된 유전자 및 암호 DNA 서열(구조적 특징)을 구현할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 하나 이상의 실시형태에서, 본 개시내용의 식은 아데노바이러스 게놈에서 천연 유래 서열을 설명하도록 시도한다. 이와 관련하여, 식이 게놈의 적절한 부문을 특성규명하는 주된 요소에 관한 것이며, DNA의 게놈 신장의 철저한 설명인 것으로 의도되지 않는다는 것은 당업자에게 분명할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 E1A, E1B, E3 및 E4는 각각 독립적으로 야생형 및 이의 동등물, 본 명세서에 기재된 바와 같은 각각의 영역의 돌연변이되거나 또는 부분적으로 결실된 형태, 특히 공지된 아데노바이러스로부터의 야생형 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용하는 바와 같은 "삽입"은 5' 말단, 3' 말단에서 혼입된 DNA 서열 또는 기준 서열을 가로막도록 주어진 DNA 서열 기준 세그먼트를 지칭한다. 후자는 삽입이 위치된 기준 지점으로서 사용되는 기준 서열이다. 본 개시내용과 관련하여 삽입은 일반적으로 서열번호 10 또는 서열번호 11 중 하나 내에서 생긴다. 삽입은 제한 부위 삽입, 이식유전자 카세트 중 하나 또는 둘 다일 수 있다. 서열이 가로막힐 때, 바이러스는 여전히 본래의 서열을 포함할 것이지만, 일반적으로 이는 삽입물을 샌드위칭하는 2개의 단편으로서일 것이다.
일 실시형태에서, 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 비편향 삽입 트랜스포존, 예컨대, TN7 트랜스포존 또는 이의 부분을 포함하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 Tn7 트랜스포존은 WO2008/080003에 기재된 바와 같은 비편향 삽입 트랜스포존을 지칭한다.
일 실시형태에서, BX 및 BY 에서 1개 이상의 제한 부위는 본 명세서에 기재된 효소에 특이적인 제한 부위, 예를 들어, NotI, FseI, AsiSI, SgfI 및 SbfI로부터 독립적으로 선택되며, 특히 삽입된 제한 부위는 모두 상이하다(예컨대, NotI에 특이적인 부위 및 BX에 위치된 FseI 및 BY에 위치된 SgfI 및 SbfI에 특이적인 부위).
상기 논의한 바와 같이, 일 실시형태에서 영역 BX 및/또는 BY는 제한 부위를 포함하지 않는다. 유리하게는, 본 개시내용의 바이러스 및 작제물은, 예를 들어, 합성 기법을 이용하여 제한 부위 없이 제조될 수 있다. 이들 기법은 바이러스 및 작제물의 생성에서 큰 유연성을 허용한다. 더 나아가, 본 발명자들은 바이러스 및 작제물이 합성 기법에 의해 제조될 때, 바이러스 및 작제물의 특성이 감소되지 않는다는 것을 확립하였다.
프로모터
본 명세서에서 사용되는 프로모터는 특정 유전자 또는 유전자들의 전사를 개시하는 DNA 영역을 의미한다. 프로모터는 그들이 동일한 가닥 상에서 그리고 DNA 상의 상류(즉, 5')에서 전사하는 유전자의 근위에 일반적으로 위치된다. 본 내용에서 사용되는 근위는 프로모터로서 작용하기에 충분히 가까운 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 프로모터는 전사 개시 부위의 100bp 내이다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 내인성 프로모터는 이식유전자가 삽입되는 아데노바이러스(또는 작제물)에서 자연적으로 생기는(즉, 천연인) 프로모터를 지칭한다. 하나 이상의 실시형태에서, 사용되는 내인성 프로모터는 바이러스 게놈 내 그의 본래의 위치에서 바이러스 내 천연 유래 프로모터이며, 특히 이는 이식유전자 또는 이식유전자의 발현에서 사용되는 주요 또는 유일한 프로모터이다. 일 실시형태에서, 이식유전자의 번역 및 선택적으로 전사를 촉진시키기 위해 사용되는 내인성 프로모터는 하나의 체류자가 있으며, 즉, 아데노바이러스의 게놈에서 통합되고 재조합 기법에 의해 이전에 도입되지 않은 것이다.
본 명세서에서 사용되는 내인성 프로모터의 제어 하에서는 이식유전자/이식유전자 카세트가 상기 내인성 프로모터의 제어 하에 있는 적절한 배향으로 삽입되는 경우를 지칭한다. 즉, 프로모터가 일반적으로 안티센스 가닥에 있는 경우에, 카세트는, 예를 들어, 안티센스 배향으로 삽입된다.
이를 언급하면, 유전자는 2개의 배향 중 하나에서 발현될 수 있다. 그러나, 일반적으로 하나의 배향은 주어진(특정) 이식유전자에 대해 다른 배향 이상으로 증가된 발현 수준을 제공한다.
일 실시형태에서, 카세트는 센스 배향이다. 이는 5'에서 3' 방향으로 전사된다. 일 실시형태에서, 카세트는 안티센스 배향이다. 이는 3'에서 5' 배향으로 전사된다.
바이러스 내 내인성 프로모터는, 예를 들어, 이식유전자를 암호화하는 유전자 및 스플라이스 수용자 서열을 사용함으로써 이용될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서 카세트는 내인성 프로모터의 제어 하에 있을 때 스플라이스 수용자 서열을 포함할 것이다. 따라서, 일 실시형태에서, 암호 서열, 예를 들어, 항체 또는 항체 결합 단편을 암호화하는 서열은 스플라이스 수용자 서열을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 이식유전자, 이식유전자, 또는 이식유전자 카세트는 E4 프로모터 또는 주요 후기 프로모터, 예컨대, 주요 후기 프로모터(ML 프로모터)의 제어 하에 있다.
본 명세서에서 사용되는 제어 하에서는 이식유전자가 활성화되고, 즉, 특정 프로모터가 지시할 때 전사된다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 주요 후기 프로모터(ML 프로모터 또는 MLP)는 "후기 발현된" 유전자, 예컨대, L5 유전자의 발현을 제어하는 아데노바이러스 프로모터를 지칭한다. MLP는 "센스 가닥" 프로모터이다. 즉, 프로모터는 5'-3' 방향으로 프로모터의 하류인 유전자에 영향을 미친다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 주요 후기 프로모터는 바이러스 게놈에 위치된 본래의 주요 후기 프로모터를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 E4 프로모터는 E4 영역의 아데노바이러스 프로모터를 지칭한다. E4 영역은 안티센스 영역이고; 따라서 프로모터는 안티센스 프로모터이다. 즉, 프로모터는 3'-5' 방향으로 E4 영역의 상류에 있다. 따라서 E4 프로모터의 제어 하에서 임의의 이식유전자 카세트는 적절하게 배향될 필요가 있을 수 있다. 일 실시형태에서, E4 프로모터의 제어 하에서 카세트는 안티센스 배향이다. 일 실시형태에서, E4 프로모터의 제어 하에서 카세트는 센스 배향이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 E4 프로모터는 바이러스 게놈에 위치된 본래의 E4 프로모터를 지칭한다.
따라서 일 실시형태에서, 복제 적격 종양 용해성 아데노바이러스 혈청형 11(예컨대, Ad11p) 또는 이의 바이러스-유도체가 제공되되, 섬유, 헥손 및 캡시드는 혈청형 11(예컨대, Ad11p)이고, 바이러스 게놈은 치료 항체 또는 항체-결합 단편(예컨대, BiTE)을 암호화하는 DNA 서열을 포함하고, 이식유전자가 바이러스 복제를 방해하지 않도록, 예를 들어, L5 영역과 (즉, 상기 영역 전에 또는 뒤에) 결합하도록, 예컨대, 바이러스 게놈에서 L5 뒤에 위치되고, 특히 L5와 E4 영역 사이에 위치되도록, 아데노바이러스에 대해 내인성인 프로모터의 제어 하에서 상기 DNA 서열은 E4 및 주요 후기 프로모터(즉, E4 프로모터 또는 주요 후기 프로모터)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 내인성 프로모터는 재조합 기법에 의해 목적으로 하는 위치에서 바이러스 게놈 내로 도입되고, 예를 들어, 이식유전자 카세트에 도입된다. 그러나, 본 명세서와 관련하여, 이 배열은 일반적으로 외인성 프로모터로서 지칭될 것이다.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 외인성 프로모터를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 외인성 프로모터는 이식유전자가 삽입되는 아데노바이러스에서 천연 유래가 아닌 프로모터를 지칭한다. 전형적으로, 외인성 프로모터는 다른 바이러스로부터 유래되거나 또는 포유류 프로모터이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 외인성 프로모터는 유전자의 전사를 조절하는 관심 대상의 유전자 상류에 보통 위치되는 DNA 요소를 의미한다.
일 실시형태에서, 유전자 발현의 조절자는 외인성 프로모터, 예를 들어, CMV(사이토메갈로바이러스 프로모터), CBA(닭 베타 액틴 프로모터) 또는 PGK(포스포글리세레이트 키나제 1 프로모터), 예컨대, CMV 프로모터이다.
일 실시형태에서, 사용되는 CMV 외인성 프로모터는 서열번호 52의 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 일 실시형태에서, 사용되는 PGK 외인성 프로모터는 서열번호 53의 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 일 실시형태에서, 사용되는 CBA 외인성 프로모터는 서열번호 54의 뉴클레오타이드 서열을 가진다.
일 실시형태에서 복제 적격 종양 용해성 아데노바이러스 혈청형 11(예컨대, Ad11p) 또는 이의 바이러스-유도체가 제공되되, 섬유, 헥손 및 캡시드는 혈청형 11(예컨대, Ad11p)이고, 이식유전자가 바이러스 복제를 방해하지 않도록 바이러스 게놈은 바이러스복제 주기에서 후기에 발현되는 바이러스 게놈의 부분에 위치된 치료 항체 또는 항체-결합 단편(예컨대, 본 개시내용에 따른 BiTE)을 암호화하는 DNA 서열을 포함하며, 상기 DNA 서열은 아데노바이러스에 대해 외인성인 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)의 제어 하에 있다. 일 실시형태에서, 항체 또는 단편(예컨대, 본 개시내용에 따른 BiTE)를 암호화하는 DNA 서열은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 L5 영역과 결합되고, 특히 L5와 E4 영역 사이에 위치된다.
일 실시형태에서, 외인성 프로모터는 항원-제시 세포 프로모터이다. 본 명세서에서 사용되는 항원-제시 세포 프로모터는 항원-제시 세포, 예컨대, 수지상 세포 또는 대식세포에 의해 선택적으로 발현되는 유전자에 대한 프로모터를 지칭한다. 이러한 유전자는 FLT-3, FLT-3 리간드, TLR, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, GITR 리간드, IFN-α2, IL-12, IL-23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, TSLP 수용체, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 또는 CD304; 항원 처리 및 제시 매개체, 예컨대, CTIIA 또는 GILT를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 일 실시형태에서 외인성 프로모터는 상기 항원-제시 세포에서 이식유전자의 선택적 발현에 적합하다.
다른 조절 서열
본 명세서에서 사용되는 "유전자 발현의 조절자"(또는 조절자/조절 요소)는 전형적으로 전사 또는 번역을 개시 또는 향상시킴으로써 유전자 발현에서 어떤 역할을 하는 유전적 특징, 예컨대, 프로모터, 인핸서 또는 스플라이스 수용자 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "스플라이스 수용자 서열", "스플라이스 수용자" 또는 "스플라이스 부위"는 mRNA 분자가 스플라이소좀 복합체의 소핵 리보뉴클레오단백질에 의해 인식될 때를 결정하는 조절 서열을 지칭한다. 일단 조립되면, 스플라이소좀은 mRNA 분자의 스플라이스 수용자 부위와 상류의 스플라이스 공여자 부위 사이의 스플라이싱을 촉매하여 단일 폴리펩타이드 또는 단백질을 생성하도록 번역될 수 있는 성숙 mRNA 분자를 생성한다.
상이한 크기의 스플라이스 수용자 서열은 본 발명에서 사용될 수 있으며, 이들은 짧은 스플라이스 수용자(짧음), 스플라이스 수용자(중간) 및 분지된 스플라이스 수용자(거대)로서 기재될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 SSA는 전형적으로 바로 스플라이스 부위, 예를 들어, 4개의 염기쌍을 포함하는 짧은 스플라이스 수용자를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 SA는 전형적으로 짧은 스플라이스 수용자 및 폴리피리미딘 관, 예를 들어, 16 bp를 포함하는 스플라이스 수용자를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 bSA는 전형적으로 짧은 스플라이스 수용자, 폴리피리미딘관 및 분지점, 예를 들어, 26개의 염기쌍을 포함하는 분지된 스플라이스 수용자를 의미한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 작제물에서 사용되는 스플라이스 수용자는 서열번호 55 내지 57에 나타낸다. 일 실시형태에서, SSA는 서열번호 55의 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 일 실시형태에서, SA는 서열번호 56의 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 일 실시형태에서, bSA는 서열번호 57의 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 일 실시형태에서, 스플라이스 수용자 서열은 TGCTAATCTT CCTTTCTCTC TTCAGG(서열번호 57), CCTTTCTCTCTT CAGG(서열번호 56), 및 CAGG(서열번호 55)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일 실시형태에서, 스플라이스 부위는 CCACC를 포함하는 공통 코작 서열에 의해 즉시 진행된다(즉, 5'에서 3' 방향으로 이어짐). 일 실시형태에서, 스플라이스 부위 및 코작 서열은 100개 이하까지의 염기쌍에 의해 개재된다. 일 실시형태에서, 코작 서열은 서열번호 58의 뉴클레오타이드 서열을 가진다.
전형적으로, 내인성 또는 외인성 프로모터(예컨대, 내인성 프로모터)의 제어 하에 있을 때, 암호 서열은 코작 서열의 바로 앞에 있을 것이다. 암호 영역의 시작은 개시 코돈(AUG)으로 표시되며, 예를 들어, 서열(gcc)gccRccAUGg [서열번호 59]와 관련하여 암호 서열 "시작"의 시작은 볼드체 염기로 나타낸다. 소문자는 이 위치에서 통상적인 염기(그렇지만 다를 수 있음)를 나타내고, 대문자는 고도로 보존된 염기를 나타내며, 즉, 'AUGG' 서열은 변화가 있다고 해도 일정하거나 또는 드물며; 'R'은 퓨린(아데닌 또는 구아닌)이 이 위치에서 보통 관찰되고 괄호 내 서열(gcc)이 불확실한 유의도를 가진다는 것을 나타낸다. 따라서, 일 실시형태에서, 개시 코돈 AUG는 코작 서열 내로 혼입된다.
본 명세서에서 사용되는 내부 리보솜 유입 DNA 서열은 내부 리보솜 유입 서열(IRES)을 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 IRES는 번역의 개시를 허용하는 뉴클레오타이드 서열, mRNA 서열 내에서 시작하는 개시를 포함하는 전령 RNA(mRNA) 서열을 의미한다. 이는 카세트가 다시트론성 mRNA를 암호화할 때 특히 유용하다. IRES를 이용하여 다중 개개 단백질 또는 펩타이드로 번역되는 다시트론성 mRNA를 초래한다. 일 실시형태에서, 내부 리보솜 유입 DNA 서열은 서열번호 60의 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 일 실시형태에서, 특정 IRES는 게놈에서 1회만 사용된다. 이는 게놈의 안정성에 대해 이점을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "높은 자기-절단 효율 2A 펩타이드" 또는 "2A 펩타이드"는 번역 후에 효율적으로 절단되는 펩타이드를 지칭한다. 적합한 2A 펩타이드는 P2A, F2A, E2A 및 T2A를 포함한다. 본 발명자들은 일단 주어진 2A 펩타이드를 암호화하는 특정 DNA 서열이 1회 사용된다면, 동일한 특정 DNA 서열이 2회 사용되지 않을 수도 있다는 것을 주목하였다. 그러나, DNA 암호에서의 중복은 동일한 2A 펩타이드로 번역되는 DNA 서열을 생성하는 데 이용될 수 있다. 2A 펩타이드의 이용은 카세트가 다시트론성 mRNA를 암호화할 때 특히 유용하다. 2A 펩타이드의 이용은 다중 개개 단백질 또는 펩타이드로 번역후에 변형되는 번역 중인 단일 폴리펩타이드 쇄를 초래한다.
일 실시형태에서, 사용되는 암호화된 P2A 펩타이드는 서열번호 61의 아미노산 서열을 가진다. 일 실시형태에서, 사용되는 암호화된 F2A 펩타이드는 서열번호 62의 아미노산 서열을 가진다. 일 실시형태에서, 사용되는 암호화된 E2A 펩타이드는 서열번호 63의 아미노산 서열을 가진다. 일 실시형태에서, 사용되는 암호화된 T2A 펩타이드는 서열번호 64의 아미노산 서열을 가진다.
일 실시형태에서, 이식유전자(들)에 의해 암호화된 mRNA 또는 각각의 mRNA는, 예를 들어, 서열번호 65에서 나타낸 바와 같이, 예컨대, 전형적으로 mRNA 서열의 말단에서 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 따라서 일 실시형태에서, 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 폴리아데닐화 신호 서열을 암호화하는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "폴리A", "폴리아데닐화 신호" 또는 "폴리아데닐화 서열"은 일단 전사되면 초기 mRNA 분자를 절단하고 폴리아데닐화하는 다중단백질 복합체에 의해 인식될 수 있는 보통 AATAAA 부위를 함유하는 DNA 서열을 의미한다.
일 실시형태에서, 폴리아데닐화 서열은 서열번호 65의 뉴클레오타이드 서열을 가진다.
일 실시형태에서, 작제물은 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 유전자 발현의 조절자는 스플라이스 수용자 서열이다.
일 실시형태에서, 단백질/폴리펩타이드/펩타이드, 예컨대, 항체 또는 항체 단편(예컨대, 본 개시내용에 따른 BiTE)을 암호화하는 서열은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.
이식유전자에 의해 암호화된 분자
본 명세서에 기재된 바와 같이, 바이러스에서 적어도 하나의 이식유전자는 BiTE를 암호화하되, 하나의 결합 도메인은 T 세포 표면 항원에 특이적이다. 제2 결합 도메인은 적합한 항원, 예를 들어, 병원균 항원, 암 항원, 기질 항원을 표적화할 수 있다.
암 항원(또한 종양 항원으로 지칭됨)은 특정 관심 대상의 적어도 하나의 범주이며, 예를 들어, CEA, MUC-1, EpCAM, HER 수용체 HER1, HER2, HER3, HER4, PEM, A33, G250, 탄수화물 항원 Ley, Lex, Leb, PSMA, TAG-72, STEAP1, CD166, CD24, CD44, E-카데린, SPARC, ErbB2, ErbB3, WT1, MUC1, LMP2, 유전자형, HPV E6&E7, EGFRvIII, HER-2/neu, MAGE A3, p53 비돌연변이체, p53 돌연변이체, NY-ESO-1, GD2, PSMA, PCSA, PSA, MelanA/MART1, Ras 돌연변이체, 프로테이나제3(PR1), bcr-abl, 타이로시나제, 서비빈, PSA, hTERT, 특히 WT1, MUC1, HER-2/neu, NY-ESO-1, 서비빈 및 hTERT로부터 선택되는 것을 포함한다.
기질 항원은 섬유아세포 항원, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 것, 예컨대, FAP, 종양 연관 대식세포 항원 및 골수 유래 억제 세포 항원을 포함하고, 예를 들어, CD163, CD206, CD68, CD11c, CD11b, CD14, CSF1 수용체, CD15, CD33 및 CD66b를 포함한다.
이하의 표적 목록은, 적절하다면, 본 개시내용에 따른 BiTE에서 암호화될 수 있거나 또는 대안적으로 추가적인 치료적 이식유전자로서 제공될 수 있거나, 또는 둘 다이다.
일 실시형태에서, 이식유전자 또는 이식유전자는 단백질, 펩타이드, RNA 분자, 예컨대, RNA 분자를 독립적으로 암호화한다. 유리하게는, 이식유전자는 세포내로 전달될 수 있고, 후속적으로 전사될 수 있으며, 적절하다면 번역될 수 있다. 이식유전자에 의해 암호화된 유전자 물질의 예는, 예를 들어, 항체 또는 이의 결합 단편, 케모카인, 사이토카인, 면역조절제, 효소(예를 들어, 활성제에서 프로드러그를 전환시킬 수 있음) 및 RNAi 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 펩타이드는 2 내지 50개의 잔기, 예를 들어, 5 내지 20개의 잔기의 아미노산 서열을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 폴리펩타이드는 3차 구조 없이, 특히 2차 및 3차 구조 없이 50개 초과의 잔기의 아미노산 서열을 지칭한다. 단백질은 2차 및/또는 3차 구조를 갖는, 특히 2차 및 3차 구조를 갖는 50개 초과의 잔기의 아미노산 서열을 지칭한다.
일 실시형태에서, 암호 서열은 치료적 RNA, 치료적 펩타이드, 치료적 폴리펩타이드 또는 치료적 단백질(즉, 치료적 유전자임)을 암호화한다.
본 명세서에서 사용되는 면역조절제 유전자 또는 이식유전자는 면역계 세포의 활성 또는 활성들을 정성적으로 또는 정량적으로 변형시킬 수 있는 펩타이드 또는 단백질 분자를 암호화하는 유전자를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 치료적 유전자는 질환의 치료, 개선 또는 예방에서 유용할 수 있는 독립체를 암호화하는 유전자, 예를 들어, 암과 같은 질환의 진행을 적어도 늦추거나, 중단시키거나 또는 반전시키는 치료적 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 RNA를 발현시키는 유전자를 의미한다.
일 실시형태에서, 세포, 예컨대, 암세포에서 전사되거나 또는 번역될 때 이식유전자에 의해 암호화되는 독립체는 세포에 의한 위험한 신호의 생성을 증가시킨다. 본 명세서에서 사용되는 "위험한 신호"는, 예를 들어, 선천성 면역계 세포를 직접 반응하도록 자극할 뿐만 아니라 적응 면역계 세포의 활성화를 향상시키는 역할을 함으로써 알람 신호로서 작용하는 손상, 스트레스 또는 비세포자멸사적 사멸을 겪는 세포에 의해 생성되는 다양한 분자를 지칭한다.
천연 인간 면역 반응이 하향 조절되도록 종양의 미세환경이 종종 변한다는 것을 공지되어 있다. 따라서, 종양 내로부터의 면역 반응을 재시작하는 능력은 잠재적으로 암 치료에서 매우 흥미롭다.
일 실시형태에서, 암호화된 치료적 펩타이드 또는 단백질은 세포외 환경으로 분비되도록 설계된다. 일 실시형태에서, 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예컨대, 항체는 세포의 외부 미세환경으로, 예를 들어, 배양물 상청액 또는 생체내: 조직, 기질, 순환, 혈액 및/또는 림프계 내로 방출된다.
일 실시형태에서, 이식유전자에 의해 암호화되는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질(본 개시내용에 따른 BiTE를 포함)은 신호 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 신호 펩타이드는 분비 또는 막 발현을 위해 분비 경로 내로 단백질의 유입을 돕는 단백질의 N-말단에 위치된 짧은 13 내지 36개의 잔기 펩타이드 서열을 지칭한다. 일 실시형태에서, 리더 서열(신호 펩타이드)는 서열번호 66 또는 67의 아미노산 서열을 가진다.
다른 실시형태에서, 암호화된 치료적 펩타이드 또는 단백질, 예컨대, 항체는, 예를 들어, 지질막 앵커의 부착을 위해 단백질 또는 부위에서 막관통 도메인의 암호화를 포함함으로써, 세포의 표면막에서 막-고정 형태로서 발현되도록 설계된다. 일반적으로, 본 개시내용의 BiTE 또는 BiTE들은 세포 표면 앵커 형식으로서 발현되지 않는다.
일 실시형태에서, 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예컨대, 항체는, 예를 들어, 활성 분비에 의해 또는 세포 용해의 결과로서 아데노바이러스에 의해 감염되는 세포로부터 방출된다. 따라서, 일 실시형태에서 아데노바이러스는 세포를 용해시킴으로써, 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예컨대, 항체를 방출시킨다.
다른 실시형태에서, 암호화된 추가적인 치료적 펩타이드 또는 단백질, 예컨대, 항체는 무손상 세포 내에 보유되도록 설계된다.
유리하게는, 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예컨대, 본 개시내용의 아데노바이러스에 의해 발현되는 항체는 mRNA와 항체 단백질 둘 다로서 생체내 조직에서 검출될 수 있다. 더 나아가, 발현된 기능성 RNA, 펩타이드 또는 단백질, 예컨대, 항체는 ELISA에서 그의 리간드에 결합할 수 있다. 또한 추가로, 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예컨대, 항체는 조기에(예를 들어, 감염의 3일 이내에) 검출 가능하며, 발현은 몇주에 걸쳐 지속된다.
일 실시형태에서 본 개시내용의 아데노바이러스는 감염의 약 3일 이상 이내에, 예컨대, 약 36, 48, 60 또는 72시간, 또는 예컨대, 2, 3, 4, 5 또는 6일 이내에 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예컨대, 항체를 발현시킨다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스는 몇 주, 예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주 동안 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예컨대, 항체를 발현시킨다. 예컨대, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 또는 42일.
유리하게는, 기능성 RNA, 펩타이드 또는 단백질 발현, 예컨대, 항체 발현은 혈액에서 기능성 RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예컨대, 항체를 검출할 수 있도록 충분히 높다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스에 의해 발현되는 기능성 RNA, 펩타이드 또는 단백질, 항체는 혈류 및/또는 림프계로 유입된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스는 암 세포에 대해 향상된 치료 지수를 갖는 종양 용해성 바이러스이다.
일 실시형태에서, 암호 서열은 기능성 RNA, 예를 들어, 치료적 RNA를 추가로 암호화한다.
본 명세서에서 사용되는 기능성 RNA는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 것 이외의 기능을 갖고, 예를 들어, 유전자 활성을 저해하거나 또는 감소시키는 데 적합한 RNA 작제물(RNAi, 예컨대, shRNA 및 miRNA를 포함)을 포함하는, RNA를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 shRNA는 RNA 간섭(RNAi)을 통해 표적 유전자 발현을 침묵시키는 데 사용될 수 있는 단단한 헤어핀을 만드는 RNA 서열인 짧은 헤어핀 RNA를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 miRNA(마이크로RNA)는 전사 또는 번역후 수준에서 유전자 발현을 조절하기 위해 mRNA 분자 내에서 상보성 서열과의 염기 짝짓기를 통해 작용하는 작은 비암호 RNA 분자(약 22개의 뉴클레오타이드를 함유)를 지칭한다. miRNA에 의해 결합된 mRNA는 침묵되는데, 그들이 더 이상 리보솜에 의해 단백질로 번역될 수 없고, 이러한 복합체는 종종 세포에 의해 적극적으로 해체되기 때문이다.
일 실시형태에서, 이식유전자는 단백질을 암호화한다. 본 명세서에서 사용되는 단백질은 단백질 리간드, 단백질 수용체, 또는 항체 분자를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 단백질 리간드는, 예를 들어, 세포내 신호전달을 자극하고 세포 내에서 유전자 전사를 조절함으로써, 세포 기능에 영향을 비치기 위해 세포의 수용체에 결합하거나 또 다르게는 이에 맞물리는 세포 표면막 또는 이의 분비된 단백질 결합 단편을 지칭한다. 일 실시형태에서, 발현되는 단백질은 세포 표면 상에서 발현되고/되거나 세포로부터 분비되도록 조작된다.
일 실시형태에서, 암호화된 단백질은 이중특이성 항체, 예컨대, BiTE이다.
일 실시형태에서, 이식유전자는 추가로, 예를 들어, 종양의 세포외 기질 분해를 돕는 효소, 예를 들어, DNAse, 콜라게나제, 기질 메탈로프로테이나제(예컨대, MMP2 또는 14) 또는 유사체를 암호화한다.
적합한 항체 및 항체 단편은 작용적 또는 길항적일 수 있으며, 항암 활성을 갖는 것 및 암에 대해 숙주 세포 반응을 변형시키는 것을 포함하고, 예를 들어, 작용제 또는 길항적 항체 또는 항체 단편은 혈관화를 감소시키거나 또는 종양의 혈관화를 정상화시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 작용적 항체 또는 다른 암호화된 단백질은, 예를 들어, 항원, 위험한 신호, 사이토카인 또는 케모카인을 끌어들이고 활성화시키기 위해 이를 발현시킴으로써, 또는 적응 면역 반응을 향상시키기 위해 공자극 또는 관문 경로 분자에 결합함으로써 숙주의 선천성 및 적응 면역 반응에 대해 숙주 세포를 더 가시적으로 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 치료 항체 또는 항체-결합 단편은 종양 용해성 바이러스에 삽입될 때, 환자에서의 병리에 대해, 예를 들어, 치료 중인 암에 대해 유리한 영향을 갖는, 항체 또는 항체-결합 단편을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 유리한 영향은 생체내에서 발현 중인 항체의 바람직한 그리고/또는 유리한 효과를 지칭한다.
치료적 항체 및 항체-결합 단편의 부류는 항-EGF 항체, 항-VEGF 항체, 항-PDGF 항체, 항-CTLA 항체, 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체 및 항-FGF 항체를 포함한다.
본 개시내용의 바이러스 내로 혼입에 적합한 공인된 치료적 항체는 압식시맙, 아달리무맙, 알렘투주맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베바시주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 카나키누맙, 세툭시맙, 세르톨주맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에쿨주맙, 에팔릭수맙, 겜투주맙, 골리무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 인플릭시맙, 이플리무맙, 무로모납-CD3, 오파투무맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 토시투모맙 및 트라스투주맙을 포함한다.
일 실시형태에서, 사용되는 항체 또는 항체 단편의 항체 가변 영역 서열은 베바시주맙(또한 아바스타틴(Avastin)(등록상표)로서 알려짐) 가변 영역과 95 내지 100% 유사 또는 동일, 예컨대, 96, 97, 98 또는 99% 유사 또는 동일하다.
암 적응증을 위해 승인된 해당 항체 및 이의 결합 단편, 예를 들어, 트라스투주맙, 토시투모맙, 리툭시맙, 파니투무맙, 오파투무맙, 이필리무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 겜투주맙, 데노수맙, 세툭시맙, 브렌툭시맙 베도틴, 아바스틴 및 아달리무맙에 대한 암호 서열은 또한 본 개시내용의 바이러스 내로 혼입에 적합하다.
일 실시형태에서, 사용된 항체 또는 항체 단편의 항체 가변 영역 서열은 공지된 항체 또는 본 명세서에 개시된 항체의 가변 영역에 대해 95 내지 100% 유사하거나 또는 동일하다.
본 명세서에서 사용되는 "항체 분자"는 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 항체는 일반적으로 전장 항체 및 이중특이성 또는 이를 포함하는 다중 특이성 형식을 지칭한다.
항체-결합 단편은 그것이 유래된 본래의 "항체"에 대해 동일한, 유사한 또는 더 양호한 특이성을 갖는 항원을 표적화할 수 있는 항체를 포함한다. 항체 단편은 Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, Bis-scFv, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디 및 상기 중 임의의 에피토프-결합 단편을 포함한다(예를 들어, 문헌[Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참조). 이들 항체 단편을 생성하고 제조하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조). 본 발명에서 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 출원 WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성, 예를 들어, 이중특이성을 포함할 수 있거나 또는 단일특이성일 수 있다(예를 들어, WO 92/22853, WO05/113605, WO2009/040562 및 WO2010/035012 참조).
본 명세서에서 사용되는 특이성은 특이적인 항원만을 인식하는 항체 또는 단편 또는 특이적이지 않은 항원에 대한 그의 결합 친화도에 비해 특이적인 항원에 대해 상당히 더 높은 결합 친화도, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 더 높은 결합 친화도를 갖는 항체 또는 단편을 지칭하는 것으로 의도된다.
공지된 항체 또는 항체-결합 단편은 동일한 CDR 또는 동일한 가변 영역을 갖는 대안의 항체 형식을 생성하도록 사용될 수 있으며, 예를 들어, 전장 항체는 Fab, Fab' 또는 scFv 단편으로 용이하게 전환될 수 있다.
다양한 범위의 상이한 형태의 항체가 비-인간 동물로부터의 항체 분자, 인간 항체 분자, 인간화된 항체 분자 및 키메라 항체 분자를 포함하는 본 개시내용의 작제물에서 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 항체 또는 결합 단편은 단클론성이다. 단클론성 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대, 하이브리도마 기법(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트라이오마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)에 의해 제조될 수 있다.
일 실시형태에서, 항체 또는 결합 단편은 비인간, 즉, 완전히 비인간 유래이다. 이는 항체 및 단편이 바이러스에 의해 암세포 내부에 전달될 수 있기 때문에 가능하다.
일 실시형태에서, 항체는 키메라이며, 예를 들어, 인간 불변 영역(들) 및 비인간 가변 영역을 가진다.
일 실시형태에서, 항체 또는 결합 단편은 인간, 즉, 완전히 인간 유래이다.
일 실시형태에서, 항체 또는 결합 단편은 인간화된다. 인간화된 항체(CDR-접합 항체를 포함)는 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 항체 분자이다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; WO91/09967). 전체 CDR보다는 CDR의 특이성 결정 잔기를 전달하는 데만 필요할 수 있다는 것을 인식할 것이다(예를 들어, 문헌[Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 인간화된 항체는 선택적으로 비인간 종으로부터 유래된, 예를 들어, CDR이 유래된 하나 이상의 프레임워크 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 암호 서열은 항체 중쇄, 항체 경쇄 또는 항체 단편을 암호화한다. 본 명세서에서 사용되는 중쇄(HC)는 항체의 거대 폴리펩타이드 서브유닛을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 경쇄(LC)는 항체의 작은 폴리펩타이드 서브유닛을 지칭한다. 일 실시형태에서, 항체 경쇄는 CL 도메인, 카파 또는 람다 중 하나를 포함한다.
본 개시내용에서 사용하기 위한 항체는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 폴리펩타이드를 (재조합적으로 또는 자연적으로) 발현시키는 세포(예컨대, 활성화된 T 세포)를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 항원 폴리펩타이드/단백질은 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 폴리펩타이드는 '성숙' 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편 또는 유도체일 수 있다.
항체에 대한 선별은 항원에 대한 결합을 측정하는 분석 및/또는 수용체를 길항하는 능력을 측정하는 분석을 이용하여 수행될 수 있다. 결합 분석의 예는, 특히, 플레이트 상에서 고정된 융합 단백질(선택적으로 수용체를 포함)을 이용하고, 융합 단백질에 결합된 항-항원을 검출하는 접합된 2차 항체를 사용하는 ELISA이다.
본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은, 존재한다면, 항체 분자의 제안된 기능 및 특히 필요할 수 있는 효과기 기능에 대해 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 항체 분자가 치료적 용도로 의도되고 항체 효과기 기능이 필요할 때 특히 IgG1 및 IgG3 아이소타입의 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있다. 대안적으로, IgG2 및 IgG4 아이소타입은, 항체 분자가 치료적 목적을 위해 의도되고, 예를 들어, 단순히 작용 활성을 위해 또는 표적 중화를 위해 항체 효과기 기능이 필요하지 않을 때 사용될 수 있다. 이들 불변 영역 도메인의 서열 변이체가 또한 사용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 위치 241에서 세린이 문헌[Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108]에 기재된 바와 같이 프롤린으로 변화된 IgG4 분자가 사용될 수 있다.
특정 항체 기능을 위해, 예를 들어, 항체의 표적 분자를 보유하는 세포, 예컨대, 면역계의 세포에 활성화 신호를 전달하기 위해, 항체가 발현 세포의 표면 상에서 발현되도록 항체의 막-고정된 형태를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 세포 표면 발현된 결합 분자는 표적 분자로부터의 활성화 신호의 수용 세포 내로의 전달을 향상시키는 고정 세포 표면 상의 표적 신호전달 분자 사이의 효율적인 다량체 상호작용을 가능하게 한다.
유리하게는, 본 개시내용의 아데노바이러스는 전장 항체, 항체 단편, 예커대 scFvs, 다중특이성 항체, 특히 이중특이성 항체, 예컨대, 본 명세서에 기재되는 BiTE를 발현시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열(예컨대, 본 개시내용에 따른 BiTE)은 내부 리보솜 유입 서열을 포함하거나 또는 추가로 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 내부 리보솜 유립 서열(IRES)은 전령 RNA(mRNA) 서열의 중간에서 번역 개시를 허용하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
일 실시형태에서, 암호화된 치료적 단백질 또는 펩타이드는 특정 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 표적화한다.
본 명세서에서 사용되는 표적 특이적 단백질 또는 펩타이드는 표적 단백질 그 자체, 또는 표적 단백질 또는 펩타이드에 직접 결합하거나(예를 들어, 표적에 특이적임) 또는 이의 수준을 달리 변형시키는 상이한 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 전자의 예는 사이토카인인 반면, 후자의 예는 해당 사이토카인에 대해 항체일 것이다.
관심 대상의 표적은 일반적으로 질환, 특히 암과 관련된 특정 세포, 세포 생성물, 항원 또는 신호전달 경로에 관한 것이다. 문맥에 따라서 표적은 또한 mRNA에 관한 것이거나 또는, 예를 들어, RNAi 유형 기법에 의해 저해될 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자로부터 유사하게 전사된다. 따라서, RNA, 예컨대, RNAi 기법과 관련하여, 표적은 표적 유전자에 의해 암호화된 mRNA이다.
관심 대상의 표적의 예는 자극 T-세포 공동-수용체 및 이에 대한 리간드, 관문 저해 T-세포 공동-수용체 분자 및 이에 대한 리간드, 수용체 및 조절 T-세포, 골수 유래 억제 세포 및 면역억제 면역 세포에 의해 발현되는 이에 대한 리간드, 수지상 세포 및 항원-제시 세포 수용체 및 이에 대한 리간드, 항원 가공 및 제시 매개체, 사이토카인 및 사이토카인 수용체, 케모카인 및 케모카인 수용체, 전사 인자 및 전사 조절자, 세포내 수송 분자 및 세포 기능의 조절자, 종양 세포 및 종양 미세환경 수용체 및 생성물, 세포내 종양 세포 효소, 예컨대, IDO, 면역 세포에 의한 인식을 위한 항원을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
따라서 일 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되는 표적은 적절하다면, 예를 들어, 항체 또는 이에 대한 결합 단편에 의해 저해되거나, 중화되거나 또는 활성화될 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 사이토카인과 관련하여 표적은 사이토카인에 특이적인 사이토카인 그 자체 또는 이의 항체 또는 결합 단편을 지칭한다. 따라서, 바이러스는 사이토카인 그 자체를 암호화하고 발현시킬 수 있는데, 이의 방출이 "숙주" 면역 반응을 자극할 수 있기 때문이다. 리간드와 관련하여, 리간드의 돌연변이 형태는 수용체에 결합하는 천연 리간드와 경쟁하는 바이러스에 의해 암호화될 수 있다. 돌연변이된 리간드는, 예를 들어, 그것이 느린 속도를 가짐으로써 수용체를 점유하고 그로부터의 신호전달을 증가 또는 감소시키도록, 수용체에 대해 증가된 결합 친화도를 가질 수 있다. 대안적으로, 돌연변이된 리간드의 활성은 야생형 리간드에 비해 감소될 수 있으며, 이에 의해 천연 리간드로부터 수용체를 통해 결합 및 전반적인 활성을 감소시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 작제물은 프로드러그, 면역조절제 및/또는 효소를 암호화한다.
본 명세서에서 사용되는 프로드러그는 종종 정상 대사 과정을 통해 신체에서 활성 약학 제제로 후속적으로 전환되는 비활성(또는 완전한 활성보다 적은) 유도체로서 투여되는 분자를 의미한다. 프로드러그는 의도된 약물에 대한 전구체 유형으로서 작용한다. 프로그러그 전환 효소는 프로드러그를 그의 약학적으로 활성인 형태로 전환시키는 효소로서 작용한다.
본 명세서에서 사용되는 면역조절제는 면역 반응의 조절제를 의미한다. 면역조절제는 면역강화, 면역억제 또는 면역관용의 유도에서와 같이 면역 반응을 목적으로 하는 수준까지 조절하는 작용을 한다.
T 세포는 2개의 신호가 완전히 활성화될 것을 필요로 한다. 항원-특이적인 제1 신호는 항원 제시 세포(APC)의 막 상에서 펩타이드-MHC 분자와 상호작용하는 T 세포 수용체를 통해 제공된다. 공자극 신호인 제2 신호는 항원 비특이적이며, APC의 막 상에서 발현되는 공자극 분자와 T 세포 사이의 상호작용에 의해 제공된다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 공자극 분자는 활성화, 증식 및 생존을 위해 T 세포에 의해 필요로 되는 항원-특이적 신호에 상보적 신호를 제공하는 분자를 의미한다. 공자극 분자의 예는 CD28, CD80, CD86, CD83 및 4-1BB를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 효소는 살아있는 유기체에서 촉매로서 작용하여, 그 자체가 과정에서 변경되는 일 없이 화학 반응을 진행시키는 속도를 조절하는 물질을 의미한다.
다음은 예시적인 표적 펩타이드/폴리펩타이드 및 단백질의 철저하지 않은 논의이다.
일 실시형태에서, 표적은 관문 단백질, 예컨대, 면역 관문 또는 세포 주기 관문 단백질이다. 관문 단백질의 예는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, VISTA, B7-H3, B7-H4, HVEM, ILT-2, ILT-3, ILT-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, LIGHT 또는 CD160, 예를 들어, CTLA-4, PD-1, PD-L1 및 PD-L2를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 이들 중 하나에 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편이 제공된다. 따라서, 일 실시형태에서 이식유전자 또는 이식유전자 카세트는 CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 암호화한다. 일 실시형태에서, 아데노바이러스는 CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 발현시킨다.
일 실시형태에서, 항체는 관문 저해제 항체, 예를 들어, 항-PD-L1이다. 일 실시형태에서, 아데노바이러스는 전장 항-인간 PD-L1 항체를 발현시킨다. 일 실시형태에서, 전장 항-인간 PD-L1 항체의 발현은 특히 위치 BY에서 내인성 프로모터, 예컨대, 주요 후기 프로모터(MLP)의 제어 하에 있다. 일 실시형태에서, 아데노바이러스는 항-인간 PD-L1 항체의 scFv 형태를 발현시킨다. 일 실시형태에서, 항-인간 PD-L1 항체의 scFv 형태의 발현은 특히 위치 BY에서 내인성 프로모터, 예컨대, 주요 후기 프로모터의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서, 예를 들어, 본 명세서에 예시되는 바와 같이 CTLA-4에 특이적인 전장 항체 또는 scFv에 대해 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 작제물이 제공된다.
일 실시형태에서, 표적은 CD16, CD25, CD33, CD332, CD127, CD31, CD43, CD44, CD162, CD301a, CD301b 및 갈렉틴-3을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상이다. 일 실시형태에서, 항체 또는 이에 특이적인 결합 단편, 예를 들어, 전장 항체 또는 scFv가 제공된다.
일 실시형태에서, 예를 들어, 항체 또는 결합 단편에 의해 표적화될 수 있는 표적은 FLT-3, FLT-3 리간드, TLR, TLR 리간드, CCR7, CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD80, CD83, CD86, CD123, CD172a, CD205, CD207, CD209, CD273, CD281, CD283, CD286, CD289, CD287, CXCR4, GITR 리간드, IFN-α2, IL-12, IL-23, ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT7, TSLP 수용체, CD141, CD303, CADM1, CLEC9a, XCR1 및 CD304를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는 BiTE의 표적은 종양 세포 항원이다.
일 실시형태에서, 표적은 CEA, MUC-1, EpCAM, HER 수용체 HER1, HER2, HER3, HER4, PEM, A33, G250, 탄수화물 항원 Ley, Lex, Leb, PSMA, TAG-72, STEAP1, CD166, CD24, CD44, E-카데린, SPARC, ErbB2, ErbB3을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는 BiTE의 표적은 종양 기질 항원이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는 BiTE의 표적은 FAP, TREM1, IGFBP7, FSP-1, 혈소판-유래 성장 인자-α 수용체(PDGFR-α), 혈소판-유래 성장 인자-β 수용체(PDGFR-β) 및 비멘틴을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상이다.
일 실시형태에서, 예를 들어, 항체 또는 결합 단편(예컨대, BiTE)에 의해 표적화될 수 있는 표적은 암 표적이다.
일 실시형태에서, 표적은 OX40, OX40 리간드, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40 리간드, TL1A, CD70, CD137, GITR, 4-1BB, ICOS 또는 ICOS 리간드, 예를 들어, CD40 및 CD40 리간드를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상이다.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 CD40 또는 CD40 리간드, 또는 CD40 또는 CD40 리간드에 표적화된 항체, 항체 단편 또는 shRNA를 포함하는 리간드를 암호화한다. 일 실시형태에서, 아데노바이러스는 CD40 또는 CD40 리간드, 또는 CD40 또는 CD40 리간드(에 특이적인)에 표적화된 항체, 항체 단편 또는 shRNA를 포함하는 리간드를 발현시킨다.
일 실시형태에서, 표적은 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-33, IL-35를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 사이토카인이다. 인터류킨-2(IL-2), IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, TGFβ, 림포톡신 α(LTA) 및 GM-CSF.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 IL-12, IL-18, IL-22, IL-7, IL-15, IL-21, IFNα, IFNγ, TNFα, TGFβ 또는 림포톡신 α(LTA)에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 암호화한다. 일 실시형태에서, 아데노바이러스는 IL-12, IL-18, IL-22, IL-7, IL-15, IL-21, IFNα, IFNγ, TNFα, TGFβ 또는 림포톡신 α(LTA)를 발현시킨다.
일 실시형태에서, IFNγ의 아미노산 서열은 서열번호 68이다. 일 실시형태에서, IFNα의 아미노산 서열은 서열번호 69이다. 일 실시형태에서, TNFα의 아미노산 서열은 서열번호 70이다.
일 실시형태에서, 표적은 케모카인, 예를 들어: IL-8, CCL3, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CXCR3, CXCR4, CXCR5 및 CRTH2를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상이다.
일 실시형태에서, 이식유전자 카세트는 CCL5, CXCL9, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4 또는 CXCR4에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 암호화한다. 케모카인과 관련하여, 표적은, 예를 들어, 암에 대해 숙주 면역 반응을 유도하거나 또는 증가시키기 위해, 바이러스가 케모카인을 암호화하고 발현시키는 경우를 포함한다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 CCL5, CXCL9, CXCL12, CCL2, CCL19, CCL21, CXCR2, CCR2, CCR4 또는 CXCR4에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 발현시킨다.
일 실시형태에서, 표적은 STAT3, STAT1, STAT4, STAT6, CTIIA, MyD88 및 NFκ패밀리 구성원을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상이고, 예를 들어, 단백질은 저해제, 예를 들어, 항체 또는 이의 결합 단편에 의해 표적화되거나, 또는 적절한 유전자로부터 전사된 mRNA는 RNAi와 같은 메커니즘에 의해 저해된다.
일 실시형태에서, 표적은 HSp70 또는 세포 생존 및 사멸의 조절자, 예컨대, 서비빈이고, 예를 들어, 단백질은 저해제, 예를 들어, 항체 또는 이의 결합 단편에 의해 표적화되거나, 또는 적절한 유전자로부터 전사된 mRNA는 RNAi와 같은 메커니즘에 의해 저해된다.
일 실시형태에서, 표적은 암피레귤린, BTC, NRG1a, NRG1b, NRG3, TGF, LRIG1, LRIG3, EGF, EGF-L6, Epigen, HB-EGF, EGFR, Her2, Her3 및 Her4을 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상이고, 예를 들어, 단백질은 저해제, 예를 들어, 항체 또는 이의 결합 단편에 의해 표적화되거나, 또는 적절한 유전자로부터 전사된 mRNA는 RNAi와 같은 메커니즘에 의해 저해된다.
일 실시형태에서, 표적은 헤지호그, FGF, IGF, Wnt, VEGF, TNF, TGF, PDGF 및 Notch를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상에 대한 리간드 또는 수용체이다.
일 실시형태에서, 아데노바이러스는 VEGF에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 발현시킨다. 일 실시형태에서, 항체는 항-VEGF 항체이다. 예를 들어, 항체 베바시주맙 또는 이의 동등물의 아미노산 서열을 갖는 항체. 일 실시형태에서, 아데노바이러스는 전장 항-인간 VEGF 항체를 발현시킨다. 일 실시형태에서, 전장 항-인간 VEGF 항체의 발현은 특히 위치 BY에서 내인성 프로모터, 예컨대, 주요 후기 프로모터(MLP)의 제어 하에 있다. 일 실시형태에서, 아데노바이러스는 항-인간 VEGF 항체의 scFv 형태를 발현시킨다. 일 실시형태에서, 항-인간 VEGF 항체의 scFv 형태의 발현은 특히 위치 BY에서 내인성 프로모터, 예컨대, 주요 후기 프로모터의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서, 표적은 IDO이다.
일 실시형태에서, 표적은 면역 세포(예컨대, BiTE에 의해 맞물린 T 세포)에 의한 인식을 위한 항원이며, 감염 유기체로부터의 면역원성 단백질, 예컨대, 거대세포바이러스 항원, 인플루엔자 항원, B형 간염 표면 및 코어 항원, 디프테리아 톡소이드, Crm197, 파상풍 톡소이드; 공지된 T-세포 또는 항체 에피토프인 이러한 항원으로부터 유래된 펩타이드, 또는 이러한 항원의 유전자 조작된 복합체 또는 다량체; 항원으로서 종양-유래 단백질; 공지된 T-세포 또는 항체 에피토프인 이러한 항원으로부터 유래된 펩타이드; 및 이러한 항원의 유전자 조작된 복합체 또는 다량체, 예를 들어, WT1, MUC1, LMP2, 유전자형, HPV E6&E7, EGFRvIII, HER-2/neu, MAGE A3, p53 비돌연변이체, p53 돌연변이체, NY-ESO-1, GD2, PSMA, PCSA, PSA, gp100, CEA, MelanA/MART1, Ras 돌연변이체, 프로테이나제3(PR1), bcr-abl, 타이로시나제, 서비빈, PSA, hTERT, 특히 WT1, MUC1, HER-2/neu, NY-ESO-1, 서비빈 또는 hTERT를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 펩타이드이다.
당업자는 코돈 중복에 기인하여 주어진 아미노산 서열을 암호화시키는 핵산 서열에 대해 다수의 가능성이 존재한다는 것, 침묵 핵산 염기쌍 돌연변이가 용인되며, 임의의 서열번호에서 나타내는 주어진 아미노산 서열을 암호화하는 모든 핵산 서열이 본 개시내용에 의해 생각된다는 것을 인식할 것이다.
일 실시형태에서, 이식유전자에 의해 암호화된 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 미모톱(mimotope)이다. 본 명세서에서 사용되는 미모톱은 에피토프의 구조를 모방하는 분자, 종종 펩타이드이다. 후자의 특성은 에피토프에 의해 유발되는 것과 유사한 항체 반응을 야기한다. 주어진 에피토프 항원에 대한 항체는 해당 에피토프를 모빙하는 미모톱을 인식할 것이다. 미모톱은 바이오패닝(biopanning)을 통해 파지 디스플레이 라이브러리로부터 통상적으로 얻어진다. 미모톱을 이용하는 백신은 개발 중에 있다. 따라서 공지된 특이성의 항체는 라이브러리(예를 들어, 파지 디스플레이 내 펩타이드 라이브러리 - 예를 들어, Ab 서열 라이브러리 또는 비항체 펩타이드 라이브러리, 특히 더 안정한 3D 입체배좌를 갖는 펩타이드를 생성하기 위해 최적화된 것)를 선별하기 위해 사용될 수 있으며 - 미모톱의 생성은 당업계에 잘 기재되어 있다(문헌[Tribbick G, Rodda S. Combinatorial methods for discovery of peptide ligands which bind to antibody-like molecules. J Mol Recognit. 2002 15(5):306-10; Masuko T, Ohno Y, Masuko K, Yagi H, Uejima S, Takechi M, Hashimoto Y. Towards therapeutic antibodies to membrane oncoproteins by a robust strategy using rats immunized with transfectants expressing target molecules fused to green fluorescent protein. Cancer Sci. 2011 102(1):25-35] 참조).
일 실시형태에서, 미모톱 또는 다른 설계된 백신 항원은 이식유전자에 의해 암호화되고, 수용자 환자에서의 항체 반응을 유도하기 위해 발현되되, 유도된 항체는 목적으로 하는 치료 효과를 가진다. 일 실시형태에서, 목적으로 하는 인간 리간드로부터의 펩타이드 서열을 갖는 GFP-펩타이드 융합 단백질은 항-자기 표적 항체 반응을 유도하기 위해 사용되며, 예를 들어, 펩타이드에 대한 면역 항체 반응이 천연 PDL1 분자와 교차 반응하는 항체를 포함하고 따라서 항-PDL1 항체를 직접 암호화하는 것과 동일한 방식으로 PD-L1:PD-1 상호작용을 차단하는 작용을 하도록 표적 분자 PD-1에 대한 결합에 중요한 것으로 알려진 PD-L1의 펩타이드 영역은 GFP 또는 다른 고도로 면역원성인 외래 담체 단백질과 유전자 연결될 수 있다. 항-자기 치료 항체 반응을 유도하는 백신에 대한 개념은 당업계에 잘 기재되어 있다(문헌[Spohn G, Bachmann MF. Therapeutic vaccination to block receptor-ligand interactions. Expert Opin Biol Ther. 2003 3(3):469-76; Link A, Bachmann MF. Immunodrugs: breaking B- but not T-cell tolerance with therapeutic anticytokine vaccines. Immunotherapy 2010 2(4):561-74;
Figure 112022078544073-pat00001
L, Assier E, Semerano L, Bessis N, Boissier MC. Emerging applications of anticytokine vaccines. Expert Rev Vaccines. 2008 7(10):1507-17] 참조).
하나 이상의 실시형태에서, 사용된 이식유전자는 서열번호 2, 4, 7, 11 또는 16 중 임의의 하나에서 나타낸 서열을 암호화한다.
다른 실시형태에서, 사용된 이식유전자는, 예를 들어, 서열번호 72 내지 78 중 임의의 하나에 제시된 바이러스에 나타낸 바와 같은 C-말단 단부에서 데카-His 친화도 태그를 제외하는 서열을 암호화한다.
유리하게는, 본 개시내용의 아데노바이러스는 시험관내에서 배양물 상청액 내로 또는 생체내에서 종양 조직 기질 내로 그의 이식유전자에 의해 암호화된 항체 형태(예컨대, BiTE) 및 다른 단백질, 예컨대, 사이토카인을 발현시키고 방출한다. 리더 서열은 암세포를 나가는 암호화된 단백질/폴리펩타이드 또는 펩타이드를 도울 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서 암호화된 "단백질"은 리더 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 리더 서열은 프로모터 서열과 전사 또는 번역 수준에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 암호 영역 사이에 위치된 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
일 실시형태에서, 암호 서열은 펩타이드를 암호화한다. 본 명세서에서 사용되는 펩타이드는 완전한 기능성 단백질이 아닌 아미노산 쇄를 지칭한다. 전형적으로, 단백질 기능의 일부 또는 모두를 보유하는 단편은 면역계, 예를 들어, T-세포에 의해 인식될 수 있는 8개 이상의 아미노산의 펩타이드의 단편이거나 또는 이에 의해 인식될 수 있다.
일 실시형태에서, 이식유전자는, 예를 들어, 생물발광, 형광 영상화제(활성화 가능한 형광 영상화제를 포함), 예컨대, 루시퍼라제, GFP 또는 eGFP 또는 적색 형광 단백질을 포함하는 영상화제를 암호화하는 리포터 유전자이다.
본 명세서에서 사용되는 리포터 유전자 또는 리포터 서열은 진핵 세포에서 용이하게 검출되는 생성물을 생성하는 유전자 또는 DNA 서열을 의미하며, 그의 DNA가 가깝게 연결되거나 또는 조합된 다른 유전자의 활성을 결정하기 위한 마커로서 사용될 수 있다. 리포터 유전자는 용이하게 동정되고 측정되는 그들을 발현시키는 세포 또는 유기체 상에서의 특징을 부여하거나, 또는 선택 가능한 마커이다. 리포터 유전자는 종종 세포 또는 유기체 집단에서 특정 유전자가 취해지거나 또는 발현되는지 여부의 표시로서 사용된다. 통상적인 리포터 유전자의 예는 LacZ, 루세퍼라제, GFP, eGFP, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 요오드화나트륨 동일방향 수송체(sodium iodide symporter: NIS), 나이트로리덕타제(예를 들어, NfsA, NfsB) 세포내 메탈로프로테인, HSV1-tk 또는 에스트로겐 수용체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 유전자 물질(특히 이식유전자)는 리포터 유전자, 예컨대, 영상화제, 루시퍼라제, GFP 또는 eGFP를 암호화 또는 발현시키지 않는다.
본 개시내용에 따른 바이러스는 종양 세포의 패널에서 그의 용해 가능성의 시험에 의해 특정 종양 유형에 대한 그들의 선호도에 대해 조사될 수 있고, 예를 들어, 결장 종양 세포주는 HT-29, DLD-1, LS174T, LS1034, SW403, HCT116, SW48 및 Colo320DM을 포함한다. 임의의 이용 가능한 결장 종양 세포주는 이러한 평가에 대해 동등하게 유용할 것이다.
전립선 세포주는 DU145 및 PC-3 세포를 포함한다. 췌장 세포주는 Panc-1 세포를 포함한다. 유방 종양 세포주는 MDA231 세포주를 포함하고, 난소 세포주는 OVCAR-3 세포주를 포함한다. 조혈 세포주는 Raji 및 Daudi B-림프계 세포, K562 적혈모세포, U937 골수 세포 및 HSB2 T-림프계 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 이용 가능한 종양 세포주는 동등하게 유용하다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 신규한 서열로 확장된다. 일 실시형태에서, 바이러스는 본 명세서에 개시된 서열 중 임의의 하나, 예를 들어, 서열번호 34 내지 37의 임의의 서열 또는 이에 대해 적어도 95% 동일한 서열, 예를 들어, 서열번호 79 내지 82 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 서열에 나타낸다.
제형
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스의 약제학적 제형으로의 확장에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따라 복제 가능한 종양 용해성의, 예를 들어, 주입 또는 주사용의 액체 비경구 제형이 제공되되, 제형은 용량의 용적 당 1x1010 내지 1x1014개의 바이러스 입자 범위의 용량을 제공한다.
비경구 제형은 GI 관을 통해 전달되지 않도록 설계된 제형을 의미한다. 전형적인 비경구 전달 경로는 주사, 이식 또는 주입을 포함한다. 일 실시형태에서, 제형은 볼루스 전달을 위한 형태로 제공된다.
일 실시형태에서, 제형은 주사 형태이다. 주사는 정맥내, 피하, 종양내 또는 근육내 주사를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 주사는 주사기를 통한 신체 내로의 액체의 삽입을 의미한다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 종양 내 주사를 수반하지 않는다.
일 실시형태에서, 제형은 주입 형태이다.
본 명세서에서 사용되는 주입은 점적, 주입 펌프, 주사기 펌프 또는 동등한 장치에 의해 더 느린 속도로 유체의 투여를 의미한다. 일 실시형태에서, 주입은 1.5분 내지 120분, 예컨대, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 65, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 또는 115분의 범위로 기간에 걸쳐 투여된다.
일 실시형태에서, 100㎖ 미만, 예를 들어, 30㎖의 1회 용량 제형이 예컨대, 주사기 펌프에 의해 투여된다. 일 실시형태에서, 1회 용량의 제형은 10㎖ 미만, 예를 들어, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1㎖이다. 일 실시형태에서, 1회 용량의 제형은 1㎖ 미만, 예컨대, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1㎖이다.
일 실시형태에서, 주사는, 예를 들어, 1.5 내지 30분의 기간에 걸쳐 느린 주사로서 투여된다.
일 실시형태에서, 제형은 정맥내(i.v.) 투여를 위한 것이다. 이 경로는 종양 용해성 바이러스의 전달을 위해 특히 효과적인데, 그것이 대다수의 기관 및 조직에 대한 빠른 접근을 허용하며, 전이, 예를 들어, 특히 고도로 혈관성인 영역, 예컨대, 간 및 폐에 위치된 확립된 전이의 치료에 특히 유용하다.
치료 제형은 전형적으로 멸균성이며, 제조 및 저장 조건 하에서 안정할 것이다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 리포좀 또는 인간에 대한 투여에 적합한 다른 비경구 제형으로서 제형화될 수 있으며, 사전 충전된 장치로서, 예컨대, 주사기 또는 바이알, 특히 단일 용량으로서 제형화될 수 있다.
제형은 일반적으로 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체, 예를 들어, 바이러스에 적합한 비독성, 등장성 담체를 포함할 것이며, 이때 바이러스는 필요한 시간 기간 동안 안정하다.
담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 분산물 또는 계면활성제, 예컨대, 레시틴 또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리솔베이트 80 또는 40의 사용에 의해 유지될 수 있다. 분산물에서, 필요한 입자 크기의 유지는 계면활성제의 존재에 의해 보조될 수 있다. 등장성 제제의 예는 조성물 중에서 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 포함한다.
일 실시형태에서, 사용되는 비경구 제형은 다음의 완충제, 예를 들어, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산, 인산염 완충제 및/또는 트리스 완충제, 당, 예를 들어, 덱스트로스, 만노스, 수크로스 또는 유사체, 염, 예컨대, 염화나트륨, 염화마그네슘 또는 염화칼륨, 세정제, 예컨대, 비이온성 계면활성제, 예컨대, briji, PS-80, PS-40 또는 유사체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 제형은 또한 가능한 분해의 하나 이상의 경로를 막는 것으로 생각되는 보존제, 예컨대, EDTA 또는 에탄올 또는 EDTA와 에탄올의 조합물을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제형은 본 개시내용에 따른 정제된 종양 용해성 바이러스, 예를 들어, 용량 당 1x1010 내지 1x1014개의 바이러스 입자, 예컨대, 용량 당 1x1010 내지 1x1012개의 바이러스 입자를 포함할 것이다. 일 실시형태에서, 제형 중의 바이러스 농도는 2 x 108 내지 2 x 1014 vp/㎖, 예컨대, 2 x 1012 vp/㎖의 범위이다.
일 실시형태에서, 비경구 제형은 글리세롤을 포함한다.
일 실시형태에서, 제형은 본 명세서에 기재된 바와 같은 종양 용해성 아데노바이러스, HEPES(N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산), 글리세롤 및 완충제를 포함한다.
일 실시형태에서, 비경구 제형은 본 개시내용의 바이러스, HEPES, 예를 들어, 5mM, 글리세롤 예를 들어, 5 내지 20%(v/v), 염산(예를 들어, pH를 7 내지 8 범위로 조절하기 위함) 및 주사용수로 이루어진다.
일 실시형태에서, 2 x 1012 vp/㎖의 농도로 본 개시내용의 0.7㎖의 바이러스는 최종 pH 7.8로 5mM HEPES, 20% 글리세롤 중에서 제형화된다.
약제학적으로 허용 가능한 담체의 철저한 논의는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)]에서 이용 가능하다.
일 실시형태에서, 제형은 흡입을 포함하는 국소 투여를 위한 제형으로서 제공된다.
적합한 흡입 가능한 제제는 흡입 가능한 분말, 추진 가스를 함유하는 정량 에어로졸 또는 추진 가스가 없는 흡입 가능한 용액을 포함한다. 본 개시내용에 따른 흡입 가능한 분말은 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스를 생리적으로 허용 가능한 부형제와 함께 함유할 것이다.
이들 흡입 가능한 분말은 단당류(예를 들어, 글루코스 또는 아라비노스), 이당류(예를 들어, 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고- 및 다당류(예를 들어, 덱스트란), 폴리알코올(예를 들어, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨), 염(예를 들어, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 이들과 다른 것의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 이당류는 락토스 또는 글루코스가, 특히 배타적으로는 아니지만 그들의 수화물의 형태로 적합하게 사용된다.
폐에서의 침착을 위한 입자는 10 마이크론 미만, 예컨대, 1 내지 9마이크론, 예를 들어, 0.1 내지 5㎛, 특히 1 내지 5㎛의 입자 크기를 필요로 한다. 바이러스를 운반하는 입자 크기는 주된 중요성을 가지며, 따라서 일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스는 입자, 예컨대, 주어진 크기의 락토스 입자 상에 흡착되거나 또는 흡수될 수 있다.
흡수 가능한 에어로졸을 준비하기 위해 사용될 수 있는 추진제 가스는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 추진제 가스는 탄화수소 중에서, 예컨대, n-프로판, n-부탄 또는 아이소부탄 및 할로탄화수소, 예컨대, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 사이클로프로판 또는 사이클로부탄의 염소화된 및/또는 플루오린화된 유도체로부터 선택된다. 상기 언급된 추진제 가스는 그 자체로 또는 이들의 혼합물에서 사용될 수 있다.
특히 적합한 추진제 가스는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227 중에서 선택되는 할로겐화된 알칸 유도체이다. 상기 언급된 할로겐화된 탄화수소 중에서, TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이들의 혼합물이 특히 적합하다.
추진제 가스-함유 흡입 가능 에어로졸은 또한 다른 성분, 예컨대, 공용매, 안정제, 표면활성제(계면활성제), 항산화제, 윤활제, 및 pH를 조절하기 위한 수단을 함유할 수 있다. 모든 이들 성분은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 추진제 가스-함유 흡입 가능 에어로졸은 활성 물질의 5중량%까지를 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은, 예를 들어, 0.002 내지 5중량%, 0.01 내지 3중량%, 0.015 내지 2중량%, 0.1 내지 2중량%, 0.5 내지 2중량% 또는 0.5 내지 1중량%의 활성 성분을 함유한다.
대안적으로 폐에 대한 국소 투여는 또한 액체 용액 또는 현탁액 제형의 투여에 의해, 예를 들어, 장치, 예컨대, 네뷸라이저, 예를 들어, 압축기에 연결된 네뷸라이저(예를 들어, 버지니아주 리치몬드시에 소재한 파리 레스퍼러토리 이큅먼트 인코포레이티드(Pari Respiratory Equipment, Inc.)에 의해 제조된) 파리 마스터(알)(Pari Master(R)) 압축기에 연결된 파리 LC-제트 플러스(알)(Pari LC-Jet Plus(R)) 네뷸라이저)를 사용하는 것에 의할 수 있다.
본 발명의 바이러스는 용매 중에서, 예를 들어, 용액 또는 현탁액의 형태로, 예를 들어, 비경구 제형에 대해 상기 이미 기재한 바와 같이 분산되어 전달될 수 있다. 이는 적절한 생리적 용액, 예를 들어, 식염수 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 용매 또는 완충 용액 중에서 현탁될 수 있다. 당업계에 공지된 완충 용액은 약 4.0 내지 5.0의 pH를 달성하기 위해 1㎖의 물당 0.05㎎ 내지 0.15㎎ 에데트산이나트륨, 8.0㎎ 내지 9.0㎎ NaCl, 0.15㎎ 내지 0.25㎎ 폴리솔베이트, 0.25㎎ 내지 0.30㎎ 무수 시트르산, 및 0.45㎎ 내지 0.55㎎ 시트르산나트륨을 함유할 수 있다.
치료적 현탁액 또는 용액 제형은 또한 1종 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 당업계에 잘 공지되어 있고, 완충제(예를 들어, 시트르산 완충제, 인산염 완충제, 아세트산염 완충제 및 중탄산염 완충제), 아미노산, 요소, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 솔비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생체 분해 가능한 마이크로스피어에서 캡슐화될 수 있다. 제형은 일반적으로 멸균 제조 과정을 사용하여 실질적으로 멸균 형태로 제공될 수 있다.
이는 제형에 사용되는 완충 용매/용액의 여과, 멸균 완충 용매 용액 중의 항체의 무균 현탁액 및 당업자에게 익숙한 방법에 의한 멸균 리셉터클 내로의 제형의 분산에 의한 생성 및 멸균을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따른 네뷸라이징 가능한 제형은, 예를 들어, 호일 봉투 내에 포장된 단일 용량 단위(예를 들어, 밀봉 플라스틱 용기 또는 바이알)로서 제공될 수 있다. 각각의 바이알은 용적 중의 단위 용량, 예를 들어, 2㎖의 용매/용액 완충제를 함유한다.
치료
추가 양상에서, 본 개시내용은 치료, 특히 암 치료를 위한 용도를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 또는 이의 제형으로 확장된다.
일 실시형태에서, 치료 방법은 종양, 특히 고형 종양의 치료에서 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 종양은 신생물로도 불리는 제어되지 않은 그리고 진행성인 과도한 세포 분할로부터 초래되는 조직의 비정상적 덩어리를 지칭하는 것으로 의도된다. 종양은 양성(암성이 아님) 또는 악성 중 하나일 수 있다. 종양은 모든 형태의 암 및 전이를 포함한다.
일 실시형태에서, 종양은 고형 종양이다. 고형 종양은 국소화되거나 또는 전이될 수 있다.
일 실시형태에서, 종양은 상피 유래이다.
일 실시형태에서, 종양은 악성종양, 예컨대, 결장직장암, 간세포암, 전립선암, 췌장암, 유방암, 난소암, 갑상선암, 신장암, 방광암, 두경부암 또는 폐암이다.
일 실시형태에서, 종양은 결장직장 악성종양이다.
본 명세서에서 사용되는 악성 종양은 암성 세포를 의미한다.
일 실시형태에서, 종양 용해성 아데노바이러스는 전이의 치료 또는 예방에서 사용된다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 방법 또는 제형은 약물 내성암의 치료에서 사용된다.
일 실시형태에서, 바이러스는 추가적인 암치료 또는 요법의 투여와 조합하여 투여된다.
일 실시형태에서, 암, 예를 들어, 상기 기재한 암의 치료를 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 제형이 제공된다.
추가 양상에서, 암 치료가 필요한 환자, 예를 들어, 인간 환자에게 본 개시내용에 따른 치료적 유효량의 바이러스 또는 제형을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 종양 용해성 바이러스 또는 제형은 다른 요법과 조합하여 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 "조합하여"는 종양 용해성 바이러스가 암치료 또는 요법 전에, 동시에 및/또는 후에 투여되는 경우를 포함하는 것으로 의도된다.
암 요법은 수술, 방사선 요법, 표적화된 요법 및/또는 화학요법을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 암 치료는 치료적 화합물 또는 생물학적 제제, 예를 들어, 암을 치료하기 위해 의도되는 항체 및/또는 이의 유지 요법을 이용하는 치료를 지칭한다.
일 실시형태에서, 암 치료는 화학치료제, 표적화된 항암제, 방사선요법, 방사성-동위원소 요법 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 임의의 다른 항암 요법으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스, 예컨대, 종양 용해성 아데노바이러스는 종양을 수축시키기 위해, 전이를 치료하기 위해 그리고/또는 전이 또는 추가적인 전이를 방지하기 위해 요법, 예컨대, 수술(신보강 요법(neoadjuvant therapy))에 대한 전처리로서 사용될 수 있다. 종양 용해성 아데노바이러스는 전이를 치료하기 위해 그리고/또는 전이 또는 추가적인 전이를 방지하기 위해 요법, 예컨대, 수술(보조 요법) 후에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 동시에는 종양 용해성 아데노바이러스 제형과 동시에 또는 거의 동시에 추가적인 암 치료의 투여이다. 치료는 동일한 제형 내에 함유될 수 있거나 또는 별개의 제형으로서 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 바이러스는 화학치료제의 투여와 조합하여 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 화학치료제는 악성종양 세포 및 조직에 대해 파괴적인 특정 항신생물 화학 제제 또는 약물을 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 알킬화제, 항대사물질, 안트라사이클린, 식물 알칼로이드, 토포아이소머라제 저해제 및 다른 항종양 제제. 화학치료제의 다른 예는 독소루비신, 5-플루오로유라실(5-FU), 파클리탁셀, 카페시타빈, 이리노테칸 및 플라틴, 예컨대, 시스플라틴 및 옥살리플라틴을 포함한다. 바람직한 용량은 치료 중인 암의 특성에 기반하여 실행자에 의해 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 치료적 제제는 면역 반응 및/또는 종양 혈관화를 제어하는 것을 보조할 수 있는 간사이클로비어이다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 방법에서 사용되는 하나 이상의 요법은 종종 다른 요법 방법과 동시에 주어지는 저용량의 항암 약물을 이용하는 연속적 또는 빈번한 치료인 메트로노믹(metronomic)이다.
하위그룹 B 종양 용해성 아데노바이러스, 특히 Ad11 및 그로부터 유래된 것, 예컨대, EnAd는 화학치료제에 의해 특히 상승적일 수 있는데, 이는 대부분 괴사용해성인 메커니즘에 의해 암 세포를 사멸시키는 세포자멸사와 크게 독립적인 작용 메커니즘을 갖는 것으로 보이기 때문이다. 게다가, 화학요법 동안 생기는 면역억제는 종양 용해성 바이러스가 더 큰 효율로 작용하도록 허용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 치료 용량은 적합한 치료 섭생에서 사용될 때, 예를 들어, 질환의 증상 또는 병태를 개선시키는 의도된 치료 효과를 달성하기에 적합한 바이러스, 예컨대, 종양 용해성 아데노바이러스의 양을 지칭한다. 바이러스 입자의 수가 다음을 초래하기에 충분할 때 암 또는 전이의 치료에서 용량은 치료적 용량으로 고려될 수 있다: 종양 또는 전이 성장이 느리거나 또는 중단되거나, 또는 종양 또는 전이가 크기를 수축시키는 것으로 발견되고/되거나 환자의 수명 기간이 연장된다. 적합한 치료 용량은 일반적으로 치료 효과와 용인 가능한 독성 사이의 균형이며, 예를 들어, 부작용 및 독성은 요법에 의해 달성되는 주어지는 이점을 용인 가능하다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 치료적 작제물(이를 포함하는 제형을 포함)은 매주, 예를 들어, 1주 1회 투여되며, 용량은 제1일, 제3일, 제5일, 다음에 각각의 후속적 주에 1회 투여된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 치료적 작제물(이를 포함하는 제형을 포함)은 2주마다 또는 3주마다 투여되고, 예를 들어, 1주에, 제1일, 제3일 및 제5일에 1회 투여되고, 그리고 2주 또는 3주에 1회 제1일, 제3일 및 제5일에 투여된다. 이 투약 섭생은 적절하다면 다회 반복될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 바이러스 또는 치료적 작제물(이를 포함하는 제형을 포함)은 매달 투여된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 및 작제물은 재조합 기법에 의해 제조된다. 당업자는 갖추어진 아데노바이러스 게놈이 게놈 또는 게놈의 부분 또는 모두를 포함하는 플라스미드를 전체적으로 합성하는 다른 기술적 수단에 의해 제조될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 제놈을 합성하는 사건에서, 삽입 영역이 제한 부위 뉴클레오타이드를 포함하지 않을 수도 있는데, 후자가 클로닝 방법을 이용하는 유전자의 삽입 후의 인공물이기 때문임을 인식할 것이다.
일 실시형태에서, 갖추어진 아데노바이러스 게놈은, 예를 들어, 서열번호 34 내지 37에 따라 전체적으로 합성에 의해 제조된다.
본 명세서의 개시내용은 추가로 이식유전자 또는 이식유전자 카세트를 삽입하는 것으로부터 얻어지거나 또는 얻을 수 있는 식 (I) 또는 이의 하위 식으로 확장된다.
본 명세서에서 사용되는 "이다"는 포함하는을 의미한다.
본 명세서와 관련하여 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)"으로 해석되어야 한다.
특정 특징/요소를 포함하는 본 발명의 실시형태는 또한 적절한 요소/특징으로 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진" 대안의 실시형태로 확장되는 것으로 의도된다.
기술적으로 적절한 경우, 본 발명의 실시형태는 조합될 수 있다.
기술적 참고문헌, 예컨대, 특허 및 출원은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 구체적으로 그리고 명확하게 인용되는 임의의 실시형태는 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 실시형태와 조합하여 청구범위에 기반하여 형성될 수 있다.
본 출원은 본 명세서에 참고로 포함되는 GB1614607.8, GB1700663.6, GB1706219.1 및 GB1713765.4로부터의 우선권을 주장한다. 이들 문헌은 본 명세서의 오류, 특히 서열목록의 오류를 수정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 수반하는 도면에 관해 다음의 실시예에서 단지 예시의 방법으로 추가로 기재된다:
도 1 (a) 선택적 데카히스티딘 친화도 태그을 포함하거나 또는 결여된 본 개시내용의 BiTE 항체의 개략적 표현을 도시한 도면. Ig SP: 신호 펩타이드; 10His: 데카히스티딘 친화도 태그; L: GS 링커; VL: 가변 경쇄 도메인; VH 가변 중쇄 도메인. (b) pSF-CMV-EpCAMBiTE에 대한 플라스미드 맵을 도시한 도면. (c) pSF-CMV-FAPBiTE에 대한 플라스미드 맵을 도시한 도면. (d) pSF-CMV-대조군BiTE에 대한 플라스미드 맵을 도시한 도면.
도 2 (a) 재조합 BiTE의 정량화를 나타내는 도트 블롯을 도시한 도면. (b) FAP에 대한 ELISA 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면. (c) EpCAM에 대한 ELISA 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 3은 유세포 분석을 이용하여 측정된 FAP BiTE 및 대조군 BiTE의 존재 하에 단독으로 또는 NHDF와 함께 공동 배양된 T 세포에 대한 CD69(a) 및 CD25(b)의 발현 수준을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 4 (a) 세포내 사이토카인 염색에 의해 측정된 FAP BiTE 및 대조군 BiTE의 존재 하에서 단독으로 또는 NHDF 세포와 함께 공동 배양된 T 세포에 대한 IFN γ발현 수준을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 그래프 (b) 및 (c)는 유세포 분석을 이용하여 측정된 EpCAM BiTE 및 대조군 BiTE의 존재 하에 단독으로 또는 DLD 세포와 함께 공동 배양된 T 세포에 대한 CD69 및 CD25의 발현 수준을 도시한 도면.
도 5 (a) 세포내 사이토카인 염색에 의해 측정된 EpCAM BiTE 및 대조군 BiTE의 존재 하에서 NHDF 세포와 함께 공동 배양된 T 세포에 대한 IFN γ발현 수준을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 그래프 (b) 및 (c)는 유세포 분석에 의해 측정된 EpCAM BiTE 및 대조군 BiTE의 존재 하에서 DLD 세포와 함께 공동 배양된 PBMC에 대한 CD69 및 CD25의 수준을 도시한 도면.
도 6 (A) T 세포 및 FAP BiTE 또는 대조군 BiTE와 함께 공동 배양시킨 NHDF 세포의 세포독성을 나타내는 LDF 분석 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면. (B) T 세포 및 FAP BiTE 또는 대조군 BiTE와 함께 공동 배양시킨 BTC100 세포의 세포독성을 나타내는 LDH 분석 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면. (C) T 세포 및 FAP BiTE 대 대조군 BiTE와 함께 공동 배양 후에 NHDF 세포의 이미지를 도시한 도면.
도 7 (a) 다중 환자-유래 세포에서 FAP 발현을 나타내는 산점도를 도시한 도면. (b) 다중 세포 및 세포주에 걸쳐 EpCAM 및 FAP를 발현시키는 세포의 %를 나타내는 그래프.
도 8 (a) BiTE 농도가 증가함에 따라 FAP BiTE에 대한 NHDF 용량 반응을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 그래프 (b) 및 (c)는 T 세포 및 EpCAM BiTE 또는 대조군 BiTE와 함께 공동 배양시킨 DLD 세포의 세포독성을 나타내는 LDH 분석 결과를 도시한 도면.
도 9 (a) T 세포 및 EpCAM BiTE 또는 대조군 BiTE와 함께 공동 배양시킨 SKOV 세포의 세포독성을 나타내는 LDF 분석 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면. (b) T 세포 및 EpCAM BiTE 또는 대조군 BiTE와 함께 공동 배양시킨 MCF7 세포의 세포독성을 나타내는 LDH 분석 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 10은 BiTE 농도가 증가함에 따라 EpCAM BiTE에 대한 NHDF 용량 반응을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 11 (A) FAP 또는 동위원소 대조군 항체에 의해 결정되고 유세포 분석에 의해 분석된 CHO 세포에서의 FAP 발현을 나타내는 그래프를 도시한 도면. (B)는 T 세포 및 FAP BiTE 또는 대조군 BiTE와 함께 공동 배양시킨 CHO 또는 CHO-FAP 세포의 세포독성을 나타내는 LDH 분석 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 12는 유세포 분석을 이용하여 분석한 CHO 대 CHO-FAP 세포에 의한 (CD69 및 CD25 발현 수준에 기반한) T 세포 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 13 (a) EpCAM 또는 동위원소 대조군 항체를 이용하는 염색에 의해 결정되고 유세포 분석을 이용하여 분석한 모 세포주 대 안정한 형질감염 변이체의 EpCAM 발현을 나타내는 그래프를 도시한 도면. (b) T 세포 및 EpCAM BiTE 또는 대조군 BiTE와 함께 공동 배양시킨 CHO 또는 CHO-EpCAM 세포의 세포독성을 나타내는 LDH 분석 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 14는 유세포 분석을 이용하여 분석한 CHO 대 CHO-EpCAM 세포에 의한 (CD69 및 CD25 발현 수준에 기반한) T 세포 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 15 (A) 유세포 분석을 이용하여 분석한 (CD69 및 CD25 발현 수준에 기반한) CD4+ 또는 CD8+ T-세포를 활성화시키는 FAP BiTE의 능력을 나타내는 그래프를 도시한 도면. (B) CD4+ 또는 CD8 T 세포 및 FAP BiTE 또는 대조군 BiTE와 함께 공동 배양시킨 NHDF 세포의 세포독성을 나타내는 LDH 분석 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 16 (A) 유세포 분석을 이용하여 분석한 EpCAM 또는 대조군 BiTE의 존재 하에 DLD 세포에 의한 (CD69 및 CD25 발현 수준에 기반한) CD4+ 및 CD8+ T-세포 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면. (B) CD4+ 또는 CD8+ T 세포 및 EpCAM BiTE 또는 대조군 BiTE와 함께 공동 배양시킨 DLD 세포의 세포독성을 나타내는 LDH 분석 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 17 (A) 대조군 또는 FAP BiTE와 함께 배양한 복수로부터의 CD3+ T 세포의 수를 나타내는 그래프를 도시한 도면. (B) 대조군 또는 FAP BiTE와 함께 배양시킨 복수로부터의 T 세포의 CD25 발현 수준을 나타내는 그래프를 도시한 도면. (C) 대조군 또는 FAP BiTE와 함께 배양시킨 복수로부터의 FAP+ 세포의 수를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 18 (A) 본 개시내용의 아데노바이러스의 게놈의 개략적 표현을 도시한 도면. (B) CMV 대 SA 프로모터 유도 발현의 역학을 비교하는 그래프를 도시한 도면.
도 19 (A) NG-601, NG-602, NG-603, NG-604, NG-605, NG-606 및 EnAd에 대해 세포 당 검출된 바이러스 게놈 수의 정량화를 나타내는 그래프를 도시한 도면. (B) A549 세포의 감염에 의해 평가된 NG-601, NG-602, NG-603, NG-604, NG-605, NG-606 또는 EnAd의 종양 용해성 활성을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 20 (a) 유세포 분석을 이용하여 분석한, CHO-FAP와 함께 공동배양시켰을 때 NG-601, NG-602, NG-605 및 NG-606에 의한 (CD69 및 CD25 발현 수준에 기반한) T-세포 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면. (b) 유세포 분석을 이용하여 분석한, CHO-EpCAM과 함께 공동배양시켰을 때 NG-601, NG-602, NG-605 및 NG-606에 의한 (CD69 및 CD25 발현 수준에 기반한) T-세포 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 21은 NG-605 및 NG-606으로부터 생성된 FAP BiTE의 양을 결정하기 위한 실험 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 22는 NG-601 및 NG-602로부터 생성된 EpCAMBiTE의 양을 결정하기 위한 실험 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 23은 NG-607, NG-608, NG-609 및 NG-610으로 감염시킨 Ad293 세포의 현미경 이미지를 도시한 도면.
도 24 (A) XCELLigence를 이용하여 분석한 EnAd로 감염시킨 DLD 세포의 세포독성을 나타내는 그래프를 도시한 도면. (B) XCELLigence를 이용하여 분석한 EnAd로 감염시킨 SKOV 세포의 세포독성을 나타내는 그래프를 도시한 도면. (C) XCELLigence를 이용하여 분석한 EnAd로 감염시킨 NHDF 세포의 세포독성을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 25 (A) XCELLigence를 이용하여 분석한, NHDF 세포를 사멸시키는 NG-603, NG-604, NG-605, NG-606 및 EnAd의 능력을 나타내는 그래프를 도시한 도면. (B) LDH 분석을 이용하여 분석한, NHDF 세포를 사멸시키는 NG-603, NG-604, NG-605, NG-606 및 EnAd의 능력을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 26은 유세포 분석을 이용하여 분석한 NHDF 세포, SKOV 및 T 세포와 함께 공동 배양시킨 NG-603, NG-604, NG-605, NG-606에 의한 (CD69 및 CD25 발현 수준에 기반한) T-세포 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 27 (A) 유세포 분석을 이용하여 분석한 NHDF와 SKOV 세포 대 SKOV 단독과 함께 공동 배양시킨 NG-603, NG-604, NG-605, NG-606에 의한 (CD69 및 CD25 발현 수준에 기반한) T-세포 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면. (B) LDH 분석을 이용하여 분석한 NG-605 및 NG-606으로 감염시킨 NHDF 세포의 세포독성을 나타내는 그래프를 도시한 도면
도 28은 재조합 FAP BiTE, EnAd, NG-603 또는 NG-605에 의한 NHDF 세포 용해의 타임랩스(timelapse) 비디오로부터의 프레임 이미지를 도시한 도면.
도 29는 NG-607, NG-608, NG-609 또는 NG-610에 의한 NHDF 세포 용해의 타임랩스 비디오로부터의 프레임 이미지를 도시한 도면.
도 30은 XCELLigence를 이용하여 분석한 T 세포의 존재 또는 T 세포의 부재 하에 EnAd, NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604로 감염시킨 DLD 세포의 세포독성을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 31은 XCELLigence를 이용하여 분석한 T 세포의 존재 또는 T 세포의 부재 하에 EnAd, NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604로 감염시킨 LDH 분석의 세포독성을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 32는 유세포 분석에 의해 분석한 EnAd, NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604에 의한 (CD69 및 CD25 발현 수준에 기반한) T-세포 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 33은 xCELLigence를 이용하여 평가한 CD3+ T-세포의 존재 또는 부재 하에 감염 다중도(multiplicity of infection: MOI)를 달리한 DLD 종양 세포를 사멸시키는 NG-601의 능력을 결정하기 위한 실험 결과를 도시한 도면.
도 34는 xCELLigence를 이용하여 평가한 CD3+ T-세포의 존재 또는 부재 하에 SKOV 종양 세포를 사멸시키는 EnAd 및 NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604의 능력을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 35는 LDH 분석을 이용하여 평가한 CD3+ T-세포의 존재 또는 부재 하에 SKOV 종양 세포를 사멸시키는 EnAd 및 NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604의 능력을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 36은 유세포 분석을 이용하여 분석한, SKOV 종양 세포와 함께 공동배양시킨 EnAd, NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604에 의한 (CD69 및 CD25 발현 수준에 기반한) T-세포 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 37은 유세포 분석을 이용하여 분석한, 복수 세포와 함께 공동배양시킨 EnAd, NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604에 의한 (CD69 및 CD25 발현 수준에 기반한) T-세포 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 38은 또한 EpCAM BiTE, EnAd, NG-601 또는 NG-603에 의한 NHDF 세포 용해의 타임랩스 비디오로부터의 프레임 이미지를 도시한 도면.
도 39는 본 개시내용의 바이러스로 감염시키고 감염 및 후기 단계 바이러스 유전자 발현을 결정하기 위한 리포터로서 EnAd-CMV-GFP 및 EnAd-SA-GFP로 염색한, 환자로부터 얻은 복수 세포의 현미경 이미지를 도시한 도면.
도 40 (A) 본 개시내용의 바이러스로 감염된 복수 샘플에서 CD3+ T 세포에 대한 CD25의 발현 수준을 나타내는 그래프를 도시한 도면. (B) 본 개시내용의 바이러스로 감염된 복수 샘플에서 FAP+ 세포의 수를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 41은 본 개시내용의 바이러스로 감염시키고 감염 및 후기 단계 바이러스 유전자 발현을 결정하기 위한 리포터로서 EnAd-CMV-GFP 및 EnAd-SA-GFP로 염색한, 암환자로부터 얻은 복수 세포의 현미경 이미지를 도시한 도면.
도 42는 암환자로부터 얻고 본 개시내용의 바이러스로 감염된 복수 샘플에서 CD3+ T 세포의 수를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 43은 암환자로부터 얻고 본 개시내용의 바이러스로 감염된 복수 샘플에서 CD3+ T 세포 상에서 CD25 발현 수준을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 44는 암환자로부터 얻고 본 개시내용의 바이러스로 감염된 복수 샘플에서 FAP+ 세포의 수를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 45는 PBMC-유래 T 세포에 대한 EpCAM BiTE 및 그의 효과의 특성규명을 도시한 도면
(a) EpCAM-표적화된 BiTE 및 비-특이적 대조군 BiTE 구조의 개략도. VL 및 VH 도메인은 가요성 및 용해도를 위해 세린 및 글라이신이 풍부한 가요성 펩타이드 링커(L)와 연결된다. Ig SP, 경쇄 면역글로불린 신호 펩타이드; 10His, 데카히스티딘 친화도 태그. (B) 활성화 마커 CD69의 유도 및 (C) BiTE-함유 상청액의 존재 하에서 단독으로 또는 DLD 세포(5:1)와 함께 배양시킨 CD3-정제된 PBMC에 대한 CD25. CD69 및 CD25를 공동 배양 24시간 후에 유세포 분석에 의해 측정하였다. 유의도를 IgG 아이소타입에 대해 평가하였다 (D) DLD 세포(5:1) 및 BiTE-함유 상청액과 함께 공동 배양물에서 6시간 후에 IFNγ-양성 T-세포의 백분율. (E) DLD 세포(5:1) 및 BiTE-함유 상청액과 함께 공동 배양물에서 CFSE-염색한 T-세포의 증식에 유입된 모 T 세포 집단의 분할 지수 및 백분율로 나타낸 증식. 공동 배양 5일 후에 형광을 유세포 분석으로 측정하였다. FlowJo 증식 도구를 이용하여 분할 지표를 모델링하였다. (f) DLD 세포(5:1) 및 BiTE-함유 상청액과 함께 공동 배양물에서 CD107a 외부화에 의해 측정한 T-세포의 탈과립화. 6시간 동안 CD107a-특이적 항체와 함께 공동 배양 다음에 유세포 분석으로 외부화를 평가하였다. (g) 48 h 동안 BiTE-함유 상청액의 존재 하에서 DLD 세포(5:1)와 함께 T-세포의 공동 배양물로부터의 상청액을 이용하여 LEGENDplex 인간 Th 사이토카인 패널에 의해 사이토카인 수준을 측정하였다. 각각의 조건을 생물학적으로 3회 중복하여 측정하고, 데이터를 평균 ± SD로서 나타내었다. 달리 언급되지 않는 한 터키 사후 검정 분석과 함께 일원 ANOVA을 이용하여 비처리에 대해 유의도를 평가하였다, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 46은 재조합 EpCAM BiTE의 특성규명을 도시한 도면
(A) 형질감염된 HEK293A 세포에 의해 생성된 EpCAM BiTE의 양을 추정하기 위한 점적 검사. (B) 대조군 또는 재조합 EpCAM 또는 비특이적 BiTE에 의한 EpCAM 결합 수준을 측정하는 ELISA. 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA 검정을 이용하여 빈 벡터 대조군 샘플에 대한 비교에 의해 유의도를 평가하였다, ***p<0.001
도 47은 EpCAM BiTE-매개 T 세포의 세포독성의 항원-특이성 평가를 도시한 도면
(A) 공동 배양 24시간 후에 FACS 분석에 의해 측정한 CHO 또는 CHO-EpCAM 세포(5:1) 및 BiTE-함유 상청액과의 함께 공동 배양물에서 CD3+ T 세포에 대한 활성화 마커 CD25의 유도. (B) BiTE-함유 상청액 단독과 함께 또는 T-세포와의 공동 배양물에서 배양시킨 CHO 또는 CHO-EpCAM 세포의 세포독성. 24시간의 인큐베이션 후에 배양 상청액 내로 LDH의 방출에 의해 세포독성을 평가하였다. (C) T-세포(1:5) 및 BiTE-함유 상청액과의 공동 배양물에서 24시간 후에 다중 EpCAM-양성 암종의 세포독성. 24시간의 공동 배양 후에 MTS 분석에 의해 생존도를 측정하였다. (D) 아이소타입 대조군 항체를 이용함으로써 측정한 배경 형광에 비해 (C)에서 EpCAM-양성 세포주의 FACS 분석에 의해 평가한 EpCAM 발현의 수준(N=1). (AC) 각각의 조건을 생물학적으로 3회 중복하여 측정하고, 평균 ± SD로서 나타내었다. 터키 사후 검정 분석과 함께 일원 ANOVA을 이용하여 비처리 또는 T-세포 단독 대조군에 대해 유의도를 평가하였다, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 48은 SKOV3 세포에서 EnAd-발현 EpCAM BiTE의 세포독성을 도시한 도면
SKOV3 세포를 T 세포의 부재(A) 또는 존재(B)에서 EnAd 또는 재조합 바이러스와 함께 인큐베이션시키고, 구체화된 시점에 LDH 방출에 의해 세포독성을 측정하였다. 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA 검정을 이용하여 비감염 대조군 웰에 대한 비교에 의해 유의도를 평가하였다, ***p<0.001
도 49는 BiTE-매개 세포독성을 초래하는 T 세포의 동정을 도시한 도면
(a) DLD 세포(5:1) 및 BiTE-함유 상청액과 함께 CD3 T-세포의 공동 배양 24시간 후 CD4 및 CD8 세포의 BiTE-매개 T-세포 활성화. CD69 및 CD25의 표면 발현에 의해 활성화를 평가하고, 유세포 분석에 의해 측정하였다. (B) DLD 세포와의 공동 배양시키고, BiTE-함유 상청액과 함께 인큐베이션시킨 CFSE-염색 CD4 및 CD8 T-세포의 증식 반응. 5일 인큐베이션 후에 FACS에 의해 형광을 측정하였다. (C) BiTE-함유 상청액과 함께 6시간 공동 배양 후 CD4 및 CD8 세포의 탈과립화. CD107a-특이적 항체를 공동 배양의 지속 기간 동안 배양 배지에 첨가하고 나서, 유세포 분석에 의해 탈과립화를 평가한다. (d) CD4 또는 CD8 T-세포 서브세트 중 하나에 의한 세포독성을 상청액 내로 LDH 방출 다음에, CD4- 또는 CD8-정제된 T-세포(1:5) 및 BiTE 함유 상청액과 함께 DLD 세포의 24시간 인큐베이션에 의해 평가한다. 각각의 조건을 생물학적으로 3회 중복하여 측정하고, 평균 ± SD로서 나타내었다. 달리 언급되지 않는 한, EpCAM BiTE 처리를 대조군 BiTE에 비교하였고, 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA 검정을 이용하여 유의도를 평가하였다, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 50은 DLD 세포에서 EnAd-발현 EpCAM BiTE에 의한 세포독성 및 T 세포 활성화를 도시한 도면
T-세포의 부재(A) 또는 존재(B) 하에 감염된 DLD 세포에 대한 세포독성. DLD 세포를 감염시키고, T-세포와 함께 공동 배양시키고 나서, 세포독성을 구체화된 시점에 LDH 방출에 의해 측정하였다. (C 내지 D) (B)로부터의 T-세포를 채취하고 나서, 활성화 마커 CD69(C) 또는 CD25(D)에 대해 염색하고, 유세포 분석을 통해 분석하였다. (E 내지 F) 재조합 바이러스로 감염시킨 DLD 세포로부터 생성된 EpCAM BiTE의 정량화. CD3+ 세포 및 다르게 알려진 양의 재조합 EpCAM BiTE(E)와의 공동 배양물에서 DLD의 LDH 방출(Ab)의 표준 곡선. 동시에, 공동 배양물을 3일 감염시킨 DLD 세포로부터의 희석된 상청액(10,000배)과 함께 인큐베이션시켰다(F). 표준 곡선은 각각 EnAd-CMV-EpCAMBiTE 및 EnAd-SA-EpCAMBiTE에 대해 백만개의 DLD 세포 당 165㎍ 내지 50㎍에서 생성된 EpCAM BiTE의 대략의 결정을 허용하였다. 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA 검정을 이용하여 비감염 대조군 웰에 대한 비교에 의해 유의도를 평가하였다, ***p<0.001
도 51은 세포주 및 PBMC 유래 T 세포를 이용하는 종양 용해성 바이러스 EnAd 발현 EpCAM BiTE의 특성규명을 도시한 도면
(A) DLD 세포를 모 EnAd 또는 재조합 바이러스(100vp/세포)로 감염시키고, 웰을 24 또는 72 h에 채취하였다. 바이러스 헥손에 대해 qPCR을 이용하여 게놈을 측정함으로써 복제를 평가하였다. (B) 증가된 농도의 바이러스에서 EnAd 또는 재조합 바이러스로 감염시킨 DLD 세포의 세포독성. 5일 감염 후에 MTS 분석에 의해 세포독성을 측정하였다. (c) 제3일 비감염 또는 바이러스-감염 HEK293A 세포로부터의 상청액을 면역블롯 분석에 의한 이식유전자 발현을 위해 평가하고 나서, 항-His 항체로 프로빙하였다. (d) CHO 또는 CHO-EpCAM(E:T 5:1)과 함께 배양시킨 CD3-양성 T-세포의 활성화 마커 CD25의 유도, (D)로부터의 HEK293A 상청액을 희석시켰다. 유세포 분석에 의해 CD25의 표면 발현에 의해 활성화를 측정하였다. (e) (D)로부터의 HEK293A 상청액을 단독으로 또는 CD3-정제된 PBMC와의 공동 배양물로(E:T 5:1) 인큐베이션시킨 CHO 또는 CHO-EpCAM 세포의 세포독성. HEK293A 상청액을 300배 희석시켰다. 24시간 인큐베이션 후 상청액 내로 방출된 LDH에 의해 세포독성을 평가하였다. 각각의 조건을 생물학적으로 3회 중복하여 측정하고, 평균 ± SD로서 나타내었다. 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA 검정을 이용하여 유의도를 평가하였고, 각각의 조건을 비처리와 비교하였다, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 52는 악성종양 삼출물의 세포 조성을 도시한 도면
(a) 유세포 분석에 의해 평가한 바와 같은 복수 및 삼출액의 그들의 세포 조성에 대한 선별을 보여주는 대표적인 영상(흉수 샘플, 도 57로부터의 환자 3). (b) 각각의 세포 유형의 절대 수(10,000개의 세포 샘플 크기에서)를 표에 기록한다.
도 53은 부분적으로 EnAd-내성 암 세포주에서 EnAd 발현 EpCAM BiTE의 우수한 효능을 도시한 도면
(A 내지 B) SKOV3 세포의 생존도를 xCELLigence-기반 세포독성 분석에 의해 160시간에 걸쳐 실시간으로 모니터링하였다. SKOV3 세포를 파종시키고 나서, 0시간에 EnAd 또는 BiTE-아암 EnAd 바이러스로 감염시키고, 비감염 세포는 음성 대조군으로서 작용하였다. (B)에서 CD3-정제된 PBMC(5:1)를 감염 2시간 후에 첨가하고 나서, 15분 간격으로 임피던스를 측정하였다. (C 내지 D) CD3-정제된 PBMC를 모 EnAd 또는 재조합 아암 바이러스로 감염시킨 SKOV3 세포(5:1)와 함께 배양시켰다. 각각의 시점에, T 세포를 채취하고 나서, 유세포 분석에 의해 CD69 (C) 또는 CD25(D)의 표면 발현에 대해 분석하였다. (e) EnAd, EnAd-CMVEpCAMBiTE로 감염시키거나 또는 비감염된 SKOV3 암종 세포(비염색), NHDF 섬유아세포(적색) 및 CD3-정제된 PBMC(청색)의 공동 배양물을 나타내는 타임 랩스 서열. 셀이벤트 카스파제(CellEvent Caspase) 3/7 검출 시약(녹색)을 이용하여 세포자멸사를 시각화하였다. 96시간의 기간에 걸쳐 15분 간격으로 니콘(Nikon) TE 2000-E 이클립스(Eclipse) 도립 현미경으로 영상을 촬영하였다. 나타낸 시간으로 대표적인 영상을 기록하였다; 본래의 배율 ×10; 스케일 바 100㎛. (A 내지 D) 각각의 조건을 생물학적으로 3회 중복하여 측정하고, 평균 ± SD로서 나타내었다. 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA 검정을 이용하여 비감염 대조군과의 비교에 의해 유의도를 평가하였다, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 54는 PD1의 발현 및 BiTE-매개 T 세포 활성화에 대한 PD1 항체의 효과를 도시한 도면
(A) 흉수로부터의 내인성 T 세포의 초기 단리 후 내인성 T 세포에 의한 PD1의 발현을 유세포 분석에 의해 평가하였다. (B 내지 D) 유리 BiTE, EnAd 또는 재조합 바이러스의 존재 하에 동일한 흉막 삼출액으로부터의 100% 유체에서 흉수로부터의(3명의 상이한 환자로부터의) 비정제된 총 세포를 인큐베이션시켰다. 5일 후에, 총 세포 집단을 채취하고 나서, (B) CD3+ T 세포 및 (C) CD25+의 수를 정량화하였다. (D) 유세포 분석을 이용하여 EpCAM+ 세포의 수를 측정하였다. 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA 검정을 이용하여 비처리 대조군 웰에 대한 비교에 의해 유의도를 평가하였다, ***p<0.001
도 55는 EnAd 발현 EpCAM BiTE가 화학요법-전처리 환자로부터 1차 인간 종양 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다는 것을 도시한 도면
3명 환자의 복수로부터 처음 단리시키고 생체외에서 확장시키고, 이어서, 재조합 BiTE와 함께 인큐베이션시키거나, 또는 EnAd 또는 재조합 바이러스로 감염시킨 (A) EpCAM+ 세포 또는 (B) FAP+ 섬유아세포의 세포독성. 5일 후에 유세포분석에 의해 세포독성을 측정하였다. (c) (A+B)로부터의 복수 유래 EpCAM+ 및 FAP+ 세포와 함께 배양시킨 CD3-양성 T-세포 상의 활성화 마커 CD25의 유도. 각각의 조건을 생물학적으로 3회 중복하여 측정하고, 평균 ± SD로서 나타내었다. 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA 검정을 이용하여 비처리와의 비교에 의해 유의도를 평가하였다, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 56은 EpCAM BiTE는 복수액의 면역 억제 효과를 극복하고 내인성 T 세포를 활성화시킬 수 있다는 것을 도시한 도면
(a 내지 b) PBMC-유래 T 세포를 RPMI 배양물 배지 내 항-CD3 항체 또는 5명의 난소암 환자로부터의 100% 복막 복수액의 존재와 함께 인큐베이션시켰다. (a) 24시간에, T 세포 활성화 마커 CD69 및 CD25의 유도를 분석하고, 그리고 (b) 유세포 분석을 이용하여 CD107a 외부화에 의해 측정한 T 세포의 탈과립화. (c) MCF7 세포의 생존도를 xCELLigence-기반 세포독성 분석에 의해 60시간에 걸쳐 실시간으로 모니터링하였다. MCF7 세포를 파종하고 나서, RPMI 배지 또는 100% 복수액 #1 또는 #2의 존재 하에 25시간에 대조군 또는 EpCAM BiTE와 함께 인큐베이션시켰다. 비처리 세포는 음성 대조군으로서 작용하였다. CD3-정제된 PBMC(5:1)를 동시에 첨가하고 나서, 15분 간격으로 임피던스를 측정하였다. (d) 복막 복수로부터의 내인성 비정제 총 세포를 유리 EpCAM 또는 대조군 BiTE의 존재 하에 100% 복수액에서 인큐베이션시켰다. 24시간 후에, 총 세포 집단을 채취하고 나서, CD3+/CD69+ 및 CD3+/CD25+ 세포의 수를 유세포 분석에 의해 측정하였다. 각각의 조건을 생물학적으로 3회 중복하여 측정하고, 평균 ± SD로서 나타내었다. 터키 사후검정과 함께 일원 ANOVA를 이용하여 RPMI (A+B), 비처리 (D) 또는 대조군 BiTE (E)와의 비교에 의해 유의도를 평가하였다, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 57은 EnAd 발현 EpCAM BiTE는 악성 흉막 삼출액 내에서 내인성 종양 세포를 사멸시키도록 내인성 T 세포를 활성화시킬 수 있다는 것을 도시한 도면
유리 BiTE, EnAd 또는 재조합 바이러스의 존재 하에 동일한 흉막 삼출액으로부터의 100% 유체에서 흉수로부터의(4명의 상이한 환자로부터의) 비정제된 총 세포를 인큐베이션시켰다. 5일 후에, 총 세포 집단을 채취하고 나서, (A) CD3+ T 세포 및 (B) CD25+의 수를 정량화하였다. (c) 유세포 분석을 이용하여 EpCAM+ 세포의 수를 측정하였다. (d) EnAd 또는 EnAd-CMVEpCAM BiTE로 처리 후 환자 3의 흉수 세포(암 세포 및 림프구)의 대표적인 영상(배율 ×10; 스케일 바 100㎛) 및 유세포 분석. (e) 제5일에, 유리 재조합 BiTE와 함께 인큐베이션 또는 EnAd 또는 재조합 바이러스를 이용하는 감염 후에 흉수 배양물을 이용하여 LEGENDplex 인간 Th 사이토카인 패널에 의해 사이토카인 수준을 측정하였다. 각각의 조건을 생물학적으로 3회 중복하여 측정하고, 평균 ± SD로서 나타내었다. 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA 검정을 이용하여 비처리 대조군 샘프과의 비교에 의해 유의도를 평가하였다, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 58은 인간 IL-10 ELISA MAX 키트(바이오레전드(Biolegend), 430604)를 이용하여 정상 혈청(NS) 또는 환자 악성 삼출액(A: 복막 복수, P: 흉수)에서 측정한 IL-10의 양을 도시한 도면.
도 59는 유세포 분석에 의해 측정한 환자 유체 대 정상 혈청에서 (CD69/CD25 수준에 기반한) CD3/28 비드-매개 PBMC T-세포 활성화를 도시한 도면. A: 환자 삼출액, P: 흉수.
도 60은 환자 유체에서 (CD107a 발현에 기반한) CD3/28 비드-매개 PBMC T-세포 탈과립화를 도시한 도면. A: 복수, P: 흉수.
도 61은 환자 유체 및 CD3/CD28 비드-매개 T-세포 탈과립화에서 IL-10 수준 사이의 상관관계를 도시한 도면.
도 62는 환자 유체에서 (CD69/CD25 발현에 기반한) EpCAM BiTE 비드-매개 PBMC T-세포 활성화를 도시한 도면. A: 복수, P: 흉수.
도 63은 환자 유체에서 (CD107a 발현에 기반한) EpCAM BiTE 비드-매개 PBMC T-세포 탈과립화를 도시한 도면. A: 복수, P: 흉수.
도 64는 환자 유체에서 SKOV3의 EpCAM BiTE 비드-매개 세포독성을 도시한 도면. A: 복수, P: 흉수.
도 65는 RPMI 배지 대 복수액에서 (CD25/CD69 발현에 기반한) EpCAM BiTE-매개 T-세포 활성화를 도시한 도면.
도 66은 RPMI 배지 대 복수액에서 T 세포-매개 표적 세포 용해를 유도하는 EnAd-SA-EpCAMBiTE 및 EnAd-SA-대조군BiTE의 능력을 도시한 도면. ((a) CD3+의 수. (b) T-세포의 CD25 발현. (c) 유세포 분석에 의해 결정되는 EpCAM+ 세포의 수.
도 67은 복수액(7명 환자 샘플)에서 T 세포-매개 표적 세포 용해를 유도하는 EnAd-SA-EpCAMBiTE 및 EnAd-SA-대조군BiTE의 능력을 도시한 도면.
(a) CD3+의 수. (b) T-세포의 CD25 발현. (c) 유세포 분석에 의해 결정되는 EpCAM+ 세포의 수. 범례에 대해 도 67a를 참조.
도 68은 인간 섬유아세포의 존재 하에 재조합 FAP BiTE 단백질에 의한 그리고 항-CD3/CD28 비드를 이용하는 다클론성 활성화에 의한 T-세포 사이토카인 생성의 활성화 비교를 도시한 도면. (A) ELISA로 측정한 IFNγ수준. (B) 사이토카인 비드 어레이로 사이토카인 수준을 측정하였다.
도 69는 FAP-표적화된 BiTE가 T-세포 탈과립화 및 FAP+ 세포의 특이적 세포독성을 유도한다는 것을 도시한 도면
(A) NHDF 세포가 있는 배양물에서(5:1) T-세포의 탈과립화 및 (B) BiTE-함유 상청액. CD107a-특이적 항체가 있는 배양물에서 6시간 후 CD107a의 외부화에 의해 탈과립화를 평가하고 나서, 유세포 분석에 의해 측정하였다. CD3/CD28 다이나비드(Dynabead)를 양성 대조군으로서 사용하였다. (C) BiTE-함유 상청액의 T-세포(1:5) 및 10-배 연속 희석물과의 공동 배양물에서 24시간 후 NHDF 세포의 세포독성. 배양물 상청액 내로 LDH의 방출에 의해 세포독성을 평가하였다. (D) 6명의 건강한 공여자로부터의 PBMC-유래 T-세포(1:5) 및 BiTE-함유 상청액과 함께 24시간 공동 배양 후 LDH 방출(좌) 및 T-세포 상에서 CD25 유도(우)에 의한 NHDF의 용해를 평가하였다.
도 70은 EnAd 발현 FAP BiTE는 FAP + 섬유아세포를 선택적으로 사멸시키고, 복막 복수 샘플에서 TGFb를 감소시킨다는 것을 도시한 도면
(A,B) PBMC-유래 T-세포 및 EnAd 또는 재조합 바이러스와 함께 72시간 배양 후 FAP+ 섬유아세포 (A) 및 EpCAM+ 종양 세포 (B)의 수. 복수 세포를 3명의 환자 복수로부터 처음 단리시키고 생체외에서 확장시켰다. 감염 후 72시간에 유세포 분석에 의해 세포수를 측정하였다. (C) (A)로부터의 PBMC-유래 CD3 세포 상에서 활성화 마커 CD25의 유도를 감염 후 72시간에 측정하였다. (D) (A)로부터 채취한 상청액을 이용하여 ELISA에 의해 TGFb 수준을 측정하였다.
도 71은 FAP BiTE 단백질 및 EnAd-FAPBiTE 바이러스에 의한 환자 악성종양 복수 생검 샘플에서 내인성 종양 관련 T-세포의 활성화 및 FAP+ 세포의 관련된 사멸을 도시한 도면. (A) CD25 발현에 의해 측정한 T 세포 활성화. (B) 유세포 분석에 의해 측정한 FAP+ 세포의 잔여 수.
도 72는 환자 샘플에서 BiTE-매개 T 세포 활성화에 대한 PD-L1 차단 항체의 효과를 도시한 도면
(A) 복막 복수로부터 내인성 T 세포에 의한 PD1 및 FAP+ 세포 상의 PD-L1의 초기 단리 후 이들의 발현을 유세포 분석에 의해 평가하였다. (B) 복막 복수로부터의 비정제 총 세포를 항-PD-L1 차단 항체와 함께 또는 차단 항체 없이, 유리 BiTE, EnAd 또는 재조합 바이러스의 존재 하에 동일한 삼출물로부터 50% 유체 중에서 인큐베이션시켰다. 2일 후에, 총 세포 집단을 채취하고 나서, CD25+ T-세포의 수를 유세포 분석에 의해 정량화하였다. (C) ELISA에 의해 측정한 (B, d)로부터의 배양물 상청액 중의 인터페론 감마의 양. (d) (B)에서 잔여 FAP+ 세포의 수를 유세포 분석을 이용하여 측정하였다.
도 73은 EnAd 발현 BiTE는 NHDF 섬유아세포를 용해시키기 위해 환자 생검 샘플로부터 T-세포를 활성화시키고 전향시킨다는 것을 도시한 도면
(A) 건강한 공여자 또는 악성 종양 삼출물 암 생검 샘플로부터 단리 후 내인성 T 세포에 의한 PD-1의 발현. PD-1 발현을 유세포 분석에 의해 측정하였다. (B) 유세포 분석에 의해 측정한 바와 같은 PBMC 및 암 생검 샘플의 비정제 세포 집단 내에서 CD3+ 세포의 비율. (C) 처리 후 120시간에 (B)로부터 채취한 배양물 상청액 중에서 ELISA에 의해 측정한 인터페론 감마의 수준. (D) PBMC 또는 총 암 생검 세포(1:5) 및 BiTE-함유 상청액과의 공동 배양물에서 xCELLigence 세포독성 분석에 의해 130시간에 걸쳐 실시간으로 NHDF 섬유아세포의 생존도를 모니터링하였다.
도 74는 PBMC T-세포의 FAP BiTE- 및 항-CD3/CD28 비드-매개 활성화에 대한 면역억제 복수액 샘플의 효과를 도시한 도면. (A) 항-CD3/Cd28 다이나비드를 이용하여 활성화시킨 PBMC T 세포. (B) NHDF 세포의 존재 하에서 대조군 또는 FAP BITE로 활성화시킨 PBMC T 세포. NS: 정상 혈청, A: 복막 복수.
도 75는 FAP BiTE 발현 EnAd는 환자 복수 중의 CD11b + 대식세포를 더 염증성의 표현형으로 분극화한다는 것을 도시한 도면
(A) 복수 샘플로부터의 비정제 총 세포를 유리 BiTE 또는 BiTE 발현 바이러스의 존재 하에 50% 복수액에서 인큐베이션시켰다. 인터페론 감마 처리를 양성 대조군으로서 사용하였다. 3일 후에, 총 세포 집단을 채취하고 나서, CD3+ 세포 상에서 활성화 마커 CD25의 유도를 유세포 분석에 의해 측정하였다. (B) (A)로부터의 배양물 상청액 중의 인터페론 감마 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. (c) 제3일에, (A)로부터의 CD11b+ 세포 상에서 CD68, CD86, CD206 및 CD163의 발현 수준을 유세포 분석에 의해 측정하였다. 3회 중ㅂ복으로부터의 대표적인 유세포 분석 스펙트럼을 완전한 데이터 세트와 함께 나타낸다.
도 76은 고형 전립선 종양의 구조 및 세포 조성의 특성규명을 도시한 도면
(A) EpCAM 염색, (B) CD8 염색, (C) FAP 염색. (D) BiTE 발현 바이러스에 의한 처리 후 전립선 종양 슬라이스 내에서 CD25 유도의 대표적인 조직 화학 영상. 레이카(Leica) 미세절단기를 이용하여 종양 코어를 300 uM 두께로 슬라이싱하고, 배양시키고 나서, 삽입물에서 감염시키고, 7일 처리 후에 채취하였다. (E) ELISA로 측정한 조직 슬라이스 배양물 배지 내 IFNg 수준. 구체화된 시점에 악성 및 양성 조직의 슬라이스 배양물로부터 상청액을 채취하였다. (F) ELISA에 의해 측정한 악성 및 양성 조직의 조직 배양물 배지 내 IL-2 수준.
도 77A 내지 도 77C는 실시예 33에서 사용한 이식유전자 카세트의 개략적 표현을 도시한 도면.
도 77d는 NG-611, NG-612 및 NG-617 처리 종양 세포에서 세포 당 검출된 바이러스 게놈 수를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 78은 NG-612, 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군 상청액에 비해 NG-611 바이러스 입자로 처리 후 24, 48 또는 72시간에 A549 세포로부터 채취한 상청액 및 EpCam 발현 SKOV 세포와 함께 공동 배양시킨 후 T 세포 발현 CD69 (a), CD25(b) HLA-DR (c), CD40L (d) 또는 세포 표면 CD107a (e)의 백분율을 도시한 도면.
도 79는 NG-611, 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군 상청액에 비해 NG-612 바이러스로 처리 후 24, 48 또는 72시간에 A549 세포로부터 채취한 상청액 및 FAP 발현 MRC-5 세포와 함께 공동 배양시킨 후 T 세포 발현 CD69 (a), CD25(b) HLA-DR (c), CD40L (d) 또는 세포 표면 CD107a (e)의 백분율을 도시한 도면.
도 80은 EpCAM 및 FAP를 발현시키는 MRC-5 세포의 백분율을 도시한 도면.
도 81은 NG-611, NG-612 또는 에나데노툭시레브 바이러스 입자, 또는 비처리 대조군 상청액으로 처리 후 24, 48 또는 72시간에 A549 세포로부터 채취한 상청액과 함께 인큐베이션시킨 SKOV 세포 (A) 또는 MRC-5 세포(B)와 함께 T 세포 공동 배양물의 상청액에서 IFNγ발현을 도시한 도면.
도 82는 생체내 BiTE 발현 바이러스의 항-종양 효능 및 면역 활성화를 도시한 도면. (a) 식염수, 에나데노툭시레브 또는 NG-611로 처리한 마우스에서의 종양 용적. (b) 에나데노툭시레브 처리 또는 비처리 대조군에 비해 NG-611 처리 종양에서 CD8 대 CD4 T 세포의 비.
도 83은 이식유전자 카세트의 개략적 표현을 도시한 도면. (a) NG-615, (b) NG-640, (c) NG-641.
도 84는 NG-612 및 NG-615 처리 종양 세포에서 세포 당 검출된 바이러스 게놈 수를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 85는 NG-615의 세포 상청액 대 에나데노툭시레브 및 비처리 대조군 종양 세포의 상청액에서 IFNα, MIP1α 및 Flt3 L의 발현을 도시한 도면.
도 86은 NG-612, 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군 상청액에 비해 NG-615 바이러스 입자로 처리 후24, 48 또는 72시간에 A549 세포로부터 채취한 상청액 및 FAP 발현 MRC-5 세포와 함께 공동 배양시킨 후 T 세포 발현 CD69 (a), CD25(b) HLA-DR (c), CD40L (d) 또는 세포 표면 CD107a (e)의 수를 도시한 도면.
도 87은 NG-612, NG-615 또는 에나데노툭시레브 바이러스 입자, 또는 비처리 대조군 상청액으로 처리 후 24, 48 또는 72시간에 A549 세포로부터 채취한 상청액과 함께 인큐베이션시킨 MRC-5와 T 세포 공동 배양물의 상청액에서 IFNγ발현을 도시한 도면.
도 88은 NG-618 이식유전자 카세트의 개략적 표현을 도시한 도면
도 89는 NG-611, NG-612, NG-615 또는 에나데노툭시레브 바이러스 입자로 처리 후 72시간에 A549 세포로부터 채취한 상청액과 함께 인큐베이션 후 MRC-5 세포 상의 표면 FAP 발현(a) 또는 SKOV 세포 상의 EpCam 발현(b)의 검출을 도시한 도면.
도 90은 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군에 비해 NG-618 바이러스 입자로 처리 후 72시간에 A549 세포로부터 채취한 상청액 및 FAP 발현 MRC-5 세포와 공동 배양시킨 후 T 세포 발현 CD24 (a), CD40L (b) 또는 세포 표면 CD107a (c)의 백분율을 도시한 도면.
도 91은 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군에 비해 NG-618 바이러스 입자로 처리 후 72시간에 A549 세포로부터 채취한 상청액 및 EpCam 발현 SKOV 세포와 공동 배양시킨 후 T 세포 발현 CD24 (a), CD40L (b) 또는 세포 표면 CD107a (c)의 백분율을 도시한 도면.
도 92는 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군에 비해 NG-618 바이러스 입자로 처리 후 72시간에 A549 세포로부터 채취한 상청액 및 T 세포와 함께 공동 배양시킨 후 사멸된 MRC-5(a) 또는 SKOV (b) 세포의 백분율을 도시한 도면.
서열
서열번호 1 N-말단의 신호 서열 및 C-말단의 데카-His 친화도 태그를 갖는 항-EpCAM BiTE DNA 암호 서열
서열번호 2 N-말단의 신호 서열 및 C-말단의 데카-His 친화도 태그를 갖는 항-EpCAM BiTE 단백질 서열
서열번호 3 N-말단의 신호 서열 및 C-말단의 데카-His 친화도 태그를 갖는 항-FAP BiTE DNA 암호 서열
서열번호 4 N-말단의 신호 서열 및 C-말단의 데카-His 친화도 태그를 갖는 항-FAP BiTE 아미노산 서열
서열번호 5: N-말단의 신호 서열 및 C-말단의 데카-His 친화도 태그를 갖는 대조군(항-FHA) BiTE DNA 암호 서열
서열번호 6: N-말단의 신호 서열 및 C-말단의 데카-His 친화도 태그를 갖는 대조군(항-FHA) BiTE 아미노산 서열
서열번호 7: 항-CD3 ScFv 아미노산 서열
서열번호 8: 항-CD3 VH
서열번호 9: 항-CD3 VL
서열번호 10: 항-CD3 ScFv 링커 서열
서열번호 11: 항-FAP ScFv
서열번호 12: 항-FAP VL 도메인
서열번호 13: 항-FAP VH 도메인
서열번호 14: 항-FAP 및 항-EpCAM 링커 서열
서열번호 15: BiTE 리더 서열
서열번호 16: 항-EpCAM ScFv
서열번호 17: 항-EpCAM VL
서열번호 18: 항-EpCAM VH
서열번호 19: 대조군 BiTE(항-FHA)
서열번호 20: 대조군 (항-FHA) ScFv
서열번호 21: 대조군 (항-FHA) VL
서열번호 22: 대조군 (항-FHA) VH
서열번호 23: 대조군 (항-FHA) ScFv 링커 서열
서열번호 24: 데카-His 태그 서열
서열번호 25: FAP BiTE-P2A-RFP(이탤릭체 = 리더, 볼드체 = 퓨린 절단 부위, 밑줄 = P2A 서열, 소문자 = RFP)
서열번호 26: 대조군 (항-FHA) BiTE-P2A-RFP(이탤릭체 = 리더, 볼드체 = 퓨린 절단 부위, 밑줄 = P2A 서열, 소문자 = RFP)
서열번호 27: 인간 EpCAM DNA 암호 서열
서열번호 28: 인간 EpCAM 아미노산 서열
서열번호 29: 인간 FAP DNA 암호 서열
서열번호 30: 인간 FAP 아미노산 서열
서열번호 31: CMV 프로모터 서열
서열번호 32: SV40 후기 폴리아데닐화 서열
서열번호 33: 널(Null) 서열
서열번호 34: NG-601 (EnAd-CMV-EpCAMBiTE)
서열번호 35: NG-602(EnAd-SA-EpCAMBiTE)
서열번호 36: NG-605(EnAd-CMV-FAPBiTE)
서열번호 37: NG-606 (EnAd-SA-FAPBiTE)
서열번호 38 EnAd 게놈
서열번호 39 EnAd 게놈의 bp 28166 내지 28366에 대응하고 이를 포함하는 BX DNA 서열
서열번호 40 EnAd 게놈 bp 29345 내지 29379에 대응하고 이를 포함하는 BY DNA 서열
서열번호 41 HIS-태그
서열번호 42 스플라이스 수용자 서열.
서열번호 43 SV40 폴리 아데닐화 서열
서열번호 44 EpCam BiTE 핵산 서열 (OKT3)
서열번호 45 FAP BiTE 핵산 서열 (OKT3)
서열번호 46 FAP BiTE 핵산 서열 (aCD3)
서열번호 47 NG-611 이식유전자 카세트
서열번호 48 NG-612 이식유전자 카세트
서열번호 49 NG-613 이식유전자 카세트
서열번호 50 제한 부위 삽입(BX)
서열번호 51 제한 부위 삽입(BY)
서열번호 52 CMV 프로모터 서열
서열번호 53 PGK 프로모터 서열
서열번호 54 CBA 프로모터 서열
서열번호 55 짧은 스플라이스 수용자(SSA) DNA 서열
서열번호 56 스플라이스 수용자(SA) DNA 서열
서열번호 57 분지된 스플라이스 수용자(bSA) DNA 서열
서열번호 58 코작 서열(널 서열)
서열번호 59 시작 코돈의 예
서열번호 60 내부 리보솜 유입 서열(IRES)
서열번호 61 P2A 펩타이드
서열번호 62 F2A 펩타이드
서열번호 63 E2A 펩타이드
서열번호 64 T2A 펩타이드
서열번호 65 폴리아데닐화(폴리A) 서열
서열번호 66 리더 서열
서열번호 67 리더 서열
서열번호 68 IFNγ 아미노산 서열
서열번호 69 IFNα 아미노산 서열
서열번호 70 TNFα 아미노산 서열
서열번호 71 EnAd 게놈의 E2B 영역에 대응하는 DNA 서열(bp 10355-5068)
서열번호 72: N-말단의 신호 서열 및 C-말단의 데카-His 친화도 태그를 갖는 항-EpCAM BiTE DNA 암호 서열
서열번호 73: C-말단의 데카-His 친화도 태그 없이 N-말단의 신호 서열을 갖는 항-EpCAM BiTE 단백질 서열
서열번호 74: C-말단의 데카-His 친화도 태그 없이 N-말단의 신호 서열을 갖는 항-FAP BiTE DNA 암호 서열
서열번호 75: C-말단의 데카-His 친화도 태그 없이 N-말단의 신호 서열을 갖는 항-FAP BiTE 아미노산 서열
서열번호 76: C-말단의 데카-His 친화도 태그 없이 N-말단의 신호 서열을 갖는 대조군 (항-FHA) BiTE DNA 암호 서열
서열번호 77: C-말단의 데카-His 친화도 태그 없이 N-말단의 신호 서열을 갖는 대조군 (항-FHA) BiTE 아미노산 서열
서열번호 78: C-말단의 데카-His 친화도 태그가 없는 대조군 BiTe(항-FHA)
서열번호 79: 데카-His 친화도 태그가 없는 NG-601(EnAd-CMV-EpCAMBiTE)
서열번호 80: 데카-His 친화도 태그가 없는 NG-602(EnAd-SA-EpCAMBiTE)
서열번호 81: 데카-His 친화도 태그가 없는 NG-605(EnAd-CMV-FAPBiTE)
서열번호 82: 데카-His 친화도 태그가 없는 NG-606 (EnAd-SA-FAPBiTE)
서열번호 83: EpCam BiTE 핵산 서열 (OKT3)
서열번호 84: 널 서열
서열번호 85: FAP BiTE 핵산 서열 (OKT3)
서열번호 86: 널 서열
서열번호 87: FAP BiTE 핵산 서열 (aCD3)
서열번호 88: NG-611 이식유전자 카세트
서열번호 89: NG-612 이식유전자 카세트
서열번호 90: NG-613 이식유전자 카세트
서열번호 91: NG-614 이식유전자 카세트
서열번호 92: NG-617 이식유전자 카세트
서열번호 93: EpCam BiTE 아미노산 서열 (OKT3)
서열번호 94: FAP BiTE 아미노산 서열 (OKT3)
서열번호 95: FAP BiTE 아미노산 서열 (aCD3)
서열번호 96: NG-611 게놈
서열번호 97: NG-612 게놈
서열번호 98: NG-613 게놈
서열번호 99: NG-614 게놈
서열번호 100: NG-617 게놈
서열번호 101: NG-615 게놈
서열번호 102: NG-640 게놈
서열번호 103: NG-641 게놈
서열번호 104: 널 서열
서열번호 105: Flt3L 핵산 서열
서열번호 106: 널 서열
서열번호 107: MIP1α 핵산 서열
서열번호 108: 가요성 링커 서열
서열번호 109: IFNα 핵산 서열
서열번호 110: CXCL10 핵산 서열
서열번호 111: CXCL9 핵산 서열
서열번호 112: NG-615 이식유전자 카세트
서열번호 113: NG-640 이식유전자 카세트
서열번호 114: NG-641 이식유전자 카세트
서열번호 115: FLT3L 아미노산 서열
서열번호 116: MIP1α 아미노산 서열
서열번호 117: IFNα 아미노산 서열
서열번호 118: CXCL9 아미노산 서열
서열번호 119: CXCL10 아미노산 서열
서열번호 120: NG-618 게놈
서열번호 121: NG-618 EpCam BiTE 핵산 서열
서열번호 122: NG-618 FAP BiTE 핵산 서열
서열번호 123: NG-618 이식유전자 카세트
서열번호 124 내지 297은 링커 서열임
서열번호 298 NG-616 게놈
실시예
실시예 1
재조합 BiTE를 설계하고, 단백질을 본 실시예에 기재한 바와 같이 생성하였다.
BiTE 조작
가요성 Gly4Ser 링커를 이용하여 상이한 특이성의 2개의 단일 쇄 항체 단편 (ScFv)을 결합시킴으로써 BiTE를 생성한다. 링커에 의해 모 단클론성 항체로부터 VH 및 VL 도메인을 결합함으로써 ScFv를 생성한다. 검출 및 정제를 위해 포유류 분비에 대한 N-말단의 신호 서열 및 C-말단의 데카히스티딘 친화도 태그를 갖는 각각의 BiTE를 설계하였다. 표준 DNA 클로닝 기법에 의해 BiTE를 조작하고, 단백질 발현 벡터 내로 삽입하였다(도 1). 신호 서열 및 친화도 태그를 첨가한 항-EpCAM BiTE는 특허 WO 2005040220(이의 서열번호 63)으로부터의 것이다. 신호 서열 및 친화도 태그를 첨가한 특허 WO2010037835A2로부터의 항-FAP ScFv 및 특허 WO 2005040220으로부터의 항-CD3 ScFv(이의 서열번호 63)을 이용하여, 드노보로 항-FAP BiTE를 생성하였다. 대조군 BiTE는 신호 서열 및 친화도 태그를 첨가한 문헌[Hussein et al, 2007 (Hussein AH et al (2007) "Construction and characterization of single-chain variable fragment antibodies directed against the Bordetella pertussis surface adhesins filamentous hemagglutinin and pertactin". Infect Immunity 75, 5476-5482)]으로부터의 항-FHA(보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)로부터의 섬유성 헤마글루티닌) ScFv 및 특허 WO 2005040220(이의 서열번호 63) 항-CD3 ScFv를 사용하였다. 이들 BiTE에 대한 DNA 암호 및 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 6이다.
재조합 BiTE 생성
단백질 발현을 유도하기 위해 CMV 프로모터(서열번호 31)를 이용하여 pSF-CMV 벡터 내로 각각의 서열의 클로닝에 의해 재조합 BiTE 단백질을 생성하였다(도 1). 플라스미드, pSF-CMV-EpCAMBiTE, pSF-CMV-FAPBiTE 및 pSF-CMV-대조군BiTE에 대한 플라스미드 DNA의 농도(표 2)를 NanoDrop을 통해 측정하였다. Empty pSF-CMV 벡터를 음성 대조군으로서 포함시킨다. 각각의 54.7㎍을 4㎖ OptiMEM으로 희석시켰다. 109.2㎍ PEI(선형, MW 25000, 미국에 소재한 폴리사이언시즈(Polysciences))를 4㎖ OptiMEM 배지에서 희석시키고, 4㎖의 희석시킨 DNA와 혼합하여 DNA-PEI 복합체(1:2(w/w)의 DNA:PEI 비)를 생성하였다. 실온에서 20분 동안 인큐베이션 후에, 복합체 혼합물을 OptiMEM을 이용하여 18㎖까지 높였고, 90% 합류로 Ad293 세포를 함유하는 T175 플라스크에 이 형질감염 혼합물을 첨가하였다. 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 형질감염 혼합물과 함께 세포의 인큐베이션 후, 30㎖의 세포 배지(글루타민을 보충한 DMEM 고글루코스, 페놀 레드 없음)를 세포에 첨가하고 나서, 플라스크를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포의 다른 플라스크를 pSF-CMV-GFP와 동시에 형질감염시켜 효율적인 형질감염 효율을 보장하였다. 분비된 단백질을 채취하기 위해, 형질감염 세포의 상청액을 수집하고 나서, 350g에서 4℃로 5분 동안 원심분리시켜 세포 성분을 제거하였다(알레그라(Allegra) X-15R, 베크만 쿨터(Beckman Coulter)). 10k MWCO 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-15 원심분리 필터 유닛(밀리포어(Millipore))에 상청액을 전달하였다. 4750rpm 및 4℃에서 교반 후에, 통과액을 이용하여 체류액의 용적을 조절하여 50-배 더 높은 농도를 얻었다. 농축된 단백질의 분취액을 -80℃에서 저장하였다.
Figure 112022078544073-pat00002
재조합 BiTE 검출
BiTE를 검출하기 위해, 웨스턴 블롯 기법을 이용하여 C-말단의 데카히스티딘 친화도 태그를 항-His 항체로 프로빙할 수 있다. β-머캅토에탄올 및 SDS를 함유하는 2,5㎕ 6x Laemmli SDS 샘플 완충제를 포함하는 15㎕의 최종 용적으로 용해 완충제를 이용하여 단백질 샘플을 조절하였다. 샘플을 5분 동안 95℃에서 인큐베이션시켜 단백질을 변성시키고 15-웰 10% 사전 성형된 폴리아크릴아마이드 겔(영국 바이오라드에 소재한 미니-프로테안 TGX 프레캐스트 겔(Mini-PROTEAN TGX Precast Gels)) 상에 장입하였다. 미니-프로테안 테트라 시스템(Mini-PROTEAN Tetra System)(영국에 소재한 바이오라드) 내에서 1 x 실행 완충제 중에서 45분 동안 180 V로 겔을 실행하였다. SDS 겔로부터의 단백질을 미니 트랜스-블롯 셀(Mini Trans-Blot Cell)(영국에 소재한 바이로라드) 내에서 1 x 전달 완충제 중에서 90분 동안 300mA 및 4℃에서 습식 일렉트로블롯팅에 의해 나이트로셀룰로스 막 상에 전달하였다. 열을 제한하기 위해 아이스팩의 존재하에 전달을 수행하였다. 이어서, 1시간 동안 실온에서 진탕기 상에서 PBS-T 중의 5% 우유를 이용하여 나이트로셀룰로스 막을 차단시키고, PBS/5% 우유 중에서 1:5000으로 희석시킨 항-His(C-말단) 항체(마우스 α-6xHis, 클론 3D5, 영국에 소재한 인비트로젠(Invitrogen), #46-0693)을 이용하여 프로빙하였다. 밤새 4℃에서 진탕기 상의 인큐베이션 후에, 막을 세척하고 나서, 실온에서 1시간 동안 HRP-표지 다클론성 2차 α-마우스-면역글로불린-항체(PBS/5% 우유 중에서 1:10.000, 다코(Dako), #P0161)를 이용하여 프로빙하였다. 시각화를 위해, 제조업자의 설명서에 따라 슈퍼시그널 웨스트 듀라 익스텐디드 듀레이션 서브스트레이트(SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate)(영국에 소재한 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 적용하였고, X-선 필름에 노출시키고 나서, 자동 필름 처리기에서 현상하였다. 결과는 BiTE 발현 플라스미드로 형질감염시켰지만, 모 벡터로는 형질감염시키지 않은 Ad293 세포로부터의 BiTE 단백질의 발현 및 분비를 입증하였다.
재조합 BiTE 정량화
재조합 BiTE 단백질의 양을 측정하기 위해, 도트 블롯 기법을 사용하여 BiTE 신호를 His-태그된(C-말단의 10His) 단백질 표준(10 x His-태그된 인간 카텝신 D, 바이오레전드(Biolegend), #556704)과 비교하였다. BiTE 샘플 및 단백질 표준의 2배 연속 희석물을 준비하고 나서, 나이트로셀룰로스 막에 각각 1.5㎕를 직접 도포하고 나서, 20분 동안 공기 건조시켰다. 이어서, 웨스턴 블롯에 대해 상기 기재한 차단 및 염색 프로토콜을 수행하였다. 250㎍/㎖의 BiTE 농도를 나타내기 위해 단백질 표준의 몰 농도를 조절하였다. 결과(도 2a)는 BiTE 발현 플라스미드로 형질감염시킨 Ad293 세포로부터의 BiTE 단백질의 발현 및 분비를 입증하였다.
FAP 결합 ELISA
pSF-CMV-FAPBiTE 또는 pSF-CMV-대조군BiTE로 형질감염시킨 세포로부터 분비된 FAP BiTE 및 대조군(항-FHA) BiTE(서열번호 4 및 6)의 FAP-결합 활성을 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 평가하였다. 빈 pSF-CMV 벡터 상청액을 음성 대조군으로서 포함시켰다. PBS 완충제 중에서 인간 FAP/세프라제 단백질(100ng/웰, 시노 바이오로지컬 인코포레이티드(Sino Biological Inc), 10464-H07H-10)를 이용하여 밤새 4℃에서 코팅에 의해 ELISA 플레이트(눈크 이뮤노 막시소프(Nunc Immuno MaxiSorp) 96 웰 마이크로플레이트)를 제조하였다. PBS 0.05% 트윈 20을 이용하는 모든 후속 결합 단계 사이에 플레이트를 세척하였다. PBS 0.05% 트윈 20 중에서 5% BSA를 이용하여 실온에서 1시간 동안 플레이트를 차단시켰다. BiTE 단백질 또는 빈 pSF-CMV 벡터-형질감염 세포로부터 채취한 단백질의 분취액을 PBS/5% BSA/0.05% 트윈 20 내로 10배 희석시켰다. 모든 샘플을 FAP 코팅 플레이트에 첨가하고 나서, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 검출 항체, 항-His(C-말단) 항체(마우스 항-6xHis, 클론 3D5, 영국에 소재한 인비트로젠, #46-0693)를 1:1000으로 희석시키고 나서, 1시간 동안 실온에서 적용하였다. 이어서, HRP 접합 항-마우스-Fc(PBS/5% 우유 중의 1:1000, 다코)를 1시간 동안 실온에서 적용한 후에 HRP 기질 용액 3.3.5.5'-테트라메틸에틸렌다이아민(TMB, 써모-피셔)를 이용하여 HRP 검출을 수행하였다. 반응을 종결시키기 위해 중단 용액을 사용하고 나서, 플레이트 판독기 상에서 450㎚에서 전개된 색을 측정하였다. 450㎚에서 흡광도를 FAP BiTE, 대조군 BiTE 및 빈 벡터 상청액에 대해 플롯팅하여, FAP 단백질에 대한 FAP BiTE의 특이적 결합을 입증하였다. 결과(도 2b)는 FAP BiTE의 특이적 결합을 나타내며 재조합 FAP 단백질에 대한 대조군 BiTE의 특이적 결합은 나타내지 않는다.
EpCAM 결합 ELISA
pSF-CMV-EpCAMBiTE 또는 pSF-CMV-대조군BiTE로 형질감염시킨 세포로부터 분비된 EpCAM BiTE 및 대조군 BiTE (서열번호 2 및 6)의 EpCAM-결합 활성을 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 평가하였다. 빈 pSF-CMV 벡터 상청액을 음성 대조군으로서 포함시킨다. PBS 완충제 중에서 인간 EpCAM/TROP-1 단백질(50ng/웰, 시노 바이올로지컬 인코포레이티드, #10694-H02H-50)을 이용하여 밤새 4℃에서 코팅에 의해 ELISA 플레이트(눈크 이뮤노 맥시소프 96 웰 마이크로플레이트)를 제조하였다. PBS 0.05% 트윈 20을 이용하는 모든 후속 결합 단계 사이에 플레이트를 세척하였다. PBS 0.05% 트윈 20 중에서 5% BSA를 이용하여 실온에서 1시간 동안 플레이트를 차단시켰다. BiTE 단백질 또는 빈 pSF-CMV 벡터-형질감염 세포로부터 채취한 단백질의 분취액을 PBS/5% BSA/0.05% 트윈 20 내로 10배 희석시켰다. 모든 샘플을 EpCAM 코팅 플레이트에 첨가하고 나서, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 검출 항체, 항-His(C-말단) 항체(마우스 항-6xHis, 클론 3D5, 영국에 소재한 인비트로젠, #46-0693)를 1:5000으로 희석시키고 나서, 1시간 동안 실온에서 적용하였다. 이어서, HRP 접합 항-마우스-Fc(PBS/5% 우유 중의 1:1000, 다코)를 1시간 동안 실온에서 적용한 후에 HRP 기질 용액 3.3.5.5'-테트라메틸에틸렌다이아민(TMB, 써모-피셔)를 이용하여 HRP 검출을 수행하였다. 반응을 종결시키기 위해 중단 용액을 사용하고 나서, 플레이트 판독기 상에서 450㎚에서 전개된 색을 측정하였다. 450㎚에서 흡광도를 EpCAM BiTE, 대조군 BiTE 및 빈 벡터 상청액에 대해 플롯팅하여, 재조합 EpCAM에 대한 EpCAM BiTE의 특이적 결합을 입증하였다. 결과(도 2c)는 EpCAM BiTE의 특이적 결합을 나타내며 재조합 EpCAM 단백질에 대한 대조군 BiTE의 특이적 결합은 나타내지 않는다.
실시예 2
BiTE 이식유전자-보유 EnAd 바이러스를 작제하기 전에 다수의 상이한 분석에서 재조합 BiTE 단백질의 기능적 활성을 평가하였다.
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 단리
옥스퍼드 내 영국 NHS 혈액 및 이식(NHS Blood and Transplant UK)으로부터 얻은 건강한 공여자의 신선한 인간 혈액 샘플로부터 또는 전혈 백혈구 원뿔로부터 밀도 구배 원심분리에 의해 인간 PBMC를 단리시켰다. 이 경우 중 하나에서, 샘플을 PBS를 이용하여 1:2로 희석시키고, 25㎖의 이 혼합물은 50㎖ 팔콘(Falcon) 관에서 13㎖ 피콜(Ficoll)(1.079g/㎖, 피콜-파크 플러스(Ficoll-Paque Plus), GE 헬스케어(GE Healthcare)) 상에서 층상화되었다. 샘플을 1600rpm에서 30분 동안 22℃에서 원심분리시키고(알레그라(Allegra) X-15R, 베크만 쿨터) 가장 낮은 감속을 설정하여 상 분리를 보존하였다. 원심분리 후, 상부에 혈장층 다음에 PBMC를 함유하는 계면, 피콜(Ficoll) 층 및 하부에 적혈구 및 과립구 층을 포함하는 4개의 층을 관찰할 수 있었다. 파스퇴르 피펫을 이용하여 PBMC를 수집하고 나서, PBS로 2회 세척하고(10분 동안 실온에서 1200rpm) 10% FBS로 보충한 RPMI 배지에서 재현탁시켰다.
CD3-양성 T-세포의 단리
제조업자의 프로토콜에 따라 Pan T 세포 단리 키트(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), #130-096-535)를 이용하여 비-CD3 세포의 고갈에 의해 PBMC로부터 CD3-양성(CD3+) T-세포를 추출하였다.
1차 복수 샘플의 가공
1차 인간 복수 샘플을 난소, 췌장, 유방 및 위암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다중 적응증을 갖는 환자로부터 처칠힐 병원의 종양 병동(oncology ward of the Churchill Hospital)(옥스퍼드 유니버시티 병원(Oxford University Hospitals))으로부터 수용하였다. 수용 시, 세포 및 유체 분획을 분리시키고, 저장 및 장래의 분석을 위해 유체의 분취액을 -20℃에서 냉동시켰다. 제조업자의 설명서에 따라 적혈구 세포를 제거하기 위해 적혈구 용해 완충제(로슈(Roche), #11814389001)를 이용하여 세포 분획을 처리하였다. 각각의 샘플에 존재하는 세포 유형을 EpCAM, EGFR, FAP, CD45, CD11b, CD56, CD3, CD4, CD8, PD1 및 CTLA4에 대한 염색에 의해 결정하고 나서, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 이어서, 생체외 T-세포 활성화 및 표적 세포 용해 실험을 위해 세포를 신선하게 사용하였다. 일부 경우에, 세포를 후속 실험에서 사용하기 위해 10% FBS로 보충한 DMEM 중에서 계대시켰다.
세포주 유지
달리 구체화되지 않는 한 37℃ 및 5% CO2에서 습윤화된 인큐베이터(MCO-17AIC, 산요(Sanyo))에서 10%(v/v) 소태아 혈청(FBS, 깁코(Gibco)(상표명)) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(10㎎/㎖, 영국에 소재한 시그마-알드리치)으로 보충한 표 3에서 구체화한 바와 같이 모든 세포주를 DMEM(영국에 소재한 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 또는 RPMI 배지(영국에 소재한 시그마-알드리치)에서 유지시켰다. 트립신/EDTA(0.05% 트립신 0,02% EDTA, 영국에 소재한 시그마-알드리치)를 이용하는 효소적 해리에 의한 합류에 도달되기 전에 세포를 2 내지 3일마다 분할하였다. 이 과정에서, 배양 배지를 흡입하고 나서, 세포를 15㎖의 PBS로 세척하고, 후속적으로 세포를 2 내지 10분 동안 37℃에서 2㎖의 트립신/EDTA로 처리하였다. 10% FBS를 함유하는 10㎖의 DMEM으로 트립신을 중화시키고 나서, 세포의 일부를 신선한 배지를 함유하는 새로운 플라스크에 옮겼다. 일상적인 세포 배양물에 대해, 배지를 10% FBS로 보충하고, 감염 및 바이러스 플라스미드 형질감염에 대해 2% FBS로 보충하고, 재조합 BiTE 플라스미드 형질감염에 대해 FBS 보충이 없었다.
Figure 112022078544073-pat00003
통계학
두 조건을 비교한 사례에서, t-검정을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 모든 다른 사례에서, 일원 ANOVA를 이용함으로써 통계학적 분석을 수행하였다.
재조합 FAP BiTE에 의한 인간 T-세포 활성화의 특성규명
정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF) 세포의 존재 또는 부재 하에서 T-세포 활성화를 유도하는 FAP BiTE의 능력을 비교하였다. 인간 CD3+ T-세포(96-웰 U-바닥 플레이트에서 웰 당 70,000개의 세포)를 배지 단독으로 또는 300ng/㎖ FAP 또는 대조군 BiTE의 존재 하에 단독 또는 NHDF 세포(10:1 T:NHDF)와 공동 배양시켰다. 37℃에서 24시간 동안 세포를 공동배양시키고 나서, 후속적으로 무효소 세포 해리 완충제(써모, #13151014)를 이용하여 채취하였다. 이어서, CD45+ T-세포 상에서 CD69(도 3a) 및 CD25(도 3b)의 발현 수준을 항체 염색 및 유세포 분석에 의해 분석하고, 기하평균 형광(gMFI) 값으로 나타내었다. 플레이트-고정 항-CD3 항체(7.5㎍/㎖)를 T 세포 활성화를 위한 양성 대조군으로서 사용하였다. FAP BiTE는 T 세포 상에서 활성화 마커 CD69 및 CD25의 발현을 선택적으로 유도하였는데, 이는 T 세포를 활성화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
제2의 유사한 실험에서, NHDF 세포(96-웰 플레이트의 웰에서 200,000개의 CD3+ 세포 + 40,000개의 NHDF) 및 300ng/㎖ FAP 또는 대조군 BiTE와 함께 공동 배양 후 6시간에 세포내 사이토카인 염색에 의해 T 세포를 평가하였다. 채취 5시간 전에 배양 배지 내로 첨가한 브레펠딘 A를 이용하여 CD45+ T-세포를 IFNγ발현에 대해 세포내로 염색하였다. 양성 대조군으로서, 가용성 PMA(10ng/㎖) 및 이노마이신(1㎍/㎖)을 이용하여 T-세포를 자극하였다. 도 4a에 나타낸 결과는 NHDF의 존재 하의 FAP BiTE가 대조군 BiTE에 비해 상당히 더 많은 수의 IFNγ발현 T-세포를 초래한다는 것을 나타낸다.
실시예 3
실시예 2와 유사한 세트의 실험을 실행하여 재조합 EpCAM BiTE 단백질을 특성규명하였다.
재조합 EpCAM BiTE에 의한 인간 T-세포 활성화의 특성규명
EpCAM-양성 DLD 세포주의 존재 또는 부재 하에 T-세포 활성화를 유도하는EpCAM BiTE의 능력을 비교하였다. 인간 CD3+ T-세포(96-웰 U-바닥 플레이트에서 웰 당 70,000개의 세포)를 배지 단독으로 또는 600ng/㎖ EpCAM 또는 대조군 BiTE의 존재 하에 단독 또는 DLD 세포(10:1 T:DLD)와 공동 배양시켰다. 37℃에서 24시간 동안 세포를 공동배양시키고 나서, 후속적으로 무효소 세포 해리 완충제를 이용하여 채취하였다. 이어서, CD45+ T-세포 상에서 CD69 및 CD25의 발현 수준을 항체 염색 및 유세포 분석에 의해 분석하고, 데이터를 기하평균 형광(gMFI) 값으로 나타내었다. 플레이트-고정 항-CD3 항체(7.5㎍/㎖)를 T 세포 활성화를 위한 양성 대조군으로서 사용하였다. EpCAM BiTE는 T 세포 상에서 활성화 마커 CD69 및 CD25의 발현을 선택적으로 유도하였는데, 이는 T 세포를 활성화시킬 수 있다는 것을 나타낸다(도 4b 및 도 4c).
유사한 실험에서, DLD 세포(96-웰 플레이트의 웰 당 200,000개의 CD3+ T-세포 + 40,000개의 DLD 세포) 및 300ng/㎖ EpCAM 또는 대조군 BiTE와 함께 공동 배양 후 6시간에 세포내 사이토카인 염색에 의해 T 세포를 평가하였다. 채취 5시간 전에 배양 배지 내로 첨가한 브레펠딘 A를 이용하여 CD45 + T-세포를 IFNγ 발현에 대해 세포내로 염색하였다. 양성 대조군으로서, 가용성 PMA(10ng/㎖) 및 이노마이신(1㎍/㎖)을 이용하여 T 세포를 자극하였다. 결과는 DLD의 존재 하의 EpCAM BiTE가 대조군 BiTE에 비해 상당히 더 많은 수의 IFNγ발현 T-세포를 초래한다는 것을 나타내었다(도 5a).
다른 유사한 실험에서, 8명의 상이한 공여자로부터의 PBMC를 사용하여 BiTE-매개 T-세포 활성화에서 공여자-의존적 변화를 평가하였다. 배지 단독 또는 300ng/㎖의 대조군 또는 EpCAM BiTE의 존재 하에서 U-바닥 96 웰 플레이트에서 DLD(7,000개의 세포)를 100,000개의 PBMC와 함께 공동배양시켰다. 세포를 24시간 동안 37℃에서 공동 배양시키고, 후속적으로 채취하였다. 이어서, CD45+ T-세포 상에서 CD69 및 CD25의 발현 수준을 항체 염색 및 유세포 분석에 의해 분석하고, 데이터를 기하평균 형광(gMFI) 값으로 나타내었다. 결과는 EpCAM BiTE가 모두 8명의 공여자로부터의 CD3+ T-세포에서 활성화 마커 CD69 및 CD25의 발현을 유도하였다는 것을 나타내었다(도 5b 및 도 5c).
실시예 4
이 실시예에서, 섬유아세포 표적 세포의 사멸을 유도하는 재조합 FAP BiTE-활성화된 T-세포의 능력을 평가하였다.
FAP BiTE는 FAP-양성 세포주 및 1차 세포의 T 세포-매개된 용해를 유도한다
NHDF(7,000개의 세포)를 배지 단독 또는 300ng/㎖의 대조군 또는 FAP BiTE의 존재 하에 U-바닥 96 웰 플레이트의 웰에서 70,000개의 T-세포와 함께 공동배양시켰다. 24시간의 공동 배양 후에, 상청액을 채취하고 나서, 제조업자의 설명서에 따라 LDH 분석에 의해 세포독성을 결정하였다. 결과는 도 6A에 있으며, FAP BiTE가 NHDF 세포의 용해를 상당히 증가시켰다는 것을 나타낸다.
유사한 실험에서, 7,000개의 1차 폐 섬유아세포(BTC100)를 300ng/㎖의 대조군 또는 FAP BiTE와 함께 또는 이것 없이 70,000개의 CD3+ T-세포와 함께 공동 배양시켰다. 24시간의 공동 배양 후에, 상청액을 채취하고 나서, LDH 분석에 의해 세포독성을 결정하였다. 도 6B 및 도 6C의 결과는 FAP BiTE가 1차 인간 암 관련 섬유아세포(CAF) 세포의 용해를 상당히 증가시켰다는 것을 나타낸다. 이들 및 다른 환자-유래 세포주에 의한 FAP의 발현을 도 7에 나타낸다.
40,000개의 T-세포 및 BiTE를 2×103 내지 2×10-2ng/㎖ 범위의 농도로 8,000개의 NHDF 세포와 공동 배양시킴으로써 FAP BiTE-매개 세포 용해에 대한 용량-반응 관계를 평가하였다. 24시간 동안 37℃에서 공동 배양 후에, LDH 분석을 상청액에 대해 수행하여 표적 세포 세포독성을 결정하였다. 용량 반응 곡선을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)에 통합된 4모수 비선형 적합 모델을 이용하여 적합화시켜, 3.2ng/㎖의 FAP BiTE에 대한 EC50값을 생성하였다. 결과(도 8a)는 LDH 분석에 의해 측정한 바와 같이 FAP BiTE 농도와 세포독성 사이의 용량-의존적 관계를 나타낸다(Abs490으로 나타냄).
실시예 5
표적 종양 세포의 사멸을 유도하는 재조합 EpCAM BiTE-활성화된 T 세포의 능력을 평가하는 것을 입증하기 위해 실시예 4와 유사한 연구를 사용하였다.
EpCAM BiTE는 EpCAM-양성 세포주의 T 세포-매개 용해를 유도한다
DLD 종양 세포(7,000개의 세포)를 배지 단독 또는 300ng/㎖의 대조군 또는 EpCAM BiTE의 존재 하에 U-바닥 96 웰 플레이트의 웰에서 70,000개의 T-세포와 함께 공동배양시켰다. 24시간의 공동 배양 후에, 상청액을 채취하고 나서, LDH 분석에 의해 세포독성을 결정하였다. 도 8b의 결과는 EpCAM BiTE가 DLD 세포의 용해를 상당히 증가시켰다는 것을 나타낸다(DLD 세포 상의 EpCAM 발현을 도 8c에 나타낸다).
유사한 실험에서, 4,000개의 SKOV 세포를 300ng/㎖의 대조군 또는 EpCAM BiTE와 함께 또는 이것 없이 40,000개의 CD3+ T-세포와 공동 배양시켰다. 24시간의 공동 배양 후에, 상청액을 채취하고 나서, LDH 분석에 의해 세포독성을 결정하였다. 도 9a의 결과는 EpCAM BiTE가 SKOV 세포의 용해를 상당히 증가시켰다는 것을 나타낸다.
다른 유사한 실험에서, 5,000개의 MCF7 세포를 300ng/㎖의 대조군 또는 EpCAM BiTE와 함께 또는 이것 없이 50,000개의 CD3+ T-세포와 공동 배양시켰다. 24시간의 공동 배양 후에, 상청액을 채취하고 나서, LDH 분석에 의해 세포독성을 결정하였다. 도 9b의 결과는 또한 EpCAM BiTE가 MCF7 세포의 용해를 상당히 증가시켰다는 것을 나타낸다.
40,000개의 T-세포 및 EpCAM 또는 대조군 BiTE를 2×103 내지 2×10-2ng/㎖ 범위의 농도로 8,000개의 DLD와 공동 배양시킴으로써 EpCAM BiTE-매개 세포 용해에 대한 용량-반응 관계를 평가하였다. 24시간 동안 37℃에서 공동 배양 후에, LDH 분석을 상청액에 대해 수행하여 표적 세포 세포독성을 결정하였다. 용량 반응 곡선을 그래프패드 프리즘에 통합된 4모수 비선형 적합 모델을 이용하여 적합화시켜, 7.4ng/㎖의 EpCAM BiTE에 대한 EC50값을 생성하였다. 도 10의 결과는 EpCAM BiTE 농도와 세포독성 사이의 용량 의존적 관계를 나타낸다.
결론적으로, 본 실시예의 결과는 EpCAM BiTE가 다중 EpCAM-양성 종양 세포주의 T-세포 매개 용해를 유도할 수 있었다는 것을 입증한다.
실시예 6
모 비형질감염 세포에 비교함으로써 FAP BiTE의 FAP 항원 특이성을 입증하기 위한 수단으로서 안정한 FAP 발현 CHO 및 Ad293 세포주를 생성하였다.
FAP-발현 안정-형질감염 세포주의 생성
FAP 유전자의 단백질 서열을 NCBI 데이터베이스(서열번호 30)로부터 얻었고, 옥스퍼드 제네틱스 엘티디(Oxford Genetics Ltd)(영국 옥스퍼드에 소재)에 의해 합성된 DNA 암호 서열을 생성하도록 역전사시켰다. pSF-렌티-FAP 벡터를 생성하는 표준 클로닝 기법에 의해 FAP 유전자를 pSF-렌티 벡터 내로 클로닝시켰다. HEK293T 세포를 pSF-CMV-HIV-Gag-Pol, pSF-CMV-VSV-G, pSF-CMV-HIV-Rev와 함께 렌티바이러스 FAP 발현 벡터로 형질감염시켰다. 리포펙타민 2000을 형질감염 시약으로서 사용하였고, 1:2의 DNA:리포펙타민 비로 벡터 DNA에 첨가하고 나서, 37℃에서 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 렌티바이러스를 함유하는 상청액을 48시간 후에 채취하고 나서, 폴리브렌(최종 농도, 8㎍/㎖)과 혼합하였다. 렌티바이러스/폴리브렌 혼합물을 첨가하여 Ad293 또는 CHO 세포를 파종시키고 나서, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 제4일에, 상청액을 퓨로마이신(Ad293에 대해 2㎍/㎖ 및 CHO에 대해 7.5㎍/㎖)을 함유하는 배지로 교환하였다. 이어서, 안정한 변이체를 클론으로 선택하고 나서, 모 세포주 또는 안정한-형질감염 변이체의 FAP 발현을 FAP 또는 동위원소 대조군 항체를 이용하는 염색에 의해 결정하고 나서, 유세포 분석으로 분석하였다(도 11A).
FAP BiTE-매개 표적 세포 용해는 FAP-발현 세포에 특이적이다
U-바닥 96-웰 플레이트의 웰에서 배지 단독으로 또는 2㎍/㎖ 대조군 또는 FAP BiTE의 존재 하에 CHO 또는 CHO-FAP 세포(7,000개 세포)를 단독으로 또는 인간 T-세포(70,000)과 함께 공동 배양시켰다. 24시간 인큐베이션 후에, 상청액을 채취하고 나서, 표적 세포 세포독성을 실시예 4에 기재한 바와 같이 LDH 세포독성에 의해 측정하였다(도 11B). 유세포 분석을 통해 CD69 및 CD25의 발현 수준을 분석함으로써 T-세포 활성화를 또한 결정하였다(도 12). CHO-FAP 세포를 T-세포 및 FAP BiTE와 함께 배양시켰을 때에만 세포독성이 관찰되었다. 이는 FAP BiTE 매개 T-세포 활성화 및 표적 세포 용해가 고도로 특이적이고 FAP-발현 세포로 제한되며, FAP-음성 모 세포주에는 그렇지 않다는 것을 나타낸다.
실시예 7
모 비형질감염 세포에 비교함으로써 EpCAM BiTE의 EpCAM 항원 특이성을 입증하기 위한 수단으로서 안정한 EpCAM 발현 CHO 및 Ad293 세포주를 생성하였다.
EpCAM-발현 안정-형질감염 세포주의 생성
EpCAM 유전자의 단백질 서열을 NCBI 데이터베이스(서열번호 28)로부터 얻었고, 옥스퍼드 제네틱스 엘티디(Oxford Genetics Ltd)(영국 옥스퍼드에 소재)에 의해 합성된 DNA 암호 서열을 생성하도록 역전사시켰다. pSF-렌티-EpCAM 벡터를 생성하는 표준 클로닝 기법에 의해 EpCAM 유전자를 pSF-렌티 벡터 내로 클로닝시켰다. HEK293T 세포를 pSF-CMV-HIV-Gag-Pol, pSF-CMV-VSV-G, pSF-CMV-HIV-Rev와 함께 렌티바이러스 EpCAM 발현 벡터로 형질감염시켰다. 리포펙타민 2000을 형질감염 시약으로서 사용하였고, 1:2의 DNA:리포펙타민 비로 벡터 DNA에 첨가하고 나서, 37℃에서 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 렌티바이러스를 함유하는 상청액을 48시간 후에 채취하고 나서, 폴리브렌(최종 농도, 8㎍/㎖)과 혼합하였다. 렌티바이러스/폴리브렌 혼합물을 첨가하여 Ad293 또는 CHO 세포를 파종시키고 나서, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 제4일에, 상청액을 퓨로마이신(Ad293에 대해 2㎍/㎖ 및 CHO에 대해 7.5㎍/㎖)을 함유하는 배지로 교환하였다. 이어서, 안정한 변이체를 클론으로 선택하고 나서, 모 세포주 또는 안정한-형질감염 변이체의 EpCAM 발현을 EpCAM 또는 동위원소 대조군 항체를 이용하는 염색에 의해 결정하고 나서, 유세포 분석으로 분석하였다(도 13a).
EpCAM BiTE-매개 표적 세포 용해는 EpCAM-발현 세포에 특이적이다
U-바닥 96-웰 플레이트의 웰에서 배지 단독으로 또는 2㎍/㎖ 대조군 또는 EpCAM BiTE의 존재 하에 CHO 또는 CHO-EpCAM 세포(7,000개 세포)를 단독으로 또는 인간 T-세포(70,000)과 함께 공동 배양시켰다. 24시간 인큐베이션 후에, 상청액을 채취하고 나서, 표적 세포 세포독성을 LDH 세포독성에 의해 측정하였다(도 13b). 유세포 분석을 통해 CD69 및 CD25의 발현 수준을 분석함으로써 T-세포 활성화를 또한 결정하였다(도 14). CHO-EpCAM 세포를 T-세포 및 EpCAM BiTE와 함께 배양시켰을 때에만 세포독성이 관찰되었다. 이는 EpCAM BiTE 매개 T-세포 활성화 및 표적 세포 용해가 고도로 특이적이고 EpCAM-발현 세포로 제한되며, EpCAM-음성 모 세포주에는 그렇지 않다는 것을 나타낸다.
실시예 8
추가 실험에서, CD4 또는 CD8 T-세포를 활성화시키는 재조합 FAP BiTE 단백질의 능력 및 NHDF 세포를 용해시키는 각각의 이들 T-세포 서브세트의 능력을 평가하였다. CD3+ T-세포(35,000개)를 U-바닥 96 웰 플레이트의 웰에서 300ng/㎖ 대조군 또는 FAP BiTE의 존재 하에 7,000개의 NHDF 세포와 함께 공동 배양시키고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 채취하고 나서, CD4 또는 CD8 및 CD69 및 CD25에 대해 항체로 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 결과(도 15A)는 FAP BiTE가 CD4+와 CD8+ T-세포 둘 다에서 활성화 마커 CD69 및 CD25의 증가를 유도한다는 것을 입증하였다.
유사한 실험에서, 표적 세포를 사멸시키는 각각의 T-세포 서브세트(CD4 및 CD8)의 능력을 평가하였다. 비단리 통과액 내에서 CD8 세포를 이용하는 제조업자의 프로토콜에 따라 CD4 T 세포 단리 키트(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), #130-045-101)를 이용하여 양성 선택에 의해 CD4+ T-세포를 CD3-정제 세포로부터 추출하였다. U-바닥 96-웰 플레이트의 웰에서, 7,000개의 NHDF를 300ng/㎖의 대조군 또는 FAP BiTE와 함께 35,000개의 CD4+ 또는 CD8+ T-세포와 공동 배양시키고, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 24시간 후에, 상청액을 채취하고 나서, 표적 세포 세포독성을 LDH 세포독성에 의해 측정하였다. 결과(도 15B)는 FAP BiTE가 NHDF 세포를 사멸시키는 CD4+와 CD8+ T-세포를 둘 다 유도하였다는 것을 나타낸다.
실시예 9
CD4+ 또는 CD8+ T-세포를 활성화시키는 EpCAM BiTE의 능력 및 DLD 종양 세포를 용해시키는 각각의 서브세트의 능력을 평가하였다. CD3+ T-세포(35,000개)를 U-바닥 96 웰 플레이트의 웰에서 300ng/㎖ 대조군 또는 EpCAM BiTE의 존재 하에 7,000개의 DLD 세포와 함께 공동 배양시키고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 채취하고 나서, CD4 또는 CD8 및 CD69 및 CD25에 대한 항체로 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 결과(도 16A)는 EpCAM BiTE가 CD4+와 CD8+ T-세포 둘 다에서 활성화 마커 CD69 및 CD25의 증가를 유도한다는 것을 입증하였다.
유사한 실험에서, 표적 세포를 사멸시키는 각각의 T-세포 서브세트(CD4 및 CD8)의 능력을 평가하였다. 비선택 통과액 내에서 CD8 세포를 이용하는 제조업자의 프로토콜에 따라 CD4 T 세포 단리 키트를 이용하여 양성 선택에 의해 CD4+ T-세포를 CD3-정제 세포로부터 추출하였다. U-바닥 96-웰 플레이트의 웰에서, 7,000개의 DLD를 300ng/㎖의 대조군 또는 EpCAM BiTE와 함께 35,000개의 CD4+ 또는 CD8+ T-세포와 공동 배양시키고, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 24시간 후에, 상청액을 채취하고 나서, 표적 세포 세포독성을 LDH 세포독성에 의해 측정하였다(도 16B). 결과는 EpCAM BiTE가 DLD 세포를 사멸시키는 CD4+와 CD8+ T-세포를 둘 다 유도하였다는 것을 나타낸다.
실시예 10
1차 악성종양 복수로부터의 자가 종양-관련 림프구의 FAP BiTE-매개 활성화의 특성규명
암환자 유래 세포를 이용하여 BiTE 단백질의 활성을 평가하기 위해, 검사를 위해 CD3+ T-세포와 FAP+ 세포를 둘 다 함유하는 1차 악성종양 복수액의 샘플을 얻었다. 100% 복수액에서 또는 500ng/㎖ 대조군 또는 FAP BiTE의 존재 하에 1% 인간 혈청으로 보충한 배지에서 U-바닥 96-웰 플레이트의 웰 당 250,000개의 세포로 비정제 복수 세포(따라서 수용하였을 때로부터 변하지 않음)를 파종하였다. 비처리 웰은 음성 대조군으로서 작용하였다. 37℃에서 5일 동안 인큐베이션 후에, 총 세포 집단을 채취하고 나서, CD3+ T-세포의 수(도 17A) 및 CD3+ T-세포 상에서 CD25의 발현 수준을 결정하였다(도 17B). 정밀도 계수 비드를 이용하여 웰 당 총 세포 수를 결정하였다. 결과는 FAP BiTE가 암 환자로부터의 종양-관련 T-세포의 T-세포 활성화에서 상당한 증가를 초래한다는 것을 입증한다.
상기 실험의 연장으로서, 복제 웰을 채취하고 나서, FAP + 세포의 수를 유세포 분석에 의해 결정하였다(도 17C). 정밀도 계수 비드를 이용하여 웰 당 총 세포 수를 결정하였다. 결과는 FAP BiTE가 복수 샘플 내 자가 FAP-발현 세포 수의 상당한 감소를 초래하였다는 것을 나타낸다.
실시예 11
상기 기재한 방법을 이용하여 재조합 BiTE-발현 EnAd 바이러스를 조작하고, 생성하고 정제하였다.
BiTE-발현 에나데노툭시레브의 생성
EnAd는 E2B 영역에서 Ad3의 Ad11p로의 빈번한 비상동성 뉴클레오타이드 치환, 거의 완전한 E3 결실 및 E4orf4에 맵핑된 더 작은 E4 결실을 함유하는 복제 적격 키메라 그룹 B 아데노바이러스이다(Kuhn et al, Directed evolution generates a novel oncolytic virus for the treatment of colon cancer, PLoS One, 2008 Jun 18; 3(6): e2409). 본 연구에서 사용되는 아데노바이러스 게놈의 개략적 표현을 도 18A에 나타낸다.
EpCAM BiTE (서열번호 1), FAP BiTE (서열번호 3) 또는 대조군 BiTE (서열번호 5)를 암호화하는 카세트의 직접 삽입에 의해 플라스미드pEnAd2.4-CMV-EpCAMBiTE, pEnAd2.4-SA-EpCAMBiTE, pEnAd2.4-CMV-FAPBiTE, pEnAd2.4-SA-FAPBiTE, pEnAd2.4-CMV-대조군BiTE, pEnAd2.4-SA-대조군BiTE(표 4)를 생성하기 위해 플라스미드 pEnAd2.4를 사용하였다. 이식유전자 카세트는 5' 짧은 스플라이스 수용자 서열(서열번호 33) 또는 외인성 CMV 프로모터(서열번호 31), EpCAM, FAP 또는 대조군 BiTE cDNA 서열 및 3' 폴리아데닐화 서열(서열번호 32)을 함유하였다. DNA 서열분석에 의해 플라스미드의 작제를 확인하였다. 외인성 CMV 프로모터는 구성적으로 활성이고, 따라서 이식유전자의 조기 발현을 야기한다. 스플라이스 수용자 서열은 바이러스의 주요 후기 프로모터의 제어 하에서 발현을 유도하고, 바이러스 게놈 복제의 개시 후 후기 이식유전자 발현을 야기한다. 이 프로모터-유도 발현의 역학을 도 18B에서 관찰할 수 있으며, 이때 GFP를 이식유전자로서 사용하였다.
Figure 112022078544073-pat00004
바이러스 생성 및 특성규명
선형 바이러스 게놈을 생성하는 효소 AscI를 이용하는 제한 분해에 의해 플라스미드 EnAd2.4-CMV-EpCAMBiTE, pEnAd2.4-SA-EpCAMBiTE, pEnAd2.4-CMV-FAPBiTE, pEnAd2.4-SA-FAPBiTE, pEnAd2.4-CMV-대조군BiTE, pEnAd2.4-SA-대조군BiTE를 선형화하였다. 분해된 DNA를 아이소프로판올 추출에 의해 정제하고 나서, 300㎕ >95% 분자 생물학 등급 에탄올 및 10㎕의 3M 아세트산나트륨에서 16시간 동안, -20℃에서 침전시켰다. 14000rpm, 5분에서 원심분리에 의해 침전된 DNA를 펠릿화하고 나서, 14000rpm, 5분으로 다시 원심분리시키기 전에 500㎕ 70% 에탄올에서 세척하였다. 깨끗한 DNA 펠릿을 공기 건조시키고 나서, 100㎕ 물 중에서 재현탁시켰다. 6.25 g의 DNA를 OptiMEM에서 15.6㎕ 리포펙타민 형질감염 시약과 혼합하고 나서, 20분 동안, RT에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 80% 합류로 성장시킨 Ad293 세포를 함유하는 T-25 플라스크에 형질감염 혼합물을 첨가하였다. 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 형질감염 혼합물과 함께 세포의 인큐베이션 후, 4㎖의 세포 배지(10% FBS와 함께 글루타민을 보충한 DMEM 고 글루코스)를 세포에 첨가하고 나서, 플라스크를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 형질감염시킨 Ad293 세포를 24시간마다 모니터링하고 나서, 48 내지 72시간마다 추가 배지로 보충하였다. 세포 단일층에서 상당한 세포 변성 효과(cytopathic effect)의 관찰에 의해 바이러스의 생성을 모니터링하였다. 일단 광대한 CPE가 관찰되면, 3회의 냉동-해동 주기에 의해 Ad293 세포로부터 바이러스를 채취하였다. 채취한 용해물의 연속 희석에 의해 단일 바이러스 클론을 선택하고, Ad293 세포를 재감염시키고 나서, 단일 플라크를 함유하는 웰을 채취하였다. 바이러스 저장액을 증폭시키기 위해 일단 감염이 완전한 CPE에 도달되면 Ad293 세포의 연속 감염을 수행하였다. 세포 단일층에서 상당한 CPE의 관찰에 의해 증폭 동안 살아있는 바이러스 생성을 확인하였다.
바이러스 정제
일단 강력한 바이러스 저장액이 증폭되면, NG-601, NG-602, NG-603, NG-604, NG-605 및 NG-606 바이러스 저장액을 생성하기 위해 2배의 염화세슘 밀도 구배 원심분리(밴딩)에 의해 바이러스를 정제하였다. 제조업자의 설명서에 따라 마이크로BCA 분석(라이프 테크놀로지즈)에 의해 이들 저장액을 적정하였다(표 5).
Figure 112022078544073-pat00005
실시예 12
이하에 기재하는 방법을 이용하여 NG-601, NG-602, NG-603, NG-604, NG-605 및 NG-606 바이러스의 활성을 특성규명하였다.
암종 세포주에서 EnAd에 비교되는 BiTE 암호화 EnAd 활성의 특성규명
NG-601, NG-602, NG-603, NG-604, NG-605, NG-606 또는 EnAd의 복제하는 능력을 A549 폐암종 세포의 감염에 의해 분석하고 나서, qPCR에 의해 평가하였다. A549 세포를 2x105개의 세포/웰의 세포 밀도로 24-웰 플레이트의 웰에서 파종하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 세포 당 100개의 바이러스 입자(ppc)로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 감염 후 24, 48 또는 72시간에 웰을 채취하고 나서, 제조업자의 프로토콜에 따라 PureLink 게놈 DNA 미니 키트(인비트로젠)를 이용하여 DNA를 정제하였다. 표 6에서 상술한 반응 혼합물에서 EnAd 헥손 유전자 특이적 프라이머-프로브 세트를 이용하여 각각의 추출된 샘플 또는 표준으로 qPCR에 의해 총 바이러스 게놈을 정량화하였다. 표 7의 프로그램에 따라 qPCR을 수행하였다.
Figure 112022078544073-pat00006
Figure 112022078544073-pat00007
세포당 검출된 바이러스 게놈 수의 정량화는 NG-601, NG-602, NG-603, NG-604, NG-605, NG-606 및 EnAd 바이러스 복제가 A549 세포주에서 유사하였다는 것을 입증하였다(도 19A).
NG-601, NG-602, NG-603, NG-604, NG-605, NG-606 또는 EnAd의 종양 용해성 활성을 A549의 감염에 의해 평가하였다(도 19B). A549 세포를 1.5x104개의 세포/웰의 세포 밀도로 96-웰 플레이트에서 파종하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 바이러스의 ppc(5배 연속 희석, 4.1x10-7 내지 5000개의 바이러스 ppc)를 증가시키면서 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 제5일에 셀타이터(CellTiter) 96(등록상표) AQueous One 용액 세포 증식 분석(MTS)(프로메가(Promega), # G3582)에 의해 A549 세포독성을 측정하였다. 용량 반응 곡선을 그래프패드 프리즘에 통합된 4모수 비선형 적합 모델을 이용하여 적합화시켰다. 각각의 바이러스에 대해 생성된 IC50 값은 NG-601, NG-602, NG-603, NG-604, NG-605, NG-606 및 EnAd의 종양 용해성 활성이 각각의 바이러스에 대해 비슷하다는 것을 입증하였다.
NG-601, NG-602, NG-603, NG-604, NG-605, NG-606로부터의 기능성 BiTE 이식유전자 발현의 확인
바이러스 NG-601, NG-602, NG-605, NG-606이 기능성 BiTE를 생성하는지의 여부를 결정하기 위해, 표적 세포로서 CHO, CHO-EpCAM 및 CHO-FAP 세포주를 이용하는 T-세포 활성화 분석을 수행하였다. 배양 배지에서 100배로 희석시킨 Ad293 바이러스 상청액이 있는 U-바닥 96-웰 플레이트의 웰에서 10,000개의 표적 세포를 50,000개의 CD3+ T-세포와 함께 공동배양시키고, 24시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. T-세포를 채취하고 나서, CD25 및 CD69에 특이적인 항체로 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 결과(도 20a 및 도 20b)는 바이러스 NG-601 및 NG-602가 CHO-EpCAM 세포와 함께 공동 배양시킬 때 T 세포를 활성화시킨 기능성 BiTE 이식유전자를 발현시키고, NG-605 및 NG-606이 CHO-FAP 세포와 함께 공동 배양시킬 때(그러나 CHO 세포와 함께 공동 배양시킬 때는 아님) T 세포를 활성화시킨 기능성 BiTE 이식유전자를 발현시켰다는 것을 나타내었다.
결장 암종 세포주에서 BiTE 발현의 정량화
인간 결장 암종 세포주 DLD의 NG-601, NG-602, NG-605, NG-606 감염에 의한 BiTE 발현의 양을 평가하였다. DLD 세포를 1.2x106개의 세포/웰의 밀도로 6웰 배양물 플레이트에 파종하였다.　 파종 18시간 후에, DLD 세포를 100 ppc에서 EnAd, NG-601, NG-602, NG-603, NG-604, NG-605, NG-606으로 감염시켰다.　 세포를 72시간 동안 배양시킨 후에, 상청액을 웰로부터 수집하고 나서, 5분 동안, 1200rpm에서 원심분리시켜 세포 파편을 제거하였다.　 이어서, 바이러스 상청액 중의 BiTE 양의 결정을 허용하는 공지된 농도의 재조합 BiTE에 의해 생성된 표준 곡선과 비교되는 세포독성을 이용하는 사멸 분석을 위해 정제된 상청액을 사용하였다.
NG-605 및 NG-606으로부터 생성된 FAP BiTE의 양을 결정하기 위해, 세포독성 분석을 수행하였고, 이때 8,000개의 NHDF를 40,000개의 CD3+ T-세포 및 103 중의 1, 104 중의 1 및 105 중의 1로 희석시킨 DLD 바이러스 상청액과 함께 공동배양시켰다. 3333 내지 3.33x10-4 ng/㎕의 10배 연속 희석으로 FAP 또는 대조군 BiTE와 함께 NHDF 및 CD3+ T-세포를 인큐베이션시킴으로써 표준 곡선을 생성하였다. 처리 24시간 후에 상청액을 채취하고 나서, 세포독성을 LDH 분석에 의해 측정하였다. 바이러스 상청액의 세포독성을 재조합 BiTE 표준 곡선과 비교함으로써 발현된 BiTE의 양을 결정하였다. 결과(도 21)는 바이러스 NG-605 및 NG-606이 백만개의 DLD 세포당 각각 9.8 및 49.2㎍ FAP BiTE를 생성하였다는 것을 나타내었다.
NG-601 및 NG-602으로부터 생성된 EpCAM BiTE의 양을 결정하기 위해, 세포독성 분석을 수행하였고, 이때 8,000개의 DLD를 40,000개의 CD3+ T-세포 및 103 중의 1, 104 중의 1 및 105 중의 1로 희석시킨 DLD 바이러스 상청액과 함께 공동배양시켰다. 3333 내지 3.33x10-4 ng/㎕의 10배 연속 희석으로 EpCAM 또는 대조군 BiTE와 함께 DLD 및 CD3+ T-세포를 인큐베이션시킴으로써 표준 곡선을 생성하였다. 처리 24시간 후에 상청액을 채취하고 나서, 세포독성을 LDH 분석에 의해 측정하였다(도 22). 바이러스 상청액의 세포독성을 재조합 BiTE 표준 곡선과 비교함으로써 발현된 BiTE의 양을 결정하였다. 결과는 바이러스 NG-601 및 NG-602가 백만개의 DLD 세포당 각각 165 및 50.3㎍의 EpCAM BiTE를 생성하였다는 것을 나타내었다.
실시예 13
FAP 또는 대조군 BiTE를 암호화하는 것에 추가로, NG-607, NG-608, NG-609, NG-610 바이러스는 또한 형광 현미경 방법을 이용하여 감염된 세포의 시각화를 위해 적색 형광 단백질(red fluorescent protein: RFP) 이식유전자를 운반한다(서열번호 25 및 26, 표 4). 이하에 기재하는 방법을 이용하여 이들 바이러스의 기능성 활성을 특성규명하였다.
NG-607, NG-608, NG-609, NG-610으로부터의 이식유전자 발현의 확인
바이러스가 NG-607, NG-608, NG-609 및NG-610가 이들의 BiTE 이식유전자를 생성하는 능력을 Ad293 세포의 감염에 의해 평가하였다. Ad293 세포를 1x106개의 세포/웰로 6-웰 플레이트에서 플레이팅하였다. 플레이트를 24시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 세포 당 100 ppc로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 감염 48시간 후에, 플라크를 수은 램프로 조사하고 나서, 촬영하였다(도 23). 결과는 바이러스 NG-607, NG-608, NG-609 및 NG-610이 RFP 이식유전자를 발현시킨다는 것을 시사하였다.
실시예 14
다음 시리즈의 실험에서, 종양 세포 및 섬유아세포를 포함하는 표적 세포를 사멸시키는 EnAd 및 FAP 또는 대조군 BiTE 바이러스 NG-603, NG-604, NG-605, NG-606, NG-607, NG-608, NG-609, NG-610의 능력을 평가하였다.
첫 번째 연구에서, xCELLigence 기법을 이용하여 DLD 세포를 사멸시키는 EnAd의 능력을 평가하였다. DLD 세포를 1.2x104개의 세포/웰로 48-웰 E-플레이트에서 플레이팅하고, 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 100 EnAd ppc로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. XCELLigence를 사용하여 8일 인큐베이션 기간에 걸쳐 15분마다 표적 세포독성을 측정하였다. 결과(도 24A)는 시간 기간에 걸쳐 DLD 세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있다는 것을 시사한다.
유사한 실험에서, xCELLigence 기법을 이용하여 SKOV 세포를 사멸시키는 EnAd의 능력을 평가하였다. SKOV 세포를 1x104개의 세포/웰로 48-웰 E-플레이트에서 플레이팅하고, 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 100 EnAd ppc로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. xCELLigence를 사용하여 8일의 기간 동안 15분마다 표적 세포독성을 측정하였다. 결과(도 24B)는 이 시간틀에 걸쳐 SKOV 세포가 EnAd-매개 세포독성에 내성이 있다는 것을 시사한다.
유사한 실험에서, xCELLigence 기법을 이용하여 NHDF 세포를 사멸시키는 EnAd의 능력을 또한 평가하였다. NHDF 세포를 4x103개의 세포/웰로 48-웰 E-플레이트에서 플레이팅하고, 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 100 EnAd ppc로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. xCELLigence를 사용하여 A549 및 SKOV 세포와 동일한 시간 기간에 걸쳐 15분마다 표적 세포의 세포독성을 측정하였다. 결과(도 24C)는 EnAd가 관찰한 시간 기간에 NHDF 세포를 사멸시킬 수 없다는 것을 시사한다.
유사한 실험에서, xCELLigence를 이용하여 SKOV 종양 세포 및 CD3+ T-세포와의 공동배양물에서 NHDF 세포를 사멸시키는 NG-603, NG-604, NG-605, NG-606 및 EnAd의 능력을 평가하였다. NHDF 세포 및 SKOV 세포를 각각 4x103 및 1x103개의 세포/웰로 48-웰 E-플레이트에서 파종시켰다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 세포 당 100 ppc의 NG-603, NG-604, NG-605 또는 NG-606로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 2시간의 인큐베이션 후에, 37,500개의 CD3+ T-세포를 각각의 웰에 첨가하였다. xCELLigence를 사용하여 15분마다 표적 세포독성을 측정하였다. 결과(도 25A)는 FAP BiTE-발현 바이러스 NG-605 및 NG606(그러나 EnAd 또는 대조군 BiTE-발현 바이러스 NG-603 및 NG-604는 아님)이 BiTE 발현을 위해 사용되는 프로모터에 의존적인 역학으로(CMV 프로모터에 의해 더 빠르게) NHDF 세포의 용해를 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
유사한 실험에서, LDH 세포독성 분석을 이용하여 SKOV 및 CD3+ T-세포와의 공동배양물에서 NHDF 세포를 사멸시키는 NG-603, NG-604, NG-605, NG-606 및 EnAd의 능력을 평가하였다. NHDF 세포 및 SKOV 세포를 각각 8x103 및 2x103개의 세포/웰로 96-웰 U-바닥 플레이트에서 파종시키고, NG-603, NG-604, NG-605 또는 NG-606의 100 ppc의 EnAd로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 2시간의 인큐베이션 후에, 75,000개의 CD3+ T-세포를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 상청액을 처리 후 0, 24, 48 및 96시간에 채취하고 나서, 세포독성을 LDH 세포독성 분석에 의해 측정하였다. 결과(도 25B)는 FAP BiTE-발현 바이러스 NG-605 및 NG606(그러나 EnAd 또는 대조군 BiTE-발현 바이러스 NG-603 및 NG-604는 아님)이 BiTE 발현을 위해 사용되는 프로모터에 의존적인 역학으로 NHDF 세포의 용해를 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
상기 LDH 실험의 연장으로서, 세포를 또한 처리 후 0, 24, 48 및 96시간에 채취하고, CD45, CD69 및 CD25에 대한 항체로 염색하고 나서, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 결과(도 26)는 FAP BiTE-발현 바이러스 NG-605 및 NG-606(그러나 EnAd 또는 대조군 BiTE-발현 바이러스 NG-603 및 NG-604는 아님)이 BiTE 발현을 위해 사용되는 프로모터에 의존적인 역학으로 T-세포 활성화를 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
유사한 실험에서, FAP BiTE-매개 T-세포 활성화를 유도하는 FAP에 대한 의존도를 평가하였다. 96-웰 U-바닥 플레이트에서, 2x103개의 세포/웰 단독으로 또는 8x103개의 세포/웰로 NHDF 세포와 조합하여 SKOV 세포를 파종하였다. 바이러스 입자를 100 ppc로 각각의 웰에 첨가하고 나서, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 2시간 후에, 75,000개의 CD3+ T-세포를 첨가하고 나서, 플레이트를 추가로 인큐베이션시켰다. 감염 96-시간 후에, 세포를 채취하고 나서, CD45 및 CD25에 대해 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다(도 27A). 결과는 FAP BiTE-발현 바이러스 NG-605 및 NG-606만이 FAP-양성 NHDF 세포의 존재 하에 T-세포 활성화를 유도하였다는 것을 입증한다.
유사한 실험에서, NG-605 및 NG-606에서 프로모터(CMV 또는 바이러스 MLP/SA)-유래 BiTE 발현의 특이성을 추가로 연구하였다. 96-웰 U-바닥 플레이트에서, NHDF 세포를 4x103개의 세포/웰로 파종하였다. 세포당 100개의 바이러스 입자를 각각의 웰에 첨가하고 나서, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 2시간 후에, 40,000개의 CD3 세포를 첨가하고 나서, 플레이트를 추가로 인큐베이션시켰다. 감염 72시간 후에, 상청액을 채취하고 나서, 세포독성을 LDH 세포독성에 의해 측정하였다. 결과(도 27B)는 CMV-유도 바이러스 NG-605(그러나 SA-유도 NG-606은 아님)가 NHDF 세포 단독의 감염 시 NHDF 세포의 사멸을 매개할 수 있다는 것을 입증한다.
결과는 사용한 프로모터에 따라 역학 프로파일이 약간 상이하지만, NG-605와 NG-606이 둘 다 T 세포 활성화 및 표적 세포 용해를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
재조합 FAP BiTE, EnAd, NG-603 또는 NG-605에 의한 표적 세포의 바이러스 또는 T-세포 매개 용해를 관찰하기 위해 타임랩스 비디오를 얻었다. 셀트랙커(CellTracker) 오렌지 CMTMR 염료(라이프 테크, #C2927)를 이용하여 NHDF 세포를 염색하고 나서, 제조업자의 프로토콜에 따라 CD3+ T-세포를 셀트레이스 바이올렛(CellTrace Violet) 세포 증식 키트(라이프 테크, #C34557)로 염색하였다. 1.35x104개의 DLD 또는 SKOV 종양 세포와의 공동 배양물에서 7.5x103개의 세포/웰로 24-웰 플레이트에서 염색한 NHDF를 플레이팅하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 300ng/㎖ FAP BiTE로 처리하거나 또는 100 ppc의 EnAd, NG-603 및 NG-605로 감염시키거나 또는 비처리로 두었다. 2시간의 인큐베이션 후에, 1.5μM 셀이벤트(CellEvent) 카스파제 3-7 시약(라이프 테크, #C10423)에 추가로 100,000개의 염색한 CD3+ T-세포를 필요한 웰에 첨가하였다. 니콘 TE 2000-E 이클립스 도립 현미경 상에서 비디오를 얻었고, 96시간 동안 15분마다 영상을 포획하였다. 비디오로부터의 프레임을 도 28에 나타낸다. 결과는 재조합 FAP BiTE 및 NG-605(EnAd 또는 NG-603은 아님)가 NHDF 세포의 빠른 용해를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
유사한 실험에서, 셀트랙커 녹색 CMFDA 염료(라이프 테크, #C2925) 를 이용하여 NHDF 세포를 염색하고 나서, 제조업자의 프로토콜에 따라 CD3+ T-세포를 셀트레이스 바이올렛 세포 증식 키트(라이프 테크, #C34557)로 염색하였다. 1.35x104개의 DLD 또는 SKOV 종양 세포와의 공동 배양물에서 7.5x103개의 세포/웰로 24-웰 플레이트에서 염색한 NHDF를 플레이팅하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 100 ppc의 NG-607, NG-608, NG-609 또는 NG-610로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 2시간의 인큐베이션 후에, 100,000개의 염색한 CD3+ T-세포를 필요한 웰에 첨가하였다. 니콘 TE 2000-E 이클립스 도립 현미경 상에서 비디오를 얻었고, 96시간 동안 15분마다 영상을 포획하였다. 비디오로부터의 프레임을 도 29에 나타낸다. 결과는 모든 바이러스가 종양 세포 감염(RFP, 적색 형광, 양성)을 야기할 뿐만 아니라, NG-609 및 NG-610이 공동 배양된 NHDF 세포의 빠른 용해를 유도할 수 있었다는 것을 나타낸다.
실시예 15
이 시리즈의 실험에서, 종양 세포 및 섬유아세포를 포함하는 표적 세포를 사멸시키는 EnAd 및 EpCAM 또는 대조군 BiTE 바이러스 NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604 의 능력을 평가하였다.
EnAd, NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604에 의한 인간 T-세포 활성화 및 EpCAM-양성 표적 세포 용해의 특성규명
CD3+ T-세포의 존재 또는 부재 하에 DLD 종양 세포를 사멸시키는 EnAd 및 NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604의 능력을 xCELLigence 기법을 이용하여 평가하였다. DLD 세포를 1.2x104개의 세포/웰로 48-웰 E-플레이트에서 플레이팅하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 세포 당 100 ppc에서 EnAd로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 감염 2시간 후에, 75,000개의 CD3+ T-세포를 필요한 웰에 첨가하였다. XCELLigence를 사용하여 15분마다 표적 세포독성을 측정하였다. 결과(도 30)는 NG-601 및 NG-602가 T 세포-의존적 방식으로 상당히 더 빠른 DLD 세포독성을 야기한다는 것을 입증한다.
유사한 실험에서, CD3+ T-세포의 존재 또는 부재 하에 DLD 종양 세포를 사멸시키는 EnAd 및 NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604의 능력을 LDH 세포독성 분석을 이용하여 평가하였다. DLD 세포를 2x104개의 세포/웰로 96-웰 U-바닥 플레이트에서 플레이팅하고 나서, 100 ppc의 EnAd로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 감염 2시간 후에, 150,000개의 CD3+ T-세포를 필요한 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시키고 나서, 상청액을 채취하고, 감염 후 0, 24, 48 및 72시간에 LDH 세포독성 분석에 의해 분석하였다. 결과(도 31)는 NG-601 및 NG-602가 T 세포-의존적 방식으로 더 빠른 DLD 세포독성을 야기한다는 것을 입증한다.
상기 LDH 실험의 연장으로서, 세포를 또한 처리 후 0, 24, 48 및 96시간에 채취하고, CD45, CD69 및 CD25에 대한 항체로 염색하고 나서, CD3+ T-세포의 활성화 상태를 결정하기 위해 유세포 분석에 의해 분석하였다. 결과(도 32)는 EpCAM BiTE-발현 바이러스 NG-601 및 NG-602(그러나 EnAd 또는 대조군 BiTE-발현 바이러스 NG-603 및 NG-604는 아님)이 BiTE 발현을 위해 사용되는 프로모터에 의존적인 역학으로 T-세포 활성화를 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
다른 실험에서, CD3+ T-세포의 존재 또는 부재 하에 감염 다중도(MOI)를 달리한 DLD 종양 세포를 사멸시키는 NG-601의 능력을 xCELLigence를 이용하여 평가하였다. DLD 세포를 2x104개의 세포/웰로 48-웰 E-플레이트에서 플레이팅하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 0.001 내지 10에서 변하는 MOI에서 NG-601로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 감염 2시간 후에, 150,000개의 CD3+ T-세포를 필요한 웰에 첨가하였다. xCELLigence를 사용하여 15분마다 표적 세포독성을 측정하였다. 결과(도 33)는 NG-601이 0.001만큼 낮은 MOI에서 T 세포-의존적 방식으로 더 빠른 DLD 세포독성을 야기한다는 것을 입증한다.
유사한 실험에서, CD3+ T-세포의 존재 또는 부재 하에 SKOV 종양 세포를 사멸시키는 EnAd 및 NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604의 능력을 xCELLigence 기법을 이용하여 평가하였다. SKOV 세포를 1x104개의 세포/웰로 48-웰 E-플레이트에서 플레이팅하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 EnAd(100 ppc)로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 감염 2시간 후에, 50,000개의 CD3+ T-세포를 필요한 웰에 첨가하였다. xCELLigence를 사용하여 15분마다 표적 세포독성을 측정하였다. 결과(도 34)는 SKOV 세포가 이 연구의 시간틀에 걸쳐 EnAd-매개 세포독성에 대해 내성이 있지만, 그러나 NG-601 및 NG-602는 CD3+ T-세포의 존재 하에 SKOV 세포의 빠른 용해를 유도할 수 있었다는 것을 시사한다.
유사한 실험에서, CD3+ T-세포의 존재 또는 부재 하에 SKOV 세포를 사멸시키는 EnAd 및 NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604의 능력을 LDH 세포독성 분석을 이용하여 평가하였다. SKOV 세포를 2x104개의 세포/웰로 96-웰 U-바닥 플레이트에서 플레이팅하고 나서, EnAd(100 ppc)로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 감염 2시간 후에, 150,000개의 CD3+ T-세포를 필요한 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시키고 나서, 상청액을 채취하고, 감염 후 0, 24, 48 및 72시간에 LDH 세포독성 분석에 의해 분석하였다. 결과(도 35)는 이전의 데이터와 일치되며, SKOV 세포가 이 시간틀에 걸쳐 EnAd-매개 세포독성에 대해 내성이 있지만, 그러나 NG-601 및 NG-602는 CD3+ T-세포의 존재 하에 SKOV 세포의 빠른 용해를 유도할 수 있다는 것을 시사한다.
상기 LDH 실험의 연장으로서, 세포를 또한 처리 후 0, 24, 48 및 96시간에 채취하고, CD45, CD69 및 CD25에 대한 항체로 염색하고 나서, CD3+ T-세포의 활성화 상태를 결정하기 위해 유세포 분석에 의해 분석하였다(도 36). 결과는 EpCAM BiTE-발현 바이러스 NG-601 및 NG-602(그러나 EnAd 또는 대조군 BiTE-발현 바이러스 NG-603 및 NG-604는 아님)이 BiTE 발현을 위해 사용되는 프로모터에 의존적인 역학으로 T-세포 활성화를 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
유사한 실험에서, CD3+ EpCAM-음성 1차 복수 샘플로부터 암환자-유래 CD3+ T-세포를 활성화시키는 EnAd 및 NG-601, NG-602, NG-603 및 NG-604의 능력을 평가하였다. 96-웰 U-바닥 플레이트에서 웰 당 1x104개의 세포로 EpCAM-양성 DLD 세포를 플레이팅하고, 100,000개의 복수 세포(수용하였을 때 변하지 않음)와 함께 공동배양시켰다. 세포를 100 ppc로 바이러스 입자로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션 후에, 총 세포 집단을 채취하고 나서, CD3+ T-세포 상의 CD25의 발현 수준을 유세포 분석에 의해 결정하였다. 결과(도 37)는 EpCAM BiTE-발현 바이러스 NG-601 및 NG-602(그러나 EnAd 또는 대조군 BiTE-발현 바이러스 NG-603 및 NG-604는 아님)이 환자-유래 CD3+ T-세포의 T-세포 활성화를 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
결과는 사용한 프로모터에 따라 역학 프로파일이 약간 상이하지만, EpCAM BiTE 바이러스 NG-601과 NG-602가 둘 다 T 세포 활성화 및 표적 세포 용해를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
재조합 EpCAM BiTE, EnAd, NG-601 또는 NG-603에 의한 표적 세포의 바이러스 또는 T-세포 매개 용해를 관찰하기 위해 타임랩스 비디오를 얻었다. 셀트랙커(CellTracker) 오렌지 CMTMR 염료(라이프 테크(Life Tech), #C2927)를 이용하여 NHDF 세포를 염색하고 나서, 제조업자의 프로토콜에 따라 CD3+ T-세포를 셀트레이스 바이올렛(CellTrace Violet) 세포 증식 키트(라이프 테크, #C34557)로 염색하였다. 1.35x104개의 DLD 또는 SKOV 종양 세포와의 공동 배양물에서 7.5x103개의 세포/웰로 24-웰 플레이트에서 염색한 NHDF를 플레이팅하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 300ng/㎖ EpCAM BiTE로 처리하거나 또는 100 ppc에서 EnAd, NG-601 또는 NG-603으로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 2시간의 인큐베이션 후에, 1.5μM 셀이벤트(CellEvent) 카스파제 3-7 시약(라이프 테크, #C10423)에 추가로 100,000개의 염색한 CD3+ T-세포를 필요한 웰에 첨가하였다. 니콘 TE 2000-E 이클립스 도립 현미경 상에서 비디오를 얻었고, 96시간 동안 15분마다 영상을 포획하였다. 비디오로부터의 프레임을 도 38에 나타낸다. 결과는 재조합 EpCAM BiTE 및 NG-605가 DLD와 SKOV 표적 세포 둘 다의 빠른 용해를 야기하지만, NHDF는 영향받지 않고 남아있었다는 것을 나타낸다.
실시예 16
본 실시예에서, EnAd, NG-603, NG-604, NG-605 및 NG-606에 의해 암환자로부터의 FAP+ 1차 악성종양 복수로부터 자가 종양-관련 림프구의 활성화를 평가하였다. 추가 분석에 적합한 것으로 고려되는 환자 샘플은 CD3+ T-세포 및 FAP+ 세포를 함유하는 것이었다.
첫 번째 실험에서, 환자로부터의 비정제(따라서 수용하였을 때로부터 변하지 않음) 복수 세포를 100% 복수액에서 U-바닥 96-웰 플레이트의 웰당 250,000개의 세포로 파종하였다. 세포를 100 ppc에서 바이러스로 감염시켰고, 비처리 웰은 음성 대조군으로서 작용하였다. EnAd-CMV-GFP 및 EnAd-SA-GFP는 또한 도 39에 나타내는 현미경 사진에 의해 각각 감염 및 후기 단계 바이러스 유전자 발현을 결정하기 위한 리포터로서 실험에 포함시켰다. 37℃에서 5일 동안 인큐베이션 후에, 총 세포 집단을 채취하고 나서, 채취하고, CD3+ T-세포 상의 CD25의 발현 수준(도 40A)을 유세포 분석에 의해 결정하였다. 정밀도 계수 비드를 이용하여 웰 당 총 세포 수를 결정하였다. 결과는 FAP BiTE 바이러스 NG-605 및 NG-606이 종양-관련 림프구의 T-세포 활성화에서 상당한 증가를 초래한다는 것을 입증한다.
상기 실험의 연장으로서, 복제 웰을 채취하고 나서, 내인성 FAP + 세포의 수를 유세포 분석에 의해 결정하였다. 정밀도 계수 비드를 이용하여 웰 당 총 세포 수를 결정하였다. 결과(도 40B)는 NG-605 및 NG-606이 복수 샘플에서 자가 FAP-발현 세포 수의 상당한 감소를 초래하였다는 것을 나타내는데, 이는 일부 FAP+ 세포가 활성화된 T-세포에 의해 사멸되었다는 것을 시사한다.
두 번째 실험에서, 암환자로부터의 비정제(따라서 수용하였을 때로부터 변하지 않음) 복수 세포를 100% 복수액에서 또는 1% 인간 혈청으로 보충한 배지에서 U-바닥 96-웰 플레이트의 웰당 250,000개의 세포로 파종하였다. 세포를 100 ppc에서 바이러스로 감염시켰고, 비처리 웰은 음성 대조군으로서 작용하였다. EnAd-CMV-GFP 및 EnAd-SA-GFP는 또한 도 41에 나타내는 현미경 사진에 의해 각각 감염 및 후기 단계 바이러스 유전자 발현을 결정하기 위한 리포터로서 포함시켰다. 37℃에서 5일 동안 인큐베이션 후에, 총 세포 집단을 채취하고 나서, CD3+ T-세포의 수(도 42) 및 CD3+ T-세포 상의 CD25의 발현 수준(도 43)을 유세포 분석에 의해 결정하였다. 정밀도 계수 비드를 이용하여 웰 당 총 세포 수를 결정하였다. 결과는 이 환자에 대해 재조합 FAP BiTE 및 NG-605(그러나 NG-606은 아님)가 배지에서 종양-관련 림프구의 T-세포 활성화의 상당한 증가를 초래하였다는 것을 입증한다. 바이러스 중 어떤 것도 복수액에서 활성화를 야기하지 않았다.
상기 실험의 연장으로서, 복제 웰을 채취하고 나서, FAP + 세포의 수를 유세포 분석에 의해 결정하였다(도 44). 정밀도 계수 비드를 이용하여 웰 당 총 세포 수를 결정하였다. 결과는 재조합 FAP BiTE 및 NG-605(그러나 NG-606은 아님)가 배지에서 자가 FAP-발현 세포 수의 상당한 감소를 초래하였다는 것을 입증한다. 바이러스 중 어떤 것도 복수액에서 FAP+ 세포의 감소를 야기하지 않았다.
실시예 17 - 물질 및 방법
세포주
HEK293A, DLD, SKOV3, MCF7, A431, A549 및 PC3 세포(ATCC)를 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM, 영국에 소재한 시그마-알드리치) 및 로즈웰 파크 메모리얼 연구소(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI-1640, 영국에 소재한 시그마-알드리치)의 CHO 세포(ATCC)에서 배양시켰다. 성장 배지를 10% (v/v) 소태아 혈청(FBS, 영국에 소재한 깁코(Gibco)) 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신(10㎎/㎖, 시그마-알드리치)로 보충하고 나서, 세포를 습한 분위기에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다. 바이러스 감염 및 바이러스 플라스미드 형질감염을 위해, 2% FBS로 보충한 DMEM에서 세포를 유지시켰다. 재조합 BiTE 플라스미드 형질감염을 위해, 세포를 FBS 없이 DMEM에서 유지시켰다. 표적 세포주의 EpCAM 발현을 유세포 분석에 의해 결정하였다.
EpCAM-발현 안정 세포주의 생성
EpCAM 유전자(ID: 4072)의 단백질 서열을 NCBI 데이터베이스 및 옥스퍼드 제네틱스 엘티디(영국 옥스퍼드에 소재)에 의해 합성한 DNA로부터 얻었다. pSF-렌티-EpCAM 벡터를 생성하는 표준 클로닝 기법에 의해 EpCAM 유전자를 pSF-렌티 벡터 내로 클로닝시켰다. 렌티pSF-CMVHIV-Gag-Pol, pSF-CMV-VSV-G, pSF-CMV-HIV-Rev(옥스퍼드 제네틱스 엘티디)와 함께 렌티바이러스 EpCAM 발현 벡터를 이용하는 리포펙타민 2000을 사용하여 HEK293T 세포를 형질감염시켰다. 렌티바이러스를 함유하는 상청액을 48시간 후에 채취하고 나서, 폴리브렌(8㎍/㎖)과 혼합하였다. 렌티바이러스/폴리브렌 혼합물을 CHO 세포에 첨가하고 나서, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 제4일에, 상청액을 7.5㎍/㎖의 퓨로마이신을 함유하는 배지로 교환하였다. 이어서, 안정한 변이체를 클론으로 선택하고 나서, 모 세포주 또는 안정한-형질감염 변이체의 EpCAM 발현을 EpCAM 또는 동위원소 대조군 항체를 이용하는 항체 염색에 의해 결정하고 나서, 유세포 분석으로 분석하였다. 양성 클론을 확장시키고 나서, 추가 실험에서 사용하였다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 T 세포 단리의 제조
영국 NHS 혈액 및 이식(영국 옥스퍼드에 소재)으로부터 얻은 전혈 백혈구 원뿔로부터 밀도 구배 원심분리(보이엄, 1968)에 의해 PBMC를 단리시켰다. 혈액을 PBS에 의해 1:2로 희석시키고 나서, 피콜(1,079g/㎖, 피콜-플라크 플러스, GE 헬스케어) 상에서 층상화한 후에 400g에서 30분 동안 22℃에서 낮은 감속으로 원심분리시켰다. 원심분리 후에, 파스퇴르 피펫을 이용하여 PBMC를 수집하고 나서, PBS로 2회 세척하고(10분 동안 실온에서 300g) 10% FBS로 보충한 RPMI-1640 배지에서 재현탁시켰다. PBMC로부터 CD3-양성 T-세포의 추출을 위해, 제조업자의 프로토콜에 따라 Pan T 세포 단리 키트(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), #130-096-535)를 이용하여 비-CD3 세포를 고갈시켰다. CD4- 및 CD8-양성 T-세포의 추가적인 단리를 위해, CD3 T-세포는 CD4+ 마이크로비드(밀테니 바이오텍, #130-045-101)를 이용하는 정제의 다른 라운드를 겪었다.
1차 복수 및 흉수의 가공
난소, 췌장, 유방 및 폐를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 진행된 암종의 다중 적응증을 갖는 환자로부터 사전 동의서를 받은 후에 1차 인간 악성 복수 및 흉수 샘플을 처칠힐 병원, 옥스퍼드 유니버시티 병원(영국 옥스퍼드에 소재)으로부터 수용하였다. 이 작업은 병리조직학 연구를 위한 옥스퍼드 센터의 연구 윤리 위원회에 의해 승인받았다. 수용 시, 세포 및 유체 분획을 분리시키고 나서, 유체를 즉시 사용하거나 또는 장래의 분석을 위해 -20℃에서 분취액을 저장하였다. 제조업자의 설명서에 따라 적혈구 용해 완충제(영국에 소재한 로슈)를 이용하여 세포 분획을 처리하였다. 트립판 블루 염색에 의해 세포수 및 생존도를 결정하였다. 각각의 샘플에 존재하는 세포 유형을 EpCAM, EGFR, FAP, CD45, CD11b, CD56, CD3, CD4, CD8, PD1 및 CTLA4에 대한 항체 염색에 의해 결정하고 나서, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 생체외 T-세포 활성화 및 표적 세포 용해 실험을 위해, 신선한 세포 및 유체를 사용하였다. 일부 경우에, 10% FBS로 보충한 DMEM에서 부착 세포를 계대시키고, 이후의 용도를 위해 확장시켰다.
BiTE 조작 및 생성
가요성 GS 링커를 이용하여 상이한 특이성의 두 scFv를 결합시킴으로써 BiTE를 생성하였다. 링커에 의해 모 단클론성 항체로부터 VH 및 VL 도메인을 결합함으로써 각각의 scFv를 생성한다. 각각의 BiTE는 포유류 분비를 위해 면역글로불린 경쇄(Ig) N-말단의 신호 서열 및 검출 및 정제를 위해 C-말단의 데카히스티딘 친화도 태그를 가졌다. 표준 DNA 클로닝 기법에 의해 BiTE를 조작하고 나서, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터-유도 구성적 단백질 발현 및 분비를 위해 단백질 발현 벡터(pSFCMV- Amp) 내로 삽입하였다. 다음의 조건 하에서 폴리에틸렌이민(PEI, 선형, MW 25000, 미국 폴리사이언시즈)을 이용하여 pSF-CMV-EpCAMBiTE 또는 pSF-CMV-대조군BiTE 플라스미드 DNA를 HEK293A 세포 내로 형질감염시키고, 55㎍의 플라스미드 DNA:110㎍ PEI(DNA:PEI 비는 1:2(w/w))를 세포에 첨가하고 나서, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 신선한 무혈청 DMEM으로 대체하고 나서, 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 형질감염 효율을 보장하기 위해 세포를 pSF-CMV-GFP와 병행하여 형질감염시켰다. 분비된 단백질을 채취하기 위해, 형질감염된 세포의 상청액을 수집하고, 350 g, 4℃에서 5분 동안 원심분리시켜 세포 성분을 제거하였다. 10,000 MWCO 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-15 원심분리 필터 유닛(밀리포어(Millipore))에 상청액을 전달하였다. 4750g 및 4℃에서 원심분리 후에, 통과액을 이용하여 체류액의 용적을 조절하여 50-배 더 높은 농도를 얻었다. 농축된 단백질의 분취액을 -80℃에서 저장하였다.
BiTE-발현 에나데노툭시레브의 생성
깁슨 조립 기법을 이용하여 염기성 EnAd 플라스미드 pEnAd2.4 내로 EpCAM BiTE 또는 대조군 BiTE를 암호화하는 이식유전자 카세트의 직접 삽입에 의해 플라스미드 pEnAd2.4-CMV-EpCAMBiTE, pEnAd2.4-SA-EpCAMBiTE, pEnAd2.4-CMV-대조군BiTE, pEnAd2.4-SA-대조군BiTE를 생성하였다. 이식유전자 카세트는 5' 짧은 스플라이스 수용자 서열 또는 외인성 CMV 프로모터 다음에 하류의 EpCAM, FAP 또는 대조군 BiTE cDNA 서열 및 3' 폴리아데닐화 서열을 함유하였다. 삽입된 이식유전자 카세트의 개략도를 도 18에 나타낸다. DNA 서열분석에 의해 플라스미드의 정확한 작제를 확인하였다. HEK293A 세포에서 형질감염 전에 효소 AscI를 이용하는 제한 분해에 의해 플라스미드 EnAd2.4-CMV-EpCAMBiTE, pEnAd2.4-SA-EpCAMBiTE, pEnAd2.4-CMV-대조군BiTE 및 pEnAd2.4-SA-대조군BiTE를 선형화시켰다. 세포 단일층에서 세포 변성 효과의 관찰에 의해 바이러스의 생성을 모니터링하였다. 일단 광대한 CPE가 관찰되면, 3회의 냉동-해동 주기에 의해 HEK293A 세포로부터 바이러스를 채취하였다. 채취한 용해물의 연속 희석에 의해 단일 바이러스 클론을 선택하고, HEK293A 세포를 재감염시키고 나서, 단일 플라크를 함유하는 웰을 채취하였다. 바이러스 저장액을 증폭시키기 위해 일단 감염이 완전한 CPE에 도달되면 HEK293A 세포의 연속 감염을 수행하였다. 일단 강한 바이러스 저장액이 증폭되면, EnAd-CMVEpCAMBiTE, EnAd-SA-EpCAMBiTE, EnAd-CMV-대조군BiTE, EnAd-SA-대조군BiTE 바이러스 저장액을 생성하기 위한 2배 염화세슘 밴딩에 의해 바이러스를 정제하였다. 제조업자의 설명서에 따라 TCID50 및 피코그린 분석(라이프 테크놀로지즈)에 의해 이들 저장액을 적정하였다.
상청액의 제조
BiTE-매개 사이토카인 방출을 평가하기 위해, 96-웰 편평 바닥 플레이트 단독으로 또는 2ng/㎕ EpCAM 또는 대조군 BiTE와 함께 DLD 세포(20,000개)를 100,000개의 CD3+ T-세포와 함께 플레이팅시켰다. 37℃ 및 5% CO2에서 48시간의 인큐베이션 후에, 상청액을 수집하고 나서, 세포 성분을 원심분리에 의해 제거하고, 분취액을 -20℃에서 저장하였다. 재조합 바이러스로부터의 BiTE 이식유전자 발현을 평가하기 위해, HEK293A(1e6) 또는 DLD 세포(1.2e6)를 100vp/세포에서 EnAd-CMV-EpCAMBiTE, EnAd-SA-EpCAMBiTE, EnAd-CMV대조군BiTE, EnAd-SA-대조군BiTE 또는 EnAd에서 감염시켰다. 세포변성효과(CPE)가 진행되는 시점인 72시간 동안 세포를 배양시켰다. 상청액을 수집ㅈ하고 나서, 5분 동안, 300g으로 원심분리시켜 세포 파편을 제거하고, 장래의 분석을 위해 -20℃에서 저장하였다.
면역블롯팅
플라스미드 형질감염으로부터 생성된 재조합 BiTE의 농도를 측정하기 위해 도트 블롯을 사용하였다. 각각의 BiTE의 그리고 단백질 표준(10 x His-태그(C말단) 인간 카텝신 D, 바이오레전드, #556704)의 2배 연속 희석물을 제조하였다. 100㎍/㎖의 BiTE 농도를 나타내기 위해 단백질 표준의 몰 농도를 조절하였다. 2㎕의 각각의 샘플 및 단백질 표준을 나이트로셀룰로스 막 상에 직접 적용하였다. 막을 공기건조시키고 나서, C-말단으로 His-태그된 단백질의 검출을 위해 α-6xHis(C-말단) 항체(1:5000, 클론 3D5, 영국에 소재한 인비트로젠, #46- 0693)를 이용하여 프로빙한 후에, 세척 및 항마우스 2차 항체(1:10000, 다코, #P0161)와 함께 인큐베이션이 이어지고, 제조업자의 설명서에 따라 슈퍼시그널 웨스트 듀라 장기간 기질(써모 피셔, #34075)의 적용에 의해 검출하였다. 바이러스-감염 HEK293A 세포의 상청액을 BiTE 발현에 대해 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 상청액을 SDS-PAGE에 의해 분획화하고 나서, 제조업자의 프로토콜(바이오-라드)에 따라 나이트로셀룰로스 막에 옮겼다. 막을 상기의 도트 블롯 프로토콜과 동일하게 추가로 처리하였다.
효소-결합 면역 흡착 분석(ELISA)
EpCAM 결합을 평가하기 위해, 인간 EpCAM/TROP-1 단백질(50ng/웰, 시노 바이올로지컬 인코포레이티드, #10694-H02H-50)을 이용하여 4℃에서 밤새 코팅시킴으로써 ELISA 플레이트를 제조하였다. 플레이트를 1시간 동안 주위 온도에서 5% BSA로 차단시킨 후에, 희석된 EpCAM BiTE-, 대조군 BiTE- 및 빈 pSF-CMV 벡터-형질감염 HEK293A 상청액(2시간, 실온)과 함께 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBS-T를 이용하여 3회 세척하고, 후속적으로 모든 장래의 결합 단계 후에 세척하였다. 플레이트를 항-His(C-말단) 항체(1:5000, 클론 3D5, #46-0693, 영국에 소재한 인비트로젠)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후에, HRP 접합 항-마우스-Fc(PBS/5% 우유에서 1:1000, 다코)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 3.3.5.5'-테트라메틸에틸렌다이아민(TMB, 써모-피셔)을 이용하여 HRP 검출을 수행하였고, 반응을 종결시키기 위해 중단 용액을 사용하였다. 왈락(Wallac) 1420 플레이트 판독기(퍼킨 엘머(Perkin Elmer)) 상에서 450㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
유세포분석
유세포분석을 FACSCalibur 유세포분석기(BD 바이오사이언시즈) 상에서 수행하고 나서, FlowJo v10.0.7r2 소프트웨어(미국에 소재한 트리스타 인코포레이티드(TreeStar Inc.))를 이용하여 데이터를 처리하였다. 상이한 세포 집단의 분류를 위해, CD45(HI30, 바이오레전드), CD11b(ICRF44, 바이오레전드), EpCAM(9C4, 바이오레전드) 및 FAP(427819, 알앤디 시스템즈)에 특이적인 항체를 사용하였다. T-세포 집단의 분석을 위해, 상이한 형광단에 결합된 다음의 항체 클론을 사용하였다: CD69(FN50, 바이오레전드), CD25(BC96, 바이오레전드), IFNγ(4S.B3, 바이오레전드), αCD107a 항체(H4A3, 바이오레전드), CD3(HIT3a, 바이오레전드), CD4(OKT4, 바이오레전드), CD8a(HIT8a, 바이오레전드), PD1(H4A3, 바이오레전드). 각각의 경우에, 절절한 아이소타입 대조군 항체를 사용하였다.
인간 T-세포 활성화의 특성규명
CD69 및 CD25 발현 수준
T-세포 활성화를 유도하는 재조합 EpCAM BiTE 또는 EpCAM BiTE 바이러스의 능력을 CD69 및 CD25의 표면 발현에 의해 평가하였다. 배지 단독, EpCAM 또는 대조군 BiTE 단백질(2ng/㎕) 또는 재조합 바이러스(100vp/세포)의 존재 하에서 PBMC 또는 복수 샘플로부터의 인간 CD3 세포(96-웰 편평바닥 플레이트에서 75,000개의 세포/웰)를 단독으로 또는 DLD, SKOV, CHO, CHOEpCAM 또는 복수 표적 세포(15,000)와 함께 배양시켰다. 일부 경우에, 2.5㎍/㎖의 최종 농도로 항-PD1(인비보겐, #hpd1ni-mab7) 항체를 첨가하였다. CD3 세포를 T 세포 활성화를 위한 양성 대조군으로서 CD3/CD28 다이아비즈(Dynabeads)(써모 피셔, #11131D)와 함께 인큐베이션시켰다. 달리 언급되지 않는 한, 세포를 24시간 동안 37℃에서 배지 배양시키고, 후속적으로 무 효소 세포 해리 완충제(깁코, #13151014)로 채취하였다. 총 세포를 CD69, CD25, CD3, CD4 또는 CD8의 표면 발현에 대해 항체로 염색하였고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. RPMI-1640 또는 악성종양 복수 샘플로부터 단리시킨 유체에서 플레이트-고정된 CD3 항체(7.5㎍/㎖, HIT3a, 바이오레전드, #300313)와 함께 인큐베이션시킴으로써 CD3-정제된 PBMC(100,000개)를 다클론성으로 활성화시킴으로써 T-세포 활성화(CD69, CD25) 상의 복수액의 효과를 연구하였다.
IFNγ발현
DLD 세포(200,000개의 CD3 세포/웰, 편평-바닥 96 웰 플레이트에서 40,000개의 DLD 세포/웰) 및 2ng/㎕ 재조합 EpCAM 또는 대조군 BiTE와 함께 6시간 동안 T-세포의 공동 배양시킴으로써 T-세포 활성을 유도하는 EpCAM BiTE의 능력을 IFNγ발현에 의해 평가하였다. 양성 대조군으로서, T 세포를 가용성 PMA/이오노마이신 세포 활성화 칵테일(바이오레전드, #423301)로 자극하였다. CD3+ T-세포를 채취한 시점인 채취 5시간 전에 브레펠딘 A(골지플러그(GolgiPlug), BD 바이오사이언시즈)를 배양 배지에 첨가하고 나서, IFNγ발현에 대해 세포내로 염색하고 유세포 분석에 의해 분석하였다.
T 세포 증식
T 세포 증식을 연구하기 위해, 100,000개의 CFSE-표지된(셀트레이스 CFSE 키트, 인비트로젠, #C34554) CD3+ T 세포를 2ng/㎕ EpCAM 또는 대조군 BiTE와 함께 96 웰 플레이트 형식에서 20,000개의 DLD 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 공동배양 5일 후에, 세포를 CD3, CD4 또는 CD8에 대해 염색하고 나서, 살아있는 CD3+ T-세포의 CFSE 형광을 유세포 분석에 의해 측정하였으며, 정확성 계수 비드(5000개/웰, 바이오레전드, #424902)를 이용하여 총 세포 수를 정규화하였다. 형광 데이터를 분석하고 나서, FlowJo v7.6.5 소프트웨어의 증식 기능을 이용하여 모델링하였다. 데이터를 증식 주기(분할된%)에 유입된 본래 세포의 백분율 또는 본래 집단에서 세포가 겪는 세포 분할의 평균 수로서 제시하였다(분할 지수).
CD107a 탈과립화
DLD 세포(15,000개의 세포/웰)를 배지 단독 또는 2ng/㎕의 대조군 또는 EpCAM BiTE의 존재 하에서 편평-바닥 96 웰 플레이트에서 75,000개의 CD3+ T-세포와 함께 공동 배양시켰다. αCD107a 또는 아이소타입 대조군 항체를 배양 배지에 직접 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 1시간의 인큐베이션 후에 모네신(골지스탑(GolgiStop), BD 바이오사이언시즈)를 첨가한 다음 5시간의 추가 인큐베이션이 이어졌다. 후속적으로 세포를 채취하고 나서, CD3, CD4 또는 CD8에 대해 염색하고, 유세포 분석으로 분석하였다.
사이토카인 방출
제조업자의 설명서에 따라 레전드플렉스(LEGENDplex) 인간 T 헬퍼 사이토카인 패널(바이오레전드, #740001) 및 유세포 분석을 이용하여 DLD/PBMC 또는 흉수 세포의 배양물로부터 채취한 상청액 내의 사이토카인을 정량화하였다. 분석에서 유도한 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IFNγ 및 TNFα이다.
시험관내 표적 세포의 세포독성 분석
재조합 BiTE 또는 바이러스에 의해 매기되는 표적 세포 세포독성을 LDH 방출 또는 MTS 분석에 의해 평가하였다. 표적 세포(DLD, SKOV, HT-29, A431, A549, PC3, CHO, CHO-EpCAM)를 배지 단독, 희석된 상청액 또는 바이러스(100vp/세포)의 존재 하에 편평-바닥 96 웰 플레이트에서 CD3, CD4 또는 CD8 T-세포(E:T 5:1)와 함께 공동 배양시켰다. 24시간의 공동 배양 후에(달리 언급되지 않는 한), 상청액 및 세포를 채취하고 나서, 세포독성을 제조업자의 설명서에 따라 LDH 분석(사이토톡스(CytoTox) 96 비-방사성 세포독성 분석, 프로메가, #G1780) 또는 MTS 생존도 분석(셀타이터(CellTiter) 96 세포 증식 분석, 프로메가, #G3580)에 의해 결정하였다. 재조합 BiTE을 이용하여 생성된 표준 곡선과 희석된 바이러스 상청액에 의해 유도된 세포독성을 비교함으로써 바이러스-감염 DLD 세포로부터 생성된 BiTE의 양을 결정하였다.
바이러스의 종양 용해성 활성을 평가하기 위해, DLD 세포를 96-웰 플레이트(25,000개의 세포/웰)에서 18시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 파종시킨 후에, 증가된 vp/세포(5-배 연속 희석, 100 내지 5.12e-5 vp/세포)로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. MTS 생존도 분석에 의해 제5일에 DLD 세포독성을 측정하였다. 용량 반응 곡선을 적합화하고 나서, 프리즘 7 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어) 내로 통합된 4모수 비선형 적합 모델을 이용하여 IC50을 결정하였다. xCELLigence RTCA DP 테크놀로지(아세아 바이오사이언시즈(Acea Biosciences))를 이용하여 세포 생존도를 실시간으로 모니터링하였다. DLD, SKOV3 또는 MCF7 세포를 12,000개의 세포/웰로 48-웰 E-플레이트에서 플레이팅하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 BiTE(2ng/㎕)로 처리하거나 또는 바이러스(100vp/세포)로 감염시키거나 또는 비처리로 두었다. 감염 2시간 후에, 75,000개의 CD3+ T-세포를 필요한 웰에 첨가하였다. 160시간까지의 지속기간 동안 15분마다 세포 임피던스를 측정하였다. 생체외 세포독성 분석을 위해, 복수 또는 흉수 샘플로부터의 비정제 세포를 복수액에서 재현탁시키고 나서, 편평 바닥 96-웰 플레이트에서 플레이팅하였다(1.5e5/웰). 언급된 지속기간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션 후에, 상청액을 LDH 분석에 의해 분석하거나 또는 총 세포를 세포-해리 완충제에 의해 채취하고, CD3, CD25 및 EpCAM에 대해 염색하고 나서, 유세포 분석에 의해 분석하였다. PD1 차단 실험을 위해, 항-PD1 항체(2.5㎍/㎖, 인비보겐, #hpd1ni-mab7) 항체를 포함시켰다.
바이러스 게놈 복제 및 qPCR
100vp/세포에 의한 감염 전에 24-웰 플레이트(150,000개의 세포/웰)에서 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서DLD 세포를 파종함으로써 EnAd-CMV-EpCAMBiTE, EnAd-SA-EpCAMBiTE, EnAd-CMV-대조군BiTE, EnAd-SA대조군BiTE 또는 EnAd가 그들의 게놈을 복제하는 능력을 분석하였다. 감염 후 24 및 72시간에 웰을 채취하고 나서, 제조업자의 프로토콜에 따라 PureLink 게놈 DNA 미니 키트(인비트로젠, #K182001)를 이용하여 DNA를 정제하였다. 특정 프라이머-프루브 세트를 이용하여 EnAd 헥손에 대해 총 바이러스 게놈을 qPCR로 정량화하였다(프라이머: TACATGCACATCGCCGGA/CGGGCGAACTGCACCA, 프로브: CCGGACTCAGGTACTCCGAAGCATCCT).
현미경 관찰
제이스 악시오버트(Zeiss Axiovert) 25 현미경 상에서 명시야 및 형광 이미지를 포획하였다. EnAd 또는 EnAd-CMVEpCAMBiTE에 의한 표적 세포의 바이러스 또는 T-세포 매개 용해를 관찰하기 위해 타임랩스 비디오를 얻었다. 비감염 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 셀트랙커 오렌지 CMTMR 염료(라이프 테크놀로지즈, #C2927)를 이용하여 NHDF 세포를 염색하고 나서, 제조업자의 프로토콜에 따라 CD3+ 세포를 셀트레이스 바이올렛 세포 증식 키트(라이프 테크놀로지즈, #C34557)로 염색하였다. 공동 배양물 SKOV3에서 13,500개의 세포/웰로 염색한 NHDF를 24웰 플레이트에서 7,500개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 300ng/㎖ EpCAM BiTE로 처리하거나 또는 EnAd 또는 EnAd2.4-CMV-EpCAMBiTE의 100vp/세포로 감염시키거나 또는 비처리로 두었다. 2시간의 인큐베이션 후에, 1.5μM 셀이벤트(CellEvent) 카스파제 3-7 시약(라이프 테크, #C10423)에 추가로 100,000개의 염색한 CD3+ T-세포를 필요한 웰에 첨가하였다. 96시간의 기간에 걸쳐 15분 간격으로 니콘 TE 2000-E 이클립스(Eclipse) 도립 현미경(10× 광학 대물렌즈)으로 영상을 포획하였다. ImageJ 소프트웨어를 이용하여 타임랩스 비디오(12 프레임/초)를 생성하였다.
통계학
비교되는 2회 초과의 실험 조건의 모든 경우에, 터키 사후 검정과 함께 일원 ANOVA 검정을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 모든 데이터를 평균 ± SD로서 제시한다. 사용한 유의 수준은 P = 0.01 - 0.05(*), 0.001 - 0.01 (**), 0.0001-0.001 (***)이었다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 시험관내 실험을 3회 중복하여 수행하였다.
실시예 18 - BiTE 표적화 EpCAM의 생성 및 생산
CD3ε 및 EpCAM에 특이적인 2개의 scFv를 가요성 글리신-세린(GS) 링커와 결합함으로써 BiTE 표적화 EpCAM을 조작하였다. CD3ε 및 부적절한 항원(보르데텔라 퍼투시스의 섬유성 헤마글루티닌 부착소(FHA))을 인식하는 대조군 BiTE를 또한 생성하였다. BiTE를 둘 다 포유류 분비에 대해 N-말단의 신호서열 및 검출 및 정제를 위해 C-말단의 데카히스티딘 친화도 태그를 함유하도록 조작하였다(도 45a). 재조합 BiTE의 기능성을 특성규명하기 위해, CMV 급초기 프로모터(각각 pSF-CMV-EpCAMBiTE 및 pSF-CMV-대조군BiTE)의 전사 제어 하에서 그들을 발현 벡터 내로 클로닝시켰다.
부착 HEK293 세포(HEK293A)를 발현 벡터로 형질감염시키고 나서, 상청액을 채취하고, 추가 분석을 위해 50배 농축시켰다. 생성된 BiTE의 양을 추정하기 위해, 샘플을 연속 희석시키고, 표준으로서 데카히스티딘-태그된 카텝신 D를 이용하는 도트 블롯에서 항-His을 이용하여 평가하였다. 이런 방법으로, (1.8e7 HEK293A 세포의) 형질감염 후 48시간에 상청액 내로 생성되는 BiTE의 수준이 대략 20㎍/㎖이 된다는 것을 추정하는 것이 가능하다(도 46A). 재조합 EpCAM 단백질에 대한 EpCAM BiTE의 특이적 결합(대조군 BiTE는 아님)은 ELISA에 의해 입증되었다(도 46B).
실시예 19 - 재조합 EpCAM BiTE에 의한 인간 T-세포 활성화의 특성규명
표면 상에서 EpCAM을 발현시키는 것으로 알려진, 인간 DLD 결장직장 암종 세포의 배양물에 비자극 인간 1차 CD3+ 세포를 첨가함으로써 PBMC-유래 T 세포를 활성화시키는 재조합 EpCAM BiTE 단백질의 능력을 평가하였다(Karlsson et al, 2008). (형질도입된 HEK293A 세포로부터의 상청액으로서) 2.5ng/㎖ EpCAM BiTE의 첨가는 T 세포 활성화 마커 CD69 및 CD25에서 상당한 증가를 야기한 반면(도 45B 및 도 45C), 대조군 BiTE는 효과가 없었다.
종양 세포의 부재 하에 EpCAM BiTE에 대한 CD3 세포의 노출은 CD69 및 CD25에서 매우 보통의 증가를 제공하였으며, 이는 CD3의 항체-매개 클러스터링이 이 항-CD3 결합에 의한 완전한 활성화에 필수적이라는 것을 나타낸다. 종양 세포의 존재 하에 EpCAM BiTE에 의해 자극되는 T 세포는 또한 감마 인터페론(도 45D) 및 세포 증식(도 45E)의 생성에서 상당한 증가를 나타낸 반면, 대조군 BiTE는 효과가 없었다. T 세포 활성화의 목표는 탈과립화-매개 세포독성을 야기하는 것이며, 표면 CD107a/LAMP1의 발현(탈과립화를 나타냄, Aktas et al.)은 EpCAM BiTE에 의해(그러나 대조군에 의해서는 아님) 강하게 상향조절되었다(도 45f).
DLD 세포의 존재 하에 PBMC-유도 T 세포의 EpCAM BiTE-매개 활성 후에 사이토카인 방출을 사이토카인 비드 어레이를 이용하는 유세포 분석에 의해 특성규명하였다. EpCAM BiTE는 고수준의 IL-2, IL-6, IL-10, IL-13, 감마 인터페론 및 TNF를 포함하는 몇몇 사이토카인의 방출을 촉발시켰지만, 앞에서와 같이 대조군 BiTE는 거의 활성을 나타내지 않았다(도 45g). IL-2, 감마 인터페론 및 TNF의 생성은 일반적으로 Th1 반응과 관련되는 반면, IL-6 및 IL-10은 Th2 반응과 더 자주 연결된다(Mosmann & Sad, 1996).
실시예 20 - 재조합 EpCAM BiTE의 특이성
EpCAM BiTE의 효과가 항원-특이적인지 여부를 평가하기 위해 대부분의 인간 상피 세포는 EpCAM을 발현시키고, 인간 EpCAM이 그들의 표면 상에서 발현하도록 렌티바이러스 벡터를 이용하여 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포)를 조작하였다. EpCAM BiTE 및 CHO-EpCAM 세포의 존재 하에, 외인성으로 첨가한 PBMC-유래 T 세포는 모 CHO 대조군 세포 또는 대조군 BiTE에 의해 보이지 않는 강한 활성화(CD25 발현에 의해 평가, 도 47A 참조) 및 관련된 세포독성(도 47B)를 나타내었다. 이는 EpCAM BiTE의 세포독성이 항원-특이적이라는 것을 나타낸다.
이어서, 본 발명자들은 EpCAM BiTE가 다수의 종양 세포를 사멸시키는지의 여부, 및 관찰된 EpCAM BiTE-매개 세포독성 수준이 EpCAM 발현 밀도에 의존하는지의 여부를 평가하였다. EpCAM BiTE의 존재하에 T 세포의 세포독성을 6가지 상이한 암종 세포주에서 측정하였고, 가장 큰 세포독성을 DLD 및 A431에서 관찰하였고, 가장 작은 세포독성을 A549 및 PC3에서 관찰하였다(도 47C). 이는 EpCAM의 표면 수준과 헐거운 결합을 나타내었는데(유세포 분석에 의해 결정), 여기서 A549 및 PC3 세포는 가장 낮은 수준을 나타내었고, DLD는 가장 높은 수준을 나타내었다(도 47D). 이는 다른 인자(그랜자임-매개 세포자멸사에 대한 세포의 고유한 내성일 가능성이 있음)가 또한 세포 사멸의 전반적 수준을 결정하는 데 어떤 역할을 하지만, EpCAM 발현의 존재 및 수준이 세포독성 정도에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
실시예 21 - CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브세트의 BiTE 매개 활성화
T 세포 유형이 EpCAM BiTE에 의해 활성화되는지를 결정하기 위해, PBMC-유래 T 세포를 DLD 세포와 함께 인큐베이션시키고 나서, 유세포 분석 전에 BiTE를 이용하여 활성화시켰다. 활성화된 CD4 세포의 백분율은 일반적으로 약간 더 높았지만 CD4+와 CD8+ 세포는 CD69 및 CD25의 고수준의 발현을 나타내었다(도 49a). CFSE 균주(도 49B), 및 CD197a/LAMP1의 발현에 의한 탈과립화(도 49C)를 이용하여 EpCAM BiTE-매개 T 세포 증식을 평가하였고, 또한 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 다에 대해 유사한 수준의 활성화가 보였다. 최종적으로, 달성된 종양 세포의 세포독성 수준을 정제된 CD4+ 및 CD8+ 서브세트를 활성화시키는 EpCAM BiTE를 이용하여 비교하였다. 모든 T 세포 제제는 유사한 세포독성을 나타내었는데(도 49D), CD4+와 CD8+ 세포가 둘 다 관찰된 BiTE-매개 세포독성에 기여할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 22 - 종양 용해성 아데노바이러스, 에나데노툭시레브로부터의 EpCAM BiTE의 발현
에나데노툭시레브(EnAd)는 모자이크 E2B 영역, E4orf4로 맵핑된 거의 완전한 E3 결실 및 더 작은 E4 결실을 갖는 그룹 B 11형 및 3형 아데노바이러스의 키메라인 종양 용해성 아데노바이러스이다(Kuhn 2008). 암 치료를 위해 몇 가지 초기상 임상 시험을 현재 겪고 있으며, 바이러스는 양호한 전신성 약물동력학과 이식유전자를 암호화하고 발현시키는 가능성을 갖는 임상 활성을 조합한다(Calvo 2014, Boni 2014). EpCAM BiTE는 깁슨 조립에 의해 바이러스 내로 삽입되는 셔틀 벡터를 이용하여 섬유 유전자 바로 하류의 EnAd 내에서 암호화된다(도 18). BiTE는 CMV 급초기 프로모터(EnAd-CMV-EpCAM BITE)의 전사 제어 하에 위치되거나 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(MLP; EnAd-SA-EpCAM BiTE)에 대한 스플라이스 수용자 부위 하류에 위치되었다. 전자의 입체배치에서, BiTE는 바이러스가 세포를 성공적으로 감염시키는 때 발현되어야 하는 반면, MLP 스플라이스 수용자 부위로부터의 발현은 MLP가 바이러스 복제를 허용하는 세포에서 활성화되는 때에만 일어날 것이다. 또한 2개의 대응하는 바이러스를 생성하도록 대조군 BiTE(CD3 및 FHA를 인식)를 도입하였다.
바이러스를 클로닝하며, HEK293A 세포에서 구조되고, 각각의 큰 배취는 하이퍼플라스크에서 준비하고, 염화세슘 밴딩에 의해 2회 정제하였다. 모 EnAd 및 재조합 BiTE 바이러스에 의한 DLD의 감염은 시험한 모든 시점에 유사한 바이러스 게놈(qPCR에 의해 측정)을 수득하였는데, 이는 BiTE 이식유전자가 바이러스 복제 역학을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다(도 51A). 다음에, 본 발명자들은 인간 T-세포의 부재하에서 바이러스의 복제 및 종양 용해성 특성을 연구하였다. DLD 세포는 증가된 바이러스 입자(vp)/세포에서 바이러스 배취에 의해 감염되고, 세포독성은 제5일에 MTS 분석에 의해 측정된다. CMV 프로모터 또는 스플라이스 수용자에 의해 조절되는 EpCAM 및 대조군 BiTE를 갖는 것을 포함하는 모든 재조합 바이러스는 모 바이러스와 구별할 수 없는 세포독성 활성을 나타내었는데, 이는 유전자 변형이 바이러스의 고유한 종양 용해성 활성을 변화시키지 않았다는 것을 나타낸다(도 51B).
BiTE 발현 및 분비를 평가하기 위해, HEK293A 세포를 감염시키기 위해 BiTE-발현 EnAd 바이러스를 사용하였고, 항-His 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 72시간 상청액을 시험하였다. 도 51c에서 나타내는 바와 같이, 모두 4가지의 바이러스(대조군 BiTE를 발현시키는 2가지 및 EpCAM BiTE를 발현시키는 2가지)는 상청액으로부터 분비된 BiTE의 유사한 수준을 나타내었다.
실시예 23 - 바이러스로 생성된 EpCAM BiTE에 의한 EpCAM 양성 세포의 선택적 사멸
EnAd-EpCAM BiTE-감염된 HEK293A 세포로부터의 상청액을 PBMC-유래 T 세포와 함께 또는 이것 없이 CHO 및 CHO-EpCAM 세포의 배양물에 첨가하였고; T 세포 활성화 및 CHO/CHO-EpCAM 세포에 대한 세포독성을 24시간 후에 측정하였다. CHO 세포의 경우에, CD25의 T 세포 발현의 증가도(도 51d) 또는 임의의 처리에 의해 관찰되는 임의의 세포독성도 없었다(도 51e). 그러나, CHO-EpCAM 세포와 함께 인큐베이션시킨 T 세포 I은 EnAd-CMV-EpCAM BiTE 또는 EnAd-SA-EpCAM BiTE 바이러스 중 하나로 감염시킨 HEK293A 세포로부터의 상청액을 이용하여 CD25 발현의 실질적인 증가를 나타내었다(도 51d). 예상한 바와 같이, 이는 T 세포가 EnAd-CMV-EpCAM BiTE 또는 EnAd-SA-EpCAM BiTE 바이러스 중 하나로 감염된 293A 세포로부터의 상청액의 존재 하에 첨가되었을 때에만 CHO-EpCAM 세포에 대한 선택적 세포독성으로 번역되었다(도 51e). 결정적으로, T 세포의 부재하에서 또는 세포가 대조군 BiTE를 발현시키는 EnAd로 감염된 HEK293A로부터의 상청액을 이용할 때 세포독성이 없다.
실시예 24 - EnAd 발현 EpCAM BiTE의 우수한 세포독성
일부 세포 - 특히 SKOV3 난소 암종 세포 -는 부분적으로 내성이며, 더 느리게 사멸되었지만, EnAd는 직접적인 종양용해에 의해 대부분의 암종 세포를 빠르게 사멸시킨다(Kuhn 2008). 따라서 본 발명자들은 T 세포의 세포독성 활성화를 야기하는 EpCAM BiTE를 분비하기 위한 End의 보강 결과가 SKOV3 세포에서 특히 분명할 수 있다는 것을 추론하였다. 따라서 파종 및 xCELLigence 시스템에 의해 모니터링된 세포사의 24시간 후에 세포를 바이러스(100vp/세포)에 노출시켰다. PBMC-유래 T 세포를 2시간 후에 SKOV3 세포 배양물에 첨가하였다(또는 첨가하지 않았다). T 세포의 부재 하에서, 종양 세포는 대략 72시간 동안 성장하였지만(도 53A에서 증가된 세포 지수로 나타냄), 이어서, 세포 성장은 안정기에 도달되었고, 적어도 160시간까지 바이러스 감염과 독립적으로 안정하게 남아있었다. 모 EnAd를 포함하는 모든 시험 바이러스는 측정한 시간 동안 관찰 가능한 표적 세포의 세포독성을 유도하지 않았다. 그러나, PBMC-유래 T 세포와 함께 공동배양시켰을 때, CMV-와 SA- EpCAM BiTE-아암 바이러스는 둘 다 빠른 SKOV3 용해를 유도하였고, CMV-유도는 16시간 이내에, 그리고 SA는 T 세포의 첨가 후 44시간 이내에 세포 용해를 유도하였다(도 53B). 중요하게는, 모 EnAd 또는 비-특이적 BiTE 대조군 바이러스는 T 세포의 첨가가 있을 때조차 이 프레임에서 표적 세포가 없다는 것을 입증하였다. 이 결과는 상기와 동일한 공동 배양물이 감염 후 24, 48 및 96시간에 측정된 세포독성으로 설정된 LDH 분석에 의해 확인되었다(도 48). 이 결과는 EpCAM BiTE 발현 바이러스가 대조군 BiTE 바이러스보다 상당히 더 빠른 속도로 세포독성을 유도하는 DLD 세포에서의 유사한 발견에 의해 추가로 뒷받침된다(도 50A+B).
표적 세포의 세포독성이 T 세포 활성화를 통해 매개된다는 것을 확인하기 위해, 각각의 시점에 CD3 세포를 채취하고, 활성화 상태를 CD69 및 CD25 발현에 의해 결정하였는데, 이는 세포독성에 대해 관찰된 것과 유사한 발현 역할을 입증한다(도 53C 및 도 53D, 도 50C 및 도 50D). 감염된 DLD 세포로부터 생성된 EpCAM BiTE의 대략적인 양은 재조합 BiTE의 알려진 양(즉, 표준 곡선의 생성(Abs490))에 의해 유도된 세포독성과 감염된 DLD 상청액에 의해 유도되는 세포독성(Abs490)을 비교함으로써 결정하였다. CD3-정제된 PBMC(1:5)와의 공동배양물에서 DLD는 재조합 BiTE(도 50E) 또는 감염된 DLD 상청액(도 50F)과 함께 인큐베이션시켰고, LDH 방출을 24시간에 측정하였다. 이는 EnAd-CMV-EpCAMBiTE 및 EnAd-SAEpCAMBiTE에 대해 각각 백만개의 DLD당 165㎍ 및 50㎍으로 EpCAM BiTE가 생성된다는 것을 본 발명자들이 결정하게 한다. EpCAM BiTE에 대한 EC50은 7.4ng/㎖(도 50E 및 도 50F)이고, 따라서 EpCAM BiTE는 치료적 용량에 도달할 가능성이 있는 수준에서 재조합 바이러스에 의해 생성된다.
EpCAM BiTE-발현 EnAd의 세포독성은 타임랩스 비디오 현미경 관찰에 의해 시각화하였다. 카스파제 염색(셀이벤트 카스파제3-7 시약은 카스파제가 활성화될 때 녹색을 생성함)의 존재 하에 SKOV3 종양 세포(비표지)를 정상 인간 섬유아세포(EpCAM-음성, 적색으로 표지, 비-표적 대조군 세포로서 작용) 및 PBMC-유래 T 세포(청색으로 표지)와 함께 공동 인큐베이션시켰다. 또한 외인성 T 세포와 조합된 EpCAM BITE-발현 EnAd의 조합은 EnAd-CMV-EpCAMBiTE(그러나 모 EnAd는 아님)로 감염될 때 세포자멸사의 강한 유도를 나타낸 SKOV3 종양 세포에 대해 극적인 세포독성을 제공하였다. 중요하게는, 공동배양물에서 EpCAM-음성 NHDF는 전체적으로 생존 가능하게 남아있었다. SKOV3 비디오로부터 상이한 시점에 대표적인 형광 이미지를 도 53e에 나타낸다. NHDF와 함께 공동배양시킨 DLD 세포(본질적으로 바이러스에 더 민감함)를 나타내는 동등한 타임랩스 비디오를 또한 나타낸다.
실시예 25 - EpCAM BiTE는 면역억제를 극복하고, 내인성 T 세포를 활성화시키며, 악성종 복막 복수 내에서 내인성 종양 세포를 사멸시킬 수 있다
EpCAM-양성 종양 세포 및 1차 섬유아세포(대조군으로서, 비 EpCAM-발현 세포)를 함유하는 악성종양 복막 복수의 3개 임상 샘플을 생체밖에서 확장시켰고, 혼합된 1차 세포 집단을 PBMC-유래 T-세포와 함께 인큐베이션시키고 나서, 배양물 배지에서 유리 BiTE 또는 100vp/세포 EnAd-EpCAMBiTE로 처리하였다. 72시간 후에, EpCAM-양성 표적 세포(도 55A) 또는 비-표적 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)-양성 섬유아세포(도 55B)의 수준을 유세포 분석에 의해 측정하였다. CD25 발현을 측정함으로써 T 세포의 활성화를 분석하였다(도 55c). 유리 EpCAM BiTE 및 EpCAM BiTE-발현 바이러스는 EpCAM-양성 종양 세포의 고갈을 유도하는 T-세포 활성화를 유도하였으며, 1차 FAP-양성(EpCAM-음성) 섬유아세포는 수의 변화 없음을 나타낸다. 이는 모든 환자의 샘플에서 관찰되었고, 다른 처리 중 어떤 것도 임의의 상당한 효과를 나타내지 않았다. 이는 EpCAM BiTE(또는 이를 암호화하는 종양 용해성 바이러스)가 인간 난소 복수 종양 세포에 대해 PBMC-유래 T 세포에 의한 활성화 및 선택적 세포독성을 매개할 수 있다는 것을 입증한다.
악성종양 삼출액은 후기 전이성 암을 갖는 환자에서 통상적으로 관찰되는 억제된 면역 반응을 갖는 강력한 면역관용 환경을 나타낼 가능성이 있다. 이 가설을 검증하기 위해, 본 발명자들은 배양 배지에서 또는 복막의 악성종양이 있는 5명의 환자로부터의 100% 복수액의 존재에서 항-CD3 항체를 이용하여 PBMC-유래 T 세포를 다클론성으로 자극하였다. RPMI 배지에서 항-CD3 항체는 CD25와 CD69 둘 다에 대해 양성인 T 세포의 거의 50%를 제공하는 반면, 복수액의 존재는 CD69/CD25 발현의 감소된 항체-매개 상승에 의해 결정되는 바와 같이 T-세포의 활성화를 약화시키는 것으로 나타났으며, 이는 환자 유체 #2에 대해 특히 주목할 만하였다(도 56a). 이는 복수액의 성분이 면역억제적이거나 또는 내성화 효과를 발휘할 수 있다는 본 발명자들의 개념을 뒷받침한다. 그러나, 활성화 마커 증가의 이런 감쇠는 T-세포 탈과립화의 억제, 배양 배지에서와 유사하게 복수액에서의 CD107a 외부화와 상관관계가 없었다(도 56B). 이는 BiTE가 T-세포 면역억제의 종양 미세환경-관련 메커니즘을 우회할 수 있다는 것을 따른다(Nakamura & Smyth, 2016).
따라서 본 발명자들은 면역억제 복수액의 존재 하에 PBMC-유래 T 세포 및 EpCAM BiTE가 표적 세포의 세포독성을 매개하는 능력을 연구하였다. 세포독성이 환자 복수액 #2의 존재 하에 약 8시간의 지연을 나타내었지만, 복수액 1 및 2와 함께 인큐베이션시킨 T-세포는 RPMI 배양 배지에 있을 때(xCELLigence를 이용하여 측정) 인간 유방 선암종 MCF7 세포주의 유사한 용해를 유도하였다(도 56C). 존재하는 면역 억제 유체 및 종양 세포에 추가로, 복수는 종양-관련 림프구 및 종양 기질의 억제 세포를 함유하여, 내인성 환자-유래 T-세포의 BiTE-매개 활성화를 시험하기 위한 독특한 종양-유사 모델 시스템을 제공한다. 유리 재조합 BiTE와 함께 총 내인성 세포와 복수액의 24시간 인큐베이션 후에, 환자 T 세포의 활성화를 평가하였다(도 56d). 이 고도로 임상적으로 적절한 상황에서, 실험이 단순 배지에서보다 100% 복수액에서 수행될 때 CD25가 더 낮은 수준에 있을지라도 EpCAM BiTE(그러나 대조군 상대는 아님)는 CD69 및 CD25 발현을 유도하였다. 이들 데이터는 EpCAM BiTE가 적어도 일부의 복막 복수액의 면역 억제 효과를 극복하여 내인성 T 세포를 활성화시킬 수 있다는 것을 시사한다. LDH의 방출을 측정함으로써 세포독성을 평가하였고, BiTE는 실험이 배지에서 그리고 또한 100% 복수액에서 수행되었을 때 상당한 상승을 야기하였다. 이는 1차 복수에 존재하는 다중 세포 유형이 주어지더라도, 복수 세포의 일부가 BiTE-매개 세포독성에 의해 사멸되었고, 종양세포가 사멸된 비율을 정하는 것은 가능하지 않다는 것을 나타낸다.
실시예 26 - EnAd 발현 EpCAM BiTE는 악성 흉막 삼출액 내에서 내인성 종양 세포를 사멸시키도록 내인성 T 세포를 활성화시킬 수 있다
다른 임상적으로 절절한 상황에서 EpCAM BiTE-발현 바이러스의 효과를 연구하기 위해, 본 발명자들은 다수의 악성종양을 갖는 환자로부터의 흉막 삼출액의 몇몇 샘플을 얻었다. 초기 선별에서(실시예를 도 52에 나타냄), 추가 분석에 적합한 것으로 고려되는 샘플은 CD3 및 EpCAM-양성 세포를 함유하는 것이었다. 본 발명자들은 또한 그들의 초기 단리 후에 내인성 T 세포에 의해 PD1 발현을 평가하였고, 반면에 10%의 PBMC-유래 T 세포만이 PD1을 발현시켰으며, 모든 악성종양 유출물 샘플 T 세포는 PD1에 대해 적어도 40% 양성이고, 때때로 100%만큼 높게 도달되었다(도 54). 비정제 총 세포(원심분리에 의해 단리되고 재현탁됨)를 500ng/㎖의 유리 EpCAM BiTE 또는 100vp/세포 바이러스 암호화 BiTE의 존재 하에 100% 흉수 유체에서 고정된 농도로 인큐베이션시켰다. 5일 후에, 총 세포 집단을 채취하고 나서, CD3+ 세포의 총 수(도 57A)를 측정하였다.
비러치 대조군에 비해, 유리 EpCAM BiTE 또는 EnAd 암호화 EpCAM BiTE를 받는 샘플만이 T 세포 증식을 나타내었다. 이는 EpCAM BiTE가 EpCAM 표적에 결합하고 내인성 T 세포를 자극하도록 CD3을 가교한다는 것을 확인한다. CD3 세포 상에서 CD25의 발현 수준을 또한 결정하였다(도 57B). 흉수액의 면역-내성 가능성이 있는 환경에서조차, 모든 환자의 샘플에서 유리 EpCAM BiTE는 종양 관련 림프구의 상당한 T-세포 활성화를 유도하였다(CD25 발현에 의해 평가). 항-PD1 차단 항체의 첨가는 이 상황에서 T 세포의 EpCAM BiTE 매개 활성화에 대해 효과가 없었다(도 54B 및 도 54C). 환자 간의 주목할 만한 변화는 없었으며(동일한 환자로부터의 샘플 간에 변화는 거의 없었지만), 활성화는 공여자에 따라서 50% 내지 90%의 범위였다. 유사하게, EpCAM BiTE를 발현시키는 EnAd로 처리한 샘플은 일부 환자에서 높은 활성화를 나타내었다(EnAd-CMV-EpCAM BITE와 EnAd-SA-EpCAM BiTE 둘 다에 대해 10 내지 20%로부터 80%까지의 범위임).
흥미롭게도, 가장 낮은 BiTE-매개 활성화를 나타내는 환자는 또한 가장 낮은 수준의 배경 T 세포 활성화를 나타내었다. 모 EnAd, 도는 EnAd 발현 대조군 BiTE, 또는 유리 대조군 BiTE는 배경 초과의 자극을 야기하지 않았다.
본 발명자들은 5일 인큐베이션의 마지막에 유세포분석에 의해 EpCAM 양성 세포의 잔여 수준을 측정함으로써 EpCAM-표적화된 세포독성을 매개하는 BiTE-발현 바이러스의 능력을 평가하였다(도 57C). 유리 EpCAM BiTE, 및 2종의 바이러스 암호화 EpCAM BiTE는 모든 경우에 자가 EpCAM-발현 세포의 현저한 결실을 야기한 반면, 다른 처리는 EpCAM-양성 세포 수준에 대한 효과가 거의 없거나 또는 전혀 없었다. 샘플 #1의 경우에, 비처리 대조군에 비해 모든 EnAd 기반 바이러스에 의해 약간 감소된 생존도가 있으며, 이는 직접적인 바이러스 종양용해 효과를 나타낼 가능성이 있다. T 세포 활성화에 대한 PD1 차단 항체 영향의 결여와 함께, 표적 세포의 EpCAM BiTE 매개 사멸에 대한 효과는 없었고, PD1 차단제의 부재 하에서 EpCAM+ 세포(환자 2, 3 및 4)의 거의 완전한 세포독성이 있었다(도 54D).
모 EnAd 및 EnAd-CMV-EpCAM BiTE의 상이한 효과를 도 57D의 현미경관찰에서 나타내며, BiTE의 발현은 종양 세포의 존재를 감소시키고 T 세포 집단을 확장시킨다. 관련된 유세포 분석 플롯은 EpCAM BiTE-발현 바이러스에 의한 처리 후 T 세포의 실질적인 확장 및 활성화를 확인한다.
최종적으로, 다양한 처리 효과는 LEGENDplex 단백질 어레이를 이용하여 생성된 중요한 사이토카인 수준을 측정함으로써 특성규명하였다(도 57E). 단연코 가장 큰 배수 증가는 감마 인터페론인데, 이는 유리 EpCAM BiTE 또는 EnAd 암호화 EpCAM BiTE에 의한 처리 후 거의 1000배 상승되었다. 이들 두 처리는 또한 IL-5, IL-13, 종양 괴사 인자(TNF), IL17A 및 IL17F 발현에서 거의 10배 증가를 야기하였는데, 이는 활성화된 T 세포의 특징이다. EnAd 단독(또한 대조군 BiTE를 발현시킴)은 또한 감마 인터페론의 10배 상승을 야기하였지만, 다르게는 어떤 처리도 사이토카인 발현에서 임의의 인식 가능한 변화를 야기하지 않았다.
실시예 27 - 논의
종양 용해성 바이러스는 단일 표적화, 자기 증식 제제 내에서 몇몇 치료적 양상을 조합하기 위한 아주 흥미로운 새로운 전략을 제공한다(Keller & Bell, 2016; Seymour & Fisher, 2016). 그들이 암세포 내에서 선택적으로 복제하고 세포에서 세포로 확산됨에 따라, 일부 종양 용해성 바이러스는 바이러스 입자가 건조 세포로부터 탈출하도록 허용하는 과정의 부분으로서 비세포자멸사적 사멸 경로에 의해 세포사를 매개하는 것으로 생각된다(Ingemarsdotter et al, 2010; Li et al, 2013). EnAd는, 특히, 종양병증 또는 허혈성 세포사로서 알려진 전염증 과정에 의해 세포를 사멸시킨다(Dyer, 2017). 이런 비-세포자멸사적 사멸 메커니즘은 몇몇 전염증 세포 성분, 예컨대, ATP, HMGB1 및 칼레티쿨린의 노출(손상-관련 분자 패턴으로서 알려짐, DAMP)의 방출을 야기하며(Weerasinghe & Buja, 2012), 효과적인 항암 면역 반응을 촉진시키는 바이러스의 능력에 대한 중심이 될 가능성이 있다. 그러나, 직접적인 용해 결과에 추가로, 바이러스는 다른 항암 생물제제를 암호화하고 발현시킬 가능성을 제공하여, 전달 도전을 제거하며, 종양 미세환경 내에서 생물 제제가 고농도를 달성하는 것을 보장한다. 임리직(Imlygic)은 GM-CSF를 암호화하지만, 그러나 바이러스를 보강하기 위한 가능성은 사실상 제한이 없고, 상가적 또는 상승적 항암 효과를 갖는 다중모드 치료 전략을 설계하는 다수의 흥미로운 기회를 제공한다(de Gruijl et al, 2015; Hermiston & Kuhn, 2002).
종양 용해성 바이러스 내에서 BiTE의 암호화는 종양 용해성 바이러스 내에서 종양 침윤성 림프구를 활성화시키는 강력한 수단을 제공하여 세포독성이 되며 항원-양성 표적 세포를 용해시키도록, 직접적인 바이러스 용해 효과로부터 치료적 양상을 완전히 분리시키는 것을 제공한다. 본 연구에서 본 발명자들은 BiTE-표적화된 세포독성이 완전히 항원-특이적이며, CD4와 CD8 T 세포 둘 다에 의해 매개될 수 있고(Brischwein et al, 2006) 종양 용해성 아데노바이러스 내로 혼입될 수 있으며, 바이러스 복제를 허용하는 세포에서만 발현된다는 것을 나타내었다. 추가로 현재의 연구는 처음으로, 액체암 생검 내에서 내인성 T 세포가 BiTE 및 바이러스-암호화된 BiTE에 의해 활성화될 수 있고, 멱역 억제의 임의의 추가적인 자극 또는 반전 없이 내인성 종양 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 중요하게는, 이는 고형종양의 면역억제 미세환경에 대한 대리로서, 복막 복수 또는 흉수의 미세환경을 포함하는 1차 유체에서조차 일어날 수 있다.
BiTE를 발현시키기 위한 종양 용해성 바이러스의 보강은 2가지의 완전히 별개의 치료적 메커니즘을 조합하는데, 전자는 바이러스 감염에 허용적인 종양 세포의 용해 사멸을 제공하며, 후자는 특이적, 선택 항원을 통해 T 세포의 세포독성을 표적화한다. 이는 치료적 접근의 설계에서 상당한 유연성을 제공하는데, 이는 바이러스에 의해 직접적으로 사멸시키는 데 상대적으로 내성이 있는 종양-관련 세포에 세포독성을 전달하기 위해 BiTE를 이용할 가능성이 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 암종-관련 항원(EpCAM)을 인식하는 BiTE를 이용하는 본 명세서의 기술을 예시하였지만, 종양-관련 섬유아세포 또는 다른 기질 세포에 세포독성을 표적화하기 위한 BiTE 접근을 사용하는 것이 가능하다. 사실, BiTE-인식에 대한 표적이 종양 미세환경에서의 발현으로 제한되지 않을 때조차, BiTE 생성을 바이러스 복제에 연결시킴으로써 BiTE의 발현이 종양으로 공간적으로 제한되도록 하여, 전신의 독성을 최소화한다. 이는 정맥내로 투여된 BiTE가 상대적으로 짧은 순환 역학을 나타내고(Klinger et al, 2012) 상당한 표적 상의 종양을 벗어난 독성과 종종 관련되기 때문에(Teachey et al, 2013) 중요하다.
종양 용해성 바이러스 내에서 BiTE를 암호화하는 가능성은 Ephrin A2-표적화 BiTE를 갖는 종양 용해성 백시니아 바이러스를 이용하여 이전에 연구되었다. 이 제제는 Ephrin BiTE가 시험관내와 생체내 둘 다에서 PBMC의 활성화 및 종양세포의 항원-표적화된 사멸을 매개할 수 있었다는 것을 나타내었다. 흥미롭게도, BiTE가 T 세포를 활성화시킬 수 있었지만, 이는 외인성 IL-2의 첨가 없이 T 세포 증식을 야기하지 않는 반면, 현재의 연구에서 사용되는 BiTE는 시험관내에서 PBMC의 그리고 생체외에서 임상 생검 샘플을 이용하여 종양-관련 림프구의 광대한 증식을 야기하였다.
본 발명자들은 관찰된 차이가 상이한 BiTE 설계를 반영할 수 있으며, 상이한 종양 용해성 바이러스가 사용되거나 또는 T 세포 상에서 CD3의 충분한 가교를 제공하는 항원 밀도에 의존할 가능성이 있다는 것을 믿는다.
종양 용해성 바이러스 요법의 한가지 중심 목표는 환자 특이적 신생항원뿐만 아니라 "공공의" 종양 관련 항원을 인식하는 항암 T 세포 반응을 생성하는 것이다. 용해 바이러스는 바이러스-관련 병원균-관련 분자 패턴(PAMP)과 함께 DAMP와 관련하여 종양 세포를 용해시킴으로써 개선된 항원 제시를 자극하는 것에 의해 이것을 행할 수 있다. EnAd의 정맥내 전달 후 절제된 결장 종양의 면역조직화학적 염색은 바이러스가 종양 조직 내로 CD8+ T 세포의 강한 유입을 촉진시킨다는 것을 시사한다(Garcia-Carbonero, 2017). 그러나, 이는 잠재적으로 매우 강력한 접근이지만, 적응성 T 세포 반응은 종양 세포에 의한 MHC 클래스 I 항원의 발현에 궁극적으로 의존하여, 표적화된 사멸을 허용한다. MHC 발현의 상실은 종양에 대한 잘 보고된 면역 회피 전략이다(Garrido et al, 2016).
BiTE-아암 종양 용해성 바이러스에 의해 즉시 맞물리는 세포독성 전략은 둘 다 종양 세포에 의해 MHC 클래스 I과 독립적으로 작용하고, 따라서 종양 세포가 MHC 발현을 상실했을 때조차 암세포를 사멸시키는 데 사용될 수 있다는 것은 주목할 만하다.
따라서 본 연구는 EnAd 내에서 BiTE의 암호화가 파종성 종양에서 표적화된 발현을 달성하기 위한 특히 유망한 전략을 제공하며, 몇몇 초기상 임상 연구에서 현재 연구되는 바이러스의 알려진 혈액-안정성 및 전신 생체이용가능성을 이용한다는 것을 입증한다. 특히, 바이러스가 원발성 결장암의 절제 며칠 전에 정맥내로 주어지는 연구에서, 종양 절개의 후속적인 면역조직화학적 평가는 바이러스가 종양을 통해 영역으로 도달되고 강한 핵내 헥손 신호를 제공한다는 것을 나타내는데, 이는 종양 세포에서의 성공적인 감염 및 선택적으로 바이러스 복제를 나타낸다. 이는 이 바이러스가 100% 인간 혈액에서 안정하고 인간 환자에서 파종성이며 전이성인 악성 종양의 종양 표적화된 감염을 가능하게 하여야 한다는 것을 나타내는 전임상 데이터를 확인한다(Di et al, 2014; Illingworth, 2017).
BiTE는 종양 용해성 독력의 임의의 상실 없이 EnAd에 의해 암호화될 수 있는데(도 51B), 이는 바이러스의 상당한 이식유전자 패키징 능력을 반영한다. 이식유전자의 존재는 바이러스 입자의 생리화학적 특성에 영향을 미치지 않을 것이며, 따라서, 변형된 바이러스는 모 제제와 정확하게 동일한 임상 약물동태학을 나타내어야 하고, 그리고 신체 전체적으로 종양 내에서 암호화된 BiTE를 선택적으로 발현시킬 수 있어야 한다. 이는 현재 임상 평가를 위해 우선적으로 처리되어야 하는 전신으로 표적화된 암에 대한 흥미롭고 강력하게 매우 효과적인 새로운 접근을 제공한다.
실시예 28
환자 악성종양 삼출액에 의한 인간 T-세포 활성화 및 표적 세포의 세포독성의 면역억제
악성종양 삼출액은 후기 전이성 암을 갖는 환자에서 통상적으로 관찰되는 억제된 면역 반응을 갖는 강력한 면역관용 환경을 나타낸다. 항염증 사이토카인으로 고려되는 IL-10의 양은 인간 IL-10 ELISA MAX 키트(바이오레전드, 430604)를 이용하여 정상 혈청(NS) 또는 환자 악성 삼출액(A: 복막 복수, P: 흉수)에서 측정하였다. 삼출액 중의 IL-10 수준(88.1 내지 633.4pg/㎖)은 정상 혈청에서 측정된 것(7.2 내지 10pg/㎖)보다 훨씬 과량이었다. 도 58 참조.
정상 혈청, 복수 또는 흉수의 존재 하에서 PBMC T-세포를 활성화시키는 CD3/CD28 비드(깁코, 11161D)의 능력을 연구하였다. 인간 PBMC T-세포(96 웰 플레이트에서 웰당 100,000개의 세포)를 정상 혈청 또는 환자 삼출액(50%)에서 (제조업자의 설명서에 따라) CD3/CD28 비드로 처리하였다. 음성 대조군으로서 T-세포를 각각의 유체에서 비처리로 두었다. 24시간의 배양 후에, 세포를 채취하고 나서, 이어서, CD3+ T-세포 상에서 CD69 및 CD25의 발현 수준을 항체 염색 및 이중 양성(CD69+CD25+ 세포)의 백분율로서 나타낸 유세포 분석에 의해 분석하였다(도 59). 정상 혈청에서, 항-CD3/CD28 비드는 CD25 및 CD69 둘 다에 대해 이중 양성인 대략 60%의 T 세포를 제공한 반면, 복수액의 존재는 6/12 유체에서 T 세포 활성화를 약화시켰다.
유사한 실험에서, 100,000개의 T-세포를 정상 혈청, 복수 또는 흉수의 존재(50%) 하에 CD3/CD28 비드로 처리하였다. 항-CD107a 또는 아이소타입 대조군 항체를 배양 배지에 직접 첨가하였다. 1시간 후에, 제조업자의 설명서에 따라 모네신을 첨가하였다(BD 골지스탑(BD Golgistop), BD 바이오사이언시즈). 추가 5시간 후에, 세포를 채취하고 나서, 유세포 분석에 의해 분석하여 탈과립화를 결정하였다(도 60). 정상 혈청에서, 항-CD3/CD28 비드는 대략 22.5%의 탈과립화된 T 세포를 제공한 반면, 복수액의 존재는 10/12 유체에서 T 세포 활성화를 약화시켰다. 탈과립화 수준은 각각의 유체에서 IL-10의 양과 상당히 상관관계가 있었다(피어슨 상관계수, r = -0.7645; p = 0.0038)(도 61).
유사한 실험에서, 75,000개의 T-세포를 정상 혈청, 복수 또는 흉수의 존재(50%) 하에 15,000개의 SKOV3 및 EpCAM과 함께 공동배양시켰다. 음성 대조군으로서 T-세포를 각각의 유체에서 대조군 BiTE로 처리하였다. 24시간의 배양 후에, 세포를 채취하고 나서, 이어서, CD3+ T-세포 상에서 CD69 및 CD25의 발현 수준을 항체 염색 및 이중 양성(CD69+CD25+ 세포)의 백분율로서 나타낸 유세포 분석에 의해 분석하였다(도 62). 정상 혈청에서, EpCAM BiTE는 CD25와 CD69 둘 다에 대해 이중 양성인 대략 67.6%의 T 세포를 제공한 반면, 복수액의 존재는 0/12 유체에서 T 세포 활성화를 약화시키고, 4/10 유체에서 활성화를 약간 유도하였다.
유사한 실험에서, 75,000개의 T-세포를 정상 혈청, 복수 또는 흉수의 존재(50%) 하에 15,000개의 SKOV3 및 EpCAM과 함께 공동배양시켰다. 음성 대조군으로서 T-세포를 각각의 유체에서 대조군 BiTE로 처리하였다. 항-CD107a 또는 아이소타입 대조군 항체를 배양 배지에 직접 첨가하였다. 1시간 후에, 제조업자의 설명서에 따라 모네신을 첨가하였다(BD 골지스탑(BD Golgistop), BD 바이오사이언시즈). 추가 5시간 후에, 세포를 채취하고 나서, 유세포 분석에 의해 분석하여 탈과립화를 결정하였다(도 63). 정상 혈청에서, EpCAM BiTE 비드는 대략 41.4%의 탈과립화된 T 세포를 제공한 반면, 복수액의 존재는 2/12 유체에서 T 세포 활성화를 약화시켰다.
xCELLigence 기법을 이용하여 EnAd-SA-EpCAMBiTE 및 EnAd-SA-대조군BiTE가 악성종양 삼출액에서 T-세포 매개 표적 세포 용해를 유도하는 능력을 평가하였다. SKOV 세포를 1e4개의 세포/웰로 48-웰 E-플레이트에서 각각 플레이팅하였다. 플레이트를 18시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 세포 당 100개의 바이러스 입자(ppc)로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 2시간 후에, 정상 혈청 또는 환자 삼출액(최종, 50%)에서 PBMC T-세포(5:1)를 첨가하였다. xCELLigence를 사용하여 10분마다 표적 세포독성을 측정하였다(도 64). 결과는 T-세포에 의한 BiTE-매개 SKOV3 용해가 사용한 유체와 독립적이라는 것을 시사한다.
비정제된 복수 세포(따라서 수용하였을 때로부터 변하지 않음)를 RPMI 배지 또는 복수액에서 편평-바닥 96-웰 플레이트의 웰당 100,000개의 세포로 파종하였다. 세포를 EpCAM 또는 대조군 BiTE로 처리하였고, 비처리 웰은 음성 대조군으로서 작용하였다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 세포를 채취하고 나서, CD3 세포 상에서 CD25 및 CD69의 발현 수준을 결정하였다(도 65). 결과는 EpCAM BiTE가 복수액에 의해 약간 증가된 종양 관련 림프구의 T-세포 활성화(CD69/CD25 이중 양성)의 상당한 증가를 야기하였다는 것을 입증한다.
유사한 실험에서, 비정제된 복수 세포(따라서 수용하였을 때로부터 변하지 않음)를 RPMI 배지 또는 복수액에서 편평-바닥 96-웰 플레이트의 웰당 100,000개의 세포로 파종하였다. 세포를 EpCAM, 대조군 BiTE 또는 재조합 BiTE 바이러스(100vp/세포)로 처리하였고, 비처리 세포는 음성 대조군으로서 작용하였다(도 66). 37℃에서 5일 동안 인큐베이션 후에, 총 세포 집단을 채취하고 나서, CD3+ 세포의 수(도 66a) 및 CD3 세포 상에서 CD25의 발현 수준을 결정하였고(도 66b) 내인성 EpCaM + 세포의 수를 유세포 분석에 의해 결정하였다(도 66c). 정밀도 계수 비드를 이용하여 웰 당 총 세포 수를 결정하였다. 결과는 EpCAM BiTE 및 EnAd 발현 EpCAM BiTE가 RPMI 배지와 복수액 둘 다에서 종양-관련 림프구의 T-세포 활성화(CD3 수, CD25)의 상당한 증가 및 EpCAM+ 세포의 세포독성을 초래하였다는 것을 입증한다.
상기 실험의 연장으로서, 6명 초과의 환자 삼출물 샘플(총 7명에 대해)을 복수액에서 동일하게 처리하였고(도 67) CD3+의 수(도 67a), T-세포의 CD25 발현(도 67b) 및 EpCAM+ 세포의 수(도 67c)를 유세포 분석에 의해 결정하였다. 결과는 EpCAM BiTE 및 EnAd 발현 EpCAM BiTE가 다양한 삼출액 생검 샘플에서 재현 가능하게 종양-관련 림프구의 T-세포 활성화(CD3 수, CD25)의 상당한 증가 및 EpCAM+ 세포의 세포독성을 초래하였다는 것을 나타낸다.
실시예 29
FAP BiTE는 상이한 공여자 T 세포에 의해 T-세포의 활성화 및 FAP+ 세포의 사멸을 매개한다
다른 실험에서, 실시예 2에 기재한 방법을 사용하여 NHDF 및 T-세포의 공동 배양물에서 시험한 재조합 FAP BiTE 단백질의 T-세포 활성화 특성을 추가로 평가하고, 항-CD3/CD28 다이나비즈를 이용하여 대조군 BiTE와 다클론성 T-세포 활성화를 비교하였다.
IFNγ에 대해 ELISA에 의해(도 68A) 그리고 사이토카인의 패널에 대해 사이토카인 비드 어레이(LEGENDplex 인간 T 헬퍼 사이토카인 패널, BioLegend #74001)에 의해(도 68B) 24시간의 배양 후에 취한 상청액을 시험하였다. 대조군 BiTE는 임의의 사이토카인에서 상당한 변화를 유도하였지만, 그러나, FAP-BiTE는 자극 중인 T 세포의 상이한 서브세트와 일치되게 감마 인터페론, IL-2, TNF, IL-17 및 IL-10의 강한 증가를 야기하였고, IFNγ의 생성은 항-CD3/CD28에 의해 촉발되는 것보다 훨씬 더 컸다.
NHDF 세포의 존재 하에서 FAP BiTE에 의한(그러나 대조군 BiTE는 아님) 자극은 또한 T-세포 표면 상에서 CD107a/LAMP1의 외부화에 의해 결정되는(유세포 분석에 의해 평가) T-세포(CD4+와 CD8+ 서브세트 둘 다)의 빠른 탈과립화를 유도하였는데(6시간 이내), 이는 표적 세포를 사멸시키는 그들의 능력과 강하게 상관관계가 있다(도 69A 및 도 69B). PBMC T-세포와 함께 24시간의 공동 배양 후에(대략 2.5ng/㎖의 EC50) LDH 방출에 의해 측정하여 FAP BiTE에 의한 탈과립화의 유도는 강한 섬유아세포 용해(도 69C)로 번역되었고, 6/6 공여자 T-세포를 이용하여, 유도된 T-세포 활성화 및 세포독성이 관찰되었다(도 69D). 대조군 BiTE에 의해 세포독성은 유도되지 않았는데, 이는 비활성화 상태로 남아있는 T-세포와 일치된다.
실시예 30
상이한 암환자로부터의 1차 악성종양 복수 샘플에서 세포 상의 FAP BiTE 및 EnAd-FAP BiTE 바이러스의 효과
실시예 16에 기재한 연구에 후속적으로, EnAd FAP BiTE 바이러스 활성 연구를 위해 추가적인 암환자로부터의 신선한 1차 악성종양 복막 복수를 얻었다. EpCAM+ 종양 세포 및 FAP+ 섬유아세포를 둘 다 함유하는 3명의 환자 샘플을 생체외에서 확장시키고 나서, 혼합된(부착) 세포 집단을 PBMC-유래 T-세포 및 비변형 또는 BiTE 발현 EnAd 바이러스와 함께 배양시켰다. 72시간 후에, 총 세포를 채취하고 나서, FAP+(도 70A) 및 EpCAM+ 세포의 수(도 70B)를 유세포 분석에 의해 결정하였다. 추가적으로, (CD25 발현에 의해) T-세포의 활성화 상태를 측정하였다(도 70C). EnAd-CMV-FAPBiTE와 EnAd-SA-FAPBiTE 둘 다에 의한 감염은 모든 환자 샘플에서 T-세포 활성화 및 FAP+ 세포 고갈을 유도하였고, EpCAM+ 종양 세포 수준의 상당한 변화는 없었다. 모 EnAd 또는 대조군 바이러스는 관찰 가능한 T 세포 활성화를 유도하지 않았고, FAP+ 세포 수는 비감염 대조군과 유사하게 남아있었다.
중요하게는, FAP+ 섬유아세포의 이런 고갈은 상청액에서 검출되는 면역억제 사이토카인 TGFβ수준의 강한 감소를 일관되게 야기하였다(도 70D).
실험의 제2 시리즈에서, 샘플 내 내인성 종양-관련 T-세포의 활성을 평가하기 위해 5명의 환자 생검 샘플로부터의 총(그리고 비정제된) 세포를 평가하였다. 세포를 50% 복수액에서 플레이팅하고 나서, 재조합 대조군 또는 FAP BiTE 단백질, 또는 100vp/세포의 EnAd 또는 EnAd-BiTE 바이러스로 처리하였다. 5일의 인큐베이션 후에, (CD25 발현에 의한) T-세포 활성화 및 FAP+ 세포의 잔여 수를 유세포 분석에 의해 측정하였다(도 71A&B). 모두 3명의 환자 샘플에서, 재조합 FAP-BiTE 및 EnAd-CMV-FAP BiTE는 강한 T-세포 활성화를 유도하였고, 대략 80%까지의 환자-유래 T-세포가 활성화되었는데, 이는 FAP+ 섬유아세포의 현저한 고갈을 야기하였다. 흥미롭게도, EnAd-SA-FAP-BiTE는 2/3 샘플에서 CD25 발현을 유도하였고, 환자 1에서 관찰 가능한 활성화 또는 FAP+ 세포 고갈은 없었다. 이는 바이러스에 의한 감염 및 BiTE 단백질의 생성에 대해 존재하는 불충분한 종양 세포에 기인할 가능성이 있으며(유세포 분석에 의해 이 샘플에서 검출된 EpCAM+ 종양 세포 없음), 이는 MLP(SA)-유도 이식유전자 발현을 위한 종양 세포에 대한 필요와 일치된다(이는 또한 도 42 내지 44에 예시한 환자 복수 샘플을 이용하여 EnAd-SA-FAP-BiTE 바이러스에 의한 T-세포 활성화의 결여 및 FAP+ 세포 고갈을 설명할 가능성이 있음). 종합적으로, 데이터는 EnAd 발현 FAP-BiTE가 종양 세포의 감염 후에 내인성 섬유아세포를 사멸시키는 종양-관련 T-세포의 활성화를 재현 가능하게 야기한다는 것을 나타낸다.
다른 실험은 FAP-BiTE 활성이 환자 생검 샘플을 이용하여 PD-1 관문을 차단함으로써 개선될 수 있는지의 여부를 연구하였으며, 이때 T-세포는 73.6% PD-1 양성이고, FAP+ 세포는 62.9% PDL1-양성이다(도 72A). 2.5㎍/㎖의 최종 농도로 인간 PDL1(바이오레전드, 클론 29E.2A3)에 대한 정제된 차단 마우스 IgG2b 항체의 존재 또는 부재 하에서 상기 기재한 것과 유사한 공동 배양물을 설정하였다. 2일의 배양 후에, 총 세포를 채취하고 나서, 잔여 FAP+ 세포 및 T-세포 활성화를 측정하였다. 차단 항-PDL1 항체의 포함은 상황 중 하나에서 2일까지 거의 완전한 용해에 의해, CD25 유도에서 보통의 증가(도 72B) 및 2배 더 높은 IFNγ 생성(도 72C), FAP+ 세포 고갈의 변경 없음(도 72d)을 야기하였다.
난소암 환자 복수로부터 단리시킨 종양-관련 림프구(TAL)는 PD-1의 풍부한 발현 및 손상된 효과기 기능(세포독성 및 IFNg 생성을 포함)을 갖는 것으로 보고된다. 이와 일치되게, PD-1 발현은 3명의 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서보다 6명의 암환자 복수 생검으로부터의 CD3+ 세포에 대해 2배 더 높았다(도 73A). 이들 암 생검 샘플 내에서 T-세포의 기능성을 평가하기 위해, NHDF 세포 및 비정제 PBMC 또는 복수 세포(각각의 샘플에 대한 CD3+ 세포%를 도 73B에 나타냄)를 대조군 또는 FAP BiTE-함유 상청액과 함께 공동 배양시켰고, 상청액을 5일 후에 채취하고 나서, ELISA에 의해 IFNγ에 대해 시험하였다(도 73C). IFNγ는 대조군 BiTE에 의해 유도되지 않았다. 복수세포 샘플 중 셋은 PBMC 샘플과 유사한 수준으로 IFNγ를 생성하였지만, 다른 셋은 FAP BiTE에 대해 약화된 반응을 가졌다. 본 발명자들은 다음에 NHDF 세포의 BiTE-매개 용해를 유도하는 이들 T 세포의 능력을 연구한다. NHDF를 플레이팅하고 나서, PBMC 또는 복수 세포를 BiTE-함유 상청액과 함께 첨가하고, 배양물 중의 세포 생존도를 xCELLigence 세포독성 분석 시스템을 이용하여 실시간으로 모니터링하였다. IFNγ 생성의 가변성에도 불구하고, FAP BiTE와 함께 첨가할 때 모든 복수 샘플은 NHDF 세포의 완전한 세포독성을 유도하였으며, 전반적으로 유사한 속도의 BiTE-매개 NHDF 용해가 PBMC에 의해 달성될 때 보였다(도 73D).
FAP BiTE가 환자 악성종양 삼출액 샘플의 존재 하에서(모두 50%에서) T-세포 활성화를 매개할 수 있는지의 여부를 연구하기 위해, PBMC T-세포를 NHDF 세포의 존재 하에 대조군 또는 FAP BiTE를 이용하여 활성화시키거나, 또는 50% 정상 인간 혈청(NS) 또는 상이한(무세포) 악성종양 삼출액 샘플 중 하나에서 항-CD3/CD28 다이나비즈를 이용하여 활성화시켰다. 항-CD3/CD28 비드에 의한 자극 후 24시간에 정상 혈청에서 T-세포의 74%를 활성화시켰지만(CD25와 CD69 둘 다에 대해 이중-양성), 3/5 검사 복수액은 NS에서의 반응에 비해 T-세포 활성화를 상당히 약화시켰다(도 74A). 그러나, PBMC를 NHDF와 함께 배양시키고 FAP BiTE와 함께 자극하였을 때, 임의의 삼출액의 존재 하에서 T-세포 활성화의 관찰 가능한 억제는 없었는데(도 74B), 이는 FAP BiTE가 T-세포를 활성화시키는 면역억제 메커니즘을 극복할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 31
EnAd-FAPBiTE-매개 종양용해 및 T 세포 자극은 환자 복수에서 CD11b+ TAM을 더 활성화된 표현형으로 분극화한다
T-세포의 FAP BiTE-매개 활성화, 및 FAP+ 섬유아세포의 후속적 제거에 의한 Th1 사이토카인(IFNγ, TNFα 및 IL-2를 포함)의 생성 및 TGFβ1의 관련된 감소가 항-종양 활성에 대해 면역억제성 그리고 암유발성으로부터 종양 미세환경에서의 다른 이동과 관련되었는지의 여부를 연구하기 위해, 비분리 복수 세포 샘플에서 종양-관련 대식세포(TAM)에 대한 효과를 평가하였다. 총 비정제 환자 복수 세포를 50% 복수액에서 플레이팅하고, 유리 대조군 또는 FAP BiTE로 처리하거나 또는 EnAd-SA-대조군 BiTE 또는 EnAd-SA-FAPBiTE 바이러스(100vp/세포에서)로 감염시켰다. 동시에, 활성화된 CD11b 골수성 세포 표현형을 유도하기 위해 일부 세포를 IFNγ로 처리하였다. 3일의 인큐베이션 후에, T-세포의 활성화 상태를 처음 측정하였고; CD25+ 세포를 유세포 분석 및 ELISA에 의한 IFNγ분비에 의해 측정하였다.
FAP BiTE 및 EnAd-SA-FAPBiTE에 의한 처리는 led to 대략 60%의 CD3+ T-세포가 CD25+가 되도록(도 75A) 그리고 배양물 상청액에서 다량의 IFNγ(도 75B)를 야기하였다. CD25 발현 또는 IFNγ에 대해 대조군 BiTE 또는 대조군 바이러스에 의한 상기 배경의 증가는 관찰되지 않았다. TAM 분극을 평가하기 위해, CD64 및 CD86(M1 또는 '활성화된' 대식세포 마커) 및 CD206 및 CD163(M2 또는 TAM 마커)의 발현 수준을 유세포 분석에 의해 CD11b+ 세포 상에서 측정하였다(도 75c). 유리 FAP BiTE 또는 EnAd 발현 FAP BiTE에 의한 처리는 더 활성화된 표현형을 유도하고, CD64 발현의 상당한 증가 및 CD206 및 CD163의 강한 감소에 의해 나타난다 - IFNγ가 배양물 내로 박힐 때 관찰되는 것과 유사.
유리 FAP BiTE 또는 대조군 바이러스는 본 실험에서 배경 초과로 CD86의 분명한 변화를 유도하지 않았지만, EnAd 발현 FAP BiTE는 CD86 발현의 큰 증가를 유도하였는데, 이는 EnAd 바이러스 감염 및 FAP BiTE 활성이 억제성 종양 미세환경, 예컨대, 본 명세서에서 시험한 악성종양 복수액 내에서 1차 골수 세포를 활성화시키도록 상승작용할 수 있다는 것을 나타낸다. 본 연구에서, IFNγ 처리는 CD86의 보통의 감소를 유도하였는데, 이는 EnAd-SA-FAPBiTE에 의해 관찰되는 CD86의 강한 증가가 IFNγ-독립적 메커니즘을 통할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 32
EnAd-FAPBiTE는 종양-침윤성 림프구를 활성화하며, 생체외 고형 전립선 종양 생검에서 세포독성을 유도한다
조직 슬라이스 배양물은 다양한 조직, 기관 및 종양의 가장 현실적인 전임상 모델 중 하나를 제공한다. 이 고도로 임상적으로 적절한 설정에서 FAP BiTE 발현 바이러스의 활성을 평가하기 위해, 절제된 인간 전립선으로부터의 악성종양 및 양성 전립선 조직의 몇몇 짝지어진 펀치 생검을 연구하였다. 초기 선별 시, 전립선 조직은 산재된 CD8 T-세포(도 76B)를 함유하는 기질의 거대 영역 사이에 배치된 EpCAM+ 종양 세포(도 76A)의 원형 고리를 갖는 것으로 재현 가능하게 나타났다. FAP 염색은 종양 영역에 인접한 섬유아세포 상에서 발견되었다(도 76C).
코어는 미세절단기에 의해 300㎛ 두께로 슬라이싱하였고, 슬라이스 배양물은 바이러스의 존재 하에(1.5e9vp/슬라이스) 확립되거나, 또는 비감염으로 남았다. 7일 후에, 슬라이스를 고정시키고, 파라핀-포매하고 나서, 절단하고, T-세포 활성화 상태를 CD25 발현에 대해 염색에 의해 면역조직화학(IHC)으로 평가하였다(도 76D). EnAd-CMV-FAPBiTE 또는 EnAd-SA-FAPBiTE를 받은 샘플만이 강한 CD25 염색에 의해 나타나는 종양-침윤성 T-세포의 활성화를 나타내었다. 비처리 또는 대조군 바이러스-처리 중 어떤 것도 검출 가능한 CD25-양성 세포를 갖지 않았다. 감염 후 4일 및 7일에 취한 이들 슬라이스 배양물로부터의 상청액을 ELISA에 의해 IFNγ 및 IL-2에 대해 시험하였고, IFNγ의 증가는 악성종양으로부터 검출되었지만, 양성에 대해서는 그렇지 않으며, 전립선 슬라이스 배양물은 FAP BiTE 바이러스 중 하나로 감염되었고(도 76E) 그리고 IL-2는 EnAd-SA-FAPBiTE 바이러스와의 배양물에서 검출되었다(도 76F). EnAd-SA-FAPBiTE는 더 다량의 IFNγ를 유도하였는데, 이는 CMV-유도 FAPBiTE 바이러스보다 더 빠르게 검출 가능하였다.
실시예 33 - EnAd 바이러스 발현 EpCAM 또는 FAP BiTE
단일 BiTE를 암호화하는 5종의 바이러스(NG-611, NG-612, NG-613, NG-614, NG-617)를 생성하였다(표 8).
Figure 112022078544073-pat00008
각각의 이식유전자 카세트에서, BiTE를 암호화하는 cDNA는 짧은 스플라이스 수용자 서열(SSA, 서열번호 55) 또는 더 긴 스플라이스 수용자 서열(SA, 서열번호 86) 중 하나를 갖는 5' 말단에 측접된다. BiTE의 3' 말단에서, 히스티딘 태그(HIS, 서열번호 41) 또는 태그 없음 중 하나에 의해 선행되는 SV40 후기 폴리(A) 서열(PA, 서열번호 65)이 암호화되었다. 바이러스 NG-611, NG-612, NG-613 및 NG-617에서, BiTE 분자의 항-CD3 부분은 마우스 항-인간 CD3 단클론성 항체 OKT3의 단일쇄 변이체를 사용하였다.
바이러스 생성
합성된 이식유전자 카세트의 직접 삽입에 의해 플라스미드 pNG-611, pNG-612, pNG-613, pNG-614 및 pNG-617(각각 서열번호 88 내지 92)을 생성하기 위해 플라스미드 pEnAd2.4를 사용하였다. pNG-611 이식유전자 카세트는 EpCam 표적화 BiTE(서열번호 93)에 대해 암호화하고, pNG-612, pNG-613 및 pNG-617 이식유전자 카세트는 서열번호 94의 FAP 표적화 BiTE를 암호화하며, pNG-614 이식유전자 카세트는 서열번호 95의 FAP 표적화 BiTE를 암호화한다. 이식유전자 카세트의 개략도를 도 77A 내지 도 77C에 나타낸다. 제한 분석 및 DNA 서열분석에 의해 플라스미드 DNA의 작제를 확인하였다.
바이러스 게놈을 생성하기 위해 효소 AscI를 이용하는 제한 분해에 의해 플라스미드, pNG-611, pNG-612, pNG-613, pNG-614 및 pNG-617을 선형화하였다. 바이러스를 증폭시키고 나서, 이하에 제공하는 방법에 따라 정제하였다.
분해된 DNA를 페놀/클로로폼 추출에 의해 정제하고 나서, 300㎕의 95% 초과 분자 생물학 등급 에탄올 및 10㎕의 3M 아세트산나트륨에서 16시간 동안, -20℃에서 침전시켰다. 14000rpm, 5분에서 원심분리에 의해 침전된 DNA를 펠릿화하고 나서, 14000rpm, 5분으로 다시 원심분리시키기 전에 500㎕의 70% 에탄올에서 세척하였다. 깨끗한 DNA 펠릿을 공기 건조시키고 나서, 15㎕의 리포펙타민 형질감염시약을 함유하는 500㎕의 OptiMEM에서 재현탁시키고, 30분 동안, RT에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 70% 합류로 성장시킨 293 세포를 함유하는 T-25 플라스크에 형질감염 혼합물을 적가하였다. 2시간 동안 37℃, 5% CO2에서 형질감염 혼합물과 함께 세포의 인큐베이션 후, 4㎖의 세포 배지(2% FBS와 함께 글루타민을 보충한 DMEM 고 글루코스)를 세포에 첨가하고 나서, 플라스크를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다.
형질감염시킨 293 세포를 24시간마다 모니터링하고 나서, 48 내지 72시간마다 추가 배지로 보충하였다. 세포 단일층에서 상당한 세포 변성 효과의 관찰에 의해 바이러스의 생성을 모니터링하였다. 일단 광대한 CPE가 관찰되면, 3회의 냉동-해동 주기에 의해 293 세포로부터 바이러스를 채취하였다. 바이러스 저장액을 증폭시키기 위해 채취한 바이러스를 사용하여 293 세포를 재감염시켰다. 세포 단일층에서 상당한 CPE의 관찰에 의해 증폭 동안 살아있는 바이러스 생성을 확인하였다. 일단 CPE가 관찰되면, 3회의 냉동-해동 주기에 의해 293 세포로부터 바이러스를 채취하였다. 추가 증폭을 위해 바이러스의 증폭된 저장액을 사용한 후에, 정제된 바이러스 저장액을 생성하기 위해 2배 염화세슘 밴딩에 의해 바이러스를 정제하였다.
qPCR에 의해 평가한 바이러스 활성
qPCR에 의한 바이러스 DNA의 정량화를 위해, 72시간 동안 1ppc의 NG-611, NG-612, NG-617, 에나데노툭시레브로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 둔 A549 세포를 사용하였다. 세포 상청액을 수집하고 나서, 5분 동안, 1200rpm에서 원심분리에 의해 정제하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 퀴아젠(Qiagen) DNeasy 키트를 이용하여 45㎕의 상청액으로부터 DNA를 추출하였다. 에나데노툭시레브 바이러스 입자(2.5e10-2.5e5vp)를 이용하는 표준 곡선을 준비하고 나서, DNeasy 키트를 이용하여 추출하였다. 각각의 추출된 샘플 또는 표준을 초기 유전자 E3으로 설정한 바이러스 유전자 특이적 프라이머-프로브를 이용하는 qPCR에 의해 분석하였다.
세포당 검출된 바이러스 게놈 수의 정량화는 NG-611, NG-612 및 NG-617이 A549 세포주에서 상당한 게놈 복제를 나타내었다는 것을 입증하였다(도 77d). 이는 모 바이러스 에나데노툭시레브를 포함하는 시험한 모든 바이러스에 대해 유사하였는데, 이는 BiTE 이식유전자의 포함이 바이러스 복제 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 바이러스 게놈은 비감염 세포에서 검출할 수 없었다(데이터 미제시).
BiTE 발현 바이러스에 의해 매개되는 T 세포 활성화 및 탈과립화.
암종 세포 감염
A549 세포를 2.5e5개의 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에서 파종하였다. 플레이트를 4시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 1ppc의 NG-611, NG-612, 에나데노툭시레브로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 감염 후 24, 48 또는 72시간에, 상청액을 세포로부터 채취하고 나서, 5분 동안, 1200rpm에서 원심분리에 의해 정제하고, 순간 냉동시켰다.
T 세포 분석
FAP 발현 폐 섬유아세포 세포주 MRC-5, 또는 EpCam 발현 난소 암종 세포, SKOV3를 각각 5.7e4개의 세포/웰 및 1.2e5개의 세포/웰의 밀도로 48 웰 플레이트 내로 파종하였다. 플레이트를 4시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 배양시킨 후에, 배지를 A549 플레이트로부터 채취한 150㎕/웰의 해동 상청액으로 대체하였다. 이어서, 인간 PBMC 공여자로부터 단리시킨 정제된 CD3 T 세포를 플레이트에 첨가하여 2 대 1의 T세포 대 MRC-5 또는 SKOV3의 비를 제공하였다. 공동 배양물을 16시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에 ELISA 분석을 위해 세포의 상청액을 수집하였고, 유세포 분석을 위해 T 세포를 채취하였다. 비부착 세포를 함유하는 배양 배지를 공동 배양 웰로부터 제거하고, 원심분리시켰다(300xg). 상청액을 조심해서 제거하고 나서, PBS 5% BSA를 이용하여 1:2로 희석시키고, ELISA 분석을 위해 저장하였다. PBS를 이용하여 부착 세포 단일층을 1회 세척하고, 이어서, 트립신을 이용하여 탈착시켰다. 10% FBS RPMI 배지를 이용하여 트립신을 비활성화시키고 나서, 세포를 배양물 상청액으로부터 수집한 세포 펠릿에 첨가하였다. 세포를 원심분리시키고(300xg), 상청액을 버리고 나서, 세포 펠릿을 200㎕의 PBS 중에서 세척하였다. 세포를 다시 원심분리시키고, 이어서, RT에서 15분 동안 생/사멸 아쿠아(Live/Dead Aqua)(라이프 테크)를 함유하는 50㎕의 PBS에서 재현탁시켰다. 세포를 FACs 완충제에서 1회 세척한 후에, 직접 접합된 항체의 패널로 염색하였다: AF700에 접합된 항-CD3; BV421에 접합된 항-CD25; PE/CY5에 접합된 항-HLA-DR; BV605에 접합된 항-CD40L; PE에 접합된 항-CD69 및 FITC에 접합된 항-CD107a. 각각의 공동 배양 조건으로부터의 세포의 샘플을 적절한 아이소타입 대조군 항체로 염색하였다. 15분 동안, 4℃에서 50㎕/웰의 총 용적으로 FACs 완충제 중에서 모든 염색을 수행하였다. 이어서, 세포를 FACs 완충제(200㎕)로 2회 세척한 후에, 200㎕의 FACs 완충제 중에서 재현탁시키고, 유세포 분석(어튠(Attune))에 의해 분석하였다.
T 세포 활성화 마커의 상향조절
T 세포 활성화의 유세포 분석을 T 세포 활성화 마커 CD25, CD69, HLA-DR 및 CD40L 또는 T 세포 탈과립화 마커, 살아있는 CD107a, 단일 세포의 발현에 의해 평가하였다. 이들 데이터는 EpCam+ SKOV3 세포와 함께 공동 배양시켰을 때, T 세포 발현 CD25, CD69, HLA-DR, CD40L 또는 세포 표면 CD107a의 수는 NG-612, 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군 상청액에 비해 NG-611 상청액을 세포에 첨가하였을 때 상당히 증가되었다는 것을 나타내었다(도 78). 모든 이들 마커에 대해, lT 세포 활성화는 24시간 동안 감염시킨 A549 세포로부터의 상청액에 의해 거의 자극되지 않았지만, 그러나 감염 후 48시간 까지 상청액은 모든 마커에 걸쳐 상당한 T 세포 활성화를 자극하였다. 이는 또한 감염 후 72시간의 경우이다.
FAP+ MRC-5 세포와 함께 공동배양시켰을 때, NG-611, 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군 상청액에 비해 NG-612 상청액을 세포에 첨가하였을 때, T 세포 발현 CD25, CD69, HLA-DR, CD40L 또는 세포 표면 CD107a의 수는 상당히 증가되었다(도 79). 일부 T 세포 활성화는 또한 NG-611 바이러스에 의해 관찰될 수 있었는데, 이는 NG-611 바이러스에 의해 발현되는 EpCam BiTE에 맞물리는 MRC-5 세포주 상에서 EpCam의 낮지만 검출 가능한 발현(대략 5%)에 기인할 가능성이 있다(도 80). 모든 이들 마커에 대해, lT 세포 활성화는 24시간 동안 감염시킨 A549 세포로부터의 상청액에 의해 거의 자극되지 않았지만, 그러나 감염 후 48시간 까지 상청액은 모든 마커에 걸쳐 상당한 T 세포 활성화를 자극하였다. CD25 및 CD69 마커는 또한 감염 후 72시간에 채취한 상청액과 함께 인큐베이션 후에 상향조절되었지만, 그러나, 활성화 마커, HLA-DR, CD40L 및 CD107a는 감염 후 48시간보다 감염후 72시간에 채취한 상청액에 의해 더 낮은 수준으로 검출되었다. 이는 빠르고 강력한 T 세포 활성화를 야기하는 이런 이후 단계의 감염에 존재하는 고수준의 BiTE에 기인할 수 있는데, 이는 효과기 기능이 상청액에 의한 인큐베이션 후 16시간보다 더 빠른 시점에 측정될 필요가 있다는 것을 의미한다.
IFNγ 발현의 검출을 위해, 공동 배양물 상청액을 5% BSA/PBS 분석 완충제로 희석시키고(1:10 내지 1:1000 범위에서) 제조업자의 프로토콜에 따라 인간 IFN 감마 퀀티카인(Quantikine) ELISA 키트(알앤디 시스템즈)를 이용하여 ELISA를 수행하였다. 표준 곡선으로부터 보간함으로써 분비된 IFNγ의 농도를 결정하였다. IFNγ의 발현은 SKOV3 세포 상에서 NG-611(도 81A) 또는 MRC-5 세포 상에서 NG-611, NG-612(도 81B)를 이용하여 공동배양물의 상청액 중에서만 검출될 수 있었다.
실시예 34: 생체내 BiTE 발현 바이러스의 면역 활성화 및 항-종양 효능
NSG 마우스 인간화된 CD34+ 조혈 줄기 세포(잭슨 랩스(Jackson Labs)로부터)를 생착 후 18주에 양 옆구리 상에 피하로 HCT116 종양 세포를 이식하였다. 일단 종양이 80 내지 400㎣에 도달되면, 각각의 처리 아암은 동등한 분포의 종양 용적을 갖도록 마우스를 그룹화하였다(그룹당 7마리 마우스). 마우스에 주사당 5x109개의 입자로 식염수, 에나데노툭시레브 또는 NG-611로 종양내로 주사하였다(종양당 2회 주사). 옆구리 둘 다에 대한 종양을 치료하였다. 종양 용적을 주당 3 내지 4회 측정하였고, NG-611 처리는 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군에 비해 투약 후 20일에 상당한 항종양 반응을 초래하였다는 것을 입증하였다(도 82a). 투약 후 20일 후에, 각각의 그룹에서 4마리 마우스로부터 하나의 종양을 유세포 분석을 위해 처리한 한편, 남아있는 종양을 드라이 아이스 상에서 냉동시켰다.
유세포 분석
작은 용적의 RPMI 배지에서 절제 직후에 종양 샘플을 기계적으로 분해시켰다. 이어서, 분해된 종양을 70㎛의 셀 스트레이너(cell strainer)에 통과시키고, 300g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 15분 동안 얼음 상에서 생/사 아쿠아(라이프 테크)를 함유하는 100㎕의 PBS 중에 세포 펠릿을 재현탁시켰다.　 세포를 FACs 완충제(5% BSA PBS) 중에서 1회 세척한 후에 직접 접합된 항체의 패널을 이용하여 염색하였다: 항-CD8 (RPA-T8, AF700); 항-CD4(RPA-T4, PE); 항-CD45(2D1, APC-Fire 750); 항-CD3 (OKT3, PerCP-Cy5.5); 항-CD25(M-A251, PE-Dazzle 594); 항-CD69 (FN50, APC); 항-HLA-DR (L243, BV605); 항-CD107a(H4A3, FITC).　 적절한 아이소타입 대조군 항체를 이용하여 종양 세포 현탁액의 풀을 염색하였다.　 20분 동안, 4℃에서 50㎕/웰의 총 용적으로 FACs 완충제 중에서 모든 염색을 수행하였다. 세포를 FACs 완충제(200㎕)로 3회 세척한 후에, 200㎕의 FACs 완충제 중에서 재현탁시키고, 유세포 분석(어튠(Attune))에 의해 분석하였다. FACs 분석은 종양 내 CD8 대 CD4 T 세포의 비가 에나데노툭시레브 처리 또는 비처리 대조군에 비해 NG-611 처리 종양에서 상당히 증가되었다는 것을 입증하였다(도 82b).
실시예 35 - EnAd 바이러스는 FAP BiTE 및 면역 조절 사이토카인 및 케모카인을 공동 발현시킨다
FAP BiTE 및 면역조절 단백질을 암호화한 3종의 바이러스(NG-615, NG-640 및 NG-641)를 생성하였다(표 9).
Figure 112022078544073-pat00009
바이러스 생성
합성된 이식유전자 카세트의 직접 삽입에 의해 플라스미드 pNG-615, pNG-616, pNG-640 및 pNG-641(각각 서열번호 112 내지 114)을 생성하기 위해 플라스미드 pEnAd2.4를 사용하였다. NG-615 및 NG-616은 FAP-표적화 BiTE(서열번호 94), Flt3L(서열번호 115), MIP1α 서열번호 116) 및 IFNα(서열번호 117)를 암호화하는 4가지의 이식유전자를 함유한다. NG-640 및 NG-641은 FAP 표적화 BiTe (서열번호 94), CXCL9(서열번호 118) 및 CXCL10(서열번호 119)을 암호화하고, NG-641은 또한 IFNα을 암호화하는 4번째 이식유전자(서열번호 117)를 함유한다. 이식유전자 카세트의 개략도를 도 83A 내지 도 83C에 나타낸다. 제한 분석 및 DNA 서열분석에 의해 플라스미드 DNA의 작제를 확인하였다.
바이러스 게놈을 생성하기 위해 효소 AscI를 이용하는 제한 분해에 의해 플라스미드, pNG-615, pNG-616, pNG-640 및 pNG-641을 선형화하였다. 바이러스를 증폭시키고 나서, 실시예 33에 상술하는 방법에 따라 정제하였다.
qPCR 및 이식유전자 ELISA에 의해 평가한 바이러스 활성
암종 세포 감염
qPCR에 의한 바이러스 DNA의 정량화 및 ELISA에 의한 이식유전자 발현의 분석을 위해, 72시간 동안 1ppc NG-615, 에나데노툭시레브로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 둔 A549 세포를 사용하였다. 세포 상청액을 수집하고 나서, 5분 동안, 1200rpm에서 원심분리에 의해 정제하였다. DNA 분석을 위해 45㎕의 상청액을 사용하였고, ELISA를 위해 남아있는 상청액을 사용하였다.
qPCR
제조업자의 프로토콜에 따라 퀴아젠(Qiagen) DNeasy 키트를 이용하여 상청액 샘플로부터 DNA를 추출하였다. 에나데노툭시레브 바이러스 입자(2.5e10-2.5e5vp)를 이용하는 표준 곡선을 준비하고 나서, DNeasy 키트를 이용하여 추출하였다. 각각의 추출된 샘플 또는 표준을 초기 유전자 E3으로 설정한 바이러스 유전자 특이적 프라이머-프로브를 이용하는 qPCR에 의해 분석하였다. 세포당 검출된 바이러스 게놈 수의 정량화는 NG-615가 모 바이러스 에나데노툭시레브와 유사한 수준으로 A549 세포주에서 상당한 게놈 복제를 나타내었다는 것을 입증하였다(도 84). 이들 데이터는 BiTE 및 3가지 면역조절 이식유전자의 포함이 바이러스 복제 활성에 상당히 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내었다. 바이러스 게놈은 비감염 세포에서 검출할 수 없었다.
ELISA
베리카인(Verikine) 인간 IFN 알파 키트(Pbl 어세이 사이언스(Pbl assay science))를 이용하여 IFNα ELISA를 수행하였고, 인간 CCL3 퀀티카인 ELISA 키트(알앤디 시스템즈)를 이용하여 MIP1α ELISA를 수행하였으며, Flt3L 인간 ELISA 키트(앱캠(Abcam))를 이용하여 Flt3L ELISA를 수행하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 모든 분석을 수행하였다.
표준 곡선으로부터 보간함으로써 분비된 IFNα, MIPα 또는 FLt3L의 농도를 결정하였다. IFNα, MIP1α 및 Flt3 L 발현을 NG-615의 세포 상청액(그러나 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군 세포는 아님)에서 검출할 수 있었다(도 85).
BiTE 발현 바이러스에 의해 매개되는 T 세포 활성화 및 탈과립화.
암종 세포 감염
A549 세포를 2.5e5개의 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에서 파종하였다. 플레이트를 4시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 1ppc의 NG-612, NG-615, 에나데노툭시레브로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 감염 후 24, 48 또는 72시간에, 상청액을 세포로부터 채취하고 나서, 5분 동안, 1200rpm에서 원심분리에 의해 정제하고, 순간 냉동시켰다.
T 세포 분석
5.7e4개의 세포/웰의 밀도로 FAP 발현 폐 섬유아세포 세포주 MRC-5를 48 웰 플레이트 내로 파종하였다. 플레이트를 4시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 배양시킨 후에, 배지를 A549 플레이트로부터 채취한 150㎕/웰의 해동 상청액으로 대체하였다. 이어서, 인간 PBMC 공여자로부터 단리시킨 정제된 CD3 T 세포를 플레이트에 첨가하여 2 대 1의 T세포 대 MRC-5의 비를 제공하였다. 공동 배양물을 16시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에 ELISA 분석을 위해 세포의 상청액을 수집하였고, 실시예 29에 상술한 방법에 따라 유세포 분석을 위해 T 세포를 채취하였다.
T 세포 활성화 마커의 상향조절
T 세포 활성화의 유세포 분석을 T 세포 활성화 마커 CD25, CD69, HLA-DR 및 CD40L 또는 T 세포 탈과립화 마커, 살아있는 CD107a, CD3+, 단일 세포의 발현에 의해 평가하였다. 이들 데이터는 FAP+ MRC-5 세포와 함께 공동배양시켰을 때, 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군 상청액에 비해 NG-615 또는 612 상청액을 세포에 첨가하였을 때, T 세포 발현 CD25, CD69, HLA-DR, CD40L 또는 CD107a의 수가 상당히 증가되었다는 것을 나타내었다(도 86).
자극 사이토카인 IFNγ의 분비
IFNγ발현의 검출을 위해, 공동 배양물 상청액을 5% BSA/PBS 분석 완충제로 희석시키고(1:10 내지 1:1000 범위에서) 제조업자의 프로토콜에 따라 인간 IFN 감마 퀀티카인 키트(알앤디 시스템즈)를 이용하여 ELISA를 수행하였다. 표준 곡선으로부터 보간함으로써 분비된 IFNγ의 농도를 결정하였다. IFNγ의 발현은 NG-612 또는 NG-615 감염 A549 상청액을 이용하여 공동 배양물의 상청액에서만 검출할 수 있었다(도 87).
실시예 36 - EnAd 바이러스는 BiTE 표적화 FAP 및 BiTE 표적화 EpCam를 공동 발현시킨다
2개의 BiTE 분자(하나는 EpCam(EpCam BiTE)를 표적화하고 하나는 FAP(FAP BiTE)를 표적화함)를 암호화하는 바이러스 NG-618을 생성하였다(표 10).
Figure 112022078544073-pat00010
바이러스 생성
합성된 이식유전자 카세트의 직접 삽입에 의해 플라스미드 pNG-618(서열번호 123)을 생성하기 위해 플라스미드 pEnAd2.4를 사용하였다. NG-618 바이러스는 EpCam 표적화 BiTE(서열번호 93) 및 FAP 표적화 BiTE(서열번호 95)를 암호화하는 2개의 이식유전자를 함유한다. 이식유전자 카세트의 개략도를 도 88에 나타낸다. 제한 분석 및 DNA 서열분석에 의해 플라스미드 DNA의 작제를 확인하였다.
바이러스 게놈을 생성하기 위해 효소 AscI를 이용하는 제한 분해에 의해 플라스미드 pNG-618을 선형화하였다. 바이러스를 증폭시키고 나서, 실시예 33에 상술하는 방법에 따라 정제하였다.
BiTE 발현 바이러스에 의해 매개되는 T 세포 활성화 및 탈과립화.
암종 세포 감염
A549 세포를 1.2e6개의 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에서 파종하였다. 플레이트를 4시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에, 세포를 NG-611, NG-612, NG-618, 에나데노툭시레브로 감염시키거나 또는 비감염인 채로 두었다. 감염 후 72시간에, 상청액을 세포로부터 채취하고 나서, 5분 동안, 1200rpm에서 원심분리에 의해 정제하였다.
T 세포 분석
1.5e5개의 세포/웰의 밀도로 FAP 발현 폐 섬유아세포 세포주 MRC-5 및 EpCam 발현 A549 세포를 24 웰 플레이트 내로 파종하였다. MRC-5 및 A549 세포를 또한 1 대 1 비로 혼합하고, 1.5e5개의 세포/웰의 총 세포 밀도로 24 플레이트에 파종하였다. 플레이트를 4시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 배양시킨 후에, 배지를 A549 플레이트로부터 채취한 300㎕/웰의 해동 상청액으로 대체하였다. 이어서, 인간 PBMC 공여자로부터 단리시킨 정제된 CD3 T 세포를 플레이트에 첨가하여 2 대 1의 T세포 대 MRC-5 또는 SKOV3 세포의 비를 제공하였다. 공동 배양물을 16시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시킨 후에 ELISA 분석을 위해 세포의 상청액을 수집하였고, 유세포 분석을 위해 T, MRC-5 및 A549 세포를 채취하였다.
MRC-5 또는 SKOV 세포 상에서 FAP 및 EpCam의 검출
FACs 완충제 중에서 1회 세포를 세척함으로써 MRC-5 또는 SKOV 세포 각각의 표면 상에서 검출 가능한 FAP 또는 EpCam의 유세포 분석을 평가한 후에, 직접 접합된 항체의 패널을 이용하여 염색하였다: AF647에 접합된 항-FAP; PE에 접합된 항-EpCam. 분석은 FAP 발현이 FAP-BiTE 발현 바이러스인 NG-618로 감염시킨 세포로부터의 상청액과 함께 인큐베이션시킨 MRC-5 세포 상에서 더 이상 검출 가능하지 않았지만, EnAd로 처리한 세포 또는 비처리 세포로부터의 상청액과 함께 인큐베이션시킨 80% 초과의 세포가 검출되었다는 것을 나타내었다(도 89A). 이들 데이터는 NG-618 바이러스에 의해 생성된 FAP-BiTE가 MRC-5 세포 상에서 그의 FAP 표적과 결합하여 항-FAP 항체의 결합을 막는다는 것을 나타낸다. EpCam의 검출 가능한 발현에 대해 살아있는, 거대, 단일 세포 SKOV 세포를 평가하였다. EpCam 발현은 EpCam-BiTE 발현 바이러스인 NG-618로 감염시킨 세포(세포의 17%)로부터의 상청액과 함께 인큐베이션시킨 SKOV 세포 상에서 단지 낮은 수준으로 검출 가능하였지만, EnAd로 처리한 세포 또는 비처리 세포로부터의 상청액과 함께 인큐베이션시킨 세포의 40% 초과에 대해 검출되었다(도 89B). 종합적으로, 이들 데이터는 NG-618이 EpCam 및 FAP 표적 단백질에 결합하는 BiTE 분자를 생성한다는 것을 나타낸다.
T 세포 활성화 마커의 상향조절
T 세포 활성화의 유세포 분석을 T 세포 활성화 마커 CD25, CD69, HLA-DR 및 CD40L 또는 T 세포 탈과립화 마커, 살아있는 CD107a, CD3+, 단일 세포의 발현에 의해 평가하였다. 이들 데이터는 FAP+ MRC-5 세포와 함께 공동배양시켰을 때, T 세포 발현 CD25, CD40L 또는 CD107a의 수는 NG-618 상청액이 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군 상청액에 비해 세포에 첨가되었을 때에 상당히 증가되었다는 것을 나타내었다(도 90). NG-618 상청액이 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군 상청액에 비해 EpCam+ SKOV3 세포에 첨가되었을 때 T 세포 발현 CD25, CD40L 또는 CD107a의 수는 또한 상당히 증가되었다(도 91). 이들 데이터는 NG-618 바이러스에 의해 발현되는 BiTE 분자가 둘 다 T 세포 활성화 유도에 관해 기능성이라는 것을 입증한다.
T 세포 매개 표적(MRC-5 및 SKOV) 세포 사멸의 분석
RT에서 15분 동안 생/사멸 아쿠아(라이프 테크)를 함유하는 50㎕의 PBS에서 세포를 염색함으로써 MRC-5 및 SKOV 세포 생존도의 유세포 분석을 평가하였다. 세포를 FACs 완충제 중에서 1회 세척한 후에, 직접 접합된 항체의 패널을 이용하여 염색하였다: AF647에 접합된 항-FAP; PE에 접합된 항-EpCam. MRC-5 및 SKOV 세포 생존도는 NG-618 상청액 샘플과 함께 인큐베이션 후에 상당히 감소된 반면, 에나데노툭시레브 또는 비처리 대조군 상청액에서 상당한 세포사는 검출 가능하지 않았다 도 92. 이들 데이터는 표적 세포의 T 세포 매개 세포 사멸을 유도하는 NG-618 공동발현된 FAP 및 EpCam 표적화 BiTe의 기능성 능력을 입증한다.
서열
Figure 112022078544073-pat00011
<110> PsiOxus Therapeutics Limited <120> Adenovirus armed with bispecific T cell activator <130> WO/2018/041838 <140> PCT/EP2017/071674 <141> 2017-08-29 <150> GB1614607.8 <151> 2016-08-29 <150> GB1700663.6 <151> 2017-01-13 <150> GB1706219.1 <151> 2017-04-19 <150> GB1713765.4 <151> 2017-08-28 <160> 298 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1578 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-EpCAM bispecific T cell activator DNA coding sequence, with N-terminal signal sequence and C-terminal deca-His affinity tag <400> 1 atgggatgga gctgcatcat cctattcctc gtggcgacgg ccactggagt gcatagcgaa 60 ctggtgatga ctcagtcccc gtcatccctg acggtgaccg ccggcgagaa ggtcaccatg 120 tcgtgcaagt cctcgcaaag cctgcttaac agcggcaacc agaaaaacta cctcacgtgg 180 tatcagcaaa agccaggtca acccccaaaa ctgctcatct actgggcgag cacccgcgag 240 tcgggggtgc cagaccggtt caccggctcc gggtcaggaa ctgatttcac cctaaccatc 300 agctcggtgc aagcggagga cctggccgtg tactactgcc aaaatgatta ctcgtaccct 360 ctgacctttg gagcgggcac caagctcgaa atcaagggcg gtggaggaag cggcggggga 420 ggctcaggtg ggggaggatc agaagtccaa ctgctggagc agtcaggagc cgaactggtc 480 cgcccgggaa cctccgtcaa gatttcctgt aaggcttccg gctacgcttt taccaattac 540 tggctgggct gggtcaagca aagaccgggg catggcctgg agtggatcgg cgacatcttc 600 ccagggagcg gcaacatcca ctacaacgag aagttcaagg ggaaagcgac tctgactgcc 660 gacaaatcat ccagcaccgc ctacatgcag ctgtcgtcgc tcactttcga agacagcgcg 720 gtgtactttt gtgctcggct ccggaactgg gatgaaccaa tggactactg gggacaagga 780 actaccgtga ccgtctcctc cggcggcggt ggaagcgatg tgcaactcgt gcagtccggt 840 gcggaagtga aaaagccggg cgcgagcgtc aaagtgtcat gcaaggcgtc aggatatacg 900 tttactagat acactatgca ctgggtgcgc caggcacctg gtcagggcct tgaatggatc 960 ggctacatca atccgtcgag aggctacact aattacgcgg actcagtcaa agggcgcttc 1020 acgattacga ccgacaagtc cacctcgact gcatacatgg aactgtcctc gctgagaagc 1080 gaggacaccg ctacttacta ctgcgctaga tactacgatg atcactactg cctcgattac 1140 tggggccagg gaaccactgt cacggtgtca tcgggagagg gcacctcaac cggatcaggg 1200 ggatcgggag gctcgggcgg cgcagacgac atcgtcctga cccagtcgcc cgccaccttg 1260 tcgctgtccc caggagaaag agcgaccctg tcatgccggg cgtcgcaaag cgtgagctat 1320 atgaattggt atcagcagaa gccaggaaag gcgccgaaga gatggatcta cgacacctcc 1380 aaggtcgctt caggtgtccc ggctagattc tcaggatcgg gatcaggaac ggactactcc 1440 ctgaccatca attcactgga agcagaagat gcggccacct actactgtca gcagtggtcc 1500 tccaacccgc tgactttcgg aggcggaact aaggtcgaga tcaagcatca ccatcaccat 1560 caccaccatc accattag 1578 <210> 2 <211> 525 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-EpCAM bispecific T cell activator protein sequence, with N-terminal signal sequence and C-terminal deca-His affinity tag <400> 2 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val 20 25 30 Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val 145 150 155 160 Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala 165 170 175 Phe Thr Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly 180 185 190 Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr 195 200 205 Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser 210 215 220 Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala 225 230 235 240 Val Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 260 265 270 Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 275 280 285 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 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aacaacggaa tcccaaatta caatcagaaa tttaaagggc gggtgactat caccgtggat 660 acctcggcct ccacggcgta catggagctc tcatcactca gatcggagga caccgcggtc 720 tattactgcg cccgccgccg gatcgcttat ggatacgatg aaggacatgc gatggattac 780 tggggccagg gcaccctcgt cacggtgtcg tcaggaggcg gcggttcaga tgtgcaactc 840 gtgcagtccg gtgcggaagt gaaaaagccg ggcgcgagcg tcaaagtgtc atgcaaggcg 900 tcaggatata cgtttactag atacactatg cactgggtgc gccaggcacc tggtcagggc 960 cttgaatgga tcggctacat caatccgtcg agaggctaca ctaattacgc ggactcagtc 1020 aaagggcgct tcacgattac gaccgacaag tccacctcga ctgcatacat ggaactgtcc 1080 tcgctgagaa gcgaggacac cgctacttac tactgcgcta gatactacga tgatcactac 1140 tgcctcgatt actggggcca gggaaccact gtcacggtgt catcgggaga gggcacctca 1200 accggatcag ggggatcggg aggctcgggc ggcgcagacg acatcgtcct gacccagtcg 1260 cccgccacct tgtcgctgtc cccaggagaa agagcgaccc tgtcatgccg ggcgtcgcaa 1320 agcgtgagct atatgaattg gtatcagcag aagccaggaa aggcgccgaa gagatggatc 1380 tacgacacct ccaaggtcgc ttcaggtgtc ccggctagat tctcaggatc gggatcagga 1440 acggactact ccctgaccat caattcactg gaagcagaag atgcggccac ctactactgt 1500 cagcagtggt cctccaaccc gctgactttc ggaggcggaa ctaaggtcga gatcaagcat 1560 caccatcacc atcaccacca tcaccattag 1590 <210> 4 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-FAP bispecific T cell activator amino acid sequence, with N-terminal signal sequence and C-terminal deca-His affinity tag <400> 4 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val 20 25 30 Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Leu Tyr Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 145 150 155 160 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe 165 170 175 Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 180 185 190 Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn 195 200 205 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser 210 215 220 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His 245 250 255 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 275 280 285 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 290 295 300 Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 305 310 315 320 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr 325 330 335 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 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actacccata ctactacgct 780 atggactact ggggacaagg aaccagcgtg accgtctcat cggcgaaaac tactccgccg 840 tcggtgacgt cgggaggtgg tggaagcgac gtgcagctcg tccagtcggg tgccgaggtg 900 aagaagccag gagcctccgt gaaggtctcg tgcaaagcca gcggctacac ttttactagg 960 tacactatgc actgggtgcg gcaagcgccg ggacaaggtc tggagtggat cggatacatc 1020 aatccgtcgc ggggatacac taattacgcg gactccgtca agggacggtt tactatcact 1080 acggataagt ccactagcac cgcctacatg gaactgtcct cgctgcggtc ggaagacact 1140 gcgacctact actgcgctag atattacgat gaccactact gcctcgacta ttgggggcag 1200 ggcactacgg tcaccgtctc gtcgggagaa ggaacctcaa ctggatcggg cggatcggga 1260 ggctccggag gagccgacga catcgtgctt acccagtcgc ctgcgaccct gtccctgtcc 1320 ccaggagaga gagcgactct ttcatgcagg gcttcccaat cagtctccta catgaattgg 1380 tatcaacaaa aacccggcaa ggccccgaaa cgctggatct acgatacttc aaaggtggcc 1440 agcggtgtgc ctgcccgctt ctccgggtcg gggtccggca ccgattactc gttgactatc 1500 aatagcctgg aggccgagga cgctgcaact tactactgcc agcagtggtc ctccaaccct 1560 ctcaccttcg gaggcgggac caaggtggaa atcaaacatc accatcacca tcaccaccat 1620 caccattag 1629 <210> 6 <211> 542 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control (Anti-FHA) bispecific T cell activator amino acid sequence with N-terminal signal sequence and C-terminal deca-His affinity tag <400> 6 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys 35 40 45 Ser Val Ser Ser Ser Gly Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 100 105 110 Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Ser Arg Ser Ser Leu Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro 145 150 155 160 Glu Leu 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atgagttcgt gtcctcgttg 540 agtgacaaac aggctgtccg tgtccccgta gactgatttt acaggcctct tctccagtgg 600 agtgcctcgg tcttcttcgt acaggaactc tgaccactct gatacaaagg cgcgcgtcca 660 ggccagcaca aaggaggcta tgtgggaggg gtagcgatcg ttgtcaacca gggggtccac 720 cttttccaaa gtatgcaaac acatgtcacc ctcttcaaca tccaggaatg tgattggctt 780 gtaggtgtat ttcacgtgac ctggggtccc cgctgggggg gtataaaagg gggcggttct 840 ttgctcttcc tcactgtctt ccggatcgct gtccaggaac gtcagctgtt ggggtaggta 900 ttccctctcg aaggcgggca tgacctctgc actcaggttg tcagtttcta agaacgagga 960 ggatttgata ttgacagtgc cggttgagat gcctttcatg aggttttcgt ccatctggtc 1020 agaaaacaca atttttttat tgtcaagttt ggtggcaaat gatccataca gggcgttgga 1080 taaaagtttg gcaatggatc gcatggtttg gttcttttcc ttgtccgcgc gctctttggc 1140 ggcgatgttg agttggacat actcgcgtgc caggcacttc cattcgggga agatagttgt 1200 taattcatct ggcacgattc tcacttgcca ccctcgatta tgcaaggtaa ttaaatccac 1260 actggtggcc acctcgcctc gaaggggttc attggtccaa cagagcctac ctcctttcct 1320 agaacagaaa gggggaagtg ggtctagcat aagttcatcg ggagggtctg catccatggt 1380 aaagattccc ggaagtaaat ccttatcaaa atagctgatg ggagtggggt catctaaggc 1440 catttgccat tctcgagctg ccagtgcgcg ctcatatggg ttaaggggac tgccccatgg 1500 catgggatgg gtgagtgcag aggcatacat gccacagatg tcatagacgt agatgggatc 1560 ctcaaagatg cctatgtagg ttggatagca tcgcccccct ctgatacttg ctcgcacata 1620 gtcatatagt tcatgtgatg gcgctagcag ccccggaccc aagttggtgc gattgggttt 1680 ttctgttctg tagacgatct ggcgaaagat ggcgtgagaa ttggaagaga tggtgggtct 1740 ttgaaaaatg ttgaaatggg catgaggtag acctacagag tctctgacaa agtgggcata 1800 agattcttga agcttggtta ccagttcggc ggtgacaagt acgtctaggg cgcagtagtc 1860 aagtgtttct tgaatgatgt cataacctgg ttggtttttc ttttcccaca gttcgcggtt 1920 gagaaggtat tcttcgcgat ccttccagta ctcttctagc ggaaacccgt ctttgtctgc 1980 acggtaagat cctagcatgt agaactgatt aactgccttg taagggcagc agcccttctc 2040 tacgggtaga gagtatgctt gagcagcttt tcgtagcgaa gcgtgagtaa gggcaaaggt 2100 gtctctgacc atgactttga ggaattggta tttgaagtcg atgtcgtcac aggctccctg 2160 ttcccagagt tggaagtcta cccgtttctt gtaggcgggg ttgggcaaag cgaaagtaac 2220 atcattgaag agaatcttgc cggccctggg catgaaattg cgagtgatgc gaaaaggctg 2280 tggtacttcc gctcggttat tgataacctg ggcagctagg acgatctcgt cgaaaccgtt 2340 gatgttgtgt cctacgatgt ataattctat gaaacgcggc gtgcctctga cgtgaggtag 2400 cttactgagc tcatcaaagg ttaggtctgt ggggtcagat aaggcgtagt gttcgagagc 2460 ccattcgtgc aggtgaggat tcgctttaag gaaggaggac cagaggtcca ctgccagtgc 2520 tgtttgtaac tggtcccggt actgacgaaa atgccgtccg actgccattt tttctggggt 2580 gacgcaatag aaggtttggg ggtcctgccg ccagcgatcc cacttgagtt ttatggcgag 2640 gtcataggcg atgttgacga gccgctggtc tccagagagt ttcatgacca gcatgaaggg 2700 gattagctgc ttgccaaagg accccatcca ggtgtaggtt tccacatcgt aggtgagaaa 2760 gagcctttct gtgcgaggat gagagccaat cgggaagaac tggatctcct gccaccagtt 2820 ggaggaatgg ctgttgatgt gatggaagta gaactccctg cgacgcgccg agcattcatg 2880 cttgtgcttg tacagacggc cgcagtagtc gcagcgttgc acgggttgta tctcgtgaat 2940 gagttgtacc tggcttccct tgacgagaaa tttcagtggg aagccgaggc ctggcgattg 3000 tatctcgtgc tttactatgt tgtctgcatc ggcctgttca tcttctgtct cgatggtggt 3060 catgctgacg agccctcgcg ggaggcaagt ccagacctcg gcgcggcagg ggcggagctc 3120 gaggacgaga gcgcgcaggc tggagctgtc cagggtcctg agacgctgcg gactcaggtt 3180 agtaggcagt gtcaggagat taacttgcat gatcttttgg agggcgtgcg ggaggttcag 3240 atagtacttg atctcaacgg gtccgttggt ggagatgtcg atggcttgca gggttccgtg 3300 tcccttgggc gctaccaccg tgcccttgtt tttcattttg gacggcggtg gctctgttgc 3360 ttcttgcatg tttagaagcg gtgtcgaggg cgcgcaccgg gcggcagggg cggctcggga 3420 cccggcggca tggctggcag tggtacgtcg gcgccgcgcg cgggtaggtt ctggtactgc 3480 gccctgagaa gactcgcatg cgcgacgacg cggcggttga catcctggat ctgacgcctc 3540 tgggtgaaag ctaccggccc cgtgagcttg aacctgaaag agagttcaac agaatcaatc 3600 tcggtatcgt tgacggcggc ttgcctaagg atttcttgca cgtcaccaga gttgtcctgg 3660 taggcgatct ccgccatgaa ctgctcgatc tcttcctctt gaagatctcc gcggcccgct 3720 ctctcgacgg tggccgcgag gtcgttggag atgcgcccaa tgagttgaga gaatgcattc 3780 atgcccgcct cgttccagac gcggctgtag accacggccc ccacgggatc tctcgcgcgc 3840 atgaccacct gggcgaggtt gagctccacg tggcgggtga agaccgcata gttgcatagg 3900 cgctggaaaa ggtagttgag tgtggtggcg atgtgctcgg tgacgaagaa atacatgatc 3960 catcgtctca gcggcatctc gctgacatcg cccagagctt ccaagcgctc catggcctcg 4020 tagaagtcca cggcaaaatt aaaaaactgg gagtttcgcg cggacacggt caactcctct 4080 tccagaagac ggataagttc ggcgatggtg gtgcgcacct cgcgctcgaa agcccctggg 4140 atttcttcct caatctcttc ttcttccact aacatctctt cctcttcagg tggggctgca 4200 ggaggagggg gaacgcggcg acgccggcgg cgcacgggca gacggtcgat gaatctttca 4260 atgacctctc cgcggcggcg gcgcatggtt tcagtgacgg cgcggccgtt ctcgcgcggt 4320 cgcagagtaa aaacaccgcc gcgcatctcc ttaaagtggt gactgggagg ttctccgttt 4380 gggagggaga gggcgctgat tatacatttt attaattggc ccgtagggac tgcacgcaga 4440 gatctgatcg tgtcaagatc cacgggatct gaaaaccttt cgacgaaagc gtctaaccag 4500 tcacagtcac aaggtaggct gagtacggct tcttgtgggc gggggtggtt atgtgttcgg 4560 tctgggtctt ctgtttcttc ttcatctcgg gaaggtgaga cgatgctgct ggtgatgaaa 4620 ttaaagtagg cagttctaag acggcggatg gtggcgagga gcaccaggtc tttgggtccg 4680 gcttgctgga tacgcaggcg attggccatt ccccaagcat tatcctgaca tctagcaaga 4740 tctttgtagt agtcttgcat gagccgttct acgggcactt cttcctcacc cgttctgcca 4800 tgcatacgtg tgagtccaaa tccgcgcatt ggttgtacca gtgccaagtc agctacgact 4860 ctttcggcga ggatggcttg ctgtacttgg gtaagggtgg cttgaaagtc atcaaaatcc 4920 acaaagcggt ggtaagctcc tgtattaatg gtgtaagcac agttggccat gactgaccag 4980 ttaactgtct ggtgaccagg gcgcacgagc tcggtgtatt taaggcgcga ataggcgcgg 5040 gtgtcaaaga tgtaatcgtt gcaggtgcgc accagatact ggtaccctat aagaaaatgc 5100 ggcggtggtt ggcggtagag aggccatcgt tctgtagctg gagcgccagg ggcgaggtct 5160 tccaacataa ggcggtgata gccgtagatg tacctggaca tccaggtgat tcctgcggcg 5220 gtagtagaag cccgaggaaa ctcgcgtacg cggttccaaa tgttgcgtag cggcatgaag 5280 tagttcat 5288 <210> 72 <211> 1548 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-EpCAM bispecific T cell activator DNA coding sequence, with N-terminal signal sequence and C-terminal deca-His affinity tag <400> 72 atgggatgga gctgcatcat cctattcctc gtggcgacgg ccactggagt gcatagcgaa 60 ctggtgatga ctcagtcccc gtcatccctg acggtgaccg ccggcgagaa ggtcaccatg 120 tcgtgcaagt cctcgcaaag cctgcttaac agcggcaacc agaaaaacta cctcacgtgg 180 tatcagcaaa agccaggtca acccccaaaa ctgctcatct actgggcgag cacccgcgag 240 tcgggggtgc cagaccggtt caccggctcc gggtcaggaa ctgatttcac cctaaccatc 300 agctcggtgc aagcggagga cctggccgtg tactactgcc aaaatgatta ctcgtaccct 360 ctgacctttg gagcgggcac caagctcgaa atcaagggcg gtggaggaag cggcggggga 420 ggctcaggtg ggggaggatc agaagtccaa ctgctggagc agtcaggagc cgaactggtc 480 cgcccgggaa cctccgtcaa gatttcctgt aaggcttccg gctacgcttt taccaattac 540 tggctgggct gggtcaagca aagaccgggg catggcctgg agtggatcgg cgacatcttc 600 ccagggagcg gcaacatcca ctacaacgag aagttcaagg ggaaagcgac tctgactgcc 660 gacaaatcat ccagcaccgc ctacatgcag ctgtcgtcgc tcactttcga agacagcgcg 720 gtgtactttt gtgctcggct ccggaactgg gatgaaccaa tggactactg gggacaagga 780 actaccgtga ccgtctcctc cggcggcggt ggaagcgatg tgcaactcgt gcagtccggt 840 gcggaagtga aaaagccggg cgcgagcgtc aaagtgtcat gcaaggcgtc aggatatacg 900 tttactagat acactatgca ctgggtgcgc caggcacctg gtcagggcct tgaatggatc 960 ggctacatca atccgtcgag aggctacact aattacgcgg actcagtcaa agggcgcttc 1020 acgattacga ccgacaagtc cacctcgact gcatacatgg aactgtcctc gctgagaagc 1080 gaggacaccg ctacttacta ctgcgctaga tactacgatg atcactactg cctcgattac 1140 tggggccagg gaaccactgt cacggtgtca tcgggagagg gcacctcaac cggatcaggg 1200 ggatcgggag gctcgggcgg cgcagacgac atcgtcctga cccagtcgcc cgccaccttg 1260 tcgctgtccc caggagaaag agcgaccctg tcatgccggg cgtcgcaaag cgtgagctat 1320 atgaattggt atcagcagaa gccaggaaag gcgccgaaga gatggatcta cgacacctcc 1380 aaggtcgctt caggtgtccc ggctagattc tcaggatcgg gatcaggaac ggactactcc 1440 ctgaccatca attcactgga agcagaagat gcggccacct actactgtca gcagtggtcc 1500 tccaacccgc tgactttcgg aggcggaact aaggtcgaga tcaagtag 1548 <210> 73 <211> 515 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-EpCAM bispecific T cell activator protein sequence, with N-terminal signal sequence without C-terminal deca-His affinity tag <400> 73 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Leu Val 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ggcaaggcac caaggtggag attaagggag ggggcggcag cgggggaggc 420 ggcagcggcg gcgggggatc gcaggtccag ctcgtccaat ccggagccga agtcaagaag 480 ccgggagcgt cggtcaaggt cagctgcaaa acttcgcgct acaccttcac tgagtacacg 540 atccactggg tccgccaggc gcccggccag cggctggagt ggatcggcgg gatcaaccca 600 aacaacggaa tcccaaatta caatcagaaa tttaaagggc gggtgactat caccgtggat 660 acctcggcct ccacggcgta catggagctc tcatcactca gatcggagga caccgcggtc 720 tattactgcg cccgccgccg gatcgcttat ggatacgatg aaggacatgc gatggattac 780 tggggccagg gcaccctcgt cacggtgtcg tcaggaggcg gcggttcaga tgtgcaactc 840 gtgcagtccg gtgcggaagt gaaaaagccg ggcgcgagcg tcaaagtgtc atgcaaggcg 900 tcaggatata cgtttactag atacactatg cactgggtgc gccaggcacc tggtcagggc 960 cttgaatgga tcggctacat caatccgtcg agaggctaca ctaattacgc ggactcagtc 1020 aaagggcgct tcacgattac gaccgacaag tccacctcga ctgcatacat ggaactgtcc 1080 tcgctgagaa gcgaggacac cgctacttac tactgcgcta gatactacga tgatcactac 1140 tgcctcgatt actggggcca gggaaccact gtcacggtgt catcgggaga gggcacctca 1200 accggatcag ggggatcggg aggctcgggc ggcgcagacg acatcgtcct gacccagtcg 1260 cccgccacct tgtcgctgtc cccaggagaa agagcgaccc tgtcatgccg ggcgtcgcaa 1320 agcgtgagct atatgaattg gtatcagcag aagccaggaa aggcgccgaa gagatggatc 1380 tacgacacct ccaaggtcgc ttcaggtgtc ccggctagat tctcaggatc gggatcagga 1440 acggactact ccctgaccat caattcactg gaagcagaag atgcggccac ctactactgt 1500 cagcagtggt cctccaaccc gctgactttc ggaggcggaa ctaaggtcga gatcaagtag 1560 1560 <210> 75 <211> 519 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-FAP bispecific T cell activator amino acid sequence, with N-terminal signal sequence without C-terminal deca-His affinity tag <400> 75 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val 20 25 30 Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Leu Tyr Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro 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Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 <210> 164 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rigid linker <400> 164 Pro Pro Pro Pro 1 <210> 165 <400> 165 000 <210> 166 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 166 Asp Lys Thr His Thr Cys Xaa Xaa 1 5 <210> 167 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 167 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 <210> 168 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 168 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala <210> 169 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 169 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro 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180 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Ser Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala <210> 181 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 181 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala <210> 182 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 182 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala <210> 183 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 183 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Ser Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ala <210> 184 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 184 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro Ala Thr Cys Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ala <210> 185 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 185 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ala <210> 186 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 186 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala <210> 187 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 187 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Thr Ser Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala <210> 188 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 188 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro Ala Thr Ser Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala <210> 189 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 189 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Thr Ser Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ala <210> 190 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 190 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro Ala Thr Ser Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ala <210> 191 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 191 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Thr Ser Pro Pro Ser 1 5 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Pro Ala Thr Ser Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 <210> 207 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 207 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 <210> 208 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 208 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 <210> 209 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 209 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Ser Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 <210> 210 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 210 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro Ala Thr Cys Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 <210> 211 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 211 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 <210> 212 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 212 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro Ala Thr Ser Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 <210> 213 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 213 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Thr Ser Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 <210> 214 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 214 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 <210> 215 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 215 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ala Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala 20 25 <210> 216 <211> 25 <212> PRT <213> 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tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080 aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140 tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200 attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260 atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320 caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380 cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440 agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500 ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560 taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620 gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680 tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740 aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800 ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860 caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920 tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980 gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040 gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100 aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160 gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220 taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280 gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340 agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400 tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460 acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520 ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580 gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640 tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700 ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc 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caccatgggc tggagctgca 29400 tcatcttgtt cctggtcgca actgctaccg gagtccattc ggacatcgtc atgacccaaa 29460 gccctgactc gctcgctgtg tcactgggag agcgggcgac tatcaactgc aaatcatccc 29520 agagcctgct gtattcacgc aatcagaaaa actacctggc ctggtatcag cagaagccgg 29580 gccagcctcc caagctgctg atcttctggg cctccacccg cgaaagcggc gtgccggacc 29640 gcttcagcgg aagcggattc ggaactgact ttactctgac cattagctcc ttgcaggcgg 29700 aggacgtggc cgtctactac tgccagcagt atttctccta tccgctcacc tttgggcaag 29760 gcaccaaggt ggagattaag ggagggggcg gcagcggggg aggcggcagc ggcggcgggg 29820 gatcgcaggt ccagctcgtc caatccggag ccgaagtcaa gaagccggga gcgtcggtca 29880 aggtcagctg caaaacttcg cgctacacct tcactgagta cacgatccac tgggtccgcc 29940 aggcgcccgg ccagcggctg gagtggatcg gcgggatcaa cccaaacaac ggaatcccaa 30000 attacaatca gaaatttaaa gggcgggtga ctatcaccgt ggatacctcg gcctccacgg 30060 cgtacatgga gctctcatca ctcagatcgg aggacaccgc ggtctattac tgcgcccgcc 30120 gccggatcgc ttatggatac gatgaaggac atgcgatgga ttactggggc cagggcaccc 30180 tcgtcacggt gtcgtcagga ggcggcggtt cacaggtgca gctgcagcag tctggggctg 30240 aactggcaag acctggggcc tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacaccttta 30300 ctaggtacac gatgcactgg gtaaaacaga ggcctggaca gggtctggaa tggattggat 30360 acattaatcc tagccgtggt tatactaatt acaatcagaa gttcaaggac aaggccacat 30420 tgactacaga caaatcctcc agcacagcct acatgcaact gagcagcctg acatctgagg 30480 actctgcagt ctattactgt gcaagatatt atgatgatca ttactgcctt gactactggg 30540 gccaaggcac cactctcaca gtctcctcag gtggcggtgg ctcgggcggt ggtggatctg 30600 gtggcggcgg atctgatatc gtgctcactc agtctccagc aatcatgtct gcatctccag 30660 gggagaaggt caccatgacc tgcagtgcca gctcaagtgt aagttacatg aactggtacc 30720 agcagaagtc aggcacctcc cccaaaagat ggatttatga cacatccaaa ctggcttctg 30780 gagtccctgc tcacttcagg ggcagtgggt ctgggacctc ttactctctc acaatcagcg 30840 gcatggaggc tgaagatgct gccacttatt actgccagca gtggagtagt aacccattca 30900 cgttcggctc ggggacaaag ttggaaataa accggggaag cggacagtgt actaattatg 30960 ctctcttgaa attggctgga gatgttgaga gcaaccctgg acctacagtg ctggcgccag 31020 cctggagccc aacaacctat ctcctcctgc tgctgctgct gagctcggga ctcagtggga 31080 cccaggactg ctccttccaa cacagcccca tctcctccga cttcgctgtc aaaatccgtg 31140 agctgtctga ctacctgctt caagattacc cagtcaccgt ggcctccaac ctccaggacg 31200 aggagctctg cgggggcctc tggcggctgg tcctggcaca gcgctggatg gagcggctca 31260 agactgtcgc tgggtccaag atgcaaggct tgctggagcg cgtgaacacg gagatacact 31320 ttgtcaccaa atgtgccttt cagccccccc ccagctgtct tcgcttcgtc cagaccaaca 31380 tctcccgcct cctacaggag acctccgagc agctggtggc gctgaagccc tggatcactc 31440 gccagaactt ctcccggtgc ctggagctgc agtgtcagcc cgactcctca accctgccac 31500 ccccatggag tccccggccc ctggaggcca cagccccggg aagcggagct actaacttca 31560 gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg acctcaggtc tccactgctg 31620 cccttgccgt cctcctctgc accatggctc tctgcaacca ggtcctctct gcaccacttg 31680 ctgctgacac gccgaccgcc tgctgcttca gctacacctc ccgacagatt ccacagaatt 31740 tcatagctga ctactttgag acgagcagcc agtgctccaa gcccagtgtc atcttcctaa 31800 ccaagagagg ccggcaggtc tgtgctgacc ccagtgagga gtgggtccag aaatacgtca 31860 gtgacctgga gctgagtgcc ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg 31920 acgtcgagga gaatcctgga cctgccttga cctttgcttt actggtggcc ctcctggtgc 31980 tcagctgcaa gtcaagctgc tctgtgggct gtgatctgcc tcaaacccac agcctgggta 32040 gcaggaggac cttgatgctc ctggcacaga tgaggagaat ctctcttttc tcctgcttga 32100 aggacagaca tgactttgga tttccccagg aggagtttgg caaccagttc caaaaggctg 32160 aaaccatccc tgtcctccat gagatgatcc agcagatctt caatctcttc agcacaaagg 32220 actcatctgc tgcttgggat gagaccctcc tagacaaatt ctacactgaa ctctaccagc 32280 agctgaatga cctggaagcc tgtgtgatac agggggtggg ggtgacagag actcccctga 32340 tgaaggagga ctccattctg gctgtgagga aatacttcca aagaatcact ctctatctga 32400 aagagaagaa atacagccct tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc atgagatctt 32460 tttctttgtc aacaaacttg caagaaagtt taagaagtaa ggaataagct agcttgactg 32520 actgagatac agcgtacctt cagctcacag acatgataag atacattgat gagtttggac 32580 aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg 32640 ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt 32700 ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca 32760 aatgtggtag tcgtcagcta tcctgcagga acttgtttat ttgaaaatca attcacaaaa 32820 tccgagtagt tattttgcct cccccttccc atttaacaga atacaccaat ctctccccac 32880 gcacagcttt aaacatttgg ataccattag atatagacat ggttttagat tccacattcc 32940 aaacagtttc agagcgagcc aatctggggt cagtgataga taaaaatcca tcgggatagt 33000 cttttaaagc gctttcacag tccaactgct gcggatgcga ctccggagtc tggatcacgg 33060 tcatctggaa gaagaacgat gggaatcata atccgaaaac ggtatcggac gattgtgtct 33120 catcaaaccc acaagcagcc gctgtctgcg tcgctccgtg cgactgctgt ttatgggatc 33180 agggtccaca gtgtcctgaa gcatgatttt aatagccctt aacatcaact ttctggtgcg 33240 atgcgcgcag caacgcattc tgatttcact caaatctttg cagtaggtac aacacattat 33300 tacaatattg tttaataaac cataattaaa agcgctccag ccaaaactca tatctgatat 33360 aatcgcccct gcatgaccat cataccaaag tttaatataa attaaatgac gttccctcaa 33420 aaacacacta cccacataca tgatctcttt tggcatgtgc atattaacaa tctgtctgta 33480 ccatggacaa cgttggttaa tcatgcaacc caatataacc ttccggaacc acactgccaa 33540 caccgctccc ccagccatgc attgaagtga accctgctga ttacaatgac aatgaagaac 33600 ccaattctct cgaccgtgaa tcacttgaga atgaaaaata tctatagtgg cacaacatag 33660 acataaatgc atgcatcttc tcataatttt taactcctca ggatttagaa acatatccca 33720 gggaatagga agctcttgca gaacagtaaa gctggcagaa caaggaagac cacgaacaca 33780 acttacacta tgcatagtca tagtatcaca atctggcaac agcgggtggt cttcagtcat 33840 agaagctcgg gtttcatttt cctcacaacg tggtaactgg gctctggtgt aagggtgatg 33900 tctggcgcat gatgtcgagc gtgcgcgcaa ccttgtcata atggagttgc ttcctgacat 33960 tctcgtattt tgtatagcaa aacgcggccc tggcagaaca cactcttctt cgccttctat 34020 cctgccgctt agcgtgttcc gtgtgatagt tcaagtacaa ccacactctt aagttggtca 34080 aaagaatgct ggcttcagtt gtaatcaaaa ctccatcgca tctaatcgtt ctgaggaaat 34140 catccaagca atgcaactgg attgtgtttc aagcaggaga ggagagggaa gagacggaag 34200 aaccatgtta atttttattc caaacgatct cgcagtactt caaattgtag atcgcgcaga 34260 tggcatctct cgcccccact gtgttggtga aaaagcacag ctagatcaaa agaaatgcga 34320 ttttcaaggt gctcaacggt ggcttccagc aaagcctcca cgcgcacatc caagaacaaa 34380 agaataccaa aagaaggagc attttctaac tcctcaatca tcatattaca ttcctgcacc 34440 attcccagat aattttcagc tttccagcct tgaattattc gtgtcagttc ttgtggtaaa 34500 tccaatccac acattacaaa caggtcccgg agggcgccct ccaccaccat tcttaaacac 34560 accctcataa tgacaaaata tcttgctcct gtgtcacctg tagcgaattg agaatggcaa 34620 catcaattga catgcccttg gctctaagtt cttctttaag ttctagttgt aaaaactctc 34680 tcatattatc accaaactgc ttagccagaa gccccccggg aacaagagca ggggacgcta 34740 cagtgcagta caagcgcaga cctccccaat tggctccagc aaaaacaaga ttggaataag 34800 catattggga accgccagta atatcatcga agttgctgga aatataatca ggcagagttt 34860 cttgtaaaaa ttgaataaaa gaaaaatttg ccaaaaaaac attcaaaacc tctgggatgc 34920 aaatgcaata ggttaccgcg ctgcgctcca acattgttag ttttgaatta gtctgcaaaa 34980 ataaaaaaaa aaacaagcgt catatcatag tagcctgacg aacagatgga taaatcagtc 35040 tttccatcac aagacaagcc acagggtctc cagctcgacc ctcgtaaaac ctgtcatcat 35100 gattaaacaa cagcaccgaa agttcctcgc ggtgaccagc atgaataatt cttgatgaag 35160 catacaatcc agacatgtta gcatcagtta acgagaaaaa acagccaaca tagcctttgg 35220 gtataattat gcttaatcgt aagtatagca aagccacccc tcgcggatac aaagtaaaag 35280 gcacaggaga ataaaaaata taattatttc tctgctgctg ttcaggcaac gtcgcccccg 35340 gtccctctaa atacacatac aaagcctcat cagccatggc ttaccagaca aagtacagcg 35400 ggcacacaaa gcacaagctc taaagtgact ctccaacctc tccacaatat atatatacac 35460 aagccctaaa ctgacgtaat gggagtaaag tgtaaaaaat cccgccaaac ccaacacaca 35520 ccccgaaact gcgtcaccag ggaaaagtac agtttcactt ccgcaatccc aacaggcgta 35580 acttcctctt tctcacggta cgtgatatcc cactaacttg caacgtcatt ttcccacggt 35640 cgcaccgccc cttttagccg ttaaccccac agccaatcac cacacgatcc acacttttta 35700 aaatcacctc atttacatat tggcaccatt ccatctataa ggtatattat atagataga 35759

Claims (20)

  1. 식 (I): 5'ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR (I)
    의 서열을 포함하는 종양용해성(oncolytic) 아데노바이러스로서,
    식 중
    B1은 결합이거나 또는 E1A, E1B 또는 E1A-E1B를 포함하고;
    BA는 -E2B-L1-L2-L3-E2A-L4를 포함하고;
    B2는 결합이거나 또는 E3을 포함하고;
    BX는 결합이거나, 또는 제한 부위, 하나 이상의 이식유전자(transgene) 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이며;
    BB는 L5를 포함하고;
    BY는 제한 부위, 하나 이상의 이식유전자 또는 둘 다를 포함하는 DNA 서열이며;
    B3은 결합이거나 또는 E4를 포함하며,
    여기서, 상기 아데노바이러스는 주요 후기 프로모터의 제어하에 위치 BY에서 적어도 2개의 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 T 세포 활성자(Bispecific T cell Activator)를 인코딩하되,
    상기 도메인 중 하나는 T-세포 수용체 복합체(T-cell receptor complex: TCR)의 성분에 특이적이고;
    결합 도메인 중 하나는 CEA, MUC-1, EpCAM, HER 수용체 HER1, HER2, HER3, HER4, PEM, A33, G250, 탄수화물 항원 Ley, Lex, Leb, PSMA, TAG-72, STEAP1, CD166, CD24, CD44, E-cadherin, SPARC, ErbB2 및 ErbB3을 포함하는 군에서 선택되는 종양 항원에 특이적이며,
    상기 아데노바이러스는 에나데노툭시레브(Enadenotucirev: EnAd) 또는 혈청타입 11 아데노바이러스(Ad11)인, 종양용해성 아데노바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 EnAd인, 종양용해성 아데노바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 TCR의 성분은 CD3인, 종양용해성 아데노바이러스.
  4. 제3항에 있어서, 상기 TCR의 성분은 CD3ε, CD3γ 또는 CD3δ인, 종양용해성 아데노바이러스.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 종양 항원은 CEA, MUC-1, EpCAM, HER 수용체 HER1, HER2, HER3, HER4, PEM, A33, G250, 탄수화물 항원 Ley, Lex, Leb, PSMA, TAG-72, STEAP1, CD166, CD24, CD44, E-cadherin, SPARC, ErbB2 및 ErbB3를 포함하는 군으로부터 선택된, 종양용해성 아데노바이러스.
  6. 제5항에 있어서, 상기 종양 항원은 EpCAM인, 종양용해성 아데노바이러스.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 복제 적격(replication competent)인, 종양용해성 아데노바이러스.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아데노바이러스가 제2 이중특이성 T 세포 활성자를 추가로 인코딩하는 종양용해성 아데노바이러스.
  9. 제8항에 있어서, 두 이중특이성 T 세포 활성자 모두가 위치 BY에서 인코딩되는, 종양용해성 아데노바이러스.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인코딩된 이중특이성 T 세포 활성자가 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 또는 이와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 종양용해성 아데노바이러스.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인코딩된 이중특이성 T 세포 활성자가 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열, 또는 이와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 종양용해성 아데노바이러스.
  12. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 서열번호 34, 35, 79, 80 또는 96으로 표시되는 서열을 포함하는, 종양용해성 아데노바이러스.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 2, 3 또는 4개의 추가 이식유전자(transgene)를 코딩하는, 종양용해성 아데노바이러스.
  14. 제13항에 있어서, 상기 추가 이식유전자(들)는 사이토카인, 케모카인 및 면역조절제 중 하나 이상을 코딩하는, 종양용해성 아데노바이러스.
  15. 제13항에 있어서, 모든 추가 이식유전자는 위치 BY에 있는, 종양용해성 아데노바이러스.
  16. 제14항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 케모카인이 MIP1α, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-33, IL-35, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-21, IL-25, IL-1RA, IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, 림포톡신α(LTA), Flt3L, GM-CSF, IL-8, CCL2, CCL3, CCL5, CCL17, CCL20, CCL22, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL12, CCL2, CCL19 및 CCL21로부터 선택되는, 종양용해성 아데노바이러스.
  17. 제1항 또는 제2항에 따른 아데노바이러스 및 희석제 또는 담체를 포함하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 암 치료용 조성물.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 암 치료에 사용하기 위한 종양용해성 아데노바이러스.
  20. 삭제
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