CN1213004A - 重组白细胞介素－2腺病毒载体及产生方法 - Google Patents

Abstract

携带白细胞介素2(IL－2)重组腺病毒载体及其产生方法,属于基因治癌药物及其制备方法。该载体包含位于巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子控制下的IL－2表达区和SV－40多聚腺苷化信号序列,及来自SV40一小段DNA序列,由于这段DNA序列,使得重组载体能在宿主细胞中高效表达IL－2,通过pJM17和pAC－CMVpLpA－SV－IL2共转染宿主细胞,筛选得到重组病毒,能高效表达IL－2,使癌细胞内人白细胞抗原(HLA)表达增强,激活免疫细胞,杀死肿瘤细胞。

Description

重组白细胞介素-2腺病毒载体及产生方法

本发明属于治癌药物及其制备方法。

基因治疗法治癌研究已在先进国家全面展开，其主要方法从治疗途径划分有：①体外法(ex vivo)，②体内法(in vivo)。体内法主要是把载有治疗基因的生物药品输入病人体内，而达到治癌效果，体内法治疗癌症的关键是使治疗基因能专一地在癌细胞内表达。

体内法治癌可采用三种基因，一是采用激活体内免疫系统的基因，白细胞介素-2(IL-2)是最广泛使用的基因，二是采用能杀死细胞的基因(自杀基因)，三是肿瘤抑制基因，如P₅₃和R_b基因等。这三种基因虽然都被广泛地研究，但从安全性和有效性而言，采用能激活体内免疫系统的基因是较为成熟又较有把握的方法，因为癌的生成原因之一是癌细胞能有效地避开免疫系统的攻击，二是细胞能分泌一些特别的蛋白质，抑制周围T-细胞的活力或是在癌细胞内某些蛋白(如HLA蛋白)的表达被强烈抑制而使癌细胞特有的蛋白无法被免疫系统识别。

IL-2能有效激活已失活的T-细胞，同时也能大大提高癌细胞内的HLA蛋白的表达。因此IL-2产品被广泛使用在癌症的治疗上并显示了疗效。但直接用IL-2治疗也有缺点：一是IL-2的剂量受到限制，高剂量治疗导致头晕、恶心，病人难以忍受，甚至会导致病人死亡，低剂量往往又不能达到显著疗效，同时IL-2产品价格昂贵，普通病人难以承担。

白细胞介素2(IL-2)已广泛进入治疗癌症的临床试验，IL-2是当前利用细胞激动素治疗肿瘤和癌的主要方向。

体外实验结果充分显示IL-2的重要性，在IL-2的参与下，休眠失活的淋巴细胞被激活，IL-2在一些肾癌病人的临床试验中也显示了类似的结果，在原发处的肿瘤被切除后IL-2的注射使10％左右的病人显示出抑制癌生长和消除扩散了的癌细胞的功能。

然而尚无充分证据显示IL-2的施用能消除大面积的肿瘤，一般认为这是由于受到IL-2剂量的限制以及肿瘤细胞本身能分泌出抑制物对抗IL-2对淋巴细胞的刺激。切除大的肿瘤组织可以减少免疫抑制物的分泌，利于IL-2的治疗，但共存在肿瘤组织中的侵入性淋巴细胞(TIL)也被一并抛弃了，TIL在肾细胞癌(RCC)中与肿瘤细胞的比例约为1∶1，在病人体内处于休眠状态。有人试图利用这些TIL，手术切除的肿瘤酶解后，加入IL-2做细胞培养，TIL可在体外增殖几百～上万倍，增殖后的淋巴细胞被输回病人体内，配合IL-2的注射，可提高疗效，这一治疗方法即为体外法，它最明显的缺点是步骤太多，稍不小心会造成细胞或其它微生物的污染，同时，体外培养的淋巴细胞处于与人体内很不同的环境中，其生存与分泌得不到免疫系统及其它细胞的支持，抗癌特异性从中削弱，不能显示生物学上显著的疗效。

在这一情况下，IL-2基因治疗作为新的尝试有理论支持，本发明的目的是产生一种携带白细胞介素2(IL-2)的重组腺病毒载体。IL-2基因输入癌细胞后，每个被转导的细胞变成一个IL-2产生器不断产生IL-2，与全身注射IL-2不同的是，载体可以集中地注射到癌肿块中，体积大的肿瘤恰恰有利于载体的准确注射和高效表达，使大量IL-2产生于癌细胞中，癌细胞及周缘的IL-2浓度大大增加，癌细胞内人白细胞抗原(HLA)表达增强，大大激活体内免疫细胞，从而杀死肿瘤细胞，与逆病毒相比，其感染力和基因表达力提高十倍至上千倍，而且更安全，易于制备。

本发明的目的是通过下述方案实现的。

本发明提供了生产重组腺病毒(如IL-2腺病毒)的有效方法，公开了重组腺病毒载体组成，以及使用这样的载体激活肿瘤细胞中免疫细胞的方法，还公开了C_a ²⁺介导的二种质粒DNA转染后同源重组产生重组腺病毒的方法，以及用PCR技术分析重组腺病毒的方法。

本发明所涉及重组腺病毒载体的构建，包括使用腺病毒来携带细胞激动素基因如IL-2，包括了产生可包装的重组腺病毒的二种质粒。重组载体插入序列一般包括巨细胞病毒(CMV)启动子区，IL-2基因序列，以及位于启动子和IL-2之间的一段来自SV-40的小DNA序列，多聚腺苷酸化信号。

按照本发明的简化方法，将IL-2编码序列插入缺乏E1区的腺病毒基因组中，但优选的腺病毒是复制缺陷病毒，其中复制所必需的病毒基因已从腺病毒载体中被删除，再在其位置上导入IL-2表达区域。

本发明在重组腺病毒的构建中，是采用_pJM17和CMV_pL_pA在C_a ²⁺介导下共转染293细胞，从而让二种质粒在293细胞内发生同源重组，产生IL-2腺病毒。IL-2腺病毒因其缺失E1区，也是一种复制缺陷型的腺病毒。

制备复制缺陷型腺病毒的技术是本领域已知的，例如包括Ghoch-Chaudlumy和Graham(1987),McGrory(1988)以及Ghezmam等人(1982)所描述的方法，各种已知的细胞系只要它们补偿任何可能存在的复制缺陷，均可用于制备重组腺病毒，优选的细胞系是人293细胞系。此外，为了得到病毒原种贮存液，也可以在塑料平皿上或悬浮液培养物中增殖细胞。

腺病毒可以是42个不同的已知血清型式亚类Adv中的任何一个，为了得到用于本发明复制缺陷型腺病毒载体，优选亚类C的5型腺病毒作为起始材料。这是因为5型腺病毒是人类腺病毒，并且该病毒亚型的许多生物化学和遗传学信息都是已知的，并且历史上在利用腺病毒作载体的大多数构建工作都使用该亚型。

本发明的DNA片段在转录的5′～3′方向上一般包括巨细胞病毒启动子，来自SV-40的一段小DNA序列，人的IL-2基因序列，以及SV-40多聚腺苷酸化信号。含有重组腺病毒的宿主细胞一般是真核式哺乳动物宿主细胞，如293细胞，或是人的肿瘤细胞。

本发明的重组腺病毒载体分散于药理学中可接受的溶液或缓冲液中，包括磷酸盐、乳酸盐、Tris等中性盐。当然，也可纯化腺病毒以使其基本上没有不需要的污染物，从而避免该重组载体在动物或病人体内引起任何不适宜的反应。纯化载体的优选手段包括使用浮力密度梯度，例如氯化铯梯度离心法，以及层析等方法。

在这一实施方案中，通过比较用E1缺失的带有光化基因(Luc)的基因载体和E1缺失的不带外源基因的载体以及带IL-2的基因载体，处理动物肿瘤，可以清楚地表明带有IL-2的腺病毒更有治疗效力。

通过IL-2腺病毒载体的构建以及肿瘤治疗举例已说明了本发明的各个方面，同时本发明可适用于期望通过使用重组腺病毒实现在宿主细胞中高水平表达细胞激动素的任何情况。例如，在肿瘤治序程式方面，除了IL-2取代外，本发明人涉及的特定例子是其它白细胞介素(IL1-IL15)，干扰素(IFN-α,IFN-β和IFN-γ)，各种胞落刺激素(CSFS包括GM-CSGF，GCSF等)以及α-肿瘤坏死因子(TNF-α)，转型生长因子及其系列(TGF-β)等，以及其它用于人肿瘤治疗的相关基因。

应指出的是，所利用的腺病毒载体是复制缺陷的，所以不能在最终被感染的细胞如肿瘤细胞中复制。因此，在某些病人需要连续治疗的情况下，有必要在一定时间如(7-35日)后再次导入病毒。

本发明的IL-2表达框架(expression cassettee)，有可能放入其它病毒载体以表达和输送IL-2如单纯疱疹病毒，(HSV)，E-P病毒(EBV1)，巨细胞病毒(CMV)和假狂犬病病毒(PRV)将是适用的。

本发明还涉及生产任何一类重组腺病毒的简化方法，不仅涉及C_a ²⁺转染法和噬班检测法，而且还通过分析培养的宿主细胞，了解其是否存在同源重组病毒引起的细胞病变效应(CPE)，CPE可直接使用倒置显微镜观察。

重组病毒的产生还可用PCR法证明。即从表现出细胞病变效应的细胞上清中得到DNA，并使用两对引物-一对表达载体特异性DNA(IL-2)引物和一对腺病毒基因组特异性DNA引物，以PCR法分析DNA。

附图说明

图1显示得到重组IL-2腺病毒流程。将IL-2表达序列插入_pL_pA的BamHⅠ位点，形成_pL_pA-IL2质粒。将IL-2表达载体(_pL1A-IL2)和重组质粒_pJM17由C_a ²⁺介导共转染到293细胞中，将被转染细胞维持在培养基中7～10天，观察噬斑，以及细胞病变效应，然后提取噬斑中的DNA模板，对DNA进行PCR。分析以鉴定新产生的IL-2重组腺病毒(pAC-CMV-IL-2)。

图2，显示对pAC-CMV-IL-2基因组DNA进行细胞分析的酶切图。该基因组大约为37kb。

图3显示重组腺病毒-IL-2载体。由图中可见，在腺病毒的E1区，依次插入了巨细胞病毒CMV启动子，来自SV-40小DNA，白细胞介素2的cDNA和SV-40的多腺苷化信号序列。

图4显示HS-IL2cDNA5′末端DNA序列。一段约100个碱基对DNA序列被插入白细胞介素2蛋白质翻译起始点(130位的ATG)之前。成熟的IL2蛋白是从190位的GCA开始。

图5显示HS-IL2 cDNA5′未端DNA序列与火鸡疱疹病毒U32基因序列高度相似。

图6显示HS-IL2 cDNA5′未端DNA序列与SV-40病毒VP-1基因序列高度一致性，说明所插入的一小段DNA序列来源于SV-40。

图7插入的IL-2 cDNA序列及其5′未端序列，蛋白质翻译起始于130位的ATG，终止于861位TGA。

本发明优选实施方案的详细描述A．基因治疗技术

迄今已提出了几种基因治疗的实验方法，但每种方法都有其特定的缺点(Muiligan,1993)。如上文所述，已有几种基本转染方法，例如通过物理或化学方法加大细胞膜通透性以将含有感兴趣基因的DNA非生物学地导入细胞中。当然，这种方法只限于能暂时从体内除去的并能耐受这种处理的细胞毒性的细胞，即淋巴细胞。也可以使用与某些脂质和两亲性肽形成的脂质体或蛋白质结合物进行转染，但基因整合的效率仍很低，一般每1,000到100,000个细胞才有一个发生整合，并且已转染基因的表达常常限于几天(增殖细胞)或几周(非增殖细胞)。因此DNA转染显然不是一种肿瘤治疗的适宜方法。

第二种方法是利用病毒进入细胞的天然能力。因为逆转录病毒能将其基因整合到宿主细胞基因组中，可转移大量外来遗传材料，并可被包装到特定细胞系内，所以有希望作为基因运输载体。但仍有不足之处，第一，逆转录病毒的感染性取决于靶细胞表面上病毒受体的可利用性。第二，逆转录病毒只能有效地整合到复制中的细胞内。最后，逆转录病毒难于浓缩和纯化。B．IL-2基因治疗法对癌症的治疗效应

IL2基因治疗法治癌的主要争议是：如果IL2蛋白本身能达到治疗效果，用病毒载体将IL2基因输入癌细胞而后让其表达，是否绕了弯路。从医疗原理分析，用IL2蛋白直接注射与用载体输入IL2基因，两者解决问题的途径是很不一样的。IL2蛋白是一种自刺激和旁刺激(autocrine and paracrine)生长激素而不是一种内分泌(endocrine)生长激素。在体内循环系统中IL2蛋白浓度是极低的。给病人注射IL2一般都会产生副作用，引起病人发烧，严重的甚至会造成死亡。把IL2基因输入癌细胞则有不同的效果。一方面可以使IL2基因在癌细胞持续产生IL2蛋白，在其周围形成IL2的梯度：靠近癌细胞处的IL2浓度高而远离癌细胞处则浓度低，从而不仅能有效地刺激癌细胞周围的特异性的淋巴细胞，还能有效地避免全身性的副作用。另一方面IL2基因的输入能增强癌细胞的免疫原性(immunogenicity)。使得这些细胞能更有效地激活具有杀癌特异性功能的淋巴细胞。C．载体的选择

以E1切除的腺病毒(Adenovirus)为基础，经改造过的腺病毒载体具有安全，高效，制备成本低的优点。因为E1区的基因已被切除，产生的病毒载体不能在正常细胞内复制，大大提高其安全性。本发明生产的产品效价为每毫升10¹¹pfu(病毒班形成单位)，与其他白细胞介素2腺病毒载体相比，本发明载体具有高产额的优点。活体实验证明研制出的IL-2腺病毒载体能极有效地提高免疫细胞的抗癌效果。以小鼠肉瘤为例的动物试验显示IL-2腺病毒载体能极有效地治疗肿瘤。对于一立方厘米的大小的肿瘤，仅需0.01毫升。

此制剂可保存在零下20℃三个月以上。用前室温化冻即可使用。因此比较传统的逆病毒载体，具有活力高，易保存的特点。D．用于基因治疗的腺病毒载体的构建

人腺病毒是基因组大小约36kb的双股DNA病毒(Tooza,1981)。作为真核基因表达的模型系统，已对腺病毒进行了广泛的研究并充分鉴定了其性质，使腺病毒作为基因转移系统成为有吸引力的系统。该病毒很容易生长和操作，并且在体外和体内表现出很宽的宿主范围。在溶胞感染的细胞中，腺病毒能够切断宿主蛋白质合成途径，引导细胞合成大量的病毒蛋白质，并产生大量病毒。

基因组的E1区域包括E1A和E1B及少数细胞基因，其中E1A和E1B编码负责病毒基因组转录调节的蛋白质。包括E2A和E2B在内的E2的表达得以合成病毒复制功能蛋白质，如DNA结合蛋白、DNA聚合酶及引发复制的末端蛋白质。E3基因产物防止由细胞毒性T细胞和肿瘤坏死因子引起的细胞溶解作用并且似乎对病毒增殖有着重要作用。与E4蛋白质相关的功能包括DNA复制、晚期基因表达及宿主细胞关闭。晚期基因产物包括大部分病毒颗粒衣壳蛋白质，并且这些蛋白质只在从主要晚期启动子开始的单一初级转录本发生大部分加工后被表达。在感染的晚期，主要晚期启动子(MLP)表现出高的效率(3tratford-Perricaudet and Perricaudet,1991a)。

由于只有一小部分病毒基因组似乎需要为顺式(Tooza,1981)，腺病毒衍生的载体当与细胞系如293细胞联用时对于大DNA片段的取代具有极大的潜力。为了提供反式的病毒必需蛋白质，已建立了Ad5转化的人胚胎肾细胞系(Graham,et al.,1977)。因此本发明人推论腺病毒的特点使之成为用于导向体内癌细胞的良好候选者。

使用腺病毒系统向细胞递送外来蛋白质的特殊优点包括(ⅰ)能够由外来DNA取代相对大的病毒DNA片段；(ⅱ)重组腺病毒的结构稳定性；(ⅲ)给人投用腺病毒的安全性；(ⅳ)腺病毒感染与肿瘤或癌没有任何已知的联系；(ⅴ)能够得到高滴度重组病毒；以及(ⅵ)腺病毒有高感染力。E．IL-2腺病毒载体与肿瘤治疗

本发明提供了用新的肿瘤治疗载体进行肿瘤的基因治疗的方法，该重组腺病毒保留了腺病毒的优点，如高滴度，宿主范围广泛，高效转导及不整合入靶细胞等。

图1显示了优选的IL-2腺病毒的设计和增殖。与之相应，建立了增殖和鉴定重组腺病毒的方法-噬斑检测法。然后如图2所示，用PCR法从结构上证实IL2-重组腺病毒。证实其结构后，用IL2腺病毒感染293细胞以实现其增殖。

比较三种载体：1．E1缺失的不带外源基因的载体。2．E1缺失的带光化基因(luc)的载体。3．E1缺失带白细胞介素2的基因载体，三者对体内实体瘤的治疗作用可以清楚地看到，只有注射了IL2-腺病毒载体的肿瘤块明显减少。组建的IL2腺病毒载体能有效地转导各种培养的肿瘤细胞株，当感染系数为5时，在感染的头24小时内，每一百万个细胞能产生约18纳克的IL2，因为腺病毒载体在细胞中的表达峰期是在感染后的第3日～第8日的范围内，可以肯定在表达峰期每百万个细胞24小时能产生100纳克以上的IL2。由这一结果可见，在肿瘤细胞中，我们构建的IL2-腺病毒载体中的IL-2得到了高效表达，其原因可能在于以下几个方面：①高效基因转移；②强CMV启动子驱动人IL-2cDNA表达；③来自SV40的小DNA增强IL2 cDNA表达。

本文公开的研究工作表明IL2重组腺病毒具有肿瘤治疗效应，所说的治疗作用是通过激活免疫T细胞来实现的，这些结果支持使用IL2腺病毒颗粒作为肿瘤的治疗剂。F．患者和治疗程序

发明人提议向实体癌患者的肿瘤细胞区域性输送腺病毒-IL2载体是一种很有效的对抗临床疾病的方法，该方法是对目前肿瘤疗法的重大改进，其主要途径是通过直接向肿瘤细胞注入IL2腺病毒，以产生大量的IL2基因产物，激活肿瘤附近的T细胞，即让体内的免疫细胞直接被激活以承担清除癌的功能。

当然，对于较大体积的肿瘤，由于受到IL-2剂量及肿瘤细胞分泌的抑制物的影响，使疗效不明显，此时可以通过切除大的肿瘤组织以减少免疫抑制物的分泌，再结合IL2腺病毒的注入，以清除癌细胞。

下列实施例用于证明本发明的优选实施方案。实施方案中公开的技术代表了本发明人在实现本发明过程中的改进技术，可以看作是实践本发明的优选方式。

实施例1：IL-2表达载体的构建

本实施例描述IL-2表达载体的构建。按所指出的方法构建该载体并用于取代腺病毒Ad5的E1区域。

如图3所示。

将含有来自SV-40的小DNA(100 bp)和IL-2 cDNA的片段插入了pAC-CMV-_pL_pA的E1区的BamcHⅠ位点，该插入片段的基因组大小为700bp，形成pAC-CMV-pLpA-SV-IL2，将其与质粒pJM17由Ca²⁺介导共转染293细胞，转染细胞培养7-10天后，用病毒斑法筛选，并提取病毒斑中DNA，进行PCR分析，以鉴定IL-2重组腺病毒的产生。

实施例2：重组IL2-腺病毒的产生及增殖

本实施例描述一种适于产生表达IL2的腺病毒载体的方法。由于腺病毒的包装限制，所以_pJM17不能以其自身形成病毒，而pAC-CMV-_pL_pA-SV-IL2仅含有3.2kbAd5基因，不能形成有活性的病毒颗粒，因此，在IL2表达载体质粒pAC-CMV-_pL_pA-SV-IL2和_pJM17质粒之间发生同源重组以产生能够包装在必要的腺病毒包装蛋白中的活病毒。

本实施例的方法利用293细胞作为宿主细胞，以实现pAC-CMV-_pL_pA-SV-IL2和_pJM17之间的同源重组。这一过程需要由C_a ²⁺介导，将该二质粒DNA转染入293细胞，并用噬斑检测法筛选出重组腺病毒。

293细胞是培养在含5％胎牛血清的MEM中，并在转染前24小时将293细胞(15～20代)接种在60mm平皿上，用2ug pJM17,10ugpAC-CMV-_pL_pA-SV-IL2转染细胞，转染后1～2天，在平皿上覆盖一层海藻糖以防止重组病毒的游移。

重组IL-2腺病毒(pAC-CMV-SV-m2)的增殖是以重组IL-2腺病毒直接感染293细胞株实现的，同时以反复冻融法实现成熟重组病毒粒子从293细胞中释放。

实施例3：证实重组腺病毒的同一性

本实施例举例说明用聚合酶链式反应(PCR)技术进一步证明共转染适当细胞系后所得的重组腺病毒的同一性。

使用两对引物：一对表达载体特异性DNA(IL-2)引物和一对腺病毒基因组特异性DNA引物。

实施例4：在小鼠纤维肉瘤细胞及乳癌细胞中IL2腺病毒载体指导的IL2基因表达

分为2-3次瘤内注射重组病毒2-6×10⁹pfu，能显著地延缓癌的生长及排斥癌细胞。

小鼠纤维肉瘤(直径为0.4-0.6cm)：分别在皮下注射癌细胞后第14天，19天于形成的纤维肉瘤内注射20μL AdvIL-2，病毒滴度为2×10⁹pfu，结果使肿瘤细胞生长减慢，有些甚至完全消失。将体内注射了2×10⁹pfu病毒的0.8cm直径大小的肿瘤取出，体外培养3天后，IL-2产量为490pg/24h。

小鼠乳腺癌(直径为0.3-0.5cm)：分别在皮下注射癌细胞后第12天，15天，17天瘤内注射2×10⁹pfu病毒，也发现肿瘤生长减慢甚至完全消失。

实施例5：在人肾癌细胞中IL-2腺病毒载体指导的IL-2基因表达。

将来自病人的肾癌组织，酶解后所得的细胞悬浮液分为三份，培养在含5％牛血清的MEM培养基中，每份含有5×10⁷细胞。其中一份以每毫升24纳克的比例加入了IL2，一份细胞加入了5×10⁸腺病毒白细胞介素2载体。而第三份则不加IL2或腺病毒白细胞介素2载体。经一星期细胞培养，可以观察到淋巴细胞的生长状况在前两份细胞培养中是基本相同的。淋巴细胞的生长显著增加，从细胞的形状可明确证实淋巴细胞被激活而附着并进一步杀死癌细胞。在那份既不加腺病毒白细胞介素2载体，也不加白细胞介素2蛋白的细胞培养的对照，癌细胞继续生长而淋巴细胞仍处休眠状。

实施例6：含有SV-40片段与不含SV-40片段的IL-2重组腺病毒载体(pAC-CMV-SV-IL2和pAC-CMV-IL2)在肾癌细胞中表达的比较

结果见表1

表1：含有SV40片段与不含SV40的腺病毒IL2在肾癌细胞中表达

载体	测定时间(感染后天数)	细胞数	IL2滴度(纳克/毫升)	总液容(毫升)	产     额(纳克/106细胞)
						ADV-CMV-IL2	1	1.0×106	ND	15
3	2.8×106	0.6	15	3.2
					5		1.3×107	ND	30
ADV-CMV-SV-IL2	1	1.0×106	0.7	15							10.5
					3	2.5×108	1.9	15	11.4
	7	1.1×107	1.4	30						3.8

由表1可见：当重组腺病毒载体中不含来自SV40的小DMA片段时，只在感染后第3天表现出3.2ng/10⁶细胞的IL2产量，而在感染后的第1天和第五天，都不能检测出白细胞介素2。当一段来自SV40的小DNA插入CMV启动子和IL2表达基因之间时，白细胞介素2的表达明显增加，在第1、3、7天都检出分别高达10.5、11.4、3.8ng/10⁶细胞的产量。由此可见，来自SV40的这一小段DNA具有能明显增加IL2的表达的功能。

实施例7：加入IL-2重组腺病毒的多少对IL-2表达的影响

在用重组腺病毒IL2处理肿癌细胞的过程中，我们发现：感染倍数(MOI)不同，IL2在肿瘤细胞中的产量也就不相同，其结果见表2。

表2：IL-2重组腺病毒的剂量对IL-2表达的影响

	感染倍数(MOI)	IL2滴度(纳克/毫升)	产额(纳克/106细胞)
				乳癌细胞MCF-7	50.0	3.9	27.3
5.0	2.6	18.3
			2.5		0.2	1.4
0.5	ND
			肾癌细胞2		50.0	3.9	27.2
5.0	2.5	17.5
				2.5	1.1	7.9
0.5	0.7	4.6

由表2，我们可以看出，感染倍数分别为50、5、2.5、0.5倍时，产生的白细胞介素2的产额(ng/10⁶细胞)并不是成倍地减少，并且，由此表的结果我们也可以确定，有效感染为MOI=5的感染。同时，由此表我们也可以看出，乳癌细胞MCF-7与肾癌细胞2的结果基本一致，只是肾癌细胞随MOI的减少，IL2产额减少更小，其原因可能是因为①在肾癌细胞中，利于IL-2高效表达；②重组腺病毒更易感染进入肾癌细胞；③肾癌细胞分裂速度较乳癌细胞慢。

实施例8：感染倍数为10(病毒/细胞=10)时感染时间对IL-2表达的影响。

我们进行了固定感染倍数，测定不同感染时间，在不同肿瘤细胞中IL2的产额的试验，其结果见表3。

表3：感染时间对IL-2表达的影响

	测定时间(感染后天数)	产额(纳克/106细胞)
			肾癌细胞3	16小时	＞34(高过测程)
3天	＞34(高过测程)
		病人4肾肿瘤细胞(淋巴细胞和癌细胞混合)		5天	9.0
7天	9.0

由表3可见，对肾癌细胞3而言，在感染后的第16小时至第3天都为IL2的表达高峰期，其产额都大于34ng/10⁶细胞(高过测定范围)，而对病人4肾肿瘤细胞而言，在感染后第5天至第7天为其IL2表达的高峰期，产额为9ng/10⁶细胞。由此可见，对于不同肿瘤细胞，IL2重组腺病毒感染后，出现IL2表达峰值的时间是很不相同的。

实施例9：重组IL2腺病毒治疗程式

动物模式应用可作为临床前试验的一部份，因此，可以检测已确定进行腺病毒基因治疗的病人体内是否存在抗腺病毒的抗体，如果存在，并且，病人有对药理学式天然物质发生过敏反应的历史，则在密切临床观察下给予一定剂量的重组腺病毒。

为了应用IL-2重组腺病毒治疗肿瘤，应制备在适当启动子或增强子控制下表达IL-2的重组腺病毒，并按照符合药物与食品管理局(FDA)规定的生产人用药品的方法纯化，目前的纯化方法主要是氯化铯梯度超离心，柱层折法也正在试验中。

目前适用于IL-2腺病毒治疗的方法主要是直接或局部给药，即让病毒分散在药理学上可接受的溶液中，通过直接注射入肿瘤中，以使重组IL-2腺病毒更接近肿瘤细胞，投放剂量一般是5×10⁹个病毒/cm³癌组织。

对于较大肿瘤组织，采用切除配合注射重组IL-2腺病毒更为有效。同时，不仅要注意使用重组缺陷腺病毒基因转移载体的安全性，更应监测其使用剂量以进一步减少不期望的副作用。

确定是否有效或是否有毒性，在疗程开始前应测量肿瘤的大小，包括最大直径和垂直径，以二者的乘积作为肿瘤大小的记录。测定肿瘤需测指标，从进入程序开始测病人的存活期。

追踪检查应包括所有用于肿瘤诊断的常规检查：与肿瘤相关蛋白质、酶、抗原的检验，X线诊断，CT诊断，MRI检查，超声检查，放射性药物显象，放射性免疫显象等方法。

本说明已借助优选实施方案详细描述了本发明，但本领域技术人员显然可以在不背离本发明的概念、范围前提下对本文所述的载体、方法、步骤或各步骤的顺序作出改动。具体说，显然可以用与白细胞介素2，在生物学上相关的基因，如其它细胞激动素：其它白细胞介素干扰素，胞落刺激素，α-肿瘤坏死因子，转型生长因子系列等，取代本发明构建的IL-2腺病毒载体中的白细胞介素2基因，以及用类似本载体构建时缺失E1插入表达序列盒的方法改造腺病毒的E2A、E2B、E3、E4等区域，以达到生产表达基因产物，以及用其它化学和生理学上相关的制剂取代本文描述的制剂并获得相同或相似结果。所有这些相似的取代或修饰对本领域技术人员来说都是显而易见的，并属于本发明权利要求所限定的本发明范围和概念之内。所有权利要求的材料和方法均可重现。

本发明发明人已证明了本发明在治疗癌疗中的显著作用，特别是IL2重组腺病毒可显著激活免疫细胞，从而实现对肿瘤的识别及杀死作用。

基于下述几个理由，本发明作为一个整体是非常优秀的，首先，腺病毒携带的IL-2基因进入靶细胞高效增殖，克服了单纯使用IL-2的一切弊端，其次腺病毒的E1缺失，并在其位置上插入IL-2基因，而保留重组载体的E3区，则减小了机体对腺病毒的免疫反应，第三IL-2腺病毒在肿瘤中表达，形成IL-2梯度，可辐射性地激活免疫细胞，从而在杀死癌细胞中显示显著疗效。

Claims (16)

1、携带白细胞介素2(IL-2)的重组腺病毒载体，其特征是所说的载体包含位于巨细胞病毒(CMV)早期基因启动子控制下的IL-2表达区，SV-40多聚腺苷化信号序列，及一段来自SV40小DNA序列。

2、按照权利要求1的重组腺病毒载体，其特征是在其构建时，缺失了该病毒的E1区，在缺失处导入IL-2表达区，也可以缺失E_2A区、E_2B区、E_a区或E₄区，并分别在上述缺失处导入表达基因。

3、按照权利要求1的重组腺病毒载体，其特征是在CMV早期基因启动子和IL-2基因之间插入有一个使IL-2转录和翻译水平显著提高的DNA片段。

4、按照权利要求1、2、3的重组腺病毒载体，其特征是所说的DNA片段可以是来自SV-40的小DNA片段。

5、按照权利要求1的重组腺病毒载体，其特征是可以分散于药理学上可接受的配方中。

6、用携带白细胞介素2(IL-2)的重组腺病毒载体感染癌细胞的方法，其特征是将腺病毒以药理学上可接受的形式给含有癌细胞的哺乳动物投用。

7、按照权利要求6的方法，其特征是所说的癌细胞可以是人纤维瘤细胞或人乳腺癌细胞，肾癌细胞。

8、产生重组腺病毒的方法，其特征是该方法包括：通过BamHⅠ，将IL-2cDNA插入pAC-CMVpLpA质粒的多聚接头区域，形成pAC-CMVpLpA-SV-IL2,pAC-CMVpLpA，一种穿梭质粒，包含E₁缺失的Ad5基因组中前3.2kbpJM17是一种含有E1区缺失的Ad5部分DNA序列的质粒，通过pJM17和pAC-CMVpLpA-SV-IL2共转染细胞，并用噬斑检测法分析培养的293细胞是否有作为同源重组病毒产生之指征。

9、按照权利要求8的方法，其特征是所说的共转染是由Ca²⁺介导。

10、按照权利要求8的方法，其特征是其中的腺病毒载体是有复制缺陷的，并且宿主细胞又能弥补这一缺陷。

11、按照权利要求8、10法的方法，其特征是所说的腺病毒载体缺少功能性的E₁区，所说的宿主细胞是能够表达E₁区功能性蛋白的细胞。

12、按照权利要求8、10、11的方法，其特征是所说的宿主细胞可以是293细胞。

13、按照权利要求8、10、11的方法，其特征是所说的宿主细胞在MEM培养基中培养。

14、按照权利要求8、10的方法，其特征是检测时，从表现噬斑的细胞培养物中得到DNA并使用表达载体特异性和腺病毒基因组特异性DNA探针经PCR方法分析DNA，以证实重组腺病毒的存在。

15、按照权利要求8的方法，其特征是所使用的表达基因可以是其他的细胞激动素。

16、按照权利要求8、15的方法，其特征是所说的细胞激动素可以是白细胞介素(IL1-IL15)、干扰素(IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、胞落刺激素(CSFs、GM-CSF、GCSF)、α-肿瘤坏死因子(TNF-α)、生长因子β(TGF-βs)。

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