CN100415876C - 艾滋病重组腺病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种共表达HSP65-HIV多表位基因和人IL-15基因的重组基因疫苗AdHIV-Vac，该疫苗的制备方法、相关用途和含有该疫苗的药物组合物。将这种新的重组基因疫苗用于临床，具有成本低、使用方便、效率高等优点，尤其适用于艾滋病的预防接种和免疫治疗。

Description

艾滋病重组腺病毒疫苗

技术领域

本发明涉及基因治疗领域。更具体地，本发明涉及一种新的共表达HSP65-HIV表位肽融合基因和细胞因子(人白细胞介素15)基因的重组腺病毒，该重组腺病毒的制备方法和用途，以及含有该重组腺病毒的药物组合物。

背景技术

自1981年首次发现艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)以来，其传播已遍及全球。目前，全球AIDS病毒感染者累计已经达到4700万人，造成近1400万人死亡。AIDS的传播和蔓延对人类健康、社会生活和生产带来严重影响，已成为人类面临的最严重的社会问题之一。我国的AIDS预防与控制正处于关键时期，AIDS病毒感染者总数已近100万人，并且已进入感染人数的增长期，年增长幅度高于30％，流行形势十分严峻。

经过十多年的研究，人们对由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus，HIV)及其感染引起的AIDS已有较清楚的了解。随着对HIV认识的深入，HIV感染的防治方面也有了一定突破。目前对AIDS的治疗包括化学治疗、免疫治疗、基因治疗及HIV疫苗等措施。自1996年广泛应用高效抗逆转录病毒治疗(HAART)以来，HIV感染的疗效得到了显著提高，AIDS的发病率与死亡率也随之降低。伴随HIV感染者治疗情况的改善及预防性治疗(主要是HAART)的有效应用，患者的CD4+T细胞亚群明显升高，从而提高了免疫功能，使机会性感染的发病率显著降低。尽管HAART疗法能使多数病人体内的病毒血症得以控制，但也存在药物毒性高、耐药、费用昂贵等问题。针对HAART的上述缺陷设计的新的治疗策略间歇性结构疗法(STIs)仍存在耐药性和休眠HIV存在的棘手问题。在此背景下，AIDS的免疫疗法引起了人们的关注。

疫苗的研制是AIDS免疫治疗和预防的重点。早期人们认为HIV的防治可能与其它病毒感染相似，只需要通过疫苗接种产生针对HIV的中和抗体就可以了。由于HIV的包膜糖蛋白gp120在HIV感染中介导病毒和细胞受体的结合，并使病毒核心进入宿主细胞内，因此人们投入了大量精力研制基于HIV gp120抗原的疫苗、期望能通过疫苗接种产生能阻止HIV侵入细胞的中和抗体，但由于HIV包膜抗原变异迅速，因此至今这种努力也未能完全成功。由于诱导抗HIV的抗体反应可在健康人群中建立预防HIV感染的第一道防线，因此继续努力研制基于HIV蛋白抗原的预防性疫苗仍具有重要价值。

尽管遭遇挫折，但一些来自HIV感染个体的现象使人们坚信HIV免疫治疗是大有希望的。因为有相当部分的高危个体多次接触HIV并不被感染，一部分HIV感染者并不发展为AIDS。临床上观察到长期非进行性(LTNP)的HIV感染者与感染后病情很快恶化的HIV感染者相比，前者体内很好地建立起了HIV特异性的CD4+和CD8+T细胞免疫反应。Clerici等对无症状的HIV感染者的跟踪观察表明，持续保持以Th1应答占优势的个体不发展为AIDS，而那些进展为AIDS的个体，其针对HIV特异性的Th1型应答逐渐减弱，而Th2型应答逐渐增强。由此，目前认为，Th1向Th2转换是AIDS发生的关键步骤。

基于上述思路，世界范围内已进行过多种特异性AIDS疫苗的预防和治疗实验。这些疫苗所用到的抗原遍及HIV各种结构和功能蛋白，其中用得最多的是gag，gp120，nef等表壳和包膜蛋白，使用的形式从直接蛋白到基因载体包括质粒DNA、腺病毒、金丝雀病毒等。2003年由VaxGen公司完成的III期临床试验使用了表达HIV-1BE亚型gp120蛋白的DNA疫苗，遗憾的是其治疗和保护效果令人失望；此外尚有多家公司(包括著名制药巨头Merck、Roche等)的AIDS疫苗仍在进行临床I-III期临床试验，就目前已经公布的部分前期结果看来，尽管有一些疫苗能诱导产生HIV特异性的CD4+、CD8+T细胞应答，控制病毒复制，降低病毒荷载，但其有效率仍不高，且试验后期出现HIV的免疫逃逸，导致疫苗诱导的HIV特异的免疫保护和对抗失效。为进一步提高疫苗的疗效，AIDS疫苗的研制应强调新型佐剂的应用、DNA疫苗和其它形式的病毒载体疫苗的联合应用以及设法促进HIV特异性T细胞的增殖、功能和记忆性。

AIDS疫苗的研制和应用实践表明，在人体内诱导针对HIV的有效免疫保护反应方面，以腺病毒为载体的疫苗效果较好，而裸DNA免疫尽管在小鼠模型中表现良好，但在灵长类动物和人体内效果较差。腺病毒基因疫苗常用的载体是缺失E1区和E3区的重组Ad5型腺病毒，能高效感染人体细胞，且在细胞内不会复制。国内外已有多种基于Ad5型腺病毒载体的药物进行了针对肿瘤、遗传性疾病和传染病(包括HIV感染)的临床试验，这些临床试验结果表明，Ad5型腺病毒载体是最安全的基因治疗载体之一。

综上所述，本领域迫切需要开发有效预防HIV的免疫原和免疫制剂。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可作为HIV免疫原的融合蛋白，它含有HSP65和HIV多表位肽。

本发明的另一目的是提供含有该融合蛋白基因的重组腺病毒，以及含有该腺病毒的药物组合物。

在本发明的第一方面，提供了一种共表达HSP65-HIV表位融合蛋白和白细胞介素15的重组腺病毒，该腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，并且在E1区位置插入了HSP65-HIV表位融合蛋白基因和人白细胞介素15基因表达盒，该表达盒依次包括：启动子序列、HSP65-HIV表位融合蛋白的编码序列、以及人白细胞介素15编码序列和多聚腺苷酸化信号序列，其中所述的HSP65-HIV表位融合蛋白含有HSP65和3-20个长度为7-15个氨基酸的HIV表位。

在另一优选例中，HSP65-HIV表位融合蛋白的基因和白细胞介素15表达盒中还含有内部核糖体结合位点IRES，而且HSP65-HIV表位融合蛋白基因位于IRES之前，而白细胞介素15编码序列位于IRES之后。

在另一优选例中，该腺病毒为Ad5型腺病毒，且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP。

在另一优选例中，HSP65-HIV表位融合蛋白的基因和白细胞介素15表达盒中所含的启动子序列选自：巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子。

在另一优选例中，所述的HIV表位是HLA-A2限制性的T细胞表位，选自下组：

Gp160    SLLNATDIAV    SEQ ID NO：1；

Gp160    RGPGRAFVTI    SEQ ID NO：2；

Gp41     RIRQGLERA     SEQ ID NO：3；

P24      YVDRFYKTL     SEQ ID NO：4；

P17      SLYNTVATL     SEQ ID NO：5；

Nef      PLTFGWCYKL    SEQ ID NO：6；

Nef    VLEWRFDSRL   SEQ ID NO：7；

Vpr    AIIRILQQL    SEQ ID NO：8；

P1     FLGKIWPSWK   SEQ ID NO：9；

RT     ALVEICTEM    SEQ ID NO：10；

RT     VIYQYMDDL    SEQ ID NO：11；

RT     ILKEPVHGH    SEQ ID NO：ID NO：12。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它包括有效量的权利要求1所述的共表达HSP65-HIV表位融合蛋白和白细胞介素15的重组腺病毒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明的第三方面，提供了一种制备共表达HSP65-HIV表位融合蛋白的基因和人细胞因子基因的重组腺病毒的方法，该方法包括：

(a)提供腺病毒DNA-TP复合物，在该腺病毒DNA基因组缺失E1区和E3区，并且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP；

(b)提供含腺病毒基因组的粘粒载体，在该粘粒载体中的腺病毒基因组缺失了E1区和E3区，并且在E1区位置插入了HSP65-HIV表位融合蛋白的基因和人细胞因子基因表达盒，其中该表达盒依次包括：启动子序列、HSP65-HIV表位融合蛋白的编码序列、以及人白细胞介素15编码序列和多聚腺苷酸化信号序列，其中所述的HSP65-HIV表位融合蛋白含有HSP65和3-20个长度为7-15个氨基酸的HIV表位；

(c)将步骤(a)中的腺病毒DNA-TP复合物和步骤(b)中的粘粒载体共转染表达E1区基因的宿主细胞；

(d)筛选阳性克隆；

(e)从阳性克隆中分离纯化重组腺病毒。

在另一优选例中，在步骤(c)中共转染方法是磷酸钙DNA共沉淀转染法，该宿主细胞是293细胞。

在本发明的第四方面，提供了一种融合蛋白，它含有HSP65的氨基酸序列和3-20个长度为7-15个氨基酸的HIV表位的氨基酸序列，以及位于上述氨基酸序列之间的连接肽。

较佳地，所述的融合蛋白含有5-15个，更佳地含有8-15个，更佳地10-12个HIV表位。更佳地，HSP65的氨基酸序列如SEQ ID NO：16中第1-539位。

在另一优选例中，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO：16所示。

在本发明的第五方面，提供了一种多核苷酸，编码本发明上述的的HSP65-HIV表位融合蛋白。还提供了相应的表达载体和宿主细胞。

附图说明

图1AdHIV-Vac感染细胞表达HSP65的Western blot检测。各泳道如下：1：HSP65标准品；2：Ad-LacZ感染的HepG2细胞；3：AdHIV-Vac感染的HepG2细胞；4：Ad-LacZ感染的成纤维细胞；3：AdHIV-Vac感染的成纤维细胞。

图2显示了本发明的重组腺病毒AdHIV-Vac免疫小鼠血清中IL-15的ELISA测定结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，开发了一种基于重组缺陷型双表达腺病毒载体的新型AIDS疫苗AdHIV-Vac，该疫苗使用结核分枝杆菌的热休克蛋白HSP65作为分子佐剂，腺病毒的第一个表达框表达重构的HIV-1多表位肽与HSP65的融合蛋白，第二个表达框表达人IL-15。小鼠模型证明了该新型AIDS疫苗确能诱导产生所设计的HIV-1多种表位特异性的CTL和IL-15。

在本发明中，术语“HSP65-HIV表位融合蛋白和人白细胞介素表达盒”指含有以下元件的表达盒：HSP65-HIV表位融合蛋白和人白细胞介素(如白细胞介素15)编码序列以及表达所需元件的序列组件，表达所需的组件包括启动子和聚腺苷酸化信号序列。此外，该表达盒还可以含有或不含有其他序列，其中包括但并不限于：增强子、分泌信号肽序列等。一种优选的表达盒含有IL-12信号肽。

可以适用于HSP65-HIV表位融合蛋白和白细胞介素-15表达盒的启动子可以是任何一种常见的启动子，它可以是组成型启动子或诱导型启动子。较佳地，该启动子是组成型的强启动子，例如巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子等其它适用于真核表达的启动子。

HSP65-HIV表位融合蛋白

新型AIDS疫苗AdHIV-Vac所表达的HIV抗原为一种重构多表位肽。由于应用HIV蛋白抗原作为免疫刺激原的疫苗均未能取得理想的防治效果，研究结果则可能是HIV蛋白中不是表位的周围序列可能对诱导产生有效的CTL应答起妨碍作用，因此宜直接以表位或组合表位作为疫苗的抗原。部分学者的前期探索表明，将编码HIV表位的基因插入疫苗载体中，直接用基因疫苗免疫确实能有效诱导产生相应表位特异性的CTL。

热休克蛋白

可适用于本发明的热休克蛋白没有特别限制，可以各种来源(如人、哺乳动物、或细菌)的热休克蛋白，例如HSP65、HSP70等。优选HSP65。

HSP65是免疫学领域已研究明确、具有强的佐剂效应、并已应用于临床试验的分子佐剂。研究表明，HSP65能以HSP65-抗原表位肽复合物的方式，通过抗原递呈细胞(APC)尤其是树突状细胞(DC)上的CD91受体介导内吞，将外源的抗原表位肽递呈到MHC-I类分子，有效地诱导抗原特异性CTL的产生。抗原表位肽可以直接与HSP65共价交联、也可以包含于HSP65-抗原片断的融合蛋白之中随后被APC加工成表位递呈。此外，HSP65还能作用于DC，促进DC成熟、诱导DC分泌IL-12等前炎性细胞因子和趋化因子RANTES，MIP-1a，MIP-1b，多方面增强Th1型免疫应答。作为新型分子佐剂，HSP65具有高效、表位特异性和Th1类免疫应答偏向的特点。以HSP65-抗原融合蛋白、HSP65-抗原肽复合物形式的抗肿瘤、抗感染疫苗已进入临床验证阶段，并取得了初步的令人鼓舞的效果。Stressgen公司以HSP65为佐剂的HSPE7融合蛋白疫苗，在治疗复发性呼吸道乳头瘤(RRP)的I、II期临床试验中显示了显著的治疗效果和良好的安全性，治疗的总有效率达78.6％，目前已经FDA批准进入III期临床试验。

HIV表位肽

新型AIDS疫苗AdHIV-Vac中设计的重构多表位肽是优选目前报道的从HIV感染个体中发现的能有效诱导产生抗HIV CTL的12个最佳T细胞表位(均为HLA-A2限制性)，这些表位分别选自于HIV-1的RT、gp160、P17、gp41、Nef、P24、Vpr和P1(表1)。这种来自HIV-1多种不同结构和功能蛋白的多表位组合，可望能够同时诱导针对HIV-1的多种表位特异性CTL，从而增强抗HIV的免疫应答，减少HIV逃避免疫攻击的机会。优选的表位均为HLA-A2限制型的表位，因此该疫苗将优先应用于该型HLA表型的人群。HLA-A2表型在中国人群中的分布比例最大，约50％，因此这样设计可使该疫苗适用于更多的人群。

在融合蛋白中所包含的HIV表位数目，通常为3-20个，较佳地为5-15个，更佳地为8-15，最佳地为10-12个。其中各表位的排列次序没有限制。

此外，考虑到临床前的恒河猴体内药效学试验，还可在组合表位肽段包括了一部分HIV-1氨基酸序列上最佳表位周围的数个残基，以便使设计的抗原肽段内含有恒河猴Mamu-A可结合的表位。

在融合蛋白中，HSP65序列和HIV表位序列的连接方式及前后次序没有特别限制，例如头尾相连、头头相连、或尾尾相连。

如本文所用，术语“连接氨基酸”或“连接肽”(linker)指位于HSP65序列和HIV表位序列之间，以及各表位之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度没有特别限制，通常为0-10个。连接肽的长度也可为0，此时HSP65序列和HIV表位的氨基酸序列，或两个表位的氨基酸序列直接相连。通常，连接肽不影响或不显著影响HSP65和各表位的氨基酸序列形成正确的折叠和空间构象。一些连接肽的例子包括(但并不限于)：

(a)疏水性氨基酸Ala、Gly和Pro构成的3-10个氨基酸序列，例如Gly-Ala-Ala-Ala-Gly、Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro。

(b)多克隆位点所编码的氨基酸序列。该序列通常为5-10个氨基酸。

(d)由(a)和(b)组合形成的氨基酸序列。

编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得HSP65和HIV表位的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。

在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是酵母细胞。

在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。然后再分离出表达的融合蛋白。

另一方面，本发明还包括对HSP65-HIV表位融合蛋白具有特异性的抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于HSP65-HIV表位融合蛋白中的HIV表位。

白细胞介素15

IL-15是较新发现的一种新型细胞因子，在刺激T细胞和NK细胞方面具有与IL-2相似的生物学功能。IL-15的cDNA克隆已有猴、鼠和人细胞来源。人的IL-15与猴和鼠的IL-15大约分别有97％和73％的序列同源性。人和猴的IL-15对鼠细胞都有活性。

人IL-15cDNA编码162AA残基的前体蛋白，其中包含一个48AA残基的信号肽，当信号肽被剪切后可得到含114AA残基的成熟蛋白。另一替换的剪切方法有相同的成熟序列，但只有更短的一个信号肽。短信号肽的IL-15前体不分泌，表现为细胞内分子。

IL-15表达于多种不同的细胞和组织，包括外周血单核细胞树突状细胞，成纤维细胞和上皮细胞。然而，在已活化的大量表达IL-2的外周血T淋巴细胞，检测不到IL-15的表达。

T、B和NK细胞和非淋巴细胞表面均有IL-15的受体。IL-15受体包括α、β、γ三个亚基。α链长237aa，与IL-15高亲和，不直接参与向细胞内传导信号。βγ亚基是IL-15R与IL-2R共同的与信号转导有关的两个亚基。

因此，IL-15与IL-2相似，能通过诱导树突状细胞、NK细胞、T细胞、B细胞活化、增殖和分泌细胞因子促进机体产生较强的T细胞免疫反应。

IL-15是NK细胞分化成熟需要的重要细胞因子，能强烈促进NK细胞从NK前提细胞发育和形成。尽管IL-15与IL-12相似，但实验表明在人和小鼠体内缺乏IL-2时，并不伴随NK细胞的缺乏，但IL-15的缺乏，会导致严重的NK降低。

最近的研究表明，IL-15在促进和维持CD8+的记忆性T细胞功能方面具有重要的作用。尤其是最新报道的一些研究结果揭示，IL-15对于维持HIV感染者体内的HIV特异性的T细胞应答和免疫记忆性方面，具有独特的作用，而一部分HIV感染者的病情恶化常伴随者HIV特异性的T细胞应答的减弱。因此，不少AIDS防治专家认为，IL-15的增强细胞免疫的作用和增强细胞免疫记忆的作用，很有可能为HIV的免疫防治开辟出一条充满希望的新途径。

新型AIDS疫苗AdHIV-Vac运用HSP65作为分子佐剂与HIV-1多表位肽融合表达，表达的融合蛋白能通过HSP65与APC的作用，将HIV-1多表位肽带入APC，经APC内的抗原加工途径降解修饰形成相应的T细胞表位，从而被递呈到MHC-I分子的沟槽中，诱导产生HIV-1特异性的CTL；同时，HSP65与DC作用能增强DC的功能，诱导产生的趋化因子RANTES，MIP-1a，MIP-1b是CCR5的配体，已有研究表明这些趋化因子可抑制HIV病毒进入表达CCR5的T细胞和单核细胞。因此该疫苗还可从阻止HIV-1进入细胞的角度对抗HIV的感染，从而有利于提高对AIDS的疗效。

腺病毒载体的构建

目前的腺病毒载体大多来源于腺病毒Ad2和Ad5这两种血清型。适用于基因治疗应用的腺病毒载体属于复制缺陷型病毒。由于E1编码的蛋白功能是其他所有腺病毒基因有效表达所必须的，因此最常见的策略就是用外源DNA替代病毒E1区序列，通过包装细胞反式提供E1区序列而产生的复制缺陷腺病毒载体。

可用于本发明的宿主包装细胞是可以表达腺病毒E1区基因的任何宿主细胞，因为该细胞能够提供复制缺陷型腺病毒复制所需的E1区基因表达产物。一种优选的常用包装细胞是293细胞，该细胞由人胚肾细胞经Ad5腺病毒DNA片段转化而成，载有整合入细胞基因组的腺病毒E1区等病毒基因片段，并持续表达E1区蛋白，能为E1区置换型腺病毒载体提供反式补偿。

利用E3区缺失不影响病毒感染性，切去E3区可增加载体外源性DNA容量。切去E1和E3区，外源基因插入容量可达约8kb。而克隆更大的外源DNA片段则需切去其他的病毒序列，缺失的功能再通过互补细胞系或辅助病毒反式提供。

本发明的重组腺病毒的方法可以用多种常规方法产生，例如(1).细胞外病毒DNA直接连接法(也称Stow方法)；(2).细胞内病毒DNA同源性重组；(3).细胞内质粒DNA同源重组；和(4).COS/TPC共转染同源重组。

优选方法是更佳地是用COS/TPC共转染同源重组法产生的。腺病毒DNA的两端各共价结合有一个55kDa的末端肽(Terminal peptide，TP)，结合有末端肽的腺病毒DNA导入允许细胞后产生的空斑数是裸腺病毒DNA的100倍以上(Horwitz M.Fundamental Virolgy，2nd edition，edited by Fields B et al.Raven Press，Ltd.New York，1991；771)，表明TP的存在对腺病毒DNA的感染能力有着重要的影响。传统的重组腺病毒制备方法中常用蛋白酶将腺病毒DNA的末端肽切除，Miyake等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996，93：1320)首先采用含有TP的腺病毒DNA-TP复合物(TPC)进行同源重组，建立了COS/TPC同源重组法制备重组腺病毒，并且证明该法的重组效率可提高近百倍，而且几乎不产生亲代病毒。在该方法中，首先构建了一种含Ad5基因组(其E1或E4区含克隆位点)的E1区替代型粘粒(粘粒)载体，将含外源基因的表达单元(expressioncassette)克隆入粘粒腺病毒基因组。然后将其与腺病毒DNA-TP复合物共转染293细胞，其中腺病毒DNA-TPC事先用限制性内切酶消化以减少其感染性，在粘粒和腺病毒DNA重叠序列间进行同源重组而产生重组腺病毒。用EcoT 22I消化DNA-TPC(E3区缺失的腺病毒DNA有7个EcoT22I位点)时，重组发生在最右侧EcoT22I以右的腺病毒DNA和粘粒载体中的同源部分，同源长度达23.2kb，而传统的细胞内质粒DNA同源重组方案是同腺病毒DNA中XhoI酶切后的左末端重组，同源长度仅2.2kb，可发生重组的同源片段长度的增加无疑提高了重组效率。

在制得本发明的重组腺病毒之后，就可以将所需纯度的重组腺病毒与任选的生理上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂(Remington’s PharmaceuticalSciences，16版，Osol，A.，Ed.，[1980])，以冻干形式或水溶液形式进行混合，可以制得本发明的重组腺病毒的治疗制剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者而言在所用的剂量和浓度下应是无毒的，并且可含有缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸缓冲液；抗氧化剂如维生素C；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。作为最常见的例子，水和生理盐水就可作为本发明重组腺病毒制剂中的载体。

含本发明的新型重组腺病毒的药物组合物(制剂)可以用常规方式施用于需要治疗的个体，这些方式包括(但并不限于)：肌内注射、皮下注射、静脉注射等。

本发明的AIDS疫苗AdHIV-Vac主要具有四个方面的特色和创新点：

1.抗原选择使用了来自HIV-1多种不同结构和功能蛋白的多个最佳表位组合，并连接成多表位肽；可以诱导针对HIV-1的多种表位特异性的CTL，从而增强抗HIV的免疫应答，减少HIV逃避免疫攻击的机会。

2.使用的分子佐剂HSP65，具有辅助产生抗原表位特异性CTL的能力，同时还能诱导DC产生HIV侵入免疫细胞的强抑制剂RANTES，MIP-1a，MIP-1b，故新型AIDS疫苗AdHIV-Vac能诱导机体从杀伤HIV感染细胞和阻止HIV进入细胞双方面对抗HIV的感染，从而有利于提高对AIDS的疗效。

3.IL-15是NK细胞分化成熟需要的重要细胞因子，能强烈促进NK细胞从NK前提细胞发育和形成。

4.采用双表达重组缺陷型Ad5型腺病毒作为载体，同时表达佐剂-多表位融合蛋白和IL-15，使该疫苗具有临床应用上的有效性和良好安全性，而且保存运输稳定、应用方便。

研制新型AIDS疫苗AdHIV-Vac的目的是对HIV-1感染个体(尤其是HLA-A2阳性的感染个体)进行免疫干预，以诱导免疫系统杀灭感染者体内的HIV-1病毒或抑制HIV-1病毒的复制，目的是使接种疫苗的HIV感染个体成为无症状或LTNP的HIV感染者，甚至清除病毒完全康复。因此新型AIDS疫苗AdHIV-Vac适用人群广泛，具有重大的经济和社会价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.分泌型人IL-15基因的获得

收集人外周血白细胞，异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，AMV逆转录酶合成第一链，以其为模板分别进行PCR扩增含N端10个ATG的野生型人IL-15cDNA序列：

野生型人IL-15引物：

上游引物5’CAG CCA GGA CTC GAT GGA GAA TCC 3’(SEQ ID NO：17)

下游引物5’G ATC GGA TCC TGT CTA AGC AGC AGA GTG ATG 3’(SEQ IDNO：18)

PCR反应体积为50μl，引物浓度为0.4μM，扩增参数为94℃30秒、51℃45秒、72℃50秒，30个循环后产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。野生型人IL-15的PCR产物的大小约为790bp，PCR产物直接克隆至pMD18T(Takara)载体，进行全自动测序，连接产物转化大肠杆菌DH5α(Stratagene公司)，阳性克隆经全自动测序(ABI373，PE公司)分析，结果表明克隆到的人野生型人IL-15的cDNA与报道一致，包括完整的编码序列。

以如上获得的野生型人IL-15cDNA序列为模板，进行PCR扩增编码人成熟IL-15蛋白的cDNA序列，所用引物为：

扩增人成熟IL-15蛋白编码cDNA序列引物：

上游引物5’CG AAG CTT AAC TGG GTG AAT GTA ATA AGT GAT 3’(SEQ IDNO：19)

下游引物5’GA GGA TCC TCA AGA AGT GTT GAT GAA CAT TTG G 3’(SEQ IDNO：20)

PCR反应体积为50μl，引物浓度为0.4μM，扩增参数为94℃30秒、56℃30秒、72℃40秒，30个循环后产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。人成熟IL-15的PCR产物的大小为362bp，PCR产物经EcoRI单酶切，与人IL-2信号肽编码序列(从Nanogen公司的商业化载体p2SB/myc-his上通过XhoI/EcoRI双酶切得到)连接，连接产物直接克隆至pMD18T(Takara)载体。经测序证实，IL-2信号肽和IL-15编码序列正确连接、序列正确的质粒克隆pTS2IL15。IL-15的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：25和26所示。

实施例2.HIV-1多表位肽编码基因的合成

为设计HIV-1的多表位组合，优选十二个在HIV-1感染个体中能产生有效对抗HIV-1病毒感染的特异性CTL应答的最佳表位。这些CTL表位均具HLA-A2限制性，序列详见表1。设计的多表位肽组合为按表中所示顺序，用相应侧翼序列和连接氨基酸(GAAAG)连接而成，共有181个氨基酸组成。根据181个氨基酸序列合成相应多表位肽的编码基因序列，共长543bp(SEQ ID NO：13)。

knsavSLLNA TDIAVgaaag RGPGRAFVTI gaaagRIRQG LERAgaaagY    50

VDRFYKTLga aagSLYNTVA TLgaaagPLT FGWCYKLgaa agVLEWRFDS    100

RLgaaagAII RILQQLgaaa gFLGKIWPSW KgaaagALVE ICTEMgaaag    150

VIYQYMDDLg aaagILKEPV HGHyydpskd l                        181

(SEQ ID NO：14)

其中大写字母为表位序列(详见表1)；小写字母表示相应的侧翼序列和表位间的连接氨基酸(即连接肽)。

表1多表位肽中所包含的HIV-1的多个表位及所在位置序列

     表位名称          序列          SEQ ID NO：

1    Gp160(813-822)    SLLNATDIAV    1

2    Gp160(311-320)    RGPGRAFVTI    2

3    Gp41(335-343)     RIRQGLERA     3

4    P24(164-172)      YVDRFYKTL     4

5    P17(77-85)        SLYNTVATL     5

6    Nef(136-145)      PLTFGWCYKL    6

7    Nef(180-189)      VLEWRFDSRL    7

8    Vpr(59-67)        AIIRILQQL     8

9    P1(1-10)          FLGKIWPSWK    9

10   RT(33-41)         ALVEICTEM     10

11   RT(179-187)       VIYQYMDDL     11

12   RT(309-317)       ILKEPVHGH     12

注：设计的多表位肽即按表中从上到下顺序连接。

实施例3.HSP65与HIV-1多表位肽融合蛋白编码基因的获得

牛结核分枝杆菌来自武汉大学中国典型培养物保藏中心(ATCC)。抽提该菌的总DNA为模板进行PCR，扩增牛结核分枝杆菌HSP65蛋白的编码基因序列，引物为：

上游引物5’TAG AAT TCA TGG CCA AGA CAA TTG CGT AC 3’(SEQ ID NO：21)

下游引物5’TA GGTACC CAA ATC TTT AGA AGG GTC3’(SEQ ID NO：22)

PCR反应体积为50μl，引物浓度为0.4μM，扩增参数为94℃30秒、52℃45秒、72℃100秒，30个循环后产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。HSP65编码基因的PCR产物大小为1665bp。PCR产物用EcoRI酶切，胶回收纯化，与人IL-2信号肽编码序列(从Nanogen公司的商业化载体p2SB/myc-his上通过XhoI/EcoRI双酶切得到)连接，连接产物直接克隆至pMD18T(Takara)载体，选择经测序证实，IL-2信号肽和HSP65编码序列正确连接、序列正确的质粒克隆pTS2HSP65。

以获得的质粒pTS2HSP65为模板，通过PCR扩增IL-2信号肽-HSP65编码基因，引物序列为：

上游引物5’CG TCT AGA ATG TAC AGG ATG CAA CTC 3’(SEQ ID NO：23)

下游引物5’TA GGTACC CAA ATC TTT AGA AGG GTC3’(SEQ ID NO：24)

PCR反应体积为50μl，引物浓度为0.4μM，扩增参数为94℃30秒、55℃45秒、72℃120秒，30个循环后产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。IL-2信号肽-HSP65编码基因的PCR产物大小为1792bp。PCR产物用EcoRI酶切，胶回收纯化。

经KpnI酶切胶回收纯化IL-2信号肽-HSP65编码基因的PCR产物，与经KpnI酶切的多表位肽的编码基因连接，连接产物直接克隆至pMD18T(Takara)载体，转化大肠杆菌DH5α(Stratagene公司)，挑取阳性克隆经全自动测序(ABI373，PE公司)分析，得到pSHSPPT质粒。测序结果表明该质粒含有正确拼接HSP65与HIV-1多表位肽融合蛋白(HSP65PT)编码基因(SEQ ID NO：15)，编码氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的融合蛋白。

实施例4人IL-15和HSP65PT编码基因序列的融合及HSP65PT-IL-15腺病毒载体的构建

在该实施例中，将HSP65PT和IL-15cDNA加以融合，然后克隆至真核表达载体pCIcc(Promega公司)。

采用PstI从pIRES1neo载体(Clontech公司)切下IRES片段，插入pBlueScript SK载体；得到pKS-IRES。

将XbaI/BamHI酶切pSHSPPT质粒的片段插入pKS-IRES，得到pKS-HSP65PT-IRES。

将RI酶切的人IL-15cDNA插入pKS-HSP65PT-IRES，得到pKS-HSP65PTIREShIL15。

采用BamHI/NheI酶切鉴定插入方向，再用XbaI鉴定；结果表明插入正确。

采用NotI/EcoRV酶切pKS-HSP65PTIREShIL15，得到HSP65PTIREShIL15片段，补平后于SmaI位点插入pCIcc载体，得到重组载体pCI-HSP65PT-IL15。在该重组载体中，HSP65PT和人IL-15的cDNA由IRES连接，其转录受CMV启动子的控制，后接SV40polyA信号肽序列，HSP65PT和IL-15的蛋白合成分别受帽子依赖性和非依赖性机制控制指导。

所采用的腺病毒载体pAx1cw购自日本Takara公司。pAx1cw系E1区替代的cosmid载体，携带E1区(mu 1.3-9.3)和E3区(mu 79.6-84.8)缺失的Ad5腺病毒基因组DNA，在缺失的E1区插入了ClaI-SwaI-ClaI-SalI-NruI连接子，其中含有SwaI和ClaI两个供外源基因插入的克隆位点。

将从pCI-HSP65PT-IL15载体切下的含HSP65PT和IL-15表达盒(表达单元)的ClaI片段(4.7kbp)，与经去磷酸化的pAx1cw载体ClaI大片段于14℃连接过夜，同时挑DH5a菌落于含0.2％麦芽糖的5ml LB培养基中，振荡过夜，离心收集菌体重悬于2.5ml TM缓冲液(10mM Tris·HCl(pH7.5)，10mM MgSO₄)中备用。12.5ml的连接反应液与噬菌体包装蛋白(Strategene公司)混合，室温孵育90分钟，加入100ml TM缓冲液。取DNA溶液和DH5a菌各50ml混合，室温孵育15分钟后，加入1ml氨苄阴性LB培养基，37℃振荡30分钟，取10～100ml涂布于Amp阳性LB平板，37℃过夜。挑取阳性转化子，碱裂法小量制备DNA，酶切分析阳性重组子，重组腺病毒载体记为pAx1cw.CIHSP65PTIL15。

用高浓度肉汤TB培养基500～1000ml大量扩增阳性克隆菌，碱裂法抽提粘粒DNA，溶于4ml TE中，加入44.4g CsCl(购自美国Gibco公司)、0.4ml溴化乙锭(10mg/ml)混合，置5ml离心管(Beckman)梯度离心(VTi65.1转头，55,000rpm，20℃，16h)，收集超螺旋条带，用等体积Butanol(Sigma)抽提4～6遍，4℃下用TE透析过夜，或直接加入3倍体积无菌去离子水、8倍体积无水乙醇，于4℃沉淀DNA(3～5小时)，干燥后DNA溶于无菌TE，用分光光度计检测其浓度和纯度。

实施例5.腺病毒DNA-TPC的制备

按中国专利申请98126746.7中所述的方法，收集经E1和E3区缺失的Ad5腺病毒(全序列早已公开)感染的293细胞(表达腺病毒E1A、E1B蛋白的人胚肾细胞株293细胞(ATCC CRL-1573))，超声破碎后，离心去除细胞碎片，病毒上清经CsCl梯度离心(25,000rpm，4℃，2h)，浓缩的病毒液进行第二次CsCl梯度离心(35,000rpm，4℃，3h)，收集病毒液，对含10％甘油的PBS缓冲液透析过夜。透析后的病毒液加入等体积8M盐酸胍(pH7.4)破碎病毒，经CsCl梯度离心(55,000rpm，20℃，16h)纯化Ad5DNA，所纯化的Ad5DNA末端带有共价结合的末端肽，经EcoT22I(购自Biolab公司)酶切后分装备用。

实施例6.腺病毒DNA COS-TPC共转染

pAx1cw.CIHSP65PTIL15与Ad5DNA-TPC经磷酸钙DNA共沉淀法共转染293细胞，经同源重组产生AdHIV-Vac重组腺病毒。转染前一天，待转染的293细胞更换新鲜培养基。于500μl体积中将40μg pAx1cw.CIHSP65PTIL15与0.5μg Ad5DNA-TPC、CaCl₂(终浓度为0.25M)混合后，加入500μl的2×BBS缓冲液(50mM BES(N，N-bis(2-hydroxyethl)-2-aminoethane sulfonic acid)，280mM NaCl，1.5mM Na₂HPO₄(pH6.95))，混合后置室温作用10～20分钟，逐滴加入293细胞，置37℃、5％CO₂培养12～24小时。将共转染的293细胞与未经转染的293细胞按1∶1、1∶10和1∶100等不同比例混合，分别接种至96孔培养板(100μl/孔)，此后的第4天和第8天各补加DMEM培养基(50μl/孔)。于共转染后的第12～14天，从3块96孔板的共转染细胞克隆中陆续得到246个细胞病变死亡的克隆；收集阳性克隆孔的细胞及其培养液，超声破碎后的病毒上清为第一代种子病毒(1stseed)，于-80℃保存。

第一代种子病毒用病毒上清(10μl/孔)感染24孔培养板中的293细胞，每个克隆设2个复孔；3～4天收集一个复孔的细胞行细胞基因组DNA的酶切分析，对其中7个克隆进行了酶切鉴定，全部为阳性重组克隆。另一复孔中的细胞经超声破碎后收集病毒上清，为第二代种子病毒(2nd seed)，留作扩增用。

实施例7.AdHIV-Vac重组腺病毒的制备、扩增与滴度检测

酶切鉴定正确的重组克隆的第二代种子病毒上清(2nd seed)，用于感染293细胞扩增病毒，3～4天后，超声破碎细胞，离心去除细胞碎片，病毒上清经CsCl梯度离心(25,000rpm，4℃，2h)，浓缩的病毒液进行第二次CsCl梯度离心(35,000rpm，4℃，3h)纯化，最后将收集病毒液对含10％甘油的PBS缓冲液透析过夜，过滤除菌后分装，速冻保存于-80℃。

以293细胞为靶细胞、用微量细胞病变法检测病毒滴度。96孔板中先加入50ml培养液/孔，前8孔加入25ml经10⁴稀释的病毒液，开始行3倍的倍比稀释，共11个稀释度，每一稀释度设8复孔，每孔加50μl 293细胞，FCS的终度为5％，同时设细胞对照，此后第4天和第8天分别补加50μl含10％FCS的DMEM培养基，12～14天后判定结果。对其中的一个阳性克隆进行扩增，所制备的人p53-IL-2重组腺病毒，记为AdHIV-Vac，滴度为9.5×10¹⁰pfu/ml。收获后的重组腺病毒用注射用水稀释、分装成5×10¹⁰pfu/ml，保存于-80℃。

该腺病毒被命名为“共表达HSP65-HIV-1多表位肽融合蛋白和人白细胞介素15基因的重组5型腺病毒”，AdHIV-Vac。

实施例8.重组腺病毒AdHIV-Vac的体外表达

对数生长期的肝癌细胞HepG2(购自美国ATCC公司)或人皮肝成纤维细胞弃培养液后，按100∶1的重复感染度(Multiplicity of Infection，MOI)加入AdHIV-Vac的重组腺病毒，1小时后加入培养液，培养48小时后，收集培养上清。检测AdHIV-Vac重组腺病毒体外表达HSP65和IL-15。

HSP65表达的检测，采用Western-blot方法，将AdHIV-Vac感染HepG2细胞或人皮肝成纤维细胞，采用Ad-LacZ病毒作为对照，感染24小时后，收集细胞，裂解后行SDS-PAGE，转膜，封闭，采用抗HSP65(Stressgen公司)作为一抗，HRP标记的牛抗羊作为二抗，作用后用X射线片曝光，如图1所示，AdHIV-Vac感染HepG2细胞检测到HSP65融合蛋白的表达。融合蛋白的序列如SEQ ID NO：16所示。

人IL-15的生物学活性检测采用CTLL细胞株，加入抗人IL-2抗体以排除IL-2的作用，采用3H-TdR法检测，以hIL-15标准品作为对照。野生型及转染LacZ基因的HepG2细胞不分泌人IL-15，而感染人AdHIV-Vac腺病毒后分别不同程度地表达人IL-15(表2)。

表2感染AdHIV-Vac重组腺病毒的细胞表达IL-15水平

实施例9.AdHIV-Vac接种HLA-A2转基因小鼠诱导HIV-1表位特异性细胞免疫发应

将HLA-A2转基因小鼠，随机分为6组，每组小鼠分别注射(1)生理盐水；(2)1×10⁹PFU表达LacZ的腺病毒Ad.LacZ；(3)1×10⁹PFU共表达HSP65PT和IL-15的重组腺病毒AdHIV-Vac。免疫后2周，取小鼠脾细胞和血清实验。

小鼠脾细胞按1×10⁶/ml培养，分别用人工合成的十二个优选的HIV-1CTL表位肽(如实施例2表1所述，均由GL Biochem合成)和同样为HLA-A2限制性的无关表位肽CEA610D(YLSGADLNL)，按10μg/ml终浓度再刺激，刺激72小时后，将各刺激孔中的细胞转入IFN-γELISPOT包被板中，按试剂盒说明书显示各孔分泌IFN-γ的细胞斑，并计数。

IFN-γELISPOT结果如表3所示。结果表明，重组腺病毒AdHIV-Vac免疫小鼠诱导产生了明显的针对所设计的十二个HIV-1表位的细胞免疫应答，而注射生理盐水或腺病毒Ad.LacZ的对照组无相应表位特异性的应答，同时，无关肽CEA610D再刺激AdHIV-Vac免疫过的小鼠脾细胞未能出现明显的分泌IFN-γ的细胞斑。上述实验结果说明，重组腺病毒AdHIV-Vac中设计的十二个HIV-1表位均能在体内被正确地表达、加工和递呈，并确实能诱导机体产生这些表位特异性的细胞免疫发应，从而有望在HIV-1感染个体中对抗HIV-1的感染。

表3AdHIV-Vac免疫的HIA-A2转基因小鼠脾细胞IFN-γELISPOT结果

通过用QuantiGlo ELISA试剂盒(R&D)测定小鼠血清中的IL-15产生水平，发现重组腺病毒AdHIV-Vac免疫组的小鼠血清中IL-15的含量显著高于对照病毒Ad.LacZ接种组(P＜0.01)(图2)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>杭州浙大康泰生物技术有限公司

<120>艾滋病重组腺病毒疫苗

<130>035350

<160>26

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400>1

Ser Leu Leu Asn Ala Thr Asp Ile Ala Val

1               5                   10

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400>2

Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile

1               5                   10

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400>3

Arg Ile Arg Gln Gly Leu Glu Arg Ala

1               5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400>4

Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu

1               5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400>5

Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu

1               5

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400>6

Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu

1               5                   10

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400>7

Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu

1               5                   10

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400>8

Ala Ile Ile Arg Ile Leu Gln Gln Leu

1               5

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400>9

Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser Trp Lys

1               5                   10

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400>10

Ala Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Met

1               5

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400>11

Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu

1               5

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)

<400>12

Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly His

1               5

<210>13

<211>543

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

aagaattccg ccgtttcctt attgaacgct actgatattg ccgtcggcgc agcagctggt     60

cgcggtcctg gaagagcttt tgtcactatc ggagctgctg ctggccgtat tcgtcaagga    120

ctcgaacgtg caggcgctgc tgcaggttac gtagacagat tctacaagac cctaggcgct    180

gcagctggaa gtttatataa tactgtcgct actcttggtg ctgcagcagg accattgaca    240

ttcggttggt gctataagtt gggtgctgca gcaggtgttc tcgaatggag gtttgatagt    300

cgtttgggtg ctgcagctgg tgcaatcata cgtatattac aacaacttgg agcagctgca    360

ggattcctag gaaaaatctg gccatcctgg aaaggtgctg cagcaggtgc actcgtcgaa    420

atctctaccg aaatgggagc tgcagctggt gtcatatacc aatacatgga cgatctgggt    480

gctgcagcag gaattctgaa ggaacctgtt catggtcatt attacgatcc ttcgaaggac    540

ctc                                                                  543

<210>14

<211>181

<212>PRT

<213>人工序列

<400>14

Lys Asn Ser Ala Val Ser Leu Leu Asn Ala Thr Asp Ile Ala Val Gly

1               5                   10                  15

Ala Ala Ala Gly Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Ala

            20                  25                  30

Ala Ala Gly Arg Ile Arg Gln Gly Leu Glu Arg Ala Gly Ala Ala Ala

        35                  40                  45

Gly Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ser

    50                  55                  60

Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Gly Ala Ala Ala Gly Pro Leu Thr

65                  70                  75                  80

Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu Gly Ala Ala Ala Gly Val Leu Glu Trp

                85                  90                  95

Arg Phe Asp Ser Arg Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ile Ile Arg Ile

            100                 105                 110

Leu Gln Gln Leu Gly Ala Ala Ala Gly Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro

        115                 120                 125

Ser Trp Lys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu

    130                 135                 140

Met Gly Ala Ala Ala Gly Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Gly

145                 150                 155                 160

Ala Ala Ala Gly Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly His Tyr Tyr Asp

                165                 170                 175

Pro Ser Lys Asp Leu

            180

<210>15

<211>2166

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1617)

<223>Hsp65编码序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1623)..(2166)

<223>HIV表位肽编码序列

<400>15

gccaagacaa ttgcgtacga cgaagaggcc cgtcgcggcc tcgagcgggg cttgaacgcc     60

ctcgccgatg cggtaaaggt gacattgggc cccaagggcc gcaacgtcgt cctggaaaag    120

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gaggatccgt acgagaagat cggcgccgag ctggtcaaag aggtagccaa gaagaccgat    240

gacgtcgccg gtgacggcac cacgacggcc accgtgctgg cccaggcgtt ggttcgcgag    300

ggcctgcgca acgtcgcggc cggcgccaac ccgctcggtc tcaaacgcgg catcgaaaag    360

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cagattgcgg ccaccgcagc gatttcggcg ggtgaccagt ccatcggtga cctgatcgcc    480

gaggcgatgg acaaggtggg caacgagggc gtcatcaccg tcgaggagtc caacaccttt    540

gggctgcagc tcgagctcac cgagggtatg cggttcgaca agggctacat ctcggggtac    600

ttcgtgaccg acccggagcg tcaggaggcg gtcctggagg acccctacat cctgctggtc    660

agctccaagg tgtccactgt caaggatctg ctgccgctgc tcgagaaggt catcggagcc    720

ggtaagccgc tgctgatcat cgccgaggac gtcgagggcg aggcgctgtc caccctggtc    780

gtcaacaaga tccgcggcac cttcaagtcg gtggcggtca aggctcccgg cttcggcgac    840

cgccgcaagg cgatgctgca ggatatggcc attctcaccg gtggtcaggt gatcagcgaa    900

gaggtcggcc tgacgctgga gaacgccgac ctgtcgctgc taggcaaggc ccgcaaggtc    960

gtggtcacca aggacgagac caccatcgtc gagggcgccg gtgacaccga cgccatcgcc    1020

ggacgagtgg cccagatccg ccaggagatc gagaacagcg actccgacta cgaccgtgag    1080

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gccaccgagg tcgaactcaa ggagcgcaag caccgcatcg aggatgcggt tcgcaatgcc    1200

aaggccgccg tcgaggaggg catcgtcgcc ggtgggggtg tgacgctgtt gcaagcggcc    1260

ccgaccctgg acgagctgaa gctcgaaggc gacgaggcga ccggcgccaa catcgtgaag    1320

gtggcgctgg aggccccgct gaagcagatc gccttcaact ccgggctgga gccgggcgtg    1380

gtggccgaga aggtgcgcaa cctgccggct ggccacggac tgaacgctca gaccggtgtc    1440

tacgaggatc tgctcgctgc cggcgttgct gacccggtca aggtgacccg ttcggcgctg    1500

cagaatgcgg cgtccatcgc ggggctgttc ctgaccaccg aggccgtcgt tgccgacaag    1560

ccggaaaagg agaaggcttc cgttcccggt ggcggcgaca tgggtggcat ggatttcggt    1620

accaagaatt ccgccgtttc cttattgaac gctactgata ttgccgtcgg cgcagcagct    1680

ggtcgcggtc ctggaagagc ttttgtcact atcggagctg ctgctggccg tattcgtcaa    1740

ggactcgaac gtgcaggcgc tgctgcaggt tacgtagaca gattctacaa gaccctaggc    1800

gctgcagctg gaagtttata taatactgtc gctactcttg gtgctgcagc aggaccattg    1860

acattcggtt ggtgctataa gttgggtgct gcagcaggtg ttctcgaatg gaggtttgat    1920

agtcgtttgg gtgctgcagc tggtgcaatc atacgtatat tacaacaact tggagcagct    1980

gcaggattcc taggaaaaat ctggccatcc tggaaaggtg ctgcagcagg tgcactcgtc    2040

gaaatctcta ccgaaatggg agctgcagct ggtgtcatat accaatacat ggacgatctg    2100

ggtgctgcag caggaattct gaaggaacct gttcatggtc attattacga tccttcgaag    2160

gacctc                                                               2166

<210>16

<211>722

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(539)

<223>Hsp65

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(541)..(722)

<223>HIV表位肽

<400>16

Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu Arg

1               5                   10                  15

Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro Lys

            20                  25                  30

Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile Thr

        35                  40                  45

Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro Tyr

    50                  55                  60

Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr Asp

65                  70                  75                  80

Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln Ala

                85                  90                  95

Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro Leu

            100                 105                 110

Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu Thr

        115                 120                 125

Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala Ala

    130                 135                 140

Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala

145                 150                 155                 160

Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu Glu

                165                 170                 175

Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe

            180                 185                 190

Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gln

        195                 200                 205

Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val

    210                 215                 220

Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly Ala

225                 230                 235                 240

Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu

                245                 250                 255

Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val Ala

            260                 265                 270

Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln Asp

        275                 280                 285

Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly Leu

    290                 295                 300

Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys Val

305                 310                 315                 320

Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp Thr

                325                 330                 335

Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu Asn

            340                 345                 350

Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys

        355                 360                 365

Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu Val

    370                 375                 380

Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala

385                 390                 395                 400

Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu

                405                 410                 415

Leu Gln Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu

            420                 425                 430

Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys

        435                 440                 445

Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys

    450                 455                 460

Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly Val

465                 470                 475                 480

Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val Thr

                485                 490                 495

Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu Thr

            500                 505                 510

Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser Val

        515                 520                 525

Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe Gly Thr Lys Asn Ser

    530                 535                 540

Ala Val Ser Leu Leu Asn Ala Thr Asp Ile Ala Val Gly Ala Ala Ala

545                 550                 555                 560

Gly Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Ala Ala Ala Gly

                565                 570                 575

Arg Ile Arg Gln Gly Leu Glu Arg Ala Gly Ala Ala Ala Gly Tyr Val

            580                 585                 590

Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ser Leu Tyr Asn

        595                 600                 605

Thr Val Ala Thr Leu Gly Ala Ala Ala Gly Pro Leu Thr Phe Gly Trp

    610                 615                 620

Cys Tyr Lys Leu Gly Ala Ala Ala Gly Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp

625                 630                 635                 640

Ser Arg Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ile Ile Arg Ile Leu Gln Gln

                645                 650                 655

Leu Gly Ala Ala Ala Gly Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser Trp Lys

            660                 665                 670

Gly Ala Ala Ala Gly Ala Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Met Gly Ala

        675                 680                 685

Ala Ala Gly Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Gly Ala Ala Ala

    690                 695                 700

Gly Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly His Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys

705                 710                 715                 720

Asp Leu

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>17

cagccaggac tcgatggaga atcc                                             24

<210>18

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>18

gatcggatcc tgtctaagca gcagagtgat g                                     31

<210>19

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>19

cgaagcttaa ctgggtgaat gtaataagtg at                                    32

<210>20

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>20

gaggatcctc aagaagtgtt gatgaacatt tgg                                   33

<210>21

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>21

tagaattcat ggccaagaca attgcgtac                                        29

<210>22

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>22

taggtaccca aatctttaga agggtc                                          26

<210>23

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>23

cgtctagaat gtacaggatg caactc                                          26

<210>24

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>24

taggtaccca aatctttaga agggtc                                          26

<210>25

<211>345

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>25

aactgggtga atgtaataag tgatttgaaa aaaattgaag atcttattca atctatgcat     60

attgatgcta ctttatatac ggaaagtgat gttcacccca gttgcaaagt aacagcaatg    120

aagtgctttc tcttggagtt acaagttatt tcacttgagt ccggagatgc aagtattcat    180

gatacagtag aaaatctgat catcctagca aacaacagtt tgtcttctaa tgggaatgta    240

acagaatctg gatgcaaaga atgtgaggaa ctggaggaaa aaaatattaa agaatttttg    300

cagagttttg tacatattgt ccaaatgttc atcaacactt cttga                    345

<210>26

<211>114

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>26

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Ile Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser

Claims (10)

1. 一种共表达HSP65-HIV表位融合蛋白和白细胞介素15的重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，并且在E1区位置插入了HSP65-HIV表位融合蛋白基因和人白细胞介素15基因表达盒，该表达盒依次包括：启动子序列、HSP65-HIV表位融合蛋白的编码序列、以及人白细胞介素15编码序列和多聚腺苷酸化信号序列，其中所述的HSP65-HIV表位融合蛋白含有HSP65和3-20个长度为7-15个氨基酸的HIV表位。

2. 如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，HSP65-HIV表位融合蛋白基因和人白细胞介素15基因表达盒中还含有内部核糖体结合位点IRES，而且HSP65-HIV表位融合蛋白基因位于IRES之前，而白细胞介素15编码序列位于IRES之后。

3. 如权利要求1所述重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒为Ad5型腺病毒，且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP。

4. 如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，HSP65-HIV表位融合蛋白基因和人白细胞介素15基因表达盒中所含的启动子序列是巨细胞病毒启动子序列或牛乳头瘤病毒启动子序列。

5. 如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述的HIV表位是HLA-A2限制性的T细胞表位，其选自下组：

Gp160    SLLNATDIAV    SEQ ID NO：1；

Gp160    RGPGRAFVTI    SEQ ID NO：2；

Gp41     RIRQGLERA     SEQ ID NO：3：

P24      YVDRFYKTL     SEQ ID NO：4；

P17      SLYNTVATL     SEQ ID NO：5；

Nef      PLTFGWCYKL    SEQ ID NO：6；

Nef      VLEWRFDSRL    SEQ ID NO：7；

Vpr      AIIRILQQL     SEQ ID NO：8；

P1       FLGKIWPSWK    SEQ ID NO：9；

RT       ALVEICTEM     SEQ ID NO：10；

RT       VIYQYMDDL     SEQ ID NO：11；或

RT    ILKEPVHGH    SEQ ID NO：ID NO：12。

6. 一种药物组合物，其特征在于，它包括有效量的权利要求1所述的共表达HSP65-HIV表位融合蛋白和白细胞介素15的重组腺病毒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

7. 一种制备共表达HSP65-HIV表位融合蛋白的基因和人细胞因子基因的重组腺病毒的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)提供腺病毒DNA-TP复合物，在该腺病毒DNA基因组缺失E1区和E3区，并且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP；

(b)提供含腺病毒基因组的粘粒载体，在该粘粒载体中的腺病毒基因组缺失了E1区和E3区，并且在E1区位置插入了HSP65-HIV表位融合蛋白的基因和人细胞因子基因表达盒，其中该表达盒依次包括：启动子序列、HSP65-HIV表位融合蛋白的编码序列、以及人白细胞介素15编码序列和多聚腺苷酸化信号序列，其中所述的HSP65-HIV表位融合蛋白含有HSP65和3-20个长度为7-15个氨基酸的HIV表位；

(c)将步骤(a)中的腺病毒DNA-TP复合物和步骤(b)中的粘粒载体共转染表达E1区基因的宿主细胞；

(d)筛选阳性克隆；

(e)从阳性克隆中分离纯化重组腺病毒。

8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中所述的共转染采用磷酸钙DNA共沉淀转染法，所述的宿主细胞是293细胞。

9. 一种融合蛋白，其特征在于，含有HSP65的氨基酸序列和3-20个长度为7-15个氨基酸的HIV表位的氨基酸序列，以及位于上述氨基酸序列之间的连接肽。

10. 一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求9所述的融合蛋白。

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