CN117122676A - Hsv免疫原性组合物及其应用 - Google Patents

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Abzymo Biosciences Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种HSV免疫原性组合物，包含源自HSV的重组蛋白和佐剂，所述重组蛋白包含gB蛋白胞外域或其功能片段，提供与HSV病毒入侵细胞直接相关的高度保守的表位，能有效刺激特异性中和抗体和细胞因子产生，激发较高水平的体液免疫和细胞免疫,所述佐剂包含MPL和QS‑21；该HSV免疫原性组合物可以针对多种HSV毒株产生良好的免疫效果，从而提供广谱而高效的保护，有效预防HSV感染。

Description

HSV免疫原性组合物及其应用
技术领域
本申请属于生物医药工程领域，特别涉及一种HSV免疫原性组合物及其应用。
背景技术
单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是最常见的人类感染病毒之一，广泛存在于自然界中，主要通过皮肤、粘膜和神经组织感染宿主而引起病变。HSV可分为HSV-1和HSV-2两种血清型，HSV-1感染人体后主要引起唇疱疹、咽炎、角膜炎，甚至能引起散发性脑炎等严重疾病；HSV-2主要通过破损皮肤及黏膜感染引起生殖器疱疹、新生儿疱疹等。
HSV是双股DNA病毒，呈球形，由核心、衣壳、被摸、包膜组成，病毒颗粒直径约150～200nm。其包膜表面有gB、gC、gD、gE、gF、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM等12种糖蛋白，其中gB、gD、gH、gK和gL是感染细胞所必需的。非必要的病毒糖蛋白gC在病毒与细胞受体、细胞蛋白多糖的硫酸肝素部分的初始关联中起着主要作用，而gC与gE/gI蛋白均与HSV病毒的免疫逃逸有关。
HSV感染的第一步是膜融合，与之相关的蛋白为gB、gD以及gH/gL，这些蛋白对于HSV入侵细胞起到重要作用，其介导的HSV病毒融合过程如下：(1)gD蛋白结合受体并发生构象改变；(2)构象改变的gD促进gH/gL转化为能够与gB相互作用的形式，从而激活gB；(3)被激活的gB必须和gH/gL一起促使病毒附着在细胞膜上。其中，只有gB被认为具有促进融合的作用，其在HSV融合过程中发生构象改变，可以诱导产生特异性中和抗体，也能产生CD4+和CD8+T细胞免疫。
gB蛋白在所有疱疹病毒家族中都高度保守，也是体液免疫和细胞免疫的重要靶点，也因此成为HSV疫苗研发中的重要基因。gB蛋白由UL27基因编码，全长904个氨基酸，结构如图1所示，从N端至C端依次为信号肽(signal peptide，SP)、胞外域(extracellulardomain，ECD)、膜近端区(membrane proximal region，MPR)、跨膜结构域(transmembranedomain，TM)以及胞浆区(cytoplasmic domain，CTD)。gB蛋白的融合能力来源于胞外域，其中包含I、II、III、IV、V五个区域，其中I和II为融合(Fusion)结构域(Vollmer,B.,et al.,The prefusion structure of herpes simplex virus glycoprotein B.Sci Adv,2020.6(39))。天然gB蛋白是三聚体结构，通过与细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白结合，促进病毒膜与细胞膜的融合，进而介导病毒进入细胞。因此，针对gB蛋白的免疫保护是防止感染的第一步。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种HSV免疫原性组合物及其应用。
本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种HSV免疫原性组合物，包含源自HSV的重组蛋白和佐剂，所述重组蛋白包含HSV-1与HSV-2中至少一项的gB蛋白胞外域或其功能片段，或者与所述gB蛋白胞外域或其功能片段的序列至少90％相同；其中，所述功能片段至少包含HSV-1与HSV-2中至少一项的gB蛋白胞外域的I和II结构域，所述佐剂包含MPL和QS-21。
进一步地，所述重组蛋白包含HSV-1的gB蛋白胞外域或其功能片段和HSV-2的gB蛋白胞外域或其功能片段。
进一步地，所述HSV-1的gB蛋白胞外域或其功能片段的C端与所述HSV-2的gB蛋白胞外域或其功能片段的N端直接连接或间接连接，或者所述HSV-2的gB蛋白胞外域或其功能片段的C端与所述HSV-1的gB蛋白胞外域或其功能片段的N端直接连接或间接连接。
例如，在一个实施方式中，所述HSV-1的gB蛋白胞外域的C端与所述HSV-2的gB蛋白胞外域的N端直接连接或间接连接。在一个实施方式中，所述HSV-1的gB蛋白胞外域的功能片段的C端与所述HSV-2的gB蛋白胞外域的功能片段的N端直接连接或间接连接。在一个实施方式中，所述HSV-1的gB蛋白胞外域的功能片段的C端与所述HSV-2的gB蛋白胞外域的N端直接连接或间接连接。在一个实施方式中，所述HSV-1的gB蛋白胞外域的C端与所述HSV-2的gB蛋白胞外域的功能片段的N端直接连接或间接连接。
在另一个实施方式中，所述HSV-2的gB蛋白胞外域的C端与所述HSV-1的gB蛋白胞外域的N端直接连接或间接连接。在另一个实施方式中，所述HSV-2的gB蛋白胞外域的功能片段的C端与所述HSV-1的gB蛋白胞外域的功能片段的N端直接连接或间接连接。在另一个实施方式中，所述HSV-2的gB蛋白胞外域的功能片段的C端与所述HSV-1的gB蛋白胞外域的N端直接连接或间接连接。在另一个实施方式中，所述HSV-2的gB蛋白胞外域的C端与所述HSV-1的gB蛋白胞外域的功能片段的N端直接连接或间接连接。
进一步地，所述gB蛋白胞外域或其功能片段发生至少一处氨基酸突变。
进一步地，所述重组蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.1～7中的任一项至少90％相同。
进一步地，单次给药剂量的所述HSV免疫原性组合物中包含所述重组蛋白20～80μg，优选为50μg。
进一步地，所述佐剂为包含MPL和QS-21的脂质体佐剂。
进一步地，单次给药剂量的所述HSV免疫原性组合物中包含MPL 10～100μg和QS-21 10～100μg。
另一方面，本发明还提供了上述HSV免疫原性组合物在制备预防HSV感染的疫苗中的应用。
进一步地，所述疫苗包括成分相同、间隔14～28天(例如21天)施用的第一剂次和第二剂次。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种HSV免疫原性组合物，包含HSV重组蛋白和佐剂，所述HSV重组蛋白包含gB蛋白胞外域或其功能片段，提供与HSV病毒入侵细胞直接相关的高度保守的表位，能有效刺激特异性中和抗体和细胞因子产生，激发较高水平的体液免疫和细胞免疫；该免疫原性组合物可以针对多种HSV毒株产生良好的免疫效果，从而提供广谱而高效的保护，有效预防HSV感染。
附图说明
图1为HSV病毒gB蛋白的结构示意图；
图2为不同重组质粒的SDS-PAGE电泳图，其中：(a)中1～8泳道依次为pcDNA3.1-gB1-P、pcDNA3.1-gB1-fusion、pRK1.6-gB1-WT、pcDNA3.1-gB1-WT、pRK1.6-gB2-fusion、pcDNA3.1-gB2-fusion、pRK1.6-gB2-WT、pcDNA3.1-gB2-WT；(b)中1～3泳道(从左到右)依次为pcDNA3.1-gB1-gB2-fusion、pcDNA3.1-gB2-P、pcDNA3.1-gB2-WT；
图3为不同重组质粒的琼脂糖凝胶电泳图，其中：(a)中各泳道从左至右分别为pRK1.6-gB1-P、pcDNA3.1-gB1-P、pRK1.6-gB1-fusion、pcDNA3.1-gB1-fusion、pRK1.6-gB1-WT、pcDNA3.1-gB1-WT、pRK1.6-gB2-fusion、pcDNA3.1-gB2-fusion、pRK1.6-gB2-WT、pcDNA3.1-gB2-WT、pRK1.6-gB2-P；(b)中各泳道从左至右分别为pcDNA3.1-gB2-P、pcDNA3.1-gB2-WT、pcDNA3.1-gB1-gB2-fusion、pRK1.6-gB2-WT；
图4为pcDNA3.1-gB1-P质粒的瞬转实验结果，其中(a)、(b)、(c)分别为1～3组的SDS-PAGE电泳图；
图5为pcDNA3.1-gB1-fusion质粒的瞬转实验结果，其中(a)、(b)、(c)分别为1～2组、3～4组、5组的SDS-PAGE电泳图；
图6为pcDNA3.1-gB1-WT、pcDNA3.1-gB2-fusion和pcDNA3.1-gB1-gB2-fusion质粒的瞬转实验结果；
图7为不同疫苗免疫后CD4+T细胞内不同细胞因子检测结果；
图8为不同疫苗免疫后细胞因子产生情况比较；
图9为不同疫苗针对gB1-P抗原诱导产生特异性IgG抗体的结果；
图10为不同疫苗针对gB1-fusion抗原诱导产生特异性IgG抗体的结果；
图11为不同疫苗诱导产生特异性IgA抗体的结果；
图12为不同疫苗免疫后血清HSV-1毒株中和实验结果；
图13为用Gr3免疫后血清HSV-2毒株中和实验结果；
图14为CD4+T细胞的细胞内细胞因子检测结果；
图15为疫苗诱导血清特异性IgG抗体滴度(GMT，几何平均数)；
图16为疫苗诱导血清特异性中和抗体滴度。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。需要说明的是，以下关于重组蛋白的命名仅为便于表述，其中“gB1”代表该蛋白来自HSV-1(野生型全长序列参见GenBank:AAF04615.1)，“gB2”代表该蛋白来自HSV-2(野生型全长序列参见GenBank:AAA66440.1)，例如，gB1-WT表该蛋白直接截取自野生型HSV-1gB蛋白胞外域(即野生型gB蛋白的第31-730位，gB蛋白的第1-30为信号肽)，gB2-WT代表该蛋白直接截取自野生型HSV-2的gB蛋白胞外域(即野生型gB蛋白的第23-771位，gB蛋白的第1-22位为信号肽)，gB1-P代表该蛋白截取自HSV-1的gB蛋白胞外域，并在第516位发生脯氨酸取代，gB2-P代表该蛋白截取自HSV-2的gB蛋白胞外域，并在第510位发生脯氨酸取代，gB1-fusion代表该蛋白为HSV-1的gB蛋白中的融合(Fusion)结构域(胞外域的I和II结构域，野生型gB蛋白的第142-459位)，gB2-fusion代表该蛋白为HSV-2的gB蛋白中的融合(Fusion)结构域(胞外域的I和II结构域，野生型gB蛋白的第134-451位)，gB1-gB2-fusion代表该蛋白为HSV-1的gB1-fusion与HSV-2的gB2-fusion的结合(直接连接或间接连接)。
在本申请中，所述“直接连接或间接连接”通常是指两段序列直接相连和间接相连这两种不同的连接方式，其中的直接相连是指两段序列之间的连接没有任何人为添加的其余序列，如柔性Linker、刚性Linker或可剪切Linker等的参与。间接相连则是指两段序列是通过人为添加连接序列，例如柔性Linker、刚性Linker或可剪切Linker等手段实现的两段序列的连接方式。在某些实施方式中，所述柔性Linker可以包含一个或多个GSGSG、GGGSS、GGGS等氨基酸序列。
在本申请中，pRK1.6载体是指在pcDNA3.1载体的CMV启动子下游添加TM元件，在MCS下游添加WPRE元件后获得的载体，其中，TM元件是指人腺病毒主要晚期启动子(MLP)mRNA的三联体前导序列，WPRE元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。
实施例1合成融合基因
按照表1中的抗原蛋白设计基因序列并进行密码子优化，并人工合成相应的融合基因。
表1抗原基因序列
实施例2构建重组质粒载体
将上述抗原基因中的前6项分别克隆连接到pRK1.6和pcDNA3.1载体上，将gB1-gB2-fusion基因连接到pcDNA3.1载体上，构建分别表达七种抗原蛋白的重组质粒载体，并按如下方法转染到CHO细胞内：
将Expi CHO-S细胞(Thermo)在补充有6mM L-谷氨酰胺(sigma/G5146)的EmCDCHO-S 203(Eminence/L20301)培养基中培养，DNA用量1μg/ml，转染试剂PEI(Polysciences/24765-1)与DNA的比为6:1；用上述含L-谷氨酰胺的培养基配制转染孵育体系(体积为转染体积的10％)，将PEI混合物加至DNA混合物中静置孵育5min，将培养物于37℃、8％ CO2、120rpm的潮湿培养箱中摇瓶培养；转染24h后降温至32℃培养，转染后第1、3、5天分别按5％体积比添加Advanced Feed1(sigma/24368-1L)进行补料，期间保持糖浓度不低于2g/L，转染后第6天停止培养，取上清进行SDS-PAGE检测。结果如图2所示所示，能在相应大小的位置看到清晰的条带，表明载有目的基因的重组质粒载体已成功转入CHO细胞中。
实施例3重组质粒载体扩增及鉴定
将转入含有目的基因的质粒的甘油菌转接到150mL LB液体培养基(Amp终浓度为100μg/ml)中，在37℃、2000rpm下摇床培养过夜，用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒提取，对提取物测定质粒浓度、并进行酶切鉴定，其中pcDNA3.1质粒用NotⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，pRK1.6质粒用NotⅠ进行单酶切，37℃下酶切2h，具体的反应体系如表2所示。
表2酶切反应体系
(1)质粒扩增后测定浓度，结果如表3所示，可见各质粒均能获得较高的扩增浓度。
表3质粒浓度测定结果
质粒名称 质粒浓度(μg/mL)
pRK1.6-gB1-P 688
pcDNA3.1-gB1-P 502
pRK1.6-gB1-fusion 493
pcDNA3.1-gB1-fusion 505
pRK1.6-gB1-WT 1028
pcDNA3.1-gB1-WT 611
pRK1.6-gB2-fusion 506
pcDNA3.1-gB2-fusion 123
pRK1.6-gB2-WT 1052
pcDNA3.1-gB2-WT 1082
pRK1.6-gB2-P 293
pcDNA3.1-gB2-P 1465
pcDNA3.1-gB1-gB2-fusion 1266
(2)用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，如图3所示，在相应大小的位置可见清晰的条带。
(3)对所有质粒的进行测序，经鉴定，所有gB质粒目的基因序列完全正确。
综上可知，载有目的基因的重组质粒载体已被成功转入宿主细胞中，并已成功获得扩增。
实施例4抗原蛋白纯化
对实施例2中得到的CHO细胞发酵液在4000rpm条件下离心10min，用0.22μm的PVDF过滤器(Millipore)过滤，保留上清；将10ml金属螯合层析纯化填料(中科森辉)填入XK16/20空层析柱(cytiva)中，然后连接至AKTApure纯化仪(cytiva)，用pH7.4的PBS缓冲液平衡层析柱至电导率和吸光度基线平衡；向600ml过滤好的发酵液中添加咪唑至其中浓度为10mM，并由纯化仪泵进样。进样完毕后，用含30mM咪唑的pH7.4的PBS缓冲液清洗至基线平衡，再用含500mM咪唑的pH7.4的PBS缓冲液对目的蛋白进行洗脱，将洗脱液合并，转移至30KDa MWCO的超滤管(Millipore)中，在4000rpm的条件下离心、浓缩至液体体积为约1ml，然后添加15ml pH7.4的PBS缓冲液重悬并离心、重复三次，以PBS置换蛋白溶液的溶解体系并进行稀释。对所获得的蛋白溶液进行SDS-PAGE凝胶分析和WB分析，并使用BCA法测定蛋白浓度。
结果显示，纯化后蛋白浓度最高能达到3.45mg/ml，收率可达到50％，凝胶中在相应大小的位置可见明显条带，杂条带少且不明显，表明上述纯化方法能够获得高收率、高纯度的目的蛋白产物。
实施例5抗原蛋白质量分析
(1)粒度检测
对实施例4中提取纯化得到的目标蛋白进行粒径测定，分别用马尔文粒度仪重复检测三次，结果显示，各蛋白产物的粒径都小于30nm、分布度PDI均小于0.2，说明纯化后的蛋白粒径较小，且均一性良好、不易发生聚集。
(2)稳定性检测
对目标蛋白gB1-gB2-fusion进行高温加速试验和长期试验，结果显示，TM值(蛋白开始聚集时的温度)与单抗lgG(对照)十分接近，高达70℃以上，说明纯化后的蛋白性质稳定，便于储存和运输。
实施例6瞬转条件优化实验
6.1gB1-P质粒瞬转条件优化实验
按照实施例2提供的转染方法进行pcDNA3.1-gB1-fusion质粒的瞬转实验，分别根据表4中的条件配置PEI/DNA混合体系、并在培养过程中进行补料，期间每天监测糖浓度并补至5g/L、保持糖含量不低于2g/L；转染后第5天开始留样(上清+细胞)至活率达到70％左右收样，对产物进行SDS-PAGE检测。
表4gB1-P载体瞬转实验方案
实验结果如图4所示，各组均出现明显条带，其中1～3组清晰程度相当，说明几种PEI/DNA比例的表达量相当、且均能获得较好的表达效果；另外，由图可知，延长培养时间不仅不会使表达量提升，反而会出现明显的杂条带，不利于后续的纯化，因此瞬转后5～7天收样结束培养为宜。
6.2gB1-fusion质粒瞬转条件优化实验
按照实施例2提供的转染方法进行pcDNA3.1-gB1-fusion质粒的瞬转实验，分别根据表5中的条件配置PEI/DNA混合体系、并在培养过程中进行补料，期间每天监测糖浓度并补至5g/L、保持糖含量不低于2g/L；转染后第5天开始留样(上清+细胞)至活率达到70％左右收样，对产物进行SDS-PAGE检测。
表5gB1-fusion载体瞬转实验方案
实验结果如图5所示，各组均出现明显条带，其中1～3组清晰程度相当，说明几种PEI/DNA比例的表达量相当、且均能获得较好的表达效果；3～5组对不同的补料成分和补料量进行了比较，结果显示不同补料成分对表达量影响的差别不大。
综上可知，PEI/DNA的适宜比例较为宽泛，但出于大规模制备的考虑，优选6:1的比例，在确保表达效果的同时可有效节省DNA的用量；同时，feed1与Em-S1F均适宜作为补料的成分，但feed1比Em-S1F成本低、且收液当天活率更高，同样出于大规模制备的考虑，优选feed1进行补料。
图6为在优化的瞬转条件下获得的gB1-WT、gB2-fusion和gB1-gB2-fusion的SDS-PAGE电泳图。
实施例7抗原工作液的制备
以gB1-P(原始浓度3.45mg/ml)作为抗原，取29μl抗原母液与971μl抗原缓冲液(1×PBS缓冲液)混匀，得到gB1-P抗原工作液。
实施例8抗原工作液的制备
以gB1-fusion(原始浓度1.65mg/ml)作为抗原，取24.2μl抗原母液与375.8μl抗原缓冲液(1×PBS缓冲液)混匀，得到gB1-fusion抗原工作液。
实施例9佐剂工作液的制备
取55μl CpG(浓度为32.42mg/ml)与245μl的154mM NaCl溶液混匀，得到CpG佐剂工作液。
实施例10佐剂工作液的制备
取60μl Al(OH)3(购自Croda Denmark，浓度2％，铝含量10mg/ml，CAS：21645-51-2)，加入至430μl的154mM NaCl溶液中，混匀备用；取110μl CpG加入至上述溶液中；所获溶液在20rpm的摇床上吸附30min，得到CpG+Al(OH)3佐剂工作液。
实施例11佐剂工作液的制备
将DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)、胆固醇和MPL溶解于乙醇中，通过在真空下蒸发溶剂形成脂质膜，添加由氯化钠、无水磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制的磷酸盐缓冲液并对混合物进行预匀浆，接着在15,000psi下进行微流化(20个循环)，将所产生的脂质体通过0.22μm膜进行无菌过滤，得到AS01佐剂工作液，每0.5ml AS01佐剂工作液包含50μg MPL、50μgQS-21、1mg DOPC和0.25mg胆固醇。
实施例12疫苗工作液的制备
取300μl实施例7提供的抗原工作液与300μl实施例10提供的佐剂工作液混匀，得到Gr1疫苗工作液。
实施例13疫苗工作液的制备
取300μl实施例7提供的抗原工作液与300μl实施例9提供的佐剂工作液混匀，得到Gr2疫苗工作液。
实施例14疫苗工作液的制备
取300μl实施例7提供的抗原工作液与300μl实施例11提供的佐剂工作液混匀，得到Gr3疫苗工作液。
实施例15疫苗工作液的制备
取300μl实施例8提供的抗原工作液与300μl实施例10提供的佐剂工作液混匀，得到Gr4疫苗工作液。
实施例16包含不同佐剂的HSV疫苗免疫效果试验
取C57BL/6N小鼠20只(雌性，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，随机分成4组、每组5只，按照表6所示的方式进行分组免疫，并进行各项指标的观察与测定。
表6分组实验设计情况
组别 疫苗工作液 免疫剂量 免疫途径和体积 免疫程序
1 Gr1 1/10HD 皮内0.1ml 2剂次，间隔21d
2 Gr2 1/10HD 皮内0.1ml 2剂次，间隔21d
3 Gr3 1/10HD 皮内0.1ml 2剂次，间隔21d
4 Gr4 1/10HD 皮内0.1ml 2剂次，间隔21d
16.1一般临床观察及死亡情况
动物免疫期间，于免疫当日观察动物状态及给药部位。
16.2血液样品采集及处理
分别于免疫的第0天、21天、35天和49天进行采血，采血方法为眼后静脉丛采血、每次采血量300～500μl；取血后不抗凝，37℃放置1h、之后4℃放置0.5h，8000rpm下离心10min，收集血清，置于56℃水浴中灭活30min，-20℃保存。
16.3抗原特异性IgG抗体检测
采用ELISA方法测定抗原特异性IgG抗体，具体如下：
(1)于末次免疫后14天(35D)对小鼠采血，用CB包被液(pH7.4±0.1)将gB1-P抗原稀释至3μg/ml(或将gB1-fusion抗原稀释至5μg/ml)，在96孔板上每孔加入100μl，2～8℃包被过夜后洗涤2次；
(2)每孔加入150μl封闭液，37℃封闭2.5h；
(3)将免疫后分离得到的血清以适宜倍数作为起始稀释倍数，用样品稀释液2倍梯度稀释7个浓度点，每孔加入100μl血清样品，37℃孵育90min，孵育结束后洗涤3次；
(4)每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(Jackson，货号：115-035-003，酶标稀释液稀释30000倍)，37℃孵育45min，孵育结束后洗涤5次；
(5)每孔加入100μl显色液，37℃避光孵育15min后加入终止液，测定450nm波长处的OD值；
(6)结果判定，根据方法开发参数，样品OD值与空白对照OD均值的比值大于等于2.1所对应的最大血清稀释倍数，即判定为该血清样品的抗原特异性IgG抗体滴度(阴性对照OD均值小于0.05按0.05计)。
16.4细胞因子检测
细胞内细胞因子的检测方法具体如下(其中涉及的离心操作条件均为4℃、350g离心5min)：
(1)于末次免疫后28天(D49)将小鼠脱颈椎处死，立即放入医用酒精中浸泡，转移至生物安全柜中取出脾脏，裂解红细胞制备脾细胞悬液，计数、调整脾细胞浓度至1×106个/ml；
(2)向无菌流式管中加入1ml对应组别脾细胞悬液(即每管加入1×106个细胞)，加入20μg/ml的刺激蛋白以及CD28(Biolegend，货号：102102)、CD49d(Biolegend，货号：103708)、Brefeldin A(Biolegend，货号：420601)等刺激剂，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中孵育18h；
(3)孵育结束后，取出流式管，用DPBS(Lonza，货号：17-512F)洗两次，加入FixableViability Stain 450染料(BD Biosciences，货号：562247)(1:100)，4℃下避光孵育20min；
(4)配制Wash buffer(WB，1％FBS-PBS缓冲液)：吸取5ml的灭活FBS加至495ml PBS中，震荡混匀后使用，现用现配；
(5)用1ml的Wash buffer洗涤2次，加入TruStainFcXTM阻断剂(Biolegend，货号：103710)(1:40)，4℃孵育10min；随后加入CD3e-FITC(BD Biosciences，货号：553062)(1:100)、CD4-APC-Cy7(BD Biosciences，货号：552051)(1:100)、CD8a-PE-Cy7(BDBiosciences，货号：552877)(1:100)荧光抗体进行表面染色，4℃孵育20min；
(6)用1ml的Wash buffer洗涤2次，加入Fixation Buffer(Biolegend，货号：420801)进行固定，室温避光孵育20min；
(7)配制破膜剂(PWB，1×)：在生物安全柜中操作，吸取10ml IntracellularStaining Permeabilization Wash Buffer(10×)(Biolegend，货号：421002)加入90ml去离子水中，充分混匀后使用；
(8)用1ml的Wash buffer洗涤2次，加入1ml PWB(1×)后离心、进行细胞破膜，再加入80μl PWB(1×)重悬细胞，轻轻混匀，室温避光孵育5min；
(9)分别加入IL-2-BV605(BD Biosciences，货号：563911)(1:100)和IFN-γ-APC(BD Biosciences，货号：554413)(1:100)荧光抗体进行细胞因子染色，4℃孵育1h；
(10)用1ml的Wash buffer洗涤2次，每管加入100μl DPBS重悬细胞，用流式细胞仪收集细胞。
16.5IgA检测
(1)于末次免疫后14天(D35)对小鼠采血，按照Mouse IgAELISAKit(四正柏生物，货号：MCD-000-090)说明书溶解冻干标准品，静置15分钟后混匀备用；
(2)将标准品工作液2倍梯度稀释7个浓度点，将待测血清样品根据预实验结果用样品稀释液稀释适宜倍数；
(3)按照加样板图以100μL/孔加入标准品和样品，用封板膜封板，室温振荡孵育2小时；
(4)配制1×Wash buffer：吸取20ml的20×Wash buffer加至380ml注射用水中，振摇混匀后使用，现用现配；
(5)孵育结束后从振荡器上取下酶标板，弃去孔内溶液，每孔加入350μl 1×Washbuffer洗涤5次，每次浸泡30s；
(6)用酶标抗体稀释液将酶标抗体1:100稀释。每孔加入100μl稀释后酶标抗体，并在室温振荡孵育1小时。弃去孔内溶液，用350μl 1×Wash buffer洗涤5次，每次浸泡30s；
(7)每孔加入100μL显色剂，用封板膜封板，避光室温孵育20-25min；
(8)每孔加入100μL终止液，混匀后即刻测量OD450。
16.6试验结果
(1)一般临床观察
试验期间，未出现试验动物状态异常或死亡的情况，表明该疫苗安全性良好。
(2)T细胞免疫效果考察
试验结果如图7～8所示，各组免疫后均可以诱导产生特异性细胞因子IL-2+、IL-2+IFN-γ+和IFN-γ+，其中Gr1免疫产生特异性IL-2+、IL-2+IFN-γ+、IFN-γ+因子的细胞占CD4+T细胞频数分别为0.23％、0.1％、0.049％，Gr2免疫产生特异性IL-2+、IL-2+IFN-γ+、IFN-γ+因子的细胞占CD4+T细胞频数分别为0.06％、0％、0.051％，Gr3免疫产生特异性IL-2+、IL-2+IFN-γ+、IFN-γ+因子的细胞占CD4+T细胞频数分别为0.38％、0.43％、0.088％，Gr4免疫产生特异性IL-2+、IL-2+IFN-γ+、IFN-γ+因子的细胞占CD4+T细胞频数分别为0.21％、0.079％、0.05％。从中可以看出，Gr3免疫产生的各细胞因子均高于Gr1和Gr2，且存在统计学差异，表明AS01佐剂的免疫效果优于其余两种佐剂；Gr1和Gr4采用相同的佐剂，在细胞因子上不存在统计学差异。
(3)IgG抗体诱导效果考察
试验结果如图9～10所示，各组免疫后均可以诱导产生特异性抗体IgG。其中，包被gB1-P抗原进行检测时，Gr1免疫小鼠后诱导产生的IgG抗体几何平均滴度(GMT)为1600000，Gr2免疫产生的IgG抗体GMT为46166，Gr3免疫产生的IgG抗体GMT为11596475，Gr4免疫产生的IgG抗体GMT为334605，可见Gr3诱导产生的IgG抗体滴度高于Gr1、Gr2以及Gr4，且存在统计学差异。包被gB1-fusion抗原进行检测时，Gr1免疫小鼠后诱导产生的IgG抗体GMT为242515，Gr2免疫产生的IgG抗体GMT为757.9，Gr3免疫产生的IgG抗体GMT为3675835，Gr4免疫产生的IgG抗体GMT为278576，可见此时Gr3诱导产生的IgG抗体滴度仍然高于Gr1、Gr2以及Gr4，且存在统计学差异，而Gr1与Gr4之间不存在显著性差异。
(4)IgA抗体诱导效果考察
试验结果如图11所示，各组免疫后均可以诱导产生特异性抗体IgA，其中Gr1免疫小鼠后诱导产生的IgA抗体几何平均浓度(GMC)为40.75，Gr2免疫产生的IgA抗体GMC为64.65，Gr3免疫产生的IgA抗体GMC为41.66，Gr4免疫产生的IgA抗体GMC为90.58。从中可以看出，Gr4免疫产生的IgA抗体浓度高于Gr2免疫产生的IgA抗体浓度，Gr2产生的IgA浓度又高于Gr1和Gr3的浓度，并且相互之间存在统计学差异。
16.7结论
(1)根据细胞因子及IgG抗体检测结果，在试验中各组均显示出较好的免疫原性，说明该疫苗具有良好的免疫性能；其中Gr3(gB1-P+AS01)产生的免疫反应强于Gr1(gB1-P+CpG+Al(OH)3)和Gr4(gB1-fusion+CpG+Al(OH)3)并强于Gr2(gB1-P+CpG)，说明AS01佐剂对于细胞免疫和IgG抗体的诱导效果优于CpG或CpG与Al(OH)3的组合。
(2)根据IgA抗体检测结果，在试验中各组均显示出较好的免疫原性，说明该疫苗具有良好的免疫性能；其中Gr4(gB1-fusion+CpG+Al(OH)3)产生的免疫反应强于Gr2(gB1-P+CpG)并强于Gr1(gB1-P+CpG+Al(OH)3)和Gr3(gB1-P+AS01)，表明gB1-fusion抗原+CpG+Al(OH)3的组合对于IgA抗体的诱导效果最强，但具体的佐剂组合并未体现出突出的免疫效果。
实施例17包含不同佐剂的HSV疫苗体外中和试验
取C57BL/6N小鼠20只(雌性，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，随机分成4组、每组5只，按照表7所示的方式进行分组免疫。二次免疫后14天采血，采血方法为眼后静脉丛采血、每次采血量300～500μl；取血后不抗凝，37℃放置1h、之后4℃放置0.5h，8000rpm下离心10min，收集血清，置于56℃水浴中灭活30min，-20℃保存，按照表7所示的方式分别进行针对不同毒株的中和试验。
表7分组实验设计情况
组别 疫苗工作液 免疫剂量 免疫途径和体积 免疫程序 攻击毒株
1 Gr1 1/10HD 皮内0.1ml 2剂次，间隔21d HSV-1syn
2 Gr3 1/10HD 皮内0.1ml 2剂次，间隔21d HSV-1syn
3 Gr4 1/10HD 皮内0.1ml 2剂次，间隔21d HSV-1syn
4 Gr3 1/10HD 皮内0.1ml 2剂次，间隔21d HSV-2G
17.1血清中和活性检测
用上述采集的血清与相应毒株进行体外中和试验，结果如图12所示。HSV-1syn毒株中和试验中，用Gr3免疫后的中和能力最强、几何平均滴度(GMT)达到403.6，高于Gr1和Gr4，用Gr4免疫后的中和能力最弱，且三组之间依次存在统计学差异。HSV-2G毒株中和试验中，采用目前免疫效果最好的Gr3进行中和试验，结果如图13所示，Gr3免疫后对HSV-2G毒株能诱导较强的中和能力，几何平均滴度(GMT)可达97.14。
17.2空斑减少中和试验
(1)HSV-1中和试验
将Vero细胞用含10％胎牛血清培养基按约4×105个/mL的量接种到24孔板中，每孔500μL，37℃细胞培养箱中培养过夜，形成细胞单层，待细胞约铺满90％-100％时，弃上清，PBS洗涤后备用；将待测血清按一定比例稀释，取240μl稀释后的血清与1200pfu/ml的HSV-1 240μl混匀，室温孵育30分钟，同时设置用培养基与毒株混合孵育的阳性对照样本；24孔板Vero E6细胞去除培养上清，将上述血清+病毒的混合体系按照200μl/孔的量接种到Vero E6细胞中，每个浓度2个重复孔，CO2细胞培养箱，孵育2小时；去除24孔板中孵育液体，加入0.5％低熔点琼脂糖500μl/孔，将24孔板放入4℃冰箱冷却10分钟，待琼脂糖凝固后放入CO2细胞培养箱，培养72小时；待空斑形成后，加入400μl/孔4％多聚甲醛固定，室温过夜后用纯水洗一遍固定好的24孔板，使琼脂糖脱落，每孔加入300μl 0.2％结晶紫染色液，室温染色4小时后再用纯水洗三遍；记录每孔形成的空斑数量，根据含血清的空斑数与不含血清的阳性对照空斑数的比值来计算血清的中和效价。
实验结果如表8所示，Gr1和Gr3的血清样本均能对HSV-1产生一定的中和效价，且Gr3的产生的中和效价明显高于Gr1。
表8不同血清样本对HSV-1毒株的中和效价
(2)HSV-2中和试验
采用对HSV-1中和效果较好的Gr3，按照上述HSV-1的方法进行HSV-2中和试验，结果如表9所示，Gr3对HSV-2也能产生较高的中和效价。
表9不同血清样本对HSV-2毒株的中和效价
综上可知，该疫苗的多种配方针对HSV-1和HSV-2毒株均具有良好的免疫性能；其中Gr3(gB1-P+AS01)针对HSV1和HSV2毒株均能产生较强的中和能力，并且显著优于Gr1(gB1-P+CpG+Al(OH)3)和Gr4(gB1-fusion+CpG+Al(OH)3)，说明AS01佐剂对于毒株的中和能力优于CpG+Al(OH)3的组合。
实施例18包含不同抗原的HSV疫苗免疫效果试验
(一)T细胞免疫效果
采用0天和21天进行接种免疫的免疫程序，以5μg/只免疫C57BL/6N小鼠。于末次免疫14天(D35)后分离脾细胞，分别使用20μg/ml的5种免疫蛋白(gB1-WT、gB1-P、gB1-fusion、gB2-fusion和gB1-gB2-fusion)刺激，参照实施例16的方法进行细胞内细胞因子检测，考察重组人单纯疱疹病毒疫苗诱导产生抗原特异性细胞因子水平。如图14所示，在使用AS01佐剂的基础上，免疫gB1-WT抗原免疫产生特异性IL-2+、IL-2+IFN-γ+、IFN-γ+因子的细胞占CD4+T细胞频数分别为0.21％、0.21％、0.079％，免疫gB1-P抗原产生特异性IL-2+、IL-2+IFN-γ+、IFN-γ+因子的细胞占CD4+T细胞频数分别为0.47％、0.63％、0.18％，免疫gB1-fusion抗原产生特异性IL-2+、IL-2+IFN-γ+、IFN-γ+因子的细胞占CD4+T细胞频数分别为0.36％、0.36％、0.13％，免疫gB2-fusion抗原产生特异性IL-2+、IL-2+IFN-γ+、IFN-γ+因子的细胞占CD4+T细胞频数分别为0.46％、0.65％、0.22％，免疫gB1-gB2-fusion抗原产生特异性IL-2+、IL-2+IFN-γ+、IFN-γ+因子的细胞占CD4+T细胞频数分别为0.43％、0.73％、0.27％。gB1-gB2-fusion抗原联合AS01佐剂免疫产生细胞因子均高于其他免疫组，但与gB1-P、gB1-fusion和gB2-fusion不存在统计学差异，与gB1-WT存在统计学差异。
(二)抗原特异性IgG抗体检测
采用0天和21天进行接种免疫的免疫程序，以5μg/只免疫C57BL/6N小鼠。于末次免疫后14天(D35)后采集血液，参照实施例16的方法进行抗原特异性IgG抗体滴度检测。图15表明，在使用AS01佐剂的基础上，抗原gB1-WT、gB1-P、gB1-fusion、gB2-fusion和gB1-gB2-fusion免疫小鼠诱导机体产生抗原特异性IgG抗体滴度GMT分别为4525483、4935075、3200000、2934413和5868826。gB1-gB2-fusion抗原产生IgG抗体滴度高于gB1-P和gB1-WT，但不存在统计学差异，高于gB1-fusion和gB2-fusion，且存在统计学差异。
实施例19不同抗原的HSV体外中和试验
采用0天和21天进行接种免疫的免疫程序，以5μg/只免疫C57BL/6N小鼠。于末次免疫后14天(D35)后采集血液，参照实施例17的方法进行抗原特异性中和抗体滴度检测。图16表明，在使用AS01佐剂的基础上，gB1-WT、gB1-P、gB1-fusion和gB1-gB2-fusion抗原免疫小鼠诱导机体产生HSV-1毒株抗原特异性中和抗体滴度GMT分别为787.2、575.1、554.6和832.5，各抗原之间不存在统计学差异，但gB1-gB2-fusion抗原诱导的中和抗体滴度GMT最高，这说明不同血清型HSV蛋白的融合可以提高免疫效果，并因此提高对不同毒株的交叉保护作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种HSV免疫原性组合物，其特征在于，所述HSV免疫原性组合物包含源自HSV的重组蛋白和佐剂，所述重组蛋白包含HSV-1与HSV-2中至少一项的gB蛋白的胞外域或其功能片段，或者与所述gB蛋白胞外域或其功能片段的序列至少90％相同；其中，所述功能片段至少包含HSV-1与HSV-2中至少一项的gB蛋白胞外域的I和II结构域，所述佐剂包含MPL和QS-21。
2.如权利要求1所述的HSV免疫原性组合物，其特征在于，所述重组蛋白包含HSV-1的胞外域或其功能片段和HSV-2的胞外域或其功能片段。
3.如权利要求2所述的HSV免疫原性组合物，其特征在于，所述HSV-1的gB蛋白胞外域或其功能片段的C端与所述HSV-2的gB蛋白胞外域或其功能片段的N端直接连接或间接连接，或者所述HSV-2的gB蛋白胞外域或其功能片段的C端与所述HSV-1的gB蛋白胞外域或其功能片段的N端直接连接或间接连接。
4.如权利要求1所述的HSV免疫原性组合物，其特征在于，所述gB蛋白胞外域或其功能片段发生至少一处氨基酸突变。
5.如权利要求1所述的HSV免疫原性组合物，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.1～7中的任一项至少90％相同。
6.如权利要求1所述的HSV免疫原性组合物，其特征在于，单次给药剂量的所述HSV免疫原性组合物中包含所述重组蛋白20～80μg，优选为50μg。
7.如权利要求1所述的HSV免疫原性组合物，其特征在于，所述佐剂为包含MPL和QS-21的脂质体佐剂。
8.如权利要求7所述的HSV免疫原性组合物，其特征在于，单次给药剂量的所述HSV免疫原性组合物中包含MPL 10～100μg和QS-21 10～100μg。
9.权利要求1～8中任一项所述的HSV免疫原性组合物在制备预防HSV感染的疫苗中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疫苗包括成分相同、间隔14～28天施用的第一剂次和第二剂次。
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