ES2737852T3 - Un citomegalovirus de replicación condicional como vacuna para el CMV - Google Patents

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Abstract

Un citomegalovirus (CMV) de replicación condicional defectuosa con IE1/2 desestabilizado y UL51 proteínas, en el que el genoma del CMV está representado por la SEQ ID NO:14.

Description

DESCRIPCIÓN
Un citomegalovirus de replicación condicional como vacuna para el CMV
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos de inducción de una respuesta inmunitaria contra el citomegalovirus (CMV) usando un CMV modificado genéticamente que es de replicación condicional defectuosa. La presente invención también se refiere a un CMV que se ha alterado de manera recombinante para permitir el control externo de la replicación vírica. Las composiciones que comprenden el CMV de replicación defectuosa también se incluyen en la presente invención.
Antecedentes de la invención
El citomegalovirus (CMV), también conocido como herpesvirus 5 humano (HHV-5), es un herpesvirus clasificado como un miembro de la subfamilia beta de Herpesviridae. De acuerdo con el Centers for Disease Control and Prevention, la infección por CMV se encuentra de forma bastante ubicua en la población humana, con una población adulta infectada estimada de un 40-80 % en los Estados Unidos. El virus se propaga principalmente a través de los fluidos corporales y se pasa frecuentemente de las madres embarazadas al feto o al recién nacido. En la mayoría de los individuos, la infección por CMV es latente, aunque la activación del virus puede provocar fiebre alta, escalofríos, fatiga, cefalea, náuseas y esplenomegalia.
Aunque la mayoría de las infecciones por CMV humano son asintomáticas, las infecciones por CMV en individuos inmunocomprometidos (tales como pacientes positivos a VIH, pacientes con trasplante alogénico y pacientes con cáncer) o personas cuyo sistema inmunitario aún no se ha desarrollado completamente (tal como recién nacidos) pueden ser particularmente problemáticas (Mocarski et al., Cytomegalovirus, en Field Virology, 2701-2772, Editor: Knipes y Howley, 2007). La infección por CMV en dichos individuos puede causar morbilidad grave, incluyendo neumonía, hepatitis, encefalitis, colitis, uveítis, retinitis, ceguera y neuropatía, entre otras afecciones perjudiciales. Además, la infección por CMV durante el embarazo es una causa principal de defectos en el nacimiento (Adler, 2008 J. Clin Virol, 41:231; Arvin et al., 2004 Clin Infect Dis, 39:233; Revello et al., 2008 J Med Virol, 80:1415). El CMV infecta diversas células in vivo, incluyendo monocitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, neuronas, células de músculo liso, hepatocitos y células estromáticas (Plachter et al., 1996, Adv. Virus Res. 46:195). Aunque los aislados de CMV clínicos se replican en diversos tipos celulares, las cepas de laboratorio AD169 (Elek & Stern, 1974, Lancet 1:1) y Towne (Plotkin et al., 1975, Infect. Immun. 12:521) se replican casi exclusivamente en fibroblastos (Hahn et al., 2004, J. Virol. 78:10023). La restricción en el tropismo, que resulta de pases en serie y final adaptación del virus en los fibroblastos, se estipula como un marcador de atenuación (Gerna et al., 2005, J. Gen. Virol. 86:275; Gerna et al., 2002, J. Gen Virol. 83:1993; Gerna et al., 2003, J. Gen Virol. 84:1431; Dargan et al., 2010, J. Gen Virol. 91:1535). Las mutaciones que causan la pérdida de tropismo por células epiteliales, células endoteliales, leucocitos y células dendríticas en las cepas de laboratorio de c Mv humano se han identificado en tres fases de lectura abierta (ORF): UL128, UL130 y u L131 (Hahn et al., 2004, J. Virol. 78:10023; Wang y Shenk, 2005 J. Virol. 79:10330; Wang y Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA.
102:18153). Los estudios bioquímicos y de reconstitución muestran que UL128, UL130 y UL131 se ensamblan en una estructura gH/gL para formar un complejo gH pentamérico (Wang y Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA.
102:1815; Ryckman et al., 2008 J. Virol. 82:60). La restauración de este complejo en los viriones restaura el tropismo epitelial vírico en las cepas de laboratorio (Wang y Shenk, 2005 J. Virol. 79:10330).
La pérdida de tropismo endotelial y epitelial se ha sospechado como una deficiencia en los previamente evaluados como vacunas tales como Towne (Gerna et al., 2002, J. Gen Virol. 83:1993; Gerna et al., 2003, J. Gen Virol.
84:1431). Los anticuerpos neutralizantes en sueros de sujetos humanos de infección con CMV natural tienen una actividad más de 15 veces mayor contra la entrada epitelial vírica que contra la entrada en fibroblastos (Cui et al., 2008 Vaccine 26:5760). Los seres humanos con infección primaria desarrollan rápidamente anticuerpos neutralizantes contra la entrada endotelial y vírica del virus, pero solamente desarrollan lentamente anticuerpos neutralizantes contra la entrada en fibroblastos del virus (Gerna et al., 2008 J. Gen. Virol. 89:853). Además, la actividad neutralizante contra la entrada epitelial y endotelial del virus, está ausente en sueros inmunológicos de sujetos humanos que recibieron la vacuna Towne (Cui et al., 2008 Vaccine 26:5760). Más recientemente, se describió un panel de anticuerpos monoclonales humanos de cuatro donantes con infección por HCMV, y los clones neutralizantes más patentes del panel reconocían los antígenos del complejo gH pentamérico (Macagno et al., 2010 J. Virol. 84:1005).
Un citomegalovirus de replicación condicional defectuosa con una proteína desestabilizada única seleccionada de IE1/2, IE1/3, UL51 y UL77 ha sido descrito para facilitar el análisis de las funciones de los genes (Glass et al., 2009 Nature Methods 6:577).
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a CMV de replicación condicional defectuosa (rdCMV) y el uso de rdCMV en composiciones y métodos de tratamiento y/o disminución de la probabilidad de una infección por CMV o patología asociada con dicha infección en un paciente. El rdCMV descrito en este documento comprende un ácido nucleico que codifica una o más proteínas de fusión que comprenden una proteína esencial fusionada a una proteína desestabilizante. En ausencia de un agente estabilizante, la proteína de fusión de degrada. Por tanto, el rdCMV puede cultivarse en cultivo tisular en condiciones que permiten la replicación (es decir, en presencia del agente estabilizante), pero se reduce la replicación, y preferiblemente se evita, cuando se administra a un paciente (en ausencia del agente estabilizante).
Una realización de la presente invención es un CMV de replicación condicional defectuosa. El rdCMV comprende un ácido nucleico que codifica una o más proteínas de fusión que comprenden una proteína esencial fusionada a una proteína desestabilizante. Los ácidos nucleicos que codifican la proteína esencial de tipo silvestre ya no están presentes en el rdCMV y, por tanto, la proteína de fusión es necesaria para la replicación vírica. En realizaciones preferidas, las proteínas esenciales se seleccionan del grupo que consiste en IE1/2, UL51, UL52, UL79 y UL84 y la proteína desestabilizante es FKBP o un derivado de la misma
Otra realización de la presente invención es una composición que comprende un rdCMV aislado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender adicionalmente un adyuvante que incluye, aunque sin limitación, adyuvante ISCOMATRlX® y adyuvante de fosfato de aluminio.
Otra realización de la presente invención es el uso de la composición de rdCMV para inducir una respuesta inmunitaria contra CMV en un paciente. Los pacientes pueden tratarse profiláctica o terapéuticamente por administración del rdCMV de la presente invención. El tratamiento profiláctico proporciona suficiente inmunidad protectora para reducir la probabilidad o la gravedad de una infección por CMV, incluyendo infecciones primarias, infecciones recurrentes (es decir, aquellas que resultan de la reactivación de CMV latente) y súper-infecciones (es decir, aquellas que resultan de una infección con una cepa diferente de CMV que la previamente experimentada por el paciente). En realizaciones específicas, mujeres en edad fértil, especialmente mujeres en adolescencia temprana, se vacunan para disminuir la probabilidad de infección por CMV (primaria, recurrente o súper-infección) durante el embarazo y, por tanto, disminuye la probabilidad de transmisión de CMV al feto. El tratamiento terapéutico puede realizarse para reducir la duración/gravedad de una infección en curso por CMV.
Otra realización de la presente invención es métodos de preparación del rdCMV de la invención, que comprenden propagar el rdCMV sobre células epiteliales, tales como células ARPE-19 (n.° de acceso a la ATCC CRL-2302), en presencia de Shield-1. En algunas realizaciones, el rdCMV se propaga sobre células epiteliales sobre microvehículos o por otros sistemas de cultivo celular de alta densidad.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A-1B muestran un diagrama esquemático de la construcción de una cepa de CMV con expresión restaurada del complejo gH pentamérico. (A ) Estrategia para la generación de cromosoma artificial bacteriano (BAC) autoescindible para manipular el genoma vírico AD169. (B) Reparación de la mutación de desplazamiento de fase en UL131 para restaurar su expresión. (C) Remplazo de GFP con un gen de recombinasa cre para crear un BAC de CMV autoescindible.
Las figuras 2A-2D muestran el efecto de métodos de inactivación convencional sobre la inmunogenicidad del complejo gH. Se usó radiación-Y (A, B) y p-propiolactona (BPL) (C, D) para inactivar el CMV que expresa el complejo gH. La cinética de inactivación se determinó por ensayo de placas (A, C) mientras que la inmunogenicidad se determinó evaluando los sueros de ratones a los que se ha administrado el CMV para la actividad neutralizante contra la entrada del virus en células epiteliales (B, D).
La figura 3 muestra la producción de virus descendiente dependiente de la concentración de Shield 1 de CMV que expresa el complejo gH con diversas proteínas esenciales fusionadas a un derivado de FKBP. Se infectaron células ARPE-19 con los virus rdCMV a una multiplicidad de 0,01 PFU/célula durante 1 h, se lavaron dos veces con medio fresco y se incubaron en el medio de cultivo que contenía 0, 0,05, 0,1, 0,5 o 2 pM de Shield-1. Siete días después de la infección, se recogió el virus sin células y se determinaron los títulos del virus por ensayo de DICT50 en células ARPE-19 en presencia de 2 pM de Shield 1.
Las figuras 4A-4D muestran la cinética de crecimiento de rdCMV en células ARPE-19. Las células se infectaron con virus que contenían las proteínas de fusión (A ) IE1/2, (B) UL51, (C) IE1/2-UL51 o (D) el virus beMAD precursor a multiplicidad de 0,01 PFU/célula. Después de una hora, las células se lavaron dos veces con medio fresco y se incubaron en ausencia (círculos vacíos) o en presencia (círculos rellenos) de 2 pM de Shield-1. El virus sin células se recogió en los puntos temporales indicados después de la infección, y se cuantificó el virus infeccioso por ensayo de DICT50 en células ARPE-19 en el medio que contenía 2 pM de Shield-1.
Figuras 5A-5E. Cinética del crecimiento del rdCMV IE1/2-UL51 en diferentes tipos celulares. Se infectaron células (A) MRC-5 (B) HUVEC (C) AoSMC (D) SKMC (E) CCF-STTG1 con el virus rdCMV y se incubaron durante 1 hora. Las células se lavaron dos veces con medio fresco y después se incubaron en ausencia (círculos vacíos) o en presencia (círculos rellenos) de 2 pM de Shield-1. Se recogió el virus sin células en los puntos temporales indicados después de la infección, y se cuantificó el virus infeccioso por ensayo de DICT50 en células Ar Pe-19 en el medio que contenía 2 pM de Shield-1.
Figuras 6A-6C. Análisis de inmunogenicidad del rdCMV IE1/2-UL51 en ratones, conejos y macacos de la India. (A ) Los ratones se inmunizaron en las semanas 0 y 4 con beMAD (círculos vacíos) o con rdCMV IE1/2-UL51 (círculos rellenos). (B) Se inmunizaron conejos en las semanas 0, 3 y 8 con 10 pg de beMAD o con rdCMV indicado. (C) Se inmunizaron macacos de la India en las semanas 0 y 8 con 10 pg de beMAD o con rdCMV IE1/2-UL51. En cada caso, se recogieron muestras de suero y se analizaron por ensayo de micro-neutralización de CMV en células ARPE-19. Las líneas indican la media geométrica de los títulos de la neutralización (NT50) en cada grupo.
La figura 7 muestra los títulos neutralizantes longitudinales en macacos de la India vacunados con el virus de fusión doble IE1/2-UL51. Los grupos de monos Rhesus (n=5) se vacunaron con la dosis o formulaciones de vacuna indicadas en la semana 0, 8 y 24 (mostradas como triángulos rojos), mientras que un grupo recibió gb/mf59 (30 mg/dosis) en la semana 0, 4 y 24. Se recogieron los sueros inmunológicos en los puntos temporales indicados y se evaluaron en un ensayo de neutralización vírica. La GMT de los títulos nT50 se representa longitudinalmente con el error típico para el grupo. AAHS: sulfato de hidroxilfosfato de aluminio amorfo; IMX: ISCOMATRIX; HNS; tampón base.
Las figuras 8A-8D muestran ELISPOT de IFN-y en macacos de la India con la vacunación con virus de fusión doble IE1/2-UL51 con 100 pg (A ) o 10 pg (B-D) por dosis. Se usó ningún adyuvante (A-B), AAHS (C) o ISCOMATRIX (D). Se estimularon las PBMC con combinaciones de péptidos que representan los antígenos de HCMV. Las barras grises representan GMT para cada antígeno del grupo (n=5). La tasa de respondedores para cada antígeno se muestra en la parte superior de cada antígeno dentro de los paneles.
Las figuras 9A-9D muestran que la vacunación del virus de fusión doble IE1/2-UL51 es capaz de inducir respuestas de células T de ambos fenotipos CD8+ (A ) y CD4+ (B) en macacos de la India. Se recogieron las PBMC de monos a los que se dio una dosis de 100 pg o 10 pg de vacuna con ISCOMATRIX® como adyuvante. Las PBMC se estimularon con combinaciones de péptidos que representan antígenos de HCMV, seguido por tinción para IFN-y y los marcadores de superficie de células T CD4+/CD8+. Los datos se presentan como la cantidad de células CD4+/CD8+ positivas, IFN-y positivas por millón de PBMC. Las líneas representan las medias geométricas (GMT) del grupo que recibió la misma vacuna (n=5). Los números en la parte inferior de los gráficos representan la GMT de ambos grupos vacunados (n=10). CMV: virus purificado; SEB: mitógeno usado como agente de control positivo; IMX: ISCOMATRIX.
La figura 10 muestra que el adyuvante de fosfato de aluminio de Merck (MAPA) puede potenciar los títulos de anticuerpos neutralizantes en monos. Se inmunizaron monos Rhesus con una dosis de 30 pg de la vacuna de virus de fusión doble formulada en HNS (tampón base), AAHS o MAPA en la semana 0 y 8. Las muestras de suero se recogieron en la semana 12 y se evaluaron para los títulos neutralizantes. Las líneas representan las medias geométricas para el grupo.
Las figuras 11A-11B muestran la estabilidad de CMV que expresa gH en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a diferentes temperaturas. (A ) Se almacenaron muestras de CMV en HBSS a las temperaturas indicadas durante 4 días antes de que se midiera la estabilidad del virus CMV usando un ensayo de entrada de virus. (B) Se calcularon los valores de CE50 para las muestras usando los resultados del ensayo de entrada de virus. * indica que la CE50 no pudo calcularse debido a pérdida completa de infectividad.
Las figuras 12A-12B muestran el efecto del pH sobre la estabilidad del CMV que expresa gH a temperatura ambiente. (A ) Se almacenaron muestras de c Mv en tampones con diferente pH a temperatura ambiente durante 4 días antes de que se midiera la estabilidad del virus CMV usando un ensayo de entrada de virus. (B) Se calcularon los valores de CE50 para las muestras usando los resultados del ensayo de entrada de virus.
Las figuras 13A-13B muestran el efecto de urea en solitario o en combinación con cloruro sódico sobre la estabilidad del virus CMV que expresa gH. (A ) Se añadió urea al 2 % en solitario o en combinación con NaCl 150 mM a CMV en tampón histidina 25 mM, pH 6 a temperatura ambiente durante 4 días antes de que se midiera la estabilidad del virus CMV usando un ensayo de entrada de virus. (B) Se calcularon los valores de CE50 para las muestras usando los resultados del ensayo de entrada de virus.
Las figuras 14A-14B muestran el efecto de la fuerza iónica sobre la estabilidad del virus CMV que expresa gH. (A ) Se añadieron concentraciones crecientes de NaCl (NaCl 0 mM, 75 mM, 150 mM y 320 mM) a CMV en tampón histidina 25 mM, pH 6 a temperatura ambiente durante 4 días antes de que se midiera la estabilidad del virus CMV usando un ensayo de entrada de virus. (B) Se calcularon los valores de CE50 para las muestras usando los resultados del ensayo de entrada de virus.
La figura 15 muestra el efecto de crioprotectores sobre la estabilidad de CMV que expresa gH frente a ciclos de congelación-descongelación. Los crioprotectores indicados se añadieron a CMV en tampón histidina 25 mM, pH 6 y se sometieron a 3 ciclos de congelación-descongelación antes de que se midiera la estabilidad del virus CMV usando un ensayo de entrada de virus. Se calcularon los valores de CE50 para las muestras usando los resultados del ensayo de entrada de virus.
Las figuras 16A-16B muestran el efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la inducción de anticuerpos neutralizantes de CMV en un estudio de inmunogenicidad de ratón. Los ratones se inmunizaron en el día 0 y se reforzaron en el día 21 seguido por extracción de sangre en el día 28. El suero del ratón se ensayó para anticuerpos neutralizantes contra un CMV que expresa gH usando células ARPE-19. Los títulos NT50 se obtuvieron por ajuste de curva no lineal. (A ) Las muestras de CMV se almacenaron a diferentes temperaturas durante 3 meses antes del estudio de inmunogenicidad. (B) Las muestras de CMV se almacenaron a diferentes temperaturas durante 8 horas después de la descongelación y antes del estudio de inmunogenicidad.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a CMV de replicación condicional defectuosa (rdCMV) y el uso de rdCMV en composiciones y métodos de tratamiento y/o disminución de la probabilidad de una infección por CMV o por una patología asociada con dicha infección en un paciente. El rdCMV descrito en este documento codifica una o más proteínas de fusión que comprenden una proteína esencial fusionada a una proteína desestabilizante en lugar de la proteína esencial de tipo silvestre. En ausencia de un agente estabilizante, la proteína de fusión se degrada por la maquinaria de la célula hospedadora. En presencia de un agente estabilizante, la proteína de fusión se estabiliza y no se degrada.
Las proteínas de fusión adecuadas para su uso en la presente invención retienen suficiente actividad de la proteína esencial para facilitar la replicación del virus en una célula hospedadora en presencia de un agente estabilizante y para causar una disminución (preferiblemente mayor de un 50 %, 75 %, 90 %, 95 % o 99 % de reducción) en la replicación de CMV en ausencia de un agente estabilizante. Preferiblemente, la proteína esencial para su uso en la proteína de fusión codifica proteínas no estructurales y no se empaquetan, por tanto, en los viriones de rdCMV. Las proteínas esenciales adecuadas identificadas en este documento incluyen las proteínas de CMV codificadas por los genes esenciales IE1/2, UL51, UL52, UL79 y UL84.
Un ejemplo de una proteína desestabilizante y un agente estabilizante se describe en la publicación de patente de Estados Unidos 2009/0215169 que describe composiciones, sistemas y métodos de modulación de la estabilidad de proteínas usando una molécula pequeña. En resumen, se fusiona una proteína a una proteína que afecta a la estabilidad, FKBP o un derivado de la misma. Una molécula pequeña de permeabilidad celular añadida de forma exógena, Shield-1 (Shld-1), interactúa con la FKBP o con el derivado de la misma y estabiliza la proteína de fusión. En ausencia de Shield-1, la FKBP o el derivado de la misma dirige la proteína de fusión para degradarse por la maquinaria de la célula hospedadora.
En una realización de la presente invención, una proteína de CMV esencial se fusiona a una FKBP o a un derivado de la misma. En presencia de Shield-1, la proteína de fusión se estabiliza. Sin embargo, en ausencia de Shield-1, la FKBP o el derivado de misma dirige a la proteína para degradarse por la maquinaria de la célula hospedadora. En ausencia de proteína de fusión, se reduce la replicación de rdCMV (preferiblemente en más de un 50 %, 75 %, 90 %. 95 % o 99 % en comparación con CMV que no contiene una proteína esencial desestabilizada) o se evita. El virus recombinante a usarse en el método de la invención también presenta un complejo gH pentamérico inmunogénico en su virión.
Las realizaciones también incluyen el CMV recombinante o composiciones del mismo, descrito en este documento, o una vacuna que comprende o consiste en dicho CMV o composiciones (i) para su uso en, (ii) para su uso como medicamento para, o (iii) para su uso en la preparación de un medicamento para: (a) terapia (por ejemplo, del organismo humano); (b) medicina; (c) inhibición de la replicación de CMV; (d) tratamiento o profilaxis de infección por CMV o, (e) tratamiento, profilaxis o retardo de la aparición o progresión de una o más enfermedades asociadas a CMV. En estos usos, el CMV recombinante, composiciones del mismo y/o vacunas que comprenden o consisten en dicho CMV o composiciones pueden emplearse opcionalmente en combinación con uno o más agentes antivíricos (por ejemplo, compuestos antivíricos o inmunoglobulinas antivíricas; vacunas de combinación, descritas infra). Como se usa en este documento, la expresión "induce una respuesta inmunitaria" se refiere a la capacidad de un CMV de replicación condicional defectuosa de producir una respuesta inmunitaria en un paciente, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, al que se administra, donde la respuesta incluye, aunque sin limitación, la producción de elementos (tales como anticuerpos) que se unen específicamente, y preferiblemente neutralizan, CMV y/o causan la activación de células T. Una "respuesta inmunitaria protectora" es una respuesta inmunitaria que reduce la probabilidad de que un paciente contraiga una infección por CMV (incluyendo infección primaria, recurrente y/o súper-infección) y/o mejora al menos una patología asociada con infección por CMV y/o reduce la gravedad/duración de la infección por CMV.
Como se usa en este documento, la expresión "una cantidad inmunológicamente eficaz" se refiere a la cantidad de un inmunógeno que puede inducir una respuesta inmunitaria contra CMV cuando se administra a un paciente que puede proteger al paciente de una infección por CMV (incluyendo infecciones primarias, recurrentes y/o súperinfecciones) y/o mejora al menos una patología asociada con infección por CMV y/o reduce la gravedad/duración de la infección por CMV en el paciente. La cantidad debe ser suficiente para reducir significativamente la probabilidad o la gravedad de una infección por CMV. Pueden usarse modelos animales conocidos en la técnica para evaluar el efecto protector de la administración del inmunógeno. Por ejemplo, pueden ensayarse sueros inmunológicos o células T inmunitarias de individuos a los que se ha administrado el inmunógeno para la capacidad neutralizante por anticuerpos o por células T citotóxicas o la capacidad de producción de citoquinas por células T inmunitarias. Los ensayos habitualmente usados para dichas evaluaciones incluyen, aunque sin limitación, ensayo de neutralización de virus, ELISA de antígeno antivírico, ELISA de citoquina interferón-gamma, ELISPOT de interferón-gamma, tinción intracelular de múltiples citoquinas (ICS) y ensayo de citotoxicidad de liberación de 51cromo. También pueden usarse modelos animales de exposición para determinar una cantidad inmunológicamente eficaz de inmunógeno.
Como se usa en este documento, la expresión "virus de replicación condicional defectuosa" se refiere a partículas víricas que pueden replicarse en ciertos entornos, pero no en otros. En realizaciones preferidas, se hace que un virus sea un virus de replicación condicional defectuosa por desestabilización de una o más proteínas esenciales para la replicación del virus. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas esenciales no desestabilizadas de tipo silvestre ya no están presentes en el virus de replicación condicional defectuosa. En condiciones donde se desestabilizan la uno o más proteínas esenciales, la replicación del virus se disminuye en preferiblemente más de un 50 %, 75 %, 90 %. 95 %, 99 % o 100 % en comparación con un virus con proteínas esenciales no desestabilizadas. Sin embargo, en condiciones que estabilizan las proteínas esenciales desestabilizadas, la replicación del virus se puede producir a preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de la cantidad de replicación de un CMV que no contiene una proteína esencial desestabilizada. En realizaciones más preferidas, se desestabiliza una o más proteínas esenciales por fusión con una proteína desestabilizante, tal como FKBP o un derivado de la misma. Dichas proteínas de fusión pueden estabilizarse por la presencia de un agente estabilizante tal como Shield-1. Como se usa en este documento, el término "rdCMV" se refiere a un citomegalovirus de replicación condicional defectuosa.
En realizaciones preferidas, la respuesta inmunitaria inducida por un virus de replicación defectuosa en comparación con su equivalente de virus vivo es igual o sustancial similar en grado y/o en amplitud. En otras realizaciones preferidas, la morfología de un virus de replicación defectuosa por análisis de microscopia electrónica es indistinguible o sustancialmente similar a su equivalente de virus vivo.
Como se usa en este documento, el término "FKBP" se refiere a una proteína desestabilizante de la SEQ ID NO:11. Las proteínas de fusión que contienen FKBP se degradan por la maquinaria de la célula hospedadora. Como se usa en este documento, la expresión "derivado de FKBP" se refiere a una proteína FKBP o parte de la misma que se ha alterado por una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos. Los derivados de FKBP retienen sustancialmente todas las propiedades desestabilizantes de FKBP cuando se fusionan a una proteína y también retienen sustancialmente toda la capacidad de FKBP de estabilizarse por Shield-1. Los derivados preferidos de FKBP tienen una o más de las siguientes sustituciones en las posiciones indicadas de aminoácidos F15S, V24A, H25R, F36V, E60G, M66T, R71G, D100G, D100N, E102G, K105I y L106P. El derivado de FKBP que tiene las sustituciones F36V y L106P (SEQ ID NO:12) es particularmente preferido. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico que codifica la FKBP o el derivado de FKBP contiene al menos algunos codones que no se usan habitualmente en seres humanos para FKBP endógena. Esto disminuye la probabilidad de que la FKBP o el derivado de FKBP de la proteína de fusión se reordene o recombine con su equivalente en el genoma humano. La secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:13 codifica la SEQ ID NO:12 usando dichos codones.
Como se usa en este documento, los términos " Shield-1" o "Shld1" se refieren a una molécula pequeña sintética que se une a FKBP de tipo silvestre y derivados de la misma y actúa como agente estabilizante. La unión es aproximadamente 1000 veces más fuerte al derivado F36V en comparación con FKBP de tipo silvestre (Clackson et al., 1998, PNAS 95:10437-42). Shield-1 puede sintetizarse (esencialmente como se describe en Holt et al., 1993, J. Am. Chem. Soc. 115:9925-38 y Yang et al., 2000, J. Med. Chem. 43:1135-42 y Grimley et al., 2008, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18:759) o está disponible en el mercado en Cheminpharma LLC (Farmington, CT) o Clontech Laboratories, INC. (Mountain View, cA). También pueden usarse sales de Shield-1 en los métodos de la invención. Shield-1 tiene la siguiente estructura:
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Como se usa en este documento, los términos "fusionado" o "proteína de fusión" se refiere a dos polipéptidos ordenados en fase como parte de la misma secuencia contigua de aminoácidos. La fusión puede ser directa de modo que no haya restos de aminoácido adicionales entre los polipéptidos o indirecta de modo que haya un pequeño conector de aminoácidos para mejorar el rendimiento y añadir funcionalidad. En realizaciones preferidas, la fusión es directa.
Como se usa en este documento, las expresiones "complejo gH pentamérico" o "complejo gH" se refieren a un complejo de cinco proteínas víricas sobre la superficie del virión de CMV. El completo está compuesto de proteínas codificadas por UL128, UL130, y UL131 ensambladas en una estructura gH/gL (Wang y Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA. 102:1815; Ryckman et al., 2008 J. Virol. 82:60). Las secuencias de las proteínas complejas de la cepa de CMV AD 169 se muestran en los n.° de acceso a GenBank NP_783797.1 (UL128), NP_040067 (UL130), CAA35294.1 (UL131), NP_040009 (gH, también conocida como UL75) y NP_783793 (gL, también conocida como UL115). Algunas cepas atenuadas de CMV tienen una o más mutaciones en UL131 de modo que la proteína no se expresa y, por lo tanto, no se forma el complejo gH. En dichos casos, UL131 debe repararse (usando métodos tales como los de Wang y Shenk, 2005 J. Virol. 79:10330) de modo el complejo gH se exprese en el rdCMV de la invención. Los virus de la presente invención expresan las cinco proteínas víricas que componen el completo gH pentamérico y ensamblan el complejo gH pentamérico en la envuelta vírica.
Como se usa en este documento, la expresión "proteína esencial" se refiere a una proteína vírica que es necesaria para la replicación vírica in vivo y en cultivo tisular. Los ejemplos de proteínas esenciales en CMV incluyen, aunque sin imitación, IE1/2, UL37x1, UL44, UL51, UL52, UL53, UL56, UL77, UL79, UL84, UL87 y UL105.
Como se usa en este documento, la expresión "proteína esencial desestabilizada" se refiere a una proteína esencial que se expresa y realiza su función en la replicación vírica y se degrada en ausencia de un agente estabilizante. En realizaciones preferidas, la proteína esencial se fusiona a una proteína desestabilizante tal como FKBP o un derivado de la misma. En condiciones normales de crecimiento (es decir, sin un agente estabilizante presente) la proteína de fusión se expresa, pero se degrada por la maquinaria de la célula hospedadora. La degradación no permite que la proteína esencial funcione en la replicación vírica, por tanto, la proteína esencial se anula funcionalmente. En condiciones donde está presente un agente estabilizante tal como Shield-1, la proteína de fusión se estabiliza y puede realizar su función a un nivel que puede mantener la replicación vírica que es preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de la cantidad de replicación de un CMV que no contiene una proteína esencia desestabilizada.
CMV de replicación defectuosa
Los métodos de la presente invención usan un CMV de replicación defectuosa (rdCMV) que expresa el complejo gH pentamérico. Cualquier virus CMV atenuado que exprese en complejo gH pentamérico puede hacerse de replicación defectuosa de acuerdo con los métodos de la invención. En una realización, el CMV atenuado es AD 169 que ha restaurado la expresión del complejo gH debido a una reparación de una mutación en el gen UL131 (véase el ejemplo 1).
Los virus de replicación condicional defectuosaes son mutantes en que una o más proteínas víricas esenciales se han remplazado por un equivalente desestabilizado de las proteínas esenciales. El equivalente desestabilizado está codificado por un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión entre la proteína esencial y una proteína desestabilizante. La proteína esencial desestabilizada solamente puede funcionar manteniendo la replicación vírica cuando está presente un agente estabilizante. En realizaciones preferidas, se usan los métodos descritos en la publicación de patente de Estados Unidos 2009/0215169 para conferir un fenotipo de replicación condicional defectuosa a un CMV que expresa el complejo gH pentamérico. En resumen, se fusionan una o más proteínas esenciales para la replicación de CMV a una proteína desestabilizante, una FKBP o derivado de FKBP. Los ácidos nucleicos que codifican la proteína esencial de tipo silvestre ya no están presenten en el rdCMV. En presencia de un agente estabilizante de molécula pequeña permeable en las células añadido de forma exógena, Shield-1 (Shld-1), la proteína de fusión se estabiliza y la proteína esencial puede funcionar manteniendo la replicación vírica. La replicación del rdCMV en presencia de un agente estabilizante es preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de la cantidad de un CMV que no contiene una proteína de fusión desestabilizante (por ejemplo, el CMV atenuado precursor usado para construir el rdCMV). En ausencia de Shield-1, la proteína desestabilizante de la proteína de fusión dirige la proteína de fusión para degradarse sustancialmente por la maquinaria de la célula hospedadora. Sin proteína esencial presente o con cantidades mínimas de proteína esencial presentes, el CMV no puede replicarse a una cantidad para producir o mantener una infección por CMV en un paciente. La replicación del rdCMV en ausencia del agente estabilizante no tiene lugar o se reduce en preferiblemente más de un 50 %, 75 %, 90 %, 95 %, o 99 % en comparación con un CMV que no contiene una proteína de fusión desestabilizante (por ejemplo, el CMV atenuado precursor usado para construir el rdCMV).
Usando los métodos de ADN recombinante bien conocidos en la técnica, el ácido nucleico que codifica una proteína esencial para la replicación de CMV y/o el establecimiento/mantenimiento de la infección por CMV se une a un ácido nucleico que codifica FKBP o un derivado de la misma. La proteína de fusión codificada comprende la FKBP o derivado de FKBP fusionado basado en la proteína esencial. La proteína de fusión codificada es estable en presencia de Shield-1. Sin embargo, la proteína de fusión codifica se desestabiliza en ausencia de Shield-1 y se dirige a su destrucción. En realizaciones preferidas, la FKBP es de la SEQ ID NO: 11. En otras realizaciones preferidas, el derivado de FKBP es FKBP que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: F15S, V24A, H25R, F36V, E60G, M66T, R71G, D100G, D100N, E102G, K105I y L106P. En una realización más preferida, el derivado de FKBP comprende las sustituciones F36V y/o L106P (SEQ ID NO: 12). En una realización más preferida, el derivado de FKBP está codificado por la SEQ ID NO: 13.
Las proteínas esenciales dirigidas para su desestabilización por fusión con FKBP o un derivado de la misma 1) son esenciales para la replicación vírica; 2) pueden acomodar la fusión de la proteína desestabilizante sin alterar sustancialmente la función de la proteína esencial; y 3) pueden acomodar la inserción de un ácido nucleico que codifica la FKBP o derivado de la misma en el extremo 5' o 3' de la ORF vírica que codifica la proteína esencial sin alterar sustancialmente las ORF de otros genes víricos adyacentes. En realizaciones preferidas, las proteínas esenciales dirigidas para su desestabilización por fusión con FBBP o un derivado de la misma codifican proteínas no estructurales y, por tanto, tienen una probabilidad disminuida de empaquetarse en viriones de CMV recombinantes. La tabla 1 muestra los genes de CMV que cumplen los criterios mencionados anteriormente.
T l 1 n íri l i n r l n r i n l f i n n FKBP
Figure imgf000008_0001
La presente invención abarca rdCMV que comprende proteínas de fusión con una proteína esencial o derivado de la misma fusionada a la proteína desestabilizante. Los derivados de proteína esencial contienen una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos respecto a la proteína esencial de tipo silvestre, aunque aún pueden proporcionar la actividad de la proteína esencial al menos suficientemente bien para mantener la replicación vírica en presencia de Shield-1. Los ejemplos de medición de la actividad del virus se proporcionan en los ejemplos infra. Pueden usarse métodos conocidos en la técnica para determinar el grado de diferencia entre la proteína esencial de CMV de interés y un derivado. En una realización, la identidad de secuencia se usa para determinar la relación. Los derivados de la invención serán preferiblemente al menos un 85 % idénticos, al menos un 90 % idénticos, al menos un 95 % idénticos, al menos un 97 % idénticos, al menos un 99 % idénticos a la secuencia de bases. El porcentaje de identidad se define como la cantidad de restos idénticos dividida por la cantidad total de restos y multiplicada por 100. Si las secuencias en la alineación son de diferentes longitudes (debido a huecos o extensiones), se usará la longitud de la secuencia más larga en el cálculo, que representa el valor de la longitud total.
En algunas realizaciones, la una o más proteínas víricas esenciales para la replicación vírica dirigidas para su desestabilización se seleccionan del grupo que consiste en IE1/2, UL51, UL52, UL84, UL79, UL87, UL37x 1, UL77 y UL53 o derivados de las mismas. En una realización específica, la una o más proteínas víricas esenciales para la replicación vírica dirigidas para su desestabilización se seleccionan del grupo que consiste en IE1/2, UL51, UL52, UL84, UL79, UL87. En una realización más específica, la una o más proteínas víricas esenciales para la replicación vírica dirigidas para su desestabilización se seleccionan del grupo que consiste en IE1/2, UL51, UL52, UL79 y UL84. Puede desestabilizarse más de una proteína esencial por fusión a FKBP o derivado de la misma. En algunas realizaciones, las proteínas esenciales funcionan en diferentes fases de la replicación y/o infección de CMV (incluyendo, aunque sin limitación, la fase temprana inmediata, temprana o tardía). En realizaciones preferidas, la combinación de proteínas víricas esenciales para la replicación vírica dirigidas para su desestabilización, se seleccionan del grupo que consiste en IE1/2 y UL51, IE1/2 y UL52, IE1/2 y UL79, IE1/2 y UL84, UL84 y UL51 y UL84 y UL52. En una realización más preferida, IE1/2 y UL51 se dirigen para su desestabilización en el mismo CMV recombinante. En una realización mucho más preferida la proteína de fusión que comprende IE1/2 es la SEQ ID NO: 1 y la proteína de fusión que comprende UL51 es la SEQ ID NO: 3. Las SEQ ID NO: 1 y 3 pueden estar codificadas por las SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente. El genoma del rdCMV con IE1/2 y UL51 desestabilizadas se muestra en la SEQ ID NO: 14.
La FKBP o derivado de la misma puede fusionarse a la proteína esencial directa o indirectamente. En realizaciones preferidas, la FKBP o derivado de la misma se fusiona a la proteína esencial directamente.
La FKBP o derivado de la misma puede fusionarse a la proteína esencial en cualquiera de los extremos N o C-terminal de la proteína esencial. En realizaciones preferidas la FKBP se fusiona al extremo N-terminal de la proteína esencial.
Puede fusionarse más de una FKBP o derivado de la misma a la proteína esencial. En realizaciones donde hay más de una FKBP o derivado de la misma fusionada a la proteína esencial, cada una de las FKBP o derivados de la misma individuales puede ser igual o diferente. En realizaciones preferidas, hay una FKBP o derivado de la misma fusionada a la proteína esencial.
Métodos de inactivación adicional
En algunas realizaciones, el rdCMV descrito supra se inactiva usando una inactivación química o física. Los ejemplos de ello incluyen tratamiento térmico, incubación con formaldehído, p-propiolactona (BPL) o etilenimina binaria (BEI) o radiación gamma. Los métodos preferidos no alteran o alteran sustancialmente la inmunogenicidad, incluyendo, aunque sin limitación la inmunogenicidad inducida por el complejo gH pentamérico. Por tanto, la respuesta inmunitaria provocada por el CMV que se ha inactivado adicionalmente se conserva o se conserva sustancialmente en comparación con el rdCMV sin tratamiento de inactivación adicional. En realizaciones preferidas, la capacidad del CMV inactivado adicional de inducir anticuerpos neutralizantes es comparable con los inducidos por rdCMV sin tratamiento de inactivación adicional. El régimen de inactivación por uno cualquiera o una combinación de los métodos químicos o físicos se determina empíricamente para asegurar la inmunogenicidad de CMV, incluyendo el complejo gH pentamérico.
Evaluación de la replicación vírica
Un experto en la materia puede usar ensayos de replicación vírica para determinar la utilidad de una proteína esencial particular fusionada a FKBP o derivado de la misma. Como la expresión génica/función del producto codificado no debe verse sustancialmente afectado por la unión de la FKBP o derivado de la misma a la proteína esencial en presencial de Shield-1, el rdCMV debe replicarse a una tasa que sea comparable con el CMV precursor en presencia de Shield-1 (preferiblemente al menos un 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de los niveles del virus precursor). La replicación del rdCMV está sustancialmente alterado del CMV precursor en ausencia de Shield-1 (reducida en preferiblemente más de un 50 %, 75 %, 90 %. 95 %, 99 % o 100 % en comparación con un CMV que no contiene una proteína de fusión desestabilizante).
En realizaciones preferidas el rdCMV en presencia de al menos Shield-1 2 pM se replica preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, muchos más preferiblemente al menos un 99 %, de la cantidad en que se replica un CMV que no es rd.
En una realización, una composición que comprende el rdCMV de la invención tiene un título vírico del menos 105 ufp/ml, o más preferiblemente al menos 107 ufp/ml en presencia de al menos Shield-1 2 pM.
A la inversa, rdCMV no debe replicase sustancialmente en ausencia de Shield-1. La cualidad de un mecanismo de replicación defectuoso se juzga por lo riguroso que es el control en las condiciones no permisivas para la replicación vírica, es decir, los títulos infecciosos de viriones descendientes en estas condiciones. El rdCMV de la presente invención no puede replicarse sustancialmente (en cultivo celular o dentro de un paciente) sin Shield-1 presente. Su replicación en células ARPE-19 y otros tipos de células primarias humanas es condicional y se requiere una concentración molar de Shield-1 mayor de 0,1 j M, preferiblemente al menos 2 j M en el medio de cultivo para mantener la replicación vírica.
En una realización, una composición que comprende el rdCMV de la invención tiene un título vírico de menos de 2 ufp/ml, más preferiblemente menos de 1 ufp/ml en ausencia de Shield-1.
Los métodos para evaluar la replicación de CMV pueden usarse para evaluar la replicación de rdCMV en ausencia o presencia de Shield-1. Sin embargo, en realizaciones preferidas, se usa la DICT50.
En otra realización, los títulos de rdCMV se determinan por un ensayo de dosis infecciosa de cultivo tisular al 50 % (DICT50). En resumen, este ensayo de dilución cuantifica la cantidad de virus necesaria para eliminar el 50 % de los hospedadores infectados. Las células hospedadoras (por ejemplo, células ARPE-19) se siembran en placa y se añaden diluciones en serie del virus. Después de la incubación, se observa el porcentaje de células muertas (es decir, células infectadas) y se registra para cada dilución de virus. Los resultados se usan para calcular matemáticamente la DICT50.
En otra realización los títulos de rdCMV se determinan usando un ensayo de placa. Los ensayos de placa vírica determinan la cantidad de unidades formadoras de placa (ufp) en una muestra de virus. En resumen, se infecta una monocapa confluyente de células hospedadoras (por ejemplo, células ARPE-19) con el rdCMV a diluciones variables y se cubre con un medio semisólido, tal como agar o carboximetilcelulosa, para evitar que la infección del virus se propague indiscriminadamente. Se forma una placa vírica cuando un virus infecta una célula dentro de la monocapa celular fija. La célula infectada con virus lisará y propagará la infección a las células adyacentes donde se repite el ciclo de infección a lisis. El área celular infectada creará una placa (un área de infección rodeada por células no infectadas) que puede observarse visualmente o con un microscopio óptico. Las placas se cuentan y los resultados, en combinación con el factor de dilución usado para preparar la placa, se usan para calcular la cantidad de unidades formadoras de placas por volumen unitario de muestra (ufp/ml). El resultado de ufp/ml representa la cantidad de partículas infecciosas dentro de la muestra y se basa en la suposición de que cada placa formada es representativa de una partícula vírica infecciosa.
En otra realización, se usa un modelo de ratón hu-SCID para evaluar la capacidad de un rdCMV de replicarse in vivo. En resumen, se implantan quirúrgicamente trozos de tejidos fetales humano (tales como timo e hígado) en cápsulas renales de ratones SCID. El rdCMV se inocula 2-3 meses después cuando se vascularizan los tejidos humanos. Los títulos víricos se evalúan 3-4 semanas después de la inoculación en ensayos de placa. Los experimentos animales pueden realizarse en ausencia o presencia de Shield-1.
Evaluación de la respuesta inmunitaria
La administración de rdCMV de la invención a un paciente provoca una respuesta inmunitaria contra CMV, preferiblemente una respuesta inmunitaria protectora, que puede tratar y/o disminuir la probabilidad de una infección por CMV o patología asociada con dicha infección en un paciente. La respuesta inmunitaria es, al menos en parte, contra el complejo gH pentamérico.
La respuesta inmunitaria provocada por el rdCMV puede evaluarse usando métodos conocidos en la técnica.
Pueden usarse modelos animales conocidos en la técnica para evaluar el efecto protector de la administración del rdCMV. En una realización, puede ensayarse el suero inmunológico de individuos a los que se ha administrado el rdCMV para la capacidad neutralizante, incluyendo, aunque sin limitación, el bloqueo de la adhesión vírica o la entrada a una célula hospedadora. En otras realizaciones, pueden ensayarse las células T de los individuos a los que se ha administrado el rdCMV para la capacidad de producción de citoquinas incluyendo, aunque sin limitación, interferón gamma, en presencia de un antígeno de interés. También pueden usarse modelos de exposición animales para determinar una cantidad inmunológicamente eficaz de inmunógeno.
La neutralización vírica se refiere a anticuerpos específicos de virus capaces de interrumpir la entrada del virus y/o su replicación en los cultivos. El ensayo común para medir las actividades neutralizantes es el ensayo de reducción de placas víricas. Los ensayos de neutralización en esta invención se refieren a titulaciones de suero que pueden bloquear los virus que entran en las células. Los títulos NT50 se definen como las diluciones en suero reciprocas que bloquean el 50 % de la entrada del virus en ensayos de neutralización vírica. Los títulos NT50 se obtienen de un ajuste de curva de cuatro parámetros lógica no lineal.
Fabricación de CMV de replicación defectuosa
La presente invención abarca métodos de preparación del rdCMV. El rdCMV de la invención se propaga en presencia de un agente estabilizante tal como Shield-1 sobre células epiteliales, preferiblemente células epiteliales humanas y más preferiblemente células epiteliales pigmentadas de la retina humana. En realizaciones adicionales, las células epiteliales pigmentadas de la retina humana son células ARPE-19 depositadas en la American Type Culture Collection (ATCc ) como el n.° de acceso CRL-2302. En algunas realizaciones, Shield-1 está presente a una concentración de al menos 0,5 pM en el medio de cultivo tisular. En realizaciones preferidas, Shield-1 está presente a una concentración de al menos 2,0 pM en el medio de cultivo tisular.
En algunas realizaciones, las células usadas para propagar el rdCMV se cultivan en microvehículos. Un microvehículo es una matriz de soporte que permite el crecimiento de células adherentes en matraces de centrifugación o biorreactores (tal como biorreactores de microgravedad de pared rotatoria y biorreactores de lecho fluido). Los microvehículos son normalmente esferas de 125-250 pM con una densidad que les permite mantenerse en suspensión con agitación suave. Los microvehículos pueden prepararse a partir de varios materiales diferentes incluyendo, aunque sin limitación, DEAE-dextrano, vidrio, plástico de poliestireno, acrilamida y colágeno. Los microvehículos pueden tener diferentes químicas superficiales incluyendo, aunque sin limitación, proteínas de matriz extracelular, proteínas recombinantes, péptidos y moléculas cargadas. También pueden usarse otros sistemas de cultivo celular de alta densidad, tales como los sistemas Corning HyperFlask® e HyperStack®.
El medio de cultivo tisular sin células puede recogerse y puede purificarse el rdCMV del mismo. Las partículas víricas de CMV son de aproximadamente 200 nm de diámetro y pueden separarse de otras proteínas presenten en el medio recogido usando técnicas conocidas en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, ultracentrifugación a través de un gradiente de densidad o un lecho de sorbitol al 20 %. La masa de la proteína de las vacunas puede determinarse por ensayo de Bradford.
Shield-1 puede usarse para controlar la replicación del rdCMV junto con FKBP. Después de completarse la cantidad deseada de propagación vírica en las células de cultivo tisular, ya no es deseable la capacidad de replicación. Shield-1 se extrae del rdCMV para hacer al virus de replicación defectuosa (por ejemplo, para administrase a un paciente). En una realización, el rdCMV se purifica de Shield-1 lavando una o más veces. En otra realización, el rdCMV se purifica de Shield-1 a través de ultracentrifugación. En otra realización, el rdCMV se purifica de Shield-1 a través de diafiltraciones. Las diafiltraciones se usan habitualmente para purificar las partículas víricas. En una realización, los filtros se usan con un tamaño de poro de aproximadamente 750 kDa que permitiría solamente que Shield-1 pasara a través de los poros.
Después de la purificación de rdCMV de Shield-1, puede haber una pequeña cantidad de Shield-1 residual que queda en la composición de rdCMV. En una realización, el nivel de Shield-1 en la composición de CMV después de la purificación es al menos 100 veces por debajo del nivel necesario para mantener la replicación en cultivo tisular. En otra realización, el nivel de Shield-1 en la composición de rdCMV después de la purificación es 0,1 pM o menos. En otra realización, el nivel de Shield-1 en la composición de rdCMV después de la purificación es indetectable. La determinación de los niveles de Shield-1 en una composición puede detectarse usando ensayos de LC/MS (cromatografía líquida/espectroscopia de masas) o HPLC/MS (cromatografía líquida de alta rendimientoespectroscopia de masas). Estas técnicas combinan las capacidades de separación física de LC o HPLC con las capacidades de análisis de masa y pueden detectarse agentes químicos de interés en mezclas complejas.
Adyuvantes
Los adyuvantes son sustancias que pueden ayudar a que un inmunógeno produzca una respuesta inmunitaria. Los adyuvantes pueden funcionar por diferentes mecanismos tales como uno o más de los siguientes: aumentando la semivida biológica o inmunológica del antígeno; mejorando el suministro del antígeno a las células presentadoras de antígeno; mejorando el procesamiento y la presentación del antígeno por la células presentadoras de antígeno; consiguiendo ahorro de la dosis e induciendo la producción de citoquinas inmunomoduladoras (Vogel, 2000, Clin Infect Dis 30:S266). En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden un rdCMV y un adyuvante.
Pueden emplearse diversos tipos diferentes de adyuvantes para ayudar en la producción de una respuesta inmunitaria. Los ejemplos de adyuvantes particulares incluyen hidróxido de aluminio; fosfato de aluminio, hidroxifosfato de aluminio, adyuvante de sulfato de hidroxifosfato de aluminio amorfo (AAHSA) u otras sales de aluminio; fosfato cálcico; motivos CpG de ADN; monofosforil lípido A; toxina colérica; toxina termoinestable de E. coli; toxina pertussis; muramil dipéptido; adyuvante incompleto de Freund ; MF59; SAF; complejos inmunoestimuladores; liposomas; microesferas biodegradables; saponinas; copolímeros de bloques no iónicos; análogos de muramil péptido; polifosfazeno; polinucleótidos sintéticos; IFN-y; IL-2; IL-12; e ISCOM (Vogel, 2000, Clin Infect Dis 30:S266; Klein et al., 2000, J Pharm Sci 89:311; Rimmelzwaan et al., 2001, Vaccine 19:1180; Kersten, 2003, Vaccine 21:915; O'Hagen, 2001, Curr. Drug Target Infect. Disord. 1:273).
En algunas realizaciones, no se usan adyuvantes de base oleosa incluyendo, aunque sin limitación, adyuvante incompleto de Freund y MF59, en las composiciones de la invención.
En otras realizaciones, se usan adyuvantes particulados incluyendo, aunque sin limitación, adyuvante ISCOMATRIX® y/o adyuvante de fosfato de aluminio en las composiciones de la invención.
Composiciones farmacéuticas
Una característica adicional de la invención es el uso de un CMV recombinante descrito en este documento en una composición, preferiblemente una composición inmunogénica o vacuna, para tratar a pacientes con una infección por CMV y/o reducir la probabilidad de una infección por CMV. Adecuadamente, la composición comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se entiende que un "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un relleno líquido, diluyente o sustancia de encapsulación que puede usarse de forma segura en la administración sistémica. Dependiendo de la vía particular de administración, pueden usarse diversos vehículos farmacéuticamente aceptables, bien conocidos en la técnica. Estos vehículos pueden seleccionarse de un grupo que incluye azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato cálcico, aceites vegetales, aceites sintéticos, polioles, ácido algínico, soluciones tamponadas con fosfato incluyendo solución salina tamponada con fosfato, emulsionantes, solución salina isotónica y agua apirógena. En particular, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener diferentes componentes tales como un tampón, agua estéril para infección, solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato, sacarosa, histidina, sales y polisorbato. Las expresiones tales como "fisiológicamente aceptable", "diluyente" o "excipiente" pueden usarse de forma intercambiable.
Los procedimientos para las formulaciones de vacuna se describen, por ejemplo, en New Generation Vaccines (1997, Levine et al., Marcel Dekker, Inc. Nueva York, Basilea, Hong Kong), que se incorpora en este documento por referencia.
Formulaciones
En algunas realizaciones, el rdCMV de la invención se administra a un paciente para provocar una respuesta inmunitaria. Es deseable minimizar o evitar la pérdida de la potencia de la composición de rdCMV durante el almacenamiento de la composición inmunogénica. Las condiciones para mantener dicho objetivo incluyen, aunque sin limitación, (1) estabilidad mantenida en almacenamiento, (2) resistencia a ciclos acentuados de congelacióndescongelación, (3) estabilidad a temperaturas ambientales durante hasta una semana, (4) mantenimiento de inmunogenicidad, (5) compatibilidad con estrategia adyuvante. Las condiciones que afectan a la estabilidad del rdCMV incluyen, aunque sin limitación, pH del tampón, fuerza iónica del tampón, presencia/ausencia de excipientes particulares y temperatura. Las composiciones comprenden tampones para aumentar la estabilidad de las partículas víricas de rdCMV purificadas adecuadas como composición de vacuna.
La conservación de la integridad de las partículas víricas puede evaluarse por ensayos de inmunogenicidad en ratones y/o ensayos de entrada de virus. Los eventos de entrada de virus dependen de la integridad y de las funciones de las glucoproteínas víricas, incluyendo el complejo gH pentamérico. El complejo gH pentamérico también proporciona la inmunogenicidad sustancial de rdCMV, por tanto, las dos propiedades están vinculadas. En algunas realizaciones, el rdCMV se almacena en tampón que comprende histidina 15-35 mM y NaCl 100-200 mM a un pH entre 5 y 7. En una realización más específica, el tampón comprende histidina 25 mM y NaCl 150 mM a pH 6.
En otras realizaciones, pueden añadirse azucares para proporcionar estabilidad adicional, tales como polioles (incluyendo, aunque sin limitación, manitol y sorbitol); monosacáridos (incluyendo, aunque sin limitación, glucosa, manosa, galactosa y fructosa); disacáridos (incluyendo, aunque sin limitación, lactosa, maltosa, sacarosa, lactulosa y trehalosa) y trisacáridos (incluyendo, aunque sin limitación, rafinosa y melecitosa). En una realización más específica, el azúcar es sacarosa. En una realización incluso más específica, la sacarosa está entre un 5-15 %. En realizaciones preferidas, el rdCMV se almacena en tampón que comprende histidina 25 mM, NaCl 150 mM, sacarosa al 9 % a pH 6.
Administración
Un rdCMV descrito en este documento puede formularse y administrarse a un paciente usando las directrices proporcionadas en este documento junto con técnicas bien conocidas en la técnica. Las directrices para la administración farmacéutica en general se proporcionan en, por ejemplo, Vaccines Eds. Plotkin and Orenstein, W.B. Sanders Company, 1999; Remington's Pharmaceutical Sciences 20.a Edición, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 2000; y Modern Pharmaceutics 2.a Edición, Eds. Banker y Rhodes, Marcel Dekker, Inc., 1990.
Las vacunas pueden administrarse por diferentes vías tales como subcutánea, intramuscular, intravenosa, mucosa, parenteral, transdérmica o intradérmica. La administración subcutánea e intramuscular puede realizarse usando, por ejemplo, agujas o inyectores de presión. En una realización, la vacuna de la invención se administra por vía intramuscular. El suministro transdérmico o intradérmico puede conseguirse a tevés de inyección con aguja de jeringa intradérmica o dispositivos habilitados tales como agujas micrométricas o parches de matrices micrométricas.
Las composiciones descritas en este documento pueden administrarse de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que es inmunogénicamente eficaz para tratar y/o reducir la probabilidad de infección por CMV (incluyendo primaria, recurrente y/o súper-infección). La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para lograr una respuesta beneficiosa en un paciente a lo largo del tiempo tal como una reducción en el nivel de la infección por CMV, mejorando los síntomas de la enfermedad asociada con la infección por CMV y/o acortando la duración y/o la gravedad de la infección por CMV, o para reducir la probabilidad de la infección por CMV (incluyendo primaria, recurrente y/o súper-infección).
Los regímenes de dosificación adecuados pueden determinarse fácilmente por los expertos en la materia y se determinan preferiblemente teniendo en cuenta factores bien conocidos en la técnica incluyendo edad, peso, género y afección médica del paciente; la vía de administración; el efecto deseado; y la composición particular empleada. En la determinación de la cantidad eficaz del rdCMV a administrar en el tratamiento o la profilaxis contra CMV, el médico puede evaluar los niveles en plasma en circulación del virus, la progresión de la enfermedad y/o la producción de anticuerpos anti-CMV. La dosis para una composición de vacuna consiste en el intervalo de 103 a 1012 unidades formadoras de placa (ufp). En diferentes realizaciones, el intervalo de dosificación es de 104 a 1010 ufp, de 105 a 109 ufp, de 106 a 108 ufp o cualquier dosis dentro de estos intervalos indicados. Cuando tiene que administrarse más de una vacuna (es decir, en vacunas de combinación), la cantidad de cada agente de vacuna está dentro de sus intervalos descritos.
La composición de vacuna puede administrarse en un formato de una dosis o de múltiples dosis. Las vacunas pueden prepararse sin adyuvante horas o días antes de las administraciones, sometidas a identificación de uno o más tampones estabilizantes y composición adyuvante adecuada. Las vacunas pueden administrarse en volúmenes habitualmente en práctica, que varían de 0,1 ml a 0,5 ml.
La cronología de las dosis depende de factores bien conocidos en la técnica. Después de la administración inicial, puede administrarse una o más dosis adicionales para mantener y/o reforzar los títulos de anticuerpos y la inmunidad de células T. pueden requerirse refuerzos adicionales para mantener los niveles protectores de las respuestas inmunitarias, reflejadas en los títulos de anticuerpos y la inmunidad de células T tales como ELISPOT. Los niveles de dichas respuestas inmunitarias son objeto de investigaciones clínicas.
Para vacunas de combinación, cada uno de los inmunógenos puede administrarse juntos en una composición o por separado en diferentes composiciones. Un rdCMV descrito en este documento se administra simultáneamente con uno o más inmunógenos deseados. El término "simultáneamente" no se limita a la administración de los agentes terapéuticos a exactamente el mismo tiempo, sino en su lugar se entiende que el rdCMV descrito en este documento y el otro u otros inmunógenos deseados se administran a un sujeto en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo tal que pueden actuar juntos para proporcionar un beneficio aumentado que si administraran de otra manera. Por ejemplo, cada agente terapéutico puede administrarse al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden en diferentes puntos en el tiempo; sin embargo, sino se administran al mismo tiempo, deben administrarse suficientemente cerca en el tiempo para proporcionar el efecto terapéutico deseado. Cada agente terapéutico puede administrarse por separado, en cualquier forma apropiada y por cualquier vía adecuada.
Población de pacientes
Un "paciente" se refiere a un mamífero que pueden infectarse con CMV. En una realización preferida, el paciente es un ser humano. Un paciente puede tratarse profiláctica o terapéuticamente. El tratamiento profiláctico proporciona suficiente inmunidad protectora para reducir la probabilidad o la gravedad de una infección por CMV, incluyendo infecciones primarias, infecciones recurrentes (es decir, aquellas que resultan de la reactivación de CMV latente y súper-infecciones (es decir, aquellas que resultan de una infección con una cepa diferente de CMV que la experimentada previamente por el paciente). el tratamiento terapéutico puede realizarse para reducir la gravedad de una infección por CMV o para disminuir la probabilidad/gravedad de una infección recurrente o súper-infección. El tratamiento puede realizarse usando una composición farmacéutica que comprende un rdCMV como se describe en este documento. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse a la población general, especialmente a aquellas personas en riesgo aumentado de infección por CMV (primaria, recurrente o súper-infección) o para los que la infección por CMV sería particularmente problemática (tales como individuos inmunocomprometidos, pacientes de trasplantes o mujeres embarazadas). En una realización, las mujeres en edad fértil, especialmente mujeres en adolescencia temprana, se vacunan para disminuir la probabilidad de infección por CMV (primaria, recurrente o súper-infección) durante el embarazo.
Los que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen infección, así como aquellos propensos a tener una infección en los que se desea una reducción en la probabilidad de la infección. El tratamiento puede mejorar los síntomas de la enfermedad asociada con infección por CMV y/o acortar la duración y/o la gravedad de la infección por CMV, incluyendo infección debida a reactivación de CMV latente.
Las personas con un riesgo aumentado de infección por CMV (primaria, recurrente o súper-infección) incluyen pacientes con inmunidad debilitada o pacientes que afrontan una terapia que conduce a inmunidad debilitada (por ejemplo, que experimentan quimioterapia o radioterapia para el cáncer o que toman fármacos inmunosupresores). Como se usa en este documento, "inmunidad debilitada" se refiere a un sistema inmunitario que es menos capaz de combatir las infecciones a causa de una respuesta inmunitaria que no está funcionando apropiadamente o no está funcionando al nivel de un adulto sano normal. Los ejemplos de pacientes con inmunidad debilitada son pacientes que son lactantes, niños pequeños, ancianos, embarazadas o un paciente con una enfermedad que afecta a la función del sistema inmunitario tal como infección por VIH o SIDA.
Ejemplos
A continuación, se proporcionan ejemplos para ilustrar adicionalmente diferentes características de la presente invención. Los ejemplos también ilustran la metodología útil para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no limitan la invención reivindicada.
Ejemplo 1: Restauración del complejo gH pentamérico
Se construyó un clon de cromosoma artificial bacteriano de CMV infeccioso de modo que codificara el virión que expresa el complejo gH pentamérico que consiste en UL128, UL130 y UL131 ensamblados en una estructura gH/gL. La cepa de CMV cepa AD 169 se aisló originalmente de las vegetaciones adenoides de una niña de 7 años de edad (Elek y Stern, 1974, Lancet, 1:1). El virus se pasó 58 veces en varios tipos de fibroblastos humanos para atenuar el virus (Neff et al., 1979, Proc Soc Exp Biol Med, 160:32), con los 5 últimos pases en fibroblastos humanos WI-38. Esta variante pasada de virus AD 169 , mencionada en este estudio como Merck AD169 (MAD169), se usó como virus precursor para construir el clon de BAC infeccioso. Ni el virus precursor AD 169 ni el virus variante pasado MAD169 expresaban UL131 o el complejo gH pentamérico.
El MAD169 se usó como virus precursor para construir un clon de cromosoma artificial bacteriano (BAC) infeccioso. Un vector de BAC es una herramienta molecular que permite la manipulación genética de un fragmento de ADN de tamaño grande, tal como el genoma de CMV (~230Kb), en E. coli. Un elemento BAC junto con un gen marcador de GFP se insertó inmediatamente después del codón de parada de la fase de lectura abierta de US28 (entre las ORF de US28 y US29 en el genoma vírico) con un sitio LoxP creado en ambos extremos del fragmento (figura 1A). En resumen, un fragmento de ADN que contenía un casete de expresión de GFP flanqueado por dos sitios LoxP y las secuencias US28-US29 de CMV se sintetizaron y clonaron en el vector pBeloBAC11. El vector de BAC se linealizó con la enzima de restricción Pme I y se cotransfectó en células MRC-5 con el ADN de MAD169 extraído de viriones purificados. Las variantes recombinantes, identificadas por expresión de fluorescencia verde, se purificaron en placas. Después de una ronda de amplificación, la forma circular del genoma vírico se extrajo de las células infectadas y se sometió a electroporación en células DH10 de E. coli. Las colonias bacterianas se exploraron por PCR para la presencia de las regiones US28 y US29. Los clones candidatos se examinaron adicionalmente por análisis de restricción con EcoR I, EcoR V, Hind III, Spe I y Bam HI. Después de la exploración, un clon, bMAD-GFP, mostró patrón de restricción idéntico con el virus MAD169 precursor.
La mutación de desplazamiento de fase en el primer exón de UL131 subyacente a la deficiencia de tropismo epitelial en MAD169 se reparó genéticamente en E. coli (figura 1B). Específicamente, un nucleótido (nt) de adenina del tramo del 7 nt A en el gen UL131 se delecionó (figura 1B). La deleción de un nt fue suficiente para rescatar el tropismo de células epiteliales y endoteliales debido a UL131 y, por tanto, el complejo gH pentamérico, que ahora no está expresando. La expresión se confirmó por ELISA y transferencia de Western (datos no mostrados). Este clon se modificó adicionalmente eliminando el segmento BAC por recombinación de LoxP/Cre. El ADN de BAC se transfectó en células ARPE-19, células epiteliales pigmentadas de la retina humana (n.° de acceso a la ATCC CRL-2302), para recuperar el virus infeccioso (figura 1C). El virus infeccioso resultante, llamado virus MAD169 de tropismo epitelial derivado de BAC (beMAD), difiere de MAD169 solamente en dos loci, (1) ORF de UL131 donde se delecionó un único nucleótido de adenina y (2) un sitio LoxP de 34 pb insertado entre las ORF de US28 y US29 (véase la tabla 2). El genoma del clon de BAC beMAD se secuenció completamente. La estructura del genoma global de beMAD es idéntico al presentado en la variante AD169 de la ATCC (n.° de acceso a GenBank X17403), que está compuesto de dos regiones únicas, larga única (UL) y corta única (US). Cada región única está enmarcada por dos secuencias repetidas, repetición terminal larga (TRL)-repetición interna larga (IRL), repetición terminal corta (TRS)-repetición interna corta (IRS). La cinética de crecimiento de la variante pasada MAD169 y el virus derivado beMAD era distinguible en células MRC-5, una línea celular de fibroblastos humanos (n.° de acceso a la ATCC CCL-171) (datos no mostrados). Como el complejo gH no es necesario para el crecimiento en células fibroblásticas, las diferencias en la expresión del complejo gH entre MAD169 y beMAD no son relevantes.
Tabla 2: Diferencia molecular de virus CMV
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Ejemplo 2: Efecto de los métodos de inactivación convencional sobre el complejo gH
Se investigó el efecto de dos métodos convencionales de inactivación vírica, radiación-Y y p-propiolactona (BPL), sobre el CMV que expresa gH.
La radiación-Y se realizó sobre viriones liofilizados. La vacuna de CMV recombinante a una concentración de 0,15 mg/ml en formulación de HNS (histidina 25 mM, NaCl 150 mM, sacarosa al 9 % p/v, pH 6,0) se liofilizó usando un ciclo de liofilización conservativo (congelación a -50 °C y secado principal a -35 °C durante ~30 horas seguido por secado secundario a 25 °C durante 6 horas) para obtener un polvo seco. La vacuna se liofilizó en un vial de vidrio de 3 ml con 0,5 ml llenados en cada vial. Al final de la liofilización, los viales se taparon en un entorno de nitrógeno y las muestras se retiraron, se marcaron, se restringieron y se almacenaron a -70 °C hasta la radiación-Y. Los viales se irradiaron en un irradiador de Co para la dosificación deseada de radiación.
Para el tratamiento con BPL, se añadió una solución madre de BPL al sobrenadante de cultivo vírico en bruto del crecimiento en células ARPE-19 hasta alcanzar las concentraciones finales de un 0,01 % o 0,01 % (v/v). La reacción se terminó con tiosulfato sódico en diversos puntos temporales. El CMV que expresa gH tratado con BPL se purificó entonces por ultracentrifugación.
La cinética de inactivación para ambos métodos se determinó por ensayo de placas en células ARPE-19. En resumen, se hicieron diluciones en serie de muestras de virus en PBS y se usaron 0,1 ml para inocular cada pocillo de una placa de 6 pocillos que se había sembrado con células ARPE-19. Las placas se incuban a 37 °C durante 1 hora antes de la adición de 6 ml por pocillo de medio de recubrimiento que contenía agarosa al 0,5 %. Las placas se incuban durante 18 días a 37 °C. Para visualizar las placas, se añaden aproximadamente 0,5 ml de solución de MTT a 5 mg/ml (bromuro de tiazolil azul de tetrazolio, Sigma M5655) a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37 °C durante 2-4 horas y las placas se contaron en una mesa de luz (figura 2A y 2C).
La inmunogenicidad del CMV que expresa gH inactivado se ensayó determinando los títulos de anticuerpos neutralizantes inducidos en ratones. En resumen, se inmunizaron ratones Balb/c hembra (n=10) con 2,5 |jg de CMV por dosis en las semanas 0 y 3. Los sueros se recogieron en la semana 4 y se evaluaron para la actividad neutralizante frente a la entrada epitelial de virus. El título de neutralización (NT50) se definió como una dilución reciproca del suero que causa una reducción de un 50 % en la entrada epitelial de virus en comparación con el control negativo. Los resultados de los estudios de inmunogenicidad en ratones mostraron que ambos métodos convencionales para la inactivación tenían efectos negativos sobre los títulos de anticuerpos neutralizantes inducidos por el CMV que expresa gH (figura 2B y 2D). La reducción de los títulos NT50 se correlacionaba con la duración del tratamiento por radiación-Y o por PBL. Los tratamientos prolongados hacían que el CMV que expresa el complejo gH pentamérico fuera más parecido al CMV AD169 precursor en términos de inmunogenicidad en ratones. Se observaron resultados similares en conejos y monos Rhesus cuando se ensayaban vacunas inactivadas con radiación-Y o con PBL (datos no mostrados). Estas observaciones demostraron que el complejo gH pentamérico es sensible a ambos métodos de inactivación en las condiciones de inactivación seleccionadas.
Ejemplo 3: Construcción y exploración de fusiones de FKBP- proteína esencial
Se construyó un CMV usando la estructura de la cepa AD169 atenuada que vuelve a obtener su tropismo epitelial mientras es de replicación condicional defectuosa. Se usaron los métodos descritos en el ejemplo 1 para restaurar el tropismo epitelial.
Las proteínas víricas a fusionar al derivado de FKBP se seleccionaron basándose en dos criterios. En primer lugar, las proteínas de interés no se detectaban en viriones de CMV por análisis proteómico (Varnum et al., 2004, J. Virol.
78:10960), además, disminuyendo la probabilidad de que la proteína de fusión con FKBP se incorpore en el virus. En segundo lugar, las proteínas de interés son esenciales para la replicación del virus en cultivo tisular.
Usando beMAD como virus precursor, el derivado de FKBP (SEQ ID NO:12) se fusionó a 12 proteínas víricas esenciales individualmente, incluyendo IE1/2 (SEQ ID NO:1), pUL37x1, pUL44, pUL51 (SEQ ID NO:3), pUL52 (SEQ ID NO:5), pUL53, pUL56, pUL77, pUL79 (SEQ ID NO:7), pUL84 (SEQ ID NO:9), pUL87 y pUL105. También se construyó un virus con dos proteínas esenciales diferentes fusionadas a FKBP que fusionaba cada uno de IE1/2 y UL51 al derivado de FKBP (el genoma del rdCMV con IE1/2 y UL51 desestabilizada se muestra en la SEQ iD NO:14). Después de la construcción, se transfectaron todos los ADN de BAC recombinantes en células ARPE-19 y se cultivaron en el medio que contenía Shld-1.
Se examinó la dependencia del crecimiento vírico de Shld-1. Los virus de fusión IE1/2, UL51, UL52, UL84, UL79 y UL87 se rescataron fácilmente en Shld-1 2 jM en ensayos de placas (datos no mostrados). Los virus UL37x 1, UL77 y UL53 también produjeron placas, pero las placas eran pequeñas y crecían significativamente más lentas, en comparación con el beMAD precursor. Aumentar la concentración de Shld-1 hasta 10 pM no acelera significativamente el crecimiento del virus (datos no mostrados). Las fusiones UL56 y UL105 no se recuperaban, lo que sugiere que marcar estas proteínas altera la función de estas proteínas o la expresión de los genes adyacentes. Se usaron concentraciones variables de Shld-1 en experimentos adicionales para evaluar adicionalmente la replicación del virus en presencia o en ausencia de Shld-1. Se infectaron células ARPE-19 por el CMV que expresa gH que también contenía un derivado de FKBP fusionado a una proteína esencial a MOI de 0,01 ufp/ml. Después de infección durante 1 hora, las células se lavaron 2 veces con medio reciente para eliminar el Shld-1 de los inóculos. Los inóculos entonces se añadieron a células ARPE-19 cultivadas en medio que contenía 0,05, 0,1, 0,5 o 2 pM de Shield-1. 7 días después de la infección, el virus descendiente sin células en el sobrenadante se recogió y se tituló en células ARPE-19 suplementadas con 2 mM de Shield-1. Los títulos de virus se determinaron por un ensayo de dosis infecciosa de cultivo tisular al 50 % (DICT50). En resumen, este ensayo de dilución cuantifica la cantidad de virus necesaria para eliminar un 50 % de los hospedadores infectados. Se sembraron en placa células ARPE-19 y se añadieron diluciones en serie del virus. Después de la incubación, se observó manualmente el porcentaje de muerte celular (es decir, células infectadas) y se registró para cada dilución de virus. Los resultados se usaron para calcular matemáticamente la DICT50.
Como se muestra en la figura 3, la replicación eficaz de todos los CMV que contienen fusión con FKBP dependía de la concentración de Shield-1, aunque a grados variables. La concentración inferior de Shield-1, en general, reducía el título de la producción de virus descendiente. Entre los virus con una única fusión, solamente UL51 y UL52 requería absolutamente Shield-1 para la replicación. Otros virus con una única fusión, IE1/2, UL84, UL79 y UL87, podían producir virus descendiente detectable en ausencia de Shield-1. La regulación era más estricta cuando el derivado de FKBP se fusionaba a UL51 o a UL52.
La cinética de crecimiento de virus con fusiones IE1/2, UL51, IE1/2-UL51 se comparó con el virus beMAD precursor en presencia o en ausencia de 2 pM de Shld-1. Como se muestra en la figura 4, en presencia de Shld-1, las fusiones individuales o dobles tenían cinética de crecimiento comparable al de beMAD precursor. Sin embargo, en ausencia de Shld-1, solamente IE1/2 podía replicarse, aunque a una tasa inferior y más lenta que el beMAD precursor.
La rigurosidad del control de la replicación del virus en el virus de fusión doble también se ensayó en diferentes tipos celulares (figura 5). Estas células incluían células de vena umbilical humana (HUVEC), fibroblastos MRC-5, células de músculo liso aórtico (AoMC), células de músculo esquelético (SKMC) y células de astrocitoma CCF-STTG1. Las células se infectaron por el virus de fusión IE1/2-UL51 a MOI de 0,01 ufp/célula (excepto para CCF-STTG1 que se infectó a una MOI de 5 ufp/célula) y después se incubaron en el medio en presencia o en ausencia de Shield-1. Todos los tipos celulares eran capaces de mantener la replicación vírica lítica en presencia de Shield-1. No se detectó producción del virus en ausencia de Shield-1.
Ejemplo 4: Inmunogenicidad del virus de fusión doble IE1/2-UL51 en animales
Se evaluó la inmunogenicidad del virus de fusión doble IE1/2-UL51 en ratones, conejos y monos Rhesus. La respuesta neutralizante dependiente de la dosis contra el virus de fusión doble IE1/2-UL51 o el virus beMAD precursor en ratones se comparó en primer lugar (figura 6A). Se inmunizaron ratones Balb/c hembra de 6 semanas de edad en las semanas 0 y 4 con beMAD o el virus de fusión doble IE1/2-UL51 a dosis que varían de 0,12 pg a 10 pg. Se recogieron muestras de suero de la semana 6 y se analizaron por ensayo de microneutralización de CMV en células ARPE-19 como se describe previamente (Tang et al., Vaccine, "A novel throughput neutralization assay for supporting clinical evaluations of human cytomegalovirus vaccines" publicado electrónicamente el 30 de agosto de 2011 en doi:10.1016/j.vaccine.2011.08.086). Las respuestas se compararon a dosis de 0,12, 0,37, 1,1, 3,3 y 10 pg. al intervalo de dosis bajo (0,12 a 1,1 pg), el beMAD era ligeramente más inmunogénico con anticuerpos neutralizantes detectados constantemente cuando los niveles de dosificación estaban por encima de 0,37 pg. al intervalo de dosis alto (3,3 y 10 pg), los títulos de anticuerpos neutralizantes inducidos por los dos virus eran comparables.
A continuación, se comparó la inmunogenicidad de diferentes virus en conejos a dosis de 10 pg. se inmunizaron conejos NZW hembra en las semanas 0, 3 y 8 con 10 pg de beMAD o con los virus de fusión indicados. Se recogieron sueros de la semana 10 y se analizaron por ensayo de microneutralización de CMV en células ARPE-19 (figura 5B). El beMAD, los virus de fusión individual IE1/2 o UL51 y el virus de fusión doble IE1/2-UL51 podían inducir títulos significativamente mayores de anticuerpos neutralizantes que MAD169, un virus similar a AD169 y que carece del complejo gH pentamérico. Esto confirmó que la expresión del complejo gH por el virus aumentaba significativamente la inmunogenicidad del CMV recombinante.
A continuación, se ensayó la inmunogenicidad de 100 pg del virus de fusión doble IE1/2-UL51 o del virus precursor beMAD en macacos de la India. Se recogieron sueros de la semana 12 y se analizaron por ensayo de microneutralización de CMV en células ARPE-19. La GMT de los títulos NT50 en la semana 12 (después de la dosis 3) era 11500 o 15600, respectivamente. Estos títulos fueron comparables a los títulos NT50 observados en individuos infectados de forma natural (figura 5C).
La longevidad de la respuesta inmunitaria inducida por vacuna con CMV de virus de fusión doble IE1/2-UL51 se demostró en macacos de la India. Los animales se vacunaron con 10 pg/dosis o 100 pg/dosis de virus de fusión doble IE1/2-UL51 (basado en la masa de proteína total). También se incluyeron formulaciones de 10 pg/dosis de vacuna con sulfato de hidroxilfosfato de aluminio amorfo (AAHS) o adyuvante ISCOMATRIX®. Las vacunas se administraron en las semanas 0, 8 y 24 en macacos de la India (n=5). Para comparaciones, un grupo de control recibió gB recombinante a 30 pg/dosis formulada con adyuvante MF59 en las semanas 0, 4 y 24. Las medias geométricas para los títulos NT50 recíprocos (GMT) para todos los grupos se presentan longitudinalmente (figura 7). Antes de la vacunación, no había título de anticuerpos neutralizantes detectable >40 para ninguno de los monos. La actividad neutralizante mínima se detectó después de la primera dosis en la semana 4 para todos los grupos con los títulos de anticuerpos neutralizantes alcanzando el máximo aproximadamente en la semana 12 y en la semana 28 (4 semanas después de la segunda y de la tercera vacunación, respectivamente). La GMT máxima en la semana 28 para el grupo de 100 pg/dosis fue 14.500 (aproximadamente 3 veces mayor que el título de 4.660 para el grupo de 10 pg/dosis). El adyuvante ISCOMATRIX®, pero no AAHS, proporcionó beneficio adyuvante en comparación con el grupo de 10 pg/dosis. La GMT en la semana 28 para el grupo de ISCOMATRIX® midió 15.800 mientras que el grupo de AAHS fue 3.000 y el grupo de 10 pg/dosis fue 4.660. La actividad neutralizante mínima se detectó para el grupo de control (gB/MF59), sin exceder nunca la GMT máxima de 200. En la semana 72 del estudio, casi 1 año después de completarse el régimen de vacunación en las semanas 0, 8 y 24, la GMT para el grupo de 100 pg/dosis y el grupo de formulación de ISCOMATRIX® se mantuvo a 1400 y 3000, respectivamente. En este momento, la GMT para el grupo de 10 pg/dosis y el grupo de AAHS fue de aproximadamente 200.
Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de macacos de la India en la semana 28 (4 semanas después de la dosis 3) del régimen de vacunación y se evaluaron en el ensayo ELISPOT de IFN-y. Los monos se vacunaron con 100 pg/dosis (figura 8A) o 10 pg/dosis (figuras 8B-8D) del virus de fusión doble IE1/2-UL51. Adicionalmente, los 10 pg/dosis se formularon sin adyuvante (figura 8B) o con AAHS (figura 8C) o adyuvante ISCOMATRIX® (figura 8D). Los antígenos de péptidos solapantes combinados que representan cinco antígenos de HCMV se usaron para estimular la producción de IFN-y ex vivo. Los antígenos de HCMV usados fueron IE1 y IE2 (ambas proteínas reguladoras víricas) y pp65, gB y pp150 (antígenos estructurales víricos predominantes). Se evaluó la calidad de las respuestas de células T por la magnitud (medias geométricas) de las respuestas ELISPOT, así como la tasa de respondedores a los antígenos víricos. Antes de la vacunación, no había título ELISPOT específico de antígeno en ningún mono (datos no mostrados).
En la semana 28, las medias geométricas para las respuestas ELISPOT a los cinco antígenos de HCMV (es decir, IE1, IE2, pp65, gB y pp150) fueron 186, 132, 253, 87, 257 células formadoras de manchas (SFC)/106 PBMC para el grupo de 100 pg/dosis frente a 21, 24, 107, 111, 33 SFC/106 PBMC para el grupo de 10 pg/dosis, respectivamente (figuras 8A y 8B). Se valoró un respondedor en cada grupo (n=5) basándose en los criterios de corte de más de 55 SFC/106 PBMC y más de 3 veces de elevación en la respuesta específica de antígeno sobre la respuesta a dimetilsulfóxido (DMSO). La cantidad de respondedores a los cinco antígenos de HCMV (es decir, IE1, IE2, pp65, gB y pp150) fue 4, 4, 5, 1, 3 para el grupo de 100 pg/dosis frente a 1, 1, 5, 4, 0 para el grupo de 10 pg/dosis.
El efecto del adyuvante ISCOMATRIX® sobre las respuestas de células T a 10 pg/dosis del virus de fusión doble IE1/2-UL51 se muestra en la figura 8D. Las medias geométricas de las respuestas ELISPOT a los cinco antígenos de HCMV (es decir, IE1, IE2, pp65, gB y pp150) fueron 114, 53, 491, 85, 113 SFC/106 PBMC, respectivamente y la cantidad de respondedores en cada grupo (n=5) fue 3, 2, 5, 3, 3, respectivamente. La magnitud y amplitud de las respuestas de células T en el grupo con adyuvante ISCOMATRIX® fueron similares a las del grupo de 100 pg/dosis.
Se analizaron adicionalmente las PBMC de animales vacunados con 10 pg/dosis o 100 pg/dosis de virus de fusión doble IE1/2-UL51 (basado en la masa de proteína total) con ISCOMATRIX® en tinción de citoquinas intracelulares después de estimularse con antígenos de HCMV (pp65, IE1, IE2 o virión de HCMV completo). El control negativo fue un mono virgen no vacunado con el virus de fusión doble IE1/2-UL51 mientras que el control positivo fue enterotoxina B de Staphylococcus (SEB). La figura 9 muestra que el control negativo mostraba respuestas mínimas a todas las estimulaciones con antígeno, pero respondía al agente de control positivo enterotoxina B de Staphylococcus (SEB) como se esperaba. Los diez monos vacunados de ambos grupos respondieron a antígenos específicos de HCMV con magnitud y patrones similares. Los valores de media geométrica para cada antígeno se computaron los diez monos. Todos los monos mostraron respuestas de células T CD8+ (figura 9A) y CD4+ (figura 9B) comparables cuando sus PBMC se estimulaban con combinaciones de péptidos antigénicos de CMV (es decir, pp65, IE1 y IE2) pero mostraban preferentemente respuestas de células T c D4+ cuando se estimulaban con viriones de HCMV completos. Esto no fue inesperado ya que los viriones completos son antígenos proteicos y probablemente se procesan como antígenos exógenos y se presentan por moléculas MHC de clase II a células T CD4+. El virus de fusión doble IE1/2-UL51 puede provocar respuestas de células T de los fenotipos tanto CD4+ como CD8+, similares a las habitualmente observadas en sujetos sanos con infección por HCMV.
Se compararon diferentes formulaciones del virus de fusión doble IE1/2-UL51 con sales de aluminio para su capacidad de generar anticuerpos neutralizantes en macacos de la India (figura 10). Se formularon 30 pg/dosis de virus de fusión doble IE1/2-UL51 con HNS (tampón base), sulfato de hidroxilfosfato de aluminio amorfo (AAHS) o adyuvante de fosfato de aluminio de Merck (MAPA) y se administraron a las semanas 0 y 8. Las muestras de suero recogidas en la semana 12 mostraron que, aunque MAPA potenciaba la inducción de anticuerpos neutralizantes, la potenciación no era estadísticamente significativa (ensayo t bilateral para datos independientes).
Ejemplo 5: Identificación de tampones para almacenamiento
El virus CMV en HBSS (solución salina equilibrada de Hank) y almacenada a -70 °C hasta usarse se diluyó ~ 10x con el tampón apropiado. Los componentes residuales del tampón HBSS en cada muestra incluían cloruro de potasio 0,533 mM, fosfato de potasio monobásico 0,044 mM, fosfato sódico dibásico 0,034 mM, cloruro sódico 13,79 mM, bicarbonato sódico 0,417 mM y glucosa al 0,1 % p/v. Las muestras después se almacenaron a temperatura ambiente o entre temperaturas de 2 °C-8 °C durante 4 días o se congelaron-descongelaron. Para la congelacióndescongelación, la muestra se almacenó a -70 °C durante al menos una hora y se descongeló a TA durante 30 minutos para uno o tres ciclos. La estabilidad de las muestras se ensayó en el día 4 usando un ensayo de entrada de virus. En resumen, el ensayo se realizó usando varias diluciones de muestra diferentes para obtener una curva de respuesta y se obtuvieron valores de CE50 (pg/ml) de los resultados del ensayo de entrada del virus por ajuste de curva no lineal. Los valores de CE50 inferiores representan una mejor estabilidad. Los valores de CE50 de las muestras de estabilidad se compararon frente a una muestra de control congelada a -70 °C.
El ensayo de entrada de virus mide la capacidad de CMV de infectar células ARPE-19 y expresar IE1 (proteína 1 temprana inmediata). El ensayo se realiza en placas transparentes de 96 pocillos. Los anticuerpos primarios específicos de IE1 y los anticuerpos secundarios biotinilados se usan para detectar proteínas diana en células fijas y se cuantifica la señal fluorescente de cada pocillo usando un colorante IR 800CW de estreptavidina junto con Sapphire 700/DRAQ5 (para la normalización de introducción de células). Los resultados se representan como la relación de intensidad integrada a 800/700 (relación integrada) frente a la concentración de CMV (proteína total, pg/ml). Los valores de CE50 también se obtuvieron de los resultados del ensayo de infectividad usando ajuste de curva no lineal. Como la infección vírica de células ARPE-19 depende de la integridad de los antígenos glucoproteicos víricos, en particular el complejo gH pentamérico, los valores de CE50 reflejan lo bien que se conservan las partículas víricas en estas condiciones.
Como se muestra en la figura 11, el CMV pierde infectividad cuando se almacena durante cuatro días en HBSS a TA. Además, 3 ciclos de congelación-descongelación en HBSS dieron lugar a pérdida completa de infectividad cuando se ensayaban por ensayo de entrada de virus. Por tanto, HBSS no era un tampón óptimo para almacenamiento de CMV.
Se examinó el efecto del pH sobre la estabilidad de CMV a temperatura ambiente usando el intervalo de pH de 3 a 8. Se utilizaron los siguientes tampones: tampón citrato (25 mM), pH 3,0; tampón acetato (25 mM), pH 4; tampón acetato (25 mM), pH 5; tampón histidina (25 mM), pH 6; tampón h Ep ES (25 mM), pH 7; solución salina equilibrada de Hank (HBSS), pH 7,5 y tampón Tris (25 mM), pH 8.
Las muestras se prepararon por dilución de la masa de virus 10 veces con el tampón apropiado. Las muestras se almacenaron a TA (25 °C) durante 4 días. En el día 4, se midió la estabilidad de las muestras utilizando el ensayo de entrada de virus. El CMV en HBSS almacenado congelado a -70 °C se trató como control. Se obtuvieron los espectros UV-Vis para cada una de las muestras a tiempo 0 y en el día 4 para examinar los cambios estructurales y la agregación que se producía durante el almacenamiento.
Como se muestra en la figura 12, el tampón histidina pH 6 proporcionaba mejor estabilidad para CMV manteniendo mayor infectividad a TA en comparación con otros pH ensayados. La segunda derivada de los espectros UV indicó un perfil estructural similar del virus a todos los pH (datos no mostrados). No se observó agregación significativa a ninguno de los pH ensayados medida por densidad óptica a 350 mm (datos no mostrados).
El efecto de la urea en solitario o en combinación con cloruro sódico sobre la estabilidad del virus CMV se ensayó en tampón histidina 25 mM, pH 6. La adición de urea al 2 % en solitario no tenía efecto sobre la estabilidad de CMV. Sin embargo, la combinación de urea al 2 % con NaCl 150 mM mejoraba la estabilidad de CMV a TA (figura 13).
Se examinó el efecto de la fuera iónica sobre la estabilidad de CMV a pH 6. Se añadieron concentraciones crecientes de NaCl (0 mM, 75 mM, 150 mM y 320 mM de NaCl) a tampón histidina 25 mM a pH 6. La estabilidad de CMV era dependiente de la fuera iónica donde una fuerza iónica mayor conducía a mejor estabilidad (figura 14). La presencia de urea no tuvo efecto o tuvo efecto mínimo sobre la estabilidad de CMV (datos no mostrados).
Adicionalmente, se exploraron otros varios excipientes (sacarosa, sorbitol, glicerol y prolina) para su efecto sobre la estabilidad de CMV que expresa gH a temperatura ambiente. Los excipientes a ensayar se añadieron a CMV en tampón histidina 25 mM, pH 6 a temperatura ambiente durante 4 días antes de que se midiera la estabilidad del virus CMV usando el ensayo de entrada de virus. Se calcularon los valores de CE50 para las muestras. Entre todos los excipientes ensayados, NaCl 150 mM en solitario o en combinación con sacarosa al 9 % p/v proporcionaba mejor estabilidad a pH 6 (datos no mostrados). Por lo tanto, el tampón recomendado para el almacenamiento de CMV a TA es histidina 25 mM (pH 6) con NaCl 150 mM con o sin sacarosa al 9 % p/v.
Se investigó el efecto de los crioprotectores sobre la estabilidad de CMV durante congelación-descongelación. Como se indica previamente (figura 11), el CMV en HBSS pierde completamente su infectividad cuando se somete a 3 ciclos de congelación-descongelación. Se exploraron varios crioprotectores (incluyendo sacarosa, sorbitol, glicerol) para la capacidad de disminuir la tensión de congelación-descongelación sobre CMV. Para cada ciclo de congelación-descongelación, las muestras se congelaron a -70 °C durante al menos 1 hora y se descongelaron a TA durante 30 minutos. La adición de crioprotectores dio lugar a estabilidad aumentada del virus. Además, sacarosa al 9 % p/v en combinación con cloruro sódico 150 mM dio lugar a estabilidad significativamente potenciada del virus en comparación con otros crioprotectores ensayados (figura 15). Por lo tanto, la composición del tampón recomendado para el almacenamiento de CMV a -70 °C o hasta 3 ciclos de congelación-descongelación es histidina 25 mM, NaCl 150 mM y sacarosa al 9 % (tampón HNS).
El tampón HNS se comparó con el tampón HBSS para la protección de la estabilidad de CMV para tres ciclos de congelación-descongelación, refrigeración (2-8 °C) y TA (25 °C). El tampón HNS proporcionaba mejor estabilidad para virus vivo CMV en todas las condiciones de almacenamiento ensayadas (datos no mostrados).
Ejemplo 6: Estabilidad de CMV en tampón HNS
La solución madre de virus CMV de doble fusión IE1/2-UL51 se suministró en tampón HNS y se almacenó a -70 °C hasta su uso. El estudio de estabilidad se realizó a una concentración de 100 pg/ml (basada en el contenido de proteína total medida por ensayo de Bradford). Se diluyó el virus en bruto con tampón HNS para obtener la concentración de virus final. Las muestras después se almacenaron a temperaturas apropiadas y se ensayaron como se describe durante hasta 3 meses. Para la congelación-descongelación, las muestras se congelaron a -70 °C durante al menos 1 hora y se descongelaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras se extrajeron en diferentes puntos temporales y se mantuvieron almacenadas congeladas a -70 °C hasta analizarse. El contenido de proteína total de las muestras se midió usando un ensayo de Bradford. El contenido de proteína total de la muestra no cambiaba sobre el periodo de 3 meses (datos no mostrados).
El tamaño de partículas del CMV en las muestras a lo largo del tiempo se controló midiendo el diámetro hidrodinámico de la muestra usando el método DLS. Este método controlaba cualquier agregación o alteración de las partículas de virus a lo largo del tiempo y a diferentes temperaturas de almacenamiento. No se observó tendencia real con cambios esporádicos en el tamaño de partícula de ciertas muestras (datos no mostrados). Los resultados indicaron que las partículas de virus estaban intactas y no se agregaban a temperaturas elevadas.
Ejemplo 7: Efecto de las condiciones de almacenamiento sobre la entrada del virus y la inmunogenicidad Se observaron cambios significativos en los títulos de entrada el virus (valores de CE50) sometiendo las muestras de CMV a diferentes temperaturas de almacenamiento (datos no mostrados). El almacenamiento a -20 °C producía títulos de entrada de virus inferiores en comparación con 2-8 °C y 25 °C. Se descubrió que los títulos de muestras a 2-8 °C eran títulos de entrada de virus inferiores en comparación con el almacenamiento a 25 °C. Basándose en los valores de CE50, se clasificaron las temperaturas de almacenamiento en el siguiente orden (desde la más estable hasta la menos estable): 25 °C > 2-8 °C > -20 °C hasta el punto temporal de 1 mes. Los títulos de entrada de virus no eran detectables en el punto temporal de 3 meses para las muestras almacenadas a -20 °C, 2-8 °C y 25 °C. Se inició un estudio de inmunogenicidad en ratones al final del estudio de estabilidad para determinar el efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la capacidad de CMV de inducir anticuerpos neutralizantes de CMV. Los ratones se inmunizaron con 2,5 pg/dosis de vacuna i.m. en el día 0 y se reforzaron en el día 21 seguido por extracción de sangre en el día 28. El suero del ratón se ensayó para anticuerpos neutralizantes contra un CMV que expresa gH usando células ARPE-19 y se obtuvieron los títulos NT50 por ajuste de curva no lineal.
Se evaluó el efecto del almacenamiento a diferentes temperaturas durante 3 meses sobre la inmunogenicidad de CMV de doble fusión IE1/2-UL51. Los títulos NT50 dependían de la temperatura de almacenamiento, produciendo temperaturas mayores títulos disminuidos en comparación con el control congelado a -70 °C, aunque no significativamente (p=0,2584, ANOVA undireccional) (figura 16A). El título NT50 para las formulaciones almacenadas a -20 °C fue inferior en menos de 2 veces, pero los títulos del ensayo de entrada de virus para estas muestras se vieron afectados significativamente en comparación con el control congelado a -70 °C. La tendencia de los títulos NT50 para las muestras de estabilidad a -20 °C, 2-8 °C y 25 °C sigue los títulos ELISA de masa de CMV obtenidos para estas muestras.
Se evaluó el efecto del almacenamiento a diferentes temperaturas durante 8 horas después de la descongelación sobre la inmunogenicidad del CMV de fusión doble IE1/2-UL51. Los títulos NT50 de las formulaciones se compararon con un control congelado a -70 °C. Los títulos NT50 no se vieron afectados (p=0,5865, ANOVA unilateral) almacenando las muestras durante 8 horas a cualquiera de las temperaturas ensayadas (figura 16B). El efecto del almacenamiento del CMV de fusión doble IE1/2-UL51 a 25 °C para diferentes puntos temporales después de la descongelación de las muestras se evaluó en un estudio de inmunogenicidad en ratones. Los títulos NT50 de estas formulaciones se compararon con un control congelado a -70 °C. Los títulos NT50 no se vieron afectados (p=0,1848, ensayo t bilateral para datos independientes) almacenando las muestras a 25 °C durante hasta una semana. A los 3 meses, los títulos NT50 bajaron un poco por encima de 2 veces indicando posibles cuestiones de estabilidad de la formulación a 25 °C durante un tiempo más largo (datos no mostrados).
Se evaluó el efecto de 3 ciclos de congelación-descongelación del CMV de fusión doble IE1/2-UL51 formulado en tampón HNS por inmunogenicidad en ratones. Tres ciclos de congelación-descongelación (F/T) de la formulación de CMV de fusión doble no afectaron a la inmunogenicidad (p=0,2103, ensayo t bilateral para datos independientes) en comparación con un control congelado a -70 °C (datos no mostrados).
Otras realizaciones se encuentran en las reivindicaciones siguientes.
REALIZACIONES NUMERADAS
La presente divulgación hace referencia a las reivindicaciones numeradas siguientes:
1. Un CMV de replicación condicional defectuosa que comprende:
(a) un complejo gH pentamérico que comprende UL128, UL130, UL131, gH y gL; y
(b) un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión entre una proteína esencial y una proteína desestabilizante, en donde la proteína esencial se selecciona del grupo que consiste en IE1/2, UL51, UL52, UL79 y UL84.
2. El CMV de replicación condicional defectuosa de la realización 1, en el que la proteína desestabilizante es FKBP o un derivado de FKBP, en donde el derivado de FKBP es FKBP que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: F15S, V24A, H25R, F36V, E60G, M66T, R71G, D100G, D100N, E102G, K105I y L106P.
3. El CMV de replicación condicional defectuosa de la realización 2, en el que el derivado de FKBP es FKBP que comprende sustituciones de aminoácidos F36V y L106P.
4. El CMV de replicación condicional defectuosa de cualquiera de las realizaciones 1-3, en el que la proteína esencial es IE1/2.
5. El CMV de replicación condicional defectuosa de cualquiera de las realizaciones 1-3, en el que la proteína esencial es UL51.
6. El CMV de replicación condicional defectuosa de cualquiera de las realizaciones 1-3, en el que el CMV comprende un ácido nucleico que codifica al menos dos proteínas de fusión, en el que las proteínas en cada una de las proteínas de fusión son diferentes.
7. El CMV de replicación condicional defectuosa de la realización 6, en el que una de las proteínas de fusión comprende IE1/2.
8. El CMV de replicación condicional defectuosa de la realización 6, en el que una de las proteínas de fusión comprende UL51.
9. El CMV de replicación condicional defectuosa de la realización 6, en el que una primera proteína de fusión comprende IE1/2 y una segunda proteína de fusión comprende UL51.
10. El CMV de replicación condicional defectuosa de la realización 9, en el que
(a) la primera proteína de fusión es la SEQ ID NO: 1 o un aminoácido que es al menos un 95 % idéntico a la SEQ ID NO: 1; y
(b) la segunda proteína de fusión es la SEQ ID NO: 3 o un aminoácido que es al menos un 95 % idéntico a la SEQ ID NO: 3.
11. .El CMV de replicación condicional defectuosa de la realización 10, en el que la primera proteína de fusión es SEQ ID NO:1 y la segunda proteína de fusión es SEQ ID NO:3.
12.. El CMV de replicación condicional defectuosa de la realización 10, en el que
(a) la primera proteína de fusión está codificada por la SEQ ID NO:2 o un ácido nucleico que es al menos un 95 % idéntico a la SEQ ID NO: 2; y
(b) la segunda proteína de fusión está codificada por la SEQ ID NO:4 o un ácido nucleico que es al menos un 95 % idéntico a la SeQ ID NO:4.
13. El CMV de replicación condicional defectuosa de la realización 12, en el que la primera proteína de fusión está codificada por la SEQ ID NO:2 y la segunda proteína de fusión está codificada por la SEQ ID NO:4.
14. El CMV de replicación condicional defectuosa de la realización 9, en el que el genoma del CMV es SEQ ID NO:14.
15. Una composición que comprende el CMV de replicación condicional defectuosa de cualquiera de las realizaciones 1-14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. La composición de la realización 15 que comprende adicionalmente un adyuvante.
17. La composición de la realización 16, en la que el adyuvante es ISCOMATRIX®.
18. Un método de inducción de una respuesta inmunitaria contra CMV en un paciente que comprende la administración al paciente de una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición de cualquiera de las realizaciones 15-17.
19. El método de la realización 18, en el que la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora en un paciente contra infección por CMV.
20. El método de cualquiera de las realizaciones 18-19, en el que la infección por CMV es una infección primaria, una infección recurrente o una súper-infección.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un citomegalovirus (CMV) de replicación condicional defectuosa con IE1/2 desestabilizado y UL51 proteínas, en el que el genoma del CMV está representado por la SEQ ID NO:14.
2. Una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz del CMV de replicación condicional defectuosa de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. La composición de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente un adyuvante.
4. Una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición de la reivindicación 2 o 3 para el uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria contra CMV en un paciente.
5. La composición para el uso de la reivindicación 4, en la que la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora en un paciente contra infección por CMV.
6. La composición para el uso de la reivindicación 4 o 5, en la que el paciente tiene una inmunidad debilitada.
7. La composición para el uso de la reivindicación 4 o 5, en la que el paciente es una mujer en edad fértil.
8. Uso de un CMV de replicación condicional defectuosa de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria protectora en un paciente contra infección por CMV.
9. El CMV de replicación condicional defectuosa de la reivindicación 1, para el uso en la medicina para tratar una infección por CMV en un paciente.
10. Un método de preparación de CMV de replicación condicional defectuosa, que comprende propagar el CMV recombinante de la reivindicación 1 en células epiteliales en presencia de Shield-1, en el que Shield-1 está presente a una concentración de al menos 0,5 pM.
11. El método de la reivindicación 10, en el que las células epiteliales son células epiteliales pigmentadas de la retina humana.
12. El método de la reivindicación 11, en el que las células epiteliales pigmentadas de la retina humana son células ARPE-19 depositadas en la American Type Culture Collection (ATCC) como el n.° de acceso CRL-2302.
13. Una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz del CMV de replicación condicional defectuosa de la reivindicación 1 en un tampón a un pH entre 5-7, que comprende:
(a) entre 15-35 mM de histidina; y
(b) entre 100-200 mM de NaCl.
14. La composición de la reivindicación 13, en la que el tampón comprende 25 mM de histidina con 150 mM de NaCl a un pH de 6.
15. La composición de la reivindicación 14, que comprende adicionalmente sacarosa al 9 % p/v.
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