CN1094974C - 表达人白细胞介素12的重组腺病毒及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的表达人白细胞介素12的重组腺病毒，该重组腺病毒的制备方法和用途，以及含有该重组腺病毒的药物组合物。将这种新的重组腺病毒用于临床，具有成本低、使用方便、效率高等优点，尤其适用于肿瘤、以及细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病的免疫治疗。

Description

表达人白细胞介素12的重组腺病毒及其制法和用途

本发明涉及基因治疗领域。更具体地，本发明涉及一种新的表达人白细胞介素12的重组腺病毒，该重组腺病毒的制备方法和用途，以及含有该重组腺病毒的药物组合物。

白细胞介素12(Interleukin-12，IL-12)是目前发现的唯一由p35和p40两个亚基组成、呈异源二聚体结构的细胞因子(Munetti et al.J Exp Med，1993，177：1199)。IL-12主要由巨噬细胞和树突状细胞产生，能有效增强自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)的杀伤作用，促进T细胞增殖和产生γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，而IFN-γ是介导Th1细胞免疫应答的重要细胞因子，因此IL-12被认为是继IL-2之后又一重要的具有免疫增强作用的细胞因子，具有良好的临床应用前景。

动物试验和初步的临床试验表明，IL-12在抗肿瘤(Brnda M，et al.J ExpMed，1993，178：1223)、抗感染和抗呼吸道过敏、纠正免疫缺陷等方面具有显著疗效(Kim J，et al.J Immunol，1997，158：816)。IL-12能抑制受感染的人单核细胞中的HIV的复制(Akridge RE and Reed SG.J Infect Dis 1996；173：559-564)。IL-12还能治疗细胞内细菌感染、病毒性感染和真菌感染。IL-12是一种活性很强的佐剂，体内应用后可以显著增强机体对蛋白抗原或多肽抗原诱导的Th1类细胞免疫反应(主要是CD8⁺CTL)和体液(IgG2a)免疫反应。IL-12可以与抗原类物质一同混合后局部注射，发挥其佐剂样作用。同样，如果IL-12全身性应用，IL-12亦具有显著的佐剂样作用(Marinaro M，Boyaka PN，Jackson RJ et al.Ann N.Y.AcadSci 1996；795：361-365)可以增强粘膜等局部免疫的抗原诱发的免疫反应。。如果在多肽致敏的树突状细胞(DC)体内免疫的同时补充外源性IL-12，可以更显著地激发免疫功能(Bianchi R，et al.J Immunol 1996；157：1589-1597；Bliss J，et al.J Immunol，1996；156：887-894)。

虽然研究表明IL-12有巨大的应用前景，然而，在将IL-12直接用于临床时，仍存在一些问题。例如IL-12的体内半衰期较短，因而治疗时需要每天注射一次或多次，再加上IL-12制剂本身成本较高，所以导致治疗费用十分昂贵而且治疗效率也不高。此外，在局部施用IL-12(如治疗肿瘤时)，需要在同一部位附近反复进行注射，使病人非常痛苦。而且IL-12全身应用的毒副作用严重，导致应用受到很大限制。

因此，本领域迫切需要一种成本低，使用方便的施用IL-12的方法以及相关的制剂。更佳地，还需要一种能有效降低毒性的施用IL-12的方法以及相关制剂。

本发明的目的就是提供一种新颖的在临床上施用IL-12的方法和相关制剂，从而克服现有技术中的上述缺点，使得临床施用IL-12的成本低廉、使用方便、毒性降低和/或效率更高。

在本发明的一个方面，提供了一种表达人白细胞介素12的重组腺病毒，该腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP，并且在E1区位置插入了人白细胞介素12表达盒，该表达盒依次包括：启动子序列，人白细胞介素12的p35和p40亚基编码序列，和聚腺苷酸化信号序列。在一个优选实施例中，该腺病毒为Ad5型腺病毒。

在另一优选例子中，该IL-12表达盒中还含有内部核糖体结合位点IRES，而且p35亚基编码序列位于IRES之前，而p40亚基编码序列位于IRES之后。

在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，它包括有效量的表达人白细胞介素12的重组腺病毒和药学上可接受的载体或赋形剂，其中该重组腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP，并且在E1区位置插入了人白细胞介素12表达盒，该表达盒依次包括：启动子序列，人白细胞介素12的p35和p40亚基编码序列和聚腺苷酸化信号序列。

在本发明的又一方面，提供一种制备表达人白细胞介素12的重组腺病毒的方法，该方法包括：

(a)提供腺病毒DNA-TP复合物，在该腺病毒DNA基因组缺失E1区和E3区，并且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP；

(b)提供含腺病毒基因组的粘粒载体，在该粘粒载体中的腺病毒基因组缺失了E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人白细胞介素12表达盒，其中该表达盒依次包括：启动子序列，人白细胞介素12的p35和p40亚基编码序列，和聚腺苷酸化信号序列；

(c)将步骤(a)中的腺病毒DNA-TP复合物和步骤(b)中的粘粒载体共转染表达E1区基因的宿主细胞；

(d)筛选阳性克隆；

(e)从阳性克隆中分离纯化重组腺病毒。

图1.人IL-12 p40和p35 cDNA的RT-PCR产物的电泳图，其中泳道1为DNA分子量标准，泳道2为p40的PCR扩增产物，泳道3为p35的PCR扩增产物；

图2.pCIcc真核表达载体的物理图谱；

图3.人IL-12双亚基共表达载体pCI-35i40构建流程图；

图4.人IL-12 p35和p40的融合基因及所编码的氨基酸序列，中间用小写字母表示的是IRES序列；

图5.pAx1cw腺病毒载体的结构简图；

图6.人IL-12重组腺病毒载体pAx1cw.CIh35i40的酶切鉴定图；其中泳道1为分子量标记物；泳道2为pAx1cw.Cih35i40的ClaI酶切产物；

图7.COS/TPC同源重组法产生人IL-12重组腺病毒的构建示意图；

图8.人IL-12重组腺病毒细胞克隆的酶切鉴定分析，其中泳道1为分子量标记物，泳道2为LacZ-293的ClaI酶切产物，泳道3为人IL-12腺病毒克隆的ClaI酶切产物。

在本发明中，术语“白细胞介素12编码序列(IL-12)”指天然存在的或人工合成的IL-12编码序列(包括p35亚基和p40亚基的编码序列)，这些编码序列可以编码天然形式的IL-12及其亚基，也可以编码各种变异形式的IL-12及其亚基(例如IL-12的保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体，或其活性片段)，只要该变异形式的IL-12及其亚基具有IL-12或相应亚基的生物活性。

在本发明中，术语“白细胞介素12表达盒”指含有IL-12p35亚基和p40亚基编码序列以及表达所需元件的序列组件，表达所需的组件包括启动子和聚腺苷酸化信号序列。此外，白细胞介素12表达盒还可以含有或不含有其他序列，其中包括但并不限于：增强子、分泌信号肽序列等。

在本发明中，可以适用于人白细胞介素12表达盒的启动子可以是任何一种常见的启动子，它可以是组成型启动子或诱导型启动子。较佳地，该启动子是组成型的强启动子，例如巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子等其它适用于真核表达的启动子。

在本发明中，可供使用重组腺病毒可以是任何一种血清型的腺病毒，较佳地，为了防止在制备过程产生亲本的复制型腺病毒，宜采用E1区缺失型腺病毒。更佳地，使用E1区和E3区都缺失的腺病毒。此外，宜采用已研究得较为透彻的腺病毒类型，例如Ad2和Ad5型腺病毒。

由于IL-12是由p35、p40两个亚基经二硫键组成的异源二聚体，只有正确装配的IL-12才具有生物学活性，而p35、p40单体均不能发挥IL-12的生物学作用，相反p40亚基还会起拮抗IL-12的作用，因此IL-12双亚基共表达载体更具有应用价值。

应用IRES构建p35亚基和p40亚基共表达载体，如果p40在前，则在IL-12合成的过程中，其后受限的重要因素之一是p40表达太多。生理条件下，大部分产生的p40呈单体或同源二聚体结构，只有少数p40才与p35亚基结合形成具有IL-12活性的异源二聚体。体内外试验均证明p40亚基是IL-12的拮抗剂，其通过与IL-12拮抗发挥其免疫抑制作用，协调平衡免疫反应。局部给予p40基因可造成局部的免疫抑制状态，有利于移植物存活；在p40亚基转基因小鼠体内，Th1细胞免疫功能严重受损，因而对病原体的易感性大大增强。

因此，本发明人设计了在给予IL-12的同时，降低局部p40亚基的表达量的新方法，从而大大有利于IL-12发挥其免疫增强作用。在本发明的一个实施例中，将p35置于前，构建了p35亚基相对p40亚基过度表达人IL-12双亚基共表达腺病毒，从而大大提供了IL-12的施用效果。

下面详细描述本发明的可用于临床的复制缺陷型人IL-12重组腺病毒和相关药物组合物(制剂)的制备过程和方法。

1、腺病毒的病毒生物学和分子生物学特性

腺病毒是一种无包膜的DNA病毒，病毒颗粒呈正二十面体，直径为80-90nm。腺病毒主要有三种结构蛋白：六邻体，构成20面体的表面；五邻体，位于蛋白质外壳中的12个顶角；纤维蛋白，每个五邻体上的一条纤维突起。

腺病毒基因组为双螺旋线性双链DNA，约有36000个碱基对(bp)，在两端结合有55kDa末端肽(Terminal peptide，TP)。传统上将病毒基因组划分100个基因图距单位(mu)，1mu相当360bp。基因组两端各有一个约100bp的末端倒置反向重复DNA序列(ITR)。在基因组左端载有病毒包装信号。基因组分为早期转录区(分为E1-E4)和晚期转录区(分为L1-L5)，每个转录区在病毒生活周期中都起重要作用。此外，还有几个小的中间区和晚期区。

人腺病毒有近50种血清型，其中Ad2和Ad5基因组结构和基因表达的研究较为广泛和深入，现已确定这两型腺病毒的全部核苷酸序列，目前构建的腺病毒载体大多源于这两种血清型。

腺病毒基因组中的E1区，在病毒基因组一进入宿主细胞核中即被激活，从而编码起始因子，调节病毒的早期活动，因此E1区为病毒复制所必需。

E2区编码的蛋白与病毒DNA的复制有关，包括病毒DNA末端结合蛋白(TP)，DNA结合蛋白(DBP)和DNA聚合酶，DBP与转录调控有关。

E3区编码的多肽与病毒逃避宿主抗病毒免疫反应有关，比如，E3编码的一个19kDa糖蛋白，可抑制I类主要组织相容性抗原(MHC)提呈到感染细胞表面，使细胞毒性T淋巴细胞(CTL)不能有效识别和杀伤感染细胞；此外，E3编码的10.4kDa、24.5kDa、14.7kDa蛋白可抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)的细胞毒作用。E3区缺失对腺病毒的感染性无明显影响。

E4区编码产物参与病毒DNA复制、晚区基因表达、病毒蛋白合成和宿主蛋白合成终止等活动。主要晚期基因产物是病毒结构蛋白，而由pIX编码的小结构蛋白，有助于大于34kb的基因组包装。

腺病毒通过经介导吸附和介导内吞的两种不同受体而进入宿主细胞。病毒先通过纤维蛋白与未知的某种受体结合从而吸附到细胞表面。介导病毒内吞入内体(endosomes)的受体已被鉴定为αv整合素(αv integrins)。在内吞过程中，内体的酸化引起病毒外壳蛋白构象改变，从而导致病毒冲破内体进入胞浆，进一步在外壳蛋白的核靶向信号引导下进入细胞核。E1区编码的蛋白质首先上调自身表达和激活其他早期区基因表达，8小时后，病毒DNA开始复制，随后晚期蛋白表达并在感染细胞核中进行子代病毒颗粒的装配。腺病毒可抑制宿主细胞DNA的转录和翻译，而促进自身的蛋白合成。被感染约30-40小时后，宿主细胞溶解，释放出子代病毒颗粒。临床上，腺病毒一般可引起上呼吸道感染、角结膜炎、胃肠炎、肺炎、支气管炎、肝炎和膀胱炎，多数为轻度的自限性疾病。近20年来，腺病毒口服活疫苗已被广泛使用，从使用过的一千多万人的结果来看，疗效显著且无明显的毒副作用。

2、腺病毒载体的特点

基因转移技术和导入途径是影响基因治疗效果的重要因素。虽然逆转录病毒载体仍是目前基因转移和基因治疗中应用最广的载体系统，具有稳定整合表达等优点，但它只能感染分裂期的细胞，感染效率较低，一般不能用于体内(in vivo)途径，临床应用中难免受到限制。

腺病毒载体是继逆转录病毒载体后在基因治疗方面应用开发得较早的一种基因载体，由于其本身的特点及载体系统不断改进，近年来在基因治疗中得到日益广泛的应用。腺病毒载体首先应用于纤维囊性变(Cystic Fibrosis，CF)和al抗胰蛋白酶缺陷型肺气肿的基因治疗，现广泛应用于其他疾病的治疗，如嗜血杆菌A和B、Duehene肌营养不良、家族性胆固醇血病、血管成形术后动脉再狭窄、表面活性蛋白B缺乏、红细胞生成素缺陷和各种肿瘤，显示其具有良好的应用前景和开发价值。1995年，美国食品与药品管理局(FDA)批准腺病毒介导的p53基因疗法进入临床，试用于晚期肿瘤病人的治疗，收到显著疗效，且无明显的毒副作用。

腺病毒载体具有以下几个特点：①其宿主范围广，感染率高，包括静息细胞和终末细胞；②病毒的滴度高，可达10⁹～10¹⁰空斑形成单位(pfu)/ml，由于其理化性质较稳定，可以通过沉积、柱层析或超离心纯化获得高滴度病毒载体；③腺病毒无胞膜，对补体介导的灭活作用不敏感，体内更稳定；④目前应用的腺病毒载体多为Ad2和Ad5，对啮齿动物无致瘤性，临床上通常仅引起轻度的上呼吸道反应，甚至对于免疫抑制病人亦如此；⑤腺病毒通常不整合入宿主细胞基因组内，适用于基因的短期表达，理论上讲就不会引起宿主细胞的插入突变，比逆转录病毒更为安全。

3、腺病毒载体的构建策略

目前的腺病毒载体大多来源于腺病毒Ad2和Ad5这两种血清型。适用于基因治疗应用的腺病毒载体属于复制缺陷型病毒。由于E1编码的蛋白功能是其他所有腺病毒基因有效表达所必须的，因此最常见的策略就是用外源DNA替代病毒E1区序列，通过包装细胞反式提供E1区序列而产生的复制缺陷腺病毒载体。

可用于本发明的宿主包装细胞是可以表达腺病毒E1区基因的任何宿主细胞，因为该细胞能够提供复制缺陷型腺病毒复制所需的E1区基因表达产物。一种优选的常用包装细胞是293细胞，该细胞由人胚肾细胞经Ad5腺病毒DNA片段转化而成，载有整合入细胞基因组的腺病毒E1区等病毒基因片段，并持续表达E1区蛋白，能为E1区置换型腺病毒载体提供反式补偿。

利用E3区缺失不影响病毒感染性，切去E3区可增加载体外源性DNA容量。切去E1和E3区，外源基因插入容量可达约8kb。而克隆更大的外源DNA片段则需切去其他的病毒序列，缺失的功能再通过互补细胞系或辅助病毒反式提供。

本发明的重组腺病毒的方法可以用多种方法产生，其中主要有以下四种共转染入互补细胞系通过体内同源重组而产生重组腺病毒的方法更为常用，更佳地是用COS/TPC共转染同源重组法产生的。

(1).细胞外病毒DNA直接连接法(也称Stow方法)：此法是选d1309腺病毒基因组在3.7mu(E1区内)的XbaI限制内切酶点，切断和分离3.7-100mu病毒基因组大片段(称XbaI片段)，然后将载有外源DNA的腺病毒基因组的最左端0-1.3mu，用连接酶连到XbaI大片段上。连接产物可用于转染293细胞以制备重组腺病毒。

(2).细胞内病毒DNA同源性重组：与Stow方法很类似，将载有外源DNA的腺病毒基因左端0-1.3/9.8-16mu片段与XbaI大片段同时转染到293细胞内，通过同源性重组来制备病毒载体。

(3).细胞内质粒DNA同源重组：此法利用质粒的形式，将腺病毒基因组DNA的倒置末端相连形成环状，能在细菌内复制，从而简化了XbaI大片段的制备手续。环状腺病毒DNA由于细菌质粒插入其总基因组长度超过包装限度，在细胞内不会被包装成病毒颗粒，仅提供病毒DNA同源重组的所需片段。构建E1替代型腺病毒载体时，首先将外源DNA插入细菌质粒(如pΔElsp1A)中，该质粒含腺病毒基因组左端序列(包括ITR、包装信号和部分缺失的E1区)。含外源DNA的穿梭质粒与含腺病毒基因组其余序列的DNA共转染293细胞，通过体内的同源重组产生重组腺病毒。这种含其余序列、用于同源重组的腺病毒基因组DNA可有不同的形式，或是通过体外经限制性内切酶消化无感染性的病毒DNA，或者来源于重组质粒pJM17或pBHG系列质粒。该方法目前较为常用，但缺点是重组效率还不构理想。

(4).COS/TPC共转染同源重组：腺病毒DNA的两端各共价结合有一个55kDa的末端肽(Terminal peptide，TP)，结合有末端肽的腺病毒DNA导入允许细胞后产生的空斑数是裸腺病毒DNA的100倍以上(Horwitz M.FundamentalVirolgy，2nd edition，edited by Fields B et al.Raven Press，Ltd.New York，1991；771)，表明TP的存在对腺病毒DNA的感染能力有着重要的影响。传统的重组腺病毒制备方法中常用蛋白酶将腺病毒DNA的末端肽切除，Miyake等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996，93：1320)首先采用含有TP的腺病毒DNA-TP复合物(TPC)进行同源重组，建立了COS/TPC同源重组法制备重组腺病毒，并且证明该法的重组效率可提高近百倍，而且几乎不产生亲代病毒。在该方法中，首先构建了一种含Ad5基因组(其E1或E4区含克隆位点)的E1区替代型粘粒(粘粒)载体，将含外源基因的表达单元(expression cassette)克隆入粘粒腺病毒基因组。然后将其与腺病毒DNA-TP复合物共转染293细胞，其中腺病毒DNA-TPC事先用限制性内切酶消化以减少其感染性，在粘粒和腺病毒DNA重叠序列间进行同源重组而产生重组腺病毒。用EcoT 22I消化DNA-TPC(E3区缺失的腺病毒DNA有7个EcoT22I位点)时，重组发生在最右侧EcoT22I以右的腺病毒DNA和粘粒载体中的同源部分，同源长度达23.2kb，而传统的细胞内质粒DNA同源重组方案是同腺病毒DNA中XhoI酶切后的左末端重组，同源长度仅2.2kb，可发生重组的同源片段长度的增加无疑提高了重组效率。

在构建共表达载体时通常可采用以下3种策略：

其一是用RNA剪接信号将两目的基因(即p35和p40亚基基因)连接，同一启动子转录的一个mRNA前体分子经剪接加工形成两个成熟的mRNA分子，如逆转录病毒载体中将目的基因之一替代env序列，虽能实现共表达，但剪接效率受其上下游序列的影响，较难控制；

其二运用内部启动子，使两个编码基因受不同启动子控制，转录合成两个独立的mRNA分子，其缺点是由于启动子之间的相互竞争干扰，往往难以使两个目的基因都得到有效表达；

其三是运用mRNA 5’端非编码序列中的内部核糖体结合位点(IRES)，在一个mRNA分子上进行两种不同机制的蛋白转译，产生两种蛋白(Ghattas et al.Mol CellBio1.991，11：5848)。目前该策略曾经应用于逆转录病毒共表达载体的构建(IRES载体，Morgan R，et al.Nucl Acids Res，1992，20：1293)，但是由于逆转录病毒载体感染效率较低，不适合in vivo途径直接体内应用，且稳定整合于宿主基因组中，表达持续时间长，应用于免疫基因治疗存在明显不足。

在本发明的构建过程中，用IRES构建共表达载体。通常，置于IRES前的基因按帽子依赖机制指导蛋白合成，IRES下游基因蛋白合成则受非帽子依赖机制控制，其蛋白合成效率通常比IRES上游基因低10～20倍，因此在本发明中将p35亚基置IRES前，p40亚基置IRES后，这样可产生相对p40过量的p35，所制备的IL-12重组腺病毒记为Ad.IL12(35i40)；而将p40亚基置IRES前，p35亚基置IRES后，所制备的IL-12重组腺病毒记为Ad.IL12(40i35)。

在局部表达时，Ad.IL12(35i40)重组腺病毒本身表达的p35、p40可组装成具有活性的IL-12，而且过量的p35可与组织局部表达的p40亚基结合(因为通常情况下人体中p40亚基是稍过量的)，从而抑制p40亚基的拮抗作用，更有利于IL-12在局部发挥其免疫增强作用，因此该重组腺病毒可能具有更大的应用价值，尤其是在需增强免疫的应用场合。

相反，Ad.IL12(40i35)会表达过量的p40亚基，因此，由于不能用于增强免疫的场合而应用前景较小。但是该重组腺病毒可用于需抑制免疫的场合。

在本发明的一个优选实施例中，应用COS/TPC同源重组法来制备本发明的重组腺病毒，具体如下：首先通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆人IL-12p40和p35亚基的全长编码cDNA，并与IRES相连，将融合后的基因置于巨细胞病毒(CMV)启动子的控制之下，插入E1区替代的腺病毒载体pAx1cw，通过与经EcoT22I酶切、结合末端肽的Ad5腺病毒DNA在293细胞中的同源重组获得人IL-12的复制缺陷性重组腺病毒，滴度达8.3×10¹⁰pfu/ml；并证明了所制备的人IL-12重组腺病毒体外能有效表达具有生物学活性的人IL-12(100～200ng/10⁶细胞/24h)。

此外，考虑到亲本病毒产生的主要原因是最左端的两个EcoT22I片段发生意外的连接，因此DNA-TPC中存在E1区可能会增加产生亲本病毒的机率。为此，在本发明的一个优选实施例中选用了E1和E3区都缺失的DNA-TPC，从而进一步降低(消除)了产生亲本病毒的可能性，保证了制备的重组腺病毒是缺少E1和E3区的复制缺陷型，并可安全地应用于临床治疗。

在制得本发明的人白细胞介素12重组腺病毒之后，就可以将所需纯度的重组腺病毒与任选的生理上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂(Remington′sPharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.，Ed.，[1980])，以冻干形式或水溶液形式进行混合，可以制得本发明的重组腺病毒的治疗制剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者而言在所用的剂量和浓度下应是无毒的，并且可含有缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸缓冲液；抗氧化剂如维生素C；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。作为最常见的例子，水和生理盐水就可作为本发明重组腺病毒制剂中的载体。

含本发明的新型重组腺病毒的药物组合物(制剂)可以用常规方式施用于需要治疗的个体，这些方式包括(但并不限于)：肌内注射、皮下注射、静脉注射等。对于局部给药，一种较佳地方式是直接将本发明的制剂注射到病灶或其周围，例如肿瘤块中或其附近。

本发明制备的复制缺陷型人IL-12重组腺病毒具有巨大的应用价值和优势，主要体现在以下几方面：

(1).体外感染肿瘤细胞，制备IL-12基因转染的肿瘤瘤苗，进行肿瘤的主动免疫治疗，肿瘤细胞可来源于肿瘤患者的新鲜瘤体标本或肿瘤细胞株。

(2).体外感染经肿瘤抗原刺激的抗原提呈细胞(如树突状细胞或巨噬细胞)，进行肿瘤的主动免疫治疗，其中树突状细胞可从患者的外周血单核细胞或CD34⁺造血干细胞扩增。

(3).体外感染自体皮肤成纤维细胞等载体细胞，借助于载体细胞将IL-12导入机体。

(4).作为佐剂与抗原一起注射，与DNA疫苗或其他疫苗(感染性疾病疫苗)联合碱性免疫接种，以增强免疫效果。

(5).通过瘤体内或感染部位直接注射IL-12重组腺病毒等体内途径直接导入体内，用于肿瘤、以及细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病的治疗。

(6)治疗成本低，比直接注射IL-12进行治疗低至少50％，较佳地可低至少80％。可有效地进行局部施用，从而大大降低了施用IL-12时的毒性。

(7)注射次数稍少，通常只需数周(如1-2周)注射一次，从而减少了进行注射治疗的痛苦，并便于使用。

(8)通过感染细胞而在细胞内较长时期地局部表达IL-12，与生理条件下生物体局部分泌IL-12的情况更为接近，从而可高效和长期地发挥IL-12的功效(尤其在需要局部施用IL-12的场合，如肿瘤治疗时)。

(9)Ad.IL12(35i40)型重组腺病毒表达的p35亚基比例超过p40亚基，从而有效地提高了施用IL-12的效果，防止了p40亚基的拮抗作用。

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，比如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.人IL-12的p35亚基cDNA和p40亚基cDNA的克隆

收集经PDBu(100nM，Sigma)刺激培养20小时的KB细胞(美国ATCC)，异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，AMV逆转录酶合成第一链，以其为模板分别进行p35和p40的PCR扩增。p40  5’引物：5’GCTCTAGACTGCC ATGTGTCACCAGCAGTTGGTC  (XbaI)

3’引物：5’CGGGATCCTAACTGCAGGGCACAGATGC  (BamHI)p355’引物：5’GGGGTACCTCTAGACTCAGCATGTGTC

           CAGCGCGCAGCCTC  (KpnI)

3’引物：  5’CGTCCGGATCCTTAGGAAGCATTCAGATAGCTC(Kpn2I)

p35和p40亚基的PCR产物的预计大小为676bp和1003bp。PCR反应体积为50μl，引物浓度为0.4μM，扩增参数为94℃1’、60℃1’、72℃2’，20个循环后产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析(电泳分析见图1)。PCR产物经酶切后，克隆至pBluescript II-SK(美国Stratagene公司)进行全自动测序，连接产物转化大肠杆菌DH5α(Stratagene公司)，阳性克隆经全自动测序(ABI373，PE公司)分析，结果表明克隆到的人IL-12两亚基p40和p35的cDNA与报道一致，包括完整的编码序列(WolfS，et al.1991，146：3074)。

实施例2.pCIcc载体的改建

为将人IL-12 cDNA置于CMV启动子的控制之下，选用了pCIcc载体。pCIcc载体系由真核表达载体pCI(Promega公司)改建而来。pCI载体含有CMV启动子/增强子和SV40 polyA，在CMV启动子与目的基因克隆位点之间含有β珠蛋白的内含子，有助于提高目的基因表达水平。在pCI载体的SV40 polyA下游有一个单一的ClaI位点，改建目的是在CMV启动子上游再产生一个新的ClaI位点，便于将表达单元克隆至腺病毒载体的ClaI位点。改建的过程为，将pCI载体进行BglII酶切、T4 DNA聚合酶(BioLab公司)补平后，用T4 DNA连接酶(BioLab公司)连接，这样就使原来的BglII位点失活，产生一个新的ClaI位点(图2)。连接产物转化大肠杆菌MC1061(美国ATCC公司)，筛选阳性重组子pCIcc。实施例3.35i40型p35和p40亚基cDNA的融合及人IL-12腺病毒载体的构建

在该实施例中，将p35和p40亚基cDNA加以融合，然后克隆至真核表达载体pCIcc，构建流程见图3。

pSK-p35经Kpn2I酶切后补平，再用KpnI酶切出的片段定向插入pCIcc的KpnI、SmaI位点，得到重组载体pCI-p35；IRES的BamHI和BstXI片段经补平后，与XbaI线性化后补平pSK-p40平端连接，得到重组载体pSK-IRES40，使IRES处于p40的上游；再从重组载体pSK-IRES40中切出含IRES-p40 cDNA的BamHI片段，经T4 DNA聚合酶补平后，与NotI线性化后补平的pCI-p35平端连接，得到重组载体pCI-35i40。融合基因p35-IRES-p40的序列见图4。pCI-35i40重组载体中，人IL-12的p35和p40亚基的cDNA由IRES连接，其转录受CMV启动子的控制，后接SV40 polyA信号肽序列，p35亚基和p40亚基的蛋白合成分别受帽子依赖性和非依赖性机制控制指导。

所采用的腺病毒载体pAx1cw购自日本Takara公司。pAx1cw系E1区替代的cosmid载体，携带E1区(mu 1.3-9.3)和E3区(mu 79.6-84.8)缺失的Ad5腺病毒基因组DNA，在缺失的E1区插入了ClaI-SwaI-ClaI-SalI-NruI连接子，其中含有SwaI和ClaI两个供外源基因插入的克隆位点(图5)。将含人IL-12表达盒(表达单元)的ClaI片段(3375bp)与经去磷酸化的pAx1cw载体ClaI大片段于14℃连接过夜，同时挑DH5a菌落于含0.2％麦芽糖的5ml LB培养基中，振荡过夜，离心收集菌体重悬于2.5ml TM缓冲液(10mM Tris·HCl(pH7.5)，10mM MgSO₄)中备用。12.5ml的连接反应液与噬菌体包装蛋白(Strategene公司)混合，室温孵育90分钟，加入100ml TM缓冲液。取DNA溶液和DH5a菌各50ml混合，室温孵育15分钟后，加入1ml氨苄阴性LB培养基，37℃振荡30分钟，取10～100ml涂布于Amp阳性LB平板，37℃过夜。挑取阳性转化子，碱裂法小量制备DNA，酶切分析阳性重组子，人IL-12重组腺病毒载体记为pAx1cw.CIh35i40。

用高浓度肉汤TB培养基500～1000ml大量扩增阳性克隆菌，碱裂法抽提粘粒DNA，溶于4ml TE中，加入44.4g CsCl(购自美国Gibco公司)、0.4ml溴化乙锭(10mg/ml)混合，置5ml离心管(Beckman)梯度离心(VTi65.1转头，55,000rpm，20℃，16h)，收集超螺旋条带，用等体积Butanol(Sigma)抽提4～6遍，4℃下用TE透析过夜，或直接加入3倍体积无菌去离子水、8倍体积无水乙醇，于4℃沉淀DNA(3～5小时)，干燥后DNA溶于无菌TE，用分光光度计检测其浓度和纯度。

实施例4.腺病毒DNA-TPC的制备

收集经E1和E3区缺失的Ad5腺病毒(序列早已公开)感染的293细胞(表达腺病毒E1A、E1B蛋白的人胚肾细胞株293细胞(ATCC CRL-1573))，超声破碎后，离心去除细胞碎片，病毒上清经CsCl梯度离心(25,000rpm，4℃，2h)，浓缩的病毒液进行第二次CsCl梯度离心(35,000rpm，4℃，3h)，收集病毒液，对含10％甘油的PBS缓冲液透析过夜。透析后的病毒液加入等体积8M盐酸胍(pH7.4)破碎病毒，经CsCl梯度离心(55,000rpm，20℃，16h)纯化Ad5 DNA，所纯化的Ad5 DNA末端带有共价结合的末端肽，经EcoT22I(购自Biolab公司)酶切后分装备用。

实施例5.COS-TPC共转染

pAx1cw.CIh35i40与Ad5 DNA-TPC经磷酸钙DNA共沉淀法共转染293细胞，经同源重组产生人IL-12重组腺病毒(图6)。转染前一天，待转染的293细胞更换新鲜培养基。于500μl体积中将40μg pAx1cw.CIh35i40与0.5μg Ad5 DNA-TPC、CaCl₂(终浓度为0.25M)混合后，加入500μl的2×BBS缓冲液(50mM BES(N，N-bis(2-hydroxyethl)-2-aminoethane-sulfonic acid)，280mM NaCl，1.5mMNa₂HPO₄(pH6.95))，混合后置室温作用10～20分钟，逐滴加入293细胞，置37℃、5％CO₂培养1 2～24小时。将共转染的293细胞与未经转染的293细胞按1∶1、1∶10和1∶100等不同比例混合，分别接种至96孔培养板(100μl/孔)，此后的第4天和第8天各补加DMEM培养基(50μl/孔)。于共转染后的第12～14天，从3块96孔板的共转染细胞克隆中陆续得到246个细胞病变死亡的克隆；收集阳性克隆孔的细胞及其培养液，超声破碎后的病毒上清为第一代种子病毒(1st seed)，于-80℃保存。

第一代种子病毒用病毒上清(10μl/孔)感染24孔培养板中的293细胞，每个克隆设2个复孔；3～4天收集一个复孔的细胞行细胞基因组DNA的酶切分析，对其中7个克隆进行了酶切鉴定，全部为阳性重组克隆(图7)。另一复孔中的细胞经超声破碎后收集病毒上清，为第二代种子病毒(2nd seed)，留作扩增用。

实施例6.人IL-12重组腺病毒Ad.IL12(35i40)的制备、扩增与滴度检测

酶切鉴定正确的重组克隆的第二代种子病毒上清(2nd seed)，用于感染293细胞扩增病毒，3～4天后，超声破碎细胞，离心去除细胞碎片，病毒上清经CsCl梯度离心(25,000rpm，4℃，2h)，浓缩的病毒液进行第二次CsCl梯度离心(35,000rpm，4℃，3h)纯化，最后将收集病毒液对含10％甘油的PBS缓冲液透析过夜，过滤除菌后分装，速冻保存于-80℃。

以293细胞为靶细胞、用微量细胞病变法检测病毒滴度。96孔板中先加入50ml培养液/孔，前8孔加入25ml经10⁴稀释的病毒液，开始行3倍的倍比稀释，共11个稀释度，每一稀释度设8复孔，每孔加50μl 293细胞，FCS的终度为5％，同时设细胞对照，此后第4天和第8天分别补加50μl含10％FCS的DMEM培养基，12～14天后判定结果。对其中的一个阳性克隆进行扩增，所制备的人IL-12重组腺病毒，记为Ad.IL12(35i40)，滴度为8.3×10¹⁰pfu/ml。收获后的重组腺病毒用注射用水稀释、分装成5×10¹⁰pfu/ml，保存于-80℃。

该腺病毒被命名为“表达人白细胞介素12的重组5型腺病毒Ad-hIL-12”，1998年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国，武汉，保藏编号为CCTCC No.V98006。

实施例7.人IL-12重组腺病毒Ad.IL12(40i35)的构建

重复实施例3-6的程序，不同点在于：在IL-12表达盒中，p40亚基位于IRES序列之前，而p35亚基位于IRES序列之后。从而制得人IL-12重组腺病毒Ad.IL12(40i35)。

实施例8.人IL-12重组腺病毒Ad.IL12(35i40)的体外表达

对数生长期的肝癌细胞HepG2(购自美国ATCC公司)或人皮肝成纤维细胞弃培养液后，按100∶1的重复感染度(Multiplicity of Infection，MOI)加入人IL-12的重组腺病毒，1小时后加入培养液，培养48小时后，收集培养上清。在检测人IL-12重组腺病毒Ad.IL12(35i40)的体外表达的同时，设人IL-12重组腺病毒Ad.IL12(40i35)作为对照。

人IL-12的免疫学检测按人IL-12 p70亚基的ELISA试剂盒(R&D)说明进行，检测敏感度＜10pg/ml。野生型及转染LacZ基因的293细胞和HepG2细胞不分泌人IL-12，而感染人IL-12腺病毒后分别不同程度地表达人IL-12，其中Ad.IL12(35i40)重组腺病毒表达水平显著高于Ad.IL12(40i35)重组腺病毒(表1)。

人IL-12的生物学检测采用PHA刺激的人PMNC增殖法。健康人PMNC经PHA(10μg/ml，美国Sigma公司)刺激72小时后，按2×104/孔加入96孔培养板，上述细胞培养上清行倍比稀释后与PHA刺激的人PMNC培养48小时后，加入1μCi/ml 3H-TdR(Amersham公司)，继续培养过夜后收集细胞检测cpm，收集上清用人IFN-γ的ELISA试剂盒(美国R&D公司)检测IFN-γ含量。结果表明，经ELISA检测，野生型及转染LacZ基因的293细胞和HepG2细胞培养上清不能刺激PHA刺激的人淋巴母细胞增殖和产生IFN-γ，而感染人IL-12腺病毒后293细胞和HepG2细胞的培养上清能刺激PHA刺激的人淋巴母细胞增殖和产生IFN-γ(表2)，而且Ad.IL12(35i40)重组腺病毒感染的细胞培养上清比Ad.IL12(40i35)更有效地刺激PHA刺激的人淋巴母细胞增殖和产生IFN-γ。这证明本发明的人IL-12重组腺病毒体外能有效表达具有生物学活性的人IL-12，更为重要的是，所制备的Ad.IL12(35i40)重组腺病毒体外能比Ad.IL12(40i35)更有效地表达IL-12，表明其具有更大的临床应用价值。

       表1.腺病毒载体介导表达的人IL-12体外表达

细胞培养上清	人IL-12含量(ng/106细胞/24小时)
		293细胞上清	未检测出
AdLacZ-293上清	未检测出
		Ad.IL12(40i35)-293上清	58.3
Ad.IL12(35i40)-293上清	149.3*
		HepG2肝癌细胞上清	未检测出
AdLacZ-HepG2上清	未检测出
		Ad.IL12(40i35)-HepG2上清	36.8
Ad.IL12(35i40)-HepG2上清	129.5*

^*.和相应Ad.IL12(40i35)对照组比较，p＜0.01

表2.腺病毒载体介导表达的人IL-12刺激淋巴细胞增殖及IFN-γ产生

	3H-TdR掺入(cpm)                      IFN-γ水平(pg/ml)
			PBS对照	2028±234	＜3.0
人IL-12对照(2ng/ml)	26735±2043*	234.8±18.6
			AdLacZ-293上清	2156±198	＜3.0
Ad.IL12(40i35)-293上清(1∶10)	30984±2870	364.8±10.6
			Ad.IL12(35i40)-293上清(1∶10)	45658±3243*	614.2±19.3*
AdLacZ-HepG2上清	1865±202	＜3.0
			Ad.IL12(40i35)-HepG2上清(1∶10)	33884±2976	378.5±12.5
Ad.IL12(35i40)-HepG2上清(1∶10)	53745±3061*	697.1±13.4*

^*.和相应Ad.IL12(40i35)对照组比较，p＜0.01

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种表达人白细胞介素12的重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP，并且在E1区位置插入了人白细胞介素12表达盒，该表达盒依次包括：启动子序列，人白细胞介素12的p35和p40亚基编码序列和聚腺苷酸化信号序列。

2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，该IL-12表达盒中还含有内部核糖体结合位点IRES，而且p35亚基编码序列位于IRES之前，而p40亚基编码序列位于IRES之后。

3.如权利要求1或2所述重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒为Ad5型腺病毒。

4.如权利要求1或2所述的重组腺病毒，其特征在于，人白细胞介素12表达盒中所含的启动子序列选自：巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子。

5.如权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒是表达人白细胞介素12的重组5型腺病毒Ad-hIL-12，CCTCC No.V98006。

6.一种药物组合物，其特征在于，它包括有效量的权利要求1所述的表达人白细胞介素12的重组腺病毒和药学上可接受的载体或赋形剂。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该重组腺病毒为Ad5型腺病毒，且该IL-12表达盒中还含有内部核糖体结合位点IRES，而且p35亚基编码序列位于IRES之前，而p40亚基编码序列位于IRES之后。

8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该腺病毒是表达人白细胞介素12的重组5型腺病毒Ad-hIL-12，CCTCC No.V98006。

9.一种制备表达人白细胞介素12的重组腺病毒的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)提供腺病毒DNA-TP复合物，在该腺病毒DNA基因组缺失E1区和E3区，并且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP；

(b)提供含腺病毒基因组的粘粒载体，在该粘粒载体中的腺病毒基因组缺失了E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人白细胞介素12表达盒，其中该表达盒依次包括：启动子序列，人白细胞介素12的p35和p40亚基编码序列，和聚腺苷酸化信号序列；

(c)将步骤(a)中的腺病毒DNA-TP复合物和步骤(b)中的粘粒载体共转染表达E1区基因的宿主细胞；

(d)筛选阳性克隆；

(e)从阳性克隆中分离纯化重组腺病毒。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中共转染方法是磷酸钙DNA共沉淀转染法，该宿主细胞是293细胞，而且人白细胞介素12表达盒中所含的启动子序列选自：巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子，且该IL-12表达盒中还含有内部核糖体结合位点IRES，而且p35亚基编码序列位于IRES之前，而p40亚基编码序列位于IRES之后。

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