CN103889462A - 作为cmv疫苗的条件性复制型巨细胞病毒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用遗传修饰的条件性复制缺陷型CMV诱导针对巨细胞病毒(CMV)的免疫应答的方法。本发明的方法可以用于治疗和/或预防原发性CMV感染、由潜伏CMV的再活化引起的感染、和以前已经遇到的CMV的不同毒株的重叠感染。本发明也涉及一种复制缺陷型CMV,其已经被重组改变以允许病毒复制的外部控制。本发明也包括包含所述复制缺陷型CMV的组合物。
Description
发明领域
本发明涉及使用遗传修饰的条件性复制缺陷型CMV诱导针对巨细胞病毒(CMV)的免疫应答的方法。本发明也涉及已经重组地改变以实现病毒复制的外部控制的CMV。本发明也包括包含所述复制缺陷型CMV的组合物。
发明背景
巨细胞病毒(CMV) 也被称作人疱疹病毒5型(HHV-5),是被归类为疱疹病毒科的β亚科的一个成员的疱疹病毒。根据疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention),发现CMV感染颇为普遍地存在于人类群体中,据估算40-80%的美国成人群体已经受感染。该病毒主要通过体液传播,且经常从怀孕母体传递给胎儿或新生儿。CMV感染在大多数个体中是潜伏性的,尽管病毒活化可以导致高热、寒战、疲劳、头痛、恶心和脾肿大。
尽管大多数人CMV感染是无症状的,但是免疫受损个体(诸如HIV-阳性的患者、同种异体移植患者和癌症患者) 或其免疫系统尚未充分发育的人(诸如新生儿)中的CMV感染可以是特别有问题的(Mocarski等人, Cytomegalovirus, 在Field
Virology中, 2701-2772, 编辑: Knipes和Howley, 2007)。这样的个体中的CMV感染除了其它有害病况外还可以造成严重病态,包括肺炎、肝炎、脑炎、结肠炎、葡萄膜炎、视网膜炎、失明和神经病。另外,妊娠期间的CMV感染是出生缺陷的主要原因(Adler, 2008 J. Clin Virol, 41:231; Arvin等人, 2004 Clin Infect Dis, 39:233; Revello等人, 2008 J Med Virol, 80:1415)。CMV在体内感染多种细胞,包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经元、平滑肌细胞、肝细胞和基质细胞(Plachter等人. 1996, Adv. Virus Res. 46:195)。尽管临床CMV分离物在多种细胞类型中复制,但是实验室毒株AD169
(Elek和Stern, 1974, Lancet 1:1)和Towne (Plotkin等人,
1975, Infect. Immun. 12:521)几乎排它地在成纤维细胞中复制(Hahn等人, 2004, J. Virol. 78:10023)。由连续传代和所述病毒在成纤维细胞中的最终适应引起的趋性限制,被规定为减毒的标志物(Gerna等人, 2005, J. Gen. Virol. 86:275; Gerna等人, 2002, J. Gen Virol. 83:1993; Gerna等人, 2003, J. Gen Virol. 84:1431; Dargan等人, 2010, J. Gen Virol. 91:1535)。已经将造成人CMV实验室毒株中的上皮细胞、内皮细胞、白细胞和树突细胞趋性损失的突变定位至3个可读框(ORF):UL128、UL130和UL131 (Hahn等人, 2004, J. Virol. 78:10023; Wang和Shenk, 2005 J. Virol. 79:10330; Wang和Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA. 102:18153)。生化和重构研究表明,UL128、UL130和UL131装配到gH/gL支架上以形成五聚体gH复合物(Wang和Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA. 102:1815; Ryckman等人, 2008 J. Virol. 82:60)。该复合物在病毒粒子中的恢复会修复实验室毒株中的病毒上皮趋性(Wang和Shenk, 2005 J. Virol. 79:10330)。
已经将内皮和上皮趋性损失推测为以前评价的疫苗诸如Towne的缺陷(Gerna等人, 2002, J. Gen Virol. 83:1993; Gerna等人, 2003, J. Gen Virol. 84:1431)。得自天然CMV感染的人受试者的血清中的中和抗体的对抗病毒上皮进入的活性比对抗成纤维细胞进入的活性高超过15倍(Cui等人, 2008 Vaccine
26:5760)。具有原发性感染的人会快速地形成针对病毒内皮和上皮进入的中和抗体,但是仅缓慢地形成针对病毒成纤维细胞进入的中和抗体(Gerna等人, 2008 J. Gen. Virol. 89:853)。此外,在来自接受Towne疫苗的人受试者的免疫血清中不存在对抗病毒上皮和内皮进入的中和活性(Cui等人, 2008 Vaccine 26:5760)。更近年来,描述了一组得自4位具有HCMV感染的供体的人单克隆抗体,并且得自该组的更有效的中和克隆识别五聚体gH复合物的抗原(Macagno等人, 2010 J. Virol.
84:1005)。
发明概述
本发明涉及条件性复制缺陷型CMV (rdCMV),以及rdCMV在治疗患者中的CMV感染或与这样的感染有关的病理学和/或降低其可能性的组合物和方法中的用途。本文描述的rdCMV包含编码一种或多种融合蛋白的核酸,所述融合蛋白包含与去稳定蛋白(destabilizing
protein)融合的必需蛋白。在没有稳定剂存在下,所述融合蛋白会被降解。因而,可以在允许复制的条件下(即,在有稳定剂存在下)在组织培养物中培养rdCMV,但是当施用给患者时(在没有稳定剂存在下),会减少复制,且优选地阻止复制。
本发明的一个实施方案是条件性复制缺陷型CMV。所述rdCMV包含编码一种或多种融合蛋白的核酸,所述融合蛋白包含与去稳定蛋白融合的必需蛋白。编码野生型必需蛋白的核酸不再存在于所述rdCMV中,且因而所述融合蛋白是病毒复制所必需的。在优选的实施方案中,所述必需蛋白选自:IE1/2、UL51、UL52、UL79和UL84,且所述去稳定蛋白是FKBP或其衍生物。
本发明的另一个实施方案是,包含分离的rdCMV和药学上可接受的载体的组合物。所述组合物可以进一步包含佐剂,所述佐剂包括、但不限于ISCOMATRIX®佐剂和磷酸铝佐剂。
本发明的另一个实施方案是,所述rdCMV组合物在患者中诱导针对CMV的免疫应答的用途。通过施用本发明的rdCMV,可以预防性地或治疗性地处理患者。预防性处理会提供足够的保护性免疫以减小CMV感染的可能性或严重程度,所述CMV感染包括原发性感染、复发性感染(即,由潜伏CMV的再活化引起的那些感染)和重叠感染(即,由与患者以前经历的CMV毒株不同的CMV毒株的感染引起的那些感染)。在具体实施方案中,给育龄女性、特别是青春期早期女性接种疫苗以减小在妊娠期间CMV感染(原发性感染、复发性感染或重叠感染)的可能性,并从而减小CMV向胎儿传播的可能性。可以进行治疗性处理以减小当前的CMV感染的持续时间/严重程度。
本发明的另一个实施方案是,制备本发明的rdCMV的方法,所述方法包括:在有Shield-1存在下,在上皮细胞诸如ARPE-19细胞(ATCC登记号CRL-2302)上繁殖所述rdCMV。在一些实施方案中,在存在于微载体或其它高密度细胞培养系统上的上皮细胞上繁殖所述rdCMV。
附图说明
图1A-1B显示了具有恢复的五聚体gH复合物表达的CMV毒株的构建示意图。(A) 用于操纵AD169病毒基因组的可自切割的细菌人工染色体(BAC)的制备策略。(B) 用于恢复它的表达的UL131中的移码突变的修复。(C) 用cre重组酶基因替换GFP以建立可自切割的CMV BAC。
图2A-2D显示了常规灭活方法对gH复合物免疫原性的影响。使用γ-辐照(A, B)和ß-丙内酯(BPL) (C, D) 来灭活表达gH复合物的CMV。通过蚀斑测定来确定灭活动力学(A, C),而通过评价得自施用了CMV的小鼠的血清中对抗病毒上皮细胞进入的中和活性来确定免疫原性(B, D)。
图3显示了表达gH复合物的CMV的Shield 1浓度依赖性的后代病毒生产,所述CMV含有与FKBP衍生物融合的不同必需蛋白。以0.01 PFU/细胞的复数用rdCMV病毒感染ARPE-19细胞1 h,用新鲜培养基洗涤2次,并在含有0、0.05、0.1 0.5或2µM Shield-1的生长培养基中温育。感染后7天,收集无细胞的病毒,并通过TCID50测定在有2µM
Shield 1存在下在ARPE-19细胞上确定病毒滴度。
图4A-4D显示了rdCMV在ARPE-19细胞中的生长动力学。以0.01 PFU/细胞的复数,用含有(A) IE1/2、(B) UL51、(C) IE1/2-UL51融合蛋白的病毒或(D) 亲本beMAD病毒感染细胞。1小时以后,将细胞用新鲜培养基洗涤2次,并在没有(空心圆圈)或有(实心圆圈) 2µM Shield-1存在下温育。在感染后的指定时间点收集无细胞的病毒,并通过TCID50测定在含有2µM Shield-1的培养基中的ARPE-19细胞上定量感染性病毒。
图5A-5E IE1/2-UL51 rdCMV在不同细胞类型中的生长动力学。用rdCMV病毒感染(A) MRC-5 (B) HUVEC (C) AoSMC (D) SKMC (E) CCF-STTG1细胞,并温育1小时。将细胞用新鲜培养基洗涤2次,然后在没有(空心圆圈)或有(实心圆圈) 2µM Shield-1存在下温育。在感染后的指定时间点收集无细胞的病毒,并通过TCID50测定在含有2µM
Shield-1的培养基中的ARPE-19细胞上定量感染性病毒。
图6A-6C 在小鼠、兔和恒河猴中的IE1/2-UL51 rdCMV的免疫原性分析。(A) 在第0和4周用beMAD (空心圆圈)或IE1/2-UL51
rdCMV(实心圆圈) 免疫小鼠。(B) 在第0、3和8周用10µg beMAD或指定的rdCMV免疫兔。(C) 在第0和8周用100µg beMAD或IE1/2-UL51rdCMV免疫恒河猴。在每种情况下,收集血清样品,并通过CMV微中和测定在ARPE-19细胞上分析。线指示每组中的中和(NT50)的几何平均滴度。
图7显示了用双重融合病毒IE1/2-UL51接种的恒河猴的纵向中和滴度。在第0、8和24周(显示为红色三角形)给恒河猴组(n=5)接种指定的疫苗剂量或制剂,一组在第0、4和24周接受gb/mf59 (30 mg/剂量)。在指定的时间点收集免疫血清,并在病毒中和测定中评价。纵向绘制NT50滴度的GMT,显示该组的标准误差。AAHS:无定形硫酸羟基磷酸铝;IMX:ISCOMATRIX;HNS:碱性缓冲液。
图8A-8D显示了以每剂100 μg (A)或10 μg (B-D)用双重融合病毒IE1/2-UL51接种的恒河猴的IFN-γELISPOT。不使用佐剂(A-B),或者使用AAHS (C)或ISCOMATRIX (D)。用代表HCMV抗原的肽库刺激PBMC。灰色条代表该组的每种抗原的GMT (n=5)。每种抗原的应答者比率显示在图内的每种抗原的顶部。
图9A-9B显示,双重融合病毒IE1/2-UL51的疫苗接种能够在恒河猴中诱导CD8+ (A)和CD4+
(B)表型的T-细胞应答。从施用100 μg或10 μg剂量的疫苗(以ISCOMATRIX®作为佐剂)的猴收集PBMC。用代表HCMV抗原的肽库刺激PBMC,随后针对IFN-γ和CD4+/CD8+表面T-细胞标志物进行染色。将数据呈现为每百万PBMC的CD4+/CD8+
阳性的、IFN-γ阳性的细胞的数目。线代表接受相同疫苗的组(n=5)的几何平均值(GMT)。在图底部的数字代表2个接种疫苗组(n=10)的GMT。CMV:纯化的病毒;SEB:用作阳性对照试剂的促分裂原;IMX:ISCOMATRIX。
图10显示,Merck磷酸铝佐剂(MAPA)可以增强在猴中的中和抗体滴度。在第0和8周,用30 μg剂量的在HNS (碱性缓冲液)、AAHS或MAPA中配制的双重融合病毒疫苗免疫恒河猴。在第12周收集血清样品,并评价中和滴度。线代表该组的几何平均值。
图11A-11B显示了表达gH的CMV在不同温度下在汉克平衡盐溶液(HBSS)中的稳定性。(A) 在指定的温度下将CMV样品在HBSS中储存4天,然后使用病毒进入测定来测量CMV病毒稳定性。(B) 使用病毒进入测定结果,计算样品的EC50值。* 指示,由于侵染性的完全丧失,不可计算EC50。
图12A-12B显示了在室温下pH对表达gH的CMV的稳定性的影响。(A) 在室温将CMV样品在具有不同pH的缓冲液中储存4天,然后使用病毒进入测定来测量CMV病毒稳定性。(B) 使用病毒进入测定结果,计算样品的EC50值。
图13A-13B显示了单独的尿素或与氯化钠组合的尿素对表达gH的CMV病毒稳定性的影响。(A) 将单独的2% 尿素或与150mM NaCl组合的2% 尿素加给25 mM组氨酸缓冲液(pH 6)中的CMV在室温保持4天,然后使用病毒进入测定来测量CMV病毒稳定性。(B) 使用病毒进入测定结果,计算样品的EC50值。
图14A-14B显示了离子强度对表达gH的CMV病毒稳定性的影响。(A) 将递增浓度的NaCl (0 mM、75 mM、150 mM和320 mM NaCl)加给25 mM组氨酸缓冲液(pH 6)中的CMV在室温保持4天,然后使用病毒进入测定来测量CMV病毒稳定性。(B) 使用病毒进入测定结果,计算样品的EC50值。
图15显示了冷冻保护剂对表达gH的CMV对抗冻融循环的稳定性的影响。将指定的冷冻保护剂加给25 mM组氨酸缓冲液(pH 6)中的CMV,并进行3个冻融循环,然后使用病毒进入测定来测量CMV病毒稳定性。使用病毒进入测定结果,计算样品的EC50值。
图16A-16B显示了储存温度对在小鼠免疫原性研究中诱导CMV中和抗体的影响。在第0天免疫小鼠,并在第21天加强,随后在第28天抽血。使用ARPE-19细胞测试小鼠血清中针对表达gH的CMV的中和抗体。通过非线性曲线拟合,得到NT50滴度。(A) 在免疫原性研究之前,将CMV样品在不同温度下储存3个月。(B) 在免疫原性研究之前,且在融化后,将CMV样品在不同温度下储存8小时。
发明详述
本发明涉及条件性复制缺陷型CMV (rdCMV),以及rdCMV在治疗患者中的CMV感染或与这样的感染有关的病理学和/或降低其可能性的组合物和方法中的用途。本文描述的rdCMV编码一种或多种融合蛋白,所述融合蛋白包含与去稳定蛋白融合的必需蛋白而非野生型必需蛋白。在没有稳定剂存在下,所述融合蛋白会被宿主细胞机(host
cell machinery)降解。在有稳定剂存在下,所述融合蛋白被稳定化,且不会被降解。
用于本发明中的合适融合蛋白保留足够的必需蛋白活性,以促进在有稳定剂存在下在宿主细胞中的病毒复制,并造成在没有稳定剂存在下CMV复制的下降(优选地大于50%、75%、90%、95%或99%的下降)。优选地,用于所述融合蛋白中的必需蛋白编码非结构蛋白,且因而不会被包装进rdCMV病毒粒子中。在本文中鉴别出的合适必需蛋白包括由必需基因IE1/2、UL51、UL52、UL79和UL84编码的CMV蛋白。
去稳定蛋白和稳定剂的一个实例描述在美国专利公开2009/0215169中,其公开了使用小分子调控蛋白稳定性的组合物、系统和方法。简而言之,将蛋白与影响稳定性的蛋白FKBP或其衍生物融合。外源添加的、细胞可渗透的小分子Shield-1 (Shld-1)会与FKBP或其衍生物相互作用并稳定所述融合蛋白。在没有Shield-1存在下,FKBP或其衍生物引导所述融合蛋白被宿主细胞机降解。
在本发明的一个实施方案中,将必需的CMV蛋白与FKBP或其衍生物融合。在有Shield-1存在下,所述融合蛋白被稳定化。但是,在没有Shield-1存在下,FKBP或其衍生物引导所述融合蛋白被宿主细胞机制降解。
在没有融合蛋白存在下,会降低(优选地,与不含去稳定的必需蛋白的CMV相比,大于50%、75%、90%、95%或99%)或阻止rdCMV的复制。
要在本发明的方法中使用的重组病毒也在它的病毒粒子上展示免疫原性的五聚体gH复合物。
实施方案也包括本文描述的重组CMV或其组合物、或包含所述CMV或组合物或者由它们组成的疫苗,其(i) 用于以下用途中,(ii) 用作用于以下用途中的药物,或(iii)用于制备用于以下用途中的药物:(a) 治疗(例如,人体);(b) 药物;(c) 抑制CMV复制;(d) 治疗或预防CMV感染,或,(e) 治疗、预防一种或多种CMV相关疾病,或者延迟一种或多种CMV相关疾病的发作或进展。在这些用途中,重组CMV、其组合物、和/或包含所述CMV或组合物或者由它们组成的疫苗可以任选地与一种或多种抗病毒剂(例如,抗病毒化合物或抗病毒免疫球蛋白;下文描述的联合疫苗)联合使用。
本文中使用的术语“诱导免疫应答”表示,条件性复制缺陷型CMV在施用它的患者(优选哺乳动物,更优选人)中产生免疫应答的能力,其中所述应答包括、但不限于要素(诸如抗体)的产生,所述要素特异性地结合、且优选地中和CMV和/或造成T细胞活化。“保护性免疫应答”是这样的免疫应答:其减小患者遭受CMV感染(包括原发性感染、复发性感染和/或重叠感染)的可能性,和/或改善至少一种与CMV感染有关的病理学,和/或减轻CMV感染的严重程度/持续时间。
本文中使用的术语“免疫学上有效的量”表示,当施用给患者时可以诱导针对CMV的免疫应答的免疫原的量,所述免疫应答可以保护患者免于CMV感染(包括原发性感染、复发性感染和/或重叠感染),和/或改善至少一种与CMV感染有关的病理学,和/或减轻患者中CMV感染的严重程度/持续时间。所述量应该足以显著减小CMV感染的可能性或严重程度。可以使用本领域已知的动物模型来评估免疫原施用的保护作用。例如,可以对抗体或细胞毒性的T细胞的中和能力或者免疫T细胞的细胞因子产生能力来测定得自施用免疫原的个体的免疫血清或免疫T细胞。常用于这样的评价的测定包括、但不限于病毒中和测定、抗病毒抗原ELISA、干扰素-γ细胞因子ELISA、干扰素-γELISPOT、细胞内多细胞因子染色(ICS)和51铬(Chromimium)释放细胞毒性测定。还可以使用动物攻击模型来确定免疫原的免疫学上有效的量。
本文中使用的术语“条件性复制缺陷型病毒”表示,可以在某些环境中复制、但是不可在其它环境中复制的病毒颗粒。在优选的实施方案中,通过使病毒复制必需的一种或多种蛋白的去稳定,使病毒成为条件性复制缺陷型病毒。编码野生型非去稳定的必需蛋白的核酸不再存在于条件性复制缺陷型病毒中。在一种或多种必需蛋白被去稳定的条件下,病毒复制与不含去稳定的必需蛋白的病毒相比下降了优选大于50%、75%、90%、95%、99%或100%。但是,在使去稳定的必需蛋白稳定化的条件下,病毒复制可以以不含去稳定的必需蛋白的CMV的复制量的优选至少75%、80%、90%、95%、99%或100%进行。在更优选的实施方案中,通过与去稳定蛋白(诸如FKBP或其衍生物)融合,使一种或多种必需蛋白去稳定。这样的融合蛋白可以通过稳定剂(诸如Shield-1)的存在而稳定化。本文中使用的术语“rdCMV”表示条件性复制缺陷型巨细胞病毒。
在优选的实施方案中,由复制缺陷型病毒诱导的免疫应答与它的活病毒对应物相比在程度和/或宽度方面是相同的或基本上类似的。在其它优选的实施方案中,通过电子显微术分析得到的复制缺陷型病毒的形态学与它的活病毒对应物之间是无法区别的或与其基本上类似。
本文中使用的术语“FKBP”表示SEQ ID NO:11的去稳定蛋白。含有FKBP的融合蛋白会被宿主细胞机降解。本文中使用的术语“FKBP衍生物”表示,已经被一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加改变的FKBP蛋白或其部分。所述FKBP衍生物当与蛋白融合时保留FKBP的基本上所有的去稳定性能,且也保留FKBP的被Shield-1稳定化的基本上所有的能力。优选的FKBP衍生物在指示的氨基酸位置处具有以下取代中的一个或多个:F15S、V24A、H25R、F36V、E60G、M66T、R71G、D100G、D100N、E102G、K105I和L106P。具有F36V和L106P取代的FKBP衍生物(SEQ ID NO:12) 是特别优选的。在优选的实施方案中,编码FKBP或FKBP衍生物的核酸含有至少一些在人类中不常用于内源FKBP的密码子。这会降低融合蛋白的FKBP或FKBP衍生物与人基因组中的它的对应物重排或重组的可能性。SEQ ID NO:13的核酸序列使用这样的密码子编码SEID NO:12。
本文中使用的术语“Shield-1”或“Shld1”表示,结合野生型FKBP及其衍生物并作为稳定剂起作用的合成小分子。与F36V衍生物的结合牢固度是野生型FKBP的约1,000倍(Clackson等人, 1998, PNAS
95:10437-42)。可以合成Shield-1 (基本上如以下文献中所述:Holt等人, 1993, J. Am. Chem. Soc. 115:9925-38和Yang等人, 2000, J. Med.
Chem. 43:1135-42和Grimley等人, 2008, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters
18:759),或者可商购得自Cheminpharma LLC (Farmington, CT)或Clontech Laboratories, INC. (Mountain View, CA)。Shield-1的盐也可以用在本发明的方法中。Shield-1具有以下结构:
本文中使用的术语“融合的”或“融合蛋白”表示,作为氨基酸的同一连续序列的部分在框架内排列的2个多肽。融合可以是直接的(使得在多肽之间不存在额外氨基酸残基)或间接的(使得存在小氨基酸接头以改进性能或增加功能性)。在优选的实施方案中,所述融合是直接的。
本文中使用的术语“五聚体gH复合物”或“gH复合物”表示,在CMV病毒粒子表面上的5个病毒蛋白的复合物。所述复合物由装配到gH/gL支架上的UL128、UL130和UL131所编码的蛋白构成(Wang和Shenk, 2005 Proc
Natl Acad Sci USA. 102:1815; Ryckman等人,
2008 J. Virol. 82:60)。得自CMV毒株AD169的复合物蛋白的序列显示在GenBank登记号NP_783797.1 (UL128)、NP_040067
(UL130)、CAA35294.1 (UL131)、NP_040009 (gH, 也被称作UL75)和NP_783793 (gL, 也被称作UL115)。一些减毒的CMV毒株具有在UL131中的一个或多个突变,使得所述蛋白不被表达,且因此不会形成gH复合物。在这样的情况下,应当修复UL131
(使用诸如在Wang和Shenk,
2005 J. Virol. 79:10330中的方法),使得gH复合物在本发明的rdCMV中表达。本发明的病毒表达5个构成五聚体gH复合物的病毒蛋白,并在病毒包膜上装配所述五聚体gH复合物。
本文中使用的术语“必需蛋白”表示病毒在体内和在组织培养物中复制所必需的病毒蛋白。CMV中的必需蛋白的实例包括、但不限于:IE1/2、UL37x1、UL44、UL51、UL52、UL53、UL56、UL77、UL79、UL84、UL87和UL105。
本文中使用的术语“去稳定的必需蛋白”表示这样的必需蛋白:其被表达,并在病毒复制中执行它的功能,且在没有稳定剂存在下被降解。在优选的实施方案中,所述必需蛋白与去稳定蛋白(诸如FKBP或其衍生物)融合。在正常生长条件(即,不存在稳定剂)下,融合蛋白被表达,但是被宿主细胞机降解。所述降解不允许必需蛋白在病毒复制中起作用,因而必需蛋白在功能上被敲除。在有稳定剂(诸如Shield-1)存在的条件下,融合蛋白被稳定化,且可以在可维持病毒复制的水平执行它的功能,所述病毒复制优选地为不含有去稳定的必需蛋白的CMV的复制量的至少75%、80%、90%、95%、99%或100%。
复制缺陷型
CMV
本发明的方法使用表达五聚体gH复合物的复制缺陷型CMV
(rdCMV)。根据本发明的方法,可以使表达五聚体gH复合物的任何减毒的CMV病毒成为复制缺陷型。在一个实施方案中,所述减毒的CMV是,由于UL131基因中的突变的修复而已经恢复gH复合物表达的AD169 (参见实施例1)。
条件性复制缺陷型病毒这样的突变体:其中一种或多种必需病毒蛋白已经被必需蛋白的去稳定对应物替代。所述去稳定对应物由编码必需蛋白和去稳定蛋白之间的融合蛋白的核酸编码。所述去稳定的必需蛋白可以仅起在稳定剂存在时支持病毒复制的作用。在优选的实施方案中,使用在美国专利公开2009/0215169中描述的方法将条件性复制缺陷表型赋予表达五聚体gH复合物的CMV。简而言之,使CMV复制必需的一种或多种蛋白与去稳定蛋白FKBP或FKBP衍生物融合。编码野生型必需蛋白的核酸不再存在于rdCMV中。在有外源添加的、细胞可渗透的小分子稳定剂Shield-1 (Shld-1) 存在下,所述融合蛋白被稳定化,且所述必需蛋白可以起支持病毒复制的作用。在有稳定剂存在下,所述rdCMV的复制优选地为不含去稳定融合蛋白的CMV (例如,用于构建rdCMV的亲本减毒CMV)的复制量的至少75%、80%、90%、95%、99%或100%。在没有Shield-1存在下,所述融合蛋白的去稳定蛋白引导所述融合蛋白基本上被宿主细胞机降解。在没有或有小量必需蛋白存在下,CMV不能以在患者中产生或维持CMV感染的量复制。在没有稳定剂存在下,所述rdCMV的复制不会发生,或与不含去稳定融合蛋白的CMV(例如,用于构建rdCMV的亲本减毒CMV)相比减少了优选大于50%、75%、90%、95%或99%。
使用本领域众所周知的重组DNA方法,将编码用于CMV复制和/或CMV感染的建立/维持的必需蛋白的核酸与编码FKBP或其衍生物的核酸连接。编码的融合蛋白包含在框架内与必需蛋白融合的FKBP或FKBP衍生物。编码的融合蛋白在有Shield-1存在下是稳定的。但是,编码的融合蛋白在没有Shield-1存在下是去稳定的,且被靶向破坏。在优选的实施方案中,所述FKBP是SEQ ID NO:11。在其它优选的实施方案中,所述FKBP衍生物是包含一个或多个选自以下的氨基酸取代的FKBP:F15S、V24A、H25R、F36V、E60G、M66T、R71G、D100G、D100N、E102G、K105I和L106P。在一个更优选的实施方案中,所述FKBP衍生物包含F36V和/或L106P取代(SEQ ID NO:12)。在一个更优选的实施方案中,所述FKBP衍生物由SEQ
ID NO:13编码。
通过与FKBP或其衍生物融合而靶向去稳定的必需蛋白:1) 是病毒复制所必需的;2) 可以适应去稳定蛋白的融合,而不显著破坏所述必需蛋白的功能;和3) 可以适应编码FKBP或其衍生物的核酸在编码所述必需蛋白的病毒ORF的5'或3'末端处的插入,而不显著破坏其它周围病毒基因的ORF。在优选的实施方案中,通过与FBBP或其衍生物融合而靶向去稳定的必需蛋白编码非结构蛋白,且如此一来具有降低的被包装进重组CMV病毒粒子中的可能性。表1显示了满足前述标准的CMV基因。
表1: 为FKBP融合体的构建而选择的病毒基因
* 根据Mocarski, Shenk和Pass, Cytomegalovirus, 在Field
Virology中, 2701-2772, 编辑: Knipes和Howley, 2007。
本发明包括包含融合蛋白的rdCMV,所述融合蛋白含有与去稳定蛋白融合的必需蛋白或其衍生物。必需蛋白衍生物含有相对于野生型必需蛋白的一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失,但是仍然可以在有Shield-1存在下提供必需蛋白的活性至少完全足以支持病毒复制。测量病毒活性的实例提供在下文的实施例中。本领域已知的方法可以用于确定目标CMV必需蛋白和衍生物之间的差异程度。在一个实施方案中,使用序列同一性来确定相关性。本发明的衍生物将优选地与基础序列具有至少85%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、至少97%同一性、至少99%同一性。将同一性百分比定义为,相同残基的数目除以残基总数并乘以100。如果比对的序列具有不同的长度(由于缺口或延伸),在所述计算中将使用最长序列的长度,其代表总长度的值。
在一些实施方案中,被靶向去稳定的、病毒复制所必需的一种或多种病毒蛋白选自:IE1/2、UL51、UL52、UL84、UL79、UL87、UL37x 1、UL77和UL53或其衍生物。在一个具体实施方案中,被靶向去稳定的、病毒复制所必需的一种或多种病毒蛋白选自:IE1/2、UL51、UL52、UL84、UL79、UL87。在一个更具体的实施方案中,被靶向去稳定的、病毒复制所必需的一种或多种病毒蛋白选自:IE1/2、UL51、UL52、UL79和UL84。
通过与FKBP或其衍生物融合,可以使多于一种必需蛋白去稳定。在一些实施方案中,所述必需蛋白在CMV复制和/或感染的不同阶段(包括、但不限于,立即早期、早期或晚期阶段)起作用。在优选的实施方案中,被靶向去稳定的、病毒复制所必需的病毒蛋白的组合选自:IE1/2和UL51、IE1/2和UL52、IE1/2和UL79、IE1/2和UL84、UL84和UL51、和UL84和UL52。在一个更优选的实施方案中,在同一重组CMV中靶向去稳定IE1/2和UL51。在一个最优选的实施方案中,包含IE1/2的融合蛋白是SEQ
ID NO:1,且包含UL51的融合蛋白是SEQ
ID NO:3。SEQ ID NO:1和3可以分别由SEQ ID No:2和4编码。含有去稳定的IE1/2和UL51的rdCMV的基因组显示在SEQ ID NO:14中。
可以将FKBP或其衍生物直接地或间接地与必需蛋白融合。在优选的实施方案中,将FKBP或其衍生物直接地与必需蛋白融合。
可以将FKBP或其衍生物在必需蛋白的N-或C-端处与必需蛋白融合。在优选的实施方案中,将FKBP与必需蛋白的N-端融合。
可以将多于一种FKBP或其衍生物与必需蛋白融合。在将多于一种FKBP或其衍生物与必需蛋白融合的实施方案中,各种FKBP或其衍生物中的每一种可以是相同的或不同的。在优选的实施方案中,存在与必需蛋白融合的一种FKBP或其衍生物。
额外灭活方法
在一些实施方案中,使用化学或物理灭活,进一步灭活上述的rdCMV。这样的实例包括:热处理,用甲醛、ß-丙内酯(BPL)或二元氮丙碇(BEI) 温育,或γ辐照。优选的方法不会破坏或显著破坏免疫原性,包括、但不限于,由五聚体gH复合物诱导的免疫原性。这样,与没有经过额外灭活处理的rdCMV相比,会保留或基本上保留由已经进一步灭活的CMV引起的免疫应答。在优选的实施方案中,所述进一步灭活的CMV的诱导中和抗体的能力与没有经过额外灭活处理的rdCMV诱导的那些相当。根据经验确定通过化学或物理方法中的任一种或组合进行的灭活方案,以确保CMV(包括五聚体gH复合物)的免疫原性。
病毒复制的评价
本领域技术人员可以使用病毒复制测定来确定与FKBP或其衍生物融合的特定必需蛋白的效用。因为在有Shield-1存在下,基因表达/编码的产物功能应当基本上不受FKBP或其衍生物与必需蛋白的连接所影响,rdCMV在有Shield-1存在下应当以与亲本CMV相当的速率复制(优选亲本病毒水平的至少75%、80%、90%、95%、99%或100%)。在没有Shield-1存在下,rdCMV的复制与亲本CMV相比显著改变(与不含去稳定性融合蛋白的CMV相比,下降了优选大于50%、75%、90%、95%、99%或100%)。
在优选的实施方案中,在有至少2 μM Shield-1存在下,rdCMV复制非-rdCMV复制的量的优选至少90%、更优选至少95%、最优选至少99%。
在一个实施方案中,在有至少2 μM Shield-1存在下,包含本发明的rdCMV的组合物具有至少105
pfu/ml、更优选至少107 pfu/ml的病毒滴度。
相反,在没有Shield-1存在下,rdCMV应当基本上不复制。通过所述控制在不允许病毒复制的条件下的严谨性(即,后代病毒粒子在这些条件下的感染滴度),判断复制缺陷机制的质量。在没有Shield-1存在下,本发明的rdCMV基本上不可复制(在细胞培养物中或在患者体内)。它在ARPE-19细胞和其它类型的人原代细胞中的复制是条件性的,且需要培养基中大于0.1 μM、优选至少2 μM的Shield-1的摩尔浓度来支持病毒复制。
在一个实施方案中,在没有Shield-1存在下,包含本发明的rdCMV的组合物具有小于2 pfu/ml、更优选地小于1 pfu/ml的病毒滴度。
可以使用用于评估CMV复制的方法来评估在没有或有Shield-1存在下的rdCMV复制。但是,在优选的实施方案中,使用TCID50。
在另一个实施方案中,通过50% 组织培养物感染剂量(TCID50) 测定,确定rdCMV滴度。简而言之,该稀释测定会量化杀死50% 的受感染宿主所需的病毒的量。将宿主细胞(例如,ARPE-19细胞) 铺板,并加入所述病毒的系列稀释物。温育以后,针对每种病毒稀释度观察和记录细胞死亡(即受感染的细胞)的百分比。使用结果来数学计算TCID50。
在另一个实施方案中,使用蚀斑测定来确定rdCMV滴度。病毒蚀斑测定会确定病毒样品中的蚀斑形成单位(pfu)的数目。简而言之,用不同稀释度的rdCMV感染汇合的单层宿主细胞(例如,ARPE-19细胞),并覆盖半固体培养基(诸如琼脂或羧甲基纤维素),以防止病毒感染无差别地扩散。当病毒感染固定的细胞单层内的细胞时,形成病毒蚀斑。病毒感染的细胞将裂解并将感染传播至邻近细胞,在此处重复感染至裂解循环。受感染的细胞区域将产生蚀斑(由未感染的细胞包围的感染区域),所述蚀斑可以用肉眼或用光学显微镜看到。将蚀斑计数,并与用于制备平板的稀释因子相组合地使用所述结果来计算每个样品的单位体积的蚀斑形成单位的数目(pfu/mL)。pfu/mL结果代表样品内的感染性颗粒的数目,且基于以下假设:每个形成的蚀斑代表一个感染性病毒颗粒。
在另一个实施方案中,使用hu-SCID小鼠模型来评价rdCMV在体内复制的能力。简而言之,将人胎儿组织(诸如胸腺和肝脏)的碎片通过外科手术植入SCID小鼠的肾被膜中。2-3个月后,当人组织血管化时,接种rdCMV。在蚀斑测定中接种以后3-4周,评估病毒滴度。所述动物实验可以在没有或有Shield-1存在下进行。
免疫应答的评价
本发明的rdCMV给患者的施用会引起针对CMV的免疫应答,优选保护性免疫应答,所述免疫应答可以治疗患者中的CMV感染或与这样的感染有关的病理学和/或降低其可能性。所述免疫应答至少部分地归因于五聚体gH复合物。
使用本领域已知的方法,可以评估由rdCMV引起的免疫应答。
可以使用本领域已知的动物模型来评估rdCMV的施用的保护作用。在一个实施方案中,可以测定得自施用了rdCMV的个体的免疫血清的中和能力,包括、但不限于,病毒向宿主细胞附着或进入的阻断。在其它实施方案中,可以测定得自施用了rdCMV的个体的T细胞在有目标抗原存在下产生细胞因子(包括、但不限于,干扰素γ)的能力。还可以使用动物攻击模型来确定免疫原的免疫学上有效的量。
病毒中和表示,能够阻断病毒的进入和/或在培养物中复制的病毒特异性抗体。用于测量中和活性的常见测定是病毒蚀斑减少测定。本发明中的中和测定表示可以阻断病毒进入细胞中的血清滴定。将NT50滴度定义为,在病毒中和测定中阻断50%的输入病毒的血清稀释度的倒数。从非线性对数4-参数曲线拟合得到NT50滴度。
复制缺陷型
CMV
的制备
本发明包括制备所述rdCMV的方法。在有稳定剂(诸如Shield-1)存在下在上皮细胞、优选人上皮细胞和更优选人视网膜色素上皮细胞上繁殖本发明的rdCMV。在其它实施方案中,所述人视网膜色素上皮细胞是作为登记号CRL-2302保藏在美国典型培养物保藏中心(American
Type Culture Collection,ATCC)的ARPE-19细胞。在一些实施方案中,Shield-1以至少0.5µM的浓度存在于组织培养基中。在优选的实施方案中,Shield-1以至少2.0µM的浓度存在于组织培养基中。
在一些实施方案中,在微载体上培养用于繁殖所述rdCMV的细胞。微载体是允许粘附细胞在旋转烧瓶或生物反应器(诸如旋转壁微重力生物反应器和流化床生物反应器)中生长的支持基质(support
matrix)。微载体通常是125 - 250µM球体,所述球体具有允许它们在轻轻搅拌下维持悬浮的密度。微载体可以由许多不同的材料制成,所述材料包括、但不限于,DEAE-葡聚糖、玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺和胶原。微载体可以具有不同的表面化学物质,包括、但不限于,细胞外基质蛋白、重组蛋白、肽和带电荷的分子。还可以使用其它高密度细胞培养系统,诸如Corning
HyperFlask®和HyperStack®系统。
可以收集无细胞的组织培养基,并可以从其中纯化rdCMV。CMV病毒颗粒具有约200 nm的直径,且可以使用本领域已知的技术与存在于收获的培养基中的其它蛋白分开,所述技术包括、但不限于通过密度梯度或20% 山梨醇垫(cushion)的超速离心。通过Bradford测定,可以确定疫苗的蛋白质量。
可以使用Shield-1控制连接有FKBP的rdCMV的复制。在组织培养细胞中完成期望量的病毒繁殖以后,不再需要复制能力。从rdCMV除去Shield-1以使病毒成为复制缺陷型(例如,以便施用给患者)。在一个实施方案中,通过洗涤一次或多次,纯化rdCMV与Shield-1分开。在另一个实施方案中,通过超速离心纯化rdCMV与Shield-1分开。在另一个实施方案中,通过渗滤纯化rdCMV与Shield-1分开。渗滤常用于纯化病毒颗粒。在一个实施方案中,使用具有大约750千道尔顿孔径的过滤器,其仅允许Shield-1穿过孔。
纯化rdCMV与Shield-1分开后,在rdCMV组合物中可能存在小量残余的Shield-1。在一个实施方案中,在纯化以后,CMV组合物中的Shld-1的水平比在组织培养物中维持复制所需的水平低至少100倍。在另一个实施方案中,在纯化以后,rdCMV组合物中的Shield-1的水平是0.1 μM或更低。在另一个实施方案中,在纯化以后,rdCMV组合物中的Shield-1的水平是不可检测的。
使用LC/MS (液相层析法-质谱法)或HPLC/MS (高效液相层析法-质谱法) 测定,可以检测确定组合物中的Shield-1水平。这些技术将LC或HPLC的物理分离能力与质量分析能力相组合,且可以检测复杂混合物中的目标化学品。
佐剂
佐剂是可以辅助免疫原产生免疫应答的物质。佐剂可以通过不同的机制起作用,所述机制例如以下的一种或多种:增加抗原生物学或免疫学半衰期;改善向抗原呈递细胞的抗原递送;改善抗原加工和抗原呈递细胞的呈递;实现剂量减小(dose-sparing),和诱导免疫调节性细胞因子的产生(Vogel, 2000, Clin Infect Dis 30:S266)。在一些实施方案中,本发明的组合物包含rdCMV和佐剂。
多种不同类型的佐剂可以用于辅助产生免疫应答。特定佐剂的实例包括:氢氧化铝;磷酸铝、羟基磷酸铝、无定形硫酸羟基磷酸铝佐剂(AAHSA)或其它铝盐;磷酸钙;DNA CpG基序;单磷酰脂质A;霍乱毒素;大肠杆菌热不稳定的毒素;百日咳毒素;胞壁酰二肽;弗氏不完全佐剂;MF59;SAF;免疫刺激性的复合物;脂质体;可生物降解的微球;皂苷;非离子的嵌段共聚物;胞壁酰肽类似物;聚膦腈;合成的多核苷酸;IFN-γ;IL-2;IL-12;和ISCOMS (Vogel, 2000, Clin Infect Dis 30:S266; Klein等人, 2000, J Pharm Sci 89:311; Rimmelzwaan等人, 2001, Vaccine 19:1180; Kersten, 2003,
Vaccine 21:915; O’Hagen, 2001,
Curr. Drug Target Infect. Disord. 1:273)。
在一些实施方案中,在本发明的组合物中不使用基于油的佐剂,包括、但不限于,不完全弗氏佐剂和MF59。
在其它实施方案中,在本发明的组合物中使用微粒佐剂,包括、但不限于,ISCOMATRIX®佐剂和/或磷酸铝佐剂。
药物组合物
本发明的进一步的特征是本文描述的重组CMV在组合物(优选免疫原性组合物或疫苗)中的用途,所述组合物用于治疗具有CMV感染的患者和/或降低CMV感染的可能性。所述组合物适当地包含药学上可接受的载体。
“药学上可接受的载体”意在表示可以在全身施用中安全地使用的液体填充剂、稀释剂或包入胶囊(encapsulating)物质。取决于特定施用途径,可以使用本领域众所周知的多种药学上可接受的载体。这些载体可以选自:糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石粉、硫酸钙、植物油、合成的油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液(包括磷酸盐缓冲盐水)、乳化剂、等渗盐水、和无热原的水。具体地,药学上可接受的载体可以含有不同的组分,诸如缓冲剂、注射用无菌水、生理盐水或磷酸盐缓冲盐水、蔗糖、组氨酸、盐和聚山梨酯。术语诸如“生理上可接受的”、“稀释剂”或“赋形剂”可以互换使用。
疫苗配制程序公开在,例如,New Generation Vaccines (1997, Levine等人, Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong),其通过引用并入本文。
制剂
在一些实施方案中,将本发明的rdCMV施用给患者以引起免疫应答。合乎需要的是,在免疫原性组合物的储存期间,避免rdCMV组合物效能的损失或者使其最小化。支持这样的目的的条件包括、但不限于:(1) 在储存中持续的稳定性,(2) 耐受施加的冻融循环,(3)在环境温度稳定多达1周,(4) 维持免疫原性,(5) 与佐剂策略相容。影响rdCMV稳定性的条件包括、但不限于:缓冲液pH、缓冲液离子强度、特定赋形剂的存在/不存在和温度。所述组合物包含缓冲剂以增加适合作为疫苗组合物的纯化的rdCMV病毒颗粒的稳定性。
通过在小鼠中的免疫原性测定和/或病毒进入测定可以评估病毒颗粒的完整性的保持。病毒进入事件依赖于病毒糖蛋白(包括五聚体gH复合物)的完整性和功能。五聚体gH复合物也会提供rdCMV的大部分免疫原性,因而两种性质是有关联的。
在一些实施方案中,在包含15-35 mM组氨酸和100-200
mM NaCl的缓冲液(在5-7之间的pH)中保存rdCMV。在一个更具体的实施方案中,所述缓冲液包含25 mM组氨酸和150 mM NaCl,具有pH6。
在其它实施方案中,可以添加糖以提供额外稳定性,诸如多元醇(包括、但不限于,甘露醇和山梨醇);单糖类(包括、但不限于,葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖);二糖类(包括、但不限于,乳糖、麦芽糖、麦芽糖、蔗糖、乳果糖和海藻糖)和三糖(包括、但不限于,棉子糖和松三糖)。在一个更具体的实施方案中,所述糖是蔗糖。在一个甚至更具体的实施方案中,所述蔗糖是在5-15%之间。
在优选的实施方案中,在包含25 mM组氨酸、150
mM NaCl、9% 蔗糖的缓冲液(在pH 6)中保存rdCMV。
施用
使用本文提供的指导以及本领域众所周知的技术,可以配制本文描述的rdCMV,并施用给患者。在例如以下文献中一般地提供了关于药物施用的指导方针:Vaccines,Plotkin和Orenstein编辑, W.B. Sanders Company, 1999; Remington's
Pharmaceutical Sciences 第 20 版, Gennaro编辑, Mack
Publishing, 2000;和Modern
Pharmaceutics 第 2 版, Banker和Rhodes编辑, Marcel Dekker, Inc., 1990。
可以通过不同的途径施用疫苗,诸如皮下的、肌内的、静脉内的、粘膜的、胃肠外的、经皮的或真皮内的途径。使用例如针或喷射注射器,可以进行皮下和肌内施用。在一个实施方案中,肌内地施用本发明的疫苗。通过真皮内注射器针头注射或启用装置(诸如微米针或微米阵列贴剂),可以实现经皮或真皮内递送。
可以以与剂量制剂相容的方式且以诸如免疫原性地有效治疗CMV感染(包括原发性感染、复发性感染和/或重叠感染)和/或减小所述CMV感染的可能性的量施用本文描述的组合物。在本发明上下文内,施用给患者的剂量应当足以:在患者中随时间实现有益应答,诸如降低CMV感染的水平、改善与CMV感染有关的疾病的症状、和/或缩短CMV感染的持续时间和/或严重程度,或者减小CMV感染(包括原发性感染、复发性感染和/或重叠感染)的可能性。
合适的给药方案可以由本领域技术人员容易地确定,且优选地考虑本领域众所周知的因素来确定,所述因素包括:患者的年龄、重量、性别和医学病症;施用途径;期望的作用;和采用的具体组合物。在确定要在针对CMV的治疗或预防中施用的rdCMV的有效量时,医师可以评价病毒的循环血浆水平、疾病的进展和/或抗-CMV抗体的产生。疫苗组合物的剂量由103-1012蚀斑形成单位(pfu)的范围组成。在不同的实施方案中,所述剂量范围为104-1010
pfu、105-109 pfu、106-108 pfu或在这些所述范围内的任意剂量。当要施用多于一种疫苗时(即,在联合疫苗中),每种疫苗试剂的量是在它们的描述范围内。
可以以单次剂量或多次剂量形式施用疫苗组合物。可以在施用之前数小时或数天与佐剂一起制备疫苗,进行一种或多种稳定缓冲剂和合适的佐剂组合物的鉴别。可以以在0.1
mL至0.5 mL范围内的常用体积施用疫苗。
给药的时机取决于本领域众所周知的因素。在初次施用以后,可以施用一个或多个额外剂量以维持和/或加强抗体滴度和T细胞免疫。可能需要额外加强来维持保护性的免疫应答水平,反映在抗体滴度和T细胞免疫诸如ELISPOT中。这样的免疫应答水平是临床研究的对象。
就联合疫苗接种而言,可以在一种组合物中一起施用或在不同组合物中分开施用每种免疫原。与一种或多种期望的免疫原并行地施用本文描述的rdCMV。术语“并行地”不限于严格同时施用治疗剂,而是指,将本文描述的rdCMV和其它期望的一种或多种免疫原在一定时间间隔内依次施用给受试者,使得它们可以一起起作用以提供与以其它方式施用它们相比增加的益处。例如,可以同时施用或在不同时间点以任意次序顺序地施用每种治疗剂;但是,如果不同时施用,那么应当在时间上足够靠近地施用它们,从而提供期望的治疗效果。可以单独地、以任意适当的方式和通过任意合适的途径施用每种治疗剂。
患者群体
“患者”表示能够被CMV感染的哺乳动物。在一个优选的实施方案中,所述患者是人。可以预防性地或治疗性地处理患者。预防性处理会提供足够的保护性免疫以减小CMV感染的可能性或严重程度,所述CMV感染包括原发性感染、复发性感染(即,由潜伏CMV的再活化引起的那些感染)和重叠感染(即,由与患者以前经历的CMV毒株不同的CMV毒株的感染引起的那些感染)。可以进行治疗性处理以减轻CMV感染的严重程度、或减小复发性感染或重叠感染的可能性/严重程度。
使用包含如本文中所述的rdCMV的药物组合物,可以进行处理。可以将药物组合物施用给一般群体,特别是处于CMV感染(不论原发性感染、复发性感染还是重叠感染)的高危中的那些人,或者CMV感染对于他们而言将是特别有问题的那些人(诸如免疫受损的个体、移植患者或孕妇)。在一个实施方案中,给育龄女性、特别是青春期早期女性接种疫苗以降低在妊娠期间的CMV感染(不论原发性感染、复发性感染还是重叠感染)的可能性。
需要处理的那些人包括已经具有感染的那些人,以及易于发生感染或其中需要降低感染可能性的那些人。处理可以改善与CMV感染有关的疾病的症状,和/或缩短CMV感染(包括由潜伏CMV的再活化引起的感染)的持续时间和/或严重程度。
具有CMV感染(不论原发性感染、复发性感染还是重叠感染)的高危的人包括:免疫减弱的患者,或面临导致免疫减弱的治疗的患者(例如,经历针对癌症的化学疗法或放射疗法或服用免疫抑制性药物)。本文中使用的“免疫减弱”表示这样的免疫系统:其由于免疫应答不能正常起作用或不能以正常健康成年人的水平起作用而具有降低的对抗感染的能力。免疫减弱的患者的实例是婴儿患者、年幼儿童患者、老年人患者、孕妇患者或患有影响免疫系统功能的疾病(诸如HIV感染或AIDS)的患者。
实施例
下面提供实施例来进一步例证本发明的不同特征。所述实施例也例证了用于实践本发明的有用方法。这些实施例不限制要求保护的发明。
实施例1:五聚体 gH 复合物的恢复
构建感染性的CMV细菌人工染色体克隆,使得编码的病毒粒子表达装配至gH/gL支架上的、由UL128、UL130和UL131组成的五聚体gH复合物。
CMV毒株AD169毒株最初分离自7岁女孩的腺样体(adenoids)(Elek和Stern, 1974, Lancet, 1:1)。将该病毒在几种类型的人成纤维细胞中传代58次以将病毒减毒(Neff等人, 1979, Proc Soc
Exp Biol Med, 160:32),其中在WI-38人成纤维细胞中进行最后5次传代。AD169病毒的该传代变体在该研究中被称作Merck AD169 (MAD169),用作亲本病毒来构建感染性的BAC克隆。亲本病毒AD169和传代变体病毒MAD169都不表达UL131或五聚体gH复合物。
使用MAD169作为亲本病毒来构建感染性的细菌人工染色体(BAC)
克隆。BAC载体是允许在大肠杆菌中遗传操作大尺寸DNA片段(诸如CMV基因组(~230Kb) )的分子工具。将BAC元件与GFP标记基因一起插入在US28可读框的终止密码子之后紧邻处(在病毒基因组的US28和US29 ORF之间),在所述片段的两端处建立LoxP位点(图1A)。简而言之,合成含有GFP表达盒(其侧接2个loxP位点)和CMV US28-US29序列的DNA片段,并克隆进pBeloBAC11载体。将BAC载体用限制酶Pme I线性化,并与提取自纯化的病毒粒子的MAD169
DNA一起共转染进MRC-5细胞。将通过绿色荧光表达鉴别出的重组变体进行蚀斑纯化。1轮扩增以后,从受感染的细胞中提取圆形的病毒基因组,并电穿孔进大肠杆菌DH10细胞。通过PCR针对来US28和US29区域的存在筛选细菌菌落。通过EcoR I、EcoR V、Hind III、Spe I和Bam HI限制分析,进一步检验候选克隆。筛选后,一个克隆bMAD-GFP表现出与亲本MAD169病毒相同的限制图谱。
在大肠杆菌中遗传修复UL131的第一个外显子中的移码突变,其为MAD169中的上皮趋性缺乏的根源(图1B)。具体地,从UL131基因中的7核苷酸A-段中删除一个腺嘌呤核苷酸(nt) (图1B)。1nt的删除足以拯救由UL131引起的上皮和内皮细胞趋性,因而五聚体gH复合物现在被表达。通过ELISA和蛋白质印迹来证实表达(数据未显示)。通过LoxP/Cre重组除去BAC段,从而进一步修饰该克隆。将BAC DNA转染进ARPE-19细胞,即人视网膜色素上皮细胞(ATCC登记号CRL-2302),以回收感染性病毒(图1C)。得到的感染性病毒(被称作BAC-衍生的上皮向性的MAD169病毒(beMAD) )与MAD169的差别仅在于2个基因座:(1) UL131 ORF,其中单个腺嘌呤核苷酸被删除,和(2)插入在US28和US29 ORF之间的34bp LoxP位点(参见表2)。
将BAC克隆beMAD的基因组完全测序。beMAD的整个基因组结构与在ATCC AD169变体(GenBank登记号X17403)中报道的相同,其包含2个独特区域:独特长区域(UL)和独特短区域(US)。每个独特区域被2个重复序列括上(bracketed):末端重复长序列(TRL)-内部重复长序列(IRL),末端重复短序列(TRS)-内部重复短序列(IRS)。传代的变体MAD169和beMAD衍生出的病毒在MRC-5细胞(一种人成纤维细胞细胞系)(ATCC登记号CCL-171)中的生长动力学是无法区别的(数据未显示)。因为在成纤维细胞上的生长不需要gH复合物,MAD169和beMAD之间的gH复合物表达的差异是不相关的。
表2:CMV病毒的分子差异
实施例2:常规灭活方法对 gH 复合物的影响
研究了2种常规病毒灭活方法γ-辐照和ß-丙内酯(BPL) 对表达gH的CMV的影响。
在冷冻干燥的病毒粒子上进行γ-辐照。使用保守的冷冻干燥循环(-50℃冷冻和在-35℃初次干燥约30小时,随后在25℃二次干燥6小时),将在HNS (25 mM组氨酸, 150 mM NaCl, 9% w/v蔗糖, pH
6.0) 制剂中的浓度为0.15 mg/mL的重组CMV疫苗冷冻干燥以得到干粉。在3 mL玻璃瓶中冷冻干燥疫苗,每个瓶装有0.5ml。在冷冻干燥结束时,在氮气环境中给瓶盖上塞子,并取出样品,贴标签,压弯(crimped),并在-70℃储存直到γ辐照。在Co辐照器下照射瓶期望的辐照剂量。
就BPL处理而言,将BPL储备溶液加入到在ARPE-19细胞上生长的粗制病毒培养物上清液中,以达到0.01%或0.1% (v/v)的终浓度。在不同的时间点用硫代硫酸钠终止反应。然后通过超速离心纯化BPL处理过的表达gH的CMV。
通过蚀斑测定在ARPE-19细胞中确定两种方法的灭活动力学。简而言之,制备病毒样品在PBS中的系列稀释物,并使用0.1 mL接种已经用ARPE-19细胞接种的6-孔板的每个孔。将平板在37℃温育1小时,然后加入6 mL/孔的含有0.5% 琼脂糖的覆盖培养基。将平板在37℃温育18天。为了使蚀斑可视,向每个孔中加入约0.5
mL以5 mg/mL的MTT溶液(溴化噻唑蓝四氮唑, Sigma M5655)。将平板在37℃温育2-4小时,并在看片灯下计数蚀斑(图2A和2C)。
通过确定在小鼠中诱导中和抗体滴度,测定灭活的表达gH的CMV的免疫原性。简而言之,在第0和3周,用2.5µg CMV/剂量免疫雌性Balb/c小鼠(n=10)。在第4周收集血清,并评价对抗病毒上皮进入的中和活性。将中和滴度(NT50) 定义为,与阴性对照相比,造成病毒上皮进入的50%下降的血清稀释度的倒数。得自小鼠免疫原性研究的结果表明,两种常规灭活方法对由表达gH的CMV诱导的中和抗体滴度具有负面效应(图2B和2D)。NT50滴度的下降与γ-辐照或BPL的处理持续时间有关。就在小鼠中的免疫原性而言,延长的处理会使得表达五聚体gH复合物的CMV更类似于亲本AD169 CMV。当测试用γ-辐照或BPL灭活的疫苗时,在兔和恒河猴中观察到了类似的结果(数据未显示)。这些观察结果表明,五聚体gH复合物在所选择的灭活条件下对两种灭活方法是敏感的。
实施例3:FKBP- 必需蛋白融合体的构建和筛选
使用减毒的AD169毒株骨架构建CMV,其恢复它的上皮趋性,同时是条件性复制缺陷型。使用在实施例1中描述的方法恢复上皮趋性。
基于2个标准,选择要与FKBP衍生物融合的病毒蛋白。首先,所述目标蛋白通过蛋白组学分析没有在CMV病毒粒子中检测出(Varnum等人, 2004, J. Virol. 78:10960),因而,减小了将FKBP融合蛋白掺入病毒中的可能性。其次,所述目标蛋白是病毒在组织培养物中的复制所必需的。
使用beMAD作为亲本病毒,将FKBP衍生物(SEQ ID NO:12) 与12种必需病毒蛋白个别地融合,所述必需病毒蛋白包括IE1/2 (SEQ ID NO:1)、pUL37x1、pUL44、pUL51 (SEQ ID NO:3)、pUL52
(SEQ ID NO:5)、pUL53、pUL56、pUL77、pUL79 (SEQ ID
NO:7)、pUL84 (SEQ ID NO:9)、pUL87和pUL105。还构建了含有与FKBP融合的2种不同必需蛋白的病毒,其将IE1/2和UL51中的每一种与FKBP衍生物融合(含有去稳定的IE1/2和UL51的rdCMV的基因组显示在SEQ ID NO:14中)。构建以后,将所有重组BAC DNA转染进ARPE-19细胞中,并在含有Shld-1的培养基中培养。
检验了病毒生长对Shld-1的依赖性。在蚀斑测定中在2µM Shld-1中容易地拯救了IE1/2、UL51、UL52、UL84、UL79和UL87融合病毒(数据未显示)。UL37x 1、UL77和UL53病毒也产生蚀斑,但是蚀斑较小,并且它们比亲本beMAD显著更慢地生长。将Shld-1浓度增加至10µM没有显著加速病毒的生长(数据未显示)。没有回收UL56和UL105融合体,这提示,这些蛋白的标签会破坏这些蛋白的功能或邻近基因的表达。
在其它实验中使用不同浓度的Shld-1以进一步评估在有或没有Shld-1存在下的病毒复制。以0.01 pfu/ml的MOI,用表达gH的CMV感染ARPE-19细胞,所述CMV也含有与必需蛋白融合的FKBP衍生物。感染1小时以后,将细胞用新鲜培养基洗涤2次,以从接种物除去Shld-1。然后将接种物加给在含有0.05、0.1、0.5或2µM Shield-1的培养基中培养的ARPE-19细胞。感染后7天,收集在上清液中的无细胞的后代病毒,并在补充了2 mM Shield-1的ARPE-19细胞上滴定。通过50% 组织培养物感染剂量(TCID50) 测定,确定病毒滴度。简而言之,该稀释测定会量化杀死50%的受感染宿主所需的病毒的量。将ARPE-19细胞铺板,并加入病毒的系列稀释物。温育以后,针对每一病毒稀释度手动观察和记录细胞死亡(即受感染的细胞)的百分比。使用结果来数学计算TCID50。
如在图3中所示,所有含有CMV的FKBP融合体的有效复制依赖于Shield-1浓度,尽管程度有所不同。较低浓度的Shield-1通常会降低后代病毒产生的滴度。在具有单一融合体的病毒中,仅UL51和UL52绝对需要Shield-1才能复制。其它具有单一融合体IE1/2、UL84、UL79和UL87的病毒在没有Shield-1存在下可以产生可检测的后代病毒。当FKBP衍生物与UL51或UL52融合时,所述调节最紧密。
在有或没有2µM Shld-1存在下,将具有IE1/2、UL51、IE1/2-UL51融合体的病毒的生长动力学与亲本beMAD病毒进行了对比。如在图4中所示,在有Shld-1存在下,单一或双重融合体具有与亲本beMAD相当的生长动力学。但是,在没有Shld-1存在下,仅IE1/2可以复制,尽管以比亲本beMAD更低且更慢的速率。
还在不同的细胞类型中测试了双重融合病毒中的病毒复制的控制紧密度(图5)。这些细胞包括人脐静脉细胞(HUVECs)、MRC-5成纤维细胞、主动脉平滑肌细胞(AoMCs)、骨骼肌细胞(SKMCs)和CCF-STTG1星形细胞瘤细胞。以0.01 pfu/细胞的MOI(除了用5 pfu/细胞的MOI感染的CCF-STTG1以外),用IE1/2-UL51融合病毒感染细胞,然后在有或没有Shield-1存在下在培养基中温育。在有Shield-1存在下,所有细胞类型能够支持裂解性病毒复制。在没有Shield-1存在下,没有检测到病毒产生。
实施例4:IE1/2-UL51 双重融合病毒在动物中的免疫原性
在小鼠、兔和恒河猴中评价了IE1/2-UL51双重融合病毒的免疫原性。首先在小鼠中对比了对抗IE1/2-UL51双重融合病毒或亲本beMAD病毒的剂量依赖性的中和应答(图6A)。在第0和4周用beMAD或IE1/2-UL51双重融合病毒以在0.12µg至10µg范围内的剂量免疫6周龄雌性BALB/c小鼠。收集来自第6周的血清样品,并如以前所述通过CMV微中和测定在ARPE-19细胞上进行分析(Tang等人, Vaccine, “A
novel throughput neutralization assay for supporting clinical evaluations of
human cytomegalovirus vaccines”, 2011年8月30日电子出版,见doi:10.1016/j.vaccine.2011.08.086)。以0.12、0.37、1.1、3.3和10µg的剂量对比了应答。在低剂量范围(0.12-1.1µg),beMAD具有稍微更高的免疫原性,当剂量水平高于0.37µg时稳定地检测到中和抗体。在高剂量范围(3.3和10µg),由两种病毒诱导的中和抗体滴度是可比较的。
接着,以10µg的剂量在兔中对比了不同病毒的免疫原性。在第0、3和8周用10µg beMAD或指定的融合病毒免疫雌性NZW兔。收集第10周的血清,并通过CMV微中和测定在ARPE-19细胞上进行分析(图5B)。beMAD、单一融合病毒IE1/2或UL51和双重融合病毒IE1/2-UL51可以诱导比MAD169(一种类似于AD169且缺乏五聚体gH复合物的病毒)显著更高的中和抗体滴度。这证实,所述病毒对gH复合物的表达会显著增加重组CMV的免疫原性。
接着,在恒河猴中测试了100µg双重融合IE1/2-UL51病毒或亲本beMAD病毒的免疫原性。收集第12周的血清,并通过CMV微中和测定在ARPE-19细胞上进行分析。在第12周(第3次剂量以后)的GMT NT50滴度分别为11500或15600。这些滴度与在天然地感染的个体中观察到的NT50滴度相当(图5C)。
在恒河猴中证实了双重融合病毒IE1/2-UL51 CMV疫苗诱导的免疫应答的持续时间。给动物接种10 μg/剂量或100 μg/剂量的双重融合病毒IE1/2-UL51 (基于总蛋白质量)。还包括含有无定形硫酸羟基磷酸铝(AAHS)或ISCOMATRIX®佐剂的10 μg/剂量疫苗的制剂。在第0、8和24周在恒河猴中施用疫苗(n=5)。为了对比,对照组在第0、4和24周接受用MF59佐剂配制的30 μg/剂量的重组gB。在纵轴上呈现了所有组的NT50滴度的倒数的几何平均值(GMT) (图7)。在疫苗接种之前,对于任何猴而言不存在>40的可检测的中和抗体滴度。对于所有组而言,在第4周在第一剂量以后检测到最小中和活性,中和抗体滴度在第12周和第28周 (分别在第二次和第三次疫苗接种以后4周) 左右达到峰值。100 μg/剂量组在第28周的峰GMT为14,500 (高于10 μg/剂量组的4,660滴度约3倍)。与10 μg/剂量组相比,ISCOMATRIX®佐剂提供了辅助益处,但是AAHS没有。ISCOMATRIX®组在第28周的GMT测量为15,800,而AAHS组为3,000,且10 μg/剂量组为4,660。对对照(gB/MF59)组检测最小中和活性,峰GMT从未超过200。在研究第72周,即在第0、8和24周的疫苗接种方案完成以后接近1年,100 μg/剂量组和ISCOMATRIX®制剂组的GMT分别维持在1400和3000。在此时,10 μg/剂量组和AAHS组的GMT为约200。
在疫苗接种方案的第28周(第3次剂量以后4周),从恒河猴收集外周血单核细胞(PBMC),并在IFN-γELISPOT测定中评价。给猴接种100 μg/剂量(图8A)或10 μg/剂量(图8B-8D) 的双重融合病毒IE1/2-UL51。另外,不用佐剂(图8B)或用AAHS (图8C)或ISCOMATRIX®(图8D) 佐剂来配制10 μg/剂量。使用合并的重叠肽的抗原(代表5种HCMV抗原)离体(ex-vivo)刺激IFN-γ产生。使用的HCMV抗原是IE1和IE2 (二者为病毒调节蛋白)和pp65、gB和pp150 (占优势的病毒结构抗原)。通过ELISPOT应答的量级(几何平均值)以及针对病毒抗原的应答者比率,评估T-细胞应答的质量。在疫苗接种之前,在任何猴中不存在抗原特异性的ELISPOT滴度(数据未显示)。
在第28周,针对5种HCMV抗原(即,IE1、IE2、pp65、gB和pp150)的ELISPOT应答的几何平均值分别为:100 μg/剂量组的186、132、253、87、257个斑点形成细胞(SFC)/106
PBMC,相比于10 μg/剂量组的21、24、107、111、33 SFC/106 PBMC (图8A和8B)。基于以下截止标准将每组(n=5)中的应答者评分:大于55
SFC/106 PBMC,且抗原特异性的应答比二甲亚砜(DMSO) 应答升高多于3倍。针对5种HCMV抗原(即,IE1、IE2、pp65、gB和pp150)的应答者的数目为:100 μg/剂量组的4、4、5、1、3,相比于10 μg/剂量组的1、1、5、4、0。
ISCOMATRIX®佐剂对针对10 μg/剂量的双重融合病毒IE1/2-UL51的T-细胞应答的影响显示在图8D中。针对5种HCMV抗原(即,IE1、IE2、pp65、gB和pp150)的ELISPOT应答的几何平均值分别为114、53、491、85、113 SFC/106 PBMC,该组(n=5)中的应答者的数目分别为3、2、5、3、3。在含有ISCOMATRIX®佐剂的组中的T-细胞应答的量级和宽度类似于100 μg/剂量组中的那些。
在用HCMV抗原(pp65、IE1、IE2或完整HCMV病毒粒子)刺激以后,在胞内细胞因子染色中进一步分析了用10 μg/剂量或100 μg/剂量的双重融合病毒IE1/2-UL51 (基于总蛋白质量) 和ISCOMATRIX®接种的动物的PBMC。阴性对照为一只没有接种双重融合病毒IE1/2-UL51的未接种的猴,而阳性对照为葡萄球菌肠毒素B
(staphalococcus enterotoxin B,SEB)。图9表明,阴性对照显示出针对所有抗原刺激的最小应答,但是如预期的对阳性对照试剂葡萄球菌肠毒素B
(SEB)做出应答。来自两组的所有10只接种疫苗的猴以类似的量级和模式对HCMV-特异性的抗原做出应答。为所有10只猴计算针对每种抗原的几何平均值。所有猴在用CMV抗原肽库(即,pp65、IE1和IE2)刺激它们的PBMC时表现出可比较的CD8+ (图9A)和CD4+ (图9B) T-细胞应答,但是当用完整HCMV病毒粒子刺激时优先表现出CD4+ T-细胞应答。这不是意外的,因为完整病毒粒子是蛋白抗原,并且可能被加工为外源性抗原并由MHC
II类分子呈递给CD4+ T-细胞。双重融合病毒IE1/2-UL51可以引起CD4+和CD8+表型的T-细胞应答,类似于在具有HCMV感染的健康受试者中常见的那些。
针对它们的在恒河猴中产生中和抗体的能力,对比了双重融合病毒IE1/2-UL51和铝盐的不同制剂(图10)。用HNS (基础缓冲液)、无定形硫酸羟基磷酸铝(AAHS)或Merck磷酸铝佐剂(MAPA)配制30 μg/剂量的双重融合病毒IE1/2-UL51,并在第0和8周施用。在第12周收集的血清样品表明,尽管MAPA会增强中和抗体诱导,但是所述增强不是统计学上显著的(双尾不成对t检验)。
实施例5:用于储存的缓冲液的鉴别
将在HBSS (汉克平衡盐溶液)中并在-70℃储存备用的CMV病毒用适当的缓冲液稀释~10x。在每个样品中,HBSS缓冲液的剩余组分包括氯化钾0.533 mM、磷酸二氢钾0.044
mM、磷酸氢二钠0.034 mM、氯化钠13.79
mM、碳酸氢钠0.417 mM和葡萄糖0.1%
w/v。然后将样品在室温或在2℃-8℃温度之间储存4天或冻融。就冻融而言,将样品在-70℃储存至少1小时,并在室温融化30分钟,进行1个或3个循环。在第4天使用病毒进入测定测试样品的稳定性。简而言之,使用几种不同的样品稀释度进行测定以得到响应曲线,并通过非线性曲线拟合从病毒进入测定结果得到EC50
(µg/mL)值。更低的EC50值代表更好的稳定性。将稳定性样品的EC50值与-70℃冷冻的对照样品进行对比。
病毒进入测定会测量CMV的感染ARPE-19细胞和表达IE1 (立即早期蛋白1)的能力。在透明的96-孔平板中进行该测定。使用IE1特异性的第一抗体和生物素化的第二抗体检测固定的细胞中的靶蛋白,并使用IR染料800CW链霉抗生物素蛋白以及Sapphire
700/DRAQ5 (用于细胞输入标准化)定量得自每个孔的荧光信号。将结果绘图为800/700积分强度比(积分比)相对于CMV浓度(总蛋白, µg/mL)。还使用非线性曲线拟合从侵染性测定结果得到EC50值。由于ARPE-19细胞的病毒感染依赖于病毒糖蛋白抗原(尤其是五聚体gH复合物)的完整性,EC50值反映了在这些条件下保存病毒颗粒的完好性。
如在图11中所示,当在HBSS中在室温储存4天时,CMV丧失侵染性。此外,当通过病毒进入测定进行评估时,在HBSS中的3个冻融循环会导致侵染性的完全丧失。因而,HBSS不是用于CMV储存的最佳缓冲液。
使用3-8的pH范围,在室温检验了pH对CMV稳定性的影响。使用下述缓冲液:柠檬酸盐缓冲液(25 mM),pH
3.0;乙酸盐缓冲液(25 mM),pH 4;乙酸盐缓冲液(25 mM),pH 5;组氨酸缓冲液(25 mM),pH 6;HEPES缓冲液(25 mM),pH 7;汉克平衡盐溶液(HBSS),pH 7.5和Tris缓冲液(25 mM),pH 8。
通过用适当的缓冲液将病毒储备物(viral bulk)稀释10倍,制备样品。将样品在室温(25℃) 储存4天。在第4天,利用病毒进入测定,测量样品的稳定性。将在-70℃在HBSS中冷冻储存的CMV处理为对照。在时间0和在第4天得到每个样品的UV-Vis谱,以检验在储存期间发生的结构变化和聚集。
如在图12中所示,与测试的其它pH相比,pH 6的25 mM组氨酸缓冲液通过在室温保留更高的侵染性而给CMV提供更好的稳定性。UV光谱的二阶导数(second derivative)指示所述病毒在所有pH下的类似结构概况(数据未显示)。如通过350 nm的光密度所测得的,在任何测试的pH没有观察到显著聚集(数据未显示)。
在25 mM组氨酸缓冲液(pH 6)中测试了单独的尿素或与氯化钠组合的尿素对CMV病毒稳定性的影响。单独的2% 尿素的添加对CMV稳定性没有影响。但是,与150 mM NaCl相组合的2% 尿素改善了CMV在室温的稳定性(图13)。
在pH 6检验了离子强度对CMV稳定性的影响。将递增浓度的NaCl (0 mM、75 mM、150 mM和320 mM NaCl) 加入pH 6的25 mM组氨酸缓冲液。CMV稳定性依赖于离子强度,其中更高的离子强度会导致更好的稳定性(图14)。尿素的存在对CMV稳定性没有影响或具有微小影响(数据未显示)。
另外,筛选了几种其它的赋形剂(蔗糖、山梨醇、甘油和脯氨酸) 它们对表达gH的CMV在室温下的稳定性的影响。将待测试的赋形剂加入25 mM组氨酸缓冲液(pH 6)中的CMV在室温保持4天,然后使用病毒进入测定来测量CMV病毒稳定性。计算样品的EC50值。在所有测试的赋形剂中,单独的或与9% w/v蔗糖组合的150
mM NaCl会在pH 6提供更好的稳定性(数据未显示)。因此,为CMV室温储存推荐的缓冲液是含有150 mM NaCl的25 mM组氨酸(pH 6),其含有或不含9% w/v蔗糖。
研究了冷冻保护剂在冻融期间对CMV稳定性的影响。如以前指出的(图11),当进行3个冻融循环时,在HBSS中的CMV完全丧失它的侵染性。筛选了几种冷冻保护剂(包括蔗糖、山梨醇、甘油)的降低对CMV的冻融应激的能力。对于每个冻融循环,将样品在-70℃冷冻至少1小时,并在室温融化30分钟。冷冻保护剂的添加会导致增加的病毒稳定性。此外,与测试的其它冷冻保护剂相比,与150 mM氯化钠相组合的9% w/v蔗糖会导致显著增强的病毒稳定性(图15)。因此,为在-70℃或多达3个冻融循环的CMV储存推荐的缓冲液组成是:25 mM组氨酸、150
mM NaCl和9% 蔗糖(HNS缓冲液)。
针对在3个冻融循环、冷冻(2-8℃)和室温(25℃)期间对CMV稳定性的保护,将HNS缓冲液与HBSS缓冲液进行了对比。在所有测试的储存条件下,HNS缓冲液会为CMV活病毒提供更好的稳定性(数据未显示)。
实施例6:在 HNS 缓冲液中的 CMV 稳定性
在HNS缓冲液中提供双重融合IE1/2-UL51
CMV病毒储存物,并在-70℃储存备用。以100 μg/mL的浓度(基于通过Bradford测定测量的总蛋白质含量),进行稳定性研究。用HNS缓冲液稀释储备病毒,以得到最终的病毒浓度。然后在适当的温度储存样品,并如所述的测试长达3个月。就冻融而言,将样品在-70℃冷冻至少1小时,并在室温融化30分钟。在不同的时间点取出样品,并保持在-70℃冷冻储存直到分析。
使用Bradford测定,测量样品的总蛋白质含量。样品的总蛋白质含量在3个月时段内没有变化(数据未显示)。
通过使用DLS方法测量样品的流体动力学直径,监测样品中的CMV的颗粒大小随时间的变化。该方法会监测病毒颗粒在不同储存温度随时间的任何聚集或破裂。没有观察到真正趋势,只有某些样品的颗粒大小中的零星改变(数据未显示)。结果指示,病毒颗粒是完整的,且在升高的温度下没有聚集。
实施例7:储存条件对病毒进入和免疫原性的影响
通过使CMV样品处于不同的储存温度,观察到病毒进入滴度(EC50值)的显著变化(数据未显示)。在-20℃的储存导致与2-8℃和25℃相比更低的病毒进入滴度。发现2-8℃样品的滴度是比25℃储存更低的病毒进入滴度。基于EC50值,以下述次序将储存温度排序(从最稳定至最不稳定):25℃> 2-8℃> -20℃,高至1个月时间点。对于在-20℃、2-8℃和25℃储存的样品,病毒进入滴度在3个月时间点时是不可检测的。
在稳定性研究结束时,开始小鼠免疫原性研究,以确定储存温度对CMV的诱导CMV中和抗体的能力的影响。在第0天用2.5 μg /剂量的疫苗肌内地免疫小鼠,并在第21天加强,随后在第28天抽血。使用ARPE 19细胞,测试小鼠血清的针对表达gH的CMV的中和抗体,并通过非线性曲线拟合得到NT50滴度。
评价了在不同温度储存3个月对IE1/2-UL51双重融合CMV免疫原性的影响。NT50滴度依赖于储存温度,更高的温度会导致与-70℃冷冻对照相比降低的滴度,尽管不是显著的(p=0.2584,
单因素ANOVA) (图16A)。与-70℃冷冻对照相比,在-20℃储存的制剂的NT50滴度降低了小于2倍,但是这些样品的病毒进入测定滴度显著受到影响。-20℃、2-8℃和25℃稳定性样品的NT50滴度的趋势遵循对于这些样品得到的CMV质量ELISA滴度。
评价了融化后在不同温度储存8小时对IE1/2-UL51双重融合CMV免疫原性的影响。将制剂的NT50滴度与-70℃冷冻对照进行了对比。将样品在测试的任何温度储存8小时都不会影响NT50滴度(p=0.5865, 单因素ANOVA) (图16B)。
在小鼠免疫原性研究中评价了融化样品以后双重融合IE1/2-UL51 CMV储存在25℃下的不同时间点的影响。将这些制剂的NT50滴度与-70℃冷冻对照进行了对比。将样品在25℃储存多达1周不会影响NT50滴度(p=0.1848, 不成对双尾t-检验)。在3个月时,NT50滴度下降了略微超过2倍,从而指示所述制剂在25℃储存更长时间的可能稳定性问题(数据未显示)。
通过小鼠免疫原性,评价了3个冻融循环对在HNS缓冲液中配制的双重融合IE1/2-UL51 CMV的影响。与-70℃冷冻对照相比,双重融合CMV制剂的3个冻融(F/T)循环没有影响免疫原性(p=0.2103, 不成对的双尾t-检验) (数据未显示)。
其它实施方案在以下权利要求范围内。尽管已经显示和描述了几个实施方案,但可以做出多种改变而不背离本发明的精神和范围。
Claims (43)
1.条件性复制缺陷型CMV,其包含:
(a) 五聚体gH复合物,其包含UL128、UL130、UL131、gH和gL;和
(b) 核酸,其编码必需蛋白和去稳定蛋白之间的融合蛋白,其中所述必需蛋白选自IE1/2、UL51、UL52、UL79和UL84。
2.根据权利要求1所述的条件性复制缺陷型CMV,其中所述去稳定蛋白是FKBP或FKBP衍生物,其中所述FKBP衍生物是包含一个或多个选自以下的氨基酸取代的FKBP:F15S、V24A、H25R、F36V、E60G、M66T、R71G、D100G、D100N、E102G、K105I和L106P。
3.根据权利要求2所述的条件性复制缺陷型CMV,其中所述FKBP衍生物是包含氨基酸取代F36V和L106P的FKBP。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的条件性复制缺陷型CMV,其中所述必需蛋白是IE1/2。
5.根据权利要求1-3中的任一项所述的条件性复制缺陷型CMV,其中所述必需蛋白是UL51。
6.根据权利要求1-3中的任一项所述的条件性复制缺陷型CMV,其中所述CMV包含编码至少2种融合蛋白的核酸,其中每一所述融合蛋白中的必需蛋白是不同的。
7.根据权利要求6所述的条件性复制缺陷型CMV,其中所述融合蛋白之一包含IE1/2。
8.根据权利要求6所述的条件性复制缺陷型CMV,其中所述融合蛋白之一包含UL51。
9.根据权利要求6所述的条件性复制缺陷型CMV,其中第一种融合蛋白包含IE1/2,和第二种融合蛋白包含UL51。
10.根据权利要求9所述的条件性复制缺陷型CMV,其中
(a) 所述第一种融合蛋白是SEQ ID NO:1或与SEQ
ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸;和
(b) 所述第二种融合蛋白是SEQ ID NO:3或与SEQ
ID NO:3具有至少95%同一性的氨基酸。
11.根据权利要求10所述的条件性复制缺陷型CMV,其中所述第一种融合蛋白是SEQ ID NO:1,和所述第二种融合蛋白是SEQ ID NO:3。
12.根据权利要求10所述的条件性复制缺陷型CMV,其中
(a) 所述第一种融合蛋白由SEQ ID NO:2或与SEQ
ID NO:2具有至少95%同一性的核酸编码;和
(b) 所述第二种融合蛋白由SEQ ID NO:4或与SEQ
ID NO:4具有至少95%同一性的核酸编码。
13.根据权利要求12所述的条件性复制缺陷型CMV,其中所述第一种融合蛋白由SEQ ID NO:2编码,和所述第二种融合蛋白由SEQ ID NO:4编码。
14.根据权利要求9所述的条件性复制缺陷型CMV,其中所述CMV的基因组是SEQ ID NO:14。
15.组合物,其包含根据权利要求1-14中的任一项所述的条件性复制缺陷型CMV和药学上可接受的载体。
16.根据权利要求15所述的组合物,其进一步包含佐剂。
17.根据权利要求16所述的组合物,其中所述佐剂是ISCOMATRIX®。
18.在患者中诱导针对CMV的免疫应答的方法,其包括给所述患者施用免疫学上有效量的权利要求15-17中的任一项所述的组合物。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述免疫应答是患者中针对CMV感染的保护性免疫应答。
20.根据权利要求18-19中的任一项所述的方法,其中所述CMV感染是原发性感染、复发性感染或重叠感染。
21.根据权利要求18-20中的任一项所述的方法,其中所述患者是人。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述患者具有减弱的免疫。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述具有减弱的免疫的患者具有HIV或AIDS,或者是移植受体。
24.根据权利要求21所述的方法,其中所述患者是育龄女性。
25.根据权利要求1-14中的任一项所述的条件性复制缺陷型CMV在药物制造中的用途,所述药物用于在患者中诱导针对CMV感染的保护性免疫应答。
26.根据权利要求1-14中的任一项所述的条件性复制缺陷型CMV,其用于药剂来治疗患者中的CMV感染。
27.制备根据权利要求2-14中的任一项所述的条件性复制缺陷型CMV的方法,其包括在有Shield-1存在下,在上皮细胞中繁殖重组CMV。
28.根据权利要求27所述的方法,其中所述上皮细胞是人视网膜色素上皮细胞。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述人视网膜色素上皮细胞是作为登记号CRL-2302保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)的ARPE-19细胞。
30.根据权利要求27所述的方法,其中所述Shield-1以至少0.5µM的浓度存在。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述Shield-1以至少2µM的浓度存在。
32.制备权利要求15-17中的任一项所述的组合物的方法,其包括:
(a) 在向培养基中加入了Shield-1的情况下,在上皮细胞上繁殖所述条件性复制缺陷型CMV;
(b) 从所述培养基收集所述条件性复制缺陷型CMV;
(c) 从所述条件性复制缺陷型CMV基本上去除Shield-1;和
(d) 将药学上可接受的载体加入到所述条件性复制缺陷型CMV中。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述上皮细胞是人视网膜色素上皮细胞。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述人视网膜色素上皮细胞是作为登记号CRL-2302保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)的ARPE-19细胞。
35.根据权利要求32所述的方法,其中在步骤(a)过程中,Shield-1以至少0.5µM的浓度存在于所述培养基中。
36.根据权利要求35所述的方法,其中在步骤(a)过程中,Shield-1以至少2µM的浓度存在于所述培养基中。
37.根据权利要求32所述的方法,其中所述去除为通过超速离心或渗滤。
38.根据权利要求32所述的方法,其中所述去除将Shield-1降低至0.1µM以下。
39.组合物,其包含在pH 5-7之间的缓冲液中的根据权利要求1-14中的任一项所述的条件性复制缺陷型CMV,所述缓冲液包含:
(a) 15-35 mM之间的组氨酸;和
(b) 100-200 mM之间的NaCl。
40.根据权利要求39所述的组合物,其进一步包含5-15% 之间的蔗糖。
41.根据权利要求38-39中的任一项所述的组合物,其中所述缓冲液在pH 6包含25 mM组氨酸和150 mM NaCl。
42.根据权利要求41所述的组合物,其进一步包含9% w/v的蔗糖。
43.SEQ ID NO:14的核酸。
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