JP2016501023A - 条件付き複製ウイルスベクター - Google Patents

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Abstract

本発明は、異種ポリペプチドを発現するようにかつウイルス複製の外部制御を可能とするように、組換えで改変されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に関する。該異種ポリペプチドは、抗原、抗体または免疫調節成分等の目的ポリペプチドであり得る。本発明のＣＭＶベクターは、複製欠損性、または化学的制御複製可能、または自律増殖性である。本発明はまた、インビボでの抗原に対する免疫応答の誘導、抗体または免疫調節成分の発現等のＣＭＶベクターの使用にも関する。異種ポリペプチドを発現するＣＭＶを含む組成物もまた本発明に包含される。【選択図】図２

Description

本発明は、異種ポリペプチドを発現するようにかつウイルス複製の外部制御を可能とするように遺伝子組換えで改変された、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に関する。異種ポリペプチドは、例えば、抗原、抗体または免疫調節成分等の目的のポリペプチドであり得る。本発明はまた、抗原に対する免疫応答の誘導またはインビボでの抗体または免疫調節成分の発現等の、ＣＭＶベクターの使用にも関する。
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１２年１２月４日出願の米国仮特許出願第６１／７３３，１７９号の権利を主張し、その開示内容は内容全体が参照されることにより本明細書において援用される。
電子的に提出した配列表への言及
本出願の配列表は、作成日付２０１３年１１月２２日、および４７１ＫＢサイズの、ＡＳＣＩＩフォーマットしたファイル名「２３３７３‐ＷＯ‐ＰＣＴ‐ＳＥＱＬＩＳＴ‐２２ＮＯＶ２０１３．ＴＸＴ」の配列表として、ＥＦＳ‐Ｗｅｂにより電子的に提出した。ＥＦＳ‐Ｗｅｂにより提出したこの配列表は、本明細書の一部であり、内容全体が参照されることにより本明細書において援用される。
組換えウイルスベクターは、複合抗原の提示のためのワクチンまたは生物学的機能を有する組換えタンパク質の一過性発現のためのワクチンとして、遺伝子送達ビヒクルとして研究されてきた。アデノウイルスベクターおよびアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）は、該目的のために広く使用される二つのウイルスベクターであるが、双方には遺伝子導入の適用に関して制限がある。例えば、導入効率および発現は、アデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターにおける制御が困難である。またウイルスベクターに対する免疫応答は、これらの系の反復使用を不可能にする。最後にこれらのウイルスの大きさが、大きな異種タンパク質の遺伝子配列の包含を技術的に困難にする。
本発明は、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むサイトメガロウイルス（ＣＭＶｈｅｔ）および異種配列を発現するためのベクターとしてのＣＭＶｈｅｔの使用に関する。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＭＶｈｅｔは、インビボまたはインビトロで複製することのできるヒトＣＭＶである。別の実施形態において、ＣＭＶｈｅｔは、複製欠損型（ｒｄＣＭＶｈｅｔ）である。
本発明の特定の実施形態において、ＣＭＶｈｅｔは、異種ポリペプチドを発現する条件付き複製欠損型ＣＭＶ（ｒｄＣＭＶｈｅｔ）であり、および例えば、病態（制限されるものではないが、病原体の感染、癌および遺伝性疾患を含む）を治療しおよび／または病態の可能性を減少させるための組成物および方法等における患者におけるｒｄＣＭＶｈｅｔの使用である。本明細書に記載のｒｄＣＭＶｈｅｔは、不安定化タンパク質に融合した必須タンパク質を含む、一または複数の融合タンパク質をコードする核酸を含むために複製欠損型である。安定化剤の非存在下において、融合タンパク質は分解される。従ってｒｄＣＭＶｈｅｔは、複製を可能にさせる条件下で（すなわち安定化剤の存在下で）組織培養において増殖され得るが、しかし患者に投与された場合には（安定化剤が無い場合である）、複製は減少させられ得て、好ましくは防止させられ得る。インビボで複製が起こらないときには、ｒｄＣＭＶｈｅｔは宿主細胞に感染する能力を保持し、インビボでの異種ポリペプチドの発現をもたらす。
本発明は、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む条件付き複製欠損型ＣＭＶを提供する。ｒｄＣＭＶは、不安定化タンパク質に融合した必須タンパク質を含む、一または複数の融合タンパク質をコードする核酸を含む。野生型の必須タンパク質をコードする核酸は、ｒｄＣＭＶにはもはや存在せず、従ってウイルス複製のためには融合タンパク質が必要とされる。好ましい実施形態において、必須タンパク質は、ＵＬ５１、ＵＬ５２およびＵＬ８７から成る群より選択され、不安定化タンパク質はＦＫＢＰまたはその誘導体である。
本発明はまた、単離ｒｄＣＭＶｈｅｔおよび薬剤的に許容可能な担体を含む組成物（「ｒｄＣＭＶｈｅｔ組成物」）にも関する。該組成物は、制限されるものではないが、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバント（ＣＳＬ，Ｌｔｄ．Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）および／またはいくつかの実施形態において、リン酸アルミニウムアジュバントである、アルミニウム塩アジュバントを含むアジュバントをさらに含み得る。
本発明の他の態様は、患者において異種ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法であり、前記方法はｒｄＣＭＶｈｅｔ組成物を患者に投与することを含み、ここでｒｄＣＭＶｈｅｔは該ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいる。患者は、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔを投与するという方法を使用して予防的にまたは治療的に処置され得る。予防的処置は、異種ポリペプチドを発現する病原体に対する感染の可能性または重症度を減少するのに十分な防御免疫を提供するか、またはその臨床症状の重症度、持続期間、発症または可能性を減少する。治療的処置は、現行の感染またはその臨床徴候の持続期間／重症度を減少するために実行され得る。
本発明の他の態様は、ｒｄＣＭＶｈｅｔ組成物を患者に投与することによって、患者において抗原に対する受動免疫を生じさせる方法であり、ここでｒｄＣＭＶｈｅｔは、抗原結合性タンパク質（例えば、抗体フラグメント）または抗原に結合する抗体をコードする核酸配列を含む。異種ポリペプチドは、病原体または病原体によって産生された毒であり得る抗原を中和し得る、抗体またはその一部であり得る。前記の方法は、動物モデルにおける感染攻撃からの防御（すなわち防御免疫応答の誘導）を提供し得る。患者は、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔの投与によって予防的にまたは治療的に処置され得るが、ｒｄＣＭＶｈｅｔは抗体の発現を誘導し、それによって感染またはその臨床症状の可能性または重症性を低下させるように、または流行感染またはその臨床症状の持続期間／重症性を低減させるように抗原に対する防御免疫を提供する。
本発明の別の態様は、遺伝子治療法におけるｒｄＣＭＶｈｅｔ組成物の使用である。前記の方法においてｒｄＣＭＶｈｅｔは、野生型ポリペプチドの発現の不足またはポリペプチドの必要とされる発現レベルの不足に関連する病態を患っている患者に役立ち得る、または患者が別の方法でインビボでのポリペプチドの発現から利益を得ることができる異種ポリペプチドまたはその一部をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、異種ポリペプチドは、欠失し、低下し、変異したおよび／または患者において適当に機能しないポリペプチドである。別の特定の実施形態において、異種ポリペプチドは、病態の治療において役立つがしかし潜在的な病態には寄与しないポリペプチドである。患者は、異種ポリペプチドの発現を引き起こすための本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔの投与によって、予防的にまたは治療的に処置され得る。
本発明はまた、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の存在下にＡＲＰＥ‐１９細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ＿２３０２）等の上皮細胞またはＭＲＣ‐５細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ＿１７１）等の線維芽細胞上でｒｄＣＭＶｈｅｔを増殖する事を含む、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔを作成する方法にも関する。いくつかの実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔは、マイクロキャリア上の上皮細胞または線維芽細胞上または他の高密度細胞培養系で増殖される。
本明細書を通しておよび添付の請求項において使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、別段に解すべき事情がない限り、複数への言及が含まれる。
本明細書を通しておよび添付の請求項において使用する場合、以下の定義および略語が適用される：
用語「ＣＭＶ」とは、ヒトサイトメガロウイルスを表す。
用語「条件付き複製欠損型ウイルス」とは、一定の環境下では複製し得るが、他の環境、例えば、効率的なウイルス複製に必要とされる必須成分を欠いている環境では複製し得ないが、回復した場合には、野生型ウイルスが複製し得る、宿主内で複製し得るウイルス粒子を表す。好ましい実施形態において、ウイルスは、ウイルス複製にとって必須の一または複数のタンパク質の不安定化によって条件付き複製欠損型ウイルスに作成される。野生型の非不安定化タンパク質をコードする核酸は、もはや条件付き複製欠損型ウイルスには存在しない。一または複数の必須タンパク質が不安定化される条件下においてウイルス複製は、不安定化必須タンパク質を含まないウイルスと比較して好ましくは５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％以上減少される。しかしながら不安定化必須タンパク質を安定化する条件下においてウイルス複製は、不安定化必須タンパク質を含まないＣＭＶの複製量の好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％起こり得る。より好ましい実施形態において、一または複数の必須タンパク質は、ＦＫＢＰまたはその誘導体等の不安定化タンパク質との融合によって不安定化される。当該融合タンパク質はＳｈｉｅｌｄ‐１等の安定化剤の存在によって安定化され得る。
用語「ｒｄＣＭＶ」とは、条件付き複製欠損型サイトメガロウイルスを表す。国際（特許出願）公開第ＷＯ ２０１３／０３６４６５号は、条件付き複製欠損型ＣＭＶ（ｒｄＣＭＶ）、およびＣＭＶによる感染の可能性または患者における当該感染に関連する病態を低減するためのｒｄＣＭＶの使用を開示する。
用語「融合した」または「融合タンパク質」とは、同一の連続したアミノン酸配列の一部としてインフレームに配列された二個のポリペプチドを表す。融合は、ポリペプチド間に追加のアミノ酸残基が存在しないように直接的であるか、または能力を改善または機能性を追加するためにリンカーが存在するように間接的であり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子操作の便宜上リンカーはアミノ酸を含み得る。好ましい実施形態において、融合は直接的である。
用語「必須タンパク質」または「ＣＭＶ必須タンパク質」とは、インビボおよび組織培養においてウイルス複製に必要とされるウイルスのタンパク質を表す。ＣＭＶの必須タンパク質の例には、限定されるものではないが、ＩＥ１／２、ＵＬ３７ｘ１、ＵＬ４４、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５６、ＵＬ７７、ＵＬ７９、ＵＬ８４、ＵＬ８７およびＵＬ１０５が含まれる。
用語「非必須タンパク質」とは、インビボおよび組織培養においてウイルス複製に必要とされないウイルスのタンパク質を表す。非必須遺伝子を欠損または不活化されたウイルスは、機能的な非必須遺伝子複製物を含むウイルスが複製するレベルと実質的に同じレベルで複製し得る。
本発明の実施形態において、複製欠損型ＣＭＶベクターは、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、ここで融合タンパク質は不安定化タンパク質に融合したＣＭＶ必須タンパク質を含む。一般的にこれらの融合タンパク質は、「ｄｄＣＭＶ融合タンパク質」と表さられる。本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔにおいて使用される特定の融合タンパク質は、本明細書では「ｄｄ」の後に必須タンパク質をコードする遺伝子名を伴う命名によって表され、例えば、ｄｄＵＬ５１およびｄｄＵＬ５２は、それぞれＵＬ５１およびＵＬ５２に融合された不安定化タンパク質を表す。本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸および一または複数の異種ポリペプチドをコードする一または複数の核酸の双方を含む条件付き複製欠損型ＣＭＶは、本明細書において「ｒｄＣＭＶｈｅｔ」と表され、それはさらにｒｄＣＭＶｈｅｔの後にそれが含む融合タンパク質の名称を伴う命名によって表され、例えば、「ｒｄＣＭＶｈｅｔ‐ｄｄＵＬ５１」は、（１）一または複数の異種タンパク質をコードする一または複数の核酸、および（２）ＵＬ５１に融合した不安定化タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を含む、複製欠損型ＣＭＶを表す。
用語「不安定化必須タンパク質」とは、ウイルス複製において発現されかつその機能を実行し、かつ安定化剤の非存在下において分解される必須タンパク質を表す。好ましい実施形態において、必須タンパク質は、ＦＫＢＰまたはその誘導体等の不安定化タンパク質に融合される。通常の増殖条件下において（すなわち安定化剤が存在しない条件下において）融合タンパク質は発現されるが、しかし宿主細胞機構によって分解される。分解は、ウイルス複製において必須タンパク質が機能することを可能とせず、従って必須タンパク質は機能的にノックアウトされる。Ｓｈｉｅｌｄ‐１等の安定化剤が存在する条件下において、融合タンパク質は安定化され、ウイルス複製を持続し得るレベルで、好ましくは不安定化必須タンパク質を含まないＣＭＶの複製量の少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％であるレベルでその機能を実行し得る。
用語「ＦＫＢＰ」とは、不安定化ドメイン（「ｄｄ」）タンパク質、さもなければＦＫ５０６‐結合タンパク質として知られるタンパク質を表す（米国特許第８，１７３，７９２号を参照されたい）。
「有効量」とは、異種ＤＮＡによりコードされたタンパク質に対し患者において免疫応答を誘導すること、または異種ＤＮＡによりコードされたタンパク質に関連する病原体による感染の可能性を予防または低減させること等の所望の効果を産生するために、十分なＣＭＶｈｅｔが患者に導入されることを意味する。当業者は、このレベルが変動し得ることを認識する。
「免疫学的有効量」とは、患者に投与されたときに、異種ポリペプチドを発現する病原体による感染（一次、回帰および／重複感染を含む）から患者を防御し得る、および／または感染に関連する少なくとも一の病態を回復し得る、および／または患者における感染の重症度／持続期間を低減し得る、異種ポリペプチドに対する免疫応答を誘導し得る免疫原の量を表す。該量は、感染の可能性または重症度を顕著に低減させるために十分でなければならない。当該技術分野において既知の動物モデルが、免疫原投与の防御効果を評価するために使用し得る。例えば、免疫原を投与された個体由来の抗血清または免疫Ｔ細胞は、中和能に関しては抗体または細胞障害性Ｔ細胞によって、またはサイトカイン産生能に関しては免疫Ｔ細胞によってアッセイされ得る。当該評価のために通常使用されるアッセイには、限定されるものではないが、ウイルス中和アッセイ、抗‐ウイルス抗原ＥＬＩＳＡ、インターフェロン‐ガンマ・サイトカインＥＬＩＳＡ、インターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内マルチサイトカイン染色（ＩＣＳ）、および５１クロム放出細胞毒性アッセイが含まれる。感染攻撃用の動物モデルもまた、免疫原の免疫的有効量を決定するために使用され得る。
「免疫応答を誘導する」とは、それが投与される患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくは人において免疫応答を引き起こすために、異種ポリペプチドを発現する条件付き複製欠損型ＣＭＶの能力を表し、ここで応答には、限定されるものではないが、病原体に特異的に結合し、かつ好ましくは中和しおよび／またはＴ細胞活性化を引き起こすエレメント（抗体等）の産生が含まれる。「防御免疫応答」とは、患者が感染症（一次感染、回帰感染および／または重複感染を含む）に罹患する可能性を低減する、および／または感染に関連する少なくとも一の病態を改善する、および／または感染の重症度／持続期間を低減する免疫応答である。
好ましい実施形態において、複製欠損型ウイルスによって誘導される免疫応答は、生菌ウイルスのカウンターパートと比較して程度および／広さにおいて同一または実質的に類似している。他の好ましい実施形態において、電子顕微鏡分析による複製欠損型ウイルスの形態は、その生菌ウイルスのカウンターパートと区別が不可能であるかまたは実質的に類似している。
「受動免疫」とは、抗体形態での活性な体液性免疫の移行を表す。受動免疫は、投与された抗体によって認識される病原体からの即時の防御効果を患者に提供し、および／または病原体感染に関連する少なくとも一つの病態を回復する。しかしながら、患者は病原体に対する免疫記憶を発達させず、それ故に病原体からの防御を持続するために投与される抗体を受けつづけなければならない。好ましい実施形態において、受動免疫を与えるためにモノクローナル抗体が、より好ましくはヒトまたはヒト化抗体が患者に投与される。
「遺伝子治療」は、目的ポリペプチドまたはその部分の病態に罹患している患者における発現を表し、ポリペプチドの発現から利益を得ることができる。目的ポリペプチドは、患者において存在しないか、低下しているか、突然変異しているかおよび／または適当に機能していないポリペプチドであり得て、結果として病態を引き起こし得るかまたは寄与し得る。あるいは目的ポリペプチドは、病態の治療に役立つものであり得るが、しかし潜在的な病態には寄与しない。目的ポリペプチドをコードする一または複数の核酸は、送達ビヒクル（ｒｄＣＭＶｈｅｔ等）によって患者の中に導入される。
「患者」とは、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔ内の異種ポリペプチドによって予防および、または治療され得る疾患に罹患しうる哺乳動物を表す。患者は、病態（例えば、ウイルス、細菌または寄生中による感染または癌）に対する、免疫応答の調節に対する、損傷した生物学的機能の回復に対する免疫応答から利益を得ることができる（例えば、遺伝子治療）。
用語「五量体ｇＨ複合体」または「ｇＨ複合体」とは、ＣＭＶビリオンの表面上の五つのウイルスタンパク質を表す。複合体は、ｇＨ／ｇＬスキャフォールド上でアセンブルされるＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１によってコードされるタンパク質で構成される（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，２００５ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：１８１５；Ｒｙｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：６０）。
図１Ａ〜１Ｂは、五量体ｇＨ複合体の回復した発現を有するＣＭＶ株の構築の模式図を示す。（Ａ）ＡＤ１６９ウイルスゲノムを操作するための自己切除可能な細菌人工染色体（ＢＡＣ）生成のための戦略。（Ｂ）その発現を回復するためのＵＬ１３１におけるフレームシフト変異の修復。（Ｃ）自己切除可能なＣＭＶ ＢＡＣを作成するためのｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子によるＧＦＰの置換。 図２は、五量体ｇＨ複合体を発現し種々のＦＫＢＰ融合タンパク質を有する、ＣＭＶのＳｈｉｅｌｄ１濃度依存性子孫ウイルス産生を示す。本研究において使用したＦＫＢＰ融合タンパク質は、ＦＫＢＰ誘導体（ｄｄＩＥ１／２、ｄｄＵＬ５１、ｄｄＵＬ５２、ｄｄＵＬ７９、ｄｄＵＬ８４、ｄｄＵＬ８７およびｄｄＩＥ１／２‐ＵＬ５１）に融合した必須タンパク質（ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ７９、ＵＬ８４、ＵＬ８７、ＩＥ１／２‐ＵＬ５１）を含む。ＡＲＰＥ‐１９細胞を、示した融合タンパク質を含む種々のｒｄＣＭＶウイルスにより０．０１ＰＦＵ／細胞の多重度で１時間感染し、新鮮な培地で二回洗浄し、０、０．０５、０．１、０．５または２μＭのＳｈｉｅｌｄ‐１を含む増殖培地中でインキュベートした。感染７日後に無細胞ウイルスを収集し、２μＭのＳｈｉｅｌｄ１存在下、ＡＲＰＥ‐１９細胞上でＴＣＩＤ５０アッセイによってウイルス力価を測定した。 図３Ａ〜３Ｄは、ＡＲＰＥ‐１９細胞におけるｒｄＣＭＶの成長速度論を示す。細胞を、（Ａ）ＩＥ１／２、（Ｂ）ＵＬ５１、（Ｃ）ＩＥ１／２‐ＵＬ５１融合タンパク質または（Ｄ）親ｂｅＭＡＤウイルスを含むウイルスにより０．０１ ＰＦＵ／細胞の多重度で感染した。一時間後に、細胞を新鮮な培地により２回洗浄し、２μＭのＳｈｉｅｌｄ‐１の非存在下（白丸）または存在下（黒丸）でインキュベートした。無細胞ウイルスを、感染後に示した時点で収集し、感染性ウイルスを２μＭのＳｈｉｅｌｄ‐１を含む培地中のＡＲＰＥ‐１９細胞上でＴＣＩＤ５０アッセイによって定量した。 図４Ａ〜４Ｅは、種々の細胞型におけるｄｄＩＥ１／２‐ＵＬ５１ ｒｄＣＭＶの成長速度論を示す。（Ａ）ＭＲＣ‐５（Ｂ）ＨＵＶＥＣ（Ｃ）ＡｏＳＭＣ（Ｄ）ＳＫＭＣ（Ｅ）ＣＣＦ‐ＳＴＴＧ１細胞を、ｒｄＣＭＶウイルスにより感染し、一時間インキュベートした。細胞を新鮮な培地により２回洗浄し、それから２μＭのＳｈｉｅｌｄ‐１の非存在下（白丸）または存在下（黒丸）でインキュベートした。無細胞ウイルスを、感染後に示した時点で収集し、感染ウイルスを２μＭのＳｈｉｅｌｄ‐１を含む培地中のＡＲＰＥ‐１９細胞上でＴＣＩＤ５０アッセイによって定量した。 図５Ａ〜５Ｃは、マウス、ウサギおよびアカゲザルにおけるｄｄＩＥ１／２‐ＵＬ５１ ｒｄＣＭＶの免疫原性分析を与える。（Ａ）マウスを０週目および４周目に、ｂｅＭＡＤ（白丸）またはＩＥ１／２‐ＵＬ５１ ｒｄＣＭＶ（黒丸）により免疫した。（Ｂ）ウサギを０、３および８週目に、１０μｇのｂｅＭＡＤまたは示したｒｄＣＭＶにより免疫した。（Ｃ）アカゲザルを０および８週目に、１００μｇのｂｅＭＡＤまたはＩＥ１／２‐ＵＬ５１ ｒｄＣＭＶにより免疫した。それぞれの場合に血漿試料を収集し、ＡＲＰＥ‐１９細胞上でＣＭＶマイクロ中和アッセイによって分析した。線は、各群における中和（ＮＴ５０）の幾何平均力価を示す。 図６は、二重融合ウイルスｄｄＩＥ１／２‐ＵＬ５１を接種されたアカゲザルにおける長期的な中和力価を示す。アカゲザルの群（ｎ＝５）を０、８および２４週目（黒三角で示す）に、示したワクチン用量または製剤により接種し、一方で一の群は０、４および２４週目に、ｇｂ／ｍｆ５９（３０ｍｇ／用量）により接種した。抗血清を示した時点で収集し、ウイルス中和アッセイで評価した。ＮＴ５０力価のＧＭＴを、群に対する標準誤差を付して縦にプロットした。ＡＡＨＳ：無定形アルミニウムヒドロキシルホスファートサルファート；ＩＭＸ：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）；ＨＮＳ：塩基緩衝液。 図７Ａ〜７Ｄは、用量当たり１００μｇ（Ａ）または１０μｇ（Ｂ〜Ｄ）での二重融合ウイルスｄｄＩＥ１／２‐ＵＬ５１ワクチン接種によるアカゲザルにおけるＩＦＮ‐γＥＬＩＳＰＯＴを示す。無アジュバント（Ａ〜Ｂ）、ＡＡＨＳ（Ｃ）またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（Ｄ）を使用した。ＰＢＭＣを、ＨＣＭＶ抗原を表すペプチドプールにより刺激した。灰色の棒線は、群（ｎ＝５）の各抗原に対するＧＭＴを表す。各抗原に対する応答率を、パネル内の各抗原の上部に示す。 図８Ａ〜８Ｂは、二重融合ウイルスｄｄＩＥ１／２‐ＵＬ５１のワクチン接種がアカゲザルにおいてＣＤ８＋（Ａ）およびＣＤ４＋（Ｂ）双方のＴ細胞応答を誘導し得ることを示す。ＰＭＢＣを、アジュバントとしてＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を含むワクチンの１００μｇまたは１０μｇ用量を投与されたサルから収集した。ＰＢＭＣを、ＨＣＭＶ抗原を表すペプチドプールにより刺激し、その後にＩＦＮγおよびＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞表面マーカーを染色した。データを、ＰＢＭＣの百万個当たりのＣＤ４＋／ＣＤ８＋陽性、ＩＦＮ‐γ陽性の細胞数として表した。線は、同一のワクチンを投与された群（ｎ＝５）の幾何平均（ＧＭＴ）を表す。グラフの下部の数は、双方をワクチン接種した群（ｎ＝１０）のＧＭＴを表す。ＣＭＶ：精製ウイルス；ＳＥＢ：正の対照剤として使用した分裂促進因子；ＩＭＸ：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。 図９は、Ｍｅｒｃｋリン酸アルミニウムアジュバント（ＭＡＰＡ）がサルにおいて中和抗体価を高め得ることを示す。アカゲザルを、ＨＮＳ（塩基性緩衝液）、ＡＡＨＳまたはＭＡＰＡで製剤化した二重融合ウイルスワクチンの３０μｇ用量により０および８週目に免疫した。血清試料を、１２週目に収集し、中和価を評価した。線は、群に対する幾何平均を表す。 図１０は、線維芽細胞指向性ＡＤ１６９ウイルスと上皮指向性ワクチンウイルスのプロテオーム組成物の比較を示す。実験ワクチンとしても使用された、ＢＡＣ改変上皮指向性ＡＤ１６９（ｂｅＭＡＤ）を、親ＡＤ１６９ウイルスに存在する、ＵＬ１３１ ＯＲＦ内の変異を修復することによって構築した。ＡＤ１６９およびワクチンウイルス（ｂｅＭＡＤ）のタンパク質組成は、半定量ラベルフリーショットガンプロテオミクスによって測定した。各菌株のトリプシン消化物を、ナノＬＣ‐ＭＳ／ＭＳによって繰り返し三回分析した。 分析により０．５％未満の偽陽性率で、５０個のウイルスタンパク質を同定した。識別ＭＳ信号のピークの高さに基づいてラベルフリー定量を実施し、ａｄ１６９とワクチンを鑑別するためにフォールドチェンジ値を計算した。統計学的に有意な変化を確認するために分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った（ｐ値＜０．０１）。フォールドチェンジが２倍以上高くかつＡＮＯＶＡ分析のｐ値が０．０１未満であるならば、フォールドチェンジを有意であると考えた。縞模様の棒線で示されたフォールドチェンジは有意ではないが、一方で交差線模様の棒線で示されたフォールドチェンジは有意である。もっぱら試料のどちらか一方だけに同定されたタンパク質は、視覚化のために人為的に＋／−２５のフォールドチェンジに設定した。五量体ｇＨ複合体のメンバーを、アスタリスクにより示す。破線は２倍チェンジの境界を示す。 図１１は、実施例７に記載した通り、ＣＭＶ‐ｇＬｕｃウイルスに感染した細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す。ＡＲＰＥ‐１９細胞をＣＭＶ‐ｇＬｕｃウイルスの０．０１のＭＯＩで感染し、上清を示した通り試料を収集した。試料は、分析されるまで−７０℃で保存した。試料のルシフェラーゼ活性を、Ｐｉｅｒｃｅ Ｇａｕｓｓｉａアルシフェラーゼ増殖キットを使用して定量した。 図１２は、実施例７に記載した通り、ＣＭＶ‐ｇＬｕｃウイルスにより接種したウサギにおけるルシフェラーゼ活性を示す。二匹のニュージーランドホワイトウサギに、筋肉内注射で〜１００μｇのＣＭＶ‐ｇＬｕｃウイルスを接種した。血漿試料を示した通りに収集し、分析まで７０℃で保存した。血漿のルシフェラーゼ活性を、Ｐｉｅｒｃｅ ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ増殖キットを使用して測定した。 図１３は、ＣＭＶ‐ＧＡＧ２１１（パネルＡ）およびＣＭＶ‐ＧＡＧ６０２（パネルＢ）のウイルス培養液中のＨＩＶ‐１ ＧＡＧ（ｐ２４）の検出を示す。ＡＲＰＥ‐１９細胞を、ＣＭＶ‐ＧＡＧベクターの０．０１のＭＯＩで感染した。ＧＡＧ２１１構築物を含むウイルスを、示した通りＳｈｌｄ‐１（２μＭ）の有り無しで培養した。試料を示した通り収集し、分析まで７０℃で保存した。ＧＡＧ相対信号を、定量ＥＬＩＳＡキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＨＩＶ‐１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡ）を使用して、１：１０００に希釈した培養試料について測定した。ｐ２４の推定ピーク濃度は、ＧＡＧ２１１に対しては〜３０ｎｇ／ｍＬおよびＧＡＧ６０２に対しては〜１ｎｇ／ｍＬであった。パネルＣに示すのはＣＭＶ‐ＧＡＧベクターの０．０１のＭＯＩで感染したＡＲＰＥ‐１９細胞である。細胞を、感染７２時間後に固定し透過処理し、ＨＩＶ‐１ｐ５５ＧＡＧに対するポリクローンウサギＩｇＧにより染色した。 図１４Ａ〜１４Ｂは、ＨＩＶ‐１ＧＡＧを発現するＣＭＶベクターによるワクチン接種がマウスにおいてＴ細胞応答を誘導することを示す。（Ａ）雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０および３週目に１０、３または１μｇ／用量のＣＭＶ‐ＧＡＧ２１１ワクチンの筋肉注射により免疫した。対照群に１０μｇ／用量のｄｄＵＬ５１ウイルスを投与した。７週目に、各群の三匹のマウスおよび三匹の無感作マウスからプールした脾臓細胞をＩＦＮ‐γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで試験した。（Ｂ）雌性Ｃ５７ＢＬ／６ｘＢＡＬＢ／ｃ Ｆ１マウスを、０および３週目に３μｇ／用量のＣＭＶ‐ＧＡＧ２１１ワクチンまたは１０μｇ／用量のｄｄＵＬ５１ウイルスにより免疫した。４週目に、各群の三匹のマウスおよび三匹の無感作マウスからプールした脾臓細胞を、ＩＦＮ‐γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで試験した。使用した抗原は、培地（縞模様の棒線）、ＧＡＧプール（交差模様の棒線；ＨＩＶ‐１ ｇａｇのＯＲＦ全体に対し１１アミノ酸オーバーラップする１５‐ｍｅｒのペプチドのプール）、またはＣＤ８ペプチド（白棒線；Ｈ‐２Ｋｄとして知られるＣＤ８Ｔ細胞エピトープのペプチド、Ｍｅｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ １６１：２９８５）、またはＣＭＶｐｐ６５抗原を表すペプチドプール（縞模様の棒線）であった。 図１５は、ＣＭＶベクターに感染した細胞におけるＨＩＶ ＧＡＧ発現のウェスタンブロット分析を示す。それぞれのＣＭＶ‐ｇａｇ発現性ウイルスにより感染したＡＲＰＥ‐１９細胞を、細胞の〜９０％において細胞変性効果（ＣＰＥ）が見られるまで培養した。細胞溶解物および上清の試料を回収し、ＳＤＳ ＰＡＧＥでの分析の前に９５℃で還元し変性した。ゲルをニトロセルロース膜に転写し、ＨＩＶ‐ｇａｇに対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ ＡＢ９０７１）により写しとった。大腸菌由来の組換えＨＩＶ ｇａｇ ｐ５５（ｒ‐ｇａｇタンパク質ｐ５５）を正の対照として含め、ｄｄＵＬ５１ウイルス（ｕｌ５１ｄｄと表示した）を負の対照として含めた。
発明の詳細な説明
本発明は、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶｈｅｔ）および異種配列を発現するためのベクターとしてのＣＭＶｈｅｔの使用に関する。本発明のＣＭＶベクターは、複製欠損性であるか、または化学的制御可能な複製が可能であるか、または複製可能である。従って、本発明のいくつかの実施形態において、ＣＭＶｈｅｔは、インビトロまたはインビボで複製することのできるヒトＣＭＶである。別の実施形態において、ＣＭＶｈｅｔは複製欠損型ＣＭＶ（ｒｄＣＭＶｈｅｔ）である。
本発明のいくつかの実施形態において、ＣＭＶｈｅｔは、異種ポリペプチドを発現する条件付き複製欠損型ＣＭＶ（ｒｄＣＭＶｈｅｔ）であり、および組成物におけるｒｄＣＭＶｈｅｔの使用および例えば、患者における病態の可能性を治療および／または低減する方法等の方法であり、ここで病態は、（１）患者における正常なレベルのポリペプチドの欠如、患者における変異型のポリペプチドの存在、または患者における適当に機能する／発現するポリペプチドの不足に関連しており；（２）患者におけるポリペプチドの発現に起因またはさもなければ関連しており（ここで該方法は患者におけるポチペプチドに対する免疫応答を誘導することを含む）；（３）ポリペプチドが結合する抗原に起因し（ここで該方法は抗原に対する受動免疫を誘導することを含む）；または（４）さもなければ患者に対するポリペプチドの供給によって有利な影響を受けるであろう。特定の実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔは、少なくとも一つの機能性必須タンパク質を欠いており、その代りに一または複数の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで一または複数の融合タンパク質は不安定化タンパク質に融合した必須タンパク質を含む。本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔは、一または複数の異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。安定化剤の非存在下において、融合タンパク質は宿主機構によって分解される。安定化剤の存在下では、融合タンパク質は安定化され分解されない。
本発明おける使用に適した異種ポリペプチドは、免疫応答が望まれる疾患の予防および／または治療に有用である。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、病原体感染（例えば、ウイルス、細菌または寄生虫の感染）を予防する（例えば、可能性を低減する）および／また治療するための免疫応答の誘導（例えば、抗体、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導）に有用な抗原である。他の実施形態において、異種ポリペプチドは、抗原に対する受動免疫の誘導に有用なモノクローナル抗体またはその部分である。他の実施形態において、異種ポリペプチドは、病態に罹患している患者のために利益になるポリペプチドである（例えば、免疫調節剤、遺伝性疾患において不足しているポリペプチドまたは腫瘍関連抗原）。
本発明の実施形態には：（ａ）治療（例えば、人体の治療）；（ｂ）薬剤；（ｃ）病態（例えば、病原体、癌または遺伝性疾患に起因する病態）の抑制；（ｄ）病態（例えば、病原体、癌または遺伝性疾患に起因する病態）の治療または予防または、（ｅ）病原体、癌または遺伝性疾患に関連する病態の治療、予防、またはその発症または進行の遅延、（ｉ）における使用のための、（ｉｉ）のための薬剤としての使用のための、または（ｉｉｉ）のための薬剤の調剤化における使用のための、本明細書に記載の組換えＣＭＶｈｅｔまたはその組成物、または前記のＣＭＶｈｅｔまたは組成物を含むかまたはから成るワクチンが含まれる。これらの使用において組換えＣＭＶｈｅｔ、その組成物、および／または前記のＣＭＶｈｅｔまたは組成物を含むかまたはから成るワクチンは、一または複数の抗病原体剤（例えば、抗ウイルス化合物、抗ウイルス免疫グロブリンまたは抗体；下記の混合ワクチン）と併用して任意選択的に用いられる。
複製欠損型ＣＭＶ
本発明の一態様は、条件付き複製欠損型ＣＭＶ、すなわち「ｒｄＣＭＶｈｅｔ」であり、それは：
（ａ）融合タンパク質をコードする核酸（融合タンパク質は不安定化タンパク質に融合したＣＭＶ必須タンパク質を含む）；および
（ｂ）異種ポリペプチドをコードする核酸、を含む。
前記のｒｄＣＭＶｈｅｔは、異種遺伝子を発現するためのベクターとして有用であり、異種ポリペプチドの生産を可能とする。
本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、必須タンパク質は、ＵＬ５１、ＵＬ５２およびＵＬ８７から成る群より選択される。
ａ．ＣＭＶ株
ヒトヘルペスウイルス５（ＨＨＶ‐５）としても知られるＣＭＶは、ヘルペスウイルス科のベータ亜科のメンバーとして分類されるヘルペスウイルスである。疾病管理予防センターによればＣＭＶ感染は、人間集団においてかなり広範に見出され、合衆国成人人口の推定４０〜８０％は既に感染している。ウイルスは、その宿主において生涯にわたる持続性感染を確立するが、しかしその感染は一般的に無症状である。ＣＭＶは、ゲノムサイズ〜２４０ｋｂの大きなＤＮＡウイルスであり、そのゲノム配列および構造的および機能的遺伝子地図が知られている（Ｃｈｅｅ ｅｔ ａ．，１９９０，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１２５‐６９；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１２３９６‐１２４０１；Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１４２２３‐１４２２８）。ウイルスは、細菌人工染色体技術により大腸菌において遺伝子的に操作され得る（Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １４：９５９‐７０）。興味深いことにＣＭＶの自然感染は、ヒトにおいてＣＭＶに対する強固な液性免疫および細胞性免疫を誘導し得るのであるが、血清陽性の患者はウイルス攻撃に感受性であることが明らかにされた（Ｐｌｏｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １５９：８６０‐５）。加えてＣＭＶは、インビボでの持続的感染を確立するために重要な多数の免疫回避および免疫調節タンパク質をコードする（Ｍｏｃａｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（サイトメガロウイルス）．Ｉｎ：Ｋｎｉｐｅｓ ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ ＰＭ，ｅｄｉｔｏｒｓ（編）．Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ウイルス学フィールド）：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００７：２７０１‐７２）。
ＣＭＶ臨床単離株は種々の細胞型において複製するのであるが、実験室株ＡＤ１６９（Ｅｌｅｋ ＆ Ｓｔｅｒｎ，Ｌａｎｃｅｔ １：１（１９７４））およびＴｏｗｎｅ株（Ｐｌｏｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１２：５２１（１９７５））は、ほぼ例外なく線維芽細胞でのみ複製する（Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１００２３（２００４））。線維芽細胞におけるウイルスの連続継代およびその結果として生じる適応からもたらされる指向性における制限は、弱毒化のマーカーとして明記されている（Ｇｅｒｎａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．８６：２７５（２００５）；Ｇｅｒｎａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．８３：１９９３（２００２）；Ｇｅｒｎａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．８４：１４３１（２００３）；Ｄａｒｇａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１：１５３５（２０１０））。ヒトＣＭＶ実験室株における上皮細胞、内皮細胞、白血球および樹状細胞指向性の喪失を引き起こす突然変異は、三つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１に位置付けられた（Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１００２３（２００４）；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０３３０（２００５）；Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：１８１５３（２００５））。生化学および再構成研究は、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１が五量体ｇＨ複合体を形成するためにｇＨ／ｇＬスキャフォールド上で会合することを示している（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：１８１５（２００５）；Ｒｙｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：６０（２００８））。ウイルスにおけるこの複合体の修復は、実験室株におけるウイルスの上皮指向性を修復する（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０３３０（２００５））。
いくつかの実施形態において、本発明の組換えウイルスは、五量体ｇＨ複合体を構成する五つのウイルスタンパク質を発現し、ウイルスのエンベロープ上で五量体ｇＨ複合体をアセンブルし得る。ＣＭＶ菌株ＡＤ１６９由来の複合体タンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿７８３７９７．１（ＵＬ１２８）、ＮＰ＿０４００６７（ＵＬ１３０）、ＣＡＡ３５２９４．１（ＵＬ１３１）、ＮＰ＿０４０００９（ｇＨ、ＵＬ７５としても知られる）およびＮＰ＿７８３７９３（ｇＬ、ＵＬ１１５としても知られる）で提供される。他の実施形態において、本発明の方法において使用される組換えウイルスは、そのビリオン上に五量体ｇＨ複合体を示さない。いくつかの弱毒化ＣＭＶ株は、一または複数のタンパク質が発現されず、従ってｇＨ複合体が形成されないように、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０および／またはＵＬ１３１に一または複数の突然変異を有する。そのような場合に突然変異は、本発明のｒｄＣＭＶにおいてｇＨ複合体の発現が望まれるならば、修復され得る（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，２００５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１０３３０等の方法を使用する）。一実施形態において、弱毒化ＣＭＶは、ＵＬ１３１遺伝子における突然変異の修復に起因してｇＨ複合体発現を修復したＡＤ１６９である。さらに五量体ｇＨ複合体を発現する弱毒化ＣＭＶ株が、本発明の方法により複製欠損型と成され得る。他の実施形態において、弱毒化ＣＭＶは、五量体ｇＨ複合体を発現しないＡＤ１６９、例えば、実施例１に記載のＭＡＤ１６９である。当該実施家態においてｒｄＣＭＶは、限定されるものではないが、ＭＲＣ‐５細胞等の線維芽細胞を含む非上皮細胞型で増殖される。
本発明において条件付き複製欠損型ウイルスは、一または複数の必須ウイルスタンパク質が必須タンパク質の不安定化されたカウンターパートによって置換された突然変異株である。不安定化されたカウンターパートは、必須タンパク質と不安定化タンパク質の間の融合タンパク質をコードする核酸によってコードされている。不安定化必須タンパク質は、安定化剤が存在するときにのみ、ウイルス複製を支持するように効率的に機能し得る。好ましい実施形態において、米国特許第８，１７３，７９２号に記載の方法が、五量体ｇＨ複合体を発現するＣＭＶにさらに条件付き複製欠損の表現型を与えるために使用される。つまり、ＣＭＶ複製に必須の一または複数のタンパク質が不安定化タンパク質、ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ誘導体に融合される。野生型の必須タンパク質をコードする核酸は、ｒｄＣＭＶ中にもはや存在しない。外因的に添加される、細胞膜透過性の小分子安定化剤であるＳｈｉｅｌｄ‐１（Ｓｈｌｄ‐１）の存在下において融合タンパク質が安定化され、必須タンパク質がウイルス複製を支持するために機能し得る。安定化剤の存在下におけるｒｄＣＭＶの複製は、不安定化融合タンパク質を含まないＣＭＶの複製量の好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％である（例えば、ｒｄＣＭＶを構築するために弱毒化親ＣＭＶが使用される）。Ｓｈｉｅｌｄ‐１の非存在下において融合タンパク質の不安定化タンパク質は、融合タンパク質に宿主細胞機構によって実質的に分解されるように指揮する。必須タンパク質が無いかまたは最小量しか存在しないとＣＭＶは、患者においてＣＭＶ感染を起こすまたは維持するための量で複製し得ない。安定化剤の非存在下におけるｒｄＣＭＶの複製は、起こらないかまたは不安定化融合タンパク質を含まないＣＭＶ（例えば、ｒｄＣＭＶを構築するために使用される弱毒化親ＣＭＶ）と比較すると十分でない（例えば、好ましくは５０％、７５％、９０％、９５％または９９％以上低減される）。
ｂ．ｄｄＣＭＶ融合タンパク質
本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔに含まれるのに適した融合タンパク質は、安定化剤の存在下において宿主細胞におけるウイルス複製を促進するために十分な必須タンパク質活性を保持する。安定化剤の非存在下においてＣＭＶの複製は、融合タンパク質を含まず代わりに必須タンパク質をコードする野生型遺伝子を含むＣＭＶと比較して、低減され（好ましくは５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％以上の低減）または阻止される。
本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔに含まれるｄｄＣＭＶ融合タンパク質は、不安定化タンパク質に融合した必須タンパク質またはその誘導体を含む。不安定化タンパク質、例えば、ＦＫＢＰまたはその誘導体との融合による不安定化の標的とされる必須タンパク質は：１）ウイルス複製に必須であり；２）必須タンパク質の機能を実質的に破壊することなく不安定化タンパク質の融合を受け入れることができ；および３）他の周辺ウイルス遺伝子のＯＲＦを実質的に破壊することなく必須タンパク質をコードするウイルスＯＲＦの５´または３´末端において、不安定化タンパク質またはその誘導体をコードする核酸の挿入を受け入れることができる。表１は、前記の基準に適うＣＭＶ遺伝子を示し、不安定化タンパク質、この場合はＦＫＢＰ誘導体に融合されるこれらの必須タンパク質の例示的な配列を提供する。
不安定化の標的とされる、複製に必須のウイルスタンパク質は、構造または非構造タンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態において、ｄｄＣＭＶ融合タンパク質における使用のための必須タンパク質遺伝子は、非構造タンパク質をコードし、それ故にｒｄＣＭＶビリオンにパッケージングされない。他の実施形態において、ｄｄＣＭＶ融合タンパク質における使用のための必須タンパク質遺伝子は、構造タンパク質をコードする。二以上の必須タンパク質が破壊の標的とされるさらなる他の実施形態において、融合タンパク質における使用のための必須タンパク質遺伝子は、非構造タンパク質およびタンパク質の双方をコードする。
Figure 2016501023
いくつかの実施形態において、不安定化の標的とされる、ウイルス複製にとって必須な一または複数のウイルスタンパク質は、ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ８４、ＵＬ７９、ＵＬ８７、ＵＬ３７ｘ１、ＵＬ７７、ＵＬ５３、ＵＬ４４、ＵＬ５６、ＵＬ１０５またはその誘導体から成る群より選択される。他の実施形態において、必須タンパク質は、配列番号３２（ＩＥ１／２）、配列番号３３（ＵＬ３７ｘ１）、配列番号３４（ＵＬ４４）、配列番号３５（ＵＬ５１）、配列番号３６（ＵＬ５２）、配列番号３７（ＵＬ５３）、配列番号３８（Ｕｌ５６）、配列番号３９（ＵＬ７７）、配列番号４０（ＵＬ７９）、配列番号４１（ＵＬ８４）、配列番号４２（ＵＬ８７）または配列番号４３（ＵＬ１０５）に記載のアミノン酸配列を含む。特定の実施形態において、不安定化の標的とされる、ウイルス複製にとって必須な一または複数のウイルスタンパク質は、配列番号３５（ＵＬ５１）、配列番号３６（ＵＬ５２）、配列番号４１（ＵＬ８４）、配列番号４０（ＵＬ７９）、および配列番号４２（ＵＬ８７）から成る群より選択される。より特定の実施形態において、不安定化の標的とされる、ウイルス複製にとって必須な一または複数のウイルスタンパク質は、配列番号３５（ＵＬ５１）、配列番号３６（ＵＬ５２）および配列番号４２（ＵＬ８７）から成る群より選択される。
野生型必須タンパク質と比較して一または複数のアミノ酸置換、付加および／または欠失を含む必須タンパク質誘導体は、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の存在下においてウイルス複製を支持するために少なくとも十分な必須タンパク質の活性をなお提供し得る。ウイルス活性を測定する方法の例は、下記の実施例において提供される。当該分野で既知の方法が、目的のＣＭＶ必須タンパク質と誘導体の間の差異の程度を測定するために使用し得る。一実施形態において、配列相同性が近縁性を測定するために使用される。本発明の誘導体は、基準配列に対し好ましくは少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一であり得る。パーセント相同性は、同一の残基数割る総残基数掛ける１００として定義される。アラインメントにおける配列が異なる長さであるならば（ギャップまたは伸展により）、最長配列の長さを全長の値を代表して計算において使用し得る。
従って本発明は、融合タンパク質をコードする核酸を含むｒｄＣＭＶｈｅｔを提供し、ここで該融合タンパク質は不安定化タンパク質に融合したＣＭＶ必須タンパク質を含み、ここで該必須タンパク質は：ＩＥ１／２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ８４、ＵＬ７９、ＵＬ８７、ＵＬ３７ｘ１、ＵＬ７７、ＵＬ５３、ＵＬ４４、ＵＬ５６、ＵＬ１０５またはその誘導体から成る群より選択され、およびここで該不安定化タンパク質は配列番号２９に記載のＦＫＢＰ、または配列番号２９に関連して一または複数の置換を含むＦＫＢＰ誘導体であり、ここで該置換は：Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｅ３１Ｇ、Ｆ３６Ｖ、Ｅ６０Ｇ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、Ｋ１０５Ｉ、Ｋ１０５Ｅ、およびＬ１０６Ｐから成る群より選択される。
本発明のいくつかの実施形態において、ｄｄＣＭＶ融合タンパク質の必須タンパク質部分は、必須タンパク質をコードする核酸を、不安定化タンパク質をコードする核酸に融合するために使用されるクローニングストラテジーに基づいて、完全長必須タンパク質の基準配列よりも数残基短いか長いかもしれない。このような場合、不安定化タンパク質に融合される配列は、末端において基準配列よりも短いかまたは長いであろう。いくつかの実施形態において、ｄｄＣＭＶ融合タンパク質の必須ＣＭＶタンパク質部分は、必須タンパク質基準配列よりも５、４、３、２または１アミノ酸短い。同様にｄｄＣＭＶ融合タンパク質の不安定化タンパク質部分も、特にＣＭＶ必須タンパク質に融合される末端において、１、２、３、４または５アミノ酸残基だけ基準配列よりも短いかまたは長いかもしれない。
二以上の必須タンパク質が、不安定化タンパク質、例えば、ＦＫＢＰまたはその誘導体に対する融合によって不安定化され得る。いくかの実施形態において、必須タンパク質は、ＣＭＶ複製および／または感染の異なる時期（限定されるものではないが最初期、初期または後期を含む時期）に機能する。他の実施形態において、必須タンパク質は、ＣＭＶ複製および／または感染の同一の時期に機能する。好ましい実施形態において、不安定化の標的とされる、ウイルス複製にとって必須なウイルスタンパク質の組み合せは、ウイルスの動力学の後期から選択される。特に好ましい実施形態において、不安定化の標的とされる、ウイルス複製にとって必須なウイルスタンパク質の組み合せは、ＵＬ５１／ＵＬ５２、ＵＬ５１／ＵＬ８７、ＵＬ５２／ＵＬ８７から成る群より選択される。
一実施形態において、少なくともＵＬ５１が、ｒｄＣＭＶにおける不安定化の標的とされる。他の実施形態において、ＫＦＢＰ誘導体に融合したＵＬ５１を含む融合タンパク質（ｄｄＵＬ５１）は、配列番号７である。配列番号７に記載のｄｄＵＬ５１をコードする代表的な核酸は、配列番号８に記載のヌクレオチドの配列を含む。不安定化ＵＬ５１を含むｒｄＣＭＶの代表的なゲノムは、配列番号２８に示す。
ｄｄＣＭＶ融合タンパク質は、ＣＭＶ非必須タンパク質に基づいてはならない。ＣＭＶにおける非必須タンパク質の例は、本明細書で開示されおよびＹｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１２３９６‐１２４０１においてさらに提供される。
不安定化タンパク質および安定化剤の例は、米国特許第８，１７３，７９２号に記載されており、該特許は小分子を使用するタンパク質を調節するための組成物、系および方法を開示する。つまり、タンパク質は安定性に悪影響を与えるタンパク質であるＦＫＢＰまたはその誘導体に融合される。外因的に添加された膜透過性の小分子であるＳｈｉｅｌｄ‐１（Ｓｈｌｄ‐１）は、ＦＫＢＰまたはその誘導体と相互作用し、融合タンパク質を安定化する。Ｓｈｉｅｌｄ‐１の非存在下においてＦＫＢＰまたはその誘導体は、宿主細胞機構によって分解されるように融合タンパク質を指揮する。
本発明の実施形態において、ｄｄＣＭＶ融合タンパク質の不安定化タンパク質は、ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ誘導体である。本発明のこの実施形態の代表的な実施形態において、ｒｄＣＭＶは、ｄｄＣＭＶ融合タンパク質をコードするヌクレオチドの配列、例えば、ｄｄＥ１／２（配列番号２）、ｄｄＵＬ３７ｘ１（配列番号４）、ｄｄＵＬ４４（配列番号６）、ｄｄＬ５１（配列番号８）、ｄｄＵＬ５２（配列番号１０）、ｄｄＵＬ５３（配列番号１２）、ｄｄＵＬ５６（配列番号１４）、ｄｄＵＬ７７（配列番号１６）、ｄｄＵＬ７９（配列番号１８）、ｄｄＵＬ８４（配列番号２０）、ｄｄＵＬ８７（配列番号２２）およびｄｄＵＬ１０５（配列番号２４）をコードする代表的なｄｄＣＭＶヌクレオチド配列等を含み、該ヌクレオチドの配列はＣＭＶ必須タンパク質に融合したＦＫＢＰ誘導体を含む。さらなる実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔは：配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、または配列番号２３に記載のアミノ酸の配列を有するｄｄＣＭＶ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
そのうえさらなる実施形態において、ｒｄＣＭＶは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１または配列番号２３に記載の配列を有するｄｄＣＭＶ融合基準タンパク質に対し、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。そのうえさらなる実施形態において、ｄｄＣＭＶ融合タンパク質は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３に記載の配列を有するｄｄＣＭＶ融合基準タンパク質と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０または２５個のアミノン酸の相違を有する。
別の実施形態において、不安定化タンパク質は、二つの合成リガンド、ＣＭＰ８または４‐ヒドロキシタモキシフェンの一つによって調節されうる、エストロゲン受容体のリガンド結合ドメインに基づいている（例えば、Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４：３９４２‐３９４５を参照されたい）。他の実施形態において、不安定化タンパク質は、化学リガンドＧｕａｒｄ‐１によって制御され得る大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼに基づいている（Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｈｅｍ ＆ Ｂｉｏｌ １７：９８１‐８）。
二以上の不安定化タンパク質、例えば、ＦＫＢＰまたはその誘導体が必須タンパク質に融合され得る。必須タンパク質に融合した二以上のＦＫＢＰまたはその誘導体が存在する実施形態において、それぞれ個々のＦＫＢＰまたはその誘導体は、同一であるかまたは異なり得る。他の実施形態において、必須タンパク質に融合した、一のＦＫＢＰまたはその誘導体が存在する。
当該技術分野において周知の組換えＤＮＡ法を使用して、ＣＭＶ複製および／またはＣＭＶ感染の確立／維持にとって必須のタンパク質をコードする核酸は、不安定化タンパク質、例えば、ＦＫＢＰまたはその誘導体をコードする核酸に付着される。不安定化タンパク質またはその誘導体は、直接的にまたは間接的に必須タンパク質に融合され得る。一実施形態において、不安定化タンパク質またはその誘導体は、インフレームで直接的に必須タンパク質に融合される。別の実施形態において、必須タンパク質は間接的に、すなわちリンカーにより不安定化タンパク質に融合される。不安定化タンパク質またはその誘導体は、必須タンパク質のＮ‐またはＣ‐末端において必須タンパク質に融合され得る。異なる実施形態において、不安定化タンパク質は、必須タンパク質のＮ‐末端に融合される。
ＦＫＢＰ融合タンパク質を作成するために有用な代表的なＦＫＢＰ基準配列は以下の通りである：
Figure 2016501023
ＦＫＢＰ基準配列をコードする代表的なヌクレオチド配列を、配列番号２５に示す。ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ誘導体を含む融合タンパク質は、宿主細胞機構によって分解される。本明細書で用いる場合、用語「ＦＫＢＰ誘導体」とは、配列番号２９に記載のＦＫＢＰ基準配列と比較して、一または複数のアミノ酸置換、欠失および／または付加によって改変されたＦＫＢＰタンパク質またはその部分を表す。本発明の好ましい実施形態において、ＦＫＢＰ誘導体は、配列番号２９に記載のＦＫＢＰ基準配列に対し少なくとも９０％同一である。９０％以上の同一性によって定義される構造的類似性に加えて本発明の好ましいＦＫＢＰ誘導体は、異種タンパク質、例えばＣＭＶ必須タンパク質に融合されたとき、ＦＫＢＰの不安定化性質の全てを実質的に保持し、同様にＳｉｅｌｄ‐１によって安定化されるＦＫＢＰの能力の全てを実質的に保持する。
一実施形態において、ＦＫＢＰ誘導体は、配列番号２９によって提供される基準配列と一または複数のアミノ酸置換によって異なる、アミノ酸配列を有するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＦＫＢＰタンパク質誘導体は、基準配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノン酸置換を有する。アミノ酸置換は、「保守的」（すなわちアミノ酸が同じクラスのアミノ酸（非極性、極性／中性、酸性および塩基性）、広く類似する性質を有するアミノ酸、または同じ構造を有するアミノ酸（脂肪族、ヒドロキシまたは硫黄含有、環状、芳香族、塩基性および酸性）由来の異なるアミノ酸により置換される）または「非保守的」（すなわち、アミノ酸が異なる型のアミノン酸により置換される）であり得る。大まかに言えば非保守的置換は、ポリペプチドの生物学的活性を変更することなしにはほとんど不可能であろう。
本発明の実施形態において、ＦＫＢＰ誘導体は、配列番号２９における最初のＧ（グリシン）に相当するアミノ酸位置＃１による、１５、２４、２５、３１、３６、６０、６６、７１、１００、１０２、１０５および１０６から成る群より選択されるアミノ酸位置において一または複数のアミノ酸置換を有する。本明細書で定義する場合、ＦＫＢＰ誘導体のアミノ酸位置の番号付けは、配列番号２９におけるアミノン酸位置と関連していて、たとえ誘導体の配列中にギャップがあるとしても、番号付けは配列番号２９に呼応して維持される。例えば、最初の２０個のアミノ酸としてＧＶＱＶＥ‐ＩＳＰＧＤＧＲＴＳＰＫＲＧ（配列番号３０）で始まるＦＫＢＰ誘導体は、基準配列の番号付けがギャップ合わせ後も維持されるので、このＦ１５Ｓ位置（下線部）が誘導体の配列において１４番目のアミノ酸であるにも関わらず、Ｆ１５Ｓ置換を有する。
本発明の特定の実施形態において、ＦＫＢＰ誘導体は、Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｅ３１Ｇ、Ｆ３６Ｖ、Ｅ６０Ｇ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、Ｋ１０５Ｉ、Ｋ１０５Ｅ、およびＬ１０６Ｐからなる群より選択される一または複数のアミノ酸置換を有する。いくかの実施形態において、ＦＫＢＰは配列番号２５によってコードされるポリペプチド配列である。他の実施形態において、ＦＫＢＰは、配列番号２７によってコードされるＦＫＢＰ誘導体である。いくつかの実施形態において、ＦＫＢＰ誘導体は、Ｆ３６ＶおよびＬ１０６Ｐ置換の双方を有する配列番号２６に記載の通り、置換Ｆ３６Ｖおよび／またはＬ１０６Ｐを含む。別の実施形態において、ＦＫＢＰ誘導体は、Ｆ３６ＶおよびＬ１０６Ｐ置換の一つだけしか有さない。さらなる実施形態において、ＦＫＢＰ誘導体、例えば、配列番号４４に記載のＦＫＢＰ誘導体は、置換Ｆ３６ＶおよびＫ１０５Ｅを有する。そのうえさらなる実施形態において、ＦＫＢＰ誘導体、例えば、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＦＫＢＰ誘導体等は、アミノン酸置換Ｅ３１Ｇ、Ｆ３６Ｖ、Ｒ７１Ｇ、Ｋ１０５Ｅを有する。
いくつかの実施形態において、ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ誘導体をコードする核酸は、ヒトにおいて通常使用されない、外因性のＦＫＢＰに対する少なくともいくかのコドンを含む。ヒトにおいてタンパク質をコードするために通常余り使用されないコドンを含むことは、融合タンパク質のＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ誘導体がヒトゲノム内のそのカウンターパートと再配列または組み換える得る可能性を低減させる。代表的なヌクレオチド配列は、（１）配列番号２９によって与えられるＦＫＢＰ基準配列と比較して、置換Ｆ３６ＶおよびＬ１０６Ｐを有するＦＫＢＰ誘導体をコードし（すなわち配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする）；ならびに（２）組換えのリスクを低減するために、通常ヒトにおいて通常使用されないコドンを含むように修飾された、配列番号２７によって与えられる。
Ｓｈｉｅｌｄ‐１の存在下において、ＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ誘導体を含むｄｄＣＭＶ融合タンパク質は安定である。しかしながらＳｈｉｅｌｄ‐１の非存在下において、ＦＫＢＰまたはその誘導体は、宿主細胞機構によって分解されるように融合タンパク質を指揮する。本明細書で用いる場合、用語「Ｓｈｉｅｌｄ‐１」または「Ｓｈｌｄ １」とは、野生型のＦＫＢＰおよびその誘導体に結合し安定化剤として作用する合成小分子を表す。
Ｓｈｉｅｌｄ‐１は以下の構造を有する：
Figure 2016501023
結合は、野生型ＦＫＢＰに対してと比較するとＦ３６Ｖ誘導体に対して約１、０００倍堅固である（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０４３７‐４２）。Ｓｈｉｅｌｄ‐１は、合成され得るか（基本的には、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：９９２５‐３８およびＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：１１３５‐４２およびＧｒｉｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒ １８：７５９に記載された通りである）、またはＣｈｅｍｉｎｐｈａｒｍａ ＬＬＣ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＣＴ）またはＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から販売されている。Ｓｈｉｅｌｄ‐１の塩も、本発明の方法において使用され得る。
ｃ．異種ポリペプチド
ｒｄＣＭＶは、当該技術分野において既知の組換えＤＮＡ技術を使用して、一または複数の異種ポリペプチドを発現するように作成され得る（「ｒｄＣＭＶｈｅｔ」）。
異種ポリペプチドをコードする核酸は、プロモーターおよびポリアデニレーション配列を含む遺伝子発現カセットにクローン化され得る。典型的に遺伝子発現カセットは：（ａ）目的の異種タンパク質または抗原をコードする核酸；（ｂ）タンパク質をコードする核酸に作動可能に結合されたプロモーター；および（ｃ）転写終結（ポリアデニル化）シグナル、を含む。発現カセットは任意選択的にエンハンサーエレメントを有し得る。もし完全なカセットがＣＭＶゲノム中に挿入されるならば、主に元のプロモーター配列との相同組換えの懸案のために、プロモーターはヒトＣＭＶ由来の何れか一つのプロモーターであってはならない。カッセトにおいて使用されるプロモーターは、細胞起源または他のウイルスのプロモーターであり得る。
本発明のいくつかの実施形態において、異種タンパク質は、強力なＴ細胞応答として知られる少なくとも一つのドミナントなＣＭＶ抗原に融合される。従って異種タンパク質をコードする核酸は、ドミナントなＣＭＶ抗原をコードする核酸にインフレームで直接的にまたは間接的に融合される。当該実施形態において、プロモーターは、元のＣＭＶプロモーターであることが有利である。ドミナントなＣＭＶ抗原との前記の融合は、異種ポリペプチドに顕著な免疫応答を与え、従って異種ポリペプチドが、免疫応答が望まれる免疫原または抗原である使用において特に有用である。
異種配列がドミナントなＣＭＶ抗原に融合される本発明の実施形態において、強力なＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答と関連する任意のＣＭＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、所望の個々の型の免疫応答に依存して、異種配列に融合され得る。例えば、もしＣＤ４＋応答が所望されるならば、異種配列は：ＵＬ５５（ｇＢ）、ＵＬ８３（ｐｐ６５）、ＵＬ８６、ＵＬ９９（ｐｐ２８）、ＵＬ１２２（ＩＥ２）、ＵＬ３６、ＵＬ４８、ＵＬ３２およびＵＬ１１３、から選択されるドミナントなＣＭＶ抗原をコードするヌクレオチド配列に融合され得る。別の実施形態において、もし異種配列に対するＣＤ８＋応答が所望されるならば、異種配列は：ＵＬ４８、ＵＬ８３、ＵＬ１２３、ＵＬ１２２、ＵＳ３２、ＵＬ２８、ＵＳ２９、ＵＳ３、ＵＬ３２、ＵＬ５５、ＵＬ９４およびＵＬ６９、から選択されるドミナントなＣＭＶ抗原をコードするヌクレオチド配列に融合され得る。目的の異種配列に融合され得るさらなるドミナントなＣＭＶ抗原は、Ｓｙｌｗｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０２（５）：６７３‐６８５（２００５）に開示されている。
異種配列（すなわち「導入遺伝子」）が導入される主鎖内の部位および導入遺伝子の配向に関しても、決定がなされなければならない。より具体的には導入遺伝子は、パラレルまたはアンチパラレルに挿入され得る。加えて、ベクターが必要とされるワクチン担体としての使用のために調製されていて、しかも導入遺伝子に作動可能に結合されているという、宿主細胞における導入遺伝子の発現を指揮することのできる適切な転写調節因子。「作動可能に結合された」配列には、それらが制御する核酸配列と隣接する発現制御配列、および調節された核酸を制御するためにトランス状態で、または遠くで作用する調節配列の双方が含まれる。
調節配列には：適切な発現制御配列、例えば、転写開始、終結、エンハンサーおよびプロモーター配列等；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル等；翻訳効率を高める配列（例えば、コザック共通配列）；タンパク質の安定性を高める配列および任意選択的にタンパク質の分泌を促進する配列等、が含まれる。これらの配列および他の共通のベクター要素の選択は、通常であり、多数の適した配列が当業者にとって周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、および当該論文において、例えば、３．１８〜３．２６および１６．１７〜１６．２７において引用された参考文献およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｌａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学の最新プロトコル），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）。
ＣＭＶは、例えば、単核球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、平滑筋細胞、肝細胞および間質細胞を含む種々の細胞にインビボで感染する（Ｐｌａｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．４６：１９５）。発現カセットにおいて使用されるプロモーターは、上記の細胞型の少なくとも一つにおける、プロモーターに作動可能に結合した核酸の発現を支持できなればならない。好ましくは、異種抗原を発現するために発現カセットにおいて使用されるプロモーターは、上記の細胞型の二以上において活性である。本発明の方法において使用されるプロモーターの例には、限定されるものではないが、ＣＭＶ（ＨＣＭＶ、ＭＣＭＶ、ＲＨＣＭＶおよびＧＰＣＭＶを含む）主要ＩＥプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ‐１ ＩＣＰ０またはＴＫプロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ１‐αプロモーター、ＵｂｃプロモーターおよびＰＧＫプロモーターが含まれる。好ましい実施形態において、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターが発現カセットにおいて使用される。
本発明のいくつかの実施形態において、異種ポリペプチドをコードする核酸は、元のＣＭＶウイルスプロモーターに作動可能に結合される。
本発明の方法における使用のためのポリアデニレーション配列には、限定されるものではないが、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニレーション配列およびＳＶ４０ポリアデニレーション配列が含まれる。
一または複数のエンハンサーが発現カセットに含まれる実施形態において、エンハンサーは、発現カセットにおいて使用されるプロモーターと適合性である。
ｒｄＣＭＶｈｅｔは、異種ポリペプチド発現レベルに関して当該技術分野において既知の技術（限定されるものではないが、酵素結合免疫測定法、免疫細胞化学、免疫ブロット、ＦＡＣＳ、等が含まれる）を使用してインビトロで評価し得る。例えば、ｒｄＣＭＶｈｅｔは、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の存在下において上皮細胞または線維芽細胞を感染するために使用され得る。発現される異種ポリペプチドのレベルは、導入遺伝子発現がＳｈｉｅｌｄ‐１に依存するか否かを試験するために、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の連続投与後の細胞において、またはＳｈｉｅｌｄ‐１の投与を中止した培養液中の細胞において測定され得る。
本発明の実施形態において、異種ポリペプチドは、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔによって送達される免疫原（抗原分子）であり、該免疫原には、宿主細胞におけるコードされた産物の転写および／または翻訳を指揮するために必要な調節配列を提供するヌクレオチド配列と組み合わせた導入遺伝子（すなわち、異種ヌクレオチド配列）によってコードされるポリペプチド、タンパク質または酵素産物が含まれる。導入遺伝子の組成は、ベクターの使用目的に依存する。例えば、もし免疫原性組成物が、感染病原体に特異的な哺乳動物宿主における抗体応答、または細胞介在性免疫応答を誘導するように設計されているとするならば、その場合、受容者に対し病原体‐特異的な免疫を与えると予測される少なくとも一の免疫原性産物をコードする核酸配列を利用することが適切である。その代わりに、もし組成物が癌ワクチンとしての使用のために調製されているとするならば、適切な導入遺伝子は、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）等の自己抗原の免疫原性部分を含み得て、該自己抗原は、発癌イニシエーションを予防し、または腫瘍進行を防止するために十分であり得る、特定のＴＡＡに対する宿主寛容性を破壊し、および長続きする（例えば、記憶）応答を誘導する双方のために、十分な効力の防御免疫応答を誘導するという目標により選択された。同様に、適切な免疫原性遺伝子産物は、哺乳動物宿主に感染する幅広い病原体（例えば、限定されるものではないが、ウイルス類、寄生虫類、細菌類および糸状菌類）からまたは癌または腫瘍細胞から獲得され得る。
本発明の実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔによって発現される異種ポリペプチドは、病態の治療および／または予防において有用であるポリペプチドである。一実施形態において、病態は免疫応答によって予防および／または治療され得る病態である。特定の実施形態において、異種ポリペプチドは、疾患（すなわち、ウイルス、細菌または寄生虫感染）を予防および／または治療するための免学的応答（例えば、抗体、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞を誘導する応答）を誘導するのに有用である抗原である。他の特定の実施形態において、異種ポリペプチドは、受動免疫において有用な抗体またはその部分である。他の実施形態において、異種ポリペプチドは、遺伝子治療において有用なポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、疾患（すなわち、ウイルス、細菌または寄生虫感染）を予防および／または治療するための免疫学的応答（すなわち、抗体、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞を誘導する応答）を誘導するのに有用な抗原である。他の実施形態において、異種ポリペプチドは、受動免疫を産生するのに有用な抗体または部分である。
一実施形態において、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔおよび方法は、ＨＩＶ感染を予防および／または治療するために使用し得る。患者における免疫応答を提供するために本発明の方法において使用され得る抗原には、限定されるものではないが、Ｇａｇ、Ｎｅｆ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、ｇｐ１２０（特に、ＣＤ４結合部位、Ｖ２Ｖ３ループおよびＭＰＥＲ領域）、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０およびｇｐ１４３が含まれる（Ｂｅｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２１：６６５‐７０）。
他の実施形態において、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔおよび方法は、マラリアを予防および／または治療するために使用され得る。マラリアは、原生生物マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の感染によって引き起こされる蚊媒介性の感染性疾患である。患者における免疫応答を提供するための本発明の方法において使用され得る抗原には、限定されるものではないが、サーカムスポロゾイトタンパク質（ＣＳ）、ＳＳＰ２、肝臓ステージ抗原１（ＬＳＡ‐１）、肝臓ステージ抗原３（ＬＳＡ‐３）、搬出タンパク質１（Ｅｘｐ１）、胞子虫体高スレオニン‐アスパラギンタンパク質（ＳＴＡＲＰ）、Ｐｆ５／６、メロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ‐１）、メロゾイト表面タンパク質２（ＭＳＰ‐２）、メロゾイト表面タンパク質３（ＭＳＰ‐３）、アピカルメンブレン抗原１（ＡＭＡ１）、ＥＢＡ１７５、ＳＥＲＡ５、高グルタミンタンパク質（ＧＬＵＲＰ）、リング感染赤血球表面抗原（ＲＥＳＡ）、Ｐｆｓ２５およびＰｖｓ２５が含まれる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍａｌａｒｉａ Ｊ．１１：１１）。
他の実施形態において、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔおよび方法は、結核（ＴＢ）を予防および／または治療するために使用され得る。ＴＢは、種々のマイコバクテリアの菌株、通常はマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）によって引き起こされる、一般的で多くの場合致死的な感染性疾患である。患者における免疫応答を提供するための本発明の方法において使用し得る抗原には、限定されるものではないが、カルメット・ゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｅｒ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）ワクチン株（弱毒化生ウシ結核桿菌マイコバクテリウム・ボビス（ｂｏｖｉｎｅ ｔｕｂｅｒｕｃｕｌｏｓｉｓ ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ ｂｏｖｉｓ））、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、Ｍｔｂ３２、Ｍｔｂ３９、ＥＳＡＴ‐６、ＴＢ１０．４、ヘパリン結合性赤血球凝集素抗原（ＨＢＨＡ）、ＣＰＦ‐１０、Ｒｖ１１９６、Ｒｖ０１２５、Ｒｖ３４０７およびＲｖ２６６０が含まれる（Ｈｏｆｔ，２００８，Ｌａｎｃｅｔ ３７２：１６４‐７５；Ｋａｕｆｍａｎｎ，２０１１，Ｌａｎｃｅｔ １１：６３３‐４０；Ｏｔｔｅｎｈｏｆｆ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎｎ，２０１２，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ８：１‐１２；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄｏｈｅｒｔｙ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ ３：６５６‐６６２）。
他の実施形態において、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔおよび方法は、ＨＢＶ感染を予防および／または治療するために使用しうる。患者において免疫応答を提供するための本発明の方法において使用し得る抗原には、限定されるものではないが、表面タンパク質（ＨＢｓＡｇ、ＭＨＢｓＡｇおよびＬＨＢｓＡｇを含む）、コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）、Ｘタンパク質およびウイルスポリメラーゼが含まれる。
他の実施形態において、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔおよび方法は、癌免疫療法において使用し得る。当該実施形態において、本発明は、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導するために使用され得る免疫原性組成物（例えば、癌ワクチン）を企図する。適切な組成物は、腫瘍抗原をコードする核酸配列および薬剤的に許容可能な担体を含むｒｄＣＭＶｈｅｔを含むであろう。特別の実施例においてカッセトのコード配列因子は、単一の免疫原、例えば、腫瘍関連抗原等の自己抗原由来の免疫原性ペプチド配列等をコードし得る。いくつかの実施形態において、免疫原をコードする核酸配列（すなわち導入遺伝子）は、特定の哺乳動物種における発現のためにコドン最適化され得る。他の実施形態において、コード配列は、一以上の免疫原、例えば一または複数のコドン最適化腫瘍抗原等をコードし得る。例えば、本開示のＣＭＶベクターを利用する癌ワクチンは、自己抗原、例えば：ＰＤ‐１ ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、Ｈｅｐｃａｍ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、テロメラーゼ、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ‐Ａ／ＭＡＲＴ‐１、Ｍｕｃ‐１、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１、サバイビン、ストロメライシン３、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ３、ＣＭＬ６８、ＣＭＬ６６、ＯＹ‐ＴＥＳ‐１、ＳＳＸ‐２、ＳＡＲＴ‐１、ＳＡＲＴ‐２、ＳＡＲＴ‐３、ＮＹ‐ＣＯ‐５８、ＮＹ‐ＢＲ‐６２、ｈＫＬＰ２、ＶＥＧＦ.等の組み合せをコードし得る。
特定の実施形態において、子宮頚部癌は、本発明の方法を使用して予防または治療される疾患である。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原は、当該実施形態において、使用される。患者における免疫応答を提供するための本発明の方法において使用され得る抗原には、限定されるものではないが、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１およびＬ２が含まれる。好ましい実施形態において、ＨＰＶ抗原は、病態、例えば、子宮頚部癌、または子宮頚部上皮内腺癌、子宮頚部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）グレード１、２および３を含む前癌異形成病変に関連する任意のＨＰＶ株に由来する。好ましい実施形態において、ＨＰＶ抗原は：ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２から成る群より選択されるＨＰＶに由来する；もしより好ましい実施形態であればＨＰＶは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８から選択される。
他の特定の実施形態において、ＥＢＶ関連癌は、本発明の方法を使用して予防または治療される疾患である。ＥＢＶ関連癌には、限定されるものではないが、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、多形性Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、瀰漫性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、移植後リンパ腫、Ｔ／ＮＫ細胞型リンパ腫、微咽頭癌および胃癌が含まれる。患者における免疫応答を提供するための本発明の方法において使用され得る抗原には、限定されるものではないが、ＥＢＶ溶菌サイクル抗原（ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、ＢＮＬＦ２、ＶＣＡ、ＢＣＲＦ１、ｇｐ３５０、ｇｐ１１０を含む）、ｇｐ４２、ＢＭＲＦ‐２、ＭＶＡ‐ＥＬ、ｇｐ２２０、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２が含まれる。
他の実施形態において、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔおよび方法は、抗原に対し受動免疫を産生する方法において使用し得る。ｒｄＣＭＶｈｅｔによって発現される異種ポリペプチドは、疾患の予防および／治療において有用な抗原結合性タンパク質または抗体鎖である。一実施形態において、疾患は、有効なワクチンが存在しないがしかし病原体または病原体によって産生される毒素を中和し得るモノクローナル抗体が同定されている疾患である。例えば、発現された抗原結合性タンパク質は、２Ｆ５および４Ｅ１０（Ｇｕｅｎａｐａ ａｎｄ Ｗｙａｔｔ，ＰｌｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎ ２０１２ ８（７）：ｅ１００２８０６）およびＤ５（国際公開ＷＯ２００５／１１８８８７）等のＨＩＶ‐１を中和し、炭疽毒素を中和し（Ｍａｙｎａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００２，２０，５９７‐６０１）、またはボツリヌス毒素を中和する（Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２ ９９（１７）：１１３４６‐１１３５０）。他の実施形態において、疾患は、免疫系の調節から利益を受け得る疾患である。例えば、発現された抗体またはその部分は、ＰＤ‐１をブロックし（Ｋｌｉｎｅ ａｎｄ Ｇａｊｅｗｓｋｉ，２０１０，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ １１：１３５４‐９；Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６：２４４３‐５４；Ｂｒａｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６：２４５５‐６５）、ＣＴＬＡ‐４をブロックし（Ａｇａｒｗａｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３３：５５７‐６９）、ＣＤ２８を刺激し（国際公開ＷＯ ２０１０／００７２７６；米国特許第８，１６８，７５９号）またはＣＤ４０を刺激する（米国特許出願公開第２０１２／０２５１４９４；米国特許第７，９２７，５９６号；米国特許第７，５６３，４４３号）。
他の実施形態において、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔおよび方法は、遺伝子治療において使用し得る。前記の実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔによって発現される異種ポリペプチドは、患者において欠け、低減され、変異されておりおよび／または適切に機能しておらず、それによって患者において病態／疾患を引き起こしているポリペプチドまたはその部分である。ｒｄＣＭＶｈｅｔの投与は、患者において欠け、低減され、変異されておりおよび／または適切に機能していないポリペプチドの発現／機能を、少なくとも部分的に修復する。より特定の実施形態において、疾患は、異種ポリペプチドとしてＣＦＴＲまたはその部分を有する嚢胞性線維症（Ｏａｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：１１０８‐１５；Ｇｒｉｅｓｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ａｌｔｏｎ，２０１２，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ １８：６４２‐６２；Ｈｕｌｌ，２０１２、ＪＲ Ｓｏｃ Ｍｅｄ １０５（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ２‐８）；異種ポリペプチドとして第ＶＩＩＩ因子および／または第ＩＸ因子またはその部分を有する血友病（Ｈｉｇｈ，２０１２，Ｂｌｏｏｄ １２０：４４８２‐７；Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ ａｎｄ Ｍａｎｎｕｃｃｉ，２０１２，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ ７：２４；Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｌｏｚｉｅｒ，２０１２，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ １５６：２９５‐３０２）；異種ポリペプチドとしてジストロフィンまたはその部分を有する筋ジストロフィー（Ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ ａｎｄ ｖａｎ Ｏｍｍｅｎ，２００３，Ｎａｔｕｒｅ ４：７７４）；異種ポリペプチドとしてインスリンまたはその部分を有するＩ型糖尿病（Ｓａｎｌｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １４：ｅ１８；Ｔｕｄｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４：３１９‐３１）；異種ポリペプチドとしてＲＰＥ６５またはその部分を有するレーバー先天性黒内障（Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ ３５８：２２３１‐９）；異種ポリペプチドとしてβ‐グロブリンまたはその部分を有するβサラセミア（Ｍａｙ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ，９９：１９０２‐８；Ｒｕｎｄ ａｎｄ Ｒａｃｈｍｉｌｅｗｉｔｚ，２００５，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５３：１１３５‐４６；Ｓａｄｅｌａｉｎ，２００６，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １３：１４２‐８）；異種ポリペプチドとしてヘモグロビンまたはその部分を有する鎌状赤血球貧血（Ｓａｄｅｌａｉｎ，２００６，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １３：１４２‐８）である。
他の特定の実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔによって発現される異種ポリペプチドは、例えば、免疫系を調節することによって、病態を患う患者の利益になり得るポリペプチドである。限定されるものではないが、ＩＬ‐２、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１５、ＩＬ‐２１およびＩＬ‐２３を含む、サイトカインまたはケモカインが発現され得る。
ｄ．異種ポリペプチドをコードする核酸の挿入
異種ポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子カセットは、非必須遺伝子をコードする領域内のｒｄＣＭＶゲノムに挿入される。カセットは、非必須遺伝子のＯＲＦに挿入され、非必須遺伝子のＯＲＦを置換するか、または非必須遺伝子をコードする二つのＯＲＦの間に挿入され得る。
ＣＭＶにおける非必須遺伝子は以下の通りである（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１２３９６‐１２４０１による）：
Figure 2016501023
本発明のいくつかの実施形態において、発現カセットは、非必須遺伝子をコードするＯＲＦの間に挿入される。特定の実施形態において、発現カセットは、ＣＭＶゲノムのＵＬ１‐ＵＬ２０領域またはＣＭＶゲノムのＵＳ１‐ＵＳ１０領域に挿入される。
本発明の実施形態において、異種配列は、高転写レベルの産生に関連するＣＭＶゲノムの領域において、元のＣＭＶ配列を置換するように設計される。例えば、異種配列／遺伝子の挿入は、ＵＬ２１．５オープンリーディングフレームまたは５ｋｂ転写領域に挿入され得る（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（７）：５７５７‐５７６６（１９９９）；Ｇａｔｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８（４９）：１９７５５‐１９７６０（２０１１））。
ｒｄＣＭＶｈｅｔのゲノムサイズは、ｒｄＣＭＶゲノムのサイズと比較して５％〜１０％以上改変されるべきではない。より好ましくは、ｒｄＣＭＶｈｅｔのゲノムサイズは、ｒｄＣＭＶゲノムのサイズと比較して２％〜３％以上改変されるべきではない。ｒｄＣＭＶに挿入される大きなまたは多重発現カセットを使用する実施形態において、非必須遺伝子または非必須遺伝を含む領域は、ｒｄＣＭＶゲノムサイズと比較してゲノム全体のサイズが＋／−５％〜１０％、より好ましくは＋／−２％〜３％内に維持されることが可能なようにゲノムから欠失されるべきである。
ウイルス複製の評価
当業者は、ＦＫＢＰまたはその誘導体に融合された特定の必須タンパク質の活性を確認するために、ウイルス複製アッセイを使用し得る。遺伝子発現／コード産物の機能は、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の存在下においてＦＫＢＰまたはその誘導体の付着によって必須タンパク質に対し実質的に影響を受けてはならないので、ｒｄＣＭＶｈｅｔは、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の存在下において親ＣＭＶおよび／またはｒｄＣＭＶに匹敵する速度で複製しなければならない（好ましくは親ウイルスのレベルの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％）。ｒｄＣＭＶｈｅｔの複製は、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の非存在下において親ＣＭＶから実質的に変更される（不安定化融合タンパク質を含まないＣＭＶと比較して、好ましくは５０％、７５％、９０％、９５％、９９％または１００％以上低減される）。
異なる実施形態において、少なくとも２μＭのＳｈｉｅｄ‐１の存在下においてｒｄＣＭＶｈｅｔは、非ｒｄＣＭＶが複製する量の好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％複製する。
一実施形態において、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔを含む組成物は、少なくとも２μＭのＳｈｉｅｌｄ‐１の存在下において少なくとも１０５ｐｆｕ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０７ｐｆｕ／ｍｌのウイルス価を有する。
逆にｒｄＣＭＶｈｅｔは、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の非存在下において実質的に複製してはならない。複製欠損機構の質は、ウイルス複製に対して許容的でない条件下において制御がどれほどストリンジェントであるか、すなわちこれらの条件下における子孫ビリオンの感染力価によって判断される。本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔは、Ｓｈｉｅｌｄ‐１存在なしでは実質的に複製し得ない（細胞培養においてまたは患者体内において）。ＡＲＰＥ‐１９および他の型のヒト由来初代細胞におけるその複製は条件付きであり、ウイルス複製を維持するためには培養培地中に０．１μＭ、好ましくは少なくとも２μＭ以上のモル濃度のＳｈｉｅｌｄ‐１が要求される。
一実施形態において、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔを含む組成物は、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の非存在下において２ｐｆｕ／ｍｌ未満、より好ましくは１ｐｆｕ／ｍｌ未満のウイルス力価を有する。
ＣＭＶの複製を評価する方法は、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の非存在下または存在下においてｒｄＣＭＶの複製を評価するために使用し得る。しかしながら、好ましい実施形態においては、５０％組織細胞培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイが使用される。
他の実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔ力価は、５０％組織細胞培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイによって定量される。つまり、本希釈アッセイは、感染宿主の５０％を死滅するために必要とされるウイルス量を測定する。宿主細胞（例えば、ＡＲＰＥ‐１９細胞）をプレートに蒔き、ウイルスの段階希釈液を添加する。インキュベーション後に細胞死のパーセンテージを観察し、各ウイルス希釈度を記録する。結果は、数学的にＴＣＩＤを計算するために使用される。
他の実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔ力価は、プラークアッセイを使用して測定される。ウイルスプラークアッセイは、ウイルス試料中のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の数を測定する。つまり、コンフルエントな単層の宿主細胞（例えば、ＡＲＰＥ‐１９細胞）を、異なる希釈度のｒｄＣＭＶにより感染し、ウイルス感染が無差別に拡散するのを防ぐために、寒天またはカルボキシメチルセルロース等の半流動培地により覆う。ウイルスが固定細胞の単層内で細胞に感染するときに、ウイルスのプラークが形成される。ウイルス感染細胞は溶解し、感染を隣接する細胞に拡散し、そこで感染・溶菌サイクルが反復される。感染細胞の範囲は、肉眼または光学顕微鏡によって見ることのできるプラーク（未感染細胞によって囲まれた感染範囲）を形成する。プラークを計数しその結果を、プレートを調製するために使用された希釈係数とともに、試料単位用量当たりのプラーク形成単位の数（ｐｆｕ／ｍｌ）を計算するために使用する。ｐｆｕ／ｍｌの結果は、試料内の感染粒子の数を表すが、形成された各々のプラークが感染性の一ウイルス粒子の代表者であるという前提に基づいている。
他の実施形態において、ＳＣＩＤ‐ｈｕマウスモデルを、インビボで複製するためのｒｄＣＭＶの能力を評価するために使用する。つまり、ヒト胎児組織片（胸腺および肝臓等）をＳＣＩＤマウスの腎被膜に外科的に移植する。ｒｄＣＭＶを、２〜３か月後にヒト組織が血管新生したときに接種する。ウイルス力価を、接種３〜４週間後にプラークアッセイにおいて評価する。動物実験を、毎日の腹腔内注射によってＳｈｉｅｌｄ‐１を補給することにより、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の非存在下または存在下において実施し得る。
免疫応答の評価
患者への本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔの投与を、異種ポリペプチドに関連する病原体（すなわち、ウイルス、細菌、寄生虫）による感染の可能性または患者における当該感染に関連する病態を治療および／または低減し得る、または癌に関連する自己抗原（すなわち、腫瘍関連抗原）に対する免疫応答を誘導し得る、異種ポリペプチドに対する免疫応答、好ましくは防御免疫応答を誘導するために使用し得る。
ｒｄＣＭＶｈｅｔによって誘導される免疫応答は、当該技術分野で既知の方法を使用して評価し得る。
当該技術分野で既知の動物モデルを、ｒｄＣＭＶｈｅｔ投与の防御効果を評価するために使用し得る。一実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔを投与された個体由来の抗血清は、限定されるものではないが、病原体付着の遮断または宿主細胞への侵入を含む中和能力について分析され得る。他の実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔを投与された個体由来のＴ細胞は、限定されるものではないが、目的抗原の存在下におけるインターフェロンガンマを含むサイトカイン生産能について分析され得る。また動物感染攻撃モデルを、免疫原の免疫学的有効量を測定するためにも使用し得る。
中和とは、培養液中での病原体侵入および／または複製を阻止することのできる病原体特異的抗体を表す。ウイルスに対する中和活性を測定するための通常のアッセイは、プラーク減少アッセイである。細胞に侵入しない病原体に対する中和活性を、病原体の複製速度の減少によって測定し得る。ＮＴ５０力価は、病原体中和アッセイにおいて投入病原体の５０％をブロックする血清希釈度の逆数と定義される。ＮＴ５０力価は、４パラメータロジスティック非線形回帰モデルから得られる。
受動免疫
長年の研究および多数の技術的および免学的進歩に関わらず、有効なワクチンが、現在のところ多くの重要な感染性疾患に対して利用できない。しかしながら多数の疾患に対して、病原体または病原体によって産生される毒素を中和し得る、および動物モデルにおける感染攻撃からの防御を提供し得る、モノクローナル抗体が同定されてきた。本発明の方法は、病原体または腫瘍関連抗原等の抗原、例えば、抗体の単鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、抗体の抗原結合領域を含む抗体の部分に対する防御免疫を規定の間隔で提供するための、一または複数の抗原結合性タンパク質を発現する、ｒｄＣＭＶｈｅｔの使用を含む。抗体はまた、ワクチンと併用されるときに、シグナル伝達経路を操作し、シグナルをアゴナイズまたはアンタゴナイズし、リガンド／受容体の相互作用をブロックしまたはアジュバント様の性質によって免疫系を刺激することによっても防御免疫を提供し得る。
この系の有利な点は、ｒｄＣＭＶｈｅｔからの異種ポリペプチドの発現が１週間未満で抗体を産生するであろうとの理由で、免疫化には極めて短時間しかかからないであろうことである。抗体の発現は、ｒｄＣＭＶｈｅｔ投与後の、患者に対するＳｈｉｅｌｄ‐１の投与によって、インビボでｒｄＣＭＶｈｅｔが複製されることを可能にすることによって増加され得た。Ｓｈｌｄ‐１の二量体バージョンが臨床研究において使用され、十分な耐容性を示した（Ｄｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１１ ３６５：１６７３‐８３）。患者がＳｈｉｅｌｄ‐１を投与されなくなるやいなや、ｒｄＣＭＶｈｅｔの複製は停止するであろう。
本明細書で用いる場合、用語「抗原結合性タンパク質」には、それらが所望の生物学的活性を示す限り、標的領域または抗原の結合領域、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（二重特異性ｓｃＦｖを含む）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ´）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）および上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントに結合する抗体の部分が含まれる。抗原結合性タンパク質は、エピトープへの特異的な結合性を提供する抗体可変領域を含み得る。好ましい実施形態において、患者において受動免疫を提供するために使用される本発明の抗体は、ヒト化またはヒト抗原結合性タンパク質である。抗体可変領域は、例えば、完全抗体、抗体フラグメントおよび抗体または抗体フラグメントの組換え誘導体に存在し得る。
異なるクラスの抗体は、異なる構造を有する。異なる抗体領域は、ＩｇＧを参照することによって説明され得る。ＩｇＧ分子は、四本のアミノ酸鎖：二本のより長い重鎖および二本のより短い軽鎖を含む。重鎖および軽鎖はそれぞれ定常領域および可変領域を含む。可変領域内に、抗原特異性の原因である三個の超可変領域がある。（例えば、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（組換え抗体），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９；およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ（遺伝子ＩＶ），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｌ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。
超可変領域（相補性決定領域とも称される）は、より保存的な隣接領域（フレームワーク領域とも表される）の間に挟まれている。フレームワーク領域及び相補性決定領域（ＣＤＲ）と関連するアミノ酸は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（免疫学的に興味深いタンパク質の配列），Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（合衆国保健福祉省），１９９１に記載の通りに番号付および整列され得る。
二つの重鎖カルボキシル領域は、Ｆｃ領域を作成するためにジスルフィド結合で繋がれた定常領域である。Ｆｃ領域は、エフェクター機能を提供するために重要である。（Ｐｒｅｓｔａ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６４０‐６５６，２００６）。Ｆｃ領域を構成する二本の重鎖の各々は、ヒンジ領域を通して異なるＦａｂ領域に延びている。
高等脊椎動物において、二つのクラスの軽鎖および五つのクラスの重鎖が存在する。軽鎖は、κまたはλである。重鎖は、抗体のクラスを定義し、α、δ、ε、γまたはμである。例えば、ＩｇＧはγ重鎖を有する。また、異なる型の重鎖に対して、ヒトγ１、γ２、γ３およびγ４等のサブクラスも存在する。重鎖は、ヒンジおよび末端領域に特有のコンホメーションを分け与える。（Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ（遺伝子ＩＶ），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｅｌ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。
抗体可変領域を含む抗体フラグメントには、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦａｂ２領域が含まれる。各Ｆａｂ領域は、可変領域および定常領域から構成される軽鎖、および可変領域および定常領域を含む重鎖領域を含む。軽鎖は、定常領域でジスルフィド結合によって重鎖に結合される。Ｆａｂ領域の軽鎖および重鎖可変領域は、抗原結合に関与するＦｖ領域を提供する。
抗体可変領域は、組換え誘導体中に含まれ得る。組換え誘導体の例には、単鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体およびミニ抗体が含まれる。（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９‐６０，２００４）。
抗原結合性タンパク質は、同じまたは異なるエピトープを認識する一または複数の領域を含む。（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：３９‐６０，２００４）。
非ヒト（例えば、ネズミ科の動物）抗原結合性タンパク質の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２または抗体の他の抗原結合性サブシーケエンス）である。大部分、ヒト化抗原結合性タンパク質または抗体は、受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換される、ヒト免疫グロブリンまたはヒト型抗体フラグメントまたは鎖（受容体抗体）である。従ってヒト化抗体は、一つの種由来の抗体；例えば、げっ歯類抗体由来のＣＤＲが、げっ歯類抗体の重鎖および軽鎖可変領域から、ヒト重鎖および軽鎖可変ドメインに移入される組換えタンパク質であり得る。抗体分子の定常ドメインは、ヒト型抗体の定常ドメイン由来である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、相当する非ヒト残基によって置換される。さらにヒト化抗体は、受容体抗体にも移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに改善し最適化するために成される。一般的にヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当するＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべて、およびＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のＣＤＲ領域およびＦＲ領域である、少なくとも一の、典型的には二つの可変ドメインのすべてを実質的に含み得る。ヒト化抗体はまた、最適には少なくとも免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの部分を含み得る（例えば、Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃｙｔｏｔｅｃｈ．５５：５５；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ａｎｄ Ｌｅ Ｇａｌｌ，２００４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：３９およびＧｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２６：３１を参照されたい）。
完全ヒト型抗体がヒト患者の治療処置にとって望ましいかもしれない。ヒト型抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用して、上記のファージディスプレイ法を含む、当該技術分野において既知の種々の方法によって作成され得る。米国特許第４，４４４，８８７号および４，７１６，１１１号；および国際公開ＷＯ ９８／４６６４５；ＷＯ ９８／５０４３３；ＷＯ ９８／２４８９３およびＷＯ ９８／１６６５４を参照されたいが、その各々はその全体が参照されることによって本明細書において援用される。ヒト型抗体はまた、機能的な内在性免疫グロブリンを発現することはできないがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得る、トランスジェニックマウスを使用して産生され得る。国際公開ＷＯ ９８／２４８９３；欧州特許第０ ５９８ ８７７号；米国特許第５，９１６．７７１号；および５，９３９，５９８号を参照されたいが、その全体が本明細書において参照されることにより援用される。
本発明のＣＭＶｈｅｔまたはｒｄＣＭＶｈｅｔは、抗体の一または複数の部分または鎖をコードする一または複数のヌクレオチド配列の封入によって、抗体を産生するために使用し得る。モノクローナル抗体は、例えば、抗体をコードする一または複数の組換え遺伝子を含む一または複数のｒｄＣＭＶｈｅｔを含む組換え細胞から産生し得る。抗体は、例えば、一の遺伝子が重鎖をコードしおよび一の遺伝子が軽鎖をコードする、二以上の組換え遺伝子によってコードされ得る。
本発明の他の態様は、抗原結合性タンパク質が目的抗原の標的領域に結合する、抗原結合性タンパク質のＶｈ領域またはＶ１領域のどちらかまたは双方をコードする、一または複数の組換え遺伝子を含む核酸を含む、ＣＭＶｈｅｔまたはｒｄＣＭＶｈｅｔを記載する。複数組換え遺伝子は有用であり、例えば、そこでは一遺伝子がＶｈ領域を含むその抗体重鎖またはフラグメントをコードし、およびもう一つの遺伝子がＶ１領域を含むその抗体重鎖またはフラグメントをコードする。前記の複数組換え遺伝子は、例えば、抗原結合性タンパク質をコードする各々のヌクレオチド配列に作動可能に結合されたプロモーターを使用することによって、単一のＣＭＶｈｅｔまたはｒｄＣＭＶｈｅｔに組み込まれ得るか、または二以上のＣＭＶｈｅｔまたはｒｄＣＭＶｈｅｔに組み込まれ得る。
いくつかの実施形態において、本発明のＦｃ操作型変異抗体もまた本発明に包含される。当該変異体には、未改変抗体と比較して基礎をなす抗体分子のエフェクター機能を改善または調節するために、抗体分子のＦｃ領域において突然変異または置換を導入するように操作された、抗体またはその抗原結合性タンパク質が含まれる。一般的に、改善されたエフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣおよび抗体半減期と同じ様な活性で呼ばれる（例えば、米国特許第７，３７１，８２６号；７，２１７，７９７号；７，０８３，７８４号；７，３１７，０９１号；および５，６２４，８２１号を参照されたいが、その各々はその全体が本明細書において援用される）。
免疫グロブリンの五つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在する。ＩｇＧおよびＩｇＡクラスは、重鎖定常領域配列および機能における比較的にわずかな違いに基づきさらにサブクラスに分類され、例えば、ヒトは次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を発現する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はＩｇＧ１である。
本発明のいくつかの実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔは、ＰＤ‐１の機能をブロックする抗原結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。プログラム細胞死１（ＰＤ‐１）は、アポトーシスを起こしているマウスＴ細胞系列のサブトラクティブハイブリダイゼーションによって最初に同定された、５０〜５５ｋＤａのＩ型膜貫通受容体である（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｅｍｂｏ Ｊ．１１：３８８７‐９５）。ＣＤ２８遺伝子ファミリーのメンバーであるＰＤ‐１は、活性化Ｔ、Ｂおよび骨髄系細胞上で発現される（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：５１５‐４８；Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２３９‐４５）。ＰＤ‐１に対する二つのリガンド、ＰＤリガンド１（ＰＤ‐Ｌ１）およびリガンド２（ＰＤ‐Ｌ２）が同定された。双方ともＢ７スーパーファミリーに属する（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａ．，２００５，上掲）。ＰＤ‐Ｌ１は、Ｔ、Ｂ、内皮および上皮細胞を含む多数の細胞型で発現される。対照的にＰＤ‐Ｌ２は、かろうじて樹状細胞およびマクロファージ等のプロフェッショナル抗原提示細胞上で発現される。
ＰＤ‐１は、Ｔ細胞活性化を負に調節し、この抑制機能はその細胞質ドメインの免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）と関連している（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｐａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５：９５４３‐５３）。ＰＤ‐１のこの抑制機能の破壊は、自己免疫をもたらし得る。例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＤ‐１ノックアウトは、ループス様症候群をもたらすが、一方ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてそれは拡張型心筋症の発生をもたらす（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：１４１‐５１；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１４７７‐８３）。ヒトにおいてＰＤ‐１遺伝子座における一塩基多型は、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、リウマチ性関節炎の高発生率および多発性硬化症の進行と関連している。逆の状況もまた有害であり得る。ＰＤ‐１による持続性の負のシグナルは、腫瘍免疫回避および慢性ウイルス感染症等の多くの病的状態において、Ｔ細胞機能不全と結びつけられてきた。
抗腫瘍宿主免疫は、主に腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）によって影響される（Ｇａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：１９６０‐４）。多方面からの証拠によると、ＴＩＬはＰＤ‐１抑制制御を受けている。第一に、ＰＤ‐Ｌ１発現は、多くのヒトおよびマウス腫瘍細胞系において確認され、該発現はインビトロでＩＦＮ‐γによってさらに上方制御され得る（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３‐８００）。第二に、腫瘍細胞によるＰＤ‐Ｌ１の発現は、インビトロでの抗腫瘍Ｔ細胞による溶解に対する該腫瘍細胞の抵抗性と直接関連していた（（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：１ １４０‐５）。第三に、ＰＤ‐１ノックアウトマウスは、腫瘍攻撃に対し抵抗性があり（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３‐４４）、しかもＰＤ‐１ノックアウトマウス由来のＴ細胞は、担癌マウスに養子移植されるとき、腫瘍拒絶において高度に効果的である（Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．，上掲）。第四に、モノクローナル抗体によるＰＤ‐１抑制シグナルのブロッキングは、マウスにおける抗腫瘍宿主免疫を増強し得る（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，上掲；Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：１０８９‐９６）。第五に、腫瘍における高度のＰＤ‐Ｌ１発現は（免疫組織化学染色で検出）、多くのヒト癌型についての芳しくない予後と関連している（Ｈａｍａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４；３３６０‐５）。
従って本発明の一態様は、ＰＤ‐１シグナル伝達を、例えば、ＰＤ‐１またはＰＤ‐１リガンドに結合することによって、ブロックする抗原結合性タンパク質をコードする、ヌクレオチド配列を含むｒｄＣＭＶｈｅｔである。本発明のいくつかの実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔは、ＰＤ‐１受容体へのＰＤ‐Ｌ１リガンドの結合をブロックする抗原結合性タンパク質をコードする。当該実施形態において有用である、抗原結合性タンパク質をコードする代表的なヌクレオチド配列は、ＷＯ ２００９／１１４３３５に開示されている。
複製欠損型ＣＭＶの生産
本発明は、ｒｄＣＭＶｈｅｔを産生する方法を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔは、Ｓｈｉｅｌｄ‐１等の安定化剤の存在下において、上皮細胞、好ましくはヒト上皮細胞、およびより好ましくはヒト網膜色素上皮細胞または線維芽細胞、より好ましくはヒト線維芽細胞上で増殖される。特定の実施形態において、ヒト網膜色素上皮細胞は、寄託番号ＣＲＬ＿２３０２としてアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されたＡＲＰＥ‐１９細胞である。他の特定の実施形態において、ヒト線維芽細胞は、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ＿１７１としてＡＴＣＣに寄託されたＭＲＣ‐５細胞である。
いくつかの実施形態において、Ｓｈｉｅｌｄ‐１は、組織培養培地中に少なくとも０．５μＭの濃度で存在する。好ましい実施形態において、Ｓｈｉｅｌｄ‐１は、組織培養培地中に少なくとも２．０μＭの濃度で存在する。
いくつかの実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔを増殖するために使用される細胞は、マイクロキャリア上で増殖される。マイクロキャリアは、スピナーフラスコまたはバイオリアクター（回転壁微小重力バイオリアクターおよび流動床バイオリアクター等）において付着性の細胞の増殖を可能とする、支持マトリックスである。マイクロキャリアは、典型的には穏やかな撹拌によりそれらが浮遊状態に維持されるのを可能とする密度を有する、１２５〜２５０μＭの球体である。マイクロキャリアは、限定されるものではないが、ＤＥＡＥデキストラン、ガラス、ポリスチレンプラスチック、アクリルアミドおよびコラーゲンを含む種々の材料から作成し得る。マイクロキャリアは、限定されるものではないが、細胞マトリックスタンパク質、組換えタンパク質、ペプチドおよび帯電分子を含む種々の界面化学を有し得る。他の高密度細胞培養系、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ（登録商標）およびＨｙｐｅｒＳｔａｃｋ（登録商標）系等も使用され得る。
無細胞の組織培養液を収集することができ、それからｒｄＣＭＶｈｅｔを精製することができる。ＣＭＶウイルス粒子は、直径約２００ｎｍであり、限定されるものではないが、密度勾配または２０％ソルビトールクッションによる超遠心分離を含む、当該技術分野で既知の技術を使用して、当該粒子を収集した培地に存在する他のタンパク質から分離し得る。ワクチンのタンパク質量を、ブラッドフォード法によって定量し得る。
Ｓｈｉｅｌｄ‐１は、ＦＫＢＰと併用してｒｄＣＭＶｈｅｔの複製を制御するために使用され得る。組織培養細胞中での所望量のウイルス増殖が達成された後は、複製能はもはや望ましくない。Ｓｈｉｅｌｄ‐１は、ウイルス複製を欠損させるために（例えば、患者に投与するために）、ｒｄＣＭＶｈｅｔから取り除かれる。一実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔは、一または複数回洗浄することによってＳｈｉｅｌｄ‐１から精製される。他の実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔは、超遠心分離によってＳｈｉｅｌｄ‐１から精製される。他の実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔは、ダイアフィルトレーション（透析濾過）によって精製される。ダイアフィルトレーションは、ウイルス粒子を精製するために通常使用される。一実施形態において、約７５０キロダルトンの孔径を有するフィルターが使用され、該フィルターは、Ｓｈｉｅｌｄ‐１のみが孔を通過するのを可能にするであろう。
Ｓｈｉｅｌｄ‐１からｒｄＣＭＶｈｅｔを精製後に、ｒｄＣＭＶｈｅｔ組成物中に少量の残留Ｓｈｉｅｌｄ‐１が残っているかもしれない。一実施形態において、精製後のｒｄＣＭＶｈｅｔ組成物中のＳｈｌｄ‐１のレベルは、組織培養における複製を持続するために必要とされるレベルの少なくとも１００倍未満である。一実施形態において、精製後のｒｄＣＭＶｈｅｔ組成物中のＳｈｉｅｌｄ‐１のレベルは、０．１μＭ以下である。他の実施形態において、精製後のｒｄＣＭＶｈｅｔ組成物中のＳｈｉｅｌｄ‐１のレベルは、検出限界以下である。
組成物中のＳｈｉｅｌｄ‐１レベルの定量は、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー‐質量分析）法またはＨＰＬＣ／ＭＳ（高速液体クロマトグラフィー‐質量分析）法を使用して検出され得る。これらの技術は、ＬＣまたはＨＰＬＣの物理的分離能と質量分析の能力を組み合せており、複合混合物中の目的の化学種を検出し得る。
医薬組成物
本発明のさらなる特徴は、感染症患者を治療するおよび／または感染の可能性を低減させるための、組成物、好ましくは免疫原性組成物またはワクチンにおける、本明細書に記載のＣＭＶｈｅｔの使用である。適宜、組成物は薬剤的に許容可能な担体を含む。従って本発明は、有効量の本発明のＣＭＶｈｅｔおよび薬剤的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
「薬剤的に許容可能な担体」とは、限定されるものではないが、全身投与において安全に使用され得る；液体増量剤、希釈剤または被包剤を含む、組成物の投与を容易にする物質である。個々の投与経路に依存して当該技術分野において周知の、種々の薬剤的に許容可能な担体が使用され得る。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、滑石、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝生理食塩水を含むリン酸緩衝液、乳化剤、等張性生理食塩水およびパイロジェン除去水を含む群から選択され得る。特に、薬剤的に許容可能な担体には、種々の成分、例えば、緩衝液、注射用滅菌水、通常の生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水、ショ糖、ヒスチジン、塩類およびポリソルベート等が含まれる。「生理学的に許容可能」、「希釈剤」または「賦形剤」等の用語は、同じ意味で使用され得る。
ワクチン製剤化の手順は、例えば「Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（新世代ワクチン）」（１９９７，Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）に開示されており、参照されることによって本明細書において援用される。
本発明の組成物には、追加の成分、例えば、以下に記載する通りの一または複数のアジュバント、および／または一または複数の追加の活性成分等が含まれ得る。
アジュバント
アジュバントは、免疫応答を産生するときに免疫原を助長し得る物質である。目的抗原に対する免疫応答を増強させるのに加えていくつかのアジュバントは、所望の免疫応答を誘導するために必要な抗原量を減少させるために、または臨床計画において永続性のある免疫応答を誘導し疾病からの防御を提供するために使用され得る。アジュバントは、異なる機構、例えば：抗原の生物学的または免疫学的半減期を増加させること；抗原提示細胞への抗原送達を改善すること；抗原提示細胞による抗原プロセシングおよび提示を改善すること；用量節約を達成すること、および免疫調節性サイトカインの産生を誘導すること、の一または複数等によって機能し得る（Ｖｏｇｅｌ，２０００，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３０：Ｓ２６６）。
同様に本発明には、ヒトＣＭＶｈｅｔまたはｒｄＣＭＶｈｅｔ等のＣＭＶｈｅｔ、およびアジュバントを含む組成物が含まれる。種々の型のアジュバントが、免疫応答産生において役に立つために用いられ得る。本発明のいくつかの実施形態において、個々のアジュバントには、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム、アルミニウムヒドロキシホスファート、不定形アルミニウムヒドロキシホスファートスルファートアジュバント（ＡＡＨＳ）等が含まれる。アルミニウムを含む化合物は、アジュバント活性を有することが６０年以上前に特定された（総説としては、Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｅ．Ｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８２：４９７‐５０５（２００４）；Ｂａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：Ｓ１８‐Ｓ２３（２００２）を参照されたい）。アルミニウムアジュバントは、適切な投与量で使用されるとき、一般に安全であるとみなされている。ヒトへの投与用に、多くが規制当局によって世界的に承認されている。本発明のいくつかの実施形態において、アルミニウムアジュバントはＡＡＨＳである。別の実施形態において、アルミニウムアジュバントは、Ｍｅｒｃｋリン酸アルミニウムアジュバント（ＭＡＰＡ）等のリン酸アルミニウムアジュバントである。他の実施形態において、アジュバントは水酸化アルミニウムである。
当業者は、標的デングウイルスに対する免疫応答の増強において、安全でかつ効果的なアルミニウムアジュバントの至適投与量を決定することが出来るであろう。ＦＤＡ認可ワクチンに含まれた、アルミニウムの安全性プロフィールおよびアルミニウムの量に関する議論に対しては、Ｂａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：Ｓ１８‐Ｓ２３（２００２）を参照されたい。一般的に、アルミニウムアジュバントの効果的かつ安全な用量は、用量当たりアルミニウム元素５０μｇから１．２５ｍｇ（濃度１００μｇ／ｍＬないし２．５ｍｇ／ｍＬ）に変動する。
本発明のＣＭＶｈｅｔ組成物と併用して使用され得る他のアジュバントには、限定されるものではないが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含むアジュバント、またはリポ多糖、モノホスホリルリピドＡおよびアミノアルキルグルコサミド４‐フォスフェートを含む、ＴＬＲ４およびＴＬＲ９等のＴｏｌｌ様受容体に作用する他の分子が含まれる（総説として、Ｄａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９（１）：４５‐５２（２００７）；Ｄｕｔｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２３９（１）：１７８‐１９６（２０１１）；Ｈｅｄａｙａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２（２）：２９４‐３２５（２０１２）を参照されたい）。本発明の組成物において有用な追加のアジュバントには、免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ；例えば、米国第７，７１３，５３５号および米国第７，４７０，６７４号を参照されたい）；ヘルパーＴ細胞エピトープ、リピドＡおよびその誘導体または変異体、リポソーム、リン酸カルシウム、サイトカイン、（例えば、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、ＩＬ‐２、ＩＦＮ‐α、Ｆｌｔ‐３Ｌ）、ＣＤ４０、ＤＣ２８、ＣＤ７０、ＩＬ‐１２、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）９０、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７、非イオン性ブロック共重合体、不完全フロイントアジュバント、ケモカイン、コレラ毒素；大腸菌易熱性エンテロトキシン；百日咳毒素；ムラミルジペプチド、ムラミルペプチドアナログ、フロイント不完全アジュバント；ＭＦ５９、ＳＡＦ、免疫刺激性複合体、生分解性マイクロスフェア、サポニン；非イオン性ブロック共重合体；ムラミルペプチドアナログ；ポリフォスファゼン；合成ポリヌクレオチド；ＩＦＮ‐γ；ＩＬ‐２；ＩＬ‐１２；およびＩＳＣＯＭＳが含まれる。（Ｖｏｇｅｌ，２０００，Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３０：Ｓ２６６；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ８９：３１１；Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｖａｃｃｉｎｅ １９：１１８０；Ｋｅｒｓｔｅｎ，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：９１５；Ｏ‘Ｈａｇｅｎ，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ．１：２７３）
本発明のいくつかの実施形態において、組成物にはＣＭＶｈｅｔおよびアジュバントが含まれ、ここで該アジュバントは、限定されるものではないが、不完全フロイントアジュバントおよびＭＦ５９を含む油を含むアジュバントではない。
本発明の他の実施形態において、組成物には、サポニンを含むアジュバント、例えば、ＩＳＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバント（ＣＳＬ Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）またはサポニンを単独またはコレステロールおよびリン脂質とともに含む他のサポニンを含むアジュバント等が含まれる。さらなる実施形態において、組成物には、サポニンを含むアジュバントおよびリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはＡＡＨＳＡ等のアルミニウム塩アジュバントが含まれる。
製剤
いくつかの実施形態において、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔは、免疫応答を誘導するために患者に投与される。免疫原性組成物の保存中のｒｄＣＭＶｈｅｔ組成物の効力の損失を、最小化するかまたは回避することが望ましい。当該目的を支持するための条件には、限定されるものではないが、（１）保存中の持続的安定性、（２）凍結融解サイクルストレス耐性、（３）雰囲気温度下における一週間までの安定性、（４）免疫原性の維持、（５）アジュバント計画との適合性、が含まれる。ｒｄＣＭＶｈｅｔの安定性に影響する条件には、限定されるものではないが、緩衝液ｐＨ、緩衝液イオン強度、特定の賦形剤の有無および温度が含まれる。組成物は、ワクチン組成物として適した精製ｒｄＣＭＶｈｅｔウイルス粒子の安定性を増強するために緩衝液を含む。
ウイルス粒子の完全性の保存状態は、マウスにおける免疫原性アッセイおよび／またはウイルス侵入アッセイによって評価され得る。ウイルス侵入事象は、五量体ｇＨ複合体を含むウイルスの糖タンパク質の完全性および機能に依存する。
いくつかの実施形態において、ｒｄＣＭＶｈｅｔは、ｐＨ５ないし７で、ヒスチジン１５〜３５ｍＭおよびＮａＣｌ１００〜２００ｍＭを含む緩衝液中で保存される。いくつかの特定の実施形態において、緩衝液は、ｐＨ６で、ヒスチジン２５ｍＭおよびＮａＣｌ１５０ｍＭを含む。
他の実施形態において、糖類、例えば、ポリオール類（限定されるものではないが、マンニトールおよびソルビトールが含まれる）；単糖類（限定されるものではないが、グルコース、マンノース、ガラクトースおよびフラクトースが含まれる）；二糖類（限定されるものではないが、ラクトース、マルトース、マルトース、ショ糖、ラクチュロースおよびトレハロースが含まれる）および三糖類（限定されるものではないが、ラフィノースおよびメレチトースが含まれる）等が、さらなる安定性を提供するために添加され得る。より特定の実施形態において、糖はショ糖である。より一層特定の実施形態において、ショ糖は５〜１５％である。
好ましい実施形態において、ｒｄＣＭＶは、ｐＨ６で、ヒスチジン２５ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ショ糖９％を含む緩衝液中に保存される。
投与
本明細書記載のｒｄＣＭＶｈｅｔは、当該技術分野において周知の技術と共に本明細書記載の手引きを使用して、製剤化され患者に投与され得る。医薬投与に関する一般的な指針は、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ワクチン） Ｅｄｓ（編）．Ｐｌｏｔｋｉｎ ａｎｄ Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（レミントン薬学の科学（第２０版）），Ｅｄ（編）．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；およびＭｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（現代薬学（第２版）），Ｅｄｓ（編）．Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０において提供される。
ワクチンは、種々の経路、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、粘膜、非経口、経皮または内皮等によって投与され得る。皮下および筋肉内投与は、例えば、注射器またはジェットインジェクターを使用して実施し得る。一実施形態において、本発明のワクチンは筋肉内に投与される。経皮または内皮送達は、内皮注射針注射、またはマイクロ針またはマイクロアレイバッチ剤等のイネーブリング装置によって達成し得る。
本明細書記載の組成物は、投与製剤に適合する方法で、および感染（一次、回帰および／重複感染を含む）を治療するためにおよび／または感染の可能性を低減させるために免疫学的に有効であるような量で投与され得る。本発明との関連において、患者への投与量は、患者における経時的に有益な応答、例えば、感染レベルの低減、感染に関連する疾病の症状の改善、および／または感染の期間および／または重症度の軽減、または感染（一次、回帰および／または重複感染を含む）の可能性の低減、等をもたらすのに十分であるべきである。
適切な投与計画は、当業者によって容易に決定され得て、好ましくは年齢、体重、性別および患者の病状；投与経路；所望の効果；および用いられる具体的な組成物を含む、当該技術分野において周知の要因を考慮して決定される。病原体に対する治療または予防において投与されるべきｒｄＣＭＶｈｅｔの効果的な量を決定するときに、医師は循環血漿のウイルスレベル、疾病の進行度および／または抗病原体抗体の産生を評価し得る。ワクチン組成物のための投与量は、１０３ないし１０１２プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲から構成される。異なる実施形態において、投与量の範囲は１０４から１０１０ｐｆｕ、１０５から１０９ｐｆｕ、１０６から１０８ｐｆｕ、またはこれらに記した範囲内のいずれかの投与量である。二以上のワクチンが投与される場合（すなわち混合ワクチンにおいて）、各ワクチン剤の量はそれらについて記載された範囲内である。
ワクチン組成物は、単回投与または反復投与方式で投与され得る。ワクチンは、安定化緩衝液および適切なアジュバント組成物の確認試験を受けることを条件として、投与の数時間または数日前にアジュバントと調製され得る。ワクチンは、通常実施される０．１ｍＬから０．５ｍＬの範囲の量で投与され得る。
投与のタイミングは、当該技術分野において周知の要因に依存する。初回投与後に、一または複数の用量が、抗体力価およびＴ細胞免疫を維持および／または高めるために投与され得る。さらなる追加免疫が、ＥＬＩＳＰＯＴ法等の抗体力価およびＴ細胞免疫に反映される、免疫応答の防御レベルを持続するために必要とされ得る。当該免疫応答レベルは、臨床的検討の主題である。
混合ワクチンに関して、免疫原の各々は、一つの組成物中に一緒にまたは異なる組成物中別々に投与され得る。本明細書記載のｒｄＣＭＶｈｅｔは、一または複数の所望の免疫原と共に同時に投与される。用語「同時に」とは、治療薬の厳密に同時の投与に限定されるものではなく、むしろ本明細書記載のｒｄＣＭＶｈｅｔおよび他の免疫原が連続して、かつ、それらが別の方法で投与される場合よりも、それらが増強された有益性を提供するように共に作用し得るような期間内に患者に投与されることを意味する。例えば、各々の治療薬は、同時にまたは異なる時点に任意の順序で連続的に投与しうる；しかしながら、もし同時に投与されないならば、所望の治療効果を提供するようにそれらは時間的に十分に接近して投与されねばならない。各々の治療薬は、任意の適切な形態および任意の適切な経路によって別々に投与され得る。
患者集団
本明細書の発明には、本発明のｒｄＣＭＶｈｅｔを投与することによる患者の治療のための方法が含まれ、ここで該患者はｒｄＣＭＶｈｅｔ内の異種ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質から利益を得るであろう。該方法には、免疫応答の発生、防御免疫応答の発生、病原体に対するワクチン接種、遺伝子治療および受動免疫の発生が含まれる。いくつかの実施形態において、患者はヒトである。さらなる実施形態において、患者は、非ヒト哺乳動物、例えば、ペット（例えば、イヌまたはネコ）または家畜（例えば、ウマ、ウシ、家禽）等である。患者は、予防的にまたは治療的に処置され得る。予防的処置は、病態（例えば、一次感染、回帰および重複感染を含む感染）の可能性または重症度を低減するために十分な応答を提供する。治療的処置は、病態の重症度を低減するように（例えば、病態に関連する臨床症状を低減または和らげるように）、または病態の発症または進行を遅延するように、または感染を和らげ、改善しまたは除去するように実施され得る。
治療は、本明細書記載の、異種ポリペプチドを発現するｒｄＣＭＶｈｅｔを含む医薬組成物を使用して実施し得る。医薬組成物は、一般集団、特に感染（一次、回帰または重複感染）の危険性の高い集団の人々または感染が特に問題であろう特定の患者集団（例えば、免疫不全個体、移植患者または妊婦）に対して投与され得る。
治療を必要とする人々には、既に病態を有する人々、ならびに病態に陥りやすい人々または病態の可能性の低減が望まれる人々が含まれる。治療は、病態の症状を改善および／または病態の期間および／または重症度を低減し得る。
病態の危険性が高い人々には、弱化免疫の患者または弱化免疫をもたらす治療を受けている患者（例えば、癌の化学療法または放射線治療を受けているまたは免疫抑制剤を摂取している患者）が含まれる。本明細書で用いる場合、「弱化免疫（ｗｅａｋｅｎｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」とは、適切に機能していないまたは正常な健常成人のレベルで機能していない免疫応答のために、感染と闘う能力が減退している免疫系を表す。弱化免疫を有する患者の例は、乳児、幼児、老人、妊婦である患者、または血液悪性腫瘍を患う患者、免疫抑制治療を受けている患者、幹細胞移植または固形臓器移植を受けた患者、ＨＩＶ感染患者および自己免疫疾患の患者を含む、免疫系の機能に影響する疾病を患う患者である。
モノクローナル抗体またはその部分を発現するｒｄＣＭＶｈｅｔにとって、患者集団は、モノクローナル抗体の発現が特有の状況における期間限定の免疫化のために有用である個体の人々である。いくつかの実施形態において、患者集団には、旅行のための短期間の免疫化を要する旅行者または戦域に動員されている現役の軍人が含まれる。他の実施形態において、患者集団は、多数の個体の迅速な免疫化が必要とされる、感染病原体の感染爆発の期間、等のように広範囲である。
［実施例］
実施例を、本発明の種々の特徴をさらに説明するために、以下に提供する。実施例はまた、本発明を実施するために有用な方法論も説明する。これらの実施例は、請求項の発明を限定するものではない。
実施例１
五量体ｇＨ複合体の復元
感染性ＣＭＶの細菌人工染色体クローンは、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１からなる五量体ｇＨ複合体を発現したコード化ビリオンが、ｇＨ／ｇＬスキャフォールド上でアセンブルするように構築した。
ＣＭＶ株であるＡＤ１６９株は、もともとは７歳の少女の咽頭扁桃腺から単離された（Ｅｌｅｋ ａｎｄ Ｓｔｅｒｎ，１９７４，Ｌａｎｃｅｔ，１：１）。ウイルスは、ウイルスを弱毒化するために数種類のヒト線維芽細胞中で５８回継代し（Ｎｅｆｆ ｅｔ ａｌ，１９７９，Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，１６０：３２）、最後５回の継代はＷＩ‐３８ヒト線維芽細胞で行った。ＡＤ１６９ウイルスの継代変異株は、本研究においてＭｅｒｃｋ ＡＤ１６９（ＭＡＤ１６９）と表すが、感染性ＢＡＣクローンを構築するための親ウイルスとして使用した。親ウイルスＡＤ１６９も継代変異株ウイルスＭＡＤ１６９のどちらも、ＵＬ１３１または五量体ｇＨ複合体を発現しなかった。
ＭＡＤ１６９は、感染性細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを構築するために親ウイルスとして使用した。ＢＡＣベクターは、ＣＭＶゲノム（〜２３０Ｋｂ）等の大型ＤＮＡフラグメントのＥ．ｃｏｌｉ中での遺伝子操作を可能とする分子ツールである。ＧＦＰマーカー遺伝子を伴うＢＡＣエレメントは、フラグメントの両端に作製したＬｏｘＰ部位を有するＵＳ２８オープンリーディングフレームの終始コドンの直後（ウイルスゲノムのＵＳ２８ＯＲＦとＵＳ２９ＯＲＦの間）に挿入した（図１Ａ）。即ち、２個のｌｏｘＰ部位により隣接されるＧＦＰ発現カセットおよびＣＭＶ ＵＳ２８‐ＵＳ２９配列を含有するＤＮＡフラグメントを合成して、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクターにクローニングした。ＢＡＣベクターは制限酵素Ｐｍｅ Ｉにより直線化し、精製ビリオンから抽出したＭＡＤ１６９のＤＮＡと共にＭＲＣ‐５細胞中にコトランスフェクトした。組換え変異株は、緑色蛍光の発現により同定し、プラーク法で精製した。１回の増幅後に、環状形態のウイルスゲノムを感染細胞から抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０細胞中に電気穿孔した。細菌コロニーは、ＵＳ２８およびＵＳ２９領域の存在を調べるためにＰＣＲによってスクリーニングした。候補クローンは、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｓｐｅ ＩおよびＢａｍ ＨＩの制限酵素分析によってさらに検討した。スクリーニング後、一のクローン、ｂＭＡＤ‐ＧＦＰが親ＭＡＤ１６９ウイルスと同一の切断パターンを示した。
ＭＡＤ１６９における上皮指向性欠損の根底にあるＵＬ１３１の最初のエクソン中のフレームシフト変異を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて遺伝子的に修復した（図１Ｂ）。具体的には、ＵＬ１３１遺伝子中の７個のアデニンヌクレオチド（ｎｔ）のＡストレッチから１個のｎｔを欠失させた（図１Ｂ）。１個のｎｔの欠失が、ＵＬ１３１による上皮および皮内細胞指向性を救出するために十分だったために、今や五量体ｇＨ複合体が発現されている。発現は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットによって確認した（データ未記載）。このクローンはＬｏｘＰ／Ｃｒｅ組換えによりＢＡＣ染色体部分を除去することによってさらに修飾した。ＢＡＣ ＤＮＡを、感染性のウイルスを取り戻すために、ヒト網膜色素上皮細胞であるＡＲＰＥ‐１９細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ‐２３０２）にトランスフェクトした（図１Ｃ）。得られた感染性のウイルスは、ＢＡＣ由来上皮指向性ＭＡＤ１６９ウイルス（ｂｅＭＡＤ）と命名されたが、（１）単一のアデニンヌクレオチドが欠失されたＵＬ１３１のＯＲＦ、および（２）ＵＳ２８ＯＲＦとＵＳ２９ＯＲＦの間に挿入された３４ｂｐのＬｏｘＰ部位、の二か所の遺伝子座においてＭＡＤ１６９と異なる（表２を参照されたい）。
ＭＡＤ１６９およびｂｅＭＡＤのゲノム組成およびプロテオミクス組成は、匹敵するものであった。プロテオミクス組成を決定するために、ＭＡＤ１６９およびｂｅＭＡＤビリオンを、ソルビトールクッションによる２回の超遠心分離によって精製した。タンパク質含量を、トリプシン消化の後に半定量の非標識ショットガンプロテオミクスによって定量した（図１０）。各々の菌株試料を、ナノＬＣ‐ＭＳ／ＭＳによって３回反復して分析した。分析によって５０種のウイルスタンパク質を同定した。同定されたＭＳシグナルのピーク高さに基づいて非標識定量を実施し、ＭＡＤ１６９およびｂｅＭＡＤを鑑別するために、シグナル比値を計算した。統計的に有意な変化（ｐ値＜０．０１）を同定するために、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。結果は、五量体ｇＨ複合体［ｇＨ（ＵＬ７５）、ｇＬ（ＵＬ１１５）、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１］がｂｅＭＡＤビリオン中に存在することを確認した。ｂｅＭＡＤにおいて顕著に増加した三つの他のウイルスタンパク質は、ＵＬ４１Ａ、ＵＬ６９およびＵＬ１１６であった。これらのタンパク質の重要性は、知られていなかった。
Figure 2016501023
未成熟樹状細胞（ＤＣ）の感染のために五量体ｇＨ複合体が必要とされるので、改善された抗原プロセシングおよび抗原提示にとって、五量体ｇＨを含むＣＭＶウイルスが望ましいであろう（Ｇｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２７５‐８４）。しかしながら最近の研究は、広範囲なＴ細胞応答が、線維芽細胞で培養された複製可能なアカゲザルのＣＭＶベクターにより、アカゲザルにおいて誘導され得ることを明らかにした。該結果は、当該ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＣＤ８Ｔ細胞応答の幅が、検討されたアカゲザルＣＭＶベクターにおける五量体ｇＨ複合体の欠損と関連することをさらに示唆した（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４０：９４０）。従ってヒトＣＭＶウイルスに基づく理想的なベクターは、五量体ｇＨ複合体の発現によって決定される、ウイルス上皮指向性に関連するこれらのパラメータに関係して実験的に選択されるかもしれない。ベクターは合理的に設計され、ウイルス指向性の所望の表現型に基づいてＡＲＰＥ‐１９細胞またはＭＲＣ‐５細胞において救出され得るであろう。
実施例２
ＦＫＢＰ必須タンパク質融合体の構築およびスクリーニング
条件付き複製欠損型ＣＭＶを、弱毒化ＡＤ１６９株を主鎖として使用して構築した（ＭＡＤ１６９）。
ＦＫＢＰ誘導体に融合すべきウイルスタンパク質は、二つの基準に基づいて選択した。第一に、目的のタンパク質は、プロテオミクス分析によってＣＭＶビリオン中に検出されなかった（Ｖａｒｎｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１０９６０）、従ってＦＫＢＰ融合タンパク質がウイルスに取り込まれる可能性を低減させる。第二に、目的のタンパク質は組織培養中でのウイルス複製に必須である。
親ウイルスとしてｂｅＭＡＤを使用して実施例を提供する。ＦＫＢＰ誘導体（配列番号２６）を、１２の必須ウイルスタンパク質に個別的に融合して、融合タンパク質ＦＫＢＰ‐ＩＥ１/２（配列番号１）、ＦＫＢＰ‐ＵＬ３７ｘ１（配列番号３）、ＦＫＢＰ‐ＵＬ４４（配列番号５）、ＦＫＢＰ ＵＬ５１（配列番号７）、ＦＫＢＰ‐ＵＬ５２（配列番号９）、ＦＫＢＰ‐ＵＬ５３（配列番号１１）、ＦＫＢＰ‐ＵＬ５６（配列番号１３）、ＦＫＢＰ‐ＵＬ７７（配列番号１５）、ＦＫＢＰ‐ＵＬ７９（配列番号１７）、ＦＫＢＰ‐ＵＬ８４（配列番号１９）、ＦＫＢＰ‐ＵＬ８７（配列番号２１）およびＦＫＢＰ‐ＵＬ１０５（配列番号２３）を得た。ＦＫＢＰに融合した二つの異なる必須タンパク質を有するウイルス、即ちＩＥ１/２およびＵＬ５１の各々がＦＫＢＰ誘導体に融合したウイルスもまた構築した（ＷＯ ２０１３／０３６４６５として公開された、２０１２年９月４日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／０５３５９９号における、不安定化ＩＥ１/２およびＵＬ５１を有するｒｄＣＭＶのゲノムを、配列番号１４に示す）。構築後、全ての組換えＢＡＣ ＤＮＡを、ＡＲＰＥ-９細胞にトランスフェクトしＳｈｌｄ‐１を含む培地中で培養した。
ウイルス増殖のＳｈｌｄ‐１依存性を検討した。ＩＥ１/２、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ８４、ＵＬ７９およびＵＬ８７融合ウイルスは、プラーク分析法において２μＭ Ｓｈｌｄ‐１中で速やかに救出された（データ未記載）。ＵＬ３７ｘ１、ＵＬ７７およびＵＬ５３融合ウイルスもまたプラークを形成したが、プラークは小さく、それらは親ｂｅＭＡＤと比較して著しく緩慢に成長した。Ｓｈｌｄ‐１濃度を１０μＭまで増加してもウイルス増殖を顕著には促進しなかった（データ未記載）。ＵＬ５６およびＵＬ１０５融合体は救出されなかったが、このことはこれらのタンパク質のタグ付けがこれらのタンパク質の機能または隣接する遺伝子の発現を崩壊させることを示唆している。
Ｓｈｌｄ‐１の有無におけるウイルス複製をさらに評価するために、様々な濃度のＳｈｌｄ‐１を追加の実験において使用した。ＡＲＰＥ‐１９細胞を、必須タンパク質に融合したＦＫＢＰ誘導体も含む、ｇＨ発現ＣＭＶの０．０１ｐｆｕ／ｍｌのＭＯＩ（感染多重度）で感染した。１時間の感染後に細胞を、Ｓｈｌｄ‐１を除去するために新鮮な培地で２回洗浄した。次に感染ＡＲＰＥ‐１９細胞を、Ｓｈｉｅｌｄ‐１を０．０５、０．１、０．５または２μＭ含む培地中で培養した。感染後７日目にセルフリー子孫ウイルスを収集して、Ｓｈｉｅｌｄ‐１が２ｍＭ補充されたＡＲＰＥ‐１９細胞上に滴定した。ウイルス力価を、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）分析法によって測定した。即ち、この希釈分析法は、感染宿主の５０％を死滅させるために要求されるウイルス量を定量する。ＡＲＰＥ‐１９細胞を播種して、ウイルスの段階希釈液を添加した。インキュベーション後に、各々のウイルス希釈液について細胞死（即ち感染細胞）のパーセンテージを手作業で観察し記録した。結果は、ＴＣＩＤ５０を数学的に算出するために使用した。
図２に示す通り、すべてのＦＫＢＰ融合体を含むＣＭＶの効率的な複製は、様々な度合であるがＳｈｉｅｌｄ‐１濃度に依存した。概してより低濃度のＳｈｉｅｌｄ‐１は、子孫ウイルス産生の力価を低下させた。ウイルスの中で、ＵＬ５１とＵＬ５２だけが複製のためにＳｈｉｅｌｄ‐１を絶対的に要求した。単一融合体、ｄｄＩＥ１/２、ｄｄＵＬ８４、ｄｄＵＬ７９およびｄｄＵＬ８７を有する他のウイルスは、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の非存在下において検出可能な子孫ウイルスを産生し得た。制御は、ＦＫＢＰ誘導体がＵＬ５１またはＵＬ５２に融合したときに最も堅固だった。従って結果は、ＦＫＢＰ誘導体がＵＬ５１またはＵＬ５２に融合されたときに、５０ｎＭ程度の低濃度のＳｈｉｅｌｄ‐１がウイルスの複製を効率的にオンまたはオフし得ることを示す。このことは、ＵＬ５１またはＵＬ５２のどちらかに融合したＦＫＢＰ誘導体を有するＣＭＶベクターがインビボでＳｈｌｄ‐１により強力に制御され得ることを示唆した。
ＩＥ１/２、ＵＬ５１、ＩＥ１/２‐ＵＬ５１融合体を有するウイルスの増殖速度を、２μＭのＳｈｌｄ‐１の有無における親ｂｅＭＡＤウイルスと比較した。図３に示す通り、Ｓｈｌｄ‐１の存在下において単一または二重融合体は、親ｂｅＭＡＤと同等の増殖速度を有した。しかしながらＳｈｌｄ‐１の非存在下においては、ＩＥ１/２だけが複製し得たが、それは、親ｂｅＭＡＤよりもより低率でより緩慢であった。
二重融合ウイルスにおけるウイルス複製の制御の堅固さをも、異なる細胞型において試験した（図４）。これらの細胞には、ヒト臍帯静脈細胞（ＨＵＶＥＣ）、ＭＲＣ‐５繊維芽細胞、大動脈平滑筋細胞（ＡｏＭＣ）、骨格筋細胞（ＳＫＭＣ）およびＣＣＦ‐ＳＴＴＧ１星状細胞種細胞が含まれた。細胞は、０．０１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩ（５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染したＣＣＦ‐ＳＴＴＧ１を除く）でＩＥ１/２‐ＵＬ５１融合ウイルスに感染し、次にＳｈｉｅｌｄ‐１の存在下または非存在下に培地中でインキュベートした。すべての細胞型は、Ｓｈｉｅｌｄ‐１の存在下でウイルスの溶解複製を支持し得た。Ｓｈｉｅｌｄ‐１の非存在下でウイルス産生は検出されなかった。
実施例３
動物におけるＩＥ１／２‐ＵＬ５１二重融合ウイルスの免疫原性
ＩＥ１／２‐ＵＬ５１二重融合ウイルスの免疫原性を、マウス、ウサギおよびアカゲザルにおいて評価した。ＩＥ１／２‐ＵＬ５１二重融合ウイルスまたは親ｂｅＭＡＤウイルスに対するマウスにおける用量依存的中和応答を最初に比較した（図５Ａ）。６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０および４週目に、ｂｅＭＡＤまたはＩＥ１/２‐ＵＬ５１二重融合ウイルスにより０．１２μｇないし１０μｇの範囲の用量で免疫した。６週目の血清試料を収集し、上記の通りＡＲＰＥ‐１９細胞上でＣＭＶマイクロ中和分析法によって分析した（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ，“Ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｎｅｔｕｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ（ヒトサイトメガロウイルスワクチンの臨床評価を支援する新処理能中和分析法）”ｅ‐ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ（電子出版） Ａｕｇｕｓｔ ３０，２０１１ ａｔ ｄｏｉ（デジタル識別子）：１０．１０１６/ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１１．０８．０８６）。応答は、０．１２、０．３７、１．１、３．３および１０μｇの用量で比較した。低用量範囲（０．１２ないし１．１μｇ）においてｂｅＭＡＤは中和抗体についてわずかにより免疫原性であり、用量レベルが０．３７より高いときには、一貫して検出された。高用量範囲（３．３および１０μｇ）において、二つのウイルスによって誘導された中和抗体力価は同等であった。
次に、ウサギにおける１０μｇ用量での種々のウイルスの免疫原性を比較した。雌性ＮＺＷウサギを、０、３および８週目に、１０μｇのｂｅＭＡＤまたは表示した融合ウイルスにより免疫した。１０週目の血清を収集し、ＡＲＰＥ‐１９細胞上でＣＭＶマイクロ中和分析法によって分析した（図４Ｂ）。ｂｅＭＡＤ、単一融合ウイルスＩＥ１/２またはＵＬ５１および二重融合ウイルスＩＥ１/２‐ＵＬ５１は、ＡＤ１６９に類似して五量体ｇＨ複合体を欠くウイルスであるＭＡＤ１６９よりも顕著に高い中和抗体力価を誘導し得た。これは、ウイルスによるｇＨ複合体の発現が組換えＣＭＶの免疫原性を顕著に高めたということを裏付けた。
次に、二重融合ＩＥ１/２‐ＵＬ５１ウイルスまたは親ｂｅＭＡＤウイルスの１００μｇの免疫原性をアカゲザルにおいて試験した。１２週目の血清を収集し、ＡＲＰＥ‐１９細胞上でＣＭＶマイクロ中和分析法によって分析した。１２週目（投与３の後）のＮＴ５０力価のＧＭＴは、それぞれ１１５００または１５６００であった。これらの力価は、自然感染した個体において観察されるＮＴ５０力価と同等であった（図４Ｃ）。
二重融合ウイルスＩＥ１/２‐ＵＬ５１ＣＭＶワクチンで誘導された免疫応答の寿命を、アカゲザルにおいて明らかにした。動物を、１０μｇ／用量か１００μｇ／用量かいずれかの二重融合ウイルスＩＥ１/２‐ＵＬ５１によりワクチン接種した（総タンパク質量に基づいて）。また不定形アルミニウムヒドロキシフォスファートサルファート（ＡＡＨＳ）またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントを含む１０μｇ／用量ワクチンの製剤も含めた。ワクチンは０、８および２４週目にアカゲザルに投与した（ｎ＝５）。比較のために対照群は、ＭＦ５９アジュバントと処方した組換えｇＢを、３０μｇ／用量で、０、４および２４週目に投与した。すべての群に対する相互のＮＴ５０力価についての幾何平均（ＧＭＴ）を縦に示した（図６）。ワクチン接種に先立って、４０を超える検出可能な中和抗体力価はいかなるサルにも存在しなかった。最小の中和活性は、全ての群に対して初回投与後の４週目に検出されたが、中和抗体力価は約１２週目および２８週目（それぞれ二次接種および三次接種後４週目）にピークに達した。１００μｇ／用量群に対する２８週目のピークのＧＭＴは、１４，５００であった（１０μｇ／用量群に対する力価４，６６０より約３倍高い）。ＡＡＨＳではなくＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントが、１０μｇ／用量群について比較するとアジュバントの利益を与えた。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）群に対する２８週目のＧＭＴは１５，８００を測定したが、一方ＡＡＨＳ群は３，０００および１０μｇ／用量群は４，６６０であった。最小の中和活性が対照群（ｇＢ／ＭＦ５９）に対して検出されたが、ピークのＧＭＴは決して２００を超えなかった。研究７２週目、即ち０、８および２４週目でのワクチン接種投与レジメの終了後１年近い頃に、１００μｇ／用量群およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）製剤群に対するＧＭＴは、それぞれ１４００および３０００を維持していた。この時点で、１０μｇ／用量群およびＡＡＨＳ群に対するＧＭＴは約２００であった。
アカゲザル由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ワクチン接種レジメの２８週目（投与３後の４週目）に収集し、ＩＦＮ‐γＥＬＩＳＰＯＴ分析法で評価した。サルは、二重融合ウイルスＩＥ１/２‐ＵＬ５１の１００μｇ／用量（図７Ａ）または１０μｇ／用量（図７Ｂ〜７Ｄ）のいずれかでワクチン接種した。さらに、無アジュバント（図７Ｂ）またはＡＡＨＳ（図７Ｃ）、あるいはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（図７Ｄ）アジュバントを含むかいずれかの１０μｇ／用量を処方した。５個のＨＣＭＶ抗原を示す、プールされたオーバーラップするペプチドの抗原を、エクスビボでのＩＦＮ‐γ産生を刺激するために使用した。使用したＨＣＭＶ抗原は、ＩＥ１およびＩＥ２（双方ともウイルス調節タンパク質）ならびにｐｐ６５、ｇＢおよびｐｐ１５０（主なウイルス構造抗原）であった。Ｔ細胞応答の性質は、ＥＬＩＳＰＯＴ応答の大きさ（幾何平均）ならびにウイルス抗原に対する応答率によって評価した。ワクチン接種に先立って、抗原特異的ＥＬＩＳＰＯＴ力価はいずれのサルにおいても存在しなかった（データ未記載）。
２８週目に、５個のＨＣＭＶ抗原（即ち、ＩＥ１、ＩＥ２、ｐｐ６５、ｇＢおよびｐｐ１５０）に対するＥＬＩＳＰＯＴ応答の幾何平均は、それぞれ、１００μｇ／用量群について１８６、１３２、２５３、８７、２５７スポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０６ＰＢＭＣであったのに対して、１０μｇ／用量群については２１、２４、１０７、１１１、３３ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣであった（図７Ａおよび７Ｂ）。各群（ｎ＝５）における応答動物は、５５ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ以上かつ抗原特異的応答におけるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）応答の３倍以上の増加、というカットオフ基準に基づいてスコア化した。５個のＨＣＭＶ抗原（即ち、ＩＥ１、ＩＥ２、ｐｐ６５、ｇＢおよびｐｐ１５０）に対する応答動物の数は、１００μｇ／用量群について４、４、５、１、３であったのに対し１０μｇ／用量群については１、１、５、４、０であった。
二重融合ウイルスＩＥ１/２‐ＵＬ５１の１０μｇ／用量に対するＴ細胞応答に関するＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントの影響を図７Ｄに示す。５個のＨＣＭＶ抗原（即ち、ＩＥ１、ＩＥ２、ｐｐ６５、ｇＢおよびｐｐ１５０）に対するＥＬＩＳＰＯＴ応答の幾何平均は、それぞれ１１４、５３、４９１、８５、１１３ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣであり、群（ｎ＝５）中の応答動物の数はそれぞれ３、２、５、３、３であった。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントの群におけるＴ細胞応答の大きさと幅は、１００μｇ／用量群におけるそれらと類似していた。
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）を含む１０μｇ／用量または１００μｇ／用量の二重融合ウイルスＩＥ１/２‐ＵＬ５１（総タンパク質量に基づく）によりワクチン接種された動物由来のＰＢＭＣを、ＨＣＭＶ抗原（ｐｐ６５、ＩＥ１、ＩＥ２または全ＨＣＭＶビリオン）により刺激した後に細胞内サイトカイン染色によりさらに分析した。負の対照は二重融合ウイルスＩＥ１/２‐ＵＬ５１によりワクチン接種されていない一匹の無感作のサルであり、一方正の対照はスタフィロコッカスエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）であった。図８は、負の対照が全ての抗原刺激に対し最小の応答を示したが、想定通り正の対照剤であるスタフィロコッカスエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）に対し応答したことを示す。両群からのワクチン接種された全１０匹のサルは、類似した大きさとパターンでＨＣＭＶ特異的抗原に応答した。各々の抗原に対する幾何平均値を全１０匹のサルに対して算出した。すべてのサルは、そのＰＢＭＣがＣＭＶ抗原ペプチドプール（即ち、ｐｐ６５、ＩＥ１およびＩＥ２）により刺激されたとき、同等のＣＤ８＋（図８Ａ）およびＣＤ４＋（図８Ｂ）Ｔ細胞応答を示したが、一方、全粒子ＨＣＭＶビリオンにより刺激されたときには優先的にＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示した。全粒子ビリオンはタンパク質抗原であり、おそらく外来性抗原としてプロセシングされ、ＭＨＣクラスＩＩ分子によってＣＤ４＋Ｔ細胞に提示されるので、このことは予想外というわけではなかった。二重融合ウイルスＩＥ１/２‐ＵＬ５１は、ＨＣＭＶ感染した健康な被験者に通常みられるＴ細胞応答と類似する、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋表現型の双方のＴ細胞応答を誘導し得る。
アルミニウム塩を含む二重融合ウイルスＩＥ１/２‐ＵＬ５１の異なる製剤を、アカゲザルにおけるその中和抗体を産生する能力について比較した（図９）。二重融合ウイルスＩＥ１/２‐ＵＬ５１の３０μｇ／用量は、ＨＮＳ（塩基緩衝液）、不定形アルミニウムヒドロキシフォスファートサルファート（ＡＡＨＳ）、またはＭｅｒｃｋリン酸アルミニウムアジュバント（ＭＡＰＡ）かのいずれかと処方して、０および８週目に投与した。１２週目に収集された血清試料は、ＭＡＰＡが中和抗体誘導を増強したとはいえ、その増強が統計的に有意でなかったことを明らかにした（両側不対ｔ検定）。
ＩＥ１、ＩＥ２に対するＴ細胞応答ならびにウイルスタンパク質に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の結果は、アカゲザルにおいて発現する新規のウイルス抗原発現が存在したことの強い兆候である。従って、ＣＭＶベクターの複製が、ウイルス抗原の十分な発現にとって必要とされないことを示唆する。
実施例４
保存緩衝液の確認試験
ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）中で使用まで−７０℃に保存されたＣＭＶウイルスを、適切な緩衝液で〜１０倍に希釈した。各々の試料におけるＨＢＳＳ緩衝液の残差成分には、塩化カリウム０．５３３ｍＭ、第一リン酸カリウム０．０４４ｍＭ、第二リン酸ナトリウム０．０３４ｍＭ、塩化ナトリウム１３．７９ｍＭ、重炭酸ナトリウム０．４１７ｍＭおよびグルコース０．１％（ｗ／ｖ）が含まれた。次に試料を、室温もしくは２℃〜８℃の温度で４日間保存または凍結融解した。１または３サイクルのいずれかの凍結融解のために、試料を−７０℃で少なくとも１時間保存し、ＲＴで３０分間融解した。試料の安定性は、ウイルス侵入分析法を使用して４日目に試験した。即ち、応答曲線を得るためにいくつかの異なる試料希釈液を使用して分析を実施し、ウイルス侵入分析の結果からＥＣ５０（μｇ／ｍＬ）値を非線形曲線近似によって得た。ＥＣ５０値が低いほど良好な安定性を表す。安定性試料のＥＣ５０値を−７０℃凍結の対照試料と比較した。
ウイルス侵入分析は、ＡＲＰＥ‐１９細胞に感染し、そしてＩＥ１（前初期タンパク質１）を発現するＣＭＶの能力を測定する。分析は、透明な９６ウェルプレートで実施する。固定細胞中の標的タンパク質を検出するために、ＩＥ１特異的一次抗体およびビオチン標識二次抗体を使用し、各ウェルからの蛍光シグナルを、Ｓａｐｐｈｉｒｅ ７００／ＤＲＡＱ５と共にＩＲ Ｄｙｅ ８００ＣＷストレプトアビジンを使用して定量する（細胞数入力正規化のため）。結果を、８００／７００積算強度比（積算比）対ＣＭＶ濃度（総タンパク質、μｇ／ｍＬ）としてプロットした。ＥＣ５０値もまた感染性試験の結果から非線形曲線近似を使用して得た。ＡＲＰＥ‐細胞のウイルス感染はウイルス糖タンパク質抗原、特に五量体ｇＨ複合体の完全性に因るので、ＥＣ５０値はウイルス粒子がこれらの条件下でどれだけ良好に保存されるかを反映する。
ＣＭＶは、ＲＴでＨＢＳＳ中に４日間保存されると感染性を失う（データ未掲載）。さらに、ウイルス侵入分析法により評価すると、ＨＢＳＳ中での３サイクルの凍結融解は、完全な感染性の喪失をもたらす。従ってＨＢＳＳは、ＣＭＶ保存に対する最適の緩衝液ではなかった。
室温でのＣＭＶ安定性に関するｐＨの影響を、３ないし８のｐＨ範囲を使用して検討した。以下の緩衝液：クエン酸緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ３．０；酢酸緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ４；酢酸緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ５；ヒスチジン緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ６；ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ７；ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、ｐＨ７．５およびＴｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ）、ｐＨ８を利用した。
試料を、適切な緩衝液によりウイルスの原体を１０回希釈して調製した。試料をＲＴ（２５℃）で４日間保存した。４日目に試料の安定性を、ウイルス侵入分析法を使用して測定した。ＨＢＳＳ中−７０℃で凍結保存したＣＭＶを、対照として処理した。各々の試料に対する紫外・可視スペクトルを、保存中に生じた構造変化および凝集を調べるために、時間０および４日目に取得した。
ｐＨ６の２５ｍＭ ヒスチジン緩衝液は、他の試験ｐＨと比較してＲＴでより高い感染性を維持することによってＣＭＶに対してより良好な安定性を与えた（データ未掲載）。紫外スペクトルの二次導関数は、全ｐＨで類似したウイルスの構造特性を示した（データ未掲載）。顕著な凝集は、３５０ｎｍでの光学密度による測定で試験ｐＨのいずれにおいても観察されなかった（データ未記載）。
ＣＭＶウイルス安定性に関する、単独または塩化ナトリウムとの併用による尿素の影響を、ｐＨ６の２５ｍＭ ヒスチジン緩衝液中で試験した。２％尿素単独の添加はＣＭＶ安定性に影響しなかった。しかしながら、１５０ｍＭ ＮａＣｌとの併用での２％尿素は、ＲＴでＣＭＶの安定性を改善した（データ未掲載）。
ＣＭＶ安定性に関するイオン強度の影響をｐＨ６で検討した。ＮａＣｌの増加する濃度（０ｍＭ、７５ｍＭ、１５０ｍＭおよび３２０ｍＭ ＮａＣｌ）をｐＨ６の２５ｍＭ ヒスチジン緩衝液に添加した。ＣＭＶ安定性はイオン強度に依存し、ここで高いイオン強度ほどより良好な安定性をもたらした（データ未掲載）。尿素の存在は、ＣＭＶ安定性に全く影響がないかまたは最小の影響しかなかった（データ未記載）。
さらにいくつかの他の賦形剤（ショ糖、ソルビトール、グリセリンおよびプロリン）を、室温でのｇＨ発現のＣＭＶ安定性に関するその影響についてスクリーニングした。試験した賦形剤を、ウイルス侵入分析法を使用してＣＭＶウイルス安定性を測定する前に、ｐＨ６の２５ｍＭ ヒスチジン緩衝液中のＣＭＶに室温で４日間添加した。ＥＣ５０値を試料に対して算出した。試験した全ての賦形剤中、１５０ｍＭ ＮａＣｌ単独または９％（ｗ／ｖ）ショ糖との併用がｐＨ６でのより良好な安定性を与えた（データ未記載）。従ってＲＴでのＣＭＶ保存のために推奨できる緩衝液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含み、９％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むかまたは含まない２５ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ６）である。
凍結融解の間のＣＭＶ安定性に関する凍結保護物質の影響を調べた。既に述べた通り、ＨＢＳＳ中のＣＭＶは、三回の凍結融解サイクルを受けると完全にその感染性を失った。いくかの凍結保護物質（ショ糖、ソルビトール、グリセリンを含む）を、ＣＭＶへの凍結融解ストレスを減少する能力についてスクリーニングした。各々の凍結融解サイクルのために、試料は−７０℃で少なくとも１時間凍結し、ＲＴで３０分間融解した。凍結保護物質の添加は、増強されたウイルス安定性をもたらした。さらに、１５０ｍＭ 塩化ナトリウムと組み合わせた９％（ｗ／ｖ）ショ糖は、他の試験凍結保護物質と比較すると顕著に高められたウイルス安定性をもたらした（データ未記載）。従って−７０℃でのまたは３回までの凍結融解サイクルでのＣＭＶ保存のための推奨緩衝液組成物は、２５ｍＭ ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび９％ショ糖（ＨＮＳ緩衝液）である。
ＨＮＳ緩衝液を、３回の凍結融解サイクル、冷却（２〜８℃）およびＲＴ（２５℃）におけるＣＭＶ安定性の保護についてＨＢＳＳ緩衝液と比較した。ＨＮＳ緩衝液は、全ての試験保存条件においてＣＭＶ生菌ウイルスに対するより良好な安定性を与えた（データ未記載）。
実施例５
ＨＮＳ緩衝液中でのＣＭＶ安定性
二重融合ＩＥ１/２‐ＵＬ５１ＣＭＶウイルスのストック溶液を、ＨＮＳ緩衝液に補給し、使用まで−７０℃で保存した。安定性研究は１００μｇ／ｍＬの濃度（ブラッドフォード分析法により測定した総タンパク質含量に基づく）で実施した。原体ウイルスは、最終ウイルス濃度を得るようにＨＮＳ緩衝液により希釈した。次に試料を適切な温度で保存し、記載の通り３か月まで試験した。凍結融解のために、試料を−７０℃で少なくとも１時間凍結し、室温で３０分間融解した。試料は種々の時点で取り出し、分析するまで−７０℃で凍結保存した。
試料の総タンパク質含量は、ブラッドフォード分析法を使用して測定した。試料の総タンパク質含量は、３か月の期間にわたり変化しなかった（データ未記載）。
経時的な試料中のＣＭＶの粒子径は、ＤＬＳ法を使用して試料の流体力学的直径を測定することによってモニターした。この方法では、経時的にかつ異なる保存温度でウイルス粒子のいかなる凝集または崩壊をもモニターした。一定の試料の粒子径における突発的変化について、何ら実質的な傾向は確認されなかった（データ未記載）。結果は、ウイルス粒子が高温度でもインタクトであり凝集していなかったことを示した。
実施例６
ウイルス侵入および免疫原性に関する保存条件の影響
ウイルス侵入力価（ＥＣ５０値）における顕著な変化が、ＣＭＶ試料を種々の保存温度に晒すことによって観察された（データ未記載）。−２０℃での保存は、２〜８℃および２５℃と比較してより低いウイルス侵入力価をもたらした。２〜８℃の試料の力価は、２５℃保存と比較してより低いウイルス侵入力価であることが見出された。ＥＣ５０値に基づいて、保存温度は次の順番（最も安定から最も不安定な順）、２５℃＞２〜８℃＞−２０℃で一月の時点まで順位づけされた。ウイルス侵入力価は、−２０℃、２〜８℃および２５℃で保存された試料に対して３カ月の時点で検出できなかった。
マウスの免疫原性研究は、安定性研究の終わりに開始し、ＣＭＶ中和抗体を誘導するＣＭＶの能力に関する保存温度の影響を測定した。マウスを、用量当たり２．５μｇのワクチンの筋肉内注射により０日目に免疫し、２１日目に追加免疫し続いて２８日目に放血した。マウス血清は、ＡＲＰＥ１９細胞を使用してｇＨ発現ＣＭＶに対する中和抗体について試験し、ＮＴ５０力価は非線形曲線近似によって得た。
ＩＥ１/２‐ＵＬ５１二重融合ＣＭＶの免疫原性に関する種々の温度での３か月間の保存の影響を評価した。ＮＴ５０力価は、有意差はないものの（ｐ＝０．２５８４、一元配置分散分析法）保存温度に依存し、より高い温度では−７０℃凍結対照と比較して低下した力価をもたらした（データ未記載）。−２０℃に保存された製剤についてのＮＴ５０力価の低下は２分の１未満であったが、しかしこれらの試料に対するウイルス侵入分析力価は、−７０℃凍結対照と比較して著しく影響を受けた。−２０℃、２〜８℃および２５℃安定性試料に対するＮＴ５０力価の傾向は、これらの試料に対して得られるＣＭＶ質量ＥＬＩＳＡ力価に従っている。
ＩＥ１/２‐ＵＬ５１二重融合ＣＭＶの免疫原性に関する融解後の種々の温度における８時間保存の影響を評価した。製剤のＮＴ５０力価は−７０℃凍結対照と比較した。ＮＴ５０力価は、試料を８時間いかなる試験温度に保存しても影響されなかった（ｐ＝０．５８６５、一元配置分散分析法）（データ未記載）。
試料融解後の種々の時点についての二重融合ＩＥ１/２‐ＵＬ５１ＣＭＶの２５℃での保存の影響は、マウスの免疫原性研究において評価した。これらの製剤のＮＴ５０力価は、−７０℃凍結対照と比較した。ＴＮ５０力価は、２５℃で試料を１週間まで保存することによって影響を受けなかった（ｐ＝０．１８４８、両側不対ｔ検定）。３月目に、ＮＴ５０力価は２倍強だけ低下したが、これは２５℃でのより長時間において、製剤に起こり得る安定性の問題を示している（データ未記載）。
ＨＮＳ緩衝液中で製剤化した二重融合ＩＥ１/２‐ＵＬ５１ＣＭＶに関する凍結融解の３サイクルの影響を、マウス免疫原性によって評価した。二重融合ＣＭＶ製剤の凍結融解（Ｆ／Ｔ）の３サイクルは、−７０℃凍結対照と比較して免疫原性に影響しなかった（ｐ＝０．２１０３、両側不対ｔ検定）（データ未記載）。
他の実施形態は、以下の請求項内にある。いくつかの実施形態が示され記載されているが、種々の変更が本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに成され得る。
実施例７
ルシフェラーゼ遺伝子を含む発現カセットを含む組換えＣＭＶ
ＭＡＤ１６９に基づくＣＭＶベクターの可能性を証明するために、Ｇａｕｓｓｉａｎルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）遺伝子を駆動するＨＳＶ ＴＫ遺伝子プロモーター／エンハーンサーを含むカッセトを、ＴＫプロモーター‐ｇＬｕｃ ＤＮＡフラグメントによりＵＬ２１．５オープンリーディングフレーム全体を置換することによってＣＭＶ ＵＬ２１．５位置に挿入した。
ＣＭＶ‐ルシフェラーゼウイルス（ＣＭＶ‐ｇＬｕｃ）をＡＲＰＥ‐１９細胞において培養し、完全なＣＰＥが観察されたときに無細胞のウイルスを収集した。２０％ソルビトールクッションの超遠心分離による１回の精製後に、ウイルスをＨＮＳ緩衝液に再懸濁した。総ウイルスタンパク質量およびウイルス感染価を前述の通り測定した。
ＣＭＶベクターによる導入遺伝子ルシフェラーゼの発現は、ＣＭＶ‐ｇＬｕｃに感染した培養ＡＲＰＥ‐１９細胞におけるルシフェラーゼ活性の動力学に関して試験された。細胞をウイルスにより〜０．０１のＭＯＩで感染し、示した時点において上清を収集した。活性をＰｉｅｒｃｅ Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｇｌｏｗ Ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。図１１に示す通り、ルシフェラーゼ活性は、感染後約４日目に検出され、ＣＰＥが顕著となった約１４日目に定常状態に達した。
インビボでのＣＭＶベクターによる導入遺伝子活性を評価するために、二匹のＮＺＷウサギをＣＭＶ‐ｇＬｕｃ１００μｇ、約６．３Ｅ＋０７ｐｆｕにより筋肉内接種した。血漿試料を５日間、毎日収集し、試料についてＰｉｅｒｃｅ Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｇｌｏｗ Ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりルシフェラーゼ活性に関して測定した。ルシフェラーゼ活性は接種後１日目に検出され、約３〜４日目にピークに達した（図１２）。５日目に、双方のウサギのルシフェラーゼ活性は２０００〜４０００単位に低下した。
実施例８
ＨＩＶ‐１ ｇａｇ抗原用の組換えＣＭＶベクター
モデル抗原としてのＨＩＶ‐１ ｇａｇにより、表３に記載の通り四つのベクターを設計した。以下に記載の構築物の各々の基本ベクターは、その中でｄｄＦＫＢＰがＵＬ５１に融合された、ｄｄＵＬ５１を含むｂｅＭＡＤ ＣＭＶであった。従ってベクターは、複製欠損型であるように設計され、その複製はＳｈｉｅｌｄ‐１に依存する。ＨＩＶ‐１ ｇａｇ配列は哺乳動物での発現のためにコドン最適化され、以前に開示されている（ＷＯ９８／０３４６４０；ＷＯ２００２／０２２０８０を参照されたい）。
Figure 2016501023
表３に示す構築物にはいくつかの設計特徴がある。第一に、クローン１、３および４は、細胞プロモーターであるＥＦ１α、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルにより設計された；一方、クローン２、５、６、７および８は、天然ＣＭＶプロモーターの下流に置かれた導入遺伝子により、および天然ポリアデニル化シグナルまたはＢＧＨ（クローン＃８）との組合せにより設計された。第二に、クローン１、２、３および８は、ＧＡＧが発現するように設計されたが、一方、他のクローン（＃４、５、６および７）においてＧＡＧは、２Ａペプチドにより他のタンパク質に結合された融合ポリペプチドとして発現された（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５８４‐５９０）。クローン＃４においてＧＡＧは、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼとともに発現されたが、一方、クローン５、６および７においてＧＡＧはドミナントなＣＭＶ抗原に結合された。第三に、クローン１、２、３、４および８において遺伝子挿入断片は、ＵＬ２１．５ＯＲＦまたは５ｋｂ転写領域を置換するように設計されたが、一方、クローン５、６および７において遺伝子挿入断片は、融合ポリペプチドの発現を可能とするために、強力なＴ細胞応答として知られるＣＭＶ抗原、すなわちｐｐ６５（ＵＬ８３）およびＩＥ１／２（ＵＬ１２３／ＵＬ１２２）にインフレームで融合された。
実施例２に記載の通りにウイルス構築物を回収し、生存可能なウイルスをＧＡＧ２１１、ＧＡＧ６０２またはＧＡＧ７０２と同定した（表３）。組換えウイルスをＡＲＰＥ‐１９細胞中で培養し、完全なＣＰＥが観察されたときにウイルス培養上清を収集した。ウイルスを１回の２０％ソルビトールクッションの超遠心分離によって精製した。ウイルスをＨＮＳ緩衝液に再懸濁し、総タンパク質量およびウイルス感染価を以前に記載通り測定した。
実施例９
インビトロでのＣＭＶベクターによる外来遺伝子発現
ＣＭＶ‐ＧＡＧ２１１およびＣＭＶ‐ＧＡＧ７０２ウイルス（表３のクローン２および６を参照されたい）に関して、ＨＩＶ‐１ ｇａｇの発現を、最初にＨＩＶ ｇａｇ ｐ５５に特異的なモノクローナル抗体を使用してウェスタンブロット分析によって確認した。図１５に示す通り、分子量〜５５ｋＤａに相当するバンドが、ＣＭＶ‐ＧＡＧ２１１およびＧＡＧ７０２ベクターに感染したＡＲＰＥ‐１９細胞の細胞可溶化物および上清中に検出された。ＣＭＶ‐ＧＡＧ６０２ベクター由来の細胞可溶化物中に５５ｋＤａ辺りにわずかなバンド存在したが、ＧＡＧ発現については明確でなかった。
ＨＩＶ‐１ ｇａｇの速度論的発現を、ｐ２４定量ＥＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によってさらに検討した（図１３）。結果は、ＨＩＶ‐１ ｇａｇシグナルが感染後の６〜８日目にピークに達し、ピークがＧＡＧ２１１をＳｈｉｅｌｄ‐１と共に培養したときにより高かったことを示す。ＧＡＧ６０２では、発現速度はＧＡＧ２１１に比べて遅れていた。
実施例１０
マウスにおけるＣＭＶ‐ＧＡＧベクターによって誘導されたＧＡＧ特異的Ｔ細胞応答
二つのマウス実験を行った。第一の実験において雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０、３または１μｇ／用量のＣＭＶ‐ＧＡＧ２１１ワクチンにより０および３週目に筋肉内で免疫化した。各群の三匹のマウス由来の脾臓細胞を、２回目の注射の四週間後にプールし、ＩＦＮ‐γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで試験した。ＢＡＬＢ／ｃ中のＨＩＶ‐１ ＧＡＧのバックグラウンド中には、ただ一つのＣＤ８Ｔ細胞エピトープが存在する（Ｍｅｔａ ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：２９８５）。ＣＤ８ペプチド（Ｈ‐２Ｋｄ限定）、および「ＧＡＧプール」（ＧＡＧ ＯＲＦの全長分について、１１個のアミノ酸によって重複する１５‐ｍｅｒのペプチドのプール）を、ＩＦＮ‐γ産生のための生体外でのＴ細胞刺激用に使用した。予想通り、ｄｄＵＬ５１または無感作群においてＧＡＧ特異的Ｔ細胞応答は検出されなかった。ワクチン接種の三群について、滴定ＧＡＧ２１１容量に相当するＧＡＧ特異的ＩＦＮ‐γＥＬＩＳＰＯＴ応答が観察された。従って、ＣＭＶベクターのＧＡＧ発現は、マウスにおけるＴ細胞応答を誘導するその能力と相関した。該発見は、雌性Ｃ５７ＢＬ／６ｘＢａｌｂ／ｃ Ｆ１マウスでも繰り返された（図１４Ｂ）。

Claims (36)

  1. （ａ）融合タンパク質をコードする核酸（ここで該融合タンパク質は、不安定化タンパク質に融合した必須ＣＭＶタンパク質、またはその誘導体を含み、ここで必須タンパク質は、ＩＥ１／２、ＵＬ３７ｘ１、ＵＬ４４、ＵＬ５１、ＵＬ５２、ＵＬ５３、ＵＬ５６、ＵＬ７７、ＵＬ７９、ＵＬ８４、ＵＬ８７およびＵＬ１０５から成る群より選択される）；および
    （ｂ）異種ポリペプチドをコードする核酸、および
    （ｃ）異種ポリペプチドに作動可能に結合されたプロモーター、
    を含む条件付き複製欠損型サイトメガロウイルス（ｒｄＣＭＶｈｅｔ）。
  2. ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨおよびｇＬを含む五量体ｇＨ複合体をさらに含む、請求項１のｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  3. 該必須タンパク質が：ＵＬ５１、ＵＬ５２およびＵＬ８７、またはその誘導体から成る群より選択される、請求項１または２のｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  4. 該必須タンパク質が：
    （ａ）配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２または配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含むか、または
    （ｂ）（ａ）に記載のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一である必須タンパク質誘導体である、
    請求項１または２のｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  5. 該必須タンパク質が配列番号３５、配列番号３６または配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３５、配列番号３６または配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に少なくとも９５％同一であるタンパク質誘導体である、請求項３のｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  6. 不安定化タンパク質がＦＫＢＰまたはＦＫＢＰ誘導体であり、ここで該ＦＫＢＰタンパク質は、配列番号２９に記載のアミノン酸配列を含み、かつここで該ＦＫＢＰ誘導体は、配列番号２９と比較して一または複数のアミノン酸置換を有するＦＫＢＰタンパク質であり、ここで該置換は：Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｅ３１Ｇ、Ｆ３６Ｖ、Ｅ６０Ｇ、Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ、Ｋ１０５Ｉ、Ｋ１０５ＥおよびＬ１０６Ｐから成る群より選択される、請求項１〜５のいずれかのｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  7. 該ＦＫＢＰがアミノ酸置換Ｆ３６ＶおよびＬ１０６Ｐまたはアミノ酸置換Ｆ３６ＶおよびＫ１０５Ｅを有する、請求項６のｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  8. 該ＦＫＢＰが配列番号２６、配列番号４４または配列番号３１に記載のアミノン酸配列を含む、請求項７のｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  9. 該必須ＣＭＶタンパク質がＵＬ５１である、請求項１〜８のいずれかのｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  10. 該ＣＭＶが少なくとも二つの融合タンパク質をコードする核酸を含み、ここで該融合タンパク質の各々における該必須タンパク質が異なる、請求項１〜９のいずれかのｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  11. 該融合タンパク質が配列番号７または配列番号７に少なくとも９５％同一であるアミノ酸である、請求項１のｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  12. 該融合タンパク質が配列番号８によってコードされているかまたは配列番号８に少なくとも９５％類似するヌクレオチド配列である、請求項８のｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  13. 該異種ポリペプチドが強力なＴ細胞応答として知られるドミナントなＣＭＶ抗原にインフレームで融合され、かつ該プロモーターが天然ＣＭＶプロモーターである、請求項１〜１２のいずれかのｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  14. 該ドミナントなＣＭＶ抗原が：ＵＬ８３、ＩＥ１／２、ＵＬ５５、ＵＬ８６、ＵＬ９９、ＵＬ１２２、ＵＬ３６、ＵＬ４８、ＵＬ３２、ＵＬ１１３、ＵＬ１２３、ＵＳ３２、ＵＬ２８、ＵＳ２９、ＵＳ３、ＵＬ９４およびＵＬ６９から成る群より選択される、請求項１３のｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  15. 高転写レベル産生に関連するＣＭＶゲノムの領域において該異種ポリペプチドが天然ＣＭＶ配列を置換するように設計される、請求項１〜１２のいずれかのｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  16. 該異種ポリペプチドによって置換される該天然ＣＭＶ配列がＵＬ２１．５オープンリーディングフレームまたは５ｋｂ転写領域である、請求項１５のｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  17. 該異種ポリペプチドが感染病原体に関連する抗原または腫瘍関連抗原である、請求項１〜１２のいずれかのｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  18. 該異種ポリペプチドが抗原結合性タンパク質である、請求項１〜１２のいずれかのｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  19. 該抗原結合性タンパク質が以下の機能：ＰＤ‐１機能をブロックする、ＣＴＬＡ‐４機能をブロックする、ＣＤ２８を刺激するまたはＣＤ４０を刺激する機能、の一または複数を実行する、請求項１８のｒｄＣＭＶｈｅｔ。
  20. 請求項１〜１９のいずれかのｒｄＣＭＶｈｅｔおよび薬剤的に許容可能な担体を含む組成物。
  21. 請求項１〜１７のいずれかのｒｄＣＭＶｈｅｔ、薬剤的に許容可能な担体およびアジュバントを含む組成物。
  22. 該アジュバントがサポニンに基づくアジュバントおよび／またはアルミニウム塩アジュバントである、請求項２１の組成物。
  23. 患者における抗原に対する予防的または治療的免疫応答を誘導する方法であって、請求項２０〜２２のいずれかの組成物の免疫学的有効量を患者に対し投与することを含む前記の方法。
  24. 請求項１〜１９のいずれかのｒｄＣＭＶｈｅｔを含む組成物を患者に投与することを含む、抗原に対する防御免疫を患者に対し提供する方法であって、ここで該異種ポリペプチドが抗原結合性タンパク質、腫瘍関連抗原または感染病原体由来の抗原である前記の方法。
  25. 患者における抗原に対する防御免疫応答を誘導するための薬剤の製造における、請求項１〜１９のいずれかのｒｄＣＭＶｈｅｔの使用。
  26. 抗原に対する患者における防御免疫応答を誘導する際の使用のための、請求項２０〜２２のいずれかの組成物。
  27. Ｓｈｉｅｌｄ‐１存在下に上皮細胞または線維芽細胞において組換えｒｄＣＭＶｈｅｔを増殖することを含む、請求項６〜８または１１〜１２のいずれかのｒｄＣＭＶｈｅｔを作成する方法。
  28. 該上皮細胞がヒト網膜色素上皮細胞である、請求項２７の方法。
  29. 該細胞がＡＲＰＥ‐１９細胞またはＭＲＣ‐５細胞である、請求項２７の方法。
  30. Ｓｈｉｅｌｄ‐１が少なくとも０．５μＭの濃度で存在する、請求項２７の方法。
  31. Ｓｈｉｅｌｄ‐１が少なくとも２μＭの濃度で存在する、請求項２７の方法。
  32. （ａ）培地にＳｈｉｅｌｄ‐１が添加された上皮細胞または線維芽細胞においてｒｄＣＭＶｈｅｔを増殖すること；
    （ｂ）培地からｒｄＣＭＶｈｅｔを収集すること；
    （ｃ）ｒｄＣＭＶｈｅｔからＳｈｉｅｌｄ‐１を実質的に除去すること；および
    （ｄ）薬剤的に許容可能な担体をｒｄＣＭＶｈｅｔに添加すること、
    を含む、請求項２０〜２２のいずれかの組成物を作成する方法。
  33. Ｓｈｉｅｌｄ‐１がステップ（ａ）の間の培地中に少なくとも２μＭの濃度で存在する、請求項３２の方法。
  34. Ｓｈｉｅｌｄ‐１がステップ（ｃ）において超遠心分離またはダイアフィルトレーションによって除去される、請求項３２の方法。
  35. Ｓｈｉｅｌｄ‐１濃度が０．１μＭ未満まで低減される、請求項３２の方法。
  36. 配列番号２８に記載のヌクレオチド配列を含む核酸、または配列番号２８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも９５％類似する核酸。
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