JP2002504080A - 水痘―帯状疱疹ウィルス遺伝子６３産物に対するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、水痘帯状疱疹ウィルス(VZV)に感染した個体の水痘の治療又は予防のための組成物に、そして水痘感染の予防及び治療に関する。本発明に係る組成物は、VZV遺伝子63によりコードされたタンパク質又は免疫学的に活性なその誘導体を含む。本発明は、さらに、VZV遺伝子63に一致するDNA又はRNAを含む組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 水痘−帯状疱疹ウィルス遺伝子63産物に対するワクチン 本発明は、水痘−帯状疱疹ウィルス（Varicella Zoster virus(VZV)）に感染 した個体の帯状疱疹の治療又は予防のための組成物に、そして水痘感染の予防及 び治療に関する。本発明に係る組成物は、VZV遺伝子63によりコードされたタン パク質又は免疫学的に活性なその誘導体を含む。本発明はさらに、VZV遺伝子63 に対応するDNA又はRNAを含む組成物に関する。 水痘ウィルスは、２つのヒトの疾患を引き起こすヒト・アルファ・ヘルペス・ ウィルスである：１次感染の間、VZVは小児の水痘（chicken pox）（Varicella ）を引き起こし、その後このウィルスは潜伏するようになり、そしてしばしば（ しばしば数10年後に）再活性化して帯状疱疹（shingles）（Zoster）を作り出す 。水痘の間、このウィルスは、末梢神経系内に入り、そこで、激しい痛の帯状疱 疹形態としての再活性化まで潜伏する。このウィルスが潜伏している間、ほとん どのウィルス遺伝子の発現は抑制されている。細胞仲介免疫は潜伏の制御におい て決定的な役割を演じていると信じられている。なぜなら、帯状疱疹としての再 活性化は、老齢者又は免疫無防備状態の個体において頻発するからである。 VZV感染は、フリー・ウィルスの最小の存在を特徴とする。潜伏及び再活性化 の間、ウィルスは主に細胞内にある。従って、再発性の疾患は、高レベルの中和 抗体によってさえ防止されず、そしてウィルスの制御は、細胞仲介免疫に依存す る。種痘による保護を得るためには、それ故、抗体応答を誘発するだけでなく、 CTL応答を誘発することが望ましい。有効なワクチンは、潜伏ウィルスの再活性 化の兆候が現れるやいなやできるだけ早く働くことができるCTLをプライムしな ければならない。 細胞毒性Ｔリンパ球(Cytotoxic T lymphocytes CTL)による抗原認識のメカニ ズムは、生来の抗原がペプチドに分解すること、そのタンパク質分解断片がMHC 分子に結合すること、そしてその複合体がその細胞表面に輸送されることを含む ので、糖タンパクのような結合膜タンパク質であるものではない、ウィルスによ りコードされたいずれのポリペプチドも、Ｔ細胞仲介応答の可能性ある標的であ ることができる。しかしながら、VZVゲノムは、外部糖タンパク質に加えて、い くつかの非構造タンパク質及び内部ビリオン・タンパク質をコードしているので 、これは、多数の潜在的CTL標的をもたらし、そしてどのタンパク質が最も関連 があるのであるかは知られていない。 VZウィルスのゲノムは、68タンパク質をコードしている71のオープン・リーデ ィング・フレームから構成されている。このウィルスDNAの配列は知られている( J．Gen Virol 67 1759-1816)。水痘−帯状疱疹ウィルス遺伝子63は、30.5kDaの 推定された分子質量をもつ最初期(Immediate early)タンパク質をコードしてい る(Debruset al，J．of Virology 69(5)，1995 p3240)。この遺伝子は、110581 （開始コドン）から始まり、そして111414（終止コドン）までに及ぶ。反対方向 におけるこの遺伝子の他のコピーは、119316〜118483塩基の間にある。むしろ普 通にではないが、IE63タンパク質は、ラット・モデルにおいて、潜伏の間ニュー ロン内で発現されることが示されている。このタンパク質は、E．coli内で融合 タンパク質として発現されている(Debrus et al.)。 今般、VZV IE63タンパク質が、潜伏感染されたヒトの三叉（trigeminal）及び 胸腺のニューロンの細胞質内にだけ検出されることが 発見されている。これは、ヒトの神経系内で潜伏の間に発現されたアルファーヘ ルペスウィルス・タンパク質の最初の同定である。 さらに、本発明は、このタンパク質が免疫系のための重要な標的であり、特に Ｔ細胞応答の標的であり、そしてこれ故、VZV感染の予防及び治療において有用 であることが発見された。特に、VZVに既に感染した患者における水痘の予防に おいて有用である。 従って、本発明は、水痘−帯状疱疹ウィルスIE63タンパク質又は免疫学的に機 能するその等価物及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物を提供する。 これは、上記タンパク質についての最初の医薬用途であり、そしてこれ故、本 発明は、医薬における使用のために、VZV IE63タンパク質又は免疫学的に機能す るその等価な誘導体を提供する。 本発明のさらなる側面においては、本発明に係る組成物の安全かつ有効な量を 投与することを含む、VZV感染を受け易い又はそれを患うヒトの治療方法が提供 される。 各ワクチン投薬におけるタンパク質の量は、典型的なワクチンにおけるかなり の有害な副作用を伴ずに免疫保護応答を引き起こす量として選ばれる。この量は 、どの特定の免疫原が使用されるか、そしてそれがどのような提示されるかに依 存して変化するであろう。一般に、各投与量は、１〜1000μｇ、好ましくは２〜 100μｇ、最も好ましくは４〜40μｇのタンパク質を含むであろう。特定のワク チンの最適量は、被験体における適切な免疫応答の観察を含む標準的な試験によ り確定されることができる。最初の種痘の後、被験体は、適切な間隔をもって１ 又は数回のブースター免疫感作を受けることができる。 VZV感染を受け易いヒトの種痘に加えて、本発明に係る医薬組成物は、再発性 疾患、帯状疱疹エピソードの頻度、重度又は継続期間 を、防止し又は有意に減少させるために、VZV感染を患う患者を、免疫療法によ り、治療するために使用されることができる。 本発明に係るワクチンにおいては、VZV IE63タンパク質の水溶液を直接使用す ることができる。あるいは、VZV IE63タンパク質（単数又は複数）は、凍結乾燥 を伴って又は伴わずに、一緒に又はさまざまな知られたアジュバントのいずれか と混合されることができる。このようなアジュバントは、非限定的に、水酸化ア ルミニウム、ムラミル・ジペプチド及びサポニン、例えばQuil A、特にQS21又は ３デアシル化モノホスホリル・リピドＡ(３Ｄ−MPL)を含む。優先的にTH１応答 を誘発するアジュバント又はアジュバント系が好ましい。TH１細胞応答を優先的 に刺激することができるアジュバントは、国際特許出願WO94/00153とWO95/17209 中に記載されている。 特に好ましいアジュバントは、場合により、油／水エマルジョンと共に、QS21 、キラヤ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮から得られたHplc精製された非毒 性画分、及び３De−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡ(３Ｄ−MPL)を含む 。 ３De−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡは、GB2220211(Ribi)から知ら れている。化学的には、それは、３De−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡ と４，５又は６アシル化鎖との混合物であり、そしてRibi Immunochem Montana により製造されている。３De−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡの好まし い形態は、国際特許出願第92/16556号中に開示されている。 QS21は、南米の木キラヤ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮からのサポニン のHplc精製された非毒性画分であり、そしてその製法は、米国特許第5,057,540 号中に（QA21として）記載されている。 好ましい油／水エマルジョンは、代謝可能な油、例えばスクワレン、アルファ ートコフェロール及びtween 80を含む。さらに、この 油／水溶液エマルジョンは、span 85及び／又はレシチンを含むことができる。 QS21：３Ｄ−MPLの比は、典型的には、１：10〜10：１；好ましくは１：５〜 ５：１そしてしばしば実質的には１：１のオーダーであるであろう。最適なシナ ルジーのための好ましい範囲は、2.5：１〜１：１の３Ｄ MPL：QS21である。典 型的には、ヒト投与のためには、QS21と３Ｄ MPLは、投薬当り、１μｇ〜100μ ｇの、好ましくは10μｇ〜50μｇの範囲内でワクチン中に存在するであろう。典 型的には、油／水は、２〜10％スクアレン、２〜10％のアルファ・トコフェロー ル及び0.3〜３％のtween 80を含むであろう。好ましくは、スクアレン：アルフ ァ・トコフェロールの比は１に等しいか又はこれ未満である。なぜなら、これが より安定なエマルジョンを提供するからである。Span 85も１％のレベルで存在 することができる。ある場合には、本発明に係るワクタンがさらに安定剤を含む であろうことが有利である。 さらなる例においては、上記タンパク質は、微粒子、例えばリポソーム内に封 入されることができる。さらなる他の例示においては、VZV IE63タンパク質は、 免疫刺激性巨大分子、例えば死んだボルデテラ（Bordetella）又は破傷風毒素に 抱合されることができる。 ワクチンの調製は、一般に、New Trends and Developments in Vaccines，Vol ler et al．(eds)，University Park Press，Baltimore，Maryland，1978中に記 載されている。リポソーム内への封入は、Fullerton、米国特許第4,235,877号に より記載されている。巨大分子へのタンパク質の抱合は、例えばLikhite、米国 特許第4,372,954号及びArmor et al.，米国特許第4,474,757号により開示されて いる。Quil Aの使用は、Dalsgaard et al.，Acta Vet Scand，18：349（1977） により開示されている。３Ｄ−MPLは、Ribi imm unochem，USAから入手可能であり、そして英国特許出願第2220211号及び米国特 許第4912094号中に開示されている。QS21は、米国特許第5057540号中に開示され ている。 遺伝子免疫感作における本発明に係るポリヌクレオチドの使用は、好ましくは 、好適なデリバリー法、例えば筋中へのプラスミドDNAの直接注射（Wolff et al .，Hum Mol Genet 1992，１：363，Manthorpe et al.，Hum．Gene Ther．1963： 4，419）、特定のタンパク質担体と複合体を形成したDNAのデリバリー(Wu et al .，J Biol Chem 1989：264，1985)、リン酸カルシウムによる（Benvenisty & Re shef，PNAS，1986：83，9551）又は他の促進剤によるDNAの共沈、さまざまな形 態のリポソーム内へのDNAの封入（Kaneda et al.，Science 1989：243，375）、 粒子銃（particle bombardment）（Tang et al.，Nature 1992，356：152，Eise nbraun et al.，DNA Cell Biol 1993，12：791）及びクローン化したレトロウィ ルス・ベクター（Seegar et al，PNAS 1984：81，5849）を用いた又は非感染性 組換えウィルス・ベクター、例えばSemliki Forestヘルパー２システム（Berglu nd et al Bio/Technology 1993，11：916-920）を用いたインビボ感染を使用す るであろう。筋中トランスフェクションのために好適なプロモーターは、CMV、R SV、Sra、アクチン、MCK、アルファ・グロブリン、アデノウィルス及びデヒドロ 葉酸レダクターゼを含む。本発明によりポリヌクレオチドをデリバリーするため に好ましい方法は、遺伝子銃によりデリバリーされる金粒子を利用する（US 510 0792，US 5036006及びUS 4945050）。 本発明に係るポリヌクレオチド組成物は、WO90/11092中に記載される投与量及 び投与経路を使用して投与されることができる。しかしながら、この正確な投与 量は、その患者の体重、性別、投与方法、総合的健康状態及び治療されるべき症 状の如き要因に依存するで あろう。筋中使用のためにも拘らず、使用されるべき投与量は、典型的には、0. 05μｇ／kg〜約50mg／kgの、より典型的には約0.1〜10mg／kgの範囲内にあるで あろう。皮下、表皮、皮膚内又は粘膜内投与が、高レベルのCTLを誘発する能力 に因り、有利であることができる。 本発明に係るワクチンは、さらに、他の抗原性成分、例えばVZVgpＩ，gpII，g pIII，gpIV又はgpＶ、あるいはそれらの切断された誘導体又は他の最初期タンパ ク質、例えばIE62タンパク質を含むことができる。特に、ヨーロッパ特許出願公 開第0405867号中に開示された切断されたgpＩ，gpII又はgpIIIである。 本発明の好ましい態様においては、IE63又はIE63誘導体と共にアンカーレス（ anchorless）gpＩを含むワクチン製剤が提供される。 アンカーレスとは、そのＣ−末端アンカー領域の実質的に全てを欠き、そして 哺乳類細胞内で発現されるとき分泌を許容するVZV糖タンパク質誘導体を意味す る。このようなタンパク質は、EP−Ａ−0405867中に記載されている。 他の態様においては、IE63を織り込むアミノ酸配列又はその誘導体及びgpＩ， gpII，gpIII，gpIV又はgpＶの中の１つを織り込むアミノ酸配列又はその誘導体 又は他の最初期タンパク質、例えばIE62を含む融合タンパク質を含むワクチンが 提供される。 他の態様においては、IE63又はその誘導体を発現することができるポリヌクレ オチドが、核酸ワクチンとして直接使用されることができる。好ましくは、この ポリヌクレオチドはDNAである。この場合、このポリヌクレオチドは、好適なプ ロモーターの制御下にあるであろう。 RNA免疫感作も使用されることができる。この場合のRNAは、WO92/10578の方法 に従って調製されることができる。 実施例１：VZV IE63タンパク質を含むワクチン配合物 各々以下の油／水エマルジョン成分を含む、２つのアジュバント配合物を作る 。 SB62：５％スクアレン５％トコフェロール2.0％ tween 80；粒子サイズは180n mであった。 １（ａ）エマルジョンSB62（２倍濃縮物）の調製 Tween 80をホスフェート・バッファー生理食塩水(PBS)に溶解して、PBS中２％ 溶液を得る。100mlの２倍濃縮物エマルジョンを提供するために、５ｇのDLアル ファ・トコフェロールと５mlのスクアレンを完全混合する。90mlのPBS/Tween溶 液を添加し、そして完全混合する。次に得られたエマルジョンをシリンジに通し 、そしてM110Sマイクロ流体工学装置を使用して最終的にマイクロ流動化する。 得られた油滴は約180nmのサイズをもつ。 １（ｂ）抗原をDebrus et al（前掲）の方法に従って調製する。 １（ｃ）IE63タンパク質QS21／３Ｄ MPL油／水配合物の調製 １（ａ）のエマルジョンに、等容量の２倍濃縮抗原（20μｇ又は100μｇのい ずれか）を添加し、そして混合する。これを、50μｇ／mlの３Ｄ−MPLと20μｇ ／mlのQS21と併合して、最終配合物を得る。バッファーは、塩濃度とpHに従う。 実施例２：IEP63の免疫学的特徴 ２．１ 材料 血液を、種痘されていた者の中の11人の健康なドナーから採取した。これらの ドナーは全て成人でり、子供のとき水痘の病歴をもっていた。各ケースにおいて 、30mlの血液をヘパリン化チューブ内に収穫し、そして５mlを、血清を収穫する ために塊固のために保存した。 ２．２ 体液性免疫応答 エリーザ試験を、全VZVと対照抗原を使用して行い、血液サンプル中の抗−VZV IgGsを検出した：テストされたドナーの全ては（１人を除き）、検出可能なレ ベルの抗VZV抗体を有しており、これ故、子供の間に顕出された水痘の血清学的 証拠を提供した。 我々は、ウェスタン・ブロット分析により抗−IE63抗体の存在について調べた 。ここで、pGEX5X内でクローン化され、そしてE．coli内で融合タンパク質(GST −IE63)として発現され、そしてアフィニティー・クロマトグラフィー(Debrus e t al，J．Virol，69，3240-3245)により精製されたIE63を使用した。同じやり方 で発現され、そして精製されたGSTタンパク質を、ネガティブ・コントロールと して使用した。テストされた血液サンプルの全てにおいて、精製されたIE63融合 タンパク質が認識され、その血清中に抗−IE63抗体の存在を示した。上記対照タ ンパク質は、上記抗体により認識されなかった。 ２．３細胞免疫応答 Ｔリンパ球刺激、ficollhypaque遠心分離により単離されたPBMC(末梢血液単核 細胞Peripheral BloodMononucles cytes)の刺激により測定した。 全てのアッセイを、３連で、PHA(フィトヘマグルチニン)による３×10⁵PBMCの 刺激により行って、非特異的刺激係数、全VZV及び対照抗原（感染又は非感染メ ラノーマ細胞の音波処理により調製されたもの）並びに精製融合タンパク質(GST −IE63又はGST単独)を測定した。６日間、これらの細胞、16時間の³Ｈ−チミジ ンでパルスし、そしてその後に収穫した。刺激係数（SI）を、刺激されたウェル 内のタンパク質のCPMと対照ウェル内のタンパク質のCPMとの比として計算し、そ して＞２の場合に陽性と考えた。 ２．４ Ｔ細胞増殖結果： 10の増殖アッセイを、先に測定したパラメーターを用いて、現在まで行ってい る。 これらの結果を表１に列記する。 全VZ抗原又はIE63による刺激の後に得られたＳ．Ｉ．を、図１として示すグラ フ上にプロットした。 これらのデータから、我々は以下のように結論することができる： ほとんどのヒト（６／10）は、VZV IE63に対する記憶Ｔ細胞応答をもつ ２人のドナーは、全抗原と精製融合タンパク質の両者によるひじょうに低いSI をもち、そして陰性（SI＜２）として考えられることができるであろう。しかし ながら、これらの中の１は、水痘病歴の明らかな証拠のいずれを伴わずにひじょ うに低い抗体力価をもっており、そしてそれ故、陰性ドナーであることができた 。他の者は、その抗体力価が高く、そのアッセイがMBP−IE63(SI＝3.4)を用いて 行われた間、より良好なSIをもち、これは、いくつかのケースにおいて、その融 合タンパク質の中の１がそのＴ細胞によりより良好に認識され、そして両タンパ ク質の比較が、SIがひじょうに低い場合に、高い標準偏差をもって、有用である ことができるということを示すものであった。 ２人の他のドナーは、IE63に対する陰性応答を提示し、一方、全抗原によるSI は高いが、その刺激は、GST融合タンパク質によってのみ行われた。 実施例３：細胞応答 上記実験の延長において、19人の健康な成人からのPBMCを、VZV抗原又はGST− IE63精製タンパク質のいずれかによる刺激に対して応答するＴ細胞増殖について アッセイした。VZ抗原による平均Ｓ． Ｉ．は、15.5±3.3 SE(2.1〜52の間の値)であった。GST−IE63による刺激後の上 記平均Ｓ．Ｉ．は、3.4±0.48SE(1.8〜８の間の値)であった。これらのＳ．Ｉ． データは、そのＳ．Ｉ．がVZV抗原について1.95±0.48SEであり、そしてIE63に ついて1.3±0.1SEであった非免疫感者について観察されたものよりも有意に高い ものであった。VZV刺激後Ｓ．Ｉ．がプロットされ、そしてGST−IE63によるＳ． Ｉ．と比較されたとき、この２人の非免疫患者は、両抗原調製物による明らかな 陰性(Ｓ．Ｉ＜2.0)を現した（図２）。17免疫ドナーの全ては、2.0よりも高いVZ V抗原に対するＳ．Ｉ．をもっていた。上記陽性ドナーの中で、多発性帯状疱疹 の発疹の病歴をもっていた者の中の３人（17％）が、VZV抗原に対するひじょう に強い応答を提示し、一方、GST−IE63によるＳ．Ｉ．は2.0未満であった。４人 のドナーはGST−IE63について2.0のＳ．Ｉ．をもち、そしてVZ抗原についてのＳ ．Ｉ．は、5.4〜11の範囲にあった。しかしながら、≦２のGST−IE63によるＳ． Ｉをもつ上記ドナーの全ては、GST単独に対するひじょうに重要な応答をもち（ データを示さず）、これは、これらの結果の解釈を困難にした。他の自然免疫個 体の全て（59％）が、2.3〜８の間のＳ．Ｉ．をもって、GST−IE63に対する強い 応答を提示した。しかしながら、VZ抗原による刺激と融合タンパク質による刺激 の間に相関はなかった。 実施例４：サイトカイン・アッセイ IE63により刺激されたPBMCによるサイトカイン生産を７人の被験体について評 価した：PBMCは、GST又はGST−IE63のいずれかにより刺激され、そしてIL．２， IL４及びｇ−FNは、ELISAにより２，４又は６日目に検出された。これらの結果 を、GST−IE63又はGST単独による刺激の後に検出されたサイトカインの濃度間の 差異として表した。IL２とIL４は全く検出されなかった。一方、γ−IFNは ４日目の最大の生産をもって、IE63により刺激されたＴ−細胞により有意な量(1 75〜1400pg／ml)で生産された。刺激が全く観察されなかった培養物中に検出さ れたγ−IFNの量は、有意に低いものであった： 実施例５：細胞毒性アッセイ： IE62及びIE63−特異的CTL応答を、10 VZV−免疫ドナーから得られたＴ細胞の 限界希釈アッセイにおいて検出した。これらのアッセイを、ワクシニア−対照、 ワクシニア−IE62ワクシニア−IE63により感染され又は非感染の自己標的を用い て行った。対照標的により生成されたバックグラウンドは、これらのドナーの中 で広い範囲の変動を提示したが、これらの結果は、ウィルス−特異的標的の溶解 が、（ワクシニア−対照で感染され又は非感染の）対照標的による溶解よりも少 なくとも10％高かった場合にのみ、有効であると考えられた。 Ｔ−リンパ球により回収されたＴ細胞集団が使用されたとき、VZVタンパク質 を発現する標的の溶解は、１のアッセイについて示されるように、非感染又は対 照標的について観察されたものよりも有意に高いものであった（図３）。IE62を 発現する標的により観察さ れた溶解は、IE63を発現する標的による溶解とは有意な差があった。同様の結果 が、全Ｔ細胞集団により行われた４つのアッセイについて得られた：25〜48％の 特異的溶解がIE62について観察され、そして27〜43％がIE63について観察された 。IE62とIE63を認識したＴ細胞についての平均前駆体頻度（mean precursor fre quency）は、それぞれ、44500±22500SEと31000±16000SEであったが、その差は 統計的に有意ではなかった(ｐ＝0.8)。 限界希釈培養物をも、エフェクターとしてCD４＋とCD８＋Ｔリンパ球の精製さ れた集団を使用して調製した。両集団が、IE62とIE63・標的を溶解した。IE62又 はIE63を認識するCD８＋細胞のRCFは、それぞれ、28500±10100SEと30500±1370 0SEであり、これは統計的な差ではなく(ｐ＝0.9)、これは、両ウィルス・タンパ ク質がCD８＋細胞によって同一の効率で認識されたことを示すものであった（図 ４）。また、IE63標的を溶解する細胞の数は、エフェクター細胞の両集団におい て同一であり；平均CD４＋エフェクター細胞は31450±7500SEであった。そして これはCD８＋細胞の頻度と同じである（ｐ＝0.97）。しかしながら、IE62認識に ついてのCD４＋細胞頻度の計算は、コンピューター支援分析により拒否されてい る。 実施例６：潜伏の間のVZV IE63発現 潜伏−感染されている神経節(ganglia)内でのVZV発現を分析するために、９人 の成分及び３人の小児からの１の三叉神経（trigeminal）及び多数の胸神経（th oracic ganglia）を、死後24時間以内に得た。上記被験体のいずれも、死の前、 免疫無防備状態ではなく、そして検屍解剖において最近のヘルペスウィルス感染 の皮膚上の兆候は全く存在しなかった。エンザイム・イムノアッセイは、上記成 人の全ての血清中にVZVに対する抗体を現した。上記３人の小児の中の１のみか ら入手可能な血清は、VZVに対する抗体を含んでい なかった。VZV−特異的プライマーを使用した液体PCR増幅（Mahalingham R et a l Engl．J．Med 323 627-631）は、各神経節の小さな部分から抽出されたDNA中 に、成人神経節においてVZV DNAを現したが、小児神経節においてはVZV DNAを現 さなかった。各神経節の残りの部分を、E．coli内でグルタチオン−Ｓ−トラン スフェラーゼ融合タンパク質として発現され、そして記載されたように精製され た（Debrus et al前掲）30.5−kD−VZV IE63タンパク質に対してウサギ内で作ら れた抗体を使用して免疫化学的に分析した。VZV感染と非感染BSC−１（アフリカ ・サル腎臓）細胞は、それぞれ、ポジティブとネガティブ・コントロールとして 働いた。 VZV−感染BSC−１細胞においては、VZV IE63タンパク質を含む典型的なVZV細 胞病理学の２つの病巣領域が見られた。非感染細胞又はHSV−感染BSC−１細胞に おいてはいずれの兆候も検出されなかった。アテローム性硬化症が原因で死んだ 46歳の男性から死後17時間目に得た神経節においては、特徴的な赤色は、３つの ニューロンの細胞質内だけにVZV IE63タンパク質を現した。正常なウサギ血清が 同一神経節の隣接セクションに適用されたとき、兆候は全く検出されなかった。 濃い赤色染色は、同一被験体の異なる胸神経節の隣接セクション内のニューロン の細胞質内に検出された。より薄い赤色も、潜伏感染された神経節の多数のニュ ーロン内にしばしば見られ、このことは、より広汎性の（more diffuse）、たぶ んより発生量の少ない(lower abundance)感染を示唆している。この赤色VZV IE6 3タンパク質−特異的染色は、付随休（嚢）細胞（satellite（capsular）cells ）、毛細血管、結合組織、神経節内の神経束(nerve fascicles)、又は神経節に 侵入する神経細根内には全く見られなかった。VZV IE63タンパク質に対する抗血 清が、先天性臍帯ヘルニア（congenital omphalocele）と肺低形成（pulmonary hypoplas ia）が合併した敗血症が原因で死んだ２ヶ月齢の小児の神経節に適用されたとき 、兆候は全く検出されなかった。全体として、VZV IE63タンパク質は、２人の成 人からの５つの神経節（４つの胸及び１つの三叉神経）内にあった。上記成人の 中の１においては、VZV IE63タンパク質は、５つの胸神経節の中の４からの10セ クションの全てにおいて検出された。第２の成人においては、VZV IE63タンパク 質は、その三叉神経からの４セクションの全てにおいて検出された。陽性セクシ ョンにおいては、VZV IE63タンパク質は、２〜４ニューロンの細胞質内で検出さ れた。VZV IEタンパク質は、７人の他の成人からの16神経節のそれぞれから調製 された４セクションのいずれにおいても、又は３人の小児からの９神経節のそれ ぞれからの４セクションのいずれにおいても検出されなかった。 ほとんど全ての神経節内にVZV DNAが検出されるが、VZV IE63タンパク質はい くつかの潜伏感染神経節内にのみ存るということは、サンプリングを反映してい るかもしれない。すなわち、VZV IE63タンパク質についてのVZV DNAを含む各神 経節の各セクションの分析は、追加の陽性神経節を現していたかもしれない。あ るいは、ウィルス発現は、異なる神経節、例えばHSVで潜伏感染された神経節内 で相違しているかもしれず、HSV DNAを含むニューロンの数は、潜伏関連転写を 現すものよりもはるかに大きい。 最終的に、ウィルス再活性化は生じていたかもしれない。但し、これは、その 者の神経節がVZV IE63タンパク質を含む被験体内では、そうでないようである。 なぜなら、死の前の帯状疱疹状の発疹の臨床的証拠、発疹に先行することができ る慣性神経痛の病歴（ヘルペス前神経痛）、発疹を伴わない皮膚分散性痛の病歴 (Zoster sine herpete)、低等級神経節炎を示唆するヘルペス後神経節の病歴は 全く存在しなかった。さらに、神経節の病歴検査は、神経細胞侵食 、封入体又は炎症応答を全く現さなかった。 結論： 上記の実験から、我々は、VZV IE63が完全な免疫応答を顕出すると結論するこ とができる： ・抗−IE63抗体は、水痘の病歴をもつほとんどのドナーの血清中に、ウェスタ ン・ブロット分析により、検出されることができる； ・Ｔ細胞は、（GST−融合タンパク質として精製された）IE63によるインビト ロ刺激後に、増殖することができるが、限定された数のテストされたドナーは、 VZVによる刺激係数（Ｓ．Ｉ．）とIE63によるものとの間の直接的相関を見い出 すことはできなかった。IE63刺激に応答するＴ−細胞増殖は、上記上清中の高い 量のIFN-ガンマの発現により示されるように、主としてTh１である； ・IE63認識の意味でのＴ細胞の細胞毒性活性が示されている。精製されたエフ ェクター細胞の使用により測定されるように、CD４＋とCD８＋細胞はその溶解プ ロセスに参加する。IE63を認識する前駆細胞の数は、IE62に応答する細胞数に近 似する。 以上は、その免疫学的特性と共に採取した、ヒト神経系内で潜伏の間に発現さ れるヘルペスウィルス・タンパク質の同定についての最初の報告であり、それは 、水痘帯状疱疹に対するワクチン中に含まれるべき優れた抗原である。 表１：Ｔ細胞増殖 表１：VZVに応答する体液性及び細胞免疫応答 Ｓ．Ｉ．を、全抗原（４，16又は64倍に希釈された音波処理感染又は偽感染メ タラノーマ細胞）の刺激又はIE63融合タンパク質(GST又はGST−IE63)による刺激 後に計測した。 体液性免疫ステータスを、（Ｏ．Ｄ．が＞0.250である希釈として表された） 全抗原によるELISAにより又はIE63を用いたウェスタン・ブロット分析により評 価した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年３月２０日（１９９８．３．２０） 【補正内容】 請求の範囲 １．水痘帯状疱疹ウィルスIE63タンパク質又は免疫学的に機能する誘導体及び 医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物。 ２．IE63をコードする核酸又は免疫学的に機能するその誘導体を含む医薬組成 物。 ３．医薬における使用のためのIE63遺伝子タンパク質又は免疫学的に機能する その誘導体。 ４．水痘又は帯状疱疹の予防又は改善のための医薬の製造のための、IE63タン パク質又は免疫学的に活性なその誘導体の使用。 ５．他のVZV抗原をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。 ６．前記第２の水痘帯状疱疹タンパク質が、gpＩ，gpII，gpIII，gpIV，gpＶ ，IE62、及び免疫学的に機能するその誘導体から成る群から選ばれる、請求項５ に記載の医薬組成物。 ７．アジュバントをさらに含む、請求項１，２，５又は６のいずれか１項に記 載の医薬組成物。 ８．前記アジュバントが優先的にTH１応答を誘発する、請求項７に記載の医薬 組成物。 ９．前記抗原が、QS21と３Ｄ−MPLと共に、油／水エマルジョンとして提示さ れる、請求項８に記載の医薬組成物。 【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１２年１１月１６日（２０００．１１．１６） 【補正内容】 明細書第２頁最終行の記載「及び胸腺のニューロン」を、『及び胸腺神経節の ニューロン』に誤訳訂正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 レンティエル，ベルナルド ベルギー国，ベー―4000 リエジュ，ベ ー．23―サルト―ティルマ，トゥール ド ゥ パソロジエ（２イー エタージュ）, セントレ，オスピタリェ ユニヴェルステ ィエ ドゥ リェジェ (72)発明者 サドゾ，カトゥリヌ ベルギー国，ベー―4000 リエジュ，ベ ー．23―サルト―ティルマ，トゥール ド ゥ パソロジエ（２イー エタージュ）, セントレ，オスピタリェ ユニヴェルステ ィエ ドゥ リェジェ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．水痘帯状疱疹ウィルスIE63タンパク質又は免疫学的に機能する誘導体及び 医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物。 ２．IE63をコードする核酸又は免疫学的に機能するその誘導体を含む医薬組成 物。 ３．医薬における使用のためのIE63遺伝子タンパク質又は免疫学的に機能する その誘導体。 ４．水痘又は帯状疱疹の予防又は改善のための医薬の製造のための、IE63タン パク質又は免疫学的に活性なその誘導体の使用。 ５．他のVZV抗原をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。 ６．前記第２の水痘帯状疱疹タンパク質が、gpＩ，gpII，gpIII，gpIV，gpＶ ，IE62、及び免疫学的に機能するその誘導体から成る群から選ばれる、請求項５ に記載の医薬組成物。 ７．アジュバントをさらに含む、請求項１，２，５又は６のいずれか１項に記 載の医薬組成物。 ８．前記アジュバントが優先的にTH1応答を誘発する、請求項７に記載の医薬 組成物。 ９．前記抗原が、QS21と３Ｄ−MPLと共に、油／水エマルジョンとして提示さ れる、請求項９に記載の医薬組成物。 10．請求項１，２，５，６，７，８又は９のいずれか１項に記載の医薬組成物 の安全かつ有効な量を患者に投与することを含む、水痘帯状疱疹ウィルス感染を 患っているか又はそれを受け易い患者を治療する方法。 11．水痘帯状疱疹ウィルスIE63タンパク質、その核酸又は免疫学的に機能する その誘導体を含む医薬組成物の製法であって、上記のタンパク質、核酸又は誘導 体を、医薬として許容される賦形剤と混 合することを含む、前記製法。 12．前記賦形剤がアジュバントを含む、請求項11に記載の製法。