ES2301175T3

ES2301175T3 - Vacunas contra el producto del gen 63 del virus de la varicela zoster.

Info

Publication number: ES2301175T3
Application number: ES97902334T
Authority: ES
Inventors: Bernard Centre Hosp. Univ. De Liege Rentier; Catherine Centre Hosp. Univ. De Liege Sadzot
Original assignee: Universite de Liege; SmithKline Beecham Biologicals SA
Current assignee: Universite de Liege; GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1997-02-04
Publication date: 2008-06-16
Anticipated expiration: 2017-02-04
Also published as: JP2002504080A; PL328414A1; KR19990082360A; DE69738597D1; CN1210470A; CZ289971B6; PL188457B1; CA2245545A1; KR100365986B1; NZ331164A; AU1601297A; CA2245545C; HUP0001991A3; TR199801531T2; EP0879060B1; HUP0001991A2; NO983617D0; ATE390146T1; NO983617L; IL125440A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO O PREVENCION DE LA VARICELA ZOSTER EN INDIVIDUOS INFECTADOS CON EL VIRUS DE LA VARICELA ZOSTER (VZV) Y A LA PREVENCION Y TRATAMIENTO DE LAS INFECCIONES DE VARICELA. LAS COMPOSICIONES DE LA INVENCION COMPRENDEN LA PROTEINA CODIFICADA POR EL GEN 63 DE VZV O UN DERIVADO DEL MISMO INMUNOLOGICAMENTE ACTIVO. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A COMPOSICIONES QUE CONTIENEN ADN O ARN CORRESPONDIENTE AL GEN 63 DE VZV.

Description

Vacunas contra el producto del gen 63 del virus de la varicela zoster.

La presente invención se refiere a composiciones para el tratamiento o prevención del herpeszoster en individuos infectados con el virus de la varicela zoster (VZV), y a la prevención y tratamiento de infecciones de varicela. Las composiciones de la invención comprenden la proteína codificada por el gen 63 de VZV o un derivado inmunológicamente activo de ésta. La invención también se refiere a composiciones que contienen ADN o ARN que corresponde al gen 63 de VZV.

El virus de la varicela es un alfa-herpesvirus humano que provoca dos enfermedades en seres humanos: tras la infección primaria, el VZV provoca la varicela infantil, después el virus se hace latente y con frecuencia se reactiva (a menudo décadas después) para producir herpes (herpeszoster). Durante la varicela, el virus penetra en el sistema nervioso periférico en donde permanece latente hasta que se reactiva en forma del doloroso herpeszoster. Mientras el virus está latente se reprime la expresión de la mayoría de los genes víricos. Se cree que la inmunidad mediada por células desempeña un papel crucial en el control de la latencia, puesto que la reactivación del herpeszoster es frecuente en individuos ancianos o inmunodeprimidos.

La infección por VZV se caracteriza por la presencia mínima de virus libres. Durante la latencia y reactivación, el virus es fundamentalmente intracelular. Por consiguiente, la enfermedad recurrente no se evita incluso con altos niveles de anticuerpos neutralizantes, y el control del virus depende de la inmunidad mediada por células. Para obtener protección mediante la vacunación, sería deseable, por tanto, inducir no sólo una respuesta de anticuerpos sino también una respuesta de CTL. Una vacuna eficaz debería cebar CTL capaces de actuar tan pronto como sea posible en cuanto aparecen las señales de reactivación del virus latente.

Puesto que el mecanismo del reconocimiento del antígeno por los linfocitos T citotóxicos (CTL) implica la degradación del antígeno nativo para producir péptidos, la unión de los fragmentos proteolíticos a moléculas de MHC y la exportación del complejo hasta la superficie celular, cualquier polipéptido codificado por el virus, y no sólo los que son proteínas de membrana intregales como las glicoproteínas, puede ser una diana potencial de las respuestas mediadas por células T. Sin embargo, puesto que el genoma de VZV codifica varias proteínas no estructurales y proteínas del virión internas, además de las glicoproteínas externas, esto produce un gran número de dianas potenciales para CTL y se desconoce cuál sería la proteína más relevante.

El genoma del virus de la VZ está compuesto por 71 marcos de lectura abiertos, que codifican 68 proteínas. La secuencia del ADN del virus es conocida (J. Gen. Virol., 67:1759-1816). El gen 63 del virus de la varicela zoster codifica una proteína inmediatamente temprana con una masa molecular predicha de 30,5 kDa (Debrus et al., J. of Virology, 69(5), 1995, p. 3240). El gen comienza en 110581 (codón de inicio) y se extiende hasta 111414 (codón de fin). Otra copia del gen en orientación inversa se encuentra entre las bases 119316 y 118483. De forma bastante inusual, se ha demostrado que la proteína IE63 se expresa en un modelo de rata, en neuronas durante la latencia. La proteína se ha expresado como una proteína de fusión en E. coli (Debrus et al.).

Ahora se ha descubierto que la proteína IE63 de VZV se detecta exclusivamente en el citoplasma de neuronas de ganglios torácicos y trigémino humanos con infección latente. Esta es la primera identificación de una proteína de alfa-herpesvirus expresada durante la latencia en el sistema nervioso humano.

Además, los inventores han descubierto que esta proteína es una diana importante para el sistema inmunológico, en particular es una diana de la respuesta de células T y, por tanto, resulta útil en la prevención y tratamiento de infecciones por VZV, en particular, en la prevención del herpeszoster en pacientes que ya han sido infectados por el VZV.

Phlan et al. (PNAS, 1993, 90(9):9056-9060) indican que la expresión del subconjunto de genes de HSV-1 inmediatamente tempranos (IE) es necesaria y suficiente para la redistribución de snRNP, y que específicamente el producto del gen IE63 vírico (ICP27) es esencial para este efecto.

Kennedy et al. (Virology, 1994, 205(2):558-562) indican que después de la infección por la cepa OKA de VZV, se detectaron por primera vez efectos citopáticos y un marcaje significativo del antígeno vírico con anticuerpos contra gpI VZV y proteína 62 inmediatamente temprana (IE) de 6 a 7 días después de la infección.

El documento EP405867 describe proteínas de las glicoproteínas del virus de la varicela zoster que consisten en gpI sin anclaje, gpII sin anclaje, o gpIII sin anclaje.

El documento US5306635 describe la identificación del gen gpIII putativo del virus de la varicela zoster (VZV) que codifica proteínas víricas de la superficie exterior inmunogénicas.

El documento EP244155 describe la identificación del gen gpIII putativo del virus de la varicela zoster (VZV) que codifica proteínas víricas de la superficie exterior inmunogénicas.

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Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína IE63 del virus de la varicela zoster, y un excipiente farmacéuticamente aceptable para tratar a un ser humano susceptible a una infección por VZV o que padece una infección por VZV.

Éste es el primer uso médico para dicha proteína y, por tanto, la invención proporciona, en consecuencia, la proteína IE63 de VZV para su uso en medicina. En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para tratar a un ser humano susceptible a una infección por VZV o que padece una infección por VZV, que comprende administrar una cantidad segura y eficaz de una composición según la invención.

La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin los efectos secundarios adversos significativos de las vacunas típicas. Esta cantidad variará dependiendo del inmunógeno específico empleado y del modo en que se presente. En general, se espera que cada dosis comprenderá 1-1000 \mug de proteína, preferiblemente 2-100 \mug, lo más preferible 4-40 \mug. Puede determinarse una cantidad óptima para una vacuna particular mediante estudios convencionales que implican la observación de las respuestas inmunológicas apropiadas en sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo con un intervalo de tiempo adecuado.

Además de la vacunación de personas susceptibles a infecciones por VZV, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden emplearse para tratar inmunoterapéuticamente a pacientes que padecen infecciones por VZV, para prevenir o disminuir significativamente la enfermedad recurrente, la frecuencia, gravedad o duración de los episodios de herpeszostes.

En la vacuna de la invención, una disolución acuosa de la(s) proteína(s) IE63 de VZV puede utilizarse directamente. Como alternativa, la(s) proteína(s) IE63 de VZV, con o sin una liofilización previa, pueden mezclarse entre sí o con cualquiera de una serie de adyuvantes conocidos. Estos adyuvantes incluyen, pero no se limitan a hidróxido de aluminio, muramil dipéptido, y saponinas, tales como Quil A, en particular QS21 o monofosforil-lípido A 3-desacilado (3D-MPL). Se prefieren los adyuvantes o sistemas de adyuvantes que inducen de modo preferente una respuesta TH1. Los adyuvantes que son capaces de una estimulación preferente de la respuesta de células TH1 se describen en las solicitudes de patente internacional nº WO 94/00153 y WO 95/17209.

Un adyuvante particular preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada mediante HPLC derivada de la corteza de Quillaja saponaria Molina, y el monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con una emulsión de aceite en agua.

En el documento GB 2220211 (Ribi) se describe el monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado. Desde el punto de vista químico es una mezcla de monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado con cadenas 4-, 5- o 6-aciladas, y está fabricado por Ribi Immunochem Montana. Una forma preferida de monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado se describe en la solicitud de patente internacional nº 92/16556.

El QS21 es una fracción no tóxica purificada mediante HPLC de una saponina procedente de la corteza del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molina, y su procedimiento de producción se describe (como QS21) en la patente de EEUU nº 5.057.540.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa-tocoferol y Tween-80. Además, la emulsión de aceite en agua puede contener Span 85 y/o lecitina.

La proporción de QS21:3D-MPL será, de forma típica, del orden de 1:10 a 10:1, preferiblemente de 1:5 a 5:1, y a menudo sustancialmente 1:1. El intervalo preferido para una sinergia óptima es de 3D-MPL:QS21 2,5:1 a 1:1. De forma típica para la administración humana, el QS21 y el 3D-MPL estarán presentes en la vacuna en el intervalo de 1 \mug-100 \mug, preferiblemente 10 \mug-50 \mug por dosis. De forma típica, la emulsión de aceite en agua comprenderá escualeno del 2% al 10%, alfa-tocoferol del 2% al 10%, y Tween-80 del 0,3% al 3%. Preferiblemente, la proporción de escualeno a alfa-tocoferol es igual o menor que 1, puesto que proporciona una emulsión más estable. También puede estar presente Span 85 a un nivel del 1%. En algunos casos puede resultar ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan también un estabilizante.

Como otro ejemplo alternativo, la proteína puede encapsularse dentro de micropartículas, tales como liposomas. En otro ejemplo alternativo, la(s) proteína(s) IE63 de VZV puede(n) conjugarse con una macromolécula inmunoestimuladora, tal como Bordetella muerta o un toxoide del tétanos.

La preparación de vacunas se describe, en general, en New Trends and Developmens in Vaccines, Voller et al. (eds.), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978. La encapsulación dentro de liposomas se describe en Fullerton, patente de EEUU 4.235.877. La conjugación de proteínas a macromoléculas se describe, por ejemplo, en Likhite, patente de EEUU 4.372.954, y Armor et al., patente de EEUU 4.474.757. El uso de Quil A se describe en Dalsgaard et al., Acta Vet. Scand., 18:349 (1977). El 3D-MPL puede adquirirse en Ribi Immunochem, EEUU, y se describe en la solicitud de patente del Reino Unido nº 2220211 y en la patente de EEUU 4912094. El QS21 se describe en la patente de EEUU nº 5057540.

El uso del polinucleótido de la invención en la inmunización genética emplea, preferiblemente, un procedimiento de transporte adecuado, tal como la inyección directa de ADN de plásmido en músculos (Wolff et al., Hum. Mol. Genet., 1992, 1:363; Manthorpe et al. Hum. Gene Ther., 1963, 4:419), la administración de ADN complejado con vehículos de proteínas específicas (Wu et al., J. Biol. Chem., 1989, 264:1985), la coprecipitación del ADN con fosfato de calcio (Benvenisty y Reshef, PNAS, 1986, 839551), o con otros facilitadores de la encapsulación del ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda et al., Science, 1989, 243:375), el bombardeo de partículas (Tang et al., Nature, 1992, 356:152; Eisenbraun et al., DNA Cell Biol., 1993, 12:791), y la infección in vivo utilizando vectores retrovíricos clonados (Seegar et al., PNAS, 1984, 83:5849) o vectores víricos recombinantes no infecciosos, tales como el sistema auxiliar 2 del virus de la selva de Semliki (Berglund et al., Bio/Technology, 1993, 11:916-920). Los promotores adecuados para la transfección en músculo incluyen CMV, RSV, Sra, actina, MCK, alfa-globina, adenovirus, y dihidrofolato reductasa. Una forma de administración preferida de un polinucleótido según la invención utiliza partículas de oro administradas mediante una pistola de genes (documentos US 5100792, US 5036006 y 4945050).

Las composiciones de polinucleótidos de la invención pueden administrarse utilizando las dosificaciones y vías de administración descritas en el documento WO 90/11092. Sin embargo, será evidente que la dosificación precisa dependerá de factores, tales como el peso, sexo, vía de administración, salud general del paciente y trastorno que se va a tratar. No obstante, para el uso intramuscular, las dosificaciones empleadas estarán, de forma típica, en el intervalo de 0,05 \mug/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de forma más típica de aproximadamente 0,1 a 10 mg/kg. La administración subcutánea, epidérmica, intradérmica o mucósica puede ser ventajosa, debido a su capacidad para inducir altos niveles del CTL.

La vacuna de la presente invención también puede contener otros componentes antigénicos, tales como gpI, gpII, gpIII, gpIV o gpV de VZV, o sus derivados truncados u otras proteínas inmediatamente tempranas, tales como la proteína IE62, en particular las gpI, gpII o gpIII truncadas, según se describe en la solicitud de patente europea, publicada como nº 0405867.

En una realización preferida de la presente invención, se proporciona una composición de vacuna que comprende una gpI sin anclaje en combinación con IE63 o un derivado de IE63.

Sin anclaje significa un derivado de glicoproteína de VZV que está exento sustancialmente de toda la región de anclaje C-terminal, y que permite su secreción cuando se expresa en células de mamífero. Estas proteínas se describen en el documento EP-A-0405867.

En una realización alternativa se proporciona una vacuna, que comprende una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que representa IE63 o su derivado, y una secuencia de aminoácidos que representa gpI, gpII, gpIII, gpIV o gpV o sus derivados, u otra proteína inmediatamente temprana, tal como IE62.

En una realización alternativa, un polinucleótido capaz de expresar IE63 o su derivado puede utilizarse directamente como una vacuna de ácido nucleico. Preferiblemente, el polinucleótido es ADN. En estos casos, el polinucleótido estará bajo el control de un promotor adecuado.

También puede emplearse una inmunización con ARN. En estos casos, el ARN puede emplearse según los procedimientos del documento WO92/10578.

Ejemplo 1

Formulación de vacuna que comprende la proteína IE63 de VZV

Se preparan dos formulaciones adyuvantes, comprendiendo cada una el siguiente componente de emulsión de aceite en agua:

SB 62: escualeno al 5%, tocoferol al 5%, Tween-80 al 2,0%; el tamaño de partícula es de 180 nm.

1(a) Preparación de la emulsión SB62 (concentrada en 2 veces).

El Tween-80 se disuelve en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) para producir una disolución al 2% en PBS. Para proporcionar 100 ml de la emulsión concentrada en 2 veces, se agitan en vórtice 5 g de DL-alfa-tocoferol y 5 ml de escualeno para que se mezclen a fondo. Se añaden 90 ml de disolución de PBS/Tween y se mezcla a fondo. La emulsión resultante se hace pasar a través de una jeringa y, por último, se microfluidifica utilizando una máquina de microfluidos M110S. Las gotas de aceite resultantes tienen un tamaño de aproximadamente 180 nm.

1(b) El antígeno se prepara según el procedimiento de Debrus et al. (supra).

1(c) Preparación de la formulación de aceite en agua de proteína IE63 QS21/3D-MPL.

A la emulsión de 1(a) se le añade un volumen igual de antígeno concentrado en 2 veces (20 \mug o 100 \mug) y se mezcla. Esto se combina con 50 \mug/ml de 3D-MPL y 20 \mug/ml de QS21 para producir la formulación final. El tampón se utiliza según el contenido en sales y el pH.

Ejemplo 2

Características inmunológicas de IEP63 2.1. Materiales

Se extrajo sangre de once donantes sanos de los cuales uno se había vacunado. Todos los donantes eran adultos, con una historia de varicela durante la infancia. En cada caso, 30 ml de la sangre se recogió en tubos heparinizados y se utilizaron 5 ml para coagular con el fin de recoger suero.

2.2. Respuesta inmunológica humoral

Se realizaron ensayos ELISA utilizando VZV enteros y antígenos control para detectar IgG anti-VZV en las muestras de sangre; todos los donantes ensayados (excepto uno) tenían un nivel detectable de anticuerpos anti-VZV, lo cual proporciona una prueba serológica de varicela desarrollada durante la infancia.

Los inventores buscaron la presencia de anticuerpos anti-IE63 mediante un análisis de la transferencia Western en el que se empleó IE63, clonado en pGEX5X y expresado en E. coli como una proteína de fusión (GST-IE63) y purificado mediante cromatografía de afinidad (Debrus et al., J. Virol., 69, 3240-3245). La proteína GST, expresada y purificada de la misma manera, se utilizó como control negativo. En todas las muestras de sangre ensayadas, la proteína de fusión de IE63 purificada fue reconocida, indicando la presencia de anticuerpos anti-IE63 en el suero. La proteína control no fue reconocida nunca por los anticuerpos.

2.3 Respuesta inmunológica celular

Se determinó la estimulación de linfocitos T mediante la estimulación de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) aisladas mediante centrifugación con Ficoll Hypaque.

Todos los ensayos se realizaron por triplicado mediante la estimulación de 3 x 10^{5} PBMC con PHA (fitohemaglutinina) para determinar el índice de estimulación no específica para VZV enteros y antígenos control (preparados mediante sonicación de células de melanoma infectadas o no infectadas) y proteína de fusión purificada (GST-IE63 o GST solo). En el día 6, las células se marcaron de forma radiactiva con ^{3}H-timidina durante 16 horas y después se recogieron. Se calculó el índice de estimulación (SI) como la proporción de CPM en los pocillos estimulados con proteína frente a los pocillos control, y se consideró positivo si >2.

2.4 Resultados de la proliferación de células T

Hasta la fecha se han realizado 10 ensayos de proliferación, con los parámetros previamente determinados.

Los resultados se listan en la tabla 1.

El SI obtenido después de la estimulación con antígenos de VZV enteros o con IE63 se han representado como una gráfica que aparece en la figura 1.

A partir de estos datos se puede concluir que la mayoría de los participantes (6/10) presentaban una respuesta de células T de memoria a IE63 de VZV.

Dos donantes presentaban un SI muy bajo con antígenos completos y proteína de fusión purificada, y pueden considerarse negativos (SI<2). Sin embargo, uno de ellos presentaba una valoración de anticuerpos muy baja, sin evidencias claras de historia de varicela y, por tanto, podía ser un donante negativo. El otro, cuya valoración de anticuerpos era alta, presentaba un mejor SI cuando el ensayo se realizó con MBP-IE63 (SI = 3,4), indicando que, en algunos casos, una de las proteínas de fusión fue mejor reconocida por las células T, y que una comparación de ambas proteínas puede ser útil en los casos en los que el SI es muy bajo, con una alta desviación estándar.

Otros dos donantes presentaban una respuesta negativa a IE63 cuando el SI con anticuerpos enteros era alto, pero la estimulación sólo se realizó con proteínas de fusión de GST.

Ejemplo 3

Respuestas celulares

En una expansión del anterior experimento, se ensayaron PBMC de 19 adultos sanos para la proliferación de células T en respuesta a la estimulación con antígenos de VZV o proteína purificada GST-IE63. La media del SI con los antígenos de VZV era de 1,5 \pm 3,3 EE, con unos valores entre 2,1 y 52. Esto significa que el SI después de la estimulación con GST-IE63 era de 3,4 \pm 0,48 EE, con un valor entre 1,8 y 8. Estos datos de SI eran significativamente mayores que los observados para pacientes no inmunes, cuyo SI era de 1,95 \pm 0,48 EE para los antígenos de VZV, y de 1,3 \pm 0,1 EE para IE63. Cuando el SI después de la estimulación con VZV se representó gráficamente y se comparó con el SI con GST-IE63, los dos pacientes no inmunes aparecieron claramente negativos (SI<2,0) con ambas preparaciones de antígenos (figura 2). Todos los 17 donantes inmunes tenían un SI para los antígenos de VZV mayor que 2,0. Entre estos donantes positivos, tres (17%), de los cuales uno tenía una historia de múltiples erupciones de herpeszoster, presentaban una respuesta muy fuerte a los antígenos de VZV, mientras que el SI con GST-IE63 era menor que 2,0. Cuatro donantes tenían un SI de 2,0 para GST-IE63, con un SI para los antígenos de VZV que variaba de 5,4 a 11. Sin embargo, estos donantes con un SI con GST-IE63 \leq 2 presentaban una respuesta muy importante al GST solo (los datos no se muestran), lo cual hizo muy difícil interpretar los resultados. El resto de los individuos inmunes naturales (59%) presentaban una fuerte respuesta al GST-IE63, con un SI entre 2,3 y 8. Sin embargo, no se descubrió correlación entre la estimulación con antígenos de VZV y con la proteína de fusión.

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Ejemplo 4

Ensayos de citoquinas

Se evaluó la producción de citoquinas mediante PBMC estimuladas con IE63 en 7 sujetos: las PBMC se estimularon con GST o con GST-IE63, y se detectó IL-2, IL-4 y g-FN en los días 2, 4 ó 6 mediante ELISA. Los resultados se expresaron como la diferencia entre la concentración de citoquinas detectada después de la estimulación con GST-IE63 o GST solo. Nunca se detectó IL-2 ni IL-4, mientras que \gamma-IFN fue producida en cantidades significativas (de 175 a 1400 pg/ml) por las células T estimuladas con IE63, produciéndose el máximo en el día 4. La cantidad de \gamma-IFN detectada en el cultivo en el que no se observó estimulación fue significativamente menor.

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Ejemplo 5

Ensayos de citotoxicidad

Se detectaron respuestas de CTL específicas de IE62 e IE63 en ensayos de dilución limitante de células T obtenidas de 10 donantes inmunes a VZV. Estos ensayos se realizaron con dianas autólogas, no infectadas o infectadas con vacuna-control, vacuna-IE62 o vacuna-IE63. El fondo generado por las dianas control presentó una amplia variación entre los donantes, pero los resultados se consideraron válidos sólo si la lisis de las dianas específicas de virus era al menos 10% mayor que la lisis con las dianas control (no infectadas o infectadas con vacuna-control).

Cuando se utilizaron las poblaciones de células T recuperadas mediante T-Lymphkwik, la lisis de dianas que expresaban proteínas de VZV fue significativamente mayor que la observada para las dianas no infectadas o control, según se demostró para un ensayo (figura 3). La lisis observada con dianas que expresan IE62 no fue significativamente diferente de la lisis de dianas que expresaban IE63. Se obtuvieron resultados similares para los cuatro ensayos realizados con la población de células T entera: se observó una lisis específica del 25% al 48% para IE62, y del 27% al 43% para IE63. La frecuencia media del precursor para células T que reconocían IE62 o IE63 era de 44500 \pm 22500 EE y de 31000 \pm 16000 EE, respectivamente, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0,8).

También se prepararon diluciones limitantes de los cultivos utilizando poblaciones purificadas de linfocitos T CD4+ y CD8+ como efectores. Ambas poblaciones lisaban dianas IE62 e IE63. El RCF de células CD8+ que reconocían IE62 o IE63 fue de 28500 \pm 10100 EE y de 30500 \pm 13700 EE, respectivamente, que no fue estadísticamente significativo (p = 0,9), indicando que ambas proteínas víricas fueron reconocidas con la misma eficacia por las células CD8+ (figura 4). El número de células que lisaban las dianas IE63 también era el mismo en ambas poblaciones de células efectoras: la media de células efectoras CD4+ era de 31450 \pm 7500 EE, que es la misma que la frecuencia de células CD8+ (p = 0,97). Sin embargo, el cálculo de la frecuencia de células CD4+ para el reconocimiento de IE62 fue rechazado mediante los análisis por ordenador.

Ejemplo 6

Expresión de IE63 de VZV durante la latencia

Para analizar la expresión de VZV en ganglios infectados de forma latente, se obtuvo un ganglio trigémino y múltiples ganglios torácidos de 9 adultos y 3 bebés en las 24 horas siguientes a la muerte. Ninguno de los sujetos estaba inmunocomprometidos antes de la muerte, y en la autopsia no se observaron señales cutáneas de infección reciente por herpesvirus. Un inmunoensayo enzimático reveló anticuerpos contra VZV en el suero de todos los adultos. El suero disponible de uno solo de los 3 bebés no contenía anticuerpos contra VZV. Una amplificación mediante PCR líquida utilizando cebadores específicos de VZV (Mahalingham R. et al., Engl. J. Med., 323:627-631) reveló ADN de VZV en todos los ganglios de adultos, pero no había en ninguno de los ganglios de bebés, en ADN extraído de una pequeña porción de cada ganglio. El resto de las porciones de cada ganglio se analizaron inmunohistoquímicamente utilizando anticuerpos generados en conejos contra la proteína IE63 de VZV de 30,5 kD, expresada como una proteína de fusión con glutatión-S-transferasa en E. coli, y purificada como se describe (Debrus et al., supra). Células BSC-1 (riñón de mono africano) infectadas con VZV y no infectadas actuaron como controles positivo y negativo, respectivamente.

En las células BSC-1 infectadas con VZV se observaron dos áreas focales de citopatología de VZV típica que contenían la proteína IE63 de VZV. No se detectaron señales en células no infectadas ni en células BSC-1 infectadas con HSV. En ganglios obtenidos 17 horas después de la muerte de un hombre de 46 años que murió de aterosclerosis, un característico color rojo reveló proteína IE63 de VZV exclusivamente en el citoplasma de 3 neuronas. No se detectaron señales cuando se aplicó suero de conejo normal a una sección adyacente del mismo ganglio. Se detectó una intensa tinción roja en el citoplasma de una neurona en secciones adyacentes de un ganglio torácico diferente del mismo sujeto. También se observó un color rojo más claro en múltiples neuronas de los ganglios infectados de modo latente, lo cual sugiere una infección más difusa, quizás menos abundante. La tinción roja específica de la proteína IE63 de VZV nunca se observó en células satélite (capsulares), capilares, tejido conectivo, fascículos nerviosos dentro de los ganglios, o nervios sin raíz que se introducen en los ganglios. No se detectaron señales cuando el antisuero contra la proteína IE63 de VZV se aplicó a los ganglios de un bebé de 2 meses que murió de sepsis que complicó una hiperplasia pulmonar y un onfalocele congénito. En su conjunto, la proteína IE63 de VZV fue descubierta en 5 ganglios (4 torácicos y 1 trigémino) de 2 adultos. En uno de estos adultos, la proteína IE63 de VZV se detectó en las 10 secciones de 4 de 5 ganglios torácicos. En el segundo adulto, la proteína IE63 de VZV se detectó en las 4 secciones del ganglio trigémino. En las secciones positivas, la proteína IE63 de VZV se detectó en el citoplasma de 2-4 neuronas. La proteína IE de VZV no se detectó en ninguna de las 4 secciones preparadas a partir de cada uno de los 16 ganglios de otros 7 adultos, o en ninguna de las 4 secciones de cada uno de los 9 ganglios de los 3 bebés.

La detección de ADN de VZV en casi todos los ganglios pero de la proteína IE63 de VZV sólo en algunos ganglios infectados de modo latente puede reflejar la toma de muestras, es decir, el análisis de todas las secciones de todos los ganglios que contenían ADN de VZV para detectar IE63 de VZV podría haber revelado más ganglios positivos. Como alternativa, la expresión del virus puede ser distinta en los diferentes ganglios, por ejemplo, en ganglios con infección latente por HSV, el número de neuronas que contienen ADN de HSV es mucho mayor que las que revelan transcritos asociados a la latencia.

Por último, podría haberse producido una reactivación de los virus, aunque esto no parece probable en sujetos cuyos ganglios contenían la proteína IE63 de VZV, puesto que no había evidencias clínicas de erupción zosterioforme antes de la muerte, no había historia de dolor neurálgico prolongado que puede aparecer antes de las erupciones (neuralgia preherpética), no había historia de distribución dermatómica de dolor sin erupciones (zoster sin herpes), y no había historia de neuralgia postherpética que sugiera un grado bajo de ganglionitis. Además, el examen histológico de los ganglios no reveló neuronofagia, cuerpos de inclusión o respuesta inflamatoria.

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Conclusiones

A partir de estos experimentos se puede concluir que IE63 de VZV provoca una respuesta inmunológica completa, ya que:

- pueden detectarse anticuerpos anti-IE63 mediante análisis de la transferencia Western en el suero de la mayoría de los donantes con una historia de varicela;

- las células T pueden proliferar después de la estimulación in vitro con IE63 (purificada como una proteína de fusión con GST), pero el número limitado de donantes ensayados no permitió descubrir una correlación directa entre el índice de estimulación (SI) con VZV y con IE63. Las células T que proliferan en respuesta a la estimulación con IE63 eran en su mayor parte Th1, tal como fue indicado mediante la expresión de una alta cantidad de IFN-gamma en el sobrenadante;

- se ha demostrado una actividad citotóxica de células T en el contexto del reconocimiento de IE63. Las células CD4+, y también CD8+, participan en el proceso de lisis, según se determina mediante el uso de células efectoras purificadas. El número de células precursoras que reconocen IE63 es similar al número de células que responden a IE62.

Este es el primer informe sobre la identificación de una proteína de herpesvirus expresada durante la latencia en el sistema nervioso humano que, junto con sus propiedades inmunológicas, le hace ser un excelente antígeno para ser incluido en vacunas contra el virus de la varicela zoster.

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TABLA 1 Proliferación de células T

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Tabla 1

Respuesta inmunológica humoral y celular al VZV

El SI se midió después de una estimulación con antígenos completos (células de melanoma sonicadas infectadas o con infección ficticia diluidas 4, 16 ó 64 veces) o con proteína de fusión IE63 (GST o GST-IE63).

El estado de inmunidad humoral se evalúo mediante ELISA con el antígeno completo (expresado como la dilución en la que la DO > 0,250) o mediante análisis de la transferencia Western con IE63.

Claims

1. Una composición farmacéutica que comprende la proteína IE63 del virus de la varicela zoster y un excipiente farmacéuticamente aceptable para tratar a un ser humano susceptible o que padece una infección por VZV.

2. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica IE63 de VZV para tratar a un ser humano susceptible o que padece una infección por VZV.

3. La proteína IE63 del virus de la varicela zoster para su uso en medicina.

4. El uso de la proteína IE63 del virus de la varicela zoster para la fabricación de un medicamento para la prevención o mejoría de la varicela o el zoster.

5. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, que comprende además otras proteínas IE o antígenos de VZV.

6. Una composición farmacéutica según la reivindicación 5, en la que la segunda proteína IE de VZV o el otro antígeno de VZV es gpI, gpII, gpIII, gpIV, gpV, IE62 o su derivado inmunológicamente funcional.

7. Una composición farmacéutica según la reivindicación 6, que comprende una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que representa IE63 de VZV, y una secuencia de aminoácidos que representa una de gpI, gpII, gpIII, gpIV, gpV o sus derivados.

8. Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 1, 2, 5, 6 ó 7, que comprende además un adyuvante.

9. Una composición farmacéutica según la reivindicación 8, en la que el adyuvante induce de manera preferente una respuesta TH1.

10. Una composición farmacéutica según la reivindicación 9, en la que el antígeno se presenta como una emulsión de aceite en agua, junto con QS21 y 3D-MPL.

11. Un procedimiento para producir una composición farmacéutica que comprende una proteína IE63 de VZV, o un ácido nucleico que codifica dicha proteína, que comprende mezclar dicha proteína o ácido nucleico con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que el excipiente comprende un adyuvante.